CN114134208B - 荧光定量pcr试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法 - Google Patents

荧光定量pcr试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法，所述增敏荧光定量PCR试剂盒包括引物，以及两条以上的荧光探针，其中所述两条以上的荧光探针均具有与PCR模板互补的结合位点，在每一轮PCR过程中，扩增的一个DNA分子对应多个荧光信号的产生，从而提高了对样本的检测灵敏度。

Description

荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法
技术领域
本发明涉及荧光定量PCR技术领域，尤其涉及一种荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法。
背景技术
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)在各个领域具有广泛的应用前景：如产前诊断、疾病诊断、治疗和预后等。该技术是在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，并可结合相应的软件对产物进行定量分析，从而获得起始目的基因的初始浓度。能够满足此目的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异的引物或探针，常用的包括DNA结合染料如SYBR Green和Taq man探针。在目前的系统中，针对一个扩增靶标只设计一对特异性的引物和一条探针，扩增结果非常依赖探针的设计质量，比如当探针的结合效率不高时，可能会出现假阴性结果，由于收集荧光的仪器本身存在一定的检测下限，当目标DNA的含量处于仪器检测的临界值时，容易出现没有信号值或多次检测Ct值不稳定的情况，造成结果不易判读，例如在通过检测样本中是否存在循环肿瘤DNA(ctDNA)来检测癌症时，由于样本中的ctDNA的拷贝数可能非常少，如何利用有限的DNA分子就显得极为重要。因此，有必要发明一种增强荧光信号的PCR系统，提高样本的检测灵敏性。
发明内容
本发明实施例提供一种荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法，旨在改善样本的检测灵敏性低的问题。
为解决上述问题，第一方面，本申请提供一种荧光定量PCR试剂盒，包括引物，以及两条以上的荧光探针，其中所述两条以上的荧光探针均具有与PCR模板互补结合的结合位点。
在一些实施方式中，所述PCR模板为含两条互补或反向互补核苷酸链的双链DNA分子，所述两条以上的荧光探针互补结合于所述DNA分子中的同一条或不同的核苷酸链。
在一些实施方式中，所述PCR模板为单链DNA。在一些实施方式中，所述单链DNA为双链DNA经转化得到的两条不互补的核苷酸单链，所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对和第二引物对能够分别扩增所述两条不互补的核苷酸链生成互补链。
在一些实施方式中，所述两条以上的荧光探针互补结合于所述单链DNA或其互补链中的同一条或不同的核苷酸链。进一步的，所述两条不互补的核苷酸单链分别包括如SEQID NO.2所示的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述第一引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述第二引物对如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示；
所述荧光探针包括如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的探针，其中，所述SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的荧光探针可以互补结合于SEQID NO.2所示的核苷酸序列或其互补链，所述SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的荧光探针可以互补结合于SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或其互补链。
在一些实施方式中，所述荧光探针为TaqMan探针，所述TaqMan探针的发光基团可以为FAM、HEX、JOE、VIC、TET、ROX、Texas-Red、CY5或CY3中的一种或多种；所述TaqMan探针的猝灭基团可以为TAMRA、BHQ、DABCYL、MGB或ECLIPSE中的一种或多种。
在一些实施例中，所述单链DNA可以由本领域已知的方法来获得，例如：亚硫酸氢盐转化法、氧化-亚硫酸盐转化法、蛋白或抗体富集法、限制性内切酶法或酶促反应法。其中，所述亚硫酸氢盐可以为重亚硫酸氢盐。
第二方面，本申请提供一种以上第一方面所述的荧光定量PCR试剂盒在制备基因检测试剂中的应用，例如在制备SDC2基因甲基化检测试剂中的应用。
第三方面，本申请还提供一种荧光定量PCR系统，包括：
模板、引物及两条以上的荧光探针，其中所述两条以上的荧光探针均具有与所述模板互补的结合位点。
在一些实施例中，所述模板含两条互补或反向互补核苷酸链的双链DNA分子或者单链DNA，所述两条以上的荧光探针可以互补结合于所述模板中的同一条或不同的核苷酸链。
第四方面，本申请提供一种核酸定量检测方法，是采用第一方面中所述的荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR检测，或者是采用第三方面中所述荧光定量PCR系统。
有益效果：本发明通过提供一种荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法，所述荧光定量PCR试剂盒包括引物，以及两条以上的荧光探针，其中所述两条以上的荧光探针均具有与PCR模板互补的结合位点，通过在每一轮PCR过程中，新产生一个DNA分子对应着多个荧光信号的产生。突破现有技术中，一条模板对应一对引物，以及一条荧光探针，在每一轮PCR过程中，新产生一个DNA分子只对应着一个荧光信号的产生的问题。从而提高了对样本的检测灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是现有的荧光定量PCR反应系统的原理示意图；
图2是本发明实施例提供的一个敏荧光定量PCR反应系统的原理示意图；
图3是本发明实施例提供的又一个敏荧光定量PCR反应系统的原理示意图；
图4是本发明实施例中实施例1提供的阳性对照、系统3、系统1、系统2和阴性对照的PCR扩增曲线图；
图5是本发明实施例中实施例2提供的阳性对照、系统6、系统4、系统5和阴性对照的PCR扩增曲线图；
图6是本发明实施例中实施例3提供的阳性对照、系统9、系统8、系统7和阴性对照的荧光值的差值PCR扩增曲线图。
具体实施方式
术语定义与说明
术语“PCR”或“PCR扩增”是指聚合酶链反应。
术语“引物”是指够在PCR反应中充当DNA复制反应起始子的寡核苷酸DNA。
术语“荧光探针”是指具有荧光标签的寡核苷酸，所述荧光标签能够改变荧光强度。本领域技术人员可以理解，本发明中荧光探针可以是本领域已知的任何用于PCR定量的荧光标记分子，只要其和靶序列(PCR模板)可以发生特异性结合并因此发生荧光强度的变化，进而显示靶序列中特定片段的数量即可实现本发明的目的。在一些实施方式中，所述荧光探针为TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、分子信标探针(Molecular Beacons)、荧光能量共振转移探针(又称Light Cycler探针)、置换探针、UT探针、蝎子引物(Scorpions)、LUX引物(Invitrogen)和Amplifier引物或双环探针中的一种或多种。在一些实施方式中，所述荧光探针可以为依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针，例如，TaqMan探针；也可以为不依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针，例如分子信标探针和置换探针。
术语“核苷酸”应当在本文中理解为除了指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸之外，还指相对于正在使用的核苷酸的特定上下文(例如，杂交至互补碱基)，在功能上等同的其相关的结构变体，包括衍生物和类似物。
本发明中，“DNA甲基化”是一种表观修饰，它是在不改变碱基序列的情况下，对基因表达进行调控，所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。在一个实施方案中，可以采用亚硫酸氢盐转化的方法来区分甲基化和未甲基化的胞嘧啶(C)，亚硫酸氢盐转化过程包括变性、脱氨基和脱磺酸基，通过变性过程，DNA双链变成两条单链，通过脱氨基和脱磺酸基过程，未甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U)，在后续的PCR过程中进一步转变成胸腺嘧啶(T)，而甲基化的胞嘧啶(C)保持不变。经过以上步骤，原本互补的两条DNA链(正义链和反义链)被转化成两条完全不互补的两条DNA单链。在本发明实施例中，术语“C-T转化”指的是DNA分子序列中的胞嘧啶(C)为胸腺嘧啶(T)置换，属于碱基转换的一种类型。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
本发明实施例中涉及的引物和荧光探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明实施例中涉及的HA Buffer、probe buffer、dNTP、Taq酶和纯化水均购置于天根生化科技(北京)有限公司。
本发明实施例中涉及的试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit购自于Qiagen公司，试剂盒EZ DNA Methylation-Gold TM Kit购自于ZYMO RESEARCH生物科技公司。
本发明实施例中涉及的结直肠癌组织样本由武汉大学中南医院提供，实验过程中进行样本匿名化处理，且仅作为研究实验目的使用。
实施例1
本发明实施例1以结直肠癌SDC2基因为例，利用荧光定量PCR系统检测SDC2基因。
现有技术利用甲基化荧光法来检测结直肠癌SDC2基因的甲基化，如图1所示，即一条模板对应一对引物，以及一条荧光探针，在每一轮PCR过程中，新产生一个DNA分子只对应着一个荧光信号的产生，这种往往存在检测灵敏度不高的问题。为解决以上问题，如图2所示，本发明实施例提供了一种荧光定量PCR系统，对SDC2的每条DNA链各设计一对引物和一个以上的探针，用于检测C-T转化后的SDC2基因。
SDC2基因其中两条反向互补链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示，假设两条链完全甲基化，将两条反向互补链经亚硫酸氢盐C-T转化后形成了两条不互补的序列：分别如SEQ ID NO.2所示及SEQ ID NO.4所示。
实施例1所用到的荧光定量PCR系统包括：模板、缓冲液、dNTP、Taq酶、荧光探针以及引物组合，所述引物对和所述荧光探针组合参阅表1。
表1.实施例1中涉及到的引物对和探针组合
Figure BDA0002883707450000061
上述所有探针的发光基团均为FAM，猝灭基团均为MGB。在本申请其他实施例中，可以根据情况更换为其他的发光基团或者猝灭基团。
将SEQ ID NO.2构建到载体上，形成质粒1，将SEQ ID NO.2对应的完全非甲基化序列(即SEQ ID NO.2中所有的C均变成T)也构建到载体上，形成质粒2。将SEQ ID NO.4构建到载体上，形成质粒3，将SEQ ID NO.4对应的完全非甲基化序列(即SEQ ID NO.4中所有的C均变成T)也构建到载体上，形成质粒4。
合成质粒1、2、3和4，合成完成后，按照试剂说明向质粒粉末中加入buffer TE，按照如下公式(1)计算质粒溶液的浓度，然后将质粒溶液依次稀释到106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL。
公式(1)：
(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)＝质粒浓度(copies/μL)
将104copies/μL的质粒1和质粒2按照体积比1:99的比例混合，形成混合质粒1。
将混合质粒1作为模板，进行荧光定量PCR检测，一共设置3组系统，分别为系统1、系统2以及系统3，其中系统3设置有双探针，其余组设置有单探针。所述荧光定量PCR反应系统中的各成分的配置参照下表2。
表2：实施例1中的荧光定量PCR反应系统中各个成分的配置表
Figure BDA0002883707450000071
在表2的反应系统中，关于引物的选择：系统1、系统2以及系统3为表1中引物对1的正向引物1和逆向引物1；
关于探针的选择：系统1为探针1，用量为0.5μL。系统2为探针2，用量为0.5μL，系统1和系统2均为单探针组。系统3为探针1和探针2，为双探针组。
与单探针组不同的是，双探针组的探针1用量为0.5μL，探针2的用量为0.5μL，一共用量为1μL，纯化水用量为12μL，目的是保持系统溶液总体积一致。
其中，荧光定量PCR反应系统程序参照下表3进行：
表3：实施例1中荧光定量PCR反应系统的反应程序
Figure BDA0002883707450000081
本发明实施例中，每个PCR系统均设置阳性对照和阴性对照，阳性对照的模板是完全甲基化的质粒，对于PCR系统1、2和3，该阳性对照为浓度为104copies/μL的质粒1；阴性对照为完全非甲基化的质粒，对于PCR系统1、2、和3，该阴性质粒为浓度为104copies/μL质粒2。每种模板设置两个复孔。
实验结果如下：
如图4所示：分别代表了阳性对照、系统3、系统1、系统2和阴性对照的荧光值的差值。从图4中可以看出，所有阳性对照均能明显扩增，阴性对照均无扩增。其中：
系统3两个孔的Ct值的平均值为31.99；
系统1两个孔的Ct值的平均值为32.94；
系统2两个孔的Ct值的平均值为33.24；
以上表明系统1-3均能扩增浓度为104copies/μL总DNA分子中占比为1％的目标DNA。此外，系统3相对于系统1和2，Ct值有提前，且线形更好。
上述结果表明，同样的模板，多个探针且多个探针互补结合于同一条核苷酸链比单个探针互补结合于同一条核苷酸链的系统Ct值有提前，检测灵敏度更好，本发明实施例中的荧光定量PCR系统适用于检测SDC2基因，并能提高检测的灵敏度。
实施例2
为了更好的证明本发明实施例中的荧光定量PCR系统的检测灵敏度，在上述实施例1的基础上，本发明还提供了实施例2，与上述实施例1不同的是，实施例2是将104copies/μL的质粒1和质粒2按照体积比1:999的比例混合，形成混合质粒2。
将混合质粒2作为模板，进行荧光定量PCR检测，一共设置3组系统，分别为系统4、系统5以及系统6，其中系统6设置有双探针，其余组设置有单探针。所述荧光定量PCR反应系统中的各成分的配置参照下表4。
表4：实施例2中的荧光定量PCR反应系统中各个成分的配置表
Figure BDA0002883707450000091
在表4的反应系统中，关于引物的选择：系统4、系统5以及系统6为表1中引物对1中的正向引物1和逆向引物1；
关于探针的选择：系统4为探针1，用量为0.5μL。系统5为探针2，用量为0.5μL，系统4和系统5均为单探针组。系统6为探针1和探针2，为双探针组。
与单探针组不同的是，双探针组的探针1用量为0.5μL，探针2的用量为0.5μL，一共用量为1μL，纯化水用量为12μL，目的是保持系统溶液总体积一致。
实施例2的其他实验条件，例如荧光定量PCR反应系统程序与实施例1相同，此处不再赘述。
本发明实施例中，每个PCR系统均设置阳性对照和阴性对照，阳性对照的模板是完全甲基化的质粒，对于PCR系统4、5和6，该阳性对照为浓度为104copies/μL的质粒1；阴性对照为完全非甲基化的质粒，对于PCR系统4、5和6，该阴性质粒为浓度为104copies/μL质粒2。每种模板设置两个复孔。
实验结果如下：
如图5所示的曲线分别代表了阳性对照、系统6、系统4、系统5和阴性对照的荧光值的差值。从图5中可以看出，所有阳性对照均能明显扩增，阴性对照均无扩增。其中：
系统6两个孔的Ct值的平均值为35.13；
系统4两个孔的Ct值的平均值为36.13；
系统5两个孔的Ct值的平均值为37.05；
以上表明系统4-6均能扩增浓度为104copies/μL总DNA分子中占比为0.1％的目标DNA。此外，系统6相对于系统1和2，Ct值有提前，且线形更好。
上述结果表明，相比实施例1，实施例2中的目标DNA的浓度更小，进一步说明了本发明实施例中的增敏荧光定量PCR系统适用于检测SDC2基因，并能提高检测的灵敏度。
实施例3
在上述实施例1和实施例2的基础上，本发明还提供实施例3，实施例3的反应机理如图3所示。与上述实施例1和实施例2不同的是，实施例3是利用增敏荧光定量PCR系统检测ACTB基因，且两条探针结合于两条不同核苷酸链上，旨在验证多条探针且多条探针位于不同核苷酸链上的系统比单条探针位于一条核苷酸链上的系统检测灵敏度更好。
其中所述ACTB基因中的一条核苷酸链的序列为SEQ ID NO.13。
实施例3所用到的增敏荧光定量PCR系统包括：模板、缓冲液、dNTP、Taq酶、荧光探针以及引物组合，所述引物对和所述荧光探针组合参阅表5。
表5.实施例3中涉及到的引物对和探针组合
Figure BDA0002883707450000111
其中，正向引物3和探针5和上述序列中的某一段碱基相同，逆向引物3和探针6与上述序列的反向互补序列中的某一段碱基相同。
将SEQ ID NO.13构建到载体上，形成质粒5。将合成好的质粒稀释到104copies/μL，用作PCR系统7-9的阳性对照。
提取3×105个HT29细胞的基因组，用作PCR系统7-9的模板DNA。
对PCR系统7-9设置NTC对照(阴性对照)，即模板DNA用纯化水代替。
每个模板设置两个复孔。所述荧光定量PCR反应系统中的各成分的配置参照下表6。
表6：实施例3中的荧光定量PCR反应系统中各个成分的配置表
Figure BDA0002883707450000121
在所述表6的反应系统中，关于引物的选择：系统7、系统8以及系统9为表5中引物对3的正向引物3和逆向引物3；
关于探针的选择：系统7为探针5，用量为0.5μL。系统8为探针6，用量为0.5μL，系统7和系统8均为单探针组。系统9为探针5和探针6，为双探针组。
与单探针组不同的是，双探针组的探针5用量为0.5μL，探针6的用量为0.5μL，一共用量为1μL，纯化水用量为12μL，目的是保持系统溶液总体积一致。
实施例3的其他实验条件，例如荧光定量PCR反应系统程序与实施例1相同。
实验结果如下：
如图6所示的曲线分别代表了阳性对照、体系9、体系8、体系7和阴性对照的荧光值的差值。从图6中可以看出，所有阳性对照均能明显扩增，阴性对照均无扩增。其中：
系统9两个孔的Ct值的平均值为30.43；
系统8两个孔的Ct值的平均值为31.14；
系统7两个孔的Ct值的平均值为31.25；
由此可见，系统9相对于系统7和8，Ct值有提前，且线形更好。
上述结果表明，同样的模板，多个探针且多个探针互补结合于不同核苷酸链的系统比单个探针互补结合于同一条核苷酸链的系统Ct值有提前，检测灵敏度更好，本发明实施例中的增敏荧光定量PCR系统适用于检测ACTB基因，并能提高检测的灵敏度。
实施例4
实施例4利用本发明的增敏荧光定量PCR系统检测组织样本中的SDC2基因。
选取50例结直肠癌组织样本和50例正常的结直肠组织样本，所有样本均为由福尔马林浸泡、石蜡包埋的样本，对100例样本进行如下操作：
(1)基因组提取
利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒对组织样本DNA进行提取，具体操作参见试剂盒说明书。
(2)亚硫酸氢盐转化
利用ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold TM Kit试剂盒对组织样本DNA进行核酸转化，以获得各个结直肠癌组织样本用于荧光定量PCR检测的样本，具体实验操作参见厂家说明书。
(3)荧光定量PCR系统检测
将进行了核酸转化了的组织样本DNA作为模板，进行荧光定量PCR检测，一共设置三组系统，分别为系统10、系统11以及系统12，其中系统11和系统12设置有双探针，系统10设置有单探针。所述荧光定量PCR反应系统中的各成分的配置参照表7。
表7：实施例4中的荧光定量PCR反应系统中各个成分的配置表
Figure BDA0002883707450000141
其中，关于引物的选择：系统10、系统11以及系统12中为引物对1中的正向引物1和逆向引物1及引物对2中的正向引物2和逆向引物2；
关于探针的选择：系统10为探针1，用量为0.5μL，为单探针组。系统11为探针1和探针3，用量分别为0.5μL。系统12为探针1和探针4，用量分别为0.5μL，系统11和系统12为双探针组。
与单探针组不同的是，双探针组的纯化水用量为11μL，目的是保持系统溶液总体积一致。
关于模板的选择：系统10、系统11以及系统12中模板均为转化后的组织样本DNA。
荧光定量PCR反应系统程序参照表3进行。
每个PCR系统均要设置阳性对照和阴性对照，阳性对照的模板是完全甲基化的质粒，对于PCR系统10和11，该阳性对照为质粒1，对于PCR系统12，该阳性质粒为质粒1和3等体积混合成的质粒；阴性为完全非甲基化的质粒，对于PCR系统10和11，该阴性质粒为质粒2，对于PCR系统12，该阴性质粒为质粒2和4等体积混合成的质粒。
调整基线，将荧光值ΔR＝25000设置为阈值，输出每个组织样本的检测Ct值，将SDC2的Ct值＝38设置为cut-off值，即若样本的SDC2的Ct值小于等于38，即为SDC2甲基化阳性，若样本的SDC2的Ct值大于38，即为SDC2甲基化阴性。计算每个系统下的敏感性和特异性：
敏感性(Sensitivity)＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％；
特异性(Specificity)＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％。
实验结果参阅表8，从表中可以看出，PCR系统11和12的检测敏感性明显高于系统10，三者的特异性相当。
表8：实施例4中每个系统下的敏感性和特异性
系统10 系统11 系统12
灵敏度 82％ 94％ 96％
特异性 96％ 94％ 96％
上述结果表明，系统10只使用了一个荧光探针，系统11和12使用了两个荧光探针，系统11和12对于50例结直肠癌样本的检测灵敏度均在90％以上，远远大于系统10，三者的检测特异性相当，表明使用两个荧光探针能提高检测效果。
以上对本发明所提供的一种荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法
<141> 2021-01-04
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gagcaccaac tccgtgtcgg gagtgcagaa accaacaagt gagagggcgc cgcgttcccg 60
gggcgcagct gcgggcggcg ggagcaggcg caggaggagg aagcgagcgc ccccgagccc 120
cgagcccgag tccccgagcc tgagccgcaa tcgctgcggt actctgctcc ggattcgtgt 180
gcgcgggctg cgccgagcgc tgggcaggag gcttcgtttt gccctggttg caagcagcgg 240
ctgggagcag ccggtccctg gggaatatgc ggcgcgcgtg gatcctgctc accttgggct 300
tggtggcctg cgtgtcggcg gagtcggtga 330
<210> 2
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagtattaat ttcgtgtcgg gagtgtagaa attaataagt gagagggcgt cgcgttttcg 60
gggcgtagtt gcgggcggcg ggagtaggcg taggaggagg aagcgagcgt tttcgagttt 120
cgagttcgag ttttcgagtt tgagtcgtaa tcgttgcggt attttgtttc ggattcgtgt 180
gcgcgggttg cgtcgagcgt tgggtaggag gtttcgtttt gttttggttg taagtagcgg 240
ttgggagtag tcggtttttg gggaatatgc ggcgcgcgtg gattttgttt attttgggtt 300
tggtggtttg cgtgtcggcg gagtcggtga 330
<210> 3
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
tcaccgactc cgccgacacg caggccacca agcccaaggt gagcaggatc cacgcgcgcc 60
gcatattccc cagggaccgg ctgctcccag ccgctgcttg caaccagggc aaaacgaagc 120
ctcctgccca gcgctcggcg cagcccgcgc acacgaatcc ggagcagagt accgcagcga 180
ttgcggctca ggctcgggga ctcgggctcg gggctcgggg gcgctcgctt cctcctcctg 240
cgcctgctcc cgccgcccgc agctgcgccc cgggaacgcg gcgccctctc acttgttggt 300
ttctgcactc ccgacacgga gttggtgctc 330
<210> 4
<211> 329
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttatcgattt cgtcgatacg taggttatta agtttaaggt gagtaggatt tacgcgcgtc 60
gtatattttt tagggatcgg ttgtttttag tcgttgtttg taattagggt aaaacgaagt 120
tttttgttta gcgttcggcg tagttcgcgt atacgaattc ggagtagagt atcgtagcga 180
ttgcggttta ggttcgggga ttcgggttcg gggttcgggg gcgttcgttt tttttttttg 240
cgtttgtttt cgtcgttcgt agttgcgttt cgggaacgcg gcgttttttt atttgttggt 300
ttttgtattt tcgatacgga gttggtgtt 329
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtattaattt cgtgtcggga gt 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atccgaaaca aaataccgca 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
attaataagt gagagggcgt cgcgt 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agtaggcgta ggaggaggaa gcga 24
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agtttaaggt gagtaggatt tacgc 25
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caactacgaa cgacgaaaac aa 22
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gggatcggtt gtttttagtc gttgt 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aagttttttg tttagcgttc ggcgt 25
<210> 13
<211> 300
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
caggccagac gggggacatg cagaaagtgc aaagaacacg gctaagtgtg ctggggtctt 60
gggatgggga gtctgttcag acctactgtg cacctactta atacacactc caaggccgct 120
ttacaccagc ctcatggcct tgtcacacga gccagtgtta gtacctacac ccacaacact 180
gtcttagaca cctagtcaga gagacaaaca ccagaaaaag agctcatctg ggaaaaagca 240
aatagaacct gcagagttcc aaaggagact caggtcagag aagagagtcc tacggaaaac 300
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaagtgcaaa gaacacggct aa 22
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctctttttct ggtgtttgtc tctct 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acttaataca cactccaagg ccgct 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acagtaggtc tgaacagact cccca 25

Claims (9)

1.一种荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括引物，以及两条以上的荧光探针，其中所述两条以上的荧光探针均具有与PCR模板互补的结合位点，所述PCR模板为单链DNA，且所述两条以上的荧光探针均互补结合于同一条核苷酸链。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述单链DNA为双链DNA经转化得到的两条不互补的核苷酸链，所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对和第二引物对能够分别扩增所述两条不互补的核苷酸链生成互补链。
3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述两条以上的荧光探针互补结合于所述单链DNA或其互补链中的同一条核苷酸链。
4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述两条不互补的核苷酸链分别包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述第一引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述第二引物对如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
所述荧光探针包括如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.11、和SEQ ID NO.12所示的探针，其中，所述SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的荧光探针可以互补结合于SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列或其互补链，所述SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的荧光探针可以互补结合于SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或其互补链。
5.权利要求1-4任一项所述的荧光定量PCR试剂盒在制备基因检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的荧光定量PCR试剂盒在制备基因检测试剂中的应用，其特征在于，所述基因检测试剂为SDC2基因甲基化检测试剂。
7.一种荧光定量PCR系统，其特征在于，包括：
模板、引物及两条以上的荧光探针，其中，所述模板为单链DNA，所述两条以上的荧光探针均具有与所述模板互补的结合位点，且均互补结合于同一条核苷酸链。
8.根据权利要求7所述的荧光定量PCR系统，其特征在于，所述模板含两条互补或反向互补核苷酸链的单链DNA，所述两条以上的荧光探针可以互补结合于所述模板中的同一条或不同的核苷酸链。
9.一种非诊断目的的核酸定量检测方法，其特征在于，是采用权利要求1至4任一项中所述的荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR检测，或者是采用如权利要求7或8所述的一种荧光定量PCR系统。
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