CN114807350A

CN114807350A - 用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物、多基因联检试剂盒及应用

Info

Publication number: CN114807350A
Application number: CN202210502980.XA
Authority: CN
Inventors: 龚伟; 李雯; 石涵; 杨峰; 洪跟东
Original assignee: Shanghai Ruijing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Ruijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-09
Filing date: 2022-05-09
Publication date: 2022-07-29

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物、多基因联检试剂盒及应用。所述生物标志物组包含8种DNA单碱基突变和4种基因融合中的至少一种；所述8种DNA单碱基突变选自BRAF基因V600E、TERT基因C228T/C250T、KRAS基因G12C/G12V/Q61R、NRAS基因Q61R、HRAS基因Q61R，所述4种基因融合选自CCDC6‑RET(Exon1‑Exon12)、NCOA4‑RET(Exon8‑Exon12)、PAX8‑PPARG(Exon10‑Exon2)、ETV6‑NTRK3(Exon4‑Exon14)。本发明的方法和试剂盒检测灵敏度高、特异性高，应用场景广泛。

Description

用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物、多基因联检试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，公开了一种高性能的甲状腺结节良恶性判别多基因联检试剂盒。

背景技术

甲状腺结节是人群中普遍存在的一种甲状腺疾病，是甲状腺细胞在局部异常生长所引发的病变。大多数情况下，甲状腺结节是良性的，可以采取保守治疗的方式，但也有5％-10％的甲状腺结节是恶性的，即甲状腺癌，需要早期手术治疗，才能获得良好的预后效果。目前，通过细针穿刺(FNA)的方法获取甲状腺细胞，进行细胞学检查是当今评估甲状腺结节是否为恶性肿瘤的金标准。然而，仍有20％-30％的甲状腺结节无法通过这种方式获得明确诊断。

随着分子生物学技术的进展，分子诊断在甲状腺结节良恶性的鉴别诊断中，逐渐受到人们的关注。美国国立综合癌症网络(NCCN)2019年版的临床实践指南中明确指出：(1)对细针穿刺无法确定的疑似滤泡型及Hurthle细胞癌(诊断依据为血管或包膜的浸润)，分子检测有助于判定其良恶性；(2)细胞学无法明确诊断的结节，利用分子诊断的技术，检测BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8/PPARG等癌基因的变异对辅助诊断甲状腺癌具有重要作用。

目前的研究表明基因融合是甲状腺癌发病的决定性因素之一，癌症基因组计划(The Cancer Genome Atlas)绘制的甲状腺癌的遗传图谱提示，基因融合占据了甲状腺癌基因突变的20％左右。因此鉴定出甲状腺癌组织中的基因融合及相关基因突变情况对于甲状腺癌的精准诊断和治疗有重要意义。

受限于检测手段的不足，目前国内较少开展此类甲状腺癌相关分子检测大型研究。常规的基因检测方法为Sanger测序法，该方法存在检测周期长、灵敏度低等缺点。发展较快的NGS测序主要优点在于检测通量高，可检测未知突变，但缺点是检测周期较长，实验操作过程复杂，数据分析难度较高且试剂设备成本昂贵，短期内难以大规模应用推广，不能满足大多数医院和患者的应用需求。

荧光定量PCR技术成熟，在临床应用较为普遍，该方法操作简单，仅需2个小时即可获得检测结果，且没有扩增后开盖分析污染风险，灵敏度普遍能达到1％左右，但是特异性仍然有待提高。

发明内容

为克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物组及相关产品。本发明通过精心筛选基因，优化反应体系，开发出基于荧光定量PCR的简易的，成本低廉的普及率高的甲状腺结节多基因联合检测试剂盒，用于辅助医生对结节良恶性进行判别。所述检测试剂盒对核酸投入量要求较低，适用于甲状腺结节细针穿刺活检样本的检测，操作简洁，用时短，灵敏度高，成本低廉，普及率高，能满足患者和医院的应用需求。

本发明的目的之一是提供用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物组，其包含8种DNA单碱基突变和4种基因融合中的至少一种；所述8种DNA单碱基突变选自BRAF基因V600E、TERT基因C228T/C250T、KRAS基因G12C/G12V/Q61R、NRAS基因Q61R、HRAS基因Q61R，所述4种基因融合选自CCDC6-RET(Exon1-Exon12)、NCOA4-RET(Exon8-Exon12)、PAX8-PPARG(Exon10-Exon2)、ETV6-NTRK3(Exon4-Exon14)。

其中，所述CCDC6-RET融合是指CCDC6基因1号外显子与RET基因12号外显子的融合；其中，所述NCOA4-RET融合是指NCOA4基因8号外显子与RET基因12号外显子的融合；其中，所述PAX8-PPARG融合是指PAX8基因10号外显子与PPARG基因2号外显子的融合；其中，所述ETV6-NTRK3融合是指ETV6基因4号外显子与NTRK3基因14号外显子的融合。

本发明的另一目的是提供如上所述的生物标志物组或其检测物在制备甲状腺结节良恶性判别产品中的用途。

本发明的另一目的是提供一种检测物，所述检测物为特异性检测引物和/或特异性检测探针；

所述特异性检测引物包括以下引物对A～J至少任一：

针对BRAF基因V600E的引物对A，上游引物选自序列SEQ ID NO：1～3任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：4～6任一；

针对TERT基因C228T的引物对B，上游引物选自序列SEQ ID NO：10～12任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：13～15任一；

针对TERT基因C250T的引物对C，上游引物选自序列SEQ ID NO：19～21任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：22～24任一；

针对KRAS基因G12C的引物对D，上游引物选自序列SEQ ID NO：28～30任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：31～33任一；

针对KRAS基因G12V的引物对E，上游引物选自序列SEQ ID NO：37～39任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：40～42任一；

针对KRAS基因Q61R的引物对F，上游引物选自序列SEQ ID NO：46～48任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：49～51任一；

针对NRAS基因Q61R的引物对G，上游引物选自序列SEQ ID NO：55～57任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：58～60任一；

针对HRAS基因Q61R的引物对F，上游引物选自序列SEQ ID NO：64～66任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：67～69任一；

针对CCDC6-RET(Exon1-Exon12)的引物对G，上游引物选自序列SEQ ID NO：73～75任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：76～78任一；

针对NCOA4-RET(Exon8-Exon12)的引物对H，上游引物选自序列SEQ ID NO：82～84任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：85～87任一；

针对PAX8-PPARG(Exon10-Exon2)的引物对I，上游引物选自序列SEQ ID NO：90～91任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：92～93任一；

针对ETV6-NTRK3(Exon4-Exon14)的引物对J，上游引物选自序列SEQ ID NO：96～97任一，下游引物选自序列SEQ ID NO：98～99任一；

所述特异性检测探针包括以下探针A～J至少任一：

针对BRAF基因V600E的探针A，其序列如SEQ ID NO：7～9任一所示；

针对TERT基因C228T的探针B，其序列如SEQ ID NO：16～18任一所示；

针对TERT基因C250T的探针C，其序列如SEQ ID NO：25～27任一所示；

针对KRAS基因G12C的探针D，其序列如SEQ ID NO：34～36任一所示；

针对KRAS基因G12V的探针E，其序列如SEQ ID NO：43～45任一所示；

针对KRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：52～54任一所示；

针对NRAS基因Q61R的探针G，其序列如SEQ ID NO：61～63任一所示；

针对HRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：70～72任一所示；

针对CCDC6-RET(Exon1-Exon12)的探针G，其序列如SEQ ID NO：79～81任一所示；

针对NCOA4-RET(Exon8-Exon12)的探针H，其序列如SEQ ID NO：88～89任一所示；

针对PAX8-PPARG(Exon10-Exon2)的探针I，其序列如SEQ ID NO：94～95任一所示；

针对ETV6-NTRK3(Exon4-Exon14)的探针J，其序列如SEQ ID NO：100～101任一所示。

本发明的另一目的是提供一种甲状腺结节良恶性判别的诊断产品，所述产品包括如上所述的检测物；优选地，所述诊断产品为试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列、组合物或检测系统之任一。

本发明的另一目的是提供如上任一项所述的甲状腺结节良恶性判别产品的非诊断目的的使用方法，包括下列步骤：

(1)收集待检样本，提取基因组DNA和总RNA；

(2)配制反应体系

所述反应体系包括检测反应液、PCR Mix、模板；对于基因融合检测，所述反应体系还包括RT混合酶；

(3)进行RT-qPCR扩增反应和信号收集；

(4)对结果进行分析，根据Ct值判断待测样本为阴性或阳性。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明基于荧光PCR，操作简便，检测周期短，成本低，灵敏度高，可同时对8个基因突变及融合进行检测判定，应用场景可及率高；核酸样品一步加样后闭管检测，无需产物后处理。本发明反应体系稳定，模板投入量低，目的信号较传统的设计特异性更高；反应体系灵敏度高，5ng/μL野生型基因组DNA可以检测出至少1％的突变，RNA可以检测出至少500拷贝的融合突变。本发明制备的试剂盒应用场景为甲状腺结节的术前穿刺样本的基因检测。

附图说明

图1为BRAF V600E位点阴性、阳性样本的扩增曲线图。

图2为TERT C228T位点阴性、阳性样本的扩增曲线图。

图3为TERT C250T位点阴性、阳性样本的扩增曲线图。

图4为KRAS G12C位点阴性、阳性样本的扩增曲线图。

图5为KRAS G12V位点阴性、阳性样本的扩增曲线图。

图6为KRAS Q61R位点阴阳性、性样本的扩增曲线图。

图7为NRAS Q61R位点阴性、阳性样本的扩增曲线图。

图8为HRAS Q61R位点阴性、阳性样本的扩增曲线图。

图9为CCDC6-RET融合阴性、阳性样本的扩增曲线图。

图10为NCOA4-RET融合阴性、阳性样本的扩增曲线图。

图11为PAX8-PPARG融合阴性、阳性样本的扩增曲线图。

图12为ETV6-NTRK3融合阴性、阳性样本的扩增曲线图。

图13A为实施例3BRAF V600E检测限梯度测试结果。

图13B为实施例3TERT C228T检测限梯度测试结果。

图13C为实施例3TERT C250T检测限梯度测试结果。

图13D为实施例3KRAS G12C检测限梯度测试结果。

图13E为实施例3KRAS G12V检测限梯度测试结果。

图13F为实施例3KRAS Q61R检测限梯度测试结果。

图13G为实施例3NRAS Q61R检测限梯度测试结果。

图13H为实施例3HRAS Q61R检测限梯度测试结果。

图13I为实施例3CCDC6-RET检测限梯度测试结果。

图13J为实施例3NCOA4-RET检测限梯度测试结果。

图13K为实施例3PAX8-PPARG检测限梯度测试结果。

图13L为实施例3ETV6-NTRK3检测限梯度测试结果。

图14为实施例4甲状腺癌基因长尾分布图。

图15A为实施例5TERT C228T位点不同扩增试剂比较。

图15B为实施例5TERT C250T位点不同扩增试剂比较。

图16A为实施例6不同TERT C228T Blocker浓度比较。

图16B为实施例6不同TERT C250T Blocker浓度比较。

图16C为实施例6KRAS G12C反应体系中Blocker显著提高特异性。

图17A为实施例7添加剂对TERT C228T扩增曲线的影响。

图17B为实施例7TERT C228T高浓度野生型模板的非特异性扩增信号。

图17C为实施例7 15mM TMAC改善TERT C228T反应液扩增特异性。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明提供了用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物组，其包含8种DNA单碱基突变和4种基因融合中的至少一种；所述8种DNA单碱基突变选自BRAF基因V600E、TERT基因C228T/C250T、KRAS基因G12C/G12V/Q61R、NRAS基因Q61R、HRAS基因Q61R，所述4种基因融合选自CCDC6-RET、NCOA4-RET、PAX8-PPARG、ETV6-NTRK3。在一些优选实施方式中，本发明提供的用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物组，其包含8种DNA单碱基突变和4种基因融合。

本发明还提供了如上所述的生物标志物组或其检测物在制备甲状腺结节良恶性判别产品中的用途。优选地，所述检测物为特异性检测引物和/或特异性检测探针。

所述特异性检测引物包括以下引物对A～J至少任一：

所述特异性检测探针包括以下探针A～J至少任一：

针对BRAF基因V600E的探针A，其序列如SEQ ID NO：7～9任一所示；

针对KRAS基因G12C的探针D，其序列如SEQ ID NO：34～36任一所示；

针对KRAS基因G12V的探针E，其序列如SEQ ID NO：43～45任一所示；

针对KRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：52～54任一所示；

针对NRAS基因Q61R的探针G，其序列如SEQ ID NO：61～63任一所示；

针对HRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：70～72任一所示；

本发明还提供了一种检测物，所述检测物为特异性检测引物和/或特异性检测探针；

所述特异性检测引物包括以下引物对A～J至少任一：

所述特异性检测探针包括以下探针A～J至少任一：

针对BRAF基因V600E的探针A，其序列如SEQ ID NO：7～9任一所示；

针对KRAS基因G12C的探针D，其序列如SEQ ID NO：34～36任一所示；

针对KRAS基因G12V的探针E，其序列如SEQ ID NO：43～45任一所示；

针对KRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：52～54任一所示；

针对NRAS基因Q61R的探针G，其序列如SEQ ID NO：61～63任一所示；

针对HRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：70～72任一所示；

在一些优选实施方式中，所述特异性检测引物包括以下引物对A～J至少任一：

针对BRAF基因V600E的引物对A，其序列如SEQ ID NO：1、4所示；

针对TERT基因C228T的引物对B，其序列如SEQ ID NO：11、13所示；

针对TERT基因C250T的引物对C，其序列如SEQ ID NO：19、22所示；

针对KRAS基因G12C的引物对D，其序列如SEQ ID NO：28、31所示；

针对KRAS基因G12V的引物对E，其序列如SEQ ID NO：37、40所示；

针对KRAS基因Q61R的引物对F，其序列如SEQ ID NO：46、49所示；

针对NRAS基因Q61R的引物对G，其序列如SEQ ID NO：55、58所示；

针对HRAS基因Q61R的引物对F，其序列如SEQ ID NO：64、67所示；

针对CCDC6-RET的引物对G，其序列如SEQ ID NO：73、76所示；

针对NCOA4-RET的引物对H，其序列如SEQ ID NO：82、85所示；

针对PAX8-PPARG的引物对I，其序列如SEQ ID NO：90、92所示；

针对ETV6-NTRK3的引物对J，其序列如SEQ ID NO：96、98所示；

所述特异性检测探针包括以下探针A～J至少任一：

针对BRAF基因V600E的探针A，其序列如SEQ ID NO：7所示；

针对TERT基因C228T的探针B，其序列如SEQ ID NO：16所示；

针对TERT基因C250T的探针C，其序列如SEQ ID NO：25所示；

针对KRAS基因G12C的探针D，其序列如SEQ ID NO：34所示；

针对KRAS基因G12V的探针E，其序列如SEQ ID NO：43所示；

针对KRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：52所示；

针对NRAS基因Q61R的探针G，其序列如SEQ ID NO：61所示；

针对HRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：70所示；

针对CCDC6-RET的探针G，其序列如SEQ ID NO：79所示；

针对NCOA4-RET的探针H，其序列如SEQ ID NO：88所示；

针对PAX8-PPARG的探针I，其序列如SEQ ID NO：94所示；

针对ETV6-NTRK3的探针J，其序列如SEQ ID NO：100所示。

本发明还提供了一种甲状腺结节良恶性判别的诊断产品，所述产品包括如上所述的检测物；优选地，所述诊断产品为试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列、组合物或检测系统之任一。

在一些优选实施方式中，所述诊断产品为检测试剂盒，即本发明提供甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒。所述检测试剂盒包括检测反应液(包含目的基因引物探针组和内参基因引物探针组)、PCR Mix、模板(DNA样品、RNA样品或阳性对照品、空白对照品)。在一些优选实施方式中，本发明用于任一突变检测或基因融合检测的反应体系是独立的，即每个独立的反应体系均包含用于任一突变检测或基因融合检测的反应体系是独立的。

所述目的基因为BRAF基因V600E、TERT基因C228T/C250T、KRAS基因G12C/G12V/Q61R、NRAS基因Q61R、HRAS基因Q61R共8个DNA单碱基突变，CCDC6-RET、NCOA4-RET、PAX8-PPARG、ETV6-NTRK3共4种基因融合。所述内参基因为DNA反应管中的ACTB基因，RNA反应管中的NONO基因。

所述检测反应液包括分别用于检测BRAF基因V600E、TERT基因C228T/C250T、KRAS基因G12C/G12V/Q61R、NRAS基因Q61R、HRAS基因Q61R共8个DNA单碱基突变，CCDC6-RET、NCOA4-RET、PAX8-PPARG、ETV6-NTRK3共4种基因融合，以及内参基因的引物探针组合物。所述探针为Taqman探针，5’端添加荧光报告基团，3’端添加荧光猝灭基团。优选地，所述目的基因检测探针5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光猝灭基团TAMRA或MGB；所述内参基因探针5’端添加荧光报告基团VIC，3’端添加荧光猝灭基团TAMRA。此外TERT、KRAS、NRAS、HRAS基因反应液中还包括用于结合野生型模板的Blocker(如SEQ ID NO.108～114所示)，如下表1所示。所述Blocker 3’端添加Spacer-C3或ddC修饰，以阻止其被延伸。此外KRAS、NRAS和HRAS基因Blocker中还含有不同数量的锁核酸(LNA)修饰，从而提高Blocker的特异性；所述锁核酸修饰的数量可以是2～5个碱基，也是2个、3个、4个或5个，在一优选实施方式中，所述所述锁核酸修饰的数量为4个碱基。

在一些优选实施方式中，用于TERT C228T位点检测的Blocker选自

至少任一；优选地，为SEQ IDNO.108。用于TERT C228T位点检测的Blocker的浓度为300-600nM，可以是300-450、450-500、500-550、550-600nM；优选地，为450nM。

用于TERT C250T位点检测的Blocker为GGACCCGGGAGGGGTCGG-Spacer C3(SEQ IDNO.109)。用于TERT C250T位点检测的Blocker的浓度为800-1000nM，可以是800-850、850-900、900-950、950-1000nM；优选地，为900nM。

用于KRAS基因G12C位点检测的Blocker选自KRAS G12C Blocker A.

其中Blocker A除3’-Spacer C3外，无其他修饰，检测位点位于3’端倒数第二位，长度为29个碱基。Blocker B除3’-Spacer C3外还包含序列中的4个锁核酸修饰(LNA)，且其中一个为检测位点。用于KRAS基因G12C位点检测的Blocker的浓度为1500-4500nM；优选地，为300-3000nM；进一步优选地，为3000nM。

根据ARMS-PCR的检测原理，其常规方法是通过设计一条只能与突变型模板结合的ARMS引物来实现对样本中相应突变模板的扩增和检出，而该引物由于3’端末尾碱基不能与野生型模板匹配进而扩增产生非特异性信号。在实际应用中，对于部分特殊检测靶点(例如本发明中TERT基因启动子区含较高比例的GC碱基，RAS基因家族序列同源性较高，均容易导致ARMS引物的非特异性结合与扩增)，即使在3’端倒数第二位或第三位引入错配，仍不能较好区分检测样本中低丰度的突变型模板与大量的野生型模板。

在这种情况下，在体系中加入一定量的Blocker可以显著提高反应体系的检测特异性。Blocker是一种寡核苷酸短片段，其序列设计在待检测的突变位点处，覆盖该位点，且与ARMS引物部分重叠。Blocker与野生型模板完全匹配，Tm值略高于ARMS引物与野生型模板结合的Tm值，使得扩增过程中Blocker相比ARMS引物优先与野生型模板结合。Blocker的3’末端还包含阻止Taq酶延伸的封闭修饰，如Spacer-C3或ddC。在特定情形下，Blocker中还可加入不同数量的LNA修饰以提高Blocker的Tm值，或增加Blocker本身的结合特异性。

表1SEQ ID NO:108～114所示的Blocker序列的结构和组成

序号	位点	序列	3’修饰	LNA
					SEQ ID NO:108	TERT C228T	GGCTGGGAGGGCCCGGAG	Spacer C3	无
SEQ ID NO:109	TERT C250T	GGACCCGGGAGGGGTCGG	Spacer C3	无
					SEQ ID NO:110	KRAS G12C	TGGAGCT+G+GT+G+GCGTAG	Spacer C3	4
SEQ ID NO:111	KRAS G12V	TATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCA	ddC	无
					SEQ ID NO:112	KRAS Q61R	GACACAGCA+GG+TC+AAGAGGA	Spacer C3	3
SEQ ID NO:113	NRAS Q61R	AGCT+GG+AC+AA+GAA+GAGTAC	Spacer C3	5
					SEQ ID NO:114	HRAS Q61R	CGGCC+AG+GAGGAGTAC	Spacer C3	2

本发明所述检测试剂盒中，每条检测引物的浓度为200-800nM，每条探针的浓度为150-500nM。每条引物浓度可以是200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800nM。优选地，为300-600nM。每条探针浓度可以是150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500nM。优选地，为200-400nM。

在一些优选实施方式中，本发明所述检测试剂盒中，用于单碱基突变检测的上下游引物浓度分别为250-350nM，探针浓度为150-250nM；用于单碱基突变检测的内参基因上下游引物浓度分别为250-350nM，探针浓度为150-250nM；用于基因融合检测的上下游引物浓度分别为550-650nM，探针浓度为350-450nM；用于基因融合检测的内参基因上下游引物浓度分别为400-500nM，探针浓度为250-350nM。

在一些优选实施方式中，本发明所述检测试剂盒中，每条用于DNA单碱基突变的检测的上下游引物浓度为300nM，探针浓度为200nM；内参基因上下游引物浓度为300nM，探针浓度为200nM。

在一些优选实施方式中，本发明所述检测试剂盒中，每条用于RNA融合检测的上下游引物的浓度分别为600nM，探针浓度为400nM；内参基因上下游引物浓度为450nM，探针浓度为300nM。

用于BRAF、TERT基因DNA突变位点检测的PCR Mix为PCR Mix A，所述PCR Mix A包括DNA突变检测反应所需的热启动DNA聚合酶、UDG酶、dNTPs、dUTP、Mg²⁺和缓冲液。在一优选实施方式中，所述热启动DNA聚合酶为诺唯赞Ace Taq DNA聚合酶。

用于KRAS、NRAS、HRAS基因DNA突变位点检测的PCR Mix为PCR Mix B，所述PCR MixB包括DNA突变检测反应所需的热启动DNA聚合酶、UDG酶、dNTPs、dUTP、Mg²⁺和缓冲液。在一优选实施方式中，所述热启动DNA聚合酶为天根Chemi Taq DNA聚合酶。

PCR Mix A和PCR Mix B可以相同或不同；在一些优选实施方式中，PCR Mix A和PCR Mix B的区别包括使用不同的热启动DNA聚合酶，PCR Mix A中热启动DNA聚合酶为AceTaq DNA聚合酶，PCR Mix B中热启动DNA聚合酶为Chemi Taq DNA聚合酶。

用于RNA融合(CCDC6-RET、NCOA4-RET、PAX8-PPARG、ETV6-NTRK3基因融合)检测反应的PCR Mix为PCR Mix C；其中，所述PCR Mix C包括RNA融合检测反应所需的dNTPs、dUTP、Mg²⁺和缓冲液。

用于RNA融合检测的反应体系中还包括RT混合酶；所述RT混合酶包括RNA融合检测反应所需的DNA聚合酶、UDG酶、逆转录酶和RNase抑制剂。

用于任一突变检测或基因融合检测的反应体系中还包括添加剂；优选地，所述添加剂选自甘油和/或甜菜碱。

当采用甘油作为添加剂时，所述甘油占反应体系中体积百分比为1-10％；优选地，为2-8％，可以是2％、4％、6％、8％。

当采用甜菜碱作为添加剂时，所述甜菜碱在反应体系中的终浓度为0.4-1.6M；优选地，为0.8-1.0M，可以是0.8M、1.0M。

用于单碱基突变检测的模板选自BRAF(NG_007873.3)，TERT(NG_009265.1)，KRAS(NG_007524.2)，NRAS(NG_007572.1)，HRAS(NG_007666.1)gDNA序列至少任一。

用于基因融合检测的模板选自RET(NM_020975.6)，CCDC6(NM_005436.5)，NCOA4(NM_001145260.2)，PAX8(NM_003466.4)，PPARG(NM_015869.5)，ETV6(NM_001987.5)，NTRK3(NM_001012338.3)和NONO(NM_001145408.2)cDNA至少任一。

用于BRAF、TERT、KRAS、NRAS、HRAS基因单碱基突变位点检测的阳性对照品为DNA突变型质粒。

用于CCDC6-RET、NCOA4-RET、PAX8-PPARG、ETV6-NTRK3基因融合检测的阳性对照品为RNA融合片段的混合物。

本发明的目的还包括甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒的使用方法，该方法高效、准确且经济，并且易于对样本是否包含12种突变类型的准确判断。

在一些优选实施方式中，本发明的甲状腺结节良恶性判别产品(或试剂盒)的非诊断目的的使用方法，包括下列步骤：

(1)收集待检样本，提取基因组DNA和总RNA；

(2)配制反应体系

(3)进行RT-qPCR扩增反应和信号收集；

(4)对结果进行分析，根据Ct值判断待测样本为阴性或阳性。

其中，所述qPCR的扩增程序为(用于DNA和RNA检测的程序相同)：第一阶段：50℃15min，1个循环；第二阶段：95℃15min，1个循环；第三阶段95℃15s，66℃40s，15个循环；第四阶段：95℃15s，60℃40s，35个循环。信号收集：第四阶段60℃时收集荧光信号。其中第一阶段用于防污染和逆转录；第二阶段用于预变性；第三、四阶段用于扩增。

PCR扩增结果用Ct值来表示，Ct值的含义是PCR反应液中荧光信号达到所设定的阈值时的循环数。构建受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC曲线)，得到阳性判断值。

当使用所述甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒检测待测样本时，只有当阳性对照的各目的基因Ct值≤25，空白对照品的各目的基因Ct值＞30，待检测样品的检测结果才有效。

阳性结果的判读标准为：BRAF V600E：Ct≤30；TERT C228T：Ct≤30；TERT C250T：Ct≤26；KRAS G12C：Ct≤28；KRAS G12V：Ct≤29；KRAS Q61R：Ct≤30；NRAS Q61R：Ct≤26；HRAS Q61R：Ct≤28；CCDC6-RET：Ct≤25；NCOA4-RET：Ct≤15；PAX8-PPARG：Ct≤26；ETV6-NTRK3：Ct≤25。满足任一标准，检测结果判读为相应突变阳性。

阴性结果的判读标准为：BRAF V600E：Ct＞32；TERT C228T：Ct＞32；TERT C250T：Ct＞28；KRAS G12C：Ct＞30；KRAS G12V：Ct＞30；KRAS Q61R：Ct＞32；NRAS Q61R：Ct＞28；HRAS Q61R：Ct＞30；CCDC6-RET：Ct＞28；NCOA4-RET：Ct＞17；PAX8-PPARG：Ct＞30；ETV6-NTRK3：Ct＞30。

同时满足所有标准，检测结果为阴性。且10≤Ct(内参基因)＜20，才能判断为8基因突变阴性。

本发明所述“样品”或“生物样品”意指自受试者分离的生物材料。生物样品可含有适于检测所需生物标志物的任何生物材料，并且可包含受试者的细胞和/或非细胞材料。

本发明所述“个体”、“受试者”意指任何动物，但优选哺乳动物，例如人、猴、小鼠、兔或大鼠。

实施例1

甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒组成

试剂盒包括检测目的基因(BRAF基因V600E、TERT基因C228T/C250T、KRAS基因G12C/G12V/Q61R、NRAS基因Q61R、HRAS基因Q61R共8个DNA单碱基突变，CCDC6-RET、NCOA4-RET、PAX8-PPARG、ETV6-NTRK3共4种基因融合)以及内参基因ACTB、NONO的检测反应液、PCRMix、RT混合酶、阳性对照。

1.引物探针组合

检测反应液包括分别用于检测目的基因BRAF基因V600E、TERT基因C228T/C250T、KRAS基因G12C/G12V/Q61R、NRAS基因Q61R、HRAS基因Q61R共8个DNA单碱基突变，CCDC6-RET、NCOA4-RET、PAX8-PPARG、ETV6-NTRK3共4种基因融合)以及内参基因ACTB、NONO的引物探针组合物。

本实施例分别以BRAF(NG_007873.3)，TERT(NG_009265.1)，KRAS(NG_007524.2)，NRAS(NG_007572.1)，HRAS(NG_007666.1)和ACTB(NG_007992.1)gDNA序列为模板，设计了各自的特异性引物探针组合SEQ ID NO.1～72、SEQ ID NO.102～104分别以RET(NM_020975.6)，CCDC6(NM_005436.5)，NCOA4(NM_001145260.2)，PAX8(NM_003466.4)，PPARG(NM_015869.5)，ETV6(NM_001987.5)，NTRK3(NM_001012338.3)和NONO(NM_001145408.2)cDNA序列为模板，设计了各自的特异性引物探针组合SEQ ID NO.73～101、SEQ ID NO.105～107，其中RNA引物为跨内含子设计，防止有基因组DNA污染。目的基因探针5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光猝灭基团TAMRA或MGB；内参基因探针5’端添加荧光报告基团VIC，3’端添加荧光猝灭基团TAMRA。

2.检测反应液组成

检测反应液组成如下表1～12所示(其中，所示的浓度是指某成分工作液浓度，所述特异性检测引物包括以下引物对A～J至少任一：

针对BRAF基因V600E的引物对A，其序列如SEQ ID NO：1、4所示；

针对TERT基因C228T的引物对B，其序列如SEQ ID NO：11、13所示；

针对TERT基因C250T的引物对C，其序列如SEQ ID NO：19、22所示；

针对KRAS基因G12C的引物对D，其序列如SEQ ID NO：28、31所示；

针对KRAS基因G12V的引物对E，其序列如SEQ ID NO：37、40所示；

针对KRAS基因Q61R的引物对F，其序列如SEQ ID NO：46、49所示；

针对NRAS基因Q61R的引物对G，其序列如SEQ ID NO：55、58所示；

针对HRAS基因Q61R的引物对F，其序列如SEQ ID NO：64、67所示；

针对CCDC6-RET的引物对G，其序列如SEQ ID NO：73、76所示；

针对NCOA4-RET的引物对H，其序列如SEQ ID NO：82、85所示；

针对PAX8-PPARG的引物对I，其序列如SEQ ID NO：90、92所示；

针对ETV6-NTRK3的引物对J，其序列如SEQ ID NO：96、98所示；

针对ACTB的引物对K，其序列如SEQ ID NO：102～103所示；

针对NONO的引物对L，其序列如SEQ ID NO：105～106所示；

所述特异性检测探针包括以下探针A～J至少任一：

针对BRAF基因V600E的探针A，其序列如SEQ ID NO：7所示；

针对TERT基因C228T的探针B，其序列如SEQ ID NO：16所示；

针对TERT基因C250T的探针C，其序列如SEQ ID NO：25所示；

针对KRAS基因G12C的探针D，其序列如SEQ ID NO：34所示；

针对KRAS基因G12V的探针E，其序列如SEQ ID NO：43所示；

针对KRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：52所示；

针对NRAS基因Q61R的探针G，其序列如SEQ ID NO：61所示；

针对HRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：70所示；

针对CCDC6-RET的探针G，其序列如SEQ ID NO：79所示；

针对NCOA4-RET的探针H，其序列如SEQ ID NO：88所示；

针对PAX8-PPARG的探针I，其序列如SEQ ID NO：94所示；

针对ETV6-NTRK3的探针J，其序列如SEQ ID NO：100所示；针对ACTB的探针K，其序列如SEQ ID NO：104所示；

针对NONO的探针L，其序列如SEQ ID NO：107所示；

表2BRAF V600E检测试剂

表3TERT C228T检测试剂

表4TERT C250T检测试剂

表5KRAS G12C检测试剂

表6KRAS G12V检测试剂

表7KRAS Q61R检测试剂

表8NRAS Q61R检测试剂

表9HRAS Q61R检测试剂

表10CCDC6-RET检测试剂

表11NCOA4-RET检测试剂

表12PAX8-PPARG检测试剂

表13ETV6-NTRK3检测试剂

3.检测PCR Mix和酶液组成

检测PCR Mix A组分包括DNA突变检测反应所需的热启动DNA聚合酶、UDG酶(或UNG酶)、dNTPs、dUTP、Mg²⁺和缓冲液，用于BRAF、TERT基因位点的检测。DNA聚合酶推荐使用AceTaq DNA聚合酶(Vazyme Biotech Co.Ltd,Nanjing,China)。

检测PCR Mix B组分包括DNA突变检测反应所需的热启动DNA聚合酶、UDG酶(或UNG酶)、dNTPs、dUTP、Mg²⁺和缓冲液，用于KRAS、NRAS、HRAS基因位点的检测。DNA聚合酶推荐使用Chemi Taq DNA聚合酶(天根生化科技(北京)有限公司)。

PCR Mix A和PCR Mix B的区别包括使用不同的热启动DNA聚合酶。

检测PCR Mix C组分包括RNA融合检测反应所需的dNTPs、dUTP、Mg²⁺和缓冲液；试剂盒中RT混合酶组分包括RNA融合检测反应所需的DNA聚合酶、UDG酶、逆转录酶和RNase抑制剂，用于CCDC6-RET、NCOA4-RET、PAX8-PPARG、ETV6-NTRK3基因融合的检测。推荐使用

II U+One Step qRT-PCR Probe Kit(Vazyme Biotech Co.Ltd,Nanjing,China)。

4.阳性对照品

阳性对照品为有BRAF、TERT、KRAS、NRAS、HRAS基因突变的质粒DNA和CCDC6-RET、NCOA4-RET、PAX8-PPARG、ETV6-NTRK3基因融合的RNA片段。此外还含有野生型的背景基因组DNA和野生型总RNA。

实施例2

甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒使用方法

甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒在使用时，包括以下步骤：

1.收集待检患者的甲状腺结节细针穿刺样本，提取基因组DNA和总RNA，保存在-20℃备用。推荐使用组织细胞DNA/RNA提取试剂盒(离心柱法)(上海睿璟生物科技有限公司，中国)，按照说明书进行操作提取得到核酸。

2.以上述所得DNA、RNA、试剂盒阳性对照品和空白对照品分别为模板配制PCR反应体系(组成如表14)，充分混匀后，进行PCR反应。

表14qPCR反应体系

PCR反应条件：第一阶段：50℃15min，1个循环；第二阶段：95℃15min，1个循环；第三阶段：95℃15s，66℃40s，15个循环；第四阶段：95℃15s，60℃40s，35个循环。信号收集：第四阶段60℃时收集荧光信号。其中第一阶段用于防污染和逆转录；第二阶段用于预变性；第三、四阶段用于扩增。推荐使用ABI 7500System。

3.数据处理

qPCR结果用Ct值来表示。Ct值的确定：以扩增过程前3-15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，以荧光信号达到所设定得阈值时的循环数为Ct值。Ct(目的基因)指样品目的基因(FAM信号)对应的Ct值；Ct(内参基因)指样品内参基因(VIC信号)对应的Ct值。只有当阳性对照品的目的基因和内参基因Ct值≤25，空白对照品无扩增信号时，检测实验结果有效。得到样本Ct(目的基因)后，按照下表(表15、表16)判定标准进行结果判读：

表15阳性结果判定范围

表16阴性结果判定范围

当样本Ct(目的基因)符合表15标准时，可判读为相应突变阳性。

当样本Ct(目的基因)符合表16标准，且10≤Ct(内参基因)＜20时，可判读为相应突变阴性；如Ct(内参基因)＜10时，样本核酸浓度太高，需要对核酸进行适当稀释后再次检测；如Ct(内参基因)≥20时，提示样本核酸浓度太低或存在较多PCR抑制物，需要增加取样量或重新提取。

当样本Ct(目的基因)落在表15、16范围外时(灰区，例如对于BRAF V600E，30＜Ct≤32时)，为疑似阳性，建议进行复检。复检结果符合突变阳性判定条件，则判为突变型；复检结果符合阴性判定条件，则判为野生型或低于检测下限；复检结果仍落入灰区，表明该样本为突变型，但突变丰度较低。

实施例3

甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒检测限测试

选取试剂盒12个位点阳性样本或标准品，其中8个DNA突变位点阳性样本稀释至1％突变丰度，浓度依次为：10ng/μL、5ng/μL、2.5ng/μL、1ng/μL。4种融合阳性样本稀释至不同拷贝数浓度梯度，依次为666拷贝/μL、333拷贝/μL、166拷贝/μL、83拷贝/μL(对应总投入量为2000拷贝、1000拷贝、500拷贝、250拷贝)。使用试剂盒进行稀释模板进行检测，每个梯度重复三次，以此确认试剂盒的检测灵敏度，各位点检测模板梯度及检测结果如下：

对于BRAF V600E

BRAF V600E检测限梯度测试结果如图13A所示。

对于TERT C228T：

TERT C228T检测限梯度测试结果如图13B所示。

对于TERT C250T

TERT C250T检测限梯度测试结果如图13C所示。

对于KRAS G12C

KRAS G12C检测限梯度测试结果如图13D所示。

对于KRAS G12V

KRAS G12V检测限梯度测试结果如图13E所示。

对于KRAS Q61R：

KRAS Q61R检测限梯度测试结果如图13F所示。

对于NRAS Q61R：

NRAS Q61R检测限梯度测试结果如图13G所示。

对于HRAS Q61R：

HRAS Q61R检测限梯度测试结果如图13H所示。

对于CCDC6-RET：

CCDC6-RET检测限梯度测试结果如图13I所示。

对于NCOA4-RET：

NCOA4-RET检测限梯度测试结果如图13J所示。

对于PAX8-PPARG：

PAX8-PPARG检测限梯度测试结果如图13K所示。

对于ETV6-NTRK3：

ETV6-NTRK3检测限梯度测试结果如图13L所示。

从以上测试结果可见，在8个DNA突变位点中，BRAF V600E、TERT C228T、KRASQ61R、NRAS Q61R位点在1ng/μL浓度下均可稳定检出，KRAS G12C、KRAS G12V和HRAS Q61R可在2.5ng/μL浓度下检出，而TERT C250T位点仅在5ng/μL浓度下稳定性较好。因此本试剂盒DNA突变检出限可设定为5ng/μL基因组DNA背景下1％突变。

在4种RNA融合中，PAX8-PPARG仅在500拷贝以上时检测稳定性较好，另外三种均可检测250拷贝阳性模板。因此对于本试剂盒RNA融合检出限可设定为500拷贝。

实施例4

甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒临床性能

参考相关文献、数据库及国内外诊疗指南等均提示对于细胞学无法明确诊断的甲状腺结节，推荐增加分子标记物检测来辅助诊断。特别是在乳头状癌中，主要基因变异形式包含了BRAF、RAS、RET/PTC、TERT、NTRK3和PPARG融合等，合计可覆盖甲癌总体分子事件的80％以上(见图14)。

基于本试剂盒所包含的8个基因共12个检测位点，选取144例已确认临床病理类型的甲状腺结节穿刺样品进行测试验证。所有穿刺样本使用组织细胞DNA/RNA提取试剂盒(离心柱法)提取基因组DNA和总RNA，用甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒进行检测，按实施例1和2中的说明进行操作。每块反应板同时检测临床样本和阳性对照品、空白对照品，根据检测结果(Ct值)和说明书判读标准分析每个样本的突变情况，并与患者临床病理结果进行比较，统计基因突变检测试剂盒的临床性能。

表17

突变类型	良性例数	恶性例数	总例数
				BRAF V600E	0	92	92
BRAF V600E/TERT C228T	0	1	1
				HRAS Q61R	0	1	1
KRAS Q61R	1	3	4
				NRAS Q61R	1	1	2
NRAS Q61R/TERT C228T	0	1	1
				TERT C228T	0	1	1
CCDC6-RET	0	2	2
				NCOA4-RET	0	3	3
ETV6-NTRK3	0	1	1
				未检出变异	28	8	36

根据以上结果分别统计得到，本试剂盒敏感度为93.0％，特异性为93.3％，阳性预测值98.1％，阴性预测值77.8％。试剂盒总符合率达到93.1％，适用于临床鉴别甲状腺结节良恶性的参考指标。

实施例5

甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒DNA聚合酶的选择

本试剂盒可检测覆盖BRAF、TERT、KRAS、NRAS、HRAS 5个基因共8个DNA突变位点。其中TERT靶点所在区域序列GC含量高，而RAS基因也存在序列同源性高的问题，使得相应检测位点的检测体系的优化有较大难度。

(1)TERT基因

针对TERT C228T与C250T位点，选取五家公司不同原料配制成PCR Mix搭配反应液对阴性模板和阳性模板进行检测，比较酶的扩增效率与特异性，不同反应体系配制方法见下表18。

表18

配制好PCR反应体系后，将反应板置于宏石SLAN-96S全自动医用PCR仪上机运行。

PCR反应条件：第一阶段：50℃15min，1个循环；第二阶段：95℃15min，1个循环；第三阶段：95℃15s，66℃40s，15个循环；第四阶段：95℃15s，60℃40s，35个循环。信号收集：第四阶段60℃时收集荧光信号。其中第一阶段用于防污染和逆转录；第二阶段用于预变性；第三、四阶段用于扩增。

结果如15A、15B所示。

在五种不同DNA聚合酶(或Mix)中，诺唯赞Ace Taq DNA聚合酶扩增效果(Ct值及曲线平台期高度)均表现最佳，同时野生型也未出现非特异性扩增信号，因此对于TERT基因C228T与C250T位点，选择使用诺唯赞Ace Taq DNA聚合酶。

(2)BRAF、KRAS、NRAS、HRAS基因

针对BRAF和RAS基因各位点，重点比较诺唯赞与天根两家生产商，配制成PCR Mix搭配反应液对阴阳性模板进行检测，比较酶的扩增效率与特异性，不同反应体系配制方法见下表19。

表19

配制好PCR反应体系后，将反应板置于ABI7500 PCR仪上机运行。

PCR反应条件：第一阶段：50℃15min，1个循环；第二阶段：95℃15min，1个循环；第三阶段：95℃15s，66℃40s，15个循环；第四阶段：95℃15s，60℃40s，35个循环。信号收集：第四阶段60℃时收集荧光信号。其中第一阶段用于防污染和逆转录；第二阶段用于预变性；第三、四阶段用于扩增。结果如下表20。

表20

对于BRAF V600E位点，阳性样本使用诺唯赞DNA聚合酶的Ct值远小于天根DNA聚合酶，且同时野生型均无非特异性扩增，故该位点可优选诺唯赞Ace Taq DNA聚合酶。

对于KRAS、NRAS和HRAS 5个突变位点，阳性样本使用诺唯赞DNA聚合酶的Ct值同样小于天根DNA聚合酶，表明其扩增效率更高。但野生型样本的非特异性扩增也比天根更严重，在保证阳性灵敏度的情况下优选特异性更好的体系。故对于RAS基因各位点，可优选天根Chemi Taq DNA聚合酶。

实施例6

甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒Blocker的设计

在试剂盒部分检测位点，常规方法设计的ARMS引物仍不足以较好的区分弱阳性与野生型样本。在此基础上，我们针对相应位点的野生型序列设计了Blocker来封闭ARMS引物的非特异性结合和扩增。

(1)TERT基因

TERT C228T位点的Blocker设计

针对检测位点的不同位置设计3条候选Blocker：(

为228位点野生型碱基)

体系中Blocker浓度分别设置450nM(1倍ARMS引物浓度)和1800nM(4倍ARMS引物浓度)两组进行比较，从阳性扩增效率与野生型特异性综合来看，Blocker B在450nM时效果最佳(如下图16A)。

针对TERT C250T位点设计Blocker：GGACCCGGGAGGGGTCGG-Spacer C3(SEQ IDNO.109)。

当检测体系中无Blocker时，野生型模板较容易出现非特异性扩增。依次添加900nM(2倍ARMS引物浓度)和2250nM(5倍ARMS引物浓度)浓度时，野生型非特异性扩增信号相比无Blocker有明显的降低。如图16B所示。

考虑到5倍浓度的Blocker同时对阳性模板的扩增也造成显著的抑制，最终选择2倍引物浓度的Blocker添加量。

(2)KRAS基因G12C

根据KRAS基因野生型序列设计两条Blocker：

其中Blocker A除3’-Spacer C3外，无其他修饰，检测位点位于3’端倒数第二位，长度为29个碱基。Blocker B除3’-Spacer C3外还包含序列中的4个锁核酸修饰(LNA)，且其中一个为检测位点。Blocker中的LNA碱基一方面增强其对野生型模板的结合特异性，同时在保持较高Tm值的情况下使序列长度缩短到16个碱基，也可降低其与突变型模板发生错配的概率。

使用上述A、B两条KRAS G12C Blocker与G12C引物探针按下表配制5组反应液进行比较。

表21

上述反应液配合PCR Mix B分别同时检测1％突变型模板及野生型模板，结果如下表22。

表22

两种Blocker进行比较(反应液4与反应液5)，可以发现在同样浓度下使用LNA修饰的Blocker B特异性更好，一方面对临界阳性模板的Ct值无影响，同时完全抑制了野生型模板的扩增信号。

对于Blocker B不同浓度的比较来看，10倍于引物ARMS引物浓度的加入量可以使得野生型模板不与引物发生非特异性结合，降低Blocker浓度则会出现不同程度的扩增信号。

因此，对于KRAS G12C位点，在PCR体系中加入10倍引物浓度的LNA修饰Blocker可以抑制野生型模板的非特异性扩增，并不影响突变型模板与ARMS引物的结合(如图16C所示)。

实施例7

甲状腺结节良恶性判别的多基因联合检测试剂盒TERT C228T反应液中添加剂的优化

由于TERT C228T位点所在启动子区高GC含量的特点，PCR进行过程中模板链容易形成较为复杂的二级结构，影响引物、聚合酶的顺利结合和延伸。在反应体系中适量加入特定的PCR添加剂有助于打开模板链的复杂结构，消除变性温度对碱基的依赖性，同时还能提高DNA-蛋白复合物稳定性。

在TERT C228T位点添加剂的优化中，首先比较了不同浓度的甘油和甜菜碱对阳性模板扩增Ct值和曲线形态的影响，分组如下：

各组反应液对5％突变丰度及野生型模板检测结果如下表23。

表23

从各组Ct值可见，添加剂甘油和甜菜碱均为显著减小阳性模板Ct值，过高或过低的甜菜碱浓度反倒使Ct值变大。

从扩增曲线形态上比较(图17A)，除1.6M甜菜碱外，各组添加剂均有效提高扩增曲线平台期荧光强度，9组添加剂中终浓度1.0M甜菜碱效果最佳。

通过对较高浓度野生型(如50～100ng/μL基因组DNA)模板的大量重复测试，发现甜菜碱在改善TERT信号高度的同时，可能出现小概率的非特异随机扩增信号(图17B所示)。

在此基础上，通过进一步的筛选发现组合使用15mM四甲基氯化铵(TMAC)，在不影响临界阳性扩增的情况下可有效提高反应液对高浓度野生型模板的扩增特性(图17C所示)。

本发明涉及的序列信息如下：

SEQ ID NO:1～3

BRAF V600E上游引物

F1：AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA(SEQ ID NO:1)

F2：TGATTTTGGTCTAGCTACGGA(SEQ ID NO:2)

F3：AGGTGATTTTGGTCTAGCTACCGA(SEQ ID NO:3)

SEQ ID NO:4～6

BRAF V600E下游引物

R1：TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA(SEQ ID NO:4)

R2：GTGAATACTGGGAACTATGAAAATACTAT(SEQ ID NO:5)

R3：AAAATAGCCTCAATTCTTACCATCC(SEQ ID NO:6)

SEQ ID NO:7～9

BRAF V600E探针

P1：(FAM)CGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTG(TAMRA)(SEQ ID NO:7)

P2：(FAM)AAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATC(TAMRA)(SEQ ID NO:8)

P3：(FAM)AGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGT(TAMRA)(SEQ ID NO:9)

SEQ ID NO:10～12

TERT C228T上游引物

F1：TTCACCTTCCAGCTCCGC(SEQ ID NO:10)

F2：GTCCTGCCCCTTCACCTTC(SEQ ID NO:11)

F3：CACCCGTCCTGCCCCTTCACCTT(SEQ ID NO:12)

SEQ ID NO:13～15

TERT C228T下游引物

R1：GGCTGGGAGGGCCCGCAA(SEQ ID NO:13)

R2：GGCTGGGAGGGCCCGGTA(SEQ ID NO:14)

R3：GGCTGGGAGGGCCCGTAA(SEQ ID NO:15)

SEQ ID NO:16～18

TERT C228T探针

P1：(FAM)CCCCGTCCCGACCCCT(MGB)(SEQ ID NO:16)

P2：(FAM)CGCCTCCTCCGCGCGGACCC(TAMRA)(SEQ ID NO:17)

P3：(FAM)GGAGGAGGCGGAGCTGGAAGGT(TAMRA)(SEQ ID NO:18)

SEQ ID NO:19～21

TERT C250T上游引物

F1：TCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCT(SEQ ID NO:19)

F2：TGGCGGAGGGACTGG(SEQ ID NO:20)

F3：GGCTCCCAGTGGATTCG(SEQ ID NO:21)

SEQ ID NO:22～24

TERT C250T下游引物

R1：TGGGCCGGGGACCCTGA(SEQ ID NO:22)

R2：TGGGCCGGGGACCCAGA(SEQ ID NO:23)

R3：GGCCGGGGACCCAGA(SEQ ID NO:24)

SEQ ID NO:25～27

TERT C250T探针

P1：(FAM)CCCGCCCCGTCCCGACCC(MGB)(SEQ ID NO:25)

P2：(FAM)CACAGACGCCCAGGACC(MGB)(SEQ ID NO:26)

P3：(FAM)CACAGACGCCCAGGACCG(MGB)(SEQ ID NO:27)

SEQ ID NO:28～30

KRAS G12C上游引物

F1：AATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTT(SEQ ID NO:28)

F2：TGAATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT(SEQ ID NO:29)

F3：ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAT(SEQ ID NO:30)

SEQ ID NO:31～33

KRAS G12C下游引物

R1：AATGGTCCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO:31)

R2：TCGTCCACAAAATGATTCTG(SEQ ID NO:32)

R3：CAAAGAATGGTCCTGCACCAGT(SEQ ID NO:33)

SEQ ID NO:34～36

KRAS G12C探针

P1：(FAM)CAAGAGTGCCTTGACGATACAG(MGB)(SEQ ID NO:34)

P2：(FAM)TGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGA(TAMRA)(SEQ ID NO:35)

P3：(FAM)TGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAA(TAMRA)(SEQ ID NO:36)

SEQ ID NO:37～39

KRAS G12V上游引物

F1：CCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTC(SEQ ID NO:37)

F2：AAAGGTACTGGTGGAGTATTTGATA(SEQ ID NO:38)

F3：TTTGTATTAAAAGGTACTGGTGG(SEQ ID NO:39)

SEQ ID NO:40～42

KRAS G12V下游引物

R1：TCAAGGCACTCTTGCCTACGCGAA(SEQ ID NO:40)

R2：TATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCAAA(SEQ ID NO:41)

R3：TATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCTAA(SEQ ID NO:42)

SEQ ID NO:43～45

KRAS G12V探针

P1：(FAM)AGCTCCAA+CTACCACAA+GTTTATAT(MGB)(SEQ ID NO:43)

P2：(FAM)CTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTC(MGB)(SEQ ID NO:44)

P3：(FAM)GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAG(MGB)(SEQ ID NO:45)

SEQ ID NO:46～48

KRAS Q61R上游引物

F1：TGGCAAATACACAAAGAAAGCCCT(SEQ ID NO:46)

F2：ACCCACCTATAATGGTGAATATCTT(SEQ ID NO:47)

F3：CATGGCATTAGCAAAGACTCA(SEQ ID NO:48)

SEQ ID NO:49～51

KRAS Q61R下游引物

R1：ATATTCTCGACACAGCAGGGC+G(SEQ ID NO:49)

R2：ATTCTCGACACAGCAGGTC+G(SEQ ID NO:50)

R3：ATATTCTCGACACAGCAGGTGG(SEQ ID NO:51)

SEQ ID NO:52～54

KRAS Q61R探针

P1：(FAM)ACTGGTCCCTCATTGCACTGTACTCCT(MGB)(SEQ ID NO:52)

P2：(FAM)AGTACAGTGCAATGAGGGACCAGTA(MGB)(SEQ ID NO:53)

P3：(FAM)AGTCCTCATGTACTGGTCCCTCATT(MGB)(SEQ ID NO:54)

SEQ ID NO:55～57

NRAS Q61R上游引物

F1：ACATACTGGATACAGCTGGCC+G(SEQ ID NO:55)

F2：CATACTGGATACAGCTGGAC+G(SEQ ID NO:56)

F3：ACATACTGGATACAGCTGGGCG(SEQ ID NO:57)

SEQ ID NO:58～60

NRAS Q61R下游引物

R1：ATCCGCAAATGACTTGCTATTATTGAT(SEQ ID NO:58)

R2：AGAAAATAATGCTCCTAGTACCTG(SEQ ID NO:59)

R3：ATGGCAAATACACAGAGGAAG(SEQ ID NO:60)

SEQ ID NO:61～63

NRAS Q61R探针

P1：(FAM)AAGAGTACAGTGCCATGAGAGACCAATAC(TAMRA)(SEQ ID NO:61)

P2：(FAM)AGAAGAGTACAGTGCCATGAGAGACCAA(TAMRA)(SEQ ID NO:62)

P3：(FAM)AGTGCCATGAGAGACCAATACA(MGB)(SEQ ID NO:63)

SEQ ID NO:64～66

HRAS Q61R上游引物

F1：TGATGGCAAACACACACAGGA(SEQ ID NO:64)

F2：GACTTGGTGTTGTTGATGGC(SEQ ID NO:65)

F3：GGAAAGCGAGAGCTGGCTAC(SEQ ID NO:66)

SEQ ID NO:67～69

HRAS Q61R下游引物

R1：TGGATACCGCCGGTCG(SEQ ID NO:67)

R2：TGGATACCGCCGGCC+G(SEQ ID NO:68)

R3：TGGATACCGCCGGCGG(SEQ ID NO:69)

SEQ ID NO:70～72

HRAS Q61R探针

P1：(FAM)ACTGGTCCCGCATGGCGCTGTACTCCT(TAMRA)(SEQ ID NO:70)

P2：(FAM)TGGTCCCGCATGGCGCTGTA(TAMRA)(SEQ ID NO:71)

P3：(FAM)AGGAGTACAGCGCCATGCGG(TAMRA)(SEQ ID NO:72)

SEQ ID NO:73～75

CCDC6上游引物

F1：AACAAGGTGCTGAAGATAGAGCT(SEQ ID NO:73)

F2：GGAGACCTACAAACTGAAGTGCAAG(SEQ ID NO:74)

F3：GACCTACAAACTGAAGTGCA(SEQ ID NO:75)

SEQ ID NO:76～78

RET下游引物

R1：CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAGTT(SEQ ID NO:76)

R2：CCAAATTCGCCTTCTCCTAG(SEQ ID NO:77)

R3：GGCCGTTGCCTTGACCAC(SEQ ID NO:78)

SEQ ID NO:79～81

CCDC6-RET探针

P1：(FAM)AGTGGGAATTCCCTCGGAAGAACTTGGTTCTT(TAMRA)(SEQ ID NO:79)

P2：(FAM)AGCGTGACCATCGAGGATCCAAAG(TAMRA)(SEQ ID NO:80)

P3：(FAM)AATTCCCTCGGAAGAACTTGG(MGB)(SEQ ID NO:81)

SEQ ID NO:82～84

NCOA4上游引物

F1：GAGAAGAGAGGCTGTATCTCCAT(SEQ ID NO:82)

F2：CTTGGAGAACAGTCAGGAGGAT(SEQ ID NO:83)

F3：AGCTCCTTACATACCCAGCAC(SEQ ID NO:84)

SEQ ID NO:85～87

RET下游引物

R1：CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAGTT(SEQ ID NO:85)

R2：TTCCAAATTCGCCTTCTCCTAG(SEQ ID NO:86)

R3：CTTTCAGATGGAAGGCCGTTG(SEQ ID NO:87)

SEQ ID NO:88～89

NCOA4-RET探针

P1：(FAM)AACCAA+GTTCTTCCGAGG(MGB)(SEQ ID NO:88)

P2：(FAM)AATTCCCTCGGAAGAACTTGG(MGB)(SEQ ID NO:89)

SEQ ID NO:90～91

PAX8上游引物

F1：CTATGCCTCCTCTGCCATC(SEQ ID NO:90)

F2：CGGATACCCACCCCACAT(SEQ ID NO:91)

SEQ ID NO:92～93

PPARG下游引物

R1：CATTACGGAGAGATCCACG(SEQ ID NO:92)

R2：GAATGGCATCTCTGTGTCAACC(SEQ ID NO:93)

SEQ ID NO:94～95

PAX8-PPARG探针

P1：(FAM)ATGGTTGACACAGAGATGCCATTCTGGCCCA(MGB)(SEQ ID NO:94)

P2：(FAM)ACCAGCGGACAGGGCAGC(MGB)(SEQ ID NO:95)

SEQ ID NO:96～97

ETV6上游引物

F1：TCTATACACACACAGCCGGA(SEQ ID NO:96)

F2：AGCCGGAGGTCATACTGCAT(SEQ ID NO:97)

SEQ ID NO:98～99

NTRK3下游引物

R1：TGGTTGATGTGGTGCAGTG(SEQ ID NO:98)

R2：AGTGGGCTGGCTGAGTCCT(SEQ ID NO:99)

SEQ ID NO:100～101

ETV6-NTRK3探针

P1：(FAM)ATCAGTGGTGAGGAGGACTCAGCCAGCCCA(TAMRA)(SEQ ID NO:100)

P2：(FAM)CTCACCACTGATGACAGCCACG(MGB)(SEQ ID NO:101)

SEQ ID NO:102

ACTB上游引物

CTGGCATTGCCGACAGGA(SEQ ID NO:102)

SEQ ID NO:103

ACTB下游引物

CACGGAGTACTTGCGCTCAG(SEQ ID NO:103)

SEQ ID NO:104

ACTB探针

(VIC)CAGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACCCAGC(TAMRA)(SEQ ID NO:104)

SEQ ID NO:105

NONO上游引物

ATGGAAAGGCAGGCGAAGTCT(SEQ ID NO:105)

SEQ ID NO:106

NONO下游引物

CTATGGCAGGCAAAGCGCAC(SEQ ID NO:106)

SEQ ID NO:107

NONO探针

(VIC)TCCACGGAGTGGCATATTGTCCAGC(TAMRA)(SEQ ID NO:107)

SEQ ID NO:108

TERT C228T Blocker

GGCTGGGAGGGCCCGGAG(3’Spacer C3)(SEQ ID NO:108)

SEQ ID NO:109

TERT C250T Blocker

GGACCCGGGAGGGGTCGG(3’Spacer C3)(SEQ ID NO:109)

SEQ ID NO:110

KRAS G12C Blocker

TGGAGCT+G+GT+G+GCGTAG(3’Spacer C3)(SEQ ID NO:110)

SEQ ID NO:111

KRAS G12V Blocker

TATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCA(3’ddC)(SEQ ID NO:111)

SEQ ID NO:112

KRAS Q61R Blocker

GACACAGCA+GG+TC+AAGAGGA(3’Spacer C3)(SEQ ID NO:112)

SEQ ID NO:113

NRAS Q61R Blocker

AGCT+GG+AC+AA+GAA+GAGTAC(3’Spacer C3)(SEQ ID NO:113)

SEQ ID NO:114

HRAS Q61R Blocker

CGGCC+AG+GAGGAGTAC(3’Spacer C3)(SEQ ID NO:114)

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海睿璟生物科技有限公司

<120> 用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物、多基因联检试剂盒及应用

<160> 117

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aataggtgat tttggtctag ctacata 27

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgattttggt ctagctacgg a 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggtgatttt ggtctagcta ccga 24

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagttgagac cttcaatgac tttctagtaa 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgaatactg ggaactatga aaatactat 29

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaaatagcct caattcttac catcc 25

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgatggagtg ggtcccatca gtttgaacag ttg 33

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaatctcgat ggagtgggtc ccatc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtgggtccc atcagtttga acagt 25

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttcaccttcc agctccgc 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtcctgcccc ttcaccttc 19

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cacccgtcct gccccttcac ctt 23

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggctgggagg gcccgcaa 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggctgggagg gcccggta 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggctgggagg gcccgtaa 18

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccccgtcccg acccct 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgcctcctcc gcgcggaccc 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggaggaggcg gagctggaag gt 22

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tcctgcccct tcaccttcca gct 23

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tggcggaggg actgg 15

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggctcccagt ggattcg 17

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgggccgggg accctga 17

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgggccgggg acccaga 17

<210> 24

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggccggggac ccaga 15

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cccgccccgt cccgaccc 18

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cacagacgcc caggacc 17

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cacagacgcc caggaccg 18

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aataaacttg tggtagttgg aggtt 25

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgaataaact tgtggtagtt ggagttt 27

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ataaacttgt ggtagttgga gcat 24

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aatggtcctg caccagtaat atg 23

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tcgtccacaa aatgattctg 20

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

caaagaatgg tcctgcacca gt 22

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

caagagtgcc ttgacgatac ag 22

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tggcgtaggc aagagtgcct tga 23

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tgccttgacg atacagctaa ttcagaa 27

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ccttatgtgt gacatgttct aatatagtc 29

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aaaggtactg gtggagtatt tgata 25

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tttgtattaa aaggtactgg tgg 23

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

tcaaggcact cttgcctacg cgaa 24

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tatcgtcaag gcactcttgc ctacgcaaa 29

<210> 42

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tatcgtcaag gcactcttgc ctacgctaa 29

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

agctccaact accacaagtt tatat 25

<210> 44

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

ctaccacaag tttatattca gtcattttc 29

<210> 45

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gaaaatgact gaatataaac ttgtggtag 29

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tggcaaatac acaaagaaag ccct 24

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

acccacctat aatggtgaat atctt 25

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

catggcatta gcaaagactc a 21

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

atattctcga cacagcaggg cg 22

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

attctcgaca cagcaggtcg 20

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

atattctcga cacagcaggt gg 22

<210> 52

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

actggtccct cattgcactg tactcct 27

<210> 53

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

agtacagtgc aatgagggac cagta 25

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

agtcctcatg tactggtccc tcatt 25

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

acatactgga tacagctggc cg 22

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

catactggat acagctggac g 21

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

acatactgga tacagctggg cg 22

<210> 58

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

atccgcaaat gacttgctat tattgat 27

<210> 59

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

agaaaataat gctcctagta cctg 24

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

atggcaaata cacagaggaa g 21

<210> 61

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

aagagtacag tgccatgaga gaccaatac 29

<210> 62

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

agaagagtac agtgccatga gagaccaa 28

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

agtgccatga gagaccaata ca 22

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

tgatggcaaa cacacacagg a 21

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

gacttggtgt tgttgatggc 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

ggaaagcgag agctggctac 20

<210> 67

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

tggataccgc cggtcg 16

<210> 68

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

tggataccgc cggccg 16

<210> 69

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

tggataccgc cggcgg 16

<210> 70

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

actggtcccg catggcgctg tactcct 27

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

tggtcccgca tggcgctgta 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

aggagtacag cgccatgcgg 20

<210> 73

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

aacaaggtgc tgaagataga gct 23

<210> 74

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

ggagacctac aaactgaagt gcaag 25

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

gacctacaaa ctgaagtgca 20

<210> 76

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

ccaaattcgc cttctcctag agtt 24

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

ccaaattcgc cttctcctag 20

<210> 78

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

ggccgttgcc ttgaccac 18

<210> 79

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

agtgggaatt ccctcggaag aacttggttc tt 32

<210> 80

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

agcgtgacca tcgaggatcc aaag 24

<210> 81

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

aattccctcg gaagaacttg g 21

<210> 82

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

gagaagagag gctgtatctc cat 23

<210> 83

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

cttggagaac agtcaggagg at 22

<210> 84

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

agctccttac atacccagca c 21

<210> 85

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

ccaaattcgc cttctcctag agtt 24

<210> 86

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

ttccaaattc gccttctcct ag 22

<210> 87

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

ctttcagatg gaaggccgtt g 21

<210> 88

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

aaccaagttc ttccgagg 18

<210> 89

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

aattccctcg gaagaacttg g 21

<210> 90

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

ctatgcctcc tctgccatc 19

<210> 91

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

cggataccca ccccacat 18

<210> 92

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

cattacggag agatccacg 19

<210> 93

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

gaatggcatc tctgtgtcaa cc 22

<210> 94

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

atggttgaca cagagatgcc attctggccc a 31

<210> 95

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

accagcggac agggcagc 18

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

tctatacaca cacagccgga 20

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

agccggaggt catactgcat 20

<210> 98

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

tggttgatgt ggtgcagtg 19

<210> 99

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

agtgggctgg ctgagtcct 19

<210> 100

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

atcagtggtg aggaggactc agccagccca 30

<210> 101

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

ctcaccactg atgacagcca cg 22

<210> 102

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

ctggcattgc cgacagga 18

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

cacggagtac ttgcgctcag 20

<210> 104

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

cagaaggaga tcactgccct ggcacccagc 30

<210> 105

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

atggaaaggc aggcgaagtc t 21

<210> 106

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

ctatggcagg caaagcgcac 20

<210> 107

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

tccacggagt ggcatattgt ccagc 25

<210> 108

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

ggctgggagg gcccggag 18

<210> 109

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

ggacccggga ggggtcgg 18

<210> 110

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 110

tggagctggt ggcgtag 17

<210> 111

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 111

tatcgtcaag gcactcttgc ctacgcca 28

<210> 112

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 112

gacacagcag gtcaagagga 20

<210> 113

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

agctggacaa gaagagtac 19

<210> 114

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 114

cggccaggag gagtac 16

<210> 115

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 115

gggcccggag ggggctg 17

<210> 116

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 116

gggggctggg ccgggga 17

<210> 117

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 117

gaatataaac ttgtggtagt tggagctgg 29

Claims

1.用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物组，其特征在于，其包含8种DNA单碱基突变和4种基因融合中的至少一种；所述8种DNA单碱基突变选自BRAF基因V600E、TERT基因C228T/C250T、KRAS基因G12C/G12V/Q61R、NRAS基因Q61R、HRAS基因Q61R，所述4种基因融合选自CCDC6-RET(Exon1-Exon12)、NCOA4-RET(Exon8-Exon12)、PAX8-PPARG(Exon10-Exon2)、ETV6-NTRK3(Exon4-Exon14)。

2.如权利要求1所述的生物标志物组或其检测物在制备甲状腺结节良恶性判别产品中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述检测物为特异性检测引物和/或特异性检测探针。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，

所述特异性检测引物包括以下引物对A～J至少任一：

所述特异性检测探针包括以下探针A～J至少任一：

针对BRAF基因V600E的探针A，其序列如SEQ ID NO：7～9任一所示；

针对KRAS基因G12C的探针D，其序列如SEQ ID NO：34～36任一所示；

针对KRAS基因G12V的探针E，其序列如SEQ ID NO：43～45任一所示；

针对KRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：52～54任一所示；

针对NRAS基因Q61R的探针G，其序列如SEQ ID NO：61～63任一所示；

针对HRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：70～72任一所示；

5.一种检测物，其特征在于，所述检测物为特异性检测引物和/或特异性检测探针；

所述特异性检测引物包括以下引物对A～J至少任一：

所述特异性检测探针包括以下探针A～J至少任一：

针对BRAF基因V600E的探针A，其序列如SEQ ID NO：7～9任一所示；

针对KRAS基因G12C的探针D，其序列如SEQ ID NO：34～36任一所示；

针对KRAS基因G12V的探针E，其序列如SEQ ID NO：43～45任一所示；

针对KRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：52～54任一所示；

针对NRAS基因Q61R的探针G，其序列如SEQ ID NO：61～63任一所示；

针对HRAS基因Q61R的探针F，其序列如SEQ ID NO：70～72任一所示；

6.一种甲状腺结节良恶性判别的诊断产品，其特征在于，所述产品包括如权利要求5所述的检测物；优选地，所述诊断产品为试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列、组合物或检测系统之任一。

7.如权利要求6所述的诊断产品，其特征在于，所述产品采用RT-PCR方法检测如权利要求1所述的生物标志物组；和/或，所述产品还包括模板，PCR Mix，内参基因和阳性对照。

8.如权利要求7所述的甲状腺结节良恶性判别产品，其特征在于，包括以下至少任一项：

1)用于单碱基突变检测的内参基因为ACTB；

2)用于BRAF、TERT基因突变检测的PCR Mix为PCR Mix A，所述PCR Mix A包括热启动DNA聚合酶、UDG酶、dNTPs、dUTP、Mg²⁺和缓冲液；优选地，所述热启动DNA聚合酶为Ace TaqDNA聚合酶；

3)用于KRAS、NRAS、HRAS基因突变检测的PCR Mix为PCR Mix B，所述PCR Mix B包括热启动DNA聚合酶、UDG酶、dNTPs、dUTP、Mg²⁺和缓冲液；优选地，所述热启动DNA聚合酶为ChemiTaq DNA聚合酶；

4)用于基因融合检测的内参基因为NONO；

5)用于基因融合检测的PCR Mix为PCR Mix C，所述PCR Mix C组分包括RNA融合检测反应所需的dNTPs、dUTP、Mg²⁺和缓冲液；

6)用于基因融合检测的产品还包括RT混合酶，所述RT混合酶包括DNA聚合酶、UDG酶、逆转录酶和RNase抑制剂。

9.如权利要求8所述的诊断产品，其特征在于，包括以下至少任一项：

1)用于任一突变检测或基因融合检测的反应体系是独立的；

2)用于TERT、KRAS、NRAS、HRAS基因突变检测的反应体系中还包括用于结合野生型模板的Blocker；优选地，所述Blocker 3’端添加Spacer-C3或ddC修饰；用于KRAS、NRAS和HRAS基因检测的Blocker还包含锁核酸修饰，优选地，所述锁核酸修饰的数量可以是2～5个碱基；

3)用于单碱基突变检测的上下游引物浓度分别为250-350nM，探针浓度为150-250nM；

4)用于单碱基突变检测的内参基因上下游引物浓度分别为250-350nM，探针浓度为150-250nM；

5)用于基因融合检测的上下游引物浓度分别为550-650nM，探针浓度为350-450nM；

6)用于基因融合检测的内参基因上下游引物浓度分别为400-500nM，探针浓度为250-350nM；

7)用于任一突变检测或基因融合检测的反应体系中还包括添加剂；优选地，所述添加剂选自甘油和/或甜菜碱。

10.如权利要求9所述的诊断产品，其特征在于，包括以下任一项：

1)用于TERT C228T位点检测的Blocker选自SEQ ID NO.108、115、116至少任一；优选地，为SEQ ID NO.108；

2)用于TERT C228T位点检测的Blocker的浓度为300-600nM；优选地，为450nM；

3)用于TERT C250T位点检测的Blocker为SEQ ID NO.109；

4)用于TERT C250T位点检测的Blocker的浓度为800-1000nM；优选地，为900nM；

5)用于KRAS基因G12C位点检测的Blocker选自SEQ ID NO.110、117至少任一；优选地，SEQ ID NO.110，其中，除3’-Spacer C3外还包含序列中的4个锁核酸修饰，且其中一个为检测位点；

6)用于KRAS基因G12C位点检测的Blocker的浓度为1500-4500nM；优选地，为3000nM；

7)所述甘油占反应体系中体积百分比为1-10％；优选地，为2-8％；

8)所述甜菜碱在反应体系中的终浓度为0.4-1.6M；优选地，为0.8-1.0M。

11.如权利要求7-10任一项所述的甲状腺结节良恶性判别产品的非诊断目的的使用方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)收集待检样本，提取基因组DNA和总RNA；

(2)配制反应体系

(3)进行RT-qPCR扩增反应和信号收集；

(4)对结果进行分析，根据Ct值判断待测样本为阴性或阳性。

12.如权利要求11所述的使用方法，其特征在于，阳性结果的判读标准为：BRAF V600E：Ct≤30；TERT C228T：Ct≤30；TERT C250T：Ct≤26；KRAS G12C：Ct≤28；KRAS G12V：Ct≤29；KRAS Q61R：Ct≤30；NRAS Q61R：Ct≤26；HRAS Q61R：Ct≤28；CCDC6-RET：Ct≤25；NCOA4-RET：Ct≤15；PAX8-PPARG：Ct≤26；ETV6-NTRK3：Ct≤25至少满足其一；和/或，阴性结果的判读标准为：BRAF V600E：Ct＞32；TERT C228T：Ct＞32；TERT C250T：Ct＞28；KRAS G12C：Ct＞30；KRAS G12V：Ct＞30；KRAS Q61R：Ct＞32；NRAS Q61R：Ct＞28；HRAS Q61R：Ct＞30；CCDC6-RET：Ct＞28；NCOA4-RET：Ct＞17；PAX8-PPARG：Ct＞30；ETV6-NTRK3：Ct＞30。