CN103108960A - 用于检测胎儿核酸和诊断胎儿异常的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明通常涉及用于检测胎儿核酸的方法和用于诊断胎儿异常的方法。在某些实施方案中，本发明提供用于测定母体样品中是否存在胎儿核酸的方法，所述方法包括：获得疑似包括胎儿核酸的母体样品，对样品实施测序反应以测定样品中至少部分Y染色体的存在情况，从而确定样品中存在胎儿核酸。在其它实施方案中，本发明提供用于定量或定性分析以检测母体样品中的胎儿核酸的方法，而与检测Y染色体的能力无关，特别是对于包括来自女性胎儿的正常核酸的样品。

Description

用于检测胎儿核酸和诊断胎儿异常的方法
相关申请
本PCT申请主张于2010年3月19日提交的美国专利申请序列号12/727,824的权益和优先权，该美国专利申请是于2010年2月19日提交的美国专利申请序列号12/709,057的部分继续，而12/709,057是于2005年2月25日提交的美国专利申请序列号11/067,102的部分继续，而11/067,102主张于2004年2月27日提交的美国专利申请序列号60/548,704的优先权和权益，上述每一专利申请的内容以其整体通过引用并入本文。
发明领域
本发明通常涉及用于检测胎儿核酸的方法和用于诊断胎儿异常的方法。
背景
胎儿非整倍性(例如唐氏综合征、爱德华综合征和帕塔综合征(Patau syndrome))和其它染色体畸变影响9/1000的活产(Cunningham等, Williams Obstetrics, McGraw-Hill, New York, 第942页, 2002)。通常通过经侵入性程序例如绒毛膜绒毛取样或羊膜穿刺获得的胎儿细胞的核型分析来诊断染色体异常。这些程序与胎儿和母亲二者的潜在重大风险有关。可利用用母体血清标记或超声的非侵入性筛查，但其可靠性有限(Fan等, PNAS, 105(42): 16266-16271, 2008)。
自从在母体血液中发现完整的胎儿细胞以来，就有强烈的兴趣去试图将这些细胞用作胎儿遗传学中的诊断窗口(Fan等, PNAS, 105(42):16266-16271, 2008)。母体循环中存在一定数量(约3%-约6%)的无细胞胎儿核酸这一发现，已导致针对多种特征开发基于非侵入性PCR的产前遗传测试。这些测试的问题是基于PCR的测定失去了对特异性的灵敏度，这使得其难以鉴别特定的突变。而且，由于PCR的随机特性，忽略了样品中以少量存在的分子群，例如来自母体组织或体液的样品中的胎儿核酸。事实上，如果在开始的几轮扩增中未扩增稀有核酸，则稀有事件在任何时候的检出变得愈加不可能。
另外，亦有这样的可能性：母体样品的胎儿核酸被降解，和由于该核酸小而不可修正用于PCR扩增。
需要可非侵入性检测胎儿核酸和诊断胎儿异常的方法。
简述
本发明通常涉及用于检测胎儿核酸的方法和用于诊断胎儿异常的方法。本发明的方法利用测序技术，特别是单分子的合成测序(sequencing-by-synthesis)技术，来检测母体组织或体液中的胎儿核酸。本发明的方法高度敏感，可用于检测母体样品中小群体胎儿核酸，而通常不需要扩增样品中的核酸。
本发明的方法涉及对自母体样品获得的核酸测序和区别母体及胎儿核酸。母体和胎儿核酸之间的区别鉴别出胎儿核酸，由此使得可基于序列变异来测定异常情况。所述异常可测定为单核苷酸多态性、变异基序、倒位、缺失、添加或任何其它核酸重排或异常。
本发明方法亦用于通过鉴别对胎儿独特的核酸，来测定母体样品中胎儿核酸的存在。例如，人们可查找获得的序列和母体参照序列的差异；或可涉及鉴定样品中的Y染色体物质。母体样品可为组织或体液。在特定实施方案中，体液是母体血液、母体血浆或母体血清。
本发明亦提供通过例如查找独特的序列或变体来确认母体样品中存在胎儿核酸的方法。
测序反应可为任何测序反应。在特定实施方案中，测序反应为单分子测序反应。单分子测序例如在以下文献中显示：Lapidus等(美国专利号7,169,560)、Lapidus等(美国专利申请号2009/0191565)、Quake等(美国专利号6,818,395)、Harris (美国专利号7,282,337)、Quake等(美国专利申请号2002/0164629)和Braslavsky等, PNAS (USA), 100: 3960-3964 (2003)，这些参考文献的每一个的内容以其整体通过引用并入本文。
简言之，在一些实施方案中，让单链核酸(例如DNA或cDNA)与连接在流动池(flow cell)表面的寡核苷酸杂交。寡核苷酸可共价地连接到表面或可采用除共价连接外的如本领域普通技术人员所知的各种连接。此外，连接可为间接连接，例如，经由直接地或间接地连接到表面的本发明聚合酶。表面可为平面的或别的形式，和/或可为多孔的或无孔的，或本领域普通技术人员所知的适于连接的任何其它类型的表面。然后在单分子分辨率下，通过对聚合酶介导的荧光标记核苷酸的添加成像或通过另外方法对其进行检测来实施核酸测序，所述添加被纳入到成长链表面寡核苷酸中。在某些实施方案中，测序反应中所用的核苷酸不是链终止核苷酸。
因为Y染色体仅在胎儿核酸来自男性时才存在，所以如果在样品中未检测到Y染色体，则本发明方法可进一步包括对获得的序列实施定量测定来检测胎儿核酸的存在情况。所述定量测定包括拷贝数分析、稀疏等位基因调用(sparse allele calling)、靶向再测序和断点分析。
检测母体样品中胎儿核酸的能力使得可开发非侵入性诊断测定以评价胎儿是否具有异常。因此，本发明另一方面提供用于测定胎儿是否具有异常的非侵入性方法。本发明方法可涉及获得包括母体和胎儿核酸二者的样品，对样品实施测序反应以获得样品中的核酸信息，将获得的序列信息和参照基因组的序列信息进行比较，从而测定胎儿是否具有异常，检测样品中至少部分Y染色体的存在情况，并且如果在样品中未检测到Y染色体，则区别真阴性与假阴性。
诊断测定的重要方面是区别假阴性(实际上存在胎儿核酸而未检测到)和真阴性(检测到来自健康胎儿的核酸)的测定能力。本发明方法提供这种能力。如果在母体样品中检测到Y染色体，则本发明方法确保所述测定可完全发挥功能，因为Y染色体仅与男性相关，并且仅在样品中存在男性胎儿核酸时才在母体样品中存在。本发明的一些方法提供进一步的定量或定性分析来区别假阴性和真阴性，而与检测Y染色体的能力无关，特别是用于包括来自女性胎儿正常核酸的样品。所述额外的定量分析可包括拷贝数分析、稀疏等位基因调用、靶向再测序和断点分析。
本发明的另一方面提供用于测定胎儿是否具有异常的方法，包括获得包含母体和胎儿核酸二者的母体样品；让独特的标签与样品中的核酸连接，其中每种标签与不同的染色体缔合；对带标签的核酸实施测序反应以获得带标签的序列；通过量化带标签的序列来测定胎儿是否具有异常。在某些实施方案中，标签包括独特的核酸序列。
附图简述
图1为显示一个个体(“自身”)和两个家族成员(“家族”)之间的差异的柱状图，其代表三个样品间一组已知单核苷酸变体的比较。
图2为显示源于单分子测序并与参照人基因组独特地比对的HapMap DNA序列读数的表格。每一列代表单HELISCOPE测序仪(单分子测序仪器，Helicos BioSciences Corporation)通道的数据。
图3为显示每个样品标准化后的染色体读数的表格。将单个染色体计数除以总的常染色体计数。
图4为显示每个染色体的标准化数量的表格。读数的平均分数对应于所有样品中每一染色体。
图5为定量染色体计数的图示。
图6为显示GC偏好(bias)导致染色体计数有偏斜的样品的图表。
图7为显示作为单元中GC含量的函数而绘制的基因组单元(genomic bin)图表。在图7中，上面的样品显示与GC含量正相关，而下面的样品显示与GC含量负相关。
图8的A组是显示在给定GC含量下选择某些基因组单元用于分析的图表。图8的B组显示GC偏好校正之前的序列信息。图8的C组显示GC偏好校正之后的序列信息。
图9的A组和B组显示GC偏好校正之前的序列信息。图9的C组和D组显示GC偏好校正之后的序列信息。
图10显示序列信息的分析结果。
详述
为检测母体样品中胎儿核酸的存在情况，本发明方法使用测序反应。本发明方法亦使用测序反应来分析遗传条件下的母体血液，其中分析母体血液中胎儿和母体的混合核酸以从母体核酸背景中区别出胎儿突变或遗传异常。
胎儿核酸包括胎儿DNA和胎儿RNA两种。如在Ng等，mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma (可轻易地在母体血浆中检测到胎盘源的mRNA)，Proc. Nat. Acad. Sci. 100(8): 4748-4753 (2003)中所述。
样品
本发明方法涉及获取疑似包括母体和胎儿核酸二者的样品，例如组织或体液。所述样品可包括唾液、尿液、泪水、阴道分泌物、羊水、乳液(breast fluid)、母乳、汗液或组织。在某些实施方案中，该样品取自母体血液，并且在血浆，而不是在细胞中发现有循环DNA。优选样品是母体外周静脉血液。
在某些实施方案中，抽取大约10-20 mL血液。该数量的血液可使人们获得至少约10,000个基因组当量的总核酸(样品大小基于胎儿核酸的估计值，该估计值为在早期妊娠时约25个基因组当量/mL的母体血浆，且胎儿核酸浓度约占总血浆核酸的约3.4%)。然而，对于遗传筛选，需要较低的统计显著性，或核酸样品富含胎儿核酸，因此可抽取更少的血液。
因为母体样品中胎儿核酸的量通常随妊娠进程而增加，所以为从样品中获得相同或相似数量的胎儿核酸，随妊娠进程所需的样品可更少。
富集
在某些实施方案中，可任选通过已知的方法来富集样品(例如血液、血浆或血清)中的胎儿核酸，例如用大小分级来选择小于约300 bp的DNA片段。或者，可排除趋向大于约500 bp的母体DNA。
在某些实施方案中，可如Li等(J. Amer. Med. Assoc. 293:843-849, 2005)所述来处理母体血液以增加胎儿DNA在总DNA中的浓度，该文献内容以其整体通过引用并入本文。简言之，用市售柱技术(Roche高度纯化模板DNA纯化试剂盒；Roche, Basel, Switzerland)联合真空泵，从5 mL-10 mL母体血浆中提取循环DNA。提取后，用琼脂糖凝胶(1%)电泳(Invitrogen, Basel, Switzerland)分离DNA，小心地切除含有大小约300 bp的循环DNA的凝胶部分。通过用提取试剂盒(QIAEX 11凝胶提取试剂盒；Qiagen, Basel, Switzerland)从该凝胶薄片中提取DNA，将其洗脱到终体积为40 μL无菌10-mM的Tris盐酸中， pH 8.0 (Roche)。
可通过已知方法来浓缩DNA，包括离心和各种酶抑制剂。将DNA结合到选择性膜上(例如二氧化硅)以将其与污染物分离。优选针对血浆中循环的片段来富集DNA，其长度小于1000个碱基对，通常小于300 bp。在DNA大小分离介质例如电泳凝胶或色谱材料上进行该大小选择。Huber等(Nucleic Acids Res. 21(5):1061-1066, 1993)阐述了所述材料，Kato等(J. Biochem, 95(1):83-86, 1984)阐述了凝胶过滤色谱、TSK凝胶。这些参考文献中每一篇的内容以其整体通过引用并入本文。
另外，可通过使用肽核酸(PNA)抑制某些等位基因来完成富集，所述肽核酸与其互补的靶序列结合，但不扩增。
Enders等(Clinical Chemistry 49:727-731, 2003)阐述了血浆RNA的提取，其内容以其整体通过引用并入本文。如该文所述，将离心步骤后收获的血浆与Trizol LS试剂(Invitrogen)和氯仿混合。将混合物离心，转移水层到新的管中。将乙醇加入到水层中。然后按照厂家建议，将混合物加入到RNeasy迷你柱(Qiagen)并处理。
另一富集步骤可以如Dhallan等(J. Am. Med. Soc. 291(9): 1114-1119, 2004年3月；和美国专利申请号20040137470)所述，用甲醛处理血液样品，以上每一文献的内容以其整体通过引用并入本文。Dhallan等(美国专利申请号20040137470)阐述了胎儿DNA的富集程序，其中将血液采集到含9 ml EDTA的Vacuette管(目录号NC9897284)中，将0.225 ml含甲醛(4% w/v)的10%中性缓冲液加入到每一管中，轻微倒转每一支管。将管保存在4℃直至用于处理。
可向管中加入阻碍细胞裂解或稳定细胞膜的试剂，包括但不限于甲醛和甲醛衍生物、福尔马林、戊二醛和戊二醛衍生物、交联剂、伯胺反应交联剂、巯基反应交联剂、巯基添加物(sulfhydryl addition)或二硫化物还原物(disulfide reduction)、碳水化合物反应交联剂、羧基反应交联剂、光反应交联剂、可裂解的交联剂等。可加入稳定细胞膜或阻碍细胞裂解的任何浓度的试剂。在某些实施方案中，以不阻碍或妨碍后续反应的浓度加入稳定细胞膜或阻碍细胞裂解的试剂。
流式细胞术亦可用于富集胎儿细胞(Herzenberg等, PNAS 76:1453-1455, 1979；Bianchi等, PNAS 87:3279-3283, 1990；Bruch等, Prenatal Diagnosis 11:787-798, 1991)。Saunders等(美国专利号5,432,054)亦阐述了采用由聚乙烯制造的具有宽顶、窄的毛细底的管来分离胎儿有核红细胞的技术。使用变速程序离心导致红细胞基于分子的密度在毛细管中堆积。回收含有低-密度红细胞(包括胎儿红细胞)的密度组分，然后差异化溶血以优先破坏母体红细胞。使用高渗介质中的密度梯度来分离红细胞，现在从淋巴细胞和破裂的母体细胞中富集胎儿红细胞。高渗溶液的使用使红细胞缩小，这增加了其密度，有助于其从更稠密的淋巴细胞中纯化。分离出胎儿细胞后，可用本领域标准技术来纯化胎儿DNA。
而且，可将稳定细胞膜的试剂加入到母体血液中以降低母体细胞裂解，所述试剂包括但不限于：醛、脲甲醛、酚醛、DMAE (二甲氨基乙醇)、胆固醇、胆固醇衍生物、高浓度的镁、维生素E和维生素E衍生物、钙、葡萄糖酸钙、牛磺酸、尼克酸、羟胺衍生物、氯吡哌醇、蔗糖、虾青素、葡萄糖、阿米替林(amitriptyline)、藿烷四苯基乙酸酯异构体A(isomer A hopane tetral phenylacetate)、藿烷四苯基乙酸酯异构体B、胞磷胆碱、肌醇、维生素B、维生素B复合物、胆固醇半琥珠酸酯、山梨醇、钙、辅酶Q、泛醌、维生素K、维生素K复合物、甲萘醌、唑尼沙胺(zonegran)、锌、银杏提取物、二苯乙内酰脲、perftoran、聚乙烯吡咯烷酮、磷脂酰丝氨酸、得理多(tegretol)、PABA、色甘酸二钠、奈多罗米(nedocromil)钠、苯妥英(phenyloin)、柠檬酸锌、脉舒律(mexitil)、狄兰汀(dilantin)、透明质酸钠或泊咯沙姆(polaxamer)188。
使用这种试剂的方案的实例如下：将血液保存在4℃直至处理。在制动功率设为零的离心机中以1000 rpm让管离心十分钟。将管第二次以1000 rpm离心十分钟。将每一样品的上清液(血浆)转移到新管中，在制动功率设为零时以3000 rpm离心十分钟。将上清转移到新管中，-80℃保存。将含有母体细胞的大约两毫升“血沉棕黄层”置于单独管中，贮存在-80℃。
可使用用于从血细胞中纯化DNA的Qiagen中量试剂盒(Midi Kit)，按照厂家说明书(QIAmp DNA血液中量试剂盒，目录号51183)从血浆分离基因组DNA。将DNA洗脱到100 μl蒸镏水中。Qiagen中量试剂盒亦可用于从“血沉棕黄层”中所含有的母体细胞分离DNA。
提取
根据本领域已知方法自样品中提取核酸。参见例如Maniatis等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆：实验指南), Cold Spring Harbor, N.Y., 第280-281页, 1982，其内容以其整体通过引用并入本文。
测定母体样品中男性胎儿核酸的存在情况
然后使用测序反应分析来自样品的核酸，以检测样品中至少部分Y染色体的存在情况。例如，Bianchi等(PNAS USA, 87:3279-3283, 1990)报道仅存在于Y染色体短臂上的222 bp的序列。Lo等(Lancet, 350:485-487, 1997)、Lo等(Am J Hum Genet, 62(4):768, 1998)和Smid等(Clin Chem, 45:1570-1572, 1999)分别报道衍生自男性胎儿的不同Y-染色体序列。这些文章每一篇的内容以其整体通过引用并入本文。如果在母本样品中检测到Y染色体，则本发明方法确保样品中包括胎儿核酸，因为Y染色体仅与男性相关，并且只有样品中存在男性胎儿核酸时其才会在母体样品中存在。
在某些实施方案中，测序方法为通过合成方法的单分子测序。单分子测序在例如以下文献中显示：Lapidus等(美国专利号7,169,560)、Lapidus等(美国专利申请号2009/0191565)、Quake等(美国专利号6,818,395)、Harris(美国专利号7,282,337)、Quake等(美国专利申请号2002/0164629)和Braslavsky等, PNAS (USA), 100: 3960-3964 (2003)，这些参考文献的每一个的内容以其整体通过引用并入本文。
简言之，将单链核酸(例如DNA或cDNA)与连接在流动池表面的寡核苷酸杂交。寡核苷酸可共价地连接到表面或可采用除共价连接外的如本领域普通技术人员所知的各种连接。此外，连接可为间接连接，例如，经由直接地或间接地连接到表面的本发明聚合酶。表面可为平面的或别的形式，和/或可为多孔的或无孔的，或本领域普通技术人员所知的适于连接的任何其它类型的表面。然后通过在单分子分辨率对聚合酶介导的荧光标记核苷酸的添加成像来进行核酸测序，所述添加被纳入到成长链表面寡核苷酸中。在某些实施方案中，测序反应中所用的核苷酸不是链终止核苷酸。下面的部分讨论核酸测序的总体考虑，例如对合成测序有用的聚合酶，表面的选择、反应条件、信号检测和分析。
核苷酸
对本发明有用的核苷酸包括任何核苷酸或核苷酸类似物，不论是天然存在的还是合成的。例如，优选核苷酸包括以下核苷的磷酸酯：脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷。对本发明有用的其它核苷酸包含腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶碱基、黄嘌呤或次黄嘌呤；5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、脱氧肌苷或甲基化胞嘧啶，例如5-甲基胞嘧啶和N4-甲氧基脱氧胞嘧啶。亦包括以下多核苷酸模拟物的碱基：例如甲基化的核酸，例如2'-O-methRNA；肽核酸；修饰的肽核酸；锁定核酸和可大体上像核苷酸或碱基一样起作用(例如通过表现出与DNA或RNA中存在的一个或多个碱基的碱基互补性，和/或能够碱基互补性并入)的任何其它结构部分；并且包括链终止类似物。如果就至少一个碱基而论其享有碱基互补性，则核苷酸对应于特定核苷酸种类。
用于核酸测序的本发明核苷酸优选包括可直接或间接检测的可检测标记。优选标记包括可光学检测的标记，例如荧光标记。荧光标记的实例包括但不限于：Atto染料、4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸根合芪-2,2'二磺酸；吖啶和衍生物：吖啶、吖啶异硫氰酸酯；5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸酯；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；氨基苯甲酰胺；BODIPY；亮黄；香豆素和衍生物：香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；花菁染料；四氯四溴荧光素(cyanosine)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5'5"-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸酯；4,4'-二异硫氰酸根合二氢-芪-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸根合芪-2,2'-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)；4-二甲氨基苯基偶氮基苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；伊红和衍生物：伊红、异硫氰酸伊红；赤藓红和衍生物：赤藓红B、异硫氰酸赤藓红；溴乙啶(ethidium)；荧光素和衍生物：5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素、荧光素、异硫氰酸荧光素、QFITC、(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；异硫氰酸酯孔雀绿；4-甲基伞形酮邻甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物：芘、芘丁酸酯(pyrene butyrate)、琥珀酰亚胺1-芘；丁酸酯量子点(butyrate quantum dot)；活性红4 (Cibacron.TM.亮红3B-A)；罗丹明和衍生物：6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B、磺酰氯罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、异硫氰酸罗丹明X、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N',N'四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸；铽螯合衍生物；Cy3；Cy5；Cy5.5；Cy7；IRD 700；IRD 800；La Jolta蓝；酞菁；和萘酞菁。优选荧光标记为花菁-3和花菁-5。本发明亦考虑非荧光标记的标记，包括其它可光学检测的标记。
聚合酶
通常对本发明有用的核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶或前述任意酶的突变或改变形式。除其它地方之外，还在DNA Replication (DNA复制)，第二版, Kornberg和Baker, W. H. Freeman, New York, N.Y. (1991)中详细阐述了DNA聚合酶及其特性。对本发明有用的已知的常规DNA聚合酶包括但不限于：激烈热球菌(Pyrococcus furiosus) (Pfu) DNA聚合酶(Lundberg等, 1991, Gene, 108: 1, Stratagene)、沃氏热球菌(Pyrococcus woesei) (Pwo) DNA聚合酶(Hinnisdaels等, 1996, Biotechniques, 20:186-8, Boehringer Mannheim)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus) (Tth) DNA聚合酶(Myers和Gelfand 1991, Biochemistry 30:7661)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus) DNA聚合酶(Stenesh和McGowan, 1977, Biochim Biophys Acta 475:32)、超好热性古细菌(Thermococcus  litoralis) (Tli) DNA聚合酶(亦称为Vent.TM. DNA聚合酶, Cariello等, 1991, Polynucleotides Res, 19: 4193, New England Biolabs)、9度Nm.TM. DNA聚合酶(New England Biolabs)、Stoffel片段、ThermoSequenase? (Amersham Pharmacia Biotech UK)、Therminator.TM. (New England Biolabs)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima) (Tma) DNA聚合酶(Diaz和Sabino, 1998 Braz J. Med. Res, 31:1239)、水生栖热菌(Thermus aquaticus) (Taq) DNA聚合酶(Chien等, 1976, J. Bacteoriol, 127: 1550)、DNA聚合酶、嗜热古生菌(Pyrococcus kodakaraensis) KOD DNA聚合酶(Takagi等, 1997, Appl. Environ. Microbial. 63:4504)、JDF-3 DNA聚合酶(来自热球菌属(Thermococcus sp.) JDF-3，专利申请WO 0132887)、热球菌属(Pyrococcus) GB-D (PGB-D) DNA聚合酶(亦称为Deep Vent.TM. DNA聚合酶，Juncosa-Ginesta等, 1994, Biotechniques, 16:820, New England Biolabs)、UlTma DNA聚合酶(来自适热性海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；Diaz和Sabino, 1998 Braz J. Med. Res, 31:1239；PE Applied Biosystems)、Tgo DNA聚合酶(来自嗜热古细菌(Thermococcus gorgonarius), Roche Molecular Biochemicals)、大肠杆菌(E. coli) DNA聚合酶I (Lecomte和Doubleday, 1983, Polynucleotides Res. 11:7505)、T7 DNA聚合酶(Nordstrom等, 1981, J. Biol. Chem. 256:3112)和古细菌(archaeal)DP11/DP2 DNA聚合酶11 (Cann等, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14250)。
考虑嗜温性聚合酶或嗜热性聚合酶二者。嗜热性DNA聚合酶包括但不限于ThermoSequenase?、9.度.Nm.TM., Therminator.TM.、Taq、Tne、Tma、Pfu、Tfl、Tth、Tli、Stoffel片段、Vent.TM.和Deep Vent.TM. DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Tgo、JDF-3及其突变体、变体和衍生物。任何聚合酶的高度优选形式为3'外切核酸酶-缺陷型的突变体。
对本发明有用的反转录酶包括但不限于来自以下的反转录酶：HIV、HTLV-1、HTLV-11、FeLV、FIV、SIV、AMY、MMTV、MoMuLV和其它反转录病毒(见Levin, Cell 88:5-8 (1997)；Verma, Biochim Biophys Acta. 473:1-38 (1977)；Wu等, CRC Crit. Rev Biochem. 3:289-347 (1975))。
连接
在优选实施方案中，核酸模板分子连接到基底(本文中亦称为表面)，通过本文所述对其实施单分子测序分析。将核酸模板分子连接到表面，以便模板/引物双链体可单独地光学分辨。本发明中使用的基底可为二维或三维，并且可包含平面表面(例如玻璃载片)，或可成形。基底可包括玻璃(例如可控孔度玻璃(CPG))、石英、塑料(例如聚苯乙烯(低交联和高交联聚苯乙烯)、聚碳酸酯、聚丙烯和聚(甲基丙烯酸甲脂))、丙烯酸共聚物、聚酰胺、硅、金属(例如烷硫醇化物(thiolate)-衍生化的金)、纤维素、尼龙、胶乳、葡聚糖、凝胶基质(例如硅胶)、聚丙烯醛或复合材料。
适宜的三维基底包括例如：球体、微粒、珠、膜、载片、板、微加工芯片、管(例如毛细管)、微孔、微流体装置、通道、过滤器或任何其它适于锚定核酸的结构。基底可包括平面阵列，或能够具有包括模板核酸群或引物群的区域的基质。实例包括核苷-衍生的CPG和聚苯乙烯载片、衍生的磁性载片、接枝有聚二乙醇的聚苯乙烯等等。
优选包被基底以使得可提供最佳光学处理和核酸连接。亦可处理用于本发明的基底以降低背景。例示性的包被包括环氧化物和衍生化的环氧化物(例如带有结合分子，例如寡核苷酸或链霉亲和素)。
可使用各种方法来将核酸分子锚定或固定在基底表面。可通过直接或间接键合到表面来实现固定。可通过共价键来键合。参见Joos等, Analytical Biochemistry 247:96-101, 1997；Oroskar等, Clin. Chem. 42:1547-1555, 1996；和Khandjian, Mol. Bio. Rep. 11:107-115, 1986。优选连接是模板的末端核苷酸或引物的5'端与整合到表面的环氧化物的直接胺键合。亦可通过非共价键来键合。例如，生物素-链霉亲和素(Taylor等, J. Phys. D. Appl. Phys. 24:1443, 1991)和带有抗-地高辛的地高辛(Smith等, Science 253:1122, 1992)是将核酸锚定到表面和类似物上的常用工具。或者，可通过将疏水链锚定到脂单层或双层中来实现连接。亦可使用本领域所知的用于将核酸分子连接到基底上的其它方法。
检测
可使用适于所采用标记类型的任何检测方法。因此，例示性的检测方法包括放射性检测；光学吸光度检测，例如紫外-可见吸光度检测；光学发射检测，例如荧光或化学发光。例如，通过同时或连续地(依所用扫描方法而定)扫描每一基底的全部或部分，可检测到基底上的延伸引物。对于荧光标记，可使用荧光显微镜仪器一个一个地或一行一行地连续扫描基底上所选的区域，例如在Fodor (美国专利号5,445,934)和Mathies等(美国专利号5,091,652)中所述。能够测知来自单分子的荧光的装置包括扫描隧道显微镜(siM)和原子力显微镜(AFM)。亦可使用带有适宜光学器件的CCD照相机(例如Model TE/CCD512SF, Princeton Instruments, Trenton, N.J.)来扫描杂交模式(Ploem, Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity (生物活性的荧光和发光探针), Mason, T. G.编辑, Academic Press, Landon, 第1-11页(1993))，例如在Yershov等, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:4913 (1996)中所述，或可通过TV监测来对杂交模式成像。对于放射性信号，可使用磷屏成像装置(Johnston 等, Electrophoresis, 13:566, 1990；Drmanac等, Electrophoresis, 13:566, 1992; 1993)。成像仪器的其它市售供应商包括General Scanning Inc., (Watertown, Mass；万维网www.genscan.com)、Genix Technologies (Waterloo, Ontario, Canada；万维网www.confocal.com)、和Applied Precision Inc。所述检测方法对实现同时扫描多种连接的模板核酸特别有用。
可使用很多方法来检测单个核酸分子中荧光标记的核苷酸的引入。光学设置包括近场扫描显微术、远场共焦显微术、宽视野落射光照、光散射、暗视野显微术、光转换、单和/或多光子激发、光谱波长辨识、荧光体鉴定、隐失波光照和全内反射荧光(TIRF)显微术。总的来说，某些方法涉及用装备有照相机的显微镜来检测激光激活的荧光。适宜的光子检测系统包括但不限于光电二极管和增强型CCD照相机。例如，可使用增强型电荷耦合器件(ICCD)照相机。使用ICCD照相机来使表面附近的流体中的单个荧光染料分子成像提供了很多优势。例如，有了ICCD光学设置，有可能获得荧光团的一系列图像(影片)。
本发明的一些实施方案使用TIRF显微术来成像。TIRF显微术使用全内反射激发光，其为本领域所熟知。参见例如万维网www.nikon-instruments.jp/eng/page/products/tirf.aspx。在某些实施方案中，使用隐失波光照和全内反射荧光显微术来实施检测。可在表面设置隐失光场，例如对荧光标记的核酸分子成像。当激光束在液相和固相(例如玻璃)基底之间的界面全部反射时，激发光束仅穿透短的距离到液体中。光场不会在反射性界面突然结束，但其强度随距离而指数下降。这种叫做“隐失波”的表面电磁场可选择性地激发界面附近液体中的荧光分子。界面上薄薄的隐失光场提供低背景，促进在可见波长的高信噪比下对单分子的检测。
隐失场亦可在聚合酶存在下，当荧光标记的核苷酸掺入连接的模板/引物复合物中时对其成像。然后使用全内反射荧光显微术来使连接的模板/引物双链体和/或引入的核苷酸以单分子分辨率显现。
本发明的一些实施方案使用非光学检测方法，例如使用纳米孔(例如蛋白质或固态)的检测，其中分子单个地通过纳米孔使得可通过记录各种特性或效应(例如电容或阻断电流)的特征或变化来鉴别分子(参见例如Stoddart等, Proc. Nat. Acad. Sci., 106:7702, 2009；Purnell和Schmidt, ACS Nano,3:2533, 2009；Branton等, Nature Biotechnology, 26:1146, 2008；Polonsky等, 美国申请2008/0187915；Mitchell和Howorka, Angew. Chem. Int. Ed. 47:5565, 2008；Borsenberger等, J. Am. Chem. Soc., 131, 7530, 2009)；或其它适宜的非光学检测方法。
分析
从如上通常所述产生的图像栈(stack)获得的序列结果的比对和/或编译采用把可能的序列变化(由于例如误差、突变等)考虑在内的查表法。基本上将如本文所述获得的测序结果与含有所有可能的参照序列加上1或2个碱基误差的查找型表格进行比较。
测定母体样品中女性胎儿核酸的存在情况
本发明方法提供对序列数据的进一步定量或定性分析以检测胎儿核酸的存在情况，而与检测Y染色体的能力无关，特别是用于检测母体样品中的女性胎儿。通常将获得的序列与参照基因组(例如母体基因组、父本基因组、或代表认为可表明正常的数值范围的外标)比对。一经比对，就量化所获得的序列以测定对应每一染色体的序列读数的数量。估计染色体数目，背离2X正常比率提供母体样品中女性胎儿的证据，亦提供代表染色体非整倍性的胎儿核酸的证据。
可实施很多不同类型的定量分析以检测来自母体样品中女性胎儿的胎儿核酸的存在情况。该另外的分析可包括拷贝数分析、稀疏等位基因调用、靶向再测序、差异化DNA修饰(例如甲基化或修饰的碱基)和断点分析。在某些实施方案中，为检测部分Y染色体的存在情况不需要分析序列数据，并且本发明方法可涉及实施本文所述的定量分析以检测母体样品中胎儿核酸的存在情况。
一种检测来自母体样品中女性胎儿的胎儿核酸存在情况的方法涉及对产生的序列数据的拷贝数进行分析。该方法涉及测定基因组区段中相对于参照序列信息的拷贝数变化。参照序列信息可为已知不含胎儿核酸的母体样品(例如颊样品)，或可为代表认为可表明正常、完整核型的数值范围的外标。在该方法中，将样品中靶核酸(即染色体DNA或其部分)的计算数量(拷贝数)与参照核酸的计算数量进行比较。通过正常核型中核酸的标准(即期望的)数量，或通过与来自同一样品的非靶染色体的多种核酸比较，来测定参照数量，所述非靶染色体为已知或疑似以适当的数量(即对于常染色体为二倍体)存在于样品中。拷贝数分析的更多阐述如Lapidus等(美国专利号5,928,870和6,100,029)和Shuber等(美国专利号6,214,558)所示，其每一个的内容以其整体通过引用并入本文。
正常人基因组应可仅含有整数的拷贝数(例如0、1、2、3等)，而样品中胎儿核酸的存在情况可引入分数值的拷贝数(例如2.1)。如果序列数据分析提供以统计学显著性偏离(即大于因取样方差、参照不准确或测序误差而获得的值)预期整数值的拷贝数测量集合，则母体样品含有胎儿核酸。为了更大的灵敏度，可使用母体和/或父本核酸样品来提供另外的参照序列信息。来自母体和/或父本样品的序列信息，使得可以鉴定母体样品中疑似含有不与母体对照样品匹配和/或与父本样品匹配的胎儿核酸的拷贝数值，藉此表明胎儿核酸的存在情况。
另一种检测来自母体样品中女性胎儿的胎儿核酸存在情况的方法涉及实施稀疏等位基因调用。稀疏等位基因调用是在低覆盖度DNA测序(例如小于1倍覆盖度)中分析位于多态位点的单个等位基因以比较样品中核酸变异的方法。个体基因组通常具有约三十亿个碱基对序列。对于典型的个体，约两百万个位点是杂合的，约一百万个位点是纯合的无参照的单核苷酸多态性(SNP)。如果在个体中比较相同等位基因位点的两次测量，在纯合位点情况下，其在100%的时间将几乎一致；或在杂合位点情况下，50%的时间将几乎一致(测序误差可稍微降低这些数字)。如果在不同个体间比较相同等位基因位点的两次测量，其一致性通常将减小，这取决于群体中不同等位基因的频率和个体之间的关系。因此，两个样品中一组宽范围的等位基因位点间的一致程度可表明所取样品的个体之间的关系，其中关系越近，一致性越高(例如与陌生人相比，兄弟姊妹或小孩的样品将与个体的样品更相似，但比来自同一个个体的第二份样品的相似性小)。图1显示来自一个个体(“自身”)的两个样品和该个体及两个家族成员(“家族”)样品之间的差异的柱状图，其表示不同样品间一组已知单核苷酸变体的比较。
可通过比较母体样品与仅包括母体DNA (例如颊样品)和/或父本DNA在内的样品，采用如上所述的方法来检测母体样品中的胎儿DNA。该方法涉及以低覆盖度(例如小于1倍覆盖度)获得序列信息来测定样品中是否存在胎儿核酸。该方法利用了这一事实：变体存在于全基因组中且在公开可获得的数据库中标注有数百万。低覆盖度使得可在每一比较中分析不同组的SNP。如果人们在存在于母体基因组中的大量变体中寻找差异，则期望胎儿和他/她母亲的基因组之间的差异是统计学显著的。另外，与纯母体样品相比，预期胎儿基因组和亲本DNA之间的相似性是统计学显著的，因为胎儿DNA的一半继承自其父亲。
本发明涉及在已知(来自已有数据库)或疑似(来自数据)序列变异的位点，比较来自疑似含有胎儿DNA的母体样品和纯母体样品二者的低覆盖度基因组DNA序列(例如小于1倍覆盖度)，并且测定该差异是否比如果两个样品都是纯母体的(即不含有胎儿DNA)的预期差异高。不需要父本DNA样品，但可为了额外的敏感性而使用，此时父本样品将与纯母体样品和疑似含有胎儿DNA的样品二者比较。疑似样品与父本样品之间的统计学上显著更高的相似性可表明胎儿DNA的存在情况。
另一种检测来自母体样品中女性胎儿的胎儿核酸存在情况的方法涉及实施靶向再测序。再测序参见例如Harris (美国专利申请号2008/0233575、2009/0075252和2009/0197257)所示，其每一个的内容以其整体通过引用并入本文。简言之，在测序之前选择靶标的特异性区段(例如通过PCR、微阵列或MIPS)。将设计为与该特定区段杂交的引物引入，形成引物/模板双链体。让引物/模板双链体与聚合酶和至少一种可检测标记的核苷酸，在满足模板依赖性的让核苷酸添加到引物的条件下接触。测定标记的核苷酸的引入，也测定与引入核苷酸相对位点的模板上的核苷酸互补的核苷酸的同一性。
聚合反应后，可从双链体中去除引物。可经由任何适宜的手段来去除引入，例如通过升高表面或基底的温度以便双链体融解，或通过改变缓冲条件来使双链体去稳定，或其组合。用于融解模板/引物双链体的方法为本领域所熟知，并在例如Molecular Cloning, a Laboratory Manual(分子克隆：实验指南), 第3增补版, J. Sambrook和D. W. Russell, Cold Spring Harbor Press (2001)的第10章中阐述，其教导通过引用并入本文。
去除引物后，可让模板与能够与该模板杂交的第二引物接触。在一个实施方案中，第二引物能够与和第一引物杂交的模板区域相同的区域杂交(本文中亦称为第一区域)，形成模板/引物双链体。然后重复聚合反应，藉此再测定至少部分模板的序列。
高度可变基因组区域的靶向再测序使那些区域的覆盖度更广(例如在100倍覆盖度时1 Mb)。正常人基因组将含有约100%或约50%频率的单核苷酸变体，然而，胎儿核酸的存在将引入另外可能的频率(例如10%、60%、90%等)。如果再测序数据的分析提供以统计学显著性偏离100%或50% (即大于因取样方差、参照不准确或测序误差而得的值)的序列变体频率集合，则母体样品含有胎儿核酸。
另一种检测来自母体样品中女性胎儿的胎儿核酸存在情况的方法涉及实施考虑断点的分析。序列断点指在核酸中发现的突变类型，其中让整个DNA区段倒位、重新组合(shuffle)或重新定位，藉此创造出原始序列中不存在的新序列连接。可在疑似含有胎儿核酸的母体样品中鉴定出序列断点，并与母体和/或父本对照样品比较。出现在母体对照样品中未检测到和/或在父本样品中未检测到的统计学上显著数量的鉴定断点，表明胎儿核酸的存在。
检测胎儿异常
检测母体样品中胎儿核酸的能力使得可开发评价胎儿是否具有异常的非侵入性诊断测定。因此，本发明另一方面提供分析母体样品中胎儿核酸以测定胎儿是否具有异常的非侵入性方法。本发明方法涉及获得包括母体和胎儿核酸二者的样品，对样品实施测序反应以获得样品中核酸的序列信息，比较获得的序列信息和来自参照基因组的核酸信息，藉此测定胎儿是否具有异常。在某些实施方案中，参照基因组可为母体基因组、父本基因组或其组合。在其它实施方案中，参照基因组可为代表认为可表示正常的完整核型的数值范围的外标，例如目前已有的HG18人参照基因组。
按照本方法可检测多种遗传异常，包括非整倍性(即存在一条或多条额外染色体或缺失染色体)或一个或多个基因的已知改变，所述基因例如CFTR、VIII因子(F8基因)、β球蛋白、血色病、G6PD、神经纤维瘤病、GAPDH、β淀粉样蛋白和丙酮酸激酶。已知这些基因的序列和常见突变。可检测其它基因异常，例如涉及在人染色体中缺失、以易位和倒位来移动或在染色体复制中复制的序列的那些基因异常，其中该序列表征为在母体遗传物质中不存在的胎儿遗传物质的已知遗传病症。例如，染色体三体性可包括部分、嵌合、环、18、14、13、8、6、4等。可在OMIM疾病图谱http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/getmorbid.cgi中找到已知异常的列表，其内容以其整体通过引用并入本文。
这些遗传异常包括母体和胎儿核酸之间的可为杂合和纯合的突变及非整倍性。例如，失去一个X染色体拷贝(X单体性)导致特纳综合征(Turner's Syndrome)，而添加一个21号染色体拷贝导致唐氏综合征。其它疾病例如爱德华综合征和帕塔综合征分别由添加一个18号染色体和13号染色体拷贝造成。本发明方法可用于检测易位、添加、扩增、颠换、倒位、非整倍性、多倍性、单体性、三体性、21号三体性、13号三体性、14号三体性、15号三体性、16号三体性、18号三体性、22号三体性、三倍性、四倍性和性染色体异常，所述性染色体异常包括但不限于XO、XXY、XYY和XXX。
其中靶序列可以以一个拷贝存在于母体DNA(杂合的)中但在胎儿(纯合的)中导致疾病的疾病实例包括：镰状细胞性贫血、囊性纤维化、血友病和泰-萨病(Tay Sachs disease)。因此，使用此处所述的方法，人们可以将具有一个突变的基因组与具有两个突变的基因组区分开。
镰状细胞性贫血是常染色体隐性疾病。美国有9%的非洲裔美国人是杂合子，而有0.2%是纯合子隐性。隐性等位基因导致血红蛋白β链中的单氨基酸取代。
泰-萨病是常染色体隐性疾病，其导致神经系统的退化。其症状在出生后显现。该等位基因的纯合子隐性儿童很少存活超过五岁。患者缺乏制造N-乙酰基-氨基己糖苷酶的能力，该酶降解GM2神经节苷脂。
另一实例是苯丙酮尿症(PKU)，一种隐性遗传病症，其患者缺乏合成将苯丙氨酸转化为酪氨酸的酶的能力。该等位基因的纯合子隐性个体的尿液和血液中具有苯丙氨酸的积累和异常的降解产物。
血友病是血液不能正常凝结的一类疾病。血液因子参与凝血。认为缺乏正常VIII因子的血友病患者具有A型血友病，缺乏IX因子的患者具有B型血友病。X染色体携带这些基因，所以本发明的测序方法可用于检测胎儿是否继承了母亲的缺陷型X染色体或父亲的正常等位基因。
可适用于本方法的基因突变列表可见于GDB人类基因组数据库http://www.gdb.org/gdb，其为由RTI International, North Carolina USA建立的注释人类基因组的世界范围的官方数据库。
染色体特异性的引物如Hahn等(美国专利申请号2005/0164241)所示，其全部通过引用并入本文。可基于从数据库例如GenBank、EMBL等等中获得的核苷酸序列来制备基因的引物。例如，有多于1,000条21号染色体特异性的引物列于NIH UniSTS的网址上，该网址为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unists.
诊断测定的重要方面为该测定区别假阴性(未检测到胎儿核酸)和真阴性(在健康胎儿中检测到核酸)的能力。本发明方法通过以下来提供这样的能力：检测样品中至少部分Y染色体的存在情况，并且若在样品中未检测到Y染色体则亦实施另外的分析。在某些实施方案中，本发明方法区别假阴性和真阴性，而与检测Y染色体的能力无关。
如果在母体样品中检测到Y染色体，则本发明方法确保该测定可恰当发挥功能，因为Y染色体仅与男性相关，并且只有样品中存在男性胎儿核酸时才在母体样品中存在。因此，如果在母体样品中未检测到异常，并在样品中检测到至少部分Y染色体，则可确信地推断该测定检测到了胎儿(因为母体样品中存在Y染色体表示男性胎儿核酸)，并且胎儿不包括该测定所分析的遗传异常。
本发明方法亦提供另外的定量或定性分析来检测胎儿核酸的存在情况，而与检测Y染色体的能力无关。该步骤对样品中包括来自女性胎儿的正常核酸的实施方案尤其有用。所述另外的定量分析可包括拷贝数分析、稀疏等位基因调用、靶向再测序和断点分析，其每一种如上所讨论。因此，如果在母体样品中未检测到异常，并且对样品的定量分析揭示有胎儿核酸的存在，则可确信地推断该测定检测到了胎儿，并且胎儿不包括针对其进行该测定的遗传异常。
加标签
在某些方面，本发明方法通过以下来测定胎儿是否具有异常：获得包括母体和胎儿核酸的母体样品；将独特的标签与样品中的核酸连接，其中每一标签与不同的染色体缔合；对带标签的核酸实施测序反应以获得带标签的序列；和通过量化带标签的序列来测定胎儿是否具有异常。
靶序列上连接标签如Kahvejian等(美国专利申请号2008/0081330)和Steinman等(国际专利申请号PCT/US09/64001)所示，其每一个的内容以其整体通过引用并入本文。标签序列通常包括使该序列在测序反应中有用的某些特征。例如，将标签设计成在标签的独特部分具有最少或无同聚物区域，即在一列中2个或多个相同碱基，例如AA或CCC。亦设计标签以使当实施逐个碱基测序时其与碱基添加次序有至少一段编辑距离，这确保第一个和最后一个碱基不与序列的预期碱基匹配。
标签亦可包括阻滞剂例如链终止核苷酸，以阻断模板核酸分子3'-端的碱基添加。亦将标签设计成与碱基添加次序具有最小相似性，例如，如果实施逐个碱基测序方法，通常按照以下次序每次添加一个碱基：C、T、A和G。标签亦可包括至少一种非天然核苷酸，例如肽核酸或锁定核酸，以增强寡核苷酸的某些特性。
标签的独特序列部分(独特部分)可为不同长度。设计独特标签组的方法在例如Brenner等(美国专利号6,235,475)中显示，其内容以其整体通过引用并入本文。在某些实施方案中，标签的独特部分介于约5个核苷酸-约15个核苷酸范围。在特定实施方案中，标签的独特部分介于约4个核苷酸-约7个核苷酸范围。因为沿着模板核酸分子测定标签的独特部分的序列，所以寡核苷酸长度应为最短长度，以便自所连接的模板核酸具有最长阅读。通常通过至少一个碱基将标签的独特部分与模板核酸分子隔开(使同聚物组合最小化)。
标签亦包括用作引物结合位点的部分。可将引物结合位点用于让现有条形码模板核酸分子与测序引物杂交，可任选将所述测序引物锚定到基底上。引物结合序列可为包括至少2个碱基的独特序列，但其可能含有所有4种碱基的独特次序，通常为20-50个碱基长。在特定实施方案中，引物结合序列为单个碱基的同聚物，例如多聚A，通常20-70个碱基长。
标签亦可在3'-端包括阻滞剂，例如链终止核苷酸。阻滞剂防止在不注意时使用3'-端引物结合位点作为第二测序引物而获得非预期的序列信息，特别是当使用同聚化的引物序列时。阻滞剂可为在与dNTP孵育期间阻止聚合酶添加碱基的任何部分。例示性的阻滞剂为缺乏3'-OH的核苷酸终止子，即双脱氧核苷酸(ddNTP)。常用的核苷酸终止子有2',3'-双脱氧核苷酸、3'-氨基核苷酸、3'-脱氧核苷酸、3'-叠氮基核苷酸、非环核苷酸(acyclonucleotide)等。阻滞剂可连接有可检测的标签，例如荧光团。可经由不稳定的键例如二硫键来连接标签，以便在条形码模板核酸与表面杂交后，可通过成像来确定模板核酸的位置。通常在测序开始之前将可检测的标签去除。依键而定，裂解产物可需要或可不需要进一步的化学修饰来防止不需要的副反应，例如在通过TCEP裂解二硫键后，可用碘乙酰胺来阻止其产生活性巯基。
本发明方法涉及将标签连接到模板核酸分子上。使用各种机械、化学和/或酶方法能够将模板核酸片段化或剪切成期望的长度，例如通常为100-500个碱基或更长。可通过以下方法随机剪切DNA：经由超声例如Covaris方法；与DNA酶短暂接触；或使用一种或多种限制性酶或转座酶或切口酶的混合物。可通过与RNA酶短暂接触、热加镁或通过剪切让RNA片段化。片段化前或片段化后，可将RNA转换成cDNA。
在某些实施方案中，用酶让标签与模板核酸分子连接。酶可为连接酶或聚合酶。连接酶可为能够将寡核苷酸(RNA或DNA)连接到模板核酸分子上的任何酶。适宜的连接酶包括T4 DNA连接酶和T4 RNA连接酶(所述连接酶可自New England Biolabs市购)。在特定实施方案中，使用连接酶的方法为本领域所熟知。聚合酶可为能够在模板核酸分子的3'端添加核苷酸的任何酶。聚合酶可为例如市购自USB的酵母多聚(A)聚合酶。按照厂家说明书来使用聚合酶。
连接可为平末端或经由在突出末端(hanging end)使用互补。在某些实施方案中，片段化后可修复、修整(例如使用外切核酸酶)或填补(例如使用聚合酶和dNTP)片段的末端来形成平末端。在产生平末端时，可用聚合酶和dATP来处理末端以形成对片段3'-端的不依赖于模板的添加，藉此产生单个的A突出(overhanging)。在称为T-A克隆的方法中，使用该单个的A来引导在5'-端有单个T突出的片段的连接。
或者，因为已知道限制性消化后，通过限制性酶留下突出的可能组合，所以留下的末端可保留为，即不整齐末端。在某些实施方案中，使用带有互补突出末端的双链寡核苷酸。在特定实例中，使用A:T单碱基突出法(参见图1-2)。
在特定实施方案中，基底锚定了与寡核酸中引物结合序列反向互补的序列，例如5'-TC CAC TTA TCC TTG CAT CCA TCC TCT GCC CTG或多聚T (50)。当同聚化的序列用于引物时，在实施本领域称为“填平和锁定(fill and lock)”的程序可为有利的。当样品中的多聚A (20-70)与表面的多聚T (50)杂交时，很可能不具有完美对齐，因此通过让样品与聚合酶和TTP一起孵育来填平该杂交物。在填平步骤后，洗涤样品，让聚合酶与一种或两种与锁定序列中所用的碱基互补的dNTP一起孵育。亦可在单一的步骤过程中实施填平和锁定，在该过程中，将聚合酶、TTP和一种或两种可逆的终止子(锁定碱基的互补物)混合在一起并孵育。在这个阶段中，可逆的终止子终止添加，通过特异于所用类似物的处理可使该终止子再次发挥功能(抑制机制的逆转)。一些可逆的终止子对需要被去除的3'-OH具有功能性阻滞，而其它可逆的终止子例如Helicos BioSciences Virtual终止子具有经由二硫键连接在碱基上的抑制剂，所述二硫键可通过用TCEP处理来去除。
加上标签后如本文所述对来自母体样品的核酸进行测序。标签可使来自不同染色体的模板核酸在整个测序过程中彼此区分。因为每一种标签与不同的染色体缔合，所以可量化标签序列。评估序列读数的任何与2X正常率的偏离，该偏离表明胎儿异常。
在一个备选实施方案中，测序之前通过让条形码序列与母体DNA片段的3'端连接来使无细胞的母体核酸带上条形码。优选条形码为5-8个核苷酸，将其用作母体无细胞DNA的独特标识符。那些序列亦可包括50 nt的多核苷酸(例如多聚-A)尾。这样做可随后使核酸直接与流动池表面杂交，然后测序。除了其它之外，该方法尤其可使不同的母体DNA样品联合进入单个流动池通道中用于测序，因此使得反应可多路复用。
检测独特序列
在某些方面，使用本发明方法通过以下步骤检测胎儿核酸：获得疑似包括胎儿核酸的母体样品；检测样品中的至少两种独特序列；和基于所检测的两种序列彼此的比率测定母体样品中是否存在胎儿核酸。独特序列是已知在相关基因组(例如人)中仅出现一次的序列，其可为已知的独特的k-聚体(k-mer)或可通过测序测定。有利的是，本发明的这些方法不需要与参照序列作比较。在母体样品中，可预期两种或多种独特的k-聚体以相同频率出现，导致其比值为1.0。与预期比值在统计学上有显著方差表明样品中存在胎儿核酸。
在某些实施方案中，基于人基因组中可获得的独特k-聚体认识来预先测定一种或多种独特的k-聚体序列。例如，基于共有序列有可能估测任何基因组中独特k-聚体的数量。相关领域的普通技术人员可易于获得任何给定数量碱基的独特序列的实际出现率这一知识。
在一个实施方案中，对在母体样品中检测到任何两种或多种独特序列的次数进行计数。例如，序列A (例如独特的20-聚体)可检测到80次，序列B (例如独特的30-聚体)可检测到100次。如果在人基因组中或至少在包括序列A和B的一个或多个部分中检测到一致的序列，则具有序列B的胎儿核酸以高于母体背景的水平存在于母体样品中，显示所述水平至少部分比例为(100-80)比80。就未一致性地检测到序列来说，可使用各种已知的统计分析方法来测定序列A和序列B的频率之间的测量差异是否是统计学显著的。
亦可选择序列A、B之一或二者以具有含量(例如富含GC)，以便基于本领域普通技术人员所知的因素使一致检测更可能。可选择大量独特序列来使统计学比较更可信。此外，可基于其在特别感兴趣的基因组区域中的位置来选择序列。例如，可因为其在染色体中的存在与非整倍性有关来选择序列。因此，在某些实施方案中，如果基于其不在染色体中与非整倍性有关的位置而选择了序列A (检测到80次)，并基于其在染色体中与非整倍性有关的位置而选择了序列B (检测到100次)，则可作出胎儿非整倍性的诊断。
在其它实施方案中，独特序列包括一种或多种在已知位点的已知SNP。除对母体样品中检测到序列A的次数进行计数外，亦可对在已知SNP位点具有一个变体(例如"G")的序列A的次数和在该SNP位点具有另一个变体(例如"T")的序列A的次数进行计数。只要母亲和胎儿两者在该位点的同一个碱基不是纯合子，就可通过G或T之一与假定任何其它接合性的组合的统计学可能水平(相对于任何确定的期需水平)的任何偏离来检测胎儿信号。对于母亲和胎儿在SNP位点都是纯合子的情况，可如前所述与另一个或多个预先测定的独特序列(例如序列B)进行比较。
在又一方法中，所检测的序列不需要是独特的，并且不需要预先测定。此外，无需知道关于人(或其它)基因组的任何信息。恰恰相反，基于n–聚体(或n-聚体和k-聚体等)模式可区分母亲的标志与胎儿(如果存在)的标志。例如，在任何模式的n-聚体中，均可存在SNP，使得母亲具有一个碱基(例如"G")，而胎儿(如果存在的话)在两个等位基因的至少一个中具有另一个碱基(例如"T")。如果所有的n-聚体(考虑到任何误差率在足够大的样品中)都具有"G"，则可认为没有胎儿核酸。如果在SNP位点一些统计学上显著数量的n-聚体具有"T"，则检测到了胎儿核酸，并可测定其相对于母亲核酸的数量。即使可存在这样的两处或多处时，其中n-聚体在母亲或胎儿基因组之一或两者中出现 (即序列不是独特的)，这也是正确的，因为鉴于足够大数量的读数，基于胎儿信号的存在或不存在情况，在所检测的SNP中可具有统计学显著性差异。也就是说，等位基因频率(其在由仅一个而非两个(或更多)起作用生物而预期的等位基因之间检测)可具有统计学显著性差异。
通过引用并入
本公开内容通篇对其它文件例如专利、专利申请、专利出版物、期刊、书籍、论文、网上内容作了参考和引用。为所有目的将全部所述文件由此以其整体通过引用并入本文。
等价实施方案
在不脱离本发明精神或其基本特征的情况下，可用其它具体形式实施本发明。因此，认为前述实施方案在所有方面为阐明性的而非限制本文所述发明。因此，所述权利要求书而非前述说明来表明本发明范围，因而落入权利要求书等价实施方案的含义和范围内的所有变化意欲皆包括在其中。
实施例
实施例1：测定样品中胎儿核酸的存在情况
从正常健康成年男性和女性获得来自淋巴细胞的核酸样品。通过本领域所知的方案来提取核酸。样品设置包括2个HapMap三样品组(trio)(6个样品)，在三台不同机器的8个HELISCOPE测序仪通道中(单分子测序仪器，Helicos BioSciences Corporation)运行(2个技术性重复)。在每一通道中对来自样品之一的基因组DNA测序(8-13M独特比对读数)。
数据集包括8个压缩文件，每个HELISCOPE通道一个。将序列读数映射到参照人基因组，去掉非独特比对的读数(图2)。首先，基于常染色体的总计数将每一样品的计数标准化(图3)。然后，基于所有样品中与每一染色体比对的读数的平均分数(chrX-仅女性，chrY-仅男性；图4)，将每一条染色体计数标准化。
数据显示了定量的染色体分析(图5)。这些数据显示了所选择的HapMap样品的基因组测序，包括男性和女性二者，和随后染色体计数的准确定量。本文中的数据显示鉴定X染色体和Y染色体的预期比率的不同能力。从个体获得的基因组DNA所衍生的数据表明从正常二倍体基因组预期的基因组覆盖的均匀性，并证明在这些样品中不存在胎儿核酸。每一染色体标准化计数的偏差为平均0.5% CV。染色体越大，偏差越低(0.2-0.3%)，染色体越小，偏差越高(0.8-1.1%)。可明显区分女性和男性样品。
实施例2：检测母体样品中的胎儿核酸并检测三体性
用本领域熟知的方法例如Qiagen核酸纯化试剂盒来获得母体无细胞的血浆核酸。然后按以下方案处理核酸。简言之，该方案由一小时的3'多聚A拖尾步骤、接着一小时的3'双脱氧法-阻断步骤组成。用500 pg核酸实施该方案。
所需试剂
末端转移酶试剂盒　　　　　　　　　NEB M0315
dATP　　　　　　　　　　　　　　　Roche 11277049001
生物素-ddATP　　　　　　　　　　　Perkin Elmer NEL548001
载体寡核苷酸　　　　　　　　　　　 50-聚体的寡核苷酸
牛血清白蛋白　　　　　　　　　　　 NEB B9001S
无核酸酶的水
Quant-iT? PicoGreen dsDNA试剂　　 Invitrogen P11495
所需仪器
经研磨(milled)用于0.2 mL管的预冷铝块
热循环仪
P-2、P20、P200吸管
小冰桶
用于PicoGreen测定的Nanodrop 3300或标准的板阅读器
方法
在实施DNA拖尾反应之前，用RNA酶消化去除RNA污染物，并用Qiagen反应净化试剂盒(目录号28204)净化。在使用之前应准确定量DNA。使用Quant-iT? PicoGreen dsDNA试剂试剂盒(lnvitrogen，目录号P11495)和Nanodrop 3300荧光光谱仪。在DNA清洁/沉淀步骤期间，使用分子生物学级别的无核酸酶糖原或线性丙烯酰胺作为载体。
制备以下混合物：NEB末端转移酶10 X缓冲液(2 μl)；2.5 mM CoC12 (2μl)；母体无细胞血浆核酸和无核酸酶的水(10.8 μl)。总体积为14.8 μl。在热循环仪中让混合物于95℃下加热5分钟以使DNA变性。加热之后，在预冷的铝块上让混合物冷却以获得单链DNA，铝块保持在冰与水浆液中(约0℃)。尽可能快地冷却样品以防止变性的单链DNA再退火。
在冰上将以下混合物加入到上面变性的DNA中：1 μl的末端转移酶(用1倍的缓冲液稀释1:4至5U/μl)、4 μl的50 μM dATP；和0.2 μl的BSA。该混合物的体积为5.2 μl，使得反应的总体积为20 μl。将含有混合物的管置于热循环仪中，运行以下程序：37℃ 1小时；70℃ 10分钟；让温度返回降至4℃。此时已将多聚(A)尾加入到DNA中。
通过在热循环仪中将混合物于95℃下加热5分钟使该20 μl多聚腺苷酸化反应物变性，接着用保持在冰与水浆液(约0℃)中的预冷铝块迅速冷却。尽可能快地冷却样品以防止变性的单链DNA再退火。
将以下阻断混合物加入到上面变性的多聚腺苷酸化混合物中：1 μl的末端转移酶10倍缓冲液；1 μl的CoC12 (2.5 mM)；1 μl的末端转移酶(用1倍的缓冲液稀释1:4至5U/μl)、0.5 μl的200 μM生物素-ddATP；和6.5 μl无核酸酶的水。该混合物的体积为10 μl，使得反应的总体积为30 μl。
将含有混合物的管置于热循环仪中，运行以下程序：37℃ 1小时；70℃ 10分钟；让温度返回降至4℃。观察到此时已将3'末端阻断加入到多聚腺苷化的DNA中。
将2皮摩尔的对照寡核苷酸加入到上述热灭活的30 μl末端转移酶反应物中。将对照寡核苷酸加入到样品中以使样品装载步骤中的DNA损失最小化。对照寡核苷酸不含有多聚(A)尾，因此不会与流动池表面杂交。此时样品已做好准备与用于测序反应的流动池杂交。无需另外的清理步骤。
按照厂家说明书将样品装载入HELISCOPE序列仪通道(单分子测序仪器，Helicos BioSciences Corporation)。按照厂家说明书在通道中对来自样品的DNA测序。将序列读数映射到参照人基因组，去掉非独特比对的读数。首先，基于常染色体的总计数将每一样品的计数标准化。然后，基于所有样品中与每一染色体比对的读数的平均分数(chrX-仅女性，chrY-仅男性)，将每一条染色体计数标准化。将样品中1、18和21号染色体的染色体计数与基于对照样品的预期值的偏差进行比较。
图10显示了序列信息的分析结果。在该图中，将1号染色体用作对照。本文的数据显示检测到胎儿DNA (图10)。本文的数据进一步显示亦检测到18号染色体和21号染色体的三体性(图10)。
实施例3：GC偏好校正
当基于测序信息实施染色体计数分析时(即基于相关表示来量化每一染色体或染色体区段的数量)，将每一染色体(或染色体区段)的读数的相对数量与一个或多个正常样品中所测量的标准比较。样品制备和测序过程的某些步骤可导致GC偏好，其中每一染色体的相对表示不仅受到该染色体的相对数量(拷贝数)影响，而且受到其GC含量的影响。测量的样品和对照(正常)样品之间GC偏好的差异可导致染色体计数的偏差，以致有极端GC含量的染色体可能出现比其实际拷贝数更多或更少。图6是显示GC偏好导致染色体计数有偏差的样品的图示。按渐增的GC含量对染色体排序。这些数据显示对于具有极端GC含量的染色体，测量的变异性更高。
本发明方法可测定所获得的序列信息中GC偏好的量，亦可校正序列信息中的GC偏好。在某些实施方案中，本发明方法涉及对样品测序来获得核酸序列信息；测定序列信息中GC偏好的量；校正序列信息以解释GC偏好；和分析校正后的信息。
可用很多方式来实现样品中GC偏好的量的测定。在某些实施方案中，可通过将基因组分配到不同单元并测量每一单元中计数的数目和其GC含量之间的相关性来量化GC偏好的量。图7是显示作为单元中GC含量的函数而绘制的每一单元的图示。在该实施方案中，将基因组分配到1000 kbp的单元中。尽管该数字是例示性的，并且可使用任何大小。显著的负或正相关表明GC偏好的存在(见图7)。在图7中，上面的样品显示与GC含量正相关，而下面的样品显示与GC含量负相关。
本发明方法降低或消除序列信息中GC偏好的影响。可使用很多方案来降低或消除序列信息中GC偏好的影响。在某些实施方案中，在给定范围内选择基因组单元亚组，以使每一染色体的平均GC含量均衡(或偏差更小)。然后对所选择的亚组实施染色体计数。图8提供该方案的实施例。在图8中，分析仅限于给定GC含量为0.42-0.48的基因组单元，即占基因组的大约25% (图8的A组)。
图8的B组和C组显示在校正序列信息中的GC偏好后所获得的序列信息中的差异。图8的B组显示GC偏好校正之前的序列信息。图8的C组显示GC偏好校正之后的序列信息。这些数据显示GC偏好使染色体计数偏移，使得具有极端GC含量的染色体显得比其实际拷贝数更多或更少。在校正序列信息中的GC偏好后，数据显示更加准确的染色体计数，使得可检测18号和21号染色体的三体性，这是不可能根据在校正GC偏好之前的序列信息分析得出的。
在其它实施方案中，用数学函数(例如一次或二次多项式)在一组基因组单元中，对GC含量和染色体计数之间的相关性建模。例示性的数学函数为回归模型(即将序列信息与数学函数拟合，例如低阶函数(线性和/或二次多项式))。通过从每一单元的计数中减去模型中所反映的GC-依赖性的组分来校正GC偏好的影响。然后基于校正后的计数实施染色体计数。该实施方案的优势为其保留了原始数据集的计数数量，这对于所述方法的灵敏度是重要的。
图9提供该方案的实施例。在图9中，通过从每一基因组单元中减去线性模型的GC依赖性来校正序列信息。图9的A组和B组显示GC偏好校正之前的序列信息。图9的C组和D组显示GC偏好校正之后的序列信息。这些数据显示GC偏好使染色体计数偏移，使得具有极端GC含量的染色体显得比其实际拷贝数更多或更少。校正序列信息中的GC偏好后，数据显示更加准确的染色体计数，使得可检测18号和21号染色体的三体性，这是不可能根据在校正GC偏好之前的序列信息分析得出的。
在仍然其它实施方案中，GC偏好如下校正。获得很多对照样品中每一单元的平均覆盖度，将样品中观测到的覆盖度除以对照群体的平均值(考虑到对照样品整体覆盖度的不同水平，这可能是加权平均值)。然后每一校正后的单元值为观测值与预期值的比率，该比率在不同%GC的单元之间将更加一致。

Claims (83)

1. 一种用于测定胎儿异常的方法，所述方法包括：
获得母体样品；
对所述样品中的至少部分核酸测序；
将获得的序列信息与参照序列进行比较；
如果所述样品中存在胎儿核酸，则对其进行鉴定；
如果存在胎儿核酸，则任选测定所述胎儿是否具有异常。
2. 权利要求1的方法，其中所述参照序列选自母体参照序列、胎儿参照序列或共有人基因组序列。
3. 权利要求2的方法，其中所述母体参照序列选自从以下样品获得的序列：颊样品、唾液样品、尿液样品、乳头吸出物样品、痰样品、泪水样品和羊水样品。
4. 权利要求1的方法，其中所述测序反应为单分子测序反应。
5. 权利要求4的方法，其中所述单分子测序反应包含通过合成测序和/或通过纳米孔检测测序。
6. 权利要求1的方法，其中所述母体样品为组织或体液。
7. 权利要求6的方法，其中所述体液为母体血液、血浆或血清。
8. 权利要求1的方法，其中所述胎儿核酸为无细胞的循环胎儿核酸。
9. 权利要求1的方法，其中在所述测序步骤前，所述方法进一步包括富集所述样品中的胎儿核酸。
10. 权利要求1的方法，其中所述鉴定步骤包含选自以下的技术稀疏等位基因调用、靶向基因测序、Y染色体物质的鉴定、计算、拷贝数分析和断点分析。
11. 一种用于测定胎儿是否具有异常的方法，所述方法包括：
获得包含母体和胎儿核酸二者的母体样品；
让多种独特的标签与所述样品的核酸连接，其中每种标签与不同基因组区域缔合；
对带标签的核酸实施测序反应以获得带标签的序列；和
通过量化所述带标签的序列来测定所述胎儿是否具有异常。
12. 权利要求11的方法，其中所述不同基因组区域为至少部分染色体。
13. 一种测定胎儿核酸存在情况的方法，所述方法包括：
获得母体样品；
对所述样品中的核酸测序，其中所述测序具有伴随的误差率；
至少部分基于通过所述测序鉴定为胎儿核酸的核酸定量测量来测定所述样品中是否存在胎儿核酸，其中所述定量测量具有至少部分由误差率决定的置信水平。
14. 一种用于测定胎儿是否具有异常的方法，所述方法包括：
获得疑似含有母体和胎儿核酸的母体样品；
对所述样品中的核酸测序；
将获得的序列信息与参照序列进行比较；
鉴定所述获得的序列信息和所述参照序列之间匹配或不匹配的序列区域；
确认所述样品中胎儿核酸的存在情况；和
基于所述鉴定步骤的结果任选测定所述胎儿是否具有异常。
15. 一种用于测定母体样品中是否存在胎儿核酸的方法，所述方法包括：
获得疑似包括胎儿核酸的母体样品；和
对所述样品实施测序反应，如果所述样品中存在至少部分Y染色体，则该反应能够检测所述部分的存在情况；和
确定所述样品中存在胎儿核酸。
16. 权利要求15的方法，其中所述测序反应为单分子测序反应。
17. 权利要求15的方法，其中所述母体样品为组织或体液。
18. 权利要求17的方法，其中所述体液为母体血液、血浆或血清。
19. 权利要求15的方法，所述方法进一步包括：如果所述样品中未检测到Y染色体，则对所获得的序列实施定量分析以检测胎儿核酸的存在情况。
20. 一种用于确定用于检测胎儿异常的测定恰当起作用的方法，所述方法包括：
获得疑似包括胎儿核酸的母体样品；
测定所述样品中是否存在至少部分Y染色体；和
如果所述样品中未检测到Y染色体，则任选对所获得的序列进行定量分析以检测来自正常女性胎儿的核酸的存在情况，从而确定所述测定恰当起作用。
21. 一种用于测定胎儿是否具有异常的方法，所述方法包括：
获得包含母体和胎儿核酸二者的母体样品；
对所述样品实施测序反应以获得样品中核酸的序列信息；
将获得的序列信息与来自参照基因组的序列信息进行比较，从而测定所述胎儿是否具有异常；
检测所述样品中至少部分Y染色体的存在情况；和
如果所述样品中未检测到Y染色体，则区分假阴性和真阴性。
22. 权利要求21的方法，其中区分包含：实施选自拷贝数分析、稀疏等位基因调用、靶向再测序和倒位分析的定量分析。
23. 一种用于测定胎儿是否具有异常的方法，所述方法包括：
获得包含母体和胎儿核酸二者的母体样品；
对所述样品实施测序反应以获得所述样品中核酸的序列信息；
将获得的序列信息与来自参照基因组的序列信息进行比较，从而测定所述胎儿是否具有异常；和
区分假阴性和真阴性。
24. 权利要求23的方法，其中区分包含：
测定所述样品中至少部分Y染色体的存在情况；和
如果所述样品中未检测到Y染色体，则任选对获得的序列进行定量分析以检测来自正常女性胎儿的核酸的存在情况。
25. 权利要求24的方法，其中所述定量分析通过选自拷贝数分析、稀疏等位基因调用、靶向再测序和断点分析的技术来实现。
26. 权利要求23的方法，其中所述区分包含对获得的序列实施定量分析以检测来自正常胎儿的核酸的存在情况。
27. 权利要求26的方法，其中所述定量分析通过选自拷贝数分析、稀疏等位基因调用、靶向再测序和断点分析的技术来实现。
28. 权利要求的23方法，其中在所述实施步骤前，所述方法进一步包括富集所述样品中的胎儿核酸。
29. 权利要求23的方法，其中所述测序反应为通过合成反应的单分子测序。
30. 权利要求23的方法，其中所述母体样品为组织或体液。
31. 权利要求30的方法，其中所述体液为母体血液、血浆或血清。
32. 权利要求23的方法，其中所述异常起因于染色体畸变。
33. 权利要求23的方法，其中所述异常起因于胎儿非整倍性。
34. 权利要求23的方法，其中所述异常选自唐氏综合征(21号染色体三体性)、爱德华综合征(18号染色体三体性)和帕塔综合征(13号染色体三体性)。
35. 一种用于测定胎儿是否具有异常的方法，所述方法包括：
获得包含母体和胎儿核酸二者的母体样品；
对所述样品实施测序反应以获得所述样品中核酸的序列信息；
将获得的序列信息与来自参照基因组的序列信息进行比较，从而测定所述胎儿是否具有异常；
检测所述样品中至少部分Y染色体的存在情况；和
如果所述样品中未检测到Y染色体，则区分假阴性和真阴性。
36. 权利要求35的方法，其中在所述实施步骤前，所述方法进一步包括富集所述样品中的胎儿核酸。
37. 权利要求35的方法，其中区分包含：实施选自拷贝数分析、稀疏等位基因调用、靶向再测序和断点分析的定量分析。
38. 权利要求35的方法，其中所述比较步骤包含将所测得的感兴趣区域的测序覆盖度深度与具有相同总覆盖度的二倍体样品中的预期覆盖度深度进行比较。
39. 权利要求38的方法，其中所述感兴趣区域为整个染色体。
40. 权利要求38的方法，其中所述感兴趣区域为部分染色体。
41. 权利要求38的方法，其中通过来自对照群体的平均覆盖度来测定所述预期覆盖度深度。
42. 权利要求38的方法，其中通过与同一样品的大部分区域比较来测定所述预期覆盖度深度。
43. 权利要求38的方法，其中所述预期覆盖度深度通过在所述样品中观测到的覆盖度值的分布模型来测定，其将覆盖度深度的空间分配到对应于不同拷贝数的范围。
44. 一种用于测定胎儿是否具有异常的方法，所述方法包括：
获得包含母体和胎儿核酸二者的母体样品；
让独特的标签与所述样品的核酸连接，其中每种标签与不同的染色体缔合；
对带标签的核酸实施测序反应以获得带标签的序列；和
任选通过量化所述带标签的序列来测定所述胎儿是否具有异常。
45. 权利要求44的方法，其中所述标签包含独特的核酸序列。
46. 一种用于测定母体样品中是否存在胎儿核酸的方法，所述方法包括：
获得疑似包括胎儿核酸的母体样品；
选择用于在所述样品中检测的至少两种独特的k-聚体；和
基于独特的k-聚体的比率测定所述母体样品中是否存在胎儿核酸。
47. 权利要求46的方法，其进一步包括基于所检测序列的分析来诊断所述胎儿的异常。
48. 权利要求46的方法，其中所述独特序列包含一种或多种单核苷酸多态性。
49. 权利要求46的方法，其进一步包括测定所述独特k-聚体每一种的量的步骤。
50. 权利要求46的方法，其中所述测定步骤包含对至少部分所述核酸测序。
51. 权利要求46的方法，其中所述母体样品为组织或体液。
52. 权利要求46的方法，其中所述体液为母体血液、血浆或血清。
53. 一种用于鉴定胎儿异常的方法，所述方法包括以下步骤：
对来自母体样品的核酸测序；
区分胎儿核酸与母体核酸；
确认所述胎儿核酸的存在或不存在情况；和
任选基于所述胎儿核酸中的序列变体来鉴定异常。
54. 权利要求53的方法，其中所述确认步骤包括在所述区分步骤中鉴定假阴性结果。
55. 权利要求53的方法，其中所述确认步骤包括在所述区分步骤中鉴定假阳性结果。
56. 权利要求53的方法，其中所述确认步骤包括鉴定与Y染色体有关的核酸。
57. 权利要求53的方法，其中所述区分步骤包括将获得的序列与一种或多种参照序列进行比较。
58. 权利要求57的方法，其中所述参照序列选自人基因组的共有序列、母体参照序列、父本参照序列和胎儿参照序列。
59. 一种用于分析样品中核酸的方法，所述方法包括：
对样品测序以获得核酸序列信息；
测定所述序列信息中GC偏好的量；
校正所述序列信息以解释GC偏好；和
分析校正后的信息。
60. 权利要求59的方法，其中测定步骤包含：
将所述序列信息分配到单元中；和
测量每一单元中的多个染色体的计数和其GC含量之间的相关性，其中统计学上显著负或正相关表明存在GC偏好。
61. 权利要求59的方法，其中校正包含：
在给定的范围内选择单元亚组，以使每一染色体的平均GC含量均衡。
62. 权利要求59的方法，其中校正包含：
对单元组中GC含量和染色体计数之间的相关性建模；和
基于所述建模通过从每一单元的染色体计数中减去GC-依赖性的组分来调整所述GC偏好的影响。
63. 权利要求59的方法，其中校正包含：
获得多种对照中每一单元的平均序列覆盖度；和
将获得的所述样品的覆盖度除以所述对照的平均值。
64. 权利要求59的方法，其中所述样品为组织或体液。
65. 权利要求64的方法，其中所述样品疑似含有胎儿核酸。
66. 权利要求65的方法，其中所述体液为母体血液、血浆或血清。
67. 权利要求59的方法，其中测序为单分子测序和/或通过纳米孔检测测序。
68. 权利要求67的方法，其中单分子测序为通过合成的测序和/或通过纳米孔检测的测序。
69. 一种用于鉴定胎儿异常的方法，所述方法包括：
获得母体样品；
对所述样品中的至少部分核酸测序以获得序列信息；
测定所述序列信息中GC偏好的量；
校正所述序列信息以解释GC偏好；
将校正后的序列信息与参照序列进行比较；
如果所述样品中存在胎儿核酸，则对其进行鉴定；
如果存在胎儿核酸，则任选测定所述胎儿是否具有异常。
70. 权利要求69的方法，其中所述参照序列选自母体参照序列、胎儿参照序列或共有的人基因组序列。
71. 权利要求69的方法，其中所述母体参照序列选自从以下样品获得的序列：颊样品、唾液样品、尿液样品、乳头吸出物样品、痰样品、泪水样品和羊水样品。
72. 权利要求69的方法，其中测序为单分子测序。
73. 权利要求72的方法，其中单分子测序包含通过合成的测序和/或通过纳米孔检测的测序。
74. 权利要求69的方法，其中所述母体样品为组织或体液。
75. 权利要求74的方法，其中所述体液为母体血液、血浆或血清。
76. 权利要求69的方法，其中所述胎儿核酸为无细胞的循环胎儿核酸。
77. 权利要求69的方法，其中在所述测序步骤前，所述方法进一步包括富集所述样品中的胎儿核酸。
78. 权利要求69的方法，其中所述鉴定步骤包含选自以下的技术：稀疏等位基因调用、靶向基因测序、Y染色体物质的鉴定、计算、拷贝数分析和倒位分析。
79. 权利要求69的方法，其中测定包含：
将所述序列信息分配到单元中；和
测量每一单元中多种染色体的计数和其GC含量之间的相关性，其中统计学上显著负或正相关表明存在GC偏好。
80. 权利要求69的方法，其中校正包含：
在给定的范围内选择单元亚组，以使每一染色体的平均GC含量均衡。
81. 权利要求69的方法，其中校正包含：
对单元组中的GC含量和染色体计数之间的相关性建模；和
基于所述建模通过从每一单元的染色体计数中减去GC-依赖性的组分来调整所述GC偏好的影响。
82. 权利要求69的方法，其中校正包含：
获得多种对照中每一单元的平均序列覆盖度；和
将获得的所述样品的覆盖度除以所述对照的平均值。
83. 权利要求69的方法，其中所述测定包含：
将所测量的染色体区域中覆盖度深度与用所述样品处理后的正常对照进行比较。
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