KR100459870B1 - 트랜스포존과 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 방법을 이용하는 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주 제조방법 - Google Patents

트랜스포존과 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 방법을 이용하는 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트랜스포존(transposon)과 Cre/loxP 부위 특이적 재조합(site-specific recombination) 방법을 이용하여, 염색체의 특정부위를 선택적으로 제거하여 새로운 미생물 변이주를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 선별 마커(selectable marker)와 loxP 부위(loxP site)를 가진 트랜스포존과 Cre 발현벡터를 이용하여 미생물 염색체의 특정부위를 제거함으로써 염색체가 축소된 새로운 미생물 변이주를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이를 위하여, 본 발명은 (1) 선별 마커와 loxP 부위를 가진 트랜스포존을 제조하는 단계, (2) 상기 트랜스포존을 미생물 염색체의 임의의 위치에 삽입시키고 삽입된 위치를 확인하는 단계, (3) 서로 다른 선별 마커를 가진 트랜스포존을 하나의 염색체로 옮기는 단계, (4) 상기 염색체에 Cre 발현벡터를 도입하여 두 loxP 부위 사이의 염색체 부위를 제거하는 단계, 및 (5) 상기 염색체 일부가 제거된 변이주에 상기 (3) 및 (4) 단계를 반복하여 점진적으로 염색체를 축소시키는 단계를 포함하여 이루어진다.

Description

트랜스포존과 Ｃｒｅ/ｌｏｘＰ 부위 특이적 재조합 방법을 이용하는 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주 제조방법{CONSTRUCTION OF NOVEL STRAINS CONTAINING MINIMIZING GENOME BY Tn5-COUPLED Cre/loxP EXCISION SYSTEM}
본 발명은 loxP 부위를 갖는 트랜스포존(transposon), 및 Cre/loxP 부위 특이적 재조합(site-specific recombination) 방법을 이용하여 염색체의 특정부위가제거된 미생물 변이주 및 이들을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 선별 마커(selectable marker)와 loxP 부위(loxP site)를 가진 트랜스포존과 Cre 발현벡터를 이용하여 미생물 염색체의 특정부위를 제거하여 새로운 미생물 변이주를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 방법을 이용하여 대장균(E. coli) 염색체의 특정부위를 제거하는 기술은 이미 공지되어 있지만, 종래의 방법에 의한 경우, 염색체의 특정부위를 제거하기 위해서는 매 실험마다 타겟팅 벡터(targeting vector)를 제조하고, PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여야 하는 불편함이 있었다. 또한, 염색체 내 임의의 위치로 삽입될 수 있는 트랜스포존에 대한 기술도 이미 공지 된 바가 있으나, 트랜스포존과 Cre/loxP 부위 특이적 재조합방법을 함께 사용하여 미생물 염색체를 제거하는 기술은 아직까지 보고된 바가 없다.
본 발명은, 매 실험시 마다 타겟팅 벡터를 제조하고 PCR을 수행하여야 했던 종래의 미생물 염색체 특정 부위 제거 방법을 개선하여, 트랜스포존과 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 방법을 이용함으로써, 보다 간편하게 염색체의 특정부위를 제거할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 트랜스포존 TnKGloxP 및 TnCloxP의 제조과정 및 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 트랜스포존 TnKGloxP 및 TnCloxP를 이용하여 염색체의 특정부위가 제거된 염색체를 갖는 대장균(E.coli)을 제조하는 단계를 나타낸 것이다.
도 3은 대장균 게놈 내의 TnKGloxP 및 TnCloxP의 삽입 가능한 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 다양한 위치에 삽입된 트랜스포존 TnKGloxP와 TnCloxP를 이용하여 대장균 염색체의 특정 부위를 제거하는 방법과 제거된 염색체의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 트랜스포존과 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 방법을 이용하여 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 선별 마커와 loxP 부위를 가진 트랜스포존 및 상기 트랜스포존과 Cre 발현벡터를 이용하여 미생물 염색체의 특정부위를 제거하여 새로운 미생물 변이주를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 특정부위의 염색체 부분이 제거된 미생물 변이주의 제조방법은
(1) loxP 부위와 서로 다른 선별 마커를 가진 두 종류의 트랜스포존을 제조하는 단계,
(2) 상기 두 종류의 트랜스포존을 각각 미생물 염색체의 임의의 위치에 삽입시키고 삽입된 위치를 확인하는 단계,
(3) P1 파아지 형질도입법(P1 phage transduction)을 이용하여 상기 두 종류의 서로 다른 선별 마커를 가진 트랜스포존을 하나의 염색체로 옮기는 단계, 및
(4) 상기 염색체에 Cre 유전자를 삽입, 발현시켜 두 loxP 부위 사이의 염색체 부분을 제거하는 단계를 포함하여 이루어진다.
이를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 (1) 단계에 있어서, 상기 두 종류의 트랜스포존은 서로 다른 선별 마커를 가지고 있다. 본 발명의 구체예에서는 상기 두 종류의 트랜스포존으로서 TnKGloxP와 TnCloxP를 제조하여 사용하였다. TnKGloxP는 loxP 부위(SEQ ID NO:4)와 선별 마커로서 KmR(가나마이신 저항 유전자; kanamycin resistant gene, SEQ ID NO:5) 및 GFP(푸른 형광색 발현유전자 ; Green Flurolecent Protein, SEQ ID NO:6)를 가지고 있으며, TnCloxP는 loxP 부위(SEQ ID NO:4)와 선별 마커로서 CmR(클로람페니콜 저항 유전자; chlroramphenicol resistant gene, SEQ ID NO:7)을 가지고 있다. 상기 두 종류의 트랜스포존은 모두 그 양쪽 말단에 19 염기쌍으로 이루어진 전위효소 인식부위(outer end transposase recognition sequence ; OE sequence)를 가지고 있으며, 이들은 각각 SEQ ID NO:3(5'-ctgtctcttatacacatct-3') 및 이와 역상보적인 서열(5'-agatgtgtataagagacag-3')을 갖는다.
즉, 트랜스포존 TnKGloxP는 양 말단에 19개의 염기쌍으로 이루어진 전위효소 인식부위(OE sequence)를 가지며 loxP 부위 및 선별마커로서 KmR 유전자 및 GFP 유전자를 포함하며, 트랜스포존 TnCloxP는 양 말단에 19개의 염기쌍으로 이루어진 전위효소 인식부위를 가지며, loxP 부위와 선별마커로서 CmR 유전자를 포함한다. 이 때, 상기 트랜스포존에 있어서, 본 발명에 필수적인 재조합을 위한 loxP 부위와 양 말단에 위치하는 전위효소 인식부위 및 선별을 위한 마커 부위를 제외한 부분은 트랜스포존의 제조과정에서 사용되는 벡터의 종류에 따라 다양한 염기서열과 길이를 가질 수 있다.
상기 트랜스포존 TnKGloxP와 TnCloxP는 pTnKGloxP 벡터와 pTnCloxP 벡터로부터 PCR반응을 통하여 얻을 수 있다(도 1 참조).
본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 트랜스포존 TnKGloxP와 TnCloxP은 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
우선, 상기 트랜스포존 TnKGloxP은,
리가아제를 이용하여 GFP 유전자, 선상의 KmR 및 loxP 부위를 갖는 pKKloxP 벡터에 삽입하여 새로운 벡터 pKGloxP를 제조하는 단계,
상기 pKGloxP 벡터에 제한효소를 처리하여, KmR, GFP 및 loxP 부위를 갖는DNA 조각을 분리해 내는 단계,
리가아제를 이용하여 상기 분리해낸 DNA 조각을 선상의 pMODTM<MCS> 벡터에 삽입하여 pTnKGloxP 벡터를 제조하는 단계, 및
상기 pTnKGloxp 벡터를 PCR 수행시키는 단계를 포함하여 이루어지는 제조방법으로 제조할 수 있다.
또한, 상기 트랜스포존 TnCloxP은,
CmR와 loxP 부위를 갖는 pKCloxP 벡터에 제한효소를 처리하여, CmR와 loxP 부위를 갖는 DNA 조각을 분리해 내는 단계,
리가아제를 사용하여 상기 DNA 조각을 선상의 pMODTM<MCS> 벡터에 삽입하여 pTnCloxP 벡터를 제조하는 단계, 및
상기 pTnCloxP 벡터를 PCR 수행시키는 단계를 포함하여 이루어지는 제조방법으로 제조할 수 있다.
이와 같은 방법으로 제조된 트랜스포존 TnKGloxP 및 TnCloxP의 염기서열은 다음과 같으며, 이를 각각 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2에 나타내었다.
TnKGloxP 염기서열
1 attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca
61 g ctgtctctt atacacatct caaccatcat cgatgaattc gagctcggta cccgggttga
∥← OE sequences →∥
121 actgcggatc ttgcggccgc aaaaattaaa aatgaagttt tgacggtatc gaaccccaga
∥← KmR
181gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag
241cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa
301tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt
361cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat
421gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tccgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg
481ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca
541tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg
601gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag
661caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc
721ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg
781atagccgcgc tgcctcgtct tggagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa
841aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg
901tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt
961gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga tccactagat
1021tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag
1081aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgcatcgatg
KmR →∥
1141 aattgatccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttcgaattgt cgacaagctt
1201 gatctggctt atcgaaatta atacgactca ctatagggag accggaattcattatttgta
∥←GFP
1261gagctcatcc atgccatgtg taatcccagc agcagttaca aactcaagaa ggaccatgtg
1321gtcacgcttt tcgttgggat ctttcgaaag ggcagattgt gtcgacaggt aatggttgtc
1381tggtaaaagg acagggccat cgccaattgg agtattttgt tgataatggt ctgctagttg
1441aacggatcca tcttcaatgt tgtggcgaat tttgaagtta gctttgattc cattcttttg
1501tttgtctgcc gtgatgtata cattgtgtga gttatagttg tactcgagtt tgtgtccgag
1561aatgtttcca tcttctttaa aatcaatacc ttttaactcg atacgattaa caagggtatc
1621accttcaaac ttgacttcag cacgcgtctt gtagttcccg tcatctttga aagatatagt
1681gcgttcctgt acataacctt cgggcatggc actcttgaaa aagtcatgcc gtttcatatg
1741atccggataa cgggaaaagc attgaacacc ataagagaaa gtagtgacaa gtgttggcca
1801tggaacaggt agttttccag tagtgcaaat aaatttaagg gtaagttttc cgtatgttgc
1861atcaccttca ccctctccac tgacagaaaa tttgtgccca ttaacatcac catctaattc
1921aacaagaatt gggacaactc cagtgaaaag ttcttctcct ttactcattt tttctaccgg
1981tacccgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat
2041agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa
2101gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc
2161gctcactgcc cgctttccag tcgggaaatc caagggcgaa ttcgagctcg gtaccgggcc
GFP →∥
2221 ccccctcgag ggaccta ata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta t attaagggt
∥← loxP 부위 →∥
2281 tccggatcct ctagagtaga cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttcagggttg
2341 agatgtgtat aagagacag c tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt
∥← OE sequences →∥
2401 gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgac
TnCloxP 염기서열
1 attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca
61 g ctgtctctt atacacatct caaccatcat cgatgaattc gagctcggta ccgcaaaaat
∥← OE sequences →∥ ∥← CmR
121taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac
181caatgcttaa tcagtgaggc accaataact gccttaaaaa aattacgccc cgccctgcca
241ctcatcgcag tactgttgta attcattaag cattctgccg acatggaagc catcacagac
301ggcatgatga acctgaatcg ccagcggcat cagcaccttg tcgccttgcg tataatattt
361gcccatggtg aaaacggggg cgaagaagtt gtccatattg gccacgttta aatcaaaact
421ggtgaaactc acccagggat tggctgagac gaaaaacata ttctcaataa accctttagg
481gaaataggcc aggttttcac cgtaacacgc cacatcttgc gaatatatgt gtagaaactg
541ccggaaatcg tcgtggtatt cactccagag cgatgaaaac gtttcagttt gctcatggaa
601aacggtgtaa caagggtgaa cactatccca tatcaccagc tcaccgtctt tcattgccat
661acggaatttc ggatgagcat tcatcaggcg ggcaagaatg tgaataaagg ccggataaaa
721cttgtgctta tttttcttta cggtctttaa aaaggccgta atatccagct gaacggtctg
781gttataggta cattgagcaa ctgactgaaa tgcctcaaaa tgttctttac gatgccattg
841ggatatatca acggtggtat atccagtgat ttttttctcc attttagctt ccttagctcc
901tgaaaatctc gataactcaa aaaatacgcc cggtagtgat cttatttcat tatggtgaaa
961gttggaacct cttacgtgcc gatcaacgtc tcattttcgc caaaagttgg cccagggctt
1021cccggtatca acagggacac caggatttat ttattctgcg aagtgatctt ccgtcacagg
1081tatttattcg gcgcaaagtg cgtcgggtga tgctgccaac ttactgattt agtgtatgat
1141ggtgtttttg aggtgctcca gtggcttctg tttctatcag catcgatgaa ttgatccgaa
CmR →∥
1201 gttcctattc tctagaaagt ataggaactt cgaattgtcg acaagcttga tctggcttat
1261 cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga gctcggtacc gggccccccc
1321 tcgagggacc ta ataacttc gtatagcata cattatacga agttat atta agatcctcta
∥← loxP 부위 →∥
1381 gagtcgacct gcaggcatgc aagcttcagg gttg agatgt gtataagaga cag ctgcatt
∥← OE sequences →∥
1441 aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct
1501 cgctcactga c
상기한 바와 같이, 상기 두 종류의 트랜스포존에 있어서, loxP 부위, OE sequence, KmR 유전자, GFP유전자 및 CmR 유전자 부위를 제외한 나머지 부위의 염기 서열이나 길이는 트랜스포존의 제조에 사용되는 벡터의 종류에 따라 달라질 수 있으며, loxP 부위, OE sequence, 선별 마커(KmR/GFP 또는 CmR) 부위를 모두 포함하고 그 염기서열이 보존된다면, 이를 제외한 나머지 부위는 부분적으로 하나 이상의 염기가 결실, 삽입 또는 치환되어도 트랜스포존의 기능에는 영향이 없다. 또한, loxP 부위는 양 말단의 전위효소 인식부위 사이에 위치하면서 선별마커 서열 중간 또는 내부에 삽입되지 않으면 족하고, 선별마커의 3' 방향 또는 5' 방향 중 어디에 위치하여도 무관하다.
상기 (2)단계에 있어서, 상기 두 종류의 트랜스포존, TnKGloxP와 TnCloxP에 각각 전위효소를 첨가하여 각각의 트랜스포좀(transposome)을 형성하고, 서로 다른 트랜스포존을 포함하는 트랜스포좀을 통상적인 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 각기 다른 미생물 균주에 전달하여, 미생물 균주 염색체의 임의 위치에 트랜스포존을 각각 삽입시킨 후, 상기 트랜스포존이 삽입된 미생물 변이주를 선별한 후, 선별된 각 변이주 내의 트랜스포존 삽입위치를 확인한다. 이 때, 전위효소의 임의 삽입 기능은 Mg2+이온에 의하여 활성화되므로, 트랜스포좀의 형성은 Mg2+이온이 없는 조건하에서 수행하고, 미생물 균주 내에서의 트랜스포존의 임의 삽입은 Mg2+이온이 존재하는 조건하에서 수행한다. 또한, 상기 두 종류의 트랜스포존은 각각 가나마이신 저항 유전자와 클로람페니콜 저항 유전자를 포함하기 때문에 상기 두 항생제에 대하여 저항성을 가지므로, 상기 트랜스포존의 삽입 공정 수행 후, 미생물 균주를 가나마이신 배지 또는 클로람페니콜 배지에서 배양하여 각각의 트랜스포존이 삽입된 균주를 선별할 수 있다. 이 때, 하나의 트랜스포존 삽입은 서던 블러트(southern blot) 분석으로, 그리고 삽입된 트랜스포존의 위치는 임의적 PCR(arbitrary PCR)을 통하여 확인할 수 있다.
상기 (3) 단계에 있어서, 상기 트랜스포존의 위치를 확인한 미생물 변이주 중에서, 제거하고자 하는 염색체 부위의 한 쪽 끝에 임의의 한 종류의 트랜스포존이 삽입된 변이주와 다른 쪽 끝에 상기와 다른 종류의 트랜스포존이 삽입된 변이주를 각각 취하여, 이 중 하나를 공여자(donor)로 하고 다른 하나를 수여자(recipient)로 하여 통상적인 P1 파아지 형질도입법을 통하여 상기 두 트랜스포존을 제거하고자 하는 염색체 부위의 양 끝에 위치시킨다. 이 때, loxP 부위는 같은 방향으로 위치하도록 하여야 한다.
상기 (4) 단계에 있어서, 상기 변이주 내로 pTSCre 발현벡터를 도입시킴으로써, 제거하고자 하는 염색체 부위 양 끝에 트랜스포존을 갖는 미생물 변이주 염색체 내로의 Cre 유전자 삽입을 수행한다. 이 때, pTSCre 발현벡터에 존재하는 Cre 유전자는 테트라사이클린 프로모터(Ptet)에 의하여 전사조절 되므로, 상기 pTSCre 발현벡터가 도입된 변이주를 클로로테트라사이클린이 존재하는 배지에서 배양하여 Cre 유전자를 발현시켜 Cre DNA 재조합 효소(Cre Recombinase)를 합성한다. 이 때, Cre DNA 재조합효소는 상기 두 loxP 부위를 특이적으로 절단하여 loxP를 양 끝에 포함하는 염색체 부위를 제거하고, 절단된 부분을 다시 이어주는 역할을 한다.
이에 더하여, 본 발명에 따른 제조방법은, 상기 단계에 의하여 제조된 염색체 일부가 제거된 변이주에 상기 (3) 및 (4) 단계를 반복 실행하여 염색체를 점진적으로 축소시키는 단계를 추가적으로 포함 할 수 있다. 즉, 상기 특정 부위가 제거된 변이주들 중에서 임의로 2 개를 선택하여, 상기(3) 단계와 같이 P1 파아지 형질도입법에 의하여 하나의 염색체로 융합시켜 상기 두 개의 변이주의 제거된 부위만큼 제거부위가 확장된 변이주를 제조하고, 이것과 다른 변이주와의 P1 파아지 형질도입법을 연속적으로 수행하여 염색체 제거 부위를 점점 확장시켜, 점진적으로 변이주의 염색체 크기를 축소시킨다. 상기 연속적 P1 형질도입시 원하는 균주의 효과적 선별을 위하여 P1 수여자(recipient) 역할을 하는 균주의 선별 마커를 동형 재조합(homologous recombination)하여 제거한다.
본 발명은 상기 대상 미생물로 대장균(E. coli)을 사용하였으며, 상기 트랜스포존은 Tn5를 기초로 제조하였다. Tn5는 미생물 염색체 임의의 위치로 삽입이 가능한 것으로 보고되어 있으며(Berg, D. D., and M. M. Howe. 1989. Mobile DNA. American Society for Microbiology, Washington, D.C.), Cre DNA 재조합 효소는 두 개의 loxP 부위를 인식하여 이들 사이의 DNA 재조합 반응을 촉매하는 것으로 보고되어 있다(Abremski, K., HoessR., and Sternberg, N. 1984. Studies on the properties of P1 site-specific recombination. Cell 32, 1301-1311). 또한, P1 파아지는 감염한 숙주 미생물 염색체의 일부를 떼어내어 다른 미생물에 전달하는 기능이 있다고 알려져 있다(Watanabe, T., Furuse, C., and Sakaizumi, S. 1968. Transduction of various R factors by phage P1 in Escherichia coli and by phage P22 in Salmonella typhimurium). 그러므로, 본 발명은 트랜스포존에 loxP 부위를 삽입하여 미생물 염색체 내의 임의의 위치로 삽입시키고, P1 파아지 형질전환법을 이용하여 2개의 loxP 부위를 동일 염색체에 같은 방향으로 위치하게 형질전환시키고 여기에 Cre 발현벡터를 도입시켜 Cre DNA 재조합 효소를 발현시킴으로써, 2 개의 loxP 부위 사이의 염색체 부분이 제거된 새로운 미생물 변이주를 제조하는기술을 개발한 것이다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 상세히 설명하겠으나, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예1
대장균 염색체의 임의의 위치에 삽입 가능한 트랜스포존 TnKGloxP와 TnCloxP의 제조
도 1은 직선형의 트랜스포존 TnKGloxP와 TnCloxP를 나타내는 것으로, TnKGloxP는 KmR, GFP (pGFPuv, Clontech, Palo Alto, CA) 및 loxP 부위를 가지고 있으며, TnCloxP는 CmR과 loxP 부위를 가지고 있다. 상기 두 종류의 트랜스포존은 모두 그 양쪽 말단에 19 염기쌍으로 이루어진 전위효소(Epicentre technologies, Madison, WI) 인식부위를 가지고 있다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 트랜스포존 TnKGloxP와 TnCloxP는 pTnKGloxP 벡터와 pTnCloxP 벡터로부터 PCR반응을 통해 얻을 수 있다.
상기 pTnKGloxP 벡터를 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 우선, PCR 반응을 통하여 얻은 GFP 유전자를 EcoRI 제한효소(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 절단한 후, 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 상기 GFP 유전자를 EcoRI 제한효소에 의하여 절단시킨 선상(linear)의 KmR와 loxP 부위를 갖는 pKKloxP(Michael D. Koob, et al, 1994, In vivo excision and amplification of large segment of the Escherichia coli genome, Nucleic AcidsReserch 22(12),2392-2398)벡터에 삽입하여 새로운 벡터를 제조한 후, 이를 pKGloxP라 명명하였다. 상기 pKGloxP 벡터를 NotI/XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소와 반응시켜, KmR 유전자, GFP 유전자 및 loxP 부위를 갖는 2.2 kb 크기의 DNA 조각을 분리해 낸 후, 리가아제를 이용하여 상기 분리해낸 DNA 조각을 BamHI(New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소로 처리한 선상의 pMODTM<MCS> (Epicentre technologies, Madison, WI)벡터에 삽입하여 pTnKGloxP 벡터를 제조하였다(도 1 참조).
상기 pTnCloxP 벡터는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. CmR와 loxP 부위를 갖는 pKCloxP(Michael D. Koob, et al, 1994, In vivo excision and amplification of large segment of the Escherichia coli genome, Nucleic Acids Reserch 22(12),2392-2398) 벡터를 NotI와 BamHI 제한효소(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 절단하여, CmR, loxP 부위를 갖는 1.2 kb 크기의 DNA 조각을 분리해 낸 후, 리가아제를 사용하여 상기 DNA 조각을 BamHI 제한효소로 처리한 선상의 pMODTM<MCS> 벡터에 삽입하여 pTnCloxP 벡터를 제조하였다(도 1 참조).
상기 pTnKGloxP 벡터와 pTnCloxP 벡터를 PCR하여 트랜스포존 TnKGloxP와 TnCloxP를 제조하였다. 상기 PCR에 사용한 프라이머는 pMOD<MCS>FP-1(SEQ ID NO:8)과 pMOD<MCS>RP-1(SEQ ID NO:9)이며, 그 염기서열은 다음과 같다.
pMOD<MCS>FP-1 : 5￠ATTCAGGCTGCGCAACTGT-3￠
pMOD<MCS>RP-1 : 5￠-TCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG-3￠
실시예 2
트랜스포존 TnKGloxP와 TnCloxP를 대장균 염색체의 임의의 위치에 삽입시킨 두 종류의 대장균 변이주 라이브러리의 제조 및 삽입된 위치 확인
500 ng의 TnKGloxP와 500 ng의 TnCloxP를 각각 10 ㎕의 Tn5 전위효소(1 unit /㎕)와 DDW(Double Distilled Water)와 반응시켜 총 20 ㎕로 만든 다음, 상온(25 ℃)에서 30분동안 반응시켜 각각의 트래스포좀을 형성시켰다. 이 때, 전위효소의 임의 삽입기능을 억제하기 위하여, 상기 반응은 Mg2+이온이 없는 상황에서 진행시켰다. 그리고 나서, Mg2+이온이 존재하는 반응 조건하에서 통상적인 일렉트로포레이션 방법[Bio-RAD, Bacterial electro-transformation and Plus Controller Instruction Manual, Cat.No 165-2098 ; Thompson, JR, et al. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast 14, 565-571 (1998) ; Grant, SG, et al. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methyllation-restriction mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4645-4649 (1990)]을 통하여 1 ㎕의 트랜스포좀을 대장균 MG1655 균주(서울대 생명과학부 노정혜교수)내로 전달시켰다. 이러한 균을 배양하기 위해 LB배지(tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%)를 사용하였고, 상기 배지내에 소량의 Mg2+이온이 존재하게 하였다. 따라서, 트랜스포좀은 대장균 균주의 세포 내에서 Mg2+이온에 의하여 임의 삽입기능이 활성화되어 대장균 염색체의 임의의 위치로 삽입될 수 있게 된다. 상기 두 종류의 트랜스포존이 삽입된 각각의 대장균 변이주는 트랜스포존에 존재하는 KmR 또는 CmR 유전자 때문에 가나마이신 저항성 또는 클로람페니콜 저항성을 가지므로, 가나마이신 배지 또는 클로람페니콜 배지에서 선별하였다. 이 때, 대장균 MG1655 균주 염색체 내로 삽입된 각각의 트랜스포존을 서던 블러트(Southern blot) 분석을 통하여 확인하였다. 서던 블러트 분석의 조건은 다음과 같다. 트랜스포존이 삽입된 대장균 변이주의 염색체 DNA를 분리하여 이를 ClaI(New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소로 반응시켜 절단시킨 후, 1% 아가로스 젤에서 전기영동을 수행하였다. 이 때, 아가로스 젤의 DNA를 하이본드 N+멤브레인(Hybond N+membrane, Amersham)으로 전이시키고, 전이된 DNA는 방사선동위원소32P로 표지된 KmR 또는 CmR 유전자를 프로브로 사용하여 블러팅 하였다. 트랜스포존의 삽입위치는 임의적 PCR(arbitrary PCR)을 통해 확인하였다(Caetano-Annoles, G. 1993. Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers. PCR Methods Appl., 3, 85-92.).
트랜스포존이 삽입된 위치 주위의 DNA는 트랜스포존 내의 Tn5 삽입서열(insertion sequence)에 특이적인 프라이머와 트랜스포존 바깥쪽의 염색체 DNA에 임의로 결합하는 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 상기 임의적 PCR은 두 단계로 구성된다. 첫 번째 단계에서 트랜스포존 특이적인 프라이머 Tn5Ext(5￠AGCATACATTATACGAAGTTATATTAAG-3￠, (주)제노텍에서 합성)를 이용하여 트랜스포존의 끝부분과 그 바깥쪽 서열을 포함하는 부위의 단일가닥 DNA를 합성하고, 이어서, 불특정 부위에 결합하는 프라이머Arb1(5￠TTGAGCGATAGACGTACGATNNNNNNNNNNGATAT-3￠, (주)제노텍에서 합성)를 상기 합성된 단일가닥 DNA의 불특정 부위에 결합시켜 이중가닥의 DNA로 합성하였다. 두 번째 단계에서 트랜스포존 특이적인 프라이머 Tn5Int와 Arb1의 3' 말단의 25개의 서열과 동일한 프라이머 Arb2 ( 5￠TTGAGCGATAGACGTACGAT-3￠, (주)제노텍에서 합성)를 이용하여 상기 합성한 이중가닥 DNA를 대량으로 증폭시켰다. 증폭된 DNA는 퀴아퀵 스핀 PCR 정제 키트(Qiaquic spin PCR purification kit, Quiagen)을 이용하여 아가로스 젤로부터 분리하였고, 프라이머 Tn5Int(5￠TCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTCA-3￠, (주)제노텍에서 합성)를 이용하여 상기 분리된 DNA의 염기서열 분석을 실행하였으며, 그 결과를 BLAST 프로그램을 이용하여 유전자 은행 DNA 서열(Gene Bank DNA sequence)과 비교하여 삽입위치를 확인하였다. 상기 방법에 의하여 확인된 TnKGloxP 및 TnCloxP 의 삽입위치를 도 3에 나타내었다.
실시예 3
P1 파아지 형질도입법을 이용한 두 종류의 트랜스포존을 가지는 대장균 변이주의 제조
실시예 2에 따라 제조된 TnKGloxP 변이주 라이브러리와 TnCloxP 변이주 라이브러리 중에서, 제거하고자 하는 염색체 특정부위 한 쪽 끝부분과 다른 쪽 끝 부분에 각기 다른 트랜스포존이 존재하도록 변이주를 선별하여, P1 파아지 형질도입법을 이용하여 두 종류의 트랜스포존을 하나의 염색체 상에 제거하고자 하는 특정부위 양쪽에 위치하도록 도입시켰다. 이 때, loxP 부위는 같은 방향으로 위치하도록하였으며, P1 파아지 형질도입법은 이미 알려진 통상적인 실험방법에 따라 수행하였다(Miller,J,H., editors, 1992, A short Course in Bacterial Genetics; A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, New York: Cold Spring Harbor).
실시예 4
pTSCre 발현벡터를 도입시킴으로써 Cre DNA 재조합 효소를 발현시켜 결실변이를 갖는 대장균 변이주의 제조
실시예 3에 따라 제조된 TnKGloxP와 TnCloxP을 제거할 부위 양 끝에 갖는 대장균 변이주에 Cre를 발현시키는 pTSCre 발현벡터(Yoon YG, et al, 1998, Cre/loxP-mediated excision and amplification of the Eshcerichia coli genome, Gene 14, 89-95)를 도입시켰다. pTSCre 발현벡터에 존재하는 Cre 유전자는 테트라사이클린 프로모터(Ptet)에 의해 전사 조절 되므로, 크로로테트라사이클린이 존재하는 배지에서 42℃로 배양하여 Cre DNA 재조합 효소를 발현시켰다. Cre DNA 재조합 효소의 발현결과 얻어지는 염색체 결실변이를 가지는 대장균 변이주는 PCR을 통해 확인하였다.
본 실시예3 및 4에서, b0532 위치에 TnKGloxP가 삽입된 변이주와 b0619 위치에 TnCloxP가 삽입된 변이주, b2011 위치에 TnKGloxP가 삽입된 변이주와 b2073 위치에 TnCloxP가 삽입된 변이주, b2829 위치에 TnKGloxP가 삽입된 변이주와 b2890 위치에 TnCloxP가 삽입된 변이주 및 b4271 위치에 TnKGloxP가 삽입된 변이주와 b4326 위치에 TnCloxP가 삽입된 변이주를 사용하여, 이들을 각각 P1 형질도입시키고 Cre 유전자를 발현시켰으며, 그 결과를 각각 도 4의 A, B, C 및 D에 나타내었다.
실시예 5
P1 파아지 형질도입방법을 반복 수행하여 변이주의 염색체 결실부위가 확장된 변이체 제조
상기 염색체 특정부위가 제거된 각각의 대장균 변이주의 제거된 염색체의 부위를 상기 실시예 3 및 실시예 4와 동일한 방법으로 P1 파아지의 형질도입법을 이용하여 확장시켰다. 우선, 염색체가 제거된 변이주 중 2 개의 변이주를 선택하여 하나를 P1 파아지의 공여자로, 다른 하나를 P1 파아지 용해물(lysate)의 수여자로 하여 P1 파아지 형질도입법을 수행하여 상기 두 변이주의 염색체 제거 부분이 모두 제거된 염색체를 갖는 변이주를 제조한 후, 이를 다시 P1 파아지의 수여자로 하고, 이미 만들어진 다른 염색체 부분이 제거된 변이주를 공여자로하여 연속해서 P1 파아지 형질도입법을 수행함으로써, 하나의 염색체에서 다른 변이주의 염색체의 제거부위를 계속적으로 제거시켜 점진적으로 염색체를 축소시켰다. 이 때, 연속적인 P1 파아지의 형질전환시 원하는 균주의 효과적인 선별을 위하여 동형 재조합(homologous recombination)을 이용하여 P1 파아지 수여자의 선별 마커를 제거한다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 트랜스포존과 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 방법을 이용한 염색체의 특정부위를 제거한 대장균 변이주의 제조방법으로 보다 효율적으로 다양한 부위의 대장균 염색체를 선택적으로 제거하여 특정 부분 염색체가 제거된 대장균변이주의 라이브러리를 획득할 수 있고, 이들을 가지고 P1 파아지 형질전환법을 계속적으로 수행하면 점진적으로 염색체를 축소시켜 선택적으로 염색체가 축소된 다양한 대장균 변이주들을 창조해낼 수 있는 효과가 있다. 이러한 방법으로 대장균내 성장에 불필요한 유전자를 제거함으로써, 보다 유전적으로 간단한 염색체를 가지는 대장균 변이주를 구축하여, 이를 여러 가지 유전체 기능연구에 사용할 수 있다. 또한, 성장에 불필요한 유전자들을 제거함으로써 빠른 성장을 보이는 대장균 변이주를 선별하여 산업용 인공균주로서 사용할 수도 있다. 또한, 대장균에서뿐만 아니라 다른 미생물에서도 본 발명을 적용함으로써, 염색체가 선택적으로 축소된 다양한 미생물 변이주들을 창조해낼 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법에 의하여 제조된 축소된 미생물 염색체에 외래의 새로운 대사에 관련 유전자를 모아 카세트를 만들어 도입하여 여러 가지 유용한 기능들을 가지게 되는 새로운 생물체를 만드는데 적용 될 수도 있다.
<110> Korea Advanced institute of Science and Technology <120> CONSTRUCTION OF NOVEL STRAINS CONTAINING MINIMIZING GENOME BY Tn5-COUPLED Cre/loxP EXCISION SYSTEM <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TnKGloxP <400> 1 attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca 60 gctgtctctt atacacatct caaccatcat cgatgaattc gagctcggta cccgggttga 120 actgcggatc ttgcggccgc aaaaattaaa aatgaagttt tgacggtatc gaaccccaga 180 gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag 240 cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa 300 tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt 360 cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat 420 gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tccgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg 480 ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca 540 tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg 600 gatcaagcgt atgcagccgc 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360 caagggtatc accttcaaac ttgacttcag cacgcgtctt gtagttcccg tcatctttga 420 aagatatagt gcgttcctgt acataacctt cgggcatggc actcttgaaa aagtcatgcc 480 gtttcatatg atccggataa cgggaaaagc attgaacacc ataagagaaa gtagtgacaa 540 gtgttggcca tggaacaggt agttttccag tagtgcaaat aaatttaagg gtaagttttc 600 cgtatgttgc atcaccttca ccctctccac tgacagaaaa tttgtgccca ttaacatcac 660 catctaattc aacaagaatt gggacaactc cagtgaaaag ttcttctcct ttactcattt 720 tttctaccgg tacccgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag cttggcgtaa 780 tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 840 cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 900 attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaatc caagggc 947 <210> 7 <211> 1069 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmR gene <400> 7 gcaaaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 60 acagttacca atgcttaatc agtgaggcac caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg 120 ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca 180 tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta 240 taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa 300 tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac 360 cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt 420 agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc 480 tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc 540 attgccatac ggaatttcgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc 600 ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga 660 acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga 720 tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc 780 ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta 840 tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca aaagttggcc 900 cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa gtgatcttcc 960 gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt actgatttag 1020 tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagc 1069 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-pMOD<MCS>FP-1 <400> 8 attcaggctg cgcaactgt 19 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-pMOD<MCS>RP-1 <400> 9 tcagtgagcg aggaagcgga ag 22 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-Tn5Ext <400> 10 agcatacatt atacgaagtt atattaag 28 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-Arb1 <400> 11 ttgagcgata gacgtacgat nnnnnnnnnn gatat 35 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-Arb2 <400> 12 ttgagcgata gacgtacgat 20 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-Tn5Int <400> 13 tcgacctgca ggcatgcaag cttca 25

Claims (8)

  1. 한 쪽 말단에 SEQ ID NO:3의 서열을 갖는 19 bp의 Tn5의 전위효소 인식부위를 갖고 다른 쪽 말단에 이와 역상보적인 서열을 가지며, SEQ ID NO:4로 표현되는 loxP 부위와 SEQ ID NO:5로 표현되는 KmR 유전자 및 SEQ ID NO:6으로 표현되는 GFP 유전자를 갖는 트랜스포존 TnKGloxP.
  2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:1의 염기서열로 구성되는 트랜스포존 TnKGloxP.
  3. 한 쪽 말단에 SEQ ID NO:3의 서열을 갖는 19 bp의 Tn5의 전위효소 인식부위를 갖고 다른 쪽 말단에 이와 역상보적인 서열을 가지며, SEQ ID NO:4로 표현되는 loxP 부위와 SEQ ID NO:7로 표현되는 CmR 유전자를 갖는 트랜스포존 TnCloxP.
  4. 제 3 항에 있어서, SEQ ID NO:2의 염기서열로 구성되는 트랜스포존 TnCloxP.
  5. 전이효소 인식부위, loxP 부위 및 서로 다른 선별 마커를 갖는 두 종류의 트랜스포존을 제조하는 단계,
    상기 두 종류의 트랜스포존을 각각 미생물 염색체의 임의의 위치에 삽입하고삽입된 위치를 확인하는 단계,
    P1 파아지 형질도입법(P1 phage transduction)을 이용하여 상기 두 종류의 서로 다른 선별마커를 가진 트랜스포존을 하나의 염색체 상에 위치시키는 단계, 및
    상기 염색체에 Cre 유전자를 삽입하고 이를 발현시켜 두 개의 loxP 부위 사이의 염색체 부분을 제거하는 단계를 포함하는, 특정 염색체 부위가 제거된 미생물 변이주 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 두 종류의 트랜스포존 중 하나가 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 트랜스포존 TnKGloxP이고 다른 하나가 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 트랜스포존 TnCloxP인 미생물 변이주 제조방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 리가아제를 이용하여 GFP 유전자를 선상의 KmR 및 loxP 부위를 갖는 pKKloxP 벡터에 삽입하여 새로운 벡터 pKGloxP를 제조하는 단계, 상기 pKGloxP 벡터에 제한효소를 처리하여, KmR, GFP 및 loxP 부위를 갖는 DNA 조각을 분리해 내는 단계, 리가아제를 이용하여 상기 분리해낸 DNA 조각을 선상의 pMODTM<MCS> 벡터에 삽입하여 pTnKGloxP 벡터를 제조하는 단계, 및 상기 pTnKGloxp 벡터를 PCR 수행시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 SEQ ID NO:1의 염기서열을 포함하는 트랜스포존 TnKGloxP를 제조하고,
    CmR와 loxP 부위를 갖는 pKCloxP 벡터에 제한효소를 처리하여, CmR와 loxP 부위를 갖는 DNA 조각을 분리해 내는 단계, 리가아제를 사용하여 상기 DNA 조각을선상의 pMODTM<MCS> 벡터에 삽입하여 pTnCloxP 벡터를 제조하는 단계, 및 상기 pTnCloxP 벡터를 PCR 수행시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 SEQ ID NO:2의 염기서열을 포함하는 트랜스포존 TnCloxP을 제조하여 수행하는 미생물 변이주 제조방법.
  8. 제 5 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 염색체가 제거된 변이주 중에서 2 개의 변이주를 선택하여 하나를 공여자(donor)로, 다른 하나를 수여자(recipient)로 하여 P1 파아지 형질도입법을 수행하여, 상기 두 변이주의 염색체 제거 부분이 모두 제거된 염색체를 갖는 변이주를 제조한 후, 이를 다시 P1 파아지의 수여자로 하고 이미 만들어진 다른 염색체 부분이 제거된 변이주를 공여자로하여 연속적으로 P1 파아지 형질도입법을 수행함으로써, 하나의 염색체에서 다른 변이주의 염색체의 제거부위가 계속적으로 제거되어 점진적으로 염색체를 축소시키는 단계를 추가적으로 포함하는 미생물 변이주 제조방법.
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