JP4927730B2 - 改変トランスポゾンベクター及びその利用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子組換え技術により得られる改変トランスポゾンベクター及びその利用方法に関する。より詳細には、トランスポゾン特有のゲノム上を転移する機能を抑え、且つ大きなサイズの外来遺伝子を細胞に導入することを可能にする改変トランスポゾンベクター及びその利用方法に関する。
今日、目覚ましい進歩を遂げた遺伝子導入技術は、動物細胞に外来遺伝子を導入して得られる遺伝子組換えタンパク質の生産や遺伝子組換え生物の作製、遺伝子治療において欠かせない技術となっている。
遺伝子導入技術の中で最も重要な点は、目的とする遺伝子を効率良く細胞に導入し、これを安定的に発現させることである。通常、目的の遺伝子を発現する動物細胞或いは動物個体（以下、「組換え体」と総称する）を得るには、当該遺伝子を発現させるためのカセット（プロモーター、当該遺伝子、ポリA付加シグナル配列からなるカセット；以降、「発現カセット」と略す）と遺伝子導入のマーカーとなる薬剤耐性遺伝子の発現カセットをEG細胞或いはES細胞などの個体化可能な細胞に導入し、安定的に導入遺伝子を発現する組換え体を選別する手法がとられる。このとき、当該遺伝子や薬剤耐性遺伝子の発現カセットを導入するために用いる道具がベクターと呼ばれるものである。安定的に当該遺伝子を発現する組換え体を効率良く得るためには、如何に効率良く宿主（遺伝子導入の対象となる細胞或いは動物個体）の染色体DNAに挿入させるかが鍵となり、この点において重要となるのが用いるベクターの種類である。用いるベクターにより宿主の染色体DNAへの挿入効率は大きく異なり、その後の組換え体の作出効率にも大きく影響する。
今日、動物細胞或いは動物個体への目的遺伝子の導入に利用されるベクターは、ウイルス粒子内のウイルスゲノムを利用するウイルスベクターと非ウイルスベクターに大別される。染色体DNAへの挿入という観点から、両ベクターの特徴について、以下に概説する。
ウイルスベクターは、その名が示すようにウイルスゲノム内に目的遺伝子の発現ユニットを挿入し、当該遺伝子をゲノム内に保持したウイルス粒子を作製し、これを動物細胞或いは受精卵、時には動物個体そのものに感染させることで、当該遺伝子を導入するものである。このタイプのベクターに分類されるものとして、宿主の染色体DNAへの挿入が可能なベクターと宿主の染色体DNAには挿入されずエピソームとして存在するベクターがある。前者の例としてはオンコレトロウイルス、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスベクターがあり、後者の例としてはアデノウイルス及びヘルペスウイルスベクターが知られている。
これらウイルスベクターは、オリジナルのウイルスが有する細胞への感染力を利用することから、細胞内への目的遺伝子の導入効率が高い。また、オリジナルのウイルスが有する細胞種特異性を維持することから、導入できる細胞種に制限がある。さらに、宿主の染色体DNAへの挿入が可能なオンコレトロウイルスやレンチウイルスベクターを利用した場合、複製可能なウイルス粒子の出現やゲノム内への逆転写酵素の挿入による内在性レトロウイルスの産生による目的の遺伝子発現産物へのウイルス混入のおそれ等、安全性面での懸念が存在する。
一方、非ウイルスベクターとしては主にプラスミドベクターが利用されている。プラスミドベクターは、大腸菌の染色体外で複製・保持される環状の核外遺伝子とし発見されたプラスミドをベクターとして利用したものである。プラスミドベクターでは、目的遺伝子を挿入しても大腸菌内で容易に増やせることから、動物細胞への遺伝子導入ベクターとして汎用されている。しかし、プラスミドベクターはDNAそのものであることから、マイクロインジェクション法や電気穿孔法等の物理的な操作を行わない限り、そのままの状態で細胞内に導入することは難しい。現在、物理的手法以外に効率良く細胞内に導入する方法として、リン酸カルシウム共沈法やDEAE-デキストランやカチオン性脂質との複合体形成法が用いられている。このような工夫により、細胞内への遺伝子の導入効率は徐々に改善しているが、先に述べたウイルスベクターを利用する方法と比較するとかなり劣ると言わざるを得ない。さらに、最も重要な点は、プラスミドベクターとして目的遺伝子を導入した場合、その遺伝子が宿主の染色体DNAに挿入される確率は極めて低く、細胞質から核内にまで到達できたベクターが染色体の複製時に偶然挿入されるに過ぎない。プラスミドベクターはこのような欠点を有するものの、安全性の面ではウイルスベクターよりも優れており、現在までのところ、本ベクターで得られた組換え体でしか組換えタンパク質の生産には利用されていない。
近年、プラスミドベクター最大の弱点の一つである、宿主の染色体DNAへの挿入効率の低さを改善するために、染色体DNAへの挿入機構を有するトランスポゾンを利用したベクターが開発されている。トランスポゾンとは染色体上を転移する遺伝子という意味であり、バーバラマクリントックによりその存在が初めて報告されて以降、種々の生物の染色体上に存在することが明らかとなった（例えば、非特許文献１）。
トランスポゾンは大きく２つの種類に分けられる（例えば、非特許文献２参照）。一つは、クラスIに分類されるレトロ型のトランスポゾンであり、もう一つはクラスIIに分類されるDNA型のトランスポゾンである。クラスIのレトロ型トランスポゾンは、染色体上にDNAとして存在しているが、いったんRNAに転写された後、内部にコードされている逆転写酵素の働きでRNAから相補DNA（cDNA）に変換され、染色体上に再挿入される。したがって、この型のトランスポゾンは活性を有する限り、絶えず自身の複製を増やす傾向にある。さらに、レトロ型トランスポゾンは、逆転写酵素を有するか否かにより大きく２つのグループに分けられ、逆転写酵素をコードしていないものは自身では移動することができず、他から逆転写酵素を借りて転移する、非自立的なレトロ型トランスポゾンである。また、逆転写酵素をコードしているグループは、さらに長い末端反復配列（Long Terminal Repeat；LTR）を持つものと持たないものに大別される。いわゆるレトロウイルスは、そのゲノムの末端にLTR配列を有し、逆転写酵素をコードしていることから、レトロトランスポゾンの一種とも考えられる。
一方、クラスIIのDNA型トランスポゾンは、自身がコードするトランスポゼースと呼ばれる転移触媒酵素の働きにより、染色体上の挿入位置から切り取られ、別の位置に再挿入される。このような転移形式からカットアンドペースト型のトランスポゾンとも呼ばれる。この型のトランスポゾンの特徴は、トランスポゾン遺伝子の両末端に十数塩基から数百塩基にも及ぶ互いに逆向きの配列（Terminal Inverted Repeat；TIR）を有し、その内部にはトランスポゼースをコードする遺伝子を有している。そして、発現したトランスポゼースが、両末端のTIR配列を認識・結合し、これを染色体DNAから切り出して染色体DNA上の別の部位に挿入する反応を担い、染色体上を転移することを可能にしている。これまでに報告されている転移活性のある主なトランスポゾンは、一部を除いて細菌、植物、昆虫に限られている。しかし、１９９７年IvicsらはTc1/mariner superfamilyに属するサケ由来のトランスポゾンを単離し、遺伝子変異の蓄積により不活性化されたトランスポゼースをコードする遺伝子をすべて修復することで、ついにカットアンドペースト活性を復活した本酵素の再生に成功し、Sleeping Beautyと命名した（例えば、非特許文献３参照）。このSleeping Beautyは、魚由来の細胞だけでなく、哺乳類の細胞でも転移能を有することが明らかにされ、その染色体DNAへの導入率は一般的なトランスフェクションによる遺伝子導入率の８０倍に達している（例えば、非特許文献４参照）。
表１には、これまでに報告されている、Tc1/mariner superfamilyに属する活性型のトランスポゾンを示す。ここに示す活性型トランスポゾンの中でも、Sleeping Beautyは最も高い転移能を有することが明らかとなり（例えば、非特許文献５参照）、さらには転移活性発現にあたって宿主由来の因子を必要としないという性質も重なり、動物細胞や個体への効率の良い、非ウイルス型の遺伝子導入ベクターとしての利用が始まっている。
Ivicsらが開発したトランスポゾンベクターシステムは、両末端にアカヒレ由来のTIR配列を持つトランスポゾンベクターに目的とする遺伝子の発現ユニットを挿入したプラスミドと、染色体DNAへの転移に必要なトランスポゼース（Sleeping Beauty）の発現ユニットを挿入したプラスミドを同時に細胞に導入するものである。この方法により、目的とする遺伝子を細胞の染色体DNAに持つクローンのみを選別することで、トランスポゾンの性質である染色体DNA挿入後の転移を回避できるようにしている。さらに、本システムに用いているトランスポゾンベクターは、Tc1/mariner superfamilyの中でもTc3タイプに特徴的な比較的長いTIR配列を有し、その中にはダイレクトリピート（DR）と呼ばれる２箇所のトランスポゼース結合配列を持つ（図１）。
以上述べてきたように、Sleeping Beautyに代表されるトランスポゾンベクターは、非ウイルスベクターでありながら染色体DNAへの高い挿入効率と広い宿主スペクトルを示すことから、今後、遺伝子導入のためのベクターとしての利用が増えるものと予想される。
このような遺伝子導入のためのベクター開発が進む一方で、DNA上の特定の位置への遺伝子の挿入や、特定の遺伝子の欠失又は置換を起こすための技術にも大きな進展が見られている。その代表的な技術がCre-Lox及びFlp-FRT組換えシステムと呼ばれる組換え機構を利用したものである。
Cre-Lox組換えシステムは、バクテリオファージP1で発見された組換え機構を応用したものであり、組換えが生じる場である34塩基からなるLoxP配列と、組換え反応を担う酵素（リコンビナーゼ）であるCreという２つの要素から成る。野生型のLoxPでの組換え反応では、Creの存在下において、LoxP配列で挟まれたDNA配列が脱落する反応と、逆にLoxP配列を持つ環状DNAを別のDNA上に存在するLoxP配列に挿入する反応のいずれも生じうる。しかし、野生型のLoxPの場合、LoxP配列に挿入する反応よりもLoxP配列で挟まれたDNA配列が脱落する反応のほうが優位であることから、LoxP配列にDNA配列を挿入する反応を期待することは難しい（図２）。この問題の解決のために、今日ではLoxPの変異配列が作製され、野生型のLoxP配列では期待できない挿入反応や置換反応に応用されている。表２には主に利用されている変異Lox配列と変異箇所を示す。これら変異Loxを用いたCre-Loxシステムを利用することで、これまでの野生型のLoxPでは困難であった、効率的なLox配列へのDNAの挿入やLox配列間でのDNA配列の置換が可能となっている（図３）。
また、Flp-FRT組換えシステムは、酵母（Saccharomyces cerevisiae）で発見された組換え機構を応用したもので、Cre-Loxシステムと同様に、組換えが生じる場である48塩基からなるFRT配列と、組換え反応を担うリコンビナーゼであるFlpという２つの要素から成る。本組換えシステムでも、脱落反応によりFRT配列で挟まれたDNA配列を除いたり、逆にFRT配列にFRT配列を持つ環状DNAを挿入することが可能である。
このように、一旦、特定の配列を染色体DNAに挿入することができれば、上述の組換えシステムを利用することにより、特定の領域（組換え反応が生じる場の配列上）での遺伝子の挿入、脱落或いは置換反応を引き起こすことが可能となっている。
Richardson RDら、Stem Cells, 20, 105-118, 2002
Finnegan, Curr. Opin. Genet. Dev., 2, 861-867, 1992
Ivics Zら、Cell, 91, 501-510, 1997
Yant SRら、Nat. Genet., 25, 35-41, 2000
Sylvia EJら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 6759-6764, 2001
前述のように、Tc1/mariner superfamilyに属するトランスポゾンベクターとSleeping Beautyを用いるシステムは、細胞の染色体DNAへの遺伝子導入ベクターの中でも、安全で導入効率の高いベクターとして利用が進むものと予想されるが、以下の問題点を抱えている。
第一の問題点として、トランスポゾン活性により染色体DNAへの挿入が期待できる遺伝子サイズには制限があるという点である。報告によれば、トランスポゾンベクター中で最も遺伝子導入効率の高いSleeping Beautyを用いるシステムは、挿入対象となるDNAサイズが大きくなればなるほど、その導入効率は低下し、インサートサイズが６kbpを超えると導入効率が極端に低下する（J. Mol. Biol., 302, 93-102, 2000）。遺伝子を導入する場合、目的の遺伝子に加えて、そのmRNA転写に必要なプロモーター配列と転写されたmRNAの安定化に必要なポリA付加シグナル配列が必要である。このため、6kbpというサイズの制限は目的遺伝子の発現を意図する場合、挿入できる遺伝子の種類が制限されることになる。また、遺伝子によってはコードする数種のペプチドが会合してポリマーを形成して初めて活性のあるタンパク質となる場合もあり、活性を保持したタンパク質を発現させるために数種の発現カセットを挿入することも必要とされる。さらに、目的の遺伝子が導入されている細胞或いは動物個体を選別するために、致死性の薬剤に対する耐性を付与する薬剤耐性遺伝子の発現カセットも同時に挿入する必要がある。このように複数の遺伝子を細胞に導入する場合、一般的には必要な数の遺伝子発現カセットをそれぞれ別々のプラスミドに挿入して、同時に細胞内に導入するという手法がとられる。しかし、トランスポゾンベクターの場合、染色体DNA内に挿入される発現カセットは１コピーと言われており、その挿入機構から考えると、同時に細胞内に導入してもいずれか一つの発現カセットしか挿入できない可能性もある。
さらに、例えばフォンビルブランド因子や血液凝固第８因子のように、組換え医薬品として有用なものの中には、一つのタンパク質をコードする遺伝子だけでも8kbpを超えるものも存在する（Science, 228, 1401-, 1985、Nature, 312, 330-,）。このような巨大な遺伝子を発現させようとする場合、先に述べたように複数のベクターに分けて遺伝子を導入することは不可能であり、導入できる遺伝子サイズに6kbpという制限が存在するのは致命的である。
第二の問題点として、トランスポゾンベクターによって挿入された遺伝子が染色体DNA上を転移する可能性の存在である。細胞或いは個体への遺伝子導入のためのベクター要件として、第一に導入効率が高いこと、第二に導入された遺伝子が安定的に発現されること、そして第三に安全であることが必要と考えられる。これらの要件の中で、オンコレトロウイルスやレンチウイルスなどのウイルスベクターに比較してトランスポゾンベクターが勝るものは、ウイルス粒子形成の心配がなく、安全であるという点である。トランスポゾンベクターは、その存在が知られるきっかけとなった染色体DNA上を転移する性質を利用するベクターであることから、導入後は染色体DNA上を転移する活性を保持したままの状態で存在することになる。仮に、この活性を維持したトランスポゾンベクターがその発現産物である組換えたんぱく質中に混入するおそれがあるとすれば、安全性の面での懸念が生じ、ウイルスベクター同様その利用は限定的なものになると考えられる。
先に述べたように、トランスポゾンとして転移するには、TIR配列とともにトランスポゼースの発現が必要である。したがってIvicsらが行ったように、TIR配列で挿まれた導入すべき目的の遺伝子を有するトランスポゾンベクターとトランスポゼースの発現カセットを挿入したプラスミドを別々にして導入することで、目的の遺伝子のみを挿入した動物細胞或いは個体を選別することは可能である。一般的に考えれば、DNAの転移に必要な因子のうちの一つ（トランスポゼース）を除くことで転移能を失わせることができると考えられる。
DNA型トランスポゾンの特徴として、自立的転移能を有するトランスポゾン（活性のあるトランスポゼースを発現するトランスポゾン）が同じゲノム内に存在すれば、非自立的トランスポゾン（トランスポゼース活性を消失したトランスポゾン）も転移する性質を有する。言い換えれば、活性のあるトランスポゼースの供給さえあれば、トランスポゾンは転移する能力を保持していると言える。実際、hATファミリーに属する非自立型のTol1トランスポゾンを導入したメダカにおいて、ゲノム内での転移が明らかとなっている（蛋白質核酸酵素 49,2103-2110, 2004）。この転移再開の原因は明らかではないが、１）宿主自身がゲノム内に有する不活性化されたトランスポゼースが自然に生じた突然変異により活性体に再構築された、２）転移活性を有するトランスポゾンが他の種から侵入した、などが考えられている。活性のあるトランスポゾンの他種からの侵入に関しては、hATファミリーに属するhoboのトランスポゼースが同じhATファミリーに属するHermesを転移させる能力を有すること（Insect Mol. Biol., 8, 359-, 1999）からも、十分に起こりうると考えられる。Sleeping Beautyが属するTc1/mariner superfamilyにおいて、直接的にこのようなクロス転移反応が証明されているわけではないが、このファミリーのトランスポゾンが種々の動物種に活性のある状態で存在することを考慮すれば、本トランスポゾンベクターのゲノム内での再転移の可能性を完全に否定することはできない（Insect Biochem. Mol. Biol., 34, 121-, 2004）。
上述した機構での再転移の可能性が存在する以上、活性のあるトランスポゼースを保持していない動物細胞或いは個体を単に選別するだけで、導入したトランスポゾンベクターの再転移を防ぐことはできないと予想される。
導入したトランスポゾンベクターの再転移は、染色体DNA上の位置の変更を意味することから、選別により高発現を獲得した動物細胞においては、ポジショナル効果と呼ばれる発現量の低下を引き起こすと考えられる。一方、動物個体においては導入遺伝子の発現量への影響に留まらず、再転移された位置によっては個体そのものの生存にも影響がある。また、発現産物である組換えタンパク質の安全性を評価する上で、再転移の可能性が存在することは、導入したトランスポゾンベクターの最終産物への混入とそのヒト染色体DNAへの挿入の可能性を否定する必要が生じることを意味する。この再転移の懸念は、トランスポゾンベクターを遺伝子治療のベクターとして利用しようとする場合には、特に大きな障害となることが容易に想像できる。
以上述べたように、動物細胞や個体に遺伝子を導入するためのベクターとして、従来のSleeping Beautyに代表されるトランスポゾンベクターシステムを利用するには課題が存在し、単なる外来遺伝子発現細胞の作製に止まらず、組換え医薬品の生産や遺伝子組換え動物の作出に幅広く利用するには、その課題の克服が切望される。
したがって、本発明の目的は、上述の課題の克服が可能な外来遺伝子を細胞に導入する為のトランスポゾンベクターの改変体（以下、「改変トランスポゾンベクター」と称する）を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、上記の改変トランスポゾンベクターを用いて、トランスポゾン特有のゲノム上を転移する機能を抑え、且つ大きなサイズの外来遺伝子を細胞に導入する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間にピューロマイシン耐性酵素遺伝子発現カセットが挿入された核酸断片を有するトランスポゾンベクターをトランスポゼース発現プラスミドと共にHeLa細胞に導入した場合の形質転換効率（細胞導入効率）と、5’側TIR配列又は3’側TIR配列の少なくとも一方のDR領域の間にLox配列を挿入した前記核酸断片を有する改変トランスポゾンベクターを同プラスミドと共に同細胞に導入した場合の形質転換効率とが同じであることを見出した。
更に、改変トランスポゾンベクターが導入されたHeLa細胞に、両末端にLox配列を付加したクラゲ緑色蛍光蛋白（GFP）／アミノグリコシド3’ホスホトランスフェラーゼ（neo）遺伝子発現カッセトを有するプラスミド（以下、「ドナープラスミド」と称することもある）をCre遺伝子発現プラスミドと共に導入したところ、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子とGFP／neo遺伝子が置換されることを見出し、かつ置換した遺伝子はトランスポゼース存在下でも転移活性が認められないことを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明は、以下に示す改変トランスポゾンベクター及びこれを用いて外来遺伝子を発現させる方法並びに該方法により得られる形質転換細胞及び遺伝子組換え動物を提供するものである。
１．下記（イ）〜（ロ）又は（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクター：
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された。
２．トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である上記１の改変トランスポゾンベクター。
３．組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である上記１又は２の何れかの改変トランスポゾンベクター。
４．該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である上記３の改変トランスポゾンベクター。
５．該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される上記４の改変トランスポゾンベクター。
６．LoxP配列、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272及びLox511配列がそれぞれ配列番号３、４、５、６及び７である上記４又は５の何れかの改変トランスポゾンベクター。
１．下記（イ）〜（ロ）又は（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクター：
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された。
２．トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である上記１の改変トランスポゾンベクター。
３．組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である上記１又は２の何れかの改変トランスポゾンベクター。
４．該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である上記３の改変トランスポゾンベクター。
５．該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される上記４の改変トランスポゾンベクター。
６．LoxP配列、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272及びLox511配列がそれぞれ配列番号３、４、５、６及び７である上記４又は５の何れかの改変トランスポゾンベクター。
７．下記（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターを細胞に導入し、得られる外来遺伝子発現細胞を培養し、ついで発現された外来蛋白を回収することからなる外来蛋白の生産方法：
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された。
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された。
８．下記（１）〜（４）の工程により得られる外来遺伝子発現細胞を培養することからなる外来蛋白の生産方法：
（１）下記（イ）〜（ロ）又は（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターを細胞に導入する工程、
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された；
（２）得られる形質転換細胞をクローニングする工程、
（３）両末端又は何れか一方の末端に前記（１）（ロ）と同じ組換え反応が生じる場の配列を付加した外来遺伝子発現カセットを前記クローン化形質転換細胞に導入する工程、及び
（４）外来遺伝子発現細胞を培養する工程。
９．トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である上記７ないし８の何れかの方法。
１０．組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である上記７ないし９の何れかの方法。
１１．該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である上記１０の方法。
１２．該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される上記１１の方法。
１３．LoxP配列、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列がそれぞれ配列番号３、４、５、６及び７である上記１１又は１２の何れかの方法。
１４．前記改変トランスポゾンベクターとトランスポゼース遺伝子発現プラスミドとを一緒に細胞に導入することを特徴とする上記７ないし１３の何れかの方法。
１５．トランスポゼース遺伝子発現カセットが組み込まれた前記改変トランスポゾンベクターを用いること特徴とする上記７ないし１３の何れかの方法。
１６．前記外来遺伝子発現カセットとCre遺伝子発現プラスミドとを一緒に導入することを特徴とする上記８ないし１５の何れかの方法。
１７．Cre遺伝子発現カセットが組み込まれた前記外来遺伝子発現カセットを用いることを特徴とする上記８ないし１５の何れかの方法。
１８．該外来遺伝子発現細胞が、HeLa細胞、Vero細胞、CHO細胞、293細胞、BHK細胞及びSP2/0細胞からなる群より選択された細胞である上記７ないし１７の何れかの方法。
（１）下記（イ）〜（ロ）又は（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターを細胞に導入する工程、
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された；
（２）得られる形質転換細胞をクローニングする工程、
（３）両末端又は何れか一方の末端に前記（１）（ロ）と同じ組換え反応が生じる場の配列を付加した外来遺伝子発現カセットを前記クローン化形質転換細胞に導入する工程、及び
（４）外来遺伝子発現細胞を培養する工程。
９．トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である上記７ないし８の何れかの方法。
１０．組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である上記７ないし９の何れかの方法。
１１．該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である上記１０の方法。
１２．該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される上記１１の方法。
１３．LoxP配列、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列がそれぞれ配列番号３、４、５、６及び７である上記１１又は１２の何れかの方法。
１４．前記改変トランスポゾンベクターとトランスポゼース遺伝子発現プラスミドとを一緒に細胞に導入することを特徴とする上記７ないし１３の何れかの方法。
１５．トランスポゼース遺伝子発現カセットが組み込まれた前記改変トランスポゾンベクターを用いること特徴とする上記７ないし１３の何れかの方法。
１６．前記外来遺伝子発現カセットとCre遺伝子発現プラスミドとを一緒に導入することを特徴とする上記８ないし１５の何れかの方法。
１７．Cre遺伝子発現カセットが組み込まれた前記外来遺伝子発現カセットを用いることを特徴とする上記８ないし１５の何れかの方法。
１８．該外来遺伝子発現細胞が、HeLa細胞、Vero細胞、CHO細胞、293細胞、BHK細胞及びSP2/0細胞からなる群より選択された細胞である上記７ないし１７の何れかの方法。
１９．下記（イ）〜（ロ）若しくは（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片を有する改変トランスポゾンベクターが組み込まれた形質転換細胞、又は当該形質転換細胞に、更に両末端又は何れか一方の末端に下記（ロ）と同じ組換え反応が生じる場の配列を付加した外来遺伝子発現カセットが組み込まれた形質転換細胞：
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された。
２０．外来遺伝子を発現する上記１９の形質転換細胞。
２１．トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である上記１９又は２０の何れかの形質転換細胞。
２２．組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である上記１９ないし２１の何れかの形質転換細胞。
２３．該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である上記２２の形質転換細胞。
２４．該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される上記２３の形質転換細胞。
２５．LoxP配列、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列がそれぞれ配列番号３、４、５、６及び７である上記２３又は２４の何れかの形質転換細胞。
２６．該外来遺伝子発現細胞が、HeLa細胞、Vero細胞、CHO細胞、293細胞、BHK細胞及びSP2/0細胞からなる群より選択された細胞である上記１９ないし２５の何れかの形質転換細胞。
２７．個体化可能な細胞である上記１９ないし２５の何れかの形質転換細胞。
２８．該個体化可能な細胞が、哺乳類、鳥類、魚類及び非脊椎動物由来の受精卵、胚盤胞期までの卵割細胞、ES細胞、EG細胞並びに始原生殖細胞（PGC）からなる群より選択される上記２７の形質転換細胞。
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された。
２０．外来遺伝子を発現する上記１９の形質転換細胞。
２１．トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である上記１９又は２０の何れかの形質転換細胞。
２２．組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である上記１９ないし２１の何れかの形質転換細胞。
２３．該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である上記２２の形質転換細胞。
２４．該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される上記２３の形質転換細胞。
２５．LoxP配列、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列がそれぞれ配列番号３、４、５、６及び７である上記２３又は２４の何れかの形質転換細胞。
２６．該外来遺伝子発現細胞が、HeLa細胞、Vero細胞、CHO細胞、293細胞、BHK細胞及びSP2/0細胞からなる群より選択された細胞である上記１９ないし２５の何れかの形質転換細胞。
２７．個体化可能な細胞である上記１９ないし２５の何れかの形質転換細胞。
２８．該個体化可能な細胞が、哺乳類、鳥類、魚類及び非脊椎動物由来の受精卵、胚盤胞期までの卵割細胞、ES細胞、EG細胞並びに始原生殖細胞（PGC）からなる群より選択される上記２７の形質転換細胞。
２９．下記（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片を有する改変トランスポゾンベクターが組み込まれた外来遺伝子を発現する個体化可能な形質転換細胞、又は
下記（イ）〜（ロ）若しくは（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片を有する改変トランスポゾンベクターが組み込まれた個体化可能な形質転換細胞に、更に両末端又は何れか一方の末端に下記（ロ）と同じ組換え反応が生じる場の配列を付加した外来遺伝子発現カセットが組み込まれた、外来遺伝子を発現する個体化可能な形質転換細胞を用いて作出された遺伝子組換え動物：
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された。
３０．トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である上記２９の遺伝子組換え動物。
３１．組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である上記２９又は３０の何れかの遺伝子組換え動物。
３２．該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である上記３１の遺伝子組換え動物。
３３．該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される上記３２の遺伝子組換え動物。
３４．LoxP配列、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列がそれぞれ配列番号３、４、５、６及び７である上記３２又は３３の何れかの遺伝子組換え動物。
３５．該個体化可能な細胞が、哺乳類、鳥類、魚類及び非脊椎動物由来の受精卵、胚盤胞期までの卵割細胞、ES細胞、EG細胞並びにPGCからなる群より選択される上記２９ないし３４の何れかの遺伝子組換え動物。
３６．ニワトリである上記２９ないし３５の何れかの遺伝子組換え動物。
下記（イ）〜（ロ）若しくは（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片を有する改変トランスポゾンベクターが組み込まれた個体化可能な形質転換細胞に、更に両末端又は何れか一方の末端に下記（ロ）と同じ組換え反応が生じる場の配列を付加した外来遺伝子発現カセットが組み込まれた、外来遺伝子を発現する個体化可能な形質転換細胞を用いて作出された遺伝子組換え動物：
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された。
３０．トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である上記２９の遺伝子組換え動物。
３１．組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である上記２９又は３０の何れかの遺伝子組換え動物。
３２．該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である上記３１の遺伝子組換え動物。
３３．該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される上記３２の遺伝子組換え動物。
３４．LoxP配列、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列がそれぞれ配列番号３、４、５、６及び７である上記３２又は３３の何れかの遺伝子組換え動物。
３５．該個体化可能な細胞が、哺乳類、鳥類、魚類及び非脊椎動物由来の受精卵、胚盤胞期までの卵割細胞、ES細胞、EG細胞並びにPGCからなる群より選択される上記２９ないし３４の何れかの遺伝子組換え動物。
３６．ニワトリである上記２９ないし３５の何れかの遺伝子組換え動物。
本発明の方法によれば、細胞への高い導入効率を保持した改変トランスポゾンベクターが提供される。本発明の改変トランスポゾンベクターは、トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列の少なくとも一方にLox配列やFRT配列等の組換え反応を生じる場の配列が挿入されているため、用いた組換え反応が生じる場の配列に応じた組換えシステムを利用することで、本来、トランスポゾンベクターが有する細胞染色体上を転移する機能を破壊することが可能である。また、本発明の改変トランスポゾンベクターは、制限酵素認識部位を有するので、この部位に外来遺伝子を挿入することにより、細胞或いは動物個体に該外来遺伝子を発現させることができる。
また、本発明の方法によれば、一旦、改変トランスポゾンベクターを細胞に導入した後、組換えシステムとしてCre-Lox組換えシステムを用いることにより、変異Lox配列を利用することが可能となり、外来遺伝子を別の遺伝子に効率的に置換挿入する方法が提供される。これにより、トランスポゾンベクターを用いた場合には困難であった6kbpを超える大きなサイズの遺伝子を細胞の染色体DNA内の特定の部位に効率的に挿入することが可能となる。故に、効率的に外来遺伝子を置換することができ、高発現率を有する外来蛋白産生細胞又は外来蛋白産生遺伝子組換え動物を従来よりも効率よく取得することができる。
本発明の改変トランスポゾンベクターは、２つのTIR配列を持つトランスポゾンベクターであって、その２つのTIR配列間に外来遺伝子発現用の遺伝子領域（遺伝子発現カセット）を挿入出来るように適当な制限酵素認識部位を持つ構造を有する。本発明は、該トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間にLox配列等の組換え反応を生じる場の配列が挿入された該5’側TIR配列と3’側TIR配列からなる核酸断片を有する改変トランスポゾンベクター、該改変トランスポゾンベクターを用いて細胞に外来遺伝子を発現させる方法、該改変トランスポゾンベクターの導入により得られる外来遺伝子を保持した個体化可能細胞を利用して作出した遺伝子組換え動物に外来遺伝子を発現させる方法、さらには該改変トランスポゾンベクターを、一旦、個体化可能細胞を含む細胞に導入した後、Cre-Lox等の組換えシステムにより外来遺伝子発現カッセトを挿入、置換又は薬剤マーカー等の不必要な遺伝子の脱落により5’或いは3’側のTIR配列の少なくとも一方を破壊することからなる、外来遺伝子の発現方法により特徴付けられる。
１．トランスポゾンベクター（IR/DR-NTA-Ad/pSP）
トランスポゾンベクターに使用するトランスポゾンは挿入活性のあるものであれば動物種を問わずどの様なものでも使用可能であるが、望ましくは一つのTIR配列内にDRを２つ有するタイプのトランスポゾン、例えばTc3タイプに属するトランスポゾンが望ましい。その好適な例として、サケ由来のトランスポゾンが挙げられる。本発明のベクターには、この２つのTIR配列間に外来遺伝子を発現させるための遺伝子発現カセットが挿入できるように適当な制限酵素認識部位を付加している。
トランスポゾンベクターに使用するトランスポゾンは挿入活性のあるものであれば動物種を問わずどの様なものでも使用可能であるが、望ましくは一つのTIR配列内にDRを２つ有するタイプのトランスポゾン、例えばTc3タイプに属するトランスポゾンが望ましい。その好適な例として、サケ由来のトランスポゾンが挙げられる。本発明のベクターには、この２つのTIR配列間に外来遺伝子を発現させるための遺伝子発現カセットが挿入できるように適当な制限酵素認識部位を付加している。
（１）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列の単離
トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列の単離は、トランスポゼース遺伝子を単離したときと同じ手法を用いればよい。この場合、プライマーとして、A.D.Radiceら（Mol. Gen. Genet. 244, 606-, 1994）の報告に基づき合成されたプライマー（配列番号８）が用いられる。該プライマーを用いてPCRを行うことにより、5’側TIR配列と3’側TIR配列の両方の配列を含む不活化された約1.6kbpのトランスポゾン遺伝子が増幅される。一旦、プラスミド（pCR2.1）にクローニングした後、制限酵素EcoRIとAccIで消化し、約0.4kbpと約1.2kbpのDNA断片をそれぞれクローニングベクターpSP72（プロメガ社）に再クローニングする。こうして5’側TIR配列を含むプラスミド（5’Rg/pSP）及び3’側TIR配列を含むプラスミド（3’Rg/pSP）が得られる。
トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列の単離は、トランスポゼース遺伝子を単離したときと同じ手法を用いればよい。この場合、プライマーとして、A.D.Radiceら（Mol. Gen. Genet. 244, 606-, 1994）の報告に基づき合成されたプライマー（配列番号８）が用いられる。該プライマーを用いてPCRを行うことにより、5’側TIR配列と3’側TIR配列の両方の配列を含む不活化された約1.6kbpのトランスポゾン遺伝子が増幅される。一旦、プラスミド（pCR2.1）にクローニングした後、制限酵素EcoRIとAccIで消化し、約0.4kbpと約1.2kbpのDNA断片をそれぞれクローニングベクターpSP72（プロメガ社）に再クローニングする。こうして5’側TIR配列を含むプラスミド（5’Rg/pSP）及び3’側TIR配列を含むプラスミド（3’Rg/pSP）が得られる。
次に、これらのTIR配列はIvicsら（Cell, 91, 501-, 1997）が報告したTanichthys albonubes（日本名；アカヒレ）由来のTIR配列（EMBL／GenBank accession No.L48685）と比較され、TIR配列に違いがあれば、同じ塩基配列となるように修復される。Ivicsら（Cell, 91, 501-, 1997）が報告したTIR配列と上記5’Rg/pSP 及び3’Rg/pSP に変異が存在する場合には、TIR配列の修復が必要である。
本発明者らの5’側TIR配列の修復は、例えば以下のように行われる。一旦、IR/DR rF1（配列番号９）とIR/DR rR1（配列番号10）のプライマーを用いたPCRにより約0.3kbpのDNA断片を増幅し、プラスミド（pCR2.1）にクローニングした後、制限酵素EcoRIとHindIIIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、脱リン酸化（BAP）処理した5’Rg/pSPに挿入して5’RgDR/pSPを構築する。次いで、これを鋳型として、修復プライマーIR/DR-5’/F1（配列番号11）とIR/DR-5’/R1（配列番号12）の組合せ、及びIR/DR-5’/F2（配列番号13）とIR/DR-5’/R2（配列番号14）の組合せによるPCRを行い、約100bpと約160bpのDNA断片を得る。これらを等量混合し、変性反応（70℃、10分間）後、室温に戻るまで徐々に冷却することによりアニーリングする。両DNA断片の相同配列部分でアニーリングしたDNAを鋳型として、先に述べたプライマーIR/DR-5’/F1とIR/DR-5’/R2を用いて再度PCRを行い、得られる約240bpのDNA断片をプラスミド（pCR2.1）にクローニングする。これを制限酵素AflIIとHindIIIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理した5’RgDR/pSPに挿入し、5’側TIR配列を有するプラスミド5’IR/DR-Nを得る。
3’側TIR配列の修復は、以下のとおり行われる。先ず、3’Rg/pSPを鋳型として、修復プライマーIR/DR rF2（配列番号15）とIR/DR rR2（配列番号16）の組合せ、及びIR/DR rF3（配列番号17）とIR/DR rR3（配列番号18）の組合せによるPCRを行い、各々約200bpのDNA断片を増幅し、これらを等量混合して上述と同様にアニーリング処理する。このDNAを鋳型として、先のプライマーIR/DR rF2とIR/DR rR3を用いて再度PCRを行い、約370bpのDNA断片を得、プラスミド（pCR2.1）にクローニングする。これを制限酵素EcoRIとMscIで消化した後、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理した3’Rg/pSPに挿入して3’側TIR配列を有するプラスミド3’RgDR/pSPを構築する。このようにして修復された5’側TIR及び3’側TIRのDR領域の塩基配列は、3’側TIRの内側に存在するDRの１塩基を除きTanichthys albonubes（日本名；アカヒレ）由来のDR領域と同じであり、それぞれ配列番号19及び配列番号20記載の配列を有する。
（２）トランスポゾンベクター（IR/DR-NTA-Ad/pSP）の構築
先ず、5’IR/DR-Nを制限酵素HindIIIとEcoRVで消化して得られる5'TIR配列を含むDNA断片を、制限酵素HindIIIとPvuIIで消化後、BAP処理した、3’TIR配列を含む3’RgDR/pSPに挿入することによって、5’側と3’側の両方のTIR配列を有するIR/DR-N（図４）を構築する。
先ず、5’IR/DR-Nを制限酵素HindIIIとEcoRVで消化して得られる5'TIR配列を含むDNA断片を、制限酵素HindIIIとPvuIIで消化後、BAP処理した、3’TIR配列を含む3’RgDR/pSPに挿入することによって、5’側と3’側の両方のTIR配列を有するIR/DR-N（図４）を構築する。
次にIR/DR-NのHindIII切断部位に数種の制限酵素認識部位を有するアダプターを挿入する為に以下の処理が行われる。先ず、5’末端をリン酸化したプライマー5’IR/DR-AdF（配列番号21）と5’IR/DR-AdR（配列番号22）を等量混合し、アニーリング処理を行うことにより、両プライマーがアニーリングしたアダプター5’IR/DR-Adを得る。同様にして3’IR/DR-AdF（配列番号23）と3’IR/DR-AdR（配列番号24）をアニーリングしたアダプター3’IR/DR-Adを得る。次いで、5’IR/DR-Adと3’IR/DR-Adを等量混合し、DNA Ligation Kit（TaKaRa社）を用いて16℃、30分反応した後、エタノール沈殿法により両アダプターが結合したDNA断片を回収する。これを制限酵素HindIIIで消化し、先に構築したIR/DR-NのHindIII部位に挿入してIR/DR-N-Adを構築する。
更に、TIR配列両末端に構築に必要な制限酵素認識部位を付加するために以下の処理が行われる。IR/DR-N-AdをAflIIで消化し、pSP72ベクター部分を含む約2.5kbpのDNA断片と約630bpのDNA断片を回収する。2.5kbpのDNA断片については、DNA Ligation Kit（TaKaRa社）を用いて環状化した後、これを鋳型として、5’IR/DRTA-Fs（配列番号25）と3’IR/DRTA-R（配列番号26）のプライマーを用いてPCRを行い、5’側及び3’側の末端に制限酵素認識部位が付加した約150bpのDNA断片を増幅する。これを一旦、プラスミドにクローニング（TA-Fs/R）した後、制限酵素XhoIとBglIIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理したクローニングベクターpSP72に挿入しTA-Fs/R-pSPを得る。該TA-Fs/R-pSPを制限酵素AflIIで消化後、BAP処理し、これに先の630bpのDNA断片を挿入することにより、5’側と3’側の２つのTIR配列の間に制限酵素（StuI、NotI、SalI及びMscI）認識部位、両TIR配列の外側に制限酵素（XhoIとBglII）認識部位を有するトランスポゾンベクターIR/DR-NTA-Ad/pSP（図５）が得られる。
目的の断片が得られたか否かは適宜、塩基配列を決定することにより行われる。上記と異なる制限酵素認識部位を挿入する場合は適当な制限酵素認識部位を有するアダプターを挿入すればよい。アダプターを作製する際に目的の制限酵素認識部位が含まれるように塩基配列を調製した合成DNAを使用すればよい。このように適当な制限酵素認識部位を持つことにより、様々な遺伝子発現カセットや組換え反応を生じる場の配列を挿入することが可能となり、後述のTIR配列の破壊等に応用される。
（３）遺伝子発現カセット
遺伝子発現カセットには特段の制約はないが、外来遺伝子に適当なプロモーター等の発現調節領域、終止コドン、ポリA付加シグナル配列、Kozak配列、分泌シグナルなどを付加した核酸断片と定義される。当該発現カセットに含まれるプロモーターは、宿主として用いる動物細胞との組み合わせにより、SV40初期、SV40後期、サイトメガロウイルスプロモーター、ニワトリβアクチンなど、最終的に外来遺伝子が発現するものであれば如何なるものでもよい。好ましくは、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドpCAGG（特開平3-168087）が使用される。選択や遺伝子増幅のマーカー遺伝子として、neo遺伝子やジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子、グルタミン合成酵素(GS)遺伝子など一般に知られる選択や遺伝子増幅用のマーカー遺伝子が利用できる。市販品を利用することも可能である。動物細胞で発現させる場合はpSI、pCI-neo（プロメガ社）、酵母ではpPICZ（インビトロジェン社）、pESP-1（ストラタジーン社）、昆虫細胞ではBacPAK6（クロンテック社）、pBAC（ノバジェン社）、細菌ではpET（ストラタジーン社）などが挙げられるが、これらは、目的に合わせて適宜使用される。遺伝子発現カセットの挿入例としては、本発明の実施例にも示したピューロマイシン耐性酵素遺伝子等の薬剤選択マーカーの挿入やGFP等のマーカー遺伝子発現カセットの挿入、或いは目的とする外来遺伝子の発現カセット等の挿入が挙げられる。
遺伝子発現カセットには特段の制約はないが、外来遺伝子に適当なプロモーター等の発現調節領域、終止コドン、ポリA付加シグナル配列、Kozak配列、分泌シグナルなどを付加した核酸断片と定義される。当該発現カセットに含まれるプロモーターは、宿主として用いる動物細胞との組み合わせにより、SV40初期、SV40後期、サイトメガロウイルスプロモーター、ニワトリβアクチンなど、最終的に外来遺伝子が発現するものであれば如何なるものでもよい。好ましくは、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドpCAGG（特開平3-168087）が使用される。選択や遺伝子増幅のマーカー遺伝子として、neo遺伝子やジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子、グルタミン合成酵素(GS)遺伝子など一般に知られる選択や遺伝子増幅用のマーカー遺伝子が利用できる。市販品を利用することも可能である。動物細胞で発現させる場合はpSI、pCI-neo（プロメガ社）、酵母ではpPICZ（インビトロジェン社）、pESP-1（ストラタジーン社）、昆虫細胞ではBacPAK6（クロンテック社）、pBAC（ノバジェン社）、細菌ではpET（ストラタジーン社）などが挙げられるが、これらは、目的に合わせて適宜使用される。遺伝子発現カセットの挿入例としては、本発明の実施例にも示したピューロマイシン耐性酵素遺伝子等の薬剤選択マーカーの挿入やGFP等のマーカー遺伝子発現カセットの挿入、或いは目的とする外来遺伝子の発現カセット等の挿入が挙げられる。
２．組換え反応が生じる場の配列を挿入した改変トランスポゾンベクター
（１）改変トランスポゾンベクターの構築
トランスポゾン遺伝子の5’側及び3’側TIR配列に内在する二つのDR領域の間にLox配列等の組換え反応が生じる場の配列を挿入することにより改変トランスポゾンベクターが構築される。この位置に挿入することにより、nativeのトランスポゾンが有する細胞への高い導入効率を残し、後にCre-Lox等の組換えシステムを利用することで、その転移活性（細胞染色体上を移動する活性）を消失させることができる。斯かる効果は、少なくとも、トランスポゾンベクターの5’側又は3’側TIR配列のいずれか一方にLox配列等の組換え反応が生じる場の配列を挿入することにより達成される。
（１）改変トランスポゾンベクターの構築
トランスポゾン遺伝子の5’側及び3’側TIR配列に内在する二つのDR領域の間にLox配列等の組換え反応が生じる場の配列を挿入することにより改変トランスポゾンベクターが構築される。この位置に挿入することにより、nativeのトランスポゾンが有する細胞への高い導入効率を残し、後にCre-Lox等の組換えシステムを利用することで、その転移活性（細胞染色体上を移動する活性）を消失させることができる。斯かる効果は、少なくとも、トランスポゾンベクターの5’側又は3’側TIR配列のいずれか一方にLox配列等の組換え反応が生じる場の配列を挿入することにより達成される。
Araki, K.ら（Nucleic Acids Res., 30(19), e103, 2002）やSoukharev, S.ら（Nucleic Acids Res., 27(18), e21, 1999）は、変異型のLox配列を利用することにより、脱落反応よりも置換や挿入反応を効率的に起こすことができることを明らかにした。このような変異型のLox配列については様々な配列が研究されており（G. Lee及びI. Saito, Gene, 55-65, 216, 1998）、いろいろな配列の可能性があるが、既にLox71配列（配列番号４）、Lox66配列（配列番号５）、Lox2272配列（配列番号６）, Lox511配列（配列番号７）などが報告されており、その望ましい配列として挙げられる。単に、トランスポゾンの転移活性のみを消失させることを目的とする場合は、LoxP配列を含むいずれの組換え反応が生じる場の配列を使用してもよい。Cre-Lox組換えシステムでは、前述のように様々な変異配列が存在することから、外来遺伝子の置換或いは挿入を効率的に行うことを目的とする場合は本システムを用いることが好ましい。
さらに、Cre-Lox組換えシステムを利用する場合には、トランスポゾンベクターに挿入される変異型のLox配列と置換又は挿入反応に利用される変異型のLoxとの組合せを考慮する必要がある。置換反応を期待する場合、トランスポゾンベクターにLox71配列とLox2272配列、Lox511配列又はLoxP配列とを挿入し、後のCre-Lox組換えシステムによる置換反応により遺伝子を挿入する側のプラスミド（ドナープラスミド）にはLox66配列とLox2272配列、Lox511配列又はLoxP配列とを挿入する組合せを用いるのがよい。中でもトランスポゾンベクターにLox71配列とLox2272配列とを、ドナープラスミドにLox66配列とLox2272配列とを持つ組合せが最も効率が良い。或いは逆にLox71配列をドナープラスミドに、Lox66配列をトランスポゾンベクターに挿入する組合せも同様に効率が良い。また、挿入反応を期待する場合には、Lox71−Lox66の組合せが最も良い。この場合、Lox71配列をトランスポゾン側に、Lox66配列をドナープラスミド側に挿入してもよく、またその逆であってもよい。
上述した変異Lox配列の存在により、効率的に遺伝子を置換、挿入するにはCre-Lox組換えシステムが最良であることから、以下には本組換えシステムの利用を前提としての最良の形態を示すが、Flp−FRT等の他の組換えシステムも利用可能である。
Lox配列が挿入された改変トランスベクターは、トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列を有する核酸断片を鋳型として、Lox配列が挿入されたプライマーを用いてPCRを行うことにより構築できる。より具体的には、例えば、IR/DR-NTA-Ad/pSPを鋳型として、SP6プライマー（配列番号27）とLox71配列を有するプライマーPs/Lx71R（配列番号28）を用いてPCRを行い、約200bpのDNA断片を得、 このDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いて一旦クローニングした後、制限酵素PshAIとXhoIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理をしたIR/DR-NTA-Ad/pSPに挿入することにより、5’側TIR配列に内在する2つのDR配列の間にLox71配列が挿入された改変トランスポゾンベクターIR/DR-Ad/5’Lxpが構築される。
3’側TIR配列に内在する2つのDR配列の間にLoxP配列が挿入されたトランスポゾンベクター3’IR/DR-Lxp/pSPは、IR/DR-NTA-Ad/pSPを制限酵素SalIとBglIIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理をしたpSP72（プロメガ社）にクローニングして3’IR/DR-Ad/pSPを構築し、これを鋳型として、SP6プライマー（配列番号27）とLoxP配列を挿入したプライマーAf/LxpR（配列番号29）を用いてPCRを行い、3’側TIR配列内にLoxP配列が付加された約400bpのDNA断片を得、このDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いて一旦クローニングした後、制限酵素AflIIとSalIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理をした3’IR/DR-Ad/pSPに挿入することにより得ることができる。
トランスポゾンの5’側TIR配列と3’側TIR配列の両方にLox配列を挿入する場合は、IR/DR-Ad/5’Lxpの3’側TIR配列部分を3’IR/DR-Ad/pSPと入れ替えることで構築可能である。例えば、3’IR/DR-Lxp/pSPを制限酵素BglIIとSalIで消化し、予め同じ酵素で消化後、BAP処理したIR/DR-Ad/5’Lxpに挿入することにより、5’側TIR配列内に変異Lox配列（Lox71）、3’側TIR配列内にLoxP配列を有する改変トランスポゾンベクターIR/DR-Ad/LxDbを構築することができる。
また、動物細胞において外来遺伝子の安定的な発現には翻訳領域の下流にポリA付加シグナル配列が必要である。逆に、ポリA付加シグナル配列がなければ、遺伝子より転写されるmRNAは不安定となり、結果的に最終産物である蛋白質の発現が低下する。この原理を利用して、例えば相同組み換えにおいて、用いる薬剤選択マーカー遺伝子の下流にポリA付加シグナル配列を連結せずに細胞に導入し、目的の位置に挿入されたときにのみ薬剤マーカー遺伝子の下流にポリA付加シグナル配列が存在するように設計し、相同組み換えを起こした細胞を効率よく選択する手法、ポリAトラップ法が開発されている。先に述べた変異Lox配列の利用に加え、この手法を応用することでより置換効率の高い改変トランスポゾンベクターの構築が可能である。この目的のために、3’側TIR配列に挿入されたLox配列の下流にポリAシグナル配列を付加することもできる。
このような改変トランスポゾンべクターは、例えば、3’IR/DR-Lxp/pSPを鋳型として、SP6プライマーとLoxP配列の下流にウシ成長ホルモン由来のポリA付加シグナル配列が付加したプライマーAf/LxpAR（配列番号30）を用いてPCRを行い、3’側TIR配列内にLoxP配列及びそのLoxPの下流にポリA付加シグナル配列が付加した約400bpのDNA断片を増幅・回収し、このDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いて一旦クローニングした後、制限酵素AflIIとSalIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理した3’IR/DR-Lxp/pSPに挿入することにより得ることができる（3’IR/DR-LxpA/pSP）。さらに、3’IR/DR-LxpA/pSPを制限酵素BglIIとSalIで消化し、予め同じ酵素で消化後、BAP処理したIR/DR-Ad/5’Lxpに挿入することにより、5’側TIR配列内に変異Lox配列（Lox71）を有し、3’側TIR配列内にLoxP配列とその下流にポリA付加シグナル配列を有する改変トランスポゾンベクターIR/DR-Ad/LxpADbを構築することができる。
本発明の改変トランスポゾンベクターIR/DR-Ad/5’Lxp、IR/DR-Ad/LxDb及びIR/DR-Ad/LxpADbは、数種の制限酵素認識部位を有するので、この制限酵素切断部位に適当な外来遺伝子発現カセットを挿入することにより、外来遺伝子発現プラスミドを構築することができる。斯かる外来遺伝子発現プラスミドを適当な方法により個体化可能な細胞を含む種々の細胞に導入することにより、外来蛋白産生細胞及び外来蛋白産生動物を作製することができる。ここで、外来遺伝子発現カセットは、外来遺伝子に適当なプロモーター、終止コドン、ポリA付加シグナル配列、Kozak配列、分泌シグナルなどを付加した核酸断片と定義される。これを適当な細胞に導入することにより、外来遺伝子を該細胞内に発現させることができる。このような核酸断片は、外来遺伝子を、既に市販されている種々の発現ベクター（又は発現プラスミド）に添付のプロコールに従って挿入した後、適当な制限酵素を用いて当該核酸断片部分を切り出すことにより容易に調製することができる。例えば、市販品として、動物細胞で発現させる場合はpSI、pCI-neo（プロメガ社）、酵母ではpPICZ（インビトロジェン社）、pESP-1（ストラタジーン社）、昆虫細胞ではBacPAK6（クロンテック社）、pBAC（ノバジェン社）、細菌ではpET（ストラタジーン社）などが挙げられるが、これらは、使用目的に合わせて適宜使用される。
（２）ドナープラスミド（pLx/GFP/neo/pA(-)）の構築
Cre-Lox組換えシステムを利用した遺伝子置換に用いるドナープラスミドは以下の方法に従って構築できる。外来遺伝子発現カセットには、その両末端にLox配列が付加される。該Lox配列は、トランスポゾンベクターの5’側TIR配列及び3’側TIR配列に挿入したLox配列のいずれも使用できるが、Cre-Lox組換えシステムにおいてより高い置換効率を得るには、前述したようにLox71配列−Lox66配列またはLox2272配列-Lox2272配列の組合せが好ましい。
Cre-Lox組換えシステムを利用した遺伝子置換に用いるドナープラスミドは以下の方法に従って構築できる。外来遺伝子発現カセットには、その両末端にLox配列が付加される。該Lox配列は、トランスポゾンベクターの5’側TIR配列及び3’側TIR配列に挿入したLox配列のいずれも使用できるが、Cre-Lox組換えシステムにおいてより高い置換効率を得るには、前述したようにLox71配列−Lox66配列またはLox2272配列-Lox2272配列の組合せが好ましい。
具体的には、先ず、5’側にXhoI認識配列と内部にLox66配列を有するプライマーLx66/LxP-F（配列番号31）と5’側にBglII認識配列と内部にLoxP配列を有するプライマーLx66/LxP-R（配列番号32）を混合し、鋳型となるDNAを加えずにPCRを行い（Lx66/LxP-Fの3’側末端の25塩基とLx66/LxP-Rの3’側末端の25塩基は、互いに相補的な配列を有する）、Lox66配列とLoxP配列からなる約120bpの断片を得る。次に、この断片の間に、動物細胞用発現ベクターpCAGn-mcs-polyA（特願平８−１６５２４９）から得られるプロモーターの下流にGFP遺伝子を挿入した発現カセットを挿入する。さらに、マーカー遺伝子として、GFP遺伝子の下流にポリA付加シグナル配列のないneo遺伝子発現カセットを挿入する。こうして、GFP遺伝子とneo遺伝子を発現することができる発現カセットの5’側末端にLox66配列、3’側末端にLoxP配列が付加した、ドナープラスミドpLx/GFP/neo/pA(-)（図６）が構築される。
（３）Cre遺伝子発現プラスミド（pCAGGS/Cre）の構築
Cre-Lox組換えシステムに使用するCre遺伝子は、上述のドナープラスミドが標的細胞内に導入された際に、同じ細胞内で機能発現する必要がある。その方法として、Cre遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、細胞に導入する方法がある。この方法では、ドナープラスミドと同じプラスミドにCre遺伝子を保有させる方法と別々のプラスミドにする方法が実施可能である。さらにCreのRNAを合成して導入する方法、さらには発現蛋白質を直接細胞内に注入する方法でも、Cre活性を細胞内で発揮させる方法であれば、本発明の要件を満たす。そのような望ましいCre遺伝子を動物細胞で発現させることができるプラスミド（以下、「Cre発現プラスミド」と称することもある）として、熊本大学遺伝子実験施設の荒木助教授より供与されたプラスミドpCAGGS/Creが挙げられる。該pCAGGS/Creは、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 160-164, 1995）に記載の方法により得られる。簡単には、pCAGGS発現ベクターの制限酵素Sal I認識配列部にCreをコードする遺伝子を挿入することにより得られる。
Cre-Lox組換えシステムに使用するCre遺伝子は、上述のドナープラスミドが標的細胞内に導入された際に、同じ細胞内で機能発現する必要がある。その方法として、Cre遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、細胞に導入する方法がある。この方法では、ドナープラスミドと同じプラスミドにCre遺伝子を保有させる方法と別々のプラスミドにする方法が実施可能である。さらにCreのRNAを合成して導入する方法、さらには発現蛋白質を直接細胞内に注入する方法でも、Cre活性を細胞内で発揮させる方法であれば、本発明の要件を満たす。そのような望ましいCre遺伝子を動物細胞で発現させることができるプラスミド（以下、「Cre発現プラスミド」と称することもある）として、熊本大学遺伝子実験施設の荒木助教授より供与されたプラスミドpCAGGS/Creが挙げられる。該pCAGGS/Creは、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 160-164, 1995）に記載の方法により得られる。簡単には、pCAGGS発現ベクターの制限酵素Sal I認識配列部にCreをコードする遺伝子を挿入することにより得られる。
３．トランスポゼース（Transposase）
トランスポゾンベクターとともに使用するトランスポゼースはトランスポゾン活性をトランスポゾンベクターに付与するものであればどの様なトランスポゼースでも使用可能であるが、トランスポゾンベクターと対になったものが望ましい。トランスポゼースは、トランスポゾンベクターが標的細胞内に導入された際に、同じ細胞内で機能発現する必要がある。その方法として、トランスポゼース遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、細胞に導入する方法がある。この方法では、トランスポゾンベクターと同じプラスミドにトランスポゼース遺伝子を保有させる方法と別々のプラスミドにする方法が実施可能である。さらにトランスポゼースRNAを合成して導入する方法、さらには発現蛋白質を直接細胞内に注入する方法でも、トランスポゼース活性を細胞内で発揮させる方法であれば、本発明の要件を満たす。
トランスポゾンベクターとともに使用するトランスポゼースはトランスポゾン活性をトランスポゾンベクターに付与するものであればどの様なトランスポゼースでも使用可能であるが、トランスポゾンベクターと対になったものが望ましい。トランスポゼースは、トランスポゾンベクターが標的細胞内に導入された際に、同じ細胞内で機能発現する必要がある。その方法として、トランスポゼース遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、細胞に導入する方法がある。この方法では、トランスポゾンベクターと同じプラスミドにトランスポゼース遺伝子を保有させる方法と別々のプラスミドにする方法が実施可能である。さらにトランスポゼースRNAを合成して導入する方法、さらには発現蛋白質を直接細胞内に注入する方法でも、トランスポゼース活性を細胞内で発揮させる方法であれば、本発明の要件を満たす。
（１）トランスポゼース（Transposase）遺伝子の単離
トランスポゼースをコードする遺伝子は、サケでは不活性化され、発現していないことから、組織より抽出したゲノムDNAを出発材料として、Sambrookらが述べている一般的な遺伝子組換え技術（Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989）に従って調製することができる。実際には、市販のキットが使用される。例えば、DNAの抽出には、Wizard Purification System（プロメガ社）、ISOTISSUE（ニッポンジーン社）、DNA Extraction Kit（東洋紡）、Genomic-tip System（キアゲン社）などが使用される。
トランスポゼースをコードする遺伝子は、サケでは不活性化され、発現していないことから、組織より抽出したゲノムDNAを出発材料として、Sambrookらが述べている一般的な遺伝子組換え技術（Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989）に従って調製することができる。実際には、市販のキットが使用される。例えば、DNAの抽出には、Wizard Purification System（プロメガ社）、ISOTISSUE（ニッポンジーン社）、DNA Extraction Kit（東洋紡）、Genomic-tip System（キアゲン社）などが使用される。
より具体的には、サケの精子由来DNA（ニッポンジーン社）を鋳型としてLA-Taq（TaKaRa社）及び添付の試薬を用いてPCRを行い、トランスポゼース遺伝子の増幅が行われる。PCRのプライマーには合成DNAが使用される。例えば、サケのトランスポゼース遺伝子（EMBL／GenBank accession No. L12206）の塩基配列に基づく5’側プライマー（配列番号33）及びニジマスのトランスポゼース遺伝子（EMBL／GenBank accession No. L12209）の塩基配列に基づく3’側プライマー（配列番号34）を用いることにより、約１kbpのトランスポゼース遺伝子を増幅することができる。PCRは、反応溶液を、通常のPCR条件下（96℃、20秒間の変性反応、68℃、1.5分のアニーリング・伸長反応を40サイクル）でサーマルサイクラーPC-800（アステック社）にかけることにより行われる。
増幅したDNA断片は、一旦、TOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いてプラスミド（pCR2.1）にクローニングされる。DNA断片の全塩基配列は、アプライドバイオシステムズ（ABI）社のBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit及びABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて決定することができる。サケ由来のトランスポゼースは、アミノ酸変異の蓄積により転移活性を有しない不活性型で存在しているため、得られたDNA断片の塩基配列から予測されるアミノ酸配列は、Ivicsら（Cell, 91, 501-, 1997）により報告された転移活性を有するトランスポゼース（Sleeping Beauty Transposase；以下、「SBトランスポゼース」と称する）のアミノ酸配列と比較される。SBトランスポゼースのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列は、SBトランスポゼースのアミノ酸配列と同じ配列になるように修復が行われる。アミノ酸配列の相同性の比較には、遺伝子情報処理ソフトGENETYX（ゼネティックス社）が用いられる。また塩基配列の修復には、サイトダイレクティドミュータジェネシス法を使用するのが一般的である。実際には、本技術を応用したTakara社のSite-Directed Mutagenesis System (Mutan-Super Express Km、Mutan-Express Km、Mutan-Kなど)、 Stratagene社のQuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit、QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit、Invitrogen社のGeneTailor Site-Directed Mutagenesis Systemなどの市販のキットを用い添付のプロトコールに従って行われる。本発明では、PCRを利用した変異導入法（Ivicsらの方法：Cell, 91, 501-, 1997）により塩基配列を修復し、SBトランスポゼース遺伝子と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸断片が挿入されたプラスミド（SB/pSP）を得た。
（２）トランスポゼース発現プラスミドpCAGG/SBの構築
こうして得られるSBトランスポゼース遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを宿主に導入することによって、SBトランスポゼースを当該宿主に発現させることができる。SBトランスポゼースを発現させるための宿主として、外来遺伝子の発現に常用される細菌、酵母、動物細胞、植物細胞及び昆虫細胞などを使用することが可能であるが、宿主はそれぞれの研究・開発目的に合わせて適宜選択される。好ましくは、宿主として動物細胞が使用される。この場合、発現効率を上げるためにSBトランスポゼースの5’側にKozak配列を付加することがある。発現ベクターは、動物細胞発現用に種々のものが開発・市販されているのでこれらの中から適宜選択して使用すればよい。より具体的には、SBトランスポゼース遺伝子断片がクローニングされたプラスミド（SB/pSP）を鋳型とし、配列番号35及び36記載の合成DNAを使用し、SBトランスポゼース遺伝子を増幅する。これらのプライマーには、SBトランスポゼース遺伝子5’側に相当する配列番号33にXhoIとKozak配列、3’側に相当する配列番号34にSalI及びBglIIの制限酵素認識部位が付加される。得られたcDNA断片を制限酵素XhoIとBglIIで消化し、これを予め同じ制限酵素で消化し、脱リン酸化（BAP）したクローニングベクターpSP72（プロメガ社）にクローニングして、プラスミドSB/XSを得る。次いで、動物細胞用発現ベクターpCAGn-mcs-polyA（特願平８−１６５２４９）を一部改変したpCAGGS-DN5を制限酵素SalIで消化後、BAP処理し、これにSB/XSを制限酵素XhoIとSalIで消化して得られるトランスポゼース遺伝子を含むDNA断片を挿入し、トランスポゼース発現プラスミド（pCAGG/SB）を構築する。
こうして得られるSBトランスポゼース遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを宿主に導入することによって、SBトランスポゼースを当該宿主に発現させることができる。SBトランスポゼースを発現させるための宿主として、外来遺伝子の発現に常用される細菌、酵母、動物細胞、植物細胞及び昆虫細胞などを使用することが可能であるが、宿主はそれぞれの研究・開発目的に合わせて適宜選択される。好ましくは、宿主として動物細胞が使用される。この場合、発現効率を上げるためにSBトランスポゼースの5’側にKozak配列を付加することがある。発現ベクターは、動物細胞発現用に種々のものが開発・市販されているのでこれらの中から適宜選択して使用すればよい。より具体的には、SBトランスポゼース遺伝子断片がクローニングされたプラスミド（SB/pSP）を鋳型とし、配列番号35及び36記載の合成DNAを使用し、SBトランスポゼース遺伝子を増幅する。これらのプライマーには、SBトランスポゼース遺伝子5’側に相当する配列番号33にXhoIとKozak配列、3’側に相当する配列番号34にSalI及びBglIIの制限酵素認識部位が付加される。得られたcDNA断片を制限酵素XhoIとBglIIで消化し、これを予め同じ制限酵素で消化し、脱リン酸化（BAP）したクローニングベクターpSP72（プロメガ社）にクローニングして、プラスミドSB/XSを得る。次いで、動物細胞用発現ベクターpCAGn-mcs-polyA（特願平８−１６５２４９）を一部改変したpCAGGS-DN5を制限酵素SalIで消化後、BAP処理し、これにSB/XSを制限酵素XhoIとSalIで消化して得られるトランスポゼース遺伝子を含むDNA断片を挿入し、トランスポゼース発現プラスミド（pCAGG/SB）を構築する。
４．トランスポゾンベクターの細胞への導入
（１）動物細胞への各種トランスポゾンベクターの導入
トランスポゾンベクターの動物細胞への導入は以下の方法に従って行われる。動物細胞として、株化細胞（HeLa、Vero、CHO、293、BHK、SP2/0などのミエローマ細胞など）、初代細胞（CE、HUVECなど）、個体化可能細胞（ES細胞、EG細胞、受精卵から胚盤胞期までの細胞及び始原生殖細胞（PGC）など）が挙げられるが、目的に合わせて選択すればよい。動物細胞への遺伝子導入方法にも特段の制約はなく、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい（Molecular Cloning (3rd Ed.), Vol 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）。培養に用いる培地として、その形状から寒天培地、液体培地、その種類からDMEM、RPMI、αMEMなどが使用されるが、細胞や培養目的、或いは培養段階に応じて適宜選択すればよい。それぞれの培地のプロトコールに従って、血清、アミノ酸、ビタミン、糖、抗生物質、pH調整用緩衝液などを添加したものが使用される。培地のpHは６〜８、培養温度は30℃〜39℃の範囲が設定される。培地の量、添加物及び培養時間は、培養スケールに合わせて適宜調節される。
（１）動物細胞への各種トランスポゾンベクターの導入
トランスポゾンベクターの動物細胞への導入は以下の方法に従って行われる。動物細胞として、株化細胞（HeLa、Vero、CHO、293、BHK、SP2/0などのミエローマ細胞など）、初代細胞（CE、HUVECなど）、個体化可能細胞（ES細胞、EG細胞、受精卵から胚盤胞期までの細胞及び始原生殖細胞（PGC）など）が挙げられるが、目的に合わせて選択すればよい。動物細胞への遺伝子導入方法にも特段の制約はなく、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい（Molecular Cloning (3rd Ed.), Vol 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）。培養に用いる培地として、その形状から寒天培地、液体培地、その種類からDMEM、RPMI、αMEMなどが使用されるが、細胞や培養目的、或いは培養段階に応じて適宜選択すればよい。それぞれの培地のプロトコールに従って、血清、アミノ酸、ビタミン、糖、抗生物質、pH調整用緩衝液などを添加したものが使用される。培地のpHは６〜８、培養温度は30℃〜39℃の範囲が設定される。培地の量、添加物及び培養時間は、培養スケールに合わせて適宜調節される。
例えば、Opti-MEM I Reduced-Serum Medium（INVITROGEN社）にTrans-IT LT1（TaKaRa社）を加え攪拌し、室温で10分間静置した後、トランスポゼース発現プラスミドpCAGGS/SBと遺伝子発現カセットを持ったトランスポゾンベクターを加え攪拌し、更に室温に15分間静置する。これを、前日に調製したHeLa細胞に添加し、37℃で６時間培養した後、上清を除いて10%のウシ胎児血清と1/100量のペニシリン-ストレプトマイシン液を含むDMEM培地（以下、「10% complete DMEM」と称することもある ）2ml/wellを添加し、5%CO2存在下、37℃で２日間培養する。さらに、使用した選択マーカー遺伝子に合わせた薬剤を含有した培地で培養を継続することにより、薬剤耐性細胞を得ることができる。得られた細胞は、通常の形質転換細胞と同様に限外希釈法等によりクローン化される。
（２）改変トランスポゾンベクター形質転換細胞へのドナープラスミド及びCre遺伝子発現プラスミドの導入
前述の改変トランスポゾンベクター形質転換細胞に外来遺伝子を挿入したドナープラスミドとCre遺伝子発現プラスミドを導入することにより、ドナープラスミドの外来遺伝子発現カセットをLox配列部分で置換することができる。導入方法は先に述べた方法を使用することが可能である。選択マーカー遺伝子を使用する場合には、改変トランスポゾンベクターで使用したマーカーとは別のマーカー遺伝子を使用する必要がある。交換反応の場合には、選択マーカー遺伝子を使用せずに、薬剤耐性が無くなったことで、外来遺伝子の挿入された細胞を選ぶことが可能である。さらに、GFP遺伝子を挿入している改変トランスポゾンベクターで形質転換された細胞ではGFP遺伝子の発現が励起波長の紫外線照射により発生する蛍光の観察により容易に確認できるが、Cre-Lox組換えシステムによって新たな外来遺伝子と置換された場合、その蛍光発色を失うことから選択することが可能である。例えば、セルソーターを用いた選別により、容易かつ迅速に置換細胞とそうでない細胞を分けることも可能である。
前述の改変トランスポゾンベクター形質転換細胞に外来遺伝子を挿入したドナープラスミドとCre遺伝子発現プラスミドを導入することにより、ドナープラスミドの外来遺伝子発現カセットをLox配列部分で置換することができる。導入方法は先に述べた方法を使用することが可能である。選択マーカー遺伝子を使用する場合には、改変トランスポゾンベクターで使用したマーカーとは別のマーカー遺伝子を使用する必要がある。交換反応の場合には、選択マーカー遺伝子を使用せずに、薬剤耐性が無くなったことで、外来遺伝子の挿入された細胞を選ぶことが可能である。さらに、GFP遺伝子を挿入している改変トランスポゾンベクターで形質転換された細胞ではGFP遺伝子の発現が励起波長の紫外線照射により発生する蛍光の観察により容易に確認できるが、Cre-Lox組換えシステムによって新たな外来遺伝子と置換された場合、その蛍光発色を失うことから選択することが可能である。例えば、セルソーターを用いた選別により、容易かつ迅速に置換細胞とそうでない細胞を分けることも可能である。
Cre-Lox組換えシステムに基づく外来遺伝子発現カセットの置換により、染色体DNA上に挿入された改変トランスポゾンベクターの5’側TIR配列及び3’側TIR配列の各内側DR領域１個を含む配列の一部が除去される。これにより、改変トランスポゾンベクターの細胞内染色体DNAへの導入効率が大きく低下する。この現象は、5’側TIR配列又は3’側TIR配列のいずれか一方の内側配列が除去された場合も認められる。したがって、トランスポゾンの導入活性を保持するには、TIR配列が欠如されることなく、その特定の場所、具体的にはTIR配列内に存在する2つのDR領域の間にLox配列を挿入することが必要である。逆に、5’側TIR配列又は3’側TIR配列の内側のDR領域の除去により、トランスポゾンとしての宿命である染色体DNAへの挿入後の転移能を確実に抑えることが期待される。
また、TIR配列の破壊例としては、Cre-Loxシステムを利用した遺伝子の置換・挿入以外に、以下に示す脱落による方法が可能である。例えば、内部の制限酵素認識部位にLoxP配列等の組換え反応が生じる場の配列を挿入し、これを5’側TIR配列又は3’側TIR配列のどちらか一方のDR領域の間にもう一つの同じ組換え反応が生じる場の配列を挿入したトランスポゾンベクター細胞に導入する。得られる形質転換細胞に、挿入した組換え反応が生じる場の配列に対応した組換え反応を担う酵素の発現プラスミド（LoxP配列を利用する場合にはCre）、当該酵素のmRNA又は当該酵素そのもののうちのいずれかを導入することにより組換え反応が生じる場の配列で挟まれた領域の脱落反応を引き起こし、結果的に5’側TIR配列又は3’側TIR配列いずれか一方の２個存在するDR配列のうちの1個を取り除くことで、トランスポゾン活性を破壊することができる。
以下、実施例にて具体例を示すが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。なお、特に断りのない限り、和光純薬、ナカライテスク社の試薬を使用した。
活性を有するトランスポゼース（Transposase）の単離
サケの精子由来DNA（ニッポンジーン社）を鋳型としてPCRを行い、トランスポゼース遺伝子を含む約１kbpのDNA断片を増幅した。具体的には、TaKaRa社のLA-Taq及び添付の試薬を用いて、サケの精子由来DNA0.5μg、ｄATP、ｄCTP、ｄGTP及びｄTTP（各400μM）、塩化マグネシウム（2.5mM）、サケのトランスポゼース遺伝子（EMBL／GenBank accession No. L12206）の塩基配列に基づく5’側プライマー（配列番号33）及びニジマスのトランスポゼース遺伝子（EMBL／GenBank accession No. L12209）の塩基配列に基づく3’側プライマー（配列番号34）（各800nM）、LA-Taq（50 unit/ml）を含む反応液25μlを調製し、これをサーマルサイクラーPC-800（アステック社）にかけ、変性反応（96℃、20秒）とアニーリング・伸長反応（68℃、1.5分を40サイクル）を行った。
サケの精子由来DNA（ニッポンジーン社）を鋳型としてPCRを行い、トランスポゼース遺伝子を含む約１kbpのDNA断片を増幅した。具体的には、TaKaRa社のLA-Taq及び添付の試薬を用いて、サケの精子由来DNA0.5μg、ｄATP、ｄCTP、ｄGTP及びｄTTP（各400μM）、塩化マグネシウム（2.5mM）、サケのトランスポゼース遺伝子（EMBL／GenBank accession No. L12206）の塩基配列に基づく5’側プライマー（配列番号33）及びニジマスのトランスポゼース遺伝子（EMBL／GenBank accession No. L12209）の塩基配列に基づく3’側プライマー（配列番号34）（各800nM）、LA-Taq（50 unit/ml）を含む反応液25μlを調製し、これをサーマルサイクラーPC-800（アステック社）にかけ、変性反応（96℃、20秒）とアニーリング・伸長反応（68℃、1.5分を40サイクル）を行った。
増幅したDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いてプラスミド（ｐCR2.1）にクローニングし、そのクローンのDNA断片の全塩基配列をアプライドバイオシステムズ（ABI）社のBigDye Terminator Cycle Sequenceing FS Ready Reaction Kit及びABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて決定した。
遺伝子情報処理ソフトGENETYX（ゼネティックス社）を用いて、得られたDNA断片の塩基配列から予測されるアミノ酸配列とIvicsら（Cell, 91, 501-, 1997）が報告したSBトランスポゼースのアミノ酸配列間の相同性を比較した。その結果、予想通り、数多くの変異が認められたため、PCRを利用した変異導入法（Ivicsらの方法：Cell, 91, 501-, 1997）によりそれぞれの変異箇所をSBトランスポゼースと同じアミノ酸配列をコードする塩基配列となるように修復した。すなわち、変異箇所を修復するために必要な各種プライマーを合成し、これらのプライマーを利用して増幅したDNA断片と、変異の存在する領域とを入れ替えることにより修復後のSBトランスポゼース遺伝子断片が挿入されたプラスミド（SB/pSP）を得た。該SBトランスポゼース遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図７と図８に示す。
トランスポゼース発現プラスミドpCAGG/SBの構築
PCRにより、SBトランスポゼースをコードする遺伝子の5’側にKozak配列を付加した後、これを動物用発現ベクターに挿入した。まず、実施例１で得たSB/pSPを鋳型として、5’側プライマー（配列番号35）と3’側プライマー（配列番号36）を用いてPCRを行い、トランスポゼース遺伝子の5’側末端に制限酵素XhoIの認識配列とKozak配列、3’側末端に制限酵素SalI及びBglIIの認識配列が付加したDNA断片を増幅した。PCRは、実施例１に準じて行った。これを制限酵素XhoIとBglIIで消化後、同じ制限酵素で消化して脱リン酸化（BAP）処理したクローニングベクターpSP72（プロメガ社）に挿入した（以下、得られたクローニングベクターを「SB/XS」と称する）。
PCRにより、SBトランスポゼースをコードする遺伝子の5’側にKozak配列を付加した後、これを動物用発現ベクターに挿入した。まず、実施例１で得たSB/pSPを鋳型として、5’側プライマー（配列番号35）と3’側プライマー（配列番号36）を用いてPCRを行い、トランスポゼース遺伝子の5’側末端に制限酵素XhoIの認識配列とKozak配列、3’側末端に制限酵素SalI及びBglIIの認識配列が付加したDNA断片を増幅した。PCRは、実施例１に準じて行った。これを制限酵素XhoIとBglIIで消化後、同じ制限酵素で消化して脱リン酸化（BAP）処理したクローニングベクターpSP72（プロメガ社）に挿入した（以下、得られたクローニングベクターを「SB/XS」と称する）。
次に、動物細胞用発現ベクターpCAGn-mcs-polyA（特願平８−１６５２４９）を一部改変したベクターpCAGGS-DN5を制限酵素SalIで消化後、BAP処理し、これにSB/XSを制限酵素XhoIとSalIで消化して得たトランスポゼース遺伝子を含むDNA断片を挿入し、トランスポゼース発現プラスミドpCAGG/SBを構築した。
トランスポゾンベクター（IR/DR-NTA-Ad/pSP）の構築
トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の内側に数種の制限酵素認識部位を有するトランスポゾンベクター（IR/DR-NTA-Ad/pSP）を以下の手順に従って構築した。
トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の内側に数種の制限酵素認識部位を有するトランスポゾンベクター（IR/DR-NTA-Ad/pSP）を以下の手順に従って構築した。
（１）5’側TIR配列及び3’側TIR配列の単離
サケの精子由来のDNA（ニッポンジーン社）を鋳型として、A.D.Radiceら（Mol. Gen. Genet. 244, 606-, 1994）が報告したプライマー（配列番号８）を用いてPCRを行い、トランスポゼース遺伝子及びその5’側と3’側の両方のTIR配列を含む約1.6kbpのDNA断片を増幅した。得られたDNA断片を、実施例１と同様に、pCR2.1にクローニングした。該クローンが保持するプラスミド（以下、「Salmon Tc1」と称する）の1.6kbp DNA断片部分の全塩基配列を決定し、更にIvicsら（Cell, 91, 501-, 1997）が報告したTanichthys Albonubes（日本名；アカヒレ）由来のTIR配列（EMBL／GenBank accession No.L48685）と同じ塩基配列となるように図９のスキームに従って修復した。
サケの精子由来のDNA（ニッポンジーン社）を鋳型として、A.D.Radiceら（Mol. Gen. Genet. 244, 606-, 1994）が報告したプライマー（配列番号８）を用いてPCRを行い、トランスポゼース遺伝子及びその5’側と3’側の両方のTIR配列を含む約1.6kbpのDNA断片を増幅した。得られたDNA断片を、実施例１と同様に、pCR2.1にクローニングした。該クローンが保持するプラスミド（以下、「Salmon Tc1」と称する）の1.6kbp DNA断片部分の全塩基配列を決定し、更にIvicsら（Cell, 91, 501-, 1997）が報告したTanichthys Albonubes（日本名；アカヒレ）由来のTIR配列（EMBL／GenBank accession No.L48685）と同じ塩基配列となるように図９のスキームに従って修復した。
先ず、単離したSalmon Tc1を制限酵素EcoRIとAccIで消化し、得られた約0.4kbpと約1.2kbpのDNA断片を1.5%アガロースゲル上でプラスミド由来のDNA断片と分離した。これら２つのDNA断片をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて回収した後、予めEcoRIとAccIで消化後、BAP処理したクローニングベクターpSP72（プロメガ社）にサブクローニングした（以下、得られたベクターを各々「5’Rg/pSP」、「3’Rg/pSP」と称する）。
5’側TIR配列の修復は以下の通り行った。5’Rg/pSPを鋳型として修復プライマーIR/DR rF1（配列番号９）とIR/DR rR1（配列番号10）を用いてPCRを行い、約0.3kbpのDNA断片を増幅し、回収した。これを、TOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いてプラスミド（pCR2.1）にクローニング後、制限酵素EcoRIとHindIIIで消化し、アガロースゲル上で分離した。得られた断片を、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理した5’Rg/pSPに挿入して5’RgDR/pSPを構築した。さらに、この5’RgDR/pSPを鋳型として、修復プライマーIR/DR-5’/F1（配列番号11）とIR/DR-5’/R1（配列番号12）の組合せ、及びIR/DR-5’/F2（配列番号13）とIR/DR-5’/R2（配列番号14）の組合せによるPCRを行い、各々約100bpと約160bpのDNA断片を増幅し、回収した。これらを等量混合し、変性反応（70℃、10分間）後、室温に戻るまで徐々に冷却することによりアニーリング処理した。本操作により両DNA断片の相同配列部分でアニーリングしたDNAを鋳型として、先のプライマーIR/DR-5’/F1とIR/DR-5’/R2を用いて再度PCRを行い、増幅した約240bpのDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）によりクローニングした。これを制限酵素AflIIとHindIIIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理した5’RgDR/pSPに挿入し、5’側TIR配列を有するプラスミド5’IR/DR-Nを構築した。
一方、3’側TIR配列の修復は以下の通り行った。3’Rg/pSPを鋳型として、修復プライマーIR/DR rF2（配列番号15）とIR/DR rR2（配列番号16）の組合せ、及びIR/DR rF3（配列番号17）とIR/DR rR3（配列番号18）の組合せによるPCRを行い、各々約200bpのDNA断片を増幅し、回収した。これらを等量混合して上述と同様にアニーリング処理した。このDNAを鋳型として、先のプライマーIR/DR rF2とIR/DR rR3を用いて再度PCRを行い、増幅した約370bpのDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）によりクローニングした。これを制限酵素EcoRIとMscIで消化した後、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理した3’Rg/pSPに挿入して3’側TIR配列を有するプラスミド3’RgDR/pSPを構築した。このようにして得られた5’側TIR配列及び3’側TIR配列の２つのDR領域の塩基配列を実施例１記載の方法により決定した。その結果、変異が修復された5’側TIR及び3’側TIRのDR領域の塩基配列は、それぞれ配列番号19及び配列番号20記載の配列であった。
（２）トランスポゾンベクター（IR/DR-NTA-Ad/pSP）の構築
先ず、5’IR/DR-Nを制限酵素HindIIIとEcoRVで消化して得られる5'側TIR配列を含むDNA断片を、制限酵素HindIIIとPvuIIで消化後、BAP処理した、3’側TIR配列を含む3’RgDR/pSPに挿入することによって、5’側と3’側の両方のTIR配列を有するIR/DR-Nを構築した（図１０）。
先ず、5’IR/DR-Nを制限酵素HindIIIとEcoRVで消化して得られる5'側TIR配列を含むDNA断片を、制限酵素HindIIIとPvuIIで消化後、BAP処理した、3’側TIR配列を含む3’RgDR/pSPに挿入することによって、5’側と3’側の両方のTIR配列を有するIR/DR-Nを構築した（図１０）。
次に、IR/DR-NのHindIII切断部位に数種の制限酵素切断部位を有するアダプターを挿入した。5’側末端をリン酸化したプライマー5’IR/DR-AdF（配列番号21）と5’IR/DR-AdR（配列番号22）を等量混合し、実施例３（１）で行ったのと同様にアニーリング処理することにより、両プライマーがアニーリングしたアダプター5’IR/DR-Adを得た。同様にして3’IR/DR-AdF（配列番号23）と3’IR/DR-AdR（配列番号24）をアニーリング処理したアダプター3’IR/DR-Adを得た。5’IR/DR-Adと3’IR/DR-Adを等量混合し、DNA Ligation Kit（TaKaRa社）を用いて16℃、30分反応した後、エタノール沈殿法により両アダプターが結合したDNA断片を回収した（IR/DR-Aｄ）。これを制限酵素HindIIIで消化し、先に構築したIR/DR-NのHindIII部位に挿入してIR/DR-N-Adを構築した。
5’側及び3’側の両TIR配列末端への制限酵素認識部位の付加は、以下のとおり行った。得られたIR/DR-N-AdをAflIIで消化後、pSP72ベクター部分を含む約2.5kbpのDNA断片と約630bpのDNA断片を回収した。2.5kbpのDNA断片については、DNA Ligation Kit（TaKaRa社）を用いて環状化（16℃、30分）した後、これを鋳型として、5’IR/DRTA-Fs（配列番号25）と3’IR/DRTA-R（配列番号26）を用いてPCRを行い、5’側及び3’側の末端に制限酵素認識部位が付加した約150bpのDNA断片を増幅した。これをTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）によりクローニングし（以下、得られたクローンのプラスミドを「TA-Fs/R」と称する）、150bpのDNA断片部分の塩基配列を確認した。TA-Fs/Rを制限酵素XhoIとBglIIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理したクローニングベクターpSP72に挿入することにより、TA-Fs/R-pSPを構築した。該TA-FsR-pSPを制限酵素AflIIで消化後、BAP処理し、これに先の630bpのDNA断片を挿入した。このようにして、転移に必要な5’側と3’側の２つのTIR配列間に制限酵素（StuI、NotI、SalI及びMscI）認識部位、両TIR配列の外側に制限酵素（XhoI及びBglII）認識部位を有するトランスポゾンベクターIR/DR-NTA-Ad/pSPを得た（図１１）。
トランスポゾン活性確認用プラスミド（IR/DR-puro）の構築
実施例３（２）で得たトランスポゾンベクターIR/DR-NTA-Ad/pSPのトランスポゾン活性を確認する為に、該トランスポゾンのSalI部位に、PGKプロモーター（Adra CN, Gene, 60, 65-74, 1987）調節下にピューロマイシン耐性酵素遺伝子（Gomez LEら, Nucleic Acids Res., 19, 3465, 1991）及びPGK由来のポリA付加シグナル配列を連結した発現プラスミドpPGKpuroを制限酵素SalIで消化して得られる約1.7kbpのDNA断片を挿入することにより、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子が挿入されたトランスポゾン活性確認用プラスミド（IR/DR-puro）を構築した（図１２）。
実施例３（２）で得たトランスポゾンベクターIR/DR-NTA-Ad/pSPのトランスポゾン活性を確認する為に、該トランスポゾンのSalI部位に、PGKプロモーター（Adra CN, Gene, 60, 65-74, 1987）調節下にピューロマイシン耐性酵素遺伝子（Gomez LEら, Nucleic Acids Res., 19, 3465, 1991）及びPGK由来のポリA付加シグナル配列を連結した発現プラスミドpPGKpuroを制限酵素SalIで消化して得られる約1.7kbpのDNA断片を挿入することにより、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子が挿入されたトランスポゾン活性確認用プラスミド（IR/DR-puro）を構築した（図１２）。
Lox配列を挿入した改変トランスポゾンベクターの構築
以下、本実施例では、置換反応に使用する組換えシステムとしてCre-Lox組換えシステムを利用するために必要なベクター、ドナープラスミド、組換え反応を担う酵素Creの発現プラスミドの構築及び置換反応の例を示すが、他の組換えシステムの利用も可能である。
以下、本実施例では、置換反応に使用する組換えシステムとしてCre-Lox組換えシステムを利用するために必要なベクター、ドナープラスミド、組換え反応を担う酵素Creの発現プラスミドの構築及び置換反応の例を示すが、他の組換えシステムの利用も可能である。
（１）変異型Lox配列を挿入した改変トランスポゾンベクター（IR/DR-Ad/5’Lxp）の構築
実施例３（２）で構築したIR/DR-NTA-Ad/pSPを鋳型として、SP6プライマー（配列番号27）とLoxP配列の変異型であるLox71の配列を挿入したプライマーPs/Lx71R（配列番号28）を用いてPCRを行い、5’側TIR配列内にLox71配列が付加された約200bpのDNA断片を増幅し、回収した。 PCRは、変性反応（94℃、１分）、アニーリング反応（55℃、２分）及び伸長反応（72℃、２分を35サイクル）以外は、実施例１に準じて行った。このDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いて一旦クローニングした後、制限酵素PshAIとXhoIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理をしたIR/DR-NTA-Ad/pSPに挿入することにより、5’側TIR配列に内在する2つのDR配列の間に変異型Lox71配列を有するトランスポゾンベクターIR/DR-Ad/5’Lxpを構築した（図１３）。なお、5’側TIR配列への変異型Lox71配列の挿入に際しては、2つのDR配列間の距離（DNA内の塩基数）が変わらないように、挿入するLox71配列と置換されるオリジナルの配列の長さが同じになるようにプライマーをデザインした。
実施例３（２）で構築したIR/DR-NTA-Ad/pSPを鋳型として、SP6プライマー（配列番号27）とLoxP配列の変異型であるLox71の配列を挿入したプライマーPs/Lx71R（配列番号28）を用いてPCRを行い、5’側TIR配列内にLox71配列が付加された約200bpのDNA断片を増幅し、回収した。 PCRは、変性反応（94℃、１分）、アニーリング反応（55℃、２分）及び伸長反応（72℃、２分を35サイクル）以外は、実施例１に準じて行った。このDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いて一旦クローニングした後、制限酵素PshAIとXhoIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理をしたIR/DR-NTA-Ad/pSPに挿入することにより、5’側TIR配列に内在する2つのDR配列の間に変異型Lox71配列を有するトランスポゾンベクターIR/DR-Ad/5’Lxpを構築した（図１３）。なお、5’側TIR配列への変異型Lox71配列の挿入に際しては、2つのDR配列間の距離（DNA内の塩基数）が変わらないように、挿入するLox71配列と置換されるオリジナルの配列の長さが同じになるようにプライマーをデザインした。
（２）3’側TIR配列へのLoxP配列の挿入
実施例３（２）で構築したIR/DR-NTA-Ad/pSPを制限酵素SalIとBglIIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理をしたpSP72（プロメガ社）にサブクローニングして3’IR/DR-Ad/pSPを構築した。次に、この3’IR/DR-Ad/pSPを鋳型として、SP6プライマー（配列番号27）とLoxP配列を挿入したプライマーAf/LxpR（配列番号29）を用いて実施例５（１）と同じ条件でPCRを行い、3’側TIR配列内にLoxP配列が付加された約400bpのDNA断片を増幅し、回収した。このDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いて一旦クローニングした後、制限酵素AflIIとSalIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理をした3’IR/DR-Ad/pSPに挿入することにより、3’側TIR配列内に存在する2つのDR配列の間にLoxP配列を有する改変トランスポゾンベクター3’IR/DR-Lxp/pSPを構築した（図１４）。こうして得られた3’IR/DR-Lxp/pSPの3’側TIR配列には、内在する2つのDR間の距離（DNA内の塩基数）が変わらないように実施例５（１）と同様の処理が行われている。
実施例３（２）で構築したIR/DR-NTA-Ad/pSPを制限酵素SalIとBglIIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理をしたpSP72（プロメガ社）にサブクローニングして3’IR/DR-Ad/pSPを構築した。次に、この3’IR/DR-Ad/pSPを鋳型として、SP6プライマー（配列番号27）とLoxP配列を挿入したプライマーAf/LxpR（配列番号29）を用いて実施例５（１）と同じ条件でPCRを行い、3’側TIR配列内にLoxP配列が付加された約400bpのDNA断片を増幅し、回収した。このDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いて一旦クローニングした後、制限酵素AflIIとSalIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理をした3’IR/DR-Ad/pSPに挿入することにより、3’側TIR配列内に存在する2つのDR配列の間にLoxP配列を有する改変トランスポゾンベクター3’IR/DR-Lxp/pSPを構築した（図１４）。こうして得られた3’IR/DR-Lxp/pSPの3’側TIR配列には、内在する2つのDR間の距離（DNA内の塩基数）が変わらないように実施例５（１）と同様の処理が行われている。
（３）3’側TIR配列へのLoxP配列／ポリAシグナル配列の挿入
実施例５（２）で構築した3’IR/DR-Lxp/pSPを鋳型として、SP6プライマーとLoxP配列の下流にウシ成長ホルモン由来のポリA付加シグナル配列が付加したプライマーAf/LxpAR（配列番号30）を用いて実施例５（１）と同じ条件でPCRを行い、3’側TIR配列内にLoxP配列及びそのLoxPの下流にポリA付加シグナル配列が付加した約400bpのDNA断片を増幅し、回収した。このDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いて一旦クローニングした後、制限酵素AflIIとSalIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理した3’IR/DR-Lxp/pSPに挿入することにより、LoxP配列とその下流にポリA付加シグナルを有するトランスポゾンベクター3’IR/DR-LxpA/pSPを構築した（図１５）。こうして得られた3’IR/DR-LxpA/pSPの3’側TIR配列には、内在する2つのDR間の距離（DNA内の塩基数）が変わらないように実施例５（１）と同様の処理が行われている。
実施例５（２）で構築した3’IR/DR-Lxp/pSPを鋳型として、SP6プライマーとLoxP配列の下流にウシ成長ホルモン由来のポリA付加シグナル配列が付加したプライマーAf/LxpAR（配列番号30）を用いて実施例５（１）と同じ条件でPCRを行い、3’側TIR配列内にLoxP配列及びそのLoxPの下流にポリA付加シグナル配列が付加した約400bpのDNA断片を増幅し、回収した。このDNA断片をTOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いて一旦クローニングした後、制限酵素AflIIとSalIで消化し、予め同じ制限酵素で消化後、BAP処理した3’IR/DR-Lxp/pSPに挿入することにより、LoxP配列とその下流にポリA付加シグナルを有するトランスポゾンベクター3’IR/DR-LxpA/pSPを構築した（図１５）。こうして得られた3’IR/DR-LxpA/pSPの3’側TIR配列には、内在する2つのDR間の距離（DNA内の塩基数）が変わらないように実施例５（１）と同様の処理が行われている。
（４）変異型Lox配列及びLoxP配列を挿入した改変トランスポゾンベクター（IR/DR-Ad/LxDb）の構築
3’IR/DR-Lxp/pSP（実施例５（２）で構築）を制限酵素BglIIとSalIで消化し、予め同じ酵素で消化後、BAP処理したIR/DR-Ad/5’Lxp（実施例５（１）で構築）に挿入して、5’側TIR配列内にLox71配列を有し、3’側TIR配列内にLoxP配列を有するトランスポゾンベクターIR/DR-Ad/LxDbを構築した（図１６）。
3’IR/DR-Lxp/pSP（実施例５（２）で構築）を制限酵素BglIIとSalIで消化し、予め同じ酵素で消化後、BAP処理したIR/DR-Ad/5’Lxp（実施例５（１）で構築）に挿入して、5’側TIR配列内にLox71配列を有し、3’側TIR配列内にLoxP配列を有するトランスポゾンベクターIR/DR-Ad/LxDbを構築した（図１６）。
（５）変異型Lox配列及びLoxP配列／ポリA付加シグナル配列を挿入した改変トランスポゾンベクター（IR/DR-Ad/LxpADb）の構築
3’IR/DR-LxpA/pSP（実施例５（３）で構築）を制限酵素BglIIとSalIで消化し、予め同じ酵素で消化後、BAP処理したIR/DR-Ad/5’Lxp（実施例５（１）で構築）に挿入して、5’側TIR配列内に変異型Lox71を有し、3’側TIR配列内にLoxP配列とその下流にポリA付加シグナル配列を有する改変トランスポゾンベクターIR/DR-Ad/LxpADbを構築した（図１６）。
3’IR/DR-LxpA/pSP（実施例５（３）で構築）を制限酵素BglIIとSalIで消化し、予め同じ酵素で消化後、BAP処理したIR/DR-Ad/5’Lxp（実施例５（１）で構築）に挿入して、5’側TIR配列内に変異型Lox71を有し、3’側TIR配列内にLoxP配列とその下流にポリA付加シグナル配列を有する改変トランスポゾンベクターIR/DR-Ad/LxpADbを構築した（図１６）。
Lox配列を挿入した改変トランスポゾン活性確認用プラスミドの構築
IR/DR-Ad/5’Lxp（実施例５（１）で構築）、IR/DR-Ad/LxDb（実施例５（４）で構築）及びIR/DR-Ad/LxpADb（実施例５（５）で構築）のトランスポゾン活性を確認する為に、それぞれのSalI部位に、PGKプロモーター調節下にピューロマイシン耐性酵素遺伝子とPGK由来のポリA付加シグナル配列を連結した発現プラスミドpPGKpuroを制限酵素SalIで消化して得られる約1.7kbpのDNA断片を挿入することにより、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子発現カセットが挿入されたトランスポゾン活性確認用プラスミドIR/DR-puro/5’Lxp、IR/DR-puro/LxDb及びIR/DR-puro/LxpADbを構築した（図１７）。
IR/DR-Ad/5’Lxp（実施例５（１）で構築）、IR/DR-Ad/LxDb（実施例５（４）で構築）及びIR/DR-Ad/LxpADb（実施例５（５）で構築）のトランスポゾン活性を確認する為に、それぞれのSalI部位に、PGKプロモーター調節下にピューロマイシン耐性酵素遺伝子とPGK由来のポリA付加シグナル配列を連結した発現プラスミドpPGKpuroを制限酵素SalIで消化して得られる約1.7kbpのDNA断片を挿入することにより、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子発現カセットが挿入されたトランスポゾン活性確認用プラスミドIR/DR-puro/5’Lxp、IR/DR-puro/LxDb及びIR/DR-puro/LxpADbを構築した（図１７）。
HeLa細胞を用いた各種トランスポゾン活性確認用プラスミドの導入効率の比較
（１）各種トランスポゾン活性確認用プラスミドの精製
実施例２で構築したトランスポゼース発現プラスミドpCAGGS/SB及び、実施例４と６で構築したトランスポゾン活性確認用プラスミド（IR/DR-puro、IR/DR-puro/5’Lxp、IR/DR-puro/LxDb及びIR/DR-puro/LxpAD）を添付のプロトコールに従って、コンピテントセルJM109（TOYOBO社）に導入し、各プラスミドを保持した組換え体を作製した。これらを50mg/mlアンピシリン含有L-Broth培地で一夜培養し、得られた各組換え体の培養液をPlasmid Maxi Kit（キアゲン社）を使用して添付のプロトコールに従って精製した。精製した各プラスミドはオートクレーブ処理した蒸留水に溶解し、波長260nmの吸光度を測定してその濃度を決定し、使用時まで-20℃で保存した。
（１）各種トランスポゾン活性確認用プラスミドの精製
実施例２で構築したトランスポゼース発現プラスミドpCAGGS/SB及び、実施例４と６で構築したトランスポゾン活性確認用プラスミド（IR/DR-puro、IR/DR-puro/5’Lxp、IR/DR-puro/LxDb及びIR/DR-puro/LxpAD）を添付のプロトコールに従って、コンピテントセルJM109（TOYOBO社）に導入し、各プラスミドを保持した組換え体を作製した。これらを50mg/mlアンピシリン含有L-Broth培地で一夜培養し、得られた各組換え体の培養液をPlasmid Maxi Kit（キアゲン社）を使用して添付のプロトコールに従って精製した。精製した各プラスミドはオートクレーブ処理した蒸留水に溶解し、波長260nmの吸光度を測定してその濃度を決定し、使用時まで-20℃で保存した。
（２）HeLa細胞への各種トランスポゾン活性確認用プラスミドの導入
各種トランスポゾン活性確認用プラスミドのHeLa細胞への導入は以下のように行った。Opti-MEM I Reduced-Serum Medium（INVITROGEN社）250μlにTrans-IT LT1（TaKaRa社）10μlを加え攪拌し、室温に10分間静置した後、実施例２で調製したpCAGGS/SB1.5μgと実施例４及び６で調製したトランスポゾン活性確認用プラスミド（IR/DR-puro、IR/DR-puro/5’Lxp、IR/DR-puro /LxDb又はIR/DR-puro/LxpADbのいずれか一つ）1.5μgを加え攪拌し、更に室温に15分間静置し、DNA/Trans-IT LT1複合体を形成させた。これをトランスフェクション直前に調製したHeLa細胞に添加し、37℃で６時間培養した後、上清を除いて10% complete DMEM 2ml/wellを添加し、5%CO2存在下、37℃で２日間培養した。
各種トランスポゾン活性確認用プラスミドのHeLa細胞への導入は以下のように行った。Opti-MEM I Reduced-Serum Medium（INVITROGEN社）250μlにTrans-IT LT1（TaKaRa社）10μlを加え攪拌し、室温に10分間静置した後、実施例２で調製したpCAGGS/SB1.5μgと実施例４及び６で調製したトランスポゾン活性確認用プラスミド（IR/DR-puro、IR/DR-puro/5’Lxp、IR/DR-puro /LxDb又はIR/DR-puro/LxpADbのいずれか一つ）1.5μgを加え攪拌し、更に室温に15分間静置し、DNA/Trans-IT LT1複合体を形成させた。これをトランスフェクション直前に調製したHeLa細胞に添加し、37℃で６時間培養した後、上清を除いて10% complete DMEM 2ml/wellを添加し、5%CO2存在下、37℃で２日間培養した。
上記のHeLa細胞は、10%のウシ胎児血清（ハイクローン社）と1/100量のペニシリン-ストレプトマイシン液（INVITROGEN社）を含むDMEM（シグマ社）（以下、「10% complete DMEM」と称することもある）で培養・維持したヒト子宮頸部癌由来のHeLa細胞（大日本製薬社）1.7×105個/2 ml/wellを6-well plate（コーニング社）に播種し、約１日培養した後、培養上清を除き、ダルベッコリン酸緩衝液（シグマ社）で洗浄後、Opti-MEM I Reduced-Serum Medium 0.8mlを添加したものを使用した。pCAGGS/SBを添加せず、トランスポゾン活性確認用プラスミドを単独でHeLa細胞に導入したものをコントロールとした。
（３）各種トランスポゾン活性確認用プラスミド導入効率の評価
実施例７（２）の各種トランスポゾン活性確認用プラスミドの導入処理を行なったHeLa細胞をダルベッコリン酸緩衝液（シグマ社）で洗浄し、0.05％トリプシン溶液（INVITROGEN社）200μlで37℃、３分間放置した後、10% complete DMEM２mlを加えて酵素反応を停止した。この細胞溶液をピペッティングにより分散した後、20μlを取り、等量のトリパンブルー染色液（INVITROGEN社）を加えて血球計算板により細胞数を測定した。同細胞懸濁液から3.8×104個の細胞を取り、予め１μg/ml ピューロマイシン（BD Bioscience社）含有10% complete DMEM 10mlを入れた直径10cmのdish（コーニング社）に加え、5%CO2存在下、37℃で培養した。培養期間中には、１μg/ml ピューロマイシン含有10% complete DMEMで少なくとも1回培地交換を行った。10〜14日間の培養後上清を除き、ダルベッコリン酸緩衝液でdishを洗浄し、0.2%クリスタルバイオレット（キシダ化学）／20%メタノール（和光純薬社）溶液1ml/dishを加え、室温で30分間、細胞を染色・固定した。その後、水道水でdishを洗浄し、自然乾燥後そのコロニー数を測定した。
実施例７（２）の各種トランスポゾン活性確認用プラスミドの導入処理を行なったHeLa細胞をダルベッコリン酸緩衝液（シグマ社）で洗浄し、0.05％トリプシン溶液（INVITROGEN社）200μlで37℃、３分間放置した後、10% complete DMEM２mlを加えて酵素反応を停止した。この細胞溶液をピペッティングにより分散した後、20μlを取り、等量のトリパンブルー染色液（INVITROGEN社）を加えて血球計算板により細胞数を測定した。同細胞懸濁液から3.8×104個の細胞を取り、予め１μg/ml ピューロマイシン（BD Bioscience社）含有10% complete DMEM 10mlを入れた直径10cmのdish（コーニング社）に加え、5%CO2存在下、37℃で培養した。培養期間中には、１μg/ml ピューロマイシン含有10% complete DMEMで少なくとも1回培地交換を行った。10〜14日間の培養後上清を除き、ダルベッコリン酸緩衝液でdishを洗浄し、0.2%クリスタルバイオレット（キシダ化学）／20%メタノール（和光純薬社）溶液1ml/dishを加え、室温で30分間、細胞を染色・固定した。その後、水道水でdishを洗浄し、自然乾燥後そのコロニー数を測定した。
pCAGGS/SBと各種トランスポゾン活性確認用プラスミドを一緒に導入して得られたピューロマイシン耐性細胞のコロニー数（CSB）と各種トランスポゾン活性確認用プラスミドの単独導入により得られたピューロマイシン耐性細胞のコロニー数（CN）の比（CSB/CN）を算出し、これをトランスポゾン活性確認用プラスミドの導入効率の指標とした。
各種トランスポゾン活性確認用プラスミドは、何れもHeLa細胞の染色体に高率に組み込まれており、その導入効率は、各種トランスポゾン活性確認用プラスミド単独で導入したときよりも15〜50倍高かった（表３）。この結果は、TIR内に存在する2つのDR領域間の距離（塩基数）を変えずにLox配列を挿入してもトランスポゾン活性による細胞への導入効率にほとんど影響しないことを示すものである。
Cre-Lox組換えシステムによる外来遺伝子の置換
（１）トランスポゾンベクター（IR/DR-puro/LxpADb）導入HeLa細胞のクローニング
実施例７（２）の方法に従って、IR/DR-puro/LxpADbをHeLa細胞に導入し、培養2日目に直径10cmのdish（コーニング社）に継代し、1μg/ml ピューロマイシン（BD Bioscience社）含有10% complete DMEMで２週間培養した。dishをリン酸緩衝液（シグマ社）で洗浄し、0.5%EDTA（和光純薬社）含有ダルベッコリン酸緩衝液10mlを加えて、室温に５分間静置した。バイオガードフード内に配置した顕微鏡下でdish上に生じたHeLa細胞の単一コロニーを物理的にはがし、これを、予め1μg/ml ピューロマイシン（BD Bioscience社）含有10% complete DMEM 500μlを入れた48-well plateに加え、5%CO2存在下、37℃で培養した。こうしてクローン化したピューロマイシン耐性HeLa細胞（以下、「HeLa/puro細胞」と称することもある）を、最終的に直径10cm dish培養まで順次拡張した。フルシート状に増殖した時点で、ダルベッコリン酸緩衝液（シグマ社）で洗浄後、トリプシン処理し、細胞を回収した。該細胞106個を液体窒素に保存し、残りを以降の染色体DNAの抽出に用いた。
（１）トランスポゾンベクター（IR/DR-puro/LxpADb）導入HeLa細胞のクローニング
実施例７（２）の方法に従って、IR/DR-puro/LxpADbをHeLa細胞に導入し、培養2日目に直径10cmのdish（コーニング社）に継代し、1μg/ml ピューロマイシン（BD Bioscience社）含有10% complete DMEMで２週間培養した。dishをリン酸緩衝液（シグマ社）で洗浄し、0.5%EDTA（和光純薬社）含有ダルベッコリン酸緩衝液10mlを加えて、室温に５分間静置した。バイオガードフード内に配置した顕微鏡下でdish上に生じたHeLa細胞の単一コロニーを物理的にはがし、これを、予め1μg/ml ピューロマイシン（BD Bioscience社）含有10% complete DMEM 500μlを入れた48-well plateに加え、5%CO2存在下、37℃で培養した。こうしてクローン化したピューロマイシン耐性HeLa細胞（以下、「HeLa/puro細胞」と称することもある）を、最終的に直径10cm dish培養まで順次拡張した。フルシート状に増殖した時点で、ダルベッコリン酸緩衝液（シグマ社）で洗浄後、トリプシン処理し、細胞を回収した。該細胞106個を液体窒素に保存し、残りを以降の染色体DNAの抽出に用いた。
（２）遺伝子置換用プラスミド（ドナープラスミドとCre発現プラスミド）の構築
（イ）ドナープラスミド（pLx/GFP/neo/pA(-)）の構築
図１８のスキームに従ってLox配列でGFP遺伝子の発現カセットとneo遺伝子の発現カセットが挟まれたドナープラスミドpLx/GFP/neo/pA(-)を構築した。まず、動物細胞用発現ベクターpCAGn-mcs-polyA（特願平８−１６５２４９）を制限酵素SalIで消化した後、DNA Blunting Kit（TaKaRa社）で切断末端を平滑化してそのまま結合することにより、SalI認識配列を欠失させた。これをEcoRIで消化し、DNA Blunting Kit（TaKaRa社）で切断末端を平滑化した後、制限酵素BamHIで消化して約1.5kbpのDNA断片を得た。これを、予め制限酵素SacIIで消化後、切断末端を同様に平滑化して制限酵素BamHIで消化・BAP処理したGFP遺伝子を有するpEGFP-N1（BD Bioscience社）に挿入してpCAG/GFP-N1を構築した。これを制限酵素AflIIで消化後、末端を平滑化し、さらに制限酵素EcoRIで消化し、約2.8kbpのDNA断片を回収した。
（イ）ドナープラスミド（pLx/GFP/neo/pA(-)）の構築
図１８のスキームに従ってLox配列でGFP遺伝子の発現カセットとneo遺伝子の発現カセットが挟まれたドナープラスミドpLx/GFP/neo/pA(-)を構築した。まず、動物細胞用発現ベクターpCAGn-mcs-polyA（特願平８−１６５２４９）を制限酵素SalIで消化した後、DNA Blunting Kit（TaKaRa社）で切断末端を平滑化してそのまま結合することにより、SalI認識配列を欠失させた。これをEcoRIで消化し、DNA Blunting Kit（TaKaRa社）で切断末端を平滑化した後、制限酵素BamHIで消化して約1.5kbpのDNA断片を得た。これを、予め制限酵素SacIIで消化後、切断末端を同様に平滑化して制限酵素BamHIで消化・BAP処理したGFP遺伝子を有するpEGFP-N1（BD Bioscience社）に挿入してpCAG/GFP-N1を構築した。これを制限酵素AflIIで消化後、末端を平滑化し、さらに制限酵素EcoRIで消化し、約2.8kbpのDNA断片を回収した。
一方、5’側にXhoI認識配列と内部にLox66配列を有するプライマーLx66/LxP-F（配列番号31）と5’側にBglII認識配列と内部にLoxP配列を有するプライマーLx66/LxP-R（配列番号32）を混合し、鋳型となるDNAを加えずにPCRを行った（Lx66/LxP-Fの3’側末端の25塩基とLx66/LxP-Rの3’側末端の25塩基は、互いに相補的な配列を有する）。増幅した約120bpの断片を制限酵素XhoIとBglIIで消化した後、予め同じ酵素で消化後、BAP処理したクローニングベクターpSP72に挿入し、Lx66/LxP/pSPを構築した。
次に、上記の約2.8kbpDNA断片を、EcoRIとMscIで消化後、BAP処理したLx66/LxP/pSPに挿入してpLx/CAG/GFPを構築した。さらに、pMC1neo（STRATAGENE社）を制限酵素BamHIとXhoIで消化後、末端を平滑化した約1.1kbpのDNA断片を回収し、予め制限酵素MscIで消化した後、BAP処理したpLx/CAG/GFPに挿入し、外来遺伝子発現カセット（GFP）及びneo遺伝子発現カセット（ただし、本カセットには先に述べたポリAトラップ法の利用のために、ポリA付加シグナル配列はない）がLoxP配列で挟まれたドナープラスミドpLx/GFP/neo/pA(-)を構築した。
（ロ）Cre遺伝子発現プラスミド（pCAGGS/Cre）の入手
Cre遺伝子発現プラスミドpCAGGS/Creは、熊本大学遺伝子実験施設の荒木助教授より供与された。
Cre遺伝子発現プラスミドpCAGGS/Creは、熊本大学遺伝子実験施設の荒木助教授より供与された。
（３）HeLa/puro細胞へのドナープラスミド及びCre遺伝子発現プラスミドの導入
実施例８（２）で構築・入手したpLx/GFP/neo/pA(-)及びpCAGGS/Creの各1.5μgを実施例８（１）で得たHeLa/puro細胞 2×105個/wellに実施例７（２）の方法に従って導入した。培養２日目に、細胞をダルベッコリン酸緩衝液（シグマ社）で洗浄し、0.05％トリプシン溶液（INVITROGEN社）200μlで37℃、３分間処理した後、10% complete DMEM ２mlを加えて反応を停止した。この細胞の懸濁液を直径10cmのdish（コーニング社）に継代し、750μg/mlG418（TaKaRa社）含有10% complete DMEM培地で10〜14日間培養を続けた。実施例８（１）の方法に準じて、G418耐性の単一コロニーを回収し、750μg/ml G418含有10% complete培地中で維持・継代し、48-well plate（コーニング社）でほぼフルシート状になるまで培養した。このようにしてクローン化したG418耐性細胞を24-well plate上で２つに分け、一方は同じ750μg/ml G418含有10% complete培地中で、もう一方は1μg/ml ピューロマイシン含有10% complete培地中で約１週間培養し、750μg/ml G418含有培地中で増殖し、かつ1μg/ml ピューロマイシン含有培地中で死滅するクローンを選択した。G418耐性、且つピューロマイシン非耐性クローン（以下、「HeLa/neo細胞」と称することもある）がGFP発現による緑色の蛍光を発することを蛍光顕微鏡下で確認した後、該HeLa/neo細胞を直径10cm dishまで拡張後、回収した。その106個の細胞を液体窒素中で保存し、残りを以下の染色体DNA調製に用いた。
実施例８（２）で構築・入手したpLx/GFP/neo/pA(-)及びpCAGGS/Creの各1.5μgを実施例８（１）で得たHeLa/puro細胞 2×105個/wellに実施例７（２）の方法に従って導入した。培養２日目に、細胞をダルベッコリン酸緩衝液（シグマ社）で洗浄し、0.05％トリプシン溶液（INVITROGEN社）200μlで37℃、３分間処理した後、10% complete DMEM ２mlを加えて反応を停止した。この細胞の懸濁液を直径10cmのdish（コーニング社）に継代し、750μg/mlG418（TaKaRa社）含有10% complete DMEM培地で10〜14日間培養を続けた。実施例８（１）の方法に準じて、G418耐性の単一コロニーを回収し、750μg/ml G418含有10% complete培地中で維持・継代し、48-well plate（コーニング社）でほぼフルシート状になるまで培養した。このようにしてクローン化したG418耐性細胞を24-well plate上で２つに分け、一方は同じ750μg/ml G418含有10% complete培地中で、もう一方は1μg/ml ピューロマイシン含有10% complete培地中で約１週間培養し、750μg/ml G418含有培地中で増殖し、かつ1μg/ml ピューロマイシン含有培地中で死滅するクローンを選択した。G418耐性、且つピューロマイシン非耐性クローン（以下、「HeLa/neo細胞」と称することもある）がGFP発現による緑色の蛍光を発することを蛍光顕微鏡下で確認した後、該HeLa/neo細胞を直径10cm dishまで拡張後、回収した。その106個の細胞を液体窒素中で保存し、残りを以下の染色体DNA調製に用いた。
（４）HeLa/puro細胞及びHeLa/neo細胞からの染色体DNAの調製
実施例８（１）及び（３）で取得したHeLa/puro細胞とHeLa/neo細胞（各5〜10×106個）を1500回転で５分間遠心分離し、細胞を回収した。これに10mM Tris-HCl/1mM EDTA溶液（以下、「TE」と称する）220μlを加えて懸濁し、リシスバッファー（10mM Tris-HCl、0.1MEDTA、0.5%SDS、終濃度20μg/ml RNase（シグマ社）、pH8.0）を106個あたり200μl加えて37℃で静置した。1時間後、終濃度100μg/mlのproteinase K（インビトロジェン社）を加え、攪拌して50℃でさらに３時間反応した。反応後、TEで飽和したフェノールを等量加えて室温で10分間振とうし、遠心分離して分離した水層を回収した。この操作を中間層が出なくなるまで繰り返し、最終的に回収した水層に1/5容量の10M塩化アンモニウムと2容量のエタノールを加えてガラス棒で攪拌した。攪拌の過程で沈殿する糸状の染色体DNAをガラス棒に巻き取り、70%エタノールで洗浄後室温にて10分間自然乾燥し、200μlのTEに溶解した。溶解後、波長260nmの吸光度からDNA濃度を算出した。
実施例８（１）及び（３）で取得したHeLa/puro細胞とHeLa/neo細胞（各5〜10×106個）を1500回転で５分間遠心分離し、細胞を回収した。これに10mM Tris-HCl/1mM EDTA溶液（以下、「TE」と称する）220μlを加えて懸濁し、リシスバッファー（10mM Tris-HCl、0.1MEDTA、0.5%SDS、終濃度20μg/ml RNase（シグマ社）、pH8.0）を106個あたり200μl加えて37℃で静置した。1時間後、終濃度100μg/mlのproteinase K（インビトロジェン社）を加え、攪拌して50℃でさらに３時間反応した。反応後、TEで飽和したフェノールを等量加えて室温で10分間振とうし、遠心分離して分離した水層を回収した。この操作を中間層が出なくなるまで繰り返し、最終的に回収した水層に1/5容量の10M塩化アンモニウムと2容量のエタノールを加えてガラス棒で攪拌した。攪拌の過程で沈殿する糸状の染色体DNAをガラス棒に巻き取り、70%エタノールで洗浄後室温にて10分間自然乾燥し、200μlのTEに溶解した。溶解後、波長260nmの吸光度からDNA濃度を算出した。
（５）サザンブロットによるHeLa/puro細胞及びHeLa/neo細胞染色体DNAの遺伝子置換の確認
先ず、neo遺伝子及びピューロマイシン耐性酵素遺伝子を検出する為のRI標識プローブを調製した。Neo遺伝子検出用プローブ（neoプローブ）は、pMC1neo（STRATAGENE社）を鋳型として、プライマーneo/1072F（配列番号37）とneo/1501R（配列番号38）を用いて、また、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子検出用プローブ（puroプローブ）はpPGKpuroを鋳型として、puro In/S（配列番号39）とpuro 2（配列番号40）を用いてPCRを行い、アガロースゲル電気泳動にかけた。目的のDNA断片をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて回収した。次にこれらのDNA断片100〜200ngを鋳型として、BcaBEST Dideoxy Sequencing Kit（TaKaRa社）を用い、添付のプロトコールに従って、〔α−32P〕dCTP（アマシャムバイオサイエンス社）で標識し、neoプローブ及びpuroプローブを得た。
先ず、neo遺伝子及びピューロマイシン耐性酵素遺伝子を検出する為のRI標識プローブを調製した。Neo遺伝子検出用プローブ（neoプローブ）は、pMC1neo（STRATAGENE社）を鋳型として、プライマーneo/1072F（配列番号37）とneo/1501R（配列番号38）を用いて、また、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子検出用プローブ（puroプローブ）はpPGKpuroを鋳型として、puro In/S（配列番号39）とpuro 2（配列番号40）を用いてPCRを行い、アガロースゲル電気泳動にかけた。目的のDNA断片をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて回収した。次にこれらのDNA断片100〜200ngを鋳型として、BcaBEST Dideoxy Sequencing Kit（TaKaRa社）を用い、添付のプロトコールに従って、〔α−32P〕dCTP（アマシャムバイオサイエンス社）で標識し、neoプローブ及びpuroプローブを得た。
これらのプローブを用いてサザンブロッドを行った。実施例８（４）で調製したHeLa/puro細胞とHeLa/neo細胞由来の染色体DNA（各20μg）、及び実施例６で構築したIR/DR-puro/LxpADbと実施例８（２）で構築したpLx/GFP/neo/pA(-)（各2ng）を、それぞれ制限酵素AflIIで消化し、0.7%アガロースゲル（BioRAD社）上で分離した。これを0.4M NaOH溶液中で毛細管現象を利用して一夜Hybond-N+フィルター（アマシャムバイオサイエンス社）に転写し、Rapid Hybバッファー（アマシャムバイオサイエンス社）中で65℃、１時間反応した後、該フィルターを新たなRapid Hybバッファーに移した。これに、100℃、５分間煮沸した後氷中で急冷したneoプローブ又はpuroプローブを加え、さらに65℃で一夜反応した。フィルターを回収し、0.5%SDS含有２×SSC（0.3M塩化ナトリウム、0.03Mクエン酸ナトリウム）溶液中でリンスした後、同溶液中で室温、15分間洗浄した。続いて、0.1%SDS含有0.1×SSC溶液中で65℃、30分間の洗浄を２〜３回行い、最後に0.1×SSCでリンスしてろ紙上で水分を除いた。これをサランラップ（旭化成社）で包み、オートラジオグラフィー用のカセットに入れ、BioMax MSフィルム（Kodak社）に４日間露光した。
その結果を図１９に示す。遺伝子置換前のIR/DR-puro/LxpADb を導入したHeLa/puro細胞（No.2；アクセプタークローン）ではneoプローブと反応するシグナルは認められないが、その細胞にドナープラスミドpLx/GFP/neo/pA(-)とpCAGGS/Creを導入したHeLa/neo細胞では約4.3kbpのシグナルが検出された（No.1及びNo.2）。また、陽性コントロールとしたpLx/GFP/neo/pA(-)は消化に用いた制限酵素AflIIの認識配列が存在しないため、シグナルは検出されるがそのサイズはHeLa/neo細胞とは異なるものであった。一方、puroプローブを用いた場合、遺伝子置換前のHeLa/puro細胞では陽性コントロールのIR/DR-puro/LxpADbと同じ、約2.4kbpのシグナルが検出されるが、遺伝子置換後のHeLa/neo細胞ではシグナルは検出されなかった（No.1、No.2及びNo.9）。この結果から、染色体DNAに挿入されたIR/DR-puro/LxpADbのピューロマイシン耐性酵素遺伝子がneo遺伝子及びGFP遺伝子に置換したことが推測される（図２０）。
（６）HeLa/neo細胞染色体DNAの遺伝子置換部位の確認
図２０に示した遺伝子置換がまさにLox配列上で起こっていることを確認する為に、BD GenomeWalker Universal Kit（BD Bioscience社）を用いてPCRを行った後、両末端TIR配列内に挿入されたLox配列近傍の塩基配列を決定した（以下、「Genome Walking」と称することもある）。まず、実施例８（４）で精製したHeLa/neo細胞の染色体DNAを切断末端が平滑となる制限酵素EcoRV、PvuII、SspI及びNaeIの何れかで消化し、キットに添付のプロトコールに従って添付のアダプターを結合した。これを以下に行なうPCRの鋳型として用いた。
図２０に示した遺伝子置換がまさにLox配列上で起こっていることを確認する為に、BD GenomeWalker Universal Kit（BD Bioscience社）を用いてPCRを行った後、両末端TIR配列内に挿入されたLox配列近傍の塩基配列を決定した（以下、「Genome Walking」と称することもある）。まず、実施例８（４）で精製したHeLa/neo細胞の染色体DNAを切断末端が平滑となる制限酵素EcoRV、PvuII、SspI及びNaeIの何れかで消化し、キットに添付のプロトコールに従って添付のアダプターを結合した。これを以下に行なうPCRの鋳型として用いた。
5’側の挿入位置を確認するために、アダプター配列由来のAP1プライマー（配列番号41）とCAGプロモーター配列に基づき作製したプライマーCAG/GSP2（配列番号42）を用いて第一段階のPCRを行った。続いてPCRの反応液1μlをとり、アダプター配列由来のAP2プライマー（配列番号43）とCAGプロモーター配列から作製したプライマーCAG/GSP4（配列番号44）を用いて第二段階のPCRを行った。
一方、3’側の挿入位置を確認するために、AP1プライマーとneo遺伝子配列に基づき作製したプライマーneo/1306F（配列番号45）を用いて25μlの反応液量で第一段階のPCRを行い、さらに、AP2プライマーとneo遺伝子配列から作製したプライマーneo/1389F（配列番号46）を用いて第二段階のPCRを行った。
第二段階後のPCR液の全量を1%アガロースゲル（BioRAD社）電気泳動にかけ、増幅したDNA断片を分離した後、該DNA断片をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス社）を用いてアガロースゲルから回収し、TOPO TA Cloning kit（INVITROGEN社）を用いてプラスミドpCR2.1にクローニングした。増幅DNA断片部分の塩基配列をアプライドバイオシステムズ（ABI）社のBigDye Terminator Cycle Sequenceing FS Ready Reaction Kit及びABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて決定した。
その結果、5’側TIR配列内に挿入されたLox配列の外側は最初に導入したIR/DR-puro/LxpADbの配列と一致し、その内側は置換のために導入したpLx/GFP/neo/pA(-)の配列と一致した。同様に、3’側TIR配列内に挿入されたLox配列の外側は最初に導入したIR/DR-puro/LxpADbの配列と一致し、その内側は置換のために導入したｐLx/GFP/neo/pA(-)の配列と一致した。さらに、確認された5’側TIR配列内のLox配列は、外側のCre結合部の配列は最初に導入したIR/DR-puro/LxpADbに用いたLox71の配列であり、内側のCre結合部の配列は置換のために導入したpLx/GFP/neo/pA(-)に用いたLox66の配列であった。該塩基配列から、HeLa/neo細胞は、IR/DR-puro/LxpADbの導入によって得られたHeLa/puroがｐCAGGS/CreとpLx/GFP/neo/pA(-)の同時導入によってLox配列上で組換えを起こし、そのLox配列で挟まれた領域（ピューロマイシン耐性酵素遺伝子発現カセット）がpLx/GFP/neo/pA(-)のLox配列で挟まれた領域（GFP及びneo遺伝子発現カセット）に置換されたことによって得られたものであることが確認できる（図２１）。
また、HeLa/neo細胞染色体DNA上のGFP及びneo遺伝子発現カセットの挿入位置は、Lox配列から外側のTIR配列末端のジヌクレオチドTAまでの配列は、5’側及び3’側ともに最初に導入したIR/DR-puro/LxpADb由来の配列と同一であった。しかし、そのさらに外側の配列は、米国のNCBIの核酸配列データベース（GeneBank）に登録されているヒト第３番染色体上の配列と一致した。この結果は、HeLa細胞に導入されたトランスポゾンベクターIR/DR-puro/LxpADbが、同時に細胞内に導入されたトランスポゼース発現プラスミドにより発現したトランスポゼースの作用により惹起されたトランスポゾン活性により該HeLa細胞の第３番染色体に転移・挿入されたことを示すものである（図２２）。
以上の結果は、トランスポゾンの5’側TIR配列内及び3’側TIR配列内にLox配列を挿入したトランスポゾンベクターを用いて、トランスポゾン活性により一旦遺伝子を染色体DNAに挿入した後、該TIR内のLox配列を介したCre-Lox組み換えシステムにより、別の遺伝子に置換することが可能であることを示す。さらに、この遺伝子置換反応を利用することにより、先に導入したトランスポゾンベクターの5’側TIR配列内及び3’側TIR配列に内在する２つのDR領域のうち、各々内側のDR領域を取り除くことが可能であることを示すものである。
遺伝子置換によるTIR配列破壊後のトランスポゾン活性の評価
（１）HeLa細胞へのIR/DR-puro/LxpADbの単独導入とドナープラスミドによる遺伝子置換
実施例７（２）の方法に従って、IR/DR-puro/LxpADbのみを導入し、実施例８（１）の方法に従って、クローン化したピューロマイシン耐性酵素HeLa細胞（以下、「単独／HeLa/puro細胞」と称することもある）を、6-well plateでフルシートになるまで培養後、回収し、106個を液体窒素に保存した。残りの細胞1.7×105個/wellを6-well plateに播種し、一夜培養した後、これに、実施例７（２）の方法に従って、pLx/GFP/neo/pA(-)とpCAGGS/Creを導入した。培養２日後に細胞を回収し、750μgG418含有10％ complete培地10mlに懸濁して直径10cmのdishに播種し、約10日間培養した。実施例８（１）の方法に従ってクローン化したG418耐性HeLa細胞（以下、「単独／HeLa/neo細胞」と称することもある）を、最終的に直径10 cmのdish でほぼフルシートになるまで培養し、回収した。該細胞から、実施例８（５）の方法に従って、染色体DNAを精製し、OD260の吸光度よりDNA濃度を算出した後、-20℃で保存した。
（１）HeLa細胞へのIR/DR-puro/LxpADbの単独導入とドナープラスミドによる遺伝子置換
実施例７（２）の方法に従って、IR/DR-puro/LxpADbのみを導入し、実施例８（１）の方法に従って、クローン化したピューロマイシン耐性酵素HeLa細胞（以下、「単独／HeLa/puro細胞」と称することもある）を、6-well plateでフルシートになるまで培養後、回収し、106個を液体窒素に保存した。残りの細胞1.7×105個/wellを6-well plateに播種し、一夜培養した後、これに、実施例７（２）の方法に従って、pLx/GFP/neo/pA(-)とpCAGGS/Creを導入した。培養２日後に細胞を回収し、750μgG418含有10％ complete培地10mlに懸濁して直径10cmのdishに播種し、約10日間培養した。実施例８（１）の方法に従ってクローン化したG418耐性HeLa細胞（以下、「単独／HeLa/neo細胞」と称することもある）を、最終的に直径10 cmのdish でほぼフルシートになるまで培養し、回収した。該細胞から、実施例８（５）の方法に従って、染色体DNAを精製し、OD260の吸光度よりDNA濃度を算出した後、-20℃で保存した。
（２）単独／HeLa/neo細胞染色体DNAの遺伝子置換部位の確認
実施例９（１）で得た単独／HeLa/neo細胞染色体DNAを実施例８（６）の方法に従って、遺伝子置換部位の塩基配列を決定した（Genome Walking）。その結果、単独／HeLa/neo細胞は、トランスポゾンベクターIR/DR-puro/LxpADb単独の導入によって得られた単独／HeLa/puroがｐCAGGS/CreとｐLx/GFP/neo/pA(-)の同時導入によってLox配列上で組換えを起こし、そのLox配列で挟まれた領域（ピューロマイシン耐性酵素遺伝子発現カセット）がｐLx/GFP/neo/pA(-)のLox配列で挟まれた領域（GFP及びneo遺伝子発現カセット）に置換されたことによって得られたものであった。
実施例９（１）で得た単独／HeLa/neo細胞染色体DNAを実施例８（６）の方法に従って、遺伝子置換部位の塩基配列を決定した（Genome Walking）。その結果、単独／HeLa/neo細胞は、トランスポゾンベクターIR/DR-puro/LxpADb単独の導入によって得られた単独／HeLa/puroがｐCAGGS/CreとｐLx/GFP/neo/pA(-)の同時導入によってLox配列上で組換えを起こし、そのLox配列で挟まれた領域（ピューロマイシン耐性酵素遺伝子発現カセット）がｐLx/GFP/neo/pA(-)のLox配列で挟まれた領域（GFP及びneo遺伝子発現カセット）に置換されたことによって得られたものであった。
また、単独／HeLa/neo細胞の染色体DNAに挿入された5’側及び3’側TIR配列末端より外側の配列はIR/DR-puro/LxpADb由来の配列と一致した。さらにその外側は、米国のNCBIの核酸配列データベース（GeneBank）に登録されているヒト第12番染色体上の配列と一致した。この結果は、HeLa細胞に導入されたトランスポゾンベクターIR/DR-puro/LxpADbが、細胞内で生じる通常の組換え機構により、該HeLa細胞の第12番染色体に組み込まれたことによって単独／HeLa/puro細胞が得られ、さらにCre-Lox組換えシステムによって単独／HeLa/neo細胞が得られたことを示すものである。
以上の結果は、トランスポゾンの5’側TIR配列内及び3’側TIR配列内にLox配列を挿入したトランスポゾンベクターを単独で用いて、該トランスポゾンベクターを染色体DNAにランダムに挿入した後、該TIR内のLox配列を介したCre-Lox組換えシステムにより、別の遺伝子に置換することが可能であることを示唆するものである（図２３）。
（３）TIR配列を破壊した改変トランスポゾンベクター及び改変トランスポゾン活性評価用プラスミドの構築
実施例９（２）のGenome Walkingにより得られた、Cre-Lox組換えシステムによる置換を起こした5’側TIR配列の一部を有するDNA断片及び3’側TIR配列の一部を有するDNA断片をそれぞれ保持するクローン（2B−No.2と2B−No.6）は、置換反応によりTIR配列が破壊された構造を有する。この2つのクローンを利用して、図２４に示すスキームに従い、5’側TIR配列が破壊されたトランスポゾンベクターと5’側TIR配列及び3’側TIR配列の両方が破壊されたトランスポゾンベクター２種類を構築した。
実施例９（２）のGenome Walkingにより得られた、Cre-Lox組換えシステムによる置換を起こした5’側TIR配列の一部を有するDNA断片及び3’側TIR配列の一部を有するDNA断片をそれぞれ保持するクローン（2B−No.2と2B−No.6）は、置換反応によりTIR配列が破壊された構造を有する。この2つのクローンを利用して、図２４に示すスキームに従い、5’側TIR配列が破壊されたトランスポゾンベクターと5’側TIR配列及び3’側TIR配列の両方が破壊されたトランスポゾンベクター２種類を構築した。
先ず、2B−No.6を制限酵素SalIとBglIIで消化して得られる約170bpの断片を、予め同じ制限酵素で消化してBAP処理したIR/DR-Ad/LxpADbに挿入することにより、3’側TIR配列のみを破壊したトランスポゾンベクターIR/DR-3’IR/pSPを得た。続いて、制限酵素SalIで消化後、BAP処理したIR/DR-3’IR/pSPに、pPGKpuroの同制限酵素消化により得られる約1.7kbpのDNA断片を挿入することにより、トランスポゾン活性評価用プラスミドIR/DR-3’IR/puroを構築した。
次に、2B−No.2を制限酵素XhoIとSalIで消化して得られる約160bpの断片を、予め同じ酵素で消化後、BAP処理したクローニングベクターpSP72に挿入することにより、5’IR/pSPを得た。続いて、制限酵素SalIとBglIIで消化後、BAP処理した5’IR/pSPに、2B−No.6を同制限酵素消化により得られる約170bpのDNA断片を挿入し、5’側TIR配列及び3’側TIR配列の両方を破壊した改変トランスポゾンベクター5’+3’IR/pSPを構築した。さらに、HeLa細胞でのトランスポゾン活性を評価するために、5’+3’IR/pSPを制限酵素SalIで消化後、BAP処理したものに、pPGKpuroの同制限酵素消化により得られる約1.7kbpのDNA断片を挿入してトランスポゾン活性評価用プラスミド5’+3’IR/puroを構築した。
（４）TIR配列の破壊によるトランスポゾン活性の影響
3’側のTIR配列を破壊したIR/DR-3’IR/puro（実施例９（３）で構築）、5’側と3’側の両方のTIR配列を破壊した5’+3’IR/puro（実施例９（３）で構築）及び遺伝子置換前のTIR配列を保持したIR/DR-Ad/LxpADb（実施例５（５）で構築）を、トランスポゼース発現プラスミドpCAGGS/SB（実施例２で構築）と共に、実施例７（２）に示した方法でHeLa細胞に導入した。導入後２日目にトリプシン処理により細胞を回収し、直径10cm dish当たり5×105個の細胞を播種し、1μg/mlのピューロマイシンを含む10% Complete培地での薬剤選択を開始した。薬剤選択開始から10日後、ダルベッコリン酸緩衝液でdishを洗浄し、0.2%クリスタルバイオレット（キシダ化学）／20%メタノール（和光純薬社）溶液1ml/dishを加え、室温で30分間、細胞を染色・固定した。その後、水道水中でdishを洗浄し、自然乾燥後そのコロニー数を比較した。
3’側のTIR配列を破壊したIR/DR-3’IR/puro（実施例９（３）で構築）、5’側と3’側の両方のTIR配列を破壊した5’+3’IR/puro（実施例９（３）で構築）及び遺伝子置換前のTIR配列を保持したIR/DR-Ad/LxpADb（実施例５（５）で構築）を、トランスポゼース発現プラスミドpCAGGS/SB（実施例２で構築）と共に、実施例７（２）に示した方法でHeLa細胞に導入した。導入後２日目にトリプシン処理により細胞を回収し、直径10cm dish当たり5×105個の細胞を播種し、1μg/mlのピューロマイシンを含む10% Complete培地での薬剤選択を開始した。薬剤選択開始から10日後、ダルベッコリン酸緩衝液でdishを洗浄し、0.2%クリスタルバイオレット（キシダ化学）／20%メタノール（和光純薬社）溶液1ml/dishを加え、室温で30分間、細胞を染色・固定した。その後、水道水中でdishを洗浄し、自然乾燥後そのコロニー数を比較した。
IR/DR-puro/LxpADbとトランスポゼース発現プラスミドpCAGGS/SBを導入したHeLa細胞では、該IR/DR-puro/LxpADbを単独導入した場合に比べてピューロマイシン耐性コロニーの出現率が有意に上昇したのに対し、IR/DR-3’IR/puro及び5’+3’IR/puroを導入したHeLa細胞ではいずれもピューロマイシン耐性コロニーの出現率の上昇が認められなかった（表４）。この結果は、Cre-Lox遺伝子発現システム下にLox配列を介した遺伝子の置換によりTIR配列が破壊され、この破壊によりトランスポゾン活性が消失することを示す。また、該トランスポゾン活性の消失は、5’側TIR配列及又は3’側TIR配列いずれか一方の破壊により起こる得ることを示す。なお、表４中のCSBは、各プラスミドとpCAGGS/SBを同時に導入した際に得られたコロニー数を示し、CNは、各プラスミド単独で導入した際に得られたコロニー数を示す。
以上の結果から、本発明の改変トランスポゾンベクターは、（１）高率に外来遺伝子を細胞に導入することができる、（２）トランスポゾン活性により、染色体DNA上の特定部位（TA配列）に外来遺伝子を挿入することができる、（３）Cre-Lox組換えシステムにより大きなサイズの遺伝子を挿入又は置換することができる、（４）トランスポゾンとしての宿命である染色体DNA上の導入遺伝子の転移能を確実に抑えることができる等の特徴を有するものである。
ニワトリ始原生殖細胞（PGC）への改変トランスポゾンベクターシステムの利用と個体化
（１）PGC導入用改変トランスポゾンプラスミドの構築
実施例５（５）で構築した改変トランスポゾンベクターIR/DR-Ad/LxpADbに以下に示す手順に従って、GFP発現カセット及びneomycin耐性遺伝子の発現カセットを挿入したIR/DR-GFP/neo/LxpADbを構築した（図２５）。
（１）PGC導入用改変トランスポゾンプラスミドの構築
実施例５（５）で構築した改変トランスポゾンベクターIR/DR-Ad/LxpADbに以下に示す手順に従って、GFP発現カセット及びneomycin耐性遺伝子の発現カセットを挿入したIR/DR-GFP/neo/LxpADbを構築した（図２５）。
実施例８（２）で構築したpCAG/GFP-N1を制限酵素AflIIで消化後、末端を平滑化し、さらに制限酵素SalIで消化し、約2.8kbpのDNA断片を回収した。これを制限酵素StuIとSalIで消化後BAP処理したIR/DR-Ad/LxpADbに挿入し、IR/DR-GFP/LxpADbを構築した。次にpMC1neo PolyA（STRATAGENE社）を制限酵素XhoIとSalIで消化後回収した約1.2kbpのDNA断片を、SalI消化後BAP処理したIR/DR-GFP/LxpADbに挿入し、IR/DR-GFP/neo/LxpADbを構築した。
（２）ニワトリPGCの分離・培養
購入した産卵直後の受精卵（日生研）を孵卵器（昭和フランキ社）にて培養し、培養開始から２〜３日後の、ハンバーガー・ハミルトンの分類（J. Morphol., 88, 49-92, 1951）でステージ12〜15のニワトリ胚の血液を採取し、Zhaoらの方法（Br. Poult. Sci., 44, 30-35, 2003）に従って分離した。なお、分離したPGCは、抗SSEA-1抗体との反応性によりPGCの性状を保持していることを確認した。分離後のPGCは国際特許出願（WO 9606160）に開示された培養方法に従って維持・培養した。
購入した産卵直後の受精卵（日生研）を孵卵器（昭和フランキ社）にて培養し、培養開始から２〜３日後の、ハンバーガー・ハミルトンの分類（J. Morphol., 88, 49-92, 1951）でステージ12〜15のニワトリ胚の血液を採取し、Zhaoらの方法（Br. Poult. Sci., 44, 30-35, 2003）に従って分離した。なお、分離したPGCは、抗SSEA-1抗体との反応性によりPGCの性状を保持していることを確認した。分離後のPGCは国際特許出願（WO 9606160）に開示された培養方法に従って維持・培養した。
（３）PGCへの改変トランスポゾンプラスミドの導入
実施例２で構築したトランスポゼース発現プラスミドpCAGGS/SBと（１）で構築したIR/DR-GFP/neo/LxpADbのPGCへの導入は以下のように行った。pCAGGS/SB2.5μgとIR/DR-GFP/neo/LxpADb2.5μgをOpti-MEM I Reduced-Serum Medium（INVITROGEN社）250μlに添加・希釈し、Opti-MEM I Reduced-Serum Medium（INVITROGEN社）250μlにLF2000（INVITROGEN社）10μlを加え攪拌し、室温に５分間静置した溶液に加えてさらに室温で20分間静置した。これを抗生剤のみを除いた培地に再懸濁したPGCに添加し、5%CO2存在下、37℃で２〜３日間培養した。その後PGCを回収し、100μg /mlのG418（TaKaRa社）を含む培地で培養し、耐性クローンのセレクションを開始した。
実施例２で構築したトランスポゼース発現プラスミドpCAGGS/SBと（１）で構築したIR/DR-GFP/neo/LxpADbのPGCへの導入は以下のように行った。pCAGGS/SB2.5μgとIR/DR-GFP/neo/LxpADb2.5μgをOpti-MEM I Reduced-Serum Medium（INVITROGEN社）250μlに添加・希釈し、Opti-MEM I Reduced-Serum Medium（INVITROGEN社）250μlにLF2000（INVITROGEN社）10μlを加え攪拌し、室温に５分間静置した溶液に加えてさらに室温で20分間静置した。これを抗生剤のみを除いた培地に再懸濁したPGCに添加し、5%CO2存在下、37℃で２〜３日間培養した。その後PGCを回収し、100μg /mlのG418（TaKaRa社）を含む培地で培養し、耐性クローンのセレクションを開始した。
約2週間のセレクションの後、増殖したPGCのGFP発現及びPGCのマーカーとなる抗SSEA-１抗体に対する反応性を確認した（図２６）。その結果、図２６に示すように、1次抗体の抗SSEA-1抗体（コスモバイオ社）との反応に続くテキサスレッド標識抗マウス抗体（コスモバイオ社）との反応により、ほとんどの細胞が赤い蛍光を発し、得られた細胞がPGCの性状を維持していることが確認できた。さらに、得られたPGCの約半分に改変トランスポゾンプラスミドIR/DR-GFP/neo/LxpADbに由来するGFPの発現が認められた。
（４）改変トランスポゾンプラスミド導入PGCのニワトリ胚への注入と生殖巣原基への移動能確認
（３）で得られた、改変トランスポゾンプラスミドを導入したG418耐性、GFP発現PGCを桑名らの方法（実験医学；12(2) 増刊, 154-159, 1994）に従って、ステージ12〜13のニワトリ胚に注入した。簡単に述べると、約50〜60時間培養の受精卵の卵殻を操作可能な範囲まで取り除き、ニワトリ胚の胚外血管（周縁静脈）を実体顕微鏡下で観察できるようにした。培地で約500個／μlに懸濁した改変トランスポゾンプラスミドを導入したG418耐性、GFP発現PGCを胚外血管（周縁静脈）よりも細く伸ばしたガラス管（キャピラリー管）に約２μl取り、実体顕微鏡下で胚外血管（周縁静脈）に血流方向に沿って刺し、注入した。注入後、血管からの逆流を防ぐためにさらに泡を注入し、キャピラリーを血管より抜き、卵殻を取り除いた部位をブックテープでシールした。これを孵卵器に移し、転卵しながら培養した。
（３）で得られた、改変トランスポゾンプラスミドを導入したG418耐性、GFP発現PGCを桑名らの方法（実験医学；12(2) 増刊, 154-159, 1994）に従って、ステージ12〜13のニワトリ胚に注入した。簡単に述べると、約50〜60時間培養の受精卵の卵殻を操作可能な範囲まで取り除き、ニワトリ胚の胚外血管（周縁静脈）を実体顕微鏡下で観察できるようにした。培地で約500個／μlに懸濁した改変トランスポゾンプラスミドを導入したG418耐性、GFP発現PGCを胚外血管（周縁静脈）よりも細く伸ばしたガラス管（キャピラリー管）に約２μl取り、実体顕微鏡下で胚外血管（周縁静脈）に血流方向に沿って刺し、注入した。注入後、血管からの逆流を防ぐためにさらに泡を注入し、キャピラリーを血管より抜き、卵殻を取り除いた部位をブックテープでシールした。これを孵卵器に移し、転卵しながら培養した。
このようにして注入操作後培養した改変トランスポゾンプラスミド導入PGCの注入胚について、注入から１日後にその胚を切り取り、将来生殖巣に分化すると推定される領域（生殖巣原基）への移動能を調べた。その結果、図２７に示すように、生殖原基へのGFP発現細胞、即ち改変トランスポゾンプラスミド導入PGCの移動が確認できた。
（５）改変トランスポゾンプラスミド導入PGC注入卵の孵化と生殖巣のGFP発現確認
（４）で改変トランスポゾンプラスミド導入PGCを注入した16胚を、孵卵器での培養開始から17日後に孵化器（MURAI INCUBATOR社）に移し、さらに３日間培養した。孵化器での３日間の培養の後、16胚から8羽のヒナが孵化した。これら8羽のヒナからその生殖巣を取り、GFPの発現を調べたところ5羽にGFPの発現が確認された（表５、図２８）。
（４）で改変トランスポゾンプラスミド導入PGCを注入した16胚を、孵卵器での培養開始から17日後に孵化器（MURAI INCUBATOR社）に移し、さらに３日間培養した。孵化器での３日間の培養の後、16胚から8羽のヒナが孵化した。これら8羽のヒナからその生殖巣を取り、GFPの発現を調べたところ5羽にGFPの発現が確認された（表５、図２８）。
さらに、（４）に示す方法で4回の改変トランスポゾンプラスミド導入PGCの胚への注入操作を実施し、計131胚への注入と培養により、新たに６羽のヒナが誕生した。これら６羽のヒナ以外の孵化直前に死亡した胚15羽の生殖巣を取り、GFP発現の有無を蛍光顕微鏡により観察した。その結果、８羽の胚の生殖巣に改変トランスポゾンプラスミド導入PGC由来のGFP発現が観察された（表６）。
PGCは将来生殖細胞、即ち精子または卵子に分化することが運命付けられた細胞であることから、改変トランスポゾンプラスミド導入PGCが胚の生殖巣に定着し、かつ導入した遺伝子の発現を維持していたという事実は、次世代に導入遺伝子が受け継がれることを意味する。したがって、本発明によって得られた6羽のヒナから、改変トランスポゾンプラスミドを導入したPGCから遺伝子組換えニワトリを作製することが可能であることを意味するものである。さらに、改変トランスポゾンプラスミドを導入した遺伝子組換えニワトリの生産する受精卵から、新たにPGCを得ることでCre-Lox組換えシステムにより新たな外来遺伝子の挿入または置換が可能である。
本発明の改変トランスポゾンベクターを利用して得られるGFP産生細胞はGFP蛋白の原材料として利用される。大量培養した当該細胞の培養液又は細胞破砕物から適当な精製方法を用いてGFP蛋白を製造することができる。また、GFP遺伝子の代わりに他の外来遺伝子を挿入することにより、種々の外来蛋白産生細胞或いは外来蛋白産生動物を得ることができ、これらの外来蛋白製造の材料となり得る。
Claims (39)
- 下記（イ）〜（ロ）又は（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクター：
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された。 - トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である請求項１記載の改変トランスポゾンベクター。
- 組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である請求項１又は２の何れか一項記載の改変トランスポゾンベクター。
- 該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である請求項３記載の改変トランスポゾンベクター。
- 該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される請求項４記載の改変トランスポゾンベクター。
- LoxP配列、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272及びLox511配列がそれぞれ配列番号３、４、５、６及び７である請求項４又は５の何れか一項記載の改変トランスポゾンベクター。
- 下記（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターを細胞に導入し、得られる外来遺伝子発現細胞を培養し、ついで発現された外来蛋白を回収することからなる外来蛋白の生産方法：
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に外来遺伝子発現カセットが挿入された。 - 下記（１）〜（４）の工程により得られる外来遺伝子発現細胞を培養することからなる外来蛋白の生産方法：
（１）下記（イ）〜（ロ）又は（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターを細胞に導入する工程、
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセット（外来遺伝子発現カセットＡ）が挿入された；
（２）得られる形質転換細胞をクローニングする工程、
（３）両末端又は何れか一方の末端に前記（１）（ロ）と同じ組換え反応が生じる場の配列を付加した外来遺伝子発現カセット（外来遺伝子発現カセットＢ）を前記クローン化形質転換細胞に導入する工程、及び
（４）外来遺伝子発現細胞を培養する工程。 - トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である請求項７ないし８の何れか一項記載の方法。
- 組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である請求項７ないし９の何れか一項記載の方法。
- Lox配列が、配列番号３の配列を有するLoxP配列である、請求項１０記載の方法。
- 該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である請求項１０記載の方法。
- 該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される請求項１２記載の方法。
- Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列がそれぞれ配列番号４、５、６及び７である請求項１３記載の方法。
- 前記改変トランスポゾンベクターとトランスポゼース遺伝子発現プラスミドとを一緒に細胞に導入することを特徴とする請求項７ないし１４の何れか一項記載の方法。
- トランスポゼース遺伝子発現カセットが組み込まれた前記改変トランスポゾンベクターを用いること特徴とする請求項７ないし１４の何れか一項記載の方法。
- 前記外来遺伝子発現カセットＢとCre遺伝子発現プラスミドとを一緒に導入することを特徴とする請求項８ないし１６の何れか一項記載の方法。
- Cre遺伝子発現カセットが組み込まれた前記外来遺伝子発現カセットＢを用いることを特徴とする請求項８ないし１６の何れか一項記載の方法。
- 該外来遺伝子発現細胞が、HeLa細胞、Vero細胞、CHO細胞、293細胞、BHK細胞及びSP2/0細胞からなる群より選択された細胞である請求項７ないし１８の何れか一項記載の方法。
- 下記（イ）〜（ロ）若しくは（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片を有する改変トランスポゾンベクターが組み込まれた形質転換細胞、又は当該形質転換細胞に、更に両末端又は何れか一方の末端に下記（ロ）と同じ組換え反応が生じる場の配列を付加した外来遺伝子発現カセットが組み込まれた形質転換細胞：
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された。 - 外来遺伝子を発現する請求項２０記載の形質転換細胞。
- トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である請求項２０又は２１の何れか一項記載の形質転換細胞。
- 組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である請求項２０ないし２２の何れか一項記載の形質転換細胞。
- Lox配列が、配列番号３の配列を有するLoxP配列である、請求項２３記載の形質転換細胞。
- 該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である請求項２３記載の形質転換細胞。
- 該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される請求項２５記載の形質転換細胞。
- Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列がそれぞれ配列番号４、５、６及び７である請求項２６記載の形質転換細胞。
- 該外来遺伝子発現細胞が、HeLa細胞、Vero細胞、CHO細胞、293細胞、BHK細胞及びSP2/0細胞からなる群より選択された細胞である請求項２０ないし２７の何れか一項記載の形質転換細胞。
- 個体化可能な細胞である請求項２０ないし２７の何れか一項記載の形質転換細胞。
- 該個体化可能な細胞が、非ヒト哺乳類、鳥類、魚類及び非脊椎動物由来の受精卵、胚盤胞期までの卵割細胞、ES細胞、EG細胞並びに始原生殖細胞（PGC）からなる群より選択される請求項２９記載の形質転換細胞。
- 下記（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片を有する改変トランスポゾンベクターが組み込まれた外来遺伝子を発現する個体化可能な形質転換細胞、又は
下記（イ）〜（ロ）若しくは（イ）〜（ハ）の特徴を有する核酸断片を有する改変トランスポゾンベクターが組み込まれた個体化可能な形質転換細胞に、更に両末端又は何れか一方の末端に下記（ロ）と同じ組換え反応が生じる場の配列を付加した外来遺伝子発現カセットが組み込まれた、外来遺伝子を発現する個体化可能な形質転換細胞を用いて作出された遺伝子組換え非ヒト動物：
（イ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列からなる；
（ロ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列又は3’側TIR配列に各々2つずつ存在するDR領域の少なくとも一方のDR領域の間に組換え反応が生じる場の配列が挿入された；
（ハ）トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列と3’側TIR配列の間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入された。 - トランスポゾン遺伝子の5’側TIR配列及び3’側TIR配列がそれぞれ配列番号１及び２である請求項３１記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
- 組み換え反応が生じる場の配列がLox配列又はFRT配列である請求項３１又は３２の何れか一項記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
- Lox配列が、配列番号３の配列を有するLoxP配列である、請求項３３記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
- 該Lox配列の少なくとも一個が変異型のLox配列である請求項３３記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
- 該変異型のLox配列が、Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列からなる群より選択される請求項３５記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
- Lox71配列、Lox66配列、Lox2272配列及びLox511配列がそれぞれ配列番号４、５、６及び７である請求項３６記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
- 該個体化可能な細胞が、哺乳類、鳥類、魚類及び非脊椎動物由来の受精卵、胚盤胞期までの卵割細胞、ES細胞、EG細胞並びにPGCからなる群より選択される請求項３１ないし３７の何れか一項記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
- ニワトリである請求項３１ないし３８の何れか一項記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
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