CN114250275B - 一种荧光定量pcr反应系统、pcr反应试剂盒及核酸定量检测方法 - Google Patents

一种荧光定量pcr反应系统、pcr反应试剂盒及核酸定量检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114250275B
CN114250275B CN202010998850.0A CN202010998850A CN114250275B CN 114250275 B CN114250275 B CN 114250275B CN 202010998850 A CN202010998850 A CN 202010998850A CN 114250275 B CN114250275 B CN 114250275B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotide sequence
pcr reaction
probe
quantitative pcr
template
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010998850.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114250275A (zh
Inventor
张良禄
李婷婷
董兰兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd filed Critical Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority to CN202010998850.0A priority Critical patent/CN114250275B/zh
Publication of CN114250275A publication Critical patent/CN114250275A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114250275B publication Critical patent/CN114250275B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请公开了一种荧光定量PCR反应系统、试剂盒及核酸定量检测方法，所述荧光定量PCR反应系统利用核酸内切酶特异性地产生一段Flap序列，所述Flap序列可作为一段核苷酸序列扩增时的引物，而该核苷酸序列上存在多个的发光探针结合区段，因此，当该核苷酸序列扩增时，发光探针被DNA聚合酶切割而产生荧光信号。由于该核苷酸序列上结合有多个发光探针，且Flap序列的数量与待荧光定量PCR检测的目标基因的数量相关，所以所述荧光定量PCR反应系统可实现对目标基因的特异性扩增，且信号强度大大提升，从而提高了对临界样本的检测灵敏度。

Description

一种荧光定量PCR反应系统、PCR反应试剂盒及核酸定量检测方法
技术领域
本发明涉及荧光定量PCR技术领域，尤其涉及一种荧光定量PCR反应系统、PCR反应试剂盒及核酸定量检测方法。
背景技术
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术是指：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积而达到实时监测整个PCR进程的目的，并可结合相应的软件对产物进行定量分析，获得起始模板的初始浓度。实时荧光定量PCR技术极大地简化了定量检测的过程，真正实现了绝对定量，可应用于疾病诊断、食品安全检测、科学研究等领域，具有广泛的应用前景。
实时荧光定量PCR技术是利用荧光信号达到阈值时所需的循环数(CT值)来推算原始模板量。目前，按照荧光信号的产生原理分类，实时荧光定量PCR技术具有非特异性荧光报告系统和特异性荧光报告系统两大类，其中，非特异性荧光报告系统的代表是SYBRGreen染料法，特异性荧光报告系统的代表是TaqMan探针法。SYBR Green染料法是在常规PCR反应体系中加入SYBR Green染料分子，其与双链DNA分子结合，并在497nm波长下激发产生荧光，但是SYBR Green染料分子与双链DNA分子的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，染料分子除了与特异性的靶序列扩增产物结合外，还可与在PCR扩增过程中产生的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，即：SYBR Green染料分子可与任意一个双链DNA分子相结合，因此，采用该方法不易区分非特异性扩增，扩增效率较低，从而较大程度影响检测结果的准确性。
TaqMan探针法，是在常规PCR反应体系中加入了具有荧光标记的TaqMan探针，TaqMan探针的5′端标记有报告基团，3′端标记有淬灭基团。TaqMan探针完整时，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，无荧光信号产生；随着PCR反应的进行，通过DNA链的延伸，Taq酶遇到与模板DNA结合的TaqMan探针，在Taq酶的3′端至5′端的外切核酸酶活性下，TaqMan探针被切断，使得报告基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号产生。由于TaqMan探针的核苷酸序列是依据待扩增的靶序列设计而成，所以TaqMan探针只能与待检测序列相结合，与SYBR Green染料法相比，提高了检测的特异性和结果的准确性，但是该方法是对于每一种模板DNA，都需要针对性地设计特异性探针，具有较高的实验成本；并且由于检测仪器具有检测下限，当模板DNA的含量较少时，易发生无荧光信号值，或者多次检测中CT值不稳定的状况，导致出现检测结果不易判读的问题。也就是说，现有的TaqMan探针法具有临界样本检测灵敏度低的缺陷。
发明内容
本发明提供了一种荧光定量PCR反应系统、试剂盒及核酸定量检测方法，以改善现有TaqMan探针法荧光定量PCR中存在的实验成本高、临界样本检测灵敏度低的问题。
第一方面，本发明提供了一种荧光定量PCR反应系统，包括：核酸内切酶、上游探针、下游探针、发光探针、第一核苷酸序列以及模板，所述下游探针包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列；所述模板上具有与所述上游探针相互补结合的第一区段，且所述模板上具有与所述第二核苷酸序列互补结合的第二区段，且所述模板上不具有与所述第三核苷酸序列相结合的区段；所述第一区段和所述第二区段之间具有一个碱基的重叠；所述第一核苷酸序列以及所述第一核苷酸序列的互补序列中的至少一者上，具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的结合区段；所述下游探针与所述模板结合时，所述核酸内切酶可以从所述重叠的碱基处进行切割释放所述第三核苷酸序列。
进一步的，所述第三核苷酸序列是用于扩增所述第一核苷酸序列的正向引物。
进一步的，所述核酸内切酶为Flap核酸内切酶1(Flap endonuclease 1,FEN1)，对应地，所述第三核苷酸序列为Flap序列。本发明所述的FEN1是一种具有结构特异性的多功能核酸酶，具有5′端至3′端的Flap核酸内切酶(FEN)活力。所述FEN1在细胞内作用于冈崎片段成熟、长片段碱基切除修复和维持端粒的稳定性等多条DNA代谢途径。与其他大多识别特定核苷酸序列的限制性内切酶不同，所述FEN1是通过识别特定的DNA结构来识别DNA底物，而非通过识别特定核苷酸序列来识别DNA底物。
进一步的，所述发光探针为TaqMan探针，且所述发光探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
进一步的，所述第一核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述荧光定量PCR反应系统还包括：缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、参比基因以及用于扩增模板的正向引物和逆向引物。
进一步的，所述上游探针的核苷酸序列与用于扩增模板的正向引物相同；或者，所述上游探针的核苷酸序列与用于扩增模板的逆向引物相同。
本领域技术人员可以理解，所述荧光定量PCR反应系统还可以包括PCR反应所必须的其他试剂，例如：双蒸水等。
第二方面，本发明提供了一种PCR反应试剂盒，包括：核酸内切酶、上游探针、下游探针、发光探针以及第一核苷酸序列，其中，
所述上游探针是与PCR反应的模板的第一区段相互补结合的核苷酸序列；
所述下游探针包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列，并且所述第二核苷酸序列与所述模板的第二区段相互补结合，所述第三核苷酸序列不能与所述模板的任何区段相结合；
所述第一区段和所述第二区段之间具有一个重叠的碱基；
所述第一核苷酸序列以及所述第一核苷酸序列的互补序列中的至少一者上，具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的结合区段。
进一步的，所述第三核苷酸序列是用于扩增所述第一核苷酸序列的正向引物，所述核酸内切酶为Flap核酸内切酶1，对应地，所述第三核苷酸序列为Flap序列。
本领域技术人员可以理解，所述PCR反应试剂盒还可以包括PCR反应所必须的其他试剂，例如：脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液、DNA聚合酶、参比基因以及双蒸水等。
第三方面，本发明提供了一种核酸定量检测方法，是采用第一方面中所述的荧光定量PCR反应系统进行荧光定量PCR检测，或者是采用第二方面中所述的PCR反应试剂盒进行荧光定量PCR检测。
本发明还提供了所述荧光定量PCR反应系统或所述PCR反应试剂盒的应用，可应用于本领域各种核酸/DNA分子的定量和/或非定量检测。对本发明中所述荧光定量PCR反应系统或所述PCR反应试剂盒能够检测的核酸/DNA分子不作特别的限定，可以用于非诊断目的的疾病标志物检测、基因表达水平检测、遗传性状分析等领域，例如：DNA甲基化水平分析检测、目的基因定量检测等。
有益效果：本发明的荧光定量PCR反应系统或PCR反应试剂盒利用核酸内切酶特异性地产生一段Flap序列，所述Flap序列可作为一段核苷酸序列扩增时的引物，而该核苷酸序列上存在多个的发光探针结合区段，因此，当该核苷酸序列扩增时，发光探针被DNA聚合酶切割而产生荧光信号。由于该核苷酸序列上结合有多个发光探针，且Flap序列的数量与待荧光定量PCR检测的目标基因的数量相关，所以所述荧光定量PCR反应系统可实现对目标基因的特异性扩增，且信号强度大大提升，从而提高了对临界样本的检测灵敏度。采用所述荧光定量PCR反应系统或所述PCR反应试剂盒对目的基因进行荧光定量PCR检测，具有灵敏度高、特异性强、检测结果准确度高的优点。
附图说明
下面结合附图，通过对本申请的具体实施方式详细描述，将使本申请的技术方案及其它有益效果显而易见。
图1为本发明中所述荧光定量PCR反应系统的原理示意图。
图2为本发明实施例1中所述第一区段L1和所述第二区段L2的位置示意图。
图3为本发明实施例1中各个浓度的ACTB′基因模板在荧光定量PCR中的扩增曲线图，其中，曲线1至5分别表示ACTB′基因模板浓度为106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL以及102copies/μL的检测样品，其中每一种ACTB′基因基因模板浓度的检测样品设置2个平行样，2个平行样呈现2条走势基本相同的扩增曲线；线条6表示NTC对照组。
图4为本发明实施例1中荧光定量PCR反应系统一检测ACTB′基因的标准曲线图。
图5为本发明实施例2中所述混合DNA溶液的5个平行样在荧光定量PCR中的扩增曲线图，5个平行样呈现5条走势基本相同的扩增曲线。
图6为本发明实验例中浓度为104copies/μL的ACTB′基因模板在荧光定量PCR中的扩增曲线图，其中，曲线7表示荧光定量PCR反应系统一扩增浓度为104copies/μL的ACTB′基因模板的扩增曲线，曲线8表示荧光定量PCR反应系统二扩增浓度为104copies/μL的ACTB′基因模板的扩增曲线，其中荧光定量PCR反应系统一和荧光定量PCR反应系统二中的扩增样品各设置2个平行样，2个平行样呈现2条走势基本相同的扩增曲线；线条9表示NTC对照组。
图7为本发明实施例4中所述第一区段L1′和所述第二区段L2′的位置示意图。
图8为本发明实施例4中各个浓度的SDC2′基因模板在荧光定量PCR中的扩增曲线图，其中，曲线11至曲线15分别表示SDC2′基因模板浓度为106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL以及102copies/μL的检测样品，其中每一种SDC2′基因基因模板浓度的检测样品设置2个平行样，2个平行样呈现2条走势基本相同的扩增曲线；线条10表示NTC对照组。
图9为本发明实施例4中荧光定量PCR反应系统三检测SDC2′基因的标准曲线图。
图10为本发明实施例4中第一检测样本至第五检测样本以及NTC对照组在荧光定量PCR中的扩增曲线图，其中，曲线16至曲线20分别表示第一检测样本至第五检测样本，每一个检测样本2个平行样，2个平行样呈现2条走势基本相同的扩增曲线；线条21表示NTC对照组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
本文中，“第一”、“第二”、“第三”等编号没有特别的含义，仅仅是为了区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序，可以理解，“第一”、“第二”、“第三”在允许的情况下可以互换特定的顺序或先后次序，以使这里描述的本发明实施例能够以除了本文所记载的以外的其他顺序来实施。
术语“C-T转化”是指基因的核苷酸序列中胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的置换，属于碱基转换的一种。在本发明的实施例中，所述“C-T转化”是通过亚硫酸氢盐转化来实现，目标基因片段经过亚硫酸氢盐处理后，其核苷酸序列中的未甲基化的胞嘧啶(C)会转化为尿嘧啶(U)，在进行PCR扩增时与腺嘌呤(A)配对。对于发生甲基化的胞嘧啶(C)，经过亚硫酸氢盐转化后，仍显示为胞嘧啶，在进行PCR扩增时与鸟嘌呤(G)配对。
在本发明实施例中，术语“ACTB基因”又称β-actin基因，用于编码β-肌动蛋白，其属于管家基因之一，在大多数细胞中表达水平相对稳定，通常用作内参基因。术语“ACTB′基因”是指完全甲基化的ACTB基因经C-T转化而获得的核苷酸序列。术语“ACTB″基因”是指未甲基化的ACTB基因经C-T转化而获得的核苷酸序列。
在本发明实施例中，术语“SDC2基因”是已知的一种参与细胞分裂、迁移和在结肠间充质细胞中表达的基因，由于肿瘤细胞中SDC2基因的表达量显著升高，且在结肠癌早期患者的癌变组织中，SDC2基因甲基化程度显著高于正常组织，所以在临床诊断中已将甲基化SDC2基因作为结肠癌的检测标志物之一。命名“SDC2′基因”是指完全甲基化的SDC2基因经C-T转化而获得的核苷酸序列。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
本发明实施例中涉及的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明实施例中涉及的HA Buffer、probe buffer、dNTP、Taq酶和纯化水均购置于天根生化科技(北京)有限公司，Flap核酸内切酶1(FEN1)购自于NEB(货号#M0645S)。
本发明实施例中涉及的试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit购自于Qiagen公司，试剂盒EZ DNA Methylation-Gold TM Kit购自于ZYMO RESEARCH生物科技公司。
本发明实施例中涉及的ACTB基因模板为人工合成的质粒，购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，载体为pUC57。
本发明实施例中涉及的SDC2基因模板为人工合成的SDC2基因质粒，购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，载体为pUC57。
本发明实施例中涉及的结直肠癌组织样本由武汉大学中南医院提供，实验过程中进行样本匿名化处理，且仅作为研究实验目的使用。
本发明实施例提供一种荧光定量PCR反应系统，包括：核酸内切酶、上游探针、下游探针、发光探针、第一核苷酸序列以及模板，所述下游探针包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列；所述模板上具有与所述上游探针相互补结合的第一区段，且所述模板上具有与所述第二核苷酸序列互补结合的第二区段，且所述模板上不具有与所述第三核苷酸序列相结合的区段；所述第一区段和所述第二区段之间具有一个碱基的重叠；所述第一核苷酸序列以及所述第一核苷酸序列的互补序列中的至少一者上，具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的结合区段。所述下游探针与所述模板结合时，所述核酸内切酶可以从所述重叠的碱基处进行切割释放所述第三核苷酸序列。
具体的，所述模板既可以是单链，也可以是双链。所述模板包括来源于生物体的基因组、核苷酸序列、经人工修饰的序列、经亚硫酸氢盐转化后的序列等各种形式的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
具体的，所述第一核苷酸序列上可具有多个所述发光探针的结合区段，如：2个、4个、6个、8个、10个等，本申请实施例对其数量并无具体限定，可依据实际需要自行选择。此外，可以是所述第一核苷酸序列上具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的结合区段；也可以是，所述第一核苷酸序列的互补序列上具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的结合区段，即：所述发光探针和所述第三核苷酸序列不与所述第一核苷酸序列结合，而是与所述第一核苷酸序列的互补序列结合，在此种情况下，所述第一核苷酸序列的3′端需具有用于扩增合成互补序列的引物的结合区段，并且所述互补序列的3′端与所述第三核苷酸序列的5′端可互补结合。
进一步的，所述第三核苷酸序列是用于扩增所述第一核苷酸序列的正向引物。
进一步的，所述核酸内切酶为Flap内切酶1(Flap Endonuclease 1，FEN1)，所述第三核苷酸序列为Flap序列。本领域技术人员可以理解，本发明所述的FEN1酶可以是本领域已知的各种来源的FEN1酶，例如可以是各种天然来源的FEN1酶，或者可以是经人工纯化的酶，或者是突变的或经修饰的FEN1酶或其活性片段，只要所述酶或其活性片段具有Flap内切酶活性。其中，所述修饰包括但不限于酶的氨基酸残基的缺失、取代或增加。
进一步的，所述发光探针为TaqMan探针。
进一步的，所述荧光定量PCR反应系统一还包括：缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶以及用于扩增模板的正向引物和逆向引物。
具体的，所述缓冲液包括HA缓冲液(HA buffer)、探针缓冲液(probe buffer)以及Flap核酸内切酶1缓冲液(FEN1 buffer)，其中，所述HA Buffer用于维持Taq酶在PCR反应过程中的最佳性能，所述probe buffer用于维持上游探针、下游探针以及发光探针在PCR反应过程中的最佳性能，所述FEN1 buffer用于维持FEN1在PCR反应过程中的最佳性能。所述DNA聚合酶为Taq酶。所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合液(dNTP)。
进一步的，所述上游探针的核苷酸序列与用于扩增模板的正向引物相同；或者，所述上游探针的核苷酸序列与用于扩增模板的逆向引物相同。此外，所述上游探针的核苷酸序列也可与用于扩增模板的正向引物和逆向引物均不相同，对此并不作具体限定，可依据实际需要自行选择。本申请实施例优选的，所述上游探针的核苷酸序列与用于扩增模板的逆向引物相同。
如图1所示，所述荧光定量PCR反应系统的原理为：当所述上游探针1和所述下游探针2的第二核苷酸序列21同时结合于所述模板3的一条单链31上时，形成的侵入重叠结构能够被所述核酸内切酶特异性识别，即：所述侵入重叠结构可作为所述核酸内切酶的酶切底物。所述核酸内切酶在重叠碱基的3′端处对所述下游探针2进行切割，从而释放一个所述第三核苷酸序列22，使之成为游离寡核苷酸。因此，所述第三核苷酸序列22的数量可以实时反映每一轮扩增的模板数量。因此，所述第三核苷酸序列22的数量可以实时反映每一轮扩增的模板数量。
释放的所述第三核苷酸序列22会与所述第一核苷酸序列4互补结合，从而引发对所述第一核苷酸序列4的PCR反应，随着PCR反应的进行，合成链不断延伸，使得Taq酶遇到与所述第一核苷酸序列4结合的发光探针5，在Taq酶的3′端至5′端的外切核酸酶活性下，发光探针被切断，使得报告基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号。由于所述第一核苷酸序列4上结合有多个发光探针5，即：一个第三核苷酸序列22可引发多个发光探针5发光，所以极大地增强了荧光信号，提高了荧光定量PCR的检测灵敏度。此外，由于所述发光探针5是与所述第一核苷酸序列4互补结合，而非与所述模板互补结合，所以无需对每一种模板3都针对性地设计特异性发光探针5，即：当用同一种荧光信号检测多种模板3时，只需设计一种发光探针即可，从而极大地降低了实验成本。
实施例1：利用荧光定量PCR反应系统一检测ACTB′基因
本实施例提供了一种用于检测ACTB′基因的荧光定量PCR反应系统一，所述ACTB′基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述荧光定量PCR反应系统一包括：Flap核酸内切酶1(FEN1)、缓冲液、dNTP、Taq酶、SEQ ID NO.1所示的发光探针FP、SEQ ID NO.2所示的第一核苷酸序列、SEQ ID NO.3所示的上游探针P1、SEQ ID NO.4所示的下游探针P2、SEQ IDNO.5所示的ACTB′基因模板以及SEQ ID NO.6所示的用于扩增ACTB′基因模板的正向引物F1，其中，用于扩增ACTB′基因模板的逆向引物R1(如SEQ ID NO.3所示，与上游探针P1相同)。
其中，所述ACTB′基因模板是将所述ACTB基因模板完全甲基化后，经C-T转化而获得的核苷酸序列。上游探针P1、下游探针P2、正向引物F1以及逆向引物R1的核苷酸序列详见下表1。
表1实施例1中涉及的引物和探针
名称 核苷酸序列(5′-3′)
F1 TAGGTTAGACGGGGGATATGT(SEQ ID NO.6)
R1/P1 CACAATAAATCTAAACAAACTCC(SEQ ID NO.3)
P2 <![CDATA[<u>GACGCGGAGTTGACAT</u>CCCATCCCAAAACCCCAA(SEQ ID NO.4)]]>
由表1可知，所述下游探针P2包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列，其中，所述第三核苷酸序列对应表1中P2的划线部分，所述第三核苷酸序列为Flap序列。上游探针P1的核苷酸序列与逆向引物R1的核苷酸序列相同。
由图2可知，所述单链31上具有与所述上游探针P1相互补结合的第一区段L1，且所述单链上具有与所述第二核苷酸序列互补结合的第二区段L2，且所述单链31上不具有与所述第三核苷酸序列相结合的区段，即：所述第三核苷酸序列不能以碱基互补配对的方式结合于所述单链上。
所述第一区段L1和所述第二区段L2之间具有一个碱基的重叠，以当所述上游探针P1和所述下游探针P2的第二核苷酸序列同时结合于所述单链上时，形成的侵入重叠结构能够被所述FEN1特异性识别，即：所述侵入重叠结构可作为FEN1的酶切底物。FEN1在重叠碱基的3′端处对所述下游探针P2进行切割，从而释放所述第三核苷酸序列，使之成为游离寡核苷酸。
ACTB′基因模板在正向引物F1和逆向引物R1的作用下引发扩增，每当双链模板变性成为两条单链时，其中的一条单链就可同时与所述上游探针P1结合，以及与所述下游探针P2的第二核苷酸序列结合，从而释放一个所述第三核苷酸序列，因此，所述第三核苷酸序列的数量可以实时反映每一轮扩增的模板数量。
所述第一核苷酸序列上具有四个所述发光探针FP的结合区段和一个所述第三核苷酸序列的结合区段，所述第三核苷酸序列是用于扩增所述第一核苷酸序列的正向引物。当所述第一核苷酸序列上结合有发光探针FP，但未结合有所述第三核苷酸序列时，所述发光探针FP完整，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，无荧光信号产生；当释放所述第三核苷酸序列后，所述第三核苷酸序列会与所述第一核苷酸序列互补结合，从而引发对所述第一核苷酸序列的PCR反应，随着PCR反应的进行，合成链不断延伸，使得Taq酶遇到与所述第一核苷酸序列结合的发光探针FP，在Taq酶的3′端至5′端的外切核酸酶活性下，发光探针FP被切断，使得报告基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号。由于所述第一核苷酸序列上结合有四个发光探针FP，一个第三核苷酸序列可引发四个发光探针FP发光，所以极大地增强了荧光信号，提高了荧光定量PCR的检测灵敏度。
在本实施例中，准备一系列浓度梯度的ACTB′基因模板进行荧光定量PCR检测，所述荧光定量PCR反应系统中各个成分的配置参照下表2，表2中的ACTB′基因模板浓度为：106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL以及102copies/μL，每种浓度的ACTB′基因模板取2个平行样。另外，设置2个NTC对照组(无模板对照)，所述NTC对照组的成分配置是仅将表2中的模板替换为纯化水，其余不变。
表2实施例1中荧光定量PCR反应系统一的成分配置表
Figure BDA0002693516450000101
荧光定量PCR反应程序按照下表3进行：
表3实施例1中荧光定量PCR反应系统一的反应程序
Figure BDA0002693516450000102
由图3和图4可知，各个检测样品的扩增曲线均呈明显的S型，扩增效率为96.75％，CT值在18至32之间。图4中标准曲线的公式为Y＝-3.402lgX+37.626。所述荧光定量PCR系统在106至102之间呈线性分布，R2为1。根据各个扩增曲线的CT值，可以判断模板的浓度与扩增循环数CT值之间具有很好的线性关系。
实施例2：荧光定量PCR反应系统一检测混合DNA溶液样品中的ACTB′基因
在本实施例中，将ACTB′基因模板和ACTB″基因模板配置为混合DNA溶液，以作为荧光定量PCR反应系统一的扩增模板，其中，所述ACTB″基因模板是将未甲基化的ACTB基因模板经C-T转化而获得的核苷酸序列。在混合DNA溶液中，所述ACTB′基因模板以及所述ACTB″基因模板的总浓度为104copies/μL，其中，所述ACTB′基因模板的拷贝数占所述ACTB′基因模板和所述ACTB″基因模板的总拷贝数的0.05％。
将表2中的模板替换为所述混合DNA溶液，并且设置5个平行样。另外，设置5个NTC对照组，所述NTC对照组的各个成分及配置参照实施例1中的NTC对照组。荧光定量PCR反应程序参照实施例1中的表3进行。
由图5可知，所述荧光定量PCR反应系统一能稳定检测出所述ACTB′基因的扩增，其中，NTC对照组无扩增，所述混合DNA溶液的5个平行样均有明显扩增，并且5个平行样的扩增曲线走势基本相一致，CT值均在34至36之间。
通过本实施例可知，所述荧光定量PCR反应系统一具有临界样本检测灵敏度高、重复性理想的优点。
对比例1：构建用于检测ACTB′基因的荧光定量PCR反应系统二
一种用于检测ACTB′基因的荧光定量PCR反应系统二，与实施例1所述荧光定量PCR反应系统一的区别之处仅在于：第一核苷酸序列不相同，荧光定量PCR反应系统二的第一核苷酸序列SEQ ID NO.7所示。所述荧光定量PCR反应系统二的第一核苷酸序列上具有一个所述发光探针的结合区段和一个所述第三核苷酸序列的结合区段，即：所述荧光定量PCR反应系统二和所述荧光定量PCR反应系统一仅是在所述发光探针的结合区段的数量上存在差别。所述荧光定量PCR反应系统二的各个成分及配置参照表2，仅需替换第一核苷酸序列的种类。所述荧光定量PCR反应系统二的反应程序参照表3进行。
实验例：比较实施例1和对比例1荧光定量PCR反应系统的扩增性能和检测灵敏度
将ACTB′基因作为荧光定量PCR的模板，以比较实施例1和对比例1提供的荧光定量PCR反应系统的扩增性能和检测灵敏度。
准备浓度为104copies/μL的ACTB′基因模板，利用实施例1的荧光定量PCR反应系统一分别对所述ACTB′基因模板进行扩增，并且取2个平行样，以及设置2个NTC对照组。同样，利用对比例1的荧光定量PCR反应系统二对所述ACTB′基因模板进行扩增，同样取2个平行样，以及设置2个NTC对照组。比较所述荧光定量PCR反应系统一和所述荧光定量PCR反应系统二对ACTB′基因模板的扩增性能和检测灵敏度。
由图6可知，对于浓度为104copies/μL的ACTB′基因模板，所述荧光定量PCR反应系统一的扩增效率明显优越于所述荧光定量PCR反应系统二，所述荧光定量PCR反应系统一的CT值为24.13，所述荧光定量PCR反应系统二的CT值为25.66。相较于所述荧光定量PCR反应系统二的CT值，所述荧光定量PCR反应系统一的CT值提前了约1.5个循环。
通过本实验例可知，所述荧光定量PCR反应系统一的扩增性能优越于所述荧光定量PCR反应系统二，具有多个发光探针结合区段的所述第一核苷酸序列所对应的荧光定量PCR反应系统，其扩增性能优越于仅具有一个发光探针结合区段的所述第一核苷酸序列所对应的荧光定量PCR反应系统。
实施例4：利用荧光定量PCR反应系统三检测SDC2′基因
本实施例提供了一种用于检测SDC2′基因的荧光定量PCR反应系统三，所述SDC2′基因的序列如SEQ ID NO.8所示，所述荧光定量PCR反应系统三包括：Flap核酸内切酶1(FEN1)、缓冲液、dNTP、Taq酶、SEQ ID NO.1所示的发光探针FP、SEQ ID NO.2所示的第一核苷酸序列、SEQ ID NO.9所示的上游探针P1′、SEQ ID NO.10所示的下游探针P2′、SEQ IDNO.8所示的SDC2′基因模板、SEQ ID NO.11所示的用于扩增SDC2′基因模板的正向引物F1′，用于扩增SDC2′基因模板的逆向引物R1′(如SEQ ID NO.9所示，与上游探针P1′相同)。
其中，所述SDC2′基因模板是将所述SDC2基因模板完全甲基化后，经C-T转化而获得的核苷酸序列。上游探针P1′、下游探针P2′、正向引物F1′以及逆向引物R1′的核苷酸序列详见下表4。
表4为实施例4中涉及的引物和探针信息
名称 核苷酸序列(5′-3′)
F1′ TGAGGGGTGGAGGTTGTATCGC(SEQ ID NO.11)
R1′/P1′ CGACCCGAAACCGAACGC(SEQ ID NO.9)
P2′ <![CDATA[<u>GACGCGGAGTTGACAT</u>CCGTATCACACGTACCC(SEQ ID NO.10)]]>
其中，所述下游探针P2′包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列，其中，所述第三核苷酸序列对应表4中P2′的划线部分，所述第三核苷酸序列为Flap序列。上游探针P1′的核苷酸序列与逆向引物R1′的核苷酸序列相同。
如图7所示，用于扩增所述SDC2′基因模板的一条单链上具有与所述上游探针P1′相互补结合的第一区段L1′，且具有与所述第二核苷酸序列互补结合的第二区段L2′，且不具有与所述第三核苷酸序列相结合的区段，即：所述第三核苷酸序列不能以碱基互补配对的方式结合于所述单链上。所述第一区段L1′和所述第二区段L2′之间具有一个碱基的重叠，以形成为FEN1识别的侵入重叠结构。
在实施例中，准备一系列浓度梯度(106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL以及102copies/μL)的SDC2′基因模板，以及5例结直肠癌组织样本。采用试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Ki提取各个结直肠癌组织样本的基因组，并采用试剂盒EZDNA Methylation-Gold TM Kit对各个结直肠癌组织样本的基因组进行亚硫酸氢盐转化，以获得各个结直肠癌组织样本用于荧光定量PCR检测的样本，即：第一检测样本、第二检测样本、第三检测样本、第四检测样本和第五检测样本。
对上述各个浓度的SDC2′基因，以及第一检测样本至第五检测样本进行荧光定量PCR，所述荧光定量PCR反应系统三中各个成分的配置参照表2，每个模板取2个平行样。另外，设置2个NTC对照组，所述NTC对照组的成分配置是仅将表2中的模板替换为纯化水。
由图8和图9可知，各个浓度的SDC2′基因模板均扩增良好，扩增曲线呈标准的S形，扩增效率为101.4％，R2值为0.999，图9中标准曲线的公式为Y＝-3.284lgX+37.078，充分说明荧光定量PCR反应系统三适用于检测SDC2基因。
由图10可知，第一检测样本至第五检测样本均扩增良好，扩增曲线呈标准的S形，由标准曲线的公式可计算出第一检测样本、第二检测样本、第三检测样本、第四检测样本和第五检测样本中SDC2′基因的浓度分别为738copies/μL、165copies/μL、57copies/μL、12copies/μL和5copies/μL。
以上对本发明所提供的一种荧光定量PCR反应系统、试剂盒及核酸定量检测方法，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 一种荧光定量PCR反应系统、PCR反应试剂盒及核酸定量检测方法
<141> 2020-08-07
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcctcccgcc aaac 14
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatgtcaact ccgcgtcaaa gtttggcggg aggaaaagtt tggcgggagg aaaagtttgg 60
cgggaggaaa agtttggcgg gaggaaaa 88
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cacaataaat ctaaacaaac tcc 23
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gacgcggagt tgacatccca tcccaaaacc ccaa 34
<210> 5
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taggttagac gggggatatg tagaaagtgt aaagaatacg gttaagtgtg ttggggtttt 60
gggatgggga gtttgtttag atttattgtg 90
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taggttagac gggggatatg t 21
<210> 7
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gatgtcaact ccgcgtcaaa gtttggcggg aggaaaaatg catgcatgcg caaaatgcat 60
gcatgcgcaa aatgcatgca tgcgcaaa 88
<210> 8
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgaggggtgg aggttgtatc gcggggcgtt agggacggga ggatattttt ataggagtta 60
tacgggagtg tcgtaagtag ggcgaggcgg ggtacgtgtg tgatacggcg ttcggtttcg 120
ggtcg 125
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgacccgaaa ccgaacgc 18
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gacgcggagt tgacatccgt atcacacgta ccc 33
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgaggggtgg aggttgtatc gc 22

Claims (9)

1.一种荧光定量PCR反应系统，其特征在于，包括：核酸内切酶、上游探针、下游探针、发光探针、第一核苷酸序列、模板、DNA聚合酶以及脱氧核糖核苷三磷酸，所述下游探针包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列；所述模板上具有与所述上游探针相互补结合的第一区段，且所述模板上具有与所述第二核苷酸序列互补结合的第二区段，且所述模板上不具有与所述第三核苷酸序列相结合的区段；所述第一区段和所述第二区段之间具有一个重叠的碱基；所述第一核苷酸序列以及所述第一核苷酸序列的互补序列中的至少一者上具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的互补结合区段；
其中，所述下游探针与所述模板结合时，所述核酸内切酶可以从所述重叠的碱基处进行切割释放所述第三核苷酸序列，被释放的所述第三核苷酸序列是作为扩增所述第一核苷酸序列的正向引物，引发对所述第一核苷酸序列的荧光PCR反应。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述核酸内切酶为Flap核酸内切酶1，对应地，所述第三核苷酸序列为Flap序列。
3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述发光探针为TaqMan探针，且所述发光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述第一核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述荧光定量PCR反应系统还包括：缓冲液以及用于扩增模板的正向引物和逆向引物。
6.根据权利要求5所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述上游探针的核苷酸序列与用于扩增模板的正向引物相同；或者，所述上游探针的核苷酸序列与用于扩增模板的逆向引物相同。
7.一种PCR反应试剂盒，其特征在于，包括：核酸内切酶、上游探针、下游探针、发光探针、第一核苷酸序列、DNA聚合酶以及脱氧核糖核苷三磷酸；
所述上游探针是与PCR反应的模板的第一区段相互补结合的核苷酸序列；
所述下游探针包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列，并且所述第二核苷酸序列与所述模板的第二区段相互补结合，所述第三核苷酸序列不能与所述模板的任何区段相结合；
所述第一区段和所述第二区段之间具有一个重叠的碱基；
所述第一核苷酸序列以及所述第一核苷酸序列的互补序列中的至少一者上，具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的互补结合区段；
其中，所述下游探针与所述模板结合时，所述核酸内切酶可以从所述重叠的碱基处进行切割释放所述第三核苷酸序列，被释放的所述第三核苷酸序列作为扩增所述第一核苷酸序列的正向引物，引发对所述第一核苷酸序列的荧光PCR反应。
8.根据权利要求7所述的PCR反应试剂盒，其特征在于，所述核酸内切酶为Flap核酸内切酶1，对应地，所述第三核苷酸序列为Flap序列。
9.一种核酸定量检测方法，其特征在于，是采用权利要求1至6任一项中所述的荧光定量PCR反应系统进行荧光定量PCR检测，或者是采用如权利要求7或8所述的PCR反应试剂盒进行荧光定量PCR检测。
CN202010998850.0A 2020-09-22 2020-09-22 一种荧光定量pcr反应系统、pcr反应试剂盒及核酸定量检测方法 Active CN114250275B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010998850.0A CN114250275B (zh) 2020-09-22 2020-09-22 一种荧光定量pcr反应系统、pcr反应试剂盒及核酸定量检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010998850.0A CN114250275B (zh) 2020-09-22 2020-09-22 一种荧光定量pcr反应系统、pcr反应试剂盒及核酸定量检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114250275A CN114250275A (zh) 2022-03-29
CN114250275B true CN114250275B (zh) 2023-04-28

Family

ID=80789185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010998850.0A Active CN114250275B (zh) 2020-09-22 2020-09-22 一种荧光定量pcr反应系统、pcr反应试剂盒及核酸定量检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114250275B (zh)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070092880A1 (en) * 2003-07-16 2007-04-26 Crothers Donald M Invasive cleavage reaction with electrochemical readout
US8859266B2 (en) * 2010-04-28 2014-10-14 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Binary probe system for sensitive detection of target analytes
KR20130101952A (ko) * 2012-02-02 2013-09-16 주식회사 씨젠 Ｐｔｏ 절단과 연장-의존적 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출
WO2014160797A1 (en) * 2013-03-26 2014-10-02 Genetag Technology, Inc. Dual probe:antiprobe compositions for dna and rna detection
CN105018644B (zh) * 2015-07-17 2018-05-29 江苏省疾病预防控制中心 一种呼吸道病原体检测试剂盒
WO2017046192A1 (de) * 2015-09-18 2017-03-23 Biotype Diagnostic Gmbh Bestätigungstest für primäre nukleinsäure-amplifikate in einem kontinuierlichen reaktionsansatz und unmittelbare auswertung mittels elektrophoretischer verfahren
CN107523630B (zh) * 2017-09-26 2021-01-29 中国人民解放军东部战区总医院 一种基于信号放大dna逻辑门的基因突变多重检测方法
CN110791590B (zh) * 2019-11-12 2020-09-25 南宁众册生物科技有限公司 非洲猪瘟病毒vp72和cd2v基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114250275A (zh) 2022-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110872631B (zh) Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒
CN101952461B (zh) 用于检测核糖核酸的组合物、方法和试剂盒
CN109880891B (zh) 基于核酸酶偶联pcr原理富集低丰度dna突变的检测技术体系及应用
CN101528763B (zh) 分离和检测小多核苷酸的方法和物质
CA2718137A1 (en) Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
AU2008230813A1 (en) Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
KR102371222B1 (ko) 표적핵산 증폭방법 및 표적핵산 증폭용 조성물
US20070048757A1 (en) Methods for characterizing cells using amplified micro rnas
US20210388429A1 (en) Digital amplification assays for genetic instability
EP3055430B1 (en) Method for the detection of target nucleic acid sequences
WO2010060046A2 (en) Dye probe fluorescence resonance energy transfer genotyping
JP2024032995A (ja) 水痘帯状疱疹ウイルスを増幅または検出するための組成物および方法
WO2024012467A1 (en) Fluorescent pcr method for nucleic acids detection using the combination of primer-activated polymerization and probes
JP2009213445A (ja) 標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法、プローブセット、及び核酸の識別方法
WO2023071788A1 (zh) 一种用于检测核酸的荧光pcr方法
CN114250275B (zh) 一种荧光定量pcr反应系统、pcr反应试剂盒及核酸定量检测方法
CN114592042B (zh) 一种微rna检测方法及试剂盒
JPWO2008149855A1 (ja) メチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法
CN114250276B (zh) 基于指数扩增反应和Argonaute核酸酶的microRNA检测体系及方法
WO2006112939A2 (en) Compositions, methods, and kits for analyzing dna methylation
CN114134208B (zh) 荧光定量pcr试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法
US20180237853A1 (en) Methods, Compositions and Kits for Detection of Mutant Variants of Target Genes
JP2005328758A (ja) 核酸増幅方法及びこれを利用した一塩基多型の解析
CN114787383A (zh) 一种提高等位基因区分力的pcr方法及pcr试剂盒
CN114645078A (zh) 一种检测胎儿样品中母体细胞存在或比例的方法和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A fluorescence quantitative PCR reaction system, PCR reaction kit, and nucleic acid quantitative detection method

Granted publication date: 20230428

Pledgee: Wuhan Optics Valley Small and Medium Duty Venture Capital Co.,Ltd.

Pledgor: WUHAN AIMISEN LIFE TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980014407