CN111304329A - 一种检测braf基因v600e位点突变的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测BRAF基因V600E位点突变的试剂盒，属于生物技术领域。该试剂盒包括检测BRAF基因V600E位点突变的锁核酸探针和检测BRAF基因V600E位点突变的引物对。其中，锁核酸探针的核苷酸序列包括野生型荧光探针如序列表SEQ ID No.1所示和突变型荧光探针如序列表SEQ ID No.2所示；引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。该试剂盒还包括反应预混液、阳性标准品和阴性标准品。本发明提供的试剂盒可检测BRAF基因V600E位点突变，样品需求量少，灵敏度和特异性高，检测效率也有所提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测BRAF基因V600E位点的试剂盒。
背景技术
BRAF基因编码一种丝氨酸/苏氨酸特异性激酶，是MAPK信号通路的重要转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等。BRAF基因突变在肿瘤患者中首先发现于2002年，最常见的突变是第15号外显子上的V600E突变。V600E突变可发生于多种肿瘤，如黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌以及肺癌等。研究表明，BRAFV600E突变预示Ⅱ期和Ⅲ期结肠癌患者预后不良。NCCN指南推荐的Lynch综合征的检测策略中，推荐在DNA错配修复蛋白缺失的病例中进行BRAF基因突变检测。BRAF是甲状腺乳头状癌最为常见的基因突变，BRAFV600E突变可用于甲状腺乳头状癌的鉴别诊断。更重要的是，Ⅰ期和Ⅱ期临床试验证明携带BRAFV600E突变的黑色素瘤患者对BRAF激酶抑制剂威罗菲尼的响应效率超过50％，6个月总体生存期为84％。因此，BRAF基因突变检测已成为多种肿瘤临床诊治必需的检测项目。
近年来以血液、肿瘤等为样本基础的活检技术飞速发展。研究表明，当肿瘤组织难以获取时，无创、易采集的血液检测是组织基因突变分析合适的替代选择，并且血液检测在一定程度上能有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测等，广泛应用于肺癌早筛和治疗中耐药性的监测。
对样本进行BRAF基因V600E位点突变的检测方法主要有测序、荧光定量PCR和数字PCR。测序要求步骤较多，时间长，而且需要昂贵的机器以及专业软件分析，无法满足临床上的日常监控需求，且无法达到绝对定量的水平。荧光定量PCR依赖于扩增曲线的循环阈值，只能进行相对定量。而数字PCR不依赖于扩增曲线的循环阈值进行定量，不受扩增效率的影响，也不受管家基因和标准曲线的限制，可以实现绝对定量。
比如，中国专利CN108823311A公开了一种检测BRAF基因突变的检测体系及其试剂盒，该专利提供的试剂盒所需检测样品量少，可以快速便捷进行PCR定量检测；但是经过肽核酸修饰的探针易导致自身序列的堆积或折叠，干扰PCR产物的形成，从而影响检测灵敏度和准确度。
再如，中国专利CN107488727A公开了一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法，该试剂盒能够检测BRAF基因多个位点的突变，能够识别的突变比例为0.2％；但是由于血液中游离DNA含量极低，其中突变相关游离DNA含量更少，此试剂盒的灵敏度较低。
因此，亟需一种高灵敏度的BRAF基因突变的检测试剂盒。
发明内容
针对目前BRAF基因突变的检测试剂盒灵敏度较低的问题，本发明针对BRAF基因的V600E位点设计了特定序列的引物对和探针，在优化的反应体系中通过数字PCR平台的方法，实现对BRAF基因的V600E位点突变的高灵敏度检测。本发明提供的试剂盒可检测的样本来源多样，包括肿瘤、血液、唾液中核酸，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围。
本发明提供了一种检测BRAF基因V600E位点突变的试剂盒，所述的试剂盒检测BRAF基因V600E位点突变的锁核酸探针和检测BRAF基因V600E位点突变的引物对；
所述的锁核酸探针的核苷酸序列包括野生型荧光探针和突变型荧光探针。
其中，所述的野生型荧光探针的核苷酸序列为5’-CATCGAGATTTCACTGTAGC-3’，如序列表SEQ ID No.1所示；所述的野生型荧光探针的5’端第4位和13位碱基位锁核酸修饰碱基；所述的野生型荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM、3’端连接有淬灭基团BHQ1。
其中，所述的突变型荧光探针的核苷酸序列为5’-CATCGAGATTTCTCTGTAGC-3’，如序列表SEQ ID No.2所示；所述的突变型荧光探针的5’端第4位和13位碱基位锁核酸修饰碱基；所述的突变型荧光探针的5’端连接有荧光报告基团CY3、3’端连接有淬灭基团BHQ2。
进一步地，所述的引物对包括上游引物和下游引物。
进一步地，所述的上游引物的核苷酸序列为5’-TCATGAAGACCTCACAGTAAA-3’，如序列表中SEQIDNo.3所示；所述的下游引物的核苷酸序列为5’-ACTGTTCAAACTGATGGGA-3’，如序列表中SEQIDNo.4所示。
进一步地，所述的试剂盒还包括反应预混液。所述的反应预混液包括：dNTP、镁离子和热启动Taq酶。
进一步地，所述的反应预混液还包括扩增增强剂；所述的扩增增强剂包括：焦磷酸酶、TritonX-100和BSA；所述的焦磷酸酶在反应预混液中的终浓度为0.5-2U，所述的TritonX-10在反应预混液中的终浓度为0.1％-0.4％；所述的BSA在反应预混液中的终浓度为5-15μg/μL。
进一步地，所述的试剂盒还包括阳性标准品和阴性标准品。
其中，所述的阳性标准品为含V600E位点突变型BRAF基因的标准质粒溶液；所述的阴性标准品为含相应野生型基因序列的质粒。
进一步地，所述的试剂盒的检测样本为血液、肿瘤和唾液样本中的一种或几种。
进一步地，所述的试剂盒可利用数字PCR检测BRAF基因V600E位点突变。
本发明的有益效果：
1.本发明提供的锁核酸探针特异性高，能够达到探针和靶序列特异性结合的目的；
2.本发明基于数字PCR平台，对BRAF突变基因进行绝对定量检测；
3.本发明提供的试剂盒对检测体系进行了优化，野生型和突变型探针分别使用不同的荧光报告基团和荧光淬灭基团，在保证反应高效准确的前提下极大提高了芯片进孔效率，使用热启动的DNA聚合酶，降低反应假阳性
4.本发明提供的试剂盒在BRAF突变基因含量极低的样本检测中，灵敏度为1:3000，能够对更低突变丰度的样本进行检测。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，本发明中使用的数字PCR仪为专利CN201911061352.7中的核酸扩增仪。
实施例1设计与合成用于检测BRAF基因V600E位点突变的探针、引物
根据BRAF基因第15号外显子上的V600E位点突变，设计并合成本发明基于数字PCR技术用于检测BRAF基因V600E位点突变的锁核酸探针和引物对。
所述的锁核酸探针的核苷酸序列包括野生型荧光探针和突变型荧光探针。
其中，所述的野生型荧光探针的核苷酸序列为5’-CATCGAGATTTCACTGTAGC-3’，如序列表SEQ ID No.1所示；所述的野生型荧光探针的5’端第4位和13位碱基位锁核酸修饰碱基；所述的野生型荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM、3’端连接有淬灭基团BHQ1。
其中，所述的突变型荧光探针的核苷酸序列为5’-CATCGAGATTTCTCTGTAGC-3’，如序列表SEQ ID No.2所示；所述的突变型荧光探针的5’端第4位和13位碱基位锁核酸修饰碱基；所述的突变型荧光探针的5’端连接有荧光报告基团CY3、3’端连接有淬灭基团BHQ2。
所述的引物对包括上游引物和下游引物。
其中，所述的上游引物的核苷酸序列为5’-TCATGAAGACCTCACAGTAAA-3’，如序列表中SEQIDNo.3所示；
其中，所述的下游引物的核苷酸序列为5’-ACTGTTCAAACTGATGGGA-3’，如序列表中SEQIDNo.4所示。
引物对和锁核酸探针的合成均由上海生工公司进行合成，使用HPLC级纯化。使用前用TE缓冲液稀释至10μM。
实施例2检测BRAF基因V600E位点突变的方法
包括以下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA；
(2)反应预混液制备：由dNTP、镁离子和热启动Taq酶等组成的PCR Mix购自美国New England Biolabs公司，根据反应所需的量加入终浓度为1U的焦磷酸酶、终浓度为0.1％的Triton-X-100、终浓度为5μg/μL的BSA，混合得到反应预混液；焦磷酸酶购自美国New England Biolabs公司，Triton-X-100和购自BSA购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司(Sigma)；
(3)按照表1所述的20μL反应体系依次加入各组分，配制待检样品，上样到数字PCR芯片上，形成微反应单元。将芯片放入数字PCR仪中，按照表2所示的PCR反应条件进行PCR反应，选择FAM和CY3作为检测荧光的检测通道。
表1 BRAF基因V600E位点突变的PCR反应体系
表2 PCR反应条件
实施例3突变标准品的检测
本发明所使用的阳性质控品为含V600E位点突变型BRAF基因的标准质粒溶液；阴性质控品为含相应野生型基因序列的质粒。
制备方式为：分别进行合成含V600E位点突变的BRAF基因序列与野生型基因序列DNA，分别插入到质粒载体pET-23d(+)(购自Promega)。使用Qubit3.0进行定量，计算两种类型质粒的拷贝数浓度。按照V600E位点突变基因组DNA：野生型基因组DNA比例为1:10、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:2000和1:3000进行混合，再将所得混合质粒打断为接近的180bp的片段化DNA。
按照上述方法获得的8个突变标准品，用实施例2中的方法进行检测，实验重复3次。实验结果如表3所示。
表3标准品的检测结果
稳定性是三次重复实验结果的标准差比均值得到的百分数，稳定性越低代表重复性越好。本发明提供的试剂盒能够有效检测DNA终浓度仅为1ng/μL的样本，并且能够有效分辨低至1:3000的突变，能够顺利完成液体活检的技术要求。
实施例4临床样品的检测
使用实施例2中的方法对临床样品中的ctDNA进行检测，待测样品为6例临床确诊黑色素瘤的患者血液，采样量为10mL。在使用本发明的方法检测的同时，还有一部分血液(9mL左右)送去专业检测公司进行高通量测序，与本发明所述方法进行结果对比。
样本中ctDNA的提取方法为：使用AlineBiosciences公司IsopurectDNA/RNAIsolationKit(CFD-6001-50)试剂盒，从采血管中吸取1mL血液样本，按照使用说明书对样本中的ctDNA进行提取，基于磁珠法，样本经蛋白酶消化后，经DNA结合，洗涤，ctDNA片段的选择及洗脱，提取高质量的ctDNA。ctDNA经质检及Qubit进行定量后确认总量不低于20ng，按照实施例2中的方法进行检测。
结果如下：6例样本中，检测出带有BRAF基因V600E突变型的有4例，2例为突变型阴性。此结果与高通量测序结果相符。其中，4例突变样本中的突变比例分别为1.1％，4.2％，
7.3％，0.8％。实验结果说明，本发明提供的试剂盒能够满足临床液体活检要求，相对于高通量测序的检测方法，大大降低检测时间和成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司
<120> 一种检测BRAF基因V600E位点突变的试剂盒
<130> 2020
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
catcgagatt tcactgtagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
catcgagatt tctctgtagc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tcatgaagac ctcacagtaa a 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
actgttcaaa ctgatggga 19
Claims (10)
1.一种检测BRAF基因V600E位点突变的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括检测BRAF基因V600E位点突变的锁核酸探针和检测BRAF基因V600E位点突变的引物对；
所述的锁核酸探针的核苷酸序列包括野生型荧光探针和突变型荧光探针；
所述的野生型荧光探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
所述的突变型荧光探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的野生型荧光探针的5’端第4位和13位碱基位锁核酸修饰碱基；
所述的突变型荧光探针的5’端第4位和13位碱基位锁核酸修饰碱基。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的野生型荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM、3’端连接有淬灭基团BHQ1。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的突变型荧光探针的5’端连接有荧光报告基团CY3、3’端连接有淬灭基团BHQ2。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的引物对包括上游引物和下游引物；
所述的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，所述的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。
6.根据权利要1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括反应预混液。
7.根据权利要6所述的试剂盒，其特征在于：所述的反应预混液包括：dNTP、镁离子和热启动Taq酶。
8.根据权利要7所述的试剂盒，其特征在于：所述的反应预混液还包括扩增增强剂；
所述的扩增增强剂包括：焦磷酸酶、TritonX-100和BSA；
所述的焦磷酸酶在反应预混液中的终浓度为0.5-2U；
所述的Triton X-10在反应预混液中的终浓度为0.1％-0.4％；
所述的BSA在反应预混液中的终浓度为5-15μg/μL。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所用的检测样本为血液、肿瘤和唾液样本中的一种或几种。
10.一种如权利要求1-8任意一项所述的试剂盒在利用数字PCR检测BRAF基因V600E位点突变方面的应用。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN112322738A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-02-05 | 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 | Brafv600e突变比例检测试剂盒和检测方法 |
| CN114634987A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-06-17 | 北京积水潭医院 | 一种检测braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其使用方法和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104774962A (zh) * | 2015-04-29 | 2015-07-15 | 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 | 检测braf基因突变的试剂盒及其检测方法 |
| CN105296666A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-02-03 | 湖南圣维基因科技有限公司 | 一种braf基因v600e突变荧光pcr检测试剂盒 |
| CN108277281A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-07-13 | 天津安必森生物技术有限公司 | 一种检测人B-raf基因V600E突变的试剂盒及其检测方法 |
| CN208087620U (zh) * | 2017-12-20 | 2018-11-13 | 深圳市乐土精准医疗科技有限公司 | 一种用于BRAF基因ddPCR检测的试剂盒 |
| CN109576372A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-05 | 杭州迪安医学检验中心有限公司 | 一种用于braf基因v600e突变检测的核酸序列及其应用 |
-
2020
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104774962A (zh) * | 2015-04-29 | 2015-07-15 | 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 | 检测braf基因突变的试剂盒及其检测方法 |
| CN105296666A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-02-03 | 湖南圣维基因科技有限公司 | 一种braf基因v600e突变荧光pcr检测试剂盒 |
| CN208087620U (zh) * | 2017-12-20 | 2018-11-13 | 深圳市乐土精准医疗科技有限公司 | 一种用于BRAF基因ddPCR检测的试剂盒 |
| CN108277281A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-07-13 | 天津安必森生物技术有限公司 | 一种检测人B-raf基因V600E突变的试剂盒及其检测方法 |
| CN109576372A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-05 | 杭州迪安医学检验中心有限公司 | 一种用于braf基因v600e突变检测的核酸序列及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 彭佳等: "利用野生抑制探针提升对BRAF V600E基因痕量突变检测的研究和临床应用" * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112322738A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-02-05 | 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 | Brafv600e突变比例检测试剂盒和检测方法 |
| CN114634987A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-06-17 | 北京积水潭医院 | 一种检测braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其使用方法和应用 |
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