CN111647650B - 检测人B-raf基因V600E突变的引物、引物探针组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测人B‑raf基因V600E突变的引物、引物探针组合物及试剂盒。本发明提供的试剂盒包括B‑raf基因V600E突变的检测引物对及检测探针、内部质控引物对及质控探针，所述检测引物的正向引物中包含沿5'端到3'端按以下顺序排列的三个部分：1)第一序列，用于识别突变热点并与野生型模板杂交的肽核酸PNA序列，该序列与野生型模板序列完全匹配，与突变型模板序列有一个碱基错配；2)Spacer，连接第一序列的3'末端和第二序列的5'末端；3)第二序列，与突变位点上游的序列结合，其3'端序列的3‑6bp与第一序列的5'端重叠；其中，第一序列的Tm值比第二序列的Tm值高6.3℃～11.3℃；本发明的试剂盒简单快捷，灵敏度高达1‰，特异性强，大大降低假阳性率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学基因检测领域，具体涉及一种用于检测人B-raf基因V600E突变的引物、引物探针组合物及试剂盒。
背景技术
BRAF基因，位于染色体7q34，是RAF家族成员之一，编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该蛋白在调节MAPK/ERK信号通路中起作用，影响细胞分裂，分化和分泌。BRAF基因突变常见于一些恶性肿瘤，例如肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴等。其中尤以BRAF基因V600E的突变频率最高，因为该突变常常与临床不良预后相关，因此BRAF基因V600E突变是临床检测的重要靶点。
目前，关于B-raf基因突变检测的方法很多，已报道的方法包括DNA直接测序法、ARMS-PCR法、高分辨率溶解曲线技术(HRM)、数字PCR法等。其中，直接测序法准确，为突变检测的金标准，但其灵敏度低；HRM法的灵敏度不高，而且不易区分该位点的其它突变；数字PCR方法灵敏度高，但需要昂贵的设备；ARMS-PCR法操作简单，但由于在ARMS引物倒数第2-5个碱基引入一个额外的突变，降低了PCR扩增的效率，检测灵敏度受限，且对于野生型背景的耐受能力差，经常出现假阳性。因此，更好的区分突变型和野生型基因从而提高检测灵敏度和特异性，是ARMS-PCR法技术改进的方向。
发明内容
本发明的目的在于解决临床常用B-raf基因V600E突变检测方法灵敏度低、扩增效率低、检测成本高、野生型背景的耐受能力差等问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种用于检测人B-raf基因V600E突变的引物，包括正向引物与反向引物，正向引物包含沿5'端到3'端按以下顺序排列的三个部分：
1)第一序列，用于识别突变热点并与野生型模板杂交的肽核酸PNA序列，该序列与野生型模板序列完全匹配，与突变型模板序列有一个碱基错配；
2)Spacer，连接第一序列的3'末端和第二序列的5'末端；
3)第二序列，与突变位点上游的序列结合，其3'端序列的3-6bp与第一序列的5'端重叠；
所述第一序列的Tm值比第二序列的Tm值高6.3℃～11.3℃；
所述第一序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示；
SEQ ID NO.1：5'-TCGAGATTTCACTGTAGCTA-3'
SEQ ID NO.2：5'-ATCGAGATTTCACT-3'
SEQ ID NO.3：5'-CATCGAGATTTCACT-3'
所述第二序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示；
SEQ ID NO.4：5'-CTGATGGGACCCACTCCATCG-3'
SEQ ID NO.5：5'-CTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCA-3'
SEQ ID NO.6：5'-CTGATGGGACCCACTCCATC-3'
所述Spacer为C3，C6，C9或C18中的一种；
所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示；
SEQ ID NO.7：5'-TGAGATCTACTGTTTTCCT-3'
SEQ ID NO.8：5'-TCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3'
SEQ ID NO.9：5'-TAATGCTTGCTCTGATAGGAA-3'
所述检测探针为MGB探针，探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团MGB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13、所示；
SEQ ID NO.10：FAM/ATCTGAGGTGTAGTAAGT/MGB
SEQ ID NO.11：FAM/TAGCTAGACCAAAATC/MGB
SEQ ID NO.12：FAM/ACTGTGAGGTCTTCATG/MGB
SEQ ID NO.13：FAM/AGCTAGACCAAAATCACCTATT/MGB
本发明另一方面提供一种用于检测人类B-raf基因V600E突变的引物探针组合物，包括上述用于检测B-raf基因V600E突变的引物以及检测探针，所述检测探针为MGB探针，探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团MGB，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示；
优选的，用于检测人类B-raf基因V600E突变的引物探针组合物还包括内部质控引物对及内部质控探针，本发明选择人类原癌基因作为内部质控(序列信息见：NM_001378473.1)
所述内部质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.14以及SEQ ID NO.15所示；
SEQ ID NO.14：5'-TCACCGCAGTGCATCAGAAC-3'
SEQ ID NO.15：5'-GGACAGGAAACGCACCATAT-3'
所述内部质控探针为TaqMan探针，探针的5'端标记荧光报告基团VIC，3'端标记荧光淬灭基团BHQ1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
SEQ ID NO.16：VIC/GAATCGGGCTGGTTTCCAAACA/BHQ1
上述引物及探针可以应用于制备人类B-raf基因V600E突变检测试剂。
第三方面，本发明提供一种用于检测人B-raf基因V600E突变的试剂盒，包括上述的引物探针组合物。
优选的，上述用于检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒还包括10×PCR检测反应液，所述10×PCR检测反应液包括pH值为9.0的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为25mmol/L的氯化镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的曲拉通溶液和浓度为50mmol/L的二硫苏糖醇溶液。
优选的，上述用于检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液包括1U/μL～5U/μL的耐热DNA聚合酶和0.05U/μL～0.2U/μL尿嘧啶DNA糖基化酶。
优选的，上述用于检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒还包括还包括阳性对照品，所述阳性对照为包含内部质控序列片段的质粒和B-raf V600E突变位点所在区域片段质粒的混合物，所述内部质控为人类原癌基因，序列信息：NM_001378473.1，所述B-rafV600E突变位点所在区域核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
优选的，上述用于检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒还包括还包括阴性对照品，所述阴性对照为灭菌生理盐水。
上述检测人BRAF基因V600E突变的试剂盒包括以下使用步骤：
1)取出包装盒中的10×buffer、dNTP、Mgcl2、taq酶、UNG酶、引物探针混合液及阳性对照品，室温放置，待其温度平衡至室温后，将各组分分别混匀，备用；
2)根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每孔取PCR预混液35μL，加入5μL待测样本(阴性对照，阳性对照各5μL)，充分混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备用；
表1：PCR反应体系
3)根据样本性质，使用相应的DNA提取试剂盒进行样本DNA提取，进行DNA浓度测定并稀释至2ng/μL，备用；
4)根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量向相应数量的反应管中加入35μL的PCR-mix，并取步骤3备用的的样本DNA、阴性对照、阳性对照各5μL加入到上述PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
5)将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试，荧光定量PCR反应条件如表1；
表2：荧光定量PCR反应条件
6)结果分析：反应结束后，分析荧光定量PCR扩增数据并对是否发生BRAF基因V600E突变进行判断。扩增曲线与阈值线的交点，即为Ct值(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果，如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且Ct值≤39，可判断为阳性；如果样本扩增曲线平直，且无Ct值，可以判为阴性。
与现有B-raf基因V600E突变检测方法相比，本发明的有益效果在于：
1)扩增效率高：本发明提供的用于检测B-raf基因V600E突变区域的检测引物，正向引物中第二序列能够与突变型模板突变位点上游的序列完全匹配，没有碱基错配，扩增效率高；
2)灵敏度高：本发明提供的用于检测B-raf基因V600E突变区域的检测引物，正向引物中的第一序列是能够识别突变热点并与野生型模板杂交的肽核酸PNA序列，显著提高突变型基因扩增，增加检测灵敏度，本发明可检出B-raf基因V600E突变基因组DNA的敏感度为1‰；
3)特异性强：本发明提供的用于检测B-raf基因V600E突变区域的检测引物，正向引物中的第一序列是能够识别突变热点并与野生型模板杂交的肽核酸PNA序列，可有效抑制野生型基因组扩增，只富集突变型基因扩增，大大提高了检测特异性，本发明可有效抑制100ng野生型基因扩增；
4)检测时间短：从样本送检到出结果约3个小时完成；
5)操作简单：一次加样，从PCR反应开始到结束，一直在封闭的反应体系中进行，不但降低了污染几率，而且降低了结果出现偏差的几率。
附图说明
图1是本发明的引物结构与原理示意图；
图2是精密性试验结果图；
图3是野生型耐受性试验结果图；
图4是检测限试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
该实施例提供了一种用于检测B-raf基因V600E突变区域的引物，包括正向引物与反向引物，正向引物包含沿5'端到3'端按以下顺序排列的三个部分：
1)第一序列，用于识别突变热点并与野生型模板杂交的肽核酸PNA序列，该序列与野生型模板序列完全匹配，与突变型模板序列有一个碱基错配，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
SEQ ID NO.2：5'-ATCGAGATTTCACT-3'(Tm：65℃)
2)Spacer，连接第一序列的3'末端和第二序列的5'末端，为C6；
3)第二序列，与突变位点上游的序列结合，其3'端序列的3-6bp与第一序列的5'端重叠，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
SEQ ID NO.4：5'-CTGATGGGACCCACTCCATCG-3'(Tm：58.7℃)
所述第一序列的Tm值比第二序列的Tm值高6.3℃；
反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
SEQ ID NO.8：5'-TCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3'
实施例2
该实施例提供了一种用于检测B-raf基因V600E突变区域的引物，包括正向引物与反向引物，正向引物包含沿5'端到3'端按以下顺序排列的三个部分：
1)第一序列，用于识别突变热点并与野生型模板杂交的肽核酸PNA序列，该序列与野生型模板序列完全匹配，与突变型模板序列有一个碱基错配，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1：5'-TCGAGATTTCACTGTAGCTA-3'(Tm:76℃)
2)Spacer，连接第一序列的3'末端和第二序列的5'末端，为C3；
3)第二序列，与突变位点上游的序列结合，其3'端序列的3-6bp与第一序列的5'端重叠，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
SEQ ID NO.5：5'-CTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCA-3'(Tm：64.7)
所述第一序列的Tm值比第二序列的Tm值高11.3℃；
反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
SEQ ID NO.7：5'-TGAGATCTACTGTTTTCCT-3'
实施例3
该实施例提供了一种用于检测B-raf基因V600E突变区域的引物，包括正向引物与反向引物，正向引物包含沿5'端到3'端按以下顺序排列的三个部分：
1)第一序列，用于识别突变热点并与野生型模板杂交的肽核酸PNA序列，该序列与野生型模板序列完全匹配，与突变型模板序列有一个碱基错配，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
SEQ ID NO.3：5'-CATCGAGATTTCACT-3'
2)Spacer，连接第一序列的3'末端和第二序列的5'末端，为C18；
3)第二序列，与突变位点上游的序列结合，其3'端序列的3-6bp与第一序列的5'端重叠，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
SEQ ID NO.6：5'-CTGATGGGACCCACTCCATC-3'(Tm:58.7℃)
所述第一序列的Tm值比第二序列的Tm值高7.9℃；
反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
SEQ ID NO.9：5'-TAATGCTTGCTCTGATAGGAA-3'
实施例4
该实施例提供了一种用于检测B-raf基因V600E突变区域的引物探针组合物，包括用于检测B-raf基因V600E突变的检测引物对及检测探针，内部质控引物对及内部质控探针。
所述检测检测引物由正向引物与反向引物组成，具体的，检测引物为实施例1(也可采用实施例2或者实施例3)给出的引物。
所述检测探针为MGB探针，探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团MGB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
SEQ ID NO.13：FAM/AGCTAGACCAAAATCACCTATT/MGB
所述内部质控(NM_001378473.1)引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.14以及SEQID NO.15所示；
SEQ ID NO.14：5'-TCACCGCAGTGCATCAGAAC-3'
SEQ ID NO.15：5'-GGACAGGAAACGCACCATAT-3'
所述内部质控探针5'端标记荧光报告基团VIC，3'端标记荧光淬灭基团BHQ1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
SEQ ID NO.16：VIC/GAATCGGGCTGGTTTCCAAACA/BHQ1
实施例5
该实施例提供了一种用于检测B-raf基因V600E突变区域的试剂盒，包括实施例4给出的引物探针组合物，还包括10×PCR检测反应液、酶混合液、dNTPs、阴性对照品和阳性对照品。所述10×PCR检测反应液包括pH值为9.0的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为25mmol/L的氯化镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的曲拉通溶液和浓度为50mmol/L的二硫苏糖醇溶液(DMSO/甘油)；所述酶混合液包括1U/μL～5U/μL的耐热DNA聚合酶和0.05U/μL～0.2U/μL尿嘧啶DNA糖基化酶。所述阳性对照为包含内部质控序列片段的质粒和B-raf V600E突变位点所在区域片段质粒的混合物，所述内部质控为人类原癌基因，序列信息：NM_001378473.1，所述B-raf V600E突变位点所在区域核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。所述阴性对照为灭菌生理盐水。
实施例6
该实施例为利用上述实施例5提供的试剂盒检测临床样本的BRAF基因突变情况，具体操作步骤为：
1)取出包装盒中的取出包装盒中的10×buffer、dNTP、Mgcl2、taq酶、UNG酶、引物探针混合液及阳性对照品，室温放置，待其温度平衡至室温后，将各组分分别混匀，备用；
2)根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每孔取PCR预混液35μL，加入5μL待测样本(阴性对照，阳性对照各5μL)，充分混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备用；
表1：PCR反应体系
3)使用商业化的石蜡切片核酸提取试剂盒提取DNA，提取后进行DNA浓度测定并稀释至2ng/μL，备用；
4)根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量向相应数量的反应管中加入35μL的PCR-mix，并取步骤3备用的的样本DNA、阴性对照、阳性对照各5μL加入到上述PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
5)将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试：
进一步，将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪(以ABI7500仪器为例)上进行测试包括以下步骤：
(1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称浓度；
(2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:MGB)；内部质控选择VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)；
(3)荧光定量PCR反应条件请参见表2；
表2：实施例3荧光定量PCR反应条件
(4)设置完毕，保存文件，运行反应程序；
(5)结果分析：反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。
内部质控判定：内部质控扩增曲线应有明显的指数增长期，且CT数为18-30之间；若CT小于18说明DNA浓度过高，应进行适当稀释；若CT大于30说明DNA浓度太低或存在PCR抑制剂，需重新制备DNA进行检测。
阴性对照判定：阴性对照孔应无FAM信号，若有FAM信号说明试剂有问题，需重新更换新批次试剂进行检测。
阳性对照判定：阳性对照FAM均有信号，若无FAM信号说明试剂有问题，需重新更换新批次进行检测。
检测样本判定：如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且Ct值≤39，可判断为阳性；如果样本扩增曲线平直，且无Ct值(Undet)，可以判为阴性。
试验例1：特异性试验
本试验例采用实施例5提供的试剂盒对阴阳性工作参考品进行了检测，在本次试验中，阴性工作参考品是浓度为20ng/μL的野生型人DNA；阳性工作参考品是浓度分别为300copies/μL、120copies/μL和60copies/μL的V600E突变质粒。
通过上述测试所得到的检测结果为阴阳性参考品符合率为100％，符合质量标准，这说明本发明实施例提供的检测试剂盒具有很好的特异性。
试验例2：精密度试验
本试验例采用实施例5提供的检测试剂盒对弱阳性精密度参考品和强阳性精密度参考品分别进行荧光PCR反应测试，且该测试每组重复10次，反应的本试验中，弱阳性精密度参考品为野生型人DNA和V600E突变质粒的混合物，其中含V600E突变的百分率为1.0％；强阳性精密度参考品为野生型人DNA和V600E突变质粒的混合物，其中含V600E突变的百分率为50％。
测试结果如图2，由图可知，弱阳性精密度参考品和强阳性精密度参考品测试均出现Ct值，且Ct值具有明显的扩增曲线，Ct值的变异系数均<5％，由此可以说明本检测试剂盒具有良好的精密度。
试验例3：灵敏度及野生型耐受性试验
本试验例采用实施例5提供的试剂盒对阴阳性工作参考品进行了检测，在本次试验中，阴性工作参考品是100ng/反应野生型人DNA；阳性工作参考品是10ng/反应含1‰V600E突变的人DNA，且该测试每组重复20次。
附图3和附图4显示出了本发明实施例提供的B-raf基因V600E突变检测试剂盒对100ng/反应野生型人DNA及10ng/反应含1‰V600E突变的人DNA进行荧光PCR反应测试的扩增曲线。从图3可以看出，本发明实施例5提供的检测试剂盒通过对野生型人DNA进行荧光PCR反应测试时未见扩增曲线，且符合率为100％。从图4可以看出，本发明实施例5提供的检测试剂盒通过对含1‰V600E突变的人DNA进行荧光PCR反应测试时出现明显的扩增曲线，且扩增曲线的重复性很好，且符合率为100％。通过上述两项测试的比较可以得出，本发明实施例提供的检测试剂盒不能检测出野生型人DNA，且在人DNA的V600E突变仅仅1‰的情况下仍能检测出，并出现扩增曲线，由此可以说明本发明所提供的检测试剂盒具有较高的灵敏度以及极强的抗干扰能力，大大降低了假阳性率，从而达到高效区分突变型和野生型基因的目的。
本发明采用PNA序列链接常规序列实现V600E突变的高灵敏度、高特异性检测，其结构为：第一序列----Spacer(C3等)----第二序列；其中第一序列为PNA序列，具有很强的碱基识别能力，若发生错配则导致PNA序列不稳定，从而脱离靶序列；第二序列，基于突变位点上游的序列设计，其3'端序列的3-6bp与第一序列的5'端重叠；通过Spacer链接第一及第二序列，其中，所述第一序列的Tm值比第二序列的Tm值高10℃左右。PNA序列由于具有碱基的高识别能力且Tm值要高于第二序列，因此在高Tm条件下，PNA序列会优先和模板进行杂交，由于PNA序列基于野生序列设计，可以和野生模板完全匹配，而和突变模板产生错配，导致PNA序列不稳定，从而脱离突变区域；第二序列则位于突变位点上游，序列完全匹配，避免了常规ARMS引物需要额外引入错配而导致的灵敏度降低，因此可以很好的识别突变序列(如图1所示)。相比PNA夹法检测突变位点的技术，极大降低了引物与PNA序列浓度比例调整的难度。
本发明所提供的B-raf基因V600E突变检测试剂盒是基于荧光定量PCR技术和ARMS-PCR技术的检测试剂盒，本检测试剂盒能够在10ng/反应的野生型DNA背景下实现1‰人B-raf基因V600E突变100％检出且野生型人B-raf零检出，从而说明本检测试剂盒具有很好的特异性以及极强的抗干扰能力，大大降低了假阳性率，且操作快速、方法简便、检测精度高，同时在反应体系中增加的内部质控能够有效防止检测呈假阴性。本发明实施例提供的B-raf基因V600E突变检测试剂盒在批内和批间的重复性好，且Ct值的变异系数<5％。
最后说明的是，各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制。上文中已经用具体实施方案描述了本发明的基本原理和主要特征，在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或替换，但这些修改或者替换并不使相应技术方案的本质脱离本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 河南赛诺特生物技术有限公司
<120> 检测人B-raf基因V600E突变的引物、引物探针组合物及试剂盒
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<170> PatentIn version 3.5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 第一序列（PNA序列）
<222> (1)..(20)
<400> 1
tcgagatttc actgtagcta 20
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 第一序列（PNA序列）
<222> (1)..(14)
<400> 2
atcgagattt cact 14
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 第一序列（PNA序列）
<222> (1)..(15)
<400> 3
catcgagatt tcact 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 第二序列
<400> 4
ctgatgggac ccactccatc g 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 第二序列
<400> 5
ctgttcaaac tgatgggacc cactcca 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 第二序列
<400> 6
ctgatgggac ccactccatc 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 检测引物反向序列
<400> 7
tgagatctac tgttttcct 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 检测引物反向序列
<400> 8
tcttcataat gcttgctctg atagg 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 检测引物反向序列
<400> 9
taatgcttgc tctgatagga a 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 检测探针
<400> 10
atctgaggtg tagtaagt 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 检测探针
<400> 11
tagctagacc aaaatc 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 检测探针
<400> 12
actgtgaggt cttcatg 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 检测探针
<400> 13
agctagacca aaatcaccta tt 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 内部质控引物
<400> 14
tcaccgcagt gcatcagaac 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 内部质控引物
<400> 15
ggacaggaaa cgcaccatat 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 内部质控探针
<400> 16
gaatcgggct ggtttccaaa ca 22
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> V600E阳性突变序列（下划线所示为突变位点）
<400> 17
tcacctcatc ctaacacatt tcaagcccca aaaatcttaa aagcaggtta tataggctaa 60
atagaactaa tcattgtttt agacatactt attgactcta agaggaaaga tgaagtacta 120
tgttttaaag aatattatat tacagaatta tagaaattag atctcttacc taaactcttc 180
ataatgcttg ctctgatagg aaaatgagat ctactgtttt cctttactta ctacacctca 240
gatatatttc ttcatgaaga cctcacagta aaaataggtg attttggtct agctacagag 300
aaatctcgat ggagtgggtc ccatcagttt gaacagttgt ctggatccat tttgtggatg 360
gtaagaattg aggctatttt tccactgatt aaatttttgg ccctgagatg ctgctgagtt 420
actagaaagt cattgaaggt ctcaactata gtattttcat agttcccagt attcacaaaa 480
atcagtgttc ttatttttta tgtaaataga ttttttaact tttttcttta cccttaaaac 540
gaatattttg aaaccagttt cagtgtattt caaacaaaaa tatatgtctt ataaacagtg 600
Claims (8)
1.一种用于检测人类B-raf基因V600E突变的引物，其特征在于，包括正向引物与反向引物，正向引物包含沿5'端到3'端按以下顺序排列的三个部分：
1）第一序列，用于识别突变位点并与野生型模板杂交的肽核酸PNA序列，该序列与野生型模板序列完全匹配，与突变型模板序列有一个碱基错配；
2）Spacer，连接第一序列的3'末端和第二序列的5'末端；
3) 第二序列，与突变位点上游的序列结合，其3'端序列的3-6bp与第一序列的5'端重叠；
所述第一序列的Tm值比第二序列的Tm值高6.3℃~11.3℃；
所述第一序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，Spacer 为C3，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
或所述第一序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第二序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，Spacer 为C6，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
或所述第一序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第二序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，Spacer 为C18，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
2.一种用于检测人类B-raf基因V600E突变的引物探针组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述用于检测B-raf基因V600E突变的引物以及检测探针，所述检测探针为MGB探针，探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团MGB，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。
3.根据权利要求2所述的用于检测人类B-raf基因V600E突变的引物探针组合物，其特征在于，还包括内部质控引物及内部质控探针：
所述内部质控引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14以及SEQ ID NO.15所示；
所述内部质控探针为TaqMan探针，探针的5'端标记荧光报告基团VIC，3'端标记荧光淬灭基团BHQ1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
4.一种用于检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的引物探针组合物。
5.根据权利要求4所述的检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，还包括10×PCR检测反应液，所述10×PCR检测反应液包括pH值为9.0的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为25mmol/L的氯化镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的曲拉通溶液和浓度为50mmol/L的二硫苏糖醇溶液。
6.根据权利要求4所述的检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，还包括酶混合液，所述酶混合液包括1U/μL～5U/μL的耐热DNA聚合酶和0.05U/μL～0.2U/μL尿嘧啶DNA糖基化酶。
7.根据权利要求4所述的检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品，所述阳性对照为包含内部质控序列片段的质粒和B-raf V600E突变位点所在区域片段质粒的混合物，所述内部质控为人类原癌基因，序列信息：NM_001378473.1，所述B-raf V600E突变位点所在区域核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
8.根据权利要求4所述的检测人类B-raf基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照品，所述阴性对照为灭菌生理盐水。
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