CN114634987A - 一种检测braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其使用方法和应用 - Google Patents

一种检测braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其使用方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其使用方法和应用，属于基因检测技术领域。这种引物探针组合物包括检测BRAF基因突变位点c.1919A＞C的实时荧光PCR引物和检测探针，实时荧光PCR引物包括SEQ ID No.1～2所示的氨基酸序列；检测探针包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。这种试剂盒能够快速、准确的体外检测人全血样本中BRAF基因NM_001374258.1转录本上的c.1919T>A致病变异。检测结果可用于甲状腺乳头状癌、结直肠癌、黑色素瘤的辅助诊断。

Description

一种检测BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其使用 方法和应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其使用方法和应用。
背景技术
BRAF错义变异发生于近8％人类肿瘤中，主要发生于甲状腺乳头状癌、结直肠癌和黑色素瘤中。
甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，是危害女性健康的十大癌种之一。因此，给社会、家庭和个人带来的负担正在不断加重。
目前，甲状腺细针穿刺活检术(fine needle aspiration biopsy，FNAB)被认为是鉴别良恶性甲状腺结节的最精确检查。研究表明，行FNAB后经细胞病理学检查，其中5％为恶性，60％～70％为良性，10％～30％为不确定或可疑恶性，对这些不确定或可疑恶性病例进行术后病理检查，发现仅20％～25％为甲状腺癌，故有75％～80％的患者接受不必要的手术。因此，如何正确处理FNAB无法鉴别的病例，是目前临床医师面临的困难。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷，提供一种检测BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其使用方法和应用。这种试剂盒能够快速、准确的体外检测人全血样本中BRAF基因NM_001374258.1转录本上的c.1919T>A致病变异。检测结果用于甲状腺乳头状癌、结直肠癌、黑色素瘤的辅助诊断。
本发明通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供一种检测BRAF基因突变的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括检测BRAF基因突变位点c.1919A＞C的实时荧光PCR引物和检测探针。
这种引物探针组合物可以特异性的检测BRAF:NM_001374258.1:exon15: c.1919T>A:p.Val640Glu位点突变，即检测人全血样本中BRAF基因 NM_001374258.1转录本上的c.1919T>A致病变异，该变异的致病性明确。
实时荧光PCR引物包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列；
所述检测探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
具体地，该引物探针组合物的序列如下：
BRAF 引物序列(5'--3') 序号
Mut-F TGGATCCAGACAACTGTTCAAACT SEQ ID No.1
Mut-R TGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGAT SEQ ID No.2
Mut-P 报告基团-CATCGAGATTTCTCT-淬灭基团 SEQ ID No.3
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述探针为Taqman探针，所述 Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
所述荧光报告基团包括FAM、Cy5、ROX、VIC和NED中的任一种；所述荧光淬灭基团包括MGB、NFQ、QSY、MGB和BHQ1中的任一种。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述荧光报告基团为VIC；所述荧光淬灭基团为MGB。
第二方面，本发明提供一种检测BRAF基因突变的试剂盒，试剂盒包括上述引物探针组合物。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，试剂盒还包括针对人类CFTR基因保守序列特异性的内参引物和内参探针；
优选地，所述CFTR基因保守序列为CFTR chr7:117252809-117252824。
内参引物包括SEQ ID No.4～5所示的的核苷酸序列；
内参探针包括SEQ ID No.6所示的的核苷酸序列。
具体地，该引物探针组合物的序列如下：
CFTR 引物序列(5'--3') 序号
Ctrl-F GAATGGACCCAGGACAGATATAG SEQ ID No.4
Ctrl-R AGCAGGCATTTGCTGGAGTTAC SEQ ID No.5
Ctrl-P 报告基团-CAGCTGACTCTCTTGTG–淬灭基团 SEQ ID No.6
优选地，试剂盒中BRAF引物浓度为20μM，探针浓度为20μM；内参CFTR 引物浓度为10μM，探针浓度为20μM。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述内参探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
所述内参探针的荧光报告基团与所述检测探针的荧光报告基团不同；
优选地，所述内参探针的荧光报告基团为NED，所述内参探针的荧光淬灭基团为MGB。
优选地，在本发明较佳的实施例中，上述试剂盒还包括PCR反应液和/或染料；
优选地，PCR反应液包括Taq酶、UNG酶、Mg2+缓冲液、dNTPs；
优选地，染料包括ROX矫正染料。
第三方面，本发明提供一种上述试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，其包括：
提取待测样本的基因组，使用所述试剂盒对所述待测样本的基因组进行扩增，检测荧光信号，将荧光信号的阈值限设置为0.15，分析Ct值。
进一步地，在荧光信号的阈值限设置为0.15后，当VIC信号为Undetermined 时，表明待测样本未发生含量1％以上的BRAF NM_001374258.1c.1919T>A突变；当检出VIC信号时，表明待测样本发生含量1％以上的BRAF NM_001374258.1c.1919T>A突变；且当突变型的BRAF基因模板浓度越大时， VIC通道信号更强。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述扩增的程序包括：
预变性：95℃、30sec，1个循环；
循环扩增：95℃、10sec，60℃、30sec；
所述循环扩增的次数为45次。
第四方面，本发明提供一种上述试剂盒在制备BRAF基因突变相关的癌症诊断试剂中的应用。
如前所述，BRAF错义变异发生于近8％人类肿瘤中，因此，能够快速、特异性的检测BRAF基因突变的试剂盒，可以应用到相关癌症诊断试剂中，有助于癌症的早期筛查。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述癌症包括甲状腺乳头状癌、结直肠癌和黑色素瘤。
BRAF错义变异的致病性明确：乳头状甲状腺癌患者中有40％～70％患者可检测到该变异，而良性结节中几乎不存在；该变异与结直肠癌的临床特征如右侧位置、分化差、腹膜转移等相关，携带该变异的结直肠癌患者可考虑 FOLFOXIRI(联合贝伐珠单抗)的一线治疗；我国黑色素瘤BRAF变异率也达到了25.9％。因此，能够检测BRAF基因突变的试剂盒可用到上述三种癌症的诊断治疗中。
与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
本发明提供的试剂盒，使用人基因组DNA溶液作为模板；反应体系的探针 /引物经过优化，等位基因之间的扩增效率差异达到最大化，使实验人员可以方便准确的解读结果；相较于Sanger测序、NGS等其他检测手段，荧光定量PCR 的成本低，耗时短，准确性得到公认，适合在临床大规模推广应用。
说明书附图
图1为现有技术中ARMS-qPCR扩增程序的示意图；
图2为本发明实施例2中扩增程序的示意图；
图3为本发明实施例2中样本为野生型人基因组DNA的荧光定量PCR检测结果；
图4为本发明实施例2中样本为1％突变型的质粒DNA的荧光定量PCR检测结果；
图5为本发明实施例2中样本为5％突变型的质粒DNA的荧光定量PCR检测结果；
图6为本发明实施例2中样本为10％突变型的质粒DNA的荧光定量PCR 检测结果；
图7为本发明实施例2中样本为50％突变型的质粒DNA的荧光定量PCR 检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
随着分子生物学技术的发展，应用分子标志物对甲状腺癌进行鉴别诊断，能显著提高早期诊断水平，对甲状腺癌的诊断、治疗及预后分析有重要的临床意义。乳头状甲状腺癌患者中有40％～70％患者可检测到BRAF V600E基因变异，这一比例在老年患者中更高，而在良性结节中几乎不存在，因此认为BRAF 变异对甲状腺癌是特异性较高的诊断标志之一。在COSMIC数据库中PTC的 BRAF变异比例为54％，不同研究发现的BRAF在PTC中的变异频率有所差异。在中国，有研究报道BRAF V600E在PTC中的变异比例为75.4％，也有研究发现PTC中BRAF变异阳性的比例为51.6％，还有研究在不同的PTC 亚型中发现BRAF变异比例存在差别，如TCV中BRAF变异的比例为 85.2％，嗜酸细胞亚型中的比例为77.3％，经典型中的比例为66.0％，滤泡亚型中的比例为18.2％。BRAF V600E变异导致BRAF激酶持续激活，并使其MAPK 下游传导通路高表达，从而导致细胞过度增殖、分化，最终导致甲状腺细胞的恶性转化。该基因的变异表达增高与PTC侵袭性、复发、淋巴结转移、远处转移及病死率增高密切相关。BRAF激活的乳头状甲状腺癌临床预后不佳，因为 BRAF基因变异生成的BRAF肿瘤蛋白可抑制钠-碘膜转运体，从而影响了放射性碘治疗的疗效。BRAF变异被认为是影响甲状腺癌，特别是PTC发生、发展的重要遗传学事件。
多数病人发现时已属于中晚期。活检明确病变性质是结直肠癌治疗的依据。确定为复发或转移性结直肠癌时，推荐检测肿瘤组织K-ras及N-ras基因、 BRAF基因、错配修复蛋白表达或微卫星状态及其他相关基因状态以指导进一步治疗。CRC中BRAF基因变异率约为4.7％～20％，BRAF基因变异与临床特征有关，如右侧位置、分化差、腹膜转移等。
恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一。
由此可见，BRAF错义变异的致病性明确，能够检测BRAF基因突变的试剂盒可用到甲状腺乳头状癌、结直肠癌和黑色素瘤的诊断治疗中。
现有技术中对体细胞BRAF V600E变异的检测方法主要为ARMS-qPCR， ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大。与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，以达到高灵敏度、特异性，适于检测体细胞中的低丰度变异。ARMS-qPCR扩增程序一般分为3个阶段(如图1所示)，结果判读一般需要判断Ct值具体范围，较为繁琐复杂。
本发明采用的MGB探针qPCR检测方法，是目前临床最常用的SNP检测方法，利用特异探针对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，经过合适的引物探针设计，能够达到ARMS-qPCR同等高灵敏度、特异性，且实验操作、上机程序(仅2步，如图2所示)和结果判读(信号有或无)更简单，更适合在临床检验实验室推广使用。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
荧光定量PCR试剂盒的开发：
本发明针对BRAF基因NM_001374258.1转录本上的c.1919T>A致病变异位点进行引物探针设计，保证该引物探针只能特异性的识别BRAF c.1919T>A 突变位点。
相比于传统MGB探针qPCR，本发明中引物和MGB探针的独特序列能使本检测达到ARMS-qPCR同样的高灵敏度、特异性。
同时，本实例中以人CFTR基因作为内参基因，设计特异引物和探针。
a)BRAF V600E变异扩增引物、探针如下所示：
BRAF 引物序列(5'--3') 序号
Mut-F TGGATCCAGACAACTGTTCAAACT SEQ ID No.1
Mut-R TGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGAT SEQ ID No.2
Mut-P 报告基团-CATCGAGATTTCTCT-淬灭基团 SEQ ID No.3
b)内参人CFTR基因(保守区域)扩增引物、探针如下表所示：
CFTR 引物序列(5'--3') 序号
Ctrl-F GAATGGACCCAGGACAGATATAG SEQ ID No.4
Ctrl-R AGCAGGCATTTGCTGGAGTTAC SEQ ID No.5
Ctrl-P 报告基团-CAGCTGACTCTCTTGTG–淬灭基团 SEQ ID No.6
荧光定量PCR试剂盒包括：
(1)引物探针组：试剂盒中BRAF引物浓度为20μM，探针浓度为20μM；内参CFTR引物浓度为10μM，探针浓度为20μM。
(2)一步法扩增反应液：购自南京诺唯赞生物科技有限公司(货号：Q811)，该反应体系包括Taq酶、UNG酶、PCR缓冲液、dNTPs和各种PCR扩增反应液所需离子。
(3)阴性对照品(RNase-free ddH2O)。
试剂盒保存于-20℃。
实施例2
BRAF基因突变的荧光定量PCR检测方法
本实施例提供一种实施例1中试剂盒的使用方法，即BRAF基因突变的荧光定量PCR检测方法，分别以野生型的DNA以及1～50％突变型的DNA作为模板，按下述体系进行荧光定量PCR扩增。
1)试剂配制：
组分 体积μL 终浓度(nM)
Mut-F(20μM) 0.9 450
Mut-R(20μM) 0.9 450
Mut-P(20μM) 0.2 100
Ctrl-F(10μM) 0.9 900
Ctrl-R(10μM) 0.9 900
Ctrl-P(20μM) 0.1 200
qPCR反应缓冲液 10 -
模板DNA溶液(10ng/μL) 2 -
RNase-free ddH2O 4.1 -
Total volume 20 -
其中，qPCR反应缓冲液中含有Taq酶、PCR缓冲液、dNTPs。
2)扩增程序：
Figure RE-GDA0003652488640000101
3)实验结果：
①当使用野生型DNA作为模板时：
Figure RE-GDA0003652488640000102
上表中样本为野生型人基因组DNA，VIC和NED信号的阈值线均设置为 0.15。由上表可知，NED信号的平均Ct值为28.11，VIC信号为Undetermined。结果如图3所示，NED通道出现明显的扩增曲线，VIC通道无明显扩增曲线。
②当使用1％突变型的DNA作为模板时：
Figure RE-GDA0003652488640000103
上表中样本为1％突变型的质粒DNA，VIC和NED信号的阈值线均设置为 0.15。由上表可知，NED信号的平均Ct值为24.19，VIC信号的平均Ct值为34.53。结果如图4所示，NED和VIC通道均出现扩增曲线。
③当使用5％突变型的DNA作为模板时：
Figure RE-GDA0003652488640000104
上表中样本为5％突变型的质粒DNA，VIC和NED信号的阈值线均设置为 0.15。由上表可知，NED信号的平均Ct值为24.24，VIC信号的平均Ct值为29.94。结果如图5所示，NED和VIC通道均出现扩增曲线，且VIC通道的信号比②增强。
④当使用10％突变型的DNA作为模板时：
Figure RE-GDA0003652488640000111
上表中样本为10％突变型的质粒DNA，VIC和NED信号的阈值线均设置为0.15。由上表可知，NED信号的平均Ct值为24.27，VIC信号的平均Ct值为 27.84。结果如图6所示，NED和VIC通道均出现扩增曲线，且VIC通道的信号比③增强。
⑤当使用50％突变型的DNA作为模板时：
Figure RE-GDA0003652488640000112
上表中样本为50％突变型的质粒DNA，VIC和NED信号的阈值线均设置为0.15。由上表可知，NED信号的平均Ct值为24.65，VIC信号的平均Ct值为 22.18。结果如图7所示，NED和VIC通道均出现扩增曲线，且VIC通道的信号比④增强。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京积水潭医院、北京华诺奥美基因生物科技有限公司
<120> 一种检测BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其使用方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggatccaga caactgttca aact 24
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgaagacctc acagtaaaaa taggtgat 28
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catcgagatt tctct 15
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaatggaccc aggacagata tag 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcaggcatt tgctggagtt ac 22
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagctgactc tcttgtg 17

Claims (10)

1.一种检测BRAF基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括检测BRAF基因突变位点c.1919A＞C的实时荧光PCR引物和检测探针；
所述实时荧光PCR引物包括SEQ ID No.1～2所示的氨基酸序列；
所述检测探针包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述检测BRAF基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述探针为Taqman探针，所述Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
所述荧光报告基团包括FAM、Cy5、ROX、VIC和NED中的任一种；所述荧光淬灭基团包括MGB、NFQ、QSY、MGB和BHQ1中的任一种。
3.根据权利要求2所述检测BRAF基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光报告基团为VIC；所述荧光淬灭基团为MGB。
4.一种检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的引物探针组合物。
5.根据权利要求4所述的检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对人类CFTR基因保守序列特异性的内参引物和内参探针；
所述内参引物包括SEQ ID No.4～5所示的的核苷酸序列；所述内参探针包括SEQ IDNo.6所示的的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述内参探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
所述内参探针的荧光报告基团与所述检测探针的荧光报告基团不同；
优选地，所述内参探针的荧光报告基团为NED，所述内参探针的荧光淬灭基团为MGB。
7.一种根据权利要求4～6任一项所述的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，其包括：
提取待测样本的基因组，使用所述试剂盒对所述待测样本的基因组进行扩增，检测荧光信号，将荧光信号的阈值限设置为0.15，分析Ct值。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述扩增的程序包括：
预变性：95℃、30sec，1个循环；
循环扩增：95℃、10sec，60℃、30sec；
所述循环扩增的次数为45次。
9.一种根据权利要求4～6任一项所述的试剂盒在制备BRAF基因突变相关的癌症诊断试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症包括甲状腺乳头状癌、结直肠癌和黑色素瘤。
CN202210426209.9A 2022-04-21 2022-04-21 一种检测braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其使用方法和应用 Pending CN114634987A (zh)

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