JP2005517447A - Tn5結合Cre/loxP切除システムによる最小化ゲノムを含む新規菌株の構築 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、毎実験ごとにターゲティングベクターを調製してPCR(polymerase chain reaction)を行う必要があった従来の方法を改善するための、トランスポゾンとCre/loxP部位特異的組換えを利用する、染色体の特定部位を除去する方法に関する。
下記工程:
(1)外端トランスポザーゼ認識配列、loxP部位及び異なる選択可能なマーカーを含む二種類のトランスポゾンを調製すること、
(2)前記二種類のトランスポゾンを異なる微生物染色体の任意の位置にそれぞれ挿入し、それぞれの挿入された部位を決定すること、
(3)P1ファージ形質導入によって二つの微生物染色体を一体化し、異なる選択可能なマーカーを含む二種類のトランスポゾンを一つの染色体上に位置させること、及び
(4)導入されたCre発現ベクターによってCre遺伝子を発現させることによって二つのloxP部位間の染色体部位を除去すること
を含む。
− リガーゼを利用してGFP遺伝子を線状(linear)のKmR及びloxP部位を含むpKKloxPベクターに挿入して、新しいベクターpKGloxPを調製する工程と、
前記pKGloxPベクターに制限酵素を処理して、KmR、GFP及びloxP部位を含むDNA断片を分離する工程と、
リガーゼを利用して前記分離したDNA断片を線状のpMODTM<MCS>ベクターに挿入してpTnKGloxPベクターを調製する工程と、
前記pTnKGloxpベクターのPCRを行う工程とを含む。
CmRとloxP部位を有するpKCloxPベクターに制限酵素を処理して、CmRとloxP部位を含むDNA断片を分離する工程と、
リガーゼを使用して前記分離されたDNA断片を線状のpMODTM<MCS>ベクターに挿入してpTnCloxPベクターを調製する工程と、
前記pTnCloxPベクターのPCRを行う工程とを含む。
大腸菌染色体の任意の部位に挿入可能なトランスポゾンTnKGloxPとTnCloxPの調製
図1は直線型のトランスポゾンTnKGloxPとTnCloxPを示したもので、TnKGloxPはKmR、GFP(pGFPuv、Clontech、Palo Alto、CA)及びloxP部位を含み、TnCloxPはCmRとloxP部位を含んでいる。前記二種類のトランスポゾンは、その両側末端に19塩基対を含む外端トランスポザーゼ認識配列(Epicentre technologies、Madison、WI)を有している。図1から分かるように、前記トランスポゾンTnKGloxPとTnCloxPは、それぞれpTnKGloxPベクターとpTnCloxPベクターからPCRによって得ることができる。
pMOD<MCS>FP-1:5¢ATTCAGGCTGCGCAACTGT-3¢
pMOD<MCS>RP-1:5¢-TCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG-3¢
トランスポゾンTnKGloxPとTnCloxPを大腸菌染色体の任意の部位に挿入させた二種類の大腸菌突然変異体ライブラリーの調製及び挿入された部位確認
500ngのTnKGloxP及び500ngのTnCloxPをそれぞれ10μlのTn5トランスポザーゼと反応させ、そしてDDW(Double Distilled Water)を加え、溶液の総容量を20μlにした後、25℃で30分間反応させて各トランスポゾームを形成させた。このとき、トランスポザーゼの任意の挿入機能を阻害するために、前記反応は、Mg2+イオンのない状況で行った。その後、Mg2+イオンの存在する反応条件下で通常的なエレクトロポレーション方法[Bio-RAD,Bacterial electro-transformation and Plus Controller Instruction Manual,Cat.No 165-2098;Thompson,JR,et al.An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation.Yeast 14,565-571 (1998);Grant,SG,et al.Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methyllation-restriction mutants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,4645-4649 (1990)]により1μlのトランスポゾームを大腸菌MG1655菌株(ソウル大生命科学部ノジョンヘ教授)内に移した。このような菌を培養するためにLB培地(トリプトン1%、イーストエキストラクト0.5%、NaCl 0.5%)を使用し、前記培地内には、少量のMg2+イオンが含まれた。
P1ファージ形質導入法による染色体上に二種類のトランスポゾンを含む大腸菌突然変異体の構築
実施例2によって調製されたTnKGloxP突然変異体ライブラリーとTnCloxP突然変異体ライブラリーから、除去しようとする染色体の特定部位の一方端部と他方端部に異なるトランスポゾンを有する突然変異体を選択した。次に、P1ファージ形質導入法を利用して、二種類のトランスポゾンを、一つのトランスポゾンが除去しようとする染色体の一方の末端に位置し、そして他のトランスポゾンが他方の末端に位置するように導入させた。loxPを同じ方向に位置させ、P1ファージ形質導入法は、周知のプロトコールによって行った(Miller,J,H.,editors,1992,A short Course in Bacterial Genetics;A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria,New York:Cold Spring Harbor)。
pTSCre発現ベクターを導入させることによるCre DNAリコンビナーゼを発現させることによる欠失突然変異を含む大腸菌突然変異体の調製
除去しようとする染色体の両端にTnKGloxPとTnCloxPを有する大腸菌突然変異体に、pTSCre発現ベクター(Yoon YG,et al,1998,Cre/loxP-mediated excision and amplification of the Eshcerichia coli genome,Gene 14,89-95)を導入させた。pTSCre発現ベクターに存在するCre遺伝子の転写は、テトラサイクリンプロモーター(Ptet)により制御されるため、クロロテトラサイクリンを含む培地で42℃で培養してCreリコンビナーゼを発現させた。Cre DNAリコンビナーゼの発現によって得られる染色体の欠失突然変異を有する大腸菌突然変異体を、PCRによって確認した。
P1ファージ形質導入方法を反復的に行うことによる拡張された染色体欠失部位を有する突然変異体の構築
特定の染色体部位を含む大腸菌突然変異体の染色体の除去された部位を前記実施例3及び4に記載されたようにP1ファージ形質導入によって拡張させた。まず、特定の染色体部位が除去された突然変異体から二個の突然変異体を選択した。一つをP1ファージの供与者にし、他の一つをP1ファージ溶解物(lysate)の授与者にしてP1ファージ形質導入法を行い、前記二つの変異株の染色体除去部分が全て除去された染色体を有する新しい突然変異体を調製した。次に、この突然変異体を再びP1ファージの授与者にし、既に作られた他の染色体部分が除去された変異株を供与者にして、連続的かつ反復的にP1ファージ形質導入法を行った。この方法によって、前記で得られた突然変異体の染色体から他の突然変異体の染色体の除去部位を反復的に除去させた。連続的なP1ファージの形質導入において、微生物の効果的な選択のために、相同組換え(homologous recombination)を利用してP1授与者として作用するの選択可能なマーカーを除去した。
Claims (8)
- 一方の末端の配列番号3の塩基配列を有する外端トランスポザーゼ認識配列、他方の末端のその逆相補的な配列、配列番号4で表現されるloxP部位、配列番号5で表現されるKmR遺伝子、及び配列番号6で表現されるGFP遺伝子を含む、トランスポゾンTnKGloxP。
- 配列番号1の塩基配列を含む、請求項1記載のトランスポゾンTnKGloxP。
- 一方の末端の配列番号3の塩基配列を有する外端トランスポザーゼ認識配列、他方の末端のその逆相補的な配列、配列番号4で表現されるloxP部位、及び配列番号7で表現されるCmR遺伝子を含む、トランスポゾンTnCloxP。
- 配列番号2の塩基配列を含む、請求項3記載のトランスポゾンTnCloxP。
- 下記工程:
(1)外端トランスポザーゼ認識配列、loxP部位及び異なる選択可能なマーカーを含む二種類のトランスポゾンを調製すること、
(2)前記二種類のトランスポゾンを異なる微生物染色体の任意の位置にそれぞれ挿入し、それぞれの挿入された部位を決定すること、
(3)P1ファージ形質導入によって二つの微生物染色体を一体化し、異なる選択可能なマーカーを含む二種類のトランスポゾンを一つの染色体上に位置させること、及び
(4)導入されたCre発現ベクターによってCre遺伝子を発現させることによって二つのloxP部位間の染色体部位を除去すること
を含む、特定の染色体部位の欠失を含む新規菌株の構築方法。 - 前記二種類のトランスポゾンが、請求項1または請求項2に係るトランスポゾンTnKGloxP及び請求項3または請求項4に係るトランスポゾンTnCloxPである、請求項5記載の新規菌株の構築方法。
- 請求項5記載の新規菌株の構築方法であって、
− 配列番号1の塩基配列を含むトランスポゾンTnKGloxPを、
リガーゼを用いてGFP遺伝子をKmR及びloxPを有する線状のpKKloxPベクター内に挿入することによってベクターpKGloxPを調製すること
上記pKGloxPベクターを制限酵素で処理することによってKmR、GFP及びloxP部位を含むDNA断片を分離すること、
リガーゼを用いて上記分離されたDNA断片を線状pMODTM<MCS>ベクターに挿入することによってpTnKGloxPベクターを調製すること、
上記pTnKGloxPベクターのPCRを行うこと、
によって調製し、そして、
− 配列番号2の塩基配列を含むトランスポゾンTnCloxPを、
上記CmR及びloxP部位を含むpKGloxPベクターを制限酵素で処理することによってCmR及びloxP部位を含むDNA断片を分離すること、
上記分離されたDNA断片をリガーゼを用いて線状pMODTM<MCS>ベクターに挿入することによってpTnCloxPベクターを調製すること、及び
上記pTnCloxPベクターのPCRを行うこと
によって調製する、新規菌株の構築方法。 - 請求項5又は7記載の新規菌株の構築方法であって、下記工程:
− 特定の染色体部位の欠失を含む突然変異体から2つの突然変異体を選択し、そして選択された突然変異の一方をドナーとしてそして他方をレシピエントとして用いるP1ファージ形質導入を行い、上記2つの突然変異体の全ての染色体欠失部位を含む新規突然変異体を構築すること、
− P1ファージレシピエントとして上記で得られた突然変異体、そしてドナーとして特定の染色体部位の欠失を含む既に調製された突然変異体を用い、P1ファージ形質導入を連続的かつ反復的に行うこと、及び
− 連続的に得られた突然変異体の染色体から他のドナー突然変異体の染色体欠失部位を除去し、得られた突然変異体の染色体を徐々に短くすること
をさらに含む、新規菌株の構築方法。
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