CN108779492A - 数字蛋白质定量 - Google Patents

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Abstract

描述了用于采用高通量测序进行单细胞分辨率，定量蛋白质组学分析的方法和组合物。

Description

数字蛋白质定量
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年12月30日提交的美国临时专利申请号62/273,249的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术
下一代测序方法已允许在整个生物体到单细胞水平对数千种核酸标志物进行定量分析。不同的是，事实证明对于其它生物组分(例如蛋白质)的定量分析要困难得多。方法如FACS、ELISA和基于珠的多重法受限于灵敏性的缺乏、样品通量，和可同时分析的标志物的数量。方法如大量细胞计数法(mass cytometry)需要昂贵且专门的重原子标记才能工作，并且对于所有(除最富有经验的)用户而言受限于数十种同时标志物。
发明内容
本文描述了用于在单细胞水平对生物组分(例如蛋白质)进行定量分析的方法和组合物。该分析通过将单细胞的生物组分水平编码为寡核苷酸条码序列来进行。所述方法和组合物涉及结合元件(例如，抗体或适配体)文库的生成和应用，其中各结合元件带有可识别寡核苷酸条码的标签。所述结合元件特异性结合不同靶配体(例如，蛋白质，抗原等)。所述结合元件可与单细胞的一组靶配体接触，以形成结合-元件：配体复合物。所述结合-元件配体复合物的水平可通过对结合至所述结合元件的寡核苷酸条码进行回收并测序来检测。该分析可以高度平行的方式进行，其中同时分析数十个至数万个或更多单细胞。
在一方面中，本发明提供多个混合物分区，其中，个体混合物分区包含：i)多个固定的蛋白质，其中，该个体混合物分区中的所有固定的蛋白质均来自一个细胞；和ii)至少约10个结构不同的抗体的文库，其中，所述结构不同的抗体对于所述固定的蛋白质的结构不同的靶表位具有特异性结合亲和性并与其结合，并且其中，所述结构不同的抗体采用任选可切割接头偶联至靶标-表位特异性寡核苷酸，其中，所述靶标-表位特异性寡核苷酸包含：a)靶标-表位特异性条码序列，其中，所述靶标-表位特异性条码序列对于任一结构不同的抗体而言是相同的，且对于所有其它结构不同的抗体而言是不同的；和b)任选地，独特分子标识符序列，其中该任选的独特分子标识符序列对于靶标-表位特异性寡核苷酸的每个分子而言是不同的。
在另一方面中，本发明提供多个混合物分区，其中，个体混合物分区包含：i)多个固定的蛋白质，其中，该个体混合物分区中的所有固定的蛋白质均来自一个细胞；ii)至少约10个结构不同的抗体的文库，其中，所述结构不同的抗体对于所述固定的蛋白质的结构不同的靶表位具有特异性结合亲和性并与之结合；iii)多个双链靶标-表位特异性寡核苷酸，其中，个体双链靶标-表位特异性寡核苷酸共价连接至相应的个体的结构不同的抗体，从该相应的个体的结构不同的抗体切割，或包含寡核苷酸的反向互补物，该寡核苷酸共价连接至相应的个体的结构不同的抗体或从相应的个体的结构不同的抗体切割，并且其中，该靶标特异性寡核苷酸包含：a)靶标-表位特异性条码序列，其中，所述靶标-表位特异性条码序列对于任一结构不同的抗体而言是相同的，并且对于所有其它结构不同的抗体而言是不同的；b)任选的独特分子标识符序列，其中，该独特分子标识符序列对于每个靶标-表位特异性寡核苷酸而言是不同的；c)分区特异性条码序列，其在任一混合物分区的所有分区特异性寡核苷酸中是相同的，且与所述多个混合物分区的其它混合物分区中的所有分区特异性条码序列不同；d)第一5’区域，其包含第一测序引物结合区域；和e)第二5’区域，其包含第二测序引物结合区域，其中该第一和第二引物结合区域处于该双链靶标-表位特异性寡核苷酸的相反链上，彼此结构不同，并且侧接该靶标-表位特异性条码序列，分区特异性条码序列，和任选的通用分子标识符序列。
在另一方面中，本发明提供高通量测序文库，其包含多个双链多核苷酸，其中，该文库代表单细胞的多个靶表位的水平，其中，个体双链多核苷酸包含：i)单细胞特异性条码序列，其中，该单细胞特异性条码序列对于所有双链多核苷酸而言是相同的；ii)表位靶标识符序列，其中，该表位靶标识符序列对于每个结构不同的靶表位而言是独特的；和iii)任选的通用分子标识符序列，其中，该通用分子标识符序列对于该文库中的每个双链多核苷酸而言是独特的，其中，所述双链多核苷酸包含高通量测序衔接子，其侧接i)，ii)，和，如果存在的iii)。
在另一方面中，本发明提供前述多种高通量测序文库中任一种，其中各文库编码独特单细胞的多个靶表位的水平。
在另一方面中，本发明提供一种产生权利要求3所述的多个混合物分区的方法，所述方法包括：i)提供固定且透性化的多个单细胞，其中，个体固定且透性化的单细胞包含一个单细胞的固定的蛋白质；ii)用偶联至所述靶标-表位特异性寡核苷酸的至少约10个结构不同的抗体的文库孵育所述固定且透性化的多个单细胞，由此使所述抗体结合至它们的相应表位(若存在)，以形成多个抗体文库-单细胞表位复合物；iii)洗去未结合的抗体；iv)将所述多个抗体文库-单细胞复合物划分成所述多个混合物分区，和，任选地弃去不包含单细胞和/或包含多个细胞的混合物分区；和v)将多个分区特异性条码寡核苷酸划分成所述多个分区，和，任选地弃去不包含单一分区特异性条码序列和/或包含多个分区特异性条码序列的混合物分区。
在另一方面中，本发明提供一种通过高通量测序进行单细胞分辨率靶表位分析的方法，所述方法包括：i)形成或提供前述多个混合物分区中的任一个，其中，该混合物分区还包含热稳定的聚合酶，并且其中：a)该靶标-表位特异性寡核苷酸采用可切割接头共价偶联至结构不同的抗体；b)该分区特异性寡核苷酸采用可切割接头共价偶联至珠；或c)a)和b)；和ii)切割a)、b)或c)的可切割接头；iii)进行第一杂交：a)使分区特异性寡核苷酸的3’引发区域(3’priming regions)杂交至靶标-表位特异性寡核苷酸的5’端，并用聚合酶延伸该杂交的分区特异性寡核苷酸，由此产生双链靶标-表位特异性寡核苷酸，其包含：靶标-表位特异性条码序列、分区特异性条码序列，和任选地，通用分子标识符序列；或b)使通用引物的3’引发区域杂交至靶标-表位特异性寡核苷酸的5’端，并采用聚合酶延伸该杂交的通用引物，由此产生双链靶标-表位特异性寡核苷酸，其包含通用引发区域、靶标-表位特异性条码序列，和任选地，通用分子标识符序列；和iv)进行第二杂交：a)使分区特异性寡核苷酸的3’引发区域杂交至双链靶标-表位特异性寡核苷酸的5’端，所述双链靶标-表位特异性寡核苷酸包含所述通用引发区域(若存在)，和，用聚合酶延伸该杂交的分区特异性寡核苷酸；或b)使通用引物的3’引发区域杂交至双链靶标-表位特异性寡核苷酸的5’端，所述双链靶标-表位特异性寡核苷酸包含分区特异性条码序列(若存在)，并用聚合酶延伸该杂交的通用引物，由此产生双链靶标-表位特异性寡核苷酸，其包含通用引发区域、靶标-表位特异性条码序列、分区特异性条码序列，和任选地，通用分子标识符序列；和v)扩增iv)的双链靶标-表位特异性寡核苷酸；和vi)合并并测序扩增的双链靶标-表位特异性寡核苷酸，在高通量测序反应中进行，以获得多个靶标-表位特异性寡核苷酸序列读数，其中，该测序包括：a)确定分区特异性条码序列，由此确定测序数据所对应的单细胞；和b)确定靶标-表位特异性条码序列，由此确定测序数据所对应的蛋白质表位，其中读数具有相同分区特异性条码序列和靶标-表位特异性条码序列的靶标-表位特异性寡核苷酸序列读数的数量与测序数据所对应的单细胞中的表位的水平成比例。
附图简要说明
图1：说明了用于高通量单细胞定量蛋白质组学的方法的实施方式。在该实施方式中，结合元件是导向至蛋白质靶标的抗体。所述抗体偶联至寡核苷酸，该寡核苷酸包含靶ID条码、引物结合位点，和任选地，通用分子标识符。数十个至数万个细胞的群(1)经固定和透性化(2)，并且与所述抗体-寡核苷酸偶联物的文库接触，以形成抗体：配体复合物，而未结合的抗体被洗去(3)。单细胞被划分成多个液滴，以形成各自包含单细胞、聚合酶、通用引物和珠的多个液滴，其中所述珠偶联至具有液滴特异性条码和引物区域的多个寡核苷酸(4)。与所述珠和/或所述寡核苷酸(其偶联至抗体)偶联的寡核苷酸被切割。采用聚合酶通用引物和珠寡核苷酸扩增抗体寡核苷酸，将靶蛋白质水平转换成可计数的序列标签(5)。液滴经合并以产生测序文库(6)，其采用下一代(高通量)测序法被测序，将序列标签计数转换成靶蛋白质水平(7)。
定义
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARY OF CELLAND MOLECULAR BIOLOGY(《细胞和分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版2007)；Sambrook等，MOLECULARCLONING，ALABORATORY MANUAL(《分子克隆，实验室手册》)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约1989)。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。
述及引物、条码、衔接子，或寡核苷酸序列或区域时，本文所用术语“互补物”或“互补”可包括维持该引物、条码、衔接子，或寡核苷酸的功能性所需的反向互补物或反向互补性。例如，当单链寡核苷酸包含侧接有用于PCR扩增的两个不同引物结合序列的一种或多种条码序列时，本领域技术人员应理解，该单链寡核苷酸的两个引物结合序列之一是一个引物的序列的反向互补物，而另一个与另一引物的序列或其部分相同。一个引物的杂交部分与其反向互补物的结合以及通过聚合的延伸产生供于第二引物的杂交部分的结合位点。
术语“结合元件”指与靶生物组分(例如，靶蛋白质、抗原、寡核苷酸、碳水化合物、小分子等)特异性相互作用或与其特异性结合的分子(例如，蛋白质、核酸、适配体等)。与靶生物组分特异性相互作用或特异性结合靶生物组分的分子的非限制性示例包括核酸(如寡核苷酸)、蛋白质(如抗体或其结合片段、转录因子、锌指蛋白、非抗体蛋白支架等)和适配体。
本文所用术语“生物组分”指细胞的任何生物分子。示例性的生物组分包括但不限于，蛋白质、表位、抗原、核酸、碳水化合物、脂质，和小分子。靶生物组分是对用于本文所述的方法或存在于本文所述的组合物中的结合元件具有特异性亲和性的那些生物组分。
在靶生物组分(例如，靶蛋白质)水平的内容中，本文所用术语“水平”指靶生物组分的存在、不存在或量。因此，确定生物组分的水平指确定该生物组分的存在、不存在或量。
本文所用术语“划分”或“经划分的”指将样品分为多个部分或多个“分区(partition)”。分区可以是固体或流体。在一些实施方式中，分区是固体分区，例如微通道。在一些实施方式中，分区是流体分区，例如液滴。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是不互溶的流体(如水和油)的混合物，或乳液。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在其它实施方式中，液体分区是与相邻水性液滴在物理或化学上分开的水性液滴，使得一个液滴的内容物不会扩散到相邻液滴中。
一些情况下，分区是虚拟(virtual)的。在优选实施方式中，虚拟分区需要一种分子或一组分子的实体性改变，所述改变由此划定就该分子或该组分子而言独特的分区。适于确立或保持虚拟分区的典型实体性改变包括但不限于：核酸条码、可检测标记等。例如，样品可在物理上被分区，且各分区的组分带有独特标识符(例如，独有核酸序列条码)的标签，使得所述标识符在与其它分区比较时是独特的，但在该分区的组分间是共有的。独特标识符可用以在需将实体上分区的物质合并的下游应用中维持虚拟分区。因此，如果样品是被实体上划分为包含单细胞的多个分区的细胞样品，那么标识符可在分区被重新合并之后鉴定衍生自单细胞的不同核酸。
术语“扩增反应”指用于以线性或指数方式倍增核酸靶序列拷贝的各种体外方法。这类方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)；DNA连接酶链反应(参见美国专利号4,683,195和4,683,202，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR方案：方法和应用指南)(Innis等编，1990))(LCR)；基于QBeta RNA复制酶和基于RNA转录的扩增反应(例如，涉及T7、T3或SP6引导的RNA聚合)，例如转录扩增系统(TAS)，基于核酸序列的扩增(NSABA)，和自主维持序列复制(3SR)；等温扩增反应(例如，单引物等温扩增(SPIA))；以及本领域技术人员已知的其它方法。
“扩增”指将溶液置于足以扩增多核苷酸的条件下的步骤(如果反应的所有组分是完整的)。扩增反应的组分包括，例如，一种或多种引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”一般是指靶核酸的“指数型”增长。然而，本文所用的“扩增”也可指核酸的选择靶序列数量的线性增长，如由循环测序或线性扩增所得。
术语“扩增反应混合物”指包含用于扩增靶核酸的各种试剂的水性溶液。这些试剂包括酶、水性缓冲剂、盐、一种或多种扩增引物、靶核酸和三磷酸核苷。扩增反应混合物还可包含稳定剂和其它添加剂以优化效率和特异性。根据上下文，该混合物还可以是完整或不完整的扩增反应混合物。
“聚合酶链反应”或“PCR”是指靶双链DNA的特定区段或子序列得以几何级数式扩增的一种方法。PCR是本领域技术人员所熟知的；参见例如，美国专利号4,683,195和4,683,202；和《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等编，1990。示例性PCR反应条件一般包括两步或三步循环。两步循环具有变性步骤，之后是杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤，之后是杂交步骤，之后是独立的延伸步骤。
“引物”指与靶核酸上的序列杂交并且用作核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以是各种长度的并且通常长度小于50个核苷酸，例如长度为12-30个核苷酸。可基于本领域技术人员已知的原理设计用于PCR的引物的长度和序列，参见例如Innis等(同上)。引物可以是DNA、RNA或DNA部分与RNA部分的嵌合体。在一些情况中，引物可包括一个或多个带修饰或非天然的核苷碱基。在一些情况中，引物被标记。
核酸或其部分与另一核酸杂交摂的某些条件使得生理缓冲液(例如，pH 6-9，25-150mM盐酸盐)中限定温度下的非特异性杂交最少。在一些情况中，核酸或其部分与一组靶核酸之间共有的保守序列杂交。在一些情况中，如果包括与超过一个核苷酸伴侣互补的“通用”核苷酸在内有至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个连续的互补核苷酸，引物或其部分能杂交至引物结合位点。在一些情况中，如果在至少约12、13、14、15、16、17或18个连续核苷酸中有不到0、1或2个互补错配，则引物或其部分能杂交至引物结合位点。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度是室温。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度高于室温。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度至少约37、40、42、45、50、55、60、65、68、70、72或75℃。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度是37、40、42、45、50、55、60、65、68、70、72或75℃。
“模板”指包含待扩增，侧接一对引物杂交位点，或与引物杂交位点相邻的多核苷酸的多核苷酸序列。因此，“靶模板”包含毗邻引物的至少一个杂交位点的靶多核苷酸序列。在一些情况中，“靶模板”包含侧接有“正向”引物和“反向”引物的杂交位点的靶多核苷酸序列。靶模板可以是单链或双链的。靶标可以是单链的，并且在第一(例如，正向或反向)引物的杂交和延伸之后变为双链的。
本文所用的“核酸”表示DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序及其任意化学修饰。修饰包括但不限于，提供整合入其它电荷、极化性、氢键、静电相互作用、与核酸配体碱基或核酸配体整体的连接点和作用点的化学基团的那些修饰。这类修饰包括但不限于，肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合如异碱基(isobases)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸也可包含非天然碱基，如硝基吲哚。修饰还可包括3′和5′修饰，包括但不限于用荧光团(例如，量子点或荧光有机染料)或其他部分加帽。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。
“聚合酶”是指能进行模板引导的多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)合成的酶。该术语同时包括全长多肽和具有聚合酶活性的结构域。DNA聚合酶是本领域技术人员熟知的，包括但不限于分离或衍生自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、滨海嗜热球菌(Thermococcuslitoralis)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime)的DNA聚合酶或其修饰版本。市售的聚合酶的其它示例包括，但不限于：克列诺片段(新英格兰生物实验室公司(New EnglandInc.)、Taq DNA聚合酶(凯杰公司(QIAGEN))、9°NTMDNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、Deep VentTMDNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、Manta DNA聚合酶(Enzymatics公司)、Bst DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、和phi29 DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)。
聚合酶包括DNA-依赖聚合酶和RNA-依赖聚合酶，如逆转录酶。已知至少5个DNA-依赖DNA聚合酶家族，虽然大多数落入A、B和C家族。其它类型DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。相似地，RNA聚合酶通常包括真核RNA聚合酶I、II和III，和细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA依赖性和RNA依赖性的。
术语“标记物”、“可检测标记物”、“可检测部分”和类似术语指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记物包括荧光染料(荧光团)、发光剂、电子密度试剂、酶(例如，ELISA中常用)、生物素、地高辛、32P和其它同位素、半抗原、以及可被检测的蛋白质(例如通过将放射性标签整合至肽中或用于检测与肽特异性反应的抗体)。该术语包括单一标记试剂的组合，例如，提供独特可检测特征(例如，特定波长或波长组合下)的荧光团的组合。可以采用本领域已知的用于将标记物偶联到需要的试剂的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，《生物偶联技术》(Bioconiugate Techniques)1996，圣迭戈的学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)。
如本文所用“条码”是鉴别其所偶联分子的短核苷酸序列(例如，长至少约4、6、8、10或12个核苷酸)。在一些情况中，编码靶ID条码的寡核苷酸可偶联至结合元件(例如，抗体)。结合元件与其相应靶标的结合可由靶ID条码的存在与否来检测。因此，靶生物组分的水平可通过检测包含靶ID条码的寡核苷酸的数量来确定。类似地，各自结合不同的结构不同的靶生物组分的多个结构不同的结合元件(例如，抗体)可偶联至包含靶ID条码的多个寡核苷酸，各结构不同的结合元件具有不同条码。因此，多个靶生物组分的水平可通过检测包含各相应靶ID条码的寡核苷酸的数量来确定。
在一些情况中，条码可用来例如鉴定分区中的分子。相比其它分区中存在的分区特异性条码，这样的分区特异性条码应对于该分区是独特的。例如，包含来自单细胞的靶生物组分(例如蛋白质)的分区可在各分区中包含不同分区特异性条码序列。该分区特异性条码可用于标记包含靶ID条码且偶联至该分区中结合元件的寡核苷酸。因此，可将独特“细胞条码”的拷贝纳入各分区的靶ID寡核苷酸标签中。由此，基于独特“细胞条码”，来自各细胞的靶生物组分水平(例如，存在、不存在或量)可与来自其它细胞的靶生物组分水平区分开。
细胞条码可由偶联至颗粒的寡核苷酸上存在的“颗粒条码”提供，其中，该颗粒条码由偶联至该颗粒且不同于偶联至多个分区中的其它颗粒的寡核苷酸的全部或基本全部寡核苷酸共有(例如，在全部或基本全部寡核苷酸间相同或基本相同)。因此，细胞和颗粒条码可存在于分区中，连接至颗粒，或纳入编码靶ID的寡核苷酸。相同序列的细胞或颗粒条码可被鉴定为衍生自相同细胞、分区和/或颗粒。此类分区特异性的细胞或颗粒条码可用各种方法产生，包括但不限于，导致条码偶联至或纳入固相或水凝胶支持物(例如，固体珠或粒子或水凝胶珠或颗粒)的那些方法。在一些情况中，水凝胶支持物是或包含交联的琼脂糖。一些情况中，所述分区特异性的细胞或颗粒条码采用拆分与混合(也称拆分与合并(splitand pool))合成方案来生成。分区特异性条码可以是细胞条码和/或颗粒条码。类似地，细胞条码可以是分区特异性条码和/或颗粒条码。此外，颗粒条码可以是细胞条码和/或区分特异性条码。
在一些情况中，条码独特地鉴定其所偶联的分子。所述条码通常称为“独特分子标识符”(UMI)。在一些情况中，可采用包含对于各分区独特的“分区特异性条码”、对于结合元件对其具有特异性亲和性的各靶标独特的靶ID，和对于各分子独特的UMI的引物和/或寡核苷酸。条码化之后，可以合并分区，并任选地扩增，而保持虚拟划分。因此，例如，包含各条码的各寡核苷酸的数量可被计数(例如通过测序)，以提供各靶生物组分的水平而无需维持实体性分区。
条码序列的长度决定了可以区分多少独特的样品。例如，1个核苷酸条码可以区分不多于4个不同样品或分子；4个核苷酸条码可以区分不多于44即256个样品；6个核苷酸条码可以区分不多于4096个不同样品；而8个核苷酸的条码可以标引不多于65,536个不同样品。此外，条码可通过采用条码化的引物扩增或通过连接而连接至单链寡核苷酸的两条链。
通常使用固有不精确的方法合成和/或聚合(例如，扩增)条码。因此，希望能够均一的条码(例如，单个分区、细胞或珠的全部条码化核酸所共有的细胞、颗粒或分区特异性条码)可以相对于范本条码序列包含各种N-1缺失或其它突变。因此，被称作“相同或基本相同拷贝”条码指由于例如合成、聚合或纯化中一个或多个差错而导致条码相对范本条码序列含有各种N-1缺失或其它突变。此外，在使用例如本文所述的拆分与合并方法和/或核苷酸前体分子等量混合物的合成过程中，条码核苷酸的随机偶联可能导致低概率事件，其中条码并非绝对独特的(例如，不同于群体的其它条码，或不同于不同分区、细胞或珠的条码)。但是，这类偏离理论理想条码的轻微偏差不会干扰本文所述的单细胞分析方法、组合物和试剂盒。因此，如本文所用，在颗粒、细胞、分区特异性或分子条码上下文中的术语“独特”涵盖偏离理想条码序列的各种非有意的N-1缺失和突变。一些情况中，由于条码合成、聚合和/或扩增的不精确性质造成的问题通过相对待区分的条码序列的数量进行可能的条码序列的过密采样(oversampling)来克服(例如，至少约2、5、10倍或更多倍的可能的条码序列)。例如，可用具有9个条码核苷酸的细胞条码来分析10,000个细胞，这样的条码给出262,144个可能的条码序列。本领域熟知条码技术的使用，参见例如Katsuyuki Shiroguchi等Proc Natl Acad Sci US A.，2012年1月24日；109(4)：1347-52；和Smith，AM等，NucleicsResearch Can 11，(2010)。
发明详述
I.综述
本文描述了用于对靶生物组分进行定量分析的组合物、方法和试剂盒。本文所述的组合物、方法和试剂盒可用于以单细胞分辨率确定多个细胞的多个靶生物组分的水平。本文所述的组合物、方法和试剂盒基于如下原理：靶生物组分的水平可被编码进入寡核苷酸。待编码的寡核苷酸偶联至对该靶生物组分具有特异性的结合元件。偶联的寡核苷酸包括对应于该靶生物组分的靶ID序列。所述编码可通过靶生物组分和结合元件之间的结合事件而进行。对于编码的寡核苷酸的靶ID序列的检测能检测靶生物组分(若存在)。可对多个编码的寡核苷酸进行高通量测序以计数编码靶ID序列的寡核苷酸的数量，由此确定靶生物组分的水平。所述方法可以，例如，与特异性结合结构不同的靶生物组分的2-约10,000或更多的结构不同的结合元件平行进行。各结构不同的结合元件可偶联至具有不同靶ID序列的寡核苷酸。所述方法还可与2-约10,000或更多不同单细胞平行进行。因此，本文所述的方法、组合物和试剂盒可用于，例如，以单细胞分辨率对大量的单细胞中的大量靶生物组分进行的定量分析。
II.组合物
a.固定且透性化的细胞
本文描述固定(例如，交联)且透性化的细胞。所述固定且透性化的细胞可包含该细胞的多个靶生物组分。因此，所述固定且透性化的细胞可根据本文所述的方法分析，以确定所述多个靶生物组分的水平。所述固定且透性化的细胞可通过适于使所述固定且透性化的细胞的靶生物组分耐受洗去(washing away)且可及靶结合元件的任何方法而被固定且透性化。所述方法包括但不限于，如下进一步详细描述的细胞固定和透性化方法，及其变化形式。
b.条码和包含所述条码的寡核苷酸
本文描述靶ID条码和包含靶ID条码的寡核苷酸。靶ID条码包含核酸序列，该核酸序列为靶ID条码独有，因此为相应靶生物组分独有，且不同于对应于其它靶生物组分的所有其它靶ID条码。靶ID条码的长度可短至单核苷酸，或长达20个核苷酸，或更长。在一个示例性实施方式中，靶ID条码的长度为6-8个核苷酸。一般而言，靶ID条码序列的长度决定了可在单一测序运行中分析的不同靶生物组分的数量。例如，具有单核苷酸(可以是四种标准DNA碱基(A、G、C或T)中任一)的靶ID条码可用以分析四种或更少的不同靶生物组分。类似地，长度为四个核苷酸的靶ID条码可用以分析44(256)个或更少的不同靶生物组分。包含靶ID条码的寡核苷酸可以是测序文库、偶联文库、结合元件文库，和/或多个分区的组分。在一些情况中，包含靶ID条码的寡核苷酸偶联至结合元件(例如，抗体)，该结合元件特异性结合靶生物组分(例如，蛋白质)。
本文还描述分区特异性条码和包含所述分区特异性条码的寡核苷酸。分区特异性条码包含分区独有的且不同于其它分区中的全部其它分区特异性条码的核酸序列。在一些情况中，分区特异性条码还用于，或用于利用细胞条码标记一种或多种靶生物组分。例如，分区特异性条码可存在于包含单一固定且透性化的细胞的分区中。所述固定且透性化的细胞的靶生物组分可用分区特异性条码标记，因此将全部靶生物组分标记为衍生自相同单细胞。类似地，分区特异性条码可存在于包含单一固定且透性化的细胞和与该细胞的靶生物组分结合的多个结合元件的分区中。所述结合元件可用分区特异性条码标记，因此将全部结合元件标记为编码关于来自相同单细胞的靶生物组分的信息。所述信息可以是来自相同单细胞的靶生物组分的水平。
分区特异性条码的长度可短至单核苷酸，或长达20个核苷酸，或更长。在一个示例性实施方式中，分区特异性条码的长度是6-8个核苷酸。一般而言，分区特异性条码序列的长度决定了可在单一测序运行中分析的不同固定且透性化的细胞的数量。例如，具有单核苷酸(可以是四种标准DNA碱基(A、G、C或T)中任一)的分区特异性条码可用以分析四种或更少的不同固定且透性化的细胞。类似地，长度为四个核苷酸的分区特异性条码可用以分析44(256)个或更少的不同固定且透性化的细胞。包含分区特异性条码的寡核苷酸可以是固体表面(例如，珠)的组分，其具有包含固定于其上的分区特异性条码的寡核苷酸的多个拷贝。类似地，分区特异性条码可以是测序文库，和/或多个分区的组分。在一些情况中，包含分区特异性条码的寡核苷酸偶联至结合元件(例如，抗体)，该结合元件特异性结合靶生物组分(例如，蛋白质)。在一些情况中，包含分区特异性条码的寡核苷酸杂交至寡核苷酸，该寡核苷酸偶联至结合元件(例如，抗体)，该结合元件特异性结合靶生物组分(例如，蛋白质)。
本文还描述通用分子标识符(UMI)条码和包含所述UMI的寡核苷酸。UMI包含独特因而不同于全部其它UMI的核酸序列。在一些情况中，UMI是独特的，因此不同于衍生自相同单一固定且透性化的细胞的相同分区中的所有其它UMI。例如，如果UMI与分区特异性条码序列成对，或将在后续步骤中与分区特异性条码序列成对，那么该UMI的组相比不同分区中的UMI不需要是独特的，因为所述分区特异性条码和所述UMI的组合相比所有其它此类组合而言可以是独特的。类似地，如果UMI与靶ID条码序列成对，则该UMI的组相比与不同靶ID条码相关联的UMI不需要是独特的，因为所述靶ID条码和所述UMI的组合相比所有其它此类组合而言可以是独特的。
包含UMI条码的寡核苷酸可以是测序文库、偶联文库、结合元件文库，和/或多个分区的组分。在一些情况中，包含UMI条码的寡核苷酸偶联至结合元件(例如，抗体)，该结合元件特异性结合靶生物组分(例如，蛋白质)。包含UMI条码的寡核苷酸还可包含分区特异性条码、靶ID条码，或其组合。所述UMI，例如，与分区特异性条码和/或靶ID条码相组合，可将核酸分子鉴定为独特的或鉴定为扩增拷贝。例如，在包含相同靶ID条码、分区特异性条码，和UMI条码序列的寡核苷酸的对中，所述寡核苷酸之一可能是其它寡核苷酸的扩增拷贝，或两个寡核苷酸均为第三寡核苷酸的扩增拷贝。类似地，在包含相同靶ID条码和分区特异性条码序列但不同UMI条码序列的寡核苷酸对中，两个寡核苷酸均可能指示相应相同单细胞中不同相应靶生物组分分子的存在。
UMI条码的长度可短至单核苷酸，或长达20个核苷酸，或更长。在一个示例性实施方式中，UMI条码的长度为6-8个核苷酸。一般而言，UMI条码序列(若存在，例如，与靶ID条码序列和/或分区特异性条码序列相组合)的长度决定了单一测序运行中可分析的不同分子的数量。例如，具有单核苷酸(可以是四种标准DNA碱基(A、G、C或T)中任一)的UMI条码可用以分析对应于单一靶生物组分和/或单细胞的四种或更少的不同分子。类似地，长度为四个核苷酸的靶ID条码可用以分析对应于单一靶生物组分和/或单细胞的44(256)个或更少的不同分子。
寡核苷酸可包含靶ID条码、分区特异性条码、UMI条码，或其组合中的一种或多种。此类寡核苷酸可以相对于彼此和/或相对于该寡核苷酸的其它区域的任何合适顺序包含这些条码。在一个实施方式中，该寡核苷酸是单链的，并且从5’到3’包含分区特异性条码、靶ID条码，和任选地，UMI条码。在另一实施方式中，该寡核苷酸是单链的，并且从5’到3’包含分区特异性条码，任选的UMI条码，和靶ID条码。在另一实施方式中，该寡核苷酸是单链的，并且从5’到3’包含靶ID条码、分区特异性条码，和任选地，UMI条码。在另一实施方式中，该寡核苷酸是单链的，并且从5’到3’包含靶ID条码、任选的UMI条码，和分区特异性条码。在另一实施方式中，该寡核苷酸是单链的，并且从5’到3’包含任选的UMI条码、分区特异性条码，和靶ID条码。在另一实施方式中，该寡核苷酸是单链的，并且从5’到3’包含任选的UMI条码、靶ID条码，和分区特异性条码。
在任何前述实施方式中，所述单链寡核苷酸可包含样品指标条码。所述样品指标可相对于靶ID条码、UMI条码，或分区特异性条码(若存在)处于任何位置。例如，所述样品指标可以是分区特异性条码的5’。或者，所述样品指标可以是分区特异性条码的3’。在一些情况中，样品指标是UMI条码(若存在)的5’。在一些情况中，样品指标是UMI条码(若存在)的3’。在一些情况中，样品指标是靶ID条码的5’。在一些情况中，样品指标是靶ID条码的3’。
样品指标条码可鉴定具体核酸的来源，由此允许对多个样品进行多重分析。例如，各自包含多个固定且透性化的单细胞的多个样品可采用本文所述方法同时分析。样品指标可被检测并用以鉴定哪个寡核苷酸序列对应于哪个样品。所述多个样品可来自单一对象，例如，收集或获得自多个时间点或来自多个不同组织。所述多个样品可来自不同对象，例如，不同人对象。
样品指标条码的长度可短至单核苷酸，或长达20个核苷酸，或更长。在一个示例性实施方式中，样品指标条码的长度是2、3或4个核苷酸。一般而言，样品指标条码序列(若存在)的长度的决定了可在单一测序运行中分析的不同样品的数量。例如，具有单核苷酸(可以是四种标准DNA碱基(A、G、C或T)中任一)的样品指标条码可用以分析四种或更少的不同样品。类似地，长度为2个核苷酸的样品指标条码可用以分析42(16)个或更少的不同样品。
在任何前述实施方式中，单链寡核苷酸可在5’或3’端包含通用引物结合序列。通用引物结合序列可互补至分区中存在的通用引物。在一些情况中，单链寡核苷酸可在与第一引物互补的5’端包含引物结合序列，或包含其反向互补物，且在与第二引物互补的3’端包含不同引物结合序列，或包含其反向互补物。第一和/或第二引物可存在于包含该单链寡核苷酸的分区中。第一或第二引物可包含分区特异性条码序列、样品指标条码序列，和/或UMI条码序列。第一或第二引物可包含高通量测序文库衔接子序列(例如，P5、读数1、P7、读数2等)或其部分，或包含与高通量测序文库衔接子序列(例如，P5、读数1、P7、读数2等)或其部分互补的区域。
前述单链寡核苷酸中任一可偶联至结合元件，例如抗体，例如，在该单链寡核苷酸的5’或3’端。该单链寡核苷酸可通过可切割接头偶联至结合元件。该可切割接头可以是包含限制性核酸内切酶识别位点的核酸序列。或者，可切割接头可以是包含尿嘧啶的核酸序列，由此可被尿嘧啶-DNA糖苷酶切割。或者，可切割接头可被其它酶促手段切割。作为另一替代方式，可切割接头可包含可由化学手段切割的区域。例如，可切割接头可包含可由还原剂(例如，二硫苏糖醇或三羧乙基膦(triscarboxyethylphosphine))切割的二硫键。
本文所述的，包含分区特异性条码序列的单链寡核苷酸(即，分区特异性条码化的寡核苷酸)可共价固定在固体表面(例如珠)上。此类分区特异性条码寡核苷酸还可在5’和/或3’端包含引物和/或高通量测序衔接子序列，其反向互补物，或其部分。所述分区特异性条码寡核苷酸可在5’或3’端共价连接至珠，例如，采用可切割接头。该可切割接头可以是包含限制性核酸内切酶识别位点的核酸序列。或者，可切割接头可以是包含尿嘧啶的核酸序列，由此可被尿嘧啶-DNA糖苷酶切割。或者，可切割接头可被其它酶促手段切割。作为另一替代方式，可切割接头可包含可由化学手段切割的区域。例如，可切割接头可包含可由还原剂(例如，二硫苏糖醇或三羧乙基膦(triscarboxyethylphosphine))切割的二硫键。
作为另一替代方式，分区特异性条码化的寡核苷酸可偶联至可熔珠，例如热可逆型水凝胶珠(例如，包含交联的琼脂糖的珠)。在一些情况中，可熔珠可经加热熔化，其中该熔化使珠的一种或多种固体表面组分解散成该珠残余的混合物的其它组分，从而对于该珠的后续冷却不重新形成固体表面。因此，在一些实施方式中，分区特异性条码化的寡核苷酸可由加热而非切割释放。
类似地，在另一替代方式中，分区特异性条码化的寡核苷酸可被偶联至固体表面，该固体表面包含聚合物(例如，交联的聚合物)，该聚合物可通过化学或酶促手段解聚或去交联，以释放分区特异性条码化的寡核苷酸。例如，分区特异性条码化的寡核苷酸可被偶联至包含二硫交联的聚合物的珠，而分区特异性条码化的寡核苷酸可通过与还原剂接触而被释放。在另一示例中，分区特异性条码化的寡核苷酸可被偶联至琼脂糖珠，而分区特异性条码化的寡核苷酸可通过与琼脂糖接触而被释放。共价连接至包含分区特异性条码的寡核苷酸的示例性固体表面包括2015年6月24日提交的PCT申请系列号PCT/US15/37525中描述的那些，其内容通过引用全文的方式纳入本文用于所有目的，而具体地是用于与珠、寡核苷酸偶联的珠，和制备并采用所述珠或寡核苷酸偶联的珠的方法相关的公开内容。
前述单链寡核苷酸中任一种均可被杂交至互补、或部分互补的寡核苷酸。例如，前述单链寡核苷酸中的任一种均可被杂交至其反向互补物，形成双链寡核苷酸。在另一示例中，前述单链寡核苷酸中的任一种可被杂交至寡核苷酸引物，该引物可完全或部分互补至少所述单链寡核苷酸的部分。在一些情况中，引物可包含一个或多个条码序列例如UMI条码序列，或分区特异性条码序列。在一些情况中，引物可包含一个或多个高通量测序文库衔接子序列，或其部分。在一些情况中，引物可包含在所述单链寡核苷酸的5’或3’端特异性杂交至通用序列的3’区域。在一些情况中，引物可包含特异性杂交至与所述单链寡核苷酸的5’或3’端处的序列互补的通用序列的3’区域。因此，例如，第一引物(或其3’区域)可杂交至所述单链寡核苷酸的5’端处的引物结合位点，随后经聚合酶延伸，以在所得引物延伸产物上产生供于第二引物(或其3’区域)的引物结合位点。
c.文库
本文描述了测序文库和偶联文库。所述文库一般包含多个一种或多种前述条码寡核苷酸(包含一个或多个条码序列的寡核苷酸)。本文还描述了结合元件文库。在一些情况中，结合元件文库的个体结合元件偶联至条码寡核苷酸，例如，通过可切割接头。本文还描述了分区特异性条码文库。在一些情况中，分区特异性条码文库包含偶联至多个固体表面的多个分区特异性条码化的寡核苷酸。本文所述的文库的任何一种或多种可存在于分区中，或多个分区中。
本文所述的测序文库包含多个寡核苷酸，其经设置为可与一种或多种高通量测序平台兼容。由此，测序文库的寡核苷酸可在5’或3’端包含至少一种高通量测序衔接子序列。在一些情况中，寡核苷酸可在5’端包含第一高通量测序衔接子序列，而在3’端包含第二不同高通量测序衔接子序列。在一些情况中，寡核苷酸在一端包含P5 Illumina衔接子序列，而在另一端包含P7 Illumina衔接子序列。测序文库的寡核苷酸可以是单链或双链的。
一般而言，测序文库的寡核苷酸组分各包含分区特异性条码和靶ID条码。在一些情况中，测序文库的寡核苷酸还包含UMI条码。在一些实施方式中，测序文库的寡核苷酸包含样品指标序列。在一些情况中，样品指标对于测序文库的所有寡核苷酸而言是相同的。在一些情况中，各自包含含有均一样品指标的寡核苷酸的多个测序文库(其中该均一样品指标在不同多个测序文库间不同)可被混合在一起以同时分析对应于多个样品的测序文库。
本文所述的分区特异性条码文库可包含共有相同第一分区特异性条码序列的多个寡核苷酸，共有相同第二分区特异性条码序列的多个寡核苷酸，共有相同第三分区特异性条码序列的多个寡核苷酸等，其中各第一、第二、第三等的多个寡核苷酸包含彼此不同的分区特异性条码序列。所述分区特异性条码文库可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、500、750、1000、2500、5000、7500、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、100,000、125,000、150,000、175,000、200,000、250,000，或更多不同条码序列，各序列存在于多个相同寡核苷酸拷贝中。在一些情况中，各多个相同寡核苷酸拷贝包含至少，或包含至少约，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、500、750、1000、2500、5000、7500、10,000、15,000、20,000、30,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、125,000、150,000、175,000、200,000、250,000，300,000、400,000、500,000、750,000、106、107、108、109，或更多相同寡核苷酸拷贝。在一些情况中，偶联至共有的固体表面的各多个寡核苷酸共享相同分区特异性条码序列，其不同于该文库的所有其它分区特异性条码序列。在一些情况中，存在于相同分区中的各多个寡核苷酸共享相同分区特异性条码序列，其不同于该文库的所有其它分区特异性条码序列。
本文所述的结合元件文库包括抗体文库、抗体片段文库、适配体文库等，包括包含抗体、抗体片段、适配体等中的两个或更多个的混合物的文库。结合元件文库可包含约2-约100,000或更多结构不同的结合元件，约2-约50,000或更多结构不同的结合元件，约2-约10,000或更多结构不同的结合元件，约10-约5,000结构不同的结合元件，约10-约1,000结构不同的结合元件，约10-约500结构不同的结合元件，或约10-约100结构不同的结合元件，例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、70、80、90、100、200、300、500、750、1,000、2,500、5,000、7,500、10,000、15,000、20,000、30,000、50,000、75,000、100,000，或更多结构不同的元件。在一些情况中，各结构不同的结合元件特异性结合不同靶生物组分。
在一些情况中，大多数(例如，大于至少50％，至少75％，至少90％，或至少99％)的各个结构不同的结合元件特异性结合不同靶生物组分。在一些情况中，多个结构不同的结合元件可作为内部对照存在，从而采用特异性结合相同靶生物组分的两种不同结构不同的结合元件对靶生物组分的相同水平或大致相同水平的检测可在本文所述方法的一种或多种中提供提高的统计学置信度或减小的数据变异性。在一些情况中，约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％，或100％的结构不同的结合元件特异性结合另被文库的至少一种其它结构不同的结合元件识别的靶生物组分。在一些情况中，结合元件的文库的组分偶联至条码化的寡核苷酸。例如，结合元件的文库的组分(例如，抗体组分)可各自被偶联至包含靶ID条码序列和任选UMI条码序列的寡核苷酸。在一些情况中，偶联的寡核苷酸还包含分区特异性条码序列。
本文所述的偶联文库包含多个靶ID条码化的寡核苷酸，其可被用于对带有靶ID条码的结合元件的文库加标签，任选地联合本文所述的其它条码(例如UMI条码、分区特异性条码、样品指标条码，及其组合)中的一种或多种。偶联文库的个体寡核苷酸可包含反应性部分，其用于与结合元件形成共价连接(例如，共价可切割连接)。在一些情况中，偶联文库以可寻址分区的(addressably partitioned)形式提供，从而各分区包含共享相同靶ID条码序列的一种或多种寡核苷酸，该靶ID条码序列不同于所有其它分区中的靶ID条码序列，其中各分区中的靶ID条码序列是已知的。
在一些情况中，偶联文库存在于多孔板中的多个孔中，或多反应室装置的多个反应室中。结合元件的文库可被划分为多个反应室，从而各反应室包含特异性结合已知靶生物组分的多个结构相同的结合元件，以及共享相同靶ID条码的多个寡核苷酸。在一些情况中，结合元件的文库可被划分为多个反应室，从而各反应室包含特异性结合已知靶生物组分的多个结合元件，和共享相同靶ID条码的多个寡核苷酸。结合元件和偶联文库的寡核苷酸之间的偶联可由此在分区中进行，以产生带有靶ID条码标签的结合元件的文库，其中所述靶ID条码序列和结合元件特异性结合的相应靶生物组分是已知的。
偶联文库的寡核苷酸可包含额外的引物结合序列、衔接子序列，或其组合。在一些情况中，偶联文库的寡核苷酸在3’端包含3’引物结合序列，并在5’端包含5’引物结合序列的反向互补物。在一些情况中，引物结合序列或其反向互补物(位于5’或3’端)处可包含高通量测序衔接子序列或其反向互补物。在一些情况中，偶联文库的寡核苷酸是单链的。在一些情况中，偶联文库的寡核苷酸是双链的。
偶联文库可包含多个寡核苷酸，其中各寡核苷酸包含1个靶ID条码，并且其中该偶联文库的多个寡核苷酸包括约2-约100,000或更多结构不同的靶ID条码，约2-约50,000或更多结构不同的靶ID条码，约2-约10,000或更多结构不同的靶ID条码，约10-约5,000结构不同的靶ID条码，约10-约1,000结构不同的靶ID条码，约10-约500结构不同的靶ID条码，或约10-约100结构不同的靶ID条码，例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、70、80、90、100、200、300、500、750、1.000、2,500、5,000、7,500、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、65,536、70,000、75,000、80,000、90,000、100,000，或更多结构不同的靶ID条码。
d.混合物分区
本文描述了多个混合物分区(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、500、750、1000、2500、5000、7500、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、125,000、150,000、175,000、200,000、250,000、300,000、400,000、500,000、750,000、106、107，或更多分区)，各分区具有固定且透性化的细胞。所述分区还可包含模板导向的核酸聚合试剂和/或模板导向的核酸聚合产物。示例性的模板导向的核酸聚合试剂包括DNA模板(例如，条码化的寡核苷酸)，聚合酶(例如，热稳定的DNA-依赖性聚合酶)，核苷酸，缓冲剂，盐，寡核苷酸引物(例如，通用和/或分区特异性条码化的引物)等。
混合物分区可包含前述寡核苷酸、条码、结合元件、固定且透性化的细胞、其组分、其文库，和/或其组合中任一种。在一些实施方式中，混合物分区还各包含结合元件的文库。在一些情况中，结合元件的文库包括约2-约100,000或更多结构不同的结合元件、约2-约50,000或更多结构不同的结合元件、约2-约10,000或更多结构不同的结合元件、约10-约5,000结构不同的结合元件、约10-约1,000结构不同的结合元件、约10-约500结构不同的结合元件，或约10-约100结构不同的结合元件，例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、70、80、90、100、200、300、500、750、1,000、2,500、5,000、7,500、10,000、15,000、20,000、30,000、50,000、75,000、100,000，或更多结构不同的元件。在一些情况中，所述结合元件特异性地结合至各分区中单细胞的靶生物组分(若存在)。例如，结合元件的文库可以是结构不同的抗体的文库，其中，结构不同的抗体对于各分区中固定且透性化的细胞的结构不同的靶表位具有特异性结合亲和性或与之结合。
所述多个混合物分区中结合元件的文库可采用任选可切割接头偶联至靶标-表位特异性寡核苷酸(即，包含靶ID条码序列的寡核苷酸)。在一些情况中，结合元件与条码化的寡核苷酸之间的可切割接头选自下组：包含尿嘧啶核苷酸的接头、包含二硫键的接头、包含限制性核酸内切酶切割位点的接头，及其组合。或者，所述多个混合物分区可包含结合元件的文库和含有靶ID条码序列(即，靶ID条码化的寡核苷酸)且已从所述文库的结合元件切割的多个寡核苷酸。靶ID条码化的寡核苷酸还可包含UMI条码。在一些情况中，靶-ID特异性条码序列(例如，靶标-表位特异性条码序列)的长度是至少4个核苷酸且不多于15个核苷酸。在一些情况中，UMI条码的长度是至少4个核苷酸且不多于15个核苷酸，或长度是6-8个核苷酸。
在一些实施方式中，所述多个混合物分区的个体混合物分区包含多个分区特异性寡核苷酸，个体分区特异性寡核苷酸包含分区特异性条码序列，其在任一混合物分区的所有分区特异性寡核苷酸之间是相同的，且不同于所述多个的其它混合物分区中的所有分区特异性条码序列。在一些情况中，分区特异性条码化的寡核苷酸还可包含UMI条码。在一些情况中，UMI条码的长度是至少4个核苷酸且不多于15个核苷酸，或长度是6-8个核苷酸。在一些情况中，个体分区中的分区特异性条码化的寡核苷酸共价连接至珠(例如，单一珠)或其它固体支持物表面，并且多个混合物分区各自包含共价连接至该分区中的分区特异性条码化的寡核苷酸的珠(例如，单一珠)或其它固体支持物表面。
在一些情况中，分区特异性寡核苷酸共价连接至交联的琼脂糖珠。在一些情况中，分区特异性条码化的寡核苷酸和固体表面之间的可切割接头选自下组：包含尿嘧啶核苷酸的接头、包含二硫键的接头、包含限制性核酸内切酶切割位点的接头，及其组合。或者，分区特异性条码化的寡核苷酸可从所述混合物分区中的珠或其它固体支持物表面切割或(其它情况下)释放。
所述多个混合物分区还可包含通用引物。在一些情况中，通用引物包含杂交至寡核苷酸的通用引物结合位点的3’引发区域，所述寡核苷酸包含靶ID条码序列，或其反向互补物。在一些情况中，通用引物还可包含UMI条码。在一些情况中，UMI条码的长度是至少4个核苷酸且不多于15个核苷酸，或长度是6-8个核苷酸。
在一些情况中，所述多个混合物分区的混合物分区各自包含多个分区特异性寡核苷酸，其中，所述特异性寡核苷酸还包含3’引发区域，该3’引发区域杂交至靶标-表位特异性寡核苷酸的分区特异性寡核苷酸引物结合位点，或其反向互补物。在一些情况中，分区特异性寡核苷酸的3’引发区域的长度是至少12且不多于25个核苷酸。在一些情况中，通用引物的3’引发区域的通用引发序列的长度是至少12且不多于25个核苷酸。在一些情况中，靶标-表位特异性寡核苷酸的3’通用引物结合位点和分区特异性寡核苷酸引物结合位点在双链靶标-表位特异性寡核苷酸的相反链上，并且侧接靶标-表位特异性条码序列，和任选地，独特分子标识符序列。
在一个示例性实施方式中，个体多个混合物分区包含i)多个固定的蛋白质，其中该个体混合物分区中的所有固定的蛋白质均来自一个细胞；ii)至少约10个结构不同的抗体的文库，其中所述结构不同的抗体对于所述固定的蛋白质的结构不同的靶表位具有特异性结合亲和性并与之结合；iii)多个双链靶标-表位特异性寡核苷酸，其中个体双链靶标-表位特异性寡核苷酸共价连接至相应的个体结构不同的抗体，从相应的个体结构不同的抗体切割，或包含共价连接至相应的个体结构不同的抗体或从相应的个体结构不同的抗体切割的寡核苷酸的反向互补物。在一些情况中，靶标特异性寡核苷酸包含：a)靶标-表位特异性条码序列，其中，靶标-表位特异性条码序列对于任一结构不同的抗体而言是相同的，且对于所有其它结构不同的抗体而言是不同的；b)任选的独特分子标识符序列，其中，独特分子标识符序列对于每个靶标-表位特异性寡核苷酸而言是不同的；c)分区特异性条码序列，其在任一混合物分区的所有分区特异性寡核苷酸间是相同的，且不同于所述多个混合物分区的其它混合物分区的所有分区特异性条码序列；d)第一5’区域，其包含第一测序引物结合区域；和e)第二5’区域，其包含第二测序引物结合区域，其中该第一和第二引物结合区域处于双链靶标-表位特异性寡核苷酸的相反链上，且彼此结构不同，且侧接靶标-表位特异性条码序列，分区特异性条码序列，和任选的通用分子标识符序列。
混合物分区可以是离散的，物理上分开的反应室。例如，混合物分区可各自处于微孔板或纳米孔板的分开的孔中。在另一示例中，混合物分区可在乳液液滴中。
III.方法
本文描述了产生或使用前述组合物中一种或多种的方法。本文所述的方法包括合成或提供条码化的寡核苷酸的方法。本文所述的方法还包括文库生成方法。本文所述的方法还包括细胞固定(交联)和透性化的方法、划分方法、测序方法，和确定靶生物组分水平的方法。
a.交联和透性化细胞的方法
固定的细胞可通过使细胞与任何合适的固定剂接触而被固定。此类固定剂包括但不限于，交联剂，例如，甲醛、多聚甲醛(例如，溶解于水或缓冲剂中)、戊二醛、甲醛和多聚甲醛的组合(例如，溶解于水或缓冲剂中)、戊二醛和甲醛的组合、戊二醛和多聚甲醛的组合(例如，溶解于水或缓冲剂中)，或戊二醛、甲醛和多聚甲醛(例如，溶解于水或缓冲剂中)。此类固定剂可另外或或者包括不共价交联的试剂，例如醇类固定剂或变性剂，其使生物组分(例如蛋白质)原位沉淀。一般而言，固定在划分之前大批量地进行。
固定的细胞可通过使经固定的细胞与任何合适的透性化试剂接触而被透性化。或者，细胞可通过使该细胞与固定剂和透性化剂接触，或使该细胞与既能固定细胞又能透性化细胞的组合物接触，而被同时固定且透性化。透性化试剂包括但不限于，非离子表面活性剂。表面活性剂可以是去污剂和/或润湿剂。在一些实施方式中，表面活性剂包含亲水性和疏水性部分，因此是两亲性的。示例性的非离子表面活性剂包括但不限于，聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。示例性的泊洛沙姆包括但不限于，例如，以商标名称和出售的那些。示例性的非离子表面活性剂还包括聚乙二醇衍生物表面活性剂例如表面活性剂(例如，X-100)、去水山梨糖醇单月桂酸酯的聚氧化乙烯衍生物，例如20，包含聚乙烯尾部和芳族烃头部基团的那些，例如P40、洋地黄皂苷和皂素。
细胞可经固定和透性化，与偶联至靶ID条码化的寡核苷酸的结合元件的文库接触，经清洗以去除未结合的和非特异性结合的结合元件，然后被划分。
b.产生条码化的寡核苷酸和包含所述条码化的寡核苷酸的文库的方法
条码，包括靶ID条码、UMI条码、分区特异性条码、样品指标条码，及其组合可通过本领域已知的固相合成方法产生，包括拆分与混合(也称为拆分与合并)合成方案。在一些情况中，固相合成方案(例如，拆分与混合合成方案)是反向-亚酰胺固相合成方案(参见例如，Macosko等，2015，Cell 161，1202-14)。在一些情况中，一个或多个条码通过迭代单核苷酸拆分与混合固相合成和包含多个核苷酸(例如，2，3，4，5，6，7，8，或更多)的多核苷酸片段的固相偶联的组合来产生(参见例如，H.C.Fan等，2015，Science 347，1258367(2015).DOI10.1126/science.1258367)。在一些情况中，一个或多个条码在分开的寡核苷酸引物上各自合成，并且包含此类条码的多个组合的寡核苷酸通过使寡核苷酸引物与包含一个或多个其它条码的模板杂交和采用聚合酶使杂交的引物延伸来产生。例如，包含靶ID条码和任选UMI条码的寡核苷酸可被杂交至包含分区特异性条码的寡核苷酸引物，该引物可用聚合酶延伸以产生包含靶ID条码、任选的UMI条码，和分区特异性条码的寡核苷酸。
多个所述条码化的寡核苷酸可经合成以提供条码化的寡核苷酸的文库。在一些情况中，还可包含任选的UMI条码的靶ID条码化的寡核苷酸的文库是合成的。类似地，分区特异性条码化的寡核苷酸的文库可经合成，例如，在多个固体表面(例如，珠)上合成。在一些情况中，靶ID条码化的寡核苷酸的文库偶联至结合元件的文库。
c.划分的方法
本文描述了产生包含本文所述的组合物中任一种或多种的多个混合物分区的方法。在一方面中，本文提供了产生多个混合物分区的方法，所述方法包括：i)提供多个固定且透性化的单细胞，其中，个体固定且透性化的单细胞包含该细胞的靶生物组分，例如该单细胞的靶蛋白；ii)使所述固定且透性化的多个单细胞与至少约10个结构不同的结合元件(例如，抗体)的文库孵育，其中所述结合元件偶联至靶ID条码化的寡核苷酸，由此使所述结合元件结合至它们的相应靶生物组分，以形成多个结合元件文库-单细胞靶生物组分复合物。在一些情况中，所述复合物经清洗以去除未结合的结合元件或去除非特异性结合的结合元件。所述复合物可被划分成多个混合物分区。
在一些情况中，不包含单细胞和/或包含多个细胞的混合物分区可被去除或弃去。多个分区特异性条码寡核苷酸也可被划分为多个分区，并且任选地，不包含单一分区特异性条码序列和/或包含多个分区特异性条码序列的混合物分区可被移除，忽略或弃去。在一些情况中，不包含单一分区特异性条码序列和/或包含多个分区特异性条码序列的混合物分区可分别通过不存在珠或存在多个珠而被鉴定。所述不存在或存在能够可检测地影响分区大小、分区密度、分区的光学性质等，允许对这些分区进行选择和分开处理。
在一些情况中，所述方法包括在v)之前进行iv)，并且分区特异性条码寡核苷酸被划分为包含抗体文库-单细胞复合物的多个混合物分区。在一些情况中，所述方法包括在iv)前进行v)，并且抗体文库-单细胞复合物被划分为包含分区特异性条码寡核苷酸的多个混合物分区。
在一些情况中，结合元件的文库包含至少约10个且不多于约100,000个，或至少约10个且不多于约10,000个结构不同的抗体，其偶联至靶标-表位特异性寡核苷酸。在一些情况中，分区特异性条码寡核苷酸由任选可切割接头共价连接至珠。在一些情况中，分区特异性条码寡核苷酸从珠切割，并且杂交至靶ID条码化的寡核苷酸。在一些情况中，靶ID条码化的寡核苷酸从结合元件切割，并且杂交至分区特异性条码寡核苷酸。
分区可包括多种类型的分区中的任一种，包括固体分区(如孔，反应腔，或管)和流体分区(如油相内的水性液滴)。在一些实施方式中，分区是液滴。在一些实施方式中，分区是微通道。对样品进行划分的方法和组合物描述于，例如，公开的专利申请WO 2010/036352、US 2010/0173394、US 2011/0092373和US 2011/0092376，其全部内容各自通过引用纳入本文。
在一些方面中，分区的数量经选择以确保少数、基本少数、几乎没有、基本没有，或没有分区包含多个单细胞，包含多个不同分区特异性条码序列，或包含两者。确保充分划分的分区的数量依赖于多种因素，包括但不限于：(a)固定且透性化的单细胞的数量；(b)划分的方法；(c)分区特异性条码序列的数量；(d)划分过程中，分区特异性条码寡核苷酸是否固定于固体表面上或在溶液中；和(e)所需的统计学显著性。对于不包含于溶液中从而几乎没有分区包含多个不同分区特异性条码序列的分区特异性条码化的寡核苷酸进行的划分一般需要在稀释条件下进行划分，其产生大量的不包含任何分区特异性条码寡核苷酸的“空白”分区。因此，在一些实施方式中，优选对包含固定于其上的分区特异性条码寡核苷酸的珠进行分区。一般而言，分区的数量是，或是至少约，500、1000、10,000；或20,000、30,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、500,000、106、107，或更多。
在一些实施方式中，分区在形状和/或大小方面基本均一。例如，在一些实施方式中，分区在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，分区的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，分区的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。
在一些实施方式中，分区在体积方面基本均一。例如，分区体积的标准偏差可以低于约1皮升、5皮升、10皮升、100皮升、1nL或低于约10nL。在一些情况中，分区体积的标准偏差可低于平均分区体积的约10-25％。在一些实施方式中，分区的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL。
在一些实施方式中，试剂例如固定且透性化的细胞、缓冲剂、酶(例如，用于扩增、条码化和/或测序的聚合酶)、底物、核苷酸、引物，盐等在划分进行之前混合在一起，然后对样品进行划分。在一些情况中，试剂包括聚合酶并且在将试剂混合在一起之后不久划分样品，使得基本上全部、或大部分的聚合酶活性出现在划分之后。在其它情况中，在聚合酶缓慢或完全不进行的温度下混合试剂，然后划分样品，并且调节反应温度以使聚合酶反应进行。例如，可在冰上、小于5℃、或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-25、25-30或30-35℃或更高温度下合并试剂。一般而言，本领域技术人员会知晓如何选择温度，在该温度下，一种或多种聚合酶没有活性。在一些情况中，采用温度和时间的组合以避免划分之前的明显聚合酶活性。
在一些情况中，试剂可以使用一种或多种热启动酶，例如热启动DNA-依赖性DNA聚合酶混合。因此，可将固定且透性化的细胞、缓冲剂、盐、核苷酸、标记物、引物、酶等混合并划分。随后，可通过加热分区混合物以激活这一种或多种宿主启动的聚合酶来引发聚合反应，包括多轮聚合和/或扩增。
另外，试剂可混合在一起，而没有一种或多种引发酶促反应(例如，聚合和/或扩增)所必需的试剂。混合物然后可被划分到一组第一分区混合物中，然后可通过融合这组第一分区混合物和提供必要试剂的一组第二分区混合物来提供一种或多种必要试剂。替代地，可向第一分区混合物中加入必要试剂，而不形成第二分区混合物。例如，必要试剂可分散到第一分区混合物油包水液滴的组中。作为另一个示例，缺失的试剂可加入含有所述第一分区混合物组的一组微通道中。
在一些实施方式中，试剂可混合在一起以形成反应混合物并被划分。随后，可向分区中加入一种或多种其它试剂。例如，可向分区中注射一种或多种试剂。在一些情况中，可向分区和流体之间的界面施加电场以打破界面并使至少一部分的流体进入分区。作为另一个示例，一种或多种试剂可通过微流体技术导向微米或纳米尺寸孔中的分区中。用于向分区注射试剂的方法、组合物和装置包括但不限于WO/2010/0151776所述的那些。
可通过融合分区，注射，微流体或其他手段添加的试剂包括但不限于扩增试剂，检测试剂、测序试剂、连接试剂、条码化试剂或其组合。例如，可向分区中加入DNA依赖性DNA聚合酶(和任选的一种或多种引物)以扩增分区中的模板核酸(例如，包含一个或多个条码的寡核苷酸)。作为另一个示例，可向分区中加入条码、引物、连接酶、聚合酶或其组合来使分区中的核酸条码化。在一些情况中，条码接合到，或另外整合到或关联固体或凝胶支持物，并且带条码(和任选的其它条码化试剂，如引物、聚合酶、连接酶或其组合)的固体或凝胶支持物通过融合、注射、微流体或其它手段加入到一个或多个分区中。
在一些实施方式中，分区是包含乳液组合物，即不互溶的流体(如水和油)的混合物的液滴。在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中，本文所述液滴是相对稳定的并在两种或更多种液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中，由样品生成的液滴中少于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他液滴聚结。这些乳液还可具有有限的絮凝，一种分散相从薄片中悬浮液产生的过程。在一些实施方式中，通过使油相流过包含一种或多种本文所述组合物的水性样品来形成液滴。
该油相可包含氟化基础油，其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中，该基础油包括以下一种或多种：HFE 7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一种常见氟化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中，该阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉代衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。KrytoxFSH的吗啉代衍生物的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.62％。
在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘度或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H，1H，2H，2H-全氟癸醇。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇添加至约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇添加至约0.18％(w/w)的浓度。
在一些实施方式中，该乳液配制为生成具有类液界面膜的高度单分散液滴，其可通过加热转化为具有类固界面膜的微胶囊；这类微胶囊可作为生物反应器以通过一段时间的孵育保持其含量。转化为微胶囊可在一经加热后即发生。例如，这类转化可发生在大于约40°、50°、60°、70°、80°、90°或95℃的温度下。加热过程期间，流体或矿物油覆盖物可用于阻止蒸发。过量的连续相油可在加热前去除或留在原位。这些微胶囊可在大范围的热和机械处理下抗聚结和/或絮凝。
在将液滴转化成微胶囊之后，这些微胶囊可储存于约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下。在一些实施方式中，这些微胶囊可用于储存或运输分区混合物。例如，可在一个位置处收集样品，划分到含有酶、缓冲剂和/或引物或其它探针的液滴中，任选地可进行一个或多个聚合反应，然后可加热该分区以进行微囊化，并且可储存或运输微胶囊用于进一步分析。
微胶囊分区可以抗聚结，特别是在高温下。因此，这些胶囊可在非常高的密度(例如每单位体积的分区数)下孵育。在一些实施方式中，可每毫升孵育超过100000、500000、1000000、1500000、2000000、2500000、5000000或10000000个分区。在一些实施方式中，孵育发生在单个孔中，例如微量滴定板的孔，此时各分区之间不具有内部混合。这些微胶囊还可含有孵育期间发生反应所需的其他组分。
在一些实施方式中，含有一种或多种本文所述组合物的样品被分成至少500个分区，至少1000个分区，至少2000个分区，至少3000个分区，至少4000个分区，至少5000个分区，至少6000个分区，至少7000个分区，至少8000个分区，至少10,000个分区，至少15,000个分区，至少20,000个分区，至少30,000个分区，至少40,000个分区，至少50,000个分区，至少60,000个分区，至少70,000个分区，至少80,000个分区，至少90,000个分区，至少100,000个分区，至少200,000个分区，至少300,000个分区，至少400,000个分区，至少500,000个分区，至少600,000个分区，至少700,000个分区，至少800,000个分区，至少900,000个分区，至少1,000,000个分区，至少2,000,000个分区，至少3,000,000个分区，至少4,000,000个部分至少5,000,000个分区，至少10,000,000个分区，至少20,000,000个分区，至少30,000,000个分区，至少40,000,000个分区，至少50,000,000个分区，至少60,000,000个分区，至少70,000,000个分区，至少80,000,000个分区，至少90,000,000个分区，至少100,000,000个分区，至少150,000,000个分区或至少200,000,000个分区。
在一些实施方式中，将含有固定且透性化的细胞和一种或多种本文所述组合物的样品划分到足够数量的分区中，使得全部、基本上全部或至少大部分分区具有不超过1个固定且透性化的细胞。在一些实施方式中，所述样品被划分为足够数量的分区，从而全部、基本全部或至少大多数分区具有不多于1个分区特异性条码序列。
在一些实施方式中，生成的乳液液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。
在一些实施方式中，生成的乳液液滴分区在体积上基本均匀。例如，液滴体积的标准偏差可以低于约1皮升、5皮升、10皮升、100皮升、1nL或低于约10nL。在一些情况中，液滴体积的标准偏差可低于平均液滴体积的约10-25％。在一些实施方式中，生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL。
d.对靶生物组分水平进行单细胞分辨率分析的方法
本文描述了用于通过高通量测序进行单细胞分辨率靶生物组分分析的方法，所述方法包括：i)形成或提供多个一种或多种前述混合物分区，其中，所述混合物分区还包含热稳定的聚合酶，和a)靶生物组分特异性寡核苷酸用可切割接头共价偶联至结构不同的结合元件；b)分区特异性寡核苷酸用可切割接头共价偶联至珠；或c)a)和b)；和ii)切割该可切割接头。
在一些实施方式中，所述方法还包括：c；iii)第一杂交：a)使分区特异性寡核苷酸的3’引发区域与靶生物组分特异性寡核苷酸的5’端杂交，并用聚合酶延伸杂交的分区特异性寡核苷酸，由此产生双链靶生物组分特异性寡核苷酸，其包含靶生物组分特异性条码序列、分区特异性条码序列，和任选地，通用分子标识符序列；或b)使通用引物的3’引发区域与靶生物组分特异性寡核苷酸的5’端杂交，并用聚合酶延伸杂交的通用引物，由此产生双链靶生物组分特异性寡核苷酸，其包含通用引发区域、靶生物组分特异性条码序列，和任选地，通用分子标识符序列。
在一些实施方式中，所述方法还包括：iv)第二杂交：a)使分区特异性寡核苷酸的3’引发区域与包含通用引发区域(若存在)的双链靶生物组分特异性寡核苷酸的5’端杂交，并用聚合酶延伸杂交的分区特异性寡核苷酸；或b)使通用引物的3’引发区域与包含分区特异性条码序列(若存在)的双链靶生物组分特异性寡核苷酸的5’端杂交，并用聚合酶延伸杂交的通用引物，由此产生双链靶生物组分特异性寡核苷酸，其包含通用引发区域、靶生物组分特异性条码序列、分区特异性条码序列，和任选地，通用分子标识符序列。
在一些实施方式中，所述方法还包括扩增iv)的(如，双链的)靶生物组分寡核苷酸。在一些实施方式中，所述方法还包括，对扩增的双链靶生物组分特异性寡核苷酸进行合并和测序，在高通量测序中进行，以获得多个靶生物组分特异性寡核苷酸序列读数，其中，所述测序包括：a)确定分区特异性条码序列，由此确定该测序数据所对应的单细胞；和b)确定靶生物组分条码序列，由此确定该测序数据所对应的生物组分。一般而言，其中读数具有相同分区特异性条码序列和靶生物组分特异性条码序列的靶生物组分特异性寡核苷酸序列读数的数量与测序数据所对应的单细胞中的生物组分的水平成比例。
在一些实施方式中，双链靶生物组分特异性寡核苷酸还包含通用分子标识符序列，并且所述方法还包括确定通用分子标识符序列；和，使靶生物组分特异性寡核苷酸序列读数的数量对于扩增偏差进行标准化，通过鉴定具有相同通用分子标识符序列的成链的靶生物组分特异性寡核苷酸序列作为扩增重复物。在一些情况中，双链靶生物组分特异性寡核苷酸还包含样品指标序列，并且所述方法还包括确定样品指标序列；和，鉴定测序数据所对应的单细胞的来源。
在一些实施方式中，本文所述的方法包括以下之一或更多，或全部，参考图1：例如，至少，数十个至10,000个细胞的群(1)被固定且透性化(2)，并与所述抗体-寡核苷酸偶联物的文库接触以形成抗体：配体复合物，并洗去未结合的抗体(3)。单细胞被分区成多个液滴，以形成各自包含单细胞、聚合酶、通用引物和珠的多个液滴，其中所述珠偶联至具有液滴特异性条码和引物区域的多个寡核苷酸(4)。与珠偶联的寡核苷酸和/或与抗体偶联的寡核苷酸被切割。采用聚合酶通用引物和珠寡核苷酸扩增抗体寡核苷酸，将靶蛋白质水平转换成可计数的序列标签(5)。液滴经合并以产生测序文库(6)，其采用下一代(高通量)测序法被测序，将序列标签计数转换成靶蛋白质水平(7)。
虽然通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明以清晰理解，但本发明技术人员应理解可在所附权利要求书范围内实施某些改变和修改。通过引用将本文引用的所有专利、专利申请和其它公开文献包括GenBank登录号全文纳入本文用于所有目的。

Claims (31)

1.多个混合物分区，其中个体混合物分区包含：
i)多个固定的蛋白质，其中所述个体混合物分区中的所有固定的蛋白质均来自一个细胞；和
ii)至少约10个结构不同的抗体的文库，其中所述结构不同的抗体对于所述固定的蛋白质的结构不同的靶表位具有特异性结合亲和性并与之结合，并且其中，所述结构不同的抗体采用任选可切割接头偶联至靶标-表位特异性寡核苷酸，其中，所述靶标-表位特异性寡核苷酸包含：
a)靶标-表位特异性条码序列，其中，所述靶标-表位特异性条码序列对于任一结构不同的抗体而言是相同的，且对于所有其它结构不同的抗体而言是不同的；和
b)任选地，独特分子标识符序列，其中，所述任选的独特分子标识符序列对于靶标-表位特异性寡核苷酸的每个分子而言是不同的。
2.所述多个混合物分区，其中，所述文库包含至少约10且不多于约10,000个结构不同的抗体。
3.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中，所述个体混合物分区还包含：
iii)多个分区特异性寡核苷酸，个体分区特异性寡核苷酸包含分区特异性条码序列，其在任一混合物分区的所有分区特异性寡核苷酸之间是相同的，且不同于所述多个的其它混合物分区中的所有分区特异性条码序列，和任选地，独特分子标识符序列，其中，所述独特分子标识符序列对于分区特异性条码寡核苷酸的每个分子而言是不同的。
4.如权利要求3所述的多个混合物分区，其中，个体混合物分区的分区特异性寡核苷酸共价连接至珠。
5.如权利要求3所述的多个混合物分区，其中，个体混合物分区的分区特异性寡核苷酸采用可切割接头共价连接至珠。
6.如权利要求5所述的多个混合物分区，其中，所述可切割接头选自下组：包含尿嘧啶核苷酸的接头、包含二硫键的接头，和包含限制性核酸内切酶切割位点的接头。
7.如权利要求4-6中任一项所述的多个混合物分区，其中，所述珠包含交联的琼脂糖。
8.如前述权利要求中任一项所述的多个混合物分区，其中，所述靶标-表位特异性寡核苷酸采用可切割接头共价连接至结构不同的抗体。
9.如权利要求8所述的多个混合物分区，其中，所述可切割接头选自下组：包含尿嘧啶核苷酸的接头、包含二硫键的接头，和包含限制性核酸内切酶切割位点的接头。
10.如前述权利要求中任一项所述的多个混合物分区，其中，个体混合物分区还包含通用引物，其中，所述通用引物包含具有通用引发序列的3’引发区域，所述通用引发序列杂交至靶标-表位特异性寡核苷酸的通用引物结合位点，或其反向互补物，和任选地，独特分子标识符序列，其中，所述独特分子标识符序列对于通用引物的每个分子而言是不同的。
11.如权利要求10所述的多个混合物分区，其中，个体混合物分区包含分区特异性寡核苷酸，并且其中，分区特异性寡核苷酸还包含3’引发区域，所述3’引发区域杂交至靶标-表位特异性寡核苷酸的分区特异性寡核苷酸引物结合位点，或其反向互补物，其中，靶标-表位特异性寡核苷酸的3’通用引物结合位点和分区特异性寡核苷酸引物结合位点处于双链靶标-表位特异性寡核苷酸的相反链上，并侧接靶标-表位特异性条码序列，和任选地，独特分子标识符序列。
12.如权利要求11所述的多个混合物分区，其中，分区特异性寡核苷酸的3’引发区域的长度是至少12且不多于40个核苷酸。
13.如权利要求10-12中任一项所述的多个混合物分区，其中，通用引发序列的长度是至少12且不多于25个核苷酸。
14.如前述权利要求中任一项所述的多个混合物分区，其中，靶标-表位特异性条码序列的长度是至少4个核苷酸且不多于100个核苷酸。
15.如前述权利要求中任一项所述的多个混合物分区，其中，靶标-表位特异性寡核苷酸包含独特分子标识符序列。
16.如前述权利要求中任一项所述的多个混合物分区，其中，独特分子标识符序列的长度是至少4个核苷酸且不多于15个核苷酸。
17.多个混合物分区，其中个体混合物分区包含：
i)多个固定的蛋白质，其中所述个体混合物分区中的所有固定的蛋白质均来自一个细胞；
ii)至少约10个结构不同的抗体的文库，其中所述结构不同的抗体对于所述固定的蛋白质的结构不同的靶表位具有特异性结合亲和性并与之结合；
iii)多个双链靶标-表位特异性寡核苷酸，其中，个体双链靶标-表位特异性寡核苷酸共价连接至相应的个体结构不同的抗体，从相应的个体结构不同的抗体切割，或包含共价连接至相应的个体结构不同的抗体或从相应的个体结构不同的抗体切割的寡核苷酸的反向互补物，并且其中，靶标特异性寡核苷酸包含：
a)靶标-表位特异性条码序列，其中，所述靶标-表位特异性条码序列对于任一结构不同的抗体而言是相同的，且对于所有其它结构不同的抗体而言是不同的；
b)任选的独特分子标识符序列，其中，独特分子标识符序列对于每个靶标-表位特异性寡核苷酸而言是不同的；
c)分区特异性条码序列，其在任一混合物分区的所有分区特异性寡核苷酸之间是相同的，并且不同于所述多个混合物分区中其它混合物分区中的分区特异性条码序列；
d)第一5’区域，其包含第一测序引物结合区域；和
e)第二5’区域，其包含第二测序引物结合区域，其中该第一和第二引物结合区域处于双链靶标-表位特异性寡核苷酸的相反链上，彼此结构不同，并且侧接靶标-表位特异性条码序列，分区特异性条码序列，和任选的通用分子标识符序列。
18.包含多个双链多核苷酸的高通量测序文库，其中所述文库代表单细胞的多个靶表位的水平，其中，个体双链多核苷酸包含：
i)单细胞特异性条码序列，其中，所述单细胞特异性条码序列对于全部双链多核苷酸而言是相同的；
ii)表位靶标识符序列，其中，所述表位靶标识符序列对于每个结构不同的靶表位而言是独特的；和
iii)任选的通用分子标识符序列，其中，所述通用分子标识符序列对于所述文库中的每个双链多核苷酸而言是独特的，其中
所述双链多核苷酸包含高通量测序衔接子，其侧接i)、ii)和如果存在的iii)。
19.如权利要求18所述的高通量测序文库，其中，所述双链多核苷酸包含通用分子标识符，并且所述文库编码所述单细胞的多个靶表位的水平。
20.如权利要求18-19中任一项所述的多个高通量测序文库，其中，各文库编码独特单细胞的多个靶表位的水平。
21.如权利要求20所述的多个高通量测序文库，其中，各独特单细胞来自相同来源。
22.如权利要求20所述的多个高通量测序文库，其中，所述独特单细胞来自不同来源。
23.如权利要求22所述的多个高通量测序文库，其中，个体双链多核苷酸包含样品指标序列，其中，所述样品指标序列对于编码来自任一来源的独特单细胞的靶表位的水平的每个多核苷酸而言是相同的，且对于每个其它来源而言是不同的。
24.一种产生如权利要求3所述的多个混合物分区的方法，所述方法包括：
i)提供固定且透性化的多个单细胞，其中，个体固定且透性化的单细胞包含一个单细胞的固定的蛋白质；
ii)使所述固定且透性化的多个单细胞与至少约10个结构不同的抗体的文库孵育，所述抗体偶联至靶标-表位特异性寡核苷酸，由此使所述抗体结合至它们的相应表位，若存在，以形成多个抗体文库-单细胞表位复合物；
iii)洗去未结合的抗体；
iv)将所述多个抗体文库-单细胞复合物划分为多个混合物分区，和任选地，弃去不包含单细胞和/或包含多个细胞的混合物分区；和
v)将多个分区特异性条码寡核苷酸划分为多个分区，和任选地，弃去不包含单一分区特异性条码序列和/或包含多个分区特异性条码序列的混合物分区。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述方法包括使所述固定且透性化的多个单细胞与至少约10个且不多于约10,000个结构不同的抗体的文库孵育，所述抗体偶联至靶标-表位特异性寡核苷酸。
26.如权利要求24所述的方法，其中，所述方法包括在v)之前进行iv)，并且，分区特异性条码寡核苷酸被划分为包含抗体文库-单细胞复合物的多个混合物分区。
27.如权利要求24所述的方法，其中，所述方法包括在iv)之前进行v)，并且，抗体文库-单细胞复合物被划分为包含分区特异性条码寡核苷酸的多个混合物分区。
28.如权利要求24-27中任一项所述的方法，其中，分区特异性条码寡核苷酸用任选可切割接头共价连接至珠。
29.一种通过高通量测序进行单细胞分辨率靶表位分析的方法，所述方法包括：
i)形成或提供如权利要求11所述的多个混合物分区，其中，所述混合物分区还包含热稳定的聚合酶，并且其中：a)靶标-表位特异性寡核苷酸采用可切割接头共价偶联至结构不同的抗体；b)分区特异性寡核苷酸采用可切割接头共价偶联至珠；或c)a)和b)；和
ii)切割a)、b)或c)的可切割接头；
iii)第一杂交：
a)使分区特异性寡核苷酸的3’引发区域杂交至靶标-表位特异性寡核苷酸的5’端，并用聚合酶延伸杂交的分区特异性寡核苷酸，由此产生双链靶标-表位特异性寡核苷酸，其包含靶标-表位特异性条码序列，分区特异性条码序列，和任选地，通用分子标识符序列；或
b)使通用引物的3’引发区域杂交至靶标-表位特异性寡核苷酸的5’端，并用聚合酶延伸杂交的通用引物，由此产生双链靶标-表位特异性寡核苷酸，其包含通用引发区域，靶标-表位特异性条码序列，和任选地，通用分子标识符序列；和
iv)第二杂交：
a)使分区特异性寡核苷酸的3’引发区域杂交至包含如果存在的通用引发区域的双链靶标-表位特异性寡核苷酸的5’端，并用聚合酶延伸杂交的分区特异性寡核苷酸；或
b)使通用引物的3’引发区域杂交至包含如果存在的分区特异性条码序列的双链靶标-表位特异性寡核苷酸的5’端，并用聚合酶延伸杂交的通用引物，
由此产生双链靶标-表位特异性寡核苷酸，其包含通用引发区域，靶标-表位特异性条码序列，分区特异性条码序列，和任选地，通用分子标识符序列；和
v)扩增iv)的双链靶标-表位特异性寡核苷酸；和
vi)对扩增的双链靶标-表位特异性寡核苷酸进行合并和测序，在高通量测序反应中进行，以获得多个靶标-表位特异性寡核苷酸序列读数，其中，所述测序包括：
a)确定分区特异性条码序列，由此确定测序数据所对应的单细胞；和
b)确定靶标-表位特异性条码序列，由此确定测序数据所对应的蛋白质表位，其中
其中读数具有相同分区特异性条码序列和靶标-表位特异性条码序列的靶标-表位特异性寡核苷酸序列读数的数量与测序数据所对应的单细胞中表位的水平成比例。
30.如权利要求29所述的方法，其中，双链靶标-表位特异性寡核苷酸还包含通用分子标识符序列，并且所述方法还包括确定通用分子标识符序列；和，使靶标-表位特异性寡核苷酸序列读数的数量对于扩增偏差进行标准化，通过鉴定具有相同通用分子标识符序列的成链的靶标-表位特异性寡核苷酸序列作为扩增重复物进行。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中，双链靶标-表位特异性寡核苷酸还包含样品指标序列，并且所述方法还包括确定样品指标序列；和，鉴定测序数据所对应的单细胞的来源。
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