CN108642153B - 一种高灵敏的突变位点检测体系、方法及应用 - Google Patents
一种高灵敏的突变位点检测体系、方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高灵敏的基因突变检测体系、方法及应用，包括：设计针对野生型基因的野生型上游或下游引物、针对突变型基因的突变型上游或下游引物、通用的上游或下游引物、突变型blocker和野生型blocker；采用双管PCR体系进行PCR反应，对样本进行定量PCR检测；其中，一管包括野生型引物、突变型blocker和通用引物，另一管包括突变型引物、野生型blocker和通用引物。本发明的高灵敏的基因突变检测方法，通过特异性引物合并特异性blocker的方法，提高了检测的特异性和灵敏度；本发明通过标准品以及标准曲线的绘制，很好的避免了假阳性和假阴性结果；本发明具有检测万分之一及其以上基因突变的能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种高灵敏的基因突变检测体系、方法和应用。
背景技术
基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，如单核苷酸多态性(SNPs)以及未甲基化的核苷酸被转化后碱基的变化。
单核苷酸多态性即SNPs是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A，G，C，T)替换而引起的多态性，是新一代多态性遗传标记。 SNPs在生物基因组中广泛存在，如人类30亿个碱基中每千个碱基出现一次，在整个基因组共有300万以上的SNPs。SNPs和疾病的发生发展密切相关。
细胞基因的甲基化和肿瘤的发生、发展密切相关，非甲基化的胞嘧啶(C)在亚硫酸氢盐作用下转化为尿嘧啶(U)，从而成为具有检测价值的突变位点。
目前市面上针对基因突变检测的方法有许多，包括一代测序、二代测序，基因芯片、荧光定量PCR(qPCR)技术等。但是在较高的野生型模板的背景下，针对稀有的基因突变的检测能力有限。
稀有基因突变，指的是存在大量野生基因序列背景中的极为稀少的基因序列。在癌症病人或是治疗后病人血液中含有少量的肿瘤突变 DNA(ct-DNA)以及含有甲基化位点的DNA；孕妇外周血含有少量的胎儿DNA等，这些情况都属于大量野生型背景下的稀有基因检测。许多引起肿瘤的体细胞突变都是掺杂在野生型细胞内的，所提的 DNA也是带有大量野生型DNA，同样需要采用稀有基因突变的检测方法。因此，稀有基因突变的检测在癌症筛查和预后跟踪、无创产前筛查等具有十分重要的意义。
和测序技术检测基因突变相比，qPCR技术具有迅速、方便、价格低等优点，可以做到对基因突变的高灵敏检测。评价基因突变检测方法的优劣包括：灵敏度、特异性、简便程度等。灵敏度是指在大量野生型DNA背景下能够检测到的最小突变型的量；特异性是指不被检测到的最大突变型的量。基于PCR技术的稀有基因突变检测方法可以归为两类：(1)特异性引物扩增方法；(2)非特异性引物加特异性blockers的方法.第一类的特异性引物扩增的方法有ARMS (amplification refractory mutation system),ASB-PCR(allele-specificblocker PCR),以及castPCR(competitive allele specific TaqMan PCR)。第二类方法包括PNA blocker PCR和COLD-PCR(co-amplification at lower denaturationtemperature PCR)等.以上的方法具有高灵敏检测基因突变的能力，但是需要碱基的修饰、特殊的反应试剂或特殊的反应程序等，因此有必要研发一种简单的、灵敏度更高的检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种高灵敏的基因突变检测体系、方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于qPCR技术的特异性引物合并特异性blocker的检测方法ASPB(allele-specific primer and blocker)即高灵敏的基因突变检测体系、方法及应用，具有较高的检测灵敏度和特异性。检测突变型模板时，特异性引物与突变型模板互补配对，而与野生型不互补，特异性blocker引物与野生型模板互补对扩增抑制大而与突变型模板不互补对扩增抑制小，使得突变型模板得到扩增，而野生型模板的扩增得到抑制，从而起到了高灵敏检测基因突变的目的。与标准品曲线对比，可以确定基因突变的频率和拷贝数，很好的避免了假阳性和假阴性。本方法可以检测万分之一及以上的基因突变，灵敏度高，使用方便。
本发明采用的技术方案是：一种高灵敏的基因突变检测体系，其特征在于，包括：
针对野生型基因的野生型引物、针对突变型基因的突变型引物、通用引物、突变型blocker引物和野生型blocker引物；野生型引物为野生型上游引物或野生型下游引物；突变型引物为突变型上游引物或突变型下游引物；通用引物为通用上游引物或通用下游引物；
所述的基因突变检测体系为双管PCR体系，其中一管包括野生型引物、突变型blocker引物和通用引物，另一管包括突变型引物、野生型blocker引物和通用引物。
优选地，所述野生型引物和野生型模板互补，所述突变型引物和突变型模板互补；所述野生型引物和突变型引物的3’端的末端碱基或在引物序列中间的一个碱基不同，其它序列相同；所述野生型引物和突变型引物的长度为15-35个碱基。
优选地，所述通用引物分别和所述野生型模板、突变型模板互补，其长度为15-35个碱基。
优选地，所述野生型blocker引物和野生型模板互补，所述突变型blocker引物和突变型模板互补；所述野生型blocker引物和突变型 blocker引物的5’端的末端碱基不同或由5’端到引物序列中间所组成的序列片段的一个碱基不同，而其它序列相同；所述野生型blocker 引物和突变型blocker引物的长度为15-40个碱基；所述野生型blocker 引物和突变型blocker引物不可以发生扩增，所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的3’端被修饰基团修饰或3’端有若干个和所述野生型模板、突变型模板均不互补的碱基。
优选地，所述的通用上游引物选自
5’-ACCAGTTGGGCATGTTGA-3’SEQ ID NO：1；
5’-AGCATTGGAATCCAGAAACCAG-3’SEQ ID NO：2；
5’-GAATCCAGAAACCAGTTGGGC-3’SEQ ID NO：3；
5’-TCTCCCTCCCTCCAGGAAGC-3’SEQ ID NO：4；
5’-GACCGTCGCTTGGTGCA-3’SEQ ID NO：5；
5’-TACTTGGAGGACCGTCGCT-3’SEQ ID NO：6；
5’-AGGGCATGAACTACTTGG-3’SEQ ID NO：7；
野生型下游引物选自：
5’-CAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’SEQ ID NO：8；
5’-CCAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’SEQ ID NO：9；
5’-GCA CCC AGC AGT TTG GCCG-3’SEQ ID NO：10；
5’-CGA AGG GCA TGA GCT GCG-3’SEQ ID NO：11；
突变型blocker引物选自：
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATC-3’SEQ ID NO： 12；
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTAC-3’SEQ ID NO：13；
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’SEQ ID NO：14；
5’-ATG ATG AGC TGC ACG GTG GAG GTG AGG CAG-3’SEQ ID NO：15；每一个突变型blocker引物的3’端采用磷酸化修饰；
突变型下游引物选自：
5’-CCAAGTCCTCTCTCTGCAATG-3’SEQ ID NO：16；
5’-CAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’SEQ ID NO：17；
5’-GCA CCC AGC AGT TTG GCCG-3’SEQ ID NO：18；
5’-CGA AGG GCA TGA GCT GCA-3’SEQ ID NO：19；
野生型blocker引物选自：
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’SEQ ID NO：20；
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATC-3’SEQ ID NO： 21；
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’SEQ ID NO：22；
5’-AGC CCA AAA TCT GTG ATC TTG ACA TGC TGC G-3’ SEQ ID NO：23；
5’-AGC CCA AAA TCT GTG ATC TTG ACA TGC T-3’SEQ ID NO：24；
5’-GTG ATG AGC TGC ACG GTG GAG GTG AGG CAG-3’SEQ ID NO：25；每一个野生型blocker引物3’端采用磷酸化修饰；
通用型探针选自：
5’-CTGAAAAGTACCTCCATTCGGGT-3’SEQ ID NO：26；
5’-TTGCTGAAAAGTACCTCCATTCGG-3’SEQ ID NO：27；
5’-TTTCAC CAG TAC GTT CCT GGC TGC-3’SEQ ID NO：28；
5’-CAC CAG TAC GTT CCT GGC TGC CA-3’SEQ ID NO：29；
5’-CAC GTG GGG GTT GTC CAC GCT G-3’SEQ ID NO：30；
野生型模板选自：
5’-ACCAGTTGGGCATGTTGACATTTACCCGAATGGAGGTACTTT TCAGCCAGGATGTAACATTGGAGAAGCTATCCGCGTCATTGCAG AGAGAGGACTTGG-3’SEQ ID NO：31；
5’-ATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCT GTCCCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACT TGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGA ACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTT TGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCAT GCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAG CATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCT-3’ SEQ ID NO：32；
5’-CTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACC ATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGC CTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTG CTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCT CATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAG ACAATATTGGCTCCCA-3’SEQ ID NO：33；
突变型模板选自：
5’-ACCAGTTGGGCATGTTGACATTTACCCGAATGGAGGTACTTT TCAGCCAGGATGTAACATTGGAGAAGCTATCCGCGTGATTGCAG AGAGAGGACTTGG-3’SEQ ID NO：34；
5’-ATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCT GTCCCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACT TGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGA ACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTT TGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCAT GCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAG CATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCT-3’ SEQ ID NO：35；
5’-CTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACC ATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGC CTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTG CTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCT CATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAG ACAATATTGGCTCCCA-3’SEQ ID NO：36。
优选地，所述野生型引物和突变型引物的浓度为0.05-0.5μM，所述野生型blocker引物的浓度是突变型引物浓度的1-1000倍，所述突变型blocker引物的浓度是野生型引物浓度的1-1000倍；双管PCR 体系还包括DNA聚合酶、聚合酶buffer、dNTPs、MgCl2。
高灵敏的基因突变检测方法，采用双管PCR体系进行PCR反应，对样本进行定量PCR检测；对样本进行定量PCR检测过程中，通过定量曲线分析以及与标准品曲线对比获取稀有突变的频率和拷贝数。
优选地，通过使用Taqman探针、分子信标或荧光染料获取PCR 扩增中的荧光信号。
优选的是，所述样本中包括突变型模板或野生型模板或两者的混合物，其中，所述突变型引物与突变型模板互补配对，而与所述野生型模板不互补；所述野生型blocker引物与野生型模板互补对扩增抑制大，而与所述突变型模板不互补对扩增抑制小，使得突变型模板得到扩增，而野生型模板的扩增得到抑制。
高灵敏的基因突变检测体系作为基因突变检测试剂的应用，检测的基因突变类型包括：核苷酸多态性(SNPs)、甲基化相关的核苷酸被转化后的碱基的变化。
本发明的有益效果是：本发明的高灵敏的基因突变检测方法，通过特异性引物合并特异性blocker的方法，提高了检测的特异性和灵敏度；本发明通过标准品以及标准曲线的绘制，很好的避免了假阳性和假阴性结果；本发明具有检测千分之一及其以上基因突变的能力，本发明不需要特殊反应试剂，成本低；不需要特殊反应程序，操作简单，能够方便、高灵敏、定量地检测基因突变。
附图说明
图1为本发明的一种实施例中的ASPB检测稀有突变的示意图；
图2为本发明的一种实施例中ASPB检测EGFR L858R突变型模板和野生型模板的定量曲线的示意图；
图3为本发明的一种实施例中的ASPB检测LPL基因突变型模板的灵敏度示意图；
图4为本发明的一种实施例中的ASPB检测LPL基因不同比例突变型模板的扩增曲线示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本实施例的一种高灵敏的基因突变检测方法(ASPB)，包括：设计针对野生型基因的野生型上游或下游引物、针对突变型基因的突变型上游或下游引物、通用的上游或下游引物、突变型blocker和野生型blocker；
采用双管PCR体系进行PCR反应，对样本进行定量PCR检测；其中，一管包括野生型引物、突变型blocker和通用引物，另一管包括突变型引物、野生型blocker和通用引物。
其中，所述野生型引物和野生型模板互补，所述突变型引物和突变型模板互补，所述野生型引物和突变型引物的3’端的一个碱基或中间的一个碱基不同，其他序列相同，所述野生型引物和突变型引物的长度为15-35个碱基。
其中，所述通用引物和所述野生型模板、突变型模板均互补，其长度为15-35个碱基。
其中，所述野生型blocker和野生型模板互补，所述突变型blocker 和突变型模板互补，所述野生型blocker和突变型blocker的5’端的一个碱基或5’端到中间的一个碱基不同，而其他序列相同；所述野生型 blocker和突变型blocker的长度为15-40个碱基；所述野生型blocker 和突变型blocker不可以发生扩增，所述野生型blocker和突变型 blocker的3’端被修饰基团修饰或3’端有若干个和所述野生型模板、突变型模板均不互补的碱基。
其中，对样本进行定量PCR检测中，通过定量曲线分析以及与标准品曲线对比获取稀有突变的频率和拷贝数。通过使用Taqman探针、分子信标、荧光染料或其它方法获取PCR扩增中的荧光信号。
其中，所述野生型引物和突变型的浓度为0.05-0.5μM，所述野生型blocker的浓度是突变型引物浓度的1-1000倍，所述突变型blocker的浓度是野生型引物浓度的1-1000倍；所述双管PCR体系还包括DNA聚合酶、聚合酶buffer、dNTPs、MgCl2以及进行PCR反应的反应程序。
其中，所述样本中包括突变型模板或野生型模板或两者的混合物，其中，所述突变型引物与突变型模板互补配对，而与所述野生型不互补；所述野生型blocker与野生型模板互补、对扩增抑制大，而与所述突变型模板不互补、对扩增抑制小，使得突变型模板得到扩增，而野生型模板的扩增得到抑制。从而起到了检测稀有基因突变的目的。与标准品曲线对比，可以确定稀有基因突变的频率和拷贝数，很好的避免了假阳性和假阴性。
图1给出了本发明的一种实施例中的ASPB(高灵敏的基因突变检测方法)检测稀有突变的示意图。
下表1为野生型引物+突变型blocker、突变型引物+野生型blocker 分别检测20000个突变型模板和野生型模板得到的Ct值。
表1
图2给出了本发明的一种实施例中的ASPB检测EGFR L858R突变型模板和野生型模板的定量曲线的示意图。
本发明还提供应用本发明的高灵敏的基因突变检测方法检测LPL基因上的基因突变的实施例：
1.引物和blocker设计：
根据野生模板和突变型模板设计野生型和突变型的上游或下游引物，通用的上游或下游引物，突变型和野生型blocker。使用本发明的方法检测LPL
基因的4号外显子区域的一个碱基的突变。序列如下表2：
表2各引物序列
其中，EGFR858通用探针和LPL探针5’端加上FAM基团，探针3’端加上BHQ1基团。
2.ASPB中突变型引物合并野生型blocker、野生型引物合并突变型blocker检测突变型模板或野生型模板的灵敏度实验:
ASPB每管反应体积为30ul，含有2-5mM MgCl2、50mM KCl、 0.3mM dNTPs、特异性引物(野生型引物、突变型引物)0.1μM、特异性blocker(突变型blocker、野生型blocker)0.5-2.8μM，通用引物 0.1μM，0.05U/ul热启动聚合酶，各梯度模板5ul。经95℃酶激活 15min，再95℃变性15s，56℃退火延伸1min，45个循环。使用 7500fast系统进行定量PCR以及信号采集。每管中放入突变型下游引物、野生型blocker引物、通用上游引物，模板选择突变型模板或野生型模板；或者放入野生型下游引物、突变型blocker引物、通用上游引物。
从表3(对应于LPL基因)看出，blocker浓度对检测特异性有重要影响。图3示出了该实施例中的ASPB检测LPL基因突变型模板的灵敏度示意图，图3和图4中的百分比是指LPL基因突变型模板的拷贝数占突变型模板和野生型模板的混合物的拷贝数的比例，突变型模板占比为0.01％时即可检测出来，具有高检测灵敏度；图4示出了该实施例中的ASPB检测不同比例LPL基因突变型模板的扩增曲线示意图。从图3、图4看出，本发明的ASPB具备检测万分之一及以上基因突变的能力。
表3：不同blocker浓度梯度检测时获得的Ct值
值得一提的是，本发明的方法可用于任意基因序列的突变位点的检测。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
序列表
<110> 苏州唯善生物科技有限公司
<120> 一种高灵敏的突变位点检测体系、方法及应用
<130> xhx2018041701
<141> 2018-04-17
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 31
accagttggg catgttgaca tttacccgaa tggaggtact tttcagccag gatgtaacat 60
tggagaagct atccgcgtca ttgcagagag aggacttgg 99
<210> 32
<211> 299
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
atgaccctga attcggatgc agagcttctt cccatgatga tctgtccctc acagcagggt 60
cttctctgtt tcagggcatg aactacttgg aggaccgtcg cttggtgcac cgcgacctgg 120
cagccaggaa cgtactggtg aaaacaccgc agcatgtcaa gatcacagat tttgggctgg 180
ccaaactgct gggtgcggaa gagaaagaat accatgcaga aggaggcaaa gtaaggaggt 240
ggctttaggt cagccagcat tttcctgaca ccagggacca ggctgccttc ccactagct 299
<210> 33
<211> 232
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
cttcacctgg aaggggtcca tgtgcccctc cttctggcca ccatgcgaag ccacactgac 60
gtgcctctcc ctccctccag gaagcctacg tgatggccag cgtggacaac ccccacgtgt 120
gccgcctgct gggcatctgc ctcacctcca ccgtgcagct catcacgcag ctcatgccct 180
tcggctgcct cctggactat gtccgggaac acaaagacaa tattggctcc ca 232
<210> 34
<211> 99
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
accagttggg catgttgaca tttacccgaa tggaggtact tttcagccag gatgtaacat 60
tggagaagct atccgcgtga ttgcagagag aggacttgg 99
<210> 35
<211> 299
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
atgaccctga attcggatgc agagcttctt cccatgatga tctgtccctc acagcagggt 60
cttctctgtt tcagggcatg aactacttgg aggaccgtcg cttggtgcac cgcgacctgg 120
cagccaggaa cgtactggtg aaaacaccgc agcatgtcaa gatcacagat tttgggcggg 180
ccaaactgct gggtgcggaa gagaaagaat accatgcaga aggaggcaaa gtaaggaggt 240
ggctttaggt cagccagcat tttcctgaca ccagggacca ggctgccttc ccactagct 299
<210> 36
<211> 232
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
cttcacctgg aaggggtcca tgtgcccctc cttctggcca ccatgcgaag ccacactgac 60
gtgcctctcc ctccctccag gaagcctacg tgatggccag cgtggacaac ccccacgtgt 120
gccgcctgct gggcatctgc ctcacctcca ccgtgcagct catcatgcag ctcatgccct 180
tcggctgcct cctggactat gtccgggaac acaaagacaa tattggctcc ca 232
Claims (6)
1.一种高灵敏的基因突变检测体系，其特征在于，包括：
针对野生型基因的野生型引物、针对突变型基因的突变型引物、通用引物、突变型blocker引物、野生型blocker引物和通用型探针；野生型引物为野生型上游引物或野生型下游引物；突变型引物为突变型上游引物或突变型下游引物；通用引物为通用上游引物或通用下游引物；
所述的基因突变检测体系为双管PCR体系，其中一管包括野生型引物、突变型blocker引物和通用引物，另一管包括突变型引物、野生型blocker引物和通用引物；
所述野生型引物和野生型模板互补，所述突变型引物和突变型模板互补；所述野生型引物和突变型引物的3’端的末端碱基不同或在引物序列中间的一个碱基不同，其它序列相同；所述野生型引物和突变型引物的长度为15-35个碱基；
所述通用引物分别和所述野生型模板、突变型模板均互补，其长度为15-35个碱基；
所述野生型blocker引物和野生型模板互补，所述突变型blocker引物和突变型模板互补；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的5’端的末端碱基不同或由5’端到引物序列中间所组成的序列片段的一个碱基不同，而其它序列相同；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的长度为15-40个碱基；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物不可以发生扩增，所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的3’端被修饰基团修饰或3’端有若干个和所述野生型模板、突变型模板均不互补的碱基；
所述的通用上游引物选自：
5’-ACCAGTTGGGCATGTTGA-3’ SEQ ID NO：1；
5’-AGCATTGGAATCCAGAAACCAG-3’ SEQ ID NO：2；
5’-GAATCCAGAAACCAGTTGGGC-3’ SEQ ID NO：3；
5’-TCTCCCTCCCTCCAGGAAGC-3’ SEQ ID NO：4；
5’-GACCGTCGCTTGGTGCA-3’ SEQ ID NO：5；
5’-TACTTGGAGGACCGTCGCT-3’ SEQ ID NO：6；
5’-AGGGCATGAACTACTTGG-3’ SEQ ID NO：7；
野生型下游引物选自：
5’-CAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’ SEQ ID NO：8；
5’-CCAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’ SEQ ID NO：9；
5’-GCA CCC AGC AGT TTG GCCG-3’ SEQ ID NO：10；
5’-CGA AGG GCA TGA GCT GCG-3’ SEQ ID NO：11；
突变型blocker引物选自：
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATC-3’ SEQ ID NO：12；
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTAC-3’ SEQ ID NO：13；
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’ SEQ ID NO：14；
5’-ATG ATG AGC TGC ACG GTG GAG GTG AGG CAG-3’ SEQ ID NO：15；每一个突变型blocker引物的3’端采用磷酸化修饰；
突变型下游引物选自：
5’-CCAAGTCCTCTCTCTGCAATG-3’ SEQ ID NO：16；
5’-CAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’ SEQ ID NO：17；
5’-GCA CCC AGC AGT TTG GCCG-3’ SEQ ID NO：18；
5’-CGA AGG GCA TGA GCT GCA-3’ SEQ ID NO：19；
野生型blocker引物选自：
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’ SEQ ID NO：20；
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATC-3’ SEQ ID NO：21；
5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’ SEQ ID NO：22；
5’-AGC CCA AAA TCT GTG ATC TTG ACA TGC TGC G-3’ SEQ ID NO：23；
5’-AGC CCA AAA TCT GTG ATC TTG ACA TGC T-3’ SEQ ID NO：24；
5’-GTG ATG AGC TGC ACG GTG GAG GTG AGG CAG-3’ SEQ ID NO：25；每一个野生型blocker引物3’端采用磷酸化修饰；
通用型探针选自：
5’-CTGAAAAGTACCTCCATTCGGGT-3’ SEQ ID NO：26；
5’-TTGCTGAAAAGTACCTCCATTCGG-3’ SEQ ID NO：27；
5’-TTTCAC CAG TAC GTT CCT GGC TGC-3’ SEQ ID NO：28；
5’-CAC CAG TAC GTT CCT GGC TGC CA-3’ SEQ ID NO：29；
5’-CAC GTG GGG GTT GTC CAC GCT G-3’ SEQ ID NO：30；
野生型模板选自：
5’-ACCAGTTGGGCATGTTGACATTTACCCGAATGGAGGTACTTTTCAGCCAGGATGTAACATTGGAGAAGCTATCCGCGTCATTGCAGAGAGAGGACTTGG-3’ SEQ ID NO：31；
5’-ATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCT-3’ SEQ ID NO：32；
5’-CTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCA-3’ SEQ ID NO：33；
突变型模板选自：
5’-ACCAGTTGGGCATGTTGACATTTACCCGAATGGAGGTACTTTTCAGCCAGGATGTAACATTGGAGAAGCTATCCGCGTGATTGCAGAGAGAGGACTTGG-3’ SEQ ID NO：34；
5’-ATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCT-3’ SEQ ID NO：35；
5’-CTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCA-3’ SEQ ID NO：36。
2.根据权利要求1所述的高灵敏的基因突变检测体系，其特征在于，所述野生型引物和突变型引物的浓度为0.05-0.5 μM，所述野生型blocker引物的浓度是突变型引物浓度的1-1000倍，所述突变型blocker引物的浓度是野生型引物浓度的1-1000倍；双管PCR体系还包括DNA聚合酶、聚合酶buffer、dNTPs、MgCl2。
3.采用权利要求1-2任意一项所述的高灵敏的基因突变检测体系的检测方法，其特征在于，采用双管PCR体系进行PCR反应，对样本进行定量PCR检测；对样本进行定量PCR检测过程中，通过定量曲线分析以及与标准品曲线对比获取稀有突变的频率和拷贝数，所述检测方法用于非疾病诊断和治疗目的。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，通过使用Taqman探针获取PCR扩增中的荧光信号。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述样本中包括突变型模板或野生型模板或两者的混合物，其中，所述突变型引物与突变型模板互补配对，而与所述野生型模板不互补；所述野生型blocker引物与野生型模板互补，而与所述突变型模板不互补，使得突变型模板得到扩增，而野生型模板的扩增被抑制。
6.权利要求1-2任一项所述的高灵敏的基因突变检测体系在制备基因突变检测试剂中的应用，其特征在于，检测的基因突变类型包括：单核苷酸多态性（SNPs）、甲基化相关的核苷酸被转化后的碱基的变化。
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