ES2267567T3 - Recombinacion de adn especifica de secuencia en celulas eucariotas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la recombinación específica de secuencia de ADN en una célula eucariótica in vitro, que comprende a) la introducción en una célula de una primera secuencia de ADN, que comprende: una secuencia attB según la ID SEC Nº: 1 o su derivado, o una secuencia attP según la ID SEC Nº: 2 o su derivado, o una secuencia attL según la ID SEC Nº: 3 o su derivado, o una secuencia attR según la ID SEC Nº: 4 o su derivado, b) la introducción en la célula de una segunda secuencia de ADN, que comprende: una secuencia attP según la ID SEC Nº: 2 o su derivado, en caso de que la primera secuencia de ADN comprenda una secuencia attB según ID SEC Nº: 1 o su derivado; o una secuencia attB según la ID SEC Nº: 1 o su derivado, en caso de que la primera secuencia de ADN comprenda una secuencia attP según ID SEC Nº: 2 o su derivado; o una secuencia attL según la ID SEC Nº: 3 o su derivado, en caso de que la primera secuencia de ADN comprenda una secuencia attR según ID SEC Nº: 4 o su derivado; o una secuencia attR según la ID SEC Nº: 4 o su derivado, en caso de que la primera secuencia de ADN comprenda una secuencia attL según ID SEC Nº: 3 o su derivado; c) la realización de la recombinación específica de secuencia mediante acción de una integrasa Int del bacteriófago Lambda, en donde la expresión ¿derivado¿ designa secuencias attB, attP, attL y attR, que presentan frente a las secuencias de recombinación de origen natural modificaciones en forma de una o varias, pero como máximo seis, sustituciones.
Description
Recombinación de ADN específica de secuencia en
células eucariotas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la recombinación específica de secuencia de ADN
en células eucariotas in vitro, que comprende la introducción
en una célula de una primera secuencia de ADN, como se define en la
reivindicación 1, la introducción en una célula de una segunda
secuencia de ADN, como se define en la reivindicación 1, y la
realización de la recombinación específica de secuencia mediante
acción de una integrasa Int del bacteriófago lambda. Una
forma de realización preferida se refiere a un procedimiento que
comprende además la realización de una segunda recombinación
específica de secuencia de ADN mediante acción de una Int y de un
factor Xis. La presente invención se refiere además a vectores y su
uso como medicamentos.
La manipulación controlada del genoma
eucariótico es un procedimiento de importancia para la
investigación
de(de las) funcione(s) de determinados genes en el organismo vivo. Además de esto juegan un papel en el procedimiento de terapia génica en el campo de la medicina. La preparación de familias animales transgénicas, la modificación de genes o recortes de genes (denominados "genes diana") y la integración dirigida de ADN extraño en el genoma de ecuariotas superiores son de especial importancia a este respecto. Mediante la caracterización y uso de sistemas de recombinación específicos de secuencia se pudieron mejorar estas tecnologías en los últimos tiempos.
de(de las) funcione(s) de determinados genes en el organismo vivo. Además de esto juegan un papel en el procedimiento de terapia génica en el campo de la medicina. La preparación de familias animales transgénicas, la modificación de genes o recortes de genes (denominados "genes diana") y la integración dirigida de ADN extraño en el genoma de ecuariotas superiores son de especial importancia a este respecto. Mediante la caracterización y uso de sistemas de recombinación específicos de secuencia se pudieron mejorar estas tecnologías en los últimos tiempos.
Las recombinasas de ADN específicas de
secuencia, conservantes se distribuyen en dos familias. Los
componentes de la primera, la denominada familia de la
"integrasa" catalizan la separación y reconexión de hebras de
ADN entre dos secuencias de nucleótidos definidas, que se designan
en lo sucesivo como secuencias de recombinación. Estas se pueden
encontrar sobre dos moléculas de ADN distintas o sobre una. Se llega
entonces a la recombinación inter- o intramolecular. En el último
caso el resultado depende de la reacción de la respectiva
disposición de las secuencias de recombinación unas respecto a
otras. Si las secuencias de recombinación se encuentran en
orientación inversa, es decir, opuestas unas respecto a otras, se
llega a la inversión del segmento de ADN que se encuentra entre
ellas. Si las secuencias de recombinación se encuentran como
repeticiones directas, es decir, en paralelo, sobre un sustrato de
ADN, se llega a la deleción. En la recombinación intermolecular, es
decir, cuando las dos secuencias de recombinación están situadas
sobre dos moléculas de ADN distintas, se puede llegar a una fusión
de las dos moléculas de ADN. Mientras que los componentes de la
familia de la integrasa catalizan normalmente tanto la recombinación
intra- como también la intermolecular, las recombinasas de las dos
familias, de las denominadas "invertasas/resolvasas" son
capaces de efectuar sólo la recombinación intramolecular.
Las recombinasas que se usan hasta ahora
principalmente para la manipulación de genoma eucariótico,
pertenecen a la familia de la integrasa. Se tratan de la recombinasa
Cre del bacteriófago P1 y la recombinasa Fip de levaduras;
véase Müller, U. (1999) Mech. Develop., 82, página 3. Las
secuencias de recombinación, que se une a la recombinasa Cre, se
designan como loxP. loxP es una secuencia de
nucleótidos de 34 bp (pares de bases) de longitud, que se compone de
dos secuencias de nucleótidos invertidos de 13 pb de longitud y un
espaciador de 8 bp de longitud que se encuentra entre ellas; véase
Hoess, R. y col. (1985) J. Mol. Biol., 181, página 351. Las
secuencias de unión para Flp, designadas como RFT, se
construyen de forma similar, diferenciándose sin embargo de
loxP; véase Kilby, J. y col. (1993) Trends Genet., 9, página
413. Las secuencias de recombinación no se pueden intercambiar por
tanto unas con otras, es decir, Cre no puede recombinar secuencias
FRT y FLP tampoco secuencias loxP. Ambos sistemas de
recombinación son activos en amplias distancias, es decir, el
segmento de ADN que se va a invertir o delecionar, flanqueado por
dos secuencias loxP o FRT, puede ser de más de 10.000
pares de bases (kb) de longitud.
Con estos dos sistemas se produjo, por ejemplo,
la recombinación específica del tejido en el modelo de ratón,
translocación cromosomal en plantas y animales, y una inducción
controlada de la expresión génica; véase artículo resumen de Müller,
U. (1999) Mech. Develop., 82, página 3. De este modo se
delecionó el gen de ADN polimerasa \beta en determinado tejidos
del ratón; véase Gu, H. y col. (1994) Science, 265, página
103. Un ejemplo más es la activación específica del oncogén del
virus del tumor de ADN SV40 en las pupilas de los ojos del ratón,
que condujo a la formación de tumor exclusivamente en estos tejidos.
La estrategia Cre-loxP se usó también además
en relación con los promotores inducibles. Para ello se reguló, por
ejemplo, la expresión de la recombinasa con un promotor inducible
por interferona, lo que condujo a la deleción de un gen determinado
en el hígado y ni -o sólo mínimamente- en otros tejidos; véase Kühn,
R. y col. (1995) Science, 269, página 1427.
Se han usado hasta ahora dos componentes de la
familia de la invertasa/resolvasa para la manipulación del genoma
eucariótico. Un mutante del gen de la invertasa de bacteriófagos
Mu puede catalizar sin co-factores la
inversión de un fragmento de ADN en protoplastos vegetales. Sin
embargo se comprobó que este mutante es hiperrecombinativo, es
decir, también cataliza otras separaciones de hebras de ADN aparte
de sus secuencias de recombinación naturales. Esto conduce a
resultados de recombinación parcialmente letales, espontáneos en el
genoma de protoplastos vegetales. La recombinasa \beta de
Streptococcus pyogenes cataliza la recombinación entre dos
secuencias de recombinación directamente repetidas en cultivos
celulares de ratón, lo que conduce al recorte del segmento. Sin
embargo se detectó además de la deleción también inversión, con lo
que el uso controlado de este sistema es apto para la manipulación
del genoma eucariótico.
También la manipulación del genoma eucariótico
con la recombinasa Cre o Flp presenta desventajas considerables. En
la deleción, es decir, la recombinación de dos secuencias de
recombinación loxP o FRT presentes repetidamente de
forma directa en un genoma, se llega a la pérdida irreversible del
segmento de ADN que se encuentra entre ellas. Sobre este segmento de
ADN se encuentra un gen, este se va perder en consecuencia para
siempre en la célula y el organismo. Por tanto no es posible la
reproducción del estado original para un nuevo análisis de la
función del gen en estas células, por ejemplo, en un estadio de
desarrollo tardío del organismo. La pérdida definitiva del segmento
de ADN mediante deleción se puede evitar mediante la inversión del
segmento de ADN en cuestión. Con esto se podría desactivar un gen
sin que se llegue a perderse, y ser conectado de nuevo en un
momento posterior en el desarrollo o en el animal adulto mediante
una expresión regulable temporalmente de la recombinasa vía nueva
recombinación. La desventaja en el uso de la recombinasa Cre o Flp
en este procedimiento modificado se basa sin embargo en que la
inversión no se puede regular, ya que las secuencias de
recombinación no se cambian con el proceso de recombinación. Se
llega en consecuencia a procesos de recombinación repetidos, en los
que la inactivación del gen en cuestión es provocada por inversión
del segmento de ADN en cuestión en sólo algunas, máximo del 50%, de
las células diana. Se ha investigado resolver este problema al menos
parcialmente, de modo que se construyeron secuencias loxP
mutadas, que ya no se pueden usar tras recombinación única para
otras reacciones. A este respecto la desventaja se encuentra sin
embargo en la unicidad de la reacción, es decir, tras inactivación
de un gen mediante inversión ya no puede realizarse una activación
subsiguiente mediante nueva recombinación.
Una desventaja más de la recombinasa Fip es su
reducida estabilidad al calor a 37ºC, lo que limita
considerablemente la eficiencia de la reacción de recombinación en
eucariotas superiores, por ejemplo, del ratón con una temperatura
corporal de aproximadamente 39ºC. Aquí se construyeron mutantes Flp
que presentan una estabilidad al calor mayor que la de la
recombinasa de tipo salvaje, sin embargo muestran siempre una
eficiencia de recombinación inferior en comparación con la
recombinasa Cre.
Además en el campo de la medicina se usan
recombinasas específicas de secuencia, por ejemplo, en la terapia
génica, en la que las recombinasas deben integrar de forma estable e
intencionada un segmento de ADN deseado en el genoma de la célula
diana humana respectiva. Tanto la Cre como también la Flp pueden
catalizar la recombinación intermolecular. Ambas recombinasas
recombinan un ADN plásmido, que porta una copia de su secuencia de
recombinación respectiva, con una secuencia de recombinación
correspondiente insertada previamente de forma estable por
recombinación homóloga en el genoma eucariótico. Sin embargo es
deseable que esta reacción se pueda llevar a cabo con una secuencia
de recombinación de origen "natural" en el genoma eucariótico.
Debido a que loxP y FRT 34 ó 54 son nucleótidos
largos, un origen de estas secuencias de recombinación como
componente del genoma es extremadamente poco probable por motivos
estadísticos. Igualmente de la presencia resulta la desventaja de
la reacción de retorno previamente descrita, es decir, tras
integración exitosa tanto la recombinasa Cre como también la
recombinasa Flp pueden recortar de nuevo el segmento de ADN
insertado mediante recombinación intramolecular.
Por tanto un objetivo de la presente invención
consiste en proporcionar un sistema de recombinación simple y
regulable y la sustancia activa necesaria. Además la presente
invención comprende el objetivo de proporcionar un sistema de
recombinación y la sustancia activa necesaria que puede llevar a
cabo una integración estable e intencionada de una secuencia de ADN
seleccionada.
Los objetivos se consiguen mediante el objeto
definido en las reivindicaciones de patente.
El procedimiento de acuerdo con la invención se
aclara mediante las siguientes figuras.
La figura 1 muestra una representación
esquemática de las reacciones de recombinación, integración y
escisión catalizadas por la integrasa Int. Se representa un ADN
plásmido tensado superhelicoidal (parte superior) que porta una
copia de la secuencia de recombinación attP. Esta contiene
cinco denominados puntos de unión al brazo para Int (P1, P2, P1',
P2', P3'), dos puntos de unión de Int al "núcleo" (C y C';
marcados mediante flechas negras), tres puntos de unión para IHF
(H1, H2, H'), dos puntos de unión para Xis (X1, X2) y la denominada
región de "solapamiento" (rectángulo abierto), donde tiene
lugar el intercambio de la hebra de ADN propiamente. La secuencia
pareja para attP, attB, se representa debajo de un
segmento de ADN lineal. Este se compone de dos puntos de unión del
"núcleo" para Int (B y B'; marcados por flechas abiertas) y la
región de "solapamiento". La recombinación entre attB y
attP exige Int e IHF. Esta conduce a la integración del
plásmido en el segmento de ADN que porta attB. Para este fin
se generan dos nuevas secuencias de recombinación híbridas,
attL y attR, que sirven como secuencias diana para la
escisión. Esta reacción necesita junto a Int e IHF otro
co-factor, Xis, que es codificado por fagos
lambda.
La figura 2 A muestra una representación
esquemática de los vectores de expresión de la integrasa y la figura
2 B una representación esquemática de un análisis Western. (A): el
vector pKEXInt contiene el gen de integrasa tipo salvaje, el vector
pKEXInt-h contiene el gen del mutante
Int-h, y el vector pKEXInt-h/218
contiene el gen del mutante Int-h/218. El vector de
control (pKEX) no contiene gen de Int alguno. Los genes respectivos
para la integrasa tipo salvaje (Int) y ambos mutantes
(Int-h e Int-h/218) se representan
como barras verdes. Detrás de las regiones de codificación se
encuentran las secuencias de señal para el procesamiento de ARN,
que deben garantizar una mayor estabilidad intracelular del ARNm
respectivo (rectángulo punteado) y se designan como
SV-40, empalme t-Ag y señales poli
A. La expresión de los genes de la integrasa se realiza mediante el
promotor del citomegalovirus (CMV) humano. (B): tras incorporación
del vector respectivo, como se muestra, en las líneas celulares
reporteras B2 y B3 se prepararon lisados celulares y se separaron
proteínas en una electroforesis en gel de poliacrilamida SDS según
su peso molecular. La presencia de la proteína Int-h
se hizo visible mediante los anticuerpos de ratón policlonales, que
se dirigen contra Int de tipo salvaje (trazos 2 y 4). La posición de
Int en el gel está marcada con una
barra.
barra.
La figura 3 muestra una representación
esquemática de los vectores sustrato. (A):
pGFPattB/attP. Se representa el vector linearizado con
ApaLI. Las barras grandes, negras marcan la posición y orientación
de ambas secuencias de recombinación, attB y attP.
Estas flanquean el gen GFP (proteína verde fluorescente), que está
presente en orientación inversa respecto al promotor del CMV. pA
designa la señal de poliA. Adicionalmente se encuentra sobre el
vector el gen de resistencia "neo", que se expresa con el
promotor de SV40 prematuro y hace posible la selección de líneas
celulares reporteras estables. Se caracterizan igualmente los puntos
de corte de restricción para el enzima Ncol. La recombinación
integrativa entre attB y attP conduce a la inversión
del gen GFP y por tanto a su expresión. Las barras pequeñas,
abiertas y cerradas marcan la posición y orientación del cebador de
la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) individual y se
designan como p1 a p7. (B): pGFattL/attR. El vector
es en la constitución idéntico a pGFPattB/attP, sin
embargo contiene attL y attR en lugar de attB y
attP. El gen GFP se encuentra respecto al promotor del CMV en
orientación 3'-5'. Las cajas sombreadas designan la
posición de la sonda (muestra), que se usó para el análisis
Southern.
La figura 4 A a D muestra en una representación
esquemática la detección de la recombinación integrativa en líneas
celulares reporteras mediante PCR tras separación de las moléculas
de ADN en geles de agarosa (al 1,2% en relación p/v), en cuyo ADN se
hizo visible mediante coloración con bromuro de etidio. (A): PCR de
transcriptasa inversa (RT-PCR). Los vectores pKEX y
pKEXInt-h (véase figura 2A) se incorporaron por
separado en la línea celular reportera respectiva B1 a B3 mediante
electroporación. El análisis por RT-PCR, partiendo
de poli A ARNm aislado, muestra el producto esperado mediante el
par cebador p3/p4 (véase la figura 3) sólo si las células fueron
tratadas con pKEXInt-h (trazos 1, 3 y 5). Para el
control del contenido en ARN se amplificó el gen de
\beta-actina de las mismas preparaciones de ARN.
Trazo M: patrón de longitud de ADN; trazo O: RT-PCR
de control sin molde de ARN: (B, C): análisis de PCR genómico. Se
aisló ADN genómico a partir de las líneas celulares respectivas 72
horas después de la electroporación y se amplificó con pares
cebadores p3/p4 (véase la figura 3) y p1/p2 (véase la figura 3). La
numeración y designación de los trazos corresponde al de la (figura
4 A). (D): ensayo en deleción. Se amplificó ADN genómico aislado con
el par cebador p5/p6 (véase la figura 3). La posición del producto
de PCR esperado (420 bp) mediante delación, en lugar de inversión,
está marcada con una barra. La numeración y designación de los
trazos es como en la figura 4 A.
La figura 5 A y B muestra en una representación
esquemática la detección de la inversión en líneas celulares
reporteras mediante PCT e hibridación Southern tras separación de la
moléculas de ADN en geles de agarosa (1,2% en relación p/v). (A):
análisis por PCR. Se amplificó una fracción de ADN genómico que se
aisló a partir de líneas celulares B1, B2, B3 y NL60 tratadas con
los vectores pKEX y pKEXInt-h, con pares cebadores
p2/p4 y p4/p7 (véase la figura 3). Los productos de PCR a los que
se llegó con la inversión catalizada con integrasa del gen GFP, se
observan en los trazos 1, 3 y 5. Trazo M: patrón de longitud de ADN;
trazo O: PCR de control sin ADN genómico. (B) Análisis Southern: la
fracción restante del ADN analizado en la figura 5 A se incubó con
el enzima de restricción NcoI, se separó mediante una electroforesis
en gel de agarosa según peso molecular y a continuación se
transfirió a una membrana de nitrocelulosa. Para la detección de la
recombinación se hicieron visibles fragmentos de ADN que portan GFP
mediante una sonda marcada radiactivamente (véase la figura 3 B).
Trazo 9: pGFPattB/attP no recombinado; trazo 10:
pGFPattB/attP recombinado.
La figura 6 A muestra una representación de
secuencias de ácido nucleico que comprenden attB o
attH. La figura 6 B muestra una representación de secuencias
parciales de attP y attP*. (A): comparación de
secuencia entre attB y attH. Los puntos de unión del
"núcleo" de Int B y B' en attB están marcados con una
línea sobre las secuencias. Los puntos de unión del "núcleo"
de Int H y H' en attH están marcados con una línea
discontinua sobre las secuencias. Las secuencias de
"solapamiento" se marcan con rectángulos huecos. Las
diferencias de secuencia se marcan con líneas dobles verticales. La
numeración de los restos en las regiones núcleo y de solapamiento
se refiere al centro del solapamiento definido por Landy y Ross
((1977), Science, 197, página 1147), que se designa con O.
AttB o attH es la secuencia de -9 a +11. (B):
comparación se secuencia entre secuencias parciales de attP y
attP*, que corresponden a las secuencias attB o
attH. Las designaciones se seleccionan como en la figura 6
A.
La figura 7 muestra en una representación
esquemática la detección de la recombinación entre attH y
attP* sobre el vector pACH en E. coli tras separación
en una electroforesis en gel de agarosa. El vector sustrato pACH se
co-transformó junto con los vectores de expresión
procarióticos respectivos para Int, Int-h o
Int-h/218 en cepa de E. coli CSH26 o CSH26
delta IHF. El ADN plásmido se aisló 36 horas después de la
selección, se incubó con los enzimas de restricción HindIII y AvaI,
se separó con electroforesis en gel de agarosa y se hizo visible. La
posición de los fragmentos de restricción que se generan mediante
inversión se indica con "invers". La posición del ADN no
recombinante se marca con pACH. Los trazos 1 y 12: patrones de
longitud de ADN; trazos 2 y 3: vector de expresión o pACH-
ADN no recombinado; trazos 4 a 7: ADN aislado de CSH26; trazos 8 a 11: ADN aislado de CSH26 delta IHF.
ADN no recombinado; trazos 4 a 7: ADN aislado de CSH26; trazos 8 a 11: ADN aislado de CSH26 delta IHF.
La figura 8 muestra una representación
esquemática de la estrategia para la integración del vector pEL13 en
el locus attH genómico y el principio del procedimiento de
detección. El vector de integración pEL13 porta un gen de
resistencia (barra caracterizada con "higr"), el gen para
Int-h (barra caracterizada con "int h") con el
control del promotor del CMV y una copia de attP* (rectángulo
hueco caracterizado con "att P*/P*OP'"). Tras incorporación
del vector en células BL60 mediante electroporación se expresa
Int-h (véase la figura 2 B). La recombinasa
cataliza entonces la recombinación intermolecular entre attP*
y attH localizado en cromosoma (rectángulo puntiagudo caracterizado
con "att H/HOH'"). Esto conduce a la integración del vector
pEL13 en el genoma de las células BL60. Las células que han captado
el vector de forma estable, pueden seleccionarse e identificarse
mediante PCR con el par cebador attX1/B2 (barras
caracterizadas con "attX1" y "B2"). EcoR V y SpH I
designan puntos de corte de restricción para los enzimas de
restricción correspondientes.
La figura 9 muestra en una representación
esquemática la detección de la recombinación intermolecular entre
attP* (pLE13) y attH en células BL60. Se aisló el ADN
genómico tras electroporación de pEL13 y a continuación selección
durante varias semanas de 31 poblaciones celulares distintas y se
amplificó con par cebador attX1/B2 (véase la figura 8). Se separaron
los productos de PCR mediante electroforesis en gel de azarosa y se
hicieron visibles. La posición del producto esperado (295 bp) en
los geles se marca con la barra. Los productos se analizaron a
continuación mediante secuenciación de ADN. En el borde derecho de
los geles se encuentra un patrón de longitud.
La expresión "transformación" o
"transformar" usada en esta invención designa introducción
respectiva de una secuencia de ácido nucleico en una célula. La
introducción puede ser, por ejemplo, una transfección o lipofección,
o se puede llevar a cabo mediante el procedimiento del calcio,
procedimiento de electrochoque o una inyección de oocitos. La
expresión "transformación" o "transformar" significa en
esta invención también la introducción de una secuencia de ácido
nucleico viral, que comprende por ejemplo la(s)
secuencia(s) de recombinación y un gen o fragmento de gen
terapéutico, en la trayectoria seguida de forma natural por el
correspondiente virus. A este respecto la secuencia de ácido
nucleico viral no debe presentarse como secuencia de ácido nucleico
desnudo sino que puede estar empaquetado en una envoltura de
proteína viral. La expresión no designa por tanto sólo el
procedimiento que se entiende normalmente con el término
transformación o transformar.
La expresión usada en esta invención
"derivado" designa secuencias de attB y attP y
secuencias de attL y attR, que presentan frente a las
secuencias de recombinación de origen natural modificaciones en
forma de una o varias, como máximo seis, especialmente dos, tres,
cuatro o cinco sustituciones.
La expresión usada en esta invención
"homólogo" u "homología" o "similar" en referencia a
las secuencias de recombinación designa una secuencia de ácido
nucleico que es idéntica a las secuencias de recombinación de
origen natural en aproximadamente el 70%, preferiblemente
aproximadamente el 80%, con especial preferencia en aproximadamente
el 85%, con más especial preferencia aproximadamente el 90%, con más
especial preferencia aproximadamente el 95% y con especial
preferencia el 99%.
La expresión usada en esta invención
"vector" designa construcciones de origen natural o sintético
para la captación, multiplicación, expresión o transmisión de ácidos
nucleicos, por ejemplo, plásmidos, fagémidos, cósmidos, cromosomas
sintéticos, bacteriófagos, virus o retrovirus.
La integrasa (designada normalmente y en lo
sucesivo "Int") de los bacteriófagos Lambda pertenece,
como Cre y Flp, a la familia de integrasa de las recombinasas de ADN
específicas de secuencia conservativas. Int cataliza la
recombinación integrativa entre dos secuencias de recombinación
distintas, attB y attP. AttB comprende 21
nucleótidos y se han aislado originalmente del genoma de E.
coli; véase Mizuuchi, M. y Mizuuchi, K. (1980) Proc. Natl. Acad.
Sci. Estados Unidos, 77, página 3220. Por el contrario
attP es con 243 nucleótidos considerablemente más larga y se
origina de forma natural en el genoma del bacteriófago Lambda; véase
Landy, A. y Ross, W. (1977) Science, 197, página 1147. La
recombinasa Int tiene en total siete puntos de unión en attP
y dos en attB. La función biológica de Int es la integración
específica de secuencia del genoma de fagos circular en el locus
attB del cromosoma de E. coli. Para la recombinación
integrativa Int necesita un cofactor de proteína, el denominado
"factor de integración del huésped" (normalmente y en lo
sucesivo designado "IHF"), véase Kikuchi, Y. y Nash, H. (1978)
J. Biol. Chem., 253, 7149. IHF se necesita para la
constitución de un complejo de recombinación funcional con
attP. Un segundo cofactor para la reacción de integración es
el superenrollamiento de ADN negativo de attP. La
recombinación entre attB y attP conduce finalmente a
la formación de dos nuevas secuencias de recombinación, attL
y attR, que sirven como sustrato y secuencia de
reconocimiento para una reacción de recombinación adicional, la
reacción de escisión. Se encuentra un amplio resumen de la
integración de bacteriófagos Lambda en, por ejemplo, Landy,
A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, página 913.
La recombinación por escisión (escisión) del
genoma de fagos a partir del genoma de bacterias es catalizado
igualmente por la recombinasa Int. Para este fin se necesita
incondicionalmente además de Int y IHF un cofactor adicional, que
es codificado igualmente por bacteriófagos Lambda. Se trata
de la escisionasa (normalmente y en lo sucesivo designada
"Xis"), que presenta dos puntos de unión en attR; véase
Gottesman, M. y Weisberg, R. (1971). The Bacteriophage Lambda, Cold
Spring Harbor Laboratory, página 113. Para la recombinación por
escisión no se requiere al contrario que para la recombinación
integrativa superenrollamiento de ADN negativo de las secuencias de
recombinación, aumentando sin embargo la eficiencia de la reacción
de recombinación. Se puede conseguir una mejora adicional de la
eficiencia de la reacción de escisión mediante un segundo
co-factor, FIS (factor de estimulación de
inversión), que puede actuar en relación con Xis; véase Landy, A.
(1989) Annu. Rev. Biochem., 58, página 913. La escisión es
genéticamente la reacción inversa exacta de la integración, es
decir, se generan de nuevo attB y attP. Se encuentra
un amplio resumen de la escisión de bacteriófagos Lambda, por
ejemplo, en Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, página
913.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un procedimiento para la recombinación específica de secuencia de
ADN en células eucariotas, que comprende a) la introducción en una
célula de una primera secuencia de ADN, como se define en la
reivindicación 1, b) la introducción en una célula de una segunda
secuencia de ADN, como se define en la reivindicación 1, y c) la
realización de la recombinación específica de secuencia mediante
acción de una integrasa Int de bacteriófagos Lambda. Se
prefiere un procedimiento en el que la primera secuencia de ADN
comprende una secuencia attB según ID SEC Nº: 1 o su
derivado, y la segunda secuencia de ADN comprende una secuencia
attP según ID SEC Nº: 2 o su derivado. Se prefiere además un
procedimiento en el que la primera secuencia de ADN comprenda una
secuencia attL según ID SEC Nº: 3 o su derivado, y la segunda
secuencia de ADN comprenda una secuencia attR según ID SEC
Nº: 4 o su derivado, en donde en la etapa c) se realiza la
recombinación específica de secuencia mediante acción de una Int y
de un factor XIS.
El procedimiento de acuerdo con la invención no
se puede llevar a cabo a este respecto sólo con la secuencia
attB y/o attP o secuencia attL y/o attR
de origen natural sino también con secuencias attB y/o
attP o secuencias attL y/o attR modificadas,
por ejemplo, sustituidas. De este modo se observó, por ejemplo,
recombinación integrativa del bacteriófago Lambda y E.
coli entre secuencias homólogas attP y attB
(mutantes de las secuencias de tipo salvaje), que presentan una o
una combinación de las siguientes sustituciones en las siguientes
posiciones en attB: G, T (en posición 9); A, C, G (-8); C, A,
T (-7); T, G, A (-6); C, A (-5); A (-4); G, A (-3); A, C, G (-2); A,
C, G (-1); A, C, G (0); T, C, G (+1); A, C, G (+2); T, G, C (+3); A,
G, T (+4); A, C, G (+5); G, T, (+6); G, T (+7); G, T, A (+8); C, G,
A (+9); C, G, A (+10); T, A, C (+11) (Nash, H. (1981) Annu. Rev.
Genet. 15, página 143; Nussinov, R. y Weisberg, R. (1986) J.
Biomol. Struct. Dynamics, 3, página 1134) y/o presentan en
attP: T (en posición +1); C (+2) y A (+4), véase Nash, H.
(1981) Annu. Rev. Genet., 15, página 143.
La presente invención se refiere por tanto a un
procedimiento en el que la secuencia attB usada frente a la
secuencia attB de origen natural según ID SEC Nº: 1 y la
secuencia attP usada frente a la secuencia attP de
origen natural según ID SEC Nº: 2 presentan una o varias
sustituciones. Además la presente invención se refiere a un
procedimiento en el que la secuencia attL usada frente a la
secuencia attL de origen natural según ID SEC Nº: 3 y la
secuencia attR usada frente a la secuencia attR de
origen natural según ID SEC Nº: 3 presentan una o varias
sustituciones. Se prefiere un procedimiento en donde las secuencias
de recombinación presentan una, dos, tres, cuatro o cinco
sustituciones. Las sustituciones pueden provenir tanto de la región
de solapamiento (véase la figura 6 A, rectángulo hueco) como también
de la región núcleo (véase la figura 6 A, línea). La región de
solapamiento completa, que comprende siete nucleótidos, también
puede ser sustituida. Se prefiere especialmente un procedimiento en
el que en la secuencia attB y attP se introducen
sustituciones bien en la región núcleo o bien en la región de
solapamiento. Se prefiere la introducción de una sustitución en la
región de solapamiento y la incorporación simultánea de una o dos
sustituciones en la región núcleo.
Para el procedimiento de acuerdo con la
invención no se requiere que en una sustitución en attB la
sustitución correspondiente en attP, o en una sustitución en
attL, se introduzca o invierta la sustitución correspondiente
en attR. Se ha de seleccionar una modificación mediante
sustitución en secuencias de recombinación, de modo tal que la
recombinación se lleve a cabo a pesar de la (las)
modificación(es). Ejemplos de tales sustituciones se indican,
por ejemplo, en las publicaciones de Nash, H. (1981), véase
anteriormente y Nussinov, R. y Weisberg, R. (1986), véase
anteriormente y no se considerar como exhaustivas. Se pueden
introducir otras modificaciones fácilmente, por ejemplo, mediante
procedimientos de mutagénesis y se pueden probar en cuanto a su uso
mediante recombinaciones de prueba.
La presente invención se refiere por tanto a un
procedimiento, en el que la secuencia attB usada frente a la
secuencia attB de origen natural según ID SEC Nº: 1 y la
secuencia attP usada frente a la secuencia attP de
origen natural según ID SEC Nº: 2; o bien la secuencia attL
usada frente a la secuencia attL de origen natural según ID
SEC Nº: 3 o la secuencia attR usada frente a la secuencia
attR de origen natural según ID SEC Nº: 4 presentan una o
varias sustituciones. Por tanto, una o varias sustituciones en una
de las secuencias de recombinación no debe dar como resultado la
sustitución correspondiente en la otra secuencia de
recombinación.
En una forma de realización preferida del
procedimiento de acuerdo con la invención la secuencia attB
comprende 21 nucleótidos y coincide con la secuencia aislada del
genoma de E. coli original (Mizuuchi, M. y Mizuuchi, K.
(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 77, página
3220) y la secuencia attP comprende 243 nucleótidos y
coincide con la secuencia aislada originalmente del genoma del
bacteriófago Lambda; véase Landy, A. y Ross, W. (1977)
Science, 197, página 1147.
En una forma de realización preferida adicional
del procedimiento de acuerdo con la invención la secuencia
attL comprende 102 nucleótidos y la secuencia attR 162
nucleótidos y coinciden ambas con las secuencias originalmente
aisladas del genoma de E. coli; véase Landy, A. (1989) Annu.
Rev. Biochem., 58, página 913.
Para la realización del procedimiento de acuerdo
con la invención la primera secuencia de ADN comprende además de la
secuencia de recombinación otras secuencias de ADN, que permiten una
integración en un lugar diana deseado en el genoma de la célula
eucariótica. Esta integración discurre por la recombinación
homóloga, que es mediada por mecanismos de recombinación internos
de la célula. Para ello las otras secuencias de ADN deben ser
homólogas con el ADN del lugar diana y tanto 3' como también 5' se
deben encontrar en la secuencia attB o attL. Es
conocido por el especialista en la técnica que el grado de homología
y la longitud de las secuencias 3' y 5' respectivas deben ser tales
que la recombinación homóloga discurra con probabilidad suficiente;
véase artículo resumen de Capecchi, M. (1989), Science, 244,
página 1288.
También la segunda secuencia de ADN con la
secuencia de recombinación attP o attR puede
comprender secuencias de ADN, que son requeridas para una
integración en un lugar diana deseado por medio de recombinación
homóloga. Para el procedimiento de acuerdo con la invención tanto
la primera como la segunda secuencia de ADN pueden comprender las
otras secuencias de ADN. Se prefiere un procedimiento en el que
ambas secuencias de ADN comprenden las otras secuencias de ADN.
La introducción de la primera y segunda
secuencia de ADN con o sin otras secuencias ADN se puede llevar a
cabo tanto de forma sucesiva como también en una
co-transformación, en donde las secuencias de ADN se
presentan sobre dos moléculas de ADN distintas. Se prefiere un
procedimiento en el que la primera y la segunda secuencia de ADN,
con o sin otras secuencias de ADN, estén presentes sobre una
molécula de ADN individual y se introduzcan en las células
eucariotas. Además se pueden introducir la primera secuencia de ADN
en una célula y la segunda secuencia de ADN en otra célula,
fusionándose las células a continuación. Con fusionado se debe
entender en el sentido amplio el cruce de organismos y la fusión
celular.
El procedimiento de acuerdo con la invención se
puede usar, por ejemplo, para invertir en una recombinación
intramolecular el segmento de ADN que se encuentra entre las
secuencias de recombinación orientadas indirectamente. Además el
procedimiento de acuerdo con la invención se puede usar para
delecionar en una recombinación intramolecular el segmento de ADN
que se encuentra entre las secuencias de recombinación orientadas
directamente. Las secuencias de recombinación se presentan
orientadas directamente cuando las secuencias están construidas
respectivamente en dirección 5'-3' ó
3'-5'. Las secuencias de recombinación se encuentran
orientadas de forma indirecta, cuando por ejemplo la secuencia
attB está constituida en dirección 5'-3' y la
secuencia attP en dirección 3'-5'. Si las
secuencias de recombinación se disponen mediante recombinación
homóloga respectivamente en una secuencia intrón 5' y 3' de un exón
y la recombinación se lleva a cabo mediante la acción de la
integrasa, entonces el exón gira en las secuencias de recombinación
orientadas indirectamente (invierte) o deleciona en las secuencias
de recombinación orientadas directamente. Con esto el polipéptido
codificado por el gen correspondiente puede perder su actividad o
función o detener la trascripción mediante la inversión o deleción,
de modo que no se genera transcripto alguno (completo). De esta
forma se puede estudiar, por ejemplo, la función biológica del
polipéptido
codificado.
codificado.
La primera y/o segunda secuencia de ADN
puede/pueden comprender sin embargo otras secuencias de ácido
nucleico, que codifican uno o varios polipéptido(s) de
interés. De este modo, por ejemplo, con las secuencias de
recombinación se puede introducir una proteína de estructura, un
enzima o una proteína regulatoria en el genoma, que se expresa
transitoriamente tras recombinación intramolecular consiguiente. El
polipéptido introducido puede ser endógeno o exógeno. Se puede
introducir además una proteína marcadora. El especialista en la
técnica es conocedor de que esta enumeración de aplicaciones del
procedimiento de acuerdo con la invención es sólo a título de
ejemplo y no es exhaustivo. Ejemplos de aplicaciones de acuerdo con
la invención que se llevaron a cabo con las recombinasas Cre y Flp
usadas hasta ahora se encuentran, por ejemplo, en el artículo
resumen de Kilby, N. y col., (1993), Trenes Genet., 9, página
413.
El procedimiento de acuerdo con la invención se
puede usar además para delecionar o para invertir sobre vectores
segmentos de ADN sobre sustratos episomales en la recombinación
intramolecular. Se podría usar una reacción de deleción, por
ejemplo, para separar secuencias de empaquetamiento de los
denominados virus de la levadura. Este procedimiento tiene un amplio
campo de aplicación en la producción industrial de vectores virales
para usos de terapia génica; véase Hardy, S. y col., (1997), J.
Virol., 71, página 1842.
La recombinación intermolecular conduce a la
fusión de dos moléculas de ADN, que poseen respectivamente una copia
de attB y attP o attL y attR. De este
modo se puede introducir, por ejemplo, attB en primer lugar mediante
recombinación homóloga en un locus genómico bien caracterizado,
conocido de una célula. En esta secuencia attB genómica se
puede integrar a continuación un vector que porta attP
mediante recombinación intermolecular. Se prefiere en este
procedimiento la expresión del mutante de integrasa
Int-h/218, cuyo gen se encuentra sobre un segundo
vector de ADN que se co-transfecta. Sobre el vector
que porta attP se pueden encontrar otras secuencias, por
ejemplo, un gen para una proteína marcadora determinada, flanqueada
por secuencias loxP-IFRT. Con esta
preparación se puede conseguir, por ejemplo, que en los análisis de
expresión de comparación de distintos genes en un tipo de célula
estos se vean influenciados positiva o negativamente por los lugares
de integración genómicos respectivos.
Para la realización del procedimiento de acuerdo
con la invención debe actuar una integrasa sobre las secuencias de
recombinación. A este respecto puede estar presente la integrasa o
el gen de integrasa y/o el factor Xis o el gen del factor Xis ya
antes de la introducción de la primera y segunda secuencia de ADN en
la célula eucariótica, entre la introducción de la primera y segunda
secuencia de ADN o tras incorporación de la primera y segunda
secuencia de ADN. La integrasa usada para la recombinación
específica de secuencia se expresa preferiblemente en la célula, en
las que se lleva a cabo la reacción. Para ello se introduce en las
células una tercera secuencia de ADN, que comprende un gen de
integrasa. Si se lleva a cabo la recombinación específica de
secuencia con attL/attR, se puede introducir
adicionalmente un gen de factor Xis (cuarta secuencia de ADN) en las
células. Se prefiere especialmente un procedimiento en el que la
tercera y/o cuarta secuencia de ADN se integre en el genoma
eucariótico de la célula por recombinación homóloga o de forma
aleatoria. Además se prefiere un procedimiento en el que la tercera
y/o cuarta secuencia de ADN comprenda secuencias de ADN regulatorias
que provoquen una expresión espacial y/o temporal del gen de la
integrasa y/o del gen del factor Xis.
Expresión espacial significa en este caso que la
recombinasa o el factor Xis sólo se expresa en un determinado tipo
de célula, por ejemplo, células del hígado, células del riñón,
células de los nervios o células del sistema inmunológico, mediante
el uso de promotores específicos del tipo celular y sólo cataliza la
recombinación en estas células. Se puede producir una expresión
temporal en la regulación de la expresión de la integrasa/factor
Xis mediante promotores, que son activos a partir de o en un estadio
de desarrollo determinado o en un momento determinado son activos en
el organismo adulto. Además se puede producir la expresión temporal
mediante el uso de promotores que se puedan inducir, por ejemplo,
mediante promotores dependientes de la interferona o tetraciclina;
véase artículo resumen de Müller, U. (1999) Mech. Develop.,
82, página 3.
La integrasa usada en el procedimiento de
acuerdo con la invención puede ser tanto la integrasa de tipo
salvaje como también una integrasa modificada del bacteriófago
Lambda. Debido a que la integrasa de tipo salvaje puede
llevar a cabo la reacción de recombinación sólo con ayuda de un
co-factor, a saber IHF, se prefiere el uso de una
integrasa modificada para el procedimiento de acuerdo con la
invención. Si se usa la integrasa de tipo salvaje para el
procedimiento de acuerdo con la invención, se necesita
adicionalmente para la reacción de recombinación IHF. La integrasa
modificada es modifica de forma que se puede llevar a cabo la
reacción de recombinación sin IHF. La preparación de polipéptidos
modificados y la selección en cuanto a la actividad deseada son
estado de la técnica y se realizarán de forma sencilla; véase
Erlich, H. (1989) PCR Technology. Stockton Press. Son integrasas de
bacteriófagos Lambda preferidas dos mutantes Int, que se
designan como Int-h e Int-h/218;
véase Miller y col. (1980) Cell, 20 páginas 721; Christ, N. y Dröge,
P (1999) J. Mol. Biol., 288, página 825.
Int-h contiene un resto de lisina en lugar del resto
del glutamato en la posición 174 frente a Int de tipo salvaje.
Int-h/218 contiene un resto de lisina adicional en
lugar de un resto de glutamato en la posición 218 y se preparó
mediante mutagénesis de PCR del gen Int-h. Estos
mutantes pueden catalizar tanto la recombinación tanto entre
attB/attP como también entre attL/attR
sin los cofactores IHF, Xis y de superenrollamiento negativo en
E. coli e in vitro, es decir, con sustratos
purificados en el vidrio reactivo. En células eucariotas los
mutantes necesitan para la recombinación entre
attL/attR sólo el cofactor Xis. Se puede producir una
mejora adicional de la eficiencia de la recombinación entre
attL/attR mediante un co-factor
adicional, por ejemplo FIS. El mutante Int-h/218 es
preferido ya que puede catalizar la reacción integrativa
independiente del cofactor con mayor eficiencia; véase Christ, N. y
Dröge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, página 825.
El procedimiento de acuerdo con la invención se
puede llevar a cabo en todas las células eucariotas. Las células
pueden presentarse, por ejemplo, en un cultivo celular y comprenden
todos los tipos de células vegetales o animales. Por ejemplo, las
células pueden ser oocitos no humanos, células madre embrionarias no
humanas, células madre hematopoyéticas o cualquier tipo de células
diferenciadas. Se prefiere un procedimiento en el que la célula
eucariótica sea una célula de mamífero. Se prefiere especialmente un
procedimiento en el que la célula de mamífero sea una célula humana
con excepción de células embrionarias, célula de mono, ratón, rata,
conejo, hámster, cabra, vaca, oveja o cerdo.
Una forma de realización preferida de la
presente invención se refiere además a un procedimiento en el que
dado el caso se lleva a cabo una segunda recombinación específica de
secuencia de ADN mediante acción de una integrasa de bacteriófagos
Lambda y de un factor Xis. La segunda recombinación necesita
las secuencias attL y attR generadas mediante una
primera recombinación de attB y attP o sus derivados.
Por tanto, la segunda recombinación específica de secuencia está
limitada por un procedimiento que en la primera recombinación
específica de secuencia usa secuencias attB y attP o
sus derivados. Tanto la integrasa de tipo salvaje como también los
mutantes de Int pueden catalizar sin adición de otros cofactores
sólo la denominada recombinación integrativa, es decir, estas
recombinan attB con attP y no attL con
attR, si estas se integran de forma estable en el genoma de
las células. La integrasa de tipo salvaje necesita a este respecto
para la denominada recombinación por escisión los factores IHF, Xis
y de superenrollamiento negativo. Los mutantes de Int
Int-h e Int-h/218 necesitan para la
recombinación por escisión sólo el factor Xis. Por tanto es posible
dejar transcurrir de forma controlada dos reacciones de
recombinación una tras otra, si están presentes en las células otros
factores para la segunda reacción de recombinación, a saber la
reacción de escisión. En sintonía con otros sistemas de
recombinación ya usados, se pueden determinar aquí nuevas
estrategias para la manipulación controlada de genomas eucarióticos
superiores. Esto es posible ya que distintos sistemas de
recombinación usan exclusivamente sus propias secuencias de
recombinación.
De este modo, por ejemplo, el sistema Int se usa
para integrar secuencias loxP y/o FRT de forma
intencionada en un locus genómico de un genoma eucariota y a
continuación para activar o inactivar un gen mediante expresión
controlada de Cre y/o Flp. Se puede usar además el sistema Int para
separar secuencias loxP-/FRT tras uso, es decir,
recombinación mediante la recombinasa correspondiente a partir de un
genoma.
Se prefiere un procedimiento en el que además se
introduzca una secuencia de ADN adicional, que comprende un gen de
factor Xis, en las células. Se prefiere especialmente un
procedimiento en el que la otra secuencia de ADN comprenda además
una secuencia de ADN regulatoria, que provoque una expresión
espacial y/o temporal del gen del factor Xis.
De este modo, por ejemplo, conseguida la
recombinación integrativa, intramolecular (inversión) mediante Int,
lo que ha llevado a la activación/inactivación de un gen en un tipo
de célula determinado, este gen se inactiva o activa de nuevo en un
momento posterior mediante la expresión espacial y/o temporal
inducible de Xis en expresión simultánea de Int.
La invención se refiere además al uso de una
secuencia attB según la ID SEC Nº: 1 o su derivado y a una
secuencia attP según ID SEC Nº: 2 o su derivado, o a una
secuencia attL según ID SEC Nº: 3 o su derivado y a una
secuencia attR según ID SEC Nº: 4 o su derivado, en una
recombinación específica de secuencia de ADN en células eucariotas.
Las células eucariotas pueden presentarse también en la conexión
celular de un organismo no humano, por ejemplo, de un mamífero, que
no contiene integrasa o factor Xis alguno en sus células. Este
organismo no humano se puede usar para el cruce con otros
organismos, que contienen por su parte la integrasa o el factor Xis
en sus células, de modo que generan descendencia, en cuyas células
se lleva a cabo entonces la recombinación específica de secuencia.
Por tanto la invención se refiere asimismo al uso de una integrasa o
un gen de integrasa y un factor Xis o un gen del factor Xis en una
recombinación específica de secuencia en células eucariotas.
Se ha determinado una secuencia del genoma
humano (en lo sucesivo designada como attH), que presenta una
homología de aproximadamente el 85% con attB. AttH se
puede usar como secuencia de recombinación para la integración de un
ADN extraño en el genoma humano. Para ello se puede modificar la
segunda secuencia de recombinación attP correspondientemente,
con esto la integrasa puede realizar la reacción de recombinación
con mayor eficiencia. Se podría mostrar que attH con una de
nuestras versiones modificadas de attP, que se designa en lo
sucesivo como attP* y se enumera como ID SEC Nº: 5, se puede
recombinar mediante Int-h en E. coli.
Experimentos con células humanas mostraron que attH se
recombina también como constituyente del genoma humano con
attP*, cuando se sintetiza Int-H transitorio
por parte de las células.
De esto resulta la posibilidad de integrar un
ADN extraño circular, que contiene una secuencia de recombinación
attP, de forma estable e intencionada en el locus de origen
natural attH del genoma humano. A este respecto attH
es sólo un ejemplo de una secuencia de recombinación de origen
natural en el genoma humano. En el marco del proyecto Genoma Humano
se pueden determinar otras secuencias que presentan una homología
con attB. Estas se pueden usar asimismo para la integración
de un ADN extraño en el genoma humano. En función de la secuencia
homóloga con attB presente en el genoma humano, se selecciona
una secuencia de recombinación attP correspondiente en el ADN
extraño circular. Se prefiere un ADN extraño circular que contiene
la secuencia de ácido nucleico de la secuencia attP de origen
natural. Se prefiere especialmente un derivado de la secuencia
attP de origen natural, que presenta como máximo seis,
preferiblemente de una a cinco, especialmente tres sustituciones.
Se prefiere especialmente un ADN extraño circular, que comprende la
secuencia de ácido nucleico attP* según ID SEC Nº: 5, que
presenta una homología de aproximadamente el 95% con
attP.
A este respecto la integrasa se puede alimentar
a las células bien como polipéptido o mediante un vector de
expresión. El gen de la integrasa se puede presentar además como
secuencia de ácido nucleico expresable sobre la molécula de ADN, que
comprende la secuencia attP modificada o la natural o la
secuencia attP*.
El ADN extraño circular, que contiene la
secuencia attP natural o su derivado u homólogo,
especialmente la secuencia attP* según ID SEC Nº: 5,
comprende igualmente el gen o fragmento de gen terapéutico que se
introduce en el genoma. Los genes terapéuticos pueden ser, por
ejemplo, el gen CFTR, el gen ADA, el gen del receptor de LDL, gen
de la \beta-globina, gen del factor VIII o gen del
factor IX, gen de
alfa-1-antitripsina o el gen de
distrofina. El ADN extraño circular puede ser, por ejemplo, un
vector viral usado ya en terapias génicas somáticas. El vector
puede ser igualmente específico de la célula, de modo que sólo
transfecta las células deseadas para la terapia génica, por ejemplo,
las células del epitelio del pulmón, las células madre de la médula
ósea, los linfocitos T, los linfocitos B, las células hepáticas, las
células renales, las células nerviosas, las células del músculo
esquelético, las células madre hematopoiéticas o los fibroblastos.
Se hace evidente al especialista en la técnica que este listado
sólo representa una selección de los genes terapéuticos y células
diana y se pueden usar igualmente otros genes y células diana para
una terapia génica. Fragmentos de gen comprenden, por ejemplo,
deleciones de genes terapéuticos, exones individuales, secuencias de
ácido nucleico antisentido o ribozimas. Fragmentos de gen pueden
comprender además recortes de un gen, que contienen las repeticiones
de trinucleótidos de un gen, por ejemplo, del gen X frágil.
En la aplicación de la integrasa de tipo salvaje
debe estar presente IHF para la recombinación. Se prefiere el uso de
una integrasa modificada, en la que la recombinación se puede
realizar sin IHF. Se prefiere especialmente el uso de
Int-h o Int-h/218.
La presente invención se refiere por tanto a la
secuencia attP de origen natural o su derivado o su homólogo.
La invención se refiere especialmente a la secuencia de ácido
nucleico attP* modificada según la ID SEC Nº: 5. La presente
invención se refiere además a un vector, que comprende la secuencia
attP de origen natural o su derivado, especialmente la
secuencia de ácido nucleico attP* según ID SEC Nº: 5, y una
secuencia de ácido nucleico adicional, que comprende un gen
terapéutico o su fragmento de gen. Se prefiere un vector en el que
el gen terapéutico comprende un gen CFTR, ADA, receptor de LDL, alfa
o beta globina, alfa 1-antitripsina, factor VIII o
factor IX o su fragmento. El vector puede comprender asimismo
elementos de ADN regulatorios que controlan la expresión del gen
terapéutico o su fragmento de gen.
La presente invención se refiere además al uso
del vector como medicamento en la medicina humana o veterinaria.
Además la invención se refiere al uso del vector para la preparación
de un medicamento para la terapia génica
somática.
somática.
Los vectores de acuerdo con la invención se
pueden aplicar, por ejemplo, mediante inyecciones intravenosas o
intramusculares. Los vectores se pueden tomar asimismo mediante
aerosoles. Otras formas de aplicación son conocidas por el
especialista en la técnica.
Los vectores de expresión eucarióticos para Int
de tipo salvaje (pKEXInt), Int-h
(pKEXInt-h), Int-h/218
(pKEXInt-h/218) y pEL13 son derivados de
pKEX-2-X (Rittner y col. (1991)
Methods Mol. Cell. Biol., 2, página 176). El vector contiene
el elemento promotor/potenciador del citomegalovirus humano (CMV) y
empalme de ARN y secuencias de señal de poliadenilación del
antígeno tumoral del virus 40 de simios pequeños (SV40). Los genes
Int se clonaron mediante PCR con los siguientes cebadores: (3343)
5'-GCTCTAGACCACCATGGGAAGAAGGCGAAGT
CA-3', que se encuentra en el extremo 5' del gen Int y (3289) 5'-AAGGAAAGCGGCCGCTCATTATTTGATTT
CAATTTTGTCC-3', que se encuentra en el extremo 3'. La amplificación tuvo lugar tras una primera etapa de desnaturalización a 95ºC (4 minutos) con 30 ciclos de desnaturalización (95ºC, 45 segundos), formación de cebador (55ºC, 45 segundos), síntesis de ADN (27ºC, 2 minutos) y una última etapa de síntesis durante 4 minutos a 72ºC. El fragmento de PCR resultante se usó en el vector pKEX-2-XR con XbaI y NotI. Int-h se generó del vector pHN16 como molde (Lange-Gustafson, B. y Nash, H. (1989) J. Biol. Chem., 259, página 12724). Int de tipo salvaje e Int-h/218 se generaron con pTrcInt o pTrcInt-h/218 como moldes (Christ, N. y Dröge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, página 825). pEL13 contiene junto al gen Int-h adicionalmente una copia de attP*.
CA-3', que se encuentra en el extremo 5' del gen Int y (3289) 5'-AAGGAAAGCGGCCGCTCATTATTTGATTT
CAATTTTGTCC-3', que se encuentra en el extremo 3'. La amplificación tuvo lugar tras una primera etapa de desnaturalización a 95ºC (4 minutos) con 30 ciclos de desnaturalización (95ºC, 45 segundos), formación de cebador (55ºC, 45 segundos), síntesis de ADN (27ºC, 2 minutos) y una última etapa de síntesis durante 4 minutos a 72ºC. El fragmento de PCR resultante se usó en el vector pKEX-2-XR con XbaI y NotI. Int-h se generó del vector pHN16 como molde (Lange-Gustafson, B. y Nash, H. (1989) J. Biol. Chem., 259, página 12724). Int de tipo salvaje e Int-h/218 se generaron con pTrcInt o pTrcInt-h/218 como moldes (Christ, N. y Dröge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, página 825). pEL13 contiene junto al gen Int-h adicionalmente una copia de attP*.
AttP* se construyó partiendo de
attP mediante mutagénesis por PCR. Se usaron para ello los
siguientes oligonucleótidos:
(O3) | 5'-GTTCAGCTTTTTGATACTAAGTTG-3', | |
(O4) | 5'-CAACTTAGTATCAAAAAGCTGAAC-3' | |
(PC) | 5'-TTGATAGCTCTTCCGCTTTCTGTTACAGGTCACTAATACC-3', y | |
(PD) | 5'-ACGGTTGCTCTTCCAGCCAGGGAGTGGGACAAAATTGA-3' |
La amplificación se realizó según una primera
etapa de desnaturalización a 95ºC (4 minutos) con 30 ciclos de
desnaturalización (95ºC, 45 segundos), formación de cebador (57ºC, 1
minuto 30 segundos), síntesis de ADN (72ºC, 1 minuto 30 segundos) y
una última etapa de síntesis durante 4 minutos a 72ºC. El producto
de PCR se incubó con el enzima de restricción SapI y se ligó con el
pKEXInt-h recortado con SapI. El plásmido de control
pKEX no contiene el gen Int.
Los vectores sustrato son derivados de pEGFP
(Clontech). Los casetes de recombinación se encuentran bajo el
control del promotor del CMV, que garantiza una expresión
constructiva, fuerte. Se construyó pGFPattB/attP, de
modo que el gen GFP (proteína de fluorescencia verde) se recortó en
primer lugar de pEGFP mediante AgeI y BamHI. La secuencia
attB de tipo salvaje se usó como oligonucleótido de doble
hebra en el vector recortado con AgeI mediante los siguientes
oligonucleótidos:
(B1OB) | 5'-CCGGTTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAACTTGAGCGAACGC-3' y | |
(BOB1) | 5'-AATTGCGTTCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCAA-3'. |
La secuencia attP de tipo salvaje se
amplificó mediante PCR del vector pAB3 (Dröge, P. y Cozzarelli, N.
(1989) Proc. Natl. Acad. Sci., 86, página 6062) con uso de
los siguientes cebadores:
(p7) | 5'-TCCCCCCGGGAGGGAGTGGGACAAAATTGA-3' y | |
(p6) | 5'-GGGGATCCTCTGTTACAGGTCACTAATAC-3'. |
La amplificación se realizó tras una primera
etapa de desnaturalización a 95ºC (4 minutos) con 30 ciclos de
desnaturalización (95ºC, 45 segundos), formación de cebador (54ºC,
30 segundos), síntesis de ADN (72ºC, 30 segundos) y una última etapa
de síntesis durante 4 minutos a 72ºC. El fragmento de PCR que
contiene attP se recortó con XmaI y BamHI y se ligó con un
fragmento de restricción, que contiene el gen GFP. Este fragmento de
restricción de GFP se preparó con AgeI y EcoRI a partir de pEGFP. El
producto de la ligadura se usó en el vector que contiene
attB, recortado con MfeI/BamHI. El vector sustrato resultante
contiene el gen GFP en orientación invertida respecto al promotor
del CMV. Su funcionalidad se ensayó en recombinación integrativa en
E. coli mediante Int de tipo salvaje.
pGFPattL/attR es idéntico a
pGFPattB/attP hasta las secuencias de recombinación.
Se construyó el vector de modo que se recombinó en primer lugar
pGFPattB/attP en E. coli, lo que conduce a la
formación de attL y attR. El gen GFP orientado
correctamente respecto al promotor del CMV se recortó mediante una
reacción de restricción parcial con BsiEI y HindIII. Para usar el
gen GFP en orientación invertida respecto al promotor del CMV, se
amplificó el gen en primer lugar mediante PCR con uso de los
siguientes cebadores:
\newpage
(p2) | 5'-AATCCGCGGTCGGAGCTCGAGATCTGAGTCC-3' y | |
(p3) | 5'-AATCCCAAGCTTCCACCATGGTGAGCAAGGG-3' (figura 3). |
La amplificación se realizó tras una primera
etapa de desnaturalización a 95ºC (4 minutos) con 30 ciclos de
desnaturalización (95ºC, 45 segundos), formación de cebador (56ºC,
45 segundos), síntesis de ADN (72ºC, 1 minuto) y una última etapa de
síntesis durante 4 minutos a 72ºC. El fragmento de la PCR se recortó
a continuación con HindIII y BsiEI y se integró en el vector
recortado parcialmente. Este contiene attL y attR en
orientación invertida. pGFPattL/attR muestra por tanto
la misma estructura global que pGFPattB/attP, con
excepción de la presencia de attL/attR en lugar de
attB/attP.
El homólogo attB humano, attH, se
amplificó por el ADN humano purificado, por medio de PCR con uso de
los siguientes cebadores:
(B3) | 5'-GCTCTAGATTAGCAGAAATTCTTTTTG-3' y | |
(B2) | 5'-AACTGCAGTAAAAAGCATGCTCATCACCCC-3'. |
La amplificación se realizó tras una primera
etapa de desnaturalización a 95ºC (5 minutos) con 30 ciclos de
desnaturalización (95ºC, 45 segundos), formación de cebador (42ºC,
1,45 minutos), síntesis de ADN (72ºC, 1,45 minutos) y una última
etapa de síntesis durante 10 minutos a 72ºC. Las secuencias de
cebador para la generación de attH se tomaron de un EST
(número de acceso: N31218; base de datos de EMBL). Se confirmó la
secuencia incompleta de attH, tal como está presente en la
base de datos, y se complementó mediante secuenciación de ADN del
producto de PCR aislado (192 bp). Se recortó el fragmento a
continuación con XbaI y PstI y se usó en el vector tratado
correspondiente pACYC187 (New England Biolabs). attP* se
preparó mediante mutagénesis dirigida por PCR como se describió
(Christ, N. y Dröge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, página
825) y se usó en el vector que contiene attH en orientación
invertida respecto a attH. Esta construcción dio lugar al
vector de prueba pACH.
Se aislaron los ADN plasmídicos de la cepa de
E. coli DH5\alpha (Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol.,
166, página 557) mediante cromatografía de afinidad (Qiagen,
Alemania). Se controlaron los vectores de expresión y sustrato así
como todas las construcciones generadas por PCR mediante el sistema
de secuenciación de ADN 373A basada en fluorescencia (Applied
Biosystems). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con el
"Master Mix Kit" (Qiagen, Alema-
nia) y se analizaron los productos por electroforesis en gel de agarosa (0,8% en relación p/v) en tampón de TBE.
nia) y se analizaron los productos por electroforesis en gel de agarosa (0,8% en relación p/v) en tampón de TBE.
Los análisis de expresión y recombinación
transitorios se llevaron a cabo con una línea celular del linfoma de
Burkitt (BL60; (Wolf, J. y col., (1990) Cancer Res., 50,
página 3095)). Las células BL60 se cultivaron en medio RPMI1640
(Life Technologies, Inc.), que se enriqueció con suero bovino fetal
al 10%, y contenía L-glutamina 2 mM, estreptomicina
(0,1 mg/ml) y penicilina (100 unidades/ml).
Las líneas celulares reporteras BL60, que habían
integrado bien pGFPattB/attP o
pGFPattL/attR de forma estable en el genoma, se
construyeron como sigue: aproximadamente 20 \mug de cada vector se
linearizaron con ApaLI, se purificaron mediante extracciones con
fenol/cloroformo, se precipitaron con etanol y se incorporaron en
aproximadamente 2 x 10^{7} células mediante eletroporación a 260 v
y 960 mF con uso de un "pulsador de gen
Bio-rad". Se seleccionaron líneas celulares
estables con G418/genticina (300 \mug/ml) y a continuación se
caracterizaron mediante PCR, secuenciación de ADN y análisis
Southern.
Para llevar a cabo la recombinación
intramolecular in vivo, se transfectaron aproximadamente 2 x
10^{7} células de la línea celular reportera BL60 respectiva con
40 \mug de cada vector de expresión circular mediante
electroporación, como se describe en el ejemplo 2. Después de 72
horas se renovaron las células mediante centrifugación y se
aislaron los ADN genómicos de la mitad de las células según
indicaciones del fabricante (Qiaamp Blood Kit; Qiagen, Alemania)
mediante cromatografía de afinidad. De la segunda mitad de las
células se aisló bien ARN (Rneasy Kit, Qiagen, Alemania) o se
preparó un lisado celular para el análisis Western (véase el ejemplo
4).
Los análisis de recombinación con pACH se
describieron ya previamente (Christ, N. y Dröge, P. (1999) J. Mol.
Biol., 288, página 825) y se llevaron a cabo en E.
coli. Para ello se usaron las recombinasas Int,
Int-h e Int-h/218. La recombinación
esperada de pACH conduce a la inversión y se comprobó mediante
análisis de restricción con HindIII y AvaI.
Se llevó a cabo como sigue la recombinación
intermolecular para la integración de pEL13 en la attH
localizado en el genoma de células BL60: se transfectaron 2 x
10^{7} células con 20 \mug de pEL13 circular mediante
electroporación, como se describió anteriormente. Después de 48
horas se cultivaron las células en placas a una concentración de 1 x
10^{6} células/ml de medio de selección (200 \mug/ml de
higromicina B) y se incubaron durante 6 a 8 semanas. De una parte
de la población de células que sobreviven se preparó en este momento
ADN genómico según indicaciones del fabricante (Qiaamp Blood Kit;
Qiagen, Alemania).
Para comprobar la recombinación integrativa y
por escisión, intramolecular se amplificaron 0,4 \mug de ADN
genómico mediante PCR. Para ello se usaron de 20 a 50 pmol de los
siguientes cebadores:
(p1) | 4'-GGCAAACCGGTTGAAGCCTGCTTTT-3'; | |
(p2) | 5'-AATCCGCGGTCGGAGCTCGAGATCTGAGTCC-3'; | |
(p3) | 5'-AATCCCAAGCTTCCACCATGGTGAGCAAGGG-3'; | |
(p4) | 5'-AACCTCTACAAATGTGGTATGG-3'; | |
(p5) | 5'-TACCATGGTGATGCGGTTTTG-3'; | |
(p6) | 5'-GGGGATCCTCTGTTACAGGTCACTAATAC-3'; | |
(p7) | 5'-TCCCCCCGGGAGGGAGTGGGACAAAATTGA-3'; |
La amplificación se realizó tras una primera
desnaturalización a 95ºC (5 minutos) con 30 ciclos de
desnaturalización (95ºC, 45 segundos), formación de cebador (57ºC,
45 segundos), síntesis de ADN (72ºC, 1,5 minutos) y una última etapa
de síntesis durante 4 minutos a 72ºC.
La recombinación integrativa, intermolecular de
pEL13 se detectó como sigue. Aproximadamente 400 ng de ADN genómico
de poblaciones celulares supervivientes se incubaron con los
siguientes oligonucleótidos como cebadores para PCR:
(attx1) | 5'-AGTAGGAATTCAGTTGATTCATAGTGACTGC-3' | |
(B2) | 5'-AACTGCAGTAAAAAGCATGCTCATCACCCC-3' |
La amplificación tuvo lugar tras una primera
desnaturalización a 95ºC (4 minutos) con 30 ciclos de
desnaturalización (95ºC, 45 segundos), formación de cebador (52ºC,
45 segundos), síntesis de ADN (72ºC, 45 segundos) y una última etapa
de síntesis durante 4 minutos a 72ºC.
La PCR de transcriptasa inversa
(RT-PCR) se llevó a cabo con 4 \mug de ARN
aislado. Se sintetizaron en primer lugar los ADN según indicaciones
del fabricante con uso de cebadores oligo-dT (First
Strand Synthesis Kit; Pharmacia). Una cuarta parte de estos ADN se
usó como molde para la PCR subsiguiente, con uso de los cebadores
p3 y p4. Las condiciones de la PCR fueron como se describen para
p1-p7. Para ensayar la deleción, en lugar de
inversión, se amplificó ADN genómico aislado con los cebadores p5 y
p6. Se analizaron
beta-actin-transcriptasas partiendo
de los ADN con uso de los cebadores
(AS) | 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3' y | |
(S) | 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3' |
Las condiciones de PCR fueron como se describen
para p1-p7.
Se llevaron a cabo análisis Southern
esencialmente según el protocolo de Sambrook, J. (1989) Molecular
Cloning (segunda edición) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Se
fragmentó aproximadamente 10 \mug de ADN genómico con NcoI, se
separó mediante electroforesis en gel de agarosa (0,8% en relación
p/v) en tampón TBE y se transfirió durante la noche a una membrana
de Nylon. La sonda GFP para la detección de la recombinación se
preparó mediante PCR con uso de los cebadores p2 y p3. El marcado
radioactivo se llevó a cabo según las indicaciones del fabricante
(Megaprime; Amersham) con uso de dATP y dCTP marcados con ^{32}P
(Amersham).
Se prepararon lisados celulares de células
transfectadas transitoriamente mediante cocción (5 minutos) de las
células en tampón de ensayo (New England Biolabs). Las proteínas se
separaron en un gel de poliacrilamida SDS al 12,5% según peso
molecular y se transfirieron durante la noche a una membrana de
nitrocelulosa (Immobilon P, Millipore). La membrana se trató con
solución de bloqueo al 1% (BM Chemiluminescence Western Blotting
Kit; Boehringer Mannheim, Alemania) y se incubó con anticuerpo de
ratón policlonal contra Int de tipo salvaje a una dilución de
1:50000 (anticuerpos de A. Landy, Estados Unidos). Se usaron los
anticuerpos secundarios acoplados con peroxidasa para hacer visible
la posición de la integrasa en el gel (BM Chemiluminescence Western
Blotting Kit; Boehringer Mannheim, Alemania). Se usaron extractos
celulares de E. coli, que contenían Int de tipo salvaje, como
control.
Para ensayar si la recombinación de
Int-h se puede catalizar en células humanas fue
necesario demostrar en primer lugar que se puede sintetizar la
recombinasa de las células. Para tal fin se usó el vector de
expresión eucariótico, pKEXInt-h, que contiene el
gen Int-h bajo el control del promotor del CMV.
Después de la incorporación de pKEXInt-h en dos
líneas celulares reporteras BL60 distintas, B2 y B3, se podrían
detectar completa y correctamente transcriptasas modificadas,
específicamente para el gen Int-h, mediante análisis
por RT-PCR. Se estudiaron lisados celulares 72
horas después de la electroporación con pKEXInt-h
mediante un análisis Western. La detección de la recombinasa se
realizó mediante anticuerpos policlonales del ratón, que están
dirigidos contra Int de tipo salvaje. Como control se incorporó pKEX
en las células.
Los resultados mostraron que estaba presente una
proteína con el peso molecular esperado en las células, que se
trataron con pKEXInt-h en la electroporación. Esta
proteína no era detectable cuando se usó el vector de control
pKEX.
El análisis Western mostró que partiendo del
vector pKEXInt-h, se sintetiza la proteína
Int-h a partir de las dos líneas celulares
reporteras. Estas células contienen un vector sustrato,
pGFPattB/attP, como ADN extraño integrado de forma
estable en su genoma. Las dos secuencias de recombinación para
recombinación integrativa, attB y attP, se encuentran
en orientación invertida una respecto a otra y flanquean el gen para
GFP. El gen GFP se encuentra propiamente en orientación invertida
respecto al promotor del CMV, que está en dirección opuesta a
attB. La recombinación entre attB y attP
mediante Int-h condujo a la inversión del gen GFP y
por tanto a su expresión. Se construyeron en total tres líneas
celulares reporteras (B1-B3). El análisis Southern
de su ADN genómico mostró que B1 y B3 han integrado varias copias de
pGFPattB/attP como repeticiones directas en el
genoma. La línea celular B2 contiene por el contrario sólo una
copia. Las secuencias integradas se verificaron mediante PCR y a
continuación secuenciación.
Para ensayar la recombinación entre attB
y attP, se incorporaron pKEXInt-h y pKEX por
separado en estas líneas celulares. 72 horas tras la
electroporación se renovaron las células, se aisló el ARN de una
parte de las células y se estudió en cuanto a la expresión de GFP
por medio de RT-PCR con uso del par cebador p3/p4.
Estos cebadores amplifican un fragmento de ADN de 0,99 kp de
longitud sólo cuando el gen GFP se invirtió a consecuencia de la
recombinación. Los resultados mostraron que el producto se detectaba
en cada una de las tres líneas celulares. Si pKEX se incorporaba en
las células no se podía detectar producto alguno. Los análisis de
secuencia de ADN de los productos de PCR aislados confirman que la
región de codificación del gen GFP se transcribió y que se
detectaba attR en el transcripto, en lugar de attP.
Como control para el contenido en ARN en todas las seis
preparaciones celulares así como para la síntesis exitosa de la
primera hebra de ADN mediante la transcriptasa inversa, se analizó
el trascripto de \beta-actina endógeno mediante
PCR. Los resultados mostraron que el transcripto se presentaba en
aproximadamente las mismas cantidades.
La recombinación se detectó también mediante PCR
directa de ADN genómico. Los resultados mostraron que los productos
esperados sólo se detectaban mediante los pares cebadores p3/p4
(0,99 kb) y p1/p2 (0,92 kb), cuando pKEXInt-h se
incorporaba en las células. Los análisis de estos productos mediante
secuenciación de ADN confirmaron que attR y attL
estaban presentes en el genoma y que el gen GFP se invirtió con la
recombinación. Estos experimentos se repitieron un total de tres
veces, en donde se detectó la recombinación entre attB y
attP mediante RT-PCR y/o PCR en cada una de
las tres líneas celulares. Una detección de la deleción del gen GFP
mediante PCR con par cebador p5/p6 resultó negativa. Sólo se pudo
amplificar el fragmento de 1,3 kb esperado, que resultó del vector
integrado.
En un experimento adicional se obtuvo la señal
más fuerte, que mostró la inversión entre attB y attP
en la PCR, repetida con la línea celular B3. Se fragmentó el ADN
genómico mediante NcoI y se estudió con un análisis Southern. Para
ello se usó el gen GFP como sonda. Los resultados mostraron que
mediante la inversión se detectaba el fragmento de restricción
esperado entre attB y attP de ADN genómico en la línea
celular B3.
Para ensayar si el Int de tipo salvaje y el
mutante Int-h/218 podrían asimismo catalizar la
recombinación integrativa, intramolecular se incorporaron en un
experimento adicional los vectores pKEXInt-h,
pKEXInt-h/218, pKEXInt y como control pKEX mediante
electroporación, como se describe en el ejemplo 2, en la línea
celular reportera B3. Después de 72 horas se aisló el ADN genómico
y se ensayó mediante PCR con los pares cebadores p5/p7 y p3/p4,
como se describe en el ejemplo 3, en cuanto a recombinación. Los
resultados mostraron que ambos mutantes Int podrían catalizar la
recombinación entre attB y attP, sin embargo la Int de
tipo salvaje estaba inactiva.
Debido a que Int-h también
podría catalizar la recombinación por escisión entre attL y
attR en ausencia de los cofactores IHF y Xis, se
construyeron tres líneas celulares reporteras BL60, que han
integrado el vector pGFPatt/attR de forma estable en
el genoma. Estas líneas celulares contienen el gen GFP de nuevo en
orientación invertida respecto al promotor del CMV, flanqueado no
obstante por attL y attR en lugar de attB y
attP. Los análisis de recombinación llevados a cabo, como se
describe en el ejemplo 3, con pKEXInt-h como vector
de expresión para la recombinasa, mostraron sin embargo que debido a
la inversión aún se detectaba deleción entre attL y
attR con RT-PCR o PCR.
Como se mostró en el ejemplo 3, ambos mutantes
de recombinasa Int catalizan la recombinación integrativa,
intramolecular en células humanas. Una de las dos secuencias de
recombinación que toman parte en esta reacción, attB, es de
21 pares de bases (bp) de longitud y constituyente natural del
genoma de E. coli. Se podría mostrar que
Int-h tolera algunas desviaciones en la secuencia de
la denominada región de reconocimiento "núcleo" de attB
para una recombinación con attP (Nash (1981) Annu. Rev.
Genet., 15, página 143). A partir de consideraciones
estadísticas es por tanto posible la presencia de una secuencia
funcional, homóloga a attB en el genoma humano. En una
búsqueda en base de datos podríamos identificar una secuencia aún
incompleta como parte de una "etiqueta de secuencia expresada"
(EST). Esta secuencia se aisló y clonó a continuación mediante PCR a
partir de ADN humano. El análisis de secuencia de ADN completó la
secuencia y un análisis Southern adicional de ADN genómico de
células BL60 mostró que esta parte de la secuencia es de un gen
humano aún desconocido que se origina en una copia en el genoma.
Esta secuencia, que se designa en lo sucesivo
como attH, se desvía de la secuencia attB de tipo
salvaje en tres posiciones. Dos de los nucleótidos se encuentran en
la parte izquierda (B) región de reconocimiento Int "núcleo" y
una es parte de la denominada región de "solapamiento". Debido
a que la identidad de la región de "solapamiento" entre dos
secuencias de recombinación es una condición para una recombinación
eficiente con Int-h, se cambió el nucleótido
correspondiente en la posición 0 en el "solapamiento" de
attP de timidina en guanina, lo que condujo a attP*.
attH y attP* se usaron como secuencias invertidas en
un vector (pACH) y se ensayaron en cuanto a recombinación en E.
coli. Los resultados mostraron que Int-h e
Int-h/218 catalizan la inversión entre attH
y attP* en presencia de IHF. Los análisis de secuencia de ADN
de los productos de recombinación aislados confirmaron que la
recombinación entre attH y attP* transcurría según el
mecanismo esperado. La Int de tipo salvaje al contrario que
attH/attP* también se recombina sólo de forma muy
ineficiente en presencia de IHF. attH es por tanto una
secuencia de integración potencial para la integración catalizada
por Int-h de ADN extraño, que contiene una copia de
attP*.
Para ensayar si attH como constituyente
natural del genoma humano puede recombinarse con attP* en una
reacción intermolecular, se construyó pEL13. Este vector contenía,
junto al gen Int-h con el control del promotor de
CMV, una copia de attP* y, como marcador de selección, el gen
de resistencia a higromicina. Int-h se podría
sintetizar tras incorporación de pEL13 en células BL60 y catalizar
la recombinación intermolecular entre attP* como
constituyente de pEL13 y attH genómico.
pEL13 se incorporó en células BL60 mediante
electroporación, como se describe en el ejemplo 2, y estas se
llevaron y diluyeron después de 72 horas a presión selectiva. Se
estudiaron las poblaciones celulares que sobreviven después de 6 a
8 semanas mediante PCR con el par cebador attx1/B2 en cuanto
a sucesión de recombinación. Los resultados mostraron que en 13 de
las 31 poblaciones celulares que sobreviven se detectaba una
integración en attH. Los análisis de secuencia de ADN de los
productos de PCR aislados de los distintos preparados confirmaron su
identidad como productos de la recombinación.
<110> Dr. Dröge, Peter
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Recombinación de ADN específica de
secuencia en células eucariotas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DRO-001 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> xx
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-08-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 199 41 186.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-08-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgctttttt atactaactt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago lambda
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 102
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 162
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 243
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<212> ADN
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<213> Secuencia sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
Claims (28)
1. Procedimiento para la recombinación
específica de secuencia de ADN en una célula eucariótica in
vitro, que comprende
a) la introducción en una célula de una primera
secuencia de ADN, que comprende:
- una secuencia attB según la ID SEC Nº: 1 o su derivado, o
- una secuencia attP según la ID SEC Nº: 2 o su derivado, o
- una secuencia attL según la ID SEC Nº: 3 o su derivado, o
- una secuencia attR según la ID SEC Nº: 4 o su derivado,
b) la introducción en la célula de una segunda
secuencia de ADN, que comprende:
una secuencia attP según la ID SEC Nº: 2
o su derivado, en caso de que la primera secuencia de ADN comprenda
una secuencia attB según ID SEC Nº: 1 o su derivado; o
una secuencia attB según la ID SEC Nº: 1
o su derivado, en caso de que la primera secuencia de ADN comprenda
una secuencia attP según ID SEC Nº: 2 o su derivado; o
una secuencia attL según la ID SEC Nº: 3
o su derivado, en caso de que la primera secuencia de ADN comprenda
una secuencia attR según ID SEC Nº: 4 o su derivado; o
una secuencia attR según la ID SEC Nº: 4
o su derivado, en caso de que la primera secuencia de ADN comprenda
una secuencia attL según ID SEC Nº: 3 o su derivado;
c) la realización de la recombinación específica
de secuencia mediante acción de una integrasa Int del bacteriófago
Lambda,
en donde la expresión "derivado" designa
secuencias attB, attP, attL y attR, que
presentan frente a las secuencias de recombinación de origen natural
modificaciones en forma de una o varias, pero como máximo seis,
sustituciones.
2. Procedimiento para la recombinación
específica de secuencia de ADN en una célula eucariótica in
vitro, que contiene en su genoma la primera secuencia de ADN,
que está presente de forma natural en la célula o se incorpora
previamente con ayuda de recombinación de ADN, que comprende las
etapas b) y c), como se definieron en la reivindicación 1.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia
attB según ID SEC Nº: 1 o su derivado, y la segunda secuencia
de ADN comprende una secuencia attP según la ID SEC Nº: 2 o
su derivado.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia
attL según ID SEC Nº: 3 o su derivado, y la segunda secuencia
de ADN comprende una secuencia attR según ID SEC Nº: 4 o su
derivado, en donde está presente en la etapa c) adicionalmente un
factor Xis.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde adicionalmente se introduce/n una
tercera o una tercera y cuarta secuencia de ADN, que comprenden un
gen de Int o un gen de Int y un gen de factor Xis, en las
células.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
donde la tercera o la tercera y/o cuarta secuencia de ADN
comprende/n además una secuencia de ADN reguladora, que provoca/n
una expresión espacial y/o temporal del gen de Int y/o del gen de
factor Xis.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde Int es una integrasa
modificada.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde la Int modificada es Int-h o
Int-h/218.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde en la etapa c) toma parte
adicionalmente un "factor de integración de huésped" (IHF).
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, en donde la primera y/o segunda secuencia de
ADN comprende/n además secuencias de ADN que provoca/n una
integración de la primera y/o segunda secuencia de ADN en el genoma
de células eucariotas mediante recombinación homóloga.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, en donde la primera y/o segunda secuencia
de ADN comprende/n además una secuencia de ácido nucleico, que
codifica un polipéptido de interés.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
donde el polipéptido de interés es una proteína estructural, un
enzima endógeno o exógeno, una proteína reguladora o una proteína
marcadora.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 y 3 a 12, en donde la primera y segunda secuencia
de ADN se introduce en la misma molécula de ADN en la célula
eucariótica.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13, en donde la célula eucariótica es una
célula de mamífero.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
donde la célula de mamífero es una célula humana, una célula de
mono, ratón, rata, conejo, hámster, cabra, vaca, oveja o cerdo.
16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3 y 5 a 15, que comprende además
d) la realización de una segunda recombinación
específica de secuencia de ADN después de una primera recombinación
específica de secuencia según las etapas a) a c), en donde la
primera secuencia de ADN comprende attB según ID SEC Nº: 1 o
su derivado y la segunda secuencia de ADN attP según ID SEC
Nº: 2 o su derivado o al revés, mediante acción de una Int y de un
factor Xis.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
donde en las células se introduce además una secuencia de ADN
adicional que comprende un gen del factor Xis.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
donde la secuencia de ADN adicional comprende además una secuencia
de ADN reguladora que provoca una expresión espacial y/o temporal
del gen del factor Xis.
19. Uso de una secuencia attB según ID
SEC Nº: 1 o su derivado y una secuencia attP según ID SEC Nº:
2 o su derivado, o una secuencia attL según ID SEC Nº: 3 o su
derivado y una secuencia attR según ID SEC Nº: 4 o su
derivado, en una recombinación específica de secuencia de ADN en
células eucariotas in vitro, en donde la expresión
"derivado" designa secuencias de attB, attP,
attL y attR que presentan frente a la secuencias de
recombinación de origen natural modificaciones en forma de una o
varias, pero como máximo seis, sustituciones.
20. Ácido nucleico attP modificado según
ID SEC Nº: 5 o su derivado, en donde la expresión "derivado"
designa secuencias de attB, attP, attL y
attR que presentan frente a la ID SEC Nº: 5 modificaciones en
forma de una o varias, pero como máximo seis, sustituciones, con la
condición de que el derivado no corresponda a la secuencia
attP de tipo natural.
21. Vector que comprende la secuencia de ácido
nucleico según la reivindicación 20 y una secuencia de ácido
nucleico más, que codifica un gen terapéutico o su fragmento de
ADN.
22. Vector según la reivindicación 21, en donde
el gen terapéutico es el gen CFTR, gen ADA, gen del receptor de LDL,
gen de la \beta-globina, gen del factor VIII o gen
del factor IX, gen de
alfa-1-antitripsina o el gen de la
distrofina o un fragmento de gen de uno de estos genes.
23. Vector según la reivindicación 21 ó 22, en
donde la otra secuencia de ácido nucleico comprende además elementos
de expresión y/o transcripción.
24. Vector según una de las reivindicaciones 21
a 23 para el uso como medicamento en la medicina humana o
veterinaria.
25. Uso del vector según una de las
reivindicaciones 21 a 23 para la preparación de un medicamento para
la terapia génica somática.
26. Célula eucariótica, que contiene secuencias
de attB, attP, attL y attR, o derivados
de las mismas, que se puede obtener sometiendo a la célula
eucariótica citada en la reivindicación 1 y 2 al procedimiento según
una de las reivindicaciones 1 a 18.
27. Organismo transgénico, no humano, que
contiene al menos una célula según la reivindicación 26.
28. Organismo según la reivindicación 27, en
donde este organismo es un ratón, una rata, un conejo o un
hámster.
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