BRPI1010759B1

BRPI1010759B1 - Método para produzir uma proteína de interesse ou para obter uma suspensão de células de mamíferos capaz de produzir uma proteína de interesse, bem como vetor de expressão de proteína

Info

Publication number: BRPI1010759B1
Application number: BRPI1010759-2A
Authority: BR
Inventors: Koichi Kawakami; Keina YAMAGUCHI; Risa OGAWA; Masayoshi TSUKAHARA
Original assignee: Inter-University Research Institute Corporation Research Organization Of Information And Systems; Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
Priority date: 2009-06-11
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2019-07-16
Also published as: WO2010143698A1; EP2441831A1; ES2697535T3; US10358671B2; BRPI1010759A2; US9034649B2; TW201546281A; JP6039181B2; US20170306378A1; KR101812348B1; ES2697535T9; US9725750B2; AU2010259533B2; JP6152402B2; CN106978441A; US20110045532A1; EP2441831A4; AU2010259533A1; RU2563514C2; RU2012100250A

Abstract

método para produzir uma proteína de interesse ou para obter uma suspensão de células de mamíferos capaz de produzir uma proteína de interesse, bem como vetor de expressão de proteína a presente invenção refere-se a um método para produzir uma proteína de interesse, compreendendo a introdução de um vetor de expressão de proteína compreendendo um fragmento genético, um fragmento genético compreendendo um dna codificando uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências de transpóson em ambas extremidades do fragmento genético, em uma suspensão de células de mamíferos; integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson, em um cromossomo da célula de mamífero para obter uma célula de mamífero capaz de expressar a proteína de interesse; e cultivar em suspensão a célula de mamífero; e uma suspensão de células de mamíferos capaz de expressar a proteína de interesse.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

A presente invenção refere-se a um método para produzir uma proteína de interesse, compreendendo a introdução de um vetor de expressão de proteína que compreende um fragmento genético compreendendo um 10 DNA codificando uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências do transpóson em ambas extremidades do fragmento genético, em uma suspensão de células de mamíferos, integrando o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson em um cromossomo da célula de mamífero para obter uma célula de mamífero capaz de expressar a 15 proteína de interesse; e cultivo da suspensão a célula de mamífero; e uma suspensão de células de mamíferos capazes de expressar a proteína de interesse.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA.

A produção de proteínas exógenas por técnicas recombinantes 20 de DNA é usada em várias indústrias, tais como indústria de alimento e indústria farmacêutica. Na maioria dos casos, a produção de proteínas recombinantes é executada introduzindo um vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína de interesse em um hospedeiro, tal como Escherichia coli, levedura, célula de 25 inseto, célula de planta, e célula de animais, selecionando um transformante no qual o vetor de expressão está integrado no cromossomo, e o cultivo posterior da linhagem celular sob condições apropriadas de cultura.

Contudo, para desenvolver um hospedeiro que possa produzir uma proteína exógena eficientemente, é necessário selecionar uma célula 30 hospedeira possuindo boa produtividade de cada proteína de interesse, e para tal uma inovação técnica adicional é desejada nas técnicas de produção de proteína exógenas para um hospedeiro individual.

Segue-se folha 1a/39

Petição 870180069238, de 09/08/2018, pág. 11/21

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Petição 870180002163, de 10/01/2018, pág. 6/19

2/39 atingir em muitos casos e assim causam um problema na produção de uma proteína possuindo esta atividade.

Uma vez que a proteína produzida é sujeita a uma modificação pós translaciona 1, tal como fosforilação e adição de cadeias de açúcar no sistema de inseto, este sistema tem um mérito de que a proteína possuindo a sua atividade fisiológica original pode ser expressada. Contudo, como a estrutura da cadeia de açúcar da proteína secretada é diferente daquela de células derivadas de mamíferos, a antigenicidade e efeitos semelhantes se tornam um problema quando se aplicam a uma proteína para uso farmacêu10 tico.

Além disso, como um vírus recombinante é usado no sistema de célula de inseto quando um gene exógeno é introduzido, há um problema que a sua inativação e o refreamento do vírus são necessários do ponto de vista da segurança.

No sistema de células animais, as modificações pós-translacionais, tais como fosforilação, a adição de cadeia de açúcar, e a dobra, podem ser conduzidas ao derivado de proteínas de animais superiores incluindo o ser humano, da maneira mais semelhante àquela produzida em um corpo vivo. Tais modificações pós-translacionais exatas são necessárias pa20 ra recriar a atividade fisiológica originalmente possuída por uma proteína na sua proteína recombinante, e um sistema de produção de proteína no qual uma célula de mamífero é usada como hospedeira normalmente aplicada a produtos farmacêuticos e assemelhados que necessitam de tal atividade fisiológica.

Contudo, um sistema de expressão de proteína no qual uma célula de mamífero é usada como hospedeira é geralmente de baixa na produtividade, e também causa em muitos casos um problema da estabilidade dos genes introduzidos. A melhora da produtividade de uma proteína usa uma célula de cultura de mamífero como um hospedeiro não é só muito importan30 te na produção de medicamentos para tratamentos, reagentes para diagnósticos e assemelhados, mas também contribui muito para a pesquisa e desenvolvimento dos mesmos. Assim, é urgente desenvolver um sistema de

3/39 expressão genética que facilmente permita obter uma linhagem celular de uma alta produtividade usando uma célula de cultura de mamífero, particularmente célula de ovário de hamster chinês (célula CHO), como hospedeiras.

Um transpóson é um elemento genético transponível que pode fazer transferências de um lugar para outro lugar no cromossomo. Um transpóson é um instrumento forte do estudo da biologia molecular e da genética e é usado com um objetivo, tal como mutagênese, gene capturado em armadilha, e a preparação de indivíduos transgênicos, em insetos ou nematóides 10 (por exemplo, Drosophila melanogaster ou Caenorhabditis elegans) e plantas. Contudo, o desenvolvimento de tal técnica foi atrasado para animais vertebrados incluindo células de mamíferos.

Nos últimos anos, contudo, os transpósons que têm atividades também em animais vertebrados animais foram relatados, e mostrou-se que 15 alguns deles tinham uma atividade em células de mamífero, tais como derivado de célula de rato e de ser humano. Os exemplos típicos incluem transpósons Tol1 (Referência Patente I) e Tol2 (Referência Não-patente 1) clonado de um medaka (killifish), o Sleeping Beauty reconstruído de um transpóson não autônomo existido no genoma de peixe Onchorhynchus (Referência 20 Não Patente 2), um transpóson artificial de um sapo (Referência Não Patente 3) que é derivado da rã e um transpóson piggyBac (Referência Não Patente 4) que é derivado de inseto.

Estes transpósons de DNA foram usados para a mutagênese, captura de genes, preparação de indivíduos transgênicos, expressão de pro25 teínas resistentes à droga, e assemelhados, como um instrumento de transferência genética para trazer um novo fenótipo em um genoma de uma célula de mamífero (Referências Não Patentes de 5 a 12).

No caso de insetos, um método no qual um gene exógeno é introduzido no cromossomo de bicho da seda usa o transpóson derivado de 30 piggyBac de um inseto Lepidoptera para expressar a proteína codificada pelo dito gene exógeno foi estudado, e um método de produção de proteína usando as técnicas acima foi divulgado (Referência Patente 2).

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Contudo, como a proteína expressada de interesse não tem suficiente nível de expressão e é produzida no corpo inteiro do bicho da seda, ela causa um problema econômico devido à necessidade de uma técnica de purificação avançada para recuperar a proteína exógena expressada em uma forma altamente purificada do fluido corporal incluindo uma grande quantidade de proteínas contaminadas.

Além disso, é conhecido um exemplo no qual uma proteína que se relaciona com resistência de G418 é expressada em uma célula de mamífero usando o transpóson Tol2 derivado do medaka - (Referência Nãopatente 12).

Lista de Citação

Literatura de Patente

Literatura de Patente 1 Literatura de Patente 2 Literatura Não de Patente	W02008/072540 Pedido Publicado de Patente Japonesa Não Examinado n° 2001-532188
Literatura não de Patente 1	Nature 383,30 (1996)
Literatura não de Patente 2	Ce//91, 501-510 (1997)
Literatura não de Patente 3	Nucleic Acids Res, 31, 6873-6881 (2003)
Literatura não de Patente 4	Insect Mol. Biol. 5, 141-151 (1996)
Literatura não de Patente 5	Genetics. 166, 895-899 (2004)
Literatura não de Patente 6	PLoS Genet, 2, el 69 (2006)
Literatura não de Patente 7	Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 10769-
	10773 (1998)
Literatura não de Patente 8	Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:6759-6764
	(2001)
Literatura não de Patente 9	Nature 436,221-22 6 (2005)
Literatura não de Patente 10	Nucleic Acids Res., 31, 6873-6881 (2003)
Literatura não de Patente 11	Nucleic Acids Res., 35, e87 (2007)
Literatura não de Patente 12	Proc Natl. Acad. Sei. USA, 103, 15008-
	15013 (2006)

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Problema Técnico

Para produzir e analisar uma proteína de interesse é necessário selecionar uma linhagem celular que expresse de maneira estável e alta5 mente uma proteína de interesse, usando uma célula de cultura derivada do mamífero, mas a preparação e a cultura da célula que produz a proteína de interesse necessitam o trabalho considerável e tempo.

Além disso, embora se conheça que uma proteína de interesse seja expressada em uma célula de mamífero usando uma sequência do 10 transpóson, a preparação de uma célula que possa expressar altamente uma proteína de interesse e assim poder ser usada como um sistema de produção de proteína pela utilização uma sequência do transpóson; o método de preparação de uma célula de mamífero que possa produzir grandemente uma proteína de interesse pela utilização uma sequência do transpó15 son; e um método de produção de uma proteína usando a célula não são conhecidos.

Como descrito acima, a expressão de uma proteína de interesse em uma grande quantidade estabelecendo um sistema de produção de proteína que possa produzir grandemente uma proteína de interesse usando 20 uma célula de cultura de mamífero eficientemente e dentro de um curto período tem sido necessário. Assim, os objetivos da invenção devem fornecer uma célula capaz de expressar grandemente uma proteína de interesse que possa ser eficientemente estabelecida, e um método para produzir a proteína de interesse usando a célula.

Solução para problemas

Para resolver os problemas supracitados, os presentes inventores conduziram estudos intensivos e encontraram como resultado que uma célula de mamífero capaz de expressar grandemente uma proteína de interesse pode ser eficientemente preparada introduzindo um vetor de expres30 são de proteína compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA codificando a proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências do transpóson em ambas extremidades do fragmento genético,

6/39 em uma suspensão de células de mamíferos; e integrar o fragmento genético inserido entre um par (de duas) das sequências do transpóson em um cromossomo da célula de mamífero. Além disso, considerou-se que a proteína de interesse pode ser produzida eficientemente pela utilização da célula, e assim a invenção foi realizada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Especificamente, a invenção é como se segue:

1. Um método para produzir uma proteína de interesse, compreendendo a introdução de um vetor de expressão de proteína compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA codificando uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências do transpóson em ambas extremidades do fragmento genético, em uma suspensão de células de mamíferos; integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson em um cromossomo da célula de mamífero para obter uma célula de mamífero capaz de expressar a proteína de interesse; e cultivar a suspensão da célula de mamífero;

2. Um método para produzir uma proteína de interesse, compreendendo as seguintes etapas (A) a (C):

(A) uma etapa de simultaneamente introduzir os seguintes vetores de expressão (a) e (b) em uma suspensão de células de mamíferos: o vetor de expressão compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA codificando uma proteína de interesse e sequências do transpóson em ambas extremidades do fragmento genético, (b) um vetor de expressão compreendendo um DNA codificando uma transposase que reconhece as sequências do transpóson e tem a atividade de transferir um fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson para um cromossomo, (B) uma etapa de expressar transientemente a transposase a partir do vetor de expressão introduzido na etapa (A) para integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson em um cromossomo da célula de mamífero para obter uma suspensão de células de mamíferos capaz de expressar a proteína de interesse, e

7/39 (C) uma etapa do cultivo da suspensão, a suspensão de células de mamíferos capaz de expressar a proteína de interesse obtida na etapa (B) para produzir a proteína de interesse;

3. Um método para obter uma suspensão de células de mamíferos capaz de expressar uma proteína de interesse, compreendendo a introdução de um vetor de expressão de proteína compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA codificando uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências do transpóson em ambas extremidades do fragmento genético em uma suspensão de células de mamíferos; e integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson, em um cromossomo da célula de mamífero;

4. O método descrito em qualquer um dos itens acima mencionados de 1 a 3, em que a suspensão de células de mamíferos é uma célula capaz da sobreviver e proliferar em um meio livre de soro;

5. O método descrito por qualquer um dos itens acima mencionados de 1 a 4, em que a suspensão de células de mamíferos é pelo menos uma selecionada de uma suspensão de células CHO na qual uma célula CHO é adaptada à cultura em suspensão, uma célula PER.C6, uma célula de mieloma de rato YB2/3HL.P2. G11.16Ag.20 (ou também chamada YB2/0) e uma suspensão de célula de mieloma de rato NSO adaptada para cultura em suspensão;

6. O método descrito no item 5 acima mencionado, em que a célula CHO é pelo menos uma selecionada de CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 e CHO-S;

7. O método descrito em qualquer um dos itens acima mencionados de 1 a 6, em que o gene marcador selecionável é um gene de resistência à ciclo-heximida;

8. O método descrito no item 7 acima mencionado, em que o gene de resistência à ciclo-heximida é um gene codificando um mutante da proteína ribossômica humana L36a;

9. O método descrito por item 8 acima mencionado, em que o mutante é um mutante em que a prolina na posição 54 da proteína ribossô8/39 mica humana L36a é substituído com outro aminoácido;

10. O método descrito no item 9 acima mencionado, em que o outro aminoácido é glutamina;

11.0 método descrito por qualquer um dos itens acima mencionados de 1 a 10, em que um par das sequências do transpóson é são as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons do tipo DNA que funcionam em uma célula de mamífero;

12. O método descrito no item 11 acima mencionado, em que o nucleotídeo derivado de sequências de um par de transpósons do tipo DNA é são as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons Tol1 ou são as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons Tol2;

13. O método descrito no item 12 acima mencionado, em que as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons Tol2 é uma sequência de nucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 2 e a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 3;

14. O método descrito no item 12 acima mencionado, em que as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons de Tol1 são as sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID N°: 14ea sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 15;

15. Uma suspensão de células de mamíferos capaz de produzir uma proteína de interesse, na qual um vetor de expressão de proteína compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA codificando uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências do transpóson em ambas extremidades do fragmento genético é introduzido, para integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson em um cromossomo;

16. Uma suspensão de células de mamíferos capaz de produzir uma proteína de interesse, em que um vetor de expressão (a) compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA codificando uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências do

9/39 transpóson em ambas extremidades do fragmento genético, e um vetor de expressão (b) compreendendo um DNA codificando uma transposase (um transferase) que reconhece as sequências do transpóson e tem a atividade de transferir o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson em um cromossomo para integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson no cromossomo;

17. A célula descrita no item acima mencionado 15 ou 16, em que a célula é uma célula capaz da sobreviver e proliferar em um meio livre de soro;

18. A célula descrita em qualquer um dos itens acima mencionados de 15 a 17, em que a célula é pelo menos uma suspensão de células de mamíferos selecionada de uma suspensão de célula CHO na qual uma célula CHO é adaptada à cultura em suspensão, uma célula PER.C6, uma célula de mieloma de rato YB2/3HL.P2. G11.16Ag.2O (ou também chamada YB2/0) e uma suspensão de célula de mieloma de rato NSO adaptada para cultura em suspensão;

19. A célula descrita no item 18 acima mencionado, em que a célula CHO é pelo menos uma selecionada de CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 e CHO-S;

20. A célula descrita em qualquer um dos itens acima mencionados de 15 a 19, em que o gene marcador selecionável é um gene de resistência à ciclo-hexímida;

21. A célula descrita no item 20 acima mencionado, em que o gene de resistência à ciclo-heximida é um gene codificando um mutante da proteína ribossômica humana L36a;

22. A célula descrita no item 21 acima mencionado, em que o mutante é um mutante em que a prolina na posição 54 da proteína ribossômica humana L36a é substituída por outro aminoácido;

23. A célula descrita no item 22 acima mencionado, em que o outro aminoácido é glutamina;

24. A célula descrita em qualquer um dos itens acima mencionados 15 para 23, em que um par das sequências do transpóson é são as se

10/39 quências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons do tipo DNA que funcionam em uma célula de mamífero;

25. A célula descrita no item 24 acima mencionado, em que as sequências de nucleotídeo derivadas de um par dos transpósons do tipo DNA são as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons de Tol1 ou são as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons Tol2;

26. A célula descrita no item 25 acima mencionado, em que as sequências de nucleotídeo derivadas de um par dos transpósons Tol2 são as sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID N°: 2 e a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 3;

27. A célula descrita no item acima mencionado 25, em que as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons Tol1 são as sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID N°: 14 e a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 15;

28. Um vetor de expressão de proteína, compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA codificando uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável, e um par de sequências do transpóson em ambas extremidades do fragmento genético;

29. O vetor de expressão de proteína descrito no item 28 acima mencionado, em que um par das sequências do transpóson é são as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons de Tol1 ou são as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons Tol2.

30. O vetor de expressão de proteína descrito no item 29 acima mencionado, em que as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons theTol2 são as sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID N°: 2 e a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 3; e

31. O vetor de expressão de proteína descrito no item acima mencionado 29, em que as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transpósons Tol1 são as sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID N°: 14 e a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 15.

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Efeitos Vantajosos da Invenção

De acordo com o método de produção de proteína da invenção, uma proteína de interesse pode ser eficientemente produzida pelo uso de uma célula de mamífero. Além disso, a célula da invenção pode ser usada como uma célula de produção de proteína para produzir uma proteína recombinante com uma alta eficiência.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra uma ilustração esquemática de um vetor de transpóson para expressar um anticorpo M2 anti-humano da influenza. Tol2L representa uma extremidade esquerdo transpóson Tol2 (SEQ ID N°: 2), Tol2-R representa uma extremidade certo transpóson Tol2 (SEQ ID N°: 3), CMV representa um promotor CMV, o poli A representa um sítio de poliadenilação, Ele representa um anticorpo humano H cadeia cDNA, Lc representa um anticorpo humano L cadeia cDNA, e CHX-r representa um gene de resistência à ciclo-heximida.

A figura 2 mostra uma ilustração esquemática de um vetor de expressão do anticorpo anti-humano M2 da influenza . CMV representa um promotor CMV, o poli A representa um sítio de poliadenilação, Ele representa um anticorpo humano H cadeia cDNA, Lc representa um anticorpo humano L cadeia cDNA e CHX-r representam um gene de resistência à cicloheximida.

A figura 3 mostra uma ilustração esquemática de um vetor de expressão de transposase Tol2. CAGGS representa um promotor CAGGS, o poli A representa um sítio de poliadenilação, e cDNA TPase representa uma transposase Tol2 cDNA.

A figura 4A mostra um resultado de examinar o nível de expressão de um anticorpo M2 anti-humano da influenza em uma suspensão de célula CHO-K1 quando um vetor de transpóson Tol2 para expressar um anticorpo M2 anti-humano da influenza foi usado. A ordenada mostra a quantidade da produção de anticorpo (pg/ml), e a abscissa mostra o número de clones transgênicos da suspensão de célula CHO-K1.

A figura 4B mostra um resultado de examinar o nível de expres

12/39 são de um anticorpo M2 anti-humano da influenza em um adesivo de célula CHO-K1 quando um vetor de transpóson Tol2 para expressar um anticorpo M2 anti-humano da influenza foi usado. A ordenada mostra a quantidade da produção de anticorpo (pg/ml), e a abscissa mostra o número de clones transgênicos do adesivo de célula CHO-K1.

A figura 5 mostra uma ilustração esquemática de um vetor de transpóson Tol1 para expressar um anticorpo M2 anti-humano da influenza. Tol1-L representa uma extremidade esquerda do transpóson Tol1 (SEQ ID N°: 14), Tol1-R representa uma extremidade direita do transpóson Tol1 (SEQ ID N°: 15), CMV representa um promotor CMV, o poli A representa um sítio de poliadenilação, Hc representa a cadeia cDNA de um anticorpo humano H, Lc representa a cadeia L do cDNA de um anticorpo humano, e CHX-r representa um gene de resistência à ciclo-heximida.

A figura 6 mostra uma ilustração esquemática de um vetor de expressão de transposase Tol1. CAGGS representa um promotor CAGGS, o poli A representa um sítio de poliadenilação, e cDNA TPase representa uma transposase Tol1 cDNA.

A figura 7 mostra um resultado de examinar o nível de expressão de um anticorpo M2 anti-humano da influenza em uma suspensão de célula CHO-K1 quando um vetor de transpóson Tol1 foi usado para expressar o anticorpo M2anti-humano de uma influenza. A ordenada mostra a quantidade da produção de anticorpo (pg/ml), e a abscissa mostra o número de clones transgênicos da suspensão de célula CHO-K1.

Esta invenção refere-se a um método para produzir uma proteína de interesse, compreendendo a introdução de um vetor de expressão de proteína compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA codificando uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências do transpóson em ambas extremidades do fragmento genético, em uma suspensão de células de mamíferos; integrar o fragmento genético inserido entre um par (de duas) das sequências do transpóson, em um cromossomo da célula de mamífero para obter uma célula de mamífero capaz de expressar o dito proteína de interesse; e cultivo da suspensão a célula de

13/39 mamífero.

Os exemplos do método para produzir uma proteína de interesse da presente invenção incluem um método, compreendendo as seguintes etapas (A) a (C):

(A) uma etapa de simultaneamente introduzir os seguintes vetores de expressão (a) e (b) em uma suspensão de células de mamíferos:

(a) um vetor de expressão compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA codificando uma proteína de interesse e sequências do transpóson em ambas extremidades do fragmento genético, (b) um vetor de expressão compreendendo um DNA codificando uma transposase que reconhece as sequências do transpóson e tem a atividade de transferir um fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson em um cromossomo, (B) uma etapa de expressar transientemente a transposase transitoriamente do vetor de expressão introduzido na etapa (A) para integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson em um cromossomo da célula de mamífero para obter uma suspensão de células de mamíferos capaz de expressar a proteína de interesse, e (C) uma etapa do cultivo da suspensão a suspensão de células de mamíferos capaz de expressar a proteína de interesse obtida na etapa (B) para produzir a proteína de interesse.

Além disso, a presente invenção refere-se a uma suspensão de células de mamíferos capaz de produzir uma proteína de interesse, na qual um vetor de expressão de proteína compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA codificando uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências do transpóson em ambas extremidades do fragmento genético é introduzido, para integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson em um cromossomo.

Além disso, a presente invenção refere-se a uma suspensão de células de mamíferos capaz de produzir uma proteína de interesse, em que um vetor de expressão (a) compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA codificando uma proteína de interesse e um gene marca

14/39 dor selecionável e sequências do transpóson em ambas extremidades do fragmento genético, e um vetor de expressão (b) compreendendo um DNA codificando uma transposase (um transferase) que reconhece as sequências do transpóson e tem a atividade de transferir o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson em um cromossomo para integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências do transpóson no cromossomo.

O termo transpóson no relatório descritivo presente é um elemento genético transponível e significa uma unidade genética que move em um cromossoma ou de um cromossomo a outro cromossomo (transposição) enquanto mantém uma certa estrutura.

O transpóson compreende uma unidade genética de umas sequências do transpóson se repetem (também chamado sequência repetida invertida (sequência de IR) ou o terminal inverteu a sequência repetida (sequência de TIR)) que posições na mesma direção ou a direção reversa em ambas extremidades da unidade genética e uma sequência de nucleotídeo codificando uma transposase que reconhece que a sequência do transpóson transfere um gene existente entre as sequências do transpóson.

A transposase traduzido do transpóson pode transferir um DNA reconhecendo as sequências do transpóson de ambas extremidades do transpóson, recortando o fragmento de DNA inserido entre um par das sequências do transpóson e inserindo o fragmento no sítio ser transferido.

O termo sequência do transpóson no relatório descritivo presente significa a sequência de nucleotídeo de um transpóson reconhecido por uma transposase e tem a mesma significação que a sequência IR ou sequência TIR. Um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeo pode compreender uma parte de repetição imperfeita enquanto pode ser transferido (inserido em outra posição na genoma) pela atividade de uma transposase, e compreender uma sequência do transpóson específica para o transposase.

Como a sequência do transpóson a ser usada na invenção, um derivado de sequência de nucleotídeo de um transpóson dotipo DNA é pre

15/39 ferível, e um derivado de sequência de nucleotídeo de um par de transpósons dotipo DNA naturais ou artificiais, que podem ser reconhecidos por uma transposase e transpostos em células de mamífero, é mais preferível.

Os exemplos do derivado de sequência de nucleotídeo de um transpóson do tipo DNA incluem o derivado de sequências de nucleotídeo do derivado do peixe de medaka transpóson Tol1 e transpóson Tol2, a Bela adormecida reconstruiu de um transpóson não autônomo existido em um genoma de peixe de Onchorhynchus, o derivado da rã príncipe de Rã de transpóson artificial e o transpóson de derivado do inseto PiggyBac.

Particularmente, entre eles, o derivado de sequências de nucleotídeo do derivado do peixe de medaka transpóson Tol2 compreendendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 6 e o derivado do peixe de medaka transpóson Tol2 compreendendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 13 são preferíveis.

Os exemplos do derivado de sequência de nucleotídeo de um par de transpósons Tol2 incluem a sequência de nucleotídeo nas posições de 1 a 2229 e a sequência de nucleotídeo nas posições 4148 para 4682 na sequência de nucleotídeo de transpóson Tol2 mostrada na SEQ ID N°: 6 de Listagem de Sequência.

Como o derivado de sequência de nucleotídeo de um par de transpósons Tol2, a sequência de nucleotídeo nas posições de 1 a 200 (SEQ ID N°: 2) (daqui por diante referido como a sequência de Tol2-L) e a sequência de nucleotídeo nas posições 2285 para 2788 (SEQ ID N°: 3) (daqui por diante referido como ”a sequência de Tol2-R) na sequência de nucleotídeo de transpóson Tol2 mostrada na SEQ ID N°: 1 da Listagem de Sequência é mais preferível.

Os exemplos do derivado de sequência de nucleotídeo de um par de transpósons de Tol1 incluem a sequência de nucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo nas posições de 1 a 157 e a sequência de nucleotídeo nas posições o 1748 para 1855 na sequência de nucleotídeo de transpóson Tol1 mostrada na SEQ ID N°; 13 de Listagem de Sequência.

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Como o derivado de sequência de nucleotídeo de um par de transpósons de Tol1, a sequência de nucleotídeo nas posições de 1 a 200 (SEQ ID N°: 14) (daqui por diante referido como Tol1-L sequência) e a sequência de nucleotídeo nas posições 1351 para 1855 (SEQ ID N°: 15) (daqui por diante referido como Tol1-R sequência) na sequência de nucleotídeo de transpóson Tol2 mostrada na SEQ ID N°: 1 da Listagem de Sequência é mais preferível.

Os exemplos da sequência do transpóson a ser usada na invenção incluem sequências do transpóson das quais transferem reações são controlados pela utilização uma sequência parcial de um derivado de sequência do transpóson do transpóson supracitado, ajustando o comprimento da sequência de nucleotídeo e modificando a sequência de nucleotídeo devido a adição, eliminação ou substituição.

Em relação ao controle da reação de transferência de um transpóson, a reação de transferência pode ser acelerada ou suprimida acelerando ou suprimindo o reconhecimento da sequência do transpóson por uma transposase, respectivamente.

O termo transposase no relatório descritivo presente significa uma enzima que reconhece sequências de nucleotídeo possuindo sequências do transpóson e transfere um DNA existente entre as sequências de nucleotídeo em um cromossomo ou do cromossomo a outro cromossomo.

Os exemplos da transposase incluem o Tol1 e Tol2 que são derivados do peixe de medaka, a Bela adormecida reconstruiu de um transpóson não autônomo existido em um genoma de peixe de Onchorhynchus, o príncipe de Rã de transpóson artificial que é derivado da rã e o transpóson PiggyBac que é derivado do inseto.

Como o transposase, uma enzima nativa pode ser usou, e qualquer transposase no qual uma parte dos seus aminoácidos são substituídos, eliminou, inserido e/ou acrescentado pode ser usada enquanto a mesma atividade de transferência que a transposase é mantido. Controlando a atividade de enzima do transposase, a reação de transferência da DNA existente entre as sequências do transpóson pode ser controlada.

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Para analisar se ele possui uma atividade de transferência semelhante àquele do transposase, pode ser medido pelo sistema de análise de 2 componentes divulgado no Pedido Publicado de Patente Japonesa Não Examinado n° 235575/2003.

Ilustrativamente, se um elemento Tol2 não-automático pode ser transferido e inserido em um cromossomo de célula de mamífero pela atividade de uma transposase pode ser analisado por separadamente utilização um plasmídio compreendendo um Tol2 transpóson Tol2 eliminado da transposase (transpóson não autônomo de Tol2-derivado) e um plasmídio compreendenda transposase Tol2.

O termo transpóson não autônomo no relatório descritivo presente significa um transpóson que é perdido uma transposase existiu dentro do transpóson e por isso não pode executar a sua transferência autônoma. O transpóson não autônomo pode transferir a DNA inserida entre sequências do transpóson do transpóson não autônomo no cromossomo de célula hospedeiro, permitindo uma proteína de transposase, um mRNA codificando da proteína de transposase ou um DNA codificando a proteína de transposase para apresentar simultaneamente na célula.

O gene de transposase significa um gene codificando uma transposase. Para melhorar a sua eficiência de expressão em uma célula de mamífero, uma sequência que ajusta um espaço entre a sequência de consenso do Kozak (Kozak M., Nucleic Acids Res., 12, 857 - 872 (1984)) ou uma ribossoma ligam a sequência, a sequência de Brilho-Dalgarno e o códon de iniciação, a uma distância apropriada (por exemplo, do 6 a 18 bases) pode ser conectado a um à montante sítio do códon de iniciação de tradução ATG do gene.

De acordo com o método da invenção, para integrar um fragmento genético compreendendo um DNA codificando a proteína de interesse e um gene marcador selecionável em um vetor de expressão no cromossomo de uma célula hospedeira, um vetor de expressão compreendendo o fragmento genético compreendendo um DNA codificando a proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências do transpóson em

18/39 ambas extremidades do fragmento genético é introduzido na célula hospedeira, e uma transposase é permitido para agir de acordo com as sequências do transpóson compreendidas no vetor de expressão que é introduzido na célula.

Para permitir uma transposase para agir de acordo com as sequências do transpóson compreendeu no vetor de expressão que é introduzido na célula, a transposase pode ser injetado na célula, ou vetor de expressão compreendendo um DNA codificando a transposase pode ser introduzido na célula hospedeira em conjunto com um vetor de expressão compreendendo um DNA codificando a proteína de interesse e um gene marcador selecionável. Além disso, introduzindo um RNA codificando um gene de transposase na célula hospedeira, a transposase pode ser expressado na célula.

O vetor de expressão não é particularmente limitado. Qualquer vetor de expressão pode ser usado selecionando opcionalmente dos vetores de expressão conhecidos àqueles versado na técnica, dependendo de uma célula hospedeira na qual um vetor de expressão compreendendo um gene de transposase é introduzido; o uso; e assim por diante.

Para que uma proteína constituída de dois ou mais polipeptídeos seja produzida pelo método da invenção, a DNA pode estar integrada no cromossomo da célula integrando um DNA codificando os dois ou mais polipeptídeos nos mesmos vetores de expressão ou diferentes e depois introduz os vetores de expressão em uma célula hospedeira.

A transposase pode ser inserido em um vetor de expressão para expressar em conjunto com a proteína de interesse ou pode ser inserido em um vetor diferente do vetor de expressão. A transposase pode ser permitido para atuar transitoriamente ou pode ser permitiu para atuar continuamente, mas deve permitir preferivelmente a transposase para atuar transitoriamente para preparar uma célula para a produção estável.

Como o método para permitir a transposase para atuar transitoriamente, os exemplos incluem um método compreendendo preparação de um vetor de expressão compreendendo um DNA codificando a transposase

19/39 e um vetor de expressão compreendendo um DNA codificando uma proteína de interesse e depois introduz ambos dos plasmídios de expressão simultaneamente em uma célula hospedeira.

O termo vetor de expressão no relatório descritivo presente significa um vetor de expressão a ser usado para introduzir uma célula de mamífero para expressar uma proteína de interesse. O vetor de expressão usado na invenção tem uma estrutura na qual pelo menos um par de sequências do transpóson está presente a ambos os lados de um cassete de expressão.

O termo de expressão de cassete no relatório descritivo presente significa uma sequência de nucleotídeo que tem uma região de controle de expressão genética necessária para expressar uma proteína de interesse e uma sequência codificando a proteína de interesse. Os exemplos da região de controle de expressão genética incluem um melhorador, um promotor, e um terminador. o cassete de expressão pode conter um gene marcador selecionável.

Qualquer promotor pode ser usado, contanto que ele possa funcionar em uma células animais. Os exemplos incluem um promotor disto É (imediato primeiro) o gene de citomegalovirus (CMV), S V40 primeiro promotor, um promotor de retrovírus, um promotor de metalotioneína, um promotor de choque de calor, SR um promotor, vírus de leucemia de murina de moloney, um melhorador e assim por diante. Também, o melhorador do ISTO É gene de CMV humano pode ser usado em conjunto com o promotor.

O gene marcador selecionável significa outro gene marcador arbitrário que pode ser usado para distinguir uma célula à qual um vetor de plasmídio é introduzido de uma falta de célula do vetor.

Os exemplos do gene marcador selecionável incluem um gene de resistência a medicamentos (um gene de resistência de neomicina, um gene DHFR, um gene de resistência de puromicina, um gene de resistência de blasticidina, um gene de resistência de higromicina, e um gene de resistência à ciclo-heximida (No.262879/2002)), fluorescência e genes de marcador de biolumínescência (tais como proteína fluorescente verde GFP) e as20/39 sim por diante.

Na invenção, o marcador selecionável preferível é um gene de resistência a medicamentos e o marcador selecionável particularmente preferível é um gene de resistência à ciclo-heximida. Além disso, executando uma modificação genética do gene marcador selecionável, o desempenho de resistência a medicamentos e o desempenho de luminescência da proteína de marcador selecionável também podem ser modificados.

A ciclo-heximida (daqui por diante às vezes se referem como CFIX) é um inibidor de síntese de proteína, e como todos os exemplos do uso do gene de resistência CHX como um gene marcador selecionável, os casos da levedura (Kondo K. J. Bacteriol, 177, 24, 7171 - 7177 (1995)) e células dos animais (Pedido Publicado de Patente Japonesa Não Examinado No. 262879/2002) são conhecidos.

Em caso das células dos animais, considerou-se que a resistência à ciclo-heximida é fornecida por um transformante que expressa uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 7 de Listagem de Sequência em que a prolina em posição 54 em subunidade de proteína ribossômica humana L36a codificado pela sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 5 da Listagem de Sequência são substituídas com a glutamina.

O método para introduzir o vetor de expressão da proteína supracitada compreendendo uma sequência do transpóson, uma transposase que expressa vetor de plasmídio e RNA não é particularmente limitado. Os exemplos incluem a transfecção de fosfato de cálcio, a eletroporação, um método de lipossoma, um método de arma genética, a lipofecção e similares.

Os exemplos do método para introduzir diretamente uma transposase na forma de uma proteína incluem a microinjeção ou a endocitose para fornecer em uma célula. A transferência genética pode ser executada pelo método descrito no Manual de Shin Idenshi Kogaku (Novo Manual de Engenharia Genético), editado por Masami Muramatsu e Tadashi Yamamoto, publicado porYodo-sha, ISBN 9784897063737.

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A célula hospedeira pode ser qualquer célula de mamífero enquanto puder ser subcultivada e de maneira estável expressar uma proteína de interesse. Os exemplos da célula hospedeira incluem célula PER C6, célula de leucemia humana, célula de Namalwa, célula de macaco, célula de COS, célula de mieloma de rato, YB2/3HL.P2. G11.16Ag.20 (também referida como YB2/0), célula de mieloma de rato NSO, célula de mieloma de rato SP2/0-Agl4, célula de hamster síria ΒΗΚ, HBT5637 (a Publicação n° 1998000299 de Pedido de Patente Japonesa Não Examinada), célula ovariana de hamster chinês, célula CHO (Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Set USA., 601275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Set, 60,1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Apêndice IJI (páginas 883-900)), CHO/DG44, CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUKXB11 (ATCC CCL-9096), pro5 (ATCC CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, Cat #11619), Pro-3 e subcepa de célula CHO.

Além disso, a célula hospedeira supracitada também pode ser usada no método de produção de proteína da invenção modificando-a para ser adequada para a produção de proteína, por modificação do DNA cromossômico, introdução de um gene exógeno, e similares.

Também, para controlar a estrutura da cadeia de açúcar ligada a uma proteína de interesse para ser produzida, a Lecl3 que adquiriu a resistência de lecitina [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55 (1986)] e célula CHO da qual um gene 1,6-fucosiltransferase é eliminado (WO2005/35586, W02002/31140) também pode ser usada como a célula hospedeira.

A proteína de interesse pode ser qualquer proteína contanto que possa ser expressada pelo método da invenção. Especificamente, os exemplos incluem uma proteína do soro humano, um hormônio de peptídeo, um fator de crescimento, uma citocina, um fator de coagulação sanguínea, uma proteína do sistema de fibrinólise, um anticorpo e os fragmentos parciais, e assim por diante.

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Os exemplos preferíveis da proteína de interesse incluem um anticorpo monoclona 1,tal como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano; proteína de fusão Fc; e proteína ligada à albumina; e um fragmento das mesmas.

Uma atividade efetora de um anticorpo monoclonal obtido pelo método da presente invenção pode ser controlada por vários métodos. Por exemplo, os métodos conhecidos são um método para controlar uma quantidade de fucose (daqui por diante, mencionado também como fucose principal) que é a N-acetilglicosamina amarrada (GlcNAc) através da ligação a1,6 em uma extremidade redutora de um tipo complexo de cadeia de açúcar ligada ao N que é ligada à asparagina (Asn) na posição 297 de uma região Fc de um anticorpo (W02005/035586, W02002/31140, e WOOO/61739), um método para controlar uma atividade efetora de um anticorpo monoclonal modificando o grupo de aminoácidos de uma região Fc do anticorpo, e assim por diante. A atividade efetora do anticorpo monoclonal produzido pelo método da presente invenção pode ser controlada pela utilização algum dos métodos.

A atividade efetora significa uma atividade dependente do anticorpo que é induzida via uma região Fc de um anticorpo. Como a atividade efetora, uma citotoxicidade celular dependente do anticorpo (atividade de ADCC), uma citotoxicidade dependente do complemento (atividade de CDC), uma fagocitose dependente do anticorpo (atividade de ADP) por células fagocíticas, tais como macrofagos ou células dendríticas, e assemelhados, é conhecida.

Além disso, controlando um teor de fucose principal de um tipo complexo a cadeia de açúcar ligada ao N da região Fc de um anticorpo monoclona 1, uma atividade efetora do anticorpo pode ser aumentada ou reduzida.

Como um método para reduzir um teor de fucose que está ligado a um tipo complexo de cadeia de açúcar ligada ao N ligada ao Fc do anticorpo, um anticorpo ao qual a fucose não está ligada pode ser obtida pela expressão de um anticorpo usando uma célula CHO que é deficiente em um

23/39 gene codificando a 1,6-fucosiltransferase. O anticorpo ao qual a fucose não está ligada tem uma alta atividade ADCC.

Por outro lado, como um método para aumentar um teor de fucose que está ligado a um tipo complexo cadeia de açúcar ligada ao N ligada a Fc de um anticorpo, um anticorpo ao qual a fucose está ligada pode ser obtido pela expressão de um anticorpo usando uma célula hospedeira na qual um gene codificando a 1,6-fucosiltransferase é introduzido. O anticorpo ao qual a fucose está ligada tem uma atividade mais baixa de ADCC do que o anticorpo ao qual a fucose não está ligada.

Além disso, modificando resíduos de aminoácidos em uma região Fc de um anticorpo, a atividade ADCC ou a atividade CDC podem ser aumentadas ou reduzidas. Por exemplo, a atividade CDC de um anticorpo pode ser aumentada utilizando a sequência de aminoácidos da região Fc descrita na US2007/0148165.

Além disso, a atividade ADCC ou a atividade CDC de um anticorpo podem ser aumentadas ou reduzidas modificando o aminoácido como descrito nas Patentes dos Estados Unidos n° 6.737.056, ou 7.297.775 ou 7.317.091.

O termo suspensão de células de mamíferos na presente invenção significa uma célula que não adere a uma ancoragem de cultura de células revestida para facilitar a adesão de células de cultura, tais como microesferas, um reservatório de cultura para cultura de tecido (também referida como uma cultura de tecido ou reservatório de cultura de adesão e assemelhados) e assemelhados, e pode sobreviver e crescer como suspensão no líquido de cultura.

Quando a célula não adere ao ancoradouro de cultura de células, pode sobreviver e cultivar sob um estado de uma célula única no líquido de cultura ou sobreviver e cultivar sob um estado de uma massa de células formada pela aglutinação de duas ou mais células.

Além disso, como a suspensão de células de mamíferos a ser usada na presente invenção, uma célula que pode sobreviver e crescer em um meio livre de soro que não contendo soro a bezerro fetal (daqui por dian

24/39 te referido como FCS) e assemelhados, suspendendo no líquido de cultura sem aderir ao ancoradouro de cultura de células, é preferível, e uma célula de mamífero que pode sobreviver e crescer suspensa em um meio livre de proteína que não contém proteína é mais preferível.

Como reservatório de cultura para cultura de tecido, pode ser qualquer reservatório de cultura, tal como um frasco, uma placa de Petri e assemelhados, contanto que o revestimento da cultura de adesão seja aplicado ao mesmo. Especificamente, por exemplo, se é ou não uma suspensão de células de mamíferos pode ser confirmado pelo uso de frascso de cultura de tecido comercialmente disponíveis (produzido pela Greiner), frasco de cultura de adesão (produzido pela Sumitomo Bakelite) e assim por diante.

Como a suspensão de células de mamíferos a ser usada na presente invenção, ela pode ser uma célula preparada pela adaptação adicional de uma célula originalmente possuindo uma propriedade de suspensão em cultura em suspensão ou uma suspensão de células de mamíferos preparada adaptando um adesivo de célula de mamífero às condições de cultura em suspensão.

Os exemplos da célula originalmente possuindo uma propriedade de suspensão incluem célula PER.C6, uma célula de mieloma de rato YB2/3HL.P2. G11.16Ag.20 (ou também chamado YB2/0), célula CHO-S (produzida pela Invitrogen) e assim por diante.

A suspensão de células de mamíferos acima mencionada preparada adaptando um adesivo de mamífero a célula às condições de cultura em suspensão pode ser preparada pelo método descrito em Mol. Biotechnol, 2000, 15 (3), 249 - 57 ou pelo método mostrado a seguir, e pode ser preparada estabelecendo uma célula que mostra a propriedade de proliferação e a propriedade de sobrevivência semelhante àquelas antes da adaptação de cultura em suspensão ou superior àquelas antes de adaptar-se à cultura em suspensão (J. Biotechnol, 2007, 130 (3), 282-90).

O termo semelhante àquelas antes da adaptação de cultura em suspensão significa que a razão de sobrevivência, taxa de proliferação (dobro do tempo) e assemelhados da célula adaptada à cultura em suspensão é

25/39 substancialmente as mesmas daquelas da célula antes de serem adaptadas à cultura em suspensão.

Os exemplos do método para adaptar um adesivo de célula de mamífero às condições de cultura em suspensão de acordo com a presente invenção incluem o seguinte método. O teor de soro de um meio de soro contendo é reduzido a 1/10 e o subcultivo é repetido no momento da relativamente alta concentração da célula. Quando a célula de mamífero se torna capaz de sobreviver e proliferar, o teor de soro é também reduzido e o subcultivo é repetido. Por este método, uma suspensão de células de mamíferos que pode sobreviver e proliferar sob condições livres de soro pode ser preparada.

Além disso, uma suspensão de células de mamíferos também pode ser preparada por um método compreendendo o cultivo com a adição de um tensoativo não iônico apropriado tal como Plurônico-F68 ou assemelhados no líquido de cultura.

Os exemplos do adesivo de célula de mamífero que adquire a propriedade de suspensão adaptando-se a uma condição de cultura em suspensão incluem uma célula de mieloma de rato NSO, célula CHO e assim por diante.

Na presente invenção, como uma propriedade possuída pela suspensão de células de mamíferos, quando 2 x 10⁵ células/ml da célula é cultivado pela suspensão, a concentração de célula após o cultivo durante 3 ou 4 dias é preferivelmente 5 x 10⁵ células/ml ou mais, mais preferivelmente 8 x 10⁵ células/ml ou mais, particularmente preferivelmente 1 x 10⁶ células/ml ou mais, o mais preferivelmente 1,5 x 10⁶ células/ml ou mais.

Além disso, dobrar o tempo da suspensão de células de mamíferos da presente invenção é preferivelmente 48 horas ou menos, mais preferivelmente 24 horas ou menos, particularmente preferivelmente 18 horas ou menos, o mais preferivelmente 11 horas ou menos.

Os exemplos do meio do cultivo de suspensão incluem o meio comercialmente disponível, tal como meio de CD-CHO (produzido pela Invitrogen), meio de EX-CELL 325-PF (produzido pela SAFC Biosciences), meio

26/39 de SFM4CHO (produzido pela HyClone) e assim por diante. Além disso, também pode ser obtido misturando sacarídios, amina e ácidos assemelhados que são necessários para o cultivo de células de mamífero.

A suspensão de células de mamíferos pode ser cultivada utilizando um reservatório de cultura que pode ser usado para o cultivo de suspensão sob uma condição de cultura capaz do cultivo de suspensão. Os exemplos do reservatório de cultura incluem uma placa de 96 poços da cultura de células (produzida pela Corning), um frasco T (produzido pela Becton Dickinson), um frasco Erlenmeyer (produzido pela Corning) e similares.

Em relação às condições de cultura, por exemplo, pode ser estaticamente cultivado em uma atmosfera de CO₂ a 5% em uma temperatura de cultura de 37°C. Um equipamento de cultura com agitação, tal como equipamento de cultivo da cultura para uso exclusivo em suspensão, um Biorreator de Onda (produzido pela GE Healthcare Bioscience), também pode ser usado.

Em relação às condições de cultura em suspensão de uma suspensão de células de mamíferos usando o equipamento Biorreator de Onda, a célula pode ser cultivada pelo método descrito na homepage da GE Healthcare Bioscience <http.//www.qelifesciences.co.jp/tech>support/manual/pdf/cellcult/wave-03-16.pdf.

Além da cultura com agitação, cultivo por um equipamento de agitação por rotação, tal como um biorreator, também pode ser usado. O cultivo usando um biorreator pode ser executado pelo método descrito em Cytotechnology, (2006) 52: 199 - 207, e similares.

Na presente invenção, quando uma linhagem celular diferente das suspensões de células de mamíferos é usada, qualquer linhagem celular pode ser usada contanto que seja uma linhagem celular de mamífero adaptada à cultura em suspensão pelo método supracitado e seja uma linhagem celular que possa ser usada no método de produção de proteínas da presente invenção.

A purificação da proteína de interesse produzida pela suspensão de células de mamíferos é executada separando a proteína de interesse da

27/39 impureza diferente da proteína de interesse em um líquido de cultura ou homogenato de células contendo a proteína de interesse. Os exemplos do método de separação incluem a centrifugação, a diálise, a precipitação com sulfato de amônio, a cromatografia de coluna, um filtro e assim por diante. A separação pode ser executada baseada na diferença em propriedades fisicoquímicas da proteína de interesse e das impurezas e está baseada na diferença na suas afinidades para o transportador da coluna.

O método para purificar a proteína de interesse pode ser executado, por exemplo, pelo método descrito em Protein Experimentation Note (o primeiro volume) - Extraction, Separation and Expression of Recombinant Protein (tradução de um manual escrito em japonês) (editado por Masato Okada e Kaori Miyazaki, publicado por Yodo-sha, ISBN 9784897069180).

Os teores inteiros das referências, tais como os documentos científicos, patentes, pedidos de patentes citados aqui são incorporados aqui no mesmo grau daqueles ilustrativamente descritos, respectivamente.

A presente invenção foi descrita anteriormente mostrando modalidades preferidas da mesma para facilidade de compreensão. Daqui por diante, a presente invenção será também descrita especificamente baseado em exemplos, mas as explicações supracitadas e os seguintes exemplos são fornecidos simplesmente com objetivos de exemplificações e não fornecidos com o propósito de limitarem a invenção. Consequentemente, o alcance da invenção não está limitado às modalidades e exemplos que são especificamente descritos aqui, mas está limitado somente pelas reivindicações.

Várias técnicas experimentais que se relacionam com recombinação genética descrita daqui por diante, tais como a clonagem e assemelhados foram executadas de acordo com as técnicas de engenharia genéticas descritas na 2^a edição de Molecular Cloning editada por J. Sambrook, E. F. Frisch e T. Maniatis, Current Protocols in Molecular Biology editado por Frederick M Ausubel et al, publicado por Current Protocols, e assim por diante.

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EXEMPLOS

EXEMPLO 1 Preparação do vetor de transpóson para expressar o anticorpo anti-humano M2 da influenza

Um plasmídio que contém um cassete de expressão genética de células de mamífero compreendendo um gene de anticorpo humano arbitrai e um gene marcador de resistência a medicamentos inserido entre um par de sequências do transpóson Tol2 foi usada como um vetor de plasmídio da expressão de proteína.

Cada DNA dos genes usados foi quimicamente e artificialmente sintetizado baseado em uma sequência de nucleotídeo conhecida ou obtida preparando iniciadores para as suas sequências em ambas as terminações executando PCR usando uma fonte de DNA apropriada como um padrão. Para executar a manipulação genética depois, um sítio de restrição de uma enzima de restrição foi acrescentado na terminação do iniciador.

Entre as sequências de nucleotídeos do transpóson Tol2 não autônomo divulgado no Pedido Publicado de Patente Japonesa Não Examinado No. 235575/2003 (SEQ ID N°: 1), na sequência de nucleotídeos nas posições de 1 a 200 (sequência de Tol2-L) (SEQ ID N°: 2) e na sequência de nucleotídeos nas posições 2285 a 2788 (sequência de Tol2-R) (SEQ ID N°: 3) foram usados como as sequências do transpóson.

Cada um dos fragmentos de DNA sintético compreendendo um par de sequências do transpóson (produzido pela TAKARA BIO INC) foi preparado pelo seguinte método. Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo na qual uma sequência de reconhecimento de uma enzima de restrição Nru\ ligada a ambas as terminação 5' e terminação 3' da sequência Tol2-R foi preparada. Depois, foi preparado um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo na qual uma sequência de reconhecimento de uma enzima de restrição Fse\ foi ligada na terminação 5' da sequência Tol2-L e uma enzima de restrição Ascl foi ligada na terminação 3' da mesma.

Em seguida, os fragmentos de DNA assim preparados compre

29/39 endendo a sequência de Tol2-R e a sequência Tol2-L foram inseridos em um vetor de expressão vetor N5LG1-M2-Z3 (WO2006/061723) compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácidos Z3G1 do anticorpo M2 anti-humano da influenza.

O vetor N5LG1-M2-Z3 (W02006/061723) em que uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 8) codificando a cadeia H Z3G1 do anticorpo M2 anti-humano da influenza (Depósito de ATCC n° PTA-5968: depositado 13 de março de 2004, Coleção de Culturas do Tipo Americano, Manassas, VA, EUA) e uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 10 e SEQ ID N°: 11) codificando da cadeia L (SEQ ID N°: 9) do mesmo foram inseridos sob o controle do controle melhorador/promotor de CMV foi usado como um cassete de expressão genética de anticorpo.

O fragmento de DNA compreendendo a sequência Tol2-R foi inserido na enzima de restrição o sítio de Nru\ do vetor N5LG1-M2-Z3, no lado da terminação 5' de um fragmento genético compreendendo o cassete de expressão genética do anticorpo e um gene marcador da resistência. Depois, o fragmento de DNA compreendendo a sequência Tol2-L foi inserido nos sítios de enzima de restrição Fse\ e Ascl no lado da terminação 3'.

Além disso, um vetor de transpóson para expressar um anticorpo M2 anti-humano da influenza foi construído (figura 1) inserindo um cassete de expressão genética de resistência à ciclo-heximida conectado com uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 5) codificando um gene de resistência à ciclo-heximida (um gene em que a prolina na posição 54 da proteína ribossômica humana L36a foi substituído pela glutamina) no sítio de reconhecimento Fsel do vetor N5LG1-M2-Z3 conectado com a sequência do transpóson Tol2, sob o controle do melhorador/promotor CMV.

Por outro lado, um vetor que não contêm nenhuma sequência do transpóson foi denominado vetor de expressão do anticorpo M2 anti-humano da influenza e usado como o vetor de controle (figura 2).

EXEMPLO 2

Preparação de vetor de expressão de transposase.

A transposase foi expressada usando um vetor de expressão in

30/39 dependente do vetor de expressão do anticorpo de interesse. Isto é, um gene que está codificando uma transposase Tol2 derivada de um peixe madaka (SEQ ID N°: 4) foi inserido à jusante do promotor CAGGS de um vetor pCAGGS (Gene, 108, 193 - 200, 1991) e usado como o vetor de expressão (figura 3).

EXEMPLO 3 (1) Preparação de suspensão de célula CHO.

Um adesivo a célula CHO que tinha sido utilizada cultivada um meio α-MEM (produzido pela Invitrogen) contendo soro a 10% (FCS) foi desgrudado e recuperado por um tratamento com tripsina e cultivado sob agitação em 37°C em uma incubadora de CO₂ a 5% usando meio a-MEM fresco contendo FCS a 10%. Vários dias depois disso, o crescimento destas células foi confirmado e a cultura com agitação depois foi executada pela sementeira eles em um meio de α-MEM contendo FCS a 5% no momento de uma concentração de 2 x 10⁵ células/ml.

Também vários dias depois disso, a inoculação foi do mesmo modo executada usando o meio α-MEM contém FCS a 5%. Finalmente, uma célula adaptada à cultura em suspensão foi preparado repetindo que a subcultura e cultura sob agitação usando o meio α-MEM livre de soro e confirmando que as células têm a mesma capacidade de crescimento do caso do seu cultivo na presença do soro.

(2) Preparação da célula CHO produtora de anticorpo.

O vetor de transpóson para expressar o anticorpo anti-humano M2 da influenza preparado nos Exemplo 1 e Exemplo 2 (daqui por diante referido como o vetor de transpóson) e vetor de expressão de transposase Tol2 pCAGGS-T2TP (figura 3, Kawakami K. & Noda T., Genetics, 166, 895 899 (2004)) foram usados como os vetores de expressão. Além disso, o vetor de expressão do anticorpo anti-humano M2 da influenza não possuindo nenhuma sequência do transpóson foi usado como o controle.

Através da introdução dos vetores de expressão acima mencionados na suspensão de célula CHO-K1 adaptada à cultura (Coleção de Culturas do Tipo Americano Cat. N° CCL-61) ou de célula HEK293 (célula Fre

31/39 eStyle 293F, produzida por Invitrogen), foram comparadas as frequências de obtenção de clones resistentes à ciclo-heximida.

Cada um das células (4 x 10⁶ células) foi suspensa em 400 pl de PBS, e o vetor de transpóson para expressar a influenza anti-humano o anticorpo M2 (10 p, g) e vetor de expressão de transposase Tol2 (25 pg) foi cotransfectado diretamente na forma de DNA circular por eletroporação. Nesta conexão, para expressar a transposase Tol2 transitoriamente, o vetor de expressão de transposase Tol2 foi diretamente introduzido na forma do DNA circular com o objetivo de impedir da integrateína no cromossomo hospedeiro.

Além disso, como o controle, o vetor de expressão do anticorpo anti-humano M2 da influenza (10 pg) foi linearizado por uma enzima de restrição e depois introduzido em cada uma das células, de acordo com o método de transferência genética padrão por eletroporação.

A eletroporação foi executada usando uma cubeta de 4 mm na largura de fenda (produzido pela Bio-Rad), usando um eletroporador (Gene Pulser Xcell System (produzido pela Bio-Rad)) sob condições de 300 V de voltagem, 500 pF de capacidade eletrostática e temperatura ambiente.

Após a transfecção pela eletroporação, cada célula foi semeada em três microplacas de 96 poços e cultivadas em uma incubadora com COntendo CO₂ durante 3 dias usando o meio EX-CELL 325-PF produzido pela SAFC Biosciences para a célula CHO, e o meio FreeStyle-293 (produzido pela Invitrogen) para a célula HEK293.

Em seguida, a partir do dia da troca do meio no 4^o dia da transfecção, 3 pg/ml de ciclo-heximida foram acrescentados ao meio para que as células fossem cultivadas na presença da ciclo-heximida, seguido do cultivo durante 3 semanas executando a troca de meio em cada semana.

Após o cultivo durante 3 semanas, foi contado o número de poços nos quais as colônias resistentes à ciclo-heximida foram encontradas. Os resultados são mostrados na Tabela 1 e na Tabela 2.

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Tabela 1

Comparação dos números de células resistentes à ciclo-heximida (célula

CHO)

	Vetor transpóson	Vetor convencional
Teste 1	155/288	0/288
Teste 2	100/288	0/288
Teste 3	94/288	0/288

Tabela 2.

Comparação dos números de células resistentes à ciclo-heximida (célula

HEK293)

	Vetor transpóson	Vetor convencional
Teste 1	0/288	0/288
Teste 2	0/288	0/288
Teste 3	0/288	0/288

Como mostrado na Tabela 1, cada um vetor transpóson de expressão de anticorpo M2 anti-humano da influenza ou vetor de expressão de anticorpo M2 anti-humano da influenza foi introduzido na suspensão de células CHO-K1. Como resultado, os transformantes resistentes a ciclohexamida não foram obtidos da célula introduzida com o vetor de expressão do anticorpo anti-humano M2 da influenza como o caso de outras linhas celulares, mas os transformantes resistentes à ciclo-heximida foram obtidos da célula introduzida com o vetor de transpóson para expressar o anticorpo anti-humano M2 da influenza com uma alta frequência.

Por outro lado, como mostrado na Tabela 2, os transformantes resistentes à ciclo-heximida não foram obtidos quando qualquer um dos vetores de transpóson para expressar o anticorpo anti-humano M2 da influenza e o vetor de expressão do anticorpo anti-humano M2 da influenza foram introduzidos na célula HEK293.

Baseado nestes resultados considerou-se que o gene desejado codificado pela proteína e o gene de resistência à ciclo-heximida que foram inseridos entre um par de sequências do transpóson são eficientemente introduzidos no cromossomo da célula hospedeira, nominalmente uma suspensão de células de mamíferos.

33/39 (3) Exame da produção de anticorpos por uma suspensão de células CHO e um adesivo de células CHO

Para examinar a eficiência de produção de anticorpo por uma suspensão de célula CHO ou um adesivo da célula CHO, as quantidades de anticorpos produzidos pelas respectivas linhagens celulares foram examinadas. Como a suspensão de célula CHO, a suspensão a célula CHO-KL adaptada à cultura em suspensão foi usada. Além disso, como adesivo de célula CHO, o adesivo de célula CHO-KL antes que a adaptação à cultura em suspensão fosse usada.

O vetor transpóson de expressão de anticorpo M2 anti-humano da influenza (10 pg) e o vetor de expressão da transposase Tol2 (25 pg) foi introduzido na suspensão de célula CHO-KL e no adesivo de célula CHO-KL por meio da eletroporação, respectivamente. Depois disso, a suspensão de célula CHO-KL e o adesivo de célula CHO-KL foram semeados em três placas de 96 poços para cada célula.

Um meio de células de suspensão (EX-CELL 325-PF, produzido pela SAFC Biosciences) foi usado para a suspensão de célula CHO-KL, e o meio α-MEM contendo o soro a 10% foi usado para o adesivo de célula CHO-KL. Cada célula foi cultivada em uma incubadora com CO₂ durante 3 dias. Do dia da troca de meio no 4^o dia da transfecção, 3 ug/ml da cicloheximida foram acrescentados ao meio para que as células fossem cultivadas na presença da ciclo-heximida e as células foram adicionalmente cultivadas durante 3 semanas. Neste caso, a troca de meio foi executada a cada semana.

Para a suspensão de célula CHO-KL, 1 x 10⁶ das células foram semeadas em uma microplaca de 6 poços e cultivadas sob agitação em uma incubadora com CO₂ durante 3 dias, e a quantidade da proteína de anticorpo M2 anti-humano da influenza foi medida por HPLC usando o sobrenadante de cultura.

Para o adesivo de célula CHO-KL, a troca de meio foi executada quando a célula atingiu o confluente em uma microplaca de 6 poços (2 x 10⁶células), e 3 dias após cultura estática, a quantidade da proteína de anticor34/39 po foi medida por HPLC usando o sobrenadante de cultura.

A concentração de anticorpo no sobrenadante de cultura foi medida de acordo com o método descrito em Yeast Res., 1 (2007), 1307 1316. Os resultados são mostrados nas figura 4A e figura 4B.

Como mostrado em figura 4 A, um grande número de células mostrando um nível de expressão de anticorpo marcadamente alto foi obtido quando a célula CHO-K1 adaptada à cultura em suspensão foi usada. Por outro lado, como mostrado na figura 4B, só as células mostrando um nível de expressão do limite de detecção HPLC (5 pg/ml) ou menos foi obtido quando o adesivo de célula CHO-K1 foi usado.

Baseado nestes resultados, considerou-se que, para a expressão de uma proteína de interesse usando um vetor transpóson, a proteína de interesse pode ser expressada em um alto nível quando uma suspensão de células de mamíferos é usada.

Além disso, foi encontrado dos resultados dos Exemplos de 1 a 3 que o método da invenção pode ser usado como um método novo para produzir uma proteína de interesse, preparando eficientemente uma célula de produção que pode altamente expressar um gene exógeno usando uma suspensão de células de mamíferos adaptada à cultura em suspensão. Exemplo 4.

Preparação do vetor transpóson Tol1 para expressar o anticorpo antihumano M2 da influenza

Da mesma maneira que no Exemplo 1, um plasmídio que contém um cassete de expressão genética de células de mamífero, compreendendo um gene de anticorpo humano arbitrai e um gene marcador de resistência a medicamentos inserido entre um caminho de sequências do transpóson de Tol1, foi usada como um vetor de plasmídio de expressão de proteína.

Cada DNA dos genes usados foi quimicamente sintetizado artificialmente baseado na informação sobre sequência conhecida ou obtido preparando os iniciadores das suas sequências tanto terminais como executando PCR usando uma fonte de DNA apropriada como o padrão. Para a mani

35/39 pulação genética a ser executada depois, um sítio clivado por uma enzima de restrição foi acrescentado na extremidade final do iniciador.

Entre a sequência de nucleotídeo de transpóson Tol1 não autônoma mostrada na SEQ ID N°: 13 de Listagem de Sequência (W02008/072540), a sequência de nucleotídeo nas posições de 1 a 200 (sequência Tol1-L) (SEQ ID N°: 14) e a sequência de nucleotídeo nas posições de 1351 a 1855 (sequência Tol1-R) (SEQ ID N°: 15) foram usadas como as sequências do transpóson.

Cada um dos fragmentos de DNA sintéticos compreendendo cada um, um par de sequências do transpóson foi preparado pelo método seguinte. Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo na qual uma sequência de reconhecimento de uma enzima de restrição Nru\ foi conectado a ambas terminação 5' e terminação 3' da sequência do ToU-R. Depois, um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo na qual uma sequência de reconhecimento de uma enzima de restrição Fsel foi conectado na terminação 5' da sequência Tol1-L e uma enzima de restrição Ascl foi conectado na terminação 3' das mesmas.

Em seguida, os fragmentos de DNA assim preparados compreendendo a sequência Tol1-R e a sequência Tol1-L foram inseridos no vetor de expressão vetor N5LG1-M2-Z3. O fragmento de DNA compreendendo a sequência Tol1-R foi inserido na enzima de restrição o sítio de Nru\ do vetor theN5LGI-M2-Z3, existente no lado da terminação 5' de um fragmento genético compreendendo o cassete de expressão genética de anticorpo e um gene marcador de resistência, e o fragmento de DNA compreendendo o Tol1-L sequência foi inserido na enzima de restrição Fsel e sítios Ascl existentes no lado da terminação 3'.

Além disso, o vetor transpóson Tol1 para expressar um anticorpo M2 anti-humano da influenza foi construído (figura 5) inserindo um cassete de expressão genética de resistência à ciclo-heximida conectou-se com um gene de resistência da ciclo-heximida (um gene em que a prolina na posição 54 na proteína ribossômica humana L36a foi transformado à glutamina) no sítio de reconhecimento Fsel do vetor N5LG1-M2-Z3 conectado com

36/39 a sequência do transpóson Tol12, sob o controle do melhorador/promotor CMV.

Exemplo 5 Preparação de vetor de expressão de transposase Tol1.

A transposase foi expressada usando um vetor de expressão independente do vetor de expressão do anticorpo de interesse. Isto é, um cassete de expressão genética de transposase Tol1 conectado com um fragmento de DNA codificando a transposase Tol1 derivada de um peixe madaka, contendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°: 16 da Listagem de Sequência, foi inserido em um pBluescriptll SK (+) (produzido pela Stratagene) sob o controle do melhorador/promotor CMV e usado como o vetor de expressão pTolIase da (figura 6).

Exemplo 6 (1) Preparação da célula CHO produtora de anticorpo

O vetor transpóson Tol1 para expressar o anticorpo anti-humano M2 da influenza (daqui por diante referido como o vetor transpóson Tol1) e vetor de expressão de transposase Tol1 pTolIase de Exemplo 4 e Exemplo 5 foi usado como os vetores de expressão. Além disso, a célula CHO-K1 preparada adaptando-se à cultura em suspensão na mesma maneira que no Exemplo 3 (1) foi usada como a célula.

Os vetores de expressão acima mencionados foram introduzidos na célula CHO-K1 adaptada à cultura em suspensão, e a frequência de obter clones resistentes à ciclo-heximida foi medida. A célula CHO-K1 adaptada à cultura em suspensão (4 x 10⁶ células) foi suspensa em 400 pl de PBS, e o vetor transpóson Tol1 para expressar a influenza anti-humano o anticorpo M2 (10 pg) e vetor de expressão de transposase Tol1 (50 entalhe) foi cotransfectado diretamente na forma da DNA circular pela eletroporação. Para efetuar a expressão passageira da transposase Tol1, o vetor de expressão de transposase Tol1 foi diretamente introduzido na forma da DNA circular com o objetivo de impedir integrar-se no cromossomo hospedeiro.

A eletroporação foi executada usando uma cubeta de 4 mm na largura de fenda (produzido pela Bio-Rad), usam um eletroporador (Gene

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Pulser Xcell System (produzido pela Bio-Rad)) sob condições de 300 V na voltagem, 500 em capacidade eletrostática e temperatura ambiente.

Após a transfecção pela eletroporação, cada célula foi semeada em duas placas de 96 poços e cultivado em uma incubadora com CO₂ durante 3 dias usam o meio de EX-CELL 325-PF (produzido pela SAFC Biosciences) para a célula CHO. Em seguida, do dia da troca de meio no 4o dia da transfecção, 3 pg/ml da ciclo-heximida foram acrescentados ao meio para que as células fossem cultivadas na presença da ciclo-heximida, seguida do cultivo durante 3 semanas executando a troca de meio cada semana.

Após o cultivo durante 3 semanas, o número de poços nos quais as colônias resistentes à ciclo-heximida foram encontradas foi contado. Os resultados são mostrados na Tabela 3. Cada um dos testes de 1 a 3 na Tabela 3 mostra que um resultado da realização do gene transfere três vezes.

Tabela 3

Vetor transpóson Tol1.

	Vetor transpóson Tol1
Testes 1	133/192
Testes 2	67/192
Testes 3	122/192

Como mostrado na Tabela 3, quando o vetor transpóson Tol1 para expressar a influenza anti-humano o anticorpo M2 foi introduzido na suspensão de célula CHO-K1, resistente à ciclo-heximida transformante foram obtidos em uma alta frequência do mesmo modo ao Exemplo 3 no qual o vetor transpóson Tol2 para expressar a influenza anti-humano o anticorpo M2 foi introduzido.

Foi encontrado baseado nestes resultados que o gene de anticorpo e o gene de resistência à ciclo-heximida inserido entre um par de sequências do transpóson são eficientemente transformados no cromossomo da célula hospedeira, nominalmente a suspensão de células de mamíferos, em caso da utilização o transpóson Tol1, também.

(2) Exame em produção de anticorpo por suspensão de célula CHO-K1

A eficiência de produção de anticorpo da suspensão de célula CHO-K1 foi examinada usando a suspensão de célula CHO-K1. O vetor

38/39 transpóson para expressar o anticorpo anti-humano M2 da influenza (10 pg) e vetor de expressão de transposase Tol1 (50 ug) foi introduzido por eletroporação na suspensão de célula CHO-K1 adaptada à cultura em suspensão.

Depois disso, as células foram semeadas em duas respectivas placas de 96 poços e cultivadas durante 3 dias em uma incubadora com CO₂usando o meio de cultura em suspensão EX-CELL 325-PF. Com troca de meio no 4^o dias após a eletroporação, as células foram cultivadas durante 3 semanas na presença de 3 pg/ml da ciclo-heximida. Neste caso, a troca de meio foi executada cada semana.

Para a suspensão de célula CHO-K1, 1 x 10⁶ das células foram semeadas em uma microplaca de 6 poços e cultivadas sob agitação em uma incubadora com CO₂ durante 3 dias, e a quantidade da proteína de anticorpo M2 anti-humano da influenza foi medida por HPLC usa o sobrenadante de cultura.

A concentração de anticorpo no sobrenadante de cultura foi medida de acordo com o método descrito em Yeast Res., 7 (2007), 1307 1316. Os resultados são mostrados em figura 7.

Como mostrado em figura 7, um grande número de células mostrando um nível de expressão de anticorpo marcadamente alto foi obtido também no caso do uso do transpóson Tol1. Deste resultado, considerou-se que semelhante ao caso do uso da sequência de nucleotídeo de derivado do transpóson Tol2, uma suspensão de células de mamíferos capaz de expressar grandemente a proteína de interesse também pode ser obtida quando uma sequência de nucleotídeo de derivado do transpóson Tol1 é usada como a sequência do transpóson.

Embora a invenção tenha sido descrita detalhadamente e com referência a modalidades específicas da mesma, será evidente para uma pessoa com habilidade na técnica que várias modificações e alterações podem ser feitas dentro da mesma sem fugir do espírito e alcance da mesma. O presente Pedido está baseado no Pedido Japonês n° 2009-140626, arquivado no dia 11 de junho de 2009, e no Pedido Provisório dos Estados Unidos n° 61/186,138, arquivado no dia 11 de junho de 2009, os teores inteiros

39/39 dos quais são incorporados aqui pela referência e todas as referências citadas aqui são incorporados na sua integridade.

Aplicabilidade Industrial

Pelo método para produzir a proteína da presente invenção, uma proteína de interesse pode ser eficientemente produzida usando uma suspensão de células de mamíferos. A célula da presente invenção pode ser usada como uma célula de produção de proteína para produzir uma proteína recombinante.

Listagem de Sequência de Texto Livre,

SEQ ID N°: 1 - Descrição de sequência Artificial; sequência de nucleotídeo de transpóson Tol2 não autônomo

SEQ ID N°: 2 - Descrição de sequência Artificial: sequência de Tol2-L

SEQ ID N°: 3 - Descrição de sequência Artificial: sequência de Tol2-R

SEQ ID N°: 7 - Descrição de sequência Artificial: sequência de nucleotídeo de gene de resistência à ciclo-heximida

SEQ ID N°: 8 - Descrição de sequência Artificial: a Sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene de resistência à ciclo-heximida

SEQ ID N°: 9 - Descrição de sequência Artificial: sequência de nucleotídeo codificando H cadeia de anticorpo M2Z3

SEQ ID N°: 10 - Descrição de sequência Artificial: sequência de nucleotídeo codificando H cadeia de anticorpo M2Z3

SEQ ID N°: 11 - Descrição de sequência Artificial: sequência de nucleotídeo codificando L cadeia de anticorpo M2Z3

SEQ ID N°: 12 - Descrição de sequência Artificial: Sequência de aminoácidos codificando L cadeia de anticorpo M2Z3

SEQ ID N°: 13 - Descrição de sequência Artificial: sequência de nucleotídeo de não-transpóson Tol1 autônomo

SEQ ID N°: 14 - Descrição de sequência Artificial.· Tol1-L sequência

SEQ ID N°: 15 - Descrição de sequência Artificial: Tol1-R sequência

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir uma proteína de interesse ou para obter uma suspensão de células de mamíferos capaz de produzir uma proteína de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende:

(I) a introdução de um vetor de expressão de proteína compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA que codifica uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências de transposon em ambas as extremidades do fragmento genético, em uma suspensão de células de mamíferos; integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências de transposon em um cromossomo da célula de mamífero para obter uma célula de mamífero capaz de expressar a proteína de interesse; e cultivar a suspensão a célula de mamífero; ou (II) as seguintes etapas de (A) a (C):

(A) uma etapa de simultaneamente introduzir os seguintes vetores de expressão (a) e (b) em uma suspensão de células de mamíferos:

(a) um vetor de expressão compreendendo um fragmento genét ico compreendendo um DNA que codifica uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências de transposon em ambas as extremidades do fragmento genético, (b) um vetor de expressão compreendendo um DNA que codifica uma transposase que reconhece as sequências de transposon e tem a atividade de transferir um fragmento genético inserido entre um par das sequências de transposon em um cromossomo, (B) uma etapa de expressar transientemente a transposase do vetor de expressão introduzido na etapa (A) para integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências de transposon em um cromossomo da célula de mamífero para obter uma suspensão de células de mamíferos capaz de expressar a proteína de interesse, e (C) uma etapa do cultivo da suspensão de células de mamíferos capaz de expressar a proteína de interesse obtida na etapa (B) para produzir a proteína de interesse; ou (III) a introdução de um vetor de expressão de proteína

Petição 870190027142, de 21/03/2019, pág. 6/16
2/3 compreendendo um fragmento genético compreendendo um DNA que codifica uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável e sequências de transposon em ambas extremidades do fragmento genético em uma suspensão de células de mamíferos; e integrar o fragmento genético inserido entre um par das sequências de transposon, em um cromossomo da célula de mamífero, em que a suspensão de células de mamíferos é de uma célula capaz de sobreviver e proliferar em um meio livre de soro, em que a suspensão de células de mamíferos é pelo menos uma selecionada dentre uma suspensão de célula CHO na qual uma célula CHO é adaptada à cultura em suspensão, uma célula PER.C6, uma célula de mieloma de rato YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (ou também chamada de YB2/0) e uma suspensão de célula de mieloma de camundongo NS0 adaptada para cultura em suspensão, em que a proteína de interesse é um anticorpo ou um fragmento do mesmo, em que o gene marcador selecionável é pelo menos um selecionado dentre um gene de resistência a droga, tais como um gene de resistência a neomicina, um gene de DHFR, um gene de resistência a puromicina, um gene de resistência a blasticidina, um gene de resistência a higromicina, um gene de resistência a cicloheximida, genes marcadores de fluorescência e de bio-luminescência, tais como a proteína verde fluorescente - GFP, e em que o par de sequências de transposons são sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transposons de Tol1 mostradas nas SEQ ID NOs: 14 e 15 ou sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transposons Tol2 mostradas nas SEQ ID NOs: 2 e 3.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula CHO é pelo menos uma selecionada dentre CHO-K1, CHO-K1 SV, DUKXB1 1, CHO/DG44, Pro-3 e CHO-S.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene marcador selecionável é um gene de resistência à

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3/3 cicloheximida.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o gene de resistência à cicloheximida é um gene que codifica um mutante da proteína ribossomal humana L36a, em que o referido gene consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5.
5. Vetor de expressão de proteína que é usado no método como definido na reivindicação 1, o referido vetor caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento genético de um DNA codificando uma proteína de interesse e um gene marcador selecionável, e um par de sequências do transposon em ambas extremidades do fragmento genético, em que a proteína de interesse é um anticorpo ou um fragmento do mesmo, em que o gene marcador selecionável é pelo menos um selecionado dentre um gene de resistência a droga, tais como um gene de resistência a neomicina, um gene de DHFR, um gene de resistência a puromicina, um gene de resistência a blasticidina, um gene de resistência a higromicina, um gene de resistência a cicloheximida, genes marcadores de fluorescência e de bio-luminescência, tais como a proteína verde fluorescente - GFP, e em que o par de sequências de transposons são sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transposons de Tol1 ou sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transposons Tol2.
6. Vetor de expressão de proteína de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as sequências de nucleotídeo derivadas de um par de transposons Tol2 são as sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID NO: 2 e a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 3.
7. Vetor de expressão de proteína de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as sequências de nucleotídeo derivadas de um par dos transposons Tol1 são as sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID NO: 14 e a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 15.