CN110951828A - 一种引物和探针的设计方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于扩增低浓度突变靶序列的引物和探针的设计方法。首先确定欲扩增靶序列的突变位置(突变点，即0位)；然后在突变点的负方向选取包含0位碱基在内的15～25bp的核酸片段作为正向引物，在突变点的正方向从‑1位碱基或者0位碱基起选取12～25bp核酸序列作为扩增体系的探针序列；最后在探针序列的3’方向下游合适位置，按照常规方法设计反向引物。根据本发明的方法设计的引物和探针，可在较高含量野生型模板的背景下有效(高特异性和高效性)扩增目的片段，尤其是针对基因突变中的点突变、缺失突变以及插入突变等，结合荧光实时PCR技术，可以十分有效的解决目前临床上肿瘤检测和药物敏感性检测中灵敏度不足的难点。

Description

一种引物和探针的设计方法
本申请为申请号201610281016.3、申请日2016-04-29、发明名称“一种用于扩增低浓度突变靶序列的引物和探针的设计方法”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种新的设计核酸引物和探针的方法。更具体地，涉及一种用于扩增低浓度突变靶序列的引物和探针的设计方法。
技术背景
许多的疾病与基因突变有着密切的联系，许多情况下的用药后反应的类型与产生也与基因突变有关系。基因突变的检测在许多领域和不太的情况下都具有重要的意义，而基因突变的检测技术往往是利用PCR检测技术。PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。PCR是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA，可用于基因分离克隆、序列分析、基因表达调控、基因多态性研究等许多方面。
DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两份子拷贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火(复性)-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40～60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的，半保留复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
在临床医学方面经常使用PCR技术，如对乙肝病毒、肿瘤、病原体等的检测。如人类许多常见的肿瘤疾病与某些病毒病因及肿瘤相关基因的遗传学改变有着密切的关系。PCR技术在肿瘤病毒病因、肿瘤相关基因、肿瘤相关抑癌基因等研究方面已取得可喜成果。同时也被用于多点突变的遗传病。PCR在法学中应用于亲子鉴定，血型鉴别，以及指纹鉴别等。如对痕量的血迹，无法用传统血清学的方法进行血型检验时，就可采用PCR方法检验ABO和MN血型。对某些犯罪现场的生物材料的检定将为法医提供可靠有效的依据及直接、高效率的数据。
对于PCR检测技术而言，引物和探针的设计是至关重要的首要条件。在利用PCR技术针对检测基因突变，尤其是当野生型DNA量占比较大(即突变较少)时，现有PCR技术的缺点主要体现在引物和探针的设计上，具体表现为：①特异性不好，针对基因突变按照普通方法设计的引物和探针，常常会产生非特异性的扩增条带；②选择性不好，在较高的野生型模板背景下，针对较低含量的基因突变DNA的检测能力有限，而往往大部分引起肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞都是掺杂在野生型细胞内的，因此所提的DNA也是带有大量的野生型DNA的；③在样本量很少，或者是样本中有复杂的背景干扰的情况下，使用提取到的DNA很难产生有效的DNA扩增，甚至导致检测不出，或是造成检测假阴性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有基因突变检测引物和探针设计方法的缺陷和不足，提供一种在高含量野生型DNA背景下扩增低含量突变DNA的引物和探针的设计方法，以及它在核酸检测领域的应用。根据本发明的方法设计的引物和探针，可以在较高野生型模板的背景下有效扩增目的片段，是一种简单、廉价、高效的高特异性的扩增目的片段的PCR扩增引物和探针设计方法。
本发明的另一目的在于提供一种用于扩增低浓度突变靶序列的引物和探针的设计方法。
本发明的再一目的是提供上述引物和探针的设计方法的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种用于扩增低浓度突变靶序列的引物和探针的设计方法，优选地，所述用于扩增低浓度突变靶序列的引物和探针具体是用于扩增低浓度突变DNA的引物和探针(在高野生型DNA背景下扩增低含量突变DNA)。
所述设计方法包括如下步骤：
S1.为更好的解释本发明的技术内容，作如下定义：定义待扩增突变靶序列上的突变点碱基的位数为0位，突变点碱基5’方向为负方向，3’方向为正方向，从突变点向5’方向的碱基的位数依次称为-1，-2，-3……位；从突变点向3’方向的碱基位数依次称为+1，+2，+3……位；
S2.确定待扩增靶序列的突变碱基位置以及欲测定突变类型，即确定0位；
S3.在突变点的负方向，选取包含0位碱基在内的15～25bp的核酸片段作为扩增的前向引物；前向引物的-1位至-4位可按照测定的需要引入单碱基或多碱基错配以调整扩增的特异性和扩增的效率；
S4.在突变点的正方向，从-1位碱基或者0位碱基起选取12～25bp核酸序列作为扩增体系的探针序列；由于探针的序列从-1位或者是0位起始，因此在结构上本发明所述的方法具有一个明显的特征是：前向引物的3’端和探针的5’端有1bp或者是2bp的重叠；
S5.在探针序列的3’方向下游合适位置，按照常规方法设计反向引物。
其中，进一步地，步骤S3中的前向引物引入错配碱基对扩增特异性的影响大小依次是：-1位>-2位>-3位>-4位；即-1位引入错配碱基的扩增特异性最高。
优选地，步骤S4所述探针序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记有相应的淬灭基团。标记基团可为FAM、VIC、HEX等常规标记基团及对应的淬灭基团。
更优选地，所述标记的荧光基团和淬灭基团为FAM和BHQ1。当选用MGB标记时，探针的序列要设计的尽可能短。
优选地，步骤S4所述探针序列上-1位的碱基可以和引物上的相同，也可以和引物上的不同。
另外，优选地，为了使所设计的引物具有合适的Tm值，设计的引物和探针的GC含量宜在40％～60％之间。具体地，前向引物可以通过适当的调整引物的长度和引入的错配碱基的类型以及5’端引入合适长度的无关序列等获得；探针序列可以通过调整探针的长度，标记不同的荧光基团或者在3’端引入无关序列，但是探针的总体设计要求是宜短不宜长。
优选地，步骤S3是在突变点的负方向，选取包含0位碱基在内的18～23bp的核酸片段作为扩增的前向引物。
优选地，步骤S4是在突变点的正方向，从-1位碱基或者0位碱基起选取15～23bp核酸序列作为扩增体系的探针序列。
上述设计方法在设计用于高含量野生型DNA背景下扩增低含量突变DNA的引物和探针中的应用，也在本发明的保护范围之内。
另外，应用本发明设计的引物和探针进行PCR扩增，包括如下步骤：
(1)预变性；
(2)包含若干变性、引物退火和引物延伸循环的第一部分PCR扩增；
(3)包含若干变性，引物退火和引物延伸循环的第二部分PCR扩增。
为了提高产物的扩增效率，第二步骤的循环数设置为3～10个循环，退火温度设置为56℃～65℃，研究结果显示退火温度设定为56℃～65℃时，该温度下最有利于设计的引物和靶序列模板特异性结合，同时设计引物与野生型模板结合的可能性最低，从而使在高含量野生型背景中的突变型模板得以大量的扩增，有利于后续的第三部分循环和整个体系的扩增效率。第三步骤PCR扩增循环数设置为30～45个，优选35个，可根据需要而定，该部分的退火温度较第一部分退火温度低5～8℃。经过第一部分对靶序列的特异性扩增，本部分中的突变型模板和野生型模板的比例已经明显的比初始样品中的比例高，因此把退火温度降低有利于更加有效的进行突变型靶序列的扩增。经过第二个部分的扩增后，少量的突变被富集数百万倍，而野生型模板在整个扩增过程中完全处于结合和荧光产生的劣势，几乎不会有任何的扩增。这样一来，待检测DNA模板中极少量的突变DNA，就可以很好的被检出。研究表明，本方法设计引物和探针能够有效的检测出0.1％甚至以上的突变。
依照本发明设计的引物和探针进行PCR扩增反应时，反应液中的DNA聚合酶，dNTP，Mg2+和体系缓冲液等组分与普通的PCR相同，并可根据不同的反应予以优化。
另外，上述设计方法在设计用于检测基因突变和/或单核苷酸多态性的引物和探针中的应用，也在本发明的保护范围之内。根据此方法设计的引物和/或探针，可以很好地应用于检测基因突变、单核苷酸多态性和/或SNP。
本方法设计的引物和探针的特异性高的原因主要与以下2个方面相关：
(1)引物的设计：先按照常规的设计方法，以突变后的链作为靶序列链进行引物设计，并且将突变点放在引物的3’末端；由于3’末端的匹配对扩增至关重要，因此对于不匹配的野生型模板，该引物的扩增效率极低，这起到了第一重的扩增特异性增强。而后在引物上人为的引入若干错配碱基，错配的碱基引入后扩增出来的新链将和引物完全匹配，而此时原有的野生型链或者是突变型链均不和引物完全匹配，但是突变型链比野生型链更容易和引物匹配，在第一阶段的设置较高的退火温度，就是为了保证扩增过程中尽可能的避免让引物和野生型模板结合，这位特异性扩增提供了第二重保证，从而在初始的几个循环中让低丰度的突变模板富集。
(2)探针设计：本方法中的探针设计基本上是-1或-2位下游的15～22bp的序列，可根据实际测试情况调整探针长度。由于第0位是突变点，探针上也含有0位的突变碱基，因此根据探针的Tm值调整一个合适的退火温度可以让探针优先与靶序列结合而不是野生型序列，这起到了增加特异性的作用。
本发明设计的引物和探针进行PCR扩增反应的示意图如附图1所示。扩增的过程解释如下：在变性温度下，DNA的双链解开，分别形成单链；在初始退火阶段DNA链复性，引物会和DNA模板链进行结合。由于第一阶段的退火温度要高些，对于突变型模板来说，引物的末端和模板上的突变点是匹配的，因此比较容易结合在突变型模板链上；而野生型模板则由于末端不匹配不容易结合在模板链上(虽然是不容易结合，但是仍会有一部分的引物结合在野生型的模板链上)。之后的扩增过程中由于新生成的突变型DNA链和引物完全匹配，导致引物更加容易和突变链结合，经过若干个循环后突变型模板不断的被扩增，而野生型模板则始终不能产生有效扩增，因而导致两者量越差越多，最终实现到突变型荧光信号和野生型荧光信号的有效区分。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明设计的引物和探针最大的特点是引物的3’端和探针的5’端有1～2bp的重叠。这样扩增的时候不仅引物特异而且探针也特异。由此双重的限制更加保证了扩增的特异性和高效性。
(2)本发明设计的前向引物中可以根据扩增的结果和需要引入适当的错配碱基以增加扩增的特异性或者是提高扩增的效率，在保证扩增特异性的前提下可以根据引入的错配优化扩增对应的Ct值，有利于在多重PCR体系的过程的优化。
(3)前向引物中引入的错配碱基在-3或-4位的位置比较优，大部分的基因扩增体系在此处引入错配即可获得比较好的特异性和扩增效率。
(4)本方法设计的探针序列的标记基团可选择FAM、VIC、HEX等常规标记基团及对应的淬灭基团，更优选标记的荧光基团和淬灭基团为FAM和BHQ1。当选用MGB标记时，探针的序列要设计的尽可能短。
基于上述，本发明的引物和探针设计方法针对基因突变中的点突变，缺失突变以及插入突变等，结合荧光实时PCR技术可以十分有效的解决目前临床上肿瘤检测和药物敏感性检测中灵敏度不足的难点。
附图说明
图1为本发明设计的引物和探针进行PCR扩增反应的示意图；包括图a和图b。
图2为实施例1中按照本发明所述方法设计的引物和探针对Kras基因12号密码子上GGT>GCT突变型和野生型的扩增情况。
图3为实施例1中按照普通方法设计的引物和探针对Kras基因12号密码子上GGT>GCT突变型和野生型的扩增情况。
图4为实施例2中按照本发明所述方法设计引物和探针对BRAF基因V600E突变型和野生型的扩增情况。
图5为实施例2中按照普通方法设计引物和探针对BRAF基因V600E突变型和野生型的扩增情况。
图6为实施例3中使用本发明方法设计的引物和探针对PIK3CA基因c.3140A>G突变型和野生型的扩增情况。
图7为实施例3中使用普通方法设计的引物和探针对PIK3CA基因c.3140A>G突变型和野生型的扩增情况。
图8为使用本发明方法设计的引物和探针对BRCA1基因的(c.2311T2C；p.L771L)突变型和野生型的扩增情况。
图9为使用普通方法设计的引物和探针对BRCA1基因c.2311T2C；p.L771L突变型和野生型的扩增情况。
图10为使用本发明方法设计的引物和探针对EGFR基因的c.2573T2G；p.L858R突变型和野生型的扩增情况。
图11为使用普通方法设计的引物和探针对EGFR基因的c.2573T2G；p.L858R突变型和野生型的扩增情况。
图12为使用本专利所述方法设计的引物和探针对NRAS基因的c.182A>G；p.Q61R突变型和野生型的扩增情况。
图13为使用普通方法设计的引物和探针对NRAS基因的c.182A>G；p.Q61R突变型和野生型的扩增情况。
图14为使用本专利所述方法设计的引物和探针对TP53基因的c.524G>A；p.R175H突变型和野生型的扩增情况。
图15为使用普通方法设计的引物和探针对TP53基因的c.524G>A；p.R175H突变型和野生型的扩增情况。
图16为使用本专利所述方法设计的引物和探针对RET基因的c.2753T>C；p.M918T突变型和野生型的扩增情况。
图17为使用普通方法设计的引物和探针对RET基因的c.2753T>C；p.M918T突变型和野生型的扩增情况。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。
本发明上述方法经过大量的研究和实验验证，以下以8个基因的突变检测作为例子进行说明。
实施例1
1、使用本发明所述方法设计引物和探针，进行Kras基因12号密码子上GGT>GCT突变以及对照的野生型样本的不同梯度的荧光PCR扩增测定。
根据Cosmic数据公布的Kras基因12号密码子的野生型基因序列和GGT>GCT突变基因序列，设计一探针为Kras-Pb；引物则分别为Kras-Fp，Kras-Rp。
具体地，按照本发明方法所设计的引物和探针序列如下：
Kras-0Fp：CACTCTTGCCTACGCCTG；
Kras-0Pb：TGCAGCTCCAACTACCAC；
Kras-0Rp：GGCCTGCTGAAAATGACTG。
按照一般的常规的引物和探针设计方法设计的引物和探针如下：
Kras-1Fp：CACTCTTGCCTACGCCTG；
Kras-1Pb：GCTCCAACTACCACAAGTT；
Kras-1Rp：GGCCTGCTGAAAATGACTG。
2、样本的准备：
人工合成一段带有GGT>GCT突变的序列和相应的Kras野生序列，将这两个序列分别装载到质粒中进行扩增。将合成的质粒进行酶切并得到104拷贝数量级的酶切片段，然后对两者进行不同比例的混合，得到含有不同浓度突变型和野生型的样品：100％突变型，50％突变型，10％突变型，5％突变型，1％突变型，0.1％突变型和100％野生型样品模板。
3、实时荧光PCR扩增
(1)实时荧光PCR的体系如表1所示。
表1
组分 加入量(μl)
前向引物(100μM) 0.125
后向引物(100μM) 0.125
探针(100μM) 0.05
Mg<sup>2+</sup>(25mM) 3
dNTP(10mM) 1
热启动酶(5U/μl) 0.3
5*buffer 5
水 14.4
DNA 1
总体积 25
(2)实时荧光PCR反应程序是：
预变性：95℃5min；
第一部分10个循环：95℃20s，62℃30s，72℃20s；
第二部分40个循环：95℃20s，58℃30s，72℃20s并收集荧光信号。
4、检测结果如附图2、附图3和表2所示。
图2表示按照本发明所述方法设计的引物和探针的扩增效果，结果显示，野生型模板扩增很低，能够有效的区分0.1％的突变类型。
图3表示按照普通方法设计的引物和探针的扩增效果，野生型模板扩增的比较明显，仅能区分1％的突变类型。两者的比较见表2。
表2
Figure BDA0002331354740000091
综合比较图2、图3以及表2的扩增效果，可以明显的看出，使用本发明所述方法设计的引物和探针对低浓度的突变型模板有更好的检测特异性。图2中0.1％突变型(约10个拷贝)比例模板与野生型模板的Ct值差为12.27，而同样的模板在普通设计体系中与野生型模板的Ct值差仅为0.92，差1个Ct在实际检测中几乎无法使用。因此大多数按照普通方法设计的引物其检测限一般为1％，而使用本发明所述方法，其检测限远低于1‰，两者相差了上千倍。因而本发明方法所述的引物和探针更加的灵敏和特异，对样本的要求更低。
实施例2
1、使用本发明专利设计的引物和探针进行BRAF V600E突变检测。
根据cosmic数据查询到的BRAF基因的野生型和突变型序列进行如下的引物和探针设计：
按照发明方法设计的BRAFV600E引物和探针：
BRAF-0Fp：CCCACTCCATCGAGATGTCT；
BRAF-0Rp：TGAAGACCTCACAGTAAAA；
BRAF-0Pb：CTCTGTAGCTAGACCA。
按照普通方法设计的BRAFV600E引物和探针序列：
BRAF-1Fp：CCCACTCCATCGAGATTTCT；
BRAF-1Rp：TGAAGACCTCACAGTAAAA；
BRAF-1Pb：CTGTAGCTAGACCAA。
2、样品准备：
人工合成一段带有BRAFV600E突变的的序列和相应的BRAF野生序列，将这两个序列分别装载到质粒中进行扩增。使用酶切体系将合成的质粒进行酶切并得到10^4拷贝数量级的酶切片段，然后对两者进行不同比例的混合，得到含有不同浓度突变型和野生型的样品：100％突变型，50％突变型，10％突变型，5％突变型，1％突变型，0.1％突变型和100％野生型样品模板。
3、实时荧光PCR扩增
(1)实时荧光PCR体系如表3所示。
表3
组分 加入量(μl)
前向引物(100μM) 0.125
后向引物(100μM) 0.125
探针(100μM) 0.05
Mg2+(25mM) 3
dNTP(10mM) 1
热启动酶(5U/μl) 0.3
5*buffer 5
水 14.4
DNA 1
总体积 25
(2)实时PCR反应程序是：
95℃5min；
第一部分10个循环：95℃20s，62℃30s，72℃20s；
第二部分40个循环：95℃20s，55℃30s，72℃20s并收集荧光信号。
4、检测结果如附图4、附图5和表4所示。
图4表示按照本发明所述方法进行引物和探针的设计对BRAF V600E突变的检测效果。
图5表示按照普通方法进行引物和探针的设计对BRAFV600E突变的检测效果。
表4
Figure BDA0002331354740000111
综合比较图4和图5以及表4的扩增效果，可以明显的看出使用本发明所述方法设计的引物和探针对低浓度的突变型模板有更好的检测特异性。图4中0.1％突变型(约10个拷贝)比例模板与野生型模板的Ct值差为4，而同样的模板在普通设计体系中与野生型模板的Ct值差仅为1.2，差1个Ct在实际检测中几乎无法使用。因此大多数按照普通方法设计的引物其检测限一般为1％，而使用本发明所述方法设计引物和探针，其检测限远低于1‰，两者相差了10多倍。因而本发明方法所设计的引物和探针更加的灵敏和特异，对样本的要求更低。
实施例3
1、使用本发明所述方法设计的引物和探针和按照普通的方法设计引物和探针分别进行PIK3CA基因c.3140A>G的突变检测并比较效果。
根据cosmic数据查询到的PIK3CA基因的野生型和突变型序列进行如下的引物和探针设计：
按照本发明方法设计的PIK3CAc.3140A>G引物和探针：
PIK-0Fp：AACAAATGAATGATGCGCG
PIK-0Rp：TGCATGCTGTTTAATTGTGTGG
PIK-0Pb：CGTCATGGTGGCTGGACAACA
按照普通方法设计的PIK3CAc.3140A>G引物和探针序列：
PIK-1Fp：CAAATGAATGATGCACG
PIK-1Rp：TGCATGCTGTTTAATTGTGTGG
PIK-1Pb：ATGGTGGCTGGACAACA
2、样品准备：
人工合成一段带有PIK3CA c.3140A>G突变的的序列和相应的PIK3CA野生序列，将这两个序列分别装载到质粒中进行扩增。使用酶切体系将合成的质粒进行酶切并得到104拷贝数量级的酶切片段，然后对两者进行不同比例的混合，得到含有不同浓度突变型和野生型的样品：100％突变型，50％突变型，10％突变型，5％突变型，1％突变型，0.1％突变型和100％野生型样品模板。
3、实时荧光PCR扩增
(1)实时荧光PCR的体系如表5所示。
表5
Figure BDA0002331354740000121
Figure BDA0002331354740000131
(2)实时PCR反应程序是：
95℃5min；
第一部分10个循环：95℃20s，62℃30s，72℃20s；
第二部分40个循环：95℃20s，55℃30s，72℃20s并收集荧光信号。
4、检测结果如附图6、附图7和表6所示。
图6是使用本发明所述方法设计的引物和探针对PIK3CAc.3140A>G基因的扩增情况。图7是使用普通方法设计的引物和探针对PIK3CAc.3140A>G基因的扩增情况。
表6
Figure BDA0002331354740000132
综合比较图6和图7和表6的扩增效果，可以明显的看出使用本发明所述方法设计的引物和探针对低浓度的突变型模板有更好的检测特异性。图6中0.1％突变型(约10个拷贝)比例模板与野生型模板的Ct值差为5.1，而同样的模板在普通设计体系中与野生型模板的Ct值差仅为1.2，差1个Ct在实际检测中几乎无法使用。因此大多数按照普通方法设计的引物其检测限一般为1％，而使用本发明所述方法，其检测限远低于1‰，两者相差了30多倍。因而本发明方法所述的引物和探针更加的灵敏和特异，对样本的要求更低。
实施例4
1、使用本发明所述方法设计的引物和探针和按照普通的方法设计引物和探针分别进行BRCA1基因的(c.2311T2C；p.L771L)SNP位点的突变检测并比较效果。
根据cosmic数据查询到的BRCA1基因的野生型和突变型序列进行如下的引物和探针设计：
(1)按照本专利方法设计的BRCA1基因的(c.2311T2C；p.L771L)SNP点引物和探针：
BRC-0Fp:AATCAGTACCAGGTAGCAG
BRC-0Rp:GTGGAGAAAGGGTTTTGCAA
BRC-0Pb:GTGAAATACTGCTACTCTC
(2)按照普通方法设计的BRCA1基因的(c.2311T2C；p.L771L)SNP点引物和探针序列：
BRC-1Fp:AATCAGTACCAGGTAGCAG
BRC-1Rp:GTGGAGAAAGGGTTTTGCAA
BRC-1Pb:GAAATACTGCTACTCTCTAC
2、样品准备：
人工合成一段带有BRCA1基因(c.2311T2C；p.L771L)SNP位点的序列和相应的BRCA1野生序列，将其分别装载到质粒中进行扩增。使用酶切体系将合成的质粒进行酶切并得到104拷贝数量级的酶切片段，作为荧光PCR扩增的模板。
3、荧光PCR扩增，其体系如表7所示：
表7
Figure BDA0002331354740000141
Figure BDA0002331354740000151
实时PCR反应程序是：95℃5min；50个循环：95℃20s，51℃30s，72℃30s并收集荧光信号。
4、结果如附图8和9，以及表8所示。
表8
Figure BDA0002331354740000152
综合比较图8、图9和表4的扩增效果，可以明显的看出使用本专利所述方法设计的引物和探针对突变型模板有更好的检测特异性。
实施例5
1、使用本发明专利所述方法设计的引物和探针和按照普通的方法设计引物和探针分别进行EGFR基因的c.2573T2G；p.L858R突变型进行检测并比较效果。
根据cosmic数据查询到的EGFR基因的野生型和突变型序列进行如下的引物和探针设计：
(1)按照本专利方法设计的EGFR基因的c.2573T2G；p.L858R突变型引物和探针：
EGFR-0Fp:CAAGATCACAGATTTTGCGCG
EGFR-0Rp:CTTACTTTGCCTCCTTCTGC
EGFR-0Pb:GGGCCAAACTGCTGGGT
(2)按照普通方法设计的EGFR基因的c.2573T2G；p.L858R突变型引物和探针序列：
EGFR-1Fp:CAAGATCACAGATTTTGCGCG
EGFR-1Rp:CTTACTTTGCCTCCTTCTGC
EGFR-1Pb:GCCAAACTGCTGGGTGCGGA
2、样品准备：
人工合成一段带有EGFR基因c.2573T2G；p.L858R突变位点的序列和相应的EGFR野生序列，并将其分别装载到质粒中进行扩增。使用酶切体系将合成的质粒进行酶切并得到104拷贝数量级的酶切片段，作为荧光PCR扩增的模板。
3、荧光PCR扩增，其体系如表9所示。
表9：
组分 加入量(μl)
前向引物(100μM) 0.125
后向引物(100μM) 0.125
探针(100μM) 0.05
Mg2+(25mM) 3
dNTP(10mM) 1
热启动酶(5U/μl) 0.3
5*buffer 5
Water 14.4
DNA 1
Total 25
实时PCR反应程序是：95℃5min；50个循环：95℃20s，48℃30s，72℃30s并收集荧光信号。
4、结果如附图10、图11和表10所示。
表10
Figure BDA0002331354740000161
Figure BDA0002331354740000171
综合比较图10和图11和表10的扩增效果，可以明显的看出使用本专利所述方法设计的引物和探针对突变型模板有更好的检测特异性。
实施例6
1、使用本发明方法设计的引物和探针和按照普通的方法设计引物和探针分别进行NRAS基因的c.182A>G；p.Q61R突变型进行检测并比较效果。
根据cosmic数据查询到的NRAS基因的野生型和突变型序列进行如下的引物和探针设计：
(1)按照本专利方法设计的NRAS基因的c.182A>G；p.Q61R突变型引物和探针：
NRAS-0Fp:CATGGCACTGTACTCTGCTC
NRAS-0Rp:ACCCCCAGGATTCTTACAGA
NRAS-0Pb:CGTCCAGCTGTATCCAGTATG
(2)按照普通方法设计的NRAS基因的c.182A>G；p.Q61R突变型引物和探针序列：
NRAS-1Fp:CATGGCACTGTACTCTGCTC
NRAS-1Rp:ACCCCCAGGATTCTTACAGA
NRAS-1Pb:CCAGCTGTATCCAGTATGTCC
2、样品准备：
人工合成一段带有NRAS基因c.182A>G；p.Q61R突变位点的序列和相应的NRAS野生序列，并将其分别装载到质粒中进行扩增。使用酶切体系将合成的质粒进行酶切并得到104拷贝数量级的酶切片段，作为荧光PCR扩增的模板。
3、荧光PCR扩增，其体系如表11所示。
表11
Figure BDA0002331354740000172
Figure BDA0002331354740000181
实时PCR反应程序是：95℃5min；50个循环：95℃20s，48℃30s，72℃30s并收集荧光信号。
4、结果如附图12、图13和表12所示。
表12
Figure BDA0002331354740000182
综合比较图12和图13和表12的扩增效果，可以明显的看出使用本专利所述方法设计的引物和探针对突变型模板有更好的检测特异性。
实施例7
1、使用本发明专利所述方法设计的引物和探针和按照普通的方法设计引物和探针分别进行TP53基因的c.524G>A；p.R175H突变型进行检测并比较效果。
根据cosmic数据查询到的TP53基因的野生型和突变型序列进行如下的引物和探针设计：
(1)按照本专利方法设计的TP53基因的c.524G>A；p.R175H突变型引物和探针：
TP53-0Fp:GCTCATGGTGGGGGTAGT
TP53-0Rp:TTGATTCCACACCCCCGCC
TP53-0Pb:TGCCTCACAACCTCCGTC
(2)按照普通方法设计的TP53基因的c.524G>A；p.R175H突变型引物和探针序列：
TP53-1Fp:GCTCATGGTGGGGGTAGT
TP53-1Rp:TTGATTCCACACCCCCGCC
TP53-1Pb:ACAACCTCCGTCATGTGCTG
2、样品准备：
人工合成一段带有TP53基因c.524G>A；p.R175H突变位点的序列和相应的TP53野生序列，并将其分别装载到质粒中进行扩增。使用酶切体系将合成的质粒进行酶切并得到104拷贝数量级的酶切片段，作为荧光PCR扩增的模板。
3、荧光PCR扩增，其体系如表13所示。
表13
组分 加入量(μl)
前向引物(100μM) 0.125
后向引物(100μM) 0.125
探针(100μM) 0.05
Mg2+(25mM) 3
dNTP(10mM) 1
热启动酶(5U/μl) 0.3
5*buffer 5
Water 14.4
DNA 1
Total 25
实时PCR反应程序是：95℃5min；50个循环：95℃20s，48℃30s，72℃30s并收集荧光信号。
4、结果如附图14、图15和表14所示。
表14
Figure BDA0002331354740000191
Figure BDA0002331354740000201
综合比较图13和图14和表7的扩增效果，可以明显的看出使用本专利所述方法设计的引物和探针对突变型模板有更好的检测特异性。
实施例8
1、使用本发明专利所述方法设计的引物和探针和按照普通的方法设计引物和探针分别进行RET基因的c.2753T>C；p.M918T突变型进行检测并比较效果。
根据cosmic数据查询到的RET基因的野生型和突变型序列进行如下的引物和探针设计：
(1)按照本专利方法设计的RET基因的c.2753T>C；p.M918T突变型引物和探针：
RET-0Fp:CGGATTCCAGTTAAATCGAC
RET-0Rp:TCACTTTGCGTGGTGTAGAT
RET-0Pb:ACGGCAATTGAATCCCT
(2)按照普通方法设计的RET基因的c.2753T>C；p.M918T突变型引物和探针序列：
RET-1Fp:CGGATTCCAGTTAAATCGAC
RET-1Rp:TCACTTTGCGTGGTGTAGAT
RET-1Pb:GCAATTGAATCCCTTCTTG
2、样品准备：
人工合成一段带有RET基因c.2753T>C；p.M918T突变位点的序列和相应的RET野生序列，将两个序列分别装载到质粒中进行扩增。使用酶切体系将合成的质粒进行酶切并得到104拷贝数量级的酶切片段，作为荧光PCR扩增的模板。
3、荧光PCR扩增，其体系如表15所示。
表15
Figure BDA0002331354740000202
Figure BDA0002331354740000211
实时PCR反应程序是：95℃5min；50个循环：95℃20s，48℃30s，72℃30s并收集荧光信号。
4、结果如附图16、图17和表16所示。
表16
Figure BDA0002331354740000212
综合比较图15和图16和表16的扩增效果，可以明显的看出使用本专利所述方法设计的引物和探针对突变型模板有更好的检测特异性。

Claims (10)

1.一种引物的设计方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.待扩增突变靶序列上的突变点碱基的位数为0位，突变点碱基5’方向为负方向，3’方向为正方向，从突变点向5’方向的碱基的位数依次称为-1，-2，-3……位；从突变点向3’方向的碱基位数依次称为+1，+2，+3……位；
S2.确定待扩增突变靶序列的0位；
S3.在突变点的负方向，选取包含0位碱基在内的15～25bp的核酸片段作为扩增的前向引物。
2.一种探针的设计方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.待扩增突变靶序列上的突变点碱基的位数为0位，突变点碱基5’方向为负方向，3’方向为正方向，从突变点向5’方向的碱基的位数依次称为-1，-2，-3……位；从突变点向3’方向的碱基位数依次称为+1，+2，+3……位；
S2.确定待扩增突变靶序列的0位；
S4.在突变点的正方向，从-1位碱基或者0位碱基起选取12～25bp核酸序列作为扩增体系的探针序列。
3.一种引物和探针的设计方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.待扩增突变靶序列上的突变点碱基的位数为0位，突变点碱基5’方向为负方向，3’方向为正方向，从突变点向5’方向的碱基的位数依次称为-1，-2，-3……位；从突变点向3’方向的碱基位数依次称为+1，+2，+3……位；
S2.确定待扩增突变靶序列的0位；
S3.在突变点的负方向，选取包含0位碱基在内的15～25bp的核酸片段作为扩增的前向引物；
S4.在突变点的正方向，从-1位碱基或者0位碱基起选取12～25bp核酸序列作为扩增体系的探针序列。
4.根据权利要求3所述的设计方法，其特征在于，还包括如下步骤：
S5.在探针序列的3’方向下游合适位置，按照常规引物设计方法设计反向引物。
5.根据权利要求2或3所述的设计方法，其特征在于，步骤S4所述探针序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记有相应的淬灭基团；
优选地，步骤S4所述探针序列上-1位的碱基和引物上的相同或不同；
优选地，步骤S4是在突变点的正方向，从-1位碱基或者0位碱基起选取15～23bp核酸序列作为扩增体系的探针序列。
6.根据权利要求1或3所述的设计方法，其特征在于，步骤S3是在突变点的负方向，选取包含0位碱基在内的18～23bp的核酸片段作为扩增的前向引物。
7.根据权利要求1或3所述的设计方法，其特征在于，所述引物具体是用于扩增低浓度突变DNA的引物。
8.根据权利要求2或3所述的设计方法，其特征在于，所述探针具体是用于扩增低浓度突变DNA的探针。
9.权利要求1～4任一所述设计方法在设计用于野生型DNA背景下扩增突变DNA的引物和/或探针中的应用；
优选地，所述野生型DNA背景为高含量野生型DNA背景；
优选地，所述突变DNA为低含量突变DNA；
优选地，所述设计方法在设计用于检测基因突变和/或单核苷酸多态性的引物和/或探针中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，利用所设计的引物和/或探针进行PCR扩增的方法包括如下步骤：
(1)预变性；
(2)包含若干变性、引物退火和引物延伸循环的第一部分PCR扩增；
(3)包含若干变性、引物退火和引物延伸循环的第二部分PCR扩增。
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