CN114645078A - 一种检测胎儿样品中母体细胞存在或比例的方法和试剂盒 - Google Patents
一种检测胎儿样品中母体细胞存在或比例的方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种鉴定能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的SNP位点的方法。进一步的，本申请还涉及一种检测胎儿样品中母体细胞的存在或其比例的方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。
Description
技术领域
本申请涉及分子诊断领域。具体而言，本申请涉及一种鉴定能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的SNP位点的方法。进一步的，本申请还涉及一种检测胎儿样品中母体细胞的存在或其比例的方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。
背景技术
目前产前诊断中，胎儿样本的取材方式主要包括羊膜腔穿刺术、绒毛穿刺取样术和经皮脐血管穿刺术。因取材的特殊性，产前诊断样本可能受到不同程度的母体细胞污染(maternal cell contamination,MCC)，即大量的胎儿核酸中含有微量的母体核酸。因此，产前诊断样本中母体细胞污染程度的评估对孕妇妊娠干预至关重要，而准确评估母体细胞污染程度是获得正确产前诊断结果的前提。
1983年，Benn and Hsu(Benn PA,Hsu LY.Maternal cell contamination ofamniotic fluid cell cultures:results of a U.S.nationwide survey.Am J MedGenet,1983,15(2):297-305)对美国全国范围内的羊水标本中母体细胞污染情况进行调查，发现0.3％的羊水标本存在母体细胞污染的情况。欧洲合作研究中心调研发现(Bui TH,Iselius L,Lind sten.European collaborative study on prenatal diagnosis:mosaicism,pseudomosaicism and single abnormal cells in amniotic fluid cellcultures.Prenat Diagn,1984,4:145-162)，0.34％经过培养的羊水样本存在母体细胞污染的情况。Rebello(Rebello,M.T.,Abas,A.,Nicolaides,K.,Coleman,D.V.Maternalcontamination of amniotic fluid demonstrated by DNA analysis.Prenat Diagn,1994,14(2):109-12.)等提出，每毫升羊水中只要存在1μL母体外周血(羊膜腔穿刺术穿刺通过母体腹部时，若经过母体血管，会导致母体外周血进入羊水中，而外周血中的白细胞能释放出母体DNA，可导致MCC)，就会干扰分子遗传学技术的检测结果。2005年，Stojilkovic-Mikic(Stojilkovic-Mikic T,Mann K,Docherty Z.2005.Maternal cell contaminationof prenatal samples assessed by QF-PCR genotyping[J].Prenat Diagn 2005,25:79-83)等利用定量荧光PCR(QF-PCR)技术对307例产前诊断样本(254例羊水样本)中母体细胞污染情况进行研究，在未经培养的羊水样本中，母体细胞污染发生率高达9.1％，经过培养的羊水样本中，母体细胞污染发生率高达2.8％。
评估产前诊断样本中母体细胞污染程度的方法主要有细胞遗传学观察、PCR扩增技术、荧光定量PCR技术、短串联重复序列(STR)分型技术、高效变性液相色谱、基因芯片分析技术等。目前临床上应用最广泛的为基于短串联重复序列(short tandem repeats,STR)的荧光定量PCR技术(quantitative fluorescent PCR,QF-PCR)，该技术通过PCR技术分别扩增胎儿和母亲DNA样本的多个短串联重复序列，再将PCR产物进行毛细管电泳，比较胎儿样本和母亲电泳结果，从而得出胎儿样本中是否有母体细胞污染，由于STR在PCR扩增容易形成影子带，导致该方法灵敏度低，只能检测出10％以上的母体细胞污染，敏感性有限。2016年，中国发明专利申请(CN105586392A)公开了一种利用时间飞行质谱(MALDI-TOF MS)技术，通过对人类基因组中SNP位点碱基类型进行检测，评估产前诊断样本中母体细胞污染程度的方法，该方法同时可以进行多个样本的检测，但检测仪器成本较高，操作步骤较为繁琐，且只能检测5％以上的母体细胞污染，灵敏度有限。
随着高敏感性分子遗传学检测技术的应用，微量的母体细胞污染可能干扰产前诊断的检测结果，造成误诊或漏诊。因此，MCC是影响产前诊断结果准确性的主要因素之一，临床上迫切需要更高敏感性和准确性的检测方法以评估产前产前诊断样本中的母体细胞污染程度。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“SNP(单核苷酸多态性)”是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的核酸序列多态性。术语“SNP位点”为基因组中具有单核苷酸多态性的位点。在本文中，SNP位点包括，具有单核苷酸多态性的单个位点以及具有1个或多个(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，或更多个)核苷酸的插入或缺失的位点。在本文中，SNP位点通过其参考号(例如rs ID)命名。可以利用rs ID在公共数据库中查询SNP位点及其型别，例如，通过NCBI的dbSNP数据库，ChinaMAP数据库，JSNP数据库等。在本申请中，所选择或使用的SNP位点优选地为二等位多态性的SNP位点。
如本文中所使用的，术语“目标SNP位点”是指胎儿样本和母体样本在该位点上具有不同的基因型别的SNP位点。
如本文中所使用的，当提及SNP位点的“基因型别”时，其是指某一生物个体所有同源染色体(通常是两条同源染色体)中该SNP位点上的基因组合的总称。在本文中，SNP位点的“基因型别”指来自胎儿或母亲的一对同源染色体中该SNP位点上的基因组合。例如，“某个体rs5858210位点的基因型别为AG/-”表示，该个体的一对同源染色体在rs5858210位点上分别具有核苷酸序列“AG”和“-”(“-”表示缺失)。“某个体rs5858210位点的基因型别为AG/AG”表示，该个体的一对同源染色体在rs5858210位点上均具有核苷酸序列“AG”。相应地，单条染色体上含有该SNP位点的一段基因(即，核苷酸区段)即被称为含有该SNP位点的“等位基因”。如本文中所使用的，对于某个SNP位点而言，除了该SNP位点上的核苷酸差异之外，不同的等位基因通常具有完全相同的核苷酸序列。当某个体的一对同源染色体在某SNP位点上具有相同的核苷酸序列(即，具有相同的等位基因)时，该个体在该SNP位点上的基因型别是纯合的。当某个体的一对同源染色体在某SNP位点上具有不同的核苷酸序列(即，具有不同的等位基因)时，该个体在该SNP位点上的基因型别是杂合的。如本文中所使用的，术语“Fst”是指群体固定系数，其能够反应群体等位基因杂合性水平，用于衡量种群分化程度。Fst取值在0到1之间，当Fst为1时，表明等位基因在各地方群体中固定，完全分化；当Fst为0时，表明不同地方群体遗传结构完全一致，群体间没有分化。在本申请中，选取的SNP位点优选在不同人种之间Fst＜0.01。这些位点在不同人种之间分化程度很小，基因杂合性水平接近。
如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。如本文中所使用的，术语“不能完全互补”意指，一条核酸序列中的碱基不能够与另一条核酸链中的碱基完全配对，至少存在一个错配或缺口。
如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。
如本文中所使用的，术语“PCR反应”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指使用核酸聚合酶和引物来扩增靶核酸的反应(聚合酶链式反应)。如本文中所使用的，术语“多重扩增”是指，在同一个反应体系中对多个靶核酸进行扩增。如本文中所使用的，术语“不对称扩增”是指，对靶核酸进行扩增所获得的扩增产物中，两条互补的核酸链的量不相同，一条核酸链的量大于另一条核酸链。
如本文中所使用的，并且如本领域技术人员通常理解的，术语“正向”和“反向”仅仅是为了便于描述和区分一个引物对中的两条引物；它们是相对而言的，并不具有特别的含义。
如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如The Journal of Molecular Diagnostics2009,11(2):93-101)。在本申请中，术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义，并且可互换使用。
在本申请的某些优选实施方案中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到检测探针与其互补序列的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔点(Tm)。通常而言，检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的Tm就越高。因此，通过检测双链体的Tm，可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中，术语“熔解峰”、“熔点”和“Tm”具有相同的含义，并且可互换使用。
本申请的发明人通过深入的研究，利用多重不对称PCR扩增和多色探针熔解曲线分析，建立了一种鉴定能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的SNP位点的方法。在此基础上，结合数字PCR系统，本申请开发了一种检测胎儿样本中母体细胞的存在和比例方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。
因此，在一个方面，本申请提供了一种鉴定能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的SNP位点的方法，其包括以下步骤:
(a)提供含有来源于所述胎儿的一种或多种靶核酸的第一样品，以及含有来源于所述胎儿的母体的一种或多种靶核酸的第二样品，所述靶核酸包含一种或多种候选SNP位点，并且，
提供第一通用引物和第二通用引物，并且，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，
所述第一通用引物包含第一通用序列；
所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；
所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和
(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，通过PCR反应分别扩增第一样品和第二样品中的靶核酸，从而获得分别与第一样品和第二样品对应的扩增产物；
(c)对步骤(b)获得的与第一样品和第二样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；
(d)根据步骤(b)的熔解曲线分析结果，确定这样的SNP位点：在该位点上第一样品和第二样品具有不同基因型别；所述SNP位点为能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的SNP位点。
在本申请的方法中，正向引物和反向引物分别包含特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列和反向核苷酸序列，由此，在PCR反应过程中，靶特异性引物对(正向引物和反向引物)将退火至靶核酸，并启动PCR扩增，产生初始扩增产物，其包含分别与正向引物和反向引物互补的两条核酸链(核酸链A和核酸链B)。进一步，由于正向引物和第一通用引物均包含第一通用序列，因此，与正向引物互补的核酸链A也能够与第一通用引物互补。类似地，与反向引物互补的核酸链B也能够与第二通用引物互补。
因此，随着PCR反应的进行，第一通用引物和第二通用引物将分别退火至初始扩增产物的核酸链A和核酸链B，并进一步启动PCR扩增。在该过程中，由于反向引物/第二通用引物包含第一通用序列，因此，第一通用引物不仅能够退火至核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而且能够退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链。也即，第一通用引物可以同时扩增初始扩增产物的核酸链A和核酸链B。与此同时，第二通用引物在第一通用序列的3'端包含额外的核苷酸，因此，虽然第二通用引物也可能退火至核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链，其具有与正向引物互补的序列)，但是其与核酸链A在3'端是不匹配的(即，在3'端不能完全互补)。由此，在扩增过程中，第二通用引物将优先退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而基本上不能延伸合成核酸链A(与第一正向引物/第一通用引物互补的核酸链)的互补链。
因此，随着PCR扩增的进行，核酸链A的互补链(核酸链B)的合成效率将显著低于核酸链B的互补链(核酸链A)，导致核酸链B的互补链(核酸链A)被大量合成和扩增，而核酸链A的互补链(核酸链B)的合成和扩增受到抑制，从而产生大量单链产物(核酸链A，其含有与正向引物/第一通用引物互补的序列以及反向引物/第二通用引物的序列)，实现了对含有一种或多种SNP位点的靶核酸的不对称扩增。因此，在本申请方法的步骤(a)和(b)中，实现了不对称扩增样品中的一种或多种靶核酸。
另外，由于正向引物和反向引物均含有第一通用序列，因此，在PCR反应过程中，因正向引物和反向引物的非特异性扩增而形成的引物二聚体在变性后将产生其5'端和3'端包含彼此互补的反向序列的单链核酸，该单链核酸在退火阶段容易自身退火，形成稳定的锅柄结构，阻止第一通用引物和第二通用引物对该单链核酸的退火和延伸，从而抑制引物二聚体的进一步扩增。因此，在本发明的方法中，引物二聚体的非特异性扩增能够被有效抑制。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定第一样品和第二样品的各个候选SNP位点的型别，并分别进行比较，从而鉴定能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的SNP位点。
在某些实施方案中，第一样品选自脐带血，羊水，绒毛，及其任何组合。
在某些实施方案中，第二样品选自来自母体的皮肤，唾液，血液，毛发，指甲，及其任何组合。
在某些实施方案中，所述第一样品包含DNA(例如基因组DNA或cDNA)。
在某些实施方案中，所述第二样品包含DNA(例如基因组DNA或cDNA)。
在某些实施方案中，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：
(1)所述候选SNP位点在不同人种之间的Fst小于0.3(例如，小于0.2，小于0.1，小于0.05，小于0.01)；
(2)所述候选SNP位点位于不同染色体；
(3)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.2至0.8之间(例如，0.3至0.7之间，0.4至0.6之间)。
在某些实施方案中，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：
(1)所述候选SNP位点在不同人种之间的Fst小于0.01；
(2)所述候选SNP位点位于不同染色体；
(3)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.3至0.7之间。
在某些实施方案中，所述候选SNP位点为二等位多态性的SNP位点。
在某些实施方案中，所述候选SNP位点为人基因组中的SNP位点；例如所述靶核酸包含选自下列的人基因组SNP位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，以及前述SNP位点的任意组合(例如，前述SNP位点中任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)。
在某些实施方案中，所述样品中的靶核酸包含下列人基因组SNP位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776和rs7160304。
在某些实施方案中，在步骤(a)中，针对每一种SNP位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；
并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与第一样品和第二样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析。
在某些实施方案中，所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，检测探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在本申请的方法中，检测探针不受其长度的限制。在某些实施方案中，所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。
在某些实施方案中，所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。
在某些实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。在某些实施方案中，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离。
在某些实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。在此类实施方案中，当检测探针未与其他序列杂交时，淬灭基团位于能够吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于报告基团的邻近)，从而吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针不发出信号。进一步，当所述检测探针与其互补序列杂交时，淬灭基团位于不能吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于远离报告基团的位置)，从而无法吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针发出信号。
此类自淬灭检测探针的设计在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可在所述检测探针的5'末端标记报告基团而在3'末端标记淬灭基团，或可在所述检测探针的3'末端标记报告基团而在5'末端标记淬灭基团。由此，当所述检测探针单独存在时，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；而当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。
然而，应当理解的是，报告基团和淬灭基团并非必须标记在检测探针的末端。报告基团和/或淬灭基团也可以标记在检测探针的内部，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。例如，可将报告基团标记在检测探针的上游(或下游)，而将淬灭基团标记在检测探针的下游(或上游)，并且二者相距足够的距离(例如相距10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，或更长的距离)。由此，当所述检测探针单独存在时，由于探针分子的自由卷曲或者探针的二级结构(例如发夹结构)的形成，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；并且，当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离足够的距离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距不超过80nt，不超过70nt，不超过60nt，不超过50nt，不超过40nt，不超过30nt，或不超过20nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距至少5nt，至少10nt，至少15nt，或至少20nt。
因此，可在检测探针的任何合适的位置标记报告基团和淬灭基团，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号即可。然而，在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的至少一种位于检测探针的末端(例如5'或3'末端)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端或者距离5'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的3'末端或者距离3'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团可相距如上文所定义的距离(例如10-80nt或更长的距离)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端，并且另一种位于3'末端。
在某些实施方案中，所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL FluorRed 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)。
在某些实施方案中，所述检测探针具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰。
在某些实施方案中，所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构。
在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团。在某些实施方案中，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在。
在某些实施方案中，在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如，可将步骤(2)的产物从45℃或更低的温度(例如，不超过45℃，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)逐渐升温至75℃或更高的温度(例如，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃)，并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。升温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如，升温的速率可以为：每步骤升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)，并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s)；或者每秒升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。
然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线。
在某些实施方案中，根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定各个SNP位点的型别。
在某些实施方案中，所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)：SEQ ID NO:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66和69。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(a)中，提供1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个靶特异性引物对。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度；例如，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1-5倍，5-10倍，10-15倍，15-20倍，20-50倍或更多倍。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度是相同的；或者，所述第一通用引物的工作浓度低于第二通用引物。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的。
在某些实施方案中，所述样品或靶核酸包含mRNA，且在进行所述方法的步骤(b)之前，对所述样品进行逆转录反应。
在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应。在某些实施方案中，，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermuschliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermusoshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。在某些实施方案中，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。
在某些实施方案中，所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分。
在本申请的实施方案中，所述第一通用引物可以是任意的长度，只要其能够进行PCR反应即可。在某些实施方案中，所述第一通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。
在某些实施方案中，所述第一通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，第一通用引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在某些实施方案中，所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分。
在某些实施方案中，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在本申请的实施方案中，所述第二通用引物可以是任意的长度，只要其能够进行PCR反应即可。在某些实施方案中，所述第二通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。
在某些实施方案中，所述第二通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，第二通用引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在某些实施方案中，在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端。在某些实施方案中，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分。
在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。
在某些实施方案中，所述正向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。
在某些实施方案中，所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，正向引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在某些实施方案中，在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端。在某些实施方案中，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述反向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端。在某些实施方案中，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。
在某些实施方案中，所述反向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成。
在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分。
在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。
在某些实施方案中，所述反向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。
在某些实施方案中，所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，反向引物(或其任何组成成分)包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(LNA)。
在某些实施方案中，所述第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；例如，所述第二通用序列中位于3'末端的至少一个核苷酸，例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，不能与所述正向引物的互补序列互补。
在某些实施方案中，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:71所示。
在某些实施方案中，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:70所示。
在某些实施方案中，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：SEQ ID NO:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68。
在某些实施方案中，所述方法的步骤(a)-(b)通过包含下述步骤(I)-(VI)的方案来进行：
(I)提供来源于所述胎儿一种或多种靶核酸的第一样品，以及含有来源于所述胎儿的母体的一种或多种靶核酸的第二样品，所述靶核酸包含一种或多种SNP位点；和，提供第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种SNP位点，提供一个靶特异性引物对；以及任选地，针对每一种SNP位点，提供一个检测探针；其中，所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对如上所定义；所述检测探针如上所定义；
(II)将所述样品与所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对，核酸聚合酶，以及任选地，检测探针混合；
(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；
(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；
(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和
(VI)任选地，重复步骤(III)-(V)一次或多次。
在某些实施方案中，在步骤(III)中，在80-105℃的温度下温育步骤(II)的产物，从而使核酸变性。
在某些实施方案中，在步骤(III)中，温育步骤(II)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。
在某些实施方案中，在步骤(IV)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃的温度下温育步骤(III)的产物，从而允许核酸退火或杂交。
在某些实施方案中，在步骤(IV)中，温育步骤(III)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。
在某些实施方案中，在步骤(V)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃的温度下温育步骤(4)的产物，从而允许核酸延伸。
在某些实施方案中，在步骤(V)中，温育步骤(IV)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min。
在某些实施方案中，在相同或不同的温度下进行步骤(IV)和(V)。
在某些实施方案中，重复步骤(III)-(V)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次；在某些实施方案中，当重复步骤(III)-(V)一次或多次时，每一个循环的步骤(III)-(V)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。
在另一方面，本申请还提供了一种检测胎儿样品中母体细胞的存在或其比例的方法，其中，所述方法包含以下步骤：
(1)提供待检测的胎儿样品；
(2)鉴定一个或多个能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的目标SNP位点；其中，在所述目标SNP位点上，胎儿具有包含第一等位基因和第二等位基因的杂合基因型别，且母体具有包含第一或第二等位基因的纯合基因型别，或者，母体具有包含第一等位基因和第二等位基因的杂合基因型别，且胎儿具有包含第一或第二等位基因的纯合基因型别；
(3)对所述待检测的胎儿样品中各个目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测；然后，根据第一等位基因和第二等位基因定量检测的结果，确定所述待检测的胎儿样品中母体的核酸的存在或其比例。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，可通过选自下列的机制来检测某个SNP位点的基因型，从而鉴定目标SNP位点：探针杂交、引物延伸、杂交连接和特异酶切。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，可通过选自下列的方法来鉴定目标SNP位点：测序法(例如，一代测序法、焦磷酸测序法、二代测序法)、芯片法(例如，使用能够检测SNP的固相芯片、液相芯片)、基于qPCR的检测法(例如，Taqman探针法)、质谱法(如基于MassARRAY的iPLEXTM Gold)、色谱法(如变性高效液相色谱法dHPLC)、电泳法(如SNPshot法)、基于熔解曲线分析的检测法。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，通过基于多重PCR结合熔解曲线分析的检测法鉴定目标SNP位点。
在某些实施方案中，通过权利要求1-7任一项所描述的方法鉴定所述目标SNP位点。
在某些实施方案中，在步骤(3)中，通过数字PCR对所述样品中各个SNP位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测。
在某些实施方案中，通过下述方案进行步骤(3)：
(I)从步骤(2)中选取至少1个(例如，1个，2个，3个，或更多个)目标SNP位点，并且，针对每一个选取的目标SNP位点，提供一个扩增引物组和一个探针组，其中，
(I-1)所述扩增引物组至少包含一条扩增引物(例如一对扩增引物或更多的扩增引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增含有所述目标SNP位点的核酸分子；
(I-2)所述探针组包含第一探针和第二探针；其中，
(i)第一探针和第二探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，第一探针和第二探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；并且
(ii)第一探针能够与含有所述目标SNP位点的第一等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)，第二探针能够与含有所述目标SNP位点的第二等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)；并且，所述第一探针和第二探针特异于不同的等位基因；
(II)使用所述扩增引物组和探针组对所述待检测的胎儿样品进行数字PCR，对具有第一等位基因的核酸分子和具有第二等位基因的核酸分子进行定量检测；
(III)根据步骤(II)的定量检测结果，确定所述待检测的胎儿样品中母体细胞的比例。
在某些实施方案中，所述胎儿样品选自脐带血，羊水，绒毛，及其任何组合。
在某些实施方案中，所述胎儿样品包含DNA(例如基因组DNA或cDNA)；
在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针特异于同一SNP位点的不同的基因型别。
在某些实施方案中，所述目标SNP位点各自独立地选自：
(1)胎儿基因型为纯合、母体基因型为杂合的SNP位点；
(2)胎儿基因型为杂合、母体基因型为纯合的SNP位点；
在某些优选的实施方案中，所述目标SNP位点为胎儿基因型为纯合、母体基因型为杂合的SNP位点。
在本申请的方法中，以所述探针组中的第一探针为例，其能够与具有第一等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)。因此，在进行数字PCR反应时，在退火或延伸过程中，所述第一探针将与所述核酸分子形成双链体，并在扩增期间被核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)所降解，释放报告基团(例如荧光基团)。由此，在数字PCR扩增反应结束后，通过微滴检测仪对各微滴的终点荧光进行检测，根据游离的第一报告基团(例如第一荧光基团)的信号(例如第一荧光信号)强度，即可确定阳性微滴和阴性微滴数，从而确定样品中具有第一等位基因的核酸分子的量。类似地，在数字PCR扩增反应结束后，通过微滴检测仪对各微滴的终点荧光进行检测，根据游离的第二报告基团(例如第二荧光基团)的信号(例如第二荧光信号)强度，即可确定阳性微滴和阴性微滴数，即可确定样品中具有第二等位基因的核酸分子的量。由于母体/胎儿基因型别不同，对应于第一/第二等位基因含量即不同，因此，通过比较和分析含有第一/第二等位基因的核酸分子的量，即可判断胎儿样品中是否存在母体细胞，并且任选地，确定母体细胞的比例。
在本申请的方法中，在某些实施方案中，所述第一探针在数字PCR反应过程中不与具有第二等位基因的核酸分子退火或杂交；和/或，所述第二探针在数字PCR反应过程中不与具有第一等位基因的核酸分子退火或杂交。易于理解，所述第一/第二探针的杂交特异性是特别有利的，其能够有助于准确测定第一等位基因/第二等位基因的含量，从而有助于计算母体细胞和胎儿细胞各自的比例。在某些实施方案中，可通过控制数字PCR反应的退火温度和/或延伸温度，从而获得所述第一/第二探针的杂交特异性。例如，可设置退火温度和/或延伸温度低于第一探针与具有第一等位基因的核酸分子形成的双链体的熔点，但高于第一探针与具有第二等位基因的核酸分子形成的双链体的熔点，从而使得第一探针在数字PCR反应过程中与具有第一等位基因的核酸分子杂交，但不与具有第二等位基因的核酸分子杂交。类似地，可设置退火温度和/或延伸温度低于第二探针与具有第二等位基因的核酸分子形成的双链体的熔点，但高于第二探针与具有第一等位基因的核酸分子形成的双链体的熔点，从而使得第二探针在数字PCR反应过程中与具有第二等位基因的核酸分子杂交，但不与具有第一等位基因的核酸分子杂交。
在某些实施方案中，通过以下的一种或多种方法计算所述胎儿样品中母体细胞的比例：
(1)当目标SNP位点是胎儿基因型为纯合(例如，AA)，母体基因型为杂合(例如，AB)的SNP位点时，所述胎儿样品中母体细胞的比例为：2NB/(NA+NB)，其中，NB为等位基因B的拷贝数(其可通过数字PCR确定)，NA为等位基因A的拷贝数(其可通过数字PCR确定)；
(2)当目标SNP位点是胎儿基因型为杂合(例如，AB)，母体基因型为纯合(例如，AA)的SNP位点时，所述胎儿样品中母体细胞的比例为：(NA-NB)/(NA+NB)，其中，NB为等位基因B的拷贝数(其可通过数字PCR确定)，NA为等位基因A的拷贝数(其可通过数字PCR确定)。
在某些优选的实施方案中，通过方案(1)来计算所述胎儿样品中母体细胞的比例。
在本申请的方法中，等位基因的拷贝数量可根据泊松分布原理，由数字PCR平台检测并通过软件直接输出，其相关原理及计算方法可参见例如，Milbury CA,Zhong Q,Lin J,et al.Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.Biomol Detect Quantif.2014；1(1):8-22.Published 2014Aug20.doi:10.1016/j.bdq.2014.08.001。
在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。
在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。
在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针各自独立地具有3'-OH末端；或者，所述探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。
在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针各自独立地为自淬灭探针；例如，所述探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。在某些实施方案中，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离。
在某些实施方案中，所述探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)。
在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构。
在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针具有不同的报告基团。在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针是可被核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)降解的。
在某些实施方案中，所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，20个，40个，60个的组合)：SEQ ID NO:73，74，78，79，82，83，86，87，90，91，94，95，98，99，102，103，106，107，110，111，114，115，118，119，122，123，126，127，130，131，134，135，138，139，142，143，146，147，150，151，154，155，158，159，162，163。
在某些实施方案中，所述扩增引物组的引物各自独立地含有特异于含有SNP位点的靶核酸的序列。
在某些实施方案中，所述扩增引物组的引物的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。
在某些实施方案中，所述扩增引物组的引物或其任何组成成分各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。
在某些实施方案中，所述扩增引物组包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：SEQ ID NO:72和73；77和76；80和81；84和85；88和89；92和93；96和97；100和101；104和105；108和109；112和113；116和117；120和121；124和125；128和129；132和133；136和137；140和141；144和145；148和149；152和153；156和157；160和161。
在另一方面，本申请还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括，能够不对称扩增含有候选SNP位点的靶核酸的鉴定引物组。
在某些实施方案中，所述鉴定引物组包含：第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对，其中，
所述第一通用引物包含第一通用序列；
所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；
所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种能够检测所述候选SNP位点的检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述候选SNP位点的区域退火或杂交，并且标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。
在某些实施方案中，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：
(1)所述候选SNP位点在不同人种之间的Fst小于0.3(例如，小于0.2，小于0.1，小于0.05，小于0.01)；
(2)所述候选SNP位点位于不同染色体；
(3)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.2至0.8之间(例如，0.3至0.7之间，0.4至0.6之间)。
在某些实施方案中，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：
(1)所述候选SNP位点在不同人种之间的Fst小于0.01；
(2)所述候选SNP位点位于不同染色体；
(3)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.3至0.7之间。
在某些实施方案中，所述候选SNP位点为二等位多态性的SNP位点。
在某些实施方案中，所述候选SNP位点为人基因组中的SNP位点；例如所述靶核酸包含选自下列的人基因组SNP位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，以及前述SNP位点的任意组合(例如，前述SNP位点中任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)。
在某些实施方案中，所述靶核酸包含下列人基因组SNP位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776和rs7160304。
在某些实施方案中，所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)：SEQ ID NO:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66和69。
在某些实施方案中，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:71所示。
在某些实施方案中，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:70所示。
在某些实施方案中，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：SEQ ID NO:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68。
易于理解，本申请试剂盒中的第一通用引物、第二通用引物、靶特异性引物对和检测探针用于实施如上所述的方法。因此，上文中对于第一通用引物、第二通用引物、靶特异性引物对和检测探针所进行的详细描述(包括各种优选特征和示例性特征的描述)同样也适用于此处。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：扩增引物组，探针组，用于进行数字PCR的试剂。
在某些实施方案中，所述扩增引物组至少包含一条扩增引物(例如一对扩增引物或更多的扩增引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增含有所述SNP位点的核酸分子。
在某些实施方案中，所述探针组包含第一探针和第二探针；其中，
(i)第一探针和第二探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，第一探针和第二探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；并且
(ii)第一探针能够与含有所述目标SNP位点的第一等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)，第二探针能够与含有所述目标SNP位点的第二等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)；并且，所述第一探针和第二探针特异于不同的等位基因。
在某些实施方案中，所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，20个，40个，60个的组合)：SEQ ID NO:73，74，78，79，82，83，86，87，90，91，94，95，98，99，102，103，106，107，110，111，114，115，118，119，122，123，126，127，130，131，134，135，138，139，142，143，146，147，150，151，154，155，158，159，162，163；
在某些实施方案中，所述扩增引物组包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：SEQ ID NO:72和73；77和76；80和81；84和85；88和89；92和93；96和97；100和101；104和105；108和109；112和113；116和117；120和121；124和125；128和129；132和133；136和137；140和141；144和145；148和149；152和153；156和157；160和161。
在某些实施方案中，所述进行数字PCR的试剂选自包括选自下列的一种或多种组分：用于制备微液滴样本的试剂，用于进行核酸扩增的试剂，核酸聚合酶，用于检测微液滴样本的试剂，或其任何组合。
易于理解，本申请试剂盒中的扩增引物组和探针组(第一探针和第二探针)用于实施如上所述的方法。因此，上文中对于扩增引物组和探针组(第一探针和第二探针)所进行的详细描述(包括各种优选特征和示例性特征的描述)同样也适用于此处。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合。
在某些实施方案中，所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶，例如DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶如上所定义。
在某些实施方案中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg2+)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合。
在某些实施方案中，所述试剂盒用于判断胎儿样品中是否含有母体细胞，或者，计算胎儿样品中母体细胞的比例。
在某些实施方案中，所述数字PCR选自微滴式数字PCR和芯片式数字PCR。
在本申请的又一方面，提供了如前所定义的鉴定引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于不对称扩增靶核酸分子，或用于鉴定能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的SNP位点。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含如前所定义的检测探针。
在某些实施方案中，所述试剂盒用于实施如前所描述的方法。
在本申请的再一方面，提供了如前所定义的扩增引物组和探针组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于判断胎儿样品中是否含有母体细胞；或用于确定胎儿样品中母体细胞的比例。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含用于确定胎儿或母体的基因组中一个或多个SNP位点的基因型别的试剂。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含如前所定义的鉴定引物组和检测探针。
在某些实施方案中，所述试剂盒用于实施如前所描述的方法。
发明的有益效果
与现有技术相比，本申请的优势在于：(1)自动化检测，人工操作步骤少，且检测周期短。本申请独特的SNP分型系统可同时实现对多个SNP的分型，自动化程度高。整个流程从核酸提取到获得结果可以在1天内完成，能够及时对产前诊断样本中是否存在母体细胞做出准确判断，辅助产前诊断；(2)准确、灵敏度高。本申请能准确的给出胎儿样品中母体细胞存在的比例，甚至可检测低至0.1％的母体细胞的存在。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1示意性地描述了本发明方法通过SNP分型检测胎儿样品中母体细胞存在或比例的示例性实施方案，以阐释本发明方法的基本原理。
图1A示意性地描述了该实施方案中所涉及的引物组和自淬灭荧光检测探针，其中，引物组包括：第一通用引物和第二通用引物，以及，包含正向引物和反向引物的靶特异性引物对；其中，
第一通用引物包含第一通用序列(Tag1)；
第二通用引物包含第二通用序列(Tag2)，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸(例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸)；
正向引物包含第一通用序列和特异于含有SNP位点的靶核酸的正向核苷酸序列，且正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；
反向引物包含第二通用序列和特异于含有SNP位点的靶核酸的反向核苷酸序列，且反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，
正向引物和反向引物能够特异性扩增相应的含有SNP位点的靶核酸；并且，
第二通用序列不能与正向引物的互补序列完全互补。
图1B示意性地描述了使用图1A的引物组进行扩增时，引物二聚体的非特异性扩增被抑制的原理，其中，因正向引物和反向引物的非特异性扩增而形成的引物二聚体在变性后将产生其5'端和3'端包含彼此互补的反向序列的单链核酸，该单链核酸自身在退火阶段将形成锅柄结构，阻止第一通用引物和第二通用引物对该单链核酸的退火和延伸，从而抑制引物二聚体的进一步扩增。
图1C示意性地描述了使用图1A的引物组和检测探针对含有SNP位点的多个靶核酸同时检测的原理。在该实施方案中，针对每个含有SNP位点的靶核酸分别设计一对正向引物和反向引物以及一条自淬灭荧光检测探针，具体检测流程如下：
首先，由浓度低的靶特异性引物对启动PCR扩增，产生初始扩增产物，其包含分别与正向引物/第一通用引物和反向引物/第二通用引物互补的两条核酸链(核酸链A和核酸链B)；随后，由浓度高的第一通用引物和第二通用引物对所述初始扩增产物进行后续的PCR扩增。
由于反向引物/第二通用引物包含第一通用序列，因此，第一通用引物不仅能够退火至核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而且能够退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链。也即，第一通用引物可以同时扩增核酸链A和核酸链B。
第二通用引物在第一通用序列的3'端包含额外的核苷酸，因此，其与核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)在3'端是不匹配的(即，在3'端不能完全互补)。由此，在扩增过程中，第二通用引物将优先退火至核酸链B(与反向引物/第二通用引物互补的核酸链)并合成其互补链，而基本上不能延伸合成核酸链A(与正向引物/第一通用引物互补的核酸链)的互补链。
因此，随着PCR扩增的进行，核酸链A的互补链(核酸链B)的合成效率将显著低于核酸链B的互补链(核酸链A)，导致核酸链B的互补链(核酸链A)被大量合成和扩增，而核酸链A的互补链(核酸链B)的合成和扩增受到抑制，从而产生大量目标单链产物(核酸链A，其含有与正向引物/第一通用引物互补的序列以及反向引物/第二通用引物的序列)，实现不对称扩增。此外，为进一步增强扩增的不对称性，还可以调整第一通用引物和第二通用引物的比例，使得第一通用引物的浓度低于第二通用引物，以更好地富集目标单链产物。在同一反应体系内同时使用多对正向引物和反向引物对，就可以同时不对称扩增多个含有SNP位点的靶核酸，产生大量的含有SNP位点的靶核酸单链。
PCR扩增完之后，预先加入的多条自淬灭荧光检测探针与对应的含有SNP位点的靶核酸单链分别结合，形成检测探针与靶核酸单链的双链杂交体，因所形成双链杂交体稳定性的不同，经熔解曲线分析后，即能获得不同的熔解峰，再根据熔点(Tm)的高低及探针所标记的荧光基团类型即可判定各靶核酸单链中SNP的基因型。
图2显示了本申请方法检测胎儿样品中母体细胞的存在或比例的流程图。
图3显示了实施例2中高丰度梯度组的检测值与理论值的相关性分析结果。
图4显示了实施例2中低丰度梯度组的检测值与理论值的相关性分析结果。
图5显示了实施例3中使用本发明方法对母体基因组DNA和胎儿基因组DNA的SNP分型结果。其中，黑色实线代表P1062样本组中胎儿基因组DNA，黑色虚线代表P1062样本组中母体基因组DNA；灰色实线代表P1020样本组中胎儿基因组DNA，灰色虚线代表P1020样本组中母体基因组DNA。
图6显示了实施例3中对目标SNP位点进行数字PCR的检测结果。其中，图6A为P1062样本组的rs68076527位点的检测结果，实线圆圈中的散点代表基因型“-”的拷贝数，虚线圆圈中的散点代表基因型“TT”的拷贝数；P1062样本组的rs2122080位点的检测结果中，实线圆圈中的散点代表基因型“G”的拷贝数，虚线圆圈中的散点代表基因型“T”的拷贝数；图6B为P1020样本组的rs68076527位点的检测结果，实线圆圈中的散点代表基因型“-”的拷贝数，虚线圆圈中的散点代表基因型“TT”的拷贝数；P1020样本组的rs7160304位点的检测结果中，实线圆圈中的散点代表基因型“T”的拷贝数，虚线圆圈中的散点代表基因型“G”的拷贝数。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。应当理解的是，这些实施例只是用于说明本发明的原理和技术效果，而并不是表示本发明的所有可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数。本领域技术人员可以根据本发明的原理，利用其它类似的材料或反应条件来实施其他技术方案。此类技术方案没有脱离本发明描述的基本原理和概念，并且涵盖在本发明的范围内。
实施例1.SNP位点的选取
本申请的SNP位点优选的具备以下条件：(1)不同人种之间Fst(群体固定系数)＜0.01，即这些位点在不同人种的人群中分化程度很小，基因杂合性水平接近；(2)等位基因频率为0.3至0.7之间；(3)在亚洲人群中的分布遵循哈迪温伯格平衡；(4)每两个SNP之间的距离都>1Mb；(5)为了避免不同位点之间连锁，尽量选择位于不同染色体上的位点。按以上标准进行SNP位点的筛选，本实施例选用了优选的23个SNP位点，具体如表1所示，SNP位点信息及序列从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的dbSNP数据库查询和下载，等位基因频率参考千人基因组数据库来源的亚洲人群频率，这些位点均匀分布在基因组各条染色体上。
表1.实施例1选取的SNP位点信息
| SNP名称 | 等位基因类型 | 等位基因频率 | 所在染色体 |
| rs16363 | TGTTT/- | 0.4740/0.5260 | 22 |
| rs1610937 | AGGA/- | 0.4300/0.5700 | 5 |
| rs5789826 | GTAA/- | 0.4440/0.5560 | 11 |
| rs1611048 | TAAG/- | 0.4300/0.5700 | 7 |
| rs2307533 | TGAC/- | 0.5790/0.4210 | 14 |
| rs112552066 | AGAG/- | 0.4940/0.5060 | 1 |
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实施例2.模拟母体细胞污染考察体系的检测的能力
本实例中以rs4971514作为目标SNP位点，选取2份人类基因组DNA样本，将rs4971514位点基因型为杂合型(GC)的样本作为模拟的母体DNA样本，rs4971514位点基因型为纯合型(CC)的样本作为模拟的胎儿DNA样本。将模拟的母体样本与模拟的胎儿样本混合，得到不同比例的混合样本，其中，高丰度梯度组的混合样本中母体样本含量为0％、1.5625％、3.125％、6.25％、12.5％、25％、50％、75％、87.5％、93.75％、96.875％、98.4375％、100％；低丰度梯度组的混合样本中母体样本含量为0％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、5％、10％。将以上模拟的MCC比例的理论值与数字PCR实际检测值进行相关性分析，以考察本发明方法的检测灵敏度和准确性，建立MCC定量分析模型。
2.1数字PCR的方法
对上述混合样本分别进行数字PCR，数字PCR体系为30μL，含有ddPCR通用扩增试剂(新羿生物，北京)，rs4971514位点上、下游引物浓度0.8μmol/L，检测探针浓度0.25μmol/L(引物和探针的具体序列如表4所示)，将5ng样本分别加入至PCR体系中，使用Drop Marker样本制备仪(新羿生物，北京)制备成体积纳升级别的液滴，PCR扩增程序为95℃预变性10min，94℃变性30秒，58℃退火60秒，40个循环，12℃保温。在PCR反应结束后，使用ChipReader生物芯片阅读仪(新羿生物，北京)对微液滴进行定量检测，阅读系统导出Excel格式的样本检测数据，包括FAM、HEX荧光通道的阴阳性微滴数、拷贝数等。
2.2数据分析的方法
根据孟德尔规律可推导出母体细胞污染定量分析模型。假定模拟母体DNA样本的目标SNP位点基因型为杂合型(AB)，模拟胎儿DNA样本的目标SNP位点基因型为纯合型(AA)，而数字PCR测定的A等位基因的个数为NA，B等位基因的个数为NB，则MCC的比例PM为：
在本实施例中，检测的母体DNA样本基因型为GC，胎儿DNA样本基因型为GG，基于数字PCR分别得到G等位基因的个数为含量为NG和C等位基因的个数为含量为NC，并通过上述方法分别计算出检测值(PM)。并且，对以上模拟样本的检测值与理论值进行相关系数和T检验，相关系数(Correlation coefficient)是反应变量之间关系密切程度的统计指标，相关系数的取值区间在1到-1之间。1表示两个变量完全线性相关，-1表示两个变量完全负相关，0表示两个变量不相关。而T检验常用于样本含量较小(例如n<30)，总体标准差σ未知的正态分布资料。它是用T分布理论来推论差异发生的概率，从而比较两个平均数的差异是否显著；以此验证模拟实验数据的相关性和可靠性。
2.3实验结果
数字PCR的检测结果如表2和表3所示。将检测值与理论值进行比较，其中，高丰度梯度组的相关性分析结果如图3所示，相关系数为0.9997，T检验0.9444。低丰度梯度组的相关性分析结果如图4所示，相关系数为0.9994，T检验0.8760。通过相关系数和T检验的统计可以看出，MCC比例的检测值与理论值无显著差异，并且，检测值与理论值呈高度的线性正相关关系，结果符合预期。证明了本申请的方法评估母体细胞污染程度的可行性，并且，在MCC比例为0％至100％区间内，无论高、低程度的污染，本申请的方法均能够定量准确，且对母体样本检测的灵敏度低至0.1％及以下，具有较好的检测灵敏度。
表2.高丰度梯度组的检测结果
| N<sub>G</sub> | N<sub>C</sub> | 检测值(P<sub>M</sub>) | 理论值 |
| 9136.4 | 0.0 | 0.00％ | 0％ |
| 8188.1 | 57.8 | 1.40％ | 1.5625％ |
| 8146.5 | 159.3 | 3.84％ | 3.125％ |
| 7873.4 | 243.8 | 6.01％ | 6.25％ |
| 7706.2 | 505.9 | 12.32％ | 12.5％ |
| 6603.0 | 1003.7 | 26.39％ | 25％ |
| 6928.8 | 2487.5 | 52.83％ | 50％ |
| 4943.9 | 3210.4 | 78.74％ | 75％ |
| 4108.9 | 3291.2 | 88.95％ | 87.5％ |
| 3952.5 | 3621.5 | 95.63％ | 93.75％ |
| 4085.6 | 4057.6 | 99.66％ | 96.875％ |
| 4288.8 | 4257.1 | 99.63％ | 98.4375％ |
| 5403.1 | 5417.3 | 100.13％ | 100％ |
表3.低丰度梯度组的检测结果
实施例3.产前诊断样本中母体细胞污染的检测
本实施例采集并检测了临床中6例产前诊断样本，考察本发明方法用于检测母体样本污染程度的能力，具体流程如图2所示。
3.1样本的收集和提取
收集6例产前诊断样本，包括3例绒毛样本、2例胎儿脐血样本和1例羊水样本，以及对应的母体的外周血样本。采用Lab-Aid 824核酸提取仪以及配套的基因组DNA提取试剂(厦门致善生物科技股份有限公司，厦门)提取上述各样本的基因组DNA，使用Nanodrop-2000微量紫外可见分光光度计(赛默飞世尔科技公司，美国)测定基因组DNA的浓度和纯度。
3.2SNP位点的检测
按实施例1中所选取的SNP位点，设计相应的引物和探针，具体序列及使用浓度如表4所示。利用多重不对称PCR系统和多色探针熔解曲线分析技术(原理如图1所示)，在2个PCR反应体系中同时对23个SNP进行分型。
表4.实施例3所使用的引物、探针序列及使用浓度
SNP分型体系具体配置如下：25μL的PCR反应体系含有：1×PCR buffer(TAKARA,北京)，5.0mM MgCl2，0.2mM dNTPs，1U Taq DNA聚合酶(TAKARA,北京)，引物和探针及用量如表4所示，5μL人类基因组DNA或阴性对照(水)。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；10个循环的95℃变性15s，65℃-56℃退火15s(每个循环下降1℃)，76℃延伸20s；95℃变性15s，55℃退火15s，76℃延伸20s，50个循环；随后进行熔解曲线分析，程序为：95℃变性1min，37℃维持3min；随后按0.04℃/s的升温速率从40℃递增至85℃进行熔解曲线分析，并采集FAM、HEX、ROX、CY5、Quasar705通道的荧光信号。本实验采用的仪器为SLAN 96实时荧光PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)。
各组样本SNP的具体分型结果见表5-1、5-2和5-3。其中，P1062样本组和P1020样本组的SNP分型典型结果如图5所示。黑色实线代表P1062样本组中胎儿基因组DNA，黑色虚线代表P1062样本组中母体基因组DNA；灰色实线代表P1020样本组中胎儿基因组DNA，灰色虚线代表P1020样本组中母体基因组DNA。
3.3目标SNP位点的选取
对比胎儿DNA样本和母体DNA样本相应的SNP位点的基因型，获取目标SNP位点(即胎儿DNA样本和母体的DNA样本中的同一个SNP位点的基因型不同)。在本实施例中，6例产前诊断样本组的胎儿和母体DNA样本的各SNP分型结果见表5.1-5.3。其中，P1062样本组的目标SNP位点为8个，符合胎儿基因型为纯合、母体基因型为杂合的目标SNP位点有rs2122080、rs68076527和rs4971514，符合胎儿基因型为杂合、母体基因型为纯合的目标SNP位点有rs5858210、rs1610937、rs149809066、rs774763和rs2053911，选取其中优选的2个(即rs68076527和rs2122080)采用数字PCR对胎儿DNA的各等位基因进行定量分析；P1020样本组的目标SNP位点为10个，符合胎儿基因型为纯合、母体基因型为杂合的目标SNP位点有rs112552066、rs2053911、rs68076527和rs7160304，符合胎儿基因型为杂合、母体基因型为纯合的目标SNP位点有rs34765837、rs16363、rs12990278、rs98506667、rs774763和rs711725，选取其中优选的2个(rs68076527和rs7160304)采用数字PCR对胎儿DNA的各等位基因进行定量分析；P1008样本组的目标SNP位点为15个，符合胎儿基因型为纯合、母体基因型为杂合的目标SNP位点有rs5858210、rs34765837、rs1610937、rs2122080、rs98506667和rs711725，符合胎儿基因型为杂合、母体基因型为纯合的目标SNP位点有rs112552066、rs66960151、rs68076527、rs5789826、rs6424243、rs12990278、rs774763、rs2053911和rs7160304，选取其中优选的2个(rs34765837和rs2122080)采用数字PCR对胎儿DNA的各等位基因进行定量分析；P1070样本组的目标SNP位点为12个，符合胎儿基因型为纯合、母体基因型为杂合的目标SNP位点有rs5789826、rs34765837、rs16363、rs2307553、rs6424243和rs711725，符合胎儿基因型为杂合、母体基因型为纯合的目标SNP位点有rs2307839、rs112552066、rs5858210、rs66960151、rs68076527和rs98506667，选取其中优选的2个(rs6424243和rs711725)采用数字PCR对胎儿DNA的各等位基因进行定量分析；P1021样本组的目标SNP位点为12个，符合胎儿基因型为纯合、母体基因型为杂合的目标SNP位点有rs112552066、rs149809066和rs2053911，符合胎儿基因型为杂合、母体基因型为纯合的目标SNP位点有rs2307839、rs66960151、rs68076527、rs5789826、rs16363、rs774763、rs10779650、rs4971514和rs7160304，选取其中优选的2个(rs112552066和rs149809066)采用数字PCR对胎儿DNA的各等位基因进行定量分析；P1098样本组的目标SNP位点为10个，符合胎儿基因型为纯合、母体基因型为杂合的目标SNP位点有rs112552066、rs5858210、rs66960151、rs5789826、rs12990278、rs711725和rs7160304，符合胎儿基因型为杂合、母体基因型为纯合的目标SNP位点有rs2307839、rs1610937和rs2307553，选取其中优选的2个(rs711725和rs7160304)采用数字PCR对胎儿DNA的各等位基因进行定量分析。
表5-1.P1062组和P1020组样本的SNP分型结果
表5-2.P1008组和P1070组样本的SNP分型结果
表5-3.P1021组和P1098组样本的SNP分型结果
3.4胎儿DNA样本目标SNP位点的等位基因的定量分析
按实施例1所选取的SNP位点分别建立数字PCR定量分析体系，每个体系均包含有一对引物和分别针对SNP位点的等位基因特异的两条探针，各SNP位点定量体系所使用的引物和探针以及使用量如表6所示。对于选定的目标SNP位点，采用数字PCR体系对目标SNP位点各等位基因含量进行测定。数字PCR体系配置、PCR扩增程序、操作流程以及数据分析同实施例2。
P1062样本组选定的目标SNP位点(即rs68076527和rs2122080)和P1020样本组选定的目标SNP位点(rs68076527和rs7160304)的数字PCR定量分析结果如图6所示。在绒毛组织的P1062样本中，检测到了低于0.5％的MCC，在胎儿脐血的P1020样本中，检测到了0.0％的MCC。
表6.数字PCR定量分析体系所使用的引物和探针
3.5STR分析
本实施例以STR分析作为对照，具体实验步骤参见Buchovecky CM,Nahum O,LevyB.Assessment of Maternal Cell Contamination in Prenatal Samples byQuantitative Fluorescent PCR(QF-PCR).Methods Mol Biol.2019；1885:117-127。简言之，采用AmpFLSTR Identifiler PCR扩增试剂盒(赛默飞世尔科技公司，美国)，通过PCR分别扩增胎儿和母亲DNA样本的15个STR基因座(CSF1PO，D7S820，D8S1179，D21S11，D2S1338，D3S1358，D13S317，D16S539，TH01，D18S51，D19S433，TPOX，vWA，D5S818，FGA)及一个性别鉴定位点Amelogenin，再将PCR产物进行毛细管电泳，比较胎儿样本和母亲电泳结果，并进行STR分型，根据各STR基因座峰面积大小计算母体细胞污染的比例。
3.6检测结果
利用本发明方法对6例产前诊断样本中是否存在母体细胞污染进行定量，其中包括3例绒毛组织、2例胎儿脐血和1例羊水细胞。6例样本中，检测到了3例绒毛样本的胎儿DNA样本存在不同程度的母体细胞污染，具体结果如表7所示。而对照STR分析的结果显示所有样本均无母体细胞污染。这是由于本发明方法用于母体细胞污染检测时，可以检测低至0.1％，甚至更低的母体细胞污染，而对照的STR方法只能检测到10％以上的母体细胞污染，从表7可以看出，3份绒毛组织的母体细胞污染程度均小于1.5％。
表7. 6例胎儿产前样本的母体细胞污染检测结果
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
<120> 一种检测胎儿样品中母体细胞存在或比例的方法和试剂盒
<130> IDC200362
<160> 163
<170> PatentIn version 3.5
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<223> 探针
<400> 39
cgcagctaca aatgtacact gcg 23
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 40
taggtgtgaa cgagcctg 18
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 41
cctgttagag ctcccac 17
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 42
cggtccccag ccctgtagcc acgaccg 27
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 43
tagtctcagt ggactttggt 20
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 44
caaacatcaa acaattcagc a 21
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 45
acctgagaat gtggttactt gcaggt 26
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 46
tccccaccca gaagaaac 18
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 47
gggaggagaa ggactgatg 19
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 48
cctcagctgt cctccccact tccgtcactg agg 33
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 49
ccccagtaat ggcagatca 19
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 50
tgccttccag atatgcattc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 51
acagcaagtc aattcactgt 20
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 52
ctccagaatc aagctgtgt 19
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 53
tcatgtagga gtgcattgt 19
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 54
ccagtaagac agctgtacac tggt 24
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 55
cgtatcattc ggttatcaag 20
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 56
cccatctgag caaagaact 19
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 57
aatcggccgg atttccctcc aggtaccgat 30
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 58
taatttctct atgctcatag gttct 25
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 59
ttcaaacctc ctattccaca g 21
<210> 60
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 60
acagcacatg taacatatgg agtgct 26
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 61
gcacaggcaa ttgagaaga 19
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 62
ctcctttaaa agggtcggt 19
<210> 63
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 63
acagcccatt tgtttctcct gtcttgaggc tg 32
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 64
ccaaactcct ggatcataaa aca 23
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 65
ggaatcaggg ataatctcta tca 23
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 66
tccagggtgc ttacactg 18
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 67
tctaccgtct aacctgcaag 20
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 68
atctacgcct gagggaca 18
<210> 69
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 69
tgctgcctga gtgatgataa gtgtcagca 29
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Tag2
<400> 70
gtcgcaagca ctcacgtaga ga 22
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Tag1
<400> 71
tcgcaagcac tcacgtagag 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 72
aggtaatctg aggtggcatc 20
<210> 73
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 73
tgtaatttcc tacctaagta gttacagt 28
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 74
ggtgattatg agagaacaac cttc 24
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 75
ggtgattatg agaacaacct tc 22
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 76
atggaaaatg taatatttct gaatgaaaga 30
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 77
cctttcatct aaatgcgttg c 21
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 78
ttgaaactca gagagactac gag 23
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 79
tgaaactcag actacgagcc 20
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 80
cgctgggtca tctattaaca c 21
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 81
gaatgccagt attcacaaca gt 22
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 82
acaaaccaga gtcttcttat gaag 24
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 83
tccaacaaac cagtcttctt 20
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 84
tccaatccag tgtttcttct ga 22
<210> 85
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 85
cacccagaca agccacc 17
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 86
gacaacgctg tgaggctct 19
<210> 87
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 87
cgacaacgct gaggctct 18
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 88
agaaatgaga ttcatttgct gga 23
<210> 89
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 89
gtctaggcca cttccctc 18
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 90
cacctctttg agtgtcaatt tcc 23
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 91
cacctctgag tgtcaatttc cc 22
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 92
aattacacat ccctcattta tccag 25
<210> 93
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 93
tgcaattaaa atctattgag caatgg 26
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 94
ctgctattat ggtaagtgtc gga 23
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 95
gctattatgg tgtcggattc a 21
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 96
cgttagtcag tcttacccta aac 23
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 97
acacgagttt cgttctttgc 20
<210> 98
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 98
cggcacattc cgggagg 17
<210> 99
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 99
actgcccggc tccgg 15
<210> 100
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 100
agaagaacac agtggggc 18
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 101
gctggattga agtgcatttg a 21
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 102
ggacaacaaa acaaaacagg attc 24
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 103
gggacaacaa aacaggattc a 21
<210> 104
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 104
catttaggaa gccaaatagg atgtac 26
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 105
gtaaaagtct gcagaaaatg ggt 23
<210> 106
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 106
acgaggaagg aagggaaga 19
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 107
cacgaggaag ggaagacat 19
<210> 108
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 108
tgcatccttg ctgacga 17
<210> 109
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 109
agcttttatt tcagatacct gttga 25
<210> 110
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 110
tgcagtaact acaagtaagg aaagta 26
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 111
tgcagtaact acaaggaaag taatt 25
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 112
cccactgatc atctcccaaa 20
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 113
cactatggtg attcctagta cctt 24
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 114
gtgttgctct ctctcagttg g 21
<210> 115
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 115
gttgctctct cagttggg 18
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 116
gcatgcattt caaagtttat acctg 25
<210> 117
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 117
caaggagagc aataagtatg tatcg 25
<210> 118
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 118
catttgactg acagagtagg gg 22
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 119
agtgggcatt tgacagagta 20
<210> 120
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 120
agcagatcct tggtcagt 18
<210> 121
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 121
caaagggatg ggttcctct 19
<210> 122
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 122
gcagctacaa atgtacact 19
<210> 123
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 123
gcagctacaa atatacact 19
<210> 124
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 124
tccaccataa atctcaacta ttcg 24
<210> 125
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 125
gctcccacaa ccttcct 17
<210> 126
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 126
gttgccctgg tcatgg 16
<210> 127
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 127
gttgccctgg tcgtgg 16
<210> 128
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 128
gcattagctg aatcctttaa gaga 24
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 129
aatccttaaa aacaatgcag cag 23
<210> 130
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 130
ctgagaatgt tgttacttgc ag 22
<210> 131
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 131
ctgagaatgt ggttacttgc ag 22
<210> 132
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 132
gaaaccttgc catctccag 19
<210> 133
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 133
ggcatcagtg acggaagt 18
<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 134
gttcccagct ctcctccc 18
<210> 135
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 135
gttcccagct gtcctcc 17
<210> 136
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 136
tctgctcagt gtgacaagt 19
<210> 137
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 137
gagtgtgatt tgatttttat gcttttg 27
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 138
tgtgaattga cttgctgagg aa 22
<210> 139
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 139
tgaattgact tggtgagga 19
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 140
gttacagata ttcccagagc a 21
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 141
ttctcccaat tctcaaagca 20
<210> 142
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 142
cagtaaggca gctgtacac 19
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 143
cagtaagaca gctgtacact g 21
<210> 144
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 144
cattcggtta tcaagtatta ccca 24
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 145
ctttctggct catgtctgac 20
<210> 146
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 146
gatttccctg caggtacct 19
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 147
cggatttccc tccaggtacc 20
<210> 148
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 148
gtctttaagg atgttctcta aatttttgt 29
<210> 149
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 149
acctcctatt ccacagaaga ttat 24
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 150
agcacatgta acatatggag 20
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 151
agcacatgta acataaggag 20
<210> 152
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 152
atgatctgaa cagagcttct ga 22
<210> 153
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 153
ggtctgagtt cacctcctc 19
<210> 154
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 154
ctcaagacag gagaaac 17
<210> 155
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 155
cctcaagaca agagaaaca 19
<210> 156
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 156
ccaaactcct ggatcataaa aca 23
<210> 157
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 157
caggaaaaga gctgggtca 19
<210> 158
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 158
tccagggtgc ttacact 17
<210> 159
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 159
atccagggtg ctcacact 18
<210> 160
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 160
acaagctctc tcatcctaca tc 22
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 161
ccctgagtct gtctgatctg 20
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 162
tgcctgagtg atgataagtg 20
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 探针
<400> 163
tgccttagtg atgataagtg 20
Claims (13)
1.一种鉴定能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的SNP位点的方法，其包括以下步骤:
(a)提供含有来源于所述胎儿的一种或多种靶核酸的第一样品，以及含有来源于所述胎儿的母体的一种或多种靶核酸的第二样品，所述靶核酸包含一种或多种候选SNP位点，并且，
提供第一通用引物和第二通用引物，并且，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，
所述第一通用引物包含第一通用序列；
所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；
所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和
(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，通过PCR反应分别扩增第一样品和第二样品中的靶核酸，从而获得分别与第一样品和第二样品对应的扩增产物；
(c)对步骤(b)获得的与第一样品和第二样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；
(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，确定这样的SNP位点：在该位点上第一样品和第二样品具有不同基因型别；所述SNP位点为能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的SNP位点。
2.权利要求1的方法，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定第一样品和第二样品的各个候选SNP位点的型别，并分别进行比较，从而鉴定能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的SNP位点；
优选地，第一样品选自脐带血，羊水，绒毛，及其任何组合；
优选地，第二样品选自来自母体的皮肤，唾液，血液，毛发，指甲，及其任何组合；
优选地，所述第一样品包含DNA(例如基因组DNA或cDNA)；
优选地，所述第二样品包含DNA(例如基因组DNA或cDNA)；
优选地，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：
(1)所述候选SNP位点在不同人种之间的Fst小于0.3(例如，小于0.2，小于0.1，小于0.05，小于0.01)；
(2)所述候选SNP位点位于不同染色体；
(3)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.2至0.8之间(例如，0.3至0.7之间，0.4至0.6之间)；
优选地，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：
(1)所述候选SNP位点在不同人种之间的Fst小于0.01；
(2)所述候选SNP位点位于不同染色体；
(3)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.3至0.7之间；
优选地，所述候选SNP位点为二等位多态性的SNP位点；
优选地，所述候选SNP位点为人基因组中的SNP位点；例如所述靶核酸包含选自下列的人基因组SNP位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，以及前述SNP位点的任意组合(例如，前述SNP位点中任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)；
优选地，所述样品中的靶核酸包含下列人基因组SNP位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776和rs7160304。
3.权利要求1或2的方法，在步骤(a)中，针对每一种SNP位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；
并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与第一样品和第二样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；
优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析；
(2)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；
(3)所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；
(4)所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端；
(5)所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；
(6)所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL FluorGold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL FluorRed610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；
(7)所述检测探针具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰；
(8)所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构；
(9)所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；
(10)在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线；
(11)根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定各个SNP位点的型别；
(12)所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)：SEQ ID NO:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66和69。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)在所述方法的步骤(a)中，提供1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个靶特异性引物对；
(2)在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度；例如，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1-5倍，5-10倍，10-15倍，15-20倍，20-50倍或更多倍；
(3)在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度是相同的；或者，所述第一通用引物的工作浓度低于第二通用引物；
(4)在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的；
(5)所述样品或靶核酸包含mRNA，且在进行所述方法的步骤(b)之前，对所述样品进行逆转录反应；和
(6)在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应；优选地，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermusfiliformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermusscotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoganeapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus；优选地，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(2)所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分；
(3)所述第一通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；
(4)所述第一通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；
(5)所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(6)所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分；
(7)所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(8)所述第二通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；和
(9)所述第二通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(2)所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(3)所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；
(4)所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分；
(5)所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；
(6)所述正向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；
(7)所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；
(8)在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(9)所述反向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(10)所述反向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；
(11)所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分；
(12)所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；
(13)所述反向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；
(14)所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；和
(15)所述第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；例如，所述第二通用序列中位于3'末端的至少一个核苷酸，例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，不能与所述正向引物的互补序列互补；
优选地，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:71所示；
优选地，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:70所示；
优选地，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：SEQ ID NO:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中，所述方法的步骤(a)-(b)通过包含下述步骤(I)-(VI)的方案来进行：
(I)提供来源于所述胎儿一种或多种靶核酸的第一样品，以及含有来源于所述胎儿的母体的一种或多种靶核酸的第二样品，所述靶核酸包含一种或多种SNP位点；和，提供第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种SNP位点，提供一个靶特异性引物对；以及任选地，针对每一种SNP位点，提供一个检测探针；其中，所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对如权利要求1所定义；所述检测探针如权利要求3所定义；
(II)将所述样品与所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对，核酸聚合酶，以及任选地，检测探针混合；
(III)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；
(IV)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；
(V)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和
(VI)任选地，重复步骤(III)-(V)一次或多次；
优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)在步骤(III)中，在80-105℃的温度下温育步骤(II)的产物，从而使核酸变性；
(2)在步骤(III)中，温育步骤(II)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min；
(3)在步骤(IV)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃的温度下温育步骤(III)的产物，从而允许核酸退火或杂交；
(4)在步骤(IV)中，温育步骤(III)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min；
(5)在步骤(V)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃的温度下温育步骤(IV)的产物，从而允许核酸延伸；
(6)在步骤(V)中，温育步骤(IV)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min；
(7)在相同或不同的温度下进行步骤(IV)和(V)；和
(8)重复步骤(III)-(V)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次；优选地，当重复步骤(III)-(V)一次或多次时，每一个循环的步骤(III)-(V)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。
8.一种检测胎儿样品中母体细胞的存在或其比例的方法，其中，所述方法包含以下步骤：
(1)提供待检测的胎儿样品；
(2)鉴定一个或多个能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的目标SNP位点；其中，在所述目标SNP位点上，胎儿具有包含第一等位基因和第二等位基因的杂合基因型别，且母体具有包含第一或第二等位基因的纯合基因型别，或者，母体具有包含第一等位基因和第二等位基因的杂合基因型别，且胎儿具有包含第一或第二等位基因的纯合基因型别；
(3)对所述待检测的胎儿样品中各个目标SNP位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测；然后，根据第一等位基因和第二等位基因定量检测的结果，确定所述待检测的胎儿样品中母体的核酸的存在或其比例；
优选地，在步骤(2)中，可通过选自下列的机制来检测某个SNP位点的基因型，从而鉴定目标SNP位点：探针杂交、引物延伸、杂交连接和特异酶切；
优选地，在步骤(2)中，可通过选自下列的方法来鉴定目标SNP位点：测序法(例如，一代测序法、焦磷酸测序法、二代测序法)、芯片法(例如，使用能够检测SNP的固相芯片、液相芯片)、基于qPCR的检测法(例如，Taqman探针法)、质谱法(如基于MassARRAY的iPLEXTM Gold)、色谱法(如变性高效液相色谱法dHPLC)、电泳法(如SNPshot法)、基于熔解曲线分析的检测法；
优选地，在步骤(2)中，通过基于多重PCR结合熔解曲线分析的检测法鉴定目标SNP位点；
优选地，通过权利要求1-7任一项所描述的方法鉴定所述目标SNP位点；
优选地，在步骤(3)中，通过数字PCR对所述样品中各个SNP位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测；
优选地，通过下述方案进行步骤(3)：
(I)从步骤(2)中选取至少1个(例如，1个，2个，3个，或更多个)目标SNP位点，并且，针对每一个选取的目标SNP位点，提供一个扩增引物组和一个探针组，其中，
(I-1)所述扩增引物组至少包含一条扩增引物(例如一对扩增引物或更多的扩增引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增含有所述目标SNP位点的核酸分子；
(I-2)所述探针组包含第一探针和第二探针；其中，
(i)第一探针和第二探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，第一探针和第二探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；并且
(ii)第一探针能够与含有所述目标SNP位点的第一等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)，第二探针能够与含有所述目标SNP位点的第二等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)；并且，所述第一探针和第二探针特异于不同的等位基因；
(II)使用所述扩增引物组和探针组对所述待检测的胎儿样品进行数字PCR，对具有第一等位基因的核酸分子和具有第二等位基因的核酸分子进行定量检测；
(III)根据步骤(II)的定量检测结果，确定所述待检测的胎儿样品中母体细胞的比例；
优选地，所述胎儿样品选自脐带血，羊水，绒毛，及其任何组合；
优选地，所述胎儿样品包含DNA(例如基因组DNA或cDNA)；
优选地，所述目标SNP位点各自独立地选自：
(1)胎儿基因型为纯合、母体基因型为杂合的SNP位点；
(2)胎儿基因型为杂合、母体基因型为纯合的SNP位点；
优选地，所述目标SNP位点为胎儿基因型为纯合、母体基因型为杂合的SNP位点；
优选地，所述第一探针在数字PCR反应过程中与具有第一等位基因的核酸分子特异性退火或杂交；和，所述第二探针在数字PCR反应过程中与具有第二等位基因的核酸分子特异性退火或杂交；
优选地，所述第一探针在数字PCR反应过程中不与具有第二等位基因的核酸分子退火或杂交；和/或，所述第二探针在数字PCR反应过程中不与具有第一等位基因的核酸分子退火或杂交。
9.权利要求8的方法，其中，所述第一探针和第二探针各自独立地具有选自下列的一个或多个特征：
(1)所述第一探针和第二探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；
(2)所述第一探针和第二探针的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；
(3)所述第一探针和第二探针各自独立地具有3'-OH末端；或者，所述探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端；
(4)所述第一探针和第二探针各自独立地为自淬灭探针；例如，所述探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；
(5)所述探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL FluorGold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL FluorRed610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；
(6)所述第一探针和第二探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构；
(7)所述第一探针和第二探针具有不同的报告基团；优选地，所述第一探针和第二探针是可被核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)降解的；
(8)所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，20个，40个，60个的组合)：SEQ ID NO:73，74，78，79，82，83，86，87，90，91，94，95，98，99，102，103，106，107，110，111，114，115，118，119，122，123，126，127，130，131，134，135，138，139，142，143，146，147，150，151，154，155，158，159，162，163。
10.权利要求8或9的方法，其中，所述扩增引物组的引物各自独立地具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)含有特异于含有SNP位点的靶核酸的序列；
(2)所述引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；
(3)所述引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；
(4)所述扩增引物组包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：SEQ ID NO:72和73；77和76；80和81；84和85；88和89；92和93；96和97；100和101；104和105；108和109；112和113；116和117；120和121；124和125；128和129；132和133；136和137；140和141；144和145；148和149；152和153；156和157；160和161。
11.一种试剂盒，所述试剂盒包括，能够不对称扩增含有候选SNP位点的靶核酸的鉴定引物组；
优选地，所述鉴定引物组包含：第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种候选SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对，其中，
所述第一通用引物包含第一通用序列；
所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；
所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；
优选地，所述试剂盒还包括一种或多种能够检测所述候选SNP位点的检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述候选SNP位点的区域退火或杂交，并且标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；
优选地，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：
(1)所述候选SNP位点在不同人种之间的Fst小于0.3(例如，小于0.2，小于0.1，小于0.05，小于0.01)；
(2)所述候选SNP位点位于不同染色体；
(3)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.2至0.8之间(例如，0.3至0.7之间，0.4至0.6之间)；
优选地，所述候选SNP位点具有选自以下的1个或多个特征：
(1)所述候选SNP位点在不同人种之间的Fst小于0.01；
(2)所述候选SNP位点位于不同染色体；
(3)所述候选SNP位点的等位基因频率在0.3至0.7之间；
优选地，所述候选SNP位点为二等位多态性的SNP位点；
优选地，所述候选SNP位点为人基因组中的SNP位点；例如所述靶核酸包含选自下列的人基因组SNP位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，以及前述SNP位点的任意组合(例如，前述SNP位点中任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)；
优选地，所述靶核酸包含下列人基因组SNP位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776和rs7160304；
优选地，所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)：SEQ ID NO:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66和69；
优选地，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:71所示；
优选地，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:70所示；
优选地，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：SEQ ID NO:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68；
优选地，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：扩增引物组，探针组，用于进行数字PCR的试剂；
优选地，所述扩增引物组至少包含一条扩增引物(例如一对扩增引物或更多的扩增引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增含有所述SNP位点的核酸分子；
优选地，所述探针组包含第一探针和第二探针；其中，
(i)第一探针和第二探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，第一探针和第二探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；并且
(ii)第一探针能够与含有所述目标SNP位点的第一等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)，第二探针能够与含有所述目标SNP位点的第二等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)；并且，所述第一探针和第二探针特异于不同的等位基因；
优选地，所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，20个，40个，60个的组合)：SEQ ID NO:73，74，78，79，82，83，86，87，90，91，94，95，98，99，102，103，106，107，110，111，114，115，118，119，122，123，126，127，130，131，134，135，138，139，142，143，146，147，150，151，154，155，158，159，162，163；
优选地，所述扩增引物组包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：SEQ ID NO:72和73；77和76；80和81；84和85；88和89；92和93；96和97；100和101；104和105；108和109；112和113；116和117；120和121；124和125；128和129；132和133；136和137；140和141；144和145；148和149；152和153；156和157；160和161；
优选地，所述进行数字PCR的试剂选自包括选自下列的一种或多种组分：用于制备微液滴样本的试剂，用于进行核酸扩增的试剂，核酸聚合酶，用于检测微液滴样本的试剂，或其任何组合；
优选地，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合；
优选地，所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶，例如DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述核酸聚合酶如权利要求4和5所定义；
优选地，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg2+)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合；
优选地，所述试剂盒用于判断胎儿样品中是否含有母体细胞，或者，计算胎儿样品中母体细胞的比例；
优选地，所述数字PCR选自微滴式数字PCR和芯片式数字PCR。
12.权利要求11所定义的鉴定引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于不对称扩增靶核酸分子，或用于鉴定能够区分胎儿来源的样品与母体来源的样品的SNP位点；
优选地，所述试剂盒还包含权利要求3所定义的检测探针；
优选地，所述试剂盒用于实施权利要求1-10任一项所描述的方法。
13.权利要求11所定义的扩增引物组和探针组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于判断胎儿样品中是否含有母体细胞；或用于确定胎儿样品中母体细胞的比例；
优选地，所述试剂盒还包含用于确定胎儿或母体的基因组中一个或多个SNP位点的基因型别的试剂；
优选地，所述试剂盒还包含权利要求11所定义的鉴定引物组和检测探针；
优选地，所述试剂盒用于实施权利要求1-10任一项所描述的方法。
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| CN116497106A (zh) * | 2023-06-30 | 2023-07-28 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 一种产前诊断中母源污染的鉴别方法 |
Citations (2)
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| CN103108960A (zh) * | 2010-02-19 | 2013-05-15 | 西昆诺姆有限公司 | 用于检测胎儿核酸和诊断胎儿异常的方法 |
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