KR102531677B1 - 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법 - Google Patents
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Abstract
개별 세포 또는 세포 개체군의 내용물의 분할된 분석을 통해 개별 세포 또는 세포 개체군을 분석하기 위한 방법, 조성물 및 시스템. 개별 세포 또는 세포 개체군은 세포 내용물에 접근하기 위해, 그리고 소정의 세포 또는 세포 개체군의 내용물을 독특하게 확인하고, 그리고 차후에, 염기서열결정을 통한 세포의 핵산의 분석 및 특징화를 비롯하여, 세포의 내용물을 분석하고 이를 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 유래된 것으로 특징짓기 위해 처리 시약으로 공분할된다.
Description
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/017,558 및 2014년 10월 8일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/061,567에 우선권을 주장하고, 이들 출원은 각각, 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
배경
생물학적 및 생화학적 물질 및 시스템을 분석하고 특징짓는데 있어서 유의미한 진전은 수명, 건강, 질환 및 치료의 기전을 이해하는데 있어서 전례 없는 진전을 야기하였다. 이들 진전 중에서, 생물학적 시스템의 유전체 구성을 표적으로 하고 특징짓는 기술은 유전자 증폭 기술 및 핵산 염기서열결정 기술의 이용 및 활용에서 진전을 비롯하여, 가장 획기적인 결과 중에서 일부를 산출하였다.
핵산 염기서열결정은 진단학, 예측학, 생명공학, 그리고 법의생물학을 비롯한 매우 다양한 생물의학 배경에서 정보를 획득하는데 이용될 수 있다. 염기서열결정은 Maxam-Gilbert 염기서열결정 및 사슬-종결 방법을 비롯한 기본적인 방법, 또는 샷건 염기서열결정 및 가교 PCR을 비롯한 데노보 염기서열결정 방법, 또는 폴로니 염기서열결정, 454 파이로시퀀싱, Illumina 염기서열결정, SOLiD 염기서열결정, Ion Torrent 반도체 염기서열결정, HeliScope 단일 분자 염기서열결정, SMRT® 염기서열결정 등을 비롯한 차세대 방법을 수반할 수 있다.
생물학적 특징화에서 이들 진전에도 불구하고, 많은 과제가 여전히 다뤄지지 않은 채로 남아있거나, 또는 현재 제공되는 해법에 의해 상대적으로 불량하게 다뤄진다. 본 발명은 현재 기술의 단점 중에서 많은 것을 해소하는 신규한 해법 및 접근법을 제공한다.
짧은 요약
핵산의 분석, 그리고 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 및 이들로 핵산의 귀인을 비롯하여, 개별 세포 또는 작은 세포 개체군을 분석하기 위한 방법, 조성물 및 시스템이 본원에서 제공된다.
본 발명의 한 양상은 세포로부터 핵산을 분석하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 개별 세포로부터 유래된 핵산을 구별된 파티션 내로 제공하고; 구별된 파티션 내에 핵산으로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하고, 상기 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열은 공통 핵산 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 거기에 부착하였고; 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열, 또는 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열의 특징화를 산출하고, 상기 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열은 공통 바코드 서열을 포함하고; 그리고 최소한 부분적으로, 산출된 특징화에서 공통 핵산 바코드 서열의 존재에 근거하여, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 개별 세포로부터 유래되는 것으로 확인하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 구별된 파티션은 구별된 비말이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 개별 세포로부터 유래된 핵산으로, 구별된 파티션 내로 공분할된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 중에서 최소한 10,000, 최소한 100,000 또는 최소한 500,000개가 개별 세포로부터 유래된 핵산으로, 구별된 파티션 내로 공분할된다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 비드에 부착되게 제공되는데, 여기서 비드 상에 각 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함하고, 그리고 상기 비드는 개별 세포로, 구별된 파티션 내로 공분할된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 비드에 방출가능하게 부착된다. 일부 구체예에서, 비드는 분해성 비드를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하기에 앞서 또는 산출하는 동안, 상기 방법은 비드의 분해를 통해 비드로부터 올리고뉴클레오티드를 방출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 구별된 파티션으로부터 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 방출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 특징화를 산출하는 것은 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 염기서열결정하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열의 서열로부터, 개별 세포의 유전체의 최소한 일부에 대한 인접한 핵산 서열을 조립하는 것을 포함할 수 있다. 게다가, 상기 방법은 또한, 개별 세포의 유전체의 최소한 일부에 대한 핵산 서열에 근거하여 개별 세포를 특징짓는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 핵산은 구별된 파티션 내에 개별 세포로부터 방출된다. 일부 구체예에서, 핵산은 리보핵산 (RNA), 예를 들면, 예로서, 전령 RNA (mRNA)를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 것은 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 조건 하에, 핵산을 역전사에 종속시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 역전사는 구별된 파티션에서 발생한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 구별된 파티션에서 제공되고 폴리-T 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 역전사는 폴리-T 서열을 각 핵산의 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 폴리-T 서열을 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 폴리-T 서열의 혼성화를 용이하게 하는 정착 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 예로서, 무작위 헥사머일 수 있는 무작위 기폭 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 역전사는 무작위 기폭 서열을 각 핵산의 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 무작위 기폭 서열을 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 중에서 소정의 하나는 이들 핵산 중에서 소정의 하나의 최소한 일부에 서열 상보성을 갖는다. 일부 구체예에서, 구별된 파티션은 기껏해야, 복수의 세포 중에서 개별 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 독특한 분자 서열 분절을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 최소한 부분적으로, 독특한 분자 서열 분절의 존재에 근거하여, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열의 개별 핵산 서열을 이들 핵산 중에서 소정의 핵산으로부터 유래된 것으로 확인하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 독특한 분자 서열 분절의 존재에 근거하여 소정의 핵산의 양을 결정하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 특징화를 산출하기에 앞서, 하나 또는 그 이상의 추가 서열을 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 부가하여 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 스위치 올리고뉴클레오티드의 도움으로, 첫 번째 추가 핵산 서열을 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 부가하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 스위치 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 중에서 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 주형 지향된 방식으로 연장되어 첫 번째 추가 핵산 서열을 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 연계한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 증폭하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 증폭은 구별된 파티션에서 발생한다. 일부 구체예에서, 증폭은 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 구별된 파티션으로부터 방출한 후 발생한다.
일부 구체예에서, 증폭 후, 상기 방법은 첫 번째 추가 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 하나 또는 그 이상의 두 번째 추가 핵산 서열을 부가하여 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 두 번째 추가 서열을 부가하는 것은 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 각각의 일부를 제거하고, 그리고 거기에 하나 또는 그 이상의 두 번째 추가 핵산 서열을 연계하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거는 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 (가령, 결찰된) 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열의 전단을 통해 완결된다.
일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 전사에 종속시켜 하나 또는 그 이상의 RNA 단편을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 전사는 구별된 파티션으로부터 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 방출한 후 발생한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 T7 프로모터 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 RNA 서열 각각의 일부를 제거하고, 그리고 추가 서열을 하나 또는 그 이상의 RNA 서열에 연계하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 추가 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 RNA 서열을 역전사에 종속시켜 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 증폭하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 RNA 서열을 역전사에 종속시켜 하나 또는 그 이상의 DNA 서열을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 DNA 서열 각각의 일부를 제거하고, 그리고 하나 또는 그 이상의 추가 서열을 하나 또는 그 이상의 DNA 서열에 연계하여 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 증폭하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산은 개별 세포로부터 RNA의 역전사로부터 산출된 상보성 (cDNA)를 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 기폭 서열을 포함하고 구별된 파티션에서 제공된다. 일부 구체예에서, 기폭 서열은 무작위 N-mer을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 것은 기폭 서열을 cDNA에 혼성화하고, 그리고 기폭 서열을 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 구별된 파티션은 올리고뉴클레오티드의 보체 서열을 포함하는 스위치 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 것은 스위치 올리고뉴클레오티드를 핵산으로부터 유래된 핵산 단편 중에서 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 스위치 올리고뉴클레오티드를 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 것은 올리고뉴클레오티드를 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 부착하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열은 핵산으로부터 유래된 핵산 단편이다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 것은 올리고뉴클레오티드를 핵산에 연계하는 (가령, 결찰하는) 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 파티션은 구별된 파티션을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션은 평균적으로, 파티션 마다 1개보다 적은 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션 중에서 25%보다 적은 파티션은 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션은 각각 최소한 하나의 분할된 세포를 갖는 구별된 파티션을 포함한다. 일부 구체예에서, 구별된 파티션 중에서 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하가 하나 이상의 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 구별된 파티션의 최소한 부분집합은 비드를 포함한다. 일부 구체예에서, 구별된 파티션 중에서 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95% 또는 최소한 99%가 최소한 하나의 세포 및 최소한 하나의 비드를 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 구별된 파티션은 분할된 핵산 바코드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 구별된 파티션은 최소한 1,000개, 최소한 10,000개, 또는 최소한 100,000개의 상이한 분할된 핵산 바코드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션은 최소한 1,000, 최소한 10,000 또는 최소한 100,000개의 파티션을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 복수의 상이한 세포 유형의 개체군에서 세포를 특징짓는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 개체군에서 개별 세포로부터 핵산을 구별된 파티션 내로 제공하고; 공통 핵산 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 구별된 파티션 내에 개별 세포로부터 핵산의 하나 또는 그 이상의 단편에 부착하고, 여기서 복수의 상이한 파티션은 상이한 공통 핵산 바코드 서열을 포함하고; 그리고 최소한 부분적으로, 공통 바코드 서열의 존재에 근거하여, 복수의 구별된 파티션으로부터 핵산의 하나 또는 그 이상의 단편을 특징짓고, 그리고 하나 또는 그 이상의 단편을 개별 세포에 기인시키고; 그리고 복수의 구별된 파티션 내에 하나 또는 그 이상의 단편의 특징화에 근거하여 개체군에서 복수의 개별 세포를 특징짓는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 핵산을 단편화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 구별된 파티션은 비말이다. 일부 구체예에서, 핵산의 하나 또는 그 이상의 단편을 특징짓는 것은 개별 세포로부터 리보솜 데옥시리보핵산을 염기서열결정하는 것을 포함하고, 그리고 세포를 특징짓는 것은 세포 속, 종, 계통 또는 변이체를 확인하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 개별 세포는 마이크로바이옴 표본으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 개별 세포는 인간 조직 표본으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 개별 세포는 포유동물에서 순환성 세포로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 개별 세포는 법의학 표본으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 핵산은 구별된 파티션 내에 개별 세포로부터 방출된다.
본 발명의 추가 양상은 개별 세포 또는 세포 개체군을 특징짓는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 세포를 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기 유형과 함께 배양하고, 여기서 각 상이한 세포 표면 결합 기 유형은 상이한 세포 표면 특질에 결합할 수 있고, 그리고 여기서 각 상이한 세포 표면 결합 기 유형은 존재하면, 하나 또는 그 이상의 세포 표면 특질 결합 기 및 이의 개별 세포 표면 특질 사이에 결합을 허용하는 조건 하에, 그것과 연관된 리포터 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 상기 세포를 바코드 서열을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 파티션 내로 분할하고; 바코드 서열을 파티션 내에 존재하는 올리고뉴클레오티드 리포터 기에 부착하고; 올리고뉴클레오티드 리포터 기 및 부착된 바코드를 염기서열결정하고; 그리고 염기서열결정되는 리포터 올리고뉴클레오티드에 근거하여, 세포 상에 존재하는 세포 표면 특질을 특징짓는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 양상은 복수의 파티션을 포함하는 조성물을 제공하고, 복수의 파티션 각각은 개별 세포 및 공통 핵산 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 개체군을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션은 유제에서 비말을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션 각각 내에 올리고뉴클레오티드의 개체군은 복수의 파티션 각각 내에 배치된 비드에 연계된다. 일부 구체예에서, 개별 세포는 그들의 개별 세포 표면 특질과 연관된 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기를 그것과 연관시키고, 그리고 각 상이한 유형의 세포 표면 특질 결합 기는 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 리포터 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기는 복수의 상이한 세포 표면 특질에 대한 결합 친화성을 갖는 복수의 상이한 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
본 발명의 추가 양상 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명확해질 것인데, 여기서 본 발명의 단지 예시적인 구체예가 도시되고 설명된다. 실현되는 바와 같이, 본 발명은 다른 구체예 및 상이한 구체예가 가능할 수 있고, 그리고 이의 여러 상세는 본 발명으로부터 전혀 벗어나지 않으면서, 다양한 명백한 관점에서 변형될 수 있다. 따라서, 이들 도면 및 상세한 설명은 성격에서 예시적이고, 그리고 제한적이지 않은 것으로 간주된다.
참조로서 편입
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 그리고 특허 출원은 마치 각 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 본원에 참조로서 편입된다. 참조로서 편입된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 내포된 발명과 상충되면, 본 명세서는 임의의 이런 모순되는 자료를 대체하고 및/또는 이에 선행하는 것으로 의도된다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 신규한 특질은 첨부된 청구항에서 구체적으로 진술된다. 본 발명의 특질과 이점의 더욱 충분한 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 구체예를 진술하는 아래의 상세한 설명, 그리고 첨부 도면 (본원에서 또한, "도면 (Figure)" 및 "도면 (FIG.)")을 참조함으로써 획득될 것이다:
도면 1은 개별 세포 세포의 소집단을 분할하기 위한 미소유체 통로 구조를 개략적으로 도해한다.
도면 2는 세포 및 추가 시약을 포함하는 비드 또는 마이크로캡슐을 공분할하기 위한 미소유체 통로 구조를 개략적으로 도해한다.
도면 3은 세포의 핵산의 증폭 및 바코드화를 위한 실례 과정을 개략적으로 도해한다.
도면 4는 특징화에서 이용을 위해 서열 데이터를 개별 세포 또는 세포의 군에 기인시키는데 있어서 세포의 핵산의 바코드화의 이용의 개략적 도해를 제공한다.
도면 5는 표지화된 세포 결합 리간드와 연관된 세포의 개략적 도해를 제공한다.
도면 6은 본원에서 설명된 방법을 이용하여 RNA 분석을 수행하기 위한 실례 작업 흐름의 개략적 도해를 제공한다.
도면 7은 본원에서 설명된 방법을 이용하여 리보핵산 (RNA)의 분석에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 8은 개별 바코드 보유 비드와 함께 공분할된 개별 세포의 이미지를 제공한다.
도면 9A-E는 RNA의 분석 및 RNA 분석을 수행하기 위한 실례 작업에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 10은 RNA의 실례 분석에서 이용 및 시험관내 전사에서 서열의 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 11은 RNA의 분석 및 RNA 분석을 수행하기 위한 실례 작업에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 12A-B는 RNA의 분석에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 13A-C는 파티션에서 주형 스위치 역전사 및 PCR로부터 실례 수율의 도해를 제공한다.
도면 14A-B는 다양한 세포 수를 갖는 파티션에서 역전사 및 cDNA 증폭으로부터 실례 수율의 도해를 제공한다.
도면 15는 다양한 입력 세포 농도에서 cDNA 합성 및 실시간 정량적 PCR로부터 실례 수율, 그리고 또한, 고정된 세포 입력 농도에서 수율에 대한 변하는 프라이머 농도의 효과의 도해를 제공한다.
도면 16은 시험관내 전사로부터 실례 수율의 도해를 제공한다.
도면 17은 본원에서 제공된 방법을 실행하도록 프로그램되거나 또는 달리 설정된 실례 컴퓨터 제어 시스템을 보여준다.
본 발명의 신규한 특질은 첨부된 청구항에서 구체적으로 진술된다. 본 발명의 특질과 이점의 더욱 충분한 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 구체예를 진술하는 아래의 상세한 설명, 그리고 첨부 도면 (본원에서 또한, "도면 (Figure)" 및 "도면 (FIG.)")을 참조함으로써 획득될 것이다:
도면 1은 개별 세포 세포의 소집단을 분할하기 위한 미소유체 통로 구조를 개략적으로 도해한다.
도면 2는 세포 및 추가 시약을 포함하는 비드 또는 마이크로캡슐을 공분할하기 위한 미소유체 통로 구조를 개략적으로 도해한다.
도면 3은 세포의 핵산의 증폭 및 바코드화를 위한 실례 과정을 개략적으로 도해한다.
도면 4는 특징화에서 이용을 위해 서열 데이터를 개별 세포 또는 세포의 군에 기인시키는데 있어서 세포의 핵산의 바코드화의 이용의 개략적 도해를 제공한다.
도면 5는 표지화된 세포 결합 리간드와 연관된 세포의 개략적 도해를 제공한다.
도면 6은 본원에서 설명된 방법을 이용하여 RNA 분석을 수행하기 위한 실례 작업 흐름의 개략적 도해를 제공한다.
도면 7은 본원에서 설명된 방법을 이용하여 리보핵산 (RNA)의 분석에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 8은 개별 바코드 보유 비드와 함께 공분할된 개별 세포의 이미지를 제공한다.
도면 9A-E는 RNA의 분석 및 RNA 분석을 수행하기 위한 실례 작업에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 10은 RNA의 실례 분석에서 이용 및 시험관내 전사에서 서열의 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 11은 RNA의 분석 및 RNA 분석을 수행하기 위한 실례 작업에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 12A-B는 RNA의 분석에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 13A-C는 파티션에서 주형 스위치 역전사 및 PCR로부터 실례 수율의 도해를 제공한다.
도면 14A-B는 다양한 세포 수를 갖는 파티션에서 역전사 및 cDNA 증폭으로부터 실례 수율의 도해를 제공한다.
도면 15는 다양한 입력 세포 농도에서 cDNA 합성 및 실시간 정량적 PCR로부터 실례 수율, 그리고 또한, 고정된 세포 입력 농도에서 수율에 대한 변하는 프라이머 농도의 효과의 도해를 제공한다.
도면 16은 시험관내 전사로부터 실례 수율의 도해를 제공한다.
도면 17은 본원에서 제공된 방법을 실행하도록 프로그램되거나 또는 달리 설정된 실례 컴퓨터 제어 시스템을 보여준다.
상세한 설명
본 발명의 다양한 구체예가 본원에서 도시되고 설명되긴 했지만, 이런 구체예가 단지 실례로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 다양한 변이, 변화와 치환이 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에게 발생할 수 있다. 본원에서 설명된 발명의 구체예에 대한 다양한 대안이 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
값이 범위로서 설명되는 경우에, 이런 개시는 이런 범위 내에 모든 가능한 부분범위뿐만 아니라 특정한 수치 값 또는 특정한 부분범위가 명시적으로 언급된 지와 상관없이 이런 범위 내에 들어가는 특정한 수치 값의 개시를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
I. 단일 세포 분석
진전된 핵산 염기서열결정 기술은 개별 생물체 및 상대적으로 순수한 생물학적 표본에 관한 실제적인 서열 정보를 제공하는 것을 비롯하여, 생물학적 물질을 염기서열결정함에 있어서 기념비적인 결과를 산출하였다. 하지만, 이들 시스템은 표본의 전체 구성 중에서 더욱 작은 소수를 나타낼 수도 있지만, 개별화된 서열 정보가 훨씬 귀중한 것으로 입증될 수 있는 생물학적 표본에서 세포의 아개체군을 확인하고 특징짓는데 효과적인 것으로 입증되지 않았다.
대부분의 핵산 염기서열결정 기술은 그들이 조직 또는 다른 표본으로부터 유래된 세포의 수집으로부터 염기서열결정하는 핵산을 도출한다. 세포는 세포 개체군의 평균을 나타내는 유전 물질을 추출하기 위해 일제히 처리될 수 있고, 이것은 이후, 소정의 염기서열결정 기술을 위해 설정되는 염기서열결정 준비 DNA 라이브러리로 처리될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 비록 종종 DNA 또는 핵산에 관하여 논의된 바와 같이, 세포로부터 유래된 핵산은 예로서, 다양한 RNA-seq 방법 중에서 한 가지를 이용하여 DNA, 또는 염기서열결정을 위한 cDNA를 생산하도록 처리될 수 있는 RNA, 예를 들면, mRNA, 전체 RNA, 또는 기타 유사한 것을 포함할 수 있다. 이러한 과정에 따르면, 세포 특이적 마커가 부재하면, 표본 내에 세포의 부분집합 또는 모든 세포에 의해 기여되는 유전 물질의 귀인은 이런 앙상블 접근법에서 사실상 불가능하다.
특징을 세포 개체군의 특정 부분집합에 기인시키는 능력 없음에 더하여, 이런 앙상블 표본 제조 방법은 또한 시작부터, 세포의 표본 내에 다수 성분을 일차적으로 확인하고 특징짓는 성향이 있고, 그리고 표본 내에 소수 성분, 예를 들면, 한 세포, 소수의 세포, 또는 전체 세포 중에서 작은 백분율에 의해 기여된 유전 물질을 선발할 수 있도록 설계되지 않는다. 유사하게, 예로서 mRNA의 발현 수준을 분석하는 경우에, 앙상블 접근법은 발현 수준의 면에서 비-균질한 세포 개체군으로부터 잠재적으로 대단히 부정확한 데이터를 나타내는 성향이 있을 것이다. 일부 경우에, 발현이 분석된 개체군 내에 세포 중에서 작은 소수에서 높고, 그리고 개체군의 세포 중에서 다수에서 부재하는 경우에, 앙상블 방법은 전체 개체군에 대한 낮은 수준 발현을 지시할 것이다.
이들 표본으로부터 염기서열결정 라이브러리를 구축하는데 이용된 처리 작업 전반에서 이러한 본래 다수 선입견은 더욱 확대되고, 그리고 심지어 압도적이다. 특히, 대부분의 차세대 염기서열결정 기술은 염기서열결정 라이브러리에 대한 충분한 DNA를 생산하기 위해, 핵산 단편의 기하학적 증폭, 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응에 의존한다. 하지만, 이런 기하학적 증폭은 표본 내에 다수 성분의 증폭을 향한 선입견이 있고, 그리고 이런 소수 및 다수 성분의 시작 비율을 보존할 수 없다. 실례로서, 표본이 표본 내에 특정 세포 유형, 예를 들면, 숙주 조직 세포로부터 95 % DNA, 그리고 다른 세포 유형, 예를 들면, 암 세포로부터 5% DNA를 포함하면, PCR 기초된 증폭은 비교 지수 증폭의 함수 (더욱 높은 농도의 반복된 배가가 더욱 작은 분획물의 반복된 배가를 빠르게 앞지른다) 및 증폭 시약 및 자원의 격리의 함수 (더욱 큰 분획물이 증폭됨에 따라서, 프라이머 및 다른 증폭 시약을 우선적으로 활용한다) 둘 모두로서, 소수 DNA 대신에 다수 DNA를 우선적으로 증폭할 수 있다.
이들 어려움 중에서 일부가 상이한 염기서열결정 시스템, 예를 들면, 증폭을 필요로 하지 않는 단일 분자 시스템을 활용함으로써 다뤄질 수 있긴 하지만, 이들 단일 분자 시스템뿐만 아니라 다른 차세대 염기서열결정 시스템의 앙상블 염기서열결정 방법은 또한, 충분히 큰 입력 DNA 요건을 요구할 수 있다. 특히, 단일 분자 염기서열결정 시스템, 예를 들면, Pacific Biosciences SMRT 염기서열결정 시스템은 500 나노그램 (ng)으로부터 10 마이크로그램 (μg) 이상까지 표본 입력 DNA 요건을 가질 수 있는데, 이것은 개별 세포 또는 심지어 세포의 작은 아개체군으로부터 유래될 수 있는 것보다 훨씬 크다. 유사하게, 다른 NGS 시스템은 표본 내에 대략 50 ng 내지 약 1 μg의 표본 DNA의 시작 양에 대해 최적화될 수 있다.
II. 세포의 구획화 및 특징화
하지만, 작은 세포 개체군으로부터 핵산을 특징짓기 위한, 그리고 일부 경우에, 특히 더욱 큰 세포 개체군의 배경에서 개별 세포로부터 핵산을 특징짓기 위한 방법 및 시스템이 본원에서 개시된다. 이들 방법 및 시스템은 다른 차세대 시스템의 고처리량에 비-증폭된 단일 분자 방법의 귀인 이점을 제공할 수 있는 이점, 그리고 개별 세포 또는 세포의 작은 수집으로부터 도출가능한 극히 적은 양의 입력 핵산을 처리하고 염기서열결정할 수 있는 추가 이점을 제공한다.
특히, 본원에서 설명된 방법은 예로서, 개별 세포 또는 세포의 소집단으로부터 핵산을 비롯하여, 개별 세포 또는 작은 세포 개체군의 분석을 구획화하고, 그리고 이후, 상기 분석이 이들 핵산이 유래되었던 개별 세포 또는 세포의 소집단에 역으로 기인되도록 허용한다. 이것은 세포 개체군이 세포 유형의 50/50 혼합, 세포 유형의 90/10 혼합, 또는 사실상 임의의 비율의 세포 유형뿐만 아니라 상이한 세포 유형의 완전한 이질성 혼합, 또는 이들 사이에 임의의 혼합물을 나타내는 지에 상관없이 달성될 수 있다. 다른 세포 유형은 개체의 상이한 조직 유형으로부터, 상이한 개체로부터, 다른 속, 종, 계통, 변이체, 또는 전술한 것들 중에서 임의의 또는 모두의 임의의 조합으로부터 세포 또는 생물학적 생물체를 포함할 수 있다. 가령, 다른 세포 유형은 개체로부터 정상 조직 및 종양 조직, 환경적, 법의학적, 마이크로바이옴 또는 다른 표본으로부터 복수의 상이한 세균 종, 균주 및/또는 변이체, 또는 세포 유형의 다양한 다른 혼합물 중에서 한 가지를 포함할 수 있다.
한 양상에서, 본원에서 설명된 방법 및 시스템은 세포를 내포하는 표본 물질로부터 개별 세포의 핵산 내용물의 구별된 구획 또는 파티션 (본원에서 파티션으로서 교체 가능하게 지칭됨)으로의 구획화, 침적 또는 분할을 제공하는데, 여기서 각 파티션은 다른 파티션의 내용물로부터 자체 내용물의 분리를 유지한다. 독특한 식별자, 예를 들면, 바코드가 개별 세포의 특징의 특정 구획으로의 추후 귀인을 허용하기 위해, 구획화된 또는 분할된 세포를 유지하는 파티션에 미리, 차후에 또는 동시에 전달될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 일부 양상에서, 파티션은 컨테이너 또는 용기 (가령, 웰, 마이크로웰, 튜브, 나노어레이 기질에서 직선 포트, 예를 들면, BioTrove 나노어레이, 또는 다른 용기)를 지칭한다. 하지만, 많은 일부 양상에서, 구획 또는 파티션은 유체 흐름 내에서 가류성인 파티션을 포함한다. 이들 파티션은 예로서, 내부 유체 중심 또는 코어를 둘러싸는 외부 장벽을 갖는 마이크로캡슐 또는 마이크로소포로 구성될 수 있거나, 또는 이들은 자신의 매트릭스 내에 물질을 연행하고 및/또는 유지할 수 있는 다공성 매트릭스일 수 있다. 하지만, 일부 양상에서, 이들 파티션은 비수성 연속 상, 예를 들면, 오일 상 내에 방수의 비말을 포함한다. 다양한 상이한 용기는 예로서, 2013년 8월 13일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 13/966,150에서 설명되고, 이의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 유사하게, 비수성 또는 오일 연속 상에서 안정된 비말을 창출하기 위한 유제 시스템은 예로서, U.S. 특허 공개 번호 2010/0105112에서 상세하게 설명되고, 이의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
유제에서 비말의 경우에, 개별 세포를 구별된 파티션에 할당하는 것은 일반적으로, 비말이 두 흐름의 접합부에서 산출되도록, 방수 내에 세포의 유동 흐름을 비수성 유체의 유동 흐름 내로 도입함으로써 달성된다. 수성 세포-내포 흐름을 세포의 일정한 농도 수준에서 제공함으로써, 세포 숫자의 면에서 결과의 파티션의 점유의 수준을 제어할 수 있다. 일부 경우에, 단일 세포 파티션이 요망되는 경우에, 점유되는 파티션이 일차적으로 단독 점유되는 것을 담보하기 위해, 이들 파티션이 평균적으로, 파티션 마다 1개보다 적은 세포를 내포하도록, 유체의 상대적 유속을 제어하는 것이 바람직할 수 있다. 유사하게, 더욱 높은 백분율의 파티션이 점유되는 것을 제공하기 위해, 예를 들면, 극히 작은 백분율의 비점유된 파티션을 허용하기 위해, 유속을 제어하는 것이 요망될 수 있다. 일부 양상에서, 흐름 및 통로 구조는 원하는 숫자의 단독 점유된 파티션, 일정한 수준보다 적은 비점유된 파티션 및 일정한 수준보다 적은 복수 점유된 파티션을 담보하기 위해 제어된다.
많은 경우에, 이들 시스템 및 방법은 실제적인 다수의 점유된 파티션 (하나 또는 그 이상의 마이크로캡슐을 내포하는 파티션)이 점유된 파티션 마다 1개 이내의 세포를 포함하도록 담보하는데 이용된다. 일부 경우에, 분할 과정은 점유된 파티션 중에서 25% 이하가 하나 이상의 세포를 내포하고, 그리고 많은 경우에, 점유된 파티션 중에서 20% 이하가 하나 이상의 세포를 갖고, 반면 일부 경우에, 점유된 파티션 중에서 10% 이하 또는 심지어 5% 이하가 파티션 마다 하나 이상의 세포를 포함하도록 제어된다.
추가적으로 또는 대안으로, 많은 경우에, 과도한 숫자의 비어 있는 파티션의 발생을 방지하는 것이 바람직하다. 이것이 충분한 숫자의 세포를 분할 구역 내로 제공함으로써 달성될 수 있긴 하지만, 포와송 분포는 복수의 세포를 포함하는 파티션의 숫자를 예상된 바와 같이 증가시킬 것이다. 따라서, 본원에서 설명된 양상에 따라서, 분할 구역 내로 지향된 세포, 또는 다른 유체 중에서 하나 또는 그 이상의 흐름은 많은 경우에, 산출된 파티션 중에서 50% 이내, 산출된 파티션 중에서 25% 이내, 산출된 파티션 중에서 10% 이내가 비점유되도록, 다시 말하면, 1개 보다 적은 세포를 포함하도록 제어된다. 게다가, 일부 양상에서, 이들 흐름은 더욱 낮은 수준의 비점유된 파티션을 제공하면서 단일 점유된 파티션의 비-포와송 분포를 제공하도록 제어된다. 다시 말하면, 일부 양상에서, 비점유된 파티션의 상기 언급된 범위는 앞서 설명된 단일 점유 비율 중에서 한 가지를 여전히 제공하면서 달성될 수 있다. 가령, 많은 경우에, 본원에서 설명된 시스템 및 방법의 이용은 50%보다 적은, 40%보다 적은, 30%보다 적은, 20%보다 적은, 10%보다 적은, 그리고 일부 경우에, 5%보다 적은 비점유된 파티션을 가지면서, 25%보다 적은, 20%보다 적은, 15%보다 적은, 10%보다 적은, 그리고 많은 경우에, 5%보다 적은 복수 점유 비율을 갖는 결과의 파티션을 창출한다.
인지되는 바와 같이, 상기-설명된 점유 비율은 또한, 세포 및 바코드 올리고뉴클레오티드를 운반하는 비드 둘 모두를 포함하는 파티션에 적용가능하다. 특히, 일부 양상에서, 실제적인 백분율의 전체 점유된 파티션이 비드 및 세포 둘 모두를 포함할 것이다. 특히, 파티션 중에서 최소한 50%가 최소한 하나의 세포 및 최소한 하나의 비드에 의해 점유되거나, 또는 파티션 중에서 최소한 75%가 이렇게 점유되거나, 또는 심지어 파티션 중에서 최소한 80% 또는 최소한 90%가 이렇게 점유되는 것을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 게다가, 파티션 내에 단일 세포 및 단일 비드를 제공하는 것이 요망되는 사례에서, 파티션 중에서 최소한 50%가 이렇게 점유될 수 있고, 파티션 중에서 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80% 또는 심지어 최소한 90%가 이렇게 점유될 수 있다.
비록 실제적으로 단독 점유된 파티션을 제공하는 면에서 상기에 설명되긴 했지만, 일정한 경우에, 중복 점유된, 예를 들면, 단일 파티션 내에 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 세포 및/또는 비드를 내포하는 파티션을 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 전술한 바와 같이, 세포 및/또는 비드 내포 유체 및 분할 유체의 흐름 특징은 이런 중복 점유된 파티션을 제공하도록 제어될 수 있다. 특히, 흐름 파라미터는 파티션 중에서 50% 이상, 75% 이상, 그리고 일부 경우에 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 그 이상에서 원하는 점유 비율을 제공하도록 제어될 수 있다.
추가적으로, 많은 경우에, 단일 파티션 내에 복수의 비드는 그것과 연관된 상이한 시약을 포함할 수 있다. 이런 경우에, 공통 통로 또는 비말 산출 접합부 내로 상이한 통로 입구를 통해, 상이한 비드 공급원으로부터, 다시 말하면, 상이한 연관된 시약을 내포하는 비드 공급원으로부터 이런 공통 통로 또는 비말 산출 접합부 내로 상이한 비드를 도입하는 것이 유리할 수 있다. 이런 경우에, 통로 또는 접합부 내로 상이한 비드의 흐름 및 빈도는 원하는 숫자의 세포를 갖는 파티션 내로 이런 비드의 원하는 짝짓기 또는 조합을 담보하면서, 각 공급원으로부터 원하는 비율의 마이크로캡슐을 제공하도록 제어될 수 있다.
본원에서 설명된 파티션은 종종, 극히 적은 용적, 예를 들면, 10 μL보다 적은, 5μL보다 적은, 1μL보다 적은, 900 피코리터 (pL)보다 적은, 800 pL보다 적은, 700 pL보다 적은, 600 pL보다 적은, 500 pL보다 적은, 400pL보다 적은, 300 pL보다 적은, 200 pL보다 적은, 100pL보다 적은, 50 pL보다 적은, 20 pL보다 적은, 10 pL보다 적은, 1 pL보다 적은, 500 나노리터 (nL)보다 적은, 또는 심지어 100 nL보다 적은, 50 nL보다 적은, 또는 훨씬 적은 용적을 갖는 것으로 특징화된다.
가령, 비말 기초된 파티션의 경우에, 이들 비말은 1000 pL보다 적은, 900 pL보다 적은, 800 pL보다 적은, 700 pL보다 적은, 600 pL보다 적은, 500 pL보다 적은, 400pL보다 적은, 300 pL보다 적은, 200 pL보다 적은, 100pL보다 적은, 50 pL보다 적은, 20 pL보다 적은, 10 pL보다 적은, 또는 심지어 1 pL보다 적은 전체 용적을 가질 수 있다. 비드로 공분할되는 경우에, 파티션 내에서 예로서, 공분할된 세포를 포함하는 표본 유체 용적은 상기 설명된 용적의 90%보다 적거나, 80%보다 적거나, 70%보다 적거나, 60%보다 적거나, 50%보다 적거나, 40%보다 적거나, 30%보다 적거나, 20%보다 적거나, 또는 심지어 상기 설명된 용적의 10%보다 적은 것으로 인지될 것이다.
본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 분할 종류는 파티션의 개체군을 산출할 수 있다. 이런 경우에, 임의의 적절한 숫자의 파티션이 파티션의 개체군을 산출하기 위해 산출될 수 있다. 가령, 본원에서 설명된 방법에서, 최소한 약 1,000개 파티션, 최소한 약 5,000개 파티션, 최소한 약 10,000개 파티션, 최소한 약 50,000개 파티션, 최소한 약 100,000개 파티션, 최소한 약 500,000개 파티션, 최소한 약 1,000,000개 파티션, 최소한 약 5,000,000개 파티션, 최소한 약 10,000,000개 파티션, 최소한 약 50,000,000개 파티션, 최소한 약 100,000,000개 파티션, 최소한 약 500,000,000개 파티션 또는 최소한 약 1,000,000,000개 파티션을 포함하는 파티션의 개체군이 산출될 수 있다. 게다가, 파티션의 개체군은 비점유된 파티션 (가령, 비어 있는 파티션) 및 점유된 파티션 둘 모두를 포함할 수 있다.
일정한 경우에, 미소유체 통로 네트워크가 본원에서 설명된 바와 같은 파티션을 산출하는데 특히 적합하다. 이런 미소유체 장치의 실례는 2014년 4월 4일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/977,804에서 상세하게 설명된 것들을 포함하고, 이의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 세포의 수성 혼합물이 비수성 유체로 압출되는 다공성 막을 비롯한 대안적 기전 역시 개별 세포의 분할에 이용될 수 있다. 이런 시스템은 일반적으로, 예로서 Nanomi, Inc.로부터 가용하다.
개별 세포를 분할하기 위한 단순화된 미소유체 통로 구조의 실례는 도면 1에서 도해된다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 일부 경우에, 다수의 점유된 파티션은 점유된 파티션 마다 단지 하나의 세포만 포함하고, 그리고 일부 경우에, 산출된 파티션 중에서 일부는 비점유된다. 하지만, 일부 경우에, 점유된 파티션 중에서 일부는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 분할 과정은 점유된 파티션 중에서 25% 이하가 하나 이상의 세포를 내포하고, 그리고 많은 경우에, 점유된 파티션 중에서 20% 이하가 하나 이상의 세포를 갖고, 반면 일부 경우에, 점유된 파티션 중에서 10% 이하 또는 심지어 5% 이하가 파티션 마다 하나 이상의 세포를 포함하도록 제어될 수 있다. 보여지는 바와 같이, 통로 구조는 통로 접합부 110에서 연통하는 통로 세그먼트 102, 104, 106 및 108을 포함할 수 있다. 작업 동안, 현탁된 세포 114를 포함하는 첫 번째 방수 112는 통로 세그먼트 102를 따라서 접합부 110 내로 수송될 수 있고, 반면 방수 112와 비혼성인 두 번째 유체 116은 통로 세그먼트 104 및 106으로부터 접합부 110으로 전달되어, 통로 세그먼트 108로 흘러가는, 개별 세포 114를 포함하는 방수의 구별된 비말 118을 창출한다.
일부 양상에서, 이러한 두 번째 유체 116은 오일, 예를 들면, 플루오르화된 오일을 포함하는데, 이것은 결과의 비말을 안정시키기 위한, 예를 들면, 결과의 비말의 차후 합체를 저해하기 위한 불소계면활성제를 포함한다. 특히 유용한 분할 유체 및 불소계면활성제의 실례는 예로서, U.S. 특허 공개 번호 2010/0105112에서 설명되고, 이의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
다른 양상에서, 비말 기초된 분할에 더하여 또는 대안으로서, 세포는 하나 또는 그 이상의 개별 세포 또는 세포의 소집단이 연행되고 다른 시약을 포함할 수 있는 외부 껍질 또는 층 또는 다공성 매트릭스를 포함하는 마이크로캡슐 내에 피포될 수 있다. 세포의 피포는 다양한 과정에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 이런 과정은 분석되는 세포를 내포하는 방수를, 중합체 전구체에 특정 자극의 적용 시에 겔 또는 다른 고체 또는 반고체 매트릭스로 형성될 수도 있는 중합성 전구체 물질과 합동한다. 이런 자극은 예로서, 열 자극 (가열 또는 냉각), 광-자극 (가령, 광-경화를 통해), 화학적 자극 (가령, 교차연결을 통해), 전구체의 중합화 개시 (가령, 첨가된 개시자를 통해), 또는 기타 유사한 것을 포함한다.
세포를 포함하는 마이크로캡슐의 제조는 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 가령, 공기 분사기 비말 또는 에어로졸 발생기가 개별 세포 또는 세포의 소집단을 포함하는 마이크로캡슐을 형성하기 위해, 전구체 유체의 비말을 겔화 용액 내로 분여하는데 이용될 수 있다. 유사하게, 막 기초된 피포 시스템, 예를 들면, 예로서, Nanomi, Inc.로부터 가용한 것들이 본원에서 설명된 바와 같은 마이크로캡슐을 산출하는데 이용될 수 있다. 일부 양상에서, 미소유체 시스템, 예를 들면, 도면 1에서 도시된 것이 본원에서 설명된 바와 같이 세포를 피포하는데 쉽게 이용될 수 있다. 특히, 그리고 도면 1에 관하여, 세포 및 중합체 전구체 물질을 포함하는 방수는 통로 접합부 110 내로 흘러지는데, 여기서 이것은 비수성 유체 116의 흐름을 통해, 개별 세포 114를 포함하는 비말 118로 분할된다. 피포 방법의 경우에, 비수성 유체 116은 또한, 중합체 전구체의 중합화 및/또는 교차연결을 유발하여, 연행된 세포를 포함하는 마이크로캡슐을 형성하는 개시자를 포함할 수 있다. 특히 유용한 중합체 전구체/개시자 쌍의 실례는 예로서, 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 61/940,318, 2014년 5월 9일자 제출된 61/991,018, 그리고 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/316,383에서 설명된 것들을 포함하고, 이들의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
가령, 중합체 전구체 물질이 선형 중합체 물질, 예를 들면, 선형 폴리아크릴아미드, PEG, 또는 다른 선형 중합성 물질을 포함하는 경우에, 활성화 작용제는 교차연결 작용제, 또는 형성된 비말 내에서 교차연결 작용제를 활성화시키는 화학물질을 포함할 수 있다. 유사하게, 중합가능한 단위체를 포함하는 중합체 전구체의 경우에, 활성화 작용제는 중합화 개시자를 포함할 수 있다. 가령, 중합체 전구체가 아크릴아미드 단위체 및 N,N'-비스-(아크릴로일) 시스타민 (BAC) 공단위체의 혼합물을 포함하는 일정한 경우에, 작용제, 예를 들면, 테트라에틸메틸렌디아민 (TEMED)이 통로 세그먼트 104 및 106에서 두 번째 유체 흐름 내에 제공될 수 있는데, 이것은 아크릴아미드 및 BAC의 교차연결된 중합체 네트워크 또는, 하이드로겔로의 공중합화를 개시한다.
비말의 형성 동안 접합부 110에서 두 번째 유체 흐름 116 및 첫 번째 유체 흐름 112의 접촉 시에, TEMED는 두 번째 유체 116로부터, 선형 폴리아크릴아미드를 포함하는 수성 첫 번째 유체 112로 확산할 수 있는데, 이것은 비말 내에 폴리아크릴아미드의 교차연결을 활성화시켜, 세포 114를 연행하는 고체 또는 반고체 비드 또는 입자로서 겔, 예를 들면, 하이드로겔, 마이크로캡슐 118의 형성을 유발할 것이다. 비록 폴리아크릴아미드 피포의 면에서 설명되긴 했지만, 다른 '활성화가능' 피포 조성물 역시 본원에서 설명된 방법과 조성물의 배경에서 이용될 수 있다. 가령, 알긴산염 비말의 형성, 그 이후에 이가 금속 이온, 예를 들면, Ca2+에 노출은 설명된 과정을 이용한 피포 과정으로서 이용될 수 있다. 유사하게, 아가로오스 비말은 또한, 예로서 냉각 시에 온도 기초된 겔화, 또는 기타 유사한 것을 통해 캡슐로 변환될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 일부 경우에, 피포된 세포는 예로서, 세포, 또는 이의 내용물이 마이크로캡슐로부터 예로서, 추가 파티션, 예를 들면, 비말 내로 방출되는 것을 허용할 만큼 충분히 마이크로캡슐을 분해하는 시간의 경과를 통해, 또는 특정 자극의 적용 시에, 마이크로캡슐로부터 선별적으로 방출가능할 수 있다. 가령, 앞서 설명된 폴리아크릴아미드 중합체의 경우에, 마이크로캡슐의 분해는 중합체 매트릭스를 교차연결하는 이황화 결합을 개열하는 적절한 환원제, 예를 들면, DTT 또는 기타 유사한 것의 도입을 통해 달성될 수 있다 (가령, 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/940,318, 2014년 5월 9일자 제출된 61/991,018, 그리고 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/316,383을 참조하고, 이들의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
인지되는 바와 같이, 피포된 세포 또는 세포 개체군은 저장가능하고, 그리고 비말 기초된 분할된 세포보다 휴대가 더욱 용이하다는 일정한 잠재적 이점을 제공한다. 게다가, 일부 경우에, 상이한 자극의 존재 또는 부재에서 시간의 추이에서 분석되는 세포의 변화를 특징짓기 위해, 이런 세포가 선택된 기간 동안 배양되도록 허용하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 경우에, 개별 세포의 피포는 비록 일부 경우에, 비말 분할된 세포 역시 상이한 기간, 예를 들면, 최소한 10 초, 최소한 30 초, 최소한 1 분, 최소한 5 분, 최소한 10 분, 최소한 30 분, 최소한 1 시간, 최소한 2 시간, 최소한 5 시간, 또는 최소한 10 시간 또는 그 이상 동안 배양될 수 있긴 하지만, 유제 비말에서 단순한 분할보다 더욱 긴 배양을 허용할 수 있다. 상기에서 암시된 바와 같이, 세포의 피포는 다른 시약이 공분할되는 세포의 분할을 구성할 수 있다. 대안으로, 피포된 세포는 앞서 설명된 바와 같이, 다른 파티션, 예를 들면, 비말 내로 쉽게 침적될 수 있다.
일정한 양상에 따라서, 세포는 파티션 내에 세포의 내용물을 방출하기 위해, 용해 시약과 함께 분할될 수 있다. 이런 경우에, 용해 작용제는 예로서, 통로 접합부 110의 상류에 추가 통로 또는 통로들을 통해 분할 접합부/비말 산출 구역 내로 세포의 도입과 동시에, 또는 도입 직전에 세포 현탁액과 접촉될 수 있다. 용해 작용제의 실례는 생리활성 시약, 예를 들면, 상이한 세포 유형, 예를 들면, 그람 양성 또는 음성 세균, 식물, 효모, 포유류 등의 용해에 이용되는 용해 효소, 예를 들면, 라이소자임, 아크로모펩티다아제, 리소스타핀, 라비아제, 키탈라아제, 리티카아제, 그리고 예로서, Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO)로부터 가용한 다양한 다른 용해 효소뿐만 아니라 다른 상업적으로 가용한 용해 효소를 포함한다. 다른 용해 작용제는 부가적으로 또는 대안으로, 세포 내용물의 파티션으로의 방출을 유발하기 위해 세포로 공분할될 수 있다. 가령, 일부 경우에, 계면활성제 기초된 용해 용액은 비록 계면활성제가 안정된 유제를 간섭할 수 있는 유제 기초된 시스템에 대해 덜 바람직할 수도 있긴 하지만, 세포를 용해하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 용해 용액은 비이온성 계면활성제 예를 들면, 예로서, TritonX-100 및 Tween 20을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 용해 용액은 이온성 계면활성제, 예를 들면, 예로서, 사코실 및 황산도데실나트륨 (SDS)을 포함할 수 있다. 유사하게, 다른 방법을 이용하는 용해 방법이 이용될 수 있다, 예를 들면, 전기천공, 가열, 음향 또는 기계적 세포 붕괴 역시 일정한 경우에, 예를 들면, 비-유제 기초된 분할, 예를 들면, 비말 분할에 더하여 또는 대신에 세포의 피포에서 이용될 수 있는데, 여기서 피포물의 임의의 구멍 크기는 세포 붕괴 이후에, 원하는 크기의 핵산 단편을 유지할 만큼 충분히 작다.
앞서 설명된 세포로 공분할되는 용해 작용제에 더하여, 예로서 DNA분해효소 및 RNA분해효소 비활성화 작용제 또는 저해제, 예를 들면, 단백질분해효소 K, 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA, 그리고 핵산의 차후 처리에 대한 상이한 세포 용해물 성분의 부정적인 활성 또는 충격을 제거하거나 또는 달리 감소시키는데 이용되는 다른 시약을 비롯한 다른 시약 역시 이들 세포로 공분할될 수 있다. 이에 더하여, 피포된 세포의 경우에, 이들 세포는 공분할된 마이크로캡슐로부터 세포 또는 이들의 내용물을 방출하기 위해 적절한 자극에 노출될 수 있다. 가령, 일부 경우에, 화학적 자극이 마이크로캡슐의 분해 및 세포 또는 이의 내용물의 더욱 큰 파티션으로의 방출을 허용하기 위해, 피포된 세포와 함께 공분할될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 자극은 개별 비드 또는 파티션으로부터 올리고뉴클레오티드의 방출에 대해 본원의 다른 곳에서 설명된 자극과 동일할 수 있다. 대안적 양상에서, 이것은 피포된 세포가 올리고뉴클레오티드의 동일한 파티션 내로의 방출과 상이한 시점에서 파티션 내로 방출되도록 허용하기 위해, 상이한 비중복 자극일 수 있다.
추가 시약, 예를 들면, 세포의 DNA를 단편화시키는 엔도뉴클레아제, 세포의 핵산 단편을 증폭하고 바코드 올리고뉴클레오티드를 증폭된 단편에 부착하는데 이용되는 DNA 중합효소 효소 및 dNTP 역시 세포로 공분할될 수 있다. 추가 시약은 또한, 말단 전달효소 활성을 갖는 효소를 비롯한 역전사효소 효소, 프라이머 및 올리고뉴클레오티드, 그리고 주형 전환에 이용될 수 있는 스위치 올리고뉴클레오티드 (본원에서 "스위치 올리고"로서 또한 지칭됨)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 주형 전환은 cDNA의 길이를 증가시키는데 이용될 수 있다. 주형 전환의 한 가지 실례에서, cDNA는 주형, 예를 들면, 세포 mRNA의 역전사로부터 산출될 수 있는데, 여기서 말단 전달효소 활성을 갖는 역전사효소는 추가 뉴클레오티드, 예를 들면, 폴리(poly)C를 주형에 의해 인코딩되지 않은 cDNA에, 예를 들면, 상기 cDNA의 단부에서 부가할 수 있다. 스위치 올리고는 추가 뉴클레오티드에 상보적인 서열, 예를 들면, 폴리(poly)G를 포함할 수 있다. cDNA 상에서 추가 뉴클레오티드 (가령, 폴리C)는 스위치 올리고 상에서 이들 추가 뉴클레오티드에 상보적인 서열 (가령, 폴리G)에 혼성화할 수 있는데, 여기서 스위치 올리고는 cDNA를 더욱 연장하기 위한 주형으로서 역전사효소에 의해 이용될 수 있다. 스위치 올리고는 데옥시리보핵산, 리보핵산, 잠금된 핵산 (LNA)을 비롯한 변형된 핵산, 또는 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 스위치 올리고의 길이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 , 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다.
일부 경우에, 스위치 올리고의 길이는 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 , 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249 또는 250개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다.
일부 경우에, 스위치 올리고의 길이는 기껏해야 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 , 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249 또는 250개 뉴클레오티드일 수 있다.
일단 세포의 내용물이 그들의 개별 파티션 내로 방출되면, 그 안에 내포된 핵산이 파티션 내에서 더욱 처리될 수 있다. 본원에서 설명된 방법 및 시스템에 따라서, 개별 세포의 핵산 내용물은 일반적으로, 이들 핵산의 특징화 시에, 그들이 동일한 세포 또는 세포들로부터 유래된 것으로 기인될 수 있도록 독특한 식별자가 제공된다. 특징을 개별 세포 또는 세포의 군에 기인시키는 능력은 개별 세포 또는 세포의 군에 특이적으로 독특한 식별자의 배정에 의해 제공되는데, 이것은 본원에서 설명된 방법 및 시스템의 다른 유리한 양상이다. 특히, 예로서 핵산 바코드의 형태에서 독특한 식별자는 세포의 성분 (및 결과적으로, 이의 특징)을 독특한 식별자로 태깅하거나 또는 표지화하기 위해, 개별 세포 또는 세포 개체군에 배정되거나 또는 이들과 연관된다. 이들 독특한 식별자는 이후, 세포의 성분 및 특징을 개별 세포 또는 세포의 군에 기인시키는데 이용된다. 일부 양상에서, 이것은 개별 세포 또는 세포의 군을 독특한 식별자로 공분할함으로써 수행된다. 일부 양상에서, 독특한 식별자는 개별 세포의 핵산 내용물에, 또는 이들 세포의 다른 성분에, 그리고 특히, 이들 핵산의 단편에 부착되거나 또는 만약 그렇지 않으면, 이들과 연관될 수 있는 핵산 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 형태에서 제공된다. 올리고뉴클레오티드는 소정의 파티션 내에 올리고뉴클레오티드 사이의 경우에, 그 안에 내포된 핵산 바코드 서열은 동일한 반면, 상이한 파티션 사이의 경우에, 올리고뉴클레오티드는 다른 바코드 서열을 가질 수 있고, 그리고 실제로 갖거나, 또는 소정의 분석에서 모든 파티션을 교차하여 다수의 상이한 바코드 서열을 최소한 나타내도록 분할된다. 일부 양상에서, 단지 하나의 핵산 바코드 서열만 소정의 파티션과 연관될 수 있지만, 일부 경우에는 2개 또는 그 이상 상이한 바코드 서열이 존재할 수도 있다.
핵산 바코드 서열은 올리고뉴클레오티드의 서열 내에 6 내지 약 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 바코드 서열의 길이는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 바코드 서열의 길이는 최소한 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 바코드 서열의 길이는 기껏해야 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 뉴클레오티드 또는 그 이하일 수 있다. 이들 뉴클레오티드는 완전하게 인접하거나, 다시 말하면, 인접한 뉴클레오티드의 단일 스트레치 내에 있거나, 또는 이들은 1개 또는 그 이상 뉴클레오티드에 의해 분리되는 2개 또는 그 이상 별개의 하위서열로 분리될 수 있다. 일부 경우에, 분리된 바코드 하위서열은 길이에서 약 4 내지 약 16개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 경우에, 바코드 하위서열은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 바코드 하위서열은 최소한 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 바코드 하위서열은 기껏해야 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 뉴클레오티드 또는 그 이하일 수 있다.
공분할된 올리고뉴클레오티드는 또한, 공분할된 세포로부터 핵산의 처리에서 유용한 다른 기능적 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은 예로서, 연관된 바코드 서열을 부착하면서 파티션 내에 개별 세포로부터 유전체 DNA를 증폭하기 위한 표적화된 또는 무작위/보편적인 증폭 프라이머 서열, 염기서열결정 프라이머 또는 프라이머 인식 부위, 예로서 이들 서열의 존재를 확인하기 위한 또는 바코드화된 핵산을 허물기 위한 혼성화 또는 탐침 서열, 또는 다수의 다른 잠재적 기능적 서열 중에서 한 가지를 포함한다. 다시 한 번, 표본 물질과 함께, 올리고뉴클레오티드 및 연관된 바코드 및 다른 기능적 서열의 공분할은 예로서, 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 61/940,318, 2014년 5월 9일자 제출된 61/991,018, 그리고 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/316,383뿐만 아니라 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/175,935에서 설명되고, 이들의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 인지되는 바와 같이, 예로서 2개 또는 그 이상 비말의 합체 (여기서 1개의 비말이 올리고뉴클레오티드를 내포한다), 또는 미소유체 시스템 내에 파티션, 예를 들면, 비말 내로 올리고뉴클레오티드의 마이크로디스펜싱을 비롯하여, 올리고뉴클레오티드를 공분할하는 다른 기전 역시 이용될 수 있다.
간단히 말하면, 한 가지 실례에서, 비드에 방출가능하게 부착된 다수의 전술한 올리고뉴클레오티드를 각각 포함하는 비드, 마이크로입자 또는 마이크로캡슐이 제공되는데, 여기서 특정 비드에 부착된 모든 올리고뉴클레오티드는 동일한 핵산 바코드 서열을 포함할 것이고, 하지만 여기서 다수의 다양한 바코드 서열은 이용된 비드의 개체군을 교차하여 대표된다. 특히 유용한 실례에서, 예로서 폴리아크릴아미드 중합체 매트릭스를 포함하는 하이드로겔 비드가 올리고뉴클레오티드에 대한 고체 지지체 및 파티션 내로 이들 올리고뉴클레오티드에 대한 전달 운반제로서 이용되는데, 그 이유는 이들이 다수의 올리고뉴클레오티드 분자를 운반할 수 있고, 그리고 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 특정 자극에 노출 시에 이들 올리고뉴클레오티드를 방출하도록 설정될 수 있기 때문이다. 일부 경우에, 비드의 개체군은 최소한 1,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 5,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 10,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 최소한 50,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 100,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 1,000,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 5,000,000개의 상이한 바코드 서열, 또는 최소한 10,000,000개의 상이한 바코드 서열을 포함하는 다양한 바코드 서열 라이브러리를 제공할 것이다. 추가적으로, 각 비드는 부착된 다수의 올리고뉴클레오티드 분자가 제공될 수 있다. 특히, 개별 비드 상에서 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 분자의 숫자는 최소한 1,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 5,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 10,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 50,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 100,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 500,000개 올리고뉴클레오티드, 최소한 1,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 5,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 10,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 50,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 100,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 그리고 일부 경우에 최소한 십억 개 올리고뉴클레오티드 분자일 수 있다.
게다가, 비드의 개체군이 분할될 때, 파티션의 결과의 개체군은 또한, 최소한 1,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 5,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 10,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 최소한 50,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 100,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 1,000,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 5,000,000개의 상이한 바코드 서열, 또는 최소한 10,000,000개의 상이한 바코드 서열을 포함하는 다양한 바코드 라이브러리를 포함할 수 있다. 추가적으로, 개체군의 각 파티션은 최소한 1,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 5,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 10,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 50,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 100,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 500,000개 올리고뉴클레오티드, 최소한 1,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 5,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 10,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 50,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 100,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 그리고 일부 경우에 최소한 십억 개 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 파티션 내에 단일 또는 복수의 비드에 부착된, 소정의 파티션 내에 복수의 상이한 바코드를 통합하는 것이 바람직할 수 있다. 가령, 일부 경우에, 혼합된, 하지만 공지된 바코드 서열 세트가 예로써, 소정의 파티션으로부터 출력의 중복된 또는 독립된 확증으로서, 소정의 파티션에 바코드의 더욱 강한 주소 또는 귀인을 제공함으로써, 차후 처리에서 확인의 더욱 큰 확증을 제공할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 비드에 특정 자극의 적용 시에, 이들 비드로부터 방출가능하다. 일부 경우에, 자극은 예로서, 올리고뉴클레오티드를 방출하는 광-불안정 연쇄의 개열을 통한 광-자극일 수 있다. 다른 경우에, 열 자극이 이용될 수 있는데, 여기서 비드 환경의 온도의 상승은 이들 비드로부터 올리고뉴클레오티드의 연쇄의 개열 또는 다른 방출을 유발할 것이다. 또 다른 사례에서, 비드에 대한 올리고뉴클레오티드의 연쇄를 개열하거나, 또는 만약 그렇지 않으면, 비드로부터 올리고뉴클레오티드의 방출을 유발하는 화학적 자극이 이용된다. 이러한 유형의 시스템의 실례는 2013년 8월 13일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 13/966,150뿐만 아니라 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/940,318, 2014년 5월 9일자 제출된 61/991,018, 그리고 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/316,383에서 설명되고, 이들의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 한 가지 경우에, 이런 조성물은 세포의 피포에 대해 앞서 설명된 폴리아크릴아미드 매트릭스를 포함하고, 그리고 환원제, 예를 들면 DTT에 노출을 통한 부착된 올리고뉴클레오티드의 방출을 위해 분해될 수 있다.
본원에서 설명된 방법 및 시스템에 따라서, 부착된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 비드는 단일 비드 및 단일 세포가 개별 파티션 내에 내포되도록, 개별 세포로 공분할된다. 전술한 바와 같이, 단일 세포/단일 비드 점유가 가장 바람직한 상태이긴 하지만, 복수 점유된 파티션 (세포, 비드 또는 둘 모두의 면에서), 또는 비점유된 파티션 (세포, 비드 또는 둘 모두의 면에서)이 종종 존재할 것으로 인지될 것이다. 세포 및 바코드 올리고뉴클레오티드를 포함하는 비드를 공분할하기 위한 미소유체 통로 구조의 실례는 도면 2에서 개략적으로 도해된다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 일부 양상에서, 전체 점유된 파티션 중에서 실제적인 백분율이 비드 및 세포 둘 모두를 포함할 것이고, 그리고 일부 경우에, 산출되는 파티션 중에서 일부는 비점유될 것으로 인지될 것이다. 일부 경우에, 파티션 중에서 일부는 1:1 분할되지 않는 비드 및 세포를 가질 수 있다. 일부 경우에, 중복 점유된, 예를 들면, 단일 파티션 내에 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 세포 및/또는 비드를 내포하는 파티션을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 보여지는 바와 같이, 통로 세그먼트 202, 204, 206, 208 및 210이 통로 접합부 212에서 유체 연통으로 제공된다. 개별 세포 214를 포함하는 수성 흐름은 통로 세그먼트 202를 통해 통로 접합부 212를 향하여 흘러진다. 앞서 설명된 바와 같이, 이들 세포는 방수 내에서 현탁될 수 있거나, 또는 분할 과정에 앞서 피포되었을 수 있다.
동시에, 바코드 보유 비드 216을 포함하는 수성 흐름은 통로 세그먼트 204를 통해 통로 접합부 212를 향하여 흘러진다. 비수성 분할 유체 216은 측면 통로 206 및 208 각각으로부터 통로 접합부 212 내로 도입되고, 그리고 합동된 흐름은 출구 통로 210으로 흘러진다. 통로 접합부 212 내에, 통로 세그먼트 202 및 204로부터 2개의 합동된 수성 흐름은 합동되고, 그리고 공분할된 세포 214 및 비드 216을 포함하는 비말 218로 분할된다. 전술한 바와 같이, 통로 접합부 212에서 합동하는 유체 각각의 흐름 특징을 제어할 뿐만 아니라 통로 접합부의 기하학을 제어함으로써, 조합 및 분할을 최적화하여, 산출되는 파티션 218 내에 비드, 세포 또는 둘 모두의 원하는 점유 수준을 달성할 수 있다.
일부 경우에, 용해 작용제, 예를 들면, 세포 용해 효소가 세포의 용해가 단지 분할의 시점에서 또는 시점 후에 시작되도록, 예로서 통로 세그먼트 204를 관류하는 비드 흐름으로 파티션 내로 도입될 수 있다. 추가 시약, 예를 들면, 세포의 DNA를 단편화시키는 엔도뉴클레아제, 세포의 핵산 단편을 증폭하고 바코드 올리고뉴클레오티드를 증폭된 단편에 부착하는데 이용되는 DNA 중합효소 효소 및 dNTP 역시 이러한 설정에서 파티션에 첨가될 수 있다. 전술한 바와 같이, 많은 경우에, 화학적 자극, 예를 들면 DTT가 개별 비드로부터 바코드를 파티션 내로 방출하는데 이용될 수 있다. 이런 경우에, 바코드의 방출이 예로서, 파티션 218 내에서 2개의 흐름이 합동된 이후에만 발생하도록, 통로 세그먼트 202 내에 세포-내포 흐름과 함께 화학적 자극을 제공하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 하지만, 세포가 피포되는 경우에, 예로서, 비드로부터 올리고뉴클레오티드를 방출시킬 뿐만 아니라 마이크로캡슐로부터 세포를 방출시키는 통상적인 화학적 자극의 도입은 일반적으로, 통로 접합부 212의 상류에 또는 여기에 연결된 별개의 추가 측면 통로 (도시되지 않음)로부터 제공될 수 있다.
인지되는 바와 같이, 예로서 보호 시약, 예를 들면, 단백질분해효소 K, 킬레이터, 핵산 연장, 복제, 전사 또는 증폭 시약, 예를 들면, 중합효소, 역전사효소, 트랜스포손 기초된 방법 (가령, Nextera)에 이용될 수 있는 유전자전위효소, 뉴클레오시드 삼인산염 또는 NTP 유사체, 프라이머 서열 및 추가 보조인자, 예를 들면, 이런 반응에서 이용된 이가 금속 이온, 결찰 반응 시약, 예를 들면, 리가아제 효소 및 결찰 서열, 염료, 라벨, 또는 다른 태깅 시약을 비롯한 다수의 다른 시약이 세포, 비드, 용해 작용제 및 화학적 자극과 함께 공분할될 수 있다.
예로서 본원에서 설명된 바와 같은 통로 네트워크는 적절한 유체 성분에 유동적으로 연계될 수 있다. 가령, 입구 통로 세그먼트, 예를 들면, 통로 세그먼트 202, 204, 206 및 208은 이들이 통로 접합부 212에 전달하고자 하는 물질의 적절한 공급원에 유동적으로 연계된다. 가령, 통로 세그먼트 202는 분석되는 세포 214의 수성 현탁액의 공급원에 유동적으로 연계될 것이고, 반면 통로 세그먼트 204는 비드 216의 수성 현탁액의 공급원에 유동적으로 연계될 것이다. 통로 세그먼트 206 및 208은 이후, 비수성 유체의 하나 또는 그 이상의 공급원에 유동적으로 연결될 것이다. 이들 공급원은 미소유체 장치의 몸체 구조에서 규정된 또는 여기에 연결된 단순한 저장소로부터 오프-장치 공급원, 다양체, 또는 기타 유사한 것으로부터 유체를 전달하는 유체 도관까지, 다양한 상이한 유체 성분 중에서 한 가지를 포함할 수 있다. 유사하게, 출구 통로 세그먼트 210은 분할된 세포에 대한 수용 용기 또는 도관에 유동적으로 연계될 수 있다. 이번에도, 이것은 미소유체 장치의 몸체 내에 규정된 저장소일 수 있거나, 또는 이것은 분할된 세포를 차후 과정 작업, 기기 또는 성분에 전달하기 위한 유체 도관일 수 있다.
도면 8은 유중수 유제 내에 수성 비말에서 비드를 내포하는 바코드 올리고뉴클레오티드와 함께 공분할된 개별 Jurkat 세포의 이미지를 보여준다. 예시된 바와 같이, 개별 세포는 개별 비드와 함께 쉽게 공분할될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 개별 세포 적하의 최적화는 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 파티션 마다 원하는 세포 적하를 달성하기 위해, 미소유체 시스템 내로 세포 개체군의 희석액을 제공하는 것을 비롯한 다수의 방법에 의해 수행될 수 있다.
작업 동안, 일단 용해되면, 개별 세포의 핵산 내용물은 이후, 파티션 내에서 예로서, 단편화, 증폭 및 바코드화뿐만 아니라 다른 기능적 서열의 부착을 비롯한 추가 처리에 가용하다. 전술한 바와 같이, 단편화는 핵산을 더욱 작은 단편으로 단편화하기 위해, 전단 효소, 예를 들면, 엔도뉴클레아제의 공분할을 통해 달성될 수 있다. 이들 엔도뉴클레아제는 유형 II 및 유형 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 비롯한 제한 엔도뉴클레아제뿐만 아니라 다른 핵산 개열 효소, 예를 들면, 틈내기 엔도뉴클레아제 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단편화가 요망되지 않을 수 있고, 그리고 전장 핵산이 파티션 내에 유지될 수 있거나, 또는 피포된 세포 또는 세포 내용물의 경우에, 단편화가 분할하기에 앞서, 예로서 효소적 방법, 예를 들면, 본원에서 설명된 것들을 통해, 또는 기계적 방법, 예를 들면, 기계적, 음향 또는 다른 전단을 통해 수행될 수 있다.
일단 공분할되고, 그리고 세포가 용해되어 그들의 핵산이 방출되면, 비드 상에 배치된 올리고뉴클레오티드는 이들 핵산의 단편을 바코드화하고 증폭하는데 이용될 수 있다. 표본 핵산의 단편을 증폭하고 바코드화함에 있어서 이들 바코드 올리고뉴클레오티드의 이용을 위한 특히 우아한 과정은 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/940,318, 2014년 5월 9일자 제출된 61/991,018, 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/316,383에서 상세하게 설명되고, 그리고 이미 참조로서 편입된다. 간단히 말하면, 한 양상에서, 세포로 공분할되는 비드 상에 존재하는 올리고뉴클레오티드는 세포의 핵산과 함께 그들의 비드로부터 파티션 내로 방출된다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열과 함께, 이의 5' 단부에서 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 이러한 프라이머 서열은 세포의 핵산 상에서 다양한 상이한 영역을 무작위로 기폭하도록 의도된 무작위 올리고뉴클레오티드 서열일 수 있거나, 또는 이것은 세포의 유전체의 특정한 표적화된 영역의 상류를 기폭하도록 표적화된 특정한 프라이머 서열일 수 있다.
일단 방출되면, 올리고뉴클레오티드의 프라이머 부분은 세포의 핵산의 상보성 영역에 어닐링할 수 있다. 세포 및 비드와 함께 또한 공분할되는 연장 반응 시약, 예를 들면, DNA 중합효소, 뉴클레오시드 삼인산염, 보조인자 (가령, Mg2+ 또는 Mn2+)는 이후, 세포의 핵산을 주형으로서 이용하여 프라이머 서열을 연장하여, 상기 프라이머가 어닐링되는 세포의 핵산의 가닥에 대한 상보성 단편을 생산하고, 상기 상보성 단편은 올리고뉴클레오티드 및 이의 연관된 바코드 서열을 포함한다. 세포의 핵산의 상이한 부분에 복수의 프라이머의 어닐링 및 연장은 핵산의 중복 상보성 단편의 대규모 풀을 유발할 것인데, 이들 단편 각각은 자신이 창출되었던 파티션을 지시하는 자체 바코드 서열을 소유한다. 일부 경우에, 이들 상보성 단편은 그들 자체로, 파티션 내에 존재하는 올리고뉴클레오티드에 의해 기폭된 주형으로서 이용되어, 바코드 서열을 이번에도 포함하는 보체의 보체를 생산할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 복제 과정은 첫 번째 보체가 복제될 때, 이것이 이의 말단에서 또는 이와 가깝게 2개의 상보성 서열을 생산하여, 추가 반복적인 사본을 생산하기 위한 기초가 되는 분자의 능력을 감소시키는 헤어핀 구조 또는 부분적인 헤어핀 구조의 형성을 허용하도록 설정된다. 본원에서 설명된 바와 같이, 세포의 핵산은 예로서, 세포의 DNA, 예를 들면, 유전체 DNA, RNA, 예를 들면, 전령 RNA, 기타 등등을 비롯하여, 세포 내에 임의의 원하는 핵산을 포함할 수 있다. 가령, 일부 경우에, 본원에서 설명된 방법 및 시스템은 발현된 mRNA (가령, 이런 mRNA의 존재 및 정량 포함)를 특징짓는데 이용되고, 그리고 특징화 과정으로서 RNA 염기서열결정 과정을 포함할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 세포와 함께 분할된 시약은 DNA 염기서열결정이 이용되는 염기서열결정 과정을 용이하게 하기 위해, mRNA의 cDNA로의 전환을 위한 시약, 예를 들면, 역전사효소 효소 및 시약을 포함할 수 있다. 특징화되는 핵산이 RNA, 예를 들면, mRNA를 포함하는 일부 경우에, 이것의 한 가지 실례의 개략적 도해는 도면 3에서 도시된다.
보여지는 바와 같이, 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 표본 핵산 304와 함께, 예로서 유제 내에 비말 302에서 공분할된다. 본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 308은 표본 핵산 304로 공분할되는 비드 306 상에 제공될 수 있고, 상기 올리고뉴클레오티드는 패널 A에서 보여지는 바와 같이, 비드 306으로부터 방출가능하다. 올리고뉴클레오티드 308은 하나 또는 그 이상의 기능적 서열, 예를 들면, 서열 310, 314 및 316에 더하여, 바코드 서열 312를 포함한다. 가령, 올리고뉴클레오티드 308은 바코드 서열 312뿐만 아니라 소정의 염기서열결정 시스템에 대한 부착 또는 고정 서열, 예를 들면, Illumina Hiseq® 또는 Miseq® 시스템의 흐름 셀에서 부착에 이용된 P5 서열로서 기능할 수 있는 서열 310을 포함하는 것으로 도시된다. 보여지는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 또한, 프라이머 서열 316을 포함하는데, 이것은 표본 핵산 304의 부분의 복제를 기폭하기 위한 무작위 또는 표적화된 N-mer을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 308 내에 서열 314가 또한 포함되는데, 이것은 염기서열결정 시스템에서 합성 반응에 의한 중합효소 매개된, 주형 지향된 염기서열결정을 기폭하는데 이용되는 염기서열결정 기폭 영역, 예를 들면, "판독1" 또는 R1 기폭 영역을 제공할 수 있다. 인지되는 바와 같이, 기능적 서열은 다양한 상이한 염기서열결정 시스템, 예를 들면, 454 염기서열결정, Ion Torrent Proton 또는 PGM, Illumina X10 등, 그리고 이들의 요구사항과 양립하도록 선별될 수 있다. 많은 경우에, 바코드 서열 312, 고정 서열 310 및 R1 서열 314는 소정의 비드에 부착된 모든 올리고뉴클레오티드에 공통적일 수 있다. 프라이머 서열 316은 무작위 N-mer 프라이머를 위해 변할 수 있거나, 또는 일정한 표적화된 적용을 위해 소정의 비드 상에서 올리고뉴클레오티드에 공통적일 수 있다.
인지되는 바와 같이, 일부 경우에, 기능적 서열은 RNA-seq 적용에 유용한 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 가령, 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드는 RNA-seq의 경우에 RNA의 역전사를 기폭하기 위한 폴리-T 프라이머를 포함할 수 있다. 또 다른 사례에서, 소정의 파티션 내에, 예로서 개별 비드 상에 포함된 올리고뉴클레오티드는 공통 바코드 서열에 더하여 복수 유형의 프라이머 서열, 예를 들면, DNA-염기서열결정 및 RNA 염기서열결정 프라이머 둘 모두, 예를 들면, 비드에 연계된 올리고뉴클레오티드 내에 포함된 폴리-T 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 이런 경우에, 단일 분할된 세포는 DNA 및 RNA 염기서열결정 과정 둘 모두에 종속될 수 있다.
프라이머 서열 316의 존재에 근거하여, 올리고뉴클레오티드는 패널 B에서 보여지는 바와 같이 표본 핵산을 기폭할 수 있는데, 이것은 비드 306 및 표본 핵산 304과 함께 또한 공분할되는 중합효소 효소 및 다른 연장 시약을 이용하여 올리고뉴클레오티드 308 및 308a의 연장을 허용한다. 패널 C에서 보여지는 바와 같이, 무작위 N-mer 프라이머의 경우에, 표본 핵산 304의 복수의 상이한 영역에 어닐링할 올리고뉴클레오티드의 연장 이후에; 핵산의 복수의 중복 보체 또는 단편, 예를 들면, 단편 318 및 320이 창출된다. 비록 표본 핵산의 부분에 상보적인 서열 부분, 예를 들면, 서열 322 및 324를 포함하긴 하지만, 이들 구조체는 일반적으로 본원에서, 부착된 바코드 서열을 갖는, 표본 핵산 304의 단편을 포함하는 것으로 지칭된다.
바코드화된 핵산 단편은 이후, 예로서 서열 분석을 통한 특징화에 종속될 수 있거나, 또는 이들은 패널 D에서 보여지는 바와 같이, 과정 동안 더욱 증폭될 수 있다. 가령, 비드 306으로부터 또한, 방출된 추가 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 308b는 단편 318 및 320을 기폭할 수 있다. 이것은 단편 318에 대해 도시된다. 특히, 다시 한 번, 올리고뉴클레오티드 308b 내에 무작위 N-mer 프라이머 316b (이것은 많은 경우에, 소정의 파티션 내에 다른 무작위 N-mer, 예를 들면, 프라이머 서열 316과 상이할 수 있다)의 존재에 근거하여, 올리고뉴클레오티드는 단편 318과 어닐링하고, 그리고 연장되어 서열 328을 포함하는 단편 318의 최소한 일부에 대한 보체 326을 창출하는데, 이것은 표본 핵산 서열의 일부의 복제물을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 308b의 연장은 이것이 단편 318의 올리고뉴클레오티드 부분 308을 통해 복제될 때까지 계속된다. 본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 그리고 패널 D에서 예시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 예로서, 단편 318 내에 포함되는 올리고뉴클레오티드 308의 서열 316 및 314을 통해 복제된 후, 원하는 시점에서 중합효소에 의한 복제의 중단을 촉발하도록 설정될 수 있다. 본원에서 설명된 바와 같이, 이것은 예로서, 이용된 중합효소 효소에 의해 처리될 수 없는 상이한 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체의 통합을 비롯한 상이한 방법에 의해 달성될 수 있다. 가령, 이것은 상기 영역의 복제를 중단시키는 비-우라실 내성 중합효소를 예방하기 위해, 서열 영역 312 내에 우라실 내포 뉴클레오티드의 포함을 포함할 수 있다. 결과적으로, 바코드 서열 312, 부착 서열 310, R1 프라이머 영역 314, 그리고 무작위 N-mer 서열 316b를 포함하는 전장 올리고뉴클레오티드 308b를 한쪽 단부에서 포함하는 단편 326이 창출된다. 상기 서열의 다른 단부에는 첫 번째 올리고뉴클레오티드 308의 무작위 N-mer에 대한 보체 316'뿐만 아니라 서열 314'로서 도시된, R1 서열의 전부 또는 일부에 대한 보체가 포함될 수 있다. R1 서열 314 및 이의 보체 314'는 이후, 함께 혼성화하여 부분적인 헤어핀 구조 328을 형성할 수 있다. 인지되는 바와 같이, 이들 무작위 N-mer이 상이한 올리고뉴클레오티드 사이에서 다르기 때문에, 이들 서열 및 이들의 보체는 헤어핀 형성에 참여할 것으로 예상되지 않을 것이다, 예를 들면, 무작위 N-mer 316에 대한 보체인 서열 316'은 무작위 N-mer 서열 316b에 상보적일 것으로 예상되지 않을 것이다. 이것은 N-mer이 소정의 파티션 내에 올리고뉴클레오티드 사이에서 공통적일 다른 적용, 예를 들면, 표적화된 프라이머의 경우에는 그렇지 않을 것이다.
이들 부분적인 헤어핀 구조를 형성함으로써, 이것은 추가 복제로부터 표본 서열의 첫 번째 수준 복제물의 제거를 허용한다, 예를 들면, 사본의 반복적인 복사를 예방한다. 부분적인 헤어핀 구조는 또한, 창출된 단편, 예를 들면, 단편 326의 차후 처리를 위한 유용한 구조를 제공한다.
일반적으로, 세포의 핵산의 증폭은 파티션 내에 바코드화된 중복 단편이 세포의 유전체의 특정 부분 또는 전부의 최소한 1X 적용범위, 관심되는 유전체 또는 이의 유관한 부분의 최소한 2X, 최소한 3X, 최소한 4X, 최소한 5X, 최소한 10X, 최소한 20X, 최소한 40X 또는 그 이상 적용범위를 구성할 때까지 수행된다. 일단 바코드화된 단편이 생산되면, 이들은 적절한 염기서열결정 시스템, 예를 들면, Illumina Hiseq®, Miseq® 또는 X10 시스템에서 직접적으로 염기서열결정될 수 있거나, 또는 이들은 추가 처리, 예를 들면, 추가 증폭, 역판독을 위한 다른 기능적 서열, 예를 들면, 두 번째 염기서열결정 프라이머, 표본 색인 서열 등의 부착에 종속될 수 있다.
복수의 상이한 파티션으로부터 모든 단편은 이후, 본원에서 설명된 바와 같은 고처리량 서열분석기에서 염기서열결정을 위해 모아질 수 있는데, 여기서 모아진 단편은 상이한 세포 또는 작은 세포 개체군의 핵산으로부터 유래된 다수의 단편을 포함하지만, 여기서 소정의 세포의 핵산으로부터 단편은 동일한 바코드 서열을 공유할 것이다. 특히, 각 단편이 기원된 파티션, 그리고 결과적으로, 이의 단일 세포 또는 작은 세포 개체군에 대해 코딩되기 때문에, 단편의 서열은 바코드의 존재에 근거하여 상기 세포 또는 이들 세포에 역으로 기인될 수 있고, 이것은 또한, 복수의 파티션으로부터 상이한 세포에 대한 개별 유전체의 어셈블리까지 다양한 서열 단편을 적용하는데 보조할 것이다. 이것은 도면 4에서 개략적으로 도해된다. 한 가지 실례에서 보여지는 바와 같이, 첫 번째 세포 400으로부터 첫 번째 핵산 404, 그리고 두 번째 세포 402로부터 두 번째 핵산 406은 각각, 앞서 설명된 바와 같이 바코드 올리고뉴클레오티드의 그들의 자체 세트와 함께 분할된다. 핵산은 세포로부터 염색체, 전체 유전체 또는 다른 큰 핵산을 포함할 수 있다.
각 파티션 내에, 각 세포의 핵산 404 및 406은 이후, 첫 번째 단편(들)의 두 번째 단편의 중복 세트, 예를 들면, 두 번째 단편 세트 408 및 410을 별개로 제공하기 위해 처리된다. 이러한 과정은 또한, 특정 첫 번째 단편으로부터 유래된 두 번째 단편 각각에서와 동일한 바코드 서열을 갖는 두 번째 단편을 제공한다. 보여지는 바와 같이, 두 번째 단편 세트 408의 바코드 서열은 "1"에 의해 표시되고, 반면 단편 세트 410에 대한 바코드 서열은 "2"에 의해 표시된다. 바코드의 다양한 라이브러리가 다수의 상이한 단편 세트를 차별적으로 바코드화하는데 이용될 수 있다. 하지만, 상이한 첫 번째 단편으로부터 모든 두 번째 단편 세트가 상이한 바코드 서열로 바코드화될 필요는 없다. 실제로, 많은 경우에, 복수의 상이한 첫 번째 단편이 동일한 바코드 서열을 포함하도록 동시에 처리될 수 있다. 다양한 바코드 라이브러리는 본원의 다른 곳에서 상세하게 설명된다.
예로서, 단편 세트 408 및 410으로부터 바코드화된 단편은 이후, 예로서 Thermo-Fisher, Inc.의 Illumina 또는 Ion Torrent 부문으로부터 가용한 합성 기술에 의한 서열을 이용한 염기서열결정을 위해 모아질 수 있다. 일단 염기서열결정되면, 서열 리드 412는 포함된 바코드에 최소한 부분적으로 근거하여, 그리고 일부 경우에, 단편 그 자체의 서열에 부분적으로 근거하여 예로서, 응집된 리드 414 및 416에서 보여지는 바와 같이, 그들의 개별 단편 세트에 기인될 수 있다. 각 단편 세트에 대한 기인된 서열 리드는 이후, 각 세포의 핵산에 대한 조립된 서열, 예를 들면, 서열 418 및 420을 제공하기 위해 조립되고, 이들은 차례로, 개별 세포, 예를 들면, 세포 400 및 402에 기인될 수 있다.
세포 내에 존재하는 유전 물질을 분석하는 면에서 설명되긴 했지만, 본원에서 설명된 방법 및 시스템은 개별 세포에 시약의 할당을 허용하고, 그리고 이들 시약에 대한 응답으로 이들 세포의 귀인 분석 또는 특징화를 제공함으로써, 개별 세포 또는 세포 개체군의 다른 양상을 특징짓는 능력을 비롯한 훨씬 넓은 적용가능성을 가질 수 있다. 이들 방법 및 시스템은 예로서, 연구, 진단, 병원체 확인, 그리고 많은 다른 목적을 위해 세포를 특징지을 수 있다는 점에서 특히 귀중하다. 실례로서, 넓은 범위의 상이한 세포 표면 특질, 예를 들면, 세포 표면 단백질, 예를 들면, 분화 또는 CD 단백질의 클러스터는 암과 같은 질환의 특징화에서 유의미한 진단적 관련성을 갖는다.
한 가지 특히 유용한 적용에서, 본원에서 설명된 방법 및 시스템은 세포 특질, 예를 들면, 세포 표면 특질, 예를 들면, 단백질, 수용체 등을 특징짓는데 이용될 수 있다. 특히, 본원에서 설명된 방법은 리포터 분자를 이들 세포 특질에 부착하는데 이용될 수 있는데, 이들 특질은 앞서 설명된 바와 같이 분할될 때, 개별 세포 또는 세포 개체군 내에 이런 세포 특질의 존재, 그리고 일부 경우에, 상대적 존재비 또는 양을 확인하기 위해, 예로서 DNA 염기서열결정 기술을 이용하여 바코드화되고 분석될 수 있다.
특정 실례에서, 잠재적 세포 결합 리간드, 예를 들면, 항체, 항체 단편, 세포 표면 수용체 결합 분자, 또는 기타 유사한 것의 라이브러리는 예로서, 핵산 리포터 분자의 첫 번째 세트와 연관되어 제공될 수 있는데, 여기서 상이한 리포터 올리고뉴클레오티드 서열은 특정한 리간드와 연관되고, 그리고 이런 이유로, 특정한 세포 표면 특질에 결합할 수 있다. 일부 양상에서, 라이브러리의 상이한 구성원은 상이한 올리고뉴클레오티드 서열 라벨의 존재에 의해 특징화될 수 있다, 예를 들면, 첫 번째 유형의 세포 표면 단백질 또는 수용체에 대한 항체는 이것과 연관된 첫 번째 공지된 리포터 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 것이고, 반면 두 번째 수용체 단백질에 대한 항체는 이것과 연관된 상이한 공지된 리포터 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 것이다. 공분할하기에 앞서, 세포는 상이한 세포 표면 특질의 광범위한 패널, 예를 들면, 수용체, 단백질 등에 대한 항체를 나타낼 수 있고, 그리고 그들의 연관된 리포터 올리고뉴클레오티드를 포함하는 리간드의 라이브러리와 함께 배양될 것이다. 결합되지 않은 리간드는 세포로부터 세척되고, 그리고 이들 세포는 이후, 앞서 설명된 바코드 올리고뉴클레오티드와 함께 공분할된다. 결과적으로, 파티션은 세포 또는 세포들뿐만 아니라 결합된 리간드 및 이들의 공지된, 연관된 리포터 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이다.
파티션 내에서 세포를 용해할 필요 없이, 이후 리포터 올리고뉴클레오티드를 세포 핵산에 대해 앞서 설명된 바코드화 작업에 종속시켜, 바코드화된, 리포터 올리고뉴클레오티드를 생산할 수 있었는데, 여기서 리포터 올리고뉴클레오티드의 존재는 특정 세포 표면 특질의 존재를 지시할 수 있고, 그리고 바코드 서열은 소정의 세포 또는 세포 개체군으로 공분할된 바코드 서열에 근거하여, 상이한 세포 표면 특질의 범위의 상기 개별 세포 또는 세포 개체군으로의 귀인을 허용할 것이다. 결과적으로, 더욱 넓은 세포 개체군 내에서 세포 표면 특질의 세포별 프로필을 산출할 수 있다. 본원에서 설명된 방법 및 시스템의 이러한 양상은 아래에 더욱 상세하게 설명된다.
이러한 실례는 도면 5에서 개략적으로 도해된다. 보여지는 바와 같이, 세포 502 및 504에 의해 대표되는 세포 개체군은 세포 표면 연관된 시약의 라이브러리, 예를 들면, 항체, 세포 표면 결합 단백질, 리간드 또는 기타 유사한 것과 함께 배양되는데, 여기서 각 상이한 유형의 결합 기는 자신과 연관되는 연관된 핵산 리포터 분자를 포함하고, 리간드 및 연관된 리포터 분자 506, 508, 510 및 512 (리포터 분자는 상이하게 음영된 원에 의해 지시됨)로서 도시된다. 세포가 라이브러리에 의해 결합되는 표면 특질을 발현하는 경우에, 리간드 및 이들의 연관된 리포터 분자는 세포 표면과 연관되거나 또는 연계될 수 있다. 개별 세포는 이후, 이들의 연관된 리간드/리포터 분자뿐만 아니라 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같은 개별 바코드 올리고뉴클레오티드 비드, 예를 들면, 비드 522 및 524 각각과 함께, 별개의 파티션, 예를 들면, 비말 514 및 516 내로 분할된다. 본원에서 설명된 다른 실례에서처럼, 바코드화된 올리고뉴클레오티드는 비드로부터 방출되고, 그리고 소정의 파티션에 공통적이지만, 상이한 파티션 사이에서 폭넓게 변하는 바코드로, 각 파티션 내에 존재하는 리포터 분자에 바코드 서열을 부착하는데 이용된다. 가령, 도면 5에서 보여지는 바와 같이, 파티션 514 내에 세포 502와 연관되는 리포터 분자는 바코드 서열 518로 바코드화되고, 반면 파티션 516 내에 세포 504와 연관된 리포터 분자는 바코드 520으로 바코드화된다. 결과적으로, 리포터 분자에 의해 반영된 바와 같이, 세포의 표면 리간드를 반영하지만, 세포의 표면 특성의 단일 세포 수준 프로파일링을 허용하는 공통 바코드 서열에 의해서 개별 세포에 실제적으로 기인되는 올리고뉴클레오티드의 라이브러리가 제공된다. 인지되는 바와 같이, 이러한 과정은 세포 표면 수용체에 한정되지 않으며, 매우 다양한 특정한 세포 구조, 화학적 성질 또는 다른 특징의 존재를 확인하는데 이용될 수 있다.
III. 단일 세포 분석의 적용
특정한 개별 세포의 분석, 다른 세포 유형의 개체군 내에 상이한 세포 유형의 분석, 환경, 인간 건강, 역학적 법의학에 대한 대규모 세포 개체군의 분석 및 특징화, 또는 매우 다양한 상이한 적용 중에서 한 가지를 비롯하여, 본원에서 설명된 단일 세포 공정 및 분석 방법 및 시스템의 매우 다양한 상이한 적용이 있다.
본원에서 설명된 단일 세포 분석 과정의 특히 귀중한 적용은 암 세포의 염기서열결정 및 특징화에 있다. 특히, 상기에 암시된 앙상블 염기서열결정 과정을 비롯한 전통적인 분석 기법은 암 세포의 유전체 구성에서 작은 변이를 선발하는데 별로 뛰어나지 않은데, 이들이 정상적인 조직 세포의 바다에서 존재할 경우에 특히 그러하다. 게다가, 심지어 종양 세포 사이에도, 넓은 변이가 존재할 수 있고, 그리고 염기서열결정에 대한 이들 앙상블 접근법에 의해 차폐될 수 있다 (가령, Patel, et al., Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma, Science DOI: 10.1126/science.1254257 (2014년 6월 12일자에 온라인 공개됨)을 참조한다. 암 세포는 고형 종양, 혈액학적 악성, 세포주로부터 유래되거나, 또는 순환성 종양 세포로서 획득되고, 그리고 앞서 설명된 분할 과정에 종속될 수 있다. 분석 시에, 개별 세포 서열을 단일 세포 또는 세포의 소집단으로부터 유래하는 것으로 확인하고, 그리고 이들을 정상적인 조직 세포 서열과 식별할 수 있다. 게다가, 전체 개시가 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는, 2014년 6월 26일자 제출된 공동 계류 중인 U.S. 특허가출원 번호 62/017,808에서 설명된 바와 같이, 각 세포로부터 단계적인 서열 정보를 또한 획득하여, 암 세포 내에 일배체형 변이체의 더욱 명확한 특징화를 허용할 수 있다. 단일 세포 분석 접근법은 전체 개시가 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는, 2014년 6월 26일자 제출된 공동 계류 중인 U.S. 특허가출원 번호 62/017,580에서 설명된 바와 같이, 적은 양의 입력 핵산을 수반하는 시스템 및 방법에 특히 유용하다.
암 세포 분석에서처럼, 태아 세포의 분석을 통한 태아 건강 또는 이상의 분석 및 진단은 전통적인 기술을 이용하면 어려운 과제이다. 특히, 상대적으로 침습성 시술, 예를 들면, 양수천자의 부재에서 태아 세포 표본을 획득하는 것은 모체 순환으로부터 이들 세포를 수확하는 것을 이용할 수 있다. 인지되는 바와 같이, 이런 순환성 태아 세포는 순환의 전체 세포 개체군 중에서 극히 작은 분율을 구성한다. 결과적으로, 획득된 데이터 중에서 어느 것이 모체 세포와는 대조적으로 태아 세포로부터 아마도 유래되는 지를 특징짓기 위해 복잡한 분석이 수행된다. 하지만, 본원에서 설명된 단일 세포 특징화 방법 및 시스템을 이용함으로써, 유전자 구성을 개별 세포에 기인시키고, 그리고 이들 세포를 그들의 개별 유전자 구성에 근거하여 모체 또는 태아로 분류할 수 있다. 게다가, 태아 세포의 유전자 서열은 예로서, 이수성, 예를 들면, 다운 증후군, 에드워드 증후군 및 파타우 증후군을 비롯한 다수의 유전 질환 중에서 한 가지를 확인하는데 이용될 수 있다.
더욱 크고 다양한 세포 개체군으로부터 개별 세포를 특징짓는 능력은 또한, 환경적 시험뿐만 아니라 법의학 분석 둘 모두에서 유의미한 가치를 갖는데, 여기서 표본은 그들의 본성에 의해, 표본이 시험되는 세포에 비하여 표본을 "오염"시키는 다양한 세포 개체군 및 다른 물질, 예를 들면, 예로서, 환경 및 식품 안전성 시험을 위한 환경적 지표 생물체, 독성 생물체 등, 성폭행 및 다른 강력 범죄에 대한 법의학 분석에서 피해자 및/또는 가해자 세포, 기타 등등으로 구성될 수 있다.
상기 설명된 단일 세포 염기서열결정 및 특징화 과정의 추가 유용한 적용은 신경과학 연구 및 진단의 분야이다. 특히, 신경 세포는 유전체 주변으로 이동할 수 있는 긴 산재된 핵 요소 (LINEs), 또는 '점핑' 유전자를 포함할 수 있는데, 이들은 각 뉴런이 이웃 세포와 상이하도록 유발한다. 연구를 통해, 인간 뇌 내에 LINE의 숫자는 80 내지 300개의 독특한 삽입으로, 다른 조직, 예를 들면, 심장 및 간 조직의 것을 초과하는 것으로 밝혀졌다 (가령, Coufal, N. G. et al. Nature 460, 1127-1131 (2009)을 참조한다). 이들 차이는 신경 질환에 대한 개인의 감수성에 관련되거나 (가령, Muotri, A. R. et al. Nature 468, 443-446 (2010)을 참조한다), 또는 과제에 대응하는 다양성을 뇌에 제공하는 것으로 상정되었다. 따라서, 본원에서 설명된 방법은 개별 신경 세포의 염기서열결정 및 특징화에서 이용될 수 있다.
또한, 본원에서 설명된 단일 세포 분석 방법은 전술한 바와 같이, RNA 전사체의 확인 및 이들의 정량 둘 모두의 면에서 유전자 발현의 분석에서 유용하다. 특히, 본원에서 설명된 단일 세포 수준 분석 방법을 이용하여, 개별 세포, 세포 개체군, 또는 세포 개체군의 부분집합 내에 존재하는 RNA 전사체를 단리하고 분석할 수 있다. 특히, 일부 경우에, 바코드 올리고뉴클레오티드는 개별 세포로부터 RNA의 바코드화된 단편을 기폭하고, 복제하고, 그리고 결과적으로 산출하도록 설정될 수 있다. 가령, 일부 경우에, 바코드 올리고뉴클레오티드는 mRNA 특정한 기폭 서열, 예를 들면, 역전사 반응에서 mRNA의 기폭 및 복제를 허용하는 폴리-T 프라이머 분절 또는 다른 표적화된 기폭 서열을 포함할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 무작위 RNA 기폭은 바코드 올리고뉴클레오티드의 무작위 N-mer 프라이머 분절을 이용하여 수행될 수 있다.
도면 6은 본원에서 설명된 방법을 이용하여 개별 세포에서 RNA 발현 분석을 위한 한 가지 실례 방법의 계통도를 제공한다. 보여지는 바와 같이, 작업 602에서 세포 내포 표본은 생존가능 세포에 대해 분류되고, 이들은 차후 분할을 위해 정량되고 희석된다. 작업 604에서, 개별 세포는 본원에서 설명된 바와 같은 바코드화 올리고뉴클레오티드를 보유하는 겔 비드로 별개로 공분할된다. 세포는 용해되고, 그리고 바코드화된 올리고뉴클레오티드는 작업 606에서 파티션 내로 방출되는데, 여기서 이들은 예로서, mRNA의 폴리-A 꼬리에 상보적인 폴리-T 프라이머 서열에 의해서, 작업 608에서 mRNA와 상호작용하고 여기에 혼성화한다. 폴리-T 바코드 올리고뉴클레오티드를 기폭 서열로서 이용하여, 역전사 반응이 바코드 서열을 포함하는 mRNA의 cDNA 전사체를 합성하기 위해 작업 610에서 수행된다. 바코드화된 cDNA 전사체는 이후, 이들이 cDNA 서열 및 이의 연관된 바코드 서열(들)의 결정을 위해 핵산 염기서열결정 시스템 위에 배치되기 전에, 작업 612에서 예로서, PCR 과정을 이용한 추가 증폭, 작업 614에서 정제에 종속된다. 일부 경우에, 보여지는 바와 같이, 작업 602 내지 608은 시약이 그들의 본래 비말 또는 파티션 내에 남아있는 동안 일어날 수 있고, 반면 작업 612 내지 616은 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 612 내지 616을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다. 일부 경우에, 바코드 올리고뉴클레오티드는 유제가 파괴된 후 엑소뉴클레아제로 소화될 수 있다. 엑소뉴클레아제 활성은 프라이머 소화 이후에 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)에 의해 저해될 수 있다. 일부 경우에, 작업 610은 역전사 혼합물, 예를 들면, 역전사효소 및 연관된 시약의 공분할에 근거하여 파티션 내에서 수행될 수 있거나, 또는 이것은 대량으로 수행될 수 있다.
본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 바코드 올리고뉴클레오티드의 구조는 올리고뉴클레오티드 바코드 서열에 더하여 다수의 서열 요소를 포함할 수 있다. 앞서 설명된 바와 같은 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 한 가지 실례는 도면 7에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 702는 방출가능한 연쇄 706, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 704에 연계된다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 기능적 서열 708을 포함할 수 있는데, 이들은 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열 중에서 하나 또는 그 이상, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 P5 서열뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 R1 프라이머를 포함할 수 있다. 바코드 서열 710은 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. mRNA 특정한 기폭 서열, 예를 들면, 폴리-T 서열 712 역시 올리고뉴클레오티드 구조 내에 포함된다. 정착 서열 분절 714는 폴리-T 서열이 mRNA의 서열 단부에서 혼성화하도록 담보하기 위해 포함될 수 있다. 이러한 정착 서열은 뉴클레오티드의 무작위 짧은 서열, 예를 들면, 1-mer, 2-mer, 3-mer 또는 더욱 긴 서열을 포함할 수 있는데, 이것은 폴리-T 분절이 mRNA의 폴리-A 꼬리의 서열 단부에서 혼성화할 개연성이 더욱 높도록 담보할 것이다. 추가 서열 분절 716이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 추가 서열은 독특한 분자 서열 분절을 예로서, 무작위 서열 (가령, 예를 들면, 무작위 N-mer 서열)로서 제공하는데, 이것은 단일 비드에 연계된 개별 올리고뉴클레오티드에 걸쳐 변하고, 반면 바코드 서열 710은 개별 비드에 묶인 올리고뉴클레오티드 사이에서 일정할 수 있다. 이러한 독특한 서열은 본래 발현된 RNA의 숫자의 정량을 허용하기 위해, 포획되었던 시작 mRNA 분자의 독특한 식별자를 제공하는데 역할을 한다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다. 이러한 독특한 분자 서열 분절은 올리고뉴클레오티드의 서열 내에 5 내지 약 8개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 독특한 분자 서열 분절은 길이에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 독특한 분자 서열 분절은 길이에서 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 독특한 분자 서열 분절은 길이에서 기껏해야 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 또는 그 이하일 수 있다.
작업 동안, 그리고 도면 6 및 7에 관하여, 세포는 바코드 보유 비드와 함께 공분할되고 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출된다. 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 부분은 이후, mRNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 폴리-T 분절은 이후, mRNA의 역전사를 기폭하여 mRNA의 cDNA 전사체를 생산하지만, 이것은 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 708-716 각각을 포함한다. 다시 한 번, 올리고뉴클레오티드 702가 정착 서열 714를 포함하기 때문에, 이것은 mRNA의 폴리-A 꼬리의 서열 단부에 혼성화하고 역전사를 기폭할 개연성이 더욱 높을 것이다. 임의의 소정의 파티션 내에서, 개별 mRNA 분자의 모든 cDNA 전사체는 공통 바코드 서열 분절 710을 포함할 것이다. 하지만, 독특한 무작위 N-mer 서열을 포함함으로써, 소정의 파티션 내에 상이한 mRNA 분자로부터 만들어진 전사체는 이러한 독특한 서열에서 변할 것이다. 이것은 심지어, 소정의 파티션의 내용물의 임의의 차후 증폭 이후에도 인지가능할 수 있는 정량 특질을 제공한다, 예를 들면, 공통 바코드와 연관된 독특한 분절의 숫자는 단일 파티션 및 따라서, 단일 세포로부터 유래하는 mRNA의 양을 지시할 수 있다. 전술한 바와 같이, 전사체는 이후, mRNA의 cDNA 전사체의 서열을 확인할 뿐만 아니라 바코드 분절 및 독특한 서열 분절을 염기서열결정하기 위해 증폭되고, 청소되고, 염기서열결정된다.
본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 폴리-T 프라이머 서열이 설명되긴 하지만, 다른 표적화된 또는 무작위 기폭 서열 역시 역전사 반응을 기폭하는데 이용될 수 있다. 유사하게, 비록 바코드화된 올리고뉴클레오티드를 용해된 세포의 내용물과 함께 파티션 내로 방출하는 것으로 설명되긴 하지만, 일부 경우에, 겔 비드 결합된 올리고뉴클레오티드가 다른 세포 내용물로부터 RNA의 분리를 용이하게 하기 위해, 겔 비드의 고체상 상에서 mRNA를 혼성화하고 포획하는데 이용될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
전령 RNA (mRNA, 세포로부터 획득된 mRNA 포함) 분석을 비롯한 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 추가 실례는 도면 9A에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 902는 방출가능한 연쇄 906, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 904에 연계될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 P5 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 908뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 R1 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 910을 포함할 수 있다. 바코드 서열 912는 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. RNA 특정한 (가령, mRNA 특정한) 기폭 서열, 예를 들면, 폴리-T 서열 914 역시 올리고뉴클레오티드 구조 내에 포함된다. 정착 서열 분절 (도시되지 않음)은 폴리-T 서열이 mRNA의 서열 단부에서 혼성화하도록 담보하기 위해 포함될 수 있다. 추가 서열 분절 916이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 이러한 추가 서열은 독특한 분자 서열 분절을 예로서, 무작위 N-mer 서열로서 제공할 수 있는데, 이것은 단일 비드에 연계된 개별 올리고뉴클레오티드에 걸쳐 변하고, 반면 바코드 서열 912는 개별 비드에 묶인 올리고뉴클레오티드 사이에서 일정할 수 있다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 이러한 독특한 서열은 본래 발현된 RNA의 숫자의 정량, 예를 들면, mRNA 계수를 허용하기 위해, 포획되었던 시작 mRNA 분자의 독특한 식별자를 제공하는데 역할을 할 수 있다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다.
세포 RNA (가령, mRNA) 분석의 한 가지 실례 방법에서 및 도면 9A에 관하여, 세포는 바코드 보유 비드, 스위치 올리고 924, 그리고 다른 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 작업 950에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 902가 비드로부터 방출되고 (가령, 환원제의 작용을 통해), 그리고 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절 914는 이후, 세포로부터 방출되는 mRNA 920의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 952에서 폴리-T 분절 914는 mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 922를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 908, 912, 910, 916 및 914 각각을 포함한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. 스위치 올리고 924는 이후, cDNA 전사체에 부가된 추가 염기와 혼성화하고 주형 전환을 용이하게 할 수 있다. 스위치 올리고 서열에 상보적인 서열은 이후, 스위치 올리고 924를 주형으로서 이용한 cDNA 전사체 922의 연장을 통해 cDNA 전사체 922 내로 통합될 수 있다. 임의의 소정의 파티션 내에서, 개별 mRNA 분자의 모든 cDNA 전사체는 공통 바코드 서열 분절 912를 포함할 것이다. 하지만, 독특한 무작위 N-mer 서열 916을 포함함으로써, 소정의 파티션 내에 상이한 mRNA 분자로부터 만들어진 전사체는 이러한 독특한 서열에서 변할 것이다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 이것은 심지어, 소정의 파티션의 내용물의 임의의 차후 증폭 이후에도 인지가능할 수 있는 정량 특질을 제공한다, 예를 들면, 공통 바코드와 연관된 독특한 분절의 숫자는 단일 파티션 및 따라서, 단일 세포로부터 유래하는 mRNA의 양을 지시할 수 있다. 작업 952 이후에, cDNA 전사체 922는 이후, 작업 954에서 프라이머 926 (가령, PCR 프라이머)으로 증폭된다. 그 다음, 증폭된 산물은 이후, 작업 956에서 정제된다 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해). 작업 958에서, 증폭된 산물은 이후, 전단되고, 추가 기능적 서열에 결찰되고, 그리고 더욱 증폭된다 (가령, PCR을 통해). 기능적 서열은 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열 930, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 P7 서열뿐만 아니라 예로서, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 R2 프라이머에 대한 염기서열결정 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 928뿐만 아니라 표본 색인, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 i7 표본 색인 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 932를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 작업 950 및 952는 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 954, 956 및 958은 벌크 용액에서 (가령, 파티션 외부에서 모아진 혼합물에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 954, 956 및 958을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다. 일부 경우에, 작업 954는 파티션에서 완결될 수 있다. 일부 경우에, 바코드 올리고뉴클레오티드는 유제가 파괴된 후 엑소뉴클레아제로 소화될 수 있다. 엑소뉴클레아제 활성은 프라이머 소화 이후에 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)에 의해 저해될 수 있다. 비록 일정한 염기서열결정 시스템, 예를 들면, Illumina 시스템에 대해 이용된 특정한 서열 참조의 면에서 설명되긴 하지만, 이들 서열에 대한 참조는 단지 예시를 목적으로 하고, 그리고 본원에서 설명된 방법은 이들 시스템에서 이용되는 특정한 기폭, 부착, 색인 및 다른 작업 순서를 통합하는 다른 염기서열결정 시스템, 예를 들면, Ion Torrent, Oxford Nanopore, Genia, Pacific Biosciences, Complete Genomics 등으로부터 가용한 시스템용으로 설정될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
도면 9A에서 보여지는 바와 같이 RNA (가령, 세포 RNA) 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 대안적 실례에서, 기능적 서열 908은 P7 서열일 수 있고 기능적 서열 910은 R2 프라이머 결합 부위일 수 있다. 게다가, 기능적 서열 930은 P5 서열일 수 있고, 기능적 서열 928은 R1 프라이머 결합 부위일 수 있고, 그리고 기능적 서열 932는 Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 i5 표본 색인 서열일 수 있다. 이런 바코드 올리고뉴클레오티드에 의해 산출된 구조체의 형상은 염기서열결정 동안 폴리-T 서열의 염기서열결정을 최소화하는데 (또는 방지하는데) 도움을 줄 수 있다.
도면 9B에는 세포 mRNA 분석을 비롯한 RNA 분석을 위한 다른 실례 방법이 도시된다. 이러한 방법에서, 스위치 올리고 924는 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께, 개별 세포 및 바코드화된 비드로 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 스위치 올리고 924는 추가 태그 934, 예를 들면, 비오틴으로 표지화될 수 있다. 작업 951에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 902 (가령, 도면 9A에서 보여지는 바와 같이)가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 일부 경우에, 서열 908은 P7 서열이고, 그리고 서열 910은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 908은 P5 서열이고, 그리고 서열 910은 R1 프라이머 결합 부위이다. 그 다음, 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절 914는 세포로부터 방출되는 mRNA 920의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 작업 953에서 폴리-T 분절 914는 이후, mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 922를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 908, 912, 910, 916 및 914 각각을 포함한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. 스위치 올리고 924는 이후, cDNA 전사체와 혼성화하고 주형 전환을 용이하게 할 수 있다. 스위치 올리고 서열에 상보적인 서열은 이후, 스위치 올리고 924를 주형으로서 이용한 cDNA 전사체 922의 연장을 통해 cDNA 전사체 922 내로 통합될 수 있다. 그 다음, 단리 작업 960이 파티션 내에 시약 및 올리고뉴클레오티드로부터 cDNA 전사체 922를 단리하는데 이용될 수 있다. 추가 태그 934, 예를 들면, 비오틴은 자성 비드 938에 부착될 수 있는 상호작용 태그 936, 예를 들면, 스트렙타비딘과 접촉될 수 있다. 작업 960에서 cDNA는 작업 955에서 증폭 (가령, PCR을 통해) 전에 풀다운 작업 (가령, 자성 분리, 원심분리를 통해)으로 단리되고, 그 이후에 작업 957에서 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해)되고 작업 959에서 추가 처리 (전단, 서열 928, 932 및 930의 결찰, 그리고 차후 증폭 (가령, PCR을 통해))될 수 있다. 서열 908이 P7 서열이고 서열 910이 R2 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P5 서열이고, 서열 928은 R1 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i5 표본 색인 서열이다. 서열 908이 P5 서열이고 서열 910이 R1 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P7 서열이고, 서열 928은 R2 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i7 표본 색인 서열이다. 일부 경우에, 보여지는 바와 같이, 작업 951 및 953은 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 960, 955, 957 및 959은 벌크 용액에서 (가령, 파티션 외부에서 모아진 혼합물에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 960을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다. 이후, 작업 955, 957 및 959는 전사체가 처리를 위해 모아진 후, 작업 960 이후에 수행될 수 있다.
도면 9C에는 세포 mRNA 분석을 비롯한 RNA 분석을 위한 다른 실례 방법이 도시된다. 이러한 방법에서, 스위치 올리고 924는 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께, 개별 세포 및 바코드화된 비드로 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내에서 공분할된다. 작업 961에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 902 (가령, 도면 9A에서 보여지는 바와 같이)가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 일부 경우에, 서열 908은 P7 서열이고, 그리고 서열 910은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 908은 P5 서열이고, 그리고 서열 910은 R1 프라이머 결합 부위이다. 그 다음, 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절 914는 이후, 세포로부터 방출되는 mRNA 920의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 963에서 폴리-T 분절 914는 이후, mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 922를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 908, 912, 910, 916 및 914 각각을 포함한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. 스위치 올리고 924는 이후, cDNA 전사체와 혼성화하고 주형 전환을 용이하게 할 수 있다. 스위치 올리고 서열에 상보적인 서열은 이후, 스위치 올리고 924를 주형으로서 이용한 cDNA 전사체 922의 연장을 통해 cDNA 전사체 922 내로 통합될 수 있다. 작업 961 및 작업 963 이후에, mRNA 920 및 cDNA 전사체 922는 작업 962에서 변성된다. 작업 964에서, 두 번째 가닥은 추가 태그 942, 예를 들면, 비오틴을 갖는 프라이머 940로부터 연장되고, 그리고 cDNA 전사체 922에 혼성화된다. 또한 작업 964에서, 비오틴 표지화된 두 번째 가닥은 자성 비드 938에 부착될 수 있는 상호작용 태그 936, 예를 들면, 스트렙타비딘과 접촉될 수 있다. cDNA는 작업 965에서 증폭 (가령, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해) 전에 풀다운 작업 (가령, 자성 분리, 원심분리를 통해)으로 단리되고, 그 이후에 작업 967에서 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해)되고 작업 969에서 추가 처리 (전단, 서열 928, 932 및 930의 결찰, 그리고 차후 증폭 (가령, PCR을 통해))될 수 있다. 서열 908이 P7 서열이고 서열 910이 R2 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P5 서열이고, 서열 928은 R1 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i5 표본 색인 서열이다. 서열 908이 P5 서열이고 서열 910이 R1 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P7 서열이고, 서열 928은 R2 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i7 표본 색인 서열이다. 일부 경우에, 작업 961 및 963은 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 962, 964, 965, 967 및 969는 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 962, 964, 965, 967 및 969을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다.
도면 9D에는 세포 mRNA 분석을 비롯한 RNA 분석을 위한 다른 실례 방법이 도시된다. 이러한 방법에서, 스위치 올리고 924는 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께, 개별 세포 및 바코드화된 비드로 공분할된다. 작업 971에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 902 (가령, 도면 9A에서 보여지는 바와 같이)가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 일부 경우에, 서열 908은 P7 서열이고, 그리고 서열 910은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 908은 P5 서열이고, 그리고 서열 910은 R1 프라이머 결합 부위이다. 그 다음, 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절 914는 이후 세포로부터 방출되는 mRNA 920의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 973에서 폴리-T 분절 914는 이후, mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 922를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 908, 912, 910, 916 및 914 각각을 포함한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. 스위치 올리고 924는 이후, cDNA 전사체와 혼성화하고 주형 전환을 용이하게 할 수 있다. 스위치 올리고 서열에 상보적인 서열은 이후, 스위치 올리고 924를 주형으로서 이용한 cDNA 전사체 922의 연장을 통해 cDNA 전사체 922 내로 통합될 수 있다. 작업 966에서, mRNA 920, cDNA 전사체 922 및 스위치 올리고 924는 변성될 수 있고, 그리고 cDNA 전사체 922는 추가 태그 946, 예를 들면, 비오틴으로 표지화된 포획 올리고뉴클레오티드 944로 혼성화될 수 있다. 이러한 작업에서, cDNA 전사체에 혼성화되는 비오틴-표지화된 포획 올리고뉴클레오티드 944는 자성 비드 938에 부착될 수 있는 상호작용 태그 936, 예를 들면, 스트렙타비딘과 접촉될 수 있다. 풀다운 작업 (가령, 자성 분리, 원심분리를 통해)을 이용한 다른 종류 (가령, 과잉 바코드화된 올리고뉴클레오티드)로부터 분리 이후에, cDNA 전사체는 작업 975에서 프라이머 926으로 증폭되고 (가령, PCR을 통해), 그 이후에 작업 977에서 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해)되고 작업 979에서 추가 처리 (전단, 서열 928, 932 및 930의 결찰, 그리고 차후 증폭 (가령, PCR을 통해))될 수 있다. 서열 908이 P7 서열이고 서열 910이 R2 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P5 서열이고, 서열 928은 R1 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i5 표본 색인 서열이다. 서열 908이 P5 서열이고 서열 910이 R1 프라이머 결합 부위인 다른 경우에, 서열 930은 P7 서열이고, 서열 928은 R2 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i7 표본 색인 서열이다. 일부 경우에, 작업 971 및 973은 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 966, 975, 977 (정제) 및 979는 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 966, 975, 977 및 979을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다.
도면 9E에는 세포 RNA 분석을 비롯한 RNA 분석을 위한 다른 실례 방법이 도시된다. 이러한 방법에서, 개별 세포는 바코드 보유 비드, 스위치 올리고 990, 그리고 다른 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 작업 981에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 (가령, 도면 9A에서 보여지는 바와 같이 902)가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 일부 경우에, 서열 908은 P7 서열이고, 그리고 서열 910은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 908은 P5 서열이고, 그리고 서열 910은 R1 프라이머 결합 부위이다. 그 다음, 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절은 이후, 세포로부터 방출된 mRNA 920의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 983에서 폴리-T 분절 914는 이후, 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 922를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 908, 912, 910, 916 및 914 각각을 포함한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. 스위치 올리고 990은 이후, cDNA 전사체와 혼성화하고 주형 전환을 용이하게 할 수 있다. 스위치 올리고 서열에 상보적이고 T7 프로모터 서열을 포함하는 서열은 cDNA 전사체 922 내로 통합될 수 있다. 작업 968에서, 두 번째 가닥이 합성되고, 그리고 작업 970에서 T7 프로모터 서열이 T7 중합효소에 의해 이용되어 시험관내 전사에서 RNA 전사체가 생산될 수 있다. 작업 985에서 RNA 전사체가 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해)되고, 역전사되어 DNA 전사체를 형성할 수 있고, 그리고 두 번째 가닥이 각각의 DNA 전사체에 대해 합성될 수 있다. 일부 경우에, 정제에 앞서, RNA 전사체는 잔여 DNA를 분해하기 위해 DNA분해효소 (가령, DNAase I)와 접촉될 수 있다. 작업 987에서 DNA 전사체는 이후, 단편화되고, 추가 기능적 서열, 예를 들면, 서열 928, 932 및 930에 결찰되고, 그리고 일부 경우에, 더욱 증폭된다 (가령, PCR을 통해). 서열 908이 P7 서열이고 서열 910이 R2 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P5 서열이고, 서열 928은 R1 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i5 표본 색인 서열이다. 서열 908이 P5 서열이고 서열 910이 R1 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P7 서열이고, 서열 928은 R2 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i7 표본 색인 서열이다. 일부 경우에, DNA 전사체의 일부를 제거하기에 앞서, 이들 DNA 전사체는 잔여 RNA를 분해하기 위해 RNA분해효소와 접촉될 수 있다. 일부 경우에, 작업 981 및 983은 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 968, 970, 985 및 987은 대량으로 (가령, 파티션의 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 968, 970, 985 및 987을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다.
전령 RNA (mRNA, 세포로부터 획득된 mRNA 포함) 분석을 비롯한 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 다른 실례는 도면 10에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 1002는 방출가능한 연쇄 1006, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 1004에 연계된다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열, 예를 들면, P7 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1008뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, R2 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 1010을 포함할 수 있다. 바코드 서열 1012는 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. RNA 특정한 (가령, mRNA 특정한) 기폭 서열, 예를 들면, 폴리-T 서열 1014가 올리고뉴클레오티드 구조 내에 포함될 수 있다. 정착 서열 분절 (도시되지 않음)은 폴리-T 서열이 mRNA의 서열 단부에서 혼성화하도록 담보하기 위해 포함될 수 있다. 추가 서열 분절 1016이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 이러한 추가 서열은 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 독특한 분자 서열 분절을 제공할 수 있다. 추가 기능적 서열 1020, 예를 들면, T7 RNA 중합효소 프로모터 서열이 시험관내 전사를 위해 포함될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다.
세포 RNA 분석의 한 가지 실례 방법에서 및 도면 10에 관하여, 세포는 바코드 보유 비드, 그리고 다른 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 작업 1050에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 1002가 비드로부터 방출되고 (가령, 환원제의 작용을 통해), 그리고 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절 1014는 이후, mRNA 1020의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 1052에서 폴리-T 분절은 이후, mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA의 cDNA 전사체 1022를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 1020, 1008, 1012, 1010, 1016 및 1014 각각을 포함한다. 임의의 소정의 파티션 내에서, 개별 mRNA 분자의 모든 cDNA 전사체는 공통 바코드 서열 분절 1012를 포함할 것이다. 하지만, 독특한 무작위 N-mer 서열을 포함함으로써, 소정의 파티션 내에 상이한 mRNA 분자로부터 만들어진 전사체는 이러한 독특한 서열에서 변할 것이다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 이것은 심지어, 소정의 파티션의 내용물의 임의의 차후 증폭 이후에도 인지가능할 수 있는 정량 특질을 제공한다, 예를 들면, 공통 바코드와 연관된 독특한 분절의 숫자는 단일 파티션 및 따라서, 단일 세포로부터 유래하는 mRNA의 양을 지시할 수 있다. 작업 1054에서, 두 번째 가닥이 합성되고, 그리고 작업 1056에서 T7 프로모터 서열이 T7 중합효소에 의해 이용되어 시험관내 전사에서 RNA 전사체가 생산될 수 있다. 작업 1058에서 전사체는 단편화되고 (가령, 전단되고), 추가 기능적 서열에 결찰되고, 그리고 역전사된다. 기능적 서열은 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열 1030, 예를 들면, P5 서열뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머, 예를 들면, R1 프라이머 결합 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1028뿐만 아니라 표본 색인, 예를 들면, i5 표본 색인 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1032를 포함할 수 있다. 작업 1060에서, RNA 전사체는 DNA로 역전사될 수 있고, 상기 DNA는 mRNA의 cDNA 전사체의 서열을 확인할 뿐만 아니라 바코드 분절 및 독특한 서열 분절을 염기서열결정하기 위해 증폭 (가령, PCR을 통해)되고 염기서열결정된다. 일부 경우에, 작업 1050 및 1052는 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 1054, 1056, 1058 및 1060은 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 1054, 1056, 1058 및 1060을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다.
도면 10에서 보여지는 바와 같이 RNA (가령, 세포 RNA) 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 대안적 실례에서, 기능적 서열 1008은 P5 서열일 수 있고 기능적 서열 1010은 R1 프라이머 결합 부위일 수 있다. 게다가, 기능적 서열 1030은 P7 서열일 수 있고, 기능적 서열 1028은 R2 프라이머 결합 부위일 수 있고, 그리고 기능적 서열 1032는 i7 표본 색인 서열일 수 있다.
전령 RNA (mRNA, 세포로부터 획득된 mRNA 포함) 분석을 비롯한 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 추가 실례는 도면 11에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 1102는 방출가능한 연쇄 1106, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 1104에 연계된다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열, 예를 들면, P5 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1108뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, R1 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 1110을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 서열 1108은 P7 서열이고, 그리고 서열 1110은 R2 프라이머 결합 부위이다. 바코드 서열 1112는 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. 추가 서열 분절 1116이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 추가 서열은 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 독특한 분자 서열 분절을 제공할 수 있다. 추가 서열 1114, 예를 들면, 폴리G가 주형 전환을 용이하게 하기 위해 포함될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다.
세포 mRNA 분석의 한 가지 실례 방법에서 및 도면 11에 관하여, 세포는 바코드 보유 비드, 폴리-T 서열, 그리고 다른 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 작업 1150에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출되고 (가령, 환원제의 작용을 통해), 그리고 폴리-T 서열은 세포로부터 방출된 mRNA 1120의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 1152에서 폴리-T 서열은 이후, mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 1122를 생산한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. cDNA 전사체에 부가된 추가 염기, 예를 들면, 폴리C는 이후, 바코드화된 올리고뉴클레오티드의 1114와 혼성화할 수 있다. 이것은 주형 전환을 용이하게 할 수 있고, 그리고 바코드 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열은 cDNA 전사체 내로 통합될 수 있다. 전사체는 더욱 처리되고 (가령, 증폭되거나, 부분 제거되거나, 추가 서열 부가되거나, 기타 등등), 그리고 예로서, 염기서열결정함으로써 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 특징화될 수 있다. 이런 방법에 의해 산출된 구조체의 형상은 염기서열결정 동안 폴리-T 서열의 염기서열결정을 최소화하는데 (또는 방지하는데) 도움을 줄 수 있다.
세포 RNA 분석을 비롯한 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 추가 실례는 도면 12A에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 1202는 방출가능한 연쇄 1206, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 1204에 연계된다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열, 예를 들면, P5 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1208뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, R1 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 1210을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 서열 1208은 P7 서열이고, 그리고 서열 1210은 R2 프라이머 결합 부위이다. 바코드 서열 1212는 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. 추가 서열 분절 1216이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 추가 서열은 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 독특한 분자 서열 분절을 제공할 수 있다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다. 이러한 바코드를 이용한 세포 RNA 분석의 한 가지 실례 방법에서, 세포는 바코드 보유 비드, 그리고 다른 시약, 예를 들면, RNA 리가아제 및 환원제와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 바코드화된 올리고뉴클레오티드는 이후, 파티션 내에 있는 동안 RNA 리가아제에 의해 mRNA 전사체의 5' 단부에 결찰될 수 있다. 차후 작업은 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해) 및 추가 처리 (전단, 기능적 서열의 결찰 및 차후 증폭 (가령, PCR을 통해))를 포함할 수 있고, 그리고 이들 작업은 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 추가 작업을 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다.
세포 RNA 분석을 비롯한 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 추가 실례는 도면 12B에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 1222는 방출가능한 연쇄 1226, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 1224에 연계된다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열, 예를 들면, P5 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1228뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, R1 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 1230을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 서열 1228은 P7 서열이고, 그리고 서열 1230은 R2 프라이머 결합 부위이다. 바코드 서열 1232는 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. 기폭 서열 1234 (가령, 무작위 기폭 서열) 역시 올리고뉴클레오티드 구조, 예를 들면, 무작위 헥사머 내에 포함될 수 있다. 추가 서열 분절 1236이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 추가 서열은 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 독특한 분자 서열 분절을 제공한다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다. 도면 12B의 바코드 올리고뉴클레오티드를 이용한 세포 mRNA 분석의 한 가지 실례 방법에서, 세포는 바코드 보유 비드 및 추가 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 일부 경우에, 서열 1228은 P7 서열이고, 그리고 서열 1230은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 1228은 P5 서열이고, 그리고 서열 1230은 R1 프라이머 결합 부위이다. 무작위 헥사머의 기폭 서열 1234는 세포 mRNA에 무작위로 혼성화할 수 있다. 무작위 헥사머 서열은 이후, 세포로부터 mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체를 생산할 수 있고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 1228, 1232, 1230, 1236 및 1234 각각을 포함한다. 차후 작업은 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해) 및 추가 처리 (전단, 기능적 서열의 결찰 및 차후 증폭 (가령, PCR을 통해))를 포함할 수 있고, 그리고 이들 작업은 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 추가 작업을 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다. 바코드 보유 비드와 함께 공분할될 수 있는 추가 시약은 리보솜 RNA (rRNA)를 차단하기 위한 올리고뉴클레오티드 및 세포로부터 유전체 DNA와 cDNA를 소화하기 위한 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 대안으로, rRNA 제거 작용제는 추가 처리 작업 동안 적용될 수 있다. 이런 방법에 의해 산출된 구조체의 형상은 염기서열결정 동안 폴리-T 서열의 염기서열결정을 최소화하는데 (또는 방지하는데) 도움을 줄 수 있다.
본원에서 설명된 단일 세포 분석 방법은 또한, 전체 전사체의 분석에서 유용할 수 있다. 도면 12B의 바코드를 다시 참조하면, 기폭 서열 1234는 무작위 N-mer일 수 있다. 일부 경우에, 서열 1228은 P7 서열이고, 그리고 서열 1230은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 1228은 P5 서열이고, 그리고 서열 1230은 R1 프라이머 결합 부위이다. 이러한 바코드를 이용한 전체 전사체 분석의 한 가지 실례 방법에서, 개별 세포는 바코드 보유 비드, 폴리-T 서열, 그리고 다른 시약, 예를 들면, 역전사효소, 중합효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 이러한 방법의 작업에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출되고 (가령, 환원제의 작용을 통해), 그리고 폴리-T 서열은 세포 mRNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서, 세포 mRNA의 cDNA 전사체가 생산될 수 있다. RNA는 이후, RNA분해효소로 분해될 수 있다. 바코드화된 올리고뉴클레오티드 내에 기폭 서열 1234는 이후, cDNA 전사체에 무작위로 혼성화할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 도면 3 (패널 F)에서 도시된 실례 증폭 산물과 유사한 증폭 산물 (가령, 바코드화된 단편)을 산출하기 위해, 도면 3에서 보여지는 바와 유사하게 비드 및 세포로 공분할된 중합효소 효소 및 다른 연장 시약을 이용하여 확장될 수 있다. 바코드화된 핵산 단편은 일부 경우에, 추가 처리 (가령, 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 증폭, 추가 서열의 부가, 청소 과정 등)에 종속되고 예로서, 서열 분석을 통해 특징화될 수 있다. 이러한 작업에서, 염기서열결정 신호는 전장 RNA에서 비롯될 수 있다.
비록 다양한 바코드 설계로 작업이 개별적으로 논의되긴 했지만, 개별 비드는 동시적 이용을 위해 다양한 설계의 바코드 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
더욱 큰 개체군으로부터 개별 세포 또는 세포 아개체군을 특징짓는 것에 더하여, 본원에서 설명된 과정 및 시스템은 또한, 세포, 또는 다른 생물체 개체군의 전체 프로필을 제공하기 위한 방식으로서 개별 세포를 특징짓는데 이용될 수 있다. 다양한 적용은 예로서, 마이크로바이옴 분석 및 특징화, 환경적 시험, 식품 안전성 시험, 예로서 오염을 추적하는 역학적 분석, 또는 기타 유사한 것을 비롯하여, 세포 개체군 내에 상이한 세포 또는 생물체 유형의 존재의 평가 및 정량을 필요로 한다. 특히, 앞서 설명된 분석 과정은 개체군 내에 다수의 개별 세포를 개별적으로 특징짓고, 염기서열결정하고 및/또는 확인하는데 이용될 수 있다. 이러한 특징화는 이후, 기원하는 개체군의 전체 프로필을 집합시키는데 이용될 수 있는데, 이것은 중요한 예후 및 진단 정보를 제공할 수 있다.
가령, 예로서 소화관, 협측, 표피 마이크로바이옴 등을 비롯한 인간 마이크로바이옴에서 변동은 상이한 질환 또는 전반적인 건강 상태를 진단할 뿐만 아니라 예측하는 것으로 확인되었다. 본원에서 설명된 단일 세포 분석 방법 및 시스템을 이용하여, 다시 한 번, 전체 개체군에서 개별 세포를 특징짓고, 염기서열결정하고, 확인할 수 있고, 그리고 진단적으로 유관한 인자를 지시할 수 있는 상기 개체군 내에 변동을 확인할 수 있다. 실례로서, 세균 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기서열결정은 세균의 분류학적 분류를 위한 고도로 정확한 방법으로서 이용되었다. 앞서 설명된 표적화된 증폭 및 염기서열결정 과정을 이용하는 것은 세포 개체군 내에 개별 세포의 확인을 제공할 수 있다. 현재 상태 또는 시간의 추이에서 상태의 변동을 확인하기 위해 개체군 내에 상이한 세포의 숫자를 더욱 정량할 수 있다. 가령, Morgan et al, PLoS Comput. Biol., Ch. 12, December 2012, 8(12):e1002808, 그리고 Ram et al., Syst. Biol. Reprod. Med., June 2011, 57(3):162-170을 참조하고, 이들은 각각 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 유사하게, 감염 또는 잠재적 감염의 확인 및 진단 역시 예로서, 앞서 설명된 환경뿐만 아니라 임의의 다른 진단적으로 유관한 환경, 예를 들면, 뇌척수액, 혈액, 대변 또는 장관 표본, 또는 기타 유사한 것을 비롯하여, 다른 세포 또는 다른 생물학적 물질, 세포 및/또는 핵산의 큰 혼합물 내에 존재하는 미생물 종류를 확인하기 위한 본원에서 설명된 단일 세포 분석으로부터 이익을 얻을 수 있다.
전술한 분석은 또한, 소정의 표본 내에 세포 개체군을 교차하여 상이한 내성 마커/돌연변이의 분포 및 프로파일링의 분석을 통해, 상이한 세포, 예를 들면, 암 세포, 세균 병원체 등의 잠재적 약제 내성의 특징화에 특히 유용할 수 있다. 추가적으로, 시간의 추이에서 세포 개체군을 교차하여 이들 마커/돌연변이에서 변동의 특징화는 이런 약제 내성 문제에 의해 특징화되는 다양한 질환의 진행, 변경, 예방, 그리고 치료에 관한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있다.
비록 세포의 면에서 설명되지만, 예로서 세포, 바이러스, 소기관, 세포 봉입체, 소포, 또는 기타 유사한 것을 비롯한 임의의 다양한 개별 생물학적 생물체, 또는 생물체의 성분은 이러한 설명 내에 포괄되는 것으로 인지될 것이다. 추가적으로, 세포를 참조하는 경우에, 이런 참조는 단일 세포 또는 다세포 생물체로부터 유래되는 지에 상관없이, 원핵 세포, 진핵 세포, 세균, 진균, 식물, 포유류, 또는 다른 동물 세포 유형, 미코플라스마, 정상적인 조직 세포, 종양 세포, 또는 임의의 다른 세포 유형을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 유형의 세포를 포함하는 것으로 인지될 것이다.
유사하게, 이런 표본 내에 존재하는 미생물 생물체, 바이러스, 또는 다른 생물학적 오염체를 프로파일링하기 위한 상이한 환경적 표본의 분석은 질환 역학에 관한 중요한 정보를 제공하고, 그리고 질환 발생, 전염병 및 유행병을 잠재적으로 예측하는데 보조할 수 있다.
앞서 설명된 바와 같이, 본원에서 설명된 방법, 시스템 및 조성물은 또한, 개별 세포 또는 세포 개체군의 다른 양상의 분석 및 특징화에 이용될 수 있다. 한 가지 실례 과정에서, 세포 표면 단백질에 대해 분석되고 특징화되는 세포를 내포하는 표본이 제공된다. 항체의 라이브러리, 항체 단편, 또는 세포가 특징화되는 세포 표면 단백질 또는 항원 (또는 다른 세포 특질)에 대한 결합 친화성을 갖는 다른 분자 (본원에서 세포 표면 특질 결합 기로서 또한 지칭됨) 역시 제공된다. 논의의 용이함을 위해, 이들 친화성 기는 본원에서 결합 기로서 지칭된다. 결합 기는 이러한 결합 기가 결합하는 세포 표면 특질을 지시하는 리포터 분자를 포함할 수 있다. 특히, 한 가지 유형의 세포 표면 특질에 특이적인 결합 기 유형은 첫 번째 리포터 분자를 포함할 것이고, 반면 상이한 세포 표면 특질에 특이적인 결합 기 유형은 이것과 연관된 상이한 리포터 분자를 가질 것이다. 일부 양상에서, 이들 리포터 분자는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 올리고뉴클레오티드 기초된 리포터 분자는 서열의 면에서 유의미한 다양성을 산출할 수 있고, 그리고 또한, 대부분의 생체분자, 예를 들면, 항체 등에 쉽게 부착가능할 뿐만 아니라 예로서, 염기서열결정 또는 어레이 기술을 이용하여 쉽게 검출될 수 있는 이점을 제공한다. 실례 과정에서, 결합 기는 그들에 부착된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 첫 번째 결합 기 유형, 예를 들면, 첫 번째 유형의 세포 표면 특질에 대한 항체는 첫 번째 뉴클레오티드 서열을 갖는 리포터 올리고뉴클레오티드를 이것과 연관시킬 것이다. 상이한 결합 기 유형, 예를 들면, 다른, 상이한 세포 표면 특질에 대한 결합 친화성을 갖는 항체는 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 예를 들면, 부분적으로 또는 완전하게 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 리포터 올리고뉴클레오티드를 그것과 연관시킬 것이다. 일부 경우에, 각 유형의 세포 표면 특질 결합 기, 예를 들면, 항체 또는 항체 단편에서, 리포터 올리고뉴클레오티드 서열은 공지되고, 그리고 공지된 세포 표면 특질 결합 기와 연관되는 것으로 쉽게 인지가능하다. 이들 올리고뉴클레오티드는 결합 기에 직접적으로 연계될 수 있거나, 또는 이들은 비드, 분자 격자, 예를 들면, 선형, 구형, 교차연결된, 또는 다른 중합체, 또는 결합 기에 부착되거나 또는 달리 연관되는 다른 프레임워크에 부착될 수 있는데, 이것은 단일 결합 기에 복수 리포터 올리고뉴클레오티드의 부착을 허용한다.
단일 결합 기에 연계된 복수의 리포터 분자의 경우에, 이런 리포터 분자는 동일한 서열을 포함할 수 있거나, 또는 특정 결합 기는 리포터 올리고뉴클레오티드 서열의 공지된 세트를 포함할 것이다. 예로서, 상이한 세포 표면 특질에 특정한 상이한 결합 기 사이에서, 리포터 분자는 상이하고 특정 결합 기에 기인할 수 있다.
결합 기에 리포터 기의 부착은 다양한 직접적인 또는 간접적인, 공유 또는 비공유 연관 또는 부착 중에서 한 가지를 통해 달성될 수 있다. 가령, 항체 기초된 결합 기와 연관된 올리고뉴클레오티드 리포터 기의 경우에, 이런 올리고뉴클레오티드는 화학적 접합 기술 (가령, Innova Biosciences로부터 가용한 Lightning-Link® 항체 표지화 키트)뿐만 아니라 예로서, 아비딘 또는 스트렙타비딘 링커와 함께 비오틴화된 항체 및 올리고뉴클레오티드 (또는 올리고뉴클레오티드에 연계된, 하나 또는 그 이상의 비오틴화된 링커를 포함하는 비드)를 이용한 다른 비공유 부착 기전을 이용하여 항체 또는 항체 단편의 부분에 공유 부착될 수 있다. 항체 및 올리고뉴클레오티드 비오티닐화 기술은 가용하다 (가령, 전체 개시가 전체적으로 모든 점에서 본원에 참조로서 편입되는 Fang, et al., Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labeling and Affinity Purification of Synthetic Oligonucleotides, Nucleic Acids Res. Jan 15, 2003; 31(2):708-715를 참조, DNA 3' 단부 비오티닐화 키트, Thermo Scientific로부터 가용). 유사하게, 단백질 및 펩티드 비오티닐화 기술이 개발되었고 쉽게 가용하다 (가령, U.S. 특허 번호 6,265,552를 참조하고, 이의 전체 개시는 전체적으로 모든 점에서 본원에 참조로서 편입된다).
원하는 리포터 분자 또는 소정의 분석의 다양성, 이용된 서열 검출 계획, 기타 등등에 따라, 임의의 범위의 상이한 길이를 갖는 리포터 올리고뉴클레오티드가 제공될 수 있다. 일부 경우에, 이들 리포터 서열은 길이에서 약 5개 뉴클레오티드보다 크거나, 길이에서 약 10개 뉴클레오티드보다 크거나, 길이에서 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150 또는 심지어 200개 뉴클레오티드보다 클 수 있다. 일부 경우에, 이들 리포터 뉴클레오티드는 길이에서 약 250개 뉴클레오티드보다 작거나, 길이에서 약 200, 180, 150, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 또는 심지어 30개 뉴클레오티드보다 작을 수 있다. 많은 경우에, 리포터 올리고뉴클레오티드는 미리 크기산정되고, 그리고 만약 그렇지 않으면, 염기서열결정 시스템에서 분석되도록 설정되는 바코드화된 산물을 제공하도록 선별될 수 있다. 가령, 이들 서열은 특정 염기서열결정 시스템에 대한 원하는 길이의 염기서열결정가능 산물을 이상적으로 창출하는 길이에서 제공될 수 있다. 유사하게, 이들 리포터 올리고뉴클레오티드는 리포터 서열에 더하여, 추가 서열 요소, 예를 들면, 서열분석기 부착 서열, 염기서열결정 프라이머 서열, 증폭 프라이머 서열, 또는 이들 중에서 한 가지에 대한 보체를 포함할 수 있다.
작업 동안, 세포-내포 표본은 분석이 요망되는 임의의 세포 표면 특질을 위해, 결합 분자 및 그들의 연관된 리포터 올리고뉴클레오티드와 함께 배양된다. 배양 이후에, 세포는 결합되지 않은 결합 기를 제거하기 위해 세척된다. 세척 이후에, 세포는 앞서 설명된 바코드 운반 비드와 함께, 별개의 파티션, 예를 들면, 비말 내로 분할되는데, 여기서 각 파티션은 제한된 숫자의 세포, 예를 들면, 일부 경우에, 단일 세포를 포함한다. 비드로부터 바코드를 방출 시에, 이들은 리포터 올리고뉴클레오티드의 증폭 및 바코드화를 기폭할 것이다. 전술한 바와 같이, 리포터 분자의 바코드화된 복제물은 기능적 서열, 예를 들면, 프라이머 서열, 부착 서열 또는 기타 유사한 것을 부가적으로 포함할 수 있다.
바코드화된 리포터 올리고뉴클레오티드는 이후, 어떤 리포터 올리고뉴클레오티드가 파티션 내에서 세포에 결합되는 지를 확인하기 위한 서열 분석에 종속된다. 게다가, 연관된 바코드 서열을 또한 염기서열결정함으로써, 소정의 세포 표면 특질이 리포터 서열이 동일한 바코드 서열을 포함하는 다른 상이한 세포 표면 특질에서와 동일한 세포로부터 아마도 비롯되었다는 것을 확인할 수 있다, 다시 말하면, 이들은 동일한 파티션으로부터 유래되었다.
바코드 서열의 존재에 근거하여 개별 파티션에서 나오는 리포터 분자에 기초하여, 세포 개체군으로부터 개별 세포의 세포 표면 프로필을 창출할 수 있다. 개별 세포 또는 세포 개체군의 프로필은 세포 표면 특질에서 변이를 확인하기 위해 다른 세포, 예를 들면, '정상적인' 세포로부터 프로필과 비교될 수 있는데, 이것은 진단적으로 유관한 정보를 제공할 수 있다. 특히, 이들 프로필은 세포 표면 수용체에서 변이에 의해 특징화되는 다양한 장애, 예를 들면, 암 및 다른 장애의 진단에서 특히 유용할 수 있다.
IV. 장치 및 시스템
세포를 앞서 설명된 바와 같이 분할하는데 이용되는 미소유체 장치 역시 본원에서 제공된다. 이런 미소유체 장치는 분할 과정, 예를 들면, 도면 1 및 2에서 진술된 것들을 수행하기 위한 통로 네트워크를 포함할 수 있다. 특히 유용한 미소유체 장치의 실례는 2014년 4월 4일자에 제출되고, 그리고 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는 U.S. 특허가출원 번호 61/977,804에서 설명된다. 간단히 말하면, 이들 미소유체 장치는 세포를 별개의 파티션 내로 분할하고, 그리고 이런 세포를 예로서, 비드 상에 배치된 올리고뉴클레오티드 바코드 라이브러리 구성원으로 공분할하기 위한 통로 네트워크, 예를 들면, 본원에서 설명된 것들을 포함할 수 있다. 이들 통로 네트워크는 이들 통로가 규정되는 고형 몸체, 예를 들면, 유리, 반도체 또는 중합체 몸체 구조 내에 배치될 수 있는데, 여기서 이들 통로는 그들의 말단에서, 통로 네트워크의 출력으로부터 다양한 입력 유체를 제공받기 위해, 그리고 분할된 세포의 궁극적 침적을 위해, 기타 등등을 위해 저장소와 연통한다. 실례로서, 그리고 도면 2에 관하여, 통로 202에 유동적으로 연계된 저장소는 세포의 수성 현탁액 214가 제공될 수 있고, 반면 통로 204에 연계된 저장소는 올리고뉴클레오티드를 운반하는 비드 216의 수성 현탁액이 제공될 수 있다. 통로 세그먼트 206 및 208은 방수가 통로 접합부 212에서 비말로서 분할되는 비수성 용액, 예를 들면, 오일이 제공될 수 있다. 최종적으로, 출구 저장소는 분할된 세포 및 비드가 전달될 수 있고, 그리고 이들이 수확될 수 있는 통로 210에 유동적으로 연계될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 저장소로서 설명되긴 하지만, 통로 세그먼트는 다른 시스템의 배관, 다양체, 또는 유체 성분을 비롯하여, 임의의 다양한 상이한 유체 공급원 또는 수용 성분에 연계될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
통로 네트워크를 통해, 예를 들면, 적용된 차압, 원심력, 동전기적 펌핑, 모세관 또는 중력 흐름, 또는 기타 유사한 것을 통해 이들 유체의 흐름을 제어하는 시스템 역시 제공된다.
V. 키트
개별 세포 또는 작은 세포 개체군을 분석하기 위한 키트 역시 본원에서 제공된다. 이들 키트는 수성 완충액 및 비수성 분할 유체 또는 오일 둘 모두, 본원에서 설명된 바와 같이 비드와 방출가능하게 연관되는 핵산 바코드 라이브러리, 미소유체 장치, 세포를 파괴하고 핵산을 증폭하기 위한 시약을 포함하고, 그리고 세포 핵산 또는 이들의 복제물의 단편에 추가 기능적 서열을 제공하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상, 최대 모든 분할 유체뿐만 아니라 본원에서 설명된 방법에서 전술한 것들 중에서 한 가지를 이용하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다.
VI. 컴퓨터 제어 시스템
본 발명은 본 발명의 방법을 실행하도록 프로그램된 컴퓨터 제어 시스템을 제공한다. 도면 17은 핵산 염기서열결정 방법을 비롯한 본 발명의 방법, 핵산 염기서열결정 데이터의 해석 및 세포 핵산, 예를 들면, RNA (가령, mRNA)의 분석, 그리고 염기서열결정 데이터로부터 세포의 특징화를 실행하도록 프로그램되거나 또는 달리 설정된 컴퓨터 시스템 1701을 보여준다. 컴퓨터 시스템 1701은 전자 장치에 대하여 원격으로 위치된 사용자의 전자 장치 또는 컴퓨터 시스템일 수 있다. 전자 장치는 이동식 전자 장치일 수 있다.
컴퓨터 시스템 1701은 중앙 처리 장치 (CPU, 본원에서 또한 "프로세서" 및 "컴퓨터 프로세서") 1705를 포함하고, 이것은 단일 코어 또는 멀티 코어 프로세서, 또는 병렬 처리를 위한 복수의 프로세서일 수 있다. 컴퓨터 시스템 1701은 또한, 메모리 또는 메모리 위치 1710 (가령, 무작위 접근 메모리, 판독 전용 메모리, 플래시 메모리), 전자 기억 장치 1715 (가령, 하드 디스크), 하나 또는 그 이상의 다른 시스템과 통신하기 위한 통신 인터페이스 1720 (가령, 네트워크 어댑터), 그리고 주변 장치 1725, 예를 들면, 캐시, 다른 메모리, 데이터 저장 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함한다. 메모리 1710, 기억 장치 1715, 인터페이스 1720 및 주변 장치 1725는 통신 버스 (연속선), 예를 들면, 마더보드를 통해 CPU 1705와 통신한다. 기억 장치 1715는 데이터를 저장하기 위한 데이터 기억 장치 (또는 데이터 저장소)일 수 있다. 컴퓨터 시스템 1701은 통신 인터페이스 1720의 도움으로 컴퓨터 네트워크 ("네트워크") 1730에 작동가능하게 연계될 수 있다. 네트워크 1730은 인터넷, 인터넷 및/또는 엑스트라넷, 또는 인터넷과 통신하는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷일 수 있다. 네트워크 1730은 일부 경우에, 전기통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크 1730은 하나 또는 그 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있는데, 이들은 분산 컴퓨팅, 예를 들면, 클라우드 컴퓨팅을 가능하게 할 수 있다. 네트워크 1730은 일부 경우에, 컴퓨터 시스템 1701의 도움으로, 개인간 네트워크를 실행할 수 있는데, 이것은 컴퓨터 시스템 1701에 연계된 장치가 고객 또는 서버로서 행동할 수 있게 할 수 있다.
CPU 1705는 일련의 기계-판독가능한 명령을 실행할 수 있는데, 이들은 프로그램 또는 소프트웨어에서 구현될 수 있다. 명령은 메모리 위치, 예를 들면, 메모리 1710 내에 저장될 수 있다. 명령은 CPU 1705에 지향될 수 있고, 이것은 차후에, CPU 1705가 본 발명의 방법을 실행하도록 프로그램하거나 또는 달리 설정할 수 있다. CPU 1705에 의해 수행된 작업의 실례는 페치, 명령어 해석, 명령어 실행, 그리고 라이트백을 포함할 수 있다.
CPU 1705는 회로, 예를 들면, 집적 회로의 부분일 수 있다. 시스템 1701의 하나 또는 그 이상의 다른 성분이 회로 내에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 회로는 주문형 집적 회로 (ASIC)이다.
기억 장치 1715는 파일, 예를 들면, 드라이버, 라이브러리 및 저장된 프로그램을 저장할 수 있다. 기억 장치 1715는 사용자 데이터, 예를 들면, 사용자 선호 및 사용자 프로그램을 저장할 수 있다. 컴퓨터 시스템 1701은 일부 경우에, 컴퓨터 시스템 1701의 외부에 있는, 예를 들면, 인트라넷 또는 인터넷을 통해 컴퓨터 시스템 1701과 통신하는 원격 서버 상에 위치하는 하나 또는 그 이상의 추가 데이터 기억 장치를 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템 1701은 네트워크 1730을 통해 하나 또는 그 이상의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 가령, 컴퓨터 시스템 1701은 사용자의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 원격 컴퓨터 시스템의 실례는 개인용 컴퓨터 (가령, 휴대용 PC), 슬레이트 또는 테블릿 PC (가령, Apple® iPad, Samsung® Galaxy Tab), 전화기, 스마트폰 (가령, Apple® iPhone, 안드로이드에서 이용가능한 장치, Blackberry®), 또는 개인 휴대용 단말기를 포함한다. 사용자는 네트워크 1730을 통해 컴퓨터 시스템 1701에 접근할 수 있다.
본원에서 설명된 바와 같은 방법은 컴퓨터 시스템 1701의 전자 저장 위치 상에, 예를 들면, 예로서, 메모리 1710 또는 전자 기억 장치 1715 상에 저장된 기계 (가령, 컴퓨터 프로세서) 실행가능한 코드에 의하여 실행될 수 있다. 기계 실행가능한 또는 기계 판독가능한 코드는 소프트웨어의 형태에서 제공될 수 있다. 이용 동안, 코드는 프로세서 1705에 의해 실행될 수 있다. 일부 경우에, 코드는 기억 장치 1715로부터 회수되고, 그리고 프로세서 1705에 의한 용이한 접근을 위해 메모리 1710 상에 저장될 수 있다. 일부 상황에서, 전자 기억 장치 1715는 배제될 수 있고, 그리고 기계-실행가능 명령은 메모리 1710 상에 보관된다.
코드는 이러한 코드를 실행하도록 개조된 프로세서를 갖는 기계용으로 미리 편집되고 설정될 수 있거나, 또는 실행 시간 동안 편집될 수 있다. 코드는 이러한 코드가 미리 편집된 또는 편집된 그대로 방식으로 실행할 수 있게 하도록 선별될 수 있는 프로그래밍 언어에서 공급될 수 있다.
본원에서 제공된 시스템 및 방법, 예를 들면, 컴퓨터 시스템 1701의 양상은 프로그래밍에서 구현될 수 있다. 이러한 기술의 다양한 양상은 전형적으로, 한 유형의 기계 판독가능 매체에서 운반되거나 또는 구현되는 기계 (또는 프로세서) 실행가능한 코드 및/또는 연관된 데이터의 형태에서 "산물" 또는 "제조 물품"으로서 생각될 수 있다. 기계-실행가능 코드는 전자 기억 장치, 예를 들면, 메모리 (가령, 판독 전용 메모리, 무작위 접근 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크 상에 저장될 수 있다. "저장" 유형 매체는 컴퓨터, 프로세서 또는 기타 유사한 것의 임의의 또는 모든 실재적인 메모리, 또는 이의 연관된 모듈, 예를 들면, 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 기타 등등을 포함할 수 있는데, 이들은 임의의 시점에서 소프트웨어 프로그래밍을 위한 비-일시적인 저장을 제공할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 때때로, 인터넷 또는 다양한 다른 전기통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 이런 통신은 예로서, 한 컴퓨터 또는 프로세서로부터 다른 것으로, 예를 들면, 관리 서버 또는 주컴퓨터로부터 응용 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 소프트웨어 요소를 보유할 수 있는 다른 유형의 매체는 예로서, 국부 장치 사이에, 유선 및 광학적 지상통신선 네트워크를 통해, 그리고 다양한 에어-링크 위에서 물리적 인터페이스를 교차하여 이용된 광학파, 전기파 및 전자기파를 포함한다. 이런 파를 운반하는 물리적 요소, 예를 들면, 유선 또는 무선 링크, 광회선 또는 기타 유사한 것 역시 소프트웨어를 보유하는 매체로서 고려될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 비-일시적인, 실재적인 "저장" 매체에 한정되지 않으면, 용어, 예를 들면, 컴퓨터 또는 기계 "판독가능 매체"는 명령을 실행을 위한 프로세서에 제공하는데 참여하는 임의의 매체를 지칭한다.
따라서, 기계 판독가능 매체, 예를 들면, 컴퓨터-실행가능 코드는 실재적인 저장 매체, 반송파 매체 또는 물리적 전파 매체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 많은 형태를 취할 수 있다. 비휘발성 저장 매체는 예로서, 광학 디스크 또는 자기 디스크, 예를 들면, 도면에 도시된 바와 같이 데이터베이스 등을 실행하는데 이용될 수 있는 임의의 컴퓨터(들) 또는 기타 유사한 것에서 임의의 저장 장치를 포함한다. 휘발성 저장 매체는 동적 메모리, 예를 들면, 이런 컴퓨터 플랫폼의 주기억장치를 포함한다. 실재적인 전송 매체는 동축 케이블; 구리선 및 컴퓨터 시스템 내에 버스를 포함하는 와이어를 비롯한 광섬유를 포함한다. 반송파 전송 매체는 전기 또는 전자기 신호, 또는 음향 또는 광파, 예를 들면, 고주파 (RF) 및 적외선 (IR) 데이터 통신 동안 산출된 것들의 형태를 취할 수 있다. 컴퓨터-판독가능 매체의 통상적인 형태는 이런 이유로, 예로서 다음을 포함한다: 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자성 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드 종이 테이프, 구멍의 패턴을 갖는 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 데이터 또는 명령을 수송하는 반송파, 이런 반송파를 수송하는 케이블 또는 링크, 또는 컴퓨터가 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 판독할 수 있는 임의의 다른 매체. 이들 형태의 컴퓨터 판독가능 매체 중에서 다수는 하나 또는 그 이상의 명령의 하나 또는 그 이상의 연속을 실행을 위한 프로세서로 운반하는데 관련될 수 있다.
컴퓨터 시스템 1701은 예로서, 핵산 염기서열결정의 결과, 핵산 염기서열결정 데이터의 분석, 핵산 염기서열결정 표본의 특징화, 세포 특징화 등을 제공하기 위한 사용자 인터페이스 (UI) 1740을 포함하는 전자 디스플레이 1735를 포함하거나 또는 이것과 통신할 수 있다. UI의 실례는 제한 없이, 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 및 웹-기초된 사용자 인터페이스를 포함한다.
본 발명의 방법 및 시스템은 하나 또는 그 이상의 알고리즘에 의하여 실행될 수 있다. 알고리즘은 중앙 처리 장치 1705에 의한 실행 시에 소프트웨어에 의하여 실행될 수 있다. 알고리즘은 예로서, 핵산 염기서열결정을 개시하고, 핵산 염기서열결정 데이터를 처리하고, 핵산 염기서열결정 결과를 해석하고, 핵산 표본을 특징짓고, 세포를 특징짓고, 기타 등등일 수 있다.
VII. 실시예
실시예 I 유제를 이용한 세포 RNA 분석
한 가지 실례에서, 주형 전환 및 cDNA 증폭 (PCR을 통해)을 이용한 역전사가 도면 9A에서 보여지는 바와 같은 작업으로 유제 비말에서 수행된다. 역전사 및 cDNA 증폭 (PCR을 통해)을 위해 분할되는 반응 혼합물은 1,000개 세포 또는 10,000개 세포 또는 10 ng의 RNA, 바코드화된 올리고뉴클레오티드를 보유하는 비드/0.2% Tx-100/5x Kapa 완충액, 2x Kapa HS HiFi Ready Mix, 4 μM 스위치 올리고, 그리고 Smartscribe를 포함한다. 세포가 존재하는 경우에, 혼합물은 비말 중에서 대부분 또는 전부가 단일 세포 및 단일 비드를 포함하도록 분할된다. 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출되고, 그리고 바코드화된 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절은 작업 950에서처럼 세포로부터 방출되는 mRNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 폴리-T 분절은 작업 952에서처럼 역전사 반응에서 연장되고, 그리고 cDNA 전사체는 작업 954에서 증폭된다. 열 주기 조건은 130 분 동안 42 ℃; 2 분 동안 98 ℃; 그리고 15 초 동안 98 ℃, 20 초 동안 60 ℃ 및 6 분 동안 72 ℃의 35 주기이다. 열 주기 이후에, 유제는 파괴되고, 그리고 전사체는 작업 956에서처럼 Dynabeads 및 0.6x SPRI로 정제된다.
유제에서 주형 스위치 역전사 및 PCR로부터 수율은 도면 13A에서 1,000개 세포, 도면 13C에서 10,000개 세포, 그리고 도면 13B (Smartscribe 라인)에서 10 ng의 RNA에 대해 도시된다. 10 ng RNA에 대한 유제에서 수행된 RT 및 PCR로부터 cDNA 전사체는 전단되고, 기능적 서열에 결찰되고, 0.8x SPRI로 청소되고, 그리고 작업 958에서처럼 PCR에 의해 더욱 증폭된다. 증폭 산물은 0.8x SPRI로 청소된다. 이러한 처리로부터 수율은 도면 13B (SSII 라인)에서 도시된다.
실시예 II 유제를 이용한 세포 RNA 분석
다른 실례에서, 주형 전환 및 cDNA 증폭 (PCR을 통해)을 이용한 역전사가 도면 9A에서 보여지는 바와 같은 작업으로 유제 비말에서 수행된다. 역전사 및 cDNA 증폭 (PCR을 통해)을 위해 분할되는 반응 혼합물은Jurkat 세포, 바코드화된 올리고뉴클레오티드를 보유하는 비드/0.2% TritonX-100/5x Kapa 완충액, 2x Kapa HS HiFi Ready Mix, 4 μM 스위치 올리고, 그리고 Smartscribe를 포함한다. 혼합물은 비말 중에서 대부분 또는 전부가 단일 세포 및 단일 비드를 포함하도록 분할된다. 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출되고, 그리고 바코드화된 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절은 작업 950에서처럼 세포로부터 방출되는 mRNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 폴리-T 분절은 작업 952에서처럼 역전사 반응에서 연장되고, 그리고 cDNA 전사체는 작업 954에서 증폭된다. 열 주기 조건은 130 분 동안 42 ℃; 2 분 동안 98 ℃; 그리고 15 초 동안 98 ℃, 20 초 동안 60 ℃ 및 6 분 동안 72 ℃의 35 주기이다. 열 주기 이후에, 유제는 파괴되고, 그리고 전사체는 작업 956에서처럼 Dynabeads 및 0.6x SPRI로 청소된다. 다양한 세포 수 (625개 세포, 1,250개 세포, 2,500개 세포, 5,000개 세포, 그리고 10,000개 세포)와의 반응으로부터 수율은 도면 14A에서 도시된다. 이들 수율은 도면 14B에서 도시된 GADPH qPCR 검정 결과로 확증된다.
실시예 III 유제를 이용한 RNA 분석
다른 실례에서, 역전사가 유제 비말에서 수행되고, 그리고 cDNA 증폭이 도면 9C에서 보여지는 것과 유사한 방식으로 대량으로 수행된다. 역전사를 위해 분할되는 반응 혼합물은 바코드화된 올리고뉴클레오티드를 보유하는 비드, 10 ng Jurkat RNA (가령, Jurkat mRNA), 5x 일차-가닥 완충액 및 Smartscribe를 포함한다. 바코드화된 올리고뉴클레오티드는 비드로부터 방출되고, 그리고 바코드화된 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절은 작업 961에서처럼 RNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 폴리-T 분절은 작업 963에서처럼 역전사 반응에서 연장된다. 역전사를 위한 열 주기 조건은 2 시간 동안 42 ℃에서 1 주기 및 10 분 동안 70 ℃에서 1 주기이다. 열 주기 이후에, 유제는 파괴되고, 그리고 RNA와 cDNA 전사체는 작업 962에서 변성된다. 두 번째 가닥은 이후, 작업 964에서처럼 비오틴 태그를 갖는 프라이머를 이용한 프라이머 연장에 의해 합성된다. 이러한 프라이머 연장을 위한 반응 조건은 일차 가닥으로서 cDNA 전사체 및 0.5 - 3.0 μM의 농도 범위에서 변하는 비오틴화된 연장 프라이머를 포함한다. 열 주기 조건은 3 분 동안 98 ℃에서 1 주기 및 15 초 동안 98 ℃, 20 초 동안 60 ℃ 및 30 분 동안 72 ℃의 1 주기이다. 프라이머 연장 이후에, 두 번째 가닥은 Dynabeads MyOne 스트렙타비딘 C1과 T1로 철거되고, 그리고 Agilent SureSelect XT 완충액으로 청소된다. 두 번째 가닥은 다음의 주기 조건 - 3 분 동안 98 ℃에서 1 주기 및 15 초 동안 98 ℃, 20 초 동안 60 ℃ 및 30 분 동안 72 ℃의 1 주기로, 작업 965에서처럼 PCR을 통해 미리 증폭된다. 다양한 농도의 비오틴화된 프라이머 (0.5 μM, 1.0 μM, 2.0 μM, 그리고 3.0 μM)에 대한 수율은 도면 15에서 도시된다.
실시예 IV 유제를 이용한 RNA 분석
다른 실례에서, T7 중합효소에 의한 시험관내 전사가 도면 10에서 보여지는 바와 같이 RNA 전사체를 생산하는데 이용된다. 역전사를 위해 분할되는 혼합물은 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열, 10 ng 인간 RNA (가령, 인간 mRNA), 5x 일차-가닥 완충액 및 Smartscribe를 또한 포함하는, 바코드화된 올리고뉴클레오티드를 보유하는 비드를 포함한다. 혼합물은 비말 중에서 대부분 또는 전부가 단일 비드를 포함하도록 분할된다. 바코드화된 올리고뉴클레오티드는 비드로부터 방출되고, 그리고 바코드화된 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절은 작업 1050에서처럼 RNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 폴리-T 분절은 작업 1052에서처럼 역전사 반응에서 연장된다. 열 주기 조건은 2 시간 동안 42 ℃에서 1 주기 및 10 분 동안 70 ℃에서 1 주기이다. 열 주기 이후에, 유제는 파괴되고, 그리고 나머지 작업은 대량으로 수행된다. 두 번째 가닥은 이후, 작업 1054에서처럼 프라이머 연장에 의해 합성된다. 이러한 프라이머 연장을 위한 반응 조건은 주형으로서 cDNA 전사체 및 연장 프라이머를 포함한다. 열 주기 조건은 3 분 동안 98 ℃에서 1 주기 및 15 초 동안 98 ℃, 20 초 동안 60 ℃ 및 30 분 동안 72 ℃의 1 주기이다. 이러한 프라이머 연장 이후에, 두 번째 가닥은 0.6x SPRI로 정제된다. 작업 1056에서처럼, 시험관내 전사가 이후, RNA 전사체를 생산하기 위해 수행된다. 시험관내 전사는 하룻밤 동안 수행되고, 그리고 전사체는 0.6x SPRI로 정제된다. 시험관내 전사로부터 RNA 수율은 도면 16에서 도시된다.
본 발명의 일부 구체예가 본원에서 도시되고 설명되긴 했지만, 이런 구체예가 단지 실례로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 본 명세서 내에 제공된 특정한 실례에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명이 전술한 명세서에 관하여 설명되긴 했지만, 본원에서 구체예의 설명 및 예시는 제한하는 의미로 해석되는 것으로 의미되지 않는다. 다양한 변이, 변화와 치환이 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에게 발생할 것이다. 게다가, 본 발명의 모든 양상은 다양한 조건과 변수에 의존하는, 본원에서 진술된 특정한 묘사, 설정 또는 상대적 비율에 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 설명된 발명의 구체예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이런 이유로, 본 발명은 임의의 이런 대안, 변형, 변이 또는 등가물 역시 커버할 것으로 예기된다. 다음 청구항은 발명의 범위를 규정하고, 그리고 이들 청구항의 범위 내에 방법과 구조 및 이들의 등가물이 그것에 의해 커버되는 것으로 의도된다.
Claims (88)
- 세포의 세포 표면 특질을 특징짓는 방법으로서,
(a) 세포 표면 특질 및 전령 리보핵산(mRNA)을 포함하는 세포를 제공하는 단계;
(b) 세포를 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기와 함께, 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기들 중 세포 표면 특질 결합 기가 세포의 세포 표면 특질에 결합할 수 있는 조건 하에, 배양하는 단계로서, 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기들 중 상이한 세포 표면 특질 결합 기는 세포의 상이한 세포 표면 특질에 결합할 수 있고, 복수의 세포 표면 특질 결합 기들 중 세포 표면 특질 결합 기는 그것과 연관된 리포터 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단계;
(c) 상기 세포를, 파티션에 상응하는 바코드 서열을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 파티션으로 분할하는 단계;
(d) 복수의 올리고뉴클레오티드 중 올리고뉴클레오티드 및 리포터 올리고뉴클레오티드를 사용하여 (i) 바코드 서열 또는 이의 보체, 및 (ii) 리포터 올리고뉴클레오티드의 서열 또는 이의 보체를 포함하는 제1 핵산 분자를 형성하는 단계; 및
(e) 복수의 올리고뉴클레오티드 중 추가 올리고뉴클레오티드 및 mRNA를 사용하여 바코드 서열 또는 이의 보체를 포함하는 제2 핵산 분자를 형성하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 청구항 1에 있어서, 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기는 복수의 항체인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기는 복수의 항체 단편인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드가 비드에 부착되는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드가 바코드 서열을 포함하는 적어도 1,000,000개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 파티션이 비말(droplet)인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 파티션이 웰인 방법.
- 청구항 1에 있어서, (c)가 파티션 내에서 수행되는 것인 방법.
- 청구항 8에 있어서, 파티션으로부터 제2 핵산 분자를 방출 또는 제거하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 9에 있어서, 파티션으로부터 제2 핵산 분자를 방출 또는 제거한 후에 제2 핵산 분자에 대해 하나 이상의 반응을 실시하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 10에 있어서, 하나 이상의 반응은 중합효소 연쇄 반응을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 10에 있어서, 하나 이상의 반응은 서열분석기의 흐름 셀에의 부착을 허용하도록 구성된 하나 이상의 기능적 서열의 부가를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 4에 있어서, 비드가 겔 비드인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 세포 표면 특질이 세포 표면 단백질인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 중 올리고뉴클레오티드는 독특한 분자 서열 분절을 포함하고, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드 중 한 올리고뉴클레오티드의 독특한 분자 서열 분절은 복수의 올리고뉴클레오티드 중 다른 올리고뉴클레오티드의 독특한 분자 서열 분절과 상이한 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 중 올리고뉴클레오티드는 리포터 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 16에 있어서, 리포터 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열이 폴리-티민(폴리-T) 서열이고, 리포터 올리고뉴클레오티드가 폴리-아데닌(폴리-A) 서열을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, (d)는 핵산 연장 반응을 실시하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, (d)는 핵산 증폭 반응을 실시하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, (d)는 역전사 반응을 실시하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, (d)는 주형 전환 반응을 실시하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 적어도 (b)에서, 세포 표면 특질 결합 기는 공유 결합을 통해 리포터 올리고뉴클레오티드에 부착되는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 적어도 (b)에서, 세포 표면 특질 결합 기는 비공유결합성 상호작용을 통해 리포터 올리고뉴클레오티드에 연계되는 것인 방법.
- 청구항 23에 있어서, 적어도 (b)에서, 리포터 올리고뉴클레오티드가 공유 결합을 통해 세포 표면 특질 결합 기에 부착된 올리고뉴클레오티드에 혼성화되는 것인 방법.
- 청구항 4에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 중 올리고뉴클레오티드의 서열은 바코드 서열을 포함하고 비드로부터 방출가능한 것인 방법.
- 청구항 25에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 중 올리고뉴클레오티드의 서열은 바코드 서열을 포함하고 이황화 결합을 통해 비드에 부착되는 것인 방법.
- 청구항 25에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 중 올리고뉴클레오티드의 서열은 바코드 서열을 포함하고 화학적 자극에 노출시 비드로부터 방출가능한 것인 방법.
- 청구항 25에 있어서, (d) 전에, 바코드 서열을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드 중 올리고뉴클레오티드의 서열을 비드로부터 방출하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 제2 핵산 분자를 염기서열결정하여 (i) 바코드 서열 또는 이의 보체 및 (ii) 리포터 올리고뉴클레오티드의 서열 또는 이의 보체를 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 29에 있어서, (i) 리포터 올리고뉴클레오티드의 서열 또는 이의 보체를 사용하여 세포 표면 특질 결합 기가 결합하는 세포 표면 특질을 확인하는 단계 및 (i) 바코드 서열 또는 이의 보체를 사용하여 세포를 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 복수의 세포 중 세포의 세포 표면 특질을 특징짓는 방법으로서,
(a) 세포에 세포 결합 리간드 및 폴리뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계로서, 세포 결합 리간드는 세포 표면 특질에 결합되고, 세포 결합 리간드는 그것과 연관된 리포터 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단계;
(b) 상기 세포를, 바코드 서열을 각각 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 파티션으로 분할하는 단계;
(c) 복수의 올리고뉴클레오티드 중 올리고뉴클레오티드 및 리포터 올리고뉴클레오티드를 사용하여 (i) 바코드 서열 또는 이의 역보체(reverse complement), 및 (ii) 리포터 올리고뉴클레오티드의 서열 또는 이의 역보체를 포함하는 바코드화된 핵산 분자를 형성하는 단계; 및
(d) 복수의 올리고뉴클레오티드 중 추가 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 분자를 사용하여 바코드화된 핵산 분자 또는 이의 보체를 포함하는 핵산 분자를 형성하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 청구항 31에 있어서, 리포터 올리고뉴클레오티드의 길이는 5 뉴클레오티드 초과인 방법.
- 청구항 32에 있어서, 리포터 올리고뉴클레오티드의 길이는 10 내지 200 뉴클레오티드인 방법.
- 청구항 31에 있어서, 리포터 올리고뉴클레오티드는 추가 서열 요소를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 34에 있어서, 추가 서열 요소는 서열분석기 부착 서열, 염기서열결정 프라이머 서열, 또는 프라이머 서열을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 31에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 폴리-T 프라이머 서열을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 31에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 독특한 분자 서열 분절을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 31에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자는 리보핵산 분자인 방법.
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