ES2945227T3 - Oligonucleótidos asociados con anticuerpos - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se describen sistemas, métodos, composiciones y kits para determinar la expresión de proteínas y genes simultáneamente y para la indexación de muestras. En algunas realizaciones, un oligonucleótido asociado con un reactivo de unión a componentes celulares (p. ej., un anticuerpo) comprende uno o más de una secuencia de marcador molecular única, un adaptador de cebador, una secuencia de código de barras específica de anticuerpo, una secuencia de alineación y/o un poli (Una secuencia. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se asocia con el reactivo de unión al componente celular a través de un enlazador (p. ej., 5AmMC12). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótidos asociados con anticuerpos
ANTECEDENTES
Campo
[0001] La presente descripción se relaciona generalmente con el campo de la biología molecular, por ejemplo, identificando células de diferentes muestras y determinando perfiles de expresión de proteínas en células usando códigos de barras moleculares.
Descripción de la técnica relacionada
[0002] La tecnología actual permite la medición de la expresión génica de células individuales de forma masivamente paralela (p. ej., >10000 células) mediante la unión de códigos de barras de oligonucleótidos específicos de células a moléculas de ARNm de poli(A) de células individuales como cada una de las células se colocalizan con una perla de reactivo con código de barras en un compartimento. La expresión génica puede afectar la expresión de proteínas. La interacción proteína-proteína puede afectar la expresión génica y la expresión de proteínas. El documento WO2017117358A1 describe métodos y composiciones para el análisis proteómico cuantitativo de resolución unicelular utilizando secuenciación de alto rendimiento. US2018208975A1 describe un ensayo bioquímico para análisis genómico y proteómico simultáneos. WO2018144813A1 describe métodos y composiciones para identificar o cuantificar objetivos en una muestra biológica. El documento WO2020037065A1 describe códigos de barras de aptámeros. Existe la necesidad de sistemas y métodos que puedan analizar cuantitativamente la expresión de proteínas en las células y medir simultáneamente la expresión de proteínas y la expresión génica en las células.
RESUMEN
[0003] La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
[0004] Algunas formas de realización descritas en el presente documento proporcionan métodos para la identificación de muestras, que comprenden: poner en contacto cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, respectivamente, donde cada una de la pluralidad de muestras comprende una o más células cada una que comprende una o más dianas de componentes celulares, donde la composición de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos una de las una o más dianas de componentes celulares y en el que el reactivo de unión al componente celular comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en el que el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de indexación de la muestra y una secuencia de alineación adyacente a un poli(dA) región, y en el que las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra.
[0005] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una primera secuencia marcadora molecular. En algunas formas de realización, la secuencia del primer marcador molecular tiene una longitud de 2 a 20 nucleótidos. En algunas formas de realización, las primeras secuencias de marcadores moleculares de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son diferentes, y en las que las secuencias de indexación de muestra de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son idénticas. En algunas formas de realización, las primeras secuencias de marcadores moleculares de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son diferentes, y en las que las secuencias de indexación de muestra de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son diferentes.
[0006] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el primer cebador universal tiene una longitud de 5-50 nucleótidos. En algunas formas de realización, el primer cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el cebador de secuenciación comprende un cebador de secuenciación P7.
[0007] En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende: proporcionar una pluralidad de códigos de barras. En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende: codificar con barras oligonucleótidos de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras en los datos de secuenciación. En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra, o de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, en los datos de secuenciación. En algunas formas de realización, identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestras comprende: replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras, el al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras, o un producto del mismo, usando el primer cebador universal, un primer cebador que comprende el secuencia del primer cebador universal, o una combinación de los mismos, para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicadas; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicadas; e identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de la muestra de un oligonucleótido de indexación de la muestra replicada de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de la muestra replicada que corresponden a al menos un oligonucleótido de indexación de muestra, o el menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, en los datos de secuenciación.
[0008] En algunas formas de realización, replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra replicados comprende: antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, ligar un adaptador de replicación a al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, y en el que la replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras comprende la replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras usando el adaptador de replicación ligado al, al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados. En algunas formas de realización, replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados comprende: antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras, poner en contacto un código de barras de la pluralidad de códigos de barras con al menos un oligonucleótido de indexación de muestras. oligonucleótido, o un producto del oligonucleótido de indexación de muestra, para generar el código de barras hibridado con el oligonucleótido de indexación de muestra, o un producto del mismo; y extender el código de barras hibridado con el oligonucleótido de indexación de muestra, o el producto del oligonucleótido de indexación de muestra, para generar el oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras, y en el que replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestra comprende replicar el oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras oligonucleótido de indexación de muestras, o un producto del mismo, usando el primer cebador universal, un primer cebador que comprende la secuencia del primer cebador universal, el segundo cebador universal, un segundo cebador que comprende la secuencia del segundo cebador universal, o una combinación de los mismos, para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicadas.
[0009] En algunas formas de realización, el producto del oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia complementaria del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras, o una subsecuencia del mismo, y la secuencia del código de barras, o una subsecuencia del mismo. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA).
[0010] En algunas formas de realización, la secuencia de alineación tiene una longitud de uno o más nucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación tiene una longitud de dos o más nucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación comprende una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación comprende una secuencia poli(dT), una secuencia poli(dG), una secuencia poli(dC), una secuencia poli(dU), o una combinación de las mismas. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación es 5' con respecto a la región poli(dA).
[0011] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se asocia con el reactivo de unión al componente celular a través de un enlazador. En algunas formas de realización, el enlazador comprende una cadena de carbono. En algunas formas de realización, la cadena de carbono comprende de 2 a 30 carbonos. En algunas formas de realización, la cadena de carbono comprende 12 carbonos. En algunas formas de realización, el enlazador comprende el modificador de amino 5' C12 (5AmMC12), o un derivado del mismo. En algunas formas de realización, el componente celular diana comprende una proteína diana.
[0012] En algunas formas de realización, la secuencia de indexación de la muestra tiene una longitud de 6-60 nucleótidos. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra tiene una longitud de 50-500 nucleótidos. En algunas formas de realización, las secuencias de indexación de muestras de al menos 10, 100 o 1000 composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se une al reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se une covalentemente al reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se conjuga con el reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se conjuga con el reactivo de unión del componente celular a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se une de forma no covalente al reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares está en una superficie celular. En algunas formas de realización, los métodos comprenden eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras. En algunas formas de realización, la eliminación de las composiciones de indexación de muestras no unidas comprende el lavado de una o más células de cada una de la pluralidad de muestras con un tampón de lavado. En algunas formas de realización, eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas comprende seleccionar células unidas a al menos un reactivo de unión de componentes celulares usando citometría de flujo. En algunas formas de realización, los métodos comprenden la lisis de una o más células de cada una de la pluralidad de muestras. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra está configurado para ser separable del reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, los métodos comprenden disociar el oligonucleótido de indexación de la muestra del reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, la disociación del oligonucleótido de indexación de la muestra comprende separar el oligonucleótido de indexación de la muestra del reactivo de unión al componente celular mediante fotoescisión UV, tratamiento químico, calentamiento, tratamiento con enzimas o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la disociación se produce después de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de la muestra. En algunas formas de realización, la disociación se produce antes del código de barras de los oligonucleótidos de indexación de la muestra. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra está configurado para que no se pueda separar del reactivo de unión al componente celular.
[0013] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestras no es homólogo a las secuencias genómicas de ninguna de las una o más células, es homólogo a las secuencias genómicas de una especie o una combinación de las mismas. En algunas formas de realización, la especie es una especie no mamífera. En algunas formas de realización, una muestra de la pluralidad de muestras comprende una pluralidad de células, una pluralidad de células individuales, un tejido, una muestra de tumor o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de muestras comprende una célula de mamífero, una célula bacteriana, una célula viral, una célula de levadura, una célula fúngica o cualquier combinación de las mismas.
[0014] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura de un código de barras configurado para capturar la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestras. En algunas formas de realización, el código de barras comprende una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura. En algunas formas de realización, la región de unión a la diana comprende una región poli(dT). En algunas formas de realización, la secuencia del oligonucleótido de indexación de la muestra complementaria a la secuencia de captura comprende una región poli(dA).
[0015] En algunas formas de realización, el objetivo del componente celular comprende un carbohidrato, un lípido, una proteína, una proteína extracelular, una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un receptor principal de histocompatibilidad complejo, un antígeno tumoral, un receptor, una proteína intracelular o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el objetivo del componente celular se selecciona de un grupo que comprende de 10 a 100 objetivos del componente celular diferentes. En algunas formas de realización, el reactivo de unión de componentes celulares está asociado con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con una secuencia idéntica. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares está asociado con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con diferentes secuencias de indexación de muestra. En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras comprende un segundo reactivo de unión a componentes celulares capaz de unirse específicamente a al menos una de una o más dianas de componentes celulares. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son capaces de unirse al mismo objetivo de unión a componentes celulares de uno o más objetivos de componentes celulares. En algunas formas de realización, el segundo reactivo de unión a componentes celulares está asociado con un segundo oligonucleótido de indexación de muestra que comprende una segunda secuencia de indexación de muestra. En algunas formas de realización, la secuencia de indexación de muestras y la segunda secuencia de indexación de muestras son idénticas. En algunas formas de realización, la secuencia de indexación de muestra y la segunda secuencia de indexación de muestra son diferentes. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son idénticos en secuencia al menos en un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son idénticos. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son diferentes. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son capaces de unirse a diferentes regiones del mismo componente celular diana. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son capaces de unirse a diferentes dianas de proteínas de una o más dianas de proteínas, o diferentes dianas de componentes celulares de una o más dianas de componentes celulares.
[0016] En algunas formas de realización, los métodos comprenden, antes de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestras, agrupar la pluralidad de muestras en contacto con la pluralidad de composiciones de indexación de muestras. En algunas formas de realización, un código de barras de la pluralidad de códigos de barras comprende una región de unión al objetivo y una segunda secuencia de etiquetas moleculares, y donde las segundas secuencias de etiquetas moleculares de al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden diferentes secuencias de etiquetas de segundas moléculas. En algunas formas de realización, el código de barras comprende una secuencia de etiquetas celulares, la secuencia de un segundo cebador universal, una secuencia complementaria de la misma, una subsecuencia de la misma o cualquier combinación de las mismas. En algunas formas de realización, la región de unión a la diana comprende una región poli(dT). En algunas formas de realización, la pluralidad de códigos de barras está asociada con una partícula. En algunas formas de realización, al menos un código de barras de la pluralidad de códigos de barras está inmovilizado en la partícula, parcialmente inmovilizado en la partícula, encerrado en la partícula, parcialmente encerrado en la partícula o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la partícula se puede romper. En algunas formas de realización, la partícula comprende una perla. En algunas formas de realización, la partícula comprende una perla de Sepharose, una perla de estreptavidina, una perla de agarosa, una perla magnética, una perla conjugada, una perla conjugada con proteína A, una perla conjugada con proteína G, una perla conjugada con proteína NG, una perla conjugada con proteína L una perla conjugada, una perla conjugada con oligo(dT), una perla de sílice, una perla similar a la sílice, una perla de hidrogel, una microperla antibiotina, una microperla antifluorocromo o cualquier combinación de los mismos, o donde la partícula comprende un material seleccionado del grupo formado por polidimetilsiloxano (PDMS), poliestireno, vidrio, polipropileno, agarosa, gelatina, hidrogel, paramagnético, cerámica, plástico, vidrio, metilestireno, polímero acrílico, titanio, látex, sefarosa, celulosa, nailon, silicona y cualquier combinación del mismo. En algunas formas de realización, la partícula comprende una perla de hidrogel rompible. En algunas formas de realización, los códigos de barras de la partícula comprenden secuencias de segundas etiquetas moleculares seleccionadas de al menos 1000, 10000, o una combinación de las mismas, diferentes secuencias de segundas etiquetas moleculares. En algunas formas de realización, las segundas secuencias de etiquetas moleculares de los códigos de barras comprenden secuencias aleatorias. En algunas formas de realización, la partícula comprende al menos 10000 códigos de barras.
[0017] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando la pluralidad de códigos de barras comprende: poner en contacto la pluralidad de códigos de barras con los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestras; y extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestra para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras. En algunas formas de realización, los métodos comprenden, antes de extender los códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestra, agrupar los códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestra, y en donde extender los códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestra comprende extender los códigos de barras agrupados hibridados con la muestra oligonucleótidos de indexación para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras agrupados. En algunas formas de realización, extender los códigos de barras comprende extender los códigos de barras usando una ADN polimerasa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. En algunas formas de realización, extender los códigos de barras comprende extender los códigos de barras utilizando una transcriptasa inversa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. En algunas formas de realización, los métodos comprenden amplificar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras para producir una pluralidad de amplicones. En algunas formas de realización, amplificar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras comprende amplificar, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al menos una parte de la segunda secuencia de marcador molecular y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de muestras. En algunas formas de realización, obtener los datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras comprende obtener datos de secuenciación de la pluralidad de amplicones. En algunas formas de realización, obtener los datos de secuenciación comprende secuenciar al menos una parte de la secuencia del segundo marcador molecular y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de la muestra.
[0018] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras usando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras comprende la codificación de barras estocástica de los oligonucleótidos de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras estocásticos. En algunas formas de realización, los métodos comprenden: codificar en barras una pluralidad de objetivos de la célula usando la pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de objetivos con código de barras, donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiqueta de célula, y donde al menos dos códigos de barras de la una pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiquetas de célula idéntica; y obtener datos de secuenciación de los objetivos con código de barras. En algunas formas de realización, codificar con barras la pluralidad de objetivos usando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras comprende: poner en contacto copias de los objetivos con regiones de unión al objetivo de los códigos de barras; y la transcripción inversa de la pluralidad de objetivos utilizando la pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de objetivos transcriptos inversamente. En algunas formas de realización, los métodos comprenden: antes de obtener los datos de secuenciación de la pluralidad de objetivos con código de barras, amplificar los objetivos con código de barras para generar una pluralidad de objetivos con código de barras amplificados. En algunas formas de realización, amplificar los objetivos con código de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras amplificados comprende: amplificar los objetivos con código de barras mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En algunas formas de realización, codificar con barras la pluralidad de objetivos de la célula usando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras comprende codificar con barras estocásticamente la pluralidad de objetivos de la célula usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para generar una pluralidad de objetivos con código de barras estocásticamente.
[0019] Algunas formas de realización descritas en el presente documento proporcionan una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, en las que cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, en el que el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos un objetivo de componente celular y en el que el reactivo de unión al componente celular comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en el que el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de indexación de muestra para identificar la muestra origen de una o más células de una muestra y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y donde las secuencias de indexación de muestra de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes.
[0020] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una primera secuencia marcadora molecular. En algunas formas de realización, la secuencia del primer marcador molecular tiene una longitud de 2 a 20 nucleótidos. En algunas formas de realización, las primeras secuencias de marcadores moleculares de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son diferentes, y en las que las secuencias de indexación de muestra de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son idénticas. En algunas formas de realización, las primeras secuencias de marcadores moleculares de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son diferentes, y en las que las secuencias de indexación de muestra de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son diferentes. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el primer cebador universal tiene una longitud de 5­ 50 nucleótidos. En algunas formas de realización, el primer cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el cebador de secuenciación comprende un cebador de secuenciación P7. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA). En algunas formas de realización, la secuencia de alineación tiene una longitud de uno o más nucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación tiene una longitud de dos o más nucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación comprende una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación comprende una secuencia poli(dT), una secuencia poli(dG), una secuencia poli(dC), una secuencia poli(dU), o una combinación de las mismas. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación es 5' a la región poli(dA). En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se asocia con el reactivo de unión al componente celular a través de un enlazador. En algunas formas de realización, el enlazador comprende una cadena de carbono. En algunas formas de realización, la cadena de carbono comprende de 2 a 30 carbonos. En algunas formas de realización, la cadena de carbono comprende 12 carbonos. En algunas formas de realización, el enlazador comprende el modificador de amino 5' C12 (5AmMC12), o un derivado del mismo. En algunas formas de realización, el componente celular diana comprende una proteína diana.
[0021] En algunas formas de realización, la secuencia de indexación de la muestra tiene una longitud de 6-60 nucleótidos. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra tiene una longitud de 50-500 nucleótidos. En algunas formas de realización, las secuencias de indexación de muestras de al menos 10, 100 o 1000 composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se une al reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se une covalentemente al reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se conjuga con el reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se conjuga con el reactivo de unión al componente celular a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra está unido de forma no covalente al reactivo de unión al componente celular.
[0022] En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras comprende un segundo reactivo de unión a componentes celulares capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son capaces de unirse al mismo objetivo de unión a componentes celulares de uno o más objetivos de componentes celulares. En algunas formas de realización, el segundo reactivo de unión al componente celular está asociado con un segundo oligonucleótido de indexación de muestra que comprende una segunda secuencia de indexación de muestra. En algunas formas de realización, la secuencia de indexación de muestras y la segunda secuencia de indexación de muestras son idénticas. En algunas formas de realización, la secuencia de indexación de muestra y la segunda secuencia de indexación de muestra son diferentes. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son idénticos en secuencia al menos en un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son idénticos. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son diferentes. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son capaces de unirse a diferentes regiones del mismo componente celular diana. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son capaces de unirse a diferentes dianas de componentes celulares de una o más dianas de componentes celulares.
[0023] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra no es homólogo a las secuencias genómicas de cualquiera de una o más células. En algunas formas de realización, al menos una muestra de la pluralidad de muestras comprende una o más células individuales, una pluralidad de células, un tejido, una muestra de tumor o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la muestra comprende una muestra de mamífero, una muestra bacteriana, una muestra viral, una muestra de levadura, una muestra fúngica o cualquier combinación de las mismas. En algunas formas de realización, el componente celular diana comprende una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el objetivo del componente celular se selecciona de un grupo que comprende de 10 a 100 objetivos del componente celular diferentes.
[0024] Algunas formas de realización descritas en el presente documento proporcionan métodos para medir la expresión de componentes celulares en células, que comprenden: poner en contacto una pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares con una pluralidad de células que comprenden una pluralidad de objetivos de componentes celulares, donde cada uno de la pluralidad de reactivos de unión de componentes celulares comprende un oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares que comprende una secuencia de identificación única para el reactivo de unión a componentes celulares y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y en el que el reactivo de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de la pluralidad de objetivos de componentes celulares y en el que el reactivo de unión a componentes celulares comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos; extender los códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos específicos del reactivo de unión al componente celular, o sus productos, para producir una pluralidad de ácidos nucleicos marcados, en los que cada uno de los ácidos nucleicos marcados comprende una secuencia identificadora única, o una secuencia complementaria de la misma, y una primera etiqueta molecular secuencia, o una secuencia complementaria de la misma; y obtener información de secuencia de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados, una secuencia complementaria de los mismos o una porción de los mismos para determinar el número de copias de al menos un componente celular diana de la pluralidad de componentes celulares diana en una o más de la pluralidad de células.
[0025] En algunas formas de realización, los métodos comprenden antes de extender los códigos de barras: dividir la pluralidad de células asociadas con la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares en una pluralidad de particiones, donde una partición de la pluralidad de particiones comprende una única célula de la pluralidad de células asociadas con los reactivos de unión a componentes celulares; en la partición que comprende la célula única, poner en contacto una partícula de código de barras con los oligonucleótidos específicos del componente celular, en el que la partícula de código de barras comprende una pluralidad de códigos de barras, cada uno de los cuales comprende una región de unión a la diana y una primera secuencia marcadora molecular, y en donde dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden diferentes secuencias marcadoras moleculares. En algunas formas de realización, el número de secuencias de primera etiqueta molecular únicas asociadas con la secuencia de identificador único para el reactivo de unión al componente celular capaz de unirse específicamente al al menos un objetivo del componente celular en los datos de secuenciación indica el número de copias del al menos un objetivo de componente celular en una o más de la pluralidad de células.
[0026] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular comprende una segunda secuencia marcadora molecular. En algunas formas de realización, la secuencia del segundo marcador molecular tiene una longitud de 2 a 20 nucleótidos. En algunas formas de realización, las secuencias del segundo marcador molecular de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son diferentes, y en las que las secuencias de identificación únicas de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son idénticas. En algunas formas de realización, las secuencias del segundo marcador molecular de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son diferentes, y en las que las secuencias de identificador único de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son diferentes. En algunas formas de realización, el número de secuencias únicas de la segunda etiqueta molecular asociadas con la secuencia del identificador único para el reactivo de unión al componente celular capaz de unirse específicamente al al menos un objetivo del componente celular en los datos de secuenciación indica el número de copias del al menos un objetivo de componente celular en una o más de la pluralidad de células.
[0027] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares comprende la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el primer cebador universal tiene una longitud de 5-50 nucleótidos. En algunas formas de realización, el primer cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el cebador de secuenciación comprende un cebador de secuenciación P7. En algunas formas de realización, obtener información de secuenciación de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados o una porción de los mismos comprende someter los ácidos nucleicos marcados a una o más reacciones (p. ej., una reacción de amplificación por PCR, una reacción de transcripción inversa, una reacción de hibridación y extensión, una reacción de ligación, o cualquier combinación de las mismas) para generar un conjunto de ácidos nucleicos para la secuenciación de ácidos nucleicos. En algunas formas de realización, cada uno de los códigos de barras comprende una etiqueta celular, un segundo cebador universal, un adaptador de amplificación, un adaptador de secuenciación o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, someter los ácidos nucleicos marcados a una o más reacciones comprende someter los ácidos nucleicos marcados a una reacción de amplificación, usando el primer cebador universal, un primer cebador que comprende la secuencia del primer cebador universal, el segundo cebador universal, un segundo cebador que comprende la secuencia del segundo cebador universal, o una combinación de los mismos, para generar el conjunto de ácidos nucleicos para la secuenciación de ácidos nucleicos.
[0028] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA). En algunas formas de realización, la secuencia de alineación tiene una longitud de uno o más nucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación tiene una longitud de dos o más nucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación comprende una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación comprende una secuencia poli(dT), una secuencia poli(dG), una secuencia poli(dC), una secuencia poli(dU), o una combinación de las mismas. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación es 5' con respecto a la región poli(dA). En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares se asocia con el reactivo de unión a componentes celulares a través de un enlazador. En algunas formas de realización, el enlazador comprende una cadena de carbono. En algunas formas de realización, la cadena de carbono comprende de 2 a 30 carbonos. En algunas formas de realización, la cadena de carbono comprende 12 carbonos. En algunas formas de realización, el enlazador comprende el modificador de amino 5' C12 (5AmMC12), o un derivado del mismo.
[0029] En algunas formas de realización, la pluralidad de dianas de componentes celulares comprende una pluralidad de dianas proteicas, y donde el reactivo de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos una de la pluralidad de dianas proteicas. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares está asociado con el reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares se une covalentemente al reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares se conjuga con el reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares se conjuga con el reactivo de unión a componentes celulares a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares está unido de forma no covalente al reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares está configurado para ser separable del reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, los métodos comprenden disociar el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares del reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, la disociación del oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares comprende separar el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares del reactivo de unión a componentes celulares mediante fotoescisión UV, tratamiento químico, calentamiento, tratamiento enzimático o cualquier combinación de los mismos. En alguna forma de realización, la disociación se produce después de codificar con barras el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, la disociación se produce antes del código de barras del oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares está configurado para que no se pueda separar del reactivo de unión a componentes celulares.
[0030] En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares comprende un segundo reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son idénticos en secuencia al menos en un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son idénticos. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son diferentes. En algunas formas de realización, las dianas de componentes celulares del reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son idénticas. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son capaces de unirse a diferentes regiones de un componente celular diana. En algunas formas de realización, las dianas de componentes celulares del reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son diferentes.
[0031] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura de un código de barras configurado para capturar la secuencia del oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, el código de barras comprende una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura. En algunas formas de realización, la región de unión a la diana comprende una región poli(dT). En algunas formas de realización, la secuencia del oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular complementario a la secuencia de captura comprende una región poli(dA).
[0032] En algunas formas de realización, los métodos comprenden después de poner en contacto la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares con la pluralidad de células, eliminar uno o más reactivos de unión a componentes celulares de la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares que no están en contacto con la pluralidad de células. En algunas formas de realización, eliminar uno o más reactivos de unión a componentes celulares que no están en contacto con la pluralidad de células comprende: eliminar uno o más reactivos de unión a componentes celulares que no están en contacto con el respectivo al menos uno de la pluralidad de objetivos de componentes celulares. En algunas formas de realización, dividir la pluralidad de células comprende dividir la pluralidad de células asociadas con la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares y una pluralidad de partículas de código de barras que comprenden la partícula de código de barras a la pluralidad de particiones, donde la partición de la pluralidad de particiones comprende la célula única de la pluralidad de células asociadas con el reactivo de unión de componentes celulares y la partícula de código de barras. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares comprende una proteína de superficie celular, una proteína intracelular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la partícula de código de barras es una perla de sefarosa, una perla de estreptavidina, una perla de agarosa, una perla magnética, una perla de sílice, una perla de tipo sílice, una perla de hidrogel, una microperla de antibiotina, una microperla de antifluorocromo o una perla de hidrogel En algunas formas de realización, la partición es un pocillo o una gota. En algunas formas de realización, la pluralidad de células comprende células T, células B, células tumorales, células mieloides, células sanguíneas, células normales, células fetales, células maternas o una mezcla de las mismas.
[0033] Algunas formas de realización descritas en el presente documento proporcionan una composición que comprende: una pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares, cada uno asociado con un oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares que comprende una secuencia de identificación única para el reactivo de unión a componentes celulares y una secuencia de alineación adyacente a un región poli(dA), en la que el reactivo de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos una de una pluralidad de dianas de componentes celulares y en la que el reactivo de unión a componentes celulares comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido, o cualquier combinación de los mismos.
[0034] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular comprende una primera secuencia marcadora molecular. En algunas formas de realización, la secuencia del primer marcador molecular tiene una longitud de 2 a 20 nucleótidos. En algunas formas de realización, las primeras secuencias marcadoras moleculares de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son diferentes, y en las que las secuencias de identificación únicas de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son idénticas. En algunas formas de realización, las primeras secuencias marcadoras moleculares de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son diferentes, y en las que las secuencias de identificación únicas de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son diferentes. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares comprende la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el primer cebador universal tiene una longitud de 5-50 nucleótidos. En algunas formas de realización, el primer cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el cebador de secuenciación comprende un cebador de secuenciación P7. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA). En algunas formas de realización, la secuencia de alineación tiene una longitud de uno o más nucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación tiene una longitud de dos o más nucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación comprende una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación comprende una secuencia poli(dT), una secuencia poli(dG), una secuencia poli(dC), una secuencia poli(dU), o una combinación de las mismas. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación es 5' con respecto a la región poli(dA).
[0035] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares se asocia con el reactivo de unión a componentes celulares a través de un enlazador. En algunas formas de realización, el enlazador comprende una cadena de carbono. En algunas formas de realización, la cadena de carbono comprende de 2 a 30 carbonos. En algunas formas de realización, la cadena de carbono comprende 12 carbonos. En algunas formas de realización, el enlazador comprende el modificador de amino 5' C12 (5AmMC12), o un derivado del mismo. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares se une al reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares se une covalentemente al reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares está unido de forma no covalente al reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares se conjuga con el reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares se conjuga con el aptámero de unión a componentes celulares a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos.
[0036] En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares comprende un segundo reactivo de unión a componentes celulares. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares tienen al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a proteínas son idénticos. En algunas formas de realización, el aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular son diferentes. En algunas formas de realización, las proteínas dianas, o las dianas de componentes celulares, del reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son idénticas. En algunas formas de realización, el reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son capaces de unirse a diferentes regiones de un componente celular diana. En algunas formas de realización, las dianas de componentes celulares del reactivo de unión a componentes celulares y el segundo reactivo de unión a componentes celulares son diferentes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0037]
FIG. 1 ilustra un código de barras estocástico ejemplar no limitativo.
FIG. 2 muestra un flujo de trabajo ejemplar no limitativo de códigos de barras estocásticos y conteo digital. FIG. 3 es una ilustración esquemática que muestra un proceso ejemplar no limitativo para generar una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras estocástico a partir de una pluralidad de objetivos.
FIG. 4 muestra una ilustración esquemática de un reactivo de unión a proteínas de ejemplo (anticuerpo ilustrado aquí) asociado con un oligonucleótido que comprende un identificador único para el reactivo de unión a proteínas. FIG. 5 muestra una ilustración esquemática de un reactivo de unión ejemplar (anticuerpo ilustrado aquí) asociado con un oligonucleótido que comprende un identificador único para la indexación de muestras para determinar células de la misma muestra o de muestras diferentes.
FIG. 6 muestra una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar del uso de anticuerpos asociados a oligonucleótidos para determinar la expresión de componentes celulares (p. ej., expresión de proteínas) y la expresión génica simultáneamente con un alto rendimiento.
FIG. 7 muestra una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar del uso de anticuerpos asociados a oligonucleótidos para la indexación de muestras.
FIG. 8 muestra una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar no limitativo de codificación de barras de un oligonucleótido de reactivo de unión (oligonucleótido de anticuerpo ilustrado aquí) que está asociado con un reactivo de unión (anticuerpo ilustrado aquí).
FIGS. 9A-9D muestran diseños ejemplares no limitantes de oligonucleótidos para determinar la expresión de proteínas y la expresión génica simultáneamente y para la indexación de muestras.
FIG. 10 muestra una ilustración esquemática de una secuencia de oligonucleótidos de ejemplo no limitante para determinar la expresión de proteínas y la expresión génica simultáneamente y para la indexación de muestras. FIGS. 11A-11B muestran diseños ejemplares no limitantes de oligonucleótidos para determinar la expresión de proteínas y la expresión génica simultáneamente y para la indexación de muestras.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0038] En la siguiente descripción detallada, se hace referencia a los dibujos adjuntos, que forman parte de la misma. En los dibujos, los símbolos similares normalmente identifican componentes similares, a menos que el contexto indique lo contrario. Las formas de realización ilustrativas descritas en la descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones no pretenden ser limitativas. Se pueden utilizar otras formas de realización y se pueden realizar otros cambios, sin apartarse del alcance de la materia presentada en este documento. Se entenderá fácilmente que los aspectos de la presente descripción, tal como se describen en general en el presente documento y se ilustran en las figuras, pueden disponerse, sustituirse, combinarse, separarse y diseñarse en una amplia variedad de configuraciones diferentes, todas las cuales se contemplan explícitamente en este documento y forma parte de la divulgación en este documento.
[0039] La cuantificación de pequeños números de ácidos nucleicos, por ejemplo, moléculas de ácido ribonucleótido mensajero (ARNm), es clínicamente importante para determinar, por ejemplo, los genes que se expresan en una célula en diferentes etapas de desarrollo o bajo diferentes condiciones ambientales. Sin embargo, también puede ser muy difícil determinar el número absoluto de moléculas de ácido nucleico (p. ej., moléculas de ARNm), especialmente cuando el número de moléculas es muy pequeño. Un método para determinar el número absoluto de moléculas en una muestra es la reacción en cadena de la polimerasa digital (PCR). Idealmente, la PCR produce una copia idéntica de una molécula en cada ciclo. Sin embargo, la PCR puede tener desventajas tales como que cada molécula se replica con una probabilidad estocástica, y esta probabilidad varía según el ciclo de la PCR y la secuencia del gen, lo que da como resultado un sesgo de amplificación y mediciones de expresión génica inexactas. Los códigos de barras estocásticos con etiquetas moleculares únicas (también denominados índices moleculares [IM]) se pueden utilizar para contar el número de moléculas y corregir el sesgo de amplificación. Los códigos de barras estocásticos como el ensayo Precise™ (Cellular Research, Inc., Palo Alto, CA) pueden corregir el sesgo inducido por la PCR y los pasos de preparación de la biblioteca mediante el uso de etiquetas moleculares (ML) para etiquetar los ARNm durante la transcripción inversa (RT).
[0040] El ensayo Precise™ puede utilizar un grupo no agotador de códigos de barras estocásticos con un gran número, por ejemplo 6561 a 65536, etiquetas moleculares únicas en oligonucleótidos poli(T) para hibridar con todos los ARNm poli(A) en una muestra durante el paso RT. Un código de barras estocástico puede comprender un sitio de cebado de PCR universal. Durante la RT, las moléculas del gen diana reaccionan aleatoriamente con códigos de barras estocásticos. Cada molécula diana puede hibridarse con un código de barras estocástico que da como resultado generar moléculas de ácido ribonucleótido complementario (ADNc) con código de barras estocástico). Después del etiquetado, las moléculas de ADNc con código de barras estocástico de los micropocillos de una placa de micropocillos se pueden agrupar en un solo tubo para la amplificación y secuenciación por PCR. Los datos de secuenciación sin procesar se pueden analizar para producir el número de lecturas, el número de códigos de barras estocásticos con etiquetas moleculares únicas y el número de moléculas de ARNm.
[0041] Los métodos para determinar los perfiles de expresión de ARNm de células individuales se pueden realizar de manera masivamente paralela. Por ejemplo, el ensayo Precise™ se puede utilizar para determinar los perfiles de expresión de ARNm de más de 10000 células simultáneamente. El número de células individuales (p. ej., cientos o miles de células individuales) para el análisis por muestra puede ser inferior a la capacidad de la tecnología de célula individual actual. La combinación de células de diferentes muestras permite una mejor utilización de la capacidad de la tecnología única actual, lo que reduce el desperdicio de reactivos y el costo del análisis de células individuales. La divulgación proporciona métodos de indexación de muestras para distinguir células de diferentes muestras para la preparación de bibliotecas de ADNc para análisis celular, tal como análisis de células individuales. La combinación de células de diferentes muestras puede minimizar las variaciones en la preparación de la biblioteca de ADNc de células de diferentes muestras, lo que permite comparaciones más precisas de diferentes muestras.
[0042] En este documento se describen métodos para la identificación de muestras. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, respectivamente, donde cada una de la pluralidad de muestras comprende una o más células, cada una de las cuales comprende uno o más objetivos de componentes celulares, donde la composición de indexación de muestras comprende un reactivo de unión a componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos una de las una o más dianas de componentes celulares y donde el reactivo de unión a componentes celulares comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de indexación de la muestra y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y en donde la muestra las secuencias de indexación de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra.
[0043] En el presente documento se describen métodos para medir la expresión del componente celular en las células. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares con una pluralidad de células que comprenden una pluralidad de objetivos de componentes celulares, en donde cada uno de la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares comprende un oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares que comprende una secuencia de identificación única para el reactivo de unión a componentes celulares y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y en donde el reactivo de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de la pluralidad de objetivos de componentes celulares y en donde el reactivo de unión al componente celular comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos; extender los códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos específicos del reactivo de unión al componente celular, o sus productos, para producir una pluralidad de ácidos nucleicos marcados, en los que cada uno de los ácidos nucleicos marcados comprende una secuencia identificadora única, o una secuencia complementaria de la misma, y una primera etiqueta molecular secuencia, o una secuencia complementaria de la misma; y obtener información de secuencia de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados, una secuencia complementaria de los mismos o una porción de los mismos para determinar el número de copias de al menos un componente celular diana de la pluralidad de componentes celulares diana en una o más de la pluralidad de células.
[0044] En el presente documento se describe una pluralidad de composiciones de indexación de muestras. Cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras puede comprender un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, en donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos un componente celular diana y en donde el reactivo de unión al componente celular comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de indexación de la muestra para identificar el origen de la muestra de una o más células de una muestra y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y donde las secuencias de indexación de muestra de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes.
[0045] En algunas formas de realización, la composición comprende: una pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares, cada uno asociado con un oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares que comprende una secuencia de identificación única para el reactivo de unión a componentes celulares y una secuencia de alineación adyacente a un poli región (dA), en la que el reactivo de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos una de una pluralidad de dianas de componentes celulares y en la que el reactivo de unión a componentes celulares comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido, o cualquier combinación de los mismos.
Definiciones
[0046] A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. Véase, por ejemplo, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994); Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989). A los efectos de la presente divulgación, los siguientes términos se definen a continuación.
[0047] Como se usa en el presente documento, el término “adaptador” puede significar una secuencia para facilitar la amplificación o secuenciación de ácidos nucleicos asociados. Los ácidos nucleicos asociados pueden comprender ácidos nucleicos diana. Los ácidos nucleicos asociados pueden comprender una o más etiquetas espaciales, etiquetas diana, etiquetas de muestra, etiquetas de indexación o secuencias de código de barras (p. ej., etiquetas moleculares). Los adaptadores pueden ser lineales. Los adaptadores pueden ser adaptadores preadenilados. Los adaptadores pueden ser de doble o simple hebra. Se pueden ubicar uno o más adaptadores en el extremo 5' o 3' de un ácido nucleico. Cuando los adaptadores comprenden secuencias conocidas en los extremos 5' y 3', las secuencias conocidas pueden ser secuencias iguales o diferentes. Un adaptador ubicado en los extremos 5' y/o 3' de un polinucleótido puede hibridar con uno o más oligonucleótidos inmovilizados en una superficie. Un adaptador puede, en algunas formas de realización, comprender una secuencia universal. Una secuencia universal puede ser una región de secuencia de nucleótidos que es común a dos o más moléculas de ácido nucleico. Las dos o más moléculas de ácido nucleico también pueden tener regiones de diferente secuencia. Así, por ejemplo, los adaptadores 5' pueden comprender secuencias de ácido nucleico idénticas y/o universales y los adaptadores 3' pueden comprender secuencias idénticas y/o universales. Una secuencia universal que puede estar presente en diferentes miembros de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico puede permitir la replicación o amplificación de múltiples secuencias diferentes usando un solo cebador universal que es complementario a la secuencia universal. De manera similar, al menos una, dos (p. ej., un par) o más secuencias universales que pueden estar presentes en diferentes miembros de una colección de moléculas de ácido nucleico pueden permitir la replicación o amplificación de múltiples secuencias diferentes utilizando al menos una, dos (p. ej., un par) o más cebadores universales únicos que son complementarios a las secuencias universales. Por lo tanto, un cebador universal incluye una secuencia que puede hibridarse con dicha secuencia universal. Las moléculas portadoras de la secuencia de ácido nucleico diana pueden modificarse para unir adaptadores universales (p. ej., secuencias de ácido nucleico no diana) a uno o ambos extremos de las diferentes secuencias de ácido nucleico diana. El uno o más cebadores universales unidos al ácido nucleico diana pueden proporcionar sitios para la hibridación de cebadores universales. El uno o más cebadores universales unidos al ácido nucleico diana pueden ser iguales o diferentes entre sí.
[0048] Como se usa en el presente documento, un anticuerpo puede ser una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (p. ej., de origen natural o formada por procesos de recombinación de fragmentos de genes de inmunoglobulina normales) (p. ej., un anticuerpo IgG) o una porción inmunológicamente activa (es decir, que se une específicamente) de una molécula de inmunoglobulina, como un fragmento de anticuerpo.
[0049] En algunas formas de realización, un anticuerpo es un fragmento de anticuerpo funcional. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo puede ser una parte de un anticuerpo tal como F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv y similares. Un fragmento de anticuerpo puede unirse con el mismo antígeno que reconoce el anticuerpo completo. Un fragmento de anticuerpo puede incluir fragmentos aislados que constan de las regiones variables de los anticuerpos, como los fragmentos “Fv” que constan de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y moléculas polipeptídicas de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un conector peptídico (“proteínas scFv”). Los ejemplos de anticuerpos pueden incluir, entre otros, anticuerpos para células cancerosas, anticuerpos para virus, anticuerpos que se unen a receptores de la superficie celular (por ejemplo, CD8, CD34 y CD45) y anticuerpos terapéuticos.
[0050] Como se usa en el presente documento, el término “asociado” o “asociado con” puede significar que dos o más especies son identificables como coubicadas en un punto en el tiempo. Una asociación puede significar que dos o más especies están o estuvieron dentro de un contenedor similar. Una asociación puede ser una asociación informática. Por ejemplo, la información digital sobre dos o más especies se puede almacenar y se puede usar para determinar que una o más de las especies fueron coubicadas en un momento dado. Una asociación también puede ser una asociación física. En algunas formas de realización, dos o más especies asociadas están “atadas”, “unidas” o “inmovilizadas” entre sí o a un sólido común o superficie semisólida. Una asociación puede referirse a medios covalentes o no covalentes para unir etiquetas a soportes sólidos o semisólidos, como perlas. Una asociación puede ser un enlace covalente entre un objetivo y una etiqueta. Una asociación puede comprender la hibridación entre dos moléculas (como una molécula diana y un marcador).
[0051] Como se usa en este documento, el término “complementario” puede referirse a la capacidad para el emparejamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una posición dada de un ácido nucleico es capaz de formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido de otro ácido nucleico, entonces los dos ácidos nucleicos se consideran complementarios entre sí en esa posición. La complementariedad entre dos moléculas de ácido nucleico monocatenario puede ser “parcial”, en la que sólo se unen algunos de los nucleótidos, o puede ser completa cuando existe una complementariedad total entre las moléculas monocatenarias. Se puede decir que una primera secuencia de nucleótidos es el “complemento” de una segunda secuencia si la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a la segunda secuencia de nucleótidos. Se puede decir que una primera secuencia de nucleótidos es el “complemento inverso” de una segunda secuencia, si la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a una secuencia que es inversa (es decir, el orden de los nucleótidos se invierte) de la segunda secuencia. Como se usa en este documento, los términos “complemento”, “complementario” y “complemento inverso” se pueden usar indistintamente. Se entiende a partir de la descripción que, si una molécula puede hibridarse con otra molécula, puede ser el complemento de la molécula la que está hibridando.
[0052] Como se usa en este documento, el término “recuento digital” puede referirse a un método para estimar un número de moléculas diana en una muestra. El conteo digital puede incluir el paso de determinar una cantidad de etiquetas únicas que se han asociado con objetivos en una muestra. Esta metodología, que puede ser de naturaleza estocástica, transforma el problema de contar moléculas de ubicar e identificar moléculas idénticas a una serie de preguntas digitales de sí/no relacionadas con la detección de un conjunto de etiquetas predefinidas.
[0053] Como se usa en el presente documento, el término “marca” o “marcas” puede referirse a códigos de ácido nucleico asociados con un objetivo dentro de una muestra. Una etiqueta puede ser, por ejemplo, una etiqueta de ácido nucleico. Una etiqueta puede ser una etiqueta total o parcialmente amplificable. Una etiqueta puede ser total o parcialmente una etiqueta secuenciable. Un marcador puede ser una porción de un ácido nucleico nativo que es identificable como distinto. Una etiqueta puede ser una secuencia conocida. Un marcador puede comprender una unión de secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, una unión de una secuencia nativa y no nativa. Como se usa en este documento, el término “etiqueta” se puede usar indistintamente con los términos “índice”, “etiqueta” o “etiqueta-etiqueta”. Las etiquetas pueden transmitir información. Por ejemplo, en varias formas de realización, las etiquetas se pueden usar para determinar la identidad de una muestra, una fuente de una muestra, una identidad de una célula y/o un objetivo.
[0054] Como se usa en el presente documento, el término “depósitos que no se agotan” puede referirse a un grupo de códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) compuesto por muchas etiquetas diferentes. Un depósito que no se agota puede comprender un gran número de códigos de barras diferentes, de modo que cuando el depósito que no se agota está asociado con un grupo de objetivos, es probable que cada objetivo esté asociado con un código de barras único. La singularidad de cada molécula diana marcada puede determinarse mediante las estadísticas de elección aleatoria y depende del número de copias de moléculas diana idénticas en la colección en comparación con la diversidad de etiquetas. El tamaño del conjunto resultante de moléculas diana etiquetadas puede determinarse por la naturaleza estocástica del proceso de codificación de barras, y el análisis de la cantidad de códigos de barras detectados permite calcular la cantidad de moléculas diana presentes en la colección o muestra original. Cuando la relación entre el número de copias de una molécula objetivo presente y el número de códigos de barras únicos es bajo, las moléculas objetivo marcadas son altamente únicas (es decir, existe una probabilidad muy baja de que más de una molécula objetivo haya sido marcada con una etiqueta dada).
[0055] Como se usa en el presente documento, el término “ácido nucleico” se refiere a una secuencia de polinucleótidos, o a un fragmento de la misma. Un ácido nucleico puede comprender nucleótidos. Un ácido nucleico puede ser exógeno o endógeno a una célula. Un ácido nucleico puede existir en un entorno libre de células. Un ácido nucleico puede ser un gen o un fragmento del mismo. Un ácido nucleico puede ser ADN. Un ácido nucleico puede ser ARN. Un ácido nucleico puede comprender uno o más análogos (p. ej., estructura alterada, azúcar o nucleobase). Algunos ejemplos no limitativos de análogos incluyen: 5-bromouracilo, ácido nucleico peptídico, ácido xenonucleico, morfolinos, ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nucleicos de glicol, ácidos nucleicos de treosa, didesoxinucleótidos, cordicepina, 7-deaza-GTP, fluoróforos (p. ej., rodamina o fluoresceína unida al azúcar), nucleótidos que contienen tiol, nucleótidos unidos a biotina, análogos de bases fluorescentes, islas CpG, metil-7-guanosina, nucleótidos metilados, inosina, tiouridina, pseudouridina, dihidrouridina, queuosina y wyosina. “Ácido nucleico”, “polinucleótido”, “polinucleótido diana” y “ácido nucleico diana” pueden usarse indistintamente.
[0056] Un ácido nucleico puede comprender una o más modificaciones (p. ej., una modificación de la base, una modificación del esqueleto), para proporcionar al ácido nucleico una característica nueva o mejorada (p. ej., una estabilidad mejorada). Un ácido nucleico puede comprender una etiqueta de afinidad de ácido nucleico. Un nucleósido puede ser una combinación de base y azúcar. La porción de base del nucleósido puede ser una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos pueden ser nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede unirse al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Al formar ácidos nucleicos, los grupos fosfato pueden unir covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de este compuesto polimérico lineal se pueden unir para formar un compuesto circular; sin embargo, los compuestos lineales son generalmente adecuados. Además, los compuestos lineales pueden tener complementariedad de bases de nucleótidos internas y, por lo tanto, pueden plegarse en una manera de producir un compuesto total o parcialmente bicatenario. Dentro de los ácidos nucleicos, los grupos fosfato pueden denominarse comúnmente como formadores del esqueleto internucleósido del ácido nucleico. El enlace o columna vertebral puede ser un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
[0057] Un ácido nucleico puede comprender un esqueleto modificado y/o enlaces internucleosídicos modificados. Los esqueletos modificados pueden incluir aquellos que retienen un átomo de fósforo en el esqueleto y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. Los esqueletos de ácidos nucleicos modificados adecuados que contienen un átomo de fósforo pueden incluir, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, fosfotriésteres de aminoalquilo, metilo y otros fosfonatos de alquilo tales como fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno, fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-amino fosforamidato y aminoalquil fosforamidatos, fosforodiamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos con enlaces 2'-5' y aquellos que tienen polaridad invertida en los que uno o más enlaces entre nucleótidos es un enlace de 3' a 3', de 5' a 5' o de 2' a 2'.
[0058] Un ácido nucleico puede comprender esqueletos de polinucleótidos que están formados por enlaces internucleósidos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleósidos mixtos de heteroátomos y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Éstos pueden incluir aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de riboacetilo; esqueletos que contienen alquenos; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenoimino y metilenohidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen componentes mixtos de N, O, S y CH2.
[0059] Un ácido nucleico puede comprender un mimético de ácido nucleico. El término “mimético” puede incluir polinucleótidos en los que solo el anillo de furanosa o tanto el anillo de furanosa como el enlace entre nucleótidos se reemplazan con grupos que no son furanosa, el reemplazo del anillo de furanosa también puede denominarse como un sustituto de azúcar. La fracción de base heterocíclica o una fracción de base heterocíclica modificada puede mantenerse para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado. Uno de tales ácidos nucleicos puede ser un ácido nucleico peptídico (PNA). En un PNA, el esqueleto de azúcar de un polinucleótido se puede reemplazar con un esqueleto que contiene amida, en particular, un esqueleto de aminoetilglicina. Los nucleótidos se pueden retener y se unen directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la porción de amida del esqueleto. El esqueleto en los compuestos de PNA puede comprender dos o más unidades de aminoetilglicina unidas que dan al PNA un esqueleto que contiene amida. Los restos de base heterocíclicos se pueden unir directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción de amida del esqueleto.
[0060] Un ácido nucleico puede comprender una estructura de esqueleto de morfolino. Por ejemplo, un ácido nucleico puede comprender un anillo de morfolino de 6 miembros en lugar de un anillo de ribosa. En algunas de estas formas de realización, un enlace internucleósido fosforodiamidato u otro no fosfodiéster puede reemplazar un enlace fosfodiéster.
[0061] Un ácido nucleico puede comprender unidades de morfolino unidas (p. ej., ácido nucleico de morfolino) que tienen bases heterocíclicas unidas al anillo de morfolino. Los grupos de unión pueden unir las unidades monoméricas de morfolino en un ácido nucleico de morfolino. Los compuestos oligoméricos basados en morfolino no iónico pueden tener menos interacciones no deseadas con las proteínas celulares. Los polinucleótidos basados en morfolino pueden ser imitadores no iónicos de ácidos nucleicos. Una variedad de compuestos dentro de la clase de morfolino se pueden unir utilizando diferentes grupos de enlace. Una clase adicional de miméticos de polinucleótidos puede denominarse ácidos nucleicos de ciclohexenilo (CeNA). El anillo de furanosa normalmente presente en una molécula de ácido nucleico se puede reemplazar con un anillo de ciclohexenilo. Los monómeros de fosforamidita protegidos con CeNA DMT se pueden preparar y usar para la síntesis de compuestos oligoméricos usando química de fosforamidita. La incorporación de monómeros de CeNA en una cadena de ácido nucleico puede aumentar la estabilidad de un híbrido de ADN/ARN. Los oligoadenilatos de CeNA pueden formar complejos con complementos de ácidos nucleicos con una estabilidad similar a la de los complejos nativos. Una modificación adicional puede incluir ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en los que el grupo 2'-hidroxilo está unido al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar formando así un enlace 2'-C, 4'-coximetileno formando así un resto de azúcar bicíclico. El enlace puede ser un grupo metileno (-CH2), que une el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4' en donde n es 1 o 2. LNA y los análogos de LNA pueden mostrar estabilidades térmicas dúplex muy altas con ácido nucleico complementario (Tm=+ 3 a 10 °C), estabilidad frente a la degradación 3'-exonucleolítica y buenas propiedades de solubilidad.
[0062] Un ácido nucleico también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobase (a menudo denominado simplemente “base”). Como se usa en el presente documento, las bases nitrogenadas “sin modificar” o “naturales” pueden incluir las bases de purina (p. ej., adenina (A) y guanina (G)), y las bases de pirimidina (p. ej., timina (T), citosina (C) y uracilo (U)). Las bases nitrogenadas modificadas pueden incluir otras bases nitrogenadas sintéticas y naturales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-C=C-CH3) uracilo y citosina y demás derivados alquinílicos de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Las nucleobases modificadas pueden incluir pirimidinas tricíclicas como fenoxazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina, citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazina-2(3H)-uno), abrazaderas G como una fenoxazina citadina sustituida (p.ej, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido(5,4-(b) (1,4)benzoxazin-2(3H)-one), fenotiazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazina-2(3H)-uno), abrazaderas G como una fenoxazina citidina sustituida (p.ej, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido(4,5-b)indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido(3',2':4,5)pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona).
[0063] Como se usa en el presente documento, el término “muestra” puede referirse a una composición que comprende dianas. Las muestras adecuadas para el análisis mediante los métodos, dispositivos y sistemas descritos incluyen células, tejidos, órganos u organismos.
[0064] Como se usa en el presente documento, el término “dispositivo de muestreo” o “dispositivo” puede referirse a un dispositivo que puede tomar una sección de una muestra y/o colocar la sección sobre un sustrato. Un dispositivo de muestra puede referirse, por ejemplo, a una máquina de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), una máquina de clasificación de células, una aguja de biopsia, un dispositivo de biopsia, un dispositivo de corte de tejido, un dispositivo de microfluidos, una rejilla de hojas y/o una micrótomo.
[0065] Como se usa en el presente documento, el término “soporte sólido” puede referirse a superficies discretas sólidas o semisólidas a las que se pueden unir una pluralidad de códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos). Un soporte sólido puede abarcar cualquier tipo de esfera, bola, cojinete, cilindro u otra configuración similar sólida, porosa o hueca compuesta de material plástico, cerámico, metálico o polimérico (por ejemplo, hidrogel) sobre el cual se puede inmovilizar un ácido nucleico. (por ejemplo, de forma covalente o no covalente). Un soporte sólido puede comprender una partícula discreta que puede ser esférica (por ejemplo, microesferas) o tener una forma no esférica o irregular, como cúbica, cuboide, piramidal, cilíndrica, cónica, oblonga o en forma de disco, y similares. Una cuenta puede tener forma no esférica. Una pluralidad de soportes sólidos espaciados en una matriz puede no comprender un sustrato. Un soporte sólido se puede usar indistintamente con el término “perla”.
[0066] Como se usa en el presente documento, el término “código de barras estocástico” puede referirse a una secuencia de polinucleótidos que comprende etiquetas de la presente divulgación. Un código de barras estocástico puede ser una secuencia de polinucleótidos que se puede utilizar para la codificación de barras estocástica. Los códigos de barras estocásticos se pueden utilizar para cuantificar objetivos dentro de una muestra. Los códigos de barras estocásticos se pueden usar para controlar los errores que pueden ocurrir después de asociar una etiqueta con un objetivo. Por ejemplo, se puede utilizar un código de barras estocástico para evaluar la amplificación o los errores de secuenciación. Un código de barras estocástico asociado con un objetivo puede denominarse objetivo de código de barras estocástico o objetivo de etiqueta de código de barras estocástico.
[0067] Como se usa en el presente documento, el término “código de barras estocástico específico del gen” puede referirse a una secuencia de polinucleótidos que comprende etiquetas y una región de unión a la diana que es específica del gen. Un código de barras estocástico puede ser una secuencia de polinucleótidos que se puede utilizar para la codificación de barras estocástica. Los códigos de barras estocásticos se pueden utilizar para cuantificar objetivos dentro de una muestra. Los códigos de barras estocásticos se pueden usar para controlar los errores que pueden ocurrir después de asociar una etiqueta con un objetivo. Por ejemplo, se puede utilizar un código de barras estocástico para evaluar la amplificación o los errores de secuenciación. Un código de barras estocástico asociado con un objetivo puede denominarse código de barras-objetivo estocástico o código de barras-etiqueta-objetivo estocástico.
[0068] Como se usa en este documento, el término “código de barras estocástico” puede referirse al marcaje aleatorio (p. ej., código de barras) de ácidos nucleicos. El código de barras estocástico puede utilizar una estrategia de Poisson recursiva para asociar y cuantificar las etiquetas asociadas con los objetivos. Como se usa en este documento, el término “código de barras estocástico” se puede usar indistintamente con “etiquetado estocástico”.
[0069] Como se usa aquí, el término “objetivo” puede referirse a una composición que puede asociarse con un código de barras (p. ej., un código de barras estocástico). Ejemplos de dianas adecuadas para el análisis mediante los métodos, dispositivos y sistemas descritos incluyen oligonucleótidos, ADN, ARN, ARNm, microARN, ARNt y similares. Los objetivos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En algunas formas de realización, los objetivos pueden ser proteínas, péptidos o polipéptidos. En algunas formas de realización, los objetivos son lípidos. Como se usa en este documento, “objetivo” se puede usar indistintamente con “especie”.
[0070] Como se usa en el presente documento, el término “transcriptasas inversas” puede referirse a un grupo de enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa (es decir, que catalizan la síntesis de ADN a partir de un molde de ARN). En general, tales enzimas incluyen, pero no se limitan a transcriptasa inversa retroviral, transcriptasa inversa de retrotransposón, transcriptasas inversas de retroplásmido, transcriptasas inversas de retron, transcriptasas inversas bacterianas, transcriptasa inversa derivada de intrones del grupo II y mutantes, variantes o derivados de las mismas. Las transcriptasas inversas no retrovirales incluyen transcriptasas inversas de retrotransposones no LTR, transcriptasas inversas de retroplásmidos, transcriptasas inversas de retrones y transcriptasas inversas de intrones del grupo II. Los ejemplos de transcriptasas inversas del intrón del grupo II incluyen la transcriptasa inversa del intrón LI.LtrB de Lactococcus lactis, la transcriptasa inversa del intrón Thermosynechococcus elongatus TeI4c o la transcriptasa inversa del intrón Geobacillus stearothermophilus GsI-IIC. Otras clases de transcriptasas inversas pueden incluir muchas clases de transcriptasas inversas no retrovirales (es decir, retrones, intrones del grupo II y retroelementos generadores de diversidad, entre otros).
[0071] Los términos “cebador adaptador universal”, “adaptador de cebador universal” o “secuencia adaptadora universal” se usan indistintamente para referirse a una secuencia de nucleótidos que se puede usar para hibridar con códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) para generar genes específicos. códigos de barras Una secuencia adaptadora universal puede, por ejemplo, ser una secuencia conocida que sea universal en todos los códigos de barras utilizados en los métodos de divulgación. Por ejemplo, cuando se marcan múltiples dianas utilizando los métodos descritos en el presente documento, cada una de las secuencias específicas de la diana puede ser vinculada a la misma secuencia adaptadora universal. En algunas formas de realización, se puede usar más de una secuencia adaptadora universal en los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, cuando se marcan múltiples dianas usando los métodos descritos en el presente documento, al menos dos de las secuencias específicas de la diana se unen a diferentes secuencias adaptadoras universales. Un cebador adaptador universal y su complemento pueden incluirse en dos oligonucleótidos, uno de los cuales comprende una secuencia específica de diana y el otro comprende un código de barras. Por ejemplo, una secuencia adaptadora universal puede ser parte de un oligonucleótido que comprende una secuencia específica de diana para generar una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico diana. Un segundo oligonucleótido que comprende un código de barras y una secuencia complementaria de la secuencia adaptadora universal puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos y generar un código de barras específico del objetivo (p. ej., un código de barras estocástico específico del objetivo). En algunas formas de realización, un cebador adaptador universal tiene una secuencia que es diferente de un cebador PCR universal usado en los métodos de esta descripción.
Códigos de barras
[0072] Los códigos de barras, como los códigos de barras estocásticos, se han descrito, por ejemplo, en Fu et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU., 31 de mayo de 2011, 108 (22): 9026-31; publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° US2011/0160078; Fan et al., Science, 6 de febrero de 2015, 347(6222):1258367; publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° US2015/0299784; y Publicación de Solicitud PCT N.° WO2015/031691. En algunas formas de realización, el código de barras divulgado en el presente documento puede ser un código de barras estocástico que puede ser una secuencia de polinucleótidos que puede usarse para etiquetar estocásticamente (p. ej., código de barras, etiquetar) un objetivo. Los códigos de barras se pueden referir a códigos de barras estocásticos si la proporción del número de secuencias de códigos de barras diferentes de los códigos de barras estocásticos y el número de ocurrencias de cualquiera de los objetivos a etiquetar puede ser, o ser aproximadamente, 1:1, 2:1, 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1,20:1,30:1,40:1,50:1,60:1,70:1,80:1,90:1, 100:1, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. Un objetivo puede ser una especie de ARNm que comprenda moléculas de ARNm con secuencias idénticas o casi idénticas. Los códigos de barras se pueden denominar códigos de barras estocásticos si la proporción del número de secuencias de códigos de barras diferentes de los códigos de barras estocásticos y el número de ocurrencias de cualquiera de los objetivos a etiquetar es al menos, o como máximo, 1:1,2:1, 3 :1,4:1,5 :1,6:1,7 :1,8:1,9 :1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1,20:1, 30:1,40:1,50:1,60:1,70:1, 80:1, 90:1, o 100:1. Las secuencias de códigos de barras de códigos de barras estocásticos pueden denominarse etiquetas moleculares.
[0073] Un código de barras, por ejemplo, un código de barras estocástico puede comprender una o más etiquetas. Los ejemplos de etiquetas pueden incluir una etiqueta universal, una etiqueta de célula, una secuencia de código de barras (p. ej., una etiqueta molecular), una etiqueta de muestra, una etiqueta de placa, una etiqueta espacial y/o una etiqueta preespacial. FIG. 1 ilustra un ejemplo de código de barras 104 con una etiqueta espacial. El código de barras 104 puede comprender una 5'amina que puede vincular el código de barras a un soporte sólido 108. El código de barras puede comprender una etiqueta universal, una etiqueta de dimensión, una etiqueta espacial, una etiqueta celular y/o una etiqueta molecular. El orden de las diferentes etiquetas (incluidas, entre otras, la etiqueta universal, la etiqueta de dimensión, la etiqueta espacial, la etiqueta de célula y la etiqueta de molécula) en el código de barras puede variar. Por ejemplo, como se muestra en la FIG. 1, el marcador universal puede ser el marcador más 5' y el marcador molecular puede ser el marcador más 3'. La etiqueta espacial, la etiqueta de dimensión y la etiqueta de célula pueden estar en cualquier orden. En algunas formas de realización, la etiqueta universal, la etiqueta espacial, la etiqueta de dimensión, la etiqueta de célula y la etiqueta molecular están en cualquier orden. El código de barras puede comprender una región de unión al objetivo. La región de unión al objetivo puede interactuar con un objetivo (p. ej., ácido nucleico objetivo, ARN, ARNm, ADN) en una muestra. Por ejemplo, una región de unión a la diana puede comprender una secuencia de oligo(dT) que puede interactuar con las colas poli(A) de los ARNm. En algunos casos, las etiquetas del código de barras (p. ej., etiqueta universal, etiqueta de dimensión, etiqueta espacial, etiqueta de célula y secuencia de código de barras) pueden estar separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos.
[0074] Una etiqueta, por ejemplo, la etiqueta celular, puede comprender un conjunto único de subsecuencias de ácido nucleico de longitud definida, por ejemplo, siete nucleótidos cada una (equivalente al número de bits utilizados en algunos códigos de corrección de errores de Hamming), que pueden estar diseñado para proporcionar la capacidad de corrección de errores. El conjunto de subsecuencias de corrección de errores comprende siete secuencias de nucleótidos que pueden diseñarse de manera que cualquier combinación de secuencias por pares en el conjunto muestre una “distancia genética” definida (o número de bases no coincidentes), por ejemplo, un conjunto de subsecuencias de corrección de errores. Las secuencias pueden diseñarse para exhibir una distancia genética de tres nucleótidos. En este caso, la revisión de las secuencias de corrección de errores en el conjunto de datos de secuencias para moléculas de ácido nucleico diana marcadas (descritas con más detalle a continuación) puede permitir detectar o corregir errores de amplificación o secuenciación. En algunas formas de realización, la longitud de las subsecuencias de ácido nucleico utilizadas para crear códigos de corrección de errores puede variar, por ejemplo, pueden ser o ser aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 31, 40, 50, o un número o un rango entre dos cualquiera de estos valores, nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, las subsecuencias de ácido nucleico de otras longitudes pueden usarse para crear códigos de corrección de errores.
[0075] Un código de barras puede comprender una región de unión al objetivo. La región de unión al objetivo puede interactuar con un objetivo en una muestra. El objetivo puede ser, o comprender, ácidos ribonucleicos (ARN), ARN mensajeros (ARNm), microARN, pequeños ARN de interferencia (siARN), productos de degradación de ARN, ARN que comprenden cada uno una cola de poli(A), o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de dianas puede incluir ácidos desoxirribonucleicos (ADN).
[0076] En algunas formas de realización, una región de unión a la diana puede comprender una secuencia de oligo (dT) que puede interactuar con las colas poli (A) de los ARNm. Una o más de las etiquetas del código de barras (p. ej., la etiqueta universal, la etiqueta de dimensión, la etiqueta espacial, la etiqueta de célula y las secuencias de código de barras (p. ej., etiqueta molecular)) se pueden separar con un espaciador de otra o dos de las etiquetas restantes del código de barras El espaciador puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, o más nucleótidos. En algunas formas de realización, ninguna de las etiquetas del código de barras está separada por un espaciador.
Etiquetas universales
[0077] Un código de barras puede comprender una o más etiquetas universales. En algunas formas de realización, una o más etiquetas universales pueden ser las mismas para todos los códigos de barras en el conjunto de códigos de barras unidos a un soporte sólido dado. En algunas formas de realización, una o más etiquetas universales pueden ser las mismas para todos los códigos de barras adheridos a una pluralidad de perlas. En algunas formas de realización, un marcador universal puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridarse con un cebador de secuenciación. Los cebadores de secuenciación se pueden utilizar para secuenciar códigos de barras que comprenden una etiqueta universal. Los cebadores de secuenciación (p. ej., cebadores de secuenciación universales) pueden comprender cebadores de secuenciación asociados con plataformas de secuenciación de alto rendimiento. En algunas formas de realización, un marcador universal puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridar con un cebador de PCR. En algunas formas de realización, el marcador universal puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridarse con un cebador de secuenciación y un cebador de PCR. La secuencia de ácido nucleico del marcador universal que es capaz de hibridar con un cebador de secuenciación o de PCR puede denominarse sitio de unión del cebador. Una etiqueta universal puede comprender una secuencia que puede usarse para iniciar la transcripción del código de barras. Una etiqueta universal puede comprender una secuencia que se puede usar para la extensión del código de barras o una región dentro del código de barras. Una etiqueta universal puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos de longitud. Por ejemplo, un marcador universal puede comprender al menos alrededor de 10 nucleótidos. Una etiqueta universal puede tener al menos, o como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, un enlazador escindible o un nucleótido modificado puede formar parte de la secuencia marcadora universal para permitir que el código de barras se escinda del soporte.
Etiquetas de dimensión
[0078] Un código de barras puede comprender una o más etiquetas de dimensión. En algunas formas de realización, una etiqueta de dimensión puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información sobre una dimensión en la que se produjo el marcaje (p. ej., marcaje estocástico). Por ejemplo, una etiqueta de dimensión puede proporcionar información sobre el momento en que se codificó un objetivo. Una etiqueta de dimensión se puede asociar con un tiempo de codificación de barras (p. ej., codificación de barras estocástica) en una muestra. Se puede activar una etiqueta de dimensión en el momento del etiquetado. Se pueden activar diferentes etiquetas de dimensión en diferentes momentos. La etiqueta de dimensión proporciona información sobre el orden en que se codificaron los objetivos, grupos de objetivos y/o muestras. Por ejemplo, se puede codificar una población de células en la fase G0 del ciclo celular. Las células se pueden pulsar de nuevo con códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) en la fase G1 del ciclo celular. Las células se pueden pulsar de nuevo con códigos de barras en la fase S del ciclo celular, y así sucesivamente. Los códigos de barras en cada pulso (por ejemplo, cada fase del ciclo celular) pueden comprender diferentes etiquetas de dimensión. De esta forma, la etiqueta de dimensión proporciona información sobre qué objetivos se etiquetaron en qué fase del ciclo celular. Las etiquetas de dimensión pueden interrogar muchos tiempos biológicos diferentes. Los tiempos biológicos ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a el ciclo celular, la transcripción (p. ej., el inicio de la transcripción) y la degradación de la transcripción. En otro ejemplo, se puede marcar una muestra (p. ej., una célula, una población de células) antes y/o después del tratamiento con un fármaco y/o terapia. Los cambios en el número de copias de distintas dianas pueden ser indicativos de la respuesta de la muestra al fármaco y/o a la terapia.
[0079] Se puede activar una etiqueta de dimensión. Una etiqueta de dimensión activable se puede activar en un punto de tiempo específico. La etiqueta activable puede estar, por ejemplo, activada constitutivamente (por ejemplo, no apagada). La etiqueta de dimensión activable puede activarse, por ejemplo, de forma reversible (por ejemplo, la etiqueta de dimensión activable puede activarse y desactivarse). La etiqueta de dimensión puede ser, por ejemplo, reversiblemente activable al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces. La etiqueta de dimensión se puede activar de forma reversible, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces. En algunas formas de realización, la etiqueta de dimensión se puede activar con fluorescencia, luz, un evento químico (p. ej., escisión, unión de otra molécula, adición de modificaciones (p. ej., pegilado, sumoilado, acetilado, metilado, desacetilado, desmetilado), un evento fotoquímico (p. ej., fotoenjaulamiento) e introducción de un nucleótido no natural.
[0080] La etiqueta de dimensiones puede, en algunas formas de realización, ser idéntica para todos los códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) unidos a un soporte sólido dado (p. ej., una perla), pero diferente para diferentes soportes sólidos (p. ej., perlas). En algunas formas de realización, al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta de dimensión. En algunas formas de realización, al menos el 60 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta de dimensión. En algunas formas de realización, al menos el 95 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta de dimensión.
[0081] Puede haber hasta 106 o más secuencias de etiquetas de dimensiones únicas representadas en una pluralidad de soportes sólidos (p. ej., perlas). Una etiqueta de dimensión puede ser, o ser aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos de longitud. Una etiqueta de dimensión puede tener al menos, o como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos en longitud. El marcador de dimensiones puede comprender entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nucleótidos. Una etiqueta de dimensión puede comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150 nucleótidos. Una etiqueta de dimensión puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 125 nucleótidos de longitud.
Etiquetas espaciales
[0082] Un código de barras puede comprender una o más etiquetas espaciales. En algunas formas de realización, una etiqueta espacial puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información sobre la orientación espacial de una molécula objetivo que está asociada con el código de barras. Una etiqueta espacial se puede asociar con una coordenada en una muestra. La coordenada puede ser una coordenada fija. Por ejemplo, una coordenada se puede fijar en referencia a un sustrato. Una etiqueta espacial puede hacer referencia a una cuadrícula de dos o tres dimensiones. Una coordenada se puede fijar en referencia a un punto de referencia. El punto de referencia puede ser identificable en el espacio. Un punto de referencia puede ser una estructura de la que se puede obtener una imagen. Un punto de referencia puede ser una estructura biológica, por ejemplo, un punto de referencia anatómico. Un punto de referencia puede ser un punto de referencia celular, por ejemplo, un orgánulo. Un hito puede ser un hito no natural, como una estructura con un identificador identificable, como un código de color, un código de barras, una propiedad magnética, fluorescentes, radiactividad o un tamaño o forma únicos. Una etiqueta espacial se puede asociar con una partición física (por ejemplo, un pocillo, un contenedor o una gota). En algunas formas de realización, múltiples etiquetas espaciales se usan juntas para codificar una o más posiciones en el espacio.
[0083] La etiqueta espacial puede ser idéntica para todos los códigos de barras adheridos a un soporte sólido dado (por ejemplo, una perla), pero diferente para diferentes soportes sólidos (por ejemplo, perlas). En algunas formas de realización, el porcentaje de códigos de barras en el mismo soporte sólido que comprende la misma etiqueta espacial puede ser, o ser aproximadamente, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el porcentaje de códigos de barras en el mismo soporte sólido que comprende la misma etiqueta espacial puede ser al menos, o como máximo, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 %, o 100 %. En algunas formas de realización, al menos el 60 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta espacial. En algunas formas de realización, al menos el 95 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta espacial.
[0084] Puede haber hasta 106 o más secuencias de etiquetas espaciales únicas representadas en una pluralidad de soportes sólidos (p. ej., perlas). Una etiqueta espacial puede ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos de longitud. Una etiqueta espacial puede tener al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud. Una etiqueta espacial puede comprender entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nucleótidos. Una etiqueta espacial puede comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150 nucleótidos. Una etiqueta espacial puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 125 nucleótidos de longitud.
Etiquetas de célula
[0085] Un código de barras (por ejemplo, un código de barras estocástico) puede comprender una o más etiquetas de célula. En algunas formas de realización, un marcador celular puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información para determinar qué ácido nucleico diana se originó a partir de qué célula. En algunas formas de realización, la etiqueta de la célula es idéntica para todos los códigos de barras adheridos a un soporte sólido dado (p. ej., una perla), pero diferente para diferentes soportes sólidos (p. ej., perlas). En algunas formas de realización, el porcentaje de códigos de barras en el mismo soporte sólido que comprende la misma etiqueta de célula puede ser aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el porcentaje de códigos de barras en el mismo soporte sólido que comprende la misma etiqueta de célula puede ser de aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % Por ejemplo, al menos el 60 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta de célula. Como otro ejemplo, al menos el 95 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta de célula.
[0086] Puede haber hasta 106 o más secuencias de etiquetas celulares únicas representadas en una pluralidad de soportes sólidos (p. ej., perlas). Una etiqueta de célula puede ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos de longitud. Una etiqueta de célula puede tener al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nucleótidos. Como otro ejemplo, un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150 nucleótidos. Como otro ejemplo más, un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 125 nucleótidos de longitud.
Secuencias de códigos de barras
[0087] Un código de barras puede comprender una o más secuencias de códigos de barras. En algunas formas de realización, una secuencia de código de barras puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información de identificación para el tipo específico de especie de ácido nucleico diana hibridada con el código de barras. Una secuencia de código de barras puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona un contador (p. ej., que proporciona una aproximación aproximada) para la aparición específica de la especie de ácido nucleico objetivo hibridada con el código de barras (p. ej., región de unión al objetivo).
[0088] En algunas formas de realización, un conjunto diverso de secuencias de códigos de barras se une a un soporte sólido dado (por ejemplo, una perla). En algunas formas de realización, puede haber, o haber alrededor de, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, o un número o un rango entre dos cualquiera de estos valores, secuencias marcadoras moleculares únicas. Por ejemplo, una pluralidad de códigos de barras puede comprender aproximadamente 6561 secuencias de códigos de barras con secuencias distintas. Como otro ejemplo, una pluralidad de códigos de barras puede comprender aproximadamente 65536 secuencias de códigos de barras con secuencias distintas. En algunas formas de realización, puede haber al menos, o como máximo, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 o 109, secuencias de código de barras únicas. Las secuencias de etiquetas moleculares únicas se pueden unir a un soporte sólido dado (p. ej., una perla).
[0089] La longitud de un código de barras puede ser diferente en diferentes implementaciones. Por ejemplo, un código de barras puede ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre dos cualesquiera de estos valores, nucleótidos de longitud. Como otro ejemplo, un código de barras puede ser al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud.
Etiquetas moleculares
[0090] Un código de barras (p. ej., un código de barras estocástico) puede comprender una o más etiquetas moleculares. Las etiquetas moleculares pueden incluir secuencias de códigos de barras. En algunas formas de realización, un marcador molecular puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información de identificación para el tipo específico de especie de ácido nucleico diana hibridada con el código de barras. Un marcador molecular puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona un contador para la aparición específica de la especie de ácido nucleico objetivo hibridada con el código de barras (p. ej., región de unión al objetivo).
[0091] En algunas formas de realización, se une un conjunto diverso de etiquetas moleculares a un soporte sólido dado (p. ej., una perla). En algunas formas de realización, puede haber, o haber alrededor de, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, de secuencias marcadoras moleculares únicas. Por ejemplo, una pluralidad de códigos de barras puede comprender alrededor de 6561 etiquetas moleculares con secuencias distintas. Como otro ejemplo, una pluralidad de códigos de barras puede comprender aproximadamente 65536 etiquetas moleculares con secuencias distintas. En algunas formas de realización, puede haber al menos, o como máximo, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 o 109 secuencias marcadoras moleculares únicas. Los códigos de barras con secuencias de etiquetas moleculares únicas se pueden unir a un soporte sólido determinado (p. ej., una perla).
[0092] Para códigos de barras estocásticos que utilizan una pluralidad de códigos de barras estocásticos, la proporción del número de secuencias de etiquetas moleculares diferentes y el número de aparición de cualquiera de los objetivos puede ser, o ser aproximadamente, 1:1,2:1, 3:1,4:1,5:1,6:1,7:1, 8:1,9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. Un objetivo puede ser una especie de ARNm que comprenda moléculas de ARNm con secuencias idénticas o casi idénticas. En algunas formas de realización, la proporción del número de secuencias de etiquetas moleculares diferentes y el número de aparición de cualquiera de los objetivos es al menos, o como máximo, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1,9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1,30:1,40:1,50:1, 60:1,70:1,80:1, 90:1 o 100:1.
[0093] Un marcador molecular puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud. Una etiqueta molecular puede tener al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud.
Región de unión al objetivo
[0094] Un código de barras puede comprender una o más regiones de unión al objetivo, como sondas de captura. En algunas formas de realización, una región de unión al objetivo puede hibridarse con un objetivo de interés. En algunas formas de realización, las regiones de unión a la diana pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que hibrida específicamente con una diana (p. ej., ácido nucleico diana, molécula diana, p. ej., un ácido nucleico celular a analizar), por ejemplo, con una secuencia génica específica. En algunas formas de realización, una región de unión a la diana puede comprender una secuencia de ácido nucleico que se puede unir (p. ej., hibridar) a una ubicación específica de un ácido nucleico diana específico. En algunas formas de realización, la región de unión a la diana puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de una hibridación específica con un sitio de enzima de restricción que sobresale (p. ej., un extremo cohesivo de EcoRI). A continuación, el código de barras se puede ligar a cualquier molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia complementaria al saliente del sitio de restricción.
[0095] En algunas formas de realización, una región de unión a la diana puede comprender una secuencia de ácido nucleico diana no específica. Una secuencia de ácido nucleico diana no específica puede referirse a una secuencia que puede unirse a múltiples ácidos nucleicos diana, independientemente de la secuencia específica del ácido nucleico diana. Por ejemplo, la región de unión a la diana puede comprender una secuencia multimérica aleatoria o una secuencia oligo(dT) que se hibrida con la cola poli(A) en moléculas de ARNm. Una secuencia aleatoria de multímeros puede ser, por ejemplo, una secuencia aleatoria de dímero, trímero, cuátramero, pentámero, hexámero, septámero, octámero, nonámero, decámero o multímero superior de cualquier longitud. En algunas formas de realización, la región de unión del objetivo es la misma para todos los códigos de barras unidos a una perla dada. En algunas formas de realización, las regiones de unión al objetivo para la pluralidad de códigos de barras unidos a una perla dada pueden comprender dos o más secuencias de unión al objetivo diferentes. Una región de unión a la diana puede tener, o tener aproximadamente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos dos valores, de nucleótidos de longitud. Una región de unión a la diana puede tener como máximo aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud.
[0096] En algunas formas de realización, una región de unión a la diana puede comprender un oligo(dT) que puede hibridarse con ARNm que comprenden extremos poliadenilados. Una región de unión a la diana puede ser específica de un gen. Por ejemplo, una región de unión al objetivo puede configurarse para hibridar con una región específica de un objetivo. Una región de unión al objetivo puede ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 2627, 28, 29, 30, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos de longitud. Una región de unión al objetivo puede ser al menos, o como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 2627, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. Una región de unión a la diana puede tener una longitud de aproximadamente 5-30 nucleótidos. Cuando un código de barras comprende una región de unión a la diana específica del gen, el código de barras se puede denominar en el presente documento código de barras específico del gen.
Propiedad de orientación
[0097] Un código de barras estocástico (por ejemplo, un código de barras estocástico) puede comprender una o más propiedades de orientación que pueden usarse para orientar (por ejemplo, alinear) los códigos de barras. Un código de barras puede comprender un resto para enfoque isoeléctrico. Diferentes códigos de barras pueden comprender diferentes puntos de enfoque isoeléctrico. Cuando estos códigos de barras se introducen en una muestra, la muestra puede someterse a enfoque isoeléctrico para orientar los códigos de barras de una manera conocida. De esta forma, la propiedad de orientación se puede utilizar para desarrollar un mapa conocido de códigos de barras en una muestra. Las propiedades de orientación ejemplares pueden incluir movilidad electroforética (p. ej., en base al tamaño del código de barras), punto isoeléctrico, espín, conductividad y/o autoensamblaje. Por ejemplo, los códigos de barras con una propiedad de orientación de autoensamblaje pueden autoensamblarse en una orientación específica (p. ej., nanoestructura de ácido nucleico) tras la activación.
Propiedad de afinidad
[0098] Un código de barras (por ejemplo, un código de barras estocástico) puede comprender una o más propiedades de afinidad. Por ejemplo, una etiqueta espacial puede comprender una propiedad de afinidad. Una propiedad de afinidad puede incluir un resto químico y/o biológico que puede facilitar la unión del código de barras a otra entidad (p. ej., receptor celular). Por ejemplo, una propiedad de afinidad puede comprender un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo específico para un resto específico (p. ej., receptor) en una muestra. En algunas formas de realización, el anticuerpo puede guiar el código de barras a un tipo de célula o molécula específica. Los objetivos en y/o cerca del tipo de célula o molécula específicos pueden marcarse (p. ej., marcarse estocásticamente). La propiedad de afinidad puede, en algunas formas de realización, proporcionar información espacial además de la secuencia de nucleótidos de la etiqueta espacial porque el anticuerpo puede guiar el código de barras a una ubicación específica. El anticuerpo puede ser un anticuerpo terapéutico, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. El anticuerpo puede ser humanizado o quimérico. El anticuerpo puede ser un anticuerpo desnudo o un anticuerpo de fusión.
[0099] El anticuerpo puede ser una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, de origen natural o formada por procesos de recombinación de fragmentos de genes de inmunoglobulina normales) (por ejemplo, un anticuerpo IgG) o una porción inmunológicamente activa (es decir, que se une específicamente) de una molécula de inmunoglobulina, como un fragmento de anticuerpo.
[0100] Un fragmento de anticuerpo puede ser, por ejemplo, una porción de un anticuerpo tal como F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv y similares. En algunas formas de realización, el fragmento de anticuerpo puede unirse con el mismo antígeno que reconoce el anticuerpo de longitud completa. El fragmento de anticuerpo puede incluir fragmentos aislados que constan de las regiones variables de los anticuerpos, como los fragmentos “Fv” que constan de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y moléculas polipeptídicas de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un conector peptídico (“proteínas scFv”). Los ejemplos de anticuerpos pueden incluir, entre otros, anticuerpos para células cancerosas, anticuerpos para virus, anticuerpos que se unen a receptores de la superficie celular (CD8, CD34, CD45) y anticuerpos terapéuticos.
Cebador adaptador universal
[0101] Un código de barras puede comprender uno o más cebadores adaptadores universales. Por ejemplo, un código de barras específico de un gen, tal como un código de barras estocástico específico de un gen, puede comprender un cebador adaptador universal. Un cebador de adaptador universal puede hacer referencia a una secuencia de nucleótidos que es universal en todos los códigos de barras. Se puede utilizar un cebador de adaptador universal para crear códigos de barras específicos de genes. Un cebador de adaptador universal puede ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 2627, 28, 29, 30, o un número o un intervalo de longitud entre cualquiera de estos dos nucleótidos. Un cebador adaptador universal puede ser como mínimo, o como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. Un cebador adaptador universal puede tener una longitud de 5 a 30 nucleótidos.
Enlazador
[0102] Cuando un código de barras comprende más de un tipo de etiqueta (p. ej., más de una etiqueta celular o más de una secuencia de código de barras, como una etiqueta molecular), las etiquetas pueden intercalarse con una secuencia de etiqueta enlazadora. Una secuencia marcadora enlazadora puede tener al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Una secuencia marcadora enlazadora puede tener como máximo aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunos casos, una secuencia marcadora enlazadora tiene una longitud de 12 nucleótidos. Se puede utilizar una secuencia de etiquetas enlazadoras para facilitar la síntesis del código de barras. La etiqueta del enlazador puede comprender un código de corrección de errores (por ejemplo, Hamming).
Soportes sólidos
[0103] Los códigos de barras, como los códigos de barras estocásticos, aquí descritos pueden, en algunas formas de realización, estar asociados con un soporte sólido. El soporte sólido puede ser, por ejemplo, una partícula sintética. En algunas formas de realización, algunas o todas las secuencias de códigos de barras, tales como etiquetas moleculares para códigos de barras estocásticos (p. ej., las primeras secuencias de códigos de barras) de una pluralidad de códigos de barras (p. ej., la primera pluralidad de códigos de barras) en un soporte sólido difieren en al menos un nucleótido Las etiquetas de las células de los códigos de barras sobre un mismo soporte sólido pueden ser las mismas. Las etiquetas de las células de los códigos de barras en diferentes soportes sólidos pueden diferir en al menos un nucleótido. Por ejemplo, las primeras etiquetas de célula de una primera pluralidad de códigos de barras en un primer soporte sólido pueden tener el mismo y las segundas etiquetas de célula de una segunda pluralidad de códigos de barras en un segundo soporte sólido pueden tener la misma secuencia. Las primeras etiquetas de célula de la primera pluralidad de códigos de barras en el primer soporte sólido y las segundas etiquetas de célula de la segunda pluralidad de códigos de barras en el segundo soporte sólido pueden diferir en al menos un nucleótido. Un marcador celular puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5-20 nucleótidos. Una secuencia de código de barras puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5-20 nucleótidos. La partícula sintética puede ser, por ejemplo, una perla.
[0104] La perla puede ser, por ejemplo, una perla de gel de sílice, una perla de vidrio de poro controlado, una perla magnética, una Dynabead, una perla de Sephadex/Sepharose, una perla de celulosa, una perla de poliestireno o cualquier combinación de las mismas. La perla puede comprender un material como polidimetilsiloxano (PDMS), poliestireno, vidrio, polipropileno, agarosa, gelatina, hidrogel, paramagnético, cerámico, plástico, vidrio, metilestireno, polímero acrílico, titanio, látex, sefarosa, celulosa, nailon, silicona, o cualquier combinación de los mismos.
[0105] En algunas formas de realización, la perla puede ser una perla polimérica, por ejemplo, una perla deformable o una perla de gel, funcionalizada con códigos de barras o códigos de barras estocásticos (como perlas de gel de 10X Genomics (San Francisco, CA). En alguna implementación, una perla de gel puede comprender geles a base de polímeros. Las perlas de gel se pueden generar, por ejemplo, encapsulando uno o más precursores poliméricos en gotitas. Tras la exposición de los precursores poliméricos a un acelerador (p. ej., tetrametiletilendiamina (TEMED)), se puede generar una perla de gel.
[0106] En algunas formas de realización, la partícula puede ser degradable. Por ejemplo, la perla polimérica se puede disolver, fundir o degradar, por ejemplo, en las condiciones deseadas. La condición deseada puede incluir una condición ambiental. La condición deseada puede dar como resultado que la perla polimérica se disuelva, funda o degrade de manera controlada. Una perla de gel puede disolverse, derretirse o degradarse debido a un estímulo químico, un estímulo físico, un estímulo biológico, un estímulo térmico, un estímulo magnético, un estímulo eléctrico, un estímulo de luz o cualquier combinación de los mismos.
[0107] Los analitos y/o reactivos, como códigos de barras de oligonucleótidos, por ejemplo, pueden acoplarse/inmovilizarse a la superficie interior de una perla de gel (p. ej., el interior accesible mediante la difusión de un código de barras de oligonucleótidos y/o materiales utilizados para generar un código de barras de oligonucleótidos) y/o la superficie exterior de una perla de gel o cualquier otra microcápsula descrita en este documento. El acoplamiento/inmovilización puede ser a través de cualquier forma de enlace químico (p. ej., enlace covalente, enlace iónico) o fenómenos físicos (p. ej., fuerzas de Van der Waals, interacciones dipolo-dipolo, etc.). En algunas formas de realización, el acoplamiento/inmovilización de un reactivo a una perla de gel o cualquier otra microcápsula descrita en este documento puede ser reversible, como, por ejemplo, a través de un resto lábil (p. ej., a través de un reticulante químico, incluidos los reticulantes químicos descritos en este documento). Tras la aplicación de un estímulo, el resto lábil puede escindirse y el reactivo inmovilizado puede liberarse. En algunas formas de realización, el resto lábil es un enlace disulfuro. Por ejemplo, en el caso de que un código de barras de oligonucleótido se inmovilice en una perla de gel a través de un enlace disulfuro, la exposición del enlace disulfuro a un agente reductor puede romper el enlace disulfuro y liberar el código de barras del oligonucleótido de la perla. El resto lábil puede incluirse como parte de una perla de gel o microcápsula, como parte de un enlazador químico que une un reactivo o analito a una perla de gel o microcápsula y/o como parte de un reactivo o analito. En algunas formas de realización, al menos un código de barras de la pluralidad de códigos de barras puede inmovilizarse en la partícula, inmovilizarse parcialmente en la partícula, encerrarse en la partícula, encerrarse parcialmente en la partícula o cualquier combinación de los mismos.
[0108] En algunas formas de realización, una perla de gel puede comprender una amplia gama de diferentes polímeros que incluyen, entre otros: polímeros, polímeros sensibles al calor, polímeros fotosensibles, polímeros magnéticos, polímeros sensibles al pH, polímeros sensibles a la sal, polímeros químicamente sensibles, polielectrolitos, polisacáridos, péptidos, proteínas y/o plásticos. Los polímeros pueden incluir, entre otros, materiales como poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm), poli(sulfonato de estireno) (PSS), poli(alilamina) (PAAm), poli(ácido acrílico) (PAA), poli(etilenimina) (PEI), poli(cloruro de dialildimetilamonio) (PDa Dm a C), poli(pirola) (PPy), poli(vinilpirrolidona) (pVPo N), poli(vinilpiridina) (PVP), poli(ácido metacrílico) (PMAA)), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poliestireno (PS), poli(tetrahidrofurano) (PTHF), poli(ftaladehído) (PTHf ), poli(hexilviológeno) (PHV), poli(L-lisina) (PLL), poli (L-arginina) (PARG), poli(ácido lácticocoglicólico) (PLGA).
[0109] Numerosos estímulos químicos para desencadenar la rotura, disolución o degradación de las perlas. Los ejemplos de estos cambios químicos pueden incluir, entre otros, cambios mediados por el pH en la pared de la perla, desintegración de la pared de la perla a través de la escisión química de los enlaces de reticulación, despolimerización desencadenada de la pared de la perla y reacciones de cambio de pared de la perla. También se pueden usar cambios de volumen para desencadenar la interrupción de las perlas.
[0110] Cambios a granel o físicos en la microcápsula a través de diversos estímulos también ofrecen muchas ventajas en diseñar cápsulas para liberar reactivos. Los cambios físicos o masivos ocurren en una escala macroscópica, en la que la ruptura de las perlas es el resultado de fuerzas mecanofísicas inducidas por un estímulo. Estos procesos pueden incluir, entre otros, ruptura inducida por presión, fusión de la pared de la perla o cambios en la porosidad de la pared de la perla.
[0111] También se pueden usar estímulos biológicos para desencadenar la alteración, disolución o degradación de las perlas. En general, los desencadenantes biológicos se parecen a los desencadenantes químicos, pero muchos ejemplos utilizan biomoléculas o moléculas que se encuentran comúnmente en los sistemas vivos, como enzimas, péptidos, sacáridos, ácidos grasos, ácidos nucleicos y similares. Por ejemplo, las perlas pueden comprender polímeros con enlaces cruzados de péptidos que son sensibles a la escisión por proteasas específicas. Más específicamente, un ejemplo puede comprender una microcápsula que comprende enlaces cruzados de péptido GFLGK. Tras la adición de un activador biológico como la proteasa catepsina B, los enlaces cruzados peptídicos del pocilio de la cubierta se escinden y se libera el contenido de las perlas. En otros casos, las proteasas pueden activarse por calor. En otro ejemplo, las perlas comprenden una pared de cubierta que comprende celulosa. La adición de la enzima hidrolítica quitosano sirve como desencadenante biológico para la escisión de los enlaces celulósicos, la despolimerización de la pared de la cubierta y la liberación de su contenido interno.
[0112] También se puede inducir a las perlas a que liberen su contenido tras la aplicación de un estímulo térmico. Un cambio de temperatura puede causar una variedad de cambios en las cuentas. Un cambio en el calor puede provocar la fusión de una perla de tal manera que la pared de la perla se desintegre. En otros casos, el calor puede aumentar la presión interna de los componentes internos de la perla de manera que la perla se rompa o explote. En otros casos, el calor puede transformar la perla en un estado deshidratado y encogido. El calor también puede actuar sobre polímeros sensibles al calor dentro de la pared de una perla para provocar la ruptura de la perla.
[0113] La inclusión de nanopartículas magnéticas en la pared de la perla de las microcápsulas puede permitir la ruptura provocada de las perlas, así como guiar las perlas en una matriz. Un dispositivo de esta divulgación puede comprender perlas magnéticas para cualquier propósito. En un ejemplo, la incorporación de nanopartículas de Fe3Ü4 en perlas que contienen polielectrolitos desencadena la ruptura en presencia de un estímulo de campo magnético oscilante.
[0114] Una perla también puede romperse, disolverse o degradarse como resultado de la estimulación eléctrica. De manera similar a las partículas magnéticas descritas en la sección anterior, las perlas eléctricamente sensibles pueden permitir tanto la ruptura desencadenada de las perlas como otras funciones, como la alineación en un campo eléctrico, la conductividad eléctrica o las reacciones redox. En un ejemplo, las perlas que contienen material eléctricamente sensible se alinean en un campo eléctrico de manera que se puede controlar la liberación de los reactivos internos. En otros ejemplos, los campos eléctricos pueden inducir reacciones redox dentro de la propia pared de la perla que pueden aumentar la porosidad.
[0115] También se puede usar un estímulo de luz para romper las perlas. Numerosos activadores de luz son posibles y pueden incluir sistemas que usan varias moléculas, como nanopartículas y cromóforos, capaces de absorber fotones de rangos específicos de longitudes de onda. Por ejemplo, los recubrimientos de óxido de metal se pueden usar como disparadores de cápsulas. La irradiación UV de las cápsulas de polielectrolito recubiertas con SiÜ2 puede provocar la desintegración de la pared de la perla. En otro ejemplo más, pueden incorporarse en la pared de la perla materiales fotoconmutables tales como grupos azobenceno. Tras la aplicación de luz UV o visible, los productos químicos como estos experimentan una isomerización reversible de cis a trans tras la absorción de fotones. En este aspecto, la incorporación de interruptores de fotones da como resultado una pared de perlas que puede desintegrarse o volverse más porosa con la aplicación de un disparador de luz.
[0116] Por ejemplo, en un ejemplo no limitativo de código de barras (p. ej., código de barras estocástico) ilustrado en la FIG. 2, después de introducir células tales como células individuales en una pluralidad de micropocillos de una matriz de micropocillos en el bloque 208, se pueden introducir perlas en la pluralidad de micropocillos de la matriz de micropocillos en el bloque 212. Cada micropocillo puede comprender una perla. Las perlas pueden comprender una pluralidad de códigos de barras. Un código de barras puede comprender una región de amina 5' unida a una perla. El código de barras puede comprender una etiqueta universal, una secuencia de código de barras (p. ej., una etiqueta molecular), una región de unión al objetivo o cualquier combinación de los mismos.
[0117] Los códigos de barras divulgados en este documento pueden asociarse con (p. ej., unirse a) un soporte sólido (p. ej., una perla). Los códigos de barras asociados con un soporte sólido pueden comprender cada uno una secuencia de códigos de barras seleccionada de un grupo que comprende al menos 100 o 1000 secuencias de códigos de barras con secuencias únicas. En algunas formas de realización, diferentes códigos de barras asociados con un soporte sólido pueden comprender códigos de barras con diferentes secuencias. En algunas formas de realización, un porcentaje de códigos de barras asociados con un soporte sólido comprende la misma etiqueta de célula. Por ejemplo, el porcentaje puede ser, o estar alrededor del 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. Como otro ejemplo, el porcentaje puede ser como mínimo o como máximo 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 %. En algunas formas de realización, los códigos de barras asociados con un soporte sólido pueden tener la misma etiqueta de célula. Los códigos de barras asociados con diferentes soportes sólidos pueden tener diferentes etiquetas de células seleccionadas de un grupo que comprende al menos 100 o 1000 etiquetas de células con secuencias únicas.
[0118] Los códigos de barras divulgados en este documento pueden asociarse a (p. ej., unirse a) un soporte sólido (p. ej., una perla). En algunas formas de realización, la codificación de barras de la pluralidad de objetivos en la muestra se puede realizar con un soporte sólido que incluye una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras. En algunas formas de realización, el soporte sólido puede incluir una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras. Las etiquetas espaciales de la pluralidad de códigos de barras sobre diferentes soportes sólidos pueden diferir en al menos un nucleótido. El soporte sólido puede, por ejemplo, incluir la pluralidad de códigos de barras en dos dimensiones o en tres dimensiones. Las partículas sintéticas pueden ser perlas. Las perlas pueden ser perlas de gel de sílice, perlas de vidrio de poro controlado, perlas magnéticas, Dynabeads, perlas de Sephadex/Sepharose, perlas de celulosa, perlas de poliestireno o cualquier combinación de las mismas. El soporte sólido puede incluir un polímero, una matriz, un hidrogel, un dispositivo de matriz de agujas, un anticuerpo o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, los soportes sólidos pueden flotar libremente. En algunas formas de realización, los soportes sólidos se pueden incrustar en una matriz semisólida o sólida. Los códigos de barras no pueden estar asociados a soportes sólidos. Los códigos de barras pueden ser nucleótidos individuales. Los códigos de barras se pueden asociar a un sustrato.
[0119] Como se usa en este documento, los términos “atado”, “unido” e “inmovilizado” se usan indistintamente y pueden referirse a medios covalentes o no covalentes para unir códigos de barras a un soporte sólido. Cualquiera de una variedad de diferentes soportes sólidos se puede utilizar como soporte sólido para adjuntar códigos de barras presintetizados o para síntesis de fase sólida in situ de código de barras.
[0120] En algunas formas de realización, el soporte sólido es una perla. La perla puede comprender uno o más tipos de esfera sólida, porosa o hueca, bola, cojinete, cilindro u otra configuración similar en la que se puede inmovilizar un ácido nucleico (p. ej., de forma covalente o no covalente). La perla puede estar compuesta, por ejemplo, de plástico, cerámica, metal, material polimérico o cualquier combinación de los mismos. Una perla puede ser, o comprender, una partícula discreta que es esférica (por ejemplo, microesferas) o que tiene una forma no esférica o irregular, como cúbica, cuboide, piramidal, cilíndrica, cónica, oblonga o en forma de disco y similares. En algunas formas de realización, una perla puede tener una forma no esférica.
[0121] Las perlas pueden comprender una variedad de materiales que incluyen, entre otros, materiales paramagnéticos (p. ej., magnesio, molibdeno, litio y tántalo), materiales superparamagnéticos (p. ej., nanopartículas de ferrita (Fe3O4; magnetita), materiales ferromagnéticos (p. ej.,, hierro, níquel, cobalto, algunas de sus aleaciones y algunos compuestos de metales de tierras raras), cerámica, plástico, vidrio, poliestireno, sílice, metilestireno, polímeros acrílicos, titanio, látex, sefarosa, agarosa, hidrogel, polímero, celulosa, nailon, o cualquier combinación de los mismos.
[0122] En algunas formas de realización, la perla (p. ej., la perla a la que se unen las etiquetas) es una perla de hidrogel. En algunas formas de realización, la perla comprende hidrogel.
[0123] Algunas formas de realización descritas en este documento incluyen una o más partículas (por ejemplo, perlas). Cada una de las partículas puede comprender una pluralidad de oligonucleótidos (p. ej., códigos de barras). Cada uno de la pluralidad de oligonucleótidos puede comprender una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de marca molecular), una marca celular y una región de unión a la diana (p. ej., una secuencia de oligo(dT), una secuencia específica de gen, un multímero aleatorio, o una combinación de los mismos). La secuencia del marcador celular de cada uno de la pluralidad de oligonucleótidos puede ser la misma. Las secuencias de etiquetas de células de oligonucleótidos en diferentes partículas pueden ser diferentes de modo que se puedan identificar los oligonucleótidos en diferentes partículas. El número de secuencias de etiquetas de células diferentes puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de secuencias de etiquetas celulares puede ser, o ser aproximadamente 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108, 109, un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, o más. En algunas formas de realización, el número de secuencias de etiquetas celulares puede ser al menos, o como máximo 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108 o 109. En algunas formas de realización, no más de 1, 2, 3, 45, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 más de la pluralidad de partículas incluyen oligonucleótidos con la misma secuencia celular. En alguna forma de realización, la pluralidad de partículas que incluyen oligonucleótidos con la misma secuencia celular puede ser como máximo 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 % o más. En algunas formas de realización, ninguna de la pluralidad de partículas tiene la misma secuencia de marcador celular.
[0124] La pluralidad de oligonucleótidos en cada partícula puede comprender diferentes secuencias de código de barras (por ejemplo, etiquetas moleculares). En algunas formas de realización, el número de secuencias de código de barras puede ser, o ser aproximadamente 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108, 109, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de secuencias de código de barras puede ser al menos o como máximo 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108 o 109. Por ejemplo, al menos 100 del plural La identidad de los oligonucleótidos comprende diferentes secuencias de códigos de barras. Como otro ejemplo, en una sola partícula, al menos 100, 500, 1000, 5000, 10000, 15000, 20000, 50000, un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, o más de la pluralidad de oligonucleótidos comprenden diferentes secuencias de código de barras. Algunas formas de realización proporcionan una pluralidad de partículas que comprenden códigos de barras. En algunas formas de realización, la proporción de una ocurrencia (o una copia o un número) de un objetivo a etiquetar y las diferentes secuencias de códigos de barras pueden ser al menos 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1: 5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 o más. En algunas formas de realización, cada uno de la pluralidad de oligonucleótidos comprende además un marcador de muestra, un marcador universal o ambos. La partícula puede ser, por ejemplo, una nanopartícula o una micropartícula.
[0125] El tamaño de las perlas puede variar. Por ejemplo, el diámetro de la perla puede oscilar entre 0,1 micrómetros y 50 micrómetros. En algunas formas de realización, el diámetro de la perla puede ser, o es aproximadamente, 0,1,0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 micrómetros, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores.
[0126] El diámetro de la perla se puede relacionar con el diámetro de los pocillos del sustrato. En algunas formas de realización, el diámetro de la perla puede ser, o es aproximadamente, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, más largo o más corto que el diámetro del pocillo. El diámetro de las perlas se puede relacionar con el diámetro de una célula (p. ej., una única célula atrapada en un pocillo del sustrato). En algunas formas de realización, el diámetro de la perla puede ser al menos, o como máximo, un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % más largo o menor que el diámetro del pocillo. El diámetro de las perlas se puede relacionar con el diámetro de una célula (p. ej., una única célula atrapada en un pocillo del sustrato). En algunas formas de realización, el diámetro de la perla puede ser, o ser aproximadamente, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, más largos o más cortos que el diámetro de la célula. En algunas formas de realización, el diámetro de las perlas puede ser al menos, o como máximo, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 % o 300 % más largo o más corto que el diámetro de la célula.
[0127] Una perla se puede unir y/o incrustar en un sustrato. Una perla se puede unir y/o incrustar en un gel, hidrogel, polímero y/o matriz. La posición espacial de una perla dentro de un sustrato (p. ej., gel, matriz, armazón o polímero) se puede identificar utilizando la etiqueta espacial presente en el código de barras de la perla que puede servir como dirección de ubicación.
[0128] Los ejemplos de perlas pueden incluir, entre otros, perlas de estreptavidina, perlas de agarosa, perlas magnéticas, Dynabeads®, microperlas MACS®, perlas conjugadas con anticuerpos (por ejemplo, microperlas anti-inmunoglobulina), perlas conjugadas con proteína A, perlas conjugadas con proteína G, perlas conjugadas con proteína NG, perlas conjugadas con proteína L, perlas conjugadas con oligo(dT), perlas de sílice, perlas similares a la sílice, microperlas antibiotina, microperlas antifluorocromo y perlas magnéticas terminadas en carboxilo BcMag™.
[0129] Una perla se puede asociar con (por ejemplo, impregnarse con) puntos cuánticos o tintes fluorescentes para hacerla fluorescente en un canal óptico de fluorescencia o múltiples canales ópticos. Una perla se puede asociar con óxido de hierro u óxido de cromo para hacerla paramagnética o ferromagnética. Las cuentas pueden ser identificables. Por ejemplo, se puede obtener una imagen de una cuenta usando una cámara. Una perla puede tener un código detectable asociado con la perla. Por ejemplo, una cuenta puede comprender un código de barras. Una perla puede cambiar de tamaño, por ejemplo, debido al hinchamiento en una solución orgánica o inorgánica. Una perla puede ser hidrófoba. Una perla puede ser hidrófila. Una perla puede ser biocompatible.
[0130] Se puede visualizar un soporte sólido (por ejemplo, una perla). El soporte sólido puede comprender una etiqueta de visualización (p. ej., un tinte fluorescente). Un soporte sólido (p. ej., una cuenta) se puede grabar con un identificador (p. ej., un número). El identificador se puede visualizar a través de imágenes de las cuentas.
[0131] Un soporte sólido puede comprender un material insoluble, semisoluble o insoluble. Se puede hacer referencia a un soporte sólido como “funcionalizado” cuando incluye un enlazador, un andamio, un bloque de construcción u otro resto reactivo unido al mismo, mientras que un soporte sólido puede estar “no funcionalizado” cuando carece de dicho resto reactivo unido al mismo. El soporte sólido puede emplearse libre en solución, como en un formato de pocillo de microtitulación; en un formato continuo, como en una columna; o en una varilla.
[0132] El soporte sólido puede comprender una membrana, papel, plástico, superficie recubierta, superficie plana, vidrio, portaobjetos, chip o cualquier combinación de los mismos. Un soporte sólido puede tomar la forma de resinas, geles, microesferas u otras configuraciones geométricas. Un soporte sólido puede comprender chips de sílice, micropartículas, nanopartículas, placas, matrices, capilares, soportes planos como filtros de fibra de vidrio, superficies de vidrio, superficies metálicas (acero, oro, plata, aluminio, silicio y cobre), soportes de vidrio, soportes de plástico, soportes de silicona, chips, filtros, membranas, placas de micropocillos, portaobjetos, materiales plásticos, incluidas placas o membranas de pocillos múltiples (p. ej., formadas de polietileno, polipropileno, poliamida, difluoruro de polivinilideno) y/u obleas, peines, alfileres o agujas (p. ej., matrices de clavijas adecuadas para síntesis o análisis combinatorios) o perlas en una serie de hoyos o pocillos de nanolitros de superficies planas tales como obleas (p. ej., obleas de silicio), obleas con hoyos con o sin fondo de filtro.
[0133] El soporte sólido puede comprender una matriz de polímero (por ejemplo, gel, hidrogel). La matriz de polímero puede penetrar en el espacio intracelular (p. ej., alrededor de los orgánulos). La matriz polimérica puede bombearse por todo el sistema circulatorio.
Sustratos y matriz de micropocillos
[0134] Como se usa en el presente documento, un sustrato puede referirse a un tipo de soporte sólido. Un sustrato puede referirse a un soporte sólido que puede comprender códigos de barras o códigos de barras estocásticos de la divulgación.
Un sustrato puede, por ejemplo, comprender una pluralidad de micropocillos. Por ejemplo, un sustrato puede ser una matriz de pocillos que comprende dos o más micropocillos. En algunas formas de realización, un micropocillo puede comprender una pequeña cámara de reacción de volumen definido. En algunas formas de realización, un micropocillo puede atrapar una o más células. En algunas formas de realización, un micropocillo puede atrapar solo una célula. En algunas formas de realización, un micropocillo puede atrapar uno o más soportes sólidos. En algunas formas de realización, un micropocillo puede atrapar solo un soporte sólido. En algunas formas de realización, un micropocillo atrapa una única célula y un único soporte sólido (p. ej., una perla). Un micropocillo puede comprender reactivos de código de barras de la divulgación.
Métodos de codificación de barras
[0135] La descripción proporciona métodos para estimar el número de objetivos distintos en ubicaciones distintas en una muestra física (p. ej., tejido, órgano, tumor, célula). Los métodos pueden comprender colocar códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos) muy cerca de la muestra, lisar la muestra, asociar distintos objetivos con los códigos de barras, amplificar los objetivos y/o contar digitalmente los objetivos. El método puede comprender además analizar y/o visualizar la información obtenida de las etiquetas espaciales en los códigos de barras. En algunas formas de realización, un método comprende visualizar la pluralidad de objetivos en la muestra. Mapear la pluralidad de objetivos sobre el mapa de la muestra puede incluir generar un mapa bidimensional o un mapa tridimensional de la muestra. El mapa bidimensional y el mapa tridimensional pueden generarse antes o después de codificar con barras (por ejemplo, codificar con barras estocásticamente) la pluralidad de objetivos en la muestra. La visualización de la pluralidad de objetivos en la muestra puede incluir mapear la pluralidad de objetivos en un mapa de la muestra. Mapear la pluralidad de objetivos sobre el mapa de la muestra puede incluir generar un mapa bidimensional o un mapa tridimensional de la muestra. El mapa bidimensional y el mapa tridimensional se pueden generar antes o después de codificar con barras la pluralidad de objetivos en la muestra. en algunas formas de realización, el mapa bidimensional y el mapa tridimensional pueden generarse antes o después de lisar la muestra. El lisado de la muestra antes o después de generar el mapa bidimensional o el mapa tridimensional puede incluir calentar la muestra, poner la muestra en contacto con un detergente, cambiar el pH de la muestra o cualquier combinación de los mismos.
[0136] En algunas formas de realización, codificar con barras la pluralidad de objetivos comprende hibridar una pluralidad de códigos de barras con una pluralidad de objetivos para crear objetivos con código de barras (por ejemplo, objetivos con código de barras estocástico). Codificar con barras la pluralidad de objetivos puede comprender generar una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras. La generación de una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras se puede realizar con un soporte sólido que comprenda la pluralidad de códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos).
Poner en contacto una muestra y un código de barras
[0137] La divulgación proporciona métodos para poner en contacto una muestra (p. ej., células) con un sustrato de la divulgación. Una muestra que comprende, por ejemplo, una sección delgada de célula, órgano o tejido puede ponerse en contacto con códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos). Las células pueden ponerse en contacto, por ejemplo, mediante flujo por gravedad, en donde las células pueden asentarse y crear una monocapa. La muestra puede ser una sección delgada de tejido. La sección delgada se puede colocar sobre el sustrato. La muestra puede ser unidimensional (p. ej., forma una superficie plana). La muestra (p. ej., células) se puede esparcir por el sustrato, por ejemplo, haciendo crecer/cultivando las células sobre el sustrato.
[0138] Cuando los códigos de barras están muy cerca de los objetivos, los objetivos pueden hibridarse con el código de barras. Los códigos de barras se pueden contactar en una proporción no agotable de modo que cada objetivo distinto se pueda asociar con un código de barras distinto de la divulgación. Para asegurar una asociación eficiente entre el objetivo y el código de barras, los objetivos se pueden entrecruzar con el código de barras.
Lisis celular
[0139] Después de la distribución de células y códigos de barras, las células pueden lisarse para liberar las moléculas diana. La lisis celular se puede lograr por cualquiera de una variedad de medios, por ejemplo, por medios químicos o bioquímicos, por choque osmótico o por medio de lisis térmica, lisis mecánica o lisis óptica. Las células se pueden lisar mediante la adición de un tampón de lisis celular que comprende un detergente (p. ej., SDS, sulfato de dodecil Li, Triton X-100, Tween-20 o NP-40), un disolvente orgánico (p. ej., metanol o acetona) o enzimas digestivas (p. ej., proteinasa K, pepsina o tripsina), o cualquier combinación de las mismas. Para aumentar la asociación de un objetivo y un código de barras, la tasa de difusión de las moléculas objetivo puede alterarse, por ejemplo, reduciendo la temperatura y/o aumentando la viscosidad del lisado.
[0140] En algunas formas de realización, la muestra se puede lisar utilizando un papel de filtro. El papel de filtro se puede empapar con un tampón de lisis encima del papel de filtro. El papel de filtro se puede aplicar a la muestra con presión, lo que puede facilitar la lisis de la muestra y la hibridación de las dianas de la muestra con el sustrato.
[0141] En algunas formas de realización, la lisis se puede realizar mediante lisis mecánica, lisis por calor, lisis óptica y/o lisis química. La lisis química puede incluir el uso de enzimas digestivas como proteinasa K, pepsina y tripsina. La lisis se puede realizar mediante la adición de un tampón de lisis al sustrato. Un tampón de lisis puede comprender Tris HCl. Un tampón de lisis puede comprender al menos aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 o 1 M o más de Tris HCl. Un tampón de lisis puede comprender como máximo aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1,0,5 o 1 M o más de Tris HCL. Un tampón de lisis puede comprender Tris HCl aproximadamente 0,1 M. El pH del tampón de lisis puede ser al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. El pH del tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. En algunas formas de realización, el pH del tampón de lisis es de aproximadamente 7,5. El tampón de lisis puede comprender una sal (p. ej., LiCl). La concentración de sal en el tampón de lisis puede ser al menos aproximadamente 0,1, 0,5 o 1 M o más. La concentración de sal en el tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 0,1, 0,5 o 1 M o más. En algunas formas de realización, la concentración de sal en el tampón de lisis es de aproximadamente 0,5 M. El tampón de lisis puede comprender un detergente (p. ej., SDS, sulfato de dodecil Li, triton X, tween, NP-40). La concentración del detergente en el tampón de lisis puede ser de al menos aproximadamente 0,0001 %, 0,0005 %, 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 % o 7 %, o más. La concentración del detergente en el tampón de lisis puede ser como máximo del 0,0001 %, 0,0005 %, 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 % o 7 %, o más. En algunas formas de realización, la concentración del detergente en el tampón de lisis es de aproximadamente 1 % de sulfato de dodecil Li. El tiempo utilizado en el método de lisis puede depender de la cantidad de detergente utilizada. En algunas formas de realización, cuanto más detergente se usa, menos tiempo se necesita para la lisis. El tampón de lisis puede comprender un agente quelante (p. ej., EDTA, EGTA). La concentración de un agente quelante en el tampón de lisis puede ser de al menos aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 mM o más. La concentración de un agente quelante en el tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 mM o más. En algunas formas de realización, la concentración de agente quelante en el tampón de lisis es de aproximadamente 10 mM. El tampón de lisis puede comprender un reactivo reductor (p. ej., beta-mercaptoetanol, DTT). La concentración del reactivo reductor en el tampón de lisis puede ser al menos aproximadamente 1, 5, 10, 15 o 20 mM o más. La concentración del reactivo reductor en el tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 1,5, 10, 15 o 20 mM o más. En algunas formas de realización, la concentración de reactivo reductor en el tampón de lisis es de aproximadamente 5 mM. En algunas formas de realización, un tampón de lisis puede comprender TrisHCl aproximadamente 0,1 M, pH aproximadamente 7,5, LiCl aproximadamente 0,5 M, dodecilsulfato de litio aproximadamente al 1 %, EDTA aproximadamente 10 mM y DTT aproximadamente 5 mM.
[0142] La lisis se puede realizar a una temperatura de aproximadamente 4, 10, 15, 20, 25 o 30 °C. La lisis se puede realizar durante aproximadamente 1, 5, 10, 15 o 20 o más minutos. Una célula lisada puede comprender al menos aproximadamente 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000 o 700000 o más moléculas de ácido nucleico diana. Una célula lisada puede comprender como máximo aproximadamente 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000 o 700000 o más moléculas de ácido nucleico diana.
Unión de códigos de barras a moléculas de ácido nucleico diana
[0143] Después de la lisis de las células y la liberación de las moléculas de ácido nucleico de las mismas, las moléculas de ácido nucleico pueden asociarse aleatoriamente con los códigos de barras del soporte sólido co-localizado. La asociación puede comprender la hibridación de la región de reconocimiento de diana de un código de barras con una porción complementaria de la molécula de ácido nucleico diana (p. ej., el oligo(dT) del código de barras puede interactuar con una cola poli(A) de una diana). Las condiciones de ensayo utilizadas para la hibridación (p. ej., pH del tampón, fuerza iónica, temperatura, etc.) pueden elegirse para promover la formación de híbridos específicos y estables. En algunas formas de realización, las moléculas de ácido nucleico liberadas de las células lisadas pueden asociarse con la pluralidad de sondas en el sustrato (p. ej., hibridarse con las sondas en el sustrato). Cuando las sondas comprenden oligo(dT), las moléculas de ARNm pueden hibridarse con las sondas y transcribirse de forma inversa. La porción de oligo(dT) del oligonucleótido puede actuar como cebador para la síntesis de la primera cadena de la molécula de ADNc. Por ejemplo, en un ejemplo no limitativo de código de barras ilustrado en la FIG. 2, en el bloque 216, las moléculas de ARNm pueden hibridar con códigos de barras en perlas. Por ejemplo, los fragmentos de nucleótidos monocatenarios pueden hibridarse con las regiones de unión a la diana de los códigos de barras.
[0144] La unión puede comprender además la ligadura de la región de reconocimiento objetivo de un código de barras y una parte de la molécula de ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, la región de unión a la diana puede comprender una secuencia de ácido nucleico que puede ser capaz de una hibridación específica con un saliente del sitio de restricción (p. ej., un saliente del extremo pegajoso de EcoRI). El procedimiento de ensayo puede comprender además el tratamiento de los ácidos nucleicos diana con una enzima de restricción (p. ej., EcoRI) para crear un sitio de restricción sobresaliente. A continuación, el código de barras puede ligarse a cualquier molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia complementaria al saliente del sitio de restricción. Puede usarse una ligasa (p. ej., ADN ligasa T4) para unir los dos fragmentos.
[0145] Por ejemplo, en un ejemplo no limitativo de código de barras ilustrado en la FIG. 2, en el bloque 220, las dianas marcadas de una pluralidad de células (o una pluralidad de muestras) (por ejemplo, moléculas de código de barras diana) pueden agruparse posteriormente, por ejemplo, en un tubo. Los objetivos etiquetados se pueden agrupar, por ejemplo, recuperando los códigos de barras y/o las perlas a las que se unen las moléculas de código de barras objetivo.
[0146] La recuperación de colecciones basadas en soporte sólido de moléculas de código de barras diana unidas puede implementarse mediante el uso de perlas magnéticas y un campo magnético aplicado externamente. Una vez que se han agrupado las moléculas del código de barras objetivo, todo el procesamiento posterior puede continuar en un solo recipiente de reacción. El procesamiento adicional puede incluir, por ejemplo, reacciones de transcripción inversa, reacciones de amplificación, reacciones de escisión, reacciones de disociación y/o reacciones de extensión de ácido nucleico. Se pueden realizar más reacciones de procesamiento dentro de los micropocillos, es decir, sin reunir primero las moléculas de ácido nucleico diana marcadas de una pluralidad de células.
Transcripción inversa
[0147] La descripción proporciona un método para crear un conjugado de código de barras objetivo usando transcripción inversa (p. ej., en el bloque 224 de la FIG. 2). El conjugado de código de barras objetivo puede comprender el código de barras y una secuencia complementaria de todo o una parte del ácido nucleico objetivo (es decir, una molécula de ADNc con código de barras, tal como una molécula de ADNc con código de barras estocástico). La transcripción inversa de la molécula de ARN asociada puede ocurrir mediante la adición de un cebador de transcripción inversa junto con la transcriptasa inversa. El cebador de transcripción inversa puede ser un cebador oligo(dT), un cebador hexanucleotídico aleatorio o un cebador oligonucleotídico específico de la diana. Los cebadores oligo(dT) pueden tener, o pueden tener aproximadamente, 12-18 nucleótidos de longitud y se unen a la cola poli(A) endógena en el extremo 3' del ARNm de mamífero. Los cebadores de hexanucleótidos aleatorios pueden unirse al ARNm en una variedad de sitios complementarios. Los cebadores de oligonucleótidos específicos de la diana suelen cebar selectivamente el ARNm de interés.
[0148] En algunas formas de realización, la transcripción inversa de la molécula de ARN marcada puede ocurrir mediante la adición de un cebador de transcripción inversa. En algunas formas de realización, el cebador de transcripción inversa es un cebador oligo(dT), un cebador hexanucleotídico aleatorio o un cebador oligonucleotídico específico de la diana. En general, los cebadores oligo(dT) tienen una longitud de 12 a 18 nucleótidos y se unen a la cola poli(A) endógena en el extremo 3' del ARNm de mamífero. Los cebadores de hexanucleótidos aleatorios pueden unirse al ARNm en una variedad de sitios complementarios. Los cebadores de oligonucleótidos específicos de la diana suelen cebar selectivamente el ARNm de interés.
[0149] La transcripción inversa puede ocurrir repetidamente para producir múltiples moléculas de ADNc marcadas. Los métodos descritos en este documento pueden comprender realizar al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 reacciones de transcripción inversa. El método puede comprender realizar al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 reacciones de transcripción inversa.
Amplificación
[0150] Se pueden realizar una o más reacciones de amplificación de ácidos nucleicos (p. ej., en el bloque 228 de la FIG.
2) para crear múltiples copias de las moléculas de ácido nucleico diana marcadas. La amplificación se puede realizar de manera multiplexada, en la que múltiples secuencias de ácido nucleico diana se amplifican simultáneamente. La reacción de amplificación se puede usar para agregar adaptadores de secuenciación a las moléculas de ácido nucleico. Las reacciones de amplificación pueden comprender la amplificación de al menos una parte de un marcador de muestra, si está presente. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar al menos una parte de la etiqueta celular y/o la secuencia del código de barras (p. ej., una etiqueta molecular). Las reacciones de amplificación pueden comprender la amplificación de al menos una parte de una etiqueta de muestra, una etiqueta celular, una etiqueta espacial, una secuencia de código de barras (p. ej., una etiqueta molecular), un ácido nucleico diana o una combinación de los mismos. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 100 %, o un rango o un número entre cualquiera de estos dos valores, de la pluralidad de ácidos nucleicos. El método puede comprender además la forma de realización de una o más reacciones de síntesis de ADNc para producir una o más copias de ADNc de moléculas de código de barras diana que comprenden una etiqueta de muestra, una etiqueta celular, una etiqueta espacial y/o una secuencia de código de barras (p. ej., una etiqueta molecular).
[0151] En algunas formas de realización, la amplificación se puede realizar utilizando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se usa en este documento, PCR puede referirse a una reacción para la amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas mediante la extensión simultánea de cebadores de hebras complementarias de ADN. Como se usa aquí, la PCR puede abarcar formas derivadas de la reacción, incluidas, entre otras, RTPCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, PCR digital y PCR ensamblada.
[0152] La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender métodos no basados en PCR. Los ejemplos de métodos que no se basan en PCR incluyen, entre otros, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), SDA en tiempo real, amplificación por círculo rodante, o amplificación de círculo a círculo. Otros métodos de amplificación no basados en PCR incluyen ciclos múltiples de amplificación de transcripción de ARN impulsada por ARN polimerasa dependiente de ADN o síntesis y transcripción de ADN dirigida por ARN para amplificar objetivos de ADN o ARN, una reacción en cadena de ligasa (LCR) y una replicasa Qp (Qp), uso de sondas palindrómicas, amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación dirigida por oligonucleótidos usando una endonucleasa de restricción, un método de amplificación en donde un cebador se hibrida con una secuencia de ácido nucleico y el dúplex resultante se escinde antes de la reacción de extensión y amplificación, amplificación por desplazamiento de cadena utilizando una polimerasa de ácido nucleico que carece de actividad de exonucleasa 5', amplificación por círculo rodante y amplificación por extensión de ramificación (RAM). En algunas formas de realización, la amplificación no produce transcritos circulares.
[0153] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden además la forma de realización de una reacción en cadena de la polimerasa en el ácido nucleico marcado (p. ej., ARN marcado, ADN marcado, ADNc marcado) para producir un amplicón marcado (p. ej., un amplicón marcado estocásticamente). El amplicón marcado puede ser una molécula de doble cadena. La molécula de doble cadena puede comprender una molécula de ARN de doble cadena, una molécula de ADN de doble cadena o una molécula de ARN hibridada con una molécula de ADN. Una o ambas cadenas de la molécula de doble cadena pueden comprender un marcador de muestra, un marcador espacial, un marcador celular y/o una secuencia de código de barras (p. ej., un marcador molecular). El amplicón marcado puede ser una molécula monocatenaria. La molécula monocatenaria puede comprender ADN, ARN o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos de la divulgación pueden comprender ácidos nucleicos sintéticos o alterados.
[0154] La amplificación puede comprender el uso de uno o más nucleótidos no naturales. Los nucleótidos no naturales pueden comprender nucleótidos fotolábiles o activables. Los ejemplos de nucleótidos no naturales pueden incluir, entre otros, ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico de glicol (GNA) y ácido nucleico de treosa (TNA). Se pueden agregar nucleótidos no naturales a uno o más ciclos de una reacción de amplificación. La adición de nucleótidos no naturales se puede utilizar para identificar productos como ciclos específicos o puntos de tiempo en la reacción de amplificación.
[0155] La forma de realización de una o más reacciones de amplificación puede comprender el uso de uno o más cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. El uno o más cebadores pueden comprender menos de 12-15 nucleótidos. El uno o más cebadores pueden hibridarse con al menos una parte de la pluralidad de dianas marcadas (p. ej., dianas marcadas estocásticamente). El uno o más cebadores pueden hibridarse con el extremo 3' o el extremo 5' de la pluralidad de dianas marcadas. El uno o más cebadores pueden hibridarse con una región interna de la pluralidad de dianas marcadas. La región interna puede ser al menos 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1000 nucleótidos desde los extremos 3' la pluralidad de dianas marcadas. El uno o más cebadores pueden comprender un panel fijo de cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de control. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores específicos de genes.
[0156] El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal. El cebador universal puede hibridarse con un sitio de unión del cebador universal. El uno o más cebadores personalizados pueden hibridarse con un primer marcador de muestra, un segundo marcador de muestra, un marcador espacial, un marcador celular, una secuencia de código de barras (p. ej., un marcador molecular), un objetivo o cualquier combinación de los mismos. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal y un cebador personalizado. El cebador personalizado se puede diseñar para amplificar uno o más objetivos. Los objetivos pueden comprender un subconjunto de los ácidos nucleicos totales en una o más muestras. Los objetivos pueden comprender un subconjunto del total de objetivos etiquetados en una o más muestras. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 96 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 960 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores puede comprender al menos 9600 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores personalizados pueden hibridarse con dos o más ácidos nucleicos marcados diferentes. Los dos o más ácidos nucleicos marcados diferentes pueden corresponder a uno o más genes.
[0157] Se puede usar cualquier esquema de amplificación en los métodos de la presente divulgación. Por ejemplo, en un esquema, la primera ronda de PCR puede amplificar moléculas unidas a la perla usando un cebador específico de gen y un cebador contra la secuencia del cebador 1 de secuenciación universal de Illumina. La segunda ronda de PCR puede amplificar los primeros productos de PCR utilizando un cebador específico de gen anidado flanqueado por la secuencia del cebador 2 de secuenciación de Illumina y un cebador contra la secuencia del cebador 1 de secuenciación universal de Illumina. La tercera ronda de PCR agrega P5 y P7 y el índice de muestra para convertir los productos de PCR en una biblioteca de secuenciación de Illumina. La secuenciación con secuenciación de 150 pb x 2 puede revelar la etiqueta celular y la secuencia del código de barras (p. ej., etiqueta molecular) en la lectura 1, el gen en la lectura 2 y el índice de la muestra en la lectura del índice 1.
[0158] En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos se pueden eliminar del sustrato mediante la escisión química. Por ejemplo, se puede usar un grupo químico o una base modificada presente en un ácido nucleico para facilitar su eliminación de un soporte sólido. Por ejemplo, se puede usar una enzima para eliminar un ácido nucleico de un sustrato. Por ejemplo, se puede eliminar un ácido nucleico de un sustrato a través de una digestión con endonucleasas de restricción. Por ejemplo, se puede usar el tratamiento de un ácido nucleico que contiene un dUTP o ddUTP con uracil-dglicosilasa (UDG) para eliminar un ácido nucleico de un sustrato. Por ejemplo, se puede eliminar un ácido nucleico de un sustrato utilizando una enzima que realiza la escisión de nucleótidos, como una enzima reparadora de escisión de bases, como una endonucleasa apurínica/apirimidínica (AP). En algunas formas de realización, se puede eliminar un ácido nucleico de un sustrato utilizando un grupo fotoescindible y luz. En algunas formas de realización, se puede usar un conector escindible para eliminar un ácido nucleico del sustrato. Por ejemplo, el enlazador escindible puede comprender al menos uno de biotina/avidina, biotina/estreptavidina, biotina/neutravidina, Ig-proteína A, un enlazador fotolábil, un grupo enlazador lábil a ácidos o bases, o un aptámero.
[0159] Cuando las sondas son específicas de genes, las moléculas pueden hibridar con las sondas y ser transcritas y/o amplificadas de forma inversa. En algunas formas de realización, después de que se haya sintetizado el ácido nucleico (p. ej., transcrito de forma inversa), se puede amplificar. La amplificación se puede realizar de manera multiplex, en la que múltiples secuencias de ácido nucleico diana se amplifican simultáneamente. La amplificación puede agregar adaptadores de secuenciación al ácido nucleico.
[0160] En algunas formas de realización, la amplificación se puede realizar en el sustrato, por ejemplo, con amplificación de puente. Los ADNc pueden tener una cola de homopolímero para generar un extremo compatible para la amplificación de puente utilizando sondas de oligo(dT) en el sustrato. En la amplificación puente, el cebador que es complementario al extremo 3' del ácido nucleico molde puede ser el primer cebador de cada par que se une covalentemente a la partícula sólida. Cuando una muestra que contiene el ácido nucleico plantilla se pone en contacto con la partícula y se realiza un solo ciclo térmico, la molécula plantilla puede hibridarse con el primer cebador y el primer cebador se alarga en la dirección de avance mediante la adición de nucleótidos para formar una molécula dúplex que consta de la molécula molde y una hebra de ADN recién formada que es complementaria a la plantilla. En el paso de calentamiento del siguiente ciclo, la molécula dúplex se puede desnaturalizar, liberando la molécula molde de la partícula y dejando la hebra de ADN complementaria unida a la partícula a través del primer cebador. En la etapa de hibridación del paso de hibridación y elongación que sigue, la hebra complementaria puede hibridarse con el segundo cebador, que es complementario a un segmento de la hebra complementaria en una ubicación eliminada del primer cebador. Esta hibridación puede hacer que la hebra complementaria forme un puente entre el primer y el segundo cebador asegurado al primer cebador por un enlace covalente y al segundo cebador por hibridación. En la etapa de elongación, el segundo cebador se puede alargar en la dirección inversa mediante la adición de nucleótidos en la misma mezcla de reacción, convirtiendo así el puente en un puente de doble cadena. Entonces comienza el siguiente ciclo, y el puente de doble cadena se puede desnaturalizar para producir dos moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla, cada una con un extremo unido a la superficie de la partícula a través del primer y segundo cebador, respectivamente, con el otro extremo de cada uno sin unir. En el paso de hibridación y elongación de este segundo ciclo, cada hebra puede hibridar con otro cebador complementario, no utilizado previamente, en la misma partícula, para formar nuevos puentes monocatenarios. Los dos cebadores no utilizados anteriormente que ahora están hibridados se alargan para convertir los dos nuevos puentes en puentes de doble hebra.
[0161] Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar al menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de la pluralidad de ácidos nucleicos.
[0162] La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender métodos basados en PCR o métodos no basados en PCR. La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender la amplificación exponencial de los ácidos nucleicos marcados. La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender la amplificación lineal de los ácidos nucleicos marcados. La amplificación se puede realizar por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR puede referirse a una reacción para la amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas mediante la extensión simultánea de cebadores de hebras complementarias de ADN. La PCR puede abarcar formas derivadas de la reacción, incluidas, entre otras, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, PCR digital, PCR de supresión, PCR semisupresora y PCR de ensamblaje.
[0163] En algunas formas de realización, la amplificación de los ácidos nucleicos marcados comprende métodos no basados en PCR. Ejemplos de métodos no basados en PCR incluyen, pero no se limitan a amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), SDA en tiempo real, amplificación de círculo rodante o amplificación de círculo a círculo. Otros métodos de amplificación no basados en PCR incluyen ciclos múltiples de amplificación de transcripción de ARN impulsada por ARN polimerasa dependiente de ADN o síntesis y transcripción de ADN dirigida por ARN para amplificar objetivos de ADN o ARN, una reacción en cadena de ligasa (LCR), una replicasa Qp (Qp), uso de sondas palindrómicas, amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación dirigida por oligonucleótidos usando una endonucleasa de restricción, un método de amplificación en donde un cebador se hibrida con una secuencia de ácido nucleico y el dúplex resultante se escinde antes de la reacción de extensión y amplificación, amplificación por desplazamiento de cadena utilizando una polimerasa de ácido nucleico que carece de actividad de exonucleasa 5', amplificación por círculo rodante y/o amplificación por extensión de ramificación (RAM).
[0164] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden además la forma de realización de una reacción en cadena de la polimerasa anidada en el amplicón amplificado (p. ej., el objetivo). El amplicón puede ser una molécula de doble cadena. La molécula de doble cadena puede comprender una molécula de ARN de doble cadena, una molécula de ADN de doble cadena o una molécula de ARN hibridada con una molécula de ADN. Una o ambas cadenas de la molécula de doble cadena pueden comprender una etiqueta de muestra o una etiqueta identificadora molecular. Alternativamente, el amplicón puede ser una molécula monocatenaria. La molécula monocatenaria puede comprender ADN, ARN o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden comprender ácidos nucleicos sintéticos o alterados.
[0165] En algunas formas de realización, el método comprende amplificar repetidamente el ácido nucleico marcado para producir múltiples amplicones. Los métodos descritos en este documento pueden comprender realizar al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 reacciones de amplificación. Alternativamente, el método comprende realizar al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 reacciones de amplificación.
[0166] La amplificación puede comprender además agregar uno o más ácidos nucleicos de control a una o más muestras que comprenden una pluralidad de ácidos nucleicos. La amplificación puede comprender además agregar uno o más ácidos nucleicos de control a una pluralidad de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos de control pueden comprender un marcador de control.
[0167] La amplificación puede comprender el uso de uno o más nucleótidos no naturales. Los nucleótidos no naturales pueden comprender nucleótidos fotolábiles y/o activables. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen, entre otros, ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico de glicol (GNA) y ácido nucleico de treosa (TNA). Se pueden agregar nucleótidos no naturales a uno o más ciclos de una reacción de amplificación. La adición de nucleótidos no naturales se puede utilizar para identificar productos como ciclos específicos o puntos de tiempo en la reacción de amplificación.
[0168] La forma de realización de una o más reacciones de amplificación puede comprender el uso de uno o más cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender uno o más oligonucleótidos. El uno o más oligonucleótidos pueden comprender al menos alrededor de 7-9 nucleótidos. El uno o más oligonucleótidos pueden comprender menos de 12-15 nucleótidos. El uno o más cebadores pueden hibridarse con al menos una parte de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden hibridarse con el extremo 3' y/o el extremo 5' de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden hibridarse con una región interna de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. La región interna puede ser al menos 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1000 nucleótidos desde los extremos 3' la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden comprender un panel fijo de cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de control. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de genes de mantenimiento. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal. El cebador universal puede hibridarse con un sitio de unión del cebador universal. El uno o más cebadores personalizados pueden hibridarse con la primera etiqueta de muestra, la segunda etiqueta de muestra, la etiqueta identificadora molecular, el ácido nucleico o un producto del mismo. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal y un cebador personalizado. El cebador personalizado se puede diseñar para amplificar uno o más ácidos nucleicos diana. Los ácidos nucleicos diana pueden comprender un subconjunto de los ácidos nucleicos totales en una o más muestras. En algunas formas de realización, los cebadores son las sondas unidas a la matriz de la divulgación.
[0169] En algunas formas de realización, la codificación de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos) de la pluralidad de objetivos en la muestra comprende además generar una biblioteca indexada de los objetivos con códigos de barras (por ejemplo, objetivos con códigos de barras estocásticos) o fragmentos con códigos de barras de los objetivos. Las secuencias de códigos de barras de diferentes códigos de barras (p. ej., las etiquetas moleculares de diferentes códigos de barras estocásticos) pueden ser diferentes entre sí. La generación de una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras incluye la generación de una pluralidad de polinucleótidos indexados a partir de la pluralidad de objetivos en la muestra. Por ejemplo, para una biblioteca indexada de dianas con código de barras que comprende una primera diana indexada y una segunda diana indexada, la región etiquetada del primer polinucleótido indexado puede diferir de la región etiquetada del segundo polinucleótido indexado en, aproximadamente, al menos, o como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos. En algunas formas de realización, generar una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras incluye poner en contacto una pluralidad de objetivos, por ejemplo, moléculas de ARNm, con una pluralidad de oligonucleótidos que incluyen una región poli(T) y una región marcadora; y realizar una síntesis de la primera cadena utilizando una transcriptasa inversa para producir moléculas de ADNc marcadas de una sola cadena, cada una de las cuales comprende una región de ADNc y una región marcadora, en la que la pluralidad de dianas incluye al menos dos moléculas de ARNm de secuencias diferentes y la pluralidad de oligonucleótidos incluye al menos dos oligonucleótidos de secuencias diferentes. La generación de una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras puede comprender además la amplificación de las moléculas de ADNc marcadas de cadena sencilla para producir moléculas de ADNc marcadas de cadena doble; y llevar a cabo una PCR anidada en las moléculas de ADNc marcadas de doble hebra para producir amplicones marcados. En algunas formas de realización, el método puede incluir generar un amplicón marcado con adaptador.
[0170] La codificación de barras (p. ej., codificación de barras estocástica) puede incluir el uso de etiquetas o códigos de barras de ácido nucleico para etiquetar moléculas individuales de ácido nucleico (p. ej., ADN o ARN). En algunas formas de realización, implica agregar etiquetas o códigos de barras de ADN a las moléculas de ADNc a medida que se generan a partir del ARNm. Se puede realizar una PCR anidada para minimizar el sesgo de amplificación de la PCR. Se pueden agregar adaptadores para secuenciar usando, por ejemplo, secuenciación de próxima generación (NGS). Los resultados de la secuenciación pueden usarse para determinar etiquetas celulares, etiquetas moleculares y secuencias de fragmentos de nucleótidos de una o más copias de las dianas, por ejemplo, en el bloque 232 de la FIG. 2.
[0171] La FIG. 3 es una ilustración esquemática que muestra un proceso ejemplar no limitante de generar una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras (por ejemplo, objetivos con código de barras estocástico), tales como
ARNm con código de barras o fragmentos de los mismos. Como se muestra en el paso 1, el proceso de transcripción inversa puede codificar cada molécula de ARNm con una etiqueta molecular única, una etiqueta celular y un sitio de PCR universal. En particular, las moléculas de ARN 302 se pueden transcribir de forma inversa para producir moléculas de
ADNc 304 marcadas, incluida una región de ADNc 306, mediante hibridación (p. ej., hibridación estocástica) de un conjunto de códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) 310 con la región de cola poli(A) 308 de las moléculas de ARN 302. Cada uno de los códigos de barras 310 puede comprender una región de unión a la diana, por ejemplo, una región poli(dT) 312, una región marcadora 314 (p. ej., una secuencia de código de barras o una molécula) y una región de PCR universal 316.
[0172] En algunas formas de realización, el marcador celular puede incluir de 3 a 20 nucleótidos. En algunas formas de realización, el marcador molecular puede incluir de 3 a 20 nucleótidos. En algunas formas de realización, cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende además uno o más de una etiqueta universal y una etiqueta de célula, donde las etiquetas universales son las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos en el soporte sólido y las etiquetas de célula son las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos sobre el soporte sólido. En algunas formas de realización, el marcador universal puede incluir de 3 a 20 nucleótidos. En algunas formas de realización, el marcador celular comprende de 3 a 20 nucleótidos.
[0173] En algunas formas de realización, la región de la etiqueta 314 puede incluir una secuencia de código de barras o una etiqueta molecular 318 y una etiqueta celular 320. En algunas formas de realización, la región de la etiqueta 314 puede incluir una o más de una etiqueta universal, una etiqueta de dimensión y una etiqueta de célula. La secuencia de código de barras o etiqueta molecular 318 puede ser, puede ser aproximadamente, puede ser al menos o puede ser como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. La etiqueta de célula 320 puede ser, puede ser aproximadamente, puede ser al menos o puede ser como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. La etiqueta universal puede ser, puede ser sobre, puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. Las etiquetas universales pueden ser las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos sobre el soporte sólido y las etiquetas de célula son las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos sobre el soporte sólido. La etiqueta de dimensión puede ser, puede ser aproximadamente, puede ser al menos o puede ser como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,
90, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud.
[0174] En algunas formas de realización, la región de la etiqueta 314 puede comprender, comprender aproximadamente, comprender al menos o comprender como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200,
300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, diferentes etiquetas, como una secuencia de código de barras o una etiqueta molecular 318 y una etiqueta celular 320. Cada etiqueta puede ser, puede ser aproximadamente, puede ser al menos o puede ser como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40,
50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. Un conjunto de códigos de barras o códigos de barras estocásticos 310 puede contener, contener sobre, contener al menos, o puede ser como máximo, 10, 20, 40, 50, 70, 80, 90, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1020, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, códigos de barras o códigos de barras estocásticos
310. Y el conjunto de códigos de barras o códigos de barras estocásticos 310 puede, por ejemplo, cada uno contiene una región de marca única 314. Las moléculas de ADNc marcadas 304 se pueden purificar para eliminar el exceso de códigos de barras o los códigos de barras estocásticos 310. La purificación puede comprender la purificación con perlas Ampure.
[0175] Como se muestra en el paso 2, los productos del proceso de transcripción inversa en el paso 1 pueden agruparse en 1 tubo y amplificarse por PCR con un primer conjunto de cebadores de PCR y un primer cebador de PCR universal. El agrupamiento es posible debido a la región marcadora única 314. En particular, las moléculas de ADNc marcadas 304 se pueden amplificar para producir amplicones 322 marcados con PCR anidados. La amplificación puede comprender amplificación por PCR multiplex. La amplificación puede comprender una amplificación por PCR multiplex con 96 cebadores multiplex en un único volumen de reacción. En algunas formas de realización, la amplificación por PCR multiplex puede utilizar, utilizar aproximadamente, utilizar al menos o utilizar como máximo 10, 20, 40, 50, 70, 80, 90, 102,
103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1011, 1014, 1015, 1020, o un número o un ra valores, cebadores multiplexados en un único volumen de reacción. La amplificación puede comprender el uso de un primer grupo de cebadores de PCR 324 que comprende cebadores personalizados 326A-C dirigidos a genes específicos y un cebador universal 328. Los cebadores personalizados 326 pueden hibridar con una región dentro de la porción de
ADNc 306' de la molécula de ADNc marcada 304. El cebador universal 328 puede hibridar con la región PCR universal
316 de la molécula de ADNc marcada 304.
[0176] Como se muestra en el paso 3 de la FIG. 3, los productos de la amplificación por PCR en el paso 2 se pueden amplificar con un conjunto de cebadores de PCR anidados y un segundo cebador de PCR universal. La PCR anidada puede minimizar el sesgo de amplificación de la PCR. En particular, los amplicones 322 marcados con PCR anidada pueden amplificarse adicionalmente mediante PCR anidada. La PCR anidada puede comprender una PCR multiplex con un grupo de cebadores de PCR anidados 330 de cebadores de PCR anidados 332a-c y un segundo cebador de PCR universal 328' en un solo volumen de reacción. El grupo de cebadores de PCR anidados 328 puede contener, contener aproximadamente, contener al menos o contener como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, diferentes cebadores de PCR anidados 330. Los cebadores de PCR anidados 332 puede contener un adaptador 334 e hibridar con una región dentro de la porción de ADNc 306” del amplicón marcado 322. El cebador universal 328' puede contener un adaptador 336 e hibridar con la región PCR universal 316 del amplicón marcado 322. Así, el paso 3 produce un amplicón marcado con adaptador 338. En algunas formas de realización, los cebadores de PCR anidados 332 y el segundo cebador de PCR universal 328' pueden no contener los adaptadores 334 y 336. En cambio, los adaptadores 334 y 336 pueden ligarse a los productos de PCR anidados para producir adaptadores marcados amplicón 338.
[0177] Como se muestra en el paso 4, los productos de PCR del paso 3 se pueden amplificar por PCR para la secuenciación usando cebadores de amplificación de biblioteca. En particular, los adaptadores 334 y 336 pueden usarse para realizar uno o más ensayos adicionales en el amplicón 338 marcado con adaptador. Los adaptadores 334 y 336 pueden hibridarse con los cebadores 340 y 342. El uno o más cebadores 340 y 342 pueden ser Cebadores de amplificación por PCR. Los uno o más cebadores 340 y 342 pueden ser cebadores de secuenciación. El uno o más adaptadores 334 y 336 se pueden usar para amplificación adicional de los amplicones 338 marcados con adaptador. El uno o más adaptadores 334 y 336 se pueden usar para secuenciar el amplicón 338 marcado con adaptador. El cebador 342 puede contener un índice de placa 344 de modo que los amplicones generados usando el mismo conjunto de códigos de barras o códigos de barras estocásticos 310 pueden secuenciarse en una reacción de secuenciación usando secuenciación de próxima generación (NGS).
Composiciones que comprenden reactivos de unión a componentes celulares asociados con oligonucleótidos
[0178] Algunas formas de realización descritas en el presente documento proporcionan una pluralidad de composiciones, cada una de las cuales comprende un reactivo de unión a componentes celulares (como un reactivo de unión a proteínas) que está conjugado con un oligonucleótido, en donde el oligonucleótido comprende un identificador único para el reactivo de unión al componente celular con el que está conjugado. Los reactivos de unión a componentes celulares (como los anticuerpos con código de barras) y sus usos (como la indexación de muestras de células) se han descrito en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.° US2018/0088112 y US2018/0346970.
[0179] En algunas formas de realización, el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a un objetivo de componente celular. Por ejemplo, un objetivo de unión del reactivo de unión del componente celular puede ser, o comprender, un carbohidrato, un lípido, una proteína, una proteína extracelular, una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, una integrina, una proteína intracelular o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el reactivo de unión al componente celular (p. ej., un reactivo de unión a proteínas) es capaz de unirse específicamente a un antígeno diana o a una proteína diana. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un código de barras, como un código de barras estocástico. Un código de barras puede comprender una secuencia de código de barras (p. ej., una etiqueta molecular), una etiqueta de célula, una etiqueta de muestra o cualquier combinación de las mismas. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un enlazador. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un sitio de unión para una sonda de oligonucleótidos, como una cola de poli(A). Por ejemplo, la cola de poli(A) puede estar, por ejemplo, no anclada a un soporte sólido o anclada a un soporte sólido. La cola poli(A) puede tener una longitud de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos. En algunas formas de realización, la cola poli(A) puede tener una longitud de 18 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden comprender desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o ambos.
[0180] Los identificadores únicos pueden ser, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que tenga cualquier longitud adecuada, por ejemplo, de aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos. En algunas formas de realización, el identificador único es una secuencia de nucleótidos de 25 nucleótidos a aproximadamente 45 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, el identificador único puede tener una longitud de aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 200 nucleótidos, o un rango que esté entre cualquiera de los dos valores anteriores.
[0181] En algunas formas de realización, los identificadores únicos se seleccionan de un conjunto diverso de identificadores únicos. El conjunto diverso de identificadores únicos puede comprender, o comprender aproximadamente, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, o un número o un rango entre dos de estos valores, identificadores únicos diferentes. El conjunto diverso de identificadores únicos puede comprender al menos, o comprender como máximo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 o 5000, identificadores únicos diferentes. En algunas formas de realización, el conjunto de identificadores únicos está diseñado para tener una homología de secuencia mínima con las secuencias de ADN o ARN de la muestra que se va a analizar. En algunas formas de realización, las secuencias del conjunto de identificadores únicos son diferentes entre sí, o su complemento, en, o en aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nucleótidos, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, las secuencias del conjunto de identificadores únicos son diferentes entre sí, o su complemento, en al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos. En unas formas de realización, las secuencias del conjunto de identificadores únicos son diferentes entre sí, o su complemento, en al menos un 3 %, al menos un 5 %, al menos un 8 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos 20 %, o más.
[0182] En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender un sitio de unión para un cebador, como un cebador universal. En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender al menos dos sitios de unión para un cebador, como un cebador universal. En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender al menos tres sitios de unión para un cebador, como un cebador universal. Los cebadores se pueden usar para la amplificación de los identificadores únicos, por ejemplo, mediante amplificación por PCR. En algunas formas de realización, los cebadores pueden usarse para reacciones de PCR anidadas.
[0183] En algunas formas de realización, los reactivos de unión a componentes celulares pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos de cadena sencilla (sc-Ab) o fragmentos de los mismos, como Fab, Fv, etc. de reactivos de unión a componentes celulares puede comprender, o comprender aproximadamente, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, reactivos de componentes celulares diferentes. En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares puede comprender al menos, o comprender como máximo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 o 5000, diferentes reactivos de componentes celulares.
[0184] El oligonucleótido se puede conjugar con el reactivo de unión al componente celular a través de varios mecanismos. En algunas formas de realización, el oligonucleótido se puede conjugar covalentemente con el reactivo de unión al componente celular. En alguna forma de realización, el oligonucleótido se puede conjugar con el reactivo de unión al componente celular de forma no covalente. En algunas formas de realización, el oligonucleótido se conjuga con el reactivo de unión al componente celular a través de un enlazador. El enlazador puede ser, por ejemplo, escindible o separable del reactivo de unión al componente celular y/o del oligonucleótido. En algunas formas de realización, el enlazador puede comprender un grupo químico que une reversiblemente el oligonucleótido a los reactivos de unión del componente celular. El grupo químico se puede conjugar con el enlazador, por ejemplo, a través de un grupo amino. En algunas formas de realización, el enlazador puede comprender un grupo químico que forma un enlace estable con otro grupo químico conjugado con el reactivo de unión al componente celular. Por ejemplo, el grupo químico puede ser un grupo fotoescindible UV, un enlace disulfuro, una estreptavidina, una biotina, una amina, etc. En algunas formas de realización, el grupo químico puede conjugarse con el reactivo de unión del componente celular a través de una amina primaria en un aminoácido, como la lisina, o el N-terminal. Los kits de conjugación disponibles en el mercado, como el kit de conjugación de proteínas y oligos (Solulink, Inc., San Diego, California), el sistema de conjugación de oligos Thunder-Link® (Innova Biosciences, Cambridge, Reino Unido), etc., se pueden utilizar para conjugar el oligonucleótido al reactivo de unión al componente celular.
[0185] El oligonucleótido se puede conjugar con cualquier sitio adecuado del reactivo de unión al componente celular (p. ej., un reactivo de unión a proteínas), siempre que no interfiera con la unión específica entre el reactivo de unión al componente celular y su componente celular diana. En algunas formas de realización, el reactivo de unión al componente celular es una proteína, como un anticuerpo. En algunas formas de realización, el reactivo de unión al componente celular no es un anticuerpo. En algunas formas de realización, el oligonucleótido se puede conjugar con el anticuerpo en cualquier lugar que no sea el sitio de unión al antígeno, por ejemplo, la región Fc, el dominio Ch1, el dominio Ch2, el dominio Ch3, el dominio Cl, etc. Métodos de conjugación los oligonucleótidos a los reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., anticuerpos) se han descrito previamente, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N° 6.531.283. La estequiometría del reactivo de unión del oligonucleótido al componente celular puede variar. Para aumentar la sensibilidad de detección del oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular en la secuenciación, puede ser ventajoso aumentar la proporción de oligonucleótido a reactivo de unión al componente celular durante la conjugación. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a componente celular se puede conjugar con una sola molécula de oligonucleótido. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a componente celular se puede conjugar con más de una molécula de oligonucleótido, por ejemplo, al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos dos valores, moléculas de oligonucleótidos en las que cada una de las moléculas de oligonucleótidos comprende identificadores únicos iguales o diferentes. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a componente celular se puede conjugar con más de una molécula de oligonucleótido, por ejemplo, al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, moléculas de oligonucleótidos, en las que cada una de las moléculas de oligonucleótidos comprende identificadores únicos iguales o diferentes.
[0186] En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión de componentes celulares son capaces de unirse específicamente a una pluralidad de objetivos de componentes celulares en una muestra, como una sola célula, una pluralidad de células, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una muestra de sangre, o similar. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares comprende una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender componentes celulares intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender componentes celulares intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares puede ser, o ser aproximadamente, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, de todos los componentes celulares (p. ej., proteínas) en una célula o un organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares puede ser al menos, o ser como máximo, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, de todos los componentes celulares (por ejemplo, proteínas) en una célula o un organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender, o comprender aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, 10000, o un número o un rango entre cualquier dos de estos valores, objetivos de diferentes componentes celulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender al menos, o comprender como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, 10000 objetivos de componentes celulares diferentes.
[0187] La FIG. 4 muestra una ilustración esquemática de un ejemplo de reactivo de unión a componente celular (p. ej., un anticuerpo) que está asociado (p. ej., conjugado) con un oligonucleótido que comprende una secuencia de identificación única para el anticuerpo. Un oligonucleótido conjugado con un reactivo de unión a un componente celular, un oligonucleótido para la conjugación con un reactivo de unión a un componente celular o un oligonucleótido previamente conjugado con un reactivo de unión a un componente celular pueden denominarse en el presente documento oligonucleótido de anticuerpo (abreviado como oligonucleótido de reactivo de unión). Un oligonucleótido conjugado con un anticuerpo, un oligonucleótido para la conjugación con un anticuerpo o un oligonucleótido previamente conjugado con un anticuerpo pueden denominarse en el presente documento oligonucleótido de anticuerpo (abreviado como “AbOligo” o “AbO”). El oligonucleótido también puede comprender componentes adicionales, incluidos, entre otros, uno o más enlazadores, uno o más identificadores únicos para el anticuerpo, opcionalmente una o más secuencias de código de barras (p. ej., etiquetas moleculares) y una cola poli(A). En algunas formas de realización, el oligonucleótido puede comprender, de 5' a 3', un enlazador, un identificador único, una secuencia de código de barras (p. ej., un marcador molecular) y una cola de poli(A). Un oligonucleótido de anticuerpo puede ser un imitador de ARNm.
[0188] La FIG. 5 muestra una ilustración esquemática de un reactivo de unión de componente celular ejemplar (p. ej., un anticuerpo) que está asociado (p. ej., conjugado) con un oligonucleótido que comprende una secuencia de identificación única para el anticuerpo. El reactivo de unión de componentes celulares puede ser capaz de unirse específicamente a al menos un objetivo de componente celular, como un objetivo de antígeno o un objetivo de proteína. Un oligonucleótido reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de indexación de muestra o un oligonucleótido de anticuerpo) puede comprender una secuencia (p. ej., una secuencia de indexación de muestra) para realizar los métodos de la descripción. Por ejemplo, un oligonucleótido de indexación de muestras puede comprender una secuencia de indexación de muestras para identificar el origen de una o más células de una muestra. Las secuencias de indexación (p. ej., secuencias de indexación de muestras) de al menos dos composiciones que comprenden dos reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., composiciones de indexación de muestras) de la pluralidad de composiciones que comprenden reactivos de unión a componentes celulares pueden comprender secuencias diferentes. En algunas formas de realización, el oligonucleótido del reactivo de unión no es homólogo a las secuencias genómicas de una especie. El oligonucleótido del reactivo de unión puede configurarse para ser (o puede ser) separable o no separable del reactivo de unión del componente celular.
[0189] El oligonucleótido conjugado con un reactivo de unión a componente celular puede, por ejemplo, comprender una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia marcadora molecular), una cola de poli(A) o una combinación de las mismas. Un oligonucleótido conjugado con un reactivo de unión a un componente celular puede ser un mimético de ARNm. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura de al menos un código de barras de la pluralidad de códigos de barras. Una región de unión objetivo del código de barras puede comprender la secuencia de captura. La región de unión a la diana puede, por ejemplo, comprender una región poli(dT). En algunas formas de realización, la secuencia del oligonucleótido de indexación de la muestra complementaria a la secuencia de captura del código de barras puede comprender una cola de poli(A). El oligonucleótido de indexación de muestras puede comprender un marcador molecular.
[0190] En algunas formas de realización, el oligonucleótido reactivo de unión (p. ej., el oligonucleótido de muestra) comprende una secuencia de nucleótidos de, o una secuencia de nucleótidos de aproximadamente, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 128, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o un rango entre dos cualquiera de estos valores, nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, el oligonucleótido del reactivo de unión comprende una secuencia de nucleótidos de al menos, o como máximo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 128, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 nucleótidos de longitud.
[0191] En algunas formas de realización, el reactivo de unión al componente celular comprende un anticuerpo, un tetrámero, un aptámero, un armazón de proteína o una combinación de los mismos. El oligonucleótido del reactivo de unión se puede conjugar con el reactivo de unión del componente celular, por ejemplo, a través de un enlazador. El oligonucleótido del reactivo de unión puede comprender el enlazador. El enlazador puede comprender un grupo químico. El grupo químico puede unirse de forma reversible o irreversible a la molécula del reactivo de unión al componente celular. El grupo químico se puede seleccionar del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, un enlace disulfuro, una estreptavidina, una biotina, una amina y cualquier combinación de los mismos.
[0192] En algunas formas de realización, el reactivo de unión de componentes celulares puede unirse a ADAM10, CD156c, ANO6, ATP1B2, ATP1B3, BSG, CD147, CD109, CD230, CD29, CD298, ATP1B3, CD44, CD45, CD47, CD51, CD59, CD63, CD97, CD98, SLC3A2, CLDND1, HLA-ABC, ICAM1, ITFG3, MPZL1, NA K ATPasa alfa1, ATP1A1, NPTN, PMCA ATPasa, ATP2B1, SLC1A5, SLC29A1, SLC2A1, SLC44A2 o cualquier combinación de los mismos.
[0193] En algunas formas de realización, la proteína diana es, o comprende, una proteína extracelular, una proteína intracelular o cualquier combinación de las mismas. En algunas formas de realización, el antígeno o proteína diana es, o comprende, una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, una integrina, o cualquier combinación de los mismos. El objetivo de antígeno o proteína puede ser, o comprender, un lípido, un carbohidrato o cualquier combinación de los mismos. La proteína diana se puede seleccionar de un grupo que comprende una serie de proteínas diana. El número de objetivos de antígenos o proteínas puede ser, o aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. El número de dianas proteicas puede ser como mínimo o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10000.
[0194] El reactivo de unión al componente celular (p. ej., un reactivo de unión a proteínas) se puede asociar con dos o más oligonucleótidos del reactivo de unión (p. ej., oligonucleótidos de indexación de muestras) con una secuencia idéntica. El reactivo de unión al componente celular se puede asociar con dos o más oligonucleótidos del reactivo de unión con secuencias diferentes. El número de oligonucleótidos del reactivo de unión asociados con el reactivo de unión del componente celular puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de oligonucleótidos del reactivo de unión ya sea que tengan una secuencia idéntica o secuencias diferentes, puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de oligonucleótidos del reactivo de unión puede ser al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000.
[0195] La pluralidad de composiciones que comprenden reactivos de unión de componentes celulares (p. ej., la pluralidad de composiciones de indexación de muestras) puede comprender uno o más reactivos de unión de componentes celulares adicionales no conjugados con el oligonucleótido del reactivo de unión (como el oligonucleótido de indexación de muestras), que también es denominado en el presente documento reactivo de unión reactivo de unión de componente celular libre de oligonucleótidos (tal como reactivo de unión de componente celular libre de oligonucleótidos de indexación de muestras). El número de reactivos de unión de componentes celulares adicionales en la pluralidad de composiciones puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de reactivos de unión a componentes celulares adicionales puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de reactivos de unión de componentes celulares adicionales puede ser al menos, o como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100. El reactivo de unión de componentes celulares y cualquiera de los reactivos de unión de componentes celulares adicionales pueden ser idénticos, en algunas formas de realización.
[0196] En algunas formas de realización, una mezcla que comprende reactivos de unión a componentes celulares que se conjugan con uno o más oligonucleótidos de reactivos de unión (p. ej., oligonucleótidos de indexación de muestras) y reactivos de unión a componentes celulares que no están conjugados con oligonucleótidos de reactivos de unión está provisto. La mezcla se puede usar en algunas formas de realización de los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, para poner en contacto la(s) muestra(s) y/o la(s) célula(s). La proporción de (1) el número de un reactivo de unión a un componente celular conjugado con un oligonucleótido de un reactivo de unión y (2) el número de otro reactivo de unión a un componente celular (p. ej., el mismo reactivo de unión a un componente celular) no conjugado con el oligonucleótido de un reactivo de unión (por ejemplo, oligonucleótido de indexación de muestra) u otro(s) oligonucleótido(s) de reactivo de unión en la mezcla pueden ser diferentes en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, la relación puede ser, o ser aproximadamente, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4, 1:1,5, 1:1,6, 1:1,7, 1:1,8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84,
1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000, 1:7000, 1:8000, 1:9000, 1:10000, o un número o rango entre cualquiera de los dos valores. En algunas formas de realización, la relación puede ser al menos, o como máximo, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4, 1:1,5, 1:1,6, 1:1,7, 1: 1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11,
1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1: 24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32,
1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1: 49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53,
1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1: 74,
1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95,
1:96, 1:97, 1:98, 1: 99, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000, 1:7000, 1:8000, 1:9000 o 1:10000.
[0197] En algunas formas de realización, la relación puede ser, o ser aproximadamente, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1,
1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1.9:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1,
18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37: 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1,
60:1, 61:1, 62:1, 63:1, 64:1, 65:1, 66:1, 67:1, 68:1, 69:1, 70:1, 71:1, 72:1, 73:1, 74:1, 75:1, 76:1, 77:1, 78:1, 79: 81:1,82:1,83:1,84:1,85:1,86:1,87:1, 88:1,89:1,90:1,91:1,92:1,93:1,94:1, 95:1,96:1,97:1,98:1,99:1, 100:1,200:1, 300:1,400:1,500:1,600:1,700:1,800:1,900:1, 1000:1,2000:1,3000:1,4000:1,5000:1,6000:1,7000:1,8000:1,9000:1, 10000:1, o un número o un rango entre cualquiera de los dos valores. En algunas formas de realización, la relación puede ser al menos, o como máximo, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1.9:1, 2:1, 2.5:1, 3:1,4:1, 5:1,6:1, 7:1,8:1,9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1,22:1, 23:1, 24:1,25:1, 26:1,27:1,28:1,
29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48: 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1, 60:1, 61:1, 62:1, 63:1, 64:1, 65:1, 66:1, 67:1, 68:1, 69: 71:1, 72:1, 73:1, 74:1, 75:1, 76:1, 77:1, 78:1, 79:1, 80:1, 81:1, 82:1, 83:1, 84:1, 85:1, 86:1, 87:1, 88:1, 89:1, 90: 92:1,93:1,94:1,95:1,96:1,97:1,98:1,99:1, 100:1,200:1,300:1,400:1,500:1,600:1,700:1,800:1,900:1, 1000:1,2000:1, 3000:1,4000:1,5000:1, 6000:1,7000:1,8000:1,9000:1 o 10000:1.
[0198] Un reactivo de unión a componente celular puede conjugarse con un oligonucleótido de reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de indexación de muestra), o no. En algunas formas de realización, el porcentaje del reactivo de unión del componente celular conjugado con un oligonucleótido del reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de indexación de muestra) en una mezcla que comprende el reactivo de unión del componente celular que está conjugado con el oligonucleótido del reactivo de unión y el reactivo de unión del componente celular (s) que no está conjugado con el reactivo de unión oligonucleótido puede ser, o ser aproximadamente, 0,000000001 %, 0,00000001 %, 0,0000001 %, 0,000001 %, 0,00001 %, 0,0001 %, 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %,
12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el porcentaje del reactivo de unión al componente celular conjugado con un oligonucleótido de indexación de muestra en una mezcla puede ser al menos, o como máximo, 0,000000001 %, 0,00000001 %, 0,0000001 %, 0,000001 %, 0,00001 %, 0,0001 %, 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3
%, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23
%, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42
%, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61
%, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80
%, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99
% o 100%.
[0199] En algunas formas de realización, el porcentaje del reactivo de unión de componentes celulares no conjugado con un oligonucleótido de reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de indexación de muestra) en una mezcla que comprende un reactivo de unión de componentes celulares conjugado con un oligonucleótido de reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de muestra oligonucleótido de indexación) y el reactivo de unión del componente celular que no está conjugado con el oligonucleótido de indexación de la muestra puede ser, o ser aproximadamente, 0,000000001 %, 0,00000001 %, 0,0000001 %, 0,000001 %, 0,00001 %, 0,0001 %, 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %,
7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26
%, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45
%, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64
%, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83
%, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el porcentaje del reactivo de unión del componente celular no conjugado con un oligonucleótido del reactivo de unión en una mezcla puede ser al menos, o como máximo, 0,000000001 %, 0,00000001 %, 0,0000001 %, 0,000001 %, 0,00001 %, 0,0001 %, 0,001 %,
0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19
%, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
Cócteles de componentes celulares
[0200] En algunas formas de realización, se puede usar un cóctel de reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., un cóctel de anticuerpos) para aumentar la sensibilidad de marcaje en los métodos descritos en el presente documento. Sin estar vinculado por ninguna teoría en particular, se cree que esto puede deberse a que la expresión de componentes celulares o la expresión de proteínas pueden variar entre los tipos de células y los estados de las células, lo que dificulta la búsqueda de un reactivo universal de unión a componentes celulares o un anticuerpo que marque todos los tipos de células. Por ejemplo, se puede utilizar un cóctel de reactivos de unión a componentes celulares para permitir un etiquetado más sensible y eficaz de más tipos de muestras. El cóctel de reactivos de unión a componentes celulares puede incluir dos o más tipos diferentes de reactivos de unión a componentes celulares, por ejemplo, una gama más amplia de reactivos de unión a componentes celulares o anticuerpos. Los reactivos de unión a componentes celulares que marcan diferentes objetivos de componentes celulares se pueden combinar para crear un cóctel que marque suficientemente todos los tipos de células, o uno o más tipos de células de interés.
[0201] En algunas formas de realización, cada una de la pluralidad de composiciones (p. ej., composiciones de indexación de muestras) comprende un reactivo de unión de componentes celulares. En algunas formas de realización, una composición de la pluralidad de composiciones comprende dos o más reactivos de unión a componentes celulares, en donde cada uno de los dos o más reactivos de unión a componentes celulares está asociado con un oligonucleótido reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de indexación de muestra), en donde al menos uno de los dos o más reactivos de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares y en donde el reactivo de unión a componentes celulares comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido, o cualquier combinación de los mismos. Las secuencias de los oligonucleótidos del reactivo de unión asociados con los dos o más reactivos de unión del componente celular pueden ser idénticas. Las secuencias de los oligonucleótidos del reactivo de unión asociados a los dos o más reactivos de unión a componentes celulares pueden comprender secuencias diferentes. Cada una de la pluralidad de composiciones puede comprender los dos o más reactivos de unión a componentes celulares.
[0202] El número de diferentes tipos de reactivos de unión a componentes celulares (por ejemplo, un anticuerpo CD147 y un anticuerpo CD47) en una composición puede ser diferente en diferentes implementaciones. Una composición con dos o más tipos diferentes de reactivos de unión a componentes celulares puede denominarse en este documento cóctel de reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., un cóctel de composición de indexación de muestras). El número de diferentes tipos de reactivos de unión de componentes celulares en un cóctel puede variar. En algunas formas de realización, el número de diferentes tipos de reactivos de unión a componentes celulares en el cóctel puede ser de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de diferentes tipos de reactivos de unión a componentes celulares en el cóctel puede ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000 o 100000. Los diferentes tipos de reactivos de unión a componentes celulares se pueden conjugar con oligonucleótidos de reactivos de unión. con secuencias iguales o diferentes (p. ej., secuencias de indexación de muestra).
Métodos de análisis cuantitativo de objetivos de componentes celulares
[0203] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para el análisis cuantitativo de una pluralidad de objetivos de componentes celulares (por ejemplo, objetivos proteicos) en una muestra utilizando las composiciones descritas en el presente documento y oligonucleótidos. sondas que pueden asociar una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia marcadora molecular) a los oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., reactivos de unión a proteínas). Los oligonucleótidos de los reactivos de unión de componentes celulares pueden ser, o comprender, un oligonucleótido de anticuerpo, un oligonucleótido de indexación de muestra, un oligonucleótido de identificación celular, un oligonucleótido de partícula de control, un oligonucleótido de control, un oligonucleótido de determinación de interacción, etc. puede ser una sola célula, una pluralidad de células, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una muestra de sangre o similares. En algunas formas de realización, la muestra puede comprender una mezcla de tipos de células, como células normales, células tumorales, células sanguíneas, células B, células T, células maternas, células fetales, etc., o una mezcla de células de diferentes sujetos.
[0204] En algunas formas de realización, la muestra puede comprender una pluralidad de células individuales separadas en compartimentos individuales, como micropocillos en una matriz de micropocillos.
[0205] En algunas formas de realización, el objetivo de unión de la pluralidad de objetivos de componentes celulares (es decir, el objetivo de componentes celulares) puede ser, o comprender, un carbohidrato, un lípido, una proteína, una proteína extracelular, una proteína de superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, una integrina, una proteína intracelular o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el componente celular diana es una proteína diana. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares comprende una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender componentes celulares intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares puede ser de al menos 1 %, al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 4 %, al menos 5 %, al menos 6 %, al menos 7 %, al menos 8 %, al menos el 9 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o más, de todos los componentes celulares codificados en un organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 1000, al menos 10000 o más objetivos de componentes celulares diferentes.
[0206] En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión de componentes celulares se pone en contacto con la muestra para la unión específica con la pluralidad de objetivos de componentes celulares. Los reactivos de unión a componentes celulares pueden eliminarse, por ejemplo, mediante lavado. En las formas de realización en las que la muestra comprende células, se pueden eliminar los reactivos de unión a componentes celulares que no se unen específicamente a las células.
[0207] En algunos casos, las células de una población de células pueden separarse (p. ej., aislarse) en pocillos de un sustrato de la divulgación. La población de células se puede diluir antes de la separación. La población de células se puede diluir de tal manera que al menos 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los pocillos del sustrato reciben una única célula. La población de células se puede diluir de manera que como máximo 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los pocillos del sustrato reciben una sola célula. La población de células se puede diluir de manera que el número de células en la población diluida sea, o sea al menos, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % del número de pocillos en el sustrato. La población de células se puede diluir de manera que el número de células en la población diluida sea, o sea al menos, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % del número de pocillos en el sustrato. En algunos casos, la población de células se diluye de manera que el número de células es aproximadamente el 10 % del número de pocillos en el sustrato.
[0208] La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede seguir una distribución de Poisson. Por ejemplo, puede haber al menos un 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, o más probabilidad de que un pocillo del sustrato tiene más de una célula. Puede haber al menos un 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, o más probabilidad de que un pocillo de el sustrato tiene más de una célula. La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede ser aleatoria. La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede no ser aleatoria. Las células se pueden separar de manera que un pocillo del sustrato reciba sólo una célula.
[0209] En algunas formas de realización, los reactivos de unión a componentes celulares se pueden conjugar adicionalmente con moléculas fluorescentes para permitir la clasificación por flujo de las células en compartimentos individuales.
[0210] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento proporcionan poner en contacto una pluralidad de composiciones con la muestra para la unión específica con la pluralidad de objetivos de componentes celulares. Se apreciaría que las condiciones utilizadas pueden permitir la unión específica de los reactivos de unión de componentes celulares, por ejemplo, anticuerpos, a las dianas de componentes celulares. Después del paso de contacto, se pueden eliminar las composiciones no unidas. Por ejemplo, en formas de realización en las que la muestra comprende células, y las composiciones se unen específicamente a los componentes celulares que se dirigen son componentes celulares de la superficie celular, como las proteínas de la superficie celular, las composiciones no unidas se pueden eliminar lavando las células con tampón de manera que solo las composiciones que se unen específicamente a los blancos del componente celular permanecen con las células.
[0211] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento pueden comprender asociar un oligonucleótido (p. ej., un código de barras o un código de barras estocástico), incluida una secuencia de código de barras (como una etiqueta molecular), una etiqueta celular, una etiqueta de muestra, etc., o cualquier combinación de los mismos, a la pluralidad de oligonucleótidos asociados con los reactivos de unión a componentes celulares. Por ejemplo, se puede usar una pluralidad de sondas de oligonucleótidos que comprenden un código de barras para hibridar con la pluralidad de oligonucleótidos de las composiciones.
[0212] En algunas formas de realización, la pluralidad de sondas de oligonucleótidos se puede inmovilizar en soportes sólidos. Los soportes sólidos pueden flotar libremente, por ejemplo, perlas en una solución. Los soportes sólidos se pueden incrustar en una matriz semisólida o sólida. En algunas formas de realización, la pluralidad de sondas de oligonucleótidos puede no estar inmovilizada sobre soportes sólidos. Cuando la pluralidad de sondas de oligonucleótidos está muy próxima a la pluralidad asociada con oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares, la pluralidad de oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares puede hibridar con las sondas de oligonucleótidos. Las sondas de oligonucleótidos se pueden poner en contacto en una relación no agotable de modo que cada oligonucleótido distinto de los reactivos de unión a componentes celulares se pueda asociar con sondas de oligonucleótidos que tengan diferentes secuencias de código de barras (p. ej., etiquetas moleculares) de la descripción.
[0213] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento proporcionan la separación de los oligonucleótidos de los reactivos de unión del componente celular que se unen específicamente a las dianas del componente celular. El desprendimiento se puede realizar de diversas formas para separar el grupo químico del reactivo de unión del componente celular, como fotoescisión UV, tratamiento químico (p. ej., tratamiento con ditiotreitol), calentamiento, tratamiento enzimático o cualquier combinación de los mismos. La separación del oligonucleótido del reactivo de unión al componente celular se puede realizar antes, después o durante la etapa de hibridación de la pluralidad de sondas de oligonucleótidos con la pluralidad de oligonucleótidos de las composiciones.
Métodos de análisis cuantitativo simultáneo de dianas de componentes celulares y ácidos nucleicos
[0214] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para el análisis cuantitativo simultáneo de una pluralidad de dianas de componentes celulares (p. ej., dianas de proteínas) y una pluralidad de dianas de ácidos nucleicos. moléculas diana en una muestra usando las composiciones descritas en este documento y sondas de oligonucleótidos que pueden asociar una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia marcadora molecular) tanto a los oligonucleótidos de los reactivos de unión al componente celular como a las moléculas diana de ácido nucleico. Otros métodos de análisis cuantitativo simultáneo de una pluralidad de dianas de componentes celulares y una pluralidad de moléculas diana de ácido nucleico se describen en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° US2018/0088112 y Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° US2018/0346970. En algunas formas de realización, la muestra puede ser una sola célula, una pluralidad de células, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una muestra de sangre o similares. En algunas formas de realización, la muestra puede comprender una mezcla de tipos de células, como células normales, células tumorales, células sanguíneas, células B, células T, células maternas, células fetales o una mezcla de células de diferentes sujetos.
[0215] En algunas formas de realización, la muestra puede comprender una pluralidad de células individuales separadas en compartimentos individuales, como micropocillos en una matriz de micropocillos.
[0216] En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares comprende una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender componentes celulares intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares puede ser, o ser aproximadamente, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores, de todos los componentes celulares, como proteínas expresadas, en un organismo, o una o más células del organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares puede ser al menos, o como máximo, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, de todos los componentes celulares, como las proteínas que se pueden expresar en un organismo, o una o más células del organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender, o comprender aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, 10000, o un número o un rango entre dos cualesquiera de estos valores, objetivos de diferentes componentes celulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender al menos, o comprender como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000 o 10000 objetivos de componentes celulares diferentes.
[0217] En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares se pone en contacto con la muestra para la unión específica con la pluralidad de objetivos de componentes celulares. Los reactivos de unión de componentes celulares no unidos se pueden eliminar, por ejemplo, mediante lavado. En las formas de realización en las que la muestra comprende células, se pueden eliminar los reactivos de unión a componentes celulares que no se unen específicamente a las células.
[0218] En algunos casos, las células de una población de células pueden separarse (p. ej., aislarse) en pocillos de un sustrato de la descripción. La población de células se puede diluir antes de la separación. La población de células se puede diluir de tal manera que al menos 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los pocillos del sustrato reciben una sola célula. La población de células se puede diluir de manera que como máximo 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los pocillos del sustrato reciben una sola célula. La población de células se puede diluir de manera que el número de células en la población diluida sea, o sea al menos, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % del número de pocillos en el sustrato. La población de células se puede diluir de manera que el número de células en la población diluida sea, o sea al menos, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % del número de pocillos en el sustrato. En algunos casos, la población de células se diluye de manera que el número de células es aproximadamente el 10 % del número de pocillos en el sustrato.
[0219] La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede seguir una distribución de Poisson. Por ejemplo, puede haber al menos un 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, o más probabilidad de que un pocillo del sustrato tiene más de una célula. Puede haber al menos un 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, o más probabilidad de que un pocillo de el sustrato tiene más de una célula. La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede ser aleatoria. La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede no ser aleatoria. Las células se pueden separar de manera que un pocillo del sustrato reciba sólo una célula.
[0220] En algunas formas de realización, los reactivos de unión de componentes celulares se pueden conjugar adicionalmente con moléculas fluorescentes para permitir la clasificación de flujo de células en compartimentos individuales.
[0221] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento ponen en contacto una pluralidad de composiciones con la muestra para la unión específica con la pluralidad de objetivos de componentes celulares. Se apreciaría que las condiciones utilizadas pueden permitir la unión específica de los reactivos de unión de componentes celulares, por ejemplo, anticuerpos, a las dianas de componentes celulares. Después del paso de contacto, se pueden eliminar las composiciones no unidas. Por ejemplo, en formas de realización en las que la muestra comprende células, y las composiciones se unen específicamente a los objetivos del componente celular que se encuentran en la superficie celular, como las proteínas de la superficie celular, las composiciones no unidas se pueden eliminar lavando las células con tampón de manera que solo las composiciones que específicamente se unen a los objetivos del componente celular permanecen con las células.
[0222] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento pueden proporcionar la liberación de la pluralidad de moléculas diana de ácido nucleico de la muestra, por ejemplo, células. Por ejemplo, las células se pueden lisar para liberar la pluralidad de moléculas diana de ácido nucleico. La lisis celular se puede lograr por cualquiera de una variedad de medios, por ejemplo, por tratamiento químico, choque osmótico, tratamiento térmico, tratamiento mecánico, tratamiento óptico o cualquier combinación de los mismos. Las células se pueden lisar mediante la adición de un tampón de lisis celular que comprende un detergente (p. ej., SDS, sulfato de dodecil Li, Triton X-100, Tween-20 o NP-40), un disolvente orgánico (p. ej., metanol o acetona) o enzimas digestivas (p. ej., proteinasa K, pepsina o tripsina), o cualquier combinación de las mismas.
[0223] Sería apreciado por alguien de habilidad ordinaria en la técnica que la pluralidad de moléculas de ácido nucleico puede comprender una variedad de moléculas de ácido nucleico. En algunas formas de realización, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico puede comprender moléculas de ADN, moléculas de ARN, moléculas de ADN genómico, moléculas de ARNm, moléculas de ARNr, moléculas de ARNip o una combinación de las mismas, y pueden ser de cadena doble o sencilla. En algunas formas de realización, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico comprende, o comprende aproximadamente, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 100000, 1000000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, especies. En algunas formas de realización, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico comprende al menos, o comprende como máximo, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 100000 o 1000000 especies. En algunas formas de realización, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico puede ser de una muestra, como una sola célula o una pluralidad de células. En algunas formas de realización, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico se puede agrupar a partir de una pluralidad de muestras, como una pluralidad de células individuales.
[0224] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento pueden comprender asociar un código de barras (p. ej., un código de barras estocástico), que puede incluir una secuencia de código de barras (como una etiqueta molecular), una etiqueta de célula, una etiqueta de muestra, etc., o cualquier combinación de los mismos, a la pluralidad de moléculas diana de ácido nucleico y la pluralidad de oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares. Por ejemplo, se puede usar una pluralidad de sondas de oligonucleótidos que comprenden un código de barras estocástico para hibridar con la pluralidad de moléculas diana de ácido nucleico y la pluralidad de oligonucleótidos de las composiciones.
[0225] En algunas formas de realización, la pluralidad de sondas de oligonucleótidos se puede inmovilizar en soportes sólidos. Los soportes sólidos pueden flotar libremente, por ejemplo, perlas en una solución. Los soportes sólidos se pueden incrustar en una matriz semisólida o sólida. En algunas formas de realización, la pluralidad de sondas de oligonucleótidos puede no estar inmovilizada sobre soportes sólidos. Cuando la pluralidad de sondas de oligonucleótidos está muy cerca de la pluralidad de moléculas diana de ácido nucleico y la pluralidad de oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares, la pluralidad de moléculas diana de ácidos nucleicos y la pluralidad de oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares pueden hibridarse. a las sondas de oligonucleótidos. Las sondas de oligonucleótidos pueden ponerse en contacto en una proporción no agotable de modo que cada molécula diana de ácido nucleico distinta y los oligonucleótidos de los reactivos de unión al componente celular puedan asociarse con sondas de oligonucleótidos que tengan diferentes secuencias de código de barras (p. ej., etiquetas moleculares) de la descripción.
[0226] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento proporcionan la separación de los oligonucleótidos de los reactivos de unión del componente celular que se unen específicamente a las dianas del componente celular. El desprendimiento se puede realizar de diversas formas para separar el grupo químico del reactivo de unión del componente celular, como fotoescisión UV, tratamiento químico (p. ej., tratamiento con ditiotreitol), calentamiento, tratamiento enzimático o cualquier combinación de los mismos. La separación del oligonucleótido del reactivo de unión al componente celular se puede realizar antes, después o durante la etapa de hibridación de la pluralidad de sondas de oligonucleótidos con la pluralidad de moléculas diana de ácido nucleico y la pluralidad de oligonucleótidos de las composiciones.
Análisis cuantitativo simultáneo de dianas de proteínas y ácidos nucleicos
[0227] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para el análisis cuantitativo simultáneo de múltiples tipos de moléculas diana, por ejemplo, dianas de proteínas y ácidos nucleicos. Por ejemplo, las moléculas diana pueden ser, o comprender, componentes celulares. FIG. 6 muestra una ilustración esquemática de un método ejemplar de análisis cuantitativo simultáneo de objetivos de ácido nucleico y otros objetivos de componentes celulares (p. ej., proteínas) en células individuales. En algunas formas de realización, se proporciona una pluralidad de composiciones 605, 605b, 605c, etc., cada una de las cuales comprende un reactivo de unión al componente celular, tal como un anticuerpo. Diferentes reactivos de unión a componentes celulares, tales como anticuerpos, que se unen a diferentes dianas de componentes celulares, se conjugan con diferentes identificadores únicos. A continuación, los reactivos de unión de componentes celulares pueden incubarse con una muestra que contiene una pluralidad de células 610. Los diferentes reactivos de unión de componentes celulares pueden unirse específicamente a componentes celulares en la superficie celular, como un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o cualquier combinación de los mismos. Los reactivos de unión de componentes celulares no unidos pueden eliminarse, por ejemplo, lavando las células con un tampón. Las células con los reactivos de unión a componentes celulares se pueden separar luego en una pluralidad de compartimentos, como una matriz de micropocillos, en la que un solo compartimento 615 tiene el tamaño para adaptarse a una sola célula y una sola perla 620. Cada perla puede comprender una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, que pueden comprender un marcador celular que es común a todas las sondas de oligonucleótidos en una perla, y secuencias de código de barras (p. ej., secuencias de marcadores moleculares). En algunas formas de realización, cada sonda de oligonucleótidos puede comprender una región de unión a la diana, por ejemplo, una secuencia poli(dT). Los oligonucleótidos 625 conjugados con el reactivo de unión al componente celular pueden separarse del reactivo de unión al componente celular utilizando medios químicos, ópticos u otros. La célula se puede lisar 635 para liberar ácidos nucleicos dentro de la célula, como ADN genómico o ARNm celular 630. El ARNm celular 630, los oligonucleótidos 625 o ambos pueden ser capturados por las sondas de oligonucleótidos en la perla 620, por ejemplo, hibridando con el poli secuencia (dT). Se puede usar una transcriptasa inversa para extender las sondas de oligonucleótidos hibridadas con el ARNm celular 630 y los oligonucleótidos 625 usando el ARNm celular 630 y los oligonucleótidos 625 como moldes. Los productos de extensión producidos por la transcriptasa inversa pueden ser objeto de amplificación y secuenciación. Las lecturas de secuenciación pueden estar sujetas a demultiplexación de secuencias o identificación de archivos de etiquetas celulares, códigos de barras (p. ej., etiquetas moleculares), genes, reactivos de unión a componentes celulares, oligonucleótidos específicos (p. ej., oligonucleótidos específicos de anticuerpos), etc., que pueden dar lugar a una representación digital de los componentes celulares y la expresión génica de cada uno de ellos. célula en la muestra.
Asociación de códigos de barras
[0228] Los oligonucleótidos asociados con los reactivos de unión de componentes celulares (p. ej., reactivos de unión a antígenos o reactivos de unión a proteínas) y/o las moléculas de ácido nucleico pueden asociarse aleatoriamente con las sondas de oligonucleótidos (p. ej., códigos de barras, como códigos de barras estocásticos). Los oligonucleótidos asociados con los reactivos de unión de componentes celulares, denominados en el presente documento oligonucleótidos de reactivos de unión, pueden ser o comprender oligonucleótidos de la divulgación, como un oligonucleótido de anticuerpo, un oligonucleótido de indexación de muestra, un oligonucleótido de identificación celular, un oligonucleótido de partícula de control, un oligonucleótido de control, un oligonucleótido de determinación de interacción, etc. La asociación puede comprender, por ejemplo, la hibridación de una región de unión diana de una sonda de oligonucleótidos con una porción complementaria de la molécula de ácido nucleico diana y/o los oligonucleótidos de los reactivos de unión a proteínas. Por ejemplo, una región oligo(dT) de un código de barras (p. ej., un código de barras estocástico) puede interactuar con una cola poli(A) de una molécula de ácido nucleico diana y/o una cola poli(A) de un oligonucleótido de una proteína de unión. reactivo. Las condiciones de ensayo utilizadas para la hibridación (p. ej., pH del tampón, fuerza iónica, temperatura, etc.) pueden elegirse para promover la formación de híbridos específicos y estables.
[0229] La descripción proporciona métodos para asociar un marcador molecular con un ácido nucleico diana y/o un oligonucleótido asociado con un reactivo de unión a componente celular usando transcripción inversa. Como transcriptasa inversa, puede usar tanto ARN como ADN como molde. Por ejemplo, el oligonucleótido conjugado originalmente en el reactivo de unión al componente celular puede ser una base de ARN o ADN, o ambas. Un oligonucleótido reactivo de unión se puede copiar y vincular (p. ej., enlazar covalentemente) a un marcador celular y una secuencia de código de barras (p. ej., un marcador molecular) además de la secuencia, o una parte de la misma, de la secuencia del reactivo de unión. Como otro ejemplo, una molécula de ARNm se puede copiar y enlazar (p. ej., enlazar covalentemente) a un marcador celular y una secuencia de código de barras (p. ej., un marcador molecular) además de la secuencia de la molécula de ARNm, o una parte de la misma.
[0230] En algunas formas de realización, las etiquetas moleculares se pueden agregar mediante la unión de una región de unión a la diana de una sonda de oligonucleótidos y una parte de la molécula de ácido nucleico diana y/o los oligonucleótidos asociados con (p. ej., actualmente o previamente asociados con) con reactivos de unión de componentes celulares. Por ejemplo, la región de unión a la diana puede comprender una secuencia de ácido nucleico que puede ser capaz de una hibridación específica con un saliente del sitio de restricción (p. ej., un saliente del extremo pegajoso de EcoRI). Los métodos pueden comprender además el tratamiento de los ácidos nucleicos diana y/o los oligonucleótidos asociados con los reactivos de unión a componentes celulares con una enzima de restricción (p. ej., EcoRI) para crear un sitio de restricción sobresaliente. Puede usarse una ligasa (p. ej., ADN ligasa T4) para unir los dos fragmentos.
Determinación del número o la presencia de secuencias marcadoras moleculares únicas
[0231] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden la determinación del número o la presencia de secuencias marcadoras moleculares únicas para cada identificador único, cada molécula diana de ácido nucleico y/o cada oligonucleótido reactivo de unión (por ejemplo, oligonucleótidos de anticuerpos). Por ejemplo, las lecturas de secuenciación se pueden usar para determinar el número de secuencias de etiquetas moleculares únicas para cada identificador único, cada molécula diana de ácido nucleico y/o cada oligonucleótido reactivo de unión. Como otro ejemplo, las lecturas de secuenciación se pueden usar para determinar la presencia o ausencia de una secuencia de marcador molecular (como una secuencia de marcador molecular asociada con un objetivo, un oligonucleótido de reactivo de unión, un oligonucleótido de anticuerpo, un oligonucleótido de indexación de muestra, un oligonucleótido de identificación celular), un oligonucleótido de partícula de control, un oligonucleótido de control, un oligonucleótido de determinación de interacción, etc. en las lecturas de secuenciación).
[0232] En algunas formas de realización, el número de secuencias marcadoras moleculares únicas para cada identificador único, cada molécula diana de ácido nucleico y/o cada oligonucleótido de reactivo de unión indica la cantidad de cada diana de componente celular (p. ej., una diana de antígeno o una diana de proteína) y/o cada molécula diana de ácido nucleico en la muestra. En algunas formas de realización, la cantidad de un componente celular diana y la cantidad de sus moléculas diana de ácido nucleico correspondientes, por ejemplo, moléculas de ARNm, pueden compararse entre sí. En algunas formas de realización, se puede calcular la proporción de la cantidad de un componente celular diana y la cantidad de sus correspondientes moléculas diana de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas de ARNm. Los objetivos del componente celular pueden ser, por ejemplo, marcadores de proteínas de la superficie celular. En algunas formas de realización, la relación entre el nivel de proteína de un marcador de proteína de superficie celular y el nivel del ARNm del marcador de proteína de superficie celular es bajo.
[0233] Los métodos descritos en este documento se pueden usar para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para el análisis del proteoma y/o del transcriptoma de una muestra. En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para identificar un objetivo de componente celular y/o un objetivo de ácido nucleico, es decir, un biomarcador, en una muestra. En algunas formas de realización, el objetivo del componente celular y el objetivo del ácido nucleico se corresponden entre sí, es decir, el objetivo del ácido nucleico codifica el objetivo del componente celular. En algunas formas de realización, los métodos descritos en este documento se pueden usar para identificar objetivos de componentes celulares que tienen una relación deseada entre la cantidad del componente celular diana y la cantidad de su molécula diana de ácido nucleico correspondiente en una muestra, por ejemplo, molécula de ARNm. En algunas formas de realización, la relación es, o es aproximadamente, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de los dos valores anteriores. En algunas formas de realización, la relación es al menos, o es como máximo, 0,001,0,01,0,1, 1, 10, 100 o 1000. En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para identificar objetivos de componentes celulares en una muestra que la cantidad de su correspondiente molécula diana de ácido nucleico en la muestra es, o es aproximadamente, 1000, 100, 10, 5, 2 1, 0, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para identificar dianas de componentes celulares en una muestra en la que la cantidad de su molécula diana de ácido nucleico correspondiente en la muestra es mayor o menor que 1000, 100, 10, 5, 21, o 0.
Composiciones y kits
[0234] Algunas formas de realización descritas en este documento proporcionan kits y composiciones para el análisis cuantitativo simultáneo de una pluralidad de componentes celulares (p. ej., proteínas) y/o una pluralidad de moléculas diana de ácido nucleico en una muestra. Los kits y composiciones pueden, en algunas formas de realización, comprender una pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., una pluralidad de reactivos de unión a proteínas) cada uno conjugado con un oligonucleótido, en donde el oligonucleótido comprende un identificador único para el reactivo de unión a componentes celulares, y un una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, donde cada una de la pluralidad de sondas de oligonucleótidos comprende una región de unión objetivo, una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de marcador molecular), donde la secuencia de código de barras es de un conjunto diverso de secuencias de código de barras únicas. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un marcador molecular, un marcador celular, un marcador de muestra o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un enlazador. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un sitio de unión para una sonda de oligonucleótidos, como una cola de poli(A). Por ejemplo, la cola de poli(A) puede ser, por ejemplo, oligodAis (no anclada a un soporte sólido) u oligoAisV (anclada a un soporte sólido). Los oligonucleótidos pueden comprender restos de ADN, restos de ARN o ambos.
[0235] En el presente documento se incluye una pluralidad de composiciones de indexación de muestras. Cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras puede comprender dos o más reactivos de unión a componentes celulares. Cada uno de los dos o más reactivos de unión a componentes celulares se puede asociar con un oligonucleótido de indexación de muestra. Al menos uno de los dos o más reactivos de unión a componentes celulares puede ser capaz de unirse específicamente a al menos un objetivo de componente celular. El oligonucleótido de indexación de muestras puede comprender una secuencia de indexación de muestras para identificar el origen de una o más células de una muestra. Las secuencias de indexación de muestra de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra pueden comprender secuencias diferentes.
[0236] En el presente documento se describen kits que comprenden composiciones de indexación de muestras para la identificación de células. En algunas formas de realización. Cada una de las dos composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión a componentes celulares (p. ej., un reactivo de unión a proteínas) asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, en donde el reactivo de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más componentes celulares dianas (p. ej., una o más dianas proteicas) y en donde el reactivo de unión al componente celular comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de indexación de la muestra y una secuencia de alineamiento adyacente a una región poli(dA), y en donde las secuencias de indexación de muestra de las dos composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal o una combinación de los mismos.
[0237] En el presente documento se describen kits para la identificación de células. En algunas formas de realización, el kit comprende: dos o más composiciones de indexación de muestras. Cada una de las dos o más composiciones de indexación de muestras puede comprender un reactivo de unión de componentes celulares (por ejemplo, un reactivo de unión de antígenos) asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares y en donde el reactivo de unión al componente celular comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en donde el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de indexación de muestra y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y en donde las secuencias de indexación de muestra de las dos composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal o una combinación de los mismos. En el presente documento se describen kits para la identificación de multipletes. En algunas formas de realización, el kit comprende dos composiciones de indexación de muestras. Cada una de las dos composiciones de indexación de muestras puede comprender un reactivo de unión de componentes celulares (p. ej., un reactivo de unión de antígenos) asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, en donde el reactivo de unión de antígenos es capaz de unirse específicamente a al menos una de una o más dianas de componentes celulares (ej., dianas antigénicas) y en donde el reactivo de unión al componente celular comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de indexación de la muestra y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y en donde las secuencias de indexación de muestra de las dos composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes.
[0238] Los identificadores únicos (u oligonucleótidos asociados con reactivos de unión a componentes celulares, como oligonucleótidos de reactivos de unión, oligonucleótidos de anticuerpos, oligonucleótidos de indexación de muestras, oligonucleótidos de identificación celular, oligonucleótidos de partículas de control, oligonucleótidos de control u oligonucleótidos de determinación de interacción) pueden tener cualquier longitud adecuada, por ejemplo, de aproximadamente 25 nucleótidos a unos 45 nucleótidos de largo. En algunas formas de realización, el identificador único puede tener una longitud de aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 200 nucleótidos, o un rango que esté entre cualquiera de los dos valores anteriores.
[0239] En algunas formas de realización, los identificadores únicos se seleccionan de un conjunto diverso de identificadores únicos. El conjunto diverso de identificadores únicos puede comprender, o comprender aproximadamente, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, o un número o un rango entre dos de estos valores, identificadores únicos diferentes. El conjunto diverso de identificadores únicos puede comprender al menos, o comprender como máximo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 o 5000, identificadores únicos diferentes. En algunas formas de realización, el conjunto de identificadores únicos está diseñado para tener una homología de secuencia mínima con las secuencias de ADN o ARN de la muestra que se va a analizar. En algunas formas de realización, las secuencias del conjunto de identificadores únicos son diferentes entre sí, o su complemento, en, o en aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nucleótidos, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, las secuencias del conjunto de identificadores únicos son diferentes entre sí, o su complemento, en al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos.
[0240] En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender un sitio de unión para un cebador, como un cebador universal. En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender al menos dos sitios de unión para un cebador, como un cebador universal. En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender al menos tres sitios de unión para un cebador, como un cebador universal. Los cebadores se pueden usar para la amplificación de los identificadores únicos, por ejemplo, mediante amplificación por PCR. En algunas formas de realización, los cebadores pueden usarse para reacciones de PCR anidadas.
[0241] Los reactivos de unión a componentes celulares pueden ser reactivos de unión a proteínas. En algunas formas de realización, los reactivos de unión a componentes celulares pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos monocatenarios (scAb), o fragmentos de los mismos, como Fab, Fv, etc. En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión a proteínas puede comprender, o comprender aproximadamente, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, o un número o un rango entre dos de estos valores, diferentes reactivos de unión a proteínas. En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión a proteínas puede comprender al menos, o comprender como máximo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 o 5000, diferentes reactivos de unión a proteínas.
[0242] En algunas formas de realización, el oligonucleótido se conjuga con el reactivo de unión al componente celular a través de un enlazador. En algunas formas de realización, el oligonucleótido puede conjugarse covalentemente con el reactivo de unión a proteínas. En alguna forma de realización, el oligonucleótido se puede conjugar con el reactivo de unión a proteínas de forma no covalente. En algunas formas de realización, el enlazador puede comprender un grupo químico que une de forma reversible o irreversible el oligonucleótido a los reactivos de unión a proteínas. El grupo químico se puede conjugar con el enlazador, por ejemplo, a través de un grupo amino. En algunas formas de realización, el conector puede comprender un grupo químico que forma un enlace estable con otro grupo químico conjugado con el reactivo de unión a proteínas. Por ejemplo, el grupo químico puede ser un grupo fotoescindible UV, un enlace disulfuro, una estreptavidina, una biotina, una amina, etc. En algunas formas de realización, el grupo químico puede conjugarse con el reactivo de unión a proteínas mediante una amina primaria en un aminoácido, como la lisina, o el N-terminal. El oligonucleótido se puede conjugar con cualquier sitio adecuado del reactivo de unión a proteínas, siempre que no interfiera con la unión específica entre el reactivo de unión a proteínas y su proteína diana. En formas de realización en las que el reactivo de unión a proteínas es un anticuerpo, el oligonucleótido se puede conjugar con el anticuerpo en cualquier lugar que no sea el sitio de unión al antígeno, por ejemplo, la región Fc, el dominio Ch1, el dominio Ch2, el dominio Ch3, el dominio Cl, etc. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a proteínas se puede conjugar con una sola molécula de oligonucleótido. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a proteínas se puede conjugar con, o con aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, moléculas de oligonucleótidos, donde cada una de las moléculas de oligonucleótidos comprende el mismo identificador único. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a proteínas se puede conjugar con más de una molécula de oligonucleótido, por ejemplo, al menos o como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000, moléculas de oligonucleótidos, en las que cada una de las moléculas de oligonucleótidos comprende el mismo identificador único.
[0243] En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., reactivos de unión a proteínas) son capaces de unirse específicamente a una pluralidad de dianas de componentes celulares (p. ej., dianas de proteínas) en una muestra. La muestra puede ser, o comprender, una única célula, una pluralidad de células, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una muestra de sangre o similares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares comprende una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender proteínas intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender proteínas intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede ser, o ser aproximadamente, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores de todos los componentes celulares dianas (p. ej., proteínas expresadas o que podrían expresarse) en un organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede ser al menos, o como máximo, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de todos los objetivos de componentes celulares (p. ej., proteínas expresadas o que podrían expresarse) en un organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender, o comprender aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, 10000, o un número o un rango entre dos cualesquiera de estos valores, objetivos de diferentes componentes celulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender al menos, o comprender como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000 o 10000 objetivos de componentes celulares diferentes.
Indexación de muestras usando reactivo de unión de componentes celulares conjugados con oligonucleótidos
[0244] En el presente documento se describen métodos para la identificación de muestras. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una o más células de cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, donde cada una o más células comprende uno o más objetivos de componentes celulares, donde cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares y donde el componente celularreactivo de unión comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de indexación de la muestra y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y en donde la muestra las secuencias de indexación de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes; eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras; codificar con barras (p. ej., codificar con barras estocásticamente) los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando una pluralidad de códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestras de al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0245] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras usando la pluralidad de códigos de barras comprende: poner en contacto la pluralidad de códigos de barras con los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestras; y extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras usando una ADN polimerasa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras utilizando una transcriptasa inversa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0246] Un oligonucleótido conjugado con un anticuerpo, un oligonucleótido para la conjugación con un anticuerpo, o un oligonucleótido previamente conjugado con un anticuerpo se denomina en el presente documento oligonucleótido de anticuerpo (“AbOligo”). Los oligonucleótidos de anticuerpos en el contexto de la indexación de muestras se denominan en este documento oligonucleótidos de indexación de muestras. Un anticuerpo conjugado con un oligonucleótido de anticuerpo se denomina en este documento anticuerpo caliente o anticuerpo oligonucleótido. Un anticuerpo no conjugado con un oligonucleótido de anticuerpo se denomina aquí anticuerpo frío o anticuerpo sin oligonucleótido. Un oligonucleótido conjugado con un reactivo de unión (p. ej., un reactivo de unión a proteínas), un oligonucleótido para la conjugación con un reactivo de unión o un oligonucleótido previamente conjugado con un reactivo de unión se denomina aquí oligonucleótido reactivo. Los oligonucleótidos reactivos en el contexto de la indexación de muestras se denominan en este documento oligonucleótidos de indexación de muestras. Un reactivo de unión conjugado con un oligonucleótido de anticuerpo se denomina aquí reactivo de unión caliente o reactivo de unión de oligonucleótidos. Un reactivo de unión no conjugado con un oligonucleótido de anticuerpo se denomina aquí reactivo de unión en frío o reactivo de unión libre de oligonucleótidos.
[0247] La FIG. 7 muestra una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar que utiliza reactivos de unión a componentes celulares asociados a oligonucleótidos para la indexación de muestras. En algunas formas de realización, se proporciona una pluralidad de composiciones 705a, 705b, etc., cada una de las cuales comprende un reactivo de unión. El reactivo de unión puede ser un reactivo de unión a proteínas, tal como un anticuerpo. El reactivo de unión al componente celular puede comprender un anticuerpo, un tetrámero, un aptámero, un andamio de proteína o una combinación de los mismos. Los reactivos de unión de la pluralidad de composiciones 705a, 705b pueden unirse a un objetivo de componente celular idéntico. Por ejemplo, los reactivos de unión de la pluralidad de composiciones 705, 705b pueden ser idénticos (excepto los oligonucleótidos de indexación de muestra asociados con los reactivos de unión).
[0248] Las diferentes composiciones pueden incluir reactivos de unión conjugados con oligonucleótidos de indexación de muestra con diferentes secuencias de indexación de muestra. El número de composiciones diferentes puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de composiciones diferentes puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de composiciones diferentes puede ser al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10000.
[0249] En algunas formas de realización, los oligonucleótidos de indexación de muestra de los reactivos de unión en una composición pueden incluir una secuencia de indexación de muestra idéntica. Los oligonucleótidos de indexación de muestra de los reactivos de unión en una composición pueden no ser idénticos. En algunas formas de realización, el porcentaje de oligonucleótidos de indexación de muestra de reactivos de unión en una composición con una secuencia de indexación de muestra idéntica puede ser, o ser aproximadamente, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el porcentaje de oligonucleótidos de indexación de muestra de reactivos de unión en una composición con una secuencia de indexación de muestra idéntica puede ser al menos, o como máximo, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,9 %.
[0250] Las composiciones 705a y 705b se pueden usar para etiquetar muestras de diferentes muestras. Por ejemplo, los oligonucleótidos de indexación de muestras del reactivo de unión de componentes celulares en la composición 705a pueden tener una secuencia de indexación de muestras y se pueden usar para marcar células 710a, que se muestran como círculos negros, en una muestra 707a, como una muestra de un paciente. Los oligonucleótidos de indexación de muestras de los reactivos de unión de componentes celulares en la composición 705b pueden tener otra secuencia de indexación de muestras y se pueden usar para marcar las células 710b, que se muestran como círculos sombreados, en una muestra 707b, como una muestra de otro paciente u otra muestra de el mismo paciente Los reactivos de unión de componentes celulares pueden unirse específicamente a objetivos de componentes celulares o proteínas en la superficie celular, como un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, o cualquier combinación de los mismos. Los reactivos de unión de componentes celulares no unidos pueden eliminarse, por ejemplo, lavando las células con un tampón.
[0251] Las células con los reactivos de unión de componentes celulares pueden separarse luego en una pluralidad de compartimentos, como una matriz de micropocillos, en la que un solo compartimento 715a, 715b tiene el tamaño para adaptarse a una sola célula 710a y una sola perla 720a o un solo célula 710b y una sola perla 720b. Cada perla 720a, 720b puede comprender una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, que pueden comprender una etiqueta celular que es común a todas las sondas de oligonucleótidos en una perla, y secuencias de etiquetas moleculares. En algunas formas de realización, cada sonda de oligonucleótidos puede comprender una región de unión a la diana, por ejemplo, una secuencia poli(dT). Los oligonucleótidos de indexación de muestra 725a conjugados con el reactivo de unión al componente celular de la composición 705a pueden configurarse para ser (o pueden ser) separables o no separables del reactivo de unión del componente celular. Los oligonucleótidos de indexación de muestra 725a conjugados con el reactivo de unión al componente celular de la composición 705a pueden separarse del reactivo de unión al componente celular utilizando medios químicos, ópticos u otros. Los oligonucleótidos de indexación de muestra 725b conjugados con el reactivo de unión al componente celular de la composición 705b pueden configurarse para ser (o pueden ser) separables o no separables del reactivo de unión del componente celular. Los oligonucleótidos de indexación de muestra 725b conjugados con el reactivo de unión al componente celular de la composición 705b se pueden separar del reactivo de unión al componente celular utilizando medios químicos, ópticos u otros.
[0252] La célula 710a se puede lisar para liberar ácidos nucleicos dentro de la célula 710a, como el ADN genómico o el ARNm celular 730a. La célula lisada 735a se muestra como un círculo de puntos. El ARNm celular 730a, los oligonucleótidos de indexación de muestras 725a o ambos pueden ser capturados por las sondas de oligonucleótidos en la perla 720a, por ejemplo, hibridando con la secuencia poli(dT). Se puede usar una transcriptasa inversa para extender las sondas de oligonucleótidos hibridadas con el ARNm celular 730a y los oligonucleótidos 725a usando el ARNm celular 730a y los oligonucleótidos 725a como moldes. Los productos de extensión producidos por la transcriptasa inversa pueden ser objeto de amplificación y secuenciación.
[0253] De manera similar, la célula 710b se puede lisar para liberar ácidos nucleicos dentro de la célula 710b, como el ADN genómico o el ARNm celular 730b. La célula lisada 735b se muestra como un círculo de puntos. El ARNm celular 730b, los oligonucleótidos de indexación de muestras 725b, o ambos, pueden ser capturados por las sondas de oligonucleótidos en la perla 720b, por ejemplo, hibridando con la secuencia poli(dT). Se puede usar una transcriptasa inversa para extender las sondas de oligonucleótidos hibridadas con el ARNm celular 730b y los oligonucleótidos 725b usando el ARNm celular 730b y los oligonucleótidos 725b como moldes. Los productos de extensión producidos por la transcriptasa inversa pueden ser objeto de amplificación y secuenciación.
[0254] Las lecturas de secuenciación pueden estar sujetas a la desmultiplexación de etiquetas celulares, etiquetas moleculares, identidades génicas e identidades de muestra (p. ej., en términos de secuencias de indexación de muestra de oligonucleótidos de indexación de muestra 725a y 725b). La demultiplexación de etiquetas celulares, etiquetas moleculares e identidades génicas puede dar lugar a una representación digital de la expresión génica de cada célula individual de la muestra. La desmultiplexación de etiquetas celulares, etiquetas moleculares e identidades de muestras, utilizando secuencias de indexación de muestras de oligonucleótidos de indexación de muestras, puede usarse para determinar el origen de una muestra.
[0255] En algunas formas de realización, los reactivos de unión de componentes celulares contra los reactivos de unión de componentes celulares se pueden conjugar en la superficie celular con una biblioteca de oligonucleótidos de indexación de muestras únicos para permitir que las células conserven la identidad de la muestra. Por ejemplo, los anticuerpos contra los marcadores de la superficie celular se pueden conjugar con una biblioteca de oligonucleótidos de indexación de muestras únicos para permitir que las células conserven la identidad de la muestra. Esto permitirá que se carguen varias muestras en el mismo cartucho Rhapsody™, ya que la información relativa a la fuente de la muestra se conserva durante la preparación y la secuenciación de la biblioteca. La indexación de muestras puede permitir que varias muestras se ejecuten juntas en un solo experimento, simplificando y acortando el tiempo del experimento y eliminando el efecto de lote.
[0256] En este documento se describen métodos para la identificación de muestras. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una o más células de cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, donde cada una o más células comprende uno o más objetivos de componentes celulares, donde cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares y donde el reactivo de unión de componentes celulares comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de indexación de la muestra y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y en donde la muestra las secuencias de indexación de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes; eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras. El método puede incluir la codificación de barras (p. ej., codificación estocástica de barras) de los oligonucleótidos de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestras de al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0257] En algunas formas de realización, el método para la identificación de muestras comprende: poner en contacto una o más células de cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, donde cada una o más células comprende una o más dianas de componentes celulares, donde cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos una de las una o más dianas de componentes celulares y en donde el reactivo de unión a componentes celulares comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de indexación de la muestra y una secuencia de alineación adyacente a un poli(dA) región, y en donde las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra.
[0258] En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende: códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos) oligonucleótidos de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos) para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestras de al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando la pluralidad de códigos de barras para crear la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras comprende la codificación de barras estocástica de los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras estocásticos.
[0259] En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula puede comprender identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra. Identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestra puede comprender: replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra replicados; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicadas; e identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestra de un oligonucleótido de indexación de muestra replicado de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra que corresponden al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras en los datos de secuenciación.
[0260] En algunas formas de realización, replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra replicados comprende: antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, ligar un adaptador de replicación a al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras. oligonucleótido. La replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras puede comprender la replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras usando el adaptador de replicación ligado al al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicadas.
[0261] En algunas formas de realización, replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados comprende: antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras, poner en contacto una sonda de captura con al menos un oligonucleótido de indexación de muestras para generar una sonda de captura hibridada con el oligonucleótido de indexación de la muestra; y extender la sonda de captura hibridada con el oligonucleótido de indexación de muestra para generar un oligonucleótido de indexación de muestra asociado con la sonda de captura. La replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras puede comprender la replicación del oligonucleótido de indexación de muestras asociado con la sonda de captura para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados.
Sobrecarga de células e identificación de multipletes
[0262] También se describen en este documento métodos, kits y sistemas para identificar sobrecarga de células y multipletes. Dichos métodos, kits y sistemas se pueden usar en, o en combinación con, cualquier método, kit y sistema adecuado descrito en el presente documento, por ejemplo, los métodos, kits y sistemas para medir el nivel de expresión del componente celular (como el nivel de expresión de proteína) usando los reactivos de unión a componentes celulares asociados con oligonucleótidos.
[0263] Utilizando la tecnología actual de carga de células, cuando se cargan alrededor de 20000 células en un cartucho o matriz de micropocillos con ~60000 micropocillos, el número de micropocillos o gotitas con dos o más células (denominados dobletes o multipletes) puede ser mínimo. Sin embargo, cuando aumenta la cantidad de células cargadas, la cantidad de micropocillos o gotitas con múltiples células puede aumentar significativamente. Por ejemplo, cuando se cargan alrededor de 50000 células en alrededor de 60000 micropocillos de un cartucho o matriz de micropocillos, el porcentaje de micropocillos con múltiples células puede ser bastante alto, como 11-14 %. Tal carga de un gran número de células en micropocillos puede denominarse sobrecarga de células. Sin embargo, si las células se dividen en varios grupos (p. ej., 5) y las células de cada grupo se etiquetan con oligonucleótidos de indexación de muestras con distintas secuencias de indexación de muestras, una etiqueta de célula (p. ej., una etiqueta de célula de un código de barras, como un código de barras estocástico) asociado con dos o más secuencias de indexación de muestras puede identificarse en los datos de secuenciación y eliminarse del procesamiento posterior. En algunas formas de realización, las células se dividen en una gran cantidad de grupos (p. ej., 10000), y las células de cada grupo se etiquetan con oligonucleótidos de indexación de muestras con distintas secuencias de indexación de muestras, se puede etiquetar una muestra asociada con dos o más secuencias de indexación de muestras. identificados en los datos de secuenciación y eliminados del procesamiento posterior. En algunas formas de realización, diferentes células se marcan con oligonucleótidos de identificación celular con distintas secuencias de identificación celular, una secuencia de identificación celular asociada con dos o más oligonucleótidos de identificación celular puede identificarse en los datos de secuenciación y eliminarse del procesamiento posterior. Dicho mayor número de células puede cargarse en micropocillos en relación con el número de micropocillos en un cartucho o matriz de micropocillos.
[0264] En este documento se describen métodos para la identificación de muestras. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una primera pluralidad de células y una segunda pluralidad de células con dos composiciones de indexación de muestra, respectivamente, donde cada una de la primera pluralidad de células y cada una de la segunda pluralidad de células comprenden uno o más componentes celulares, donde cada una de las dos composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más componentes celulares, donde el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestra y una secuencia de alineamiento adyacente a una región poli(dA), y donde las secuencias de indexación de muestra de las dos composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes; codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando una pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiquetas de células, una secuencia de códigos de barras (p. ej., una secuencia de etiquetas moleculares) y un región de unión a objetivo, en la que las secuencias de códigos de barras de al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden secuencias diferentes, y en la que al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiqueta de célula idéntica; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar una o más secuencias de marcadores celulares, cada una de las cuales está asociada con dos o más secuencias de indexación de muestra en los datos de secuenciación obtenidos; y eliminar los datos de secuenciación asociados con una o más secuencias de etiquetas de células que están asociadas con dos o más secuencias de indexación de muestra de los datos de secuenciación obtenidos y/o excluir los datos de secuenciación asociados con una o más secuencias de etiquetas de células que están asociadas con dos o más secuencias de indexación de muestras de análisis posteriores (p. ej., perfiles de ARNm de una sola célula o análisis de transcriptoma completo). En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de marcador molecular), un sitio de unión para un cebador universal o una combinación de los mismos.
[0265] Por ejemplo, el método se puede usar para cargar 50000 o más células (en comparación con 10000-20000 células) usando la indexación de muestras. La indexación de muestras puede utilizar reactivos de unión de componentes celulares conjugados con oligonucleótidos (p. ej., anticuerpos) o reactivos de unión de componentes celulares contra un componente celular (p. ej., un marcador proteico universal) para etiquetar células de diferentes muestras con un índice de muestra único. Cuando dos o más células de diferentes muestras, dos o más células de diferentes poblaciones de células de una muestra, o dos o más células de una muestra, se capturan en el mismo micropocillo o gotita, la “célula” combinada (o el contenido de la dos o más células) se puede asociar con oligonucleótidos de indexación de muestras con diferentes secuencias de indexación de muestras (u oligonucleótidos de identificación celular con diferentes secuencias de identificación celular). El número de diferentes poblaciones de células puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de poblaciones diferentes puede ser, o ser aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de poblaciones diferentes puede ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100. El número, o el número medio, de células en cada población puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número, o el número medio, de células en cada población puede ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número, o el número promedio, de células en cada población puede ser al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100. Cuando el número, o el número promedio, de células en cada población es lo suficientemente pequeño (p. ej., igual o menor que 50, 25, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 células por población), la composición de indexación de muestras para la sobrecarga de células y la identificación de multipletes se puede denominar composiciones de identificación de células.
[0266] Las células de una muestra se pueden dividir en múltiples poblaciones dividiendo las células de la muestra en alícuotas en las múltiples poblaciones. Una “célula” asociada con más de una secuencia de indexación de muestra en los datos de secuenciación puede identificarse como un “multiplete” basado en dos o más secuencias de indexación de muestra asociadas con una secuencia de etiqueta de célula (p. ej., una secuencia de etiqueta de célula de un código de barras, como como un código de barras estocástico) en los datos de secuenciación. Los datos de secuenciación de una “célula” combinada también se denominan aquí multiplete. Un multiplete puede ser un doblete, un triplete, un cuarteto, un quinteto, un sexteto, un septeto, un octeto, un noneto o cualquier combinación de los mismos. Un multiplete puede ser cualquier n-pleto. En algunas formas de realización, n es, o es aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, n es al menos, o es como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20.
[0267] Al determinar los perfiles de expresión de células individuales, dos células pueden identificarse como una célula y los perfiles de expresión de las dos células pueden identificarse como el perfil de expresión para una célula (denominado perfil de expresión doble). Por ejemplo, cuando se determinan los perfiles de expresión de dos células utilizando códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos), las moléculas de ARNm de las dos células se pueden asociar con códigos de barras que tienen la misma etiqueta celular. Como otro ejemplo, dos células pueden estar asociadas con una partícula (por ejemplo, una perla). La partícula puede incluir códigos de barras con la misma etiqueta de célula. Después de lisar las células, las moléculas de ARNm en las dos células se pueden asociar con los códigos de barras de la partícula, por lo tanto, la misma etiqueta celular. Los perfiles de expresión de doblete pueden sesgar la interpretación de los perfiles de expresión.
[0268] Un doblete puede referirse a una “célula” combinada asociada con dos oligonucleótidos de indexación de muestra con diferentes secuencias de indexación de muestra. Un doblete también puede referirse a una “célula” combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con dos secuencias de indexación de muestra. Puede ocurrir un doblete cuando dos células asociadas con dos oligonucleótidos de indexación de muestra de diferentes secuencias (o dos o más células asociadas con oligonucleótidos de indexación de muestra con dos secuencias de indexación de muestra diferentes) se capturan en el mismo micropocillo o gota, la “célula” combinada puede ser asociado con dos oligonucleótidos de indexación de muestra con diferentes secuencias de indexación de muestra. Un triplete puede referirse a una “célula” combinada asociada con tres oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una “célula” combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con tres secuencias de indexación de muestra diferentes. Un cuarteto puede referirse a una “célula” combinada asociada con cuatro oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una “célula” combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con cuatro secuencias de indexación de muestra diferentes. Un quinteto puede referirse a una “célula” combinada asociada con cinco oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una “célula” combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con cinco secuencias de indexación de muestra diferentes. Un sexteto puede referirse a una “célula” combinada asociada con seis oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una “célula” combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con seis secuencias de indexación de muestra diferentes. Un septeto puede referirse a una “célula” combinada asociada con siete oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una “célula” combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con siete secuencias de indexación de muestra diferentes. Un octeto puede referirse a una “célula” combinada asociada con ocho oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una “célula” combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con ocho secuencias de indexación de muestra diferentes. Un noneto puede referirse a una “célula” combinada asociada con nueve oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una “célula” combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con nueve secuencias de indexación de muestra diferentes. Un multiplete puede ocurrir cuando dos o más células asociadas con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestras de diferentes secuencias (o dos o más células asociadas con oligonucleótidos de indexación de muestras con dos o más secuencias de indexación de muestras diferentes) se capturan en el mismo micropocillo o gota, la “célula” combinada se puede asociar con oligonucleótidos de indexación de muestra con dos o más secuencias de indexación de muestra diferentes.
[0269] Como otro ejemplo, el método se puede usar para la identificación de multipletes, ya sea en el contexto de la sobrecarga de muestras o en el contexto de cargar células en micropocillos de una matriz de micropocillos o generar gotitas que contienen células. Cuando se cargan dos o más células en un micropocillo, los datos resultantes de la “célula” combinada (o el contenido de las dos o más células) es un multiplete con un perfil de expresión génica aberrante. Mediante el uso de la indexación de muestras, uno puede reconocer algunos de estos multipletes buscando etiquetas de célula que estén asociadas o asignadas a dos o más oligonucleótidos de indexación de muestras con diferentes secuencias de indexación de muestras (u oligonucleótidos de indexación de muestras con dos o más secuencias de indexación de muestras). Con la secuencia de indexación de muestras, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para la identificación de multipletes (ya sea en el contexto de sobrecarga de muestras o no, o en el contexto de cargar células en micropocillos de una matriz de micropocillos o generar gotitas que contienen células). En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una primera pluralidad de células y una segunda pluralidad de células con dos composiciones de indexación de muestra, respectivamente, donde cada una de la primera pluralidad de células y cada una de la segunda pluralidad de células comprenden uno o más componentes celulares, donde cada una de las dos composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión a componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más componentes celulares y donde el reactivo de unión a componentes celulares reactivo comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de indexación de la muestra y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y en donde la indexación de la muestra las secuencias de las dos composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando una pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiquetas de células, una secuencia de códigos de barras (p. ej., una secuencia de etiquetas moleculares) y un objetivo de unión región, en la que las secuencias de códigos de barras de al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden secuencias diferentes, y en la que al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiqueta de célula idéntica; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar una o más secuencias de etiquetas de células multiplete, cada una de las cuales está asociada con dos o más secuencias de indexación de muestra en los datos de secuenciación obtenidos.
[0270] El número de células que se pueden cargar en micropocillos de un cartucho de micropocillos o en gotitas generadas usando un dispositivo de microfluidos puede estar limitado por la tasa de multiplete. Cargar más células puede generar más multipletes, que pueden ser difíciles de identificar y crear ruido en los datos de una sola célula. Con la indexación de muestras, el método se puede utilizar para etiquetar o identificar multipletes con mayor precisión y eliminar los multipletes de los datos de secuenciación o análisis posteriores. Ser capaz de identificar multipletes con mayor confianza puede aumentar la tolerancia del usuario a la tasa de multipletes y cargar más células en cada cartucho de micropocillos o generar gotas con al menos una célula cada una.
[0271] En algunas formas de realización, poner en contacto la primera pluralidad de células y la segunda pluralidad de células con las dos composiciones de indexación de muestras comprende respectivamente: poner en contacto la primera pluralidad de células con una primera composición de indexación de muestras de las dos composiciones de indexación de muestras; y poner en contacto la primera pluralidad de células con una segunda composición de indexación de muestra de las dos composiciones de indexación de muestra. El número de pluralidades de células y el número de pluralidades de composiciones de indexación de muestras pueden ser diferentes en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de pluralidades de células y/o composiciones de indexación de muestras puede ser, o ser aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 1000000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de pluralidades de células y/o composiciones de indexación de muestras puede ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000 o 1000000. El número de células puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número, o el número medio, de células puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 1000000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número, o el número promedio, o las células pueden ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000 o 1000000.
[0272] En algunas formas de realización, el método comprende: eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de las dos composiciones de indexación de muestras. La eliminación de las composiciones de indexación de muestras no unidas puede comprender el lavado de las células de la primera pluralidad de células y la segunda pluralidad de células con un tampón de lavado. La eliminación de las composiciones de indexación de muestras no unidas puede comprender la selección de células unidas a al menos un reactivo de unión de componentes celulares de las dos composiciones de indexación de muestras usando citometría de flujo. En algunas formas de realización, el método comprende: lisar una o más células de cada una de la pluralidad de muestras.
[0273] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra está configurado para ser (o puede ser) separable o no separable del reactivo de unión al componente celular. El método puede comprender separar el oligonucleótido de indexación de la muestra del reactivo de unión al componente celular. Separar el oligonucleótido de indexación de la muestra puede comprender separar el oligonucleótido de indexación de la muestra del reactivo de unión al componente celular mediante fotoescisión UV, tratamiento químico (p. ej., utilizando un reactivo reductor, como ditiotreitol), calentamiento, tratamiento enzimático o cualquier combinación de los mismos.
[0274] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando la pluralidad de códigos de barras comprende: poner en contacto la pluralidad de códigos de barras con los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestras; y extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras usando una ADN polimerasa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras utilizando una transcriptasa inversa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0275] En algunas formas de realización, el método comprende: amplificar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras para producir una pluralidad de amplicones. La amplificación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras puede comprender amplificar, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al menos una parte de la secuencia del código de barras (p. ej., la secuencia del marcador molecular) y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de la muestra. En algunas formas de realización, obtener los datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras puede comprender obtener datos de secuenciación de la pluralidad de amplicones. La obtención de los datos de secuenciación comprende la secuenciación de al menos una parte de la secuencia del código de barras y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de la muestra. En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende identificar el origen de la muestra de la pluralidad de dianas con código de barras basándose en la secuencia de indexación de muestra del al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras.
[0276] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestra usando la pluralidad de códigos de barras para crear la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras comprende la codificación de barras estocástica de los oligonucleótidos de indexación de muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras estocástico.
[0277] En algunas formas de realización, el método incluye: codificar en barras una pluralidad de objetivos de la célula usando la pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de objetivos con código de barras, donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiquetas de célula, y donde al menos dos los códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiquetas de célula idéntica; y obtener datos de secuenciación de los objetivos con código de barras. La codificación de barras de la pluralidad de objetivos usando la pluralidad de códigos de barras para crear la pluralidad de objetivos con código de barras puede incluir: poner en contacto copias de los objetivos con regiones de unión de objetivos de los códigos de barras; y transcripción inversa de la pluralidad de objetivos usando la pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de objetivos transcriptos inversamente.
[0278] En algunas formas de realización, el método comprende: antes de obtener los datos de secuenciación de la pluralidad de objetivos con código de barras, amplificar los objetivos con código de barras para crear una pluralidad de objetivos con código de barras amplificados. La amplificación de los objetivos con código de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras amplificados puede comprender: la amplificación de los objetivos con código de barras mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La codificación de barras de la pluralidad de objetivos de la célula usando la pluralidad de códigos de barras para crear la pluralidad de objetivos con código de barras puede comprender la codificación estocástica de la pluralidad de objetivos de la célula usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para crear una pluralidad de objetivos con código de barras estocástico.
[0279] En algunas formas de realización, el método para la identificación de células comprende: poner en contacto una primera pluralidad de una o más células y una segunda pluralidad de una o más células con dos composiciones de identificación de células respectivamente, donde cada una de la primera pluralidad de una o más células y cada una de la segunda pluralidad de una o más células comprende uno o más componentes celulares, donde cada una de las dos composiciones de identificación celular comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de identificación celular, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más componentes celulares, en donde el oligonucleótido de identificación celular comprende una secuencia de identificación celular, y en donde las secuencias de identificación celular de las dos composiciones de identificación celular comprenden secuencias diferentes; codificar con barras los oligonucleótidos de identificación celular usando una pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con código de barras, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiqueta celular, una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de etiqueta molecular) y un objetivo de unión región, en la que las secuencias de códigos de barras de al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden secuencias diferentes, y en la que al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiqueta de célula idéntica; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras; e identificar una o más secuencias de etiquetas de células, cada una de las cuales está asociada con dos o más secuencias de identificación de células en los datos de secuenciación obtenidos; y eliminar los datos de secuenciación asociados con una o más secuencias de etiquetas de células que están asociadas con dos o más secuencias de identificación de células de los datos de secuenciación obtenidos y/o excluir los datos de secuenciación asociados con una o más secuencias de etiquetas de células que están asociadas con dos o más secuencias de identificación celular de análisis posteriores (p. ej., perfiles de ARNm de una sola célula o análisis de transcriptoma completo). En algunas formas de realización, el oligonucleótido de identificación celular comprende una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de marcador molecular), un sitio de unión para un cebador universal o una combinación de los mismos.
[0280] Un multiplete (p. ej., un doblete, triplete, etc.) puede ocurrir cuando dos o más células asociadas con dos o más oligonucleótidos de identificación celular de secuencias diferentes (o dos o más células asociadas con oligonucleótidos de identificación celular con dos o más oligonucleótidos secuencias de identificación celular) se capturan en el mismo micropocillo o gotita, la “célula” combinada se puede asociar con oligonucleótidos de identificación celular con dos o más secuencias de identificación celular diferentes.
[0281] Las composiciones de identificación de células se pueden usar para la identificación de multipletes, ya sea en el contexto de la sobrecarga de células o en el contexto de la carga de células en micropocillos de una matriz de micropocillos o la generación de gotitas que contienen células. Cuando se cargan dos o más células en un micropocillo, los datos resultantes de la “célula” combinada (o el contenido de las dos o más células) es un multiplete con un perfil de expresión génica aberrante. Mediante el uso de la identificación celular, uno puede reconocer algunos de estos multipletes buscando etiquetas celulares (p. ej., etiquetas celulares de códigos de barras, como códigos de barras estocásticos) que están asociados o asignados a dos o más oligonucleótidos de identificación celular con diferentes secuencias de identificación celular (u oligonucleótidos de identificación celular con dos o más secuencias de identificación celular). Con la secuencia de identificación de células, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para la identificación de multipletes (ya sea en el contexto de sobrecarga de muestras o no, o en el contexto de cargar células en micropocillos de una matriz de micropocillos o generar gotitas que contienen células). En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una primera pluralidad de una o más células y una segunda pluralidad de una o más células con dos composiciones de identificación de células respectivamente, donde cada una de la primera pluralidad de una o más células y cada una de la segunda pluralidad de una o más células comprenden uno o más componentes celulares, donde cada una de las dos composiciones de identificación celular comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de identificación celular, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de los uno o más componentes celulares, en donde el oligonucleótido de identificación celular comprende una secuencia de identificación celular, y en donde las secuencias de identificación celular de las dos composiciones de identificación celular comprenden secuencias diferentes; codificar con barras los oligonucleótidos de identificación celular usando una pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con código de barras, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiqueta celular, una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de etiqueta molecular) y un objetivo de unión región, en la que las secuencias de códigos de barras de al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden secuencias diferentes, y en la que al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiqueta de célula idéntica; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras; e identificar una o más secuencias de etiquetas de células multiplete, cada una de las cuales está asociada con dos o más secuencias de identificación de células en los datos de secuenciación obtenidos.
[0282] El número de células que pueden cargarse en micropocillos de un cartucho de micropocillos o en gotitas generadas utilizando un dispositivo de microfluidos puede estar limitado por la tasa de multiplete. Cargar más células puede generar más multipletes, que pueden ser difíciles de identificar y crear ruido en los datos de una sola célula. Con la identificación de células, el método se puede utilizar para etiquetar o identificar multipletes con mayor precisión y eliminar los multipletes de los datos de secuenciación o del análisis posterior. Ser capaz de identificar multipletes con mayor confianza puede aumentar la tolerancia del usuario a la tasa de multipletes y cargar más células en cada cartucho de micropocillos o generar gotas con al menos una célula cada una.
[0283] En algunas formas de realización, poner en contacto la primera pluralidad de una o más células y la segunda pluralidad de una o más células con las dos composiciones de identificación de células comprende respectivamente: poner en contacto la primera pluralidad de una o más células con una primera composición de identificación de células de las dos composiciones de identificación celular; y poner en contacto la primera pluralidad de una o más células con una segunda composición de identificación de células de las dos composiciones de identificación de células. El número de pluralidades de composiciones de identificación celular puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de composiciones de identificación celular puede ser, o ser aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 1000000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de composiciones de identificación celular puede ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000 o 1000000. El número, o número promedio, de células en cada pluralidad de una o más células puede ser diferentes en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número, o número promedio, de células en cada pluralidad de una o más células puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 1000000, o un número o un rango entre dos cualquiera de estos valores En algunas formas de realización, el número, o número promedio, de células en cada pluralidad de una o más células puede ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000,100000 o 1000000.
[0284] En algunas formas de realización, el método comprende: eliminar las composiciones de identificación celular no unidas de las dos composiciones de identificación celular. Eliminar las composiciones de identificación de células no unidas puede comprender lavar las células de la primera pluralidad de una o más células y la segunda pluralidad de una o más células con un tampón de lavado. Eliminar las composiciones de identificación de células no unidas puede comprender seleccionar células unidas a al menos un reactivo de unión de componentes celulares de las dos composiciones de identificación de células usando citometría de flujo. En algunas formas de realización, el método comprende: lisar una o más células de cada una de la pluralidad de muestras.
[0285] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de identificación celular está configurado para ser (o puede ser) separable o no separable del reactivo de unión al componente celular. El método puede comprender separar el oligonucleótido de identificación celular del reactivo de unión al componente celular. Separar el oligonucleótido de identificación celular puede comprender separar el oligonucleótido de identificación celular del reactivo de unión al componente celular mediante fotoescisión UV, tratamiento químico (p. ej., usando reactivo reductor, como ditiotreitol), calentamiento, tratamiento enzimático o cualquier combinación de los mismos.
[0286] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de identificación celular usando la pluralidad de códigos de barras comprende: poner en contacto la pluralidad de códigos de barras con los oligonucleótidos de identificación celular para generar códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de identificación celular; y extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de identificación celular para generar la pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras usando una ADN polimerasa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras usando una transcriptasa inversa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras.
[0287] En algunas formas de realización, el método comprende: amplificar la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras para producir una pluralidad de amplicones. La amplificación de la pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con código de barras puede comprender amplificar, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al menos una parte de la secuencia del código de barras (p. ej., la secuencia del marcador molecular) y al menos una parte del oligonucleótido de identificación celular. En algunas formas de realización, la obtención de datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras puede comprender la obtención de datos de secuenciación de la pluralidad de amplicones. La obtención de los datos de secuenciación comprende secuenciar al menos una parte de la secuencia del código de barras y al menos una parte del oligonucleótido de identificación celular. En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende identificar el origen de la muestra de la pluralidad de dianas con código de barras basándose en la secuencia de identificación celular del al menos un oligonucleótido de identificación de células con código de barras.
[0288] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de identificación celular utilizando la pluralidad de códigos de barras para crear la pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con código de barras comprende la codificación estocástica de los oligonucleótidos de identificación celular utilizando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para crear una pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con códigos de barras estocásticos.
Anticuerpos conjugados con oligonucleótidos
Secuencia de marcador molecular única
[0289] En algunas formas de realización, el oligonucleótido asociado con un reactivo de unión a componentes celulares (p. ej., oligonucleótido de anticuerpo (“AbOligo” o “AbO”), oligonucleótido de reactivo de unión, oligonucleótidos específicos de reactivos de unión a componentes celulares, oligonucleótidos de indexación de muestras) comprende una secuencia de marca molecular única (también conocida como índice molecular (MI), “código de barras molecular” o identificador molecular único (UMI)). En algunas formas de realización, las especies de oligonucleótidos del reactivo de unión que comprenden códigos de barras de moléculas como se describe en el presente documento reducen el sesgo aumentando la sensibilidad, disminuyendo el error estándar relativo o aumentando la sensibilidad y/o reduciendo el error estándar. El código de barras de la molécula puede comprender una secuencia única, de modo que cuando múltiples muestras de ácidos nucleicos (que pueden ser iguales y/o diferentes entre sí) se asocian uno a uno con códigos de barras de moléculas, se pueden diferenciar diferentes muestras de ácidos nucleicos entre sí por los códigos de barras de la molécula. Como tal, incluso si una muestra comprende dos ácidos nucleicos que tienen la misma secuencia, cada uno de estos dos ácidos nucleicos se puede marcar con un código de barras de molécula diferente, de modo que se puedan cuantificar los ácidos nucleicos en la población, incluso después de la amplificación. El código de barras de la molécula puede comprender una secuencia de ácido nucleico de al menos 5 nucleótidos, por ejemplo, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos, incluidos los intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados, por ejemplo, 5-50, 5-45, 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5 -20, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-50, 6-45, 6-40, 6- 35, 6-30, 6-25, 6-20, 6-15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-50, 7-45, 7-40, 7-35, 7-30, 7-25, 7-20, 7-15, 7­ 14, 7-13, 7-12, 7-11,7-10, 7-9, 7-8, 8-50, 8-45, 8-40, 8-35, 8-30, 8-25, 8-20, 8-15, 8 -14, 8-13, 8-12, 8-11,8-10, 8-9, 9-50, 9- 45, 9-40, 9-35, 9-30, 9-25, 9-20, 9-15, 9-14, 9-13, 9-12, 9-11, 9-10, 10-50, 10-45, 10-40, 10-35, 10-30, 10-25, 10 -20, 10- 15, 10-14, 10-13, 10-12 o 10-11 nucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia de ácido nucleico del código de barras de la molécula comprende una secuencia única, por ejemplo, de modo que cada especie de oligonucleótido única en una composición comprende un código de barras de molécula diferente. En algunas formas de realización, dos o más especies únicas de oligonucleótidos pueden comprender el mismo código de barras de molécula, pero todavía difieren entre sí. Por ejemplo, si las especies únicas de oligonucleótidos incluyen códigos de barras de muestra, cada especie única de oligonucleótidos con un código de barras de muestra particular puede comprender un código de barras de molécula diferente. En algunas formas de realización, una composición que comprende especies de oligonucleótidos únicas comprende una diversidad de códigos de barras de moléculas de al menos 1000 códigos de barras de moléculas diferentes y, por lo tanto, al menos 1000 especies de oligonucleótidos únicas. En algunas formas de realización, una composición que comprende especies de oligonucleótidos únicas comprende una diversidad de códigos de barras de moléculas de al menos 6500 códigos de barras de moléculas diferentes y, por lo tanto, al menos 6500 especies de oligonucleótidos únicas. En algunas formas de realización, una composición que comprende especies de oligonucleótidos únicas comprende una diversidad de códigos de barras de moléculas de al menos 65.000 códigos de barras de moléculas diferentes y, por lo tanto, al menos 65.000 especies de oligonucleótidos únicas.
[0290] En algunas formas de realización, la secuencia marcadora molecular única se coloca en 5' de la secuencia identificadora única sin secuencias intermedias entre la secuencia marcadora molecular única y la secuencia identificadora única. En algunas formas de realización, la secuencia marcadora molecular única se coloca en 5' de un espaciador, que se coloca en 5' de la secuencia identificadora única, de modo que un espaciador está entre la secuencia marcadora molecular única y la secuencia identificadora única. En algunas formas de realización, la secuencia del identificador único se coloca en 5' de la secuencia del marcador molecular único sin secuencias intermedias entre la secuencia del identificador único y la secuencia del marcador molecular único. En algunas formas de realización, la secuencia de identificador único se coloca en 5' de un espaciador, que se coloca en 5' de la secuencia de marcador molecular único, de modo que un espaciador está entre la secuencia de identificador único y la secuencia de marcador molecular único.
[0291] La secuencia marcadora molecular única puede comprender una secuencia de ácido nucleico de al menos 3 nucleótidos, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos, incluidos los intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados, por ejemplo, 3-50, 3-45, 3-40, 3-35, 3 -30, 3-25, 3-20, 3-15, 3-14, 3­ 13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-50, 4-45, 4-40, 4-35, 4-30, 4-25, 4-20, 4-15, 4-14, 4-13, 4 -12, 4-11,4­ 10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-50, 5-45, 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11,5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6­ 50, 6-45, 6-40, 6-35, 6-30, 6-25, 6-20, 6-15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11,6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-50, 7-45, 7-40, 7-35, 7-30, 7-25, 7- 20, 7-15, 7-14, 7 -13, 7-12, 7-11,7-10, 7-9, 7-8, 8-50, 8-45, 8-40, 8-35, 8-30, 8-25, 8-20, 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11,8­ 10, 8-9, 9-50, 9-45, 9-40, 9-35, 9-30, 9 -25, 9-20, 9-15, 9-14, 9-13, 9-12, 9-11, 9-10, 10-50, 10-45, 10-40, 10-35, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 10-14, 10-13, 10-12 o 10-11 nucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia marcadora molecular única tiene una longitud de 2 a 20 nucleótidos.
[0292] En algunas formas de realización, la secuencia marcadora molecular única del oligonucleótido del reactivo de unión comprende la secuencia de al menos tres repeticiones de los dobletes “VN” y/o “NV” (en los que cada “V” es cualquiera de A, C, o G, y en la que “N” es cualquiera de A, G, C o T), por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 repeticiones, incluidos los rangos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. Los ejemplos de múltiples repeticiones del doblete “VN” incluyen VN, VNVN, VNVn Vn y VNVNVNVN. Cabe señalar que, si bien las fórmulas “VN” y “NV” describen restricciones en el contenido base, no todos los V o todos los N tienen que ser iguales o diferentes. Por ejemplo, si los códigos de barras de moléculas de especies únicas de oligonucleótidos en una composición comprenden VNVNVN, el código de barras de una molécula puede comprender la secuencia ACGGCA, mientras que el código de barras de otra molécula puede comprender la secuencia ATACAT, mientras que el código de barras de otra molécula puede comprender la secuencia ATACAC. Se observa que cualquier número de repeticiones del doblete “VN” tendría un contenido de T de no más del 50 %. En algunas formas de realización, al menos el 95 % de las especies únicas de oligonucleótidos de una composición que comprende al menos 1000 especies únicas de oligonucleótidos comprenden códigos de barras de moléculas que comprenden al menos tres repeticiones de los dobletes “VN” y/o “NV”, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 repeticiones, incluidos los rangos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunas formas de realización, al menos el 99 % de las especies únicas de oligonucleótidos de una composición que comprende al menos 1000 especies únicas de oligonucleótidos comprenden códigos de barras de moléculas que comprenden al menos tres repeticiones de los dobletes “VN” y/o “NV”, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 repeticiones, incluidos los rangos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunas formas de realización, al menos el 99,9 % de las especies únicas de oligonucleótidos de una composición que comprende al menos 1000 especies únicas de oligonucleótidos comprenden códigos de barras de moléculas que comprenden al menos tres repeticiones de los dobletes “VN” y/o “NV”, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 repeticiones, incluidos los rangos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunas formas de realización, al menos el 95 % de las especies únicas de oligonucleótidos de una composición que comprende al menos 6500 especies únicas de oligonucleótidos comprenden códigos de barras de moléculas que comprenden al menos tres repeticiones de los dobletes “VN” y/o “NV”, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 repeticiones, incluidos los rangos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunas formas de realización, al menos el 99 % de las especies únicas de oligonucleótidos de una composición que comprende al menos 6500 especies únicas de oligonucleótidos comprenden códigos de barras de moléculas que comprenden al menos tres repeticiones de los dobletes “VN” y/o “NV”, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 repeticiones, incluidos los rangos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunas formas de realización, al menos el 99,9 % de las especies únicas de oligonucleótidos de una composición que comprende al menos 6500 especies únicas de oligonucleótidos comprenden códigos de barras de moléculas que comprenden al menos tres repeticiones de los dobletes “VN” y/o “NV”, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 repeticiones, incluidos los rangos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunas formas de realización, al menos el 95 % de las especies únicas de oligonucleótidos de una composición que comprende al menos 65000 especies únicas de oligonucleótidos comprenden códigos de barras de moléculas que comprenden al menos tres repeticiones de los dobletes “VN” y/o “NV”, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 repeticiones, incluidos los rangos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunas formas de realización, al menos el 99 % de las especies únicas de oligonucleótidos de una composición que comprende al menos 65000 especies únicas de oligonucleótidos comprenden códigos de barras de moléculas que comprenden al menos tres repeticiones de los dobletes “VN” y/o “NV”, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 repeticiones, incluidos los rangos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunas formas de realización, al menos el 99,9 % de las especies únicas de oligonucleótidos de una composición que comprende al menos 65.000 especies únicas de oligonucleótidos comprenden códigos de barras de moléculas que comprenden al menos tres repeticiones de los dobletes “VN” y/o “NV”, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 repeticiones, incluidos los rangos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunas formas de realización, la composición consta o consiste esencialmente en al menos 1000, 6500 o 65000 especies únicas de oligonucleótidos que tienen cada una un código de barras de molécula que comprende la secuencia VNVNVN. En algunas formas de realización, la composición consiste esencialmente en al menos 1000, 6500 o 65000 especies únicas de oligonucleótidos que cada uno tiene un código de barras de molécula que comprende la secuencia VNVNVNVN. En algunas formas de realización, al menos el 95 %, 99 % o 99,9 % de las regiones de código de barras de la composición como se describe en este documento comprenden al menos tres repeticiones de los dobletes “VN” y/o “NV”, como se describe en este documento. En algunas formas de realización, las secuencias de etiquetas moleculares únicas que comprenden “dobles “VN” y/o “NV” repetidos pueden producir un sesgo bajo, al tiempo que proporcionan un compromiso entre reducir el sesgo y mantener una cantidad relativamente grande de secuencias de nucleótidos disponibles, de modo que se pueda lograr una diversidad relativamente alta. obtenerse en una secuencia relativamente corta, al tiempo que se minimiza el sesgo. En algunas formas de realización, las secuencias de etiquetas moleculares únicas que comprenden “dobles “VN” y/o “NV” repetidos pueden reducir el sesgo aumentando la sensibilidad, disminuyendo el error estándar relativo o aumentando la sensibilidad y reduciendo el error estándar. En algunas formas de realización, las secuencias de etiquetas moleculares únicas que comprenden “dobles “VN” y/o “NV” repetidos mejoran el análisis informático sirviendo como un geomarcador. En algunas formas de realización, los dobletes repetidos “VN” y/o “NV” descritos en el presente documento reducen la incidencia de homopolímeros dentro de las secuencias de marcador molecular únicas En algunas formas de realización, los dobletes repetidos “VN” y/o “NV” descritos en el presente documento rompen los homopolímeros.
[0293] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una primera secuencia marcadora molecular. En algunas formas de realización, las primeras secuencias de marcadores moleculares de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son diferentes, y las secuencias de indexación de muestra de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son idénticas. En algunas formas de realización, las primeras secuencias de marcadores moleculares de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son diferentes, y las secuencias de indexación de muestra de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son diferentes. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular comprende una segunda secuencia marcadora molecular. En algunas formas de realización, las secuencias del segundo marcador molecular de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son diferentes, y
las secuencias de identificación únicas de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son idénticas. En algunas formas de realización, las secuencias del segundo marcador molecular de al menos
dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son diferentes, y las secuencias del identificador único de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son diferentes. En algunas formas de realización, el número de secuencias únicas de la segunda etiqueta molecular asociadas
con la secuencia del identificador único para el reactivo de unión al componente celular capaz de unirse específicamente
al al menos un objetivo del componente celular en los datos de secuenciación indica el número de copias del al menos
un objetivo de componente celular en una o más de la pluralidad de células. En alguna forma de realización, una combinación (p. ej., mínimo, promedio y máximo) de (1) el número de primeras secuencias marcadoras moleculares
únicas asociadas con la secuencia identificadora única para el reactivo de unión al componente celular capaz de unirse específicamente al al menos un componente celular diana en los datos de secuenciación y (2) el número de secuencias
únicas de la segunda etiqueta molecular asociadas con la secuencia del identificador único para el reactivo de unión al componente celular capaz de unirse específicamente a al menos un componente celular diana en los datos de secuenciación indica el número de copias del al menos un componente celular diana en una o más de la pluralidad de células.
Secuencia de alineación
[0294] En algunas formas de realización, el oligonucleótido del reactivo de unión comprende una secuencia de alineación
(p. ej., la secuencia de alineación 825bb descrita con referencia a la FIG. 9) adyacente a la región poli(dA). La secuencia
de alineación puede tener 1 o más nucleótidos de longitud. La secuencia de alineación puede tener una longitud de 2 nucleótidos. La secuencia de alineación puede comprender una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. La secuencia de alineación puede comprender una región poli(dT), una región poli(dG), una
región poli(dC), una región poli(dU), o una combinación de las mismas. En algunas formas de realización, la secuencia
de alineación es 5' con respecto a la región poli(dA). Ventajosamente, en algunas formas de realización, la presencia de
la secuencia de alineación permite que la cola poli(A) de cada uno de los oligonucleótidos del reactivo de unión tenga la
misma longitud, lo que conduce a una mayor uniformidad de rendimiento. En algunas formas de realización, el porcentaje
de oligonucleótidos del reactivo de unión con una longitud de región poli(dA) idéntica dentro de una pluralidad de oligonucleótidos del reactivo de unión, cada uno de los cuales comprende una secuencia de alineación, puede ser, o ser aproximadamente, 80 %, 90 %, 91 %., 93 %, 95 %, 97 %, 99,9 %, 99,9 %, 99,99 % o 100 %, o un número o un rango
entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el porcentaje de oligonucleótidos del reactivo de
unión con una longitud de región poli(dA) idéntica dentro de la pluralidad de oligonucleótidos del reactivo de unión, cada
uno de los cuales comprende una secuencia de alineación, puede ser al menos, o como máximo, 80 %, 90 %., 91 %, 93
%, 95 %, 97 %, 99,9 %, 99,9 %, 99,99 % o 100 %.
[0295] La longitud de la secuencia de alineación puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas
de realización, la longitud de la secuencia de alineación puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,
42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, o un número o u rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, la longitud de la secuencia de alineación
puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54,
55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86,
87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100. El número de guanina(s), citosina(s), timina(s) o uracilo(s) en la secuencia de alineación puede ser diferente en diferentes implementaciones. El número de guanina(s), citosina(s), timina(s) o uracilo(s) puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,
51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82,
83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. El número de guanina(s), citosina(s), timina(s) o uracilo(s) puede ser como mínimo, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,
39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de alineación. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular comprende una secuencia de alineación.
Enlazador
[0296] El oligonucleótido del reactivo de unión se puede conjugar con el reactivo de unión del componente celular a través
de varios mecanismos. En algunas formas de realización, el oligonucleótido del reactivo de unión se puede conjugar covalentemente con el reactivo de unión del componente celular. En algunas formas de realización, el oligonucleótido del
reactivo de unión se puede conjugar con el reactivo de unión del componente celular de forma no covalente. En algunas formas de realización, el oligonucleótido del reactivo de unión se conjuga con el reactivo de unión del componente celular a través de un enlazador. En algunas formas de realización, el oligonucleótido del reactivo de unión puede comprender el enlazador. El enlazador puede comprender un grupo químico. El grupo químico puede unirse de forma reversible o irreversible a la molécula del reactivo de unión al componente celular. El grupo químico se puede seleccionar del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, un enlace disulfuro, una estreptavidina, una biotina, una amina y cualquier combinación de los mismos. El enlazador puede comprender una cadena de carbono. La cadena carbonada puede comprender, por ejemplo, de 5 a 50 átomos de carbono. La cadena de carbono puede tener diferentes números de átomos de carbono en diferentes formas de realización. En algunas formas de realización, el número de átomos de carbono en la cadena de carbono puede ser, o puede ser aproximadamente, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de átomos de carbono en la cadena de carbono puede ser al menos, o puede ser como máximo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50. En algunas formas de realización, la cadena de carbonos comprende de 2 a 30 carbonos. En algunas formas de realización, la cadena de carbono comprende 12 carbonos. En algunas formas de realización, los modificadores de amino empleados para el reactivo de unión al oligonucleótido pueden conjugarse con el reactivo de unión al componente celular. En algunas formas de realización, el enlazador comprende el modificador amino 5' C6 (5AmMC6). En algunas formas de realización, el enlazador comprende el modificador amino 5' C12 (5AmMC12). En algunas formas de realización, el enlazador comprende un derivado de 5AmMC12. En algunas formas de realización, un enlazador más largo logra una mayor eficiencia de conjugación. En algunas formas de realización, un enlazador más largo logra una mayor eficacia de modificación antes de la conjugación. En algunas formas de realización, aumentar la distancia entre la amina funcional y la secuencia de ADN produce una mayor eficiencia de conjugación. En algunas formas de realización, aumentar la distancia entre la amina funcional y la secuencia de ADN produce una mayor eficacia de modificación antes de la conjugación. En algunas formas de realización, el uso de 5AmMC12 como enlazador produce una mayor eficacia de modificación (antes de la conjugación) que el uso de 5AmMC6 como enlazador. En algunas formas de realización, el uso de 5AmMC12 como enlazador produce una mayor eficiencia de conjugación que el uso de 5AmMC6 como enlazador. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se asocia con el reactivo de unión al componente celular a través de un enlazador. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares se asocia con el reactivo de unión a componentes celulares a través de un enlazador.
Secuencia de código de barras específica de anticuerpos
[0297] En este documento, en varias formas de realización, se describen mejoras en el diseño de la secuencia de identificador único (p. ej., secuencia de código de barras específica de anticuerpo) de un oligonucleótido reactivo de unión. En algunas formas de realización, la secuencia del identificador único (p. ej., secuencia de indexación de la muestra, oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular) está diseñada para tener una distancia de Hamming superior a 3. En algunas formas de realización, la distancia de Hamming de la secuencia del identificador único puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, las secuencias de identificador único tienen un contenido de GC en el rango de 40 % a 60 % y no tienen una estructura secundaria predicha (por ejemplo, horquilla). En algunas formas de realización, la secuencia del identificador único no comprende ninguna secuencia predicha in silico para unirse a los transcritos de ratón y/o humanos. En algunas formas de realización, la secuencia del identificador único no comprende ninguna secuencia predicha in silico para unirse a los cebadores del sistema Rhapsody y/o SCMK. En algunas formas de realización, la secuencia del identificador único no comprende homopolímeros.
Adaptador de cebador
[0298] En algunas formas de realización, el oligonucleótido del reactivo de unión comprende un adaptador de cebador. En algunas formas de realización, el adaptador de cebador comprende la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el primer cebador universal comprende un cebador de amplificación, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el primer cebador universal comprende un cebador de secuenciación, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el cebador de secuenciación comprende un cebador de secuenciación de Illumina. En algunas formas de realización, el cebador de secuenciación comprende una parte de un cebador de secuenciación de Illumina. En algunas formas de realización, el cebador de secuenciación comprende un cebador de secuenciación P7. En algunas formas de realización, el cebador de secuenciación comprende una porción del cebador de secuenciación P7. En algunas formas de realización, el adaptador de cebador comprende un adaptador para Illumina P7. En algunas formas de realización, el adaptador cebador comprende un adaptador parcial para Illumina P7. En algunas formas de realización, el cebador de amplificación es una secuencia Illumina P7 o una subsecuencia de la misma. En algunas formas de realización, el cebador de secuenciación es una secuencia Illumina R2 o una subsecuencia de la misma. En algunas formas de realización, el primer cebador universal tiene una longitud de 5-50 nucleótidos. En algunas formas de realización, el cebador adaptador puede comprender una secuencia de ácido nucleico de al menos 5 nucleótidos, por ejemplo, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos, incluidos los intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados, por ejemplo, 5-50, 5-45, 5-40, 5-35, 5-30, 5 -25, 5-20, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-50, 6-45, 6-40, 6-35, 6-30, 6-25, 6-20, 6­ 15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11,6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-50, 7-45, 7-40, 7-35, 7-30, 7-25, 7-20, 7-15, 7-14, 7-13, 7-12, 7-11,7-10, 7-9, 7-8, 8-50, 8-45, 8-40, 8-35, 8-30, 8-25, 8-20, 8 -15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 9-50, 9-45, 9-40, 9-35, 9-30, 9­ 25, 9-20, 9-15, 9-14, 9-13, 9-12, 9-11,9-10, 10-50, 10-45, 10-40, 10-35, 10-30, 10 -25, 10-20, 10-15, 10-14, 10-13, 10-12 o 10-11 nucleótidos. El adaptador de cebador puede comprender una secuencia de ácido nucleico de al menos 5 nucleótidos de la secuencia de un primer cebador universal, un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos, por ejemplo al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos, incluidos los intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados, por ejemplo 5-50, 5-45, 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-50, 6-45, 6-40, 6-35, 6-30, 6-25, 6- 20, 6-15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-50, 7-45, 7-40, 7-35, 7-30, 7-25, 7-20, 7-15, 7-14, 7-13, 7-12, 7-11,7-10, 7-9, 7-8, 8- 50, 8-45, 8-40, 8-35, 8-30, 8-25, 8-20, 8-15, 8-14, 8­ 13, 8-12, 8-11,8-10, 8-9, 9-50, 9-45, 9-40, 9-35, 9-30, 9-25, 9-20, 9-15, 9-14, 9-13, 9-12, 9- 11,9-10, 10-50, 10-45, 10-40, 10-35, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 10-14, 10-13, 10-12, o 10-11 nucleótidos de la secuencia de un primer cebador universal, un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos.
[0299] En algunas formas de realización, los códigos de barras de oligonucleótidos proporcionados en el presente documento comprenden una primera secuencia universal y los oligonucleótidos del reactivo de unión comprenden una segunda secuencia universal (p. ej., un adaptador de cebador). La primera secuencia universal y la segunda secuencia universal pueden ser iguales o diferentes. La primera secuencia universal y/o la segunda secuencia universal pueden comprender los sitios de unión de un cebador de secuenciación, un adaptador de secuenciación, secuencias complementarias de los mismos y/o partes de los mismos. El adaptador de secuenciación puede comprender una secuencia P5, una secuencia P7, secuencias complementarias de las mismas y/o partes de las mismas. El cebador de secuenciación puede comprender un cebador de secuenciación de Lectura 1, un cebador de secuenciación de Lectura 2, secuencias complementarias de los mismos y/o partes de los mismos.
[0300] Un flujo de trabajo de amplificación convencional para la preparación de bibliotecas de secuenciación puede emplear tres rondas de PCR, como, por ejemplo: una primera ronda (“PCR 1”) que emplea un cebador específico de la diana y un cebador contra la secuencia del cebador 1 de secuenciación universal de Illumina; una segunda ronda (“PCR 2”) usando un cebador específico de diana anidado flanqueado por la secuencia del cebador 2 de secuenciación de Illumina, y un cebador contra la secuencia del cebador 1 de secuenciación universal de Illumina; y una tercera ronda (“PCR 3”) añadiendo Illumina P5 y P7 y el índice de muestra. Ventajosamente, en algunas formas de realización, el adaptador de cebador descrito en este documento permite un flujo de trabajo más corto y simple en la preparación de bibliotecas en comparación con si la plantilla inicial (p. ej., un oligonucleótido de indexación de muestra unido a una perla) no tiene un adaptador de cebador. En algunas formas de realización, el adaptador de cebador reduce la amplificación por PCR previa a la secuenciación de una plantilla en una ronda (en comparación con si la plantilla no comprende un adaptador de cebador). En algunas formas de realización, el adaptador de cebador reduce la amplificación por PCR previa a la secuenciación del molde a una ronda (en comparación con si el molde no comprende un adaptador de cebador). En algunas formas de realización, una plantilla que comprende el adaptador de cebador no requiere un paso de amplificación por PCR para la unión de los adaptadores de secuenciación de Illumina que requerirían una secuenciación previa si la plantilla no comprendiera un adaptador de cebador. En algunas formas de realización, la secuencia adaptadora de cebador (o una subsecuencia de la misma) no forma parte de la lectura de secuenciación de una plantilla de secuenciación que comprende una secuencia adaptadora de cebador y, por lo tanto, no afecta la calidad de lectura de una plantilla que comprende un adaptador de cebador. En algunas formas de realización, una plantilla que comprende el cebador adaptador tiene una diversidad de secuenciación reducida en comparación con si la plantilla no comprende un adaptador primario.
[0301] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende un adaptador de cebador. En algunas formas de realización, replicar un oligonucleótido de indexación de muestras, un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras o un producto del mismo comprende usar un primer cebador universal, un primer cebador que comprende la secuencia del primer cebador universal, o una combinación de los mismos, para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicadas. En algunas formas de realización, replicar un oligonucleótido de indexación de una muestra, un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, o un producto del mismo, comprende usar un primer cebador universal, un primer cebador que comprende la secuencia del primer cebador universal, un segundo cebador universal, un segundo cebador que comprende la secuencia del segundo cebador universal, o una combinación de los mismos, para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicadas. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares comprende un adaptador de cebador. En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular comprende la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos.
Código de barras del oligonucleótido del reactivo de unión
[0302] FIG. 8 muestra una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar no limitativo de codificación de barras de un oligonucleótido reactivo de unión 825 (oligonucleótido de anticuerpo ilustrado aquí) que está asociado con un reactivo de unión 805 (anticuerpo ilustrado aquí). El oligonucleótido del reactivo de unión 825 se puede asociar con el reactivo de unión 805 a través del conector 8251. El oligonucleótido del reactivo de unión 825 se puede separar del reactivo de unión usando medios químicos, ópticos u otros. El reactivo de unión oligonucleótido 825 puede ser un imitador de ARNm. El oligonucleótido reactivo de unión 825 puede incluir un adaptador cebador 825pa, un marcador molecular de anticuerpo 825am (p. ej., una secuencia de marcador molecular única), un código de barras de anticuerpo 825ab (p. ej., una secuencia de identificación única), una secuencia de alineación 825bb y un poli(A) cola 825a. En algunas formas de realización, el adaptador de cebador 825pa comprende la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el adaptador de cebador 825pa puede ser el mismo para todos o algunos de los oligonucleótidos del reactivo de unión 825. En algunas formas de realización, el código de barras del anticuerpo 825ab puede ser el mismo para todos o algunos de los oligonucleótidos del reactivo de unión 825. En algunas formas de realización, el anticuerpo el código de barras 825ab de diferentes reactivos de unión oligonucleótidos 825 son diferentes. En algunas formas de realización, el marcador molecular de anticuerpo 825am de diferentes oligonucleótidos de reactivo de unión 825 son diferentes.
[0303] Los oligonucleótidos del reactivo de unión 825 se pueden codificar con una pluralidad de códigos de barras 815 (p. ej., códigos de barras 815 asociados con una partícula, como una perla 810) para crear una pluralidad de oligonucleótidos del reactivo de unión con código de barras 840. En algunas formas de realización, un código de barras 815 puede incluir una región poli(dT) 815t para unirse a un oligonucleótido reactivo de unión 825, opcionalmente un marcador molecular 815m (p. ej., para determinar el número de ocurrencias de los oligonucleótidos reactivos de unión), un marcador celular 815c y un marcador universal 815u. En algunas formas de realización, el código de barras 815 se hibrida con la región poli(dT) 815t de los oligonucleótidos del reactivo de unión 825. En algunas formas de realización, los oligonucleótidos del reactivo de unión con código de barras 840 se generan extendiendo (por ejemplo, por transcripción inversa) el código de barras 815 hibridado con el oligonucleótido del reactivo de unión. 825. En algunas formas de realización, los oligonucleótidos reactivos de unión con código de barras 840 comprenden el adaptador de cebador 825pa, un marcador molecular de anticuerpo 825am (por ejemplo, una secuencia de marcador molecular única), un código de barras de anticuerpo 825ab (por ejemplo, una secuencia de identificador único), una secuencia de alineación 825bb, poli (dT) región 815t, marcador molecular 815m, marcador celular 815c y marcador universal 815u.
[0304] En algunas formas de realización, los oligonucleótidos del reactivo de unión con código de barras descritos en el presente documento comprenden dos secuencias de etiquetas moleculares únicas: una secuencia de etiquetas moleculares derivada del código de barras (p. ej., la etiqueta molecular 815m) y una secuencia de etiquetas moleculares derivada de un oligonucleótido del reactivo de unión (p. ej., etiqueta molecular de anticuerpo 825am, la primera secuencia de etiqueta molecular de un oligonucleótido de indexación de muestra, la segunda secuencia de etiqueta molecular de un oligonucleótido específico de reactivo de unión a componente celular). Como se usa aquí, “indexación molecular dual” se refiere a métodos y composiciones descritos aquí que emplean oligonucleótidos reactivos de unión con código de barras (o productos de los mismos) que comprenden una primera secuencia marcadora molecular única y una segunda secuencia marcadora molecular única (o secuencias complementarias de las mismas). En algunas formas de realización, los métodos de identificación de muestras y de análisis cuantitativo de objetivos de componentes celulares descritos en el presente documento pueden comprender obtener la secuencia de información de la secuencia del marcador molecular del código de barras y/o la secuencia del marcador molecular del oligonucleótido del reactivo de unión. En algunas formas de realización, el número de secuencias de etiquetas moleculares de código de barras asociadas con la secuencia del identificador único para el reactivo de unión al componente celular capaz de unirse específicamente al al menos un objetivo del componente celular en los datos de secuenciación indica el número de copias del al menos un componente celular diana en una o más de la pluralidad de células. En algunas formas de realización, el número de secuencias de etiquetas moleculares de oligonucleótidos del reactivo de unión asociadas con la secuencia del identificador único para el reactivo de unión del componente celular capaz de unirse específicamente al al menos un objetivo del componente celular en los datos de secuenciación indica el número de copias del al menos al menos un objetivo de componente celular en una o más de la pluralidad de células. En algunas formas de realización, el número de secuencias de etiquetas moleculares de oligonucleótidos del reactivo de unión y de secuencias de etiquetas moleculares de códigos de barras asociadas con la secuencia de identificador único para el reactivo de unión al componente celular capaz de unión específica a al menos un objetivo de componente celular en los datos de secuenciación indica el número de copias de al menos un objetivo de componente celular en una o más de la pluralidad de células.
[0305] El uso de PCR para amplificar la cantidad de material antes de comenzar el protocolo de secuenciación agrega la posibilidad de artefactos, como la recombinación de artefactos durante la amplificación que ocurre cuando los productos de terminación prematura preparan una ronda posterior de síntesis). En algunas formas de realización, los métodos de indexación molecular dual proporcionados en el presente documento permiten la identificación de quimeras de PCR con suficiente profundidad de secuenciación. Además, en algunas formas de realización, la adición de la secuencia marcadora molecular única al oligonucleótido del reactivo de unión aumenta la complejidad del etiquetado estocástico. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la presencia de la secuencia marcadora molecular única en el oligonucleótido del reactivo de unión puede superar las limitaciones de diversidad de UMI. En algunas formas de realización, los métodos de indexación molecular dual proporcionados en el presente documento reducen el número de objetivos de componentes celulares marcados como “saturados” durante los cálculos de cobertura molecular posteriores a la secuenciación en al menos un 2 % (p. ej., 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 500 %, 1000 % o superior y rangos superpuestos) en comparación con si no se utilizan los métodos y las composiciones.
EJEMPLOS
[0306] Algunos aspectos de las formas de realización discutidas anteriormente se describen con más detalle en los siguientes ejemplos, que de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la presente descripción.
Ejemplo 1
Oligonucleótidos para asociar con reactivos de unión a proteínas
[0307] Este ejemplo demuestra el diseño de oligonucleótidos que pueden conjugarse con reactivos de unión a proteínas. Los oligonucleótidos se pueden usar para determinar la expresión de proteínas y la expresión génica simultáneamente. Los oligonucleótidos también se pueden usar para la indexación de muestras para determinar células de la misma muestra o de muestras diferentes.
Diseño de oligonucleótidos de 95 mer
[0308] Se usó el siguiente método para generar secuencias de oligonucleótidos candidatas y secuencias de cebadores correspondientes para la determinación simultánea de la expresión de proteínas y la expresión génica o la indexación de muestras.
1. Generación y eliminación de secuencias
[0309] Se usó el siguiente proceso para generar secuencias de oligonucleótidos candidatas para la determinación simultánea de la expresión de proteínas y la expresión génica o la indexación de muestras.
[0310] Paso 1a. Genere aleatoriamente un número de secuencias candidatas (50000 secuencias) con la longitud deseada (45 bps).
[0311] Paso 1b. Agregue la secuencia LSRR del regulador transcripcional al extremo 5' de las secuencias generadas y una secuencia poli(A) (25 pb) al extremo 3' de las secuencias generadas.
[0312] Paso 1c. Elimine las secuencias generadas y adjuntas que no tengan contenidos de GC en el rango de 40 % a 50 %.
[0313] Paso 1d. Elimine las secuencias restantes con una o más estructuras de horquilla cada una.
[0314] El número de secuencias de oligonucleótidos candidatas restantes fue 423.
2. Diseño de cebadores
[0315] Se usó el siguiente método para diseñar cebadores para las 423 secuencias de oligonucleótidos candidatas restantes.
2.1 Cebador N1: Utilice la secuencia universal N1: 5’-GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG-3' (secuencia LSRR; SEQ ID NO. 3) como cebador N1.
2.2 Cebador N2 (para amplificar oligonucleótidos de índice de muestra específicos; por ejemplo, cebador N2 en las Figuras 9B-9D):
2.2a. Retire los cebadores N2 candidatos que no comiencen corriente abajo de la secuencia N1.
2.2b. Retire los cebadores N2 candidatos que se superponen en los últimos 35 pb de la secuencia de oligonucleótidos candidata.
2.2c. Retire los candidatos de cebadores que están alineados con el transcriptoma de las especies de células que se están estudiando utilizando los oligonucleótidos (p. ej., el transcriptoma humano o el transcriptoma de ratón).
2.2d. Utilice la secuencia ILR2 como control predeterminado (ACACGACGCTCTTCCGATCT; SEQ ID NO. 4) para minimizar o evitar las interacciones cebador-cebador.
[0316] De las 423 secuencias de oligonucleótidos candidatas, se diseñaron cebadores N2 para 390 candidatas.
3. Filtrado
[0317] Se usó el siguiente proceso para filtrar las 390 secuencias de cebadores candidatas restantes.
3a. Elimine cualquier secuencia de oligonucleótidos candidata con una secuencia aleatoria que termine en As (es decir, la longitud efectiva de la secuencia poli(A) es superior a 25 pb) para mantener la cola poli(A) con la misma longitud para todos los códigos de barras.
3b. Elimine las secuencias de oligonucleótidos candidatas con 4 o más G consecutivas (> 3 G) debido al costo adicional y al rendimiento potencialmente menor en la síntesis de oligo de ejecuciones de G.
[0318] FIG. 9A muestra una secuencia de oligonucleótidos candidata de ejemplo no limitante generada usando el método anterior.
Diseño de oligonucleótidos 200mer
[0319] Se usó el siguiente método para generar secuencias de oligonucleótidos candidatas y secuencias de cebadores correspondientes para la determinación simultánea de la expresión de proteínas y la expresión génica y la indexación de muestras.
1. Generación y eliminación de secuencias
[0320] Se usó lo siguiente para generar secuencias de oligonucleótidos candidatas para la determinación simultánea de la expresión de proteínas y la expresión génica y la indexación de muestras.
la . Genere aleatoriamente un número de secuencias candidatas (100000 secuencias) con la longitud deseada (128 bps).
lb . Agregue la secuencia LSRR del regulador transcripcional y una secuencia de anclaje adicional que no sea humana ni de ratón al extremo 5' de las secuencias generadas y una secuencia poli(A) (25 pb) al extremo 3' de las secuencias generadas.
lc . Elimine las secuencias generadas y adjuntas que no tengan contenidos de GC en el rango de 40 % a 50 %. ld . Ordene las secuencias de oligonucleótidos candidatas restantes en función de las puntuaciones de estructura de horquilla.
le . Seleccione las 1000 secuencias de oligonucleótidos candidatas restantes con las puntuaciones de horquilla más bajas.
2. Diseño de cebadores
[0321] Se usó el siguiente método para diseñar cebadores para 400 secuencias de oligonucleótidos candidatas con las puntuaciones de horquilla más bajas.
2.1 Cebador N1: Utilice la secuencia universal N1: 5’-GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG-3' (secuencia LSRR; SEQ ID NO. 3) como cebador N1.
2.2 Cebador N2 (para amplificar oligonucleótidos de índice de muestra específicos; por ejemplo, cebador N2 en las FIGS. 9B y 9C):
2.2a. Retire los cebadores N2 candidatos que no comiencen 23 nts corriente abajo de la secuencia N1 (la secuencia de anclaje era universal en todas las secuencias de oligonucleótidos candidatas).
2.2b. Retire los cebadores N2 candidatos que se superponen en los últimos 100 pb de la secuencia objetivo. Los cebadores candidatos resultantes pueden estar entre el nucleótido 48 y el nucleótido 100 de la secuencia diana.
2.2c. Retire los candidatos de cebadores que están alineados con el transcriptoma de las especies de células que se están estudiando utilizando los oligonucleótidos (p. ej., el transcriptoma humano o el transcriptoma de ratón).
2.2d. Utilice la secuencia ILR2, 5'-ACACGACGCTCTTCCGATCT-3' (SEQ ID NO. 4) como control predeterminado para minimizar o evitar las interacciones cebador-cebador.
2.2e. Elimine los candidatos de cebadores N2 que se superponen en los últimos 100 pb de la secuencia objetivo.
[0322] De las 400 secuencias de oligonucleótidos candidatas, se diseñaron cebadores N2 para 392 candidatas.
3. Filtrado
[0323] Se usó lo siguiente para filtrar las 392 secuencias de cebadores candidatas restantes.
3a. Elimine cualquier secuencia de oligonucleótidos candidata con una secuencia aleatoria que termine en As (es decir, la longitud efectiva de la secuencia poli(A) es superior a 25 pb) para mantener la cola poli(A) con la misma longitud para todos los códigos de barras.
3b. Elimine las secuencias de oligonucleótidos candidatas con 4 o más G consecutivas (> 3 G) debido al costo adicional y al rendimiento potencialmente menor en la síntesis de oligo de ejecuciones de G.
[0324] La FIG. 9B muestra una secuencia de oligonucleótidos candidata de ejemplo no limitante generada usando el método anterior. El cebador N2 anidado que se muestra en la FIG. 9B puede unirse al anticuerpo o a la secuencia específica de la muestra para la amplificación dirigida. FIG. 9C muestra la misma secuencia de oligonucleótidos candidata de ejemplo no limitante con un cebador N2 universal anidado que corresponde a la secuencia de anclaje para la amplificación dirigida. FIG. 9D muestra la misma secuencia de oligonucleótidos candidata de ejemplo no limitante con un cebador N2 para amplificación dirigida en un paso.
[0325] En conjunto, estos datos indican que pueden diseñarse secuencias de oligonucleótidos de diferentes longitudes para la determinación simultánea de la expresión de proteínas y la expresión génica o la indexación de muestras. Las secuencias de oligonucleótidos pueden incluir una secuencia de cebador universal, una secuencia de oligonucleótidos específica de anticuerpo o una secuencia de índice de muestra y una secuencia poli(A).
Ejemplo 2
Flujo de trabajo de anticuerpos asociados con oligonucleótidos
[0326] Este ejemplo demuestra un flujo de trabajo del uso de un anticuerpo conjugado con oligonucleótidos para determinar el perfil de expresión de una proteína diana.
[0327] Se descongelan células congeladas (p. ej., células mononucleares de sangre periférica (PBMC) congeladas) de un sujeto. Las células descongeladas se tiñen con un anticuerpo conjugado con oligonucleótidos (p. ej., un anticuerpo anti-CD4 a 0,06 μg/100 μl (dilución 1:333 de una reserva de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos)) a una temperatura durante un tiempo (p. ej., temperatura ambiente durante 20 minutos). El anticuerpo conjugado con oligonucleótido se conjuga con 1, 2 o 3 oligonucleótidos (“oligonucleótidos de anticuerpo”). La secuencia del oligonucleótido del anticuerpo se muestra en la FIG. 10. Las células se lavan para eliminar el anticuerpo conjugado con oligonucleótido no unido. Las células se tiñen opcionalmente con calceína AM (BD (Franklin Lake, Nueva Jersey)) y Draq7™ (Abcam (Cambridge, Reino Unido)) para clasificarlas con citometría de flujo para obtener células de interés (p. ej., células vivas). Las células se lavan opcionalmente para eliminar el exceso de Calcein AM y Draq7™. Las células individuales teñidas con calceína AM (células vivas) y no con Draq7™ (células que no están muertas ni permeabilizadas) se clasifican mediante citometría de flujo en un cartucho BD Rhapsody™.
[0328] De los pocillos que contienen una única célula y una perla, las células individuales de los pocillos (p. ej., 3500 células vivas) se lisan en un tampón de lisis (p. ej., un tampón de lisis con DTT 5 mM). El perfil de expresión de ARNm de un objetivo (p. ej., CD4) se determina utilizando perlas BD Rhapsody™. El perfil de expresión de proteínas de un objetivo (p. ej., CD4) se determina utilizando perlas BD Rhapsody™ y los oligonucleótidos de anticuerpos. Brevemente, las moléculas de ARNm se liberan después de la lisis celular. Las perlas Rhapsody™ están asociadas con códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos), cada uno de los cuales contiene una etiqueta molecular, una etiqueta celular y una región oligo(dT). Las regiones poli(A) de las moléculas de ARNm liberadas de las células lisadas se hibridan con las regiones poli(T) de los códigos de barras estocásticos. Las regiones poli(dA) de los oligonucleótidos del anticuerpo hibridan con las regiones oligo(dT) de los códigos de barras. Las moléculas de ARNm se transcribieron inversamente utilizando los códigos de barras. Los oligonucleótidos de anticuerpos se replican utilizando los códigos de barras. La transcripción inversa y la replicación ocurren opcionalmente en una alícuota de muestra al mismo tiempo.
[0329] Los productos transcritos inversamente y los productos replicados se amplifican por PCR usando cebadores para determinar los perfiles de expresión de ARNm de genes de interés, usando cebadores N1, y el perfil de expresión de proteína de un objetivo, usando el cebador N1 de oligonucleótido de anticuerpo. Por ejemplo, los productos de transcripción inversa y los productos replicados se pueden amplificar por PCR durante 15 ciclos a una temperatura de hibridación de 60 grados usando cebadores para determinar los perfiles de expresión de ARNm de 488 genes del panel sanguíneo, usando cebadores N1 del panel sanguíneo y el perfil de expresión de la proteína CD4, utilizando el cebador N1 del oligonucleótido de anticuerpo (“PCR 1 ”). El exceso de códigos de barras se elimina opcionalmente con la limpieza de Ampure. Los productos de PCR 1 se dividen opcionalmente en dos alícuotas, una alícuota para determinar los perfiles de expresión de ARNm de los genes de interés, utilizando los cebadores N2 para los genes de interés, y una alícuota para determinar el perfil de expresión de proteínas del objetivo de interés, utilizando el cebador N2 del oligonucleótido de anticuerpo (“PCR 2”). Ambas alícuotas se amplifican por PCR (p. ej., durante 15 ciclos a una temperatura de hibridación de 60 grados). La expresión de la proteína del objetivo en las células se determina en base a los oligonucleótidos del anticuerpo como se ilustra en la FIG. 10 (“PCR 2”). Los datos de secuenciación se obtienen y analizan después de la adición del adaptador de secuenciación (“PCR 3”), como la ligadura del adaptador de secuenciación. Los tipos de células se determinan en función de los perfiles de expresión de ARNm de los genes de interés.
[0330] En conjunto, este ejemplo describe el uso de un anticuerpo conjugado con oligonucleótido para determinar el perfil de expresión de proteínas de un objetivo de interés. Este ejemplo describe además que el perfil de expresión de proteínas del objetivo de interés y los perfiles de expresión de ARNm de genes de interés pueden determinarse simultáneamente.
Ejemplo 3
Oligonucleótidos reactivos de unión a componentes celulares
[0331] Las FIGS. 11A-11B muestran diseños ejemplares no limitantes de oligonucleótidos para determinar la expresión de proteínas y la expresión génica simultáneamente y para la indexación de muestras. FIG. 11A muestra un oligonucleótido reactivo de unión a componente celular de ejemplo no limitante (SEQ ID NO: 7) que comprende un conector C6 modificador de amino 5' (5AmMC6) para la conjugación de anticuerpos (p. ej., se puede modificar antes de la conjugación de anticuerpos), un mango de PCR universal, una secuencia de código de barras específica de anticuerpo y una cola de poli(A). Aunque esta realización representa una cola de poli(A) que tiene una longitud de 25 nucleótidos, la longitud de la cola de poli(A) puede variar. En algunas formas de realización, la secuencia de código de barras específica del anticuerpo es un código de barras específico del clon del anticuerpo para su uso en métodos de creación de perfiles de expresión de proteínas. En algunas formas de realización, la secuencia de código de barras específica de anticuerpo es una secuencia de etiqueta de muestra para uso en métodos de indexación de muestras. Las características de diseño ejemplares de la secuencia de código de barras específica de anticuerpo son, en algunas formas de realización, una distancia de Hamming superior a 3, un contenido de GC en el rango de 40 % a 60 % y una ausencia de estructuras secundarias predichas (p. ej., horquilla). En algunas formas de realización, el mango de PCR universal se emplea para la amplificación de PCR dirigida durante la preparación de la biblioteca que conecta los adaptadores de secuenciación de Illumina a los amplicones. En algunas formas de realización, se pueden lograr lecturas de secuenciación de alta calidad reduciendo la diversidad de secuenciación.
[0332] FIG. 11B muestra un oligonucleótido reactivo de unión a componente celular de ejemplo no limitante (SEQ ID NO: 8) que comprende un conector C12 modificador de amino 5' (5AmMC12) para la conjugación de anticuerpos, un adaptador de cebador (p. ej., un adaptador parcial para Illumina P7), un identificador molecular único (UMI) de anticuerpo, una secuencia de código de barras específica de anticuerpo, una secuencia de alineación y una cola de poli(A). Si bien esta realización representa una cola de poli(A) que tiene una longitud de 25 nucleótidos, la longitud de la cola de poli(A) puede oscilar, en algunas formas de realización, entre 18 y 30 nucleótidos. Las características de diseño ejemplares de la secuencia de código de barras específica del anticuerpo (en la que “X” indica cualquier nucleótido), además de las descritas en la FIG. 11A, incluyen, en algunas formas de realización, una ausencia de homopolímeros y una ausencia de secuencias previstas in silico para unirse a transcritos humanos, transcritos de ratón, cebadores del sistema Rhapsody y/o cebadores del sistema SCMK. En algunas formas de realización, la secuencia de alineación comprende la secuencia BB (en la que B es C, G o T). En algunas formas de realización se proporcionan secuencias de alineación de 1 nucleótido de longitud y más de 2 nucleótidos de longitud. El conector 5AmMC12 puede, en algunas formas de realización, lograr una mayor eficacia (p. ej., para la conjugación de anticuerpos o la modificación previa a la conjugación del anticuerpo) en comparación con un conector más corto (p. ej., 5AmMC6). La secuencia UMI del anticuerpo puede comprender dobletes “VN” y/o “NV” (en los que cada “V” es cualquiera de A, C o G, y en los que “N” es cualquiera de A, G, C o T), que, en algunas formas de realización, mejoran el análisis informático sirviendo como un geomarcador y/o reducen la incidencia de homopolímeros. En algunas formas de realización, la presencia de una secuencia de marcaje molecular única en el oligonucleótido del reactivo de unión aumenta la complejidad del marcaje estocástico. En algunas formas de realización, el adaptador de cebador comprende la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el adaptador de cebador elimina la necesidad de un paso de amplificación por PCR para la conexión de adaptadores de secuenciación de Illumina que normalmente se requeriría antes de la secuenciación. En algunas formas de realización, la secuencia adaptadora de cebador (o una subsecuencia de la misma) no forma parte de la lectura de secuenciación de una plantilla de secuenciación que comprende una secuencia adaptadora de cebador y, por lo tanto, no afecta la calidad de lectura de una plantilla que comprende un adaptador de cebador.
Terminología
[0333] En al menos algunas de las formas de realización descritas anteriormente, uno o más elementos utilizados en una forma de realización pueden intercambiarse en otra forma de realización a menos que dicho reemplazo no sea técnicamente factible. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar varias otras omisiones, adiciones y modificaciones a los métodos y estructuras descritos anteriormente sin apartarse del alcance del objeto reivindicado. Todas estas modificaciones y cambios están destinados a caer dentro del alcance de la materia, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
[0334] Con respecto al uso de sustancialmente cualquier término plural y/o singular en el presente documento, los expertos en la materia pueden traducir del plural al singular y/o del singular al plural según sea apropiado para el contexto y/o o aplicación. Las diversas permutaciones de singular/plural pueden establecerse expresamente en este documento en aras de la claridad. Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ella” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cualquier referencia a “o” en este documento pretende abarcar “y/o” a menos que se indique lo contrario.
[0335] Los expertos en la técnica entenderán que, en general, los términos utilizados en este documento, y especialmente en las reivindicaciones adjuntas (p. ej., los cuerpos de las reivindicaciones adjuntas), se entienden generalmente como términos “abiertos” (p. ej., el término “ incluyendo” debe interpretarse como “que incluye pero no se limita a”, el término “tener” se debe interpretar como “que tiene al menos”, el término “incluye” se debe interpretar como “incluye pero no se limita a”, etc.). Los especialistas en la técnica comprenderán además que, si se pretende un número específico de una recitación de reivindicación introducida, dicha intención se recitará explícitamente en la reivindicación y, en ausencia de dicha recitación, dicha intención no estará presente. Por ejemplo, como ayuda para la comprensión, las siguientes reivindicaciones adjuntas pueden contener el uso de las frases introductorias “al menos uno” y “uno o más” para introducir recitaciones de reivindicaciones. Sin embargo, el uso de tales frases no debe interpretarse en el sentido de que la introducción de una mención de reivindicación mediante los artículos indefinidos “un” o “una” limita cualquier reivindicación particular que contenga dicha mención de reivindicación introducida a las formas de realización que contengan solo una mención de este tipo, incluso cuando la misma afirmación incluye las frases introductorias “uno o más” o “al menos uno” y artículos indefinidos como “un” o “un” (por ejemplo, “un” y/o “una” debe interpretarse como “al menos uno” o “uno o más”); lo mismo se aplica al uso de artículos definidos para introducir recitaciones de reclamos. Además, incluso si se recita explícitamente un número específico de una recitación de reivindicación introducida, los expertos en la materia reconocerán que dicha recitación debe interpretarse como al menos el número recitado (por ejemplo, la simple recitación de “dos recitaciones”, sin otros modificadores, significa al menos dos recitaciones, o dos o más recitaciones). Además, en aquellos casos en que una convención análoga a “al menos uno de A, B y C, etc.” se utiliza, en general, dicha construcción se pretende en el sentido de que alguien con experiencia en la técnica entendería la convención (por ejemplo, “un sistema que tiene al menos uno de A, B y C” incluiría, entre otros, sistemas que tener A solo, B solo, C solo, A y B juntos, A y C juntos, B y C juntos, y/o A, B y C juntos, etc.). En aquellos casos en que una convención análoga a “al menos uno de A, B o C, etc.” se utiliza, en general, dicha construcción se entiende en el sentido de que un experto en la materia entendería la convención (p. e j, “un sistema que tiene al menos uno de A, B o C” incluiría, entre otros, sistemas que tienen A solo, B solo, C solo, A y B juntos, A y C juntos, B y C juntos, y/o A, B y C juntos, etc.). Los expertos en la técnica comprenderán además que prácticamente cualquier palabra y/o frase disyuntiva que presente dos o más términos alternativos, ya sea en la descripción, las reivindicaciones o los dibujos, debe entenderse que contempla las posibilidades de incluir uno de los términos, cualquiera de los términos, o ambos términos. Por ejemplo, se entenderá que la frase “A o B” incluye las posibilidades de “A” o “B” o “A y B”.
[0336] Además, cuando las características o aspectos de la divulgación se describen en términos de grupos Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la divulgación también se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.
[0337] Como entenderá un experto en la materia, para todos y cada uno de los propósitos, como en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los rangos descritos en este documento también abarcan cualquiera y todos los posibles sub-rangos y combinaciones de los mismos. Cualquier rango enumerado puede reconocerse fácilmente como una descripción suficiente y permitir que el mismo rango se divida en mitades, tercios, cuartos, quintos, décimos, etc., al menos iguales. Como ejemplo no limitativo, cada rango discutido en este documento se puede dividir fácilmente. en un tercio inferior, un tercio medio y un tercio superior, etc. Como también entenderá un experto en la materia, todo lenguaje como “hasta”, “al menos”, “mayor que”, “menor que” y similares incluyen el número recitado y hacen referencia a rangos que se pueden desglosar posteriormente en sub-rangos como se discutió anteriormente. Finalmente, como entenderá un experto en la materia, un rango incluye cada miembro individual. Así, por ejemplo, un grupo que tiene de 1 a 3 artículos se refiere a grupos que tienen 1, 2 o 3 artículos. De manera similar, un grupo que tiene de 1 a 5 artículos se refiere a grupos que tienen 1,2, 3, 4 o 5 artículos, y así sucesivamente.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la identificación de muestras, que comprende:
poner en contacto cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, respectivamente, en donde cada una de la pluralidad de muestras comprende una o más células, cada una de las cuales comprendiendo uno o más objetivos de componentes celulares, donde la composición de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares y donde el reactivo de unión a componentes celulares comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos,
en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de indexación de la muestra y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y en donde las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; e
identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra.
2. El método de la reivindicación 1:
(a) en donde el oligonucleótido de indexación de muestra comprende la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo, o una combinación de los mismos, opcionalmente donde el primer cebador universal es 5-50 nucleótidos de longitud, además opcionalmente en donde el primer cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde el cebador de secuenciación comprende un cebador de secuenciación P7; y/o
(b) en donde identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende:
codificar con barras oligonucleótidos de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras;
obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e
identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras en los datos de secuenciación.
3. El método de la reivindicación 2(b), en donde identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra, o de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, en los datos de secuenciación, opcionalmente en donde identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestras comprende:
replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestras, el al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras, o un producto del mismo, utilizando el primer cebador universal, un primer cebador que comprende la secuencia del primer cebador universal, o una combinación de los mismos, para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados;
obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicadas; e identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestra de un oligonucleótido de indexación de muestra replicado de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra replicados que corresponden al, al menos un oligonucleótido de indexación de muestra, o al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, en la secuenciación de datos.
4. El método de la reivindicación 3, en donde replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra replicados comprende: antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras:
(a) ligar un adaptador de replicación al, al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras, y
en donde replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras comprende replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras usando el adaptador de replicación ligado al, al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras oligonucleótido de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados; y/o
(b) poner en contacto un código de barras de la pluralidad de códigos de barras con el al menos un oligonucleótido de indexación de muestra, o un producto del oligonucleótido de indexación de muestra, para generar el código de barras hibridado con el oligonucleótido de indexación de muestra, o un producto del mismo; y extender el código de barras hibridado con el oligonucleótido de indexación de muestra, o el producto del oligonucleótido de indexación de muestra, para generar el oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras, y
en donde replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestra comprende replicar el oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras oligonucleótido de indexación de muestras, o un producto del mismo, usando el primer cebador universal, un primer cebador que comprende la secuencia del primer cebador universal, el segundo cebador universal, un segundo cebador que comprende la secuencia del segundo cebador universal, o una combinación de los mismos, para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados,
opcionalmente donde el producto del oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia complementaria del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras, o una subsecuencia del mismo, y la secuencia del código de barras, o una subsecuencia del mismo.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4:
(a) en donde el componente celular objetivo comprende una proteína objetivo y/o en donde al menos uno de uno o más componentes celulares objetivo está en una superficie celular; y/o
(b) en donde la secuencia de indexación de muestras tiene una longitud de 6-60 nucleótidos, opcionalmente donde las secuencias de indexación de muestras de al menos 10, 100 o 1000 composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; y/o (c) en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra tiene una longitud de 50-500 nucleótidos; y/o (d) que comprende eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras, opcionalmente en donde la eliminación de las composiciones de indexación de muestras no unidas comprende lavar una o más células de cada una de la pluralidad de muestras con un tampón de lavado y/o seleccionar células unidas a al menos un reactivo de unión a componentes celulares usando citometría de flujo; y/o
(e) que comprende lisar una o más células de cada una de la pluralidad de muestras; y/o
(f) en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra está configurado para ser separable del reactivo de unión al componente celular; y/o
(g) que comprende disociar el oligonucleótido de indexación de la muestra del reactivo de unión del componente celular, opcionalmente en donde la disociación del oligonucleótido de indexación de la muestra comprende separar el oligonucleótido de indexación de la muestra del reactivo de unión del componente celular mediante fotoescisión UV, tratamiento químico, calentamiento, tratamiento enzimático, o cualquier combinación de los mismos, además opcionalmente donde la disociación ocurre después de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestra y/o donde la disociación ocurre antes de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestra; y/o
(h) en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra está configurado para no separarse del reactivo de unión al componente celular; y/o
(i) en donde el oligonucleótido de indexación de muestra no es homólogo a las secuencias genómicas de ninguna de las una o más células, es homólogo a las secuencias genómicas de una especie, o una combinación de las mismas, opcionalmente donde la especie es una especie no mamífera; y/o
(j) en donde una muestra de la pluralidad de muestras comprende una pluralidad de células, una pluralidad de células individuales, un tejido, una muestra de tumor o cualquier combinación de los mismos, opcionalmente en donde la pluralidad de muestras comprende una célula de mamífero, una célula bacteriana, célula viral, célula de levadura, célula fúngica o cualquier combinación de las mismas; y/o
(k) en donde el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura de un código de barras configurado para capturar la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra, opcionalmente donde la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra complementaria a la secuencia de captura comprende una región poli (dA), donde adicionalmente opcionalmente el código de barras comprende una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura, opcionalmente donde la región de unión al objetivo comprende una región poli(dT); y/o
(l) en donde el componente celular objetivo comprende un carbohidrato, un lípido, una proteína, una proteína extracelular, una proteína de superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un receptor de histocompatibilidad principal complejo, un antígeno tumoral, un receptor, una proteína intracelular, o cualquier combinación de los mismos, opcionalmente en donde el objetivo de componentes celulares se selecciona de un grupo que comprende 10-100 objetivos de componentes celulares diferentes; y/o (m) en donde el reactivo de unión al componente celular está asociado con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con:
(i) una secuencia idéntica; y/o
(ii) diferentes secuencias de indexación de muestras.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2(b) y 3-5, que comprende antes de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestras, agrupar la pluralidad de muestras en contacto con la pluralidad de composiciones de indexación de muestras.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4(b) y las reivindicaciones 5-6, en donde un código de barras de la pluralidad de códigos de barras comprende una región de unión al objetivo y una segunda secuencia marcadora molecular, y en donde las segundas secuencias marcadoras moleculares de al menos dos los códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden diferentes secuencias marcadoras de segundas moléculas, opcionalmente:
(a) en donde el código de barras comprende una secuencia marcadora celular, la secuencia de un segundo cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una subsecuencia del mismo, o cualquier combinación de los mismos; y/o
(b) en donde la región de unión a la diana comprende una región poli(dT); y/o
(c) en donde la pluralidad de códigos de barras está asociada con una partícula, opcionalmente donde la partícula comprende al menos 10000 códigos de barras, adicionalmente opcionalmente:
(i) en donde al menos un código de barras de la pluralidad de códigos de barras está inmovilizado en la partícula, parcialmente inmovilizado en la partícula, encerrado en la partícula, parcialmente encerrado en la partícula, o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde la partícula es fragmentable; y/o
(ii) en donde la partícula comprende una perla, opcionalmente en donde la partícula comprende una perla de hidrogel rompible; y/o
(iii) en donde la partícula comprende una perla de Sepharose, una perla de estreptavidina, una perla de agarosa, una perla magnética, una perla conjugada, una perla conjugada con proteína A, una perla conjugada con proteína G, una perla conjugada con proteína NG, una perla conjugada con proteína L, una perla conjugada con oligo(dT), una perla de sílice, una perla similar a la sílice, una perla de hidrogel, una microperla antibiotina, una microperla antifluorocromo o cualquier combinación de los mismos, o donde la partícula comprende un material seleccionado del grupo que consiste en polidimetilsiloxano (PDMS), poliestireno, vidrio, polipropileno, agarosa, gelatina, hidrogel, paramagnético, cerámica, plástico, vidrio, metilestireno, polímero acrílico, titanio, látex, sefarosa, celulosa, nailon, silicona, y cualquier combinación de los mismos; y/o
(iv) en donde los códigos de barras de la partícula comprenden secuencias de segundas etiquetas moleculares seleccionadas de al menos 1000, 10000, o una combinación de las mismas, diferentes secuencias de segundas etiquetas moleculares, opcionalmente en donde las secuencias de segundas etiquetas moleculares de los códigos de barras comprenden secuencias aleatorias; y/o (v) en donde la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras usando la pluralidad de códigos de barras comprende:
poner en contacto la pluralidad de códigos de barras con los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestras; y extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
8. El método de la reivindicación 7(c)(v):
(a) en donde:
(i) el método comprende, antes de extender los códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de la muestra, agrupar los códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de la muestra, y en donde extender los códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestra comprende extender los códigos de barras agrupados hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestra para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras agrupados; o
(ii) extender los códigos de barras comprende extender los códigos de barras usando una ADN polimerasa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras y/o donde extender los códigos de barras comprende extender los códigos de barras usando una transcriptasa inversa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; y/o
(b) que comprende amplificar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras para producir una pluralidad de amplicones, donde opcionalmente amplificar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras comprende amplificar, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al menos una parte de la segunda secuencia de marcador molecular y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de muestra, además, opcionalmente, en donde obtener los datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras comprende obtener datos de secuenciación de la pluralidad de amplicones, opcionalmente en donde obtener los datos de secuenciación comprende secuenciar al menos una parte de la secuencia del primer marcador molecular y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de la muestra.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8:
(a) en donde la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras usando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras comprende la codificación de barras estocástica de los oligonucleótidos de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para generar una una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras estocásticos; y/o
(b) que comprende codificar con barras una pluralidad de objetivos de la célula usando la pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de objetivos con código de barras, donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiqueta de célula, y donde al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiqueta de célula idéntica; y obtener datos de secuenciación de los objetivos con código de barras, opcionalmente:
(i) en donde codificar con barras la pluralidad de objetivos usando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras comprende:
poner en contacto copias de los objetivos con regiones de unión al objetivo de los códigos de barras; y
transcripción inversa de la pluralidad de objetivos usando la pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de objetivos transcritos inversamente; y/o
(ii) que comprende: antes de obtener los datos de secuenciación de la pluralidad de objetivos con código de barras, amplificar los objetivos con código de barras para generar una pluralidad de objetivos con código de barras amplificados, donde opcionalmente amplificar los objetivos con código de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras amplificados comprende: amplificar los objetivos con código de barras mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR); y/o
(iii) en donde codificar con barras la pluralidad de objetivos de la célula usando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras comprende codificar con barras estocásticamente la pluralidad de objetivos de la célula usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para generar una pluralidad de códigos de barras estocásticos objetivos.
10. Una pluralidad de composiciones de indexación de muestras,
donde cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras,
donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos un objetivo de componente celular, y en donde el reactivo de unión a componentes celulares comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos, en donde el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestras para identificar el origen de la muestra de una o más células de una muestra y una secuencia de alineamiento adyacente a una región poli(dA), y
donde las secuencias de indexación de muestra de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes.
11. La pluralidad de composiciones de indexación de muestras de la reivindicación 10:
(a) en donde el oligonucleótido de indexación de muestras comprende la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo, o una combinación de los mismos, opcionalmente donde el primer cebador universal tiene una longitud de 5-50 nucleótidos, además opcionalmente en donde el primer cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación, porciones del mismo o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde el cebador de secuenciación comprende un cebador de secuenciación P7; y/o
(b) en donde el componente celular diana comprende una proteína diana, opcionalmente en donde el componente celular diana comprende una proteína de superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, o cualquier combinación de los mismos, además opcionalmente en donde el componente celular diana se selecciona de un grupo que comprende 10-100 componentes celulares diana diferentes; y/o
(c) en donde la secuencia de indexación de la muestra es:
(i) de 6 a 60 nucleótidos de longitud; o
(ii) 50-500 nucleótidos de longitud, opcionalmente en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra no es homólogo a las secuencias genómicas de ninguna de las una o más células; y/o
(d) en donde las secuencias de indexación de muestras de al menos 10, 100 o 1000 composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; y/o
(e) en donde al menos una muestra de la pluralidad de muestras comprende una o más células individuales, una pluralidad de células, un tejido, una muestra de tumor o cualquier combinación de los mismos, opcionalmente en donde la muestra comprende una muestra de mamífero, una muestra bacteriana, una muestra viral, una muestra de levadura, una muestra fúngica o cualquier combinación de las mismas.
12. El método o las composiciones de cualquiera de las reivindicaciones 1-11:
(a) en donde la secuencia de alineamiento tiene uno o más nucleótidos, o dos o más nucleótidos, de longitud; y/o
(b) en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende uno o más de:
(i) una primera secuencia de marcador molecular, opcionalmente en donde la primera secuencia de marcador molecular tiene una longitud de 2-20 nucleótidos; y
(ii) un enlazador, en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra está asociado con el reactivo de unión al componente celular a través del enlazador y/o
(c) en donde las primeras secuencias de etiquetas moleculares de al menos dos oligonucleótidos de indexación de la muestra son diferentes, y en donde la muestra las secuencias de indexación de al menos dos oligonucleótidos de indexación de muestra son:
(i) idénticas; y/o
(ii) diferentes; y/o
(d) en donde la secuencia de alineación:
(i) comprende una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos; y/o (ii) comprende una secuencia poli(dT), una secuencia poli(dG), una secuencia poli(dC), una secuencia poli(dU), o una combinación de las mismas; y/o
(iii) está en 5' con respecto a la región poli(dA); y/o
(e) en donde el enlazador comprende:
(i) una cadena de carbono, opcionalmente la cadena de carbono comprende de 2 a 30 carbonos, y adicionalmente opcionalmente la cadena de carbono comprende 12 carbonos; y/o
(ii) modificador de amino 5' C12 (5AmMC12), o un derivado del mismo; y/o
(f) en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra está:
(i) unido al reactivo de unión al componente celular, opcionalmente donde el oligonucleótido de indexación de la muestra está unido covalentemente al reactivo de unión al componente celular y/o no unido de forma covalente al reactivo celular reactivo de unión de componentes; y/o
(ii) conjugado con el reactivo de unión de componentes celulares, y opcionalmente en donde el oligonucleótido de indexación de la muestra se conjuga con el reactivo de unión de componentes celulares a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de las mismas.
13. Un método para medir la expresión de componentes celulares en células, que comprende:
poner en contacto una pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares con una pluralidad de células que comprenden una pluralidad de dianas de componentes celulares, en donde cada uno de la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares comprende un oligonucleótido específico del reactivo de unión de componentes celulares que comprende una secuencia identificadora única para el reactivo de unión del componente celular y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), y en donde el reactivo de unión del componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos uno de la pluralidad de objetivos de componentes celulares y en los que el reactivo de unión a componentes celulares comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos; extender los códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos específicos del reactivo de unión al componente celular, o sus productos, para producir una pluralidad de ácidos nucleicos marcados, en los que cada uno de los ácidos nucleicos marcados comprende una secuencia identificadora única, o una secuencia complementaria de la misma, y una primera etiqueta molecular secuencia, o una secuencia complementaria de la misma; y
obtener información de secuencia de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados, una secuencia complementaria de los mismos o una porción de los mismos para determinar el número de copias de al menos un componente celular diana de la pluralidad de componentes celulares diana en una o más de la pluralidad de células.
14. El método de la reivindicación 13:
(a) que comprende antes de extender los códigos de barras:
dividir la pluralidad de células asociadas con la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares a una pluralidad de particiones, en donde una partición de la pluralidad de particiones comprende una sola célula de la pluralidad de células asociadas con los reactivos de unión a componentes celulares; y en la partición que comprende la célula única, poner en contacto una partícula de código de barras con el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular, en donde la partícula de código de barras comprende una pluralidad de códigos de barras, cada uno de los cuales comprende una región de unión objetivo y una primera secuencia de marca molecular, y en donde dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprende diferentes secuencias de primeras etiquetas moleculares, opcionalmente donde la partícula de código de barras es una perla de sefarosa, una perla de estreptavidina, una perla de agarosa, una perla magnética, una perla de sílice, una perla similar a la sílice, una perla de hidrogel, una microperla anti-biotina, una microperla antifluorocromo o una combinación de las mismas; y/o
(b) en donde el número de secuencias de primera etiqueta molecular únicas asociadas con la secuencia de identificador único para el reactivo de unión al componente celular capaz de unirse específicamente a al menos un objetivo de componente celular en los datos de secuenciación indica el número de copias del al menos al menos un objetivo de componente celular en una o más de la pluralidad de células; y/o
(c) en donde el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular comprende uno o más de:
(i) una segunda secuencia marcadora molecular, opcionalmente en donde la segunda secuencia marcadora molecular tiene una longitud de 2 a 20 nucleótidos, además opcionalmente en donde la segunda las secuencias marcadoras moleculares de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son diferentes, y en las que las secuencias de identificación únicas de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son
idénticas; y/o
diferente; y/o
(ii) un enlazador, en donde el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares está asociado con el reactivo de unión a componentes celulares a través del enlazador; y/o
(d) en donde el número de secuencias únicas de la segunda etiqueta molecular asociadas con la secuencia del identificador único para el reactivo de unión al componente celular capaz de unirse específicamente a al menos un objetivo del componente celular en los datos de secuenciación indica el número de copias de el al menos un objetivo de componente celular en una o más de la pluralidad de células; y/o
(e) en donde el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular comprende la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde el primer cebador universal tiene 5-50 nucleótidos de longitud,
además, opcionalmente en donde el primer cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación, complementos del mismo, porciones del mismo o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde el cebador de secuenciación comprende un cebador de secuenciación P7; y/o (f) en donde la obtención de información de secuenciación de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados o una porción de los mismos comprende someter los ácidos nucleicos marcados a una o más reacciones para generar un conjunto de ácidos nucleicos para la secuenciación de ácidos nucleicos, opcionalmente en donde someter el ácido nucleico marcado ácidos nucleicos a una o más reacciones comprende someter los ácidos nucleicos marcados a una reacción de amplificación, usando el primer cebador universal, un primer cebador que comprende la secuencia del primer cebador universal, el segundo cebador universal, un segundo cebador que comprende la secuencia del segundo cebador universal, o una combinación de los mismos, para generar el conjunto de ácidos nucleicos para la secuenciación de ácidos nucleicos; y/o
(g) en donde cada uno de los códigos de barras comprende una etiqueta celular, un segundo cebador universal, un adaptador de amplificación, un adaptador de secuenciación o una combinación de los mismos; y/o
(h) en donde la pluralidad de dianas de componentes celulares comprende una pluralidad de dianas proteicas, y en donde el reactivo de unión al componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos una de la pluralidad de dianas proteicas, opcionalmente en donde la pluralidad de dianas celulares los objetivos del componente comprenden una proteína de la superficie celular, una proteína intracelular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o una combinación de los mismos; y/o
(i) en donde el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares está configurado para ser separable del reactivo de unión a componentes celulares; y/o
(j) que comprende disociar el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular del reactivo de unión al componente celular, opcionalmente en donde la disociación del oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular comprende separar el oligonucleótido específico del reactivo de unión del reactivo de unión del componente celular mediante fotoescisión UV, tratamiento químico, calentamiento, tratamiento con enzimas o cualquier combinación de los mismos, opcionalmente
en donde la disociación se produce después de codificar con código de barras el oligonucleótido específico del reactivo de unión del componente celular y/o en donde la disociación ocurre antes del código de barras del oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular; y/o
(k) en donde el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares está configurado para no separarse del reactivo de unión a componentes celulares; y/o
(l) en donde el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura de un código de barras configurado para capturar la secuencia del oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular, opcionalmente en donde la secuencia del oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares complementario a la secuencia de captura comprende una región poli(dA), más opcionalmente en donde el código de barras comprende una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura, y más opcionalmente en donde la región de unión al objetivo comprende una región poli(dT); y/o
(m) que comprende después de poner en contacto la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares con la pluralidad de células, eliminar uno o más reactivos de unión a componentes celulares de la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares que no están en contacto con la pluralidad de células, opcionalmente en donde eliminar uno o más reactivos de unión a componentes celulares que no están en contacto con la pluralidad de células comprende: eliminar uno o más reactivos de unión a componentes celulares que no están en contacto con el respectivo al menos uno de la pluralidad de objetivos de componentes celulares; y/o (n) en donde dividir la pluralidad de células comprende dividir la pluralidad de células asociadas con la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares y una pluralidad de partículas de código de barras que comprenden la partícula de código de barras en la pluralidad de particiones, donde la partición de la pluralidad de particiones comprende la célula individual de la pluralidad de células asociadas con el reactivo de unión de componentes celulares y la partícula de código de barras, opcionalmente donde la partición es un pocillo o una gotita; y/o
(o) en donde la pluralidad de células comprende células T, células B, células tumorales, células mieloides, células sanguíneas, células normales, células fetales, células maternas o una mezcla de las mismas.
15. Una composición que comprende:
una pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares, cada uno asociado con un oligonucleótido específico de reactivo de unión a componentes celulares que comprende una secuencia identificadora única para el reactivo de unión a componentes celulares y una secuencia de alineación adyacente a una región poli(dA), en la que el reactivo de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de una pluralidad de objetivos de componentes celulares y en donde el reactivo de unión a componentes celulares comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, una molécula pequeña, un ligando, un péptido o cualquier combinación de los mismos.
16. La composición de la reivindicación 15, en la que el oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular comprende:
(a) uno o más de:
(i) una primera secuencia marcadora molecular, opcionalmente en la que la primera secuencia marcadora molecular tiene una longitud de 2-20 nucleótidos, adicionalmente opcionalmente donde las primeras secuencias marcadoras moleculares de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son diferentes, y donde las secuencias identificadoras únicas de al menos dos oligonucleótidos específicos del reactivo de unión a componentes celulares son:
idénticas; y/o
diferente; y/o
(ii) un enlazador, en donde el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares está asociado con el reactivo de unión a componentes celulares a través del enlazador; y/o
(b) la secuencia de un primer cebador universal, una secuencia complementaria del mismo, una secuencia parcial del mismo, o una combinación de los mismos, opcionalmente donde el primer cebador universal tiene una longitud de 5-50 nucleótidos,
además, opcionalmente donde el primer cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos, donde opcionalmente el cebador de secuenciación comprende un cebador de secuenciación P7.
17. El método o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en donde:
(a) la secuencia de alineamiento:
(i) tiene una o más nucleótidos, o dos o más nucleótidos, de longitud; y/o
(ii) comprende una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos; y/o (iii) comprende una secuencia poli(dT), una secuencia poli(dG), una secuencia poli(dC), una secuencia poli(dU), o una combinación de las mismas; y/o
(iv) está en 5' con respecto a la región poli(dA); y/o
(b) el enlazador comprende:
(i) una cadena de carbono, opcionalmente la cadena de carbono comprende de 2 a 30 carbonos, y adicionalmente opcionalmente la cadena de carbono comprende 12 carbonos; y/o
(ii) modificador de amino 5' C12 (5AmMC12), o un derivado del mismo; y/o
(c) en donde el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares está:
(i) unido al reactivo de unión a componentes celulares, opcionalmente en donde el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares está unido covalentemente al reactivo de unión a componentes celulares y /o unido de forma no covalente al reactivo de unión al componente celular; y/o
(ii) conjugado con el reactivo de unión a componentes celulares, y opcionalmente el oligonucleótido específico del reactivo de unión a componentes celulares se conjuga con el reactivo de unión a componentes celulares a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos.
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