TW202204401A - 抗體組合物 - Google Patents

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丹羽倫平
宇佐美克明
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Abstract

本發明之目的在於提供一種針對共同表現互不相同之兩種抗原之靶細胞而更特異性地發揮效應子功能而進行毒殺、並且可將針對各靶抗原之親和性維持得足夠高之抗體組合物。本發明係關於一種包含第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物、及構成抗體組合物之第一IgG半聚體與第二IgG半聚體。

Description

抗體組合物
本發明係關於一種抗體組合物及其製造方法、IgG半聚體以及包含該IgG半聚體之套組。
已知目前所核准之抗體醫藥具有各種作用機制(非專利文獻1)。作為其代表性者，有阻礙生長因子等配體與受體之結合的中和活性、將所結合之受體活化之促效劑活性、以及抗體依賴性細胞毒殺(antibody-dependent cellular cytotoxicity，以下稱為ADCC)活性及補體依賴性細胞毒殺(complement-dependent cytotoxicity，以下稱為CDC)活性等IgG類抗體分子所具有之效應子功能等。該等中，根據利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)之臨床試驗之生物標記分析，表明ADCC活性為抗體醫藥之臨床中之重要之作用機制(非專利文獻2、3)。
抗體係包含兩分子之免疫球蛋白重鏈(H鏈)及兩分子之免疫球蛋白輕鏈(L鏈)、合計4分子之多肽鏈的約150 KDa之四聚物蛋白質。如圖1所示，抗體分為：可變區(V)，其包含直接參與抗原結合且各抗體純系之胺基酸序列不同之互補決定區(CDR)；及恆定區，其包含負責上述效應子功能或血中半衰期之控制之Fc區(以下亦簡稱為Fc)。Fc包含CH1～CH3域及鉸鏈域。
人類抗體根據H鏈恆定區之序列而分類為功能不同之IgG、IgA、IgM、IgD、IgE之5類。進而，人類IgG類分為IgG1至IgG4之4種亞型。
其中，已知IgG1亞型之抗體具有最高之ADCC活性、CDC活性(非專利文獻4)，包括利妥昔單抗、曲妥珠單抗之許多抗體醫藥均為IgG1。
另一方面，已知IgG4亞型具有如下特徵等：與其他亞型相比，效應子功能較弱，且具有固有之鉸鏈區域之胺基酸序列，或兩個CH3域間之相互作用比其他亞型弱，導致發生被稱為「Fab臂交換(Fab arm exchange)」之體內兩個H鏈之可逆性之結合、背離(非專利文獻5、6)。
ADCC活性係如下細胞毒殺之機制：自然殺手細胞(以下稱為NK細胞)等經由Fc受體之一種FcγRIIIA(以下亦簡稱為CD16a)識別與癌細胞表面之膜抗原結合之IgG型之抗體的Fc並將其活化，其結果，經由穿孔蛋白或顆粒酶、Fas等分子之表現而引起細胞毒殺(非專利文獻1)。
藉由X射線結晶結構分析而明確CD16a與人類IgG1之結合形式(非專利文獻7、8)。IgG1之Fc上之CD16a結合區由於Fc之結構之點對稱性而存在兩處，實際上Fc與IgG以1：1之數比(化學計量(stoichiometry))結合。並且於構成Fc之兩個CH2域中以各不相同之區域(以下稱為CD16a結合區)相接。
具體而言，CD16a與IgG1之一CH2域上之L235、G236、G237、P238、S239、D265、V266、S267、H268、E269、E294、Q295、Y296、N297、S298、T299、R301、N325、A327、I332等相互作用。另一方面，CD16a同時與IgG1之另一CH2域上之L235、G236、G237、K326、A327、L328、P329、A330等相互作用(編號表示胺基酸在CH2域上的按EU編號之位置)(非專利文獻7、8、9、10)。
可藉由將抗體醫藥之CH2域進行人工改型，提高與CD16a之結合能力，從而使ADCC活性增強。實際中已知大量藉由CH2域之胺基酸之改型而增強ADCC活性之例子(非專利文獻11)。已知對IgG1之一H鏈之CH2域與另一H鏈之CH2域施加不同之胺基酸改型、且2條H鏈藉由雙硫鍵而結合之IgG1抗體具有較高之ADCC活性(專利文獻1)。
又，亦已知藉由對結合於Fc之N-結合型複合型糖鏈之糖鏈進行改型，可增強ADCC活性(非專利文獻12)。特別是利用糖鏈改型之ADCC活性增強技術被應用於莫加珠單抗(mogamulizumab)(非專利文獻13)、奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab)(非專利文獻14)等已核准之抗體醫藥中。
雙特異性抗體不同於天然抗體，其係能夠結合於兩種不同種類之抗原的人工改型抗體分子，報告有大量分子形態(非專利文獻15)。
圖2A表示雙特異性抗體之結構之模式圖。作為雙特異性抗體於醫藥中之應用，例如可例舉藉由結合於癌細胞與T細胞表面之CD3(以下稱為CD3雙特異性抗體)並將兩者交聯而毒殺癌細胞、藉由兩種功能分子之中和而增強藥效(非專利文獻15)。
於癌症或自體免疫疾病之治療中，為了去除病原細胞之癌細胞或自身反應性之淋巴細胞，使用發揮出IgG型抗體之效應子功能或CD3雙特異性抗體之T細胞補充功能之抗體醫藥。
然而，該等病原細胞係來自原本正常之細胞，通常來說，藉由單一之表面標記分子可準確地區分其與正常細胞之情況並不多見。因此，存在如下之虞：利用效應子功能等之病原細胞之去除於多數情況下亦攻擊表現同一抗原分子之正常細胞而導致副作用。
例如，作為淋巴瘤或各種自體免疫疾病之治療中所使用之利妥昔單抗之靶抗原的CD20於正常B細胞中表現，作為乳癌治療所使用之曲妥珠單抗之靶抗原的HER2於心肌細胞中表現。因此，擔心該等抗體醫藥導致正常細胞被破壞而引起副作用。
另一方面，Mazor等人報告了針對各靶抗原之親和性經減弱之雙特異性抗體，對雙陽性細胞發揮出相對較強之效應子功能之例子(非專利文獻16)。
又，有與抗原結合分子之組合相關之報告，該抗原結合分子之組合含有第一抗原結合分子，其具有結合於第一抗原之第一抗原結合區及包含第一CH2及第一CH3之任一者或兩者之第一多肽；以及第二抗原結合分子，其具有結合於第二抗原之第二抗原結合區及包含第二CH2及第二CH3之任一者或兩者之第二多肽，且上述第一抗原結合分子及上述第二抗原結合分子未藉由共價鍵結合，並且於在液體中混合之情形時，相較於同型二聚物，更容易形成異型二聚物(專利文獻2) 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開第2013/002362號 專利文獻2：國際公開第2018/155611號 非專利文獻
非專利文獻1：Carter P. Nat Rev Cancer 2001; 1: 118-29 非專利文獻2：Cartron G, Dacheux L, Salles G, et al. Blood 2002; 99: 754-8 非專利文獻3：Weng WK, Levy R. J Clin Oncol 2003; 21: 3940-7 非專利文獻4：Birch, J.R., Lennox, E.S. (Eds.), Monoclonal Antibodies: Principles and Applications. Wiley-Liss, Inc., New York, p. 45.(1995) 非專利文獻5：Aalberse RC and Schuurman J, Immunology 2002; 105: 9-19 非專利文獻6：Labrijn AF, Nat Biotechnol 2009; 27: 767-71 非專利文獻7：Sondermann P, Nature 2000; 406: 267-73 非專利文獻8：Radaev S, J Biol Chem 2001; 276: 16469-77 非專利文獻9：Ferrara C, Proc Natl Acad Sci 2011; 108; 12669-74 非專利文獻10：Mizushima T, Genes Cells 2011; 16: 1071-80 非專利文獻11：Strohl WR, Curr Opin Biotechnol 2009; 20: 685-91 非專利文獻12：Niwa R, J Pharm Sci 2015; 930-41 非專利文獻13：Beck A, mAbs 2012; 4: 419-25 非專利文獻14：Goede V, N Engl J Med 2014; 370: 1101-10 非專利文獻15：Byrne H, Trends Biotechnol 2013; 31: 621-32 非專利文獻16：Mazor Y, MAbs 2015; 7: 377-89
[發明所欲解決之問題]
作為上述副作用之解決方法之一，考慮利用雙特異性抗體之技術，該技術僅在識別兩種不同之抗原後才發揮出效應子功能，以更高之選擇性去除病原細胞。
然而，如圖2B所示，於使用利用通常之雙特異性抗體之效應子功能攻擊靶細胞之情形時，存在如下之擔憂：雙特異性抗體不僅結合並攻擊共同表現兩種抗原之靶細胞(以下亦簡稱為雙陽性細胞)，而且還結合並攻擊僅表現一種靶抗原之細胞(以下亦簡稱為單陽性細胞)。又，不論對各靶抗原之親和性如何，均對雙陽性細胞特異性地發揮效應子功能而進行毒殺之抗體技術尚屬未知。
因此，本發明人等之目的在於提供一種針對共同表現互不相同之兩種抗原之靶細胞而更特異性地發揮效應子功能而進行毒殺之抗體組合物。 [解決問題之技術手段]
本發明人等考慮，藉由在抗體分子之恆定區中如圖3所示般具有與通常之人類IgG1抗體不同之以下所示的[1]～[3]之要素之抗體組合物，可解決上述課題。 [1]其係具有針對互不相同之第一抗原(抗原分子X)及第二抗原(抗原分子Y)之抗原結合部位的抗體之半聚體(第一及第二IgG半聚體)之混合物。即，其係於第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之間不存在藉由H鏈間之雙硫鍵形成之共價鍵的「HL體」之混合物。 [2]針對抗原分子X、Y之各HL體結合於表現抗原分子X、Y之兩者之靶細胞(X/Y雙陽性細胞)之表面後締合，形成與通常之IgG相同之H2L2體，構成CD16a結合區，而誘導抗體之活性。 [3]為了避免對僅表現單一之抗原分子之細胞誘導抗體之活性，即便針對抗原分子X或Y之HL體彼此於細胞表面締合而形成同型締合體，亦不構成CD16a結合區。
基於上述考慮，本發明人等發現下述(1)～(3)，從而完成本發明。 (1)關於上述[1]，如圖4所示，藉由將IgG半聚體之鉸鏈域中之一部分或整體進行置換或缺失、或者進行修飾而進行改型，以避免鉸鏈域中於H鏈間形成雙硫鍵。 (2)如圖5所示，CD16a分別以不同之部位(CH2-A之區域1、CH2-B之區域2)與Fc中之兩個CH2域(圖5中為CH2-A、CH2-B)相接。 因此，於分別藉由胺基酸之改型等「破壞」結合未使用之CH2-A之區域2、及CH2-B之區域1而使其結合活性減弱之情形時，此種具有改型CH2-A之HL體彼此之同型締合體中僅CH2-A之區域2不存在，或具有改型CH2-B之HL體彼此之同型締合體中僅CH2-B之區域1不存在。因此，對於該等同型締合體，CD16a無法具有充分之親和性而結合。 另一方面，藉由此種具有改型CH2-A、改型CH2-B分別作為構成要素之HL體之組合(異型締合體)，可獲得滿足上述[2]及[3]之條件之抗體組合物。 (3)藉由由向CD16a結合區或其他Fc區導入特定之胺基酸改型而成之IgG半聚體所形成之異型締合體，可獲得表現出針對X/Y雙陽性細胞之經增強之效應子功能及/或經控制之體內動態的抗體組合物。
即，本發明係關於以下。 1.一種抗體組合物，其係包含第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之針對互不相同之第一抗原及第二抗原者，且為以下之(1A)～(6A)。 (1A)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含1個免疫球蛋白輕鏈(以下簡記為L鏈)及1個免疫球蛋白重鏈(以下簡記為H鏈)，上述H鏈包含H鏈可變區、鉸鏈域、CH1域、CH2域及CH3域，於上述CH2域中具有互不相同之第一Fcγ受體IIIA(以下稱為CD16a)結合區及第二CD16a結合區。 (2A)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)上述第一IgG半聚體包含結合於上述第一抗原之抗原結合域，且於上述第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換。 (4A)上述第二IgG半聚體包含結合於上述第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換，或 上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(b)S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換。 (6A)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體中之至少一者包含CH3域中之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之上述CH3域間相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。 2.如上述1所記載之抗體組合物，其中與針對僅表現上述第一抗原之靶細胞與僅表現上述第二抗原之靶細胞之效應子功能相比，對共同表現上述第一抗原及上述第二抗原之靶細胞特異性地發揮效應子功能而進行毒殺。 3.如上述1或2所記載之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含選自EU索引所表示之Y349A、L351A、T366A、L368A、D399A、F405A、Y407A、K409A及K409R中之至少1個之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之CH3域間相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。 4.如上述3所記載之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之K409R之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之CH3域間之相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。 5.如上述1至4中任一項所記載之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含上述(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換。 6.如上述1至5中任一項所記載之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體之H鏈恆定區(以下簡記為CH)包含序列編號248所表示之胺基酸序列， 上述第二IgG半聚體之CH包含序列編號252所表示之胺基酸序列。 7.如上述1至6中任一項所記載之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體中之結合於Fc區之全部N-糖苷鍵結型糖鏈中，於糖鏈還原末端之N-乙醯葡糖胺未結合岩藻糖之糖鏈之比率為20%以上。 8.如上述1至7中任一項所記載之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體之免疫球蛋白亞型為IgG1。 9.一種第一IgG半聚體，其係以與第二IgG半聚體締合為特徵者，且上述第一IgG半聚體及第二IgG半聚體為以下之(1B)～(7B)。 (1B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體形成針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物。 (2B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含1個L鏈及1個H鏈，上述H鏈包含H鏈可變區、鉸鏈域、CH1域、CH2域及CH3域，於上述CH2域中具有互不相同之第一CD16a結合區及第二CD16a結合區。 (3B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (4B)上述第一IgG半聚體包含結合於上述第一抗原之抗原結合域，且於上述第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換。 (5B)上述第二IgG半聚體包含結合於上述第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (6B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換，或 上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(b)S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換。 (7B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體中之至少一者包含CH3域中之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之上述CH3域間相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。 10.一種第二IgG半聚體，其係以與第一IgG半聚體締合為特徵者，且上述第一IgG半聚體及第二IgG半聚體為以下之(1C)～(7C)。 (1C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體形成針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物。 (2C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含1個L鏈及1個H鏈，上述H鏈包含H鏈可變區、鉸鏈域、CH1域、CH2域及CH3域，於上述CH2域中具有互不相同之第一CD16a結合區及第二CD16a結合區。 (3C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (4C)上述第一IgG半聚體包含結合於上述第一抗原之抗原結合域，且於上述第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換。 (5C)上述第二IgG半聚體包含結合於上述第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (6C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換，或 上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(b)S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換。 (7C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體中之至少一者包含CH3域中之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之上述CH3域間相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。 11.一種DNA，其編碼以下之a)或b)之胺基酸序列： a)如上述9所記載之第一IgG半聚體之胺基酸序列； b)如上述10所記載之第二IgG半聚體之胺基酸序列。 12.一種重組載體，其包含如上述11所記載之編碼a)之胺基酸序列之DNA及編碼b)之胺基酸序列之DNA之至少一者。 13.一種轉形體，其導入有如上述12所記載之重組載體。 14.一種套組，其包含如上述9所記載之第一IgG半聚體及如上述10所記載之第二IgG半聚體。 15.一種特異性地誘發效應子功能之方法，其係使用如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物者，其與針對僅表現上述第一抗原之靶細胞與僅表現上述第二抗原之靶細胞之效應子功能相比，對共同表現上述第一抗原及上述第二抗原之靶細胞特異性地誘發效應子功能。 16.一種醫藥組合物，其包含如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物。 17.如上述16所記載之醫藥組合物，其係用於癌症、自體免疫疾病或過敏疾病之治療。 18.一種如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於癌症、自體免疫疾病或過敏疾病之治療用醫藥組合物之製造。 19.一種如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於癌症、自體免疫疾病或過敏疾病之治療。 20.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其係用於癌症、自體免疫疾病或過敏疾病之治療。 21.一種癌症、自體免疫疾病或過敏疾病之治療方法，其包括將如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 22.一種第一IgG半聚體，其係用於與第二IgG半聚體併用者，且上述第一IgG半聚體及第二IgG半聚體為以下之(1B)～(7B)。 (1B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體形成針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物。 (2B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含1個L鏈及1個H鏈，上述H鏈包含H鏈可變區、鉸鏈域、CH1域、CH2域及CH3域，於上述CH2域中具有互不相同之第一CD16a結合區及第二CD16a結合區。 (3B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (4B)上述第一IgG半聚體包含結合於上述第一抗原之抗原結合域，且於上述第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換。 (5B)上述第二IgG半聚體包含結合於上述第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (6B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換，或 上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(b)S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換。 (7B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體中之至少一者包含CH3域中之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之上述CH3域間相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。 23.一種第二IgG半聚體，其係用於與第一IgG半聚體併用者，且上述第一IgG半聚體及第二IgG半聚體為以下之(1C)～(7C)。 (1C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體形成針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物。 (2C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含1個L鏈及1個H鏈，上述H鏈包含H鏈可變區、鉸鏈域、CH1域、CH2域及CH3域，於上述CH2域中具有互不相同之第一CD16a結合區及第二CD16a結合區。 (3C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (4C)上述第一IgG半聚體包含結合於上述第一抗原之抗原結合域，且於上述第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換。 (5C)上述第二IgG半聚體包含結合於上述第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (6C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換，或 上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(b)S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換。 (7C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體中之至少一者包含CH3域中之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之上述CH3域間相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。 24.一種第一或第二IgG半聚體，其包含於如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物中。 25.一種特異性地誘發效應子功能之方法，其係使用如上述9、10或24所記載之IgG半聚體而對表現第一及第二抗原之雙陽性細胞特異性地誘發效應子功能。
26.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CADM1，第二抗原為CCR4。 27.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為EGFR，第二抗原為HER2。 28.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD52，第二抗原為CD70。 29.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD2，第二抗原為CD70。 30.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD19，第二抗原為CD70。 31.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD2，第二抗原為CD40配體。 32.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為PD-L1，第二抗原為選自CD19、CD30、CCR4、CD20、CD22及CD79b中之一者。 33.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD8，第二抗原為CCR4。 34.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CTLA-4，第二抗原為選自CD4、CCR4及GITR中之一者。 35.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為TIGIT，第二抗原為選自CD4、CCR4及GITR中之一者。 36.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為PD-1，第二抗原為選自CD4、CCR4及GITR中之一者。 37.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為OX40，第二抗原為選自CD127、CD26、CD70及CD15s中之一者。 38.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為4-1BB，第二抗原為選自CD127、CD26、CD70及CD15s中之一者。 39.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為GITR，第二抗原為選自CD127、CD26、CD70及CD15s中之一者。 40.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD40配體，第二抗原為選自CD127、CD26、CD70及CD15s中之一者。 41.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD4，第二抗原為CD69。
42.一種用於ATL之治療之醫藥組合物，其包含如上述26所記載之抗體組合物。 43.一種用於胃癌及乳癌之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述27所記載之抗體組合物。 44.一種用於修格連氏症候群之治療之醫藥組合物，其包含如上述31所記載之抗體組合物。 45.一種用於淋巴瘤及白血病之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述32所記載之抗體組合物。 46.一種用於癌症之治療之醫藥組合物，其包含如上述33至36中任一項所記載之抗體組合物。 47.一種用於自體免疫疾病之治療之醫藥組合物，其包含如上述37至40中任一項所記載之抗體組合物。 48.一種用於ANCA相關性絲球體腎炎之治療之醫藥組合物，其包含如上述41所記載之抗體組合物。
49.一種如上述26所記載之抗體組合物之用途，其係用於ATL之治療用醫藥組合物之製造。 50.一種如上述27所記載之抗體組合物之用途，其係用於胃癌及乳癌之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 51.一種如上述31所記載之抗體組合物之用途，其係用於修格連氏症候群之治療用醫藥組合物之製造。 52.一種如上述32所記載之抗體組合物之用途，其係用於淋巴瘤及白血病之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 53.一種如上述33至36中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於癌症之治療用醫藥組合物之製造。 54.一種如上述37至40中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於自體免疫疾病之治療用醫藥組合物之製造。 55.一種如上述41所記載之抗體組合物之用途，其係用於ANCA相關性絲球體腎炎之治療用醫藥組合物之製造。
56.一種如上述26所記載之抗體組合物之用途，其係用於ATL之治療。 57.一種如上述27所記載之抗體組合物之用途，其係用於胃癌及乳癌之至少一者之治療。 58.一種如上述31所記載之抗體組合物之用途，其係用於修格連氏症候群之治療。 59.一種如上述32所記載之抗體組合物之用途，其係用於淋巴瘤及白血病之至少一者之治療。 60.一種如上述33至36中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於癌症之治療。 61.一種如上述37至40中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於自體免疫疾病之治療。 62.一種如上述41所記載之抗體組合物之用途，其係用於ANCA相關性絲球體腎炎之治療。
63.如上述26所記載之抗體組合物，其係用於ATL之治療。 64.如上述27所記載之抗體組合物，其係用於胃癌及乳癌之至少一者之治療。 65.如上述31所記載之抗體組合物，其係用於修格連氏症候群之治療。 66.如上述32所記載之抗體組合物，其係用於淋巴瘤及白血病之至少一者之治療。 67.如上述33至36中任一項所記載之抗體組合物，其係用於癌症之治療。 68.如上述37至40中任一項所記載之抗體組合物，其係用於自體免疫疾病之治療。 69.如上述41所記載之抗體組合物，其係用於ANCA相關性絲球體腎炎之治療。
70.一種ATL之治療方法，其包括將如上述26所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 71.一種胃癌及乳癌之至少一者之治療方法，其包括將如上述27所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 72.一種修格連氏症候群之治療方法，其包括將如上述31所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 73.一種淋巴瘤及白血病之至少一者之治療方法，其包括將如上述32所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 74.一種癌症之治療方法，其包括將如上述33至36中任一項所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 75.一種自體免疫疾病之治療方法，其包括將如上述37至40中任一項所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 76.一種ANCA相關性絲球體腎炎之治療方法，其包括將如上述41所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。
77.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為PD-1，第二抗原為CD3。 78.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為PD-1，第二抗原為CD4。 79.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為整合素α4β7，第二抗原為選自CCR6、CXCR3、CD161及CD127中之一者。 80.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為整合素α4β7，第二抗原為CD40配體。 81.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為整合素α4β1，第二抗原為CD40配體。 82.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CXCR5，第二抗原為CD127。 83.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為TPO受體(c-mpl)，第二抗原為CD34或CD123。 84.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CXCR3，第二抗原為CD3。 85.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CXCR3，第二抗原為CD127或CD40配體。 86.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CCR4，第二抗原為CD127或CD40配體。 87.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CCR6，第二抗原為CD127或CD40配體。 88.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CRTH2，第二抗原為CD127或CD40配體。 89.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CRTH2，第二抗原為CCR4。 90.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CRTH2，第二抗原為ST2。 91.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CRTH2，第二抗原為CCR6或CCR3。 92.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD207，第二抗原為CD11b或CD1a。 93.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD123，第二抗原為HLA-DR或ASCT2。 94.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CSF1R，第二抗原為CD14。 95.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CSF1R，第二抗原為CD33。 96.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD19，第二抗原為CD38。 97.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD3，第二抗原為IL-23R。 98.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD3，第二抗原為CX3CR1。 99.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CXCR4，第二抗原為第一型膠原蛋白(Type 1 collagen)。 100.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CXCR4，第二抗原為CD14。 101.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CXCR4，第二抗原為CD16。 102.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CLEC10A，第二抗原為CD14或CD16。 103.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD70，第二抗原為CD38。 104.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD70，第二抗原為選自CD4、CD127及TIM-1中之一者。 105.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD4，第二抗原為TIM-1。 106.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD70，第二抗原為CD52。 107.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CB1，第二抗原為AT1R。 108.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD4或PD-1，第二抗原為CD153。 109.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為FcεRI，第二抗原為CD34或C-KIT。 110.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD34，第二抗原為CD203或MRGPRX2。 111.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD52，第二抗原為CD127。 112.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD69，第二抗原為CD21。 113.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD106，第二抗原為選自CD11c、CD19、CD21及CD72中之一者。 114.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為4-1BB，第二抗原為選自CD11c、CD19、CD21及CD72中之一者。 115.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為BLT1，第二抗原為CD49b。 116.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD226，第二抗原為CD8。 117.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CXCR3，第二抗原為選自CD8、CD49a、IL-15R及NKG2D中之一者。 118.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD49a，第二抗原為選自CD8、IL-15R及NKG2D中之一者。 119.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為IL-15R，第二抗原為CD8或NKG2D。 120.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為NKG2D，第二抗原為CD8。 121.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD177，第二抗原為PR3。 122.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD4，第二抗原為CD127。 123.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD40配體，第二抗原為IL-6。 124.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為IL-17R，第二抗原為膜型TNF。 125.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為IL-23R，第二抗原為CCR6。
126.一種如上述77所記載之抗體組合物之用途，其係用於類風濕性關節炎之治療用醫藥組合物之製造。 127.一種如上述78所記載之抗體組合物之用途，其係用於乳糜瀉之治療用醫藥組合物之製造。 128.一種如上述79所記載之抗體組合物之用途，其係用於炎症性腸病之治療用醫藥組合物之製造。 129.一種如上述80所記載之抗體組合物之用途，其係用於多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 130.一種如上述81所記載之抗體組合物之用途，其係用於多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 131.一種如上述82所記載之抗體組合物之用途，其係用於過敏疾病之治療用醫藥組合物之製造。 132.一種如上述83所記載之抗體組合物之用途，其係用於原發性骨髓纖維化症之治療用醫藥組合物之製造。 133.一種如上述84所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自自體免疫疾病、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 134.一種如上述85所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療用醫藥組合物之製造。 135.一種如上述86所記載之抗體組合物之用途，其係用於過敏疾病之治療用醫藥組合物之製造。 136.一種如上述87所記載之抗體組合物之用途，其係用於牛皮癬之治療用醫藥組合物之製造。 137.一種如上述88所記載之抗體組合物之用途，其係用於過敏疾病之治療用醫藥組合物之製造。 138.一種如上述89所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自哮喘、嗜酸性球鼻竇炎及異位性皮膚炎中之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 139.一種如上述90所記載之抗體組合物之用途，其係用於哮喘及嗜酸性球鼻竇炎之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 140.一種如上述91所記載之抗體組合物之用途，其係用於過敏疾病之治療用醫藥組合物之製造。 141.一種如上述92所記載之抗體組合物之用途，其係用於朗格漢斯細胞組織細胞增生症(LCH，Langerhans Cell Histiocytosis)之治療用醫藥組合物之製造。 142.一種如上述93所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療用醫藥組合物之製造。 143.一種如上述94所記載之抗體組合物之用途，其係用於特發性肺纖維化症之治療用醫藥組合物之製造。 144.一種如上述95所記載之抗體組合物之用途，其係用於癌症之治療用醫藥組合物之製造。 145.一種如上述96或97所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療用醫藥組合物之製造。 146.一種如上述98所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自自體免疫疾病、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 147.一種如上述99所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自特發性肺纖維化症、全身性硬化症及肝硬化等各種纖維化疾病中之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 148.一種如上述100所記載之抗體組合物之用途，其係用於特發性肺纖維化症之治療用醫藥組合物之製造。 149.一種如上述101所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自嗜中性球哮喘、慢性阻塞性肺病及阿茲海默症中之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 150.一種如上述102所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自克隆氏病、類風濕性關節炎及哮喘中之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 151.一種如上述103所記載之抗體組合物之用途，其係用於多發性硬化症及視神經脊髓炎之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 152.一種如上述104或105所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療用醫藥組合物之製造。 153.一種如上述106所記載之抗體組合物之用途，其係用於多發性硬化症之治療用醫藥組合物之製造。 154.一種如上述107所記載之抗體組合物之用途，其係用於肝硬化之治療用醫藥組合物之製造。 155.一種如上述108所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療用醫藥組合物之製造。 156.一種如上述109所記載之抗體組合物之用途，其係用於包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS，Mast Cell Activation Syndromes)之治療用醫藥組合物之製造。 157.一種如上述110所記載之抗體組合物之用途，其係用於包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS)之治療用醫藥組合物之製造。 158.一種如上述111所記載之抗體組合物之用途，其係用於多發性硬化症之治療用醫藥組合物之製造。 159.一種如上述112所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自多發性硬化症、1型糖尿病及類風濕性關節炎中之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 160.一種如上述113所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS，Secondary Progressive Multiple Sclerosis)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 161.一種如上述114所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 162.一種如上述115所記載之抗體組合物之用途，其係用於哮喘之治療用醫藥組合物之製造。 163.一種如上述116所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性硬皮病之治療用醫藥組合物之製造。 164.一種如上述117所記載之抗體組合物之用途，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 165.一種如上述118所記載之抗體組合物之用途，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 166.一種如上述119所記載之抗體組合物之用途，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 167.一種如上述120所記載之抗體組合物之用途，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 168.一種如上述121所記載之抗體組合物之用途，其係用於ANCA(Antineutrophil Cytoplasmic Antibody，抗中性粒細胞胞漿抗體)相關性血管炎及全身性紅斑狼瘡之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 169.一種如上述122所記載之抗體組合物之用途，其係用於T細胞依賴性之免疫相關性疾病之治療用醫藥組合物之製造。 170.一種如上述123所記載之抗體組合物之用途，其係用於免疫相關性疾病之治療用醫藥組合物之製造。 171.一種如上述124所記載之抗體組合物之用途，其係用於牛皮癬性關節炎之治療用醫藥組合物之製造。 172.一種如上述125所記載之抗體組合物之用途，其係用於包括修格連氏症候群及牛皮癬之至少一者在內之自體免疫疾病之治療用醫藥組合物之製造。
173.一種如上述77所記載之抗體組合物之用途，其係用於類風濕性關節炎之治療。 174.一種如上述78所記載之抗體組合物之用途，其係用於乳糜瀉之治療。 175.一種如上述79所記載之抗體組合物之用途，其係用於炎症性腸病之治療。 176.一種如上述80所記載之抗體組合物之用途，其係用於多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者之治療。 177.一種如上述81所記載之抗體組合物之用途，其係用於多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者之治療。 178.一種如上述82所記載之抗體組合物之用途，其係用於過敏疾病之治療。 179.一種如上述83所記載之抗體組合物之用途，其係用於原發性骨髓纖維化症之治療。 180.一種如上述84所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自自體免疫疾病、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者之治療。 181.一種如上述85所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療。 182.一種如上述86所記載之抗體組合物之用途，其係用於過敏疾病之治療。 183.一種如上述87所記載之抗體組合物之用途，其係用於牛皮癬之治療。 184.一種如上述88所記載之抗體組合物之用途，其係用於過敏疾病之治療。 185.一種如上述89所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自哮喘、嗜酸性球鼻竇炎及異位性皮膚炎中之至少一者之治療。 186.一種如上述90所記載之抗體組合物之用途，其係用於哮喘及嗜酸性球鼻竇炎之至少一者之治療。 187.一種如上述91所記載之抗體組合物之用途，其係用於過敏疾病之治療。 188.一種如上述92所記載之抗體組合物之用途，其係用於朗格漢斯細胞組織細胞增生症(LCH)之治療。 189.一種如上述93所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療。 190.一種如上述94所記載之抗體組合物之用途，其係用於特發性肺纖維化症之治療。 191.一種如上述95所記載之抗體組合物之用途，其係用於癌症之治療。 192.一種如上述96或97所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療。 193.一種如上述98所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自自體免疫疾病、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者之治療。 194.一種如上述99所記載之抗體組合物之用途，其係用於包括選自特發性肺纖維化症、全身性硬化症及肝硬化中之至少一者在內之纖維化疾病之治療。 195.一種如上述100所記載之抗體組合物之用途，其係用於特發性肺纖維化症之治療。 196.一種如上述101所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自嗜中性球哮喘、慢性阻塞性肺病及阿茲海默症中之至少一者之治療。 197.一種如上述102所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自克隆氏病、類風濕性關節炎及哮喘中之至少一者之治療。 198.一種如上述103所記載之抗體組合物之用途，其係用於多發性硬化症及視神經脊髓炎之至少一者之治療。 199.一種如上述104或105所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療。 200.一種如上述106所記載之抗體組合物之用途，其係用於多發性硬化症之治療。 201.一種如上述107所記載之抗體組合物之用途，其係用於肝硬化之治療。 202.一種如上述108所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療。 203.一種如上述109所記載之抗體組合物之用途，其係用於包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS)之治療。 204.一種如上述110所記載之抗體組合物之用途，其係用於包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS)之治療。 205.一種如上述111所記載之抗體組合物之用途，其係用於多發性硬化症之治療。 206.一種如上述112所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自多發性硬化症、1型糖尿病及類風濕性關節炎中之至少一者之治療。 207.一種如上述113所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者之治療。 208.一種如上述114所記載之抗體組合物之用途，其係用於選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者之治療。 209.一種如上述115所記載之抗體組合物之用途，其係用於哮喘之治療。 210.一種如上述116所記載之抗體組合物之用途，其係用於全身性硬皮病之治療。 211.一種如上述117所記載之抗體組合物之用途，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療。 212.一種如上述118所記載之抗體組合物之用途，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療。 213.一種如上述119所記載之抗體組合物之用途，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療。 214.一種如上述120所記載之抗體組合物之用途，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療。 215.一種如上述121所記載之抗體組合物之用途，其係用於ANCA相關性血管炎及全身性紅斑狼瘡之至少一者之治療。 216.一種如上述122所記載之抗體組合物之用途，其係用於T細胞依賴性之免疫相關性疾病之治療。 217.一種如上述123所記載之抗體組合物之用途，其係用於免疫相關性疾病之治療。 218.一種如上述124所記載之抗體組合物之用途，其係用於牛皮癬性關節炎之治療。 219.一種如上述125所記載之抗體組合物之用途，其係用於包括修格連氏症候群及牛皮癬之至少一者在內之自體免疫疾病之治療。
220.如上述77所記載之抗體組合物，其係用於類風濕性關節炎之治療。 221.如上述78所記載之抗體組合物，其係用於乳糜瀉之治療。 222.如上述79所記載之抗體組合物，其係用於炎症性腸病之治療。 223.如上述80所記載之抗體組合物，其係用於多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者之治療。 224.如上述81所記載之抗體組合物，其係用於多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者之治療。 225.如上述82所記載之抗體組合物，其係用於過敏疾病之治療。 226.如上述83所記載之抗體組合物，其係用於原發性骨髓纖維化症之治療。 227.如上述84所記載之抗體組合物，其係用於選自自體免疫疾病、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者之治療。 228.如上述85所記載之抗體組合物，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療。 229.如上述86所記載之抗體組合物，其係用於過敏疾病之治療。 230.如上述87所記載之抗體組合物，其係用於牛皮癬之治療。 231.如上述88所記載之抗體組合物，其係用於過敏疾病之治療。 232.如上述89所記載之抗體組合物，其係用於選自哮喘、嗜酸性球鼻竇炎及異位性皮膚炎中之至少一者之治療。 233.如上述90所記載之抗體組合物，其係用於哮喘及嗜酸性球鼻竇炎之至少一者之治療。 234.如上述91所記載之抗體組合物，其係用於過敏疾病之治療。 235.如上述92所記載之抗體組合物，其係用於朗格漢斯細胞組織細胞增生症(LCH)之治療。 236.如上述93所記載之抗體組合物，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療。 237.如上述94所記載之抗體組合物，其係用於特發性肺纖維化症之治療。 238.如上述95所記載之抗體組合物，其係用於癌症之治療。 239.如上述96或97所記載之抗體組合物，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療。 240.如上述98所記載之抗體組合物，其係用於選自自體免疫疾病、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者之治療。 241.如上述99所記載之抗體組合物，其係用於包括選自特發性肺纖維化症、全身性硬化症及肝硬化中之至少一者在內之纖維化疾病之治療。 242.如上述100所記載之抗體組合物，其係用於特發性肺纖維化症之治療。 243.如上述101所記載之抗體組合物，其係用於選自嗜中性球哮喘、慢性阻塞性肺病及阿茲海默症中之至少一者之治療。 244.如上述102所記載之抗體組合物，其係用於選自克隆氏病、類風濕性關節炎及哮喘中之至少一者之治療。 245.如上述103所記載之抗體組合物，其係用於多發性硬化症及視神經脊髓炎之至少一者之治療。 246.如上述104或105所記載之抗體組合物，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療。 247.如上述106所記載之抗體組合物，其係用於多發性硬化症之治療。 248.如上述107所記載之抗體組合物，其係用於肝硬化之治療。 249.如上述108所記載之抗體組合物，其係用於全身性紅斑狼瘡之治療。 250.如上述109所記載之抗體組合物，其係用於包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS)之治療。 251.如上述110所記載之抗體組合物，其係用於包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS)之治療。 252.如上述111所記載之抗體組合物，其係用於多發性硬化症之治療。 253.如上述112所記載之抗體組合物，其係用於選自多發性硬化症、1型糖尿病及類風濕性關節炎中之至少一者之治療。 254.如上述113所記載之抗體組合物，其係用於選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者之治療。 255.如上述114所記載之抗體組合物，其係用於選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者之治療。 256.如上述115所記載之抗體組合物，其係用於哮喘之治療。 257.如上述116所記載之抗體組合物，其係用於全身性硬皮病之治療。 258.如上述117所記載之抗體組合物，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療。 259.如上述118所記載之抗體組合物，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療。 260.如上述119所記載之抗體組合物，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療。 261.如上述120所記載之抗體組合物，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療。 262.如上述121所記載之抗體組合物，其係用於ANCA相關性血管炎及全身性紅斑狼瘡之至少一者之治療。 263.如上述122所記載之抗體組合物，其係用於T細胞依賴性之免疫相關性疾病之治療。 264.如上述123所記載之抗體組合物，其係用於免疫相關性疾病之治療。 265.如上述124所記載之抗體組合物，其係用於牛皮癬性關節炎之治療。 266.如上述125所記載之抗體組合物，其係用於包括修格連氏症候群及牛皮癬之至少一者在內之自體免疫疾病之治療。
267.一種類風濕性關節炎之治療方法，其包括將如上述77所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 268.一種乳糜瀉之治療方法，其包括將如上述78所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 269.一種炎症性腸病之治療方法，其包括將如上述79所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 270.一種多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者之治療方法，其包括將如上述80所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 271.一種多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者之治療方法，其包括將如上述81所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 272.一種過敏疾病之治療方法，其包括將如上述82所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 273.一種原發性骨髓纖維化症之治療方法，其包括將如上述83所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 274.一種選自自體免疫疾病、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者之治療方法，其包括將如上述84所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 275.一種全身性紅斑狼瘡之治療方法，其包括將如上述85所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 276.一種過敏疾病之治療方法，其包括將如上述86所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 277.一種牛皮癬之治療方法，其包括將如上述87所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 278.一種過敏疾病之治療方法，其包括將如上述88所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 279.一種選自哮喘、嗜酸性球鼻竇炎及異位性皮膚炎中之至少一者之治療方法，其包括將如上述89所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 280.一種哮喘及嗜酸性球鼻竇炎之至少一者之治療方法，其包括將如上述90所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 281.一種過敏疾病之治療方法，其包括將如上述91所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 282.一種朗格漢斯細胞組織細胞增生症(LCH)之治療方法，其包括將如上述92所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 283.一種全身性紅斑狼瘡之治療方法，其包括將如上述93所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 284.一種特發性肺纖維化症之治療方法，其包括將如上述94所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 285.一種癌症之治療方法，其包括將如上述95所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 286.一種全身性紅斑狼瘡之治療方法，其包括將如上述96或97所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 287.一種選自自體免疫疾病、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者之治療方法，其包括將如上述98所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 288.一種包括選自特發性肺纖維化症、全身性硬化症及肝硬化中之至少一者在內之纖維化疾病之治療方法，其包括將如上述99所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 289.一種特發性肺纖維化症之治療方法，其包括將如上述100所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 290.一種選自嗜中性球哮喘、慢性阻塞性肺病及阿茲海默症中之至少一者之治療方法，其包括將如上述101所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 291.一種選自克隆氏病、類風濕性關節炎及哮喘中之至少一者之治療方法，其包括將如上述102所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 292.一種多發性硬化症及視神經脊髓炎之至少一者之治療方法，其包括將如上述103所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 293.一種全身性紅斑狼瘡之治療方法，其包括將如上述104或105所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 294.一種多發性硬化症之治療方法，其包括將如上述106所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 295.一種肝硬化之治療方法，其包括將如上述107所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 296.一種全身性紅斑狼瘡之治療方法，其包括將如上述108所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 297.一種包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS)之治療方法，其包括將如上述109所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 298.一種包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS)之治療方法，其包括將如上述110所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 299.一種多發性硬化症之治療方法，其包括將如上述111所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 300.一種選自多發性硬化症、1型糖尿病及類風濕性關節炎中之至少一者之治療方法，其包括將如上述112所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 301.一種選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者之治療方法，其包括將如上述113所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 302.一種選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者之治療方法，其包括將如上述114所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 303.一種哮喘之治療方法，其包括將如上述115所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 304.一種全身性硬皮病之治療方法，其包括將如上述116所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 305.一種尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療方法，其包括將如上述117所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 306.一種尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療方法，其包括將如上述118所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 307.一種尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療方法，其包括將如上述119所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 308.一種尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療方法，其包括將如上述120所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 309.一種ANCA相關性血管炎及全身性紅斑狼瘡之至少一者之治療方法，其包括將如上述121所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 310.一種T細胞依賴性之免疫相關性疾病之治療方法，其包括將如上述122所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 311.一種免疫相關性疾病之治療方法，其包括將如上述123所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 312.一種牛皮癬性關節炎之治療方法，其包括將如上述124所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 313.一種包括修格連氏症候群及牛皮癬之至少一者在內之自體免疫疾病之治療方法，其包括將如上述125所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。
314.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD64，第二抗原為選自CD206、CD163及CD68中之一者。 315.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD163，第二抗原為CD206或CD68。 316.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD206，第二抗原為CD68。 317.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD14，第二抗原為選自CD48、CD84、CD97及CD305中之一者。 318.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD15，第二抗原為選自CD48、CD84、CD97及CD305中之一者。 319.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD33，第二抗原為選自CD48、CD84、CD97及CD305中之一者。 320.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD11b，第二抗原為選自CD48、CD84、CD97及CD305中之一者。 321.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CCR4，第二抗原為選自CADM1、CD30及CD70中之一者。 322.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD38，第二抗原為CD138或BCMA。 323.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為BCMA，第二抗原為CD56或CS1。 324.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD40配體，第二抗原為選自CD36、CD62P及CD63中之一者。 325.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為TIM-3，第二抗原為選自CD123、CD33、CD47、CD70及CLEC12A中之一者。 326.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD123，第二抗原為選自CD33、CD47、CD70及CLEC12A中之一者。 327.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD5，第二抗原為CD23。 328.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD10或CD5，第二抗原為CD20。 329.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CD40，第二抗原為選自CD80、CD86、ICOS配體、4-1BB配體、OX40配體、CD70、GITR、PD-L1、PD-L2、B7-DC、B7H3、B7H4、B7H5、B7H6及B7H7中之一者。 330.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為PTPRS，第二抗原為選自IL-21R、CD38及CD32a中之一者。 331.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為OX40，第二抗原為CD127或CD40配體。 332.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為OX40，第二抗原為CD8或NKG2D。 333.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為OX40，第二抗原為CD226。 334.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為OX40，第二抗原為CRTH2。 335.如上述1至8中任一項所記載之抗體組合物，其中第一抗原為CRTH2，第二抗原為選自CD2、CD7及CD45中之任一者。
336.一種用於癌症之治療之醫藥組合物，其包含如上述314至320中任一項所記載之抗體組合物。 337.一種用於白血病之治療之醫藥組合物，其包含如上述321至328中任一項所記載之抗體組合物。 338.一種用於淋巴瘤之治療之醫藥組合物，其包含如上述321至328中任一項所記載之抗體組合物。 339.一種用於炎症性疾病之治療之醫藥組合物，其包含如上述329所記載之抗體組合物。 340.一種用於過敏疾病之治療之醫藥組合物，其包含如上述331、334及335中任一項所記載之抗體組合物。 341.一種用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述332所記載之抗體組合物。 342.一種用於硬皮病之治療之醫藥組合物，其包含如上述333所記載之抗體組合物。
343.一種如上述314至320中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於癌症之治療用醫藥組合物之製造。 344.一種如上述321至328中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於白血病之治療用醫藥組合物之製造。 345.一種如上述321至328中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於淋巴瘤之治療用醫藥組合物之製造。 346.一種如上述329所記載之抗體組合物之用途，其係用於炎症性疾病之治療用醫藥組合物之製造。 347.一種如上述331、334及335中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於過敏疾病之治療用醫藥組合物之製造。 348.一種如上述332所記載之抗體組合物之用途，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療用醫藥組合物之製造。 349.一種如上述333所記載之抗體組合物之用途，其係用於硬皮病之治療用醫藥組合物之製造。 350.一種如上述314至320中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於癌症之治療。 351.一種如上述321至328中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於白血病之治療。 352.一種如上述321至328中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於淋巴瘤之治療。 353.一種如上述329所記載之抗體組合物之用途，其係用於炎症性疾病之治療。 354.一種如上述331、334及335中任一項所記載之抗體組合物之用途，其係用於過敏疾病之治療。 355.一種如上述332所記載之抗體組合物之用途，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療。 356.一種如上述333所記載之抗體組合物之用途，其係用於硬皮病之治療。
357.如上述314至320中任一項所記載之抗體組合物，其係用於癌症之治療。 358.如上述321至328中任一項所記載之抗體組合物，其係用於白血病之治療。 359.如上述321至328中任一項所記載之抗體組合物，其係用於淋巴瘤之治療。 360.如上述329所記載之抗體組合物，其係用於炎症性疾病之治療。 361.如上述331、334及335中任一項所記載之抗體組合物，其係用於過敏疾病之治療。 362.如上述332所記載之抗體組合物，其係用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療。 363.如上述333所記載之抗體組合物，其係用於硬皮病之治療。
364.一種癌症之治療方法，其包括將如上述314至320中任一項所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 365.一種白血病之治療方法，其包括將如上述321至328中任一項所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 366.一種淋巴瘤之治療方法，其包括將如上述321至328中任一項所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 367.一種炎症性疾病之治療方法，其包括將如上述329所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 368.一種過敏疾病之治療方法，其包括將如上述331、334及335中任一項所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 369.一種尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療方法，其包括將如上述332所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。 370.一種硬皮病之治療方法，其包括將如上述333所記載之抗體組合物之有效量投予至對象。
371.一種用於類風濕性關節炎之治療之醫藥組合物，其包含如上述77所記載之抗體組合物。 372.一種用於乳糜瀉之治療之醫藥組合物，其包含如上述78所記載之抗體組合物。 373.一種用於炎症性腸病之治療之醫藥組合物，其包含如上述79所記載之抗體組合物。 374.一種用於多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述80所記載之抗體組合物。 375.一種用於多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述81所記載之抗體組合物。 376.一種用於過敏疾病之治療之醫藥組合物，其包含如上述82所記載之抗體組合物。 377.一種用於原發性骨髓纖維化症之治療之醫藥組合物，其包含如上述83所記載之抗體組合物。 378.一種用於選自自體免疫疾病、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述84所記載之抗體組合物。 379.一種用於全身性紅斑狼瘡之治療之醫藥組合物，其包含如上述85所記載之抗體組合物。 380.一種用於過敏疾病之治療之醫藥組合物，其包含如上述86所記載之抗體組合物。 381.一種用於牛皮癬之治療之醫藥組合物，其包含如上述87所記載之抗體組合物。 382.一種用於過敏疾病之治療之醫藥組合物，其包含如上述88所記載之抗體組合物。 383.一種用於選自哮喘、嗜酸性球鼻竇炎及異位性皮膚炎中之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述89所記載之抗體組合物。 384.一種用於哮喘及嗜酸性球鼻竇炎之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述90所記載之抗體組合物。 385.一種用於過敏疾病之治療之醫藥組合物，其包含如上述91所記載之抗體組合物。 386.一種用於朗格漢斯細胞組織細胞增生症(LCH)之治療之醫藥組合物，其包含如上述92所記載之抗體組合物。 387.一種用於全身性紅斑狼瘡之治療之醫藥組合物，其包含如上述93所記載之抗體組合物。 388.一種用於特發性肺纖維化症之治療之醫藥組合物，其包含如上述94所記載之抗體組合物。 389.一種用於癌症之治療之醫藥組合物，其包含如上述95所記載之抗體組合物。 390.一種用於全身性紅斑狼瘡之治療之醫藥組合物，其包含如上述96或97所記載之抗體組合物。 391.一種用於選自自體免疫疾病、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述98所記載之抗體組合物。 392.一種用於包括選自特發性肺纖維化症、全身性硬化症及肝硬化中之至少一者在內之纖維化疾病之治療之醫藥組合物，其包含如上述99所記載之抗體組合物。 393.一種用於特發性肺纖維化症之治療之醫藥組合物，其包含如上述100所記載之抗體組合物。 394.一種用於選自嗜中性球哮喘、慢性阻塞性肺病及阿茲海默症中之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述101所記載之抗體組合物。 395.一種用於選自克隆氏病、類風濕性關節炎及哮喘中之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述102所記載之抗體組合物。 396.一種用於多發性硬化症及視神經脊髓炎之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述103所記載之抗體組合物。 397.一種用於全身性紅斑狼瘡之治療之醫藥組合物，其包含如上述104或105所記載之抗體組合物。 398.一種用於多發性硬化症之治療之醫藥組合物，其包含如上述106所記載之抗體組合物。 399.一種用於肝硬化之治療之醫藥組合物，其包含如上述107所記載之抗體組合物。 400.一種用於全身性紅斑狼瘡之治療之醫藥組合物，其包含如上述108所記載之抗體組合物。 401.一種用於包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS)之治療之醫藥組合物，其包含如上述109所記載之抗體組合物。 402.一種用於包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS)之治療之醫藥組合物，其包含如上述110所記載之抗體組合物。 403.一種用於多發性硬化症之治療之醫藥組合物，其包含如上述111所記載之抗體組合物。 404.一種用於選自多發性硬化症、1型糖尿病及類風濕性關節炎中之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述112所記載之抗體組合物。 405.一種用於選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述113所記載之抗體組合物。 406.一種用於選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述114所記載之抗體組合物。 407.一種用於哮喘之治療之醫藥組合物，其包含如上述115所記載之抗體組合物。 408.一種用於全身性硬皮病之治療之醫藥組合物，其包含如上述116所記載之抗體組合物。 409.一種用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述117所記載之抗體組合物。 410.一種用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述118所記載之抗體組合物。 411.一種用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述119所記載之抗體組合物。 412.一種用於尋常性白斑及牛皮癬之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述120所記載之抗體組合物。 413.一種用於ANCA相關性血管炎及全身性紅斑狼瘡之至少一者之治療之醫藥組合物，其包含如上述121所記載之抗體組合物。 414.一種用於T細胞依賴性之免疫相關性疾病之治療之醫藥組合物，其包含如上述122所記載之抗體組合物。 415.一種用於免疫相關性疾病之治療之醫藥組合物，其包含如上述123所記載之抗體組合物。 416.一種用於牛皮癬性關節炎之治療之醫藥組合物，其包含如上述124所記載之抗體組合物。 417.一種用於包括修格連氏症候群及牛皮癬之至少一者在內之自體免疫疾病之治療之醫藥組合物，其包含如上述125所記載之抗體組合物。 [發明之效果]
本發明之抗體組合物包含第一及第二IgG半聚體，該第一及第二IgG半聚體具有針對互不相同之2種抗原之抗原結合域，其係互不相同之CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之2種IgG半聚體。因此，即便由第一IgG半聚體彼此、或第二IgG半聚體彼此構成同型締合體之抗體結構，亦無法與CD16a結合，從而無法發揮出抗體所具有之活性。另一方面，若藉由第一及第二IgG半聚體構成異型締合體之抗體結構，則可經由第一IgG半聚體中之第二CD16a結合區與第二IgG半聚體中之第一CD16a結合區而結合於CD16a。
又，將第一及第二IgG半聚體中之鉸鏈域進行改型以避免形成雙硫鍵。藉此，不會於第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之間形成H鏈間之雙硫鍵。因此，於將第一及第二IgG半聚體混合之情形時，可使第一及第二IgG半聚體以締合體或半聚體之平衡狀態存在。藉此，本發明之抗體組合物可相較於單陽性細胞，針對雙陽性細胞更特異性地發揮效應子功能而進行毒殺。
進而，本發明之抗體組合物對第一及第二IgG半聚體中之CD16a結合區或其他Fc區導入有特定之胺基酸改型。藉此，由第一及第二IgG半聚體形成之異型締合體表現出針對雙陽性細胞之經增強之效應子功能及/或經控制之體內動態。
1.抗體組合物之結構 於本發明中，抗體分子亦被稱為免疫球蛋白(以下表述為Ig)，人類抗體根據分子結構之不同，分為類IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgM之同型。亦將胺基酸序列之同源性相對較高之IgG1、IgG2、IgG3及IgG4總稱為IgG。
抗體分子包含被稱為重鏈(heavy chain，以下記為H鏈)及輕鏈(light chain，以下記為L鏈)之多肽。抗體為包含2個H鏈及2個L鏈之四聚物蛋白質。
又，H鏈自N末端側起包含H鏈可變區(亦表述為VH)、H鏈恆定區(亦表述為CH)之各區域，L鏈自N末端側起包含L鏈可變區(亦表述為VL)、L鏈恆定區(亦表述為CL)之各區域。CH於各亞型中，分別已知有α、δ、ε、γ及μ鏈。CL已知有λ及κ。
域係指構成抗體分子之各多肽之功能性之結構單元。又，本發明中之Fc區(Fc)係指包含鉸鏈域、CH2域及CH3域之H鏈恆定區之部分序列及部分結構。
CH自N末端側起包含CH1域、鉸鏈域、CH2域及CH3域之各域。本發明中之CH1域、鉸鏈域、CH2域、CH3域及Fc可根據EU索引[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]，藉由自N末端起之胺基酸殘基之編號而特定。
具體而言，CH1被特定為EU索引118～215位之胺基酸序列，鉸鏈被特定為EU索引216～230位之胺基酸序列，CH2被特定為EU索引231～340位之胺基酸序列，CH3被特定為EU索引341～447位之胺基酸序列。
作為本發明中之IgG，亦包括至少具有抗原結合域及Fc之與IgG功能類似之人工亞種之改型分子。具體而言，包括IgG之胺基酸殘基經置換、缺失或附加、或者修飾之改型分子、進而多肽或域之附加體等。又，亦包括將IgG之包含VH、VL、或Fab之抗原結合部位之一部分或全部置換為其他抗原結合域而成者。具體而言，亦包括圖1所示之單鏈Fv(scFv)-Fc、重鏈抗體之重鏈之可變域(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)(VHH)-Fc等(Brinkmann U et al., MABS 2017, 9: 182-212; Fernandes CFC et al., Frontiers in Immunology 2017, 8: 653)。
於本發明中，作為抗體，除了自融合瘤獲得之單株抗體以外，亦包括藉由基因重組技術製作之基因重組抗體。作為基因重組抗體，包含使人類抗體恆定區結合於非人類抗體可變區而成之嵌合抗體、人源化抗體、使用產生人類抗體之動物等所製作之人類抗體。
嵌合抗體可自來自生產單株抗體之非人類動物細胞之融合瘤獲得編碼VH及VL之cDNA，分別插入具有編碼人類抗體之CH及CL之DNA之動物細胞用表現載體，構建全人源嵌合抗體表現載體，並導入動物細胞，藉此使其表現而製造。
人源化抗體係指藉由將非人類抗體可變區之H鏈及L鏈之互補決定區(complementarity determining region，以下簡記為CDR)插入人類抗體可變區之架構區(以下簡記為FR)所製作之抗體。
人源化抗體(或CDR移植抗體)可藉由以下方法而製造。構建編碼包含非人類動物抗體之VH之CDR之胺基酸序列與任意人類抗體之VH之FR之胺基酸序列的VH之胺基酸序列之cDNA、及編碼包含非人類動物抗體之VL之CDR之胺基酸序列與任意人類抗體之VL之FR之胺基酸序列的VL之胺基酸序列之cDNA。將該等cDNA分別插入具有編碼人類抗體之CH及CL之DNA之動物細胞用表現載體，構建人源化抗體表現載體，並導入動物細胞中，藉此使其表現，由此可製造人源化抗體。
人類抗體係指原本可於人體內天然存在之抗體或包含由人類基因編碼之胺基酸序列之抗體，亦包括自藉由最近之基因工程、細胞工程、生殖工程上之技術之進步所製作之人類抗體噬菌體基因庫、永生人類末梢血液淋巴細胞之選殖或產生人類抗體之基因轉殖動物獲得之抗體等。
人類抗體可藉由對保持人類免疫球蛋白基因之小鼠(Tomizuka K. et al., Proc Natl Acad Sci USA.97,722-7,2000)免疫所需之抗原而獲得。又，藉由使用由來自人類之B細胞擴增抗體基因而得之噬菌體展示(phage display)基因庫，選擇具有所需之結合活性之人類抗體，藉此可不進行免疫而獲得人類抗體(Winter G. et al., Annu Rev Immunol. 12: 433-55. 1994)。
進而，藉由使用EB病毒(Epstein-Barr virus，艾司坦-巴爾病毒)使人類B細胞永生，而可製作生產具有所需之結合活性之人類抗體之細胞，從而獲得人類抗體(Rosen A. et al., Nature 267, 52-54. 1977)。
人體內存在之抗體係例如藉由使自人類末梢血液單離之淋巴細胞感染EB病毒等而永生後進行選殖，藉此可培養產生該抗體之淋巴細胞，而可自培養物中純化該抗體。
人類抗體噬菌體基因庫係藉由將由人類B細胞製備之抗體基因插入噬菌體基因而使Fab或scFv等抗體片段於表面表現之噬菌體之基因庫。可以針對固定抗原之受質之結合活性為指標，自該基因庫回收表現具有所需之抗原結合活性之抗體片段之噬菌體。該抗體片段亦可進而藉由基因工程方法轉化為包含2條完整之H鏈及2條完整之L鏈之人類抗體分子。
產生人類抗體之基因轉殖動物係指宿主動物之染色體內組入有人類抗體基因之動物。具體而言，可藉由向小鼠ES細胞(embryonic stem cell，胚胎幹細胞)導入人類抗體基因，並將該ES細胞移植於其他小鼠之早期胚胎後使其生長而製作產生人類抗體之基因轉殖動物。
由產生人類抗體之基因轉殖動物製作人類抗體之方法可藉由通常之人類以外之哺乳動物中進行之融合瘤製作方法獲得產生人類抗體之融合瘤並進行培養，藉此使培養物中產生人類抗體並蓄積。
作為VH及VL之胺基酸序列，可為人類抗體之VH及VL之胺基酸序列、非人類動物抗體之VH及VL之胺基酸序列、將非人類動物抗體之CDR移植於人類抗體之架構中而成之人源化抗體之胺基酸序列以及來自人類抗體之VH及VL之胺基酸序列之任一者。
具體而言，可例舉融合瘤或抗體產生細胞所產生之非人類動物抗體、人源化抗體及人類抗體之VH及VL之胺基酸序列等。
作為CL之胺基酸序列，可為人類抗體之胺基酸序列或非人類動物抗體之胺基酸序列之任一者，較佳為人類抗體之Cκ或Cλ之胺基酸序列。
作為CH，只要屬於免疫球蛋白，則可為任一者，較佳可使用屬於人類IgG類之亞型、γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)之任一者。
作為「抗原結合域」，可為利用抗體、配體及受體等已知之結合分子之結合域重組而成之結合蛋白，具體而言，可例舉包含結合於各抗原之抗體之CDR的重組蛋白、包含CDR之抗體可變區、包含結合於抗體可變區及各抗原之配體之結合域的重組蛋白等。其中，於本發明中，抗原結合域較佳為抗體可變區。
本發明之抗體組合物係包含第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物，具有以下之1)～6)之性質。 1)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含1個L鏈及1個H鏈，H鏈包含H鏈可變區、鉸鏈域、CH1、CH2及CH3域，於CH2域中具有互不相同之第一及第二CD16a結合區。 2)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體之鉸鏈域分別包含用以避免於第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之間形成H鏈間之雙硫鍵之一部分或整體之置換或缺失、或者修飾之改型。 3)第一IgG半聚體包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含使CD16a結合活性減弱之改型。 4)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於第二CD16a結合區中包含使CD16a結合活性減弱之改型。 5)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含使CD16a結合活性增強之改型。 6)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體中之至少一者包含相較於IgG1亞型之CH3域間相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。
「針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物」表示包含針對第一抗原之IgG半聚體及針對第二抗原之IgG半聚體之組合物。
作為本發明之抗體組合物中之IgG半聚體可採用之態樣，例如可例舉單體之半聚體及包含半聚體之締合體。作為半聚體，例如可例舉第一IgG半聚體、第二IgG半聚體。作為締合體，例如可例舉第一IgG半聚體之締合體、第二IgG半聚體之締合體、第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之締合體。具體而言，抗體組合物所含之第一及第二半聚體可處於包含第一半聚體之締合體及包含第二半聚體之締合體與包含第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之締合體之平衡狀態。
本發明之「針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物」亦包含含有針對同一抗原中之第一抗原決定基(表位)之IgG半聚體及針對第二抗原決定基(表位)之IgG半聚體之抗體組合物。
「IgG半聚體」係包含1個L鏈及1個H鏈之二聚物蛋白質，H鏈包含H鏈可變區、CH1～CH3域及鉸鏈域。IgG半聚體之H鏈之CH2域中存在互不相同之兩處CD16a結合區(第一及第二CD16a結合區)。
又，「IgG半聚體」亦包括具有抗原結合域及Fc之與IgG功能類似之人工亞種之改型分子之半聚體。具體而言，包括IgG之胺基酸經置換、缺失或附加、或者修飾之改型分子之半聚體、進而多肽或域之附加體之半聚體等。又，亦包括將IgG之包含VH、VL、或Fab之抗原結合部位之一部分或全部置換為其他抗原結合域而成者之半聚體、具體而言為圖1所示之單鏈Fv(scFv)-Fc、VHH-Fc等之半聚體。
「CD16a結合區」係指IgG之Fc中存在之與CD16a結合之區域。IgG1之Fc上之CD16a結合區根據Fc之結構之點對稱性而存在兩處，於包含構成Fc之兩條多肽鏈之CH2域中分別以不同之區域與CD16a相接(參照圖5)。
作為第一CD16a結合區，可例舉包含選自EU索引所表示之235位、236位、237位、238位、239位、265位、266位、267位、268位、269位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、301位、325位、327位及332位之胺基酸殘基中之至少一者之區域。
於CH2域之免疫球蛋白亞型為IgG1之情形時，作為第一CD16a結合區，可例舉包含選自EU索引所表示之235位之Leu、236位之Gly、237位之Gly、238位之Pro、239位之Ser、265位之Asp、266位之Val、267位之Ser、268位之His、269位之Glu、294位之Glu、295位之Gln、296位之Tyr、297位之Asn、298位之Ser、299之Thr、301位之Arg、325位之Asn、327位之Ala及332位之Ile之胺基酸殘基中之至少一者之區域。
作為第二CD16a結合區，可例舉包含選自EU索引所表示之235位、236位、237位、326位、327位、328位、329位及330位之胺基酸殘基中之至少一者之區域。
於CH2域之免疫球蛋白亞型為IgG1之情形時，作為第二CD16a結合區，可例舉包含選自EU索引所表示之235位之Leu、236位之Gly、237位之Gly、326位之Lys、327位之Ala、328位之Leu、329位之Pro及330位之Ala之胺基酸殘基中之至少一者之區域。
「CD16a結合活性」係指IgG之Fc結合於CD16a之活性。IgG半聚體之CD16a結合活性可藉由將2分子之IgG半聚體加以組合而構成IgG後，使其與基因重組CD16a蛋白進行反應並測定結合活性而進行確認(美國專利申請公開第2004/0259150號說明書)。
作為IgG半聚體之CD16a結合活性之測定方法之一態樣，例如針對於細胞膜上表現之CD16a之結合活性可藉由螢光抗體法(Cancer Immunol. Immunother., 36, 373, 1993)等進行測定。又，例如針對經純化之CD16a蛋白之結合活性可依據文獻[Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., 1995;酶免疫測定法，第3版，醫學書院(1987)；修訂版，酶抗體法，學際企畫(1985)]等所記載之西方墨點染色、RIA(Radioimmunoassay，放射免疫分析)、VIA(Viroimmunoassay，病毒免疫分析)、EIA(Enzymoimmunoassay，酶免疫分析)、FIA(Fluoroimmunoassay，螢光免疫分析)、MIA(Metalloimmunoassay，金屬免疫分析)等免疫學定量方法實施。
具體而言，例如於藉由EIA對針對經純化之CD16a蛋白之結合活性進行定量之情形時，可以如下方式實施。將FcγRIIIa固定於EIA用之塑膠板，使其與含有抗體組合物之試樣進行反應。繼而，使用合適之第二抗體測定所結合之抗體組合物之量。
對經純化之CD16a蛋白之結合活性亦可藉由使用生物感測器[例如，BIAcore(BIACORE公司製造)]之測定[J. Immunol. Methods, 200, 121 (1997)]或等溫滴定熱量測定(Isothermal Titration Calorimetry)法[Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 97, 9026 (2000)]等進行測定。
又，IgG半聚體之CD16a結合活性亦可藉由使IgG半聚體之Fc中具有下文所述之效應子功能(ADCC活性等)，將該IgG半聚體組合2分子而構成IgG，並測定該IgG之效應子功能而進行確認。
「效應子功能」係指經由抗體之Fc引起之抗體依賴性之功能。作為效應子功能，例如可例舉ADCC活性、CDC活性、或者利用巨噬細胞或樹狀細胞等吞噬細胞之抗體依賴性吞噬作用(Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis activity；ADCP活性)。作為效應子功能之測定方法，例如ADCC活性及CDC活性可使用Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)所記載之方法進行測定。
作為ADCC活性或CDC活性之測定方法之一態樣，例如可例舉如下方法。具體而言，例如可例舉下文於實施例中所述之方法。 1)作為效應細胞，使用培養基(例如RPMI(Roswell Park Memorial Institute，羅斯韋爾帕克紀念研究所)培養基)製備基因轉殖人類末梢血液單核細胞(PBMC)或人類CD16a並使其穩定地表現之細胞株與靶細胞。於CDC活性測定之情形時，將人類補體蛋白稀釋為合適之濃度，將所獲得之溶液與靶細胞混合而進行調整。 2)於細胞培養用容器(例如96孔板)中分注抗體溶液、靶細胞、效應細胞。將效應細胞與靶細胞之數比(E/T比)設為一定。 3)於CO2 保溫箱中靜置2～6小時左右。同時於100%反應孔中添加助溶溶液(例如含有酸、鹼、界面活性劑等之水溶液)，使靶細胞完全溶解。將反應容器進行離心分離後，採集上清液並分注於ELISA(enzyme linked immunosorbent assay     ，酶結合免疫吸附分析)板中。利用顯色溶液進行反應後，添加停止溶液，藉由讀板儀測定吸光度(A450)。 4)使用以下之式算出ADCC活性(%)或CDC活性(%)。
ADCC活性(%)或CDC活性(%)＝100×(S－E－T)/(Max－T) S＝樣品反應孔吸光度－培養基孔吸光度 E＝效應孔吸光度－培養基孔吸光度 T＝靶孔吸光度－培養基孔吸光度 Max＝100%反應孔－100%反應對照孔
再者，可使用公知之套組作為ADCC測定用套組，例如可例舉CytoTox96(R)非放射性細胞毒性檢測(Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)(Promega)。
ADCC活性係指結合於靶細胞上之抗原之抗體經由抗體之Fc而與免疫細胞之Fc受體結合，藉此將免疫細胞(自然殺手細胞等)活化而毒殺靶細胞之活性。
Fc受體(以下有時亦記為FcR)係結合於抗體之Fc之受體，藉由抗體之結合而誘發各種效應子功能。
FcR對應於抗體之亞型，IgG、IgE、IgA、IgM分別特異性地結合於FcγR、FcεR、FcαR、FcμR。進而，FcγR中存在FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)之亞型，分別存在FcγRIA、FcγRIB、FcγRIC、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB之同功型。該等不同之FcγR存在於不同之細胞上[Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)]。
人類中FcγRIIIB於嗜中性球中特異性地表現，FcγRIIIA於單核球、Natural Killer細胞(NK細胞)及一部分T細胞中表現。經由FcγRIIIA之抗體之結合誘發NK細胞依賴性之ADCC。
CDC活性係指結合於靶細胞上之抗原之抗體將血液中包含補體相關蛋白質群之一系列之級聯(補體活化路徑)活化而毒殺靶細胞之活性。又，藉由因補體之活化所產生之蛋白質片段可誘發免疫細胞之趨化、活化。
CDC活性之級聯係藉由以下方法開始：具有與抗體之Fc之結合域之C1q結合於Fc，與2個絲胺酸蛋白酶即C1r及C1s結合，藉此形成C1複合體。
「CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱」係指將Fc中附加了使第一及/或第二CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之改型的IgG半聚體組合2分子，由此獲得之IgG之CD16a結合活性及/或效應子功能(ADCC活性等)與將改型前之IgG半聚體組合2分子而成之IgG之CD16a結合活性及/或效應子功能相比有所減弱。
作為CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之一態樣，例如可例舉將附加了上述改型之IgG半聚體組合2分子而成之IgG之CD16a結合活性於以將上述改型前之IgG半聚體組合2分子而成之IgG之CD16a結合活性作為100%之情形時，較佳為60%以下，更佳為50%以下，進而較佳依序為40%以下、30%以下、20%以下、10%以下。
作為CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之一態樣，例如可例舉將附加了上述改型之IgG半聚體組合2分子而成之IgG之ADCC活性於以將上述改型前之IgG半聚體組合2分子而成之IgG之ADCC活性作為100%之情形時，較佳為80%以下，更佳為70%以下，進而較佳依序為60%以下、50%以下、40%以下、30%以下。
CD16a結合區中之CD16a結合活性藉由CD16a結合區中之改型而減弱。本說明書中之「改型」係指來自野生型之胺基酸序列之胺基酸殘基之改型，例如意指胺基酸殘基之置換、缺失或附加、或者修飾。於本說明書中，亦將胺基酸殘基之置換簡稱為胺基酸殘基置換。本說明書中之使CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之改型並不受本發明之抗體所結合之抗原之種類所特別限定，只要發揮出本發明之效果，則可將任一具有抗原結合域之抗體與任一改型組合。
作為使第一CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之改型，可例舉選自EU索引所表示之235位、236位、237位、238位、239位、265位、266位、267位、268位、269位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、301位、325位、327位及332位之胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基之置換，較佳為選自235位、238位、239位、265位、266位、267位、268位、269位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、301位、325位、327位及332位之胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基之置換，更佳為選自235位、238位、239位、265位、267位、269位、296位、298位、299位及327位之胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基之置換。作為胺基酸殘基置換之組合，例如可例舉238位及265位之組合(以下將此種組合表述為238位/265位等)、238位/267位、265位/267位、及238位/265位/267位之胺基酸殘基之置換。
於CH2域之免疫球蛋白亞型為IgG1之情形時，作為使第一CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之改型，可例舉選自EU索引所表示之235位之Leu、236位之Gly、237位之Gly、238位之Pro、239位之Ser、265位之Asp、266位之Val、267位之Ser、268位之His、269位之Glu、294位之Glu、295位之Gln、296位之Tyr、297位之Asn、298位之Ser、299位之Thr、301位之Arg、325位之Asn、327位之Ala及332位之Ile中之至少一個胺基酸殘基之置換，較佳為選自235位之Leu、238位之Pro、239位之Ser、265位之Asp、266位之Val、267位之Ser、268位之His、269位之Glu、294位之Glu、295位之Gln、296位之Tyr、297位之Asn、298位之Ser、299位之Thr、301位之Arg、325位之Asn、327位之Ala及332位之Ile中之至少一個胺基酸殘基之置換，更佳為選自235位之Leu、238位之Pro、239位之Ser、265位之Asp、267位之Ser、269位之Glu、296位之Tyr、298位之Ser、299位之Thr及327位之Ala中之至少一個胺基酸殘基之置換。具體而言，例如可例舉選自L235R、P238A、S239R、D265A、D265N、D265E、S267L、S267K、E269P、Y296P、S298E、T299A及A327I中之至少一個胺基酸殘基置換。
作為使第二CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之改型，可例舉選自EU索引所表示之235位、236位、237位、326位、327位、328位、329位及330位之胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基之置換，較佳為選自326位、328位、329位、330位之胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基之置換，更佳為選自326位、328位及329位之胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基之置換。作為胺基酸殘基置換之組合，例如可例舉326位/328位、326位/329位、328位/329位、326位/328位/329位之胺基酸殘基之置換。
於CH2域之免疫球蛋白亞型為IgG1之情形時，作為使第二CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之改型，可例舉選自EU索引所表示之235位之Leu、236位之Gly、237位之Gly、326位之Lys、327位之Ala、328位之Leu、329位之Pro及330位之Ala中之至少一個胺基酸殘基之置換，較佳為選自326位之Lys、328位之Leu、329位之Pro及330位之Ala中之至少一個胺基酸殘基之置換，更佳為選自326位之Lys、328位之Leu及329位之Pro中之至少一個胺基酸殘基之置換。具體而言，可例舉選自K326W、K326G、L328V、L328R、P329Y、P329K、P329W及A330P中之至少一個胺基酸殘基置換。
使第一IgG半聚體之CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之改型與使第二IgG半聚體之CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之改型之組合只要成為非對稱之改型，則無特別限制，可將上述改型適當組合。具體而言，可例舉下述胺基酸殘基之置換之組合。 ・第一IgG半聚體中之265位、及第二IgG半聚體中之329位之胺基酸殘基置換 ・第一IgG半聚體中之329位、及第二IgG半聚體中之265位之胺基酸殘基置換 ・第一IgG半聚體中之238位/267位、及第二IgG半聚體中之329位之胺基酸殘基置換 ・第一IgG半聚體中之329位、及第二IgG半聚體中之238位/267位之胺基酸殘基置換
使第一IgG半聚體之CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之改型(第一改型)與使第二IgG半聚體之CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之改型(第二改型)之組合較佳為以下表1所記載之組合，更佳為第一改型與第二改型成為S267K與P329Y、Y296P與P329Y、S298E與P329Y、D265A與P329Y或S239R與P329Y之組合。
[表1]
第一改型 第二改型    第一改型 第二改型
D265A P329Y Y296P P329K
P238A/S267L P329Y S298E P329K
S239R K326G T299A P329K
S239R L328R S239R P329W
D265A L328R D265A P329W
D265E L328R D265N P329W
S267K L328R D265E P329W
E269P L328R S267K P329W
Y296P L328R E269P P329W
S298E L328R Y296P P329W
T299A L328R S298E P329W
S239R P329Y T299A P329W
D265E P329Y L235R P329W
S267K P329Y A327I P329W
Y296P P329Y S239R A330P
S298E P329Y D265A A330P
T299A P329Y D265E A330P
L235R P329Y S267K A330P
A327I P329Y E269P A330P
S239R P329K Y296P A330P
D265A P329K S298E A330P
D265E P329K T299A A330P
S267K P329K L235R A330P
      A327I A330P
上述置換後之胺基酸殘基可設為能夠互相置換之胺基酸。以下示出能夠互相置換之胺基酸之例。同一群中包含之胺基酸能夠互相置換。 A群：白胺酸、異白胺酸、甘白胺酸、纈胺酸、正纈胺酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲硫胺酸、O-甲基絲胺酸、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、環己基丙胺酸 B群：天冬胺酸、麩胺酸、異天冬胺酸、異麩胺酸、2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸 C群：天冬醯胺、麩醯胺 D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2,4-二胺基丁酸、2,3-二胺基丙酸 E群：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸 F群：絲胺酸、蘇胺酸、高絲胺酸 G群：苯丙胺酸、酪胺酸
上述被置換之胺基酸為天然型或非天然型均可。作為天然型胺基酸，可例舉：L-丙胺酸、L-天冬醯胺、L-天冬胺酸、L-麩醯胺、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-精胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-半胱胺酸等。作為非天然型胺基酸，可例舉具有胺基與羧基之各種胺基酸，較佳為各種天然型胺基酸之衍生物較為理想。多數非天然型胺基酸可自各試劑公司(Sigma-Aldrich公司、TCI公司等)獲得。關於非天然型胺基酸，文獻(Chem. Today 2003, 65. ；Curr Opin Chem Biol. 2000, 6, 645.)中有大量揭示。
第一IgG半聚體中第一CD16a結合區中之CD16a結合活性因改型而有所減弱，且第二IgG半聚體中第二CD16a結合區中之CD16a結合活性因改型而有所減弱。因此，即便藉由第一IgG半聚體彼此、或第二IgG半聚體彼此構成同型締合體之抗體結構，亦無法與CD16a結合，從而無法發揮出抗體所具有之活性。
另一方面，若藉由第一及第二IgG半聚體構成異型締合體之抗體結構，則可經由第一IgG半聚體中之第二CD16a結合區與第二IgG半聚體中之第一CD16a結合區而結合於CD16a(參照圖5)。
第一及第二IgG半聚體具有互不相同之抗原結合域。因此，藉由構成包含第一及第二IgG半聚體之異型締合體之抗體結構，而僅於對在同一細胞上表現互不相同之2種抗原之靶細胞進行結合之情形時，才成為可結合CD16a而特異性地發揮出ADCC活性等效應子功能之抗體組合物。
將第一及第二IgG半聚體各自中之鉸鏈域進行改型，以避免藉由一部分或全部之置換或缺失、或者修飾而形成雙硫鍵。藉此，於第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之間不會形成H鏈間之雙硫鍵。
因此，藉由第一及第二IgG半聚體之並存，可使第一及第二IgG半聚體以締合體或半聚體之平衡狀態存在，從而可針對雙陽性細胞發揮出較高之特異性。
藉此，相較於針對僅表現第一抗原之靶細胞與僅表現第二抗原之靶細胞之效應子功能，本發明之抗體組合物可針對共同表現第一抗原及第二抗原之靶細胞特異性地發揮出效應子功能進行毒殺。
於本發明中，所謂「相較於針對僅表現第一抗原之靶細胞與僅表現第二抗原之靶細胞之效應子功能，而針對共同表現第一抗原及第二抗原之靶細胞特異性地發揮出效應子功能」係指相較於針對僅表現第一抗原之靶細胞及僅表現第二抗原之靶細胞(單陽性細胞)之效應子功能，針對共同表現第一抗原及第二抗原之靶細胞(雙陽性細胞)之效應子功能更強。
相較於單陽性細胞而針對雙陽性細胞表現出特異性之效應子功能可藉由[1]針對雙陽性細胞之較高之特異性及[2]經增強之效應子功能之項所說明之方法進行評價。
作為用以避免於第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之間形成H鏈間之雙硫鍵之鉸鏈域中之一部分之置換，例如可例舉EU索引所表示之226位及229位之胺基酸殘基置換。或可例舉包含該半胱胺酸部位之鉸鏈區域之一部分或全部之缺損。作為用以避免於第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之間形成H鏈間之雙硫鍵之鉸鏈域中之一部分之置換，具體而言，較佳為例如EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。
為了以上述平衡狀態存在，有效的是第一及第二IgG半聚體中之H鏈間之非共價鍵性之相互作用減弱，尤佳為CH3域間相互作用減弱。
具體而言，較佳為例如第一及第二IgG半聚體中之H鏈之CH3域間相互作用弱於IgG1亞型之CH3域間相互作用。
作為使CH3域間相互作用相較於IgG1亞型之CH3域間相互作用減弱之方法，較佳為於CH3域中導入胺基酸改型(胺基酸殘基之置換、缺失或附加、或者修飾等)，尤佳為導入胺基酸殘基置換。作為為了使CH3域間相互作用相較於IgG1亞型之CH3域間相互作用減弱而導入胺基酸改型之CH3域，可例舉IgG1之CH3域、IgG4之CH3域。
報告有藉由將人類IgG4之CH3域中之EU索引所表示之409位之Arg置換為來自人類IgG1之Lys，而提高CH3域彼此之相互作用(Structure 2011 19: 9: 1274-1282)。進而，報告有藉由將人類IgG1之CH3域內之特定之胺基酸殘基置換為Ala，而根據自由能之變化鑑定出對人類IgG1之CH3域彼此之相互作用而言重要之胺基酸部位(Biochemistry 1998: 37: 9266-9273)。
作為使CH3域間相互作用減弱之胺基酸殘基置換，只要為基於所使用之CH3域之胺基酸序列而CH3域間相互作用減弱者，則可為任一者，導入至第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之至少一者即可，較佳為導入至各者。使CH3域間相互作用減弱之胺基酸殘基置換可藉由使用結合(binding)ELISA、SPR(Surface plasmon resonance，表面電漿共振)法等結合分析、SDS-PAGE及非變性質譜(native mass spectrometry)等分子量分析等對包含所需之胺基酸殘基置換之分子進行評價而鑑定。
作為使CH3域間相互作用減弱之胺基酸殘基置換，具體而言可例舉將CH3域中選自EU索引所表示之349位、351位、366位、368位、399位、405位、407位及409位之至少一個胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基。
更具體而言，較佳為Y349A、L351A、T366A、L368A、D399A、F405A、Y407A、K409A及K409R，更佳為L368A、Y407A及K409R，最佳為K409R。該等胺基酸殘基置換可導入任一者，亦可將兩者以上組合導入。
2.抗體組合物之效應子功能之控制 本發明之抗體組合物亦可賦予依賴於第一及第二IgG半聚體中之Fc之效應子功能。抗體組合物之效應子功能可藉由各種方法進行控制。
例如，較佳為第一及第二IgG半聚體於CH2域中進而包含使CD16a結合活性增強之至少一個胺基酸殘基置換，藉此使CD16a結合活性進一步增強。藉此，可增強抗體組合物之效應子功能。
使CD16a結合活性增強之胺基酸殘基置換可導入至第一及第二IgG半聚體之各者，亦可僅導入至任一者。於將使CD16a結合活性增強之胺基酸殘基置換導入至第一及第二IgG半聚體之兩者之情形時，第一IgG半聚體中之胺基酸殘基置換與第二IgG半聚體中之胺基酸殘基置換可相同，亦可互不相同，較佳為相同。
於將用以增強抗體組合物之CD16a結合活性之胺基酸殘基置換導入至第一及第二IgG半聚體之兩者之情形時，該胺基酸殘基置換成為與為了使第一及第二IgG半聚體中之CD16a結合活性減弱而改型之區域不同之區域。
作為控制本發明之抗體組合物之效應子功能之方法，可例舉如以下之方法。
例如，藉由對第一及第二IgG半聚體中使用IgG1亞型之Fc之胺基酸序列於結合於EU索引297位之Asn之N鍵結複合型糖鏈(以下有時亦簡記為複合糖鏈)之還原末端側所存在之N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)進行α-1,6結合之岩藻糖(亦稱為核心岩藻糖)之量進行控制之方法(國際公開第2005/035586號、國際公開第2002/31140號、國際公開第00/61739號)、或置換抗體之Fc之胺基酸殘基，可對抗體組合物之效應子功能進行控制。
1)利用糖鏈改型之效應子功能之控制 藉由控制對結合於第一及第二IgG半聚體之Fc之複合糖鏈的還原末端之N-乙醯葡糖胺附加之岩藻糖之含量，可增強或降低抗體組合物之效應子功能。
作為降低對結合於IgG半聚體之Fc之N鍵結複合型糖鏈附加之岩藻糖之含量的方法，可藉由使用α1,6-岩藻糖轉移酶基因(FUT8)缺損之CHO細胞表現IgG半聚體，而獲得未結合岩藻糖之IgG半聚體。包含未結合岩藻糖之IgG半聚體之抗體組合物具有較高之ADCC活性。
另一方面，作為增加對結合於IgG半聚體之Fc之N鍵結複合型糖鏈附加之岩藻糖之含量的方法，可藉由使用導入有α1,6-岩藻糖轉移酶基因之宿主細胞使IgG半聚體表現，而獲得結合有岩藻糖之IgG半聚體。包含結合有岩藻糖之IgG半聚體之抗體組合物具有較包含未結合岩藻糖之IgG半聚體之抗體組合物更低之ADCC活性。
IgG半聚體之Fc中N鍵結型糖鏈結合於EU索引297位之Asn殘基，但糖鏈結合於其以外之Fc之Asn殘基之情況尚屬未知。因此，通常每1分子抗體結合有2條N-糖苷鍵結糖鏈。
作為N鍵結型糖鏈，已知有高甘露糖型、複合型及雜合型，任一N鍵結型糖鏈只要為未結合岩藻糖之糖鏈，則均可獲得高於結合有岩藻糖之糖鏈之ADCC活性。
作為結合於IgG半聚體之Fc之複合糖鏈，可例舉於核心結構(三甘露糖基核心結構)之非還原末端側之甘露糖(Man)α1-2結合或α1-4結合有1個以上之N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)或半乳糖-N-乙醯葡糖胺(以下表述為Gal-GlcNAc)之糖鏈。
進而可例舉於Gal-GlcNAc之非還原末端側具有唾液酸、平分型(bisecting)之N-乙醯葡糖胺(以下記為平分型GlcNAc)等之複合型(complex)糖鏈。
於本發明中，所謂核心岩藻糖(core-fucose)或α1,6-岩藻糖係指N-糖苷鍵結複合型糖鏈還原末端之N-乙醯葡糖胺(以下有時亦記為GlcNAc)之6位與岩藻糖(以下有時亦記為Fuc)之1位進行α結合而成之糖鏈結構。又，將於N-糖苷鍵結複合型糖鏈還原末端之N-乙醯葡糖胺未結合岩藻糖簡稱為無岩藻糖或無核心岩藻糖之糖鏈。
又，於本發明中，所謂核心結構或三甘露糖基核心結構(tri-mannosyl core structure)係指Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc結構。
作為結合於IgG半聚體之糖鏈，雙鏈N-糖苷鍵結複合糖鏈(亦稱為雙觸角(bi-antennary)複合糖鏈)係以下述化學式表示。
[化1]
Figure 02_image001
第一及第二IgG半聚體較佳為具有於EU索引297位之Asn上結合有複合糖鏈之Fc。若具有上述糖鏈結構，則亦可具有單一或複數種不同之糖鏈結構。具體而言，可例舉：第一及第二IgG半聚體中之結合於Fc之全部N-糖苷鍵結型糖鏈中，於糖鏈還原末端之N-乙醯葡糖胺未結合岩藻糖之糖鏈(無核心岩藻糖之糖鏈)之比率為20%以上之抗體組合物。
作為無核心岩藻糖之糖鏈之比率，若抗體組合物之ADCC活性增加，則包含任意比率，可例舉較佳為20%以上、更佳為51%～100%、進而較佳為80%～100%、尤佳為90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、最佳為100%之比率。
所謂無核心岩藻糖之糖鏈之比率為50%，例如包括如下抗體組合物之任一者：包含於結合於第一及第二IgG半聚體之N-糖苷鍵結糖鏈之一個糖鏈上未結合岩藻糖之分子100%的抗體組合物；或包含於結合於第一及第二IgG半聚體之N-糖苷鍵結糖鏈之兩個糖鏈上未結合岩藻糖之分子50%，且於結合於第一及第二IgG半聚體之N-糖苷鍵結糖鏈之兩個糖鏈上結合有岩藻糖之分子50%的抗體組合物。
於本發明中，作為無岩藻糖之糖鏈，若上述所示之化學式中於還原末端側之N-乙醯葡糖胺上未結合岩藻糖，則非還原末端側之糖鏈之結構可為任意者。
於本發明中，所謂於糖鏈還原末端之N-乙醯葡糖胺未結合岩藻糖之(無核心岩藻糖)係指實質上未結合岩藻糖。所謂實質上未結合岩藻糖之IgG半聚體，具體而言，係指為於下述所記載之糖鏈分析中實質上無法檢測出岩藻糖之程度之IgG半聚體的情形。所謂實質上無法檢測出之程度係指為測定之檢測極限以下。包含於所有糖鏈無核心岩藻糖之第一及第二IgG半聚體之抗體組合物具有最高之ADCC活性。
關於具有結合有N-糖苷鍵結複合型糖鏈之Fc之IgG半聚體中的具有無岩藻糖之糖鏈之IgG半聚體之比率，可藉由如下方式確定：使用肼分解或酶消化等公知之方法[生物化學實驗法23-糖蛋白質糖鏈研究法(學會出版中心)高橋禮子編(1989)]，使糖鏈自IgG半聚體游離，將所游離之糖鏈進行螢光標記或同位元素標記，將經標記之糖鏈利用層析法分離。
又，包含結合有複合糖鏈之Fc之IgG半聚體中所包含之結合有無岩藻糖之糖鏈之IgG半聚體之比率可藉由如下方式確定：藉由HPAED-PAD(high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection，高效陰離子交換層析-脈衝安培檢測)法(J. Liq. Chromatogr., 6, 1577, 1983)對所游離之糖鏈進行分析。
2)利用胺基酸殘基置換之效應子功能之控制 本發明之抗體組合物藉由第一IgG半聚體及第二IgG半聚體中之Fc之抗體亞型之轉化或Fc之胺基酸殘基置換，可增強或減弱ADCC活性、ADCP活性及CDC活性等效應子功能。
已知IgG1亞型之抗體具有IgG亞型中最高之ADCC活性、CDC活性，CH2域之免疫球蛋白亞型較佳為IgG1。
作為Fc之胺基酸殘基置換，例如可藉由使用美國專利申請公開第2007/0148165號說明書所記載之Fc之胺基酸序列，而增加抗體之CDC活性。又，藉由進行美國專利第6,737,056號說明書、美國專利第7,297,775號說明書及美國專利第7,317,091號說明書所記載之胺基酸殘基置換，可增強亦可減弱抗體組合物之ADCC活性或CDC活性。
作為增強ADCC活性之具體之胺基酸殘基置換，可例舉P247I、A339D、F243L、R292P、Y300L、P396L、T393A、H433P、S239D、S298A、A330L、I332E、E333A及K334A等。另一方面，作為減少ADCC活性之具體之胺基酸殘基置換，可例舉L235E、P238A、N297A、K322A及P331S等。
可將上述任意胺基酸殘基置換組合2個以上而增強ADCC活性，可根據目的增加所置換之胺基酸殘基。作為可增強ADCC活性之胺基酸殘基置換之組合，較佳為S298A/E333A/K334A/P247L、S298A/E333A/K334A/H268E、S298A/E333A/K334A/P247L/N421K、S298A/E333A/K334A/E294W、S298A/E333A/K334A/K326T、S298A/E333A/R292L/K334E、S298A/E333A/K334A/S239D、S298A/E333A/K334A/K248M、S239D/I332E、S239D/A330F、S239D/K326T、S239D/K326E、S239D/K326I、S239D/I332D、S239E/I332Y、S239E/I332E、S239E/K326T、及S239E/K326I。
增強ADCC活性之胺基酸殘基置換為了可影響抗體之藥物動力，較佳為導入有胺基酸殘基置換之抗體具有與未導入胺基酸殘基置換之野生型之IgG抗體同等之藥物動力。作為具體之胺基酸置換，較佳為S239D、S239E、S239D/K326T、S239D/A330F、S239D/K326E、S239E/I332E、S298A/E333A/K334A、S298A/E333A/K334A/H268E及S239D/S298A/E333A/L242C/K334C，更佳為S239D/K326T及S239D/S298A/E333A/L242C/K334C。所謂同等之藥物動力意指最高血中濃度(Cmax)、血中半衰期(t1/2)或血中濃度-時間曲線下面積(AUC)之任一指標與野生型之IgG抗體相比為50%以上150%以下。
作為增加CDC活性之具體之胺基酸殘基置換，可例舉選自K326A、S267E、H268F、S324T、K274Q、N276K、Y296F、Y300F、K326W、K326Y、E333A、E333S、A339T、D356E、L358M、N384S、K392N、T394F、T394Y、V397M及V422I中之至少1個胺基酸殘基置換。
亦可將上述任意胺基酸殘基置換組合2個以上而增加CDC活性，可根據目的增加所置換之胺基酸殘基。作為增加CDC活性之胺基酸殘基置換，較佳可例舉：選自N276K、A339T、T394F及T394Y中之至少一個胺基酸殘基置換；N276K及A339T之胺基酸殘基置換；以及K274Q、N276K、Y296F、Y300F、A339T、D356E、L358M、N384S、V397M及V422I之胺基酸殘基置換等。另一方面，作為減少CDC活性之具體之胺基酸殘基置換，可例舉L235E、N297A、K322A、P329A及P331S等。
又，藉由將T250Q、M428L、M252Y、S254T或T256E等胺基酸殘基置換導入至人類IgG1亞型之Fc，可延長血中半衰期。又，使用藉由對N297位導入胺基酸殘基置換而去除了N鍵結型糖鏈之Fc、人類IgG2或IgG4亞型之Fc或者IgG2與IgG4之嵌合Fc等，藉此可使ADCC活性、ADCP活性及CDC活性等細胞毒殺活性減弱或缺損。
3.抗體組合物之製造方法 本發明之抗體組合物之製造方法可例舉包括以下步驟1～3之製造方法。 步驟1：將包含編碼IgG半聚體之胺基酸序列之DNA的重組載體(以下亦簡稱為IgG半聚體表現用重組載體)導入至細胞而獲得轉形體之步驟。 步驟2：對步驟1中所獲得之轉形體進行培養，使IgG半聚體蓄積於培養物中，自培養物採集IgG半聚體之步驟。 步驟3：獲得包含步驟2中所採集之IgG半聚體之抗體組合物之步驟。 以下，對各步驟進行說明。
[步驟1] 步驟1係將包含編碼第一及第二IgG半聚體之至少一者之胺基酸序列之DNA的重組載體導入至細胞而獲得轉形體之步驟。 步驟(1)具體而言包括以下步驟(1-1)～(1-3)。 (1-1)對第一IgG半聚體中之第一CD16a結合區導入使CD16a結合活性減弱之改型之步驟。 (1-2)對第二IgG半聚體中之第二CD16a結合區導入使CD16a結合活性減弱之改型之步驟。 (1-3)導入以於第一及第二IgG半聚體之鉸鏈域中不會形成H鏈間之雙硫鍵之方式進行鉸鏈域之一部分或全部之置換或缺失、或者修飾之改型之步驟。
關於步驟(1-1)，例如可例舉於第一IgG半聚體表現用重組載體之製作中，根據CH2域之亞型而適當進行對選自EU索引所表示之235位、236位、237位、238位、239位、265位、266位、267位、268位、269位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、301位、325位、327位、332位之胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基進行置換的步驟。
關於步驟(1-2)，例如可例舉於第二IgG半聚體表現用重組載體之製作中，根據CH2域之亞型而適當進行對選自EU索引所表示之235位、236位、237位、326位、327位、328位、329位、330位之胺基酸殘基中之至少一個胺基酸殘基進行置換的步驟。
關於步驟(1-3)，例如可例舉於IgG半聚體表現用重組載體之製作中，根據鉸鏈域之亞型而適當進行增加EU索引所表示之226位及229位之胺基酸殘基之置換的步驟。
IgG半聚體可使用分子・選殖第二版、Current Protocols in Molecular Biology、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988、Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993, Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996等所記載之方法，例如以如下方式於轉形體中進行表現而獲得。
(1)IgG半聚體表現用之重組載體之構建 所謂IgG半聚體表現用重組載體係組入有編碼構成本發明之抗體組合物之IgG半聚體之胺基酸序列之基因的動物細胞用表現載體。
重組載體可藉由將編碼IgG半聚體之胺基酸序列之DNA選殖至動物細胞用表現載體而構建。
DNA可合成總DNA，亦可藉由聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction)(PCR法)進行合成(分子・選殖第二版)。進而，亦可藉由將該等方法複數種組合而製作編碼IgG半聚體之基因。
於使用動物細胞作為宿主之情形時，作為表現載體，只要為於動物細胞中可發揮功能者，則可使用任一種。例如可例舉：pcDNAI、pCDM8(舟越公司製造)、pAGE107[日本專利特開平3-22979號公報；Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、pAS3-3(日本專利特開平2-227075號公報)、pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司製造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司製造)、pREP4(Invitrogen公司製造)、pAGE103[J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93(國際公開第97/10354號)、N5KG1val(美國專利第6,001,358號說明書)及Tol2轉位子載體(國際公開第2010/143698號)等。
作為啟動子，只要為於動物細胞中可發揮功能功能者，則可使用任一種。例如可例舉：巨細胞病毒(CMV)之即刻早期(IE)基因之啟動子、SV40之早期啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子、或莫洛尼鼠白血病病毒之啟動子或增強子。又，亦可將人類CMV之IE基因之增強子與啟動子一起使用。
表現載體可使用抗體H鏈及L鏈存在於不同載體上之類型或存在於同一載體上之類型(以下表述為串聯型)中之任一種。
(2)編碼可變區之cDNA之獲得 編碼任意抗體之VH及VL之cDNA可以如下方式獲得。使用自產生任意抗體之融合瘤細胞提取之mRNA作為模板，而合成cDNA。將所合成之cDNA插入至噬菌體或質體等載體而製作cDNA庫。
使用編碼現有抗體之恆定區或可變區之DNA作為探針，自上述庫分別單離具有編碼VH之cDNA之重組噬菌體或重組質體及具有編碼L鏈可變區之cDNA之重組噬菌體或重組質體。確定重組噬菌體或重組質體上之目標抗體之VH及VL之完整鹼基序列，根據鹼基序列推測VH及VL之完整胺基酸序列。
生產任意非人類動物抗體之融合瘤細胞可以如下方式獲得，即用抗體所結合之抗原對非人類動物進行免疫，依據周知之方法[分子・選殖第二版、Current Protocols in Molecular Biology、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988；Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993；Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press,1996]，利用經免疫之動物之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞來製作融合瘤。繼而，選擇經單細胞選殖之融合瘤，對其進行培養，自培養上清液進行純化可獲得上述生產任意非人類動物抗體之融合瘤細胞。
作為非人類動物，只要為小鼠、大鼠、倉鼠或兔等能夠製作融合瘤細胞者，則可使用任意非人類動物。
作為由融合瘤細胞製備總RNA之方法，例如可例舉：硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)]、RNeasy套組(QIAGEN公司製造)，又，作為由總RNA製備mRNA之方法，可例舉：寡(dT)固定化纖維素管柱法[分子・選殖：實驗手冊(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989]等。
又，作為由融合瘤細胞製備mRNA之套組，例如可例舉：快速追蹤mRNA分離套組(Fast Track mRNA Isolation Kit)(Invitrogen公司製造)、快速製備mRNA純化套組(Quick Prep mRNA Purification Kit)(Pharmacia公司製造)等。
作為cDNA之合成及cDNA庫製作法，可例舉：常規方法(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34)、或使用市售之套組之方法。作為市售之套組，例如可例舉：cDNA合成及質體選殖之Super Script(註冊商標)質體系統(Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning)(GIBCO BRL公司製造)或ZAP-cDNA合成套組(ZAP-cDNA Synthesis Kit)(Stratagene公司製造)。
於製作cDNA庫時，關於供組入以自融合瘤細胞提取之mRNA為模板而合成之cDNA的載體，只要為供組入該cDNA之載體，則可使用任意者。
例如可使用ZAP Express(Strategies, 5, 58, 1992)、pBluescript II SK(+)(Nucleic Acids Research, 17, 9494, 1989)、λZAP II(Stratagene公司製造)、λgt10、λgt11(DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985)、Lambda BlueMid(Clontech公司製造)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia公司製造)、pcD2(Mol. Cell. Biol., 3, 280, 1983)及pUC18(Gene, 33, 103, 1985)等。
作為供導入由噬菌體或質體載體構建之cDNA庫之大腸桿菌，只要為可導入、表現及維持該cDNA庫者，則可使用任意者。
例如可使用XL1-Blue MRF(Strategies, 5, 81, 1992)、C600(Genetics, 39, 440, 1954)、Y1088、Y1090(Science, 222, 778, 1983)、NM522分子生物學期刊(J. Mol. Biol., 166, 1, 1983)、K802(J. Mol. Biol., 16, 118, 1966)及JM105(Gene, 38, 275, 1985)等。
作為自cDNA庫選擇編碼非人類動物抗體之VH及VL之cDNA純系之方法，可藉由使用經同位素或螢光等標記之探針之菌落-雜交法或噬菌斑-雜交法(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989)進行選擇。
又，亦可製備引子，以cDNA或cDNA庫作為模板，進行PCR(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34)，藉此製備編碼VH及VL之cDNA。
利用合適之限制酶等切斷藉由上述方法選擇出之cDNA後，選殖至pBluescript II SK(-)(Stratagene公司製造)等質體，進行通常使用之鹼基序列分析方法、例如進行Sanger等人之雙脫氧法(Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 74, 5463, 1977)等反應，並使用鹼基序列自動分析裝置、例如ABI PRISM377 DNA定序儀(Applied Biosystems公司製造)等鹼基序列分析裝置進行分析，藉此可確定該cDNA之鹼基序列。
根據所確定之鹼基序列推測VH及VL之完整胺基酸序列，並與已知之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)進行比較，藉此可確認所獲得之cDNA是否編碼完整地包含含有分泌訊息序列之抗體之VH及VL的胺基酸序列。
進而，於抗體可變區之胺基酸序列或編碼該可變區之DNA之鹼基序列已為公知之情形時，可使用以下方法進行製造。
於胺基酸序列為公知之情形時，考慮密碼子之使用頻度(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)而設計編碼該可變區之DNA之鹼基序列，基於所設計之DNA之鹼基序列，合成包含100～150個鹼基左右長度之數條合成DNA，使用其等進行PCR法，或合成全長DNA，藉此可獲得DNA。於鹼基序列為公知之情形時，可基於其資訊，以與上述同樣之方式獲得DNA。
(3)抗體之可變區之胺基酸序列之分析 關於包含分泌訊息序列之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列，與已知之抗體之VH及VL之胺基酸序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services,1991)進行比較，藉此可推測分泌訊息序列之長度及N末端胺基酸序列，進而可獲知抗體所屬之亞群(subgroup)。又，關於VH及VL之各CDR之胺基酸序列，亦可利用同樣之方法找出。
(4)編碼人源化抗體之可變區之cDNA之構建 編碼人源化抗體之VH及VL之cDNA可以如下方式進行構建。首先，選擇移植目標之非人類動物抗體之VH及VL之CDR的人類抗體之VH及VL之架構區(以下表述為FR)之胺基酸序列。作為人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列，只要為人類抗體者，則可使用任意者。
例如可例舉：登錄於蛋白質資料庫(Protein Data Bank)等資料庫中之人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列、人類抗體之VH及VL之FR之各亞群的共通胺基酸序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)等。
其中，為了製作具有充分活性之人源化抗體，較佳為選擇與目標之非人類動物抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列具有儘可能高之同源性(至少60%以上)之胺基酸序列。
繼而，將目標之非人類動物抗體之VH及VL之CDR的胺基酸序列移植至所選擇之人類抗體之VH及VL之FR的胺基酸序列，而設計人源化抗體之VH及VL之胺基酸序列。考慮抗體之基因之鹼基序列中可見之密碼子的使用頻度(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)，將所設計之胺基酸序列轉化為DNA之鹼基序列，而設計編碼人源化抗體之VH及VL之胺基酸序列的DNA之鹼基序列。完整合成所設計之DNA之鹼基序列。
又，將合適之限制酶之識別序列導入至位於兩端之合成DNA之5'末端，藉此可容易地選殖至上述3(1)中所構建之IgG半聚體表現用重組載體。PCR後，將擴增產物選殖至pBluescript II SK(-)(Stratagene公司製造)等質體，藉由上述3(2)所記載之方法確定鹼基序列，獲得所需之具有編碼人源化抗體之VH及VL之胺基酸序列的DNA之鹼基序列之質體。
(5)人源化抗體之可變區之胺基酸序列之改型 關於人源化抗體，已知若僅將非人類動物抗體之VH及VL之CDR移植至人類抗體之VH及VL之FR，則其抗原結合活性較原本之非人類動物抗體降低(BIO/TECHNOLOGY, 9, 266, 1991)。
作為其原因，認為於原本之非人類動物抗體之VH及VL中，不僅CDR，FR之若干個胺基酸殘基亦直接或間接地與抗原結合活性相關，該等胺基酸殘基伴隨著CDR之移植，而向人類抗體之VH及VL之FR之不同胺基酸殘基變化。
為了解決該問題，而進行如下操作：對於人源化抗體，於人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列中，鑑定直接參與和抗原之結合之胺基酸殘基、或與CDR之胺基酸殘基相互作用，維持抗體之立體結構，且間接地參與和抗原之結合之胺基酸殘基，將其等改型為源自原本之非人類動物抗體之胺基酸殘基，而使降低至抗原結合活性上升(BIO/TECHNOLOGY, 9, 266, 1991)。
於人源化抗體之製作中，最重要的是如何高效率地鑑定該等與抗原結合活性相關之FR之胺基酸殘基，為此，藉由X射線結晶分析(J. Mol. Biol., 112, 535, 1977)或電腦建模(computer modeling)(Protein Engineering, 7, 1501, 1994)等而進行抗體之立體結構之構建及分析。
該等抗體之立體結構之資訊為人源化抗體之製作帶來了大量有益之資訊。然而，能夠適合所有抗體之人源化抗體之製作法尚未建立。現狀為需要針對各抗體製作數種改型體，對各自與抗原結合活性之關聯進行研究等各種試誤。
人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸殘基之改型可藉由使用改型用合成DNA進行3(4)所記載之PCR法而達成。關於PCR後之擴增產物，藉由3(2)所記載之方法確定鹼基序列，而確認已實施目標之改型。
(6) IgG半聚體之表現 將上述3(1)之IgG半聚體表現用重組載體導入至合適之動物細胞，藉此可短暫性或穩定地獲得生產第一及第二IgG半聚體之至少一者之轉形體。
(6-a)抗體組合物之短暫性表現 使用(3)及(6)中所獲得之IgG半聚體表現用重組載體、或改型其等所獲得之重組載體進行抗體組合物之短暫性表現，而可有效率地對所製作之多種抗體組合物之抗原結合活性進行評價。
關於供導入IgG半聚體表現用重組載體之宿主細胞，只要為可表現第一及第二IgG半聚體之至少一者之宿主細胞，則可使用任意細胞。例如可例舉COS-7細胞[American Type Culture Collection(ATCC)編號：CRL1651](Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283, 1991)。
向COS-7細胞導入IgG半聚體表現用重組載體時使用DEAE-葡聚糖法(Methods in Nucleic Acids Res., CRC press,1991)、或脂轉染法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413, 1987)等。
導入IgG半聚體表現用重組載體後，培養上清液中之IgG半聚體之表現量及抗原結合活性係使用酶免疫抗體法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third Edition, Academic Press(1996)；Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；單株抗體實驗指南，Kodansha Scientific(1987)]等進行測定。
(6-b) IgG半聚體之穩定表現 將(1)中所獲得之IgG半聚體表現用重組載體導入至合適之宿主細胞，藉此可獲得穩定地表現IgG半聚體之轉形體。
向宿主細胞導入重組載體時，只要為可向宿主細胞導入DNA之方法，則可使用任意方法，例如可例舉：電穿孔法(Cytotechnology, 3, 133, 1990)、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075號公報)、脂轉染法(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84, 7413, 1987)、注入法[Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual]、使用粒子槍(基因槍)之方法(日本專利第2606856號說明書、日本專利第2517813號說明書)、DEAE-葡聚糖法[生物學手冊系列4-基因轉殖與表現、分析法(羊土社)橫田崇、新井賢一編(1994)]、病毒載體法(Manipulating Mouse Embryo第二版)等。
作為供導入重組載體之宿主細胞，只要為可表現第一及第二IgG半聚體之至少一者之宿主細胞，則可使用任意細胞。例如可例舉：人類白血病細胞Namalwa細胞、猴COS細胞、作為中國倉鼠之細胞之CHO細胞、HBT5637(日本專利特開昭63-299號公報)、大鼠骨髓瘤細胞、小鼠骨髓瘤細胞、源自金倉鼠腎臟之細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等。
具體而言，例如可例舉：PER.C6、CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies，Cat #11619)、Lec13細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(ATCC編號：CRL1662、或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NS0、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14(ATCC編號：CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC編號：CRL1580)、二氫葉酸還原酶基因(Dihydroforate Reductase，以下表述為dhfr)缺損之CHO細胞(CHO/DG44)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)]、金倉鼠細胞BHK、HBT563細胞、使上述細胞株之亞株細胞及上述細胞株於無血清培養下適應過之細胞、於非黏著條件下之培養條件下適應過之細胞等。
作為IgG半聚體之生產所使用之細胞，亦可使用使與Fc中之EU索引297之Asn結合之糖鏈的核心岩藻糖量降低或缺損之細胞。具體而言，可選擇參與GDP-L-岩藻糖之合成或高爾基體之輸送的酶或者參與核心岩藻糖之結合之酶降低或缺損之細胞，或者亦可使用藉由各種人為方法所獲得之細胞作為宿主細胞。
具體而言，可藉由使與核心岩藻糖糖鏈修飾相關之酶活性減少或缺損之方法、或使核心岩藻糖切斷酶活性增加之方法等來製作核心岩藻糖受到控制之細胞。
作為與核心岩藻糖糖鏈修飾相關之酶，例如可例舉：參與GDP-L-岩藻糖之合成或輸送之酶或者參與N-糖苷鍵結複合型糖鏈之核心岩藻糖之結合之酶。
作為參與GDP-L-岩藻糖之合成或向高爾基體之輸送之酶，具體而言，例如可例舉：GDP-甘露糖 4,6-脫水酶(以下表述為GMD)、GDP-4-酮-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶(以下表述為Fx)、GDP-β-L-岩藻糖-焦磷酸化酶(GFPP)、岩藻糖激酶、GDP-L-岩藻糖轉運體等。
作為參與核心岩藻糖之結合之酶，例如可例舉：α1,6-岩藻糖轉移酶(以下表述為FUT8)等。
作為生產IgG半聚體之細胞，可使上述1種酶活性降低或缺損，亦可將複數種酶活性組合而使其降低或缺損。
作為上述使酶活性降低或缺損之方法，例如可例舉如下方法：(a)以酶之基因作為靶之基因破壞之方法；(b)導入酶之基因之顯性負性體之方法；(c)導入針對酶之突變之方法；(d)抑制酶之基因之轉錄或轉譯之方法；(e)選擇對於識別N-糖苷鍵結糖鏈還原末端之N-乙醯葡糖胺之6位與岩藻糖之1位進行α結合而成之糖鏈結構的凝集素有耐性之株之方法等。
作為凝集素，例如可例舉：兵豆凝集素LCA(源自兵豆(Lens Culinaris)之兵豆凝集素(Lentil Agglutinin))、豌豆凝集素PSA(源自豌豆(Pisum sativum)之豌豆凝集素(Pea Lectin))、蠶豆凝集素VFA(源自蠶豆(Vicia faba)之凝集素(Agglutinin))、橙黃網孢盤菌凝集素AAL(源自橙黃網孢盤菌(Aleuria aurantia)之植物凝集素(Lectin))等與α1,6岩藻糖結合之凝集素。
作為具體之細胞，例如可例舉：FUT8基因缺損之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第2002/31140號、國際公開第2000/061739號)、獲得了凝集素耐性之Lec13(Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55, 1986)、GDP-岩藻糖轉運體基因缺損之細胞(國際公開第2003/085102號)、GDP-甘露糖4,6-脫水酶(GMD)基因缺損之細胞(國際公開第2002/31140號)、WGA凝集素耐性細胞及LCA凝集素耐性細胞(國際公開第2002/31140號)等。
除了上述方法以外，藉由抑制與N鍵結型糖鏈之合成系統相關之酶即甘露糖酶I、甘露糖酶II等酶，亦可使高甘露糖型之N鍵結型糖鏈結合且核心岩藻糖量減少之IgG半聚體表現。
又，藉由使用使N-乙醯葡萄糖胺轉移酶III(GnTIII)過量表現之宿主細胞，亦可生產結合有平分型GlcNAc之複合及雜合糖鏈結合且核心岩藻糖量減少之IgG半聚體。
導入重組載體後，使IgG半聚體穩定表現之轉形體係藉由於包含G418硫酸鹽(以下表述為G418)、環己醯亞胺(以下簡記為CHX)、甲胺喋呤(以下簡記為MTX)等藥劑之動物細胞培養用培養基中進行培養而選擇(日本專利特開平2-257891號公報)。
作為動物細胞培養用培養基，例如可例舉：RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)、GIT培養基(日本製藥公司製造)、EX-CELL301培養基、EX-CELL302、EX-CELL325培養基(JRH公司製造)、IMDM培養基(Invitrogen公司製造)、Hybridoma-SFM培養基(Invitrogen公司製造)、或於該等培養基中添加有胎牛血清(以下簡記為FBS)等各種添加物之培養基等。
藉由將所獲得之轉形體於培養基中進行培養，而於培養上清液中使IgG半聚體表現並蓄積。培養上清液中之IgG半聚體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等進行測定。又，可利用dhfr基因擴增系(日本專利特開平2-257891號公報)等，使轉形體所產生之IgG半聚體之表現量提高。
以上示出了以動物細胞作為宿主之IgG半聚體之表現方法，但於酵母、昆蟲細胞、植物細胞或者動物個體或植物個體中，亦可基於公知技術並藉由與動物細胞相同之方法使IgG半聚體表現。
於以酵母作為宿主細胞之情形時，可例舉：屬於酵母屬、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、絲孢酵母屬、施萬酵母屬等之微生物，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽絲孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸施萬酵母(Schwanniomyces alluvius)等。
作為重組載體之導入方法，只要為向酵母導入DNA之方法，則可使用任一種方法，例如可例舉：電穿孔法(Methods. Enzymol., 194, 182, 1990)、球形質體法(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 84, 1929, 1978)、乙酸鋰法(J. Bacteriology, 153, 163, 1983; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 75, 1929, 1978)中所記載之方法等。
於使用昆蟲細胞作為宿主之情形時，例如可藉由Current Protocols in Molecular Biology(Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York, 1992)、Bio/Technology, 6, 47, 1988等中所記載之方法使IgG半聚體表現。
[步驟2] 步驟2係對步驟1中所獲得之轉形體進行培養，於培養物中生成並蓄積IgG半聚體，自培養物中採集IgG半聚體並對其進行純化的步驟。
第一及第二IgG半聚體可自同一轉形體中採集，亦可自使各自單獨表現之轉形體中採集。通常情況下，第一及第二IgG半聚體係於自單獨表現各自之轉形體中採集並純化後，進行混合而製備抗體組合物。
於步驟1中所製備之宿主細胞具有表現IgG半聚體之能力之情形時，可向以下所示之宿主細胞導入IgG半聚體後，培養該細胞，自該培養物採集目標之IgG半聚體。
進而，藉由使經基因轉殖之動物或植物之細胞進行再分化，亦可造就出導入有基因之動物個體(基因轉殖非人類動物)或植物個體(基因轉殖植物)，使用該等個體採集IgG半聚體。
於轉形體為動物個體或植物個體之情形時，可依據通常之方法進行飼養或栽培，生成並蓄積IgG半聚體，自該動物個體或植物個體採集該IgG半聚體。
作為使用動物個體生產IgG半聚體之方法，例如可例舉如下方法：於依據公知之方法(American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S, 1996; American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S, 1996; Bio/Technology, 9, 830, 1991)導入基因而造就之動物中生產目標之IgG半聚體之方法。
於動物個體之情形時，例如可飼養導入有編碼IgG半聚體之DNA的基因轉殖非人類動物，於該動物中生成並蓄積IgG半聚體，自該動物中採集IgG半聚體。
作為上述動物中之生成及蓄積位置，例如可例舉該動物之乳汁(日本專利特開昭63-309192號公報)或卵等。作為此時所使用之啟動子，只要為可於動物中表現者，則可使用任一者。例如可適宜地使用作為乳腺細胞特異性啟動子之α酪蛋白啟動子、β酪蛋白啟動子、β乳球蛋白啟動子及乳清酸性蛋白質啟動子等。
作為使用植物個體生產IgG半聚體之方法，例如可例舉如下方法：將導入有編碼IgG半聚體之DNA的基因轉殖植物依據公知之方法[組織培養，20(1994)；組織培養，21(1995)；Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)]進行栽培，使IgG半聚體於該植物中生成並蓄積，自該植物中採集該IgG半聚體。
IgG半聚體可以如下方式進行純化。關於藉由導入有編碼IgG半聚體之基因之轉形體所製造之IgG半聚體，例如於IgG半聚體於細胞內作為可溶性蛋白質表現之情形時，於培養結束後藉由離心分離回收細胞，於水系緩衝液中懸浮後，使用超音波破碎機、法式壓碎機、Manton Gaulin均質機、球磨機等將細胞破碎，而獲得無細胞萃取液。
可藉由將上述無細胞萃取液進行離心分離而獲得上清液，將通常之酶之單離純化法、即溶劑萃取法、利用硫酸銨等之鹽析法、除鹽法、利用有機溶劑之沈澱法、使用二乙胺基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、DIAION HPA-75(三菱化學公司製造)等樹脂之陰離子交換層析法、使用S-瓊脂糖凝膠(S-Sepharose)FF(Pharmacia公司)等樹脂之陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖凝膠、苯基瓊脂糖凝膠等樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦法、等電點電泳等電泳法等方法單獨或組合使用，而自所獲得之上清液純化IgG半聚體。
於本發明中，作為親和層析儀，可利用使用CH結合體或Fc結合體之親和層析儀(Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third Edition, Academic Press, 1996; Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
又，於IgG半聚體在細胞內形成不溶體而表現之情形時，同樣地回收細胞後將其破碎，進行離心分離，藉此以沈澱組分回收IgG半聚體之不溶體。利用蛋白質改性劑將所回收之IgG半聚體之不溶體進行可溶化。可藉由對該可溶化液進行稀釋或透析，而使該IgG半聚體恢復為正常之立體結構後，利用與上述同樣之單離純化法而純化該IgG半聚體。
於IgG半聚體被分泌至細胞外之情形時，可於培養上清液中回收該IgG半聚體或其衍生物。即，可藉由利用與上述同樣之離心分離等方法對該培養物進行處理而獲得培養上清液，且藉由使用與上述同樣之單離純化法，而可自該培養上清液純化IgG半聚體。
作為CH結合體或Fc結合體，具體而言，只要為與CH或Fc結合者，則可為蛋白質、樹脂等任意者，例如可例舉：Fc結合蛋白、與抗體H鏈恆定區(CH)結合之抗體等。
作為Fc結合蛋白，例如可例舉：源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)之蛋白A、源自溶血性鏈球菌(hemolytic Streptococcus)之蛋白G、Fc受體及該亞型(FcγRI、IIA、IIB、IIIA、IIIB)以及該等之結合部分片段等。
作為與CH結合之抗體，例如可例舉：與CH1域、鉸鏈域、CH2域或CH3域結合之抗體。
本發明中作為CH結合體，更佳可例舉：蛋白A、蛋白G、抗CH1抗體及該結合部分片段。
作為IgG半聚體之純化方法，例如將[步驟1](6)中使用上述轉形體所培養之培養上清液裝入至蛋白A管柱或蛋白G管柱後，使用磷酸緩衝液(phosphase buffer saline，以下簡記為PBS)將該管柱洗淨。
其後，於低pH值(pH值2.0～6.0)之檸檬酸緩衝液等中使IgG半聚體自管柱中溶出，利用鹼性之Tris緩衝液等將溶出液中和。經中和之溶出液係利用充分量之PBS等進行透析，而可獲得經純化之IgG半聚體。
經純化之IgG半聚體之分子量可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳法[Nature, 227, 680 (1970)]、或西方墨點法[Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third Edition, Academic Press (1996); Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等進行測定。
[步驟3] 步驟3係將步驟2中所採集、純化之第一及第二IgG半聚體混合，而獲得抗體組合物之步驟。第一及第二IgG半聚體之混合比率較佳為根據針對抗原之結合活性、針對抗原陽性培養細胞株之結合活性、針對各CD16a結合區中之CD16a結合活性之強度、第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之CH3間之相互作用等而適當設定。
又，本發明之抗體組合物亦可藉由使上述第一及第二IgG半聚體表現用重組載體同時表現於宿主細胞中並進行純化，而作為混合有第一及第二IgG半聚體之抗體組合物進行製作。於該情形時，關於第一及第二IgG半聚體之混合比率，可藉由對編碼各半聚體之基因之表現量進行控制，而製造所需混合比之抗體組合物。又，編碼第一及第二IgG半聚體之基因可利用同一表現用重組載體使其表現，亦可利用不同之表現用重組載體使其分別表現。
4.抗體組合物之活性評價 作為對經純化之IgG半聚體之蛋白質量、包含IgG半聚體之抗體組合物之FcR結合活性、C1q結合活性、抗原結合活性、或ADCC活性或者CDC活性等細胞毒殺活性進行測定之方法，例如可例舉：Molecular Cloning 2nd Eidition, Current Protocoals in Molecular BioloGy; Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996等所記載之公知之方法。
作為具體之例，抗體組合物之與抗原之結合活性、針對抗原陽性培養細胞株之結合活性可藉由ELISA法及螢光抗體法(Cancer Immunol. Immunother, 36, 373, 1993)等進行測定。針對抗原陽性培養細胞株之細胞毒殺活性可藉由測定CDC活性、ADCC活性等進行評價(Cancer Immunol. Immunother, 36, 373, 1993；美國專利申請公開第2004/0259150號說明書)。
抗體組合物具有對CD16a之結合活性可藉由如下方式進行確認：製作基因重組CD16a蛋白而測定結合活性(美國專利申請公開第2004/0259150號說明書)。
作為測定ADCC活性之方法，例如可例舉如下方法等：使經放射性同位素、螢光物質或色素等標記之靶細胞、抗體組合物及效應細胞接觸後，對自被毒殺之靶細胞游離之標記物質的活性或游離之酶之生理活性等進行測定。
作為測定CDC活性之方法，例如可例舉如下方法等：使經放射性同位素、螢光物質或色素等標記之靶細胞、抗體組合物及包含補體成分之血清等生物樣本接觸後，對自被毒殺之靶細胞游離之標記物質的活性或游離之酶之生理活性進行測定。
5.糖鏈結構之分析 於各種細胞中表現之IgG半聚體之糖鏈結構可依據通常之糖蛋白質之糖鏈結構之分析進行。
例如，結合於IgG半聚體之糖鏈包含半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)或岩藻糖(Fuc)等中性糖、N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)等胺基糖或唾液酸(Sial)等酸性糖，可使用糖組成分析及使用二維糖鏈映射表法等之糖鏈結構分析等方法來進行。
(1)中性糖、胺基糖組成分析 IgG半聚體之糖鏈之組成分析可藉由利用三氟乙酸等進行糖鏈之酸水解，使中性糖或胺基糖游離並分析其組成比。
作為具體之方法，例如可例舉使用Dionex公司製造之糖組成分析裝置之方法。BioLC係藉由HPAEC-PAD(high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection)法(J. Liq. Chromatogr., 6, 1577, 1983)對糖組成進行分析之裝置。
又，藉由利用2-胺基吡啶之螢光標記化法亦可分析組成比。具體而言，依據公知之方法[Agric. Biol. Chem., 55(1), 283-284, 1991]，將經酸水解之試樣利用2-胺基吡啶基化進行螢光標記化，進行HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析)分析而可算出組成比。
(2)糖鏈結構分析 IgG半聚體中之糖鏈之結構分析可藉由二維糖鏈映射表法(Anal. Biochem., 171, 73, 1988；生物化學實驗法23-糖蛋白質糖鏈研究法，學會出版中心，高橋禮子編，1989年)進行。二維糖鏈映射表法係例如分別於X軸上將藉由逆相層析法獲得之糖鏈之保持時間或溶出位置進行繪製，於Y軸上將藉由正相層析法獲得之糖鏈之保持時間或溶出位置進行繪製，與已知糖鏈之該等結果進行比較，藉此推測糖鏈結構之方法。
具體而言，使IgG半聚體進行肼分解，自IgG半聚體使糖鏈游離，利用2-胺基吡啶(以下簡記為PA)進行糖鏈之螢光標記(J. Biochem., 95, 197, 1984)後，藉由凝膠過濾將糖鏈與過量之PA化試劑等進行分離，進行逆相層析。繼而，對於所分取之糖鏈之各波峰進行正相層析。基於該等結果，於二維糖鏈映射表上進行繪製，根據與糖鏈標準品(TaKaRa公司製造)、文獻(Anal. Biochem., 171, 73, 1988)之定點(spot)之比較可推測糖鏈結構。
進而進行各糖鏈之MALDI-TOF-MS(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，基質輔助雷射脫附游離-飛行時間-質譜法)等質譜分析，可確認藉由二維糖鏈映射表法所推測之結構。
關於在IgG半聚體之Fc之任意部分是否結合有糖鏈，可藉由如下方式進行確認：將利用胰蛋白酶、胃蛋白酶、Lys-C、Asp-N等內切蛋白酶對經還原烷基化處理之IgG半聚體進行處理所得者利用逆相層析儀(LC)分離後，利用質譜儀(MS)等進行分析。
即，基於目標之IgG半聚體之Fc之胺基酸序列，可根據藉由蛋白酶處理可生成之肽之分子量及結合有糖鏈之肽之分子量、與MS之分析值是否一致，而確認是否實際上結合有糖鏈。
6.糖鏈結構之識別方法 IgG半聚體中之與Fc結合之全部N-糖苷鍵結複合型糖鏈中，無核心岩藻糖之糖鏈之比率可藉由使用上述5.所記載之糖鏈結構之分析法進行識別。又，亦可藉由利用使用凝集素之免疫學定量方法進行識別。
利用使用凝集素之免疫學定量方法之IgG半聚體中之糖鏈結構之識別可依據文獻[Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., (1995)；酶免疫測定法，第3版，醫學書院(1987)；修訂版，酶抗體法，學際企畫(1985)]等所記載之西方墨點染色、RIA(Radioimmunoassay)、VIA(Viroimmunoassay)、EIA(Enzymoimmunoassay)、FIA(Fluoroimmunoassay)、MIA(Metalloimmunoassay)等免疫學定量方法，例如以如下方式進行。
對識別IgG半聚體之糖鏈結構之凝集素進行標記，使經標記之凝集素與作為試樣之抗體組合物進行反應。繼而，對所標記之凝集素與抗體組合物之複合體之量進行測定。
作為用於識別IgG半聚體之糖鏈結構之凝集素，例如可例舉：WGA(源自百里香(T. vulgaris)之麥胚凝集素(wheat-germ agglutinin))、ConA(源自矮生刀豆(C. ensiformis)之刀豆球蛋白(concanavalin)A)、RIC(源自蓖麻(R. communis)之毒素)、L-PHA(源自普通變形桿菌(P. vulgaris)之白血球凝集素(leukoagglutinin))、LCA(源自兵豆(L. culinaris)之兵豆凝集素(lentil agglutinin))、PSA(源自豌豆(P. sativum)之豌豆凝集素(Pea Lectin))、AAL(橙黃網孢盤菌凝集素(Aleuria aurantia Lectin))、ACL(尾穗莧凝集素(Amaranthus caudatus Lectin))、BPL(洋紫荊凝集素(Bauhinia purpurea Lectin))、DSL(曼陀羅凝集素(Datura stramonium Lectin))、DBA(雙花扁豆凝集素(Dolichos biflorus Agglutinin))、EBL(接骨木凝集素(Elderberry Balk Lectin))、ECL(刺桐凝集素(Erythrina cristagalli Lectin))、EEL(歐洲衛矛凝集素(Euonymus europaeus Lectin))、GNL(雪花草凝集素(Galanthus nivalis Lectin))、GSL(西非單葉豆凝集素(Griffonia simplicifolia Lectin))、HPA(蝸牛凝集素(Helix pomatia Agglutinin))、HHL(孤挺花凝集素(Hippeastrum Hybrid Lectin))、榴蓮凝集素(Jacalin)、LTL(翅莢百脈根凝集素(Lotus tetragonolobus Lectin))、LEL(番茄凝集素(Lycopersicon esculentum Lectin))、MAL(山槐凝集素(Maackia amurensis Lectin))、MPL(橙桑凝集素(Maclura pomifera Lectin))、NPL(喇叭水仙凝集素(Narcissus pseudonarcissus Lectin))、PNA(花生凝集素(Peanut Agglutinin))、E-PHA(紅腰豆凝集素(Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin))、PTL(翼豆凝集素(Psophocarpus tetragonolobus Lectin))、RCA(蓖麻凝集素(Ricinus communis Agglutinin))、STL(馬鈴薯凝集素(Solanum tuberosum Lectin))、SJA(槐凝集素(Sophora japonica Agglutinin))、SBA(大豆凝集素(Soybean Agglutinin))、UEA(歐洲荊豆凝集素(Ulex europaeus Agglutinin))、VVL(毛苕子凝集素(Vicia villosa Lectin))、WFA(多花紫藤凝集素(Wisteria floribunda Agglutinin))。
較佳為使用特異性地識別核心岩藻糖之凝集素，具體而言，例如可例舉：兵豆凝集素LCA(源自兵豆之兵豆凝集素)、豌豆凝集素PSA(源自豌豆之豌豆凝集素)、蠶豆凝集素VFA(源自蠶豆之凝集素)及橙黃網孢盤菌凝集素AAL(源自橙黃網孢盤菌之凝集素)。
7.本發明之抗體組合物之用途 本發明之抗體組合物包含具有針對互不相同之抗原之抗原結合域之第一及第二IgG半聚體，藉此可識別互不相同之2種抗原。因此，包含本發明之抗體組合物之醫藥組合物可採用與不同之2種作為靶之抗原匹配之分子形態，因此，對於表現該2種抗原之雙陽性細胞可發揮出較高之特異性。
於將本發明之抗體組合物用於醫藥組合物之情形時，較佳為具有以下所示之[1]～[3]之性質。以下所示之[1]～[3]之性質可成為用以篩選本發明中之優異之抗體組合物之指標。 [1]針對雙陽性細胞之較高之特異性 [2]經增強之效應子功能 [3]與野生型之IgG抗體同等之血中半衰期 以下，對各性質進行說明。
[1]針對雙陽性細胞之較高之特異性 相較於單陽性細胞而具有針對雙陽性細胞之較高之特異性的本發明之抗體組合物例如可藉由包括以下步驟(1a)～(1d)之方法進行篩選。
(1a)製作分別導入有使鉸鏈區域中之H鏈間之雙硫鍵缺損之胺基酸改型、使第一CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之胺基酸改型、及使CH3域間相互作用減弱之胺基酸改型的第一IgG半聚體。
(1b)以與(1a)同樣之方式，製作分別導入有使鉸鏈區域中之H鏈間之雙硫鍵缺損之胺基酸改型、使第二CD16a結合區中之CD16a結合活性減弱之胺基酸改型、及使CH3域間相互作用減弱之胺基酸改型的第二IgG半聚體。
(1c)準備表現第一及第二抗原之雙陽性細胞、表現第一抗原之單陽性細胞及表現第二抗原之單陽性細胞。 由於使用各細胞之抗原之表現量經調節之細胞，故而亦可製備各抗原之轉染子。對於各細胞，對混合有第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之抗體組合物之效應子功能進行評價。
(1d)基於藉由(1c)評價之結果，選擇出相較於對各單陽性細胞之效應子功能而對雙陽性細胞之效應子功能較強之抗體組合物，藉此獲得相較於單陽性細胞而具有針對雙陽性細胞之較高之特異性的抗體組合物。
作為具體之方法，例如可例舉下文[實施例3]中所述之方法。具體而言，例如於效應子功能為ADCC活性之情形時，以如下方式選擇相較於對各單陽性細胞之效應子功能而對雙陽性細胞之效應子功能較強之抗體組合物，藉此可獲得相較於單陽性細胞而具有針對雙陽性細胞之較高之特異性的抗體組合物。 1-i)作為靶細胞，使用表現第一抗原之單陽性細胞、表現第二抗原之單陽性細胞、以及表現第一抗原及第二抗原之雙陽性細胞。使用流式細胞儀測定各細胞中之第一抗原及第二抗原之表現量，確認目標抗原於細胞中表現。 1-ii)作為效應細胞，使用培養基(例如RPMI培養基)製備導入人類末梢血液單核細胞(PBMC)或編碼人類CD16a之基因並使其穩定地表現之人類CD16a表現細胞株與靶細胞。 1-iii)於CO2 保溫箱中靜置2～6小時左右。同時於100%反應孔中添加助溶溶液(例如含有酸、鹼、界面活性劑等之水溶液)，使靶細胞完全溶解。將反應容器進行離心分離後，採集上清液並分注於ELISA板中。利用顯色溶液進行反應後，添加停止溶液，藉由讀板儀測定吸光度(A450)。 1-iv)使用以下之式算出ADCC活性(%)。 ADCC活性(%)＝100×(S－E－T)/(Max－T) S＝樣品反應孔吸光度－培養基孔吸光度 E＝效應孔吸光度－培養基孔吸光度 T＝靶孔吸光度－培養基孔吸光度 Max＝100%反應孔－100%反應對照孔 1-vi)作為陽性對照之抗體，通常使用針對IgG1型之第一抗原之抗體及針對第二抗原之抗體。確認通常針對IgG1型之第一抗原之抗體對表現第一抗原之單陽性細胞發揮出ADCC活性，通常針對IgG1型之第二抗原之抗體對表現第二抗原之單陽性細胞發揮出ADCC活性。
另一方面，於混合有針對第一抗原之抗體之半聚體與針對第二抗原之抗體之半聚體之抗體溶液對表現第一抗原之單陽性細胞及表現第二抗原之單陽性細胞不表現ADCC活性，而僅對表現第一抗原及第二抗原之雙陽性細胞特異性地發揮ADCC活性之情形時，評價為相較於對各單陽性細胞之效應子功能而對雙陽性細胞之效應子功能較強之抗體組合物。
作為「混合有針對第一抗原之抗體之半聚體與針對第二抗原之抗體之半聚體之抗體溶液對表現第一抗原之單陽性細胞及表現第二抗原之單陽性細胞不表現ADCC活性而僅對表現第一抗原及第二抗原之雙陽性細胞特異性地發揮ADCC活性」之一態樣，例如可例舉針對表現第一抗原之單陽性細胞及表現第二抗原之單陽性細胞之ADCC活性與陰性對照中之ADCC活性為同等程度、且針對表現第一抗原及第二抗原之雙陽性細胞之ADCC活性與陽性對照為同等程度之情形。作為其他態樣，例如可例舉針對表現第一抗原之單陽性細胞及表現第二抗原之單陽性細胞之ADCC活性較陽性對照中之ADCC活性有所減弱、且針對表現第一抗原及第二抗原之雙陽性細胞之ADCC活性與陽性對照為同等程度之情形。
此處，ADCC活性為同等程度係指相對於對象之ADCC活性而較佳為±0～50%、更佳為±0～30%之範圍內，ADCC活性減弱係指相對於對象之ADCC活性而較佳為0～60%、更佳為0～30%之範圍內。
作為本評價時之陰性對照，較佳為使用針對第一抗原之抗體及針對第二抗原之抗體。針對第一抗原之抗體表現出針對雙陽性細胞及表現第一抗原之單陽性細胞之效應子功能，針對第二抗原之抗體表現出針對雙陽性細胞及表現第二抗原之單陽性細胞之效應子功能。
又，可使用固定有各抗原之顆粒(bead)等代替各抗原表現細胞用於評價。例如，準備固定有第一抗原及第二抗原之雙陽性顆粒(bead)、僅固定有第一抗原之單陽性顆粒(bead)及僅固定有第二抗原之單陽性顆粒(bead)。對各顆粒(bead)添加本發明之抗體組合物後，進一步添加重組CD16a蛋白。其後，研究重組CD16a蛋白對結合於雙陽性顆粒(bead)與2個單陽性顆粒(bead)上之抗體組合物之結合活性，藉此可篩選出對目標之兩抗原具有較高之選擇性之抗體組合物。作為測定與重組CD16a蛋白之相互作用之方法，可使用結合(Binding)ELISA法、表面電漿子共振法等。
[2]經增強之效應子功能 具有經增強之效應子功能之本發明之抗體組合物例如可藉由包括以下步驟(2a)～(2c)之方法而篩選。
(2a)增強藉由上述[1]所記載之方法所篩選出之相較於單陽性細胞而具有針對雙陽性細胞之較高之特異性的抗體組合物之效應子功能。 作為增強藉由上述[1]所記載之方法所篩選出之對雙陽性細胞具有較高之特異性的本發明之抗體組合物之效應子功能之方法，例如可例舉進行增強CD16a結合活性之胺基酸改型、及/或使與Fc結合之核心岩藻糖之含量降低或缺損。
於導入用以增強CD16a結合活性之胺基酸殘基置換之情形時，該胺基酸殘基只要為IgG半聚體之異型締合體中所形成之CD16a結合區所包含之胺基酸殘基，則可為任一者。
又，該胺基酸殘基置換可導入至第一及第二IgG半聚體之兩者中，亦可導入至任一者中。但為了發揮本發明之效果，較佳為於相同之IgG半聚體中，用以增強CD16a結合活性之胺基酸殘基置換之位置與使CD16a結合活性減弱之胺基酸殘基置換之位置不同。
換言之，若為互不相同之IgG半聚體，則用以增強CD16a結合活性之胺基酸殘基置換之位置與使CD16a結合活性減弱之胺基酸殘基置換之位置可相同。
關於對何種位置導入用以增強CD16a結合活性之胺基酸殘基置換，可與使CD16a結合活性減弱之胺基酸殘基置換之位置組合而製作包含各種IgG半聚體之異型締合體，測定ADCC活性等，評價該活性為對雙陽性細胞之特異性之活性而確定。
除了用以增強CD16a結合活性之胺基酸殘基置換，藉由使與Fc結合之核心岩藻糖之含量降低或缺損而可增強效應子功能。
(2b)對於(2a)中已增強效應子功能之抗體組合物，對針對表現第一抗原之單陽性細胞及表現第二抗原之單陽性細胞、表現第一及第二抗原之雙陽性細胞之效應子功能(例如，ADCC活性等)進行評價。
(2c)基於藉由(2b)進行評價之結果，藉由選擇相較於對各單陽性細胞之效應子功能而對雙陽性細胞之效應子功能較強之抗體組合物，而獲得針對雙陽性細胞之特異性之效應子功能經增強之抗體組合物。
藉由上述方法，可篩選出效應子功能經增強、且對雙陽性細胞表現出較高之特異性之抗體組合物。
對雙陽性細胞之特異性之效應子功能經增強之抗體組合物可藉由模擬人類血液中之評價系統對更接近臨床效果之效應子功能進行評價。作為模擬人類血液中之評價系統，例如可例舉添加有人類白蛋白、免疫球蛋白、人類血漿或人類血清等血液之蛋白質成分與人類NK細胞、人類末梢血液單核細胞(PBMC)或人類粒細胞等之ADCC評價系統、使用人類全血之細胞毒殺活性評價系統等。
作為模擬人類血液中之評價系統之具體方法，例如可例舉：使用下文[實施例8]中所述之ADCC評價系統之方法、及使用下文[實施例9]中所述之細胞毒殺活性評價系統之方法。
作為使用ADCC評價系統之方法，具體而言，例如可例舉如下方法。於上述1-ii)中，以最終濃度成為較佳為0.01～10質量%、更佳為0.1～10質量%、進而較佳為1～4質量%之方式添加免疫球蛋白，構建模擬人體內之評價系統，除此以外，以與1-i)～1-vi)同樣之方式對ADCC活性進行測定及評價。
作為使用利用人類血液重構系統之細胞毒殺活性評價系統之方法，具體而言，例如可例舉如下方法。 2-i)作為靶細胞，使用表現第一抗原之單陽性細胞、表現第二抗原之單陽性細胞、以及表現第一抗原及第二抗原之雙陽性細胞。使用流式細胞儀測定各細胞中之第一抗原及第二抗原之表現量，確認目標抗原於細胞中表現。 2-ii)將人類血液進行離心分離，回收上清液，藉此獲得血漿。又，使用紅血球去除劑(例如Hetasep：Stemcell technology，#07806)自人類血液獲得末梢血液單核細胞與粒細胞之組分。 2-iii)將2-ii)中所回收之血漿、末梢血液單核細胞及粒細胞之組分加以混合，接種於細胞培養板後，添加混合有針對第一抗原之抗體之半聚體及針對第二抗原之抗體之半聚體之抗體組合物，於37℃培養12～48小時左右。 2-iv)藉由流式細胞分析法測定表現第一抗原及第二抗原之雙陽性細胞之比率。使用野生型之IgG抗體作為陰性對照。
其結果為，評價為混合有針對第一抗原之抗體之半聚體及針對第二抗原之抗體之半聚體之抗體組合物抗體濃度依賴性地去除表現第一抗原及第二抗原之雙陽性細胞，另一方面，於不分別去除表現第一抗原之單陽性細胞及表現第二抗原之單陽性細胞之情形時，對雙陽性細胞之特異性之效應子功能有所增強。
去除雙陽性細胞係指添加有本發明之抗體組合物之情形時的表現第一抗原及第二抗原之雙陽性細胞之比率低於陰性對照中之比率。雙陽性細胞之比率較低係指相對於陰性對照之雙陽性細胞之比率而較佳為0～70%、更佳為0～50%之範圍內。
不去除單陽性細胞係指添加有本發明之抗體組合物之情形時的表現第一抗原之單陽性細胞及表現第二抗原之單陽性細胞之比率與陰性對照中之比率為同等程度。單陽性細胞之比率為同等程度係指相對於陰性對照之單陽性細胞之比率而較佳為±0～40%、更佳為±0～20%之範圍內。
藉由本評價，可篩選出於人類血液中亦表現出經增強之效應子功能之抗體組合物。
(3a)對於[1]及[2]中使用上述方法所篩選出之兼具對雙陽性細胞之較高之特異性與經增強之效應子功能之抗體組合物，使用小鼠、猴等動物進行PK試驗(Pharmacokinetics，藥物動力學試驗)。 使用野生型之IgG抗體作為陰性對照。
(3b) (3a)之PK試驗之結果為，篩選出表現出與野生型之IgG抗體相近之動力之抗體組合物作為具有與野生型之IgG抗體同等之血中半衰期之抗體組合物。作為具體之方法，例如可例舉下文[實施例7]中所述之方法。
作為PK試驗之方法，具體而言，例如可例舉如下方法。 3-i)於小鼠(例如，BALB/c小鼠)之尾靜脈中投予兼具對雙陽性細胞之較高之特異性與經增強之效應子功能之抗體組合物(較佳為0.1～10 mg/kg)後，採集較佳為1小時、4小時、24小時、72小時後之血液。於異氟醚麻醉下使用採血針穿刺頰部回收血液後，利用微量採血管[例如，BD公司製造之Microtainer(註冊商標)]較佳為以4000～16000 rpm於室溫下離心較佳為5～20分鐘，藉此將血清回收。使用野生型之IgG抗體作為陽性對照之抗體。 3-ii)測定血清中存在之抗體濃度。血清中之抗體濃度可藉由公知之方法進行測定，例如可使用AlphaLISA人類κ輕鏈免疫分析套組(AlphaLISA Human Kappa light chain immunoassay kit)(AL3023，PerkinElmer)進行測定，校準曲線可利用套組內之κ輕鏈進行製作。 3-iii)將根據3-ii)中測得之抗體濃度可算出之血中半衰期(t1/2)與陽性對照之野生型IgG相比而處於較佳為50%～150%之範圍內者評價為具有與野生型之IgG抗體同等之血中半衰期之抗體組合物。
亦可藉由利用示差掃描熱量計(DSC：Differential Scanning Calorimetry)測定改性中點(Tm)值作為抗體之物理化學特徵代替使用動物之PK試驗來篩選具有較長之血中半衰期之抗體組合物。
本發明之抗體組合物中具有與野生型IgG抗體同等之Tm值(改性中點溫度)者表現出良好之PK。作為測定Tm值之具體之方法，例如可例舉下文[實施例7]中所述之方法。具體而言，可藉由示差掃描螢光定量法(DIFFERENTIAL Scanning Fluorimetry：DSF)進行測定，作為測定機器，例如可例舉NanoTemper公司之Prometheus NT.48。抗體之Tm值之測定可藉由如下方式進行測定：較佳為自10℃～30℃開始升溫至80℃～100℃，將其升溫速度設為較佳為0.5℃～2℃/分鐘。
又，已知抗體與FcRn(新生兒Fc受體)於pH值6.0下之結合活性越高，血中半衰期越長。因此，藉由測定與FcRn之結合活性，可篩選出具有較長之血中半衰期之抗體組合物。與FcRn之結合活性例如可藉由J. Immunol. 2002; 169:5171-80中所揭示之方法進行測定。
藉由上述[1]～[3]之評價，可篩選出於用於醫藥品之情形時具有較佳之性質之抗體組合物。作為具有該等性質之較佳之本發明之抗體組合物所具有之胺基酸殘基置換之組合，較佳為表2所示之組合，更佳為表3A及表3B所示之組合，最佳為表4所示之組合。
[表2]
域名 胺基酸殘基置換之目標 胺基酸殘基置換之組合
第一IgG半聚體 第二IgG半聚體
鉸鏈 製作異型締合體 C226A/C229A
CH2 僅成為異型締合體時與CD16a結合 D265A、S267K、Y296P、S298E、或S239R P329Y
CH2 CD16a結合活性之增強 S239D、S239E、S239D/K326T、 S239D/A330F、S239D/K326E、 S239E/I332E、 S298A/E333A/K334A/H268E、 或 S239D/S298A/E333A/L242C/K334C
CH3 製作異型締合體 Y349A、L351A、T366A、L368A、D399A、F405A、Y407A、K409A、或K409R
[表3A]
域名 胺基酸殘基置換之目標 胺基酸殘基置換之組合
第一IgG半聚體 第二IgG半聚體
鉸鏈 製作異型締合體 C226A/C229A
CH2 僅成為異型締合體時與CD16a結合 D265A P329Y
CH2 CD16a結合活性之增強 S239D/K326T或 S239D/S298A/E333A/L242C/K334C
CH3 製作異型締合體 L368A、Y407A或K409R
[表3B]
域名 胺基酸殘基置換之目標 胺基酸殘基置換之組合
第一IgG半聚體 第二IgG半聚體
鉸鏈 製作異型締合體 C226A/C229A
CH2 僅成為異型締合體時與CD16a結合 S298E P329Y
CH2 CD16a結合活性之增強 S239D/K326T或 S239D/S298A/E333A/L242C/K334C
CH3 製作異型締合體 L368A、Y407A或K409R
即，表3A及表3B所示之胺基酸殘基置換之組合如以下所述。
＜第一IgG半聚體＞ 1) C226A、C229A、D265A、S239D、K326T、L368A 2) C226A、C229A、D265A、S239D、K326T、Y407A 3) C226A、C229A、D265A、S239D、K326T、K409R 4) C226A、C229A、D265A、S239D、S298A、E333A、L242C、K334C、L368A 5) C226A、C229A、D265A、S239D、S298A、E333A、L242C、K334C、Y407A 6) C226A、C229A、D265A、S239D、S298A、E333A、L242C、K334C、K409R 7) C226A、C229A、S298E、S239D、K326T、L368A 8) C226A、C229A、S298E、S239D、K326T、Y407A 9) C226A、C229A、S298E、S239D、K326T、K409R 10) C226A、C229A、S298E、S239D、E333A、L242C、K334C、L368A 11) C226A、C229A、S298E、S239D、E333A、L242C、K334C、Y407A 12) C226A、C229A、S298E、S239D、E333A、L242C、K334C、K409R
＜第二IgG半聚體＞ 1) C226A、C229A、P329Y、S239D、K326T、L368A 2) C226A、C229A、P329Y、S239D、K326T、Y407A 3) C226A、C229A、P329Y、S239D、K326T、K409R 4) C226A、C229A、P329Y、S239D、S298A、E333A、L242C、K334C、L368A 5) C226A、C229A、P329Y、S239D、S298A、E333A、L242C、K334C、Y407A 6) C226A、C229A、P329Y、S239D、S298A、E333A、L242C、K334C、K409R
本發明之抗體組合物較佳為包含與上述第一IgG半聚體[1)～6)]數字分別相同之上述第二IgG半聚體[1)～6)]。又，本發明之抗體組合物較佳為以與上述第一IgG半聚體[7)～12)]成為以下組合之方式包含上述第二IgG半聚體。 ・第一IgG半聚體7)與第二IgG半聚體1) ・第一IgG半聚體8)與第二IgG半聚體2) ・第一IgG半聚體9)與第二IgG半聚體3) ・第一IgG半聚體10)與第二IgG半聚體4) ・第一IgG半聚體11)與第二IgG半聚體5) ・第一IgG半聚體12)與第二IgG半聚體6)
更具體而言，作為本發明之抗體組合物所具有之胺基酸殘基置換之組合的較佳態樣，例如可例舉以下之＜1＞～＜12＞。
＜1＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之L368A。
＜2＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體分別包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之Y407A。
＜3＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體分別包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之K409R。
＜4＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體分別包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(b)S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之L368A。
＜5＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(b)S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之Y407A。
＜6＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(b)S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之K409R。
＜7＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之S298E之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之K409R。
＜8＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之S298E之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之L368A。
＜9＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體分別包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之S298E之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之Y407A。
＜10＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體分別包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之S298E之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體包含EU索引所表示之S239D、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換，第二IgG半聚體包含EU索引所表示之S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之L368A。
＜11＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之S298E之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體包含EU索引所表示之S239D、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換，第二IgG半聚體包含EU索引所表示之S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之Y407A。
＜12＞ (2A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換。 (3A)第一IgG半聚體包含結合於第一抗原之抗原結合域，且於第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之S298E之胺基酸殘基置換。 (4A)第二IgG半聚體包含結合於第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換。 (5A)第一IgG半聚體包含EU索引所表示之S239D、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換，第二IgG半聚體包含EU索引所表示之S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換。 (6A)第一IgG半聚體及第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之K409R。
[表4]
域名 胺基酸殘基置換之目標 胺基酸殘基置換之組合
第一IgG半聚體 第二IgG半聚體
鉸鏈 製作異型締合體 C226A/C229A
CH2 僅成為異型締合體時與CD16a結合 D265A P329Y
CH2 CD16a結合活性之增強 S239D/K326T或 S239D/S298A/E333A/L242C/K334C
CH3 製作異型締合體 K409R
又，本發明之抗體組合物較佳為包含表5所示之第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之抗體組合物。於表5中，各序列編號表示CH域之胺基酸序列之序列編號。
[表5]
抗體組合物編號 第一IgG半聚體之CH序列編號(胺基酸序列) 第二IgG半聚體之CH序列編號(胺基酸序列)
1 248 252
2 272 292
作為本發明之一態樣，可例舉構成上述抗體組合物之第一IgG半聚體或第二IgG半聚體。
作為本發明之第一IgG半聚體，就可於所需之第一抗原及第二抗原表現之雙陽性細胞中與第二IgG半聚體締合而對雙陽性細胞特異性地發揮出效應子功能之方面而言，可例舉以與第二IgG半聚體締合為特徵之第一IgG半聚體。本發明之第一IgG半聚體可用於與第二IgG半聚體之併用、包含第一IgG半聚體及第二IgG半聚體之抗體組合物之製造、含有包含第一IgG半聚體及第二IgG半聚體之抗體組合物之醫藥組合物之製造。
又，作為本發明之第二IgG半聚體，就可於所需之第一抗原及第二抗原表現之雙陽性細胞中與第一IgG半聚體締合而對雙陽性細胞特異性地發揮出效應子功能之方面而言，可例舉以與第一IgG半聚體締合為特徵之第二IgG半聚體。本發明之第二IgG半聚體可用於與第一IgG半聚體之併用、包含第一IgG半聚體及第二IgG半聚體之抗體組合物之製造、含有包含第一IgG半聚體及第二IgG半聚體之抗體組合物之醫藥組合物之製造。
上述所例示之抗體組合物所含之第一IgG半聚體或第二IgG半聚體係具有與各自對應之IgG半聚體締合之特徵之IgG半聚體，因此包含於本發明之第一或第二IgG半聚體中。
進而，本發明之第一或第二IgG半聚體可為特異性地結合於任一抗原之IgG半聚體，只要第一IgG半聚體所結合之抗原與第二IgG半聚體所結合之抗原不同即可。
作為本發明之抗體組合物所結合之抗原，可為任一抗原，較佳可例舉與癌症、免疫疾病、過敏疾病或循環器官疾病等相關之抗原分子。例如可例舉細胞激素、趨化因子、生長因子及該受體以及CD抗原等。
作為細胞激素或生長因子之受體，例如可例舉針對干擾素(以下記為IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、介白素(以下記為IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、粒細胞菌落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)、或巨噬細胞菌落刺激因子(M-CSF)之受體等。
作為趨化因子受體，例如可例舉針對SLC、ELC、I-309、TARC、MDC、MIP-3α、CTACK之受體。
作為生長因子之受體，例如可例舉針對表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、血管生成素(angiopoietin)、纖維母細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)、肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)、血小板衍生生長因子(Platelet-Derived Growth Factor，PDGF)、類胰島素生長因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)、紅血球生成素(erythropoietin，EPO)、血小板生成素(Tronbopoietin，TPO)、TGFβ、蝶素(Iephrin)、血管生成素、捲曲蛋白配體(Frizzled ligand)、SDF-1(stromal cell-derived factor-1，基質細胞衍生因子-1)之受體等。
作為分化群(Cluster of Differentiation，以下記載為CD)抗原，可例舉：CD1a、CD1c(BDCA1)、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26(DPP-4)、CD27、CD28、CD30、CD32、CD32a、CD33、CD34、CD37、CD38、CD39、CD40、CD43、CD44、CD45、CD47、CD48、CD49、CD49a、CD49b、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD59、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD66a(CEACAM1)、CD66b(NCA-95)、CD66c(NCA-50/90)、CD66d(CGM1)、CD66e(CEA)、CD66f(PSG)、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD77、CD78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CD84(SLAMF5)、CD85a(ILT-5)、CD85b(ILT8)、CD85c(LIR8)、CD85d(ILT4)、CD85f(ILT11)、CD85g(ILT7)、CD85h(ILT1)、CD85i(LIR6a)、CD85j(ILT2)、CD85k(ILT3)、CD85m(ILT10)、CD86(B7.2)、CD87、CD89、CD94(NKG2)、CD95(Fas)、CD97、CD98、CD103、CD106、CD107a(LAMP1)、CD114(G-CSFR)、CD115(M-CSFR、CSF1R)、CD116(GM-CSFR)、CD117(SCF-R, C-KIT)、CD119(IFNGR1)、CD121a(IL-1R1)、CD122(IL-2Rb)、CD123(IL-3Ra)、CD124(IL-4Ra)、CD125(IL-5Ra)、CD126(IL-6Ra)、CD127(IL-7Ra)、CD134(OX40)、CD135(FLT3)、CD137(4-1BB)、CD138(多配體蛋白聚糖，Syndecan-1)、CD140(PDGFR)、CD146(MUC18)、CD147(EMMRRIN)、CD152(CTLA-4)、CD153(CD30配體)、CD158a(KIR2DL1)、CD158b1(KIR2DL2)、CD158b2(KIR2DL3)、CD158c(KIR2DS6)、CD158d(KIR2DL4)、CD158e1(KIR3DL1)、CD158e2(KIR3DS1)、CD158f(KIR2DL5)、CD158g(KIR2DS5)、CD158h(KIR2DS1)、CD158i(KIR2DS4)、CD158j(KIR2DS2)、CD158k(KIR3DL2)、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、CD161(NKRP1A)、CD162(PSGL-1)、CD163、CD169(SIGLEC1)、CD177、CD178(FasL)、CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD185(CXCR5)、CD191(CCR1)、CD193(CCR3)、CD194(CCR4)、CD195(CCR5)、CD196(CCR6)、CD197(CCR7)、CD198(CCR8)、CD199(CCR9)、CD200(OX2)、CD206(MMR)、CD207(蘭格素，Langerin)，CD209(DC-SIGN)、CD212(IL-12Rβ1)、CD213a1(IL-13Ra1)、CD213a2(IL-13Ra2)、CD215(IL-15RA)、CD217(IL-17R)、CD218a(IL-18Ra)、CD218b(IL-18Rβ)、CD223(LAG3)、CD226(DNAM-1)、CD229(SLAMF3)、CD252(OX40L)、CD269(BCMA)、CD272(BTLA)、CD274(PD-L1)、CD275(ICOS配體)、CD276(B7H3)、CD278(ICOS)、CD279(PD-1)、CD281(TLR1)、CD282(TLR2)、CD283(TLR3)、CD284(TLR4)、CD286(TLR6)、CD288(TLR8)、CD289(TLR9)、CD294(CRTH2)、CD301(CLEC10A、MGL)、CD302(DCL1)、CD303(BDCA2)、CD304(BDCA4)、CD305、CD314(NKG2D)、CD317(BST2)、CD319(CS1)、CD324(E-鈣黏附蛋白，E-cadherin)、CD326(EpCAM)、CD357(GITR)、CD358(DR6)、CD360(IL-21R)、CD365(TIM-1)、CD366(TIM-3)、CD369(DECTIN-1)、CD370(CLEC9A)、CD371(CLEC12A)、人白血球抗原(human leukocyte antigen)(HLA)-II型(例如，HLA-DR)及HLA-I等。
進而，作為與腫瘤之病情形成相關之抗原或調節免疫功能之抗體之抗原，例如可例舉：神經節苷脂GM1、GM2、GD2、GD3、Lewis X(CD15s)、Lewis Y、CD3、CD4、CD40、CD40配體、B7家族分子(例如，CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6、B7-H7)、B7家族分子之配體(例如，CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1或BTLA)、OX-40、OX-40配體、CD137、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)受體家族分子(例如，DR3、DR4、DR5、BAFFR、LIGHT、TNFR1或TNFR2)、TNF-相關凋亡誘導配體受體(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor，TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子之受體家族(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3或TRAIL-R4)、核因子κB受體激活劑配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANK)、RANK配體、CD25、葉酸受體、Mesothelin、SIGLEC8、細胞激素/趨化因子受體[例如，IL-1RII、IL-12Rβ2、IL-17RB、IL-23R、IL-27Rα、IL-31R、IL-33Rα、IL-36R、轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)βRII、CCR2、CCR10、CXCR1、CXCR2、白三烯B4受體(BLT1)]、NK細胞受體(例如，NKG2D、E4BP4、NKp30、NKp44、NKp46、AhR)、T細胞受體(例如，TCRα/β、TCR Vβ11、TCRγ/δ、TSLPR、SLAM、SLAMF6、LAP、GARP、SR-A1、CD200R、DCR3、TIGIT)、B細胞受體(例如，BLYS、APRIL、TSLPR)、樹狀細胞受體(例如，FCER1A、TLR7、CADM1、XCR1、BTLA、SIRPA、DCIR、TROP2、AXL、SIGLEC6、SIGLEC15、CX3CR1、S100A8、S100A9、ASGR1)、胺基酸轉運體(例如，ASCT2)、絲胺酸蛋白酶(例如蛋白酶-3(Proteinase-3)，PR3)等。
作為受體型酪胺酸激酶，例如可例舉：EGF受體、胰島素受體、IGF-1受體、NGF受體、PDGF受體、M-CSF受體、FGF受體、VEGF受體及Eph受體等。作為酪胺酸激酶締合型受體，例如可例舉：細胞激素受體及Fc受體等。又，作為細胞黏著分子，例如可例舉：鈣黏附蛋白及整合素等。作為G蛋白偶合型受體，例如可例舉：腺苷受體、類大麻酚受體及胰高血糖激素受體等。
具體而言，例如作為受體型酪胺酸激酶，可例舉：表皮生長因子受體(EGFR)、V-ERB-B2禽紅細胞白血病病毒致癌基因同源物2(Avian Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog2)(HER2)、V-ERB-B2禽紅細胞白血病病毒致癌基因同源物3(HER3)、V-ERB-B2禽紅細胞白血病病毒致癌基因同源物4(HER4)、胰島素受體(Insulin Receptor，INSR)、類胰島素生長因子I受體(IGF1R)、神經生長因子受體(Nerve Growth Factor Receptor，NGFR)、血小板衍生生長因子受體α(Platelet-derived Growth Factor Receptor Alpha，PDGFRA)、血小板衍生生長因子受體β(PDGFRB)、群落刺激因子受體(Colony-stimulationg Factor Receptor，CSF1R)、群落刺激因子2受體α(CSF2RA)、粒細胞群落刺激因子3受體(Colony-stimulationg Factor3 Receptor，Granulocyte)(CSF3R)、纖維母細胞生長因子受體1(FGFR1)、纖維母細胞生長因子受體2(FGFR2)、纖維母細胞生長因子受體3(FGFR3)、纖維母細胞生長因子受體4(FGFR4)、激酶插入區受體(Kinase Insert Domain Receptor，KDR)、肝配蛋白A受體1(Ephrin Receptor EphA1，EPHA1)、肝配蛋白A受體2(Ephrin Receptor EphA2，EPHA2)、肝配蛋白A受體3(Ephrin Receptor EphA3，EPHA3)等。
又，作為酪胺酸激酶締合型受體，可例舉：介白素-1受體1(IL-1R1)、介白素-1受體輔助蛋白(Interleukin-1 Receptor Accessory Protein，IL-1RAP)、類介白素-1受體(Interleukin-1 Receptor Like 1)(IL-1RL1、ST2)、肝細胞生長因子受體(Hepatocyte Growth factor Receptor)(c-Met)、巨噬細胞刺激1受體(Macrophage Stimulating 1 Receptor)(RON)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、類連接黏著分子(Junctional Adhesion Molecule-Like，JAML)、Nectin樣蛋白5(Nectin-like protein 5，Necl-5)、腫瘤壞死因子受體1(TNF-R1)、腫瘤壞死因子受體2(TNF-R2)、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體1(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptor 1，TRAIL-R1)、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體2(TRAIL-R2)、死亡受體3(Death Receptor3，DR3)、死亡受體6(DR6)、NF-kB受體激活劑(Receptor Activator of NF-kB，RANK)、神經生長因子受體(NGFR)、淋巴毒素β受體(Lymphotoxin-beta Receptor，LTβR)、OX40(TNFRSF4)、Fas(TNFRSF6)、4-1BBL(TNFRSF9)、Fn14(TNFRSF12A)、TACI(TNFRSF13B)、BAFF-R(TNFRSF13C)、HVEM(TNFRSF14)、BCMA(TNFRSF17)、GITR(TNFRSF18)、TROY(TNFRSF19)、外異蛋白A1受體(Ectodysplasin A1 Receptor，EDAR)、外異蛋白A2受體(XEDAR)、於淋巴組織中表現之受體(Receptor Expressed in Lymphoid Tissues，RELT)、CD3、CD27、CD30、CD40、FcαRI、FcγRIII及FcεRI、IgG之Fc片段受體轉運蛋白α(Fc Fragment of IgG，Receptor Transpoter，Alpha)(FCGRT)等。
又，作為細胞黏著分子，可例舉：整合素α9(Integrin，Alpha9)(ITGA9)、P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin Glycoprotein Ligand-1，PSGL-1)、鈣黏附蛋白(Cadherin11，CDH11)、黏膜血管地址素細胞黏著分子1(Mucosal Vascular Addression Cell Adhesion Molecule1，MADCAM1)、整合素α4(ITGA4)、整合素β4(Integrin，Beta4)(ITGB4)、整合素α4β7、整合素α4β1、膠原蛋白(I型膠原蛋白，Type I Collagen)，作為G蛋白偶合型受體，可例舉：腺苷A2A受體(Adenosine A2A Receptor)(ADORA2A)、腺苷A2B受體(Adenosine A2B Receptor)(ADORA2B)、反義導向分子(Repulsive Guidance Moleculea)(RGMA)、胰高血糖激素受體(Glucagon Receptor)(GCGR)、泌乳素受體(Prolactin Receptor)(PRLR)、類胰高血糖激素肽1受體(Glucagon-like Peptide1 Receptor)(GLP1R)、大麻素受體1(Cannnabinoid Receptor1)(CB1)、Mas相關G蛋白偶合受體-X2(Mas-related G protein Coupled Receptor-X2)(MRGPRX2)等。
包含本發明之抗體組合物之醫藥組合物較佳為用於使上述抗原分子於表面表現之細胞所參與之疾病之治療，更佳為用於癌症、自體免疫疾病、過敏疾病之治療。
作為癌症，例如可例舉：白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、腦瘤、乳癌、子宮體癌、宮頸癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、腎上腺癌、胃腸道間質腫瘤、間皮瘤、頭頸癌、腎癌、肺癌、肉瘤、攝護腺癌、睾丸瘤、膀胱癌、皮膚癌、兒童癌症等。又，亦包括藉由去除抑制性之免疫細胞進行之各種癌症治療。
作為自體免疫疾病或過敏，例如可例舉：格-巴二氏症候群、重症肌無力症、多發性硬化症、慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、原發性膽汁性膽管炎、潰瘍性結腸炎、克隆氏病、自體免疫性胰臟炎、高安氏動脈炎、古巴士德氏症候群、急進性絲球體腎炎、IgA腎病、巨幼紅細胞性貧血、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性嗜中性球減少症、特發性血小板減少性紫癜、巴塞多氏病(Basedow's disease)、橋本氏病、原發性甲狀腺功能減退症、突發性愛迪生氏病、I型糖尿病、慢性圓盤狀紅斑性狼瘡、局部性硬皮病、天疱瘡、膿皰性牛皮癬、關節病性牛皮癬、尋常性牛皮癬、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線性IgA水皰性皮膚病、後天性大皰性表皮鬆懈症、圓形禿、尋常性白斑、原田氏病、自體免疫性視神經病、自體免疫性內耳障礙、突發性無精症、習慣性流產、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、抗磷脂質抗體症候群、多發性肌炎、皮肌炎、硬皮病、修格連氏症候群、IgG4相關性疾病、血管炎症候群、混合性結締組織病、自體免疫性溶血性貧血、不當輸血、特發性血小板減少性紫癜、異位性皮膚炎、多發性動脈炎、過敏性鼻炎(花粉病)、過敏性結膜炎、過敏性胃腸炎、支氣管哮喘、兒童哮喘、食物過敏、藥物過敏、蕁麻疹、過敏性休克、移植排斥、接觸性皮膚炎、貝西氏病等。
以下例示本發明之抗體組合物所結合之第一抗原與第二抗原之具體之組合及靶細胞、以及成為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象的疾病。又，關於該例示，表6A～表6E中示出對應關係。
c1)第一抗原為CADM1、第二抗原為CCR4、且靶細胞為ATL(Adult T-cell Leukemia-lymphoma，成人T細胞白血病-淋巴瘤)細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：ATL。 c2)第一抗原為EGFR、第二抗原為HER2、且靶細胞為癌細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：胃癌或乳癌等實體癌。 c3)第一抗原為CD52、第二抗原為CD70、且靶細胞為活化T細胞、活化B細胞或活化APC之抗體組合物。 c4)第一抗原為CD2、第二抗原為CD70、且靶細胞為活化T細胞之抗體組合物。 c5)第一抗原為CD19、第二抗原為CD70、且靶細胞為活化B細胞之抗體組合物。 c6)第一抗原為CD2、第二抗原為CD40配體、且靶細胞為活化效應T細胞(活化Teff)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：修格連氏症候群。 c7)第一抗原為PD-L1、第二抗原為選自CD19、CD30、CCR4、CD20、CD22及CD79b中之一者且靶細胞為淋巴瘤之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：淋巴瘤。 c8)第一抗原為PD-L1、第二抗原為選自CD19、CD30、CCR4、CD20、CD22及CD79b中之一者且靶細胞為白血病之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：白血病。 c9)第一抗原為CD8、第二抗原為CCR4、且靶細胞為調節性T細胞(Treg)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。該醫藥組合物較佳為用於癌症免疫療法。 c10)第一抗原為CTLA-4、第二抗原為選自CD4、CCR4及GITR中之一者且靶細胞為調節性T細胞(Treg)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。該醫藥組合物較佳為用於癌症免疫療法。 c11)第一抗原為TIGIT、第二抗原為選自CD4、CCR4及GITR中之一者且靶細胞為調節性T細胞(Treg)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。該醫藥組合物較佳為用於癌症免疫療法。 c12)第一抗原為PD-1、第二抗原為選自CD4、CCR4及GITR中之一者且靶細胞為調節性T細胞(Treg)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。該醫藥組合物較佳為用於癌症免疫療法。 c13)第一抗原為OX40、第二抗原為選自CD127、CD26、CD70及CD15s中之一者且靶細胞為效應T細胞(Teff)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：自體免疫疾病。 c14)第一抗原為4-1BB、第二抗原為選自CD127、CD26、CD70及CD15s中之一者且靶細胞為效應T細胞(Teff)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：自體免疫疾病。 c15)第一抗原為GITR、第二抗原為選自CD127、CD26、CD70及CD15s中之一者且靶細胞為效應T細胞(Teff)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：自體免疫疾病。 c16)第一抗原為CD40配體、第二抗原為選自CD127、CD26、CD70及CD15s中之一者且靶細胞為效應T細胞(Teff)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：自體免疫疾病。 c17)第一抗原為CD4、第二抗原為CD69、且靶細胞為組織常駐記憶型T(TRM)細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：ANCA(Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibody)相關性絲球體腎炎。 c18)第一抗原為PD-1、第二抗原為CD3、且靶細胞為外周輔助性T(Peripheral helper T，TPH)細胞及PD-1高CD8陽性T細胞之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：類風濕性關節炎。 c19)第一抗原為PD-1、第二抗原為CD4、且靶細胞為PD-1陽性T細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：乳糜瀉。 c20)第一抗原為整合素α4β7、第二抗原為選自CCR6、CXCR3及CD161中之一者且靶細胞為選自效應T細胞(Teff)及先天性淋巴細胞(ILC，Innate Lymphoid Cell)中之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：炎症性腸病。 c21)第一抗原為整合素α4β7、第二抗原為CD127、且靶細胞為全部先天性淋巴細胞(ILC)及Treg以外之浸潤於腸道中之T細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：炎症性腸病。 c22)第一抗原為整合素α4β7、第二抗原為CD40配體、且靶細胞為局部趨化活化T細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者。 c23)第一抗原為整合素α4β1、第二抗原為CD40配體、且靶細胞為局部趨化活化T細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：多發性硬化症及炎症性腸病之至少一者。 c24)第一抗原為CXCR5、第二抗原為CD127、且靶細胞為先天性淋巴細胞(ILC)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：過敏疾病。 c25)第一抗原為TPO受體(c-mpl)、第二抗原為CD34、且靶細胞為異常增殖造血幹細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：原發性骨髓纖維化症。 c26)第一抗原為TPO受體(c-mpl)、第二抗原為CD123、且靶細胞為CD123陽性白血病幹細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：原發性骨髓纖維化症。 c27)第一抗原為CXCR3、第二抗原為CD3、且靶細胞為CX3CR1陽性細胞(細胞毒殺性效應T細胞等，NK細胞除外)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：選自自體免疫疾病(例如克隆氏病等)、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者。 c28)第一抗原為CXCR3、第二抗原為CD127或CD40配體、且靶細胞為Th1細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：全身性紅斑狼瘡。 c29)第一抗原為CCR4、第二抗原為CD127或CD40配體、且靶細胞為Treg以外之CCR4陽性T細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：過敏疾病。 c30)第一抗原為CCR6、第二抗原為CD127或CD40配體、且靶細胞為Th17細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：牛皮癬。 c31)第一抗原為CRTH2、第二抗原為CD127或CD40配體、且靶細胞為Th2細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：過敏疾病。 c32)第一抗原為CRTH2、第二抗原為CCR4、且靶細胞為Th2細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：選自哮喘、嗜酸性球鼻竇炎及異位性皮膚炎中之至少一者。 c33)第一抗原為CRTH2、第二抗原為ST2、且靶細胞為Tpath2細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：哮喘及嗜酸性球鼻竇炎之至少一者。 c34)第一抗原為CRTH2、第二抗原為CCR6、且靶細胞為Th2/Th17細胞(僅於重症哮喘中出現之異細胞)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：過敏疾病。 c35)第一抗原為CRTH2、第二抗原為CCR3且靶細胞為嗜酸性球、嗜鹼性球、Th2細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：過敏疾病。 c36)第一抗原為CD207、第二抗原為CD11b或CD1a、且靶細胞為朗格漢斯細胞前驅細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：朗格漢斯細胞組織細胞增生症(LCH，Langerhans Cell Histiocytosis)。 c37)第一抗原為CD123、第二抗原為HLA-DR、且靶細胞為漿細胞樣樹狀細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：全身性紅斑狼瘡。 c38)第一抗原為CD123、第二抗原為ASCT2且靶細胞為選自漿細胞樣樹狀細胞、Th1細胞及Th17細胞中之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：全身性紅斑狼瘡。 c39)第一抗原為CSF1R、第二抗原為CD14、且靶細胞為單核球系骨髓衍生抑制細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：特發性肺纖維化症。 c40)第一抗原為CSF1R、第二抗原為CD33、且靶細胞為骨髓衍生抑制細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。 c41)第一抗原為CD19、第二抗原為CD38、且靶細胞為漿細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：全身性紅斑狼瘡。 c42)第一抗原為CD3、第二抗原為IL-23R且靶細胞為選自Th1細胞、Th17細胞及Tfh細胞中之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：全身性紅斑狼瘡。 c43)第一抗原為CD3、第二抗原為CX3CR1、且靶細胞為CX3CR1陽性細胞(例如，細胞毒殺性效應T細胞等。NK細胞除外)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：選自自體免疫疾病(例如克隆氏病等)、動脈硬化及缺血性心臟病中之至少一者。 c44)第一抗原為CXCR4、第二抗原為第一型膠原蛋白、且靶細胞為纖維細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：選自特發性肺纖維化症、全身性硬化症及肝硬化等各種纖維化疾病中之至少一者。 c45)第一抗原為CXCR4、第二抗原為CD14、且靶細胞為單核球及纖維細胞之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：特發性肺纖維化症。 c46)第一抗原為CXCR4、第二抗原為CD16、且靶細胞為活化嗜中性球之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：選自嗜中性球哮喘、慢性阻塞性肺病及阿茲海默症中之至少一者。 c47)第一抗原為CLEC10A、第二抗原為CD14或CD16、且靶細胞為中間型(intermediate)單核球之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：選自克隆氏病、類風濕性關節炎及哮喘中之至少一者。 c48)第一抗原為CD70、第二抗原為CD38、且靶細胞為活化T細胞及活化B細胞之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：多發性硬化症及視神經脊髓炎之至少一者。 c49)第一抗原為CD70、第二抗原為選自CD4、CD127及TIM-1中之一者且靶細胞為選自Th1細胞、Th17細胞及漿細胞樣樹狀細胞中之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：全身性紅斑狼瘡。 c50)第一抗原為CD4、第二抗原為TIM-1且靶細胞為選自Th1細胞、Th17細胞及漿細胞樣樹狀細胞中之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：全身性紅斑狼瘡。 c51)第一抗原為CD70、第二抗原為CD52、且靶細胞為活化T細胞及活化B細胞之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：多發性硬化症。 c52)第一抗原為CB1、第二抗原為AT1R、且靶細胞為GPCR(G protein-coupled receptor，G蛋白偶合型受體)異聚體表現壞星細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉肝硬化。 c53)第一抗原為CD4或PD-1、第二抗原為CD153、且靶細胞為老化T細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：全身性紅斑狼瘡。 c54)第一抗原為FcεRI、第二抗原為CD34或C-KIT、且靶細胞為肥大細胞及肥大細胞前驅細胞之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS，Mast Cell Activation Syndromes)。 c55)第一抗原為CD34、第二抗原為CD203或MRGPRX2、且靶細胞為肥大細胞前驅細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：包括選自蕁麻疹、食物過敏及肥胖細胞症中之至少一者在內之肥大細胞活化症候群(MCAS)。 c56)第一抗原為CD52、第二抗原為CD127、且靶細胞為Treg以外之T細胞及B細胞之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：多發性硬化症。 c57)第一抗原為CD69、第二抗原為CD21、且靶細胞為活化成熟初始(mature naive)B細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：選自多發性硬化症、1型糖尿病及類風濕性關節炎中之至少一者。 c58)第一抗原為CD106、第二抗原為選自CD11c、CD19、CD21及CD72中之一者且靶細胞為濾泡樹狀細胞(follicular dendritic cells)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS，Secondary Progressive Multiple Sclerosis)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者。 c59)第一抗原為4-1BB、第二抗原為選自CD11c、CD19、CD21及CD72中之一者且靶細胞為濾泡樹狀細胞(follicular dendritic cells)之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：選自繼發進展型多發性硬化症(SPMS)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植及全身性紅斑狼瘡中之至少一者。 c60)第一抗原為BLT1、第二抗原為CD49b、且靶細胞為BLT1陽性CD8陽性細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：哮喘。 c61)第一抗原為CD226、第二抗原為CD8、且靶細胞為CD226陽性CD8陽性效應型記憶(effector memory)細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：全身性硬皮病。 c62)第一抗原為CXCR3、第二抗原為選自CD8、CD49a、IL-15R及NKG2D中之一者且靶細胞為效應型記憶CD8陽性細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：尋常性白斑及牛皮癬之至少一者。 c63)第一抗原為CD49a、第二抗原為選自CD8、IL-15R及NKG2D中之一者且靶細胞為效應型記憶CD8陽性細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：尋常性白斑及牛皮癬之至少一者。 c64)第一抗原為IL-15R、第二抗原為CD8或NKG2D、且靶細胞為效應型記憶CD8陽性細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：尋常性白斑及牛皮癬之至少一者。 c65)第一抗原為NKG2D、第二抗原為CD8、且靶細胞為效應型記憶CD8陽性細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：尋常性白斑及牛皮癬之至少一者。 c66)第一抗原為CD177、第二抗原為PR3、且靶細胞為浸潤於血管外之嗜中性球及PR3呈現嗜中性球之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：ANCA(Antineutrophil Cytoplasmic Antibody)相關性血管炎及全身性紅斑狼瘡之至少一者。 c67)第一抗原為CD4、第二抗原為CD127、且靶細胞為Treg以外之CD4陽性T細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：T細胞依賴性之免疫相關性疾病。 c68)第一抗原為CD40配體、第二抗原為IL-6、且靶細胞為活化T細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：免疫相關性疾病。 c69)第一抗原為IL-17R、第二抗原為膜型TNF、且靶細胞為IL17R及膜型TNF表現細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：牛皮癬性關節炎。 c70)第一抗原為IL-23R、第二抗原為CCR6、且靶細胞為Th17細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：包括修格連氏症候群及牛皮癬之至少一者在內之自體免疫疾病。 c71)第一抗原為CD64、第二抗原為選自CD206、CD163及CD68中之一者且靶細胞為M2巨噬細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。 c72)第一抗原為CD163、第二抗原為CD206或CD68、且靶細胞為M2巨噬細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。 c73)第一抗原為CD206、第二抗原為CD68、且靶細胞為M2巨噬細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。 c74)第一抗原為CD14、第二抗原為選自CD48、CD84、CD97及CD305中之一者且靶細胞為骨髓衍生抑制性細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。 c75)第一抗原為CD15、第二抗原為選自CD48、CD84、CD97及CD305中之一者且靶細胞為骨髓衍生抑制性細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。 c76)第一抗原為CD33、第二抗原為選自CD48、CD84、CD97及CD305中之一者且靶細胞為骨髓衍生抑制性細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。 c77)第一抗原為CD11b、第二抗原為選自CD48、CD84、CD97及CD305中之一者且靶細胞為骨髓衍生抑制性細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：癌症。 c78)第一抗原為CCR4、第二抗原為選自CADM1、CD30及CD70中之一者且靶細胞為腫瘤細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：白血病及淋巴瘤之至少一者。 c79)第一抗原為CD38、第二抗原為CD138或BCMA、且靶細胞為腫瘤細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：白血病及淋巴瘤之至少一者。 c80)第一抗原為BCMA、第二抗原為CD56或CS1、且靶細胞為腫瘤細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：白血病及淋巴瘤之至少一者。 c81)第一抗原為CD40配體、第二抗原為選自CD36、CD62P及CD63中之一者且靶細胞為異常巨核細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：白血病及淋巴瘤之至少一者。 c82)第一抗原為TIM-3、第二抗原為選自CD123、CD33、CD47、CD70及CLEC12A中之一者且靶細胞為腫瘤細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：白血病及淋巴瘤之至少一者。 c83)第一抗原為CD123、第二抗原為選自CD33、CD47、CD70及CLEC12A中之一者且靶細胞為腫瘤細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：白血病及淋巴瘤之至少一者。 c84)第一抗原為CD5、第二抗原為CD23、且靶細胞為腫瘤細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：白血病及淋巴瘤之至少一者。 c85)第一抗原為CD10或CD5、第二抗原為CD20、且靶細胞為腫瘤細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：白血病及淋巴瘤之至少一者。 c86)第一抗原為CD40、第二抗原為選自CD80、CD86、ICOS配體、4-1BB配體、OX40配體、CD70、GITR、PD-L1、PD-L2、B7-DC、B7H3、B7H4、B7H5、B7H6及B7H7中之一者且靶細胞為活化抗原呈現細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：炎症性疾病。 c87)第一抗原為PTPRS、第二抗原為IL-21R且靶細胞為選自漿細胞樣樹狀細胞(pDC，plasmacytoid dendritic cells)、T細胞及B細胞中之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：自體免疫疾病。 c88)第一抗原為PTPRS、第二抗原為CD38且靶細胞為選自漿細胞樣樹狀細胞(pDC)、活化T細胞、B細胞及漿細胞中之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：自體免疫疾病。 c89)第一抗原為PTPRS、第二抗原為CD32a、且靶細胞為漿細胞樣樹狀細胞(pDC)及骨髓細胞之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：自體免疫疾病。 c90)第一抗原為OX40、第二抗原為CD127或CD40配體、且靶細胞為Treg以外之輔助性T細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：過敏疾病。 c91)第一抗原為OX40、第二抗原為CD8或NKG2D、且靶細胞為CD8記憶型T細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：尋常性白斑及牛皮癬之至少一者。 c92)第一抗原為OX40、第二抗原為CD226、且靶細胞為CD8記憶型T細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：硬皮病。 c93)第一抗原為OX40、第二抗原為CRTH2、且靶細胞為活化Th2細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：過敏疾病。 c94)第一抗原為CRTH2、第二抗原為CD2、且靶細胞為Th2細胞及先天性淋巴細胞(ILC2細胞)之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：過敏疾病。 c95)第一抗原為CRTH2、第二抗原為CD7、且靶細胞為Th2細胞及先天性淋巴細胞(ILC2細胞)之至少一者之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：過敏疾病。 c96)第一抗原為CRTH2、第二抗原為CD45、且靶細胞為CRTH2陽性血球細胞之抗體組合物。 作為包含該抗體組合物之醫藥組合物之治療對象疾病，可例舉：過敏疾病。
[表6A]
第一抗原 第二抗原 成為治療對象之疾病 靶細胞
CADM1 CCR4 成人T細胞白血病 成人T細胞白血病(ATL)細胞
EGFR HER2 胃癌、乳癌等實體癌 癌細胞
CD52 CD70 - 活化T細胞、活化B細胞、活化APC
CD2 CD70 - 活化T細胞
CD19 CD70 - 活化B細胞
CD2 CD40配體 修格連氏症候群 活化效應T細胞(活化Teff)
PD-L1 CD19 淋巴瘤/白血病 淋巴瘤/白血病細胞
CD30
CCR4
CD20
CD22
CD79b
CD8 CCR4 癌症 (癌症免疫療法) 調節性T細胞(Treg)
CTLA-4 CD4
CCR4
GITR
TIGIT CD4
CCR4
GITR
PD-1 CD4
CCR4
GITR
OX40 CD127 自體免疫疾病 效應T細胞(Teff)
CD26
CD70
CD15s
4-1BB CD127
CD26
CD70
CD15s
GITR CD127
CD26
CD70
CD15s
CD40配體 CD127
CD26
CD70
CD15s
CD4 CD69 ANCA相關性絲球體腎炎 組織常駐記憶型T(TRM)細胞
[表6B]
第一抗原 第二抗原 成為治療對象之疾病 靶細胞
PD-1 CD3 類風濕性關節炎 外周輔助性T(TPH)細胞及PD-1 高CD8陽性T細胞
CD4 乳糜瀉 PD-1陽性T細胞
整合素α4β7 CCR6 炎症性腸病 效應T細胞(Teff)及先天性淋巴細胞(ILC)
CXCR3
CD161
CD127 炎症性腸病 全部先天性淋巴細胞(ILC)及Treg以外之浸潤於腸道中之T細胞
CD40配體 多發性硬化症、炎症性腸病 局部趨化活化T細胞
整合素α4β1 CD40配體 多發性硬化症、炎症性腸病 局部趨化活化T細胞
CXCR5 CD127 過敏疾病 先天性淋巴細胞(ILC)
TPO受體(c-mpl) CD34 原發性骨髓纖維化症 異常增殖造血幹細胞
CD123 CD123陽性白血病幹細胞
CXCR3 CD3 自體免疫疾病(克隆氏病等)、動脈硬化、缺血性心臟病 CX3CR1陽性細胞 (細胞毒殺性效應T細胞等，NK細胞除外)
CD127 全身性紅斑狼瘡 Th1細胞
CD40配體
CCR4 CD127 過敏疾病 Treg以外之CCR4陽性T細胞
CD40配體
CCR6 CD127 牛皮癬 Th17細胞
CD40配體
CRTH2 CD127 過敏疾病 Th2細胞
CD40配體
CCR4 哮喘、嗜酸性球鼻竇炎、異位性皮膚炎
ST2 哮喘、嗜酸性球鼻竇炎 Tpath2細胞
CCR6 過敏疾病 Th2/Th17細胞 (僅於重症哮喘中出現之異細胞)
CCR3 嗜酸性球、嗜鹼性球、Th2細胞
CD207 CD11b 朗格漢斯細胞組織細胞增生症(LCH) 朗格漢斯細胞前驅細胞
CD1a
CD123 HLA-DR 全身性紅斑狼瘡 漿細胞樣樹狀細胞
ASCT2 漿細胞樣樹狀細胞、Th1細胞、及Th17細胞
CSF1R CD14 特發性肺纖維化症 單核球系骨髓衍生抑制細胞
CD33 癌症 骨髓衍生抑制細胞
CD19 CD38 全身性紅斑狼瘡 漿細胞
CD3 IL-23R 全身性紅斑狼瘡 Th1細胞、Th17細胞、Tfh細胞
CX3CR1 自體免疫疾病(克隆氏病等)、動脈硬化、缺血性心臟病 CX3CR1陽性細胞 (細胞毒殺性效應T細胞等，NK細胞除外)
CXCR4 第一型膠原蛋白 特發性肺纖維化症、全身性硬化症、肝硬化等各種纖維化疾病 纖維細胞
CD14 特發性肺纖維化症 單核球及纖維細胞
CD16 嗜中性球哮喘、慢性阻塞性肺病、阿茲海默症 活化嗜中性球
CLEC10A CD14 克隆氏病，類風濕性關節炎，哮喘 中間型單核球
CD16
CD70 CD38 多發性硬化症，視神經脊髓炎 活化T細胞及活化B細胞
CD4 全身性紅斑狼瘡 Th1細胞、Th17細胞及漿細胞樣樹狀細胞
CD127
TIM-1
CD4 TIM-1
CD70 CD52 多發性硬化症 活化T細胞及活化B細胞
[表6C]
第一抗原 第二抗原 成為治療對象之疾病 靶細胞
CB1 AT1R 肝硬化 GPCR異聚體表現壞星細胞
CD4 CD153 全身性紅斑狼瘡 老化T細胞
PD-1
FcεRI CD34 蕁麻疹、食物過敏、肥胖細胞症等肥大細胞活化症候群(MCAS) 肥大細胞及肥大細胞前驅細胞
C-KIT
CD34 CD203 蕁麻疹、食物過敏、肥胖細胞症等肥大細胞活化症候群(MCAS) 肥大細胞前驅細胞
MRGPRX2
CD52 CD127 多發性硬化症 Treg以外之T細胞及B細胞
CD69 CD21 多發性硬化症、1型糖尿病，類風濕性關節炎 活化成熟初始B細胞
CD106 CD11c 繼發進展型多發性硬化症(SPMS)、抗TNF治療無效之類風濕性關節炎、移植、全身性紅斑狼瘡 濾泡樹狀細胞 (follicular dendritic cells)
CD19
CD21
CD72
4-1BB CD11c
CD19
CD21
CD72
BLT1 CD49b 哮喘 BLT1陽性CD8陽性細胞
CD226 CD8 全身性硬皮病 CD226陽性CD8陽性效應型記憶細胞
CXCR3 CD8 尋常性白斑、牛皮癬 效應型記憶CD8陽性細胞
CD49a
IL-15R
NKG2D
CD49a CD8
IL-15R
NKG2D
IL-15R CD8
NKG2D
NKG2D CD8
CD177 PR3 ANCA相關性血管炎、全身性紅斑狼瘡 浸潤於血管外之嗜中性球及PR3呈現嗜中性球
CD4 CD127 T細胞依賴性之免疫相關性疾病 Treg以外之CD4陽性T細胞
CD40配體 IL-6 免疫相關性疾病 活化T細胞
IL-17R 膜型TNF 牛皮癬性關節炎 IL17R及膜型TNF表現細胞
IL-23R CCR6 自體免疫疾病(修格連氏症候群、牛皮癬) Th17細胞
[表6D]
第一抗原 第二抗原 成為治療對象之疾病 靶細胞
CD64 CD206 癌症 M2巨噬細胞
CD64 CD163
CD64 CD68
CD163 CD206
CD163 CD68
CD206 CD68
CD14 CD48 癌症 骨髓衍生抑制性細胞
CD14 CD84
CD14 CD97
CD14 CD305
CD15 CD48
CD15 CD84
CD15 CD97
CD15 CD305
CD33 CD48
CD33 CD84
CD33 CD97
CD33 CD305
CD11b CD48
CD11b CD84
CD11b CD97
CD11b CD305
CCR4 CADM1 白血病/淋巴瘤 腫瘤細胞
CCR4 CD30
CCR4 CD70
CD38 CD138 白血病/淋巴瘤 腫瘤細胞
CD38 BCMA
BCMA CD56
BCMA CS1
CD40配體 CD36 白血病/淋巴瘤 異常巨核細胞
CD40配體 CD62P
CD40配體 CD63
TIM-3 CD123 白血病/淋巴瘤 腫瘤細胞
TIM-3 CD33
TIM-3 CD47
TIM-3 CD70
TIM-3 CLEC12A
CD123 CD33
CD123 CD47
CD123 CD70
CD123 CLEC12A
CD5 CD23 白血病/淋巴瘤 腫瘤細胞
CD10 CD20 白血病/淋巴瘤 腫瘤細胞
CD5 CD20 白血病/淋巴瘤 腫瘤細胞
[表6E]
第一抗原 第二抗原 成為治療對象之疾病 靶細胞
CD40 CD80 炎症性疾病 活化抗原呈現細胞
CD86
ICOS配體
4-1BB配體
OX40配體
CD70
GITR
PD-L1
PD-L2
B7-DC
B7H3
B7H4
B7H5
B7H6
B7H7
PTPRS IL-21R 自體免疫疾病 漿細胞樣樹狀細胞(pDC)、T細胞及B細胞
CD38 漿細胞樣樹狀細胞(pDC)、活化T細胞、B細胞及漿細胞
CD32a 漿細胞樣樹狀細胞(pDC)及骨髓細胞
OX40 CD127 過敏疾病 Treg以外之輔助性T細胞
CD40配體 過敏疾病 Treg以外之輔助性T細胞
CD8 尋常性白斑、牛皮癬 CD8記憶型T細胞
NKG2D 尋常性白斑、牛皮癬 CD8記憶型T細胞
CD226 硬皮病 CD8記憶型T細胞
CRTH2 過敏疾病 活化Th2細胞
CRTH2 CD2 過敏疾病 Th2細胞及先天性淋巴細胞(ILC2細胞)
CD7 過敏疾病 Th2細胞及先天性淋巴細胞(ILC2細胞)
CD45 過敏疾病 CRTH2陽性血球細胞
含有本發明之抗體組合物之醫藥組合物亦可以治療藥之形式單獨投予，通常較佳為以與藥理學上容許之一種或一種以上載體一起混合並藉由製劑學之技術領域中廣為人知之任意方法所製造之醫藥製劑之形式提供。
投予路徑較佳為使用治療時最有效之路徑。例如可例舉：經口投予或口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌內及靜脈內等非經口投予，於抗體組合物製劑之情形時，較佳可例舉靜脈內投予。
作為投予形態，例如可例舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、貼劑等。
作為適於經口投予之製劑，例如可例舉：乳劑、糖漿劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑等。
如乳劑及糖漿劑之液體製備物可使用如下物質作為添加劑而製造：水；蔗糖、山梨糖醇、果糖等糖類；聚乙二醇或丙二醇等二醇類；芝麻油或橄欖油、大豆油等油類；對羥基苯甲酸酯類等防腐劑；或者草莓香料或胡椒薄荷等香料類等。
膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等可使用如下物質作為添加劑而製造：乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等賦形劑；澱粉或海藻酸鈉等崩解劑；硬脂酸鎂或滑石等潤滑劑；聚乙烯醇、羥丙基纖維素或明膠等結合劑；脂肪酸酯等界面活性劑；或甘油等塑化劑等。
作為適於非經口投予之製劑，例如可例舉：注射劑、栓劑、噴霧劑等。
注射劑係使用包含鹽溶液或葡萄糖溶液或者兩者之混合物之載體等進行製備。或者依據常規方法將抗體組合物冷凍乾燥，於其中添加氯化鈉，藉此亦可製備粉末注射劑。
栓劑係使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體進行製備。
又，噴霧劑係使用該抗體組合物本身進行製備，或者使用不刺激接受者之口腔及呼吸道黏膜且使該抗體組合物以微細粒子之形式分散而使吸收變得容易之載體等進行製備。
作為載體，具體而言，可例示乳糖、甘油等。根據該抗體組合物及所使用之載體之性質，能夠實現霧劑、乾粉等製劑。又，於該等非經口劑中亦可添加於經口劑中作為添加劑所例示之成分。
投予量或投予次數係根據目標之治療效果、投予方法、治療期間、年齡、體重等而不同，以有效成分之量計，通常為成人每天10 μg/kg～20 mg/kg。
又，關於研究抗體組合物對各種腫瘤細胞之抗腫瘤效果之方法，作為試管內實驗，可例舉CDC活性測定法、ADCC活性測定法等，作為活體內實驗，可例舉使用小鼠等實驗動物中之腫瘤系統之抗腫瘤實驗等。
作為本發明之一態樣，可例舉包含第一及第二IgG半聚體之套組。套組中可任意地包含包括合適之容器(例如罐(bottle)、小瓶(vial)、試驗管)、示出說明等之標籤、過濾器、針、注射器、及使用說明書在內之其他材料。
於上述套組中，除了作為有效成分之IgG半聚體以外，亦可視需要混合例如殺菌水、生理鹽水、植物油、界面活性劑、脂質、增溶劑、緩衝劑、蛋白質穩定劑(例如BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)或明膠等)、保存劑、阻斷溶液、反應溶液、反應終止液、用以處理試樣之試劑等。
作為上述套組之使用態樣，例如可例舉：(1)預先混合第一IgG半聚體及第二IgG半聚體後進行投予之方法；以及(2)分開投予第一IgG半聚體及第二IgG半聚體之方法。作為上述(2)分開投予第一IgG半聚體及第二IgG半聚體之方法，例如可例舉同時或逐次地投予第一IgG半聚體及第二IgG半聚體之方法。第一IgG半聚體及第二半聚體之量及比率可適當調整。
又，作為本發明之一態樣，可例舉用以製造包含第一IgG半聚體與第二IgG半聚體且針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物的第一IgG半聚體。
作為本發明之另一態樣，可例舉用以製造包含第一IgG半聚體與第二IgG半聚體且針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物的第二IgG半聚體。
作為本發明之一態樣，可例舉與第二IgG半聚體併用之第一IgG半聚體。又，作為本發明之一態樣，可例舉與第一IgG半聚體併用之第二IgG半聚體。此處，所謂將第一IgG半聚體與第二IgG半聚體「併用」係指將第一IgG半聚體與第二IgG半聚體同時或逐次地投予，而製成包含第一IgG半聚體與第二IgG半聚體且包含結合於互不相同之第一抗原及第二抗原之半聚體之抗體組合物。於將第一半聚體與第二半聚體同時或逐次地投予之情形、於在注射用小瓶中混合之情形、於在點滴袋內混合之情形、或直接投予至患者之情形，以任一形式投予之情形均包含於本發明之抗體組合物之用途中。
以下，藉由實施例對本發明進行具體說明，但本發明並不限定於下述實施例。 實施例
本發明人等對於本發明中之抗體分子之恆定區，考慮到需要與通常之人類IgG1抗體不同之下述要素。 1)如圖4所示，其係針對不同之抗原分子X及Y之抗體之半聚體的混合物、即於鉸鏈區域中之H鏈之間不存在藉由雙硫鍵形成之共價鍵的「HL體」。 2)如圖3所示，針對抗原分子X、Y之各HL體與表現X、Y兩者之靶細胞表面結合後締合而形成與通常之IgG相同之H2L2體，構成CD16a結合區，從而誘導抗體之效應子功能(例如ADCC活性)。 3)如圖3所示，為了避免對僅表現單一之抗原分子之細胞誘導抗體之活性，即便針對X或Y之HL體彼此於細胞表面締合，亦不會構成CD16a結合區。
於本實施例中，關於上述1)，藉由將鉸鏈域之半胱胺酸置換為丙胺酸而進行了嘗試。
藉由X射線結晶結構分析，已知人類IgG1之Fc與CD16a顯示非對稱之結合形式(Nature 2000; 406: 267-73, J Biol Chem 2001; 276: 16469-77, Mizushima T, Genes Cells 2011; 16: 1071-80)。因此，本發明人等為了達成上述2)及3)，而考慮對上述HL體之CH2域導入利用該非對稱之結合形式之下文所述之胺基酸改型。
如圖5所示，CD16a係於Fc中之兩個CH2域中分別在不同之部位相接。假定將兩個CH2域命名為CH2-A、CH2-B，將CH2-A上之與CD16a之相互作用部位設為區域1，將CH2-B上之與CD16a之相互作用部位設為區域2。
作為區域1，已知L235、G236、G237、P238、S239、D265、V266、S267、H268、E269、E294、Q295、Y296、N297、S298、T299、R301、N325、A327及I332等。又，作為區域2，已知L235、G236、G237、K326、A327、L328、P329及A330等。
如圖5所示，由於Fc之結構之對稱性，於實際之Fc與CD16a結合之結合區之相反側存在另一個包含CH2-A之區域2、及CH2-B之區域1，且實際上未用於與CD16a之結合的結合區。
如圖6所示，對該未用於與CD16a之結合的CH2-A之區域2、及CH2-B之區域1分別導入胺基酸改型而進行「破壞」。於該情形時，於此種具有改型CH2-A之HL體(X)彼此、或具有改型CH2-B之HL體(Y)彼此同型締合而構成H2L2體之情形時(XX、YY)，變得僅存在區域1、或僅存在區域2。因此，認為存在CD16a無法具有充分之親和性而與該等同型締合體結合之可能性。相對於此，認為存在此種分別具有改型CH2-A、改型CH2-B作為構成要素之HL體異型締合而成之H2L2體(XY)滿足上述2)及3)之條件之可能性。
[實施例1] CD16a結合被「破壞」之人類IgG1抗CCR6抗體之製作 為了特定出可減弱CD16a之結合的CH2上之部位，製作上述區域1或區域2被胺基酸改型「破壞」之抗體。即，如圖7所示，對在通常之人類IgG1之型式上成為候選之部位的胺基酸殘基進行改型。
於該情形時，為了表現人類IgG1作為重組抗體，而於表現載體上由同一基因編碼兩個H鏈，不區分CH2-A與CH2-B而對兩者同時改型胺基酸殘基，CD16a之結合部位由於正反兩處同時被破壞，故而需要搜尋ADCC活性減弱之改型部位。
再者，於本實施例中，只要無特別說明，則抗體分子均係製作與H鏈297位之天冬醯胺結合之N-鍵結型糖鏈之α1,6岩藻糖未結合的ADCC活性經增強之抗體。因此，用以表現抗體之宿主細胞使用岩藻糖轉移酶(FUT8)剔除CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)。
(1)CD16a結合被「破壞」之人類IgG1抗CCR6抗體表現載體之製作 圖5及6表示CH2域上之「區域1」及「區域2」之模式圖。如圖6所示，為了「破壞」對於CD16a之結合，而構建人類IgG1抗人類CCR6抗體(國際公開第2013/005649號)之表現載體，其係對在CH2域上之「區域1」中與CD16a結合之胺基酸部位P238、D265、S267導入了胺基酸改型，且對在CH2域上之「區域2」中與CD16a結合之胺基酸部位K326、L328、P329導入了胺基酸改型而成者。將構建所使用之抗體之基因序列與胺基酸序列示於表7。
[表7]
序列名 基因序列 胺基酸序列
CCR6(KG1684) VL 序列編號1 序列編號2
CCR6(KG1684) VH 序列編號3 序列編號4
IgG1 CK 序列編號5 序列編號6
IgG1 CH 序列編號7 序列編號8
IgG1_P238A CH 序列編號9 序列編號10
IgG1_D265A CH 序列編號11 序列編號12
IgG1_S267L CH 序列編號13 序列編號14
IgG1_P238A/D265A CH 序列編號15 序列編號16
IgG1_P238A/S267L CH 序列編號17 序列編號18
IgG1_D265A/S267L CH 序列編號19 序列編號20
IgG1_P238A/D265A/S267L CH 序列編號21 序列編號22
IgG1_K326W CH 序列編號23 序列編號24
IgG1_L328V CH 序列編號25 序列編號26
IgG1_P329Y CH 序列編號27 序列編號28
IgG1_K326W/L328V CH 序列編號29 序列編號30
IgG1_K326W/P329Y CH 序列編號31 序列編號32
IgG1_L328V/P329Y CH 序列編號33 序列編號34
IgG1_K326W/L328V/P329Y CH 序列編號35 序列編號36
將包含序列編號1、3、5、7所示之鹼基序列之人類IgG1抗人類CCR6抗體表現載體pCI-IgG1_KG1684用於模板，使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TAKARA BIO)及導入有改型部位之引子(σ-oligo)，依據PrimeSTAR Max DNA聚合酶之附件進行PCR反應。
PCR反應係使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)，於98℃熱改性1分鐘後，將於98℃進行10秒、於58℃進行5秒、於72℃進行5秒之反應循環30次。將反應液供於使用0.8%瓊脂糖凝膠之電泳，使用QIAquick凝膠萃取套組(Qiagen)回收擴增片段。使用In-Fusion HD選殖套組(Clontech)而與質體pCI載體(Promega)進行連結反應，使用該反應液將大腸桿菌DH5α勝任細胞(TAKARA BIO)轉形。
由所獲得之轉形株之純系製備各質體DNA，使用Big Dye Terminator循環測序套組v3.1(Applied Biosystems)並依據隨附之說明書進行反應後，藉由同公司之DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA分析器對插入至質體中之DNA之鹼基序列進行分析。
(2) CD16a結合被「破壞」之人類IgG1抗CCR6抗體之表現 利用以下之方法對宿主細胞導入(1)中所製作之表現載體。宿主細胞使用FUT8剔除CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)。質體導入之方法係依據隨附之說明書。
培養液量係以200 mL進行，於37℃、5% CO2 、125 rpm之設定條件下培養5天。培養後進行細胞懸浮液之離心分離，通過0.2 μm過濾器(ThermoScientific)回收包含改型抗體之培養上清液。
將各抗體之經純化之抗體樣品之名稱示於表8。
[表8]
純化抗體(名稱) CH2之區域1 CH2之區域2
IgG1 - -
IgG1_P238A P238A P238A
IgG1_D265A D265A D265A
IgG1_S267L S267L S267L
IgG1_P238A/D265A P238A/D265A   
IgG1_P238A/S267L P238A/S267L   
IgG1_D265A/S267L D265A/S267L   
IgG1_P238A/D265A/S267L P238A/D265A/S267L -
IgG1_K326W - K326W
IgG1_L328V - L328V
IgG1_P329Y - P329Y
IgG1_K326W/L328V - K326W/L328V
IgG1_K326W/P329Y - K326W/P329Y
IgG1_L328V/P329Y - L328V/P329Y
IgG1_K326W/L328V/P329Y - K326W/L328V/P329Y
(3) CD16a結合被「破壞」之人類IgG1抗CCR6抗體之純化 藉由以下所示之使用MabSelect SuRe(GE Healthcare)之親和純化而純化改型抗體。利用PBS將樹脂平衡化後，裝入(2)中所獲得之培養上清液，利用PBS洗淨2次。洗淨後，使用溶出緩衝液(100 mM檸檬酸，pH值3.5)使抗體溶出，添加1/10量之中和緩衝液(2 M Tris-HCl，pH值8.0)進行中和。
繼而，使用Amicon Ultra-4 Centerifugal Filter Units(Millipore)進行利用超過濾之濃縮及緩衝液(10 mM檸檬酸、150 mM NaCl，pH值6.0)置換，使用Nanodrop8000(ThermoScientific)測定280 nM下之吸光度(A280)，而進行抗體溶液之濃度測定及製備。
(4) CD16a結合被「破壞」之人類IgG1抗CCR6抗體之利用SDS-PAGE之純化度的評價 為了對各種缺損CD16結合之人類IgG1抗CCR6抗體純化樣品之純化度進行評價，而使用約1 μg之抗體純化樣品，依據公知之方法[Nature, 227 680 (1970)]進行SDS改性聚丙烯醯胺電泳(以下表述為SDS-PAGE)。
其結果為，於還原條件下，各種缺損CD16結合之人類IgG1抗CCR6抗體與通常IgG1型同樣地，於H鏈為約50千道爾頓(以下表述為kDa)、L鏈為約25 kDa附近發現染色帶(band)。又，於非還原條件下，由於在約150 kDa附近發現了染色帶，故而確認到所製作之抗CCR6域交換抗體包含目標之H鏈及L鏈。
根據以上之結果，確認到於本實施例之第3項中所獲得之各種缺損CD16結合之人類IgG1抗CCR6抗體之純化樣品中，分別以充分之比率含有包含H鏈及L鏈之目標之IgG分子。
(5) CD16a結合區被「破壞」之人類IgG1抗CCR6抗體之ADCC活性 使用將編碼人類CD16a(Val型)之DNA基因轉殖於作為NK細胞株之NK-92(ATCC)中並使其穩定地表現所得之NK-92/CD16轉染子作為效應細胞，且使用人類CCR6/CHO轉染子作為靶細胞。將所培養之各細胞回收並對細胞進行計數，以分別成為8×105 個細胞/mL、2×105 個細胞/mL之方式使用RPMI培養基(添加有5% FBS/1% PS之不含酚紅之RPMI1640培養基)進行製備。
利用連續分注機以50 μL/孔之方式於96孔板中分注抗體溶液後，以50 μL/孔之方式分注靶細胞。以50 μL/孔之方式分注效應細胞，以1800 rpm離心分離2分鐘，確認到將細胞均等地接種。
於CO2 保溫箱中在37℃靜置3小時15分鐘後，向全部對照組分注10分之1量之助溶溶液，於37℃靜置45分鐘。以1800 rpm離心分離2分鐘後，將上清液50 μL分注於ELISA板中。使受質(粉)溶解於懸浮緩衝液12 mL中而製作顯色溶液，以50 μL/孔之方式利用顯色溶液進行反應。以50 μL/孔添加停止溶液，利用讀板儀測定吸光度(A450)。
再者，使用CytoTox96(R)非放射性細胞毒性檢測(Promega)作為ADCC測定用套組。使用以下之式算出ADCC活性(%)。
ADCC活性(%)＝100x(S－E－T)/(Max－T) S＝樣品反應孔吸光度－培養基孔吸光度 E＝效應孔吸光度－培養基孔吸光度 T＝靶孔吸光度－培養基孔吸光度 Max＝100%反應孔－100%反應對照孔
將結果示於圖8。如圖8所示，於CH2之區域1中確認到包含IgG1_D265A、IgG1_P238A/S267L、IgG1_D265A/S267L之改型體對於靶細胞，ADCC活性顯著減弱。
又，於CH2之區域2中確認到包含IgG1_P329Y、IgG1_K326W/P329Y、IgG1_L328V/P329Y、IgG1_K326W/L328V/P329Y之改型體之ADCC活性顯著減弱，可知所有改型體均包含P329Y改型。
根據以上之結果明確，於CH2域上之「區域1」中導入D265A或P238A/S267L之胺基酸改型，且於CH2域上之「區域2」中至少導入P329Y之胺基酸改型，藉此可破壞CD16a結合部位。
[實施例2] 導入有CD16a結合非對稱改型之人類IgG1抗CCR6一價抗體之製作 於實施例1中，作為可破壞CD16a與Fc之非對稱之結合部位之胺基酸序列的一例，於CH2-A中選擇源自「區域1」之D265A或P238A/S267L，於CH2-B中選擇源自「區域2」之P329Y。
於本項中，為了僅向CH2-A與CH2-B分別非對稱地導入上述改型而評價ADCC活性，而將可使編碼兩分子之H鏈之不同基因表現並使其等進行異型締合之「一價抗體」(國際公開第2011/108502號)用於基本骨架。圖9表示該一價抗體之一態樣之模式圖。圖9中上述異型締合體為「非對稱改型體#1」。
(1) CD16a結合非對稱改型一價抗體表現載體之製作 構建非對稱或對稱地導入有CH2-A(D265A或P238A/S267L)、CH2-B(P329Y)之人類IgG1抗CCR6一價抗體(國際公開第2011/108502號)之表現載體。
將人類IgG1抗CCR6一價抗體表現載體pCI-mvG1_KG1684用於模板，使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TAKARA BIO)及導入有改型部位之引子(σ-oligo)，依據PrimeSTAR Max DNA聚合酶之附件進行PCR反應。
PCR反應係使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)，於98℃熱改性1分鐘後，將於98℃進行10秒、於58℃進行5秒、於72℃進行5秒之反應循環30次。
將反應液供於使用0.8%瓊脂糖凝膠之電泳，使用QIAquick凝膠萃取套組(Qiagen)回收擴增片段。使用In-Fusion HD選殖套組(Clontech)而與質體pCI載體(Promega)進行連結反應，使用該反應液將大腸桿菌DH5α勝任細胞(TAKARA BIO)轉形。
由所獲得之轉形株之純系製備各質體DNA，使用Big Dye Terminator循環測序套組v3.1(Applied Biosystems)並依據隨附之說明書進行反應後，藉由同公司之DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA分析器對插入至質體中之DNA之鹼基序列進行分析。
(2) CD16a結合非對稱改型一價抗體之表現 藉由與實施例1之第二項同樣之方法，進行該抗體之表現，並回收包含抗體之培養上清液。將各純化抗體樣品與其改型部位示於表9。再者，改型部位中之胺基酸殘基置換係藉由與實施例1同樣之方法進行。
[表9]
純化抗體(名稱) CH2-A(區域1、區域2) CH2-B(區域1、區域2)
野生型 - -
非對稱改型體#1 D265A P329Y
非對稱改型體#2 P329Y D265A
非對稱改型體#3 P238A/S267L P329Y
非對稱改型體#4 P329Y P238A/S267L
對稱改型體#1 D265A D265A
對稱改型體#2 P329Y P329Y
對稱改型體#3 P238A/S267L P238A/S267L
對稱改型體#4 D265A、P329Y D265A、P329Y
對稱改型體#5 P238A/S267L、P329Y P238A/S267L、P329Y
(3) CD16a結合非對稱改型一價抗體之純化 藉由與實施例1之第3項同樣之方法進行該抗體之純化。溶出緩衝液係使用100 mM檸檬酸、pH值3.9。其後，使用AKTA FPLC(GE Healthcare)及Superdex高性能管柱(GE Healthcare)，自該抗體溶液分取單聚體組分。利用AKTA系統孔徑0.22 μm之膜濾器(Millex-GV，Millipore)進行過濾殺菌，藉此獲得純化抗體。使用Nanodrop8000(ThermoScientific)測定280 nm下之吸光度(A280)。
(4)導入有CD16a結合非對稱改型之人類IgG1抗CCR6一價抗體之利用SDS-PAGE之純化度的評價 為了對各種導入有CD16a結合非對稱改型之人類IgG1抗CCR6一價抗體純化樣品之純化度進行評價，而使用抗體純化樣品約1 μg進行SDS-PAGE。
其結果為，於還原條件下所有改型體與野生型一價抗體同樣地，於H鏈及Fc融合L鏈為約50 kDa附近發現染色帶。又，於非還原條件下，由於在約100 kDa附近發現了染色帶，故而確認到所製作之非對稱改型體及對稱改型體包含目標之H鏈及L鏈。
根據以上之結果，確認到於本實施例之第3項中所獲得之各種導入有CD16a結合非對稱改型之人類IgG1抗CCR6一價抗體之純化樣品中，分別以充分之比率含有包含H鏈及Fc融合L鏈之目標之一價抗體分子。
(5) CD16a結合非對稱改型一價抗體之ADCC活性 藉由與實施例1之第5項同樣之方法測定ADCC活性。將結果示於圖10。如圖10所示，確認到導入有CD16a結合之非對稱改型之一價抗體(非對稱改型體#1～4)以抗體濃度依賴性之方式毒殺靶細胞。另一方面，確認到導入有CD16a結合之對稱改型之一價抗體(對稱改型體#1～#5)對於靶細胞未表現出ADCC活性。
根據以上之結果，確認到導入有CD16a結合之非對稱改型之一價抗體對於人類CD16a之結合活性得到維持，可對靶細胞發揮ADCC活性。
另一方面，於向兩者之CH2域導入相同改型之情形時，由於失去ADCC活性，故而於具有相同改型CH2之抗體於細胞表面上嗜同性締合之情形時，確認到ADCC活性未被誘發，且發現了用以構成於細胞表面上異型締合後才對本發明所追求之兩個抗原發揮ADCC活性之HL抗體的改型CH2域。
[實施例3] 於本實施例中，將實施例1、2中所獲得之異型締合後才可誘發ADCC活性之改型CH2搭載於針對不同抗原之兩種抗體之半聚體(HL體)，驗證對共同表現兩種抗原之靶細胞是否可特異性地誘發ADCC活性。
CH3域彼此之相互作用係於J Immunol 2011; 187: 3238-3246中得到報告。人類IgG1之CH3域之相互作用(KD 值)為3.0×10-9 M，人類IgG4之CH3域之KD 值為4.8×10-8 M，人類IgG4之CH3域之相互作用較IgG1弱約6～7倍。
藉由利用該性質與切斷鉸鏈區域中之H鏈間之雙硫鍵的胺基酸改型(C226A/C229A：AA)而嘗試製作抗體之半聚體。半聚體之H鏈恆定區係使用以人類IgG1作為基本骨架，僅將CH3域交換為人類IgG4序列，進而向鉸鏈區域附加胺基酸改型(AA)之域交換抗體(以下稱為IgG1114_AA型)。
此外，為了強化ADCC活性，將公知之ADCC活性增強胺基酸改型附加於CH2域，進而將與Asn297結合之N-鍵結型糖鏈之α1,6岩藻糖去除，最後導入CD16a結合非對稱胺基酸改型。圖11表示IgG1114_AA_AAA_D265A(/P329Y)型之IgG半聚體之模式圖。使用CD4與CD70作為兩種模型抗原。
依據以下之程序製作組合有上述所示之改型之抗CD4抗體(J. Immunol. 1992; 149:1779-1787)及抗CD70抗體(國際公開第2007/03637號)。將具有包含向IgG1114_AA型導入公知之ADCC活性增強胺基酸改型(S298A/E333A/K334A：AAA)改型、CD16a結合非對稱胺基酸改型(D265A或P329Y)而成之胺基酸序列的H鏈恆定區之抗CD4及CD70抗體分別稱為IgG1114_AA_AAA_D265A(/P329Y)型抗CD4抗體之半聚體、IgG1114_AA_AAA_D265A(/P329Y)型抗CD70抗體之半聚體。
將所設計之各種抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體之各區域所來自之亞型、及H鏈恆定區之胺基酸序列之對應關係示於表10。又，將對於所使用之CD4及CD70之抗體之鹼基序列與胺基酸序列示於表11。
[表10]
結構名 CH1 鉸鏈 CH2 CH3 基因、胺基酸序列
IgG1114_AA_AAA_D265A G1 G1(AA) G1(AAA_D265A) G4 序列編號37、38
IgG1114_AA_AAA_P329Y G1 G1(AA) G1(AAA_P329Y) G4 序列編號39、40
[表11]
序列名 基因序列 胺基酸序列
CD4(艾巴利珠單抗(ibalizumab)) VL 序列編號41 序列編號42
CD4(艾巴利珠單抗) VH 序列編號43 序列編號44
CD70(2H5) VL 序列編號45 序列編號46
CD70(2H5) VH 序列編號47 序列編號48
(1)抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體表現載體之製作 使用限制酶NheI及NotI，自人類IgG1抗CD4抗體表現載體pCI-IgG1_CD4(艾巴利珠單抗)(序列編號5、7、41、43)或人類IgG1抗CD70抗體表現載體pCI-IgG1_CD70(2H5)(序列編號5、7、45、47)切出約9 kbp之DNA片段並純化。
使用In-Fusion HD選殖套組(Clontech)使經純化之DNA片段與包含人類IgG1抗體之CH1域、鉸鏈域(附加C226A/C229A改型者)、CH2域(附加S298A/K333A/E334A改型、D265A或P329Y改型者)、人類IgG4抗體之CH3域之人工合成基因進行連結反應，使用該反應液將大腸桿菌DH5α勝任細胞(TAKARA BIO)轉形。由所獲得之轉形株之純系製備各質體DNA，於FASMAC對DNA之鹼基序列進行分析。
(2)各種抗CD4 IgG1抗體及抗CD70 IgG1抗體以及該等抗體之半聚體之表現 藉由與實施例1之第二項同樣之方法，進行該抗體之表現，並回收包含抗體之培養上清液。
將經純化之抗體樣品之名稱示於表12。
[表12]
純化抗體(名稱) 抗體之結構
CD4抗體 IgG1
CD70抗體 IgG1
CD4抗體之半聚體1 IgG1114_AA_AAA_D265A
CD4抗體之半聚體2 IgG1114_AA_AAA_P329Y
CD70抗體之半聚體1 IgG1114_AA_AAA_D265A
CD70抗體之半聚體2 IgG1114_AA_AAA_P329Y
(3)抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體之純化 藉由與實施例1之第3項同樣之方法進行該抗體之純化，並進行抗體溶液之濃度測定及製備。
(4)抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體之利用SDS-PAGE之純化度的評價 為了對所製備之各種抗體樣品之純化度進行評價，使用抗體純化樣品約1 μg進行SDS-PAGE。將結果示於圖12。
如圖12所示，經純化之抗體全部於還原條件下在H鏈為約50 kDa、L鏈為約25 kDa附近發現染色帶。又，於非還原條件下，抗CD4 IgG1抗體及抗CD70 IgG1抗體於約150 kDa發現染色帶，抗CD4半聚體及抗CD70半聚體於約75 kDa附近發現染色帶，因此確認到，所製作之抗CD4 IgG1抗體及抗CD70 IgG1抗體為包含目標之H鏈及L鏈之抗體結構，抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體為包含目標之H鏈及L鏈、容易形成半聚體之抗體結構。
根據以上之結果，確認到於本實施例之第3項中所獲得之抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體純化樣品中，以充分之比率包含目標抗體分子。
(5)抗CD4 IgG1抗體及抗CD70 IgG1抗體、以及該等抗體之半聚體針對CD4/CD70雙陽性細胞、CD4及CD70單陽性細胞之ADCC活性 藉由與實施例1之第5項同樣之方法測定ADCC活性。關於靶細胞，使用CD4/EL-4轉染子作為CD4單陽性細胞，使用MT-1作為CD70單陽性細胞，使用TL-Om1作為CD4/CD70雙陽性細胞。將使用流式細胞儀測定該等細胞中之CD4及CD70之表現量所得之結果示於圖13。
如圖13所示，確認到目標抗原於細胞中表現。又，將ADCC活性評價之結果示於圖14。作為陽性對照之抗體，使用抗CD4 IgG1抗體及抗CD70 IgG1抗體。
如圖14所示，表明如預想般，抗CD4抗體對CD4/EL-4轉染子發揮ADCC活性，抗CD70抗體對MT-1發揮ADCC活性，抗CD4抗體及抗CD70抗體對TL-Om1發揮ADCC活性。
另一方面，表明混合有抗CD4抗體之半聚體1與抗CD70抗體之半聚體2之抗體溶液、或混合有抗CD4抗體之半聚體2與抗CD70抗體之半聚體1之抗體溶液對CD4及CD70單陽性細胞未表現出ADCC活性，而僅對CD4/CD70雙陽性細胞特異性地發揮ADCC活性。
[實施例4] 將藉由在第一CD16a結合區中將EU索引所表示之235位、239位、265位、267位、269位、296位、298位、299位、327位進行胺基酸殘基改型，在第二CD16a結合區中將EU索引所表示之326位、328位、329位、330位進行胺基酸殘基改型而破壞CD16a結合之改型CH2搭載於針對不同抗原之兩種之抗體之半聚體(HL體)，驗證對共同表現兩種抗原之靶細胞是否可特異性地誘發ADCC活性。
所設計之各種抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體係藉由與實施例3同樣之方法進行製備，並評價ADCC活性。混合有抗CD4半聚體與抗CD70半聚體之抗體溶液係以成為1 μg/mL之方式添加。同樣地，用作陽性對照之抗體之抗CD4 IgG1抗體及抗CD70 IgG1抗體亦以成為1 μg/mL之方式添加。將所設計之各種抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體之各區域所來自之亞型、及H鏈恆定區之胺基酸序列之對應關係示於表13。
[表13]
純化抗體(名稱) 抗體之結構 序列編號   
CD4抗體之半聚體3 IgG1114_AA_AAA_S239R CH 49 基因序列
CD4抗體之半聚體3 IgG1114_AA_AAA_S239R CH 50 胺基酸序列
CD4抗體之半聚體4 IgG1114_AA_AAA_D265N CH 51 基因序列
CD4抗體之半聚體4 IgG1114_AA_AAA_D265N CH 52 胺基酸序列
CD4抗體之半聚體5 IgG1114_AA_AAA_D265E CH 53 基因序列
CD4抗體之半聚體5 IgG1114_AA_AAA_D265E CH 54 胺基酸序列
CD4抗體之半聚體6 IgG1114_AA_AAA_S267K CH 55 基因序列
CD4抗體之半聚體6 IgG1114_AA_AAA_S267K CH 56 胺基酸序列
CD4抗體之半聚體7 IgG1114_AA_AAA_E269P CH 57 基因序列
CD4抗體之半聚體7 IgG1114_AA_AAA_E269P CH 58 胺基酸序列
CD4抗體之半聚體8 IgG1114_AA_AAA_Y296P CH 59 基因序列
CD4抗體之半聚體8 IgG1114_AA_AAA_Y296P CH 60 胺基酸序列
CD4抗體之半聚體9 IgG1114_AA_AAA_S298E CH 61 基因序列
CD4抗體之半聚體9 IgG1114_AA_AAA_S298E CH 62 胺基酸序列
CD4抗體之半聚體10 IgG1114_AA_AAA_T299A CH 63 基因序列
CD4抗體之半聚體10 IgG1114_AA_AAA_T299A CH 64 胺基酸序列
CD4抗體之半聚體11 IgG1114_AA_AAA_L235R CH 65 基因序列
CD4抗體之半聚體11 IgG1114_AA_AAA_L235R CH 66 胺基酸序列
CD4抗體之半聚體12 IgG1114_AA_AAA_A327I CH 67 基因序列
CD4抗體之半聚體12 IgG1114_AA_AAA_A327I CH 68 胺基酸序列
CD70抗體之半聚體3 IgG1114_AA_AAA_K326G CH 69 基因序列
CD70抗體之半聚體3 IgG1114_AA_AAA_K326G CH 70 胺基酸序列
CD70抗體之半聚體4 IgG1114_AA_AAA_L328R CH 71 基因序列
CD70抗體之半聚體4 IgG1114_AA_AAA_L328R CH 72 胺基酸序列
CD70抗體之半聚體5 IgG1114_AA_AAA_P329K CH 73 基因序列
CD70抗體之半聚體5 IgG1114_AA_AAA_P329K CH 74 胺基酸序列
CD70抗體之半聚體6 IgG1114_AA_AAA_P329W CH 75 基因序列
CD70抗體之半聚體6 IgG1114_AA_AAA_P329W CH 76 胺基酸序列
CD70抗體之半聚體7 IgG1114_AA_AAA_A330P CH 77 基因序列
CD70抗體之半聚體7 IgG1114_AA_AAA_A330P CH 78 胺基酸序列
如圖15A～圖15H所示，表明混合有搭載有第一CD16a結合區經胺基酸改型之CH2之抗CD4抗體之半聚體、與搭載有第二CD16a結合區經胺基酸改型之CH2之抗CD70抗體之半聚體的抗體溶液對於CD4及CD70單陽性細胞未表現出ADCC活性，僅對於CD4/CD70雙陽性細胞特異性地發揮ADCC活性。
[實施例5]CD16a結合增強胺基酸改型之探索 已知提高對CD16a之結合之公知之胺基酸改型除了S298A/E333A/K334A改型以外還有大量胺基酸改型(國際公開第99/51642號、國際公開第2006/020114號、國際公開第2004/099249號、國際公開第2004/063351號、國際公開第2013/118858號)。於本實施例中確認了S298A/E333A/K334A改型以外之CD16a結合增強胺基酸改型。
(1)導入有CD16a結合增強胺基酸改型之人類IgG1抗CCR4抗體表現載體之製作 構建對人類IgG1抗人類CCR4抗體(國際公開第2005/053741號)導入有CD16a結合增強胺基酸改型之抗體之表現載體。使用限制酶NheI及NotI自人類IgG1抗CCR4抗體表現載體pCI-IgG1_CCR4(KM2160)(序列編號5、7、79、81)切出約9 kbp之DNA片段並純化。
使用In-Fusion HD選殖套組(Clontech)使經純化之DNA片段與包含導入有CD16a結合增強胺基酸改型之抗體Fc之人工合成基因進行連結反應，使用該反應液將大腸桿菌DH5α勝任細胞(TAKARA BIO)轉形。由所獲得之轉形株之純系製備各質體DNA，於FASMAC對DNA之鹼基序列進行分析。
(2)導入有CD16a結合增強胺基酸改型之人類IgG1抗CCR4抗體之表現 利用以下之方法對宿主細胞導入(1)中所製作之表現載體。宿主細胞使用FUT8剔除CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)。質體導入之方法係依據隨附之說明書。
培養液量係以200 mL進行，於37℃、5% CO2 、125 rpm之設定條件下培養5天。培養後進行細胞懸浮液之離心分離，通過0.2 μm過濾器(ThermoScientific)回收包含改型抗體之培養上清液。
(3)導入有CD16a結合增強胺基酸改型之人類IgG1抗CCR4抗體之純化 藉由以下所示之使用MabSelect SuRe(GE Healthcare)之親和純化而純化改型抗體。利用PBS將樹脂平衡化後，裝入(2)中所獲得之培養上清液，利用PBS洗淨2次。洗淨後，使用溶出緩衝液(100 mM檸檬酸，pH值3.5)使抗體溶出，添加1/10量之中和緩衝液(2 M Tris-HCl，pH值8.0)進行中和。
繼而，使用Amicon Ultra-4 Centerifugal Filter Units(Millipore)進行利用超過濾之濃縮及緩衝液(10 mM檸檬酸、150 mM NaCl，pH值6.0)置換，使用Nanodrop8000(ThermoScientific)測定280 nM下之吸光度(A280)，而進行抗體溶液之濃度測定及製備。
(4)導入有CD16a結合增強胺基酸改型之人類IgG1抗CCR4抗體之純化度之評價 為了對所製備之各種抗體樣品之純化度進行評價，使用抗體純化樣品約1 μg進行凝膠電泳(LabChip GX，PerkinElmer)，結果為經純化之抗體全部於還原條件下於H鏈為約50 kDa、L鏈為約25 kDa附近發現了染色帶。又，於非還原條件下，於約150 kDa附近發現了染色帶，因此確認所製作之抗CCR4 IgG1抗體為包含目標之H鏈及L鏈之抗體結構。
(5)導入有CD16a結合增強胺基酸改型之人類IgG1抗CCR4抗體之ADCC活性 藉由與實施例1之(5)同樣之方法測定ADCC活性。使用TL-Om1(CCR4陽性細胞)作為靶細胞。將所使用之抗CCR4抗體之VH及VL之鹼基序列及胺基酸序列之序列編號示於表14，將導入有CD16a結合增強胺基酸改型之抗CCR4抗體之CH之鹼基序列及胺基酸序列示於表15及表16。
[表14]
序列名 鹼基序列序列編號 胺基酸序列序列編號
CCR4(KM2160) VH 79 80
CCR4(KM2160) VL 81 82
將ADCC活性評價之結果示於以下表15及16。將具有S298A/E333A/K334A(AAA)改型之IgG1抗體0.1 μg/mL中之ADCC活性設為100，算出導入有各種胺基酸改型之抗體之ADCC活性。
[表15]
對IgG1抗CCR4抗體導入之CD16a結合增強胺基酸改型 ADCC活性比對(AAA＝100) CH序列編號(鹼基序列) CH序列編號(胺基酸序列)
S298A/E333A/K334A(AAA) 100 83 84
S239D/I332E(DE) 201 85 86
S239D/A330F 161 87 88
S239D/K326T 179 89 90
S298A/E333A/K334A(AAA)/P247L 160 91 92
S298A/E333A/K334A(AAA)/R292P 125 93 94
S298A/E333A/K334A(AAA)/H268E 164 95 96
S298A/E333A/K334A(AAA)/K326T 136 97 98
S298A/E333A/K334A(AAA)/P247L/N421K 175 99 100
S298A/E333A/R292L/K334E 163 101 102
S298A/E333A/K334A(AAA)/P329R 5 103 104
S298A/E333A/K334A(AAA)/A330F 96 105 106
S298A/E333A/K334E 114 107 108
S298A/E333A/K334A(AAA)/A339T 36 109 110
S298A/E333A/K334A(AAA)/F372Y 70 111 112
S298A/E333A/K334A(AAA)/V379M 51 113 114
S298A/E333A/K334A(AAA)/S239D/I332E 119 115 116
S298A/E333A/K334A(AAA)/E283L 82 117 118
S298T/E333A/K334A -97 119 120
S298A/E333A/K334A(AAA)/E294W 171 121 122
S298A/E333A/K334A(AAA)/Q295T 4 123 124
S298A/E333A/K334A(AAA)/A327D -28 125 126
S298A/E333A/K334A(AAA)/L235T -69 127 128
S298A/E333A/K334A(AAA)/G236S -46 129 130
S298A/E333A/K334A(AAA)/S239D 291 131 132
S298A/E333A/K334A(AAA)/F243L 79 133 134
S298A/E333A/K334A(AAA)/K248M 165 135 136
S298A/E333A/K334A(AAA)/E258H 94 137 138
S298A/E333A/K334A(AAA)/D265G -89 139 140
S239D 116 141 142
S239E 88 143 144
[表16]
對IgG1抗CCR4抗體導入之CD16a結合增強胺基酸改型 ADCC活性比對(AAA＝100) CH序列編號(鹼基序列) CH序列編號(胺基酸序列)
S239D/I332D 150 145 146
S239D/I332T 72 147 148
S239D/I332L 82 149 150
S239D/I332A 94 151 152
S239D/I332Y 123 153 154
S239D/I332F 93 155 156
S239D/I332W 94 157 158
S239D/I332H 84 159 160
S239D/K326L 113 161 162
S239D/K326E 147 163 164
S239D/K326I 146 165 166
S239E/I332Y 130 167 168
S239E/I332F 34 169 170
S239E/I332W 44 171 172
S239E/I332H 71 173 174
S239E/I332E 153 175 176
S239E/I332D 90 177 178
S239E/I332T 52 179 180
S239E/I332L 57 181 182
S239E/I332A 62 183 184
S239E/K326T 132 185 186
S239E/K326L 109 187 188
S239E/K326E 129 189 190
S239E/K326I 135 191 192
F243L/R292P/Y300L 3 193 194
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L -9 195 196
P230A/E233D/I332E 53 197 198
K288N/A330S/P396L -131 199 200
K334E/T359N/T366S -110 201 202
G316D/A378V/D399E -38 203 204
如表15及16所示，除了S298A/E333A/K334A(AAA)以外，亦確認到可適應本發明之抗體組合物之CD16a結合增強胺基酸改型。
[實施例6] IgG1之CH3域中之胺基酸置換 於實施例3中，已示出使用IgG1114_AA_AAA_D265A(/P329Y)之IgG半聚體對CD4/CD70雙陽性細胞特異性地發揮ADCC活性。此處所使用之抗體之相當於Fc區之CH3域的部分係使用人類IgG4之序列。
CH3域彼此之相互作用於J Immunol 2011:187:3238-3246中得到報告，人類IgG1之CH3域之相互作用(KD 值)為3.0×10-9 M，人類IgG4之CH3域之KD 值為4.8×10-8 M，人類IgG4之CH3域之相互作用較人類IgG1弱約6～7倍。
又，報告有藉由將人類IgG4之CH3域之R409置換為人類IgG1之K，而提高CH3域彼此之相互作用(Structure 2011 19: 9: 1274-1282)。
進而，亦報告有藉由將人類IgG1之CH3域內之胺基酸置換為Ala，而根據自由能之變化鑑定出對人類IgG1之CH3域彼此之相互作用而言重要之胺基酸部位(Biochemistry 1998:37:9266-9273)。因此，藉由對人類IgG1之CH3域附加公知之胺基酸改型，而能夠減弱人類IgG1之CH3域彼此之相互作用。
因此，藉由對人類IgG1之CH3域附加胺基酸改型而減弱人類IgG1之CH3域彼此之相互作用，來驗證是否對雙陽性細胞特異性地發揮ADCC活性。
依據以下程序製作使IgG1之CH3域彼此之相互作用減弱之抗CD4抗體(J. Immunol. 1992;149;1779-1787)及抗CD70抗體(國際公開第2007/03637號)。
將所設計之各種抗CD4及抗CD70半聚體之各區域所來自之亞型、及H鏈恆定區之胺基酸序列之對應關係示於表17。於人類IgG1型具有包含導入C266A/C229A：AA作為切斷鉸鏈區域中之H鏈間之雙硫鍵的胺基酸改型、導入S239D/I332E：DE作為ADCC活性增強胺基酸改型、導入D265A作為CD16a結合非對稱胺基酸改型、導入K409R改型作為使CH3域間相互作用減弱之胺基酸改型之胺基酸序列的H鏈恆定區之情形時，記載為「IgG1_AA_DE_D265A_K409R」。
[表17]
純化抗體名稱 (CH3域間相互作用減弱改型) 抗體之CH之結構 鹼基序列序列編號 胺基酸序列序列編號
抗CD4抗體之半聚體(K409R) IgG1_AA_DE_P329Y_K409R CH 205 206
抗CD4抗體之半聚體(Y349A) IgG1_AA_DE_D265A_Y349A CH 207 208
抗CD4抗體之半聚體(L351A) IgG1_AA_DE_D265A_L351A CH 209 210
抗CD4抗體之半聚體(T366A) IgG1_AA_DE_D265A_T366A CH 211 212
抗CD4抗體之半聚體(L368A) IgG1_AA_DE_D265A_L368A CH 213 214
抗CD4抗體之半聚體(D399A) IgG1_AA_DE_D265A_D399A CH 215 216
抗CD4抗體之半聚體(F405A) IgG1_AA_DE_D265A_F405A CH 217 218
抗CD4抗體之半聚體(Y407A) IgG1_AA_DE_D265A_Y407A CH 219 220
抗CD4抗體之半聚體(K409A) IgG1_AA_DE_D265A_K409A CH 221 222
抗CD70抗體之半聚體(K409R) IgG1_AA_DE_P329Y_K409R CH 223 224
抗CD70抗體之半聚體(Y349A) IgG1_AA_DE_P329Y_Y349A CH 225 226
抗CD70抗體之半聚體(L351A) IgG1_AA_DE_P329Y_L351A CH 227 228
抗CD70抗體之半聚體(T366A) IgG1_AA_DE_P329Y_T366A CH 229 230
抗CD70抗體之半聚體(L368A) IgG1_AA_DE_P329Y_L368A CH 231 232
抗CD70抗體之半聚體(D399A) IgG1_AA_DE_P329Y_D399A CH 233 234
抗CD70抗體之半聚體(F405A) IgG1_AA_DE_P329Y_F405A CH 235 236
抗CD70抗體之半聚體(Y407A) IgG1_AA_DE_P329Y_Y407A CH 237 238
抗CD70抗體之半聚體(K409A) IgG1_AA_DE_P329Y_K409A CH 239 240
(1)抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體表現載體之製作 使用限制酶NheI及NotI自人類IgG1抗CD4抗體表現載體pCI-IgG1_CD4(艾巴利珠單抗)(序列編號5、7、41、43)、或人類IgG1抗CD70抗體表現載體pCI-IgG1_CD70(2H5)(序列編號5、7、45、47)切出約9 kbp之DNA片段並純化。
使用In-Fusion HD選殖套組(Clontech)使經純化之DNA片段與包含人類IgG1抗體之CH1域、鉸鏈域(附加C226A/C229A改型者)、CH2域(附加S239D/I332E改型及D265A或P329Y改型者)、及CH3域(附加使CH3域相互作用減弱之胺基酸改型者)之人工合成基因進行連結反應，使用該反應液將大腸桿菌DH5α勝任細胞(TAKARA BIO)轉形。由所獲得之轉形株之純系製備各質體DNA，於FASMAC對DNA之鹼基序列進行分析。
(2)抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體之表現 藉由與實施例5同樣之方法對宿主細胞導入(1)中所製作之表現載體。
(3)抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體之純化 藉由與實施例5同樣之方法將改型抗體進行純化。
(4)抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體之利用SDS-PAGE之純化度的評價 藉由與實施例5同樣之方法，對所製備之各種抗體樣品之純化度進行評價，結果為經純化之抗體全部於還原條件下於H鏈為約50 kDa、L鏈為約25 kDa附近發現了染色帶。又，於非還原條件下，抗CD4 IgG1抗體及抗CD70 IgG1抗體於約150 kDa發現了染色帶，抗CD4半聚體及抗CD70半聚體於約75 kDa附近發現了染色帶，因此確認到所製作之抗CD4及抗CD70 IgG1抗體為包含目標之H鏈及L鏈之抗體結構，抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體為包含目標之H鏈及L鏈、容易形成半聚體之抗體結構。
(5)抗CD4 IgG1抗體及抗CD70 IgG1抗體、以及該等抗體之半聚體針對CD4/CD70雙陽性細胞、CD4及CD70單陽性細胞之ADCC活性 藉由與實施例5同樣之方法，對混合有附加有使CH3域彼此之相互作用減弱之胺基酸改型的抗CD4抗體之半聚體與抗CD70抗體之半聚體之抗體組合物之ADCC活性進行評價。使用抗CD4 IgG1抗體及抗CD70 IgG1抗體作為對照之抗體。
如圖16A及B所示，表明於混合有附加有使人類IgG1之CH3域彼此之相互作用減弱之胺基酸改型的抗CD4抗體之半聚體與抗CD70抗體之半聚體之抗體溶液中，與針對CD4及CD70單陽性細胞之ADDC活性相比，針對CD4/CD70雙陽性細胞之ADCC活性較強，對於CD4/CD70雙陽性細胞具有特異性。
[實施例7]小鼠動力試驗及CH2域之熱穩定性之測定 (小鼠動力試驗) 實施將實施例1～3中所獲得之CD16a結合非對稱改型(D265A及P329Y)、實施例5中所獲得之各種CD16a結合增強改型、及實施例6中所獲得之使人類IgG1之CH3域彼此之相互作用減弱之胺基酸改型(K409R)加以組合而成之抗體組合物之動力試驗。可變區使用不與特定之蛋白質反應之Clin Cancer Res. 11(8): 3126-3135, 2005所記載的編碼抗2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitrophenol，DNP)IgG1抗體(純系名DNP2)之改型區域的DNA片段。關於抗DNP抗體之VH及VL，將鹼基序列及胺基酸序列示於表18。又，將評價所使用之抗DNP抗體之半聚體1～6之鹼基序列及胺基酸序列示於表19。
[表18]
序列名 鹼基序列序列編號 胺基酸序列序列編號
抗DNP抗體VH 241 242
抗DNP抗體VL 243 244
[表19]
純化抗體 抗體之CH之結構 鹼基序列序列編號 胺基酸序列序列編號
抗DNP抗體之半聚體1 IgG1_AA_AAA/S239D_D265A_K409R CH 245 246
抗DNP抗體之半聚體2 IgG1_AA_S239D/I332E_D265A_K409R CH 205 206
抗DNP抗體之半聚體3 IgG1_AA_S239D/K326T_D265A_K409R CH 247 248
抗DNP抗體之半聚體4 IgG1_AA_AAA/S239D_P329Y_K409R CH 249 250
抗DNP抗體之半聚體5 IgG1_AA_S239D/I332E_P329Y_K409R CH 223 224
抗DNP抗體之半聚體6 IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH 251 252
抗DNP IgG1抗體及抗DNP抗體之半聚體係藉由與實施例6所記載之方法同樣之方法而製作。經純化之抗體全部於還原條件下於H鏈為約50 kDa、L鏈為約25 kDa附近發現了染色帶。又，於非還原條件下，抗DNP抗體於約150 kDa發現了染色帶，抗DNP抗體之半聚體於約75 kDa附近發現了染色帶，因此確認到所製作之抗DNP抗體為包含目標之H鏈及L鏈之抗體結構，抗DNP抗體之半聚體為包含目標之H鏈及L鏈、容易形成半聚體之抗體結構。
將抗DNP抗體之半聚體1與4、半聚體2與5或半聚體3與6分別混合而製備本發明之抗體組合物。將該抗體組合物(1 mg/kg)投予至BALB/c小鼠之尾靜脈中後，採集1小時、4小時、24小時、72小時後之血液。於異氟醚麻醉下使用採血針穿刺頰部回收血液後，利用Microtainer(註冊商標)(BD)以8000 rpm於室溫下離心分離10分鐘，藉此將血清回收。
對於血清中存在之抗體量，使用AlphaLISA人類κ輕鏈免疫分析套組(AlphaLISA Human Kappa light chain immunoassay kit)(AL3023，PerkinElmer)測定血清中之抗體濃度。利用套組內之κ輕鏈繪製校準曲線。將結果示於圖17。
如圖17所示，可知本發明之抗體組合物之動力根據CD16a結合增強胺基酸改型之不同而表現出各種動力。其中，可知具有S239D/K326T之本發明之抗體組合物表現出接近抗DNP IgG1抗體之動力。
(CH2域之Tm值之測定) 為了研究導入半聚體中之各種CD16a結合增強胺基酸改型對CH2域之熱穩定性造成之影響，而藉由示差掃描螢光定量法(Differential Scanning Fluorimetry：DSF)進行Tm值之測定。與[實施例6]同樣地製備導入有CD16a結合增強胺基酸改型之表20所示之抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體。使用NanoTemper公司製造之Prometheus NT.48，將升溫速度條件設為20～95℃、1℃/分鐘之條件而測定所製備之抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體CH2域之Tm值。
[表20]
純化抗體名稱 (CD16a結合增強胺基酸改型) 抗體之CH之結構 Tm值 (℃) 鹼基序列序列編號 胺基酸序列序列編號
抗CD4抗體之半聚體 (AAA/S239D) IgG1_AA_AAA/S239D_D265A_K409R CH 47.4 245 246
抗CD4抗體之半聚體 (S239D/I332E) IgG1_AA_S239D/I332E_D265A_K409R CH 42.5 205 206
抗CD4抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_D265A_K409R CH 56.8 247 248
抗CD4抗體之半聚體 (239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_D265A_K409R CH 66.2 271 272
抗CD70抗體之半聚體 (AAA/S239D) IgG1_AA_AAA/S239D_P329Y_K409R CH 48.5 249 250
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/I332E) IgG1_AA_S239D/I332E_P329Y_K409R CH 44.4 223 224
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH 57.0 251 252
抗CD70抗體之半聚體 (239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_P329Y_K409R CH 65.5 291 292
若將圖17所示之小鼠PK試驗之結果與表20之Tm值合併考察，則有CH2域之Tm值越高之CD16a結合增強胺基酸改型，血中半衰期越長之傾向。藉此可知，藉由測定Tm值可篩選血中半衰期良好之本發明之抗體組合物。
[實施例8]添加有免疫球蛋白之ADCC活性試驗 對於實施例1之(5)所記載之ADCC評價系統，以最終濃度成為8質量%之方式添加獻血Venoglobulin(日本血液製劑機構，#867279694)，藉此構建模擬人體內之評價系統。關於所評價之抗體組合物，示於表21中。
[表21]
純化抗體名稱 (CD16a結合增強胺基酸改型) 抗體之CH之結構 鹼基序列序列編號 胺基酸序列序列編號
抗CD4抗體之半聚體 (S239D/I332E) IgG1_AA_S239D/I332E_D265A_K409R CH 205 206
抗CD4抗體之半聚體 (S239D/K326E) IgG1_AA_S239D/K326E_D265A_K409R CH 253 254
抗CD4抗體之半聚體 (S239D/K326I) IgG1_AA_S239D/K326l_D265A_K409R CH 255 256
抗CD4抗體之半聚體 (AAA/H268E) IgG1_AA_AAA/H268E_D265A_K409R CH 257 258
抗CD4抗體之半聚體 (S298A/E333A/K334E) IgG1_AA_S298A/E333A/K334E_D265A_K409R CH 259 260
抗CD4抗體之半聚體 (AAA/S239D) IgG1_AA_AAA/S239D_D265A_K409R CH 245 246
抗CD4抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_D265A_K409R CH 247 248
抗CD4抗體之半聚體 (S239E/I332E) IgG1_AA_S239E/I332E_D265A_K409R CH 261 262
抗CD4抗體之半聚體 (S239D/I332T) IgG1_AA_S239D/I332T_D265A_K409R CH 263 264
抗CD4抗體之半聚體 (S239D/A330F) IgG1_AA_S239D/A330F_D265A_K409R CH 265 266
抗CD4抗體之半聚體 (S239D) IgG1_AA_S239D_D265A_K409R CH 267 268
抗CD4抗體之半聚體 (AAA/S239D/L309K) IgG1_AA_AAA/S239D/L309K_D265A_K409R CH 269 270
抗CD4抗體之半聚體 (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_D265A_K409R CH 271 272
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/I332E) IgG1_AA_S239D/I332E_P329Y_K409R CH 223 224
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/K326E) IgG1_AA_S239D/K326E_P329Y_K409R CH 273 274
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/K326I) IgG1_AA_S239D/K326I_P329Y_K409R CH 275 276
抗CD70抗體之半聚體 (AAA/H268E) IgG1_AA_AAA/H268E_P329Y_K409R CH 277 278
抗CD70抗體之半聚體 (S298A/E333A/K334E) IgG1_AA_S298A/E333A/K334E_P329Y_K409R CH 279 280
抗CD70抗體之半聚體 (AAA/S239D) IgG1_AA_AAA/S239D_P329Y_K409R CH 249 250
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH 251 252
抗CD70抗體之半聚體 (S239E/I332E) IgG1_AA_S239E/I332E_P329Y_K409R CH 281 282
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/I332T) IgG1_AA_S239D/I332T_P329Y_K409R CH 283 284
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/D330F) IgG1_AA_S239D/D330F_P329Y_K409R CH 285 286
抗CD70抗體之半聚體 (S239D) IgG1_AA_S239D_P329Y_K409R CH 287 288
抗CD70抗體之半聚體 (AAA/S239D/L309K) IgG1_AA_AAA/S239D/L309K_P329Y_K409R CH 289 290
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_P329Y_K409R CH 291 292
上述抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體係與[實施例6]同樣地製備。抗CD4抗體之VH及VL以及抗CD70抗體之VH及VL係使用表11所示者。
藉由與實施例5同樣之方法，對混合有抗CD4抗體之半聚體與抗CD70抗體之半聚體之抗體組合物之ADCC活性進行評價。使用抗CD4 IgG1抗體及抗CD70 IgG1抗體作為陽性對照之抗體。
如圖18A～C所示，確認到本發明之抗體組合物即便於獻血Venoglobulin存在下亦對CD4/CD70雙陽性細胞發揮特異性之ADCC活性。
[實施例9]利用人類血液重構系統之ADCC活性 使用包含接近人體內之狀態之人類血液成分的評價系統，研究是否可特異性地去除雙陽性細胞。關於評價抗體，示於表22中。
[表22]
純化抗體名稱 (CD16a結合增強胺基酸改型) 抗體之CH之結構 鹼基序列序列編號 胺基酸序列序列編號
抗CD4抗體之半聚體 (AAA/S239D) IgG1_AA_AAA/S239D_D265A_K409R CH 245 246
抗CD4抗體之半聚體 (S239D/I332E) IgG1_AA_S239D/I332E_D265A_K409R CH 205 306
抗CD4抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_D265A_K409R CH 247 248
抗CCR6抗體之半聚體 (AAA/S239D) IgG1_AA_AAA/S239D_P329Y_K409R CH 249 250
抗CCR6抗體之半聚體 (S239D/I332E) IgG1_AA_S239D/I332E_P329Y_K409R CH 223 224
抗CCR6抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH 251 252
(1)抗CD4抗體之半聚體及抗CCR6抗體之半聚體表現載體之製作 藉由與實施例5(1)同樣之方法製作載體。
(2)抗CD4 IgG1抗體及抗CCR6 IgG1抗體(KG1684)以及該等抗體之半聚體之表現 藉由與實施例5(2)同樣之方法使抗體表現。
(3)抗CD4抗體之半聚體及抗CCR6抗體之半聚體之純化 藉由與實施例5(3)同樣之方法將抗體純化。
(4)抗CD4抗體之半聚體及抗CCR6抗體之半聚體之純化度之評價 藉由與實施例5(4)同樣之方法對各抗體之純化度進行評價，結果為經純化之抗體全部於還原條件下於H鏈為約50 kDa、L鏈為約25 kDa附近發現了染色帶。又，於非還原條件下，抗CD4 IgG1抗體及抗CCR6 IgG1抗體於約150 kDa發現了染色帶，抗CD4抗體之半聚體及抗CCR6抗體之半聚體於約75 kDa附近發現了染色帶，因此確認，所製作之抗CD4 IgG1抗體及抗CCR6 IgG1抗體為包含目標之H鏈及L鏈之抗體結構，抗CD4抗體之半聚體及抗CCR6抗體之半聚體為包含目標之H鏈及L鏈、容易形成半聚體之抗體結構。
(5)混合有抗CD4抗體之半聚體及抗CCR6抗體之半聚體之抗體組合物對CD4/CCR6雙陽性細胞之ADCC活性 對於人類血液50 mL中，將20 mL用於血漿，將30 mL用於末梢血液單核細胞與粒細胞之組分回收。為了獲得血漿，利用15 mL離心管，於4℃以2000 rpm離心分離20分鐘，將上清液回收。
為了進行末梢血液單核細胞與粒細胞之組分回收，對10 mL之血液添加2 mL之Hetasep(Stemcell technology，#07806)，充分混合後，於室溫下以50×g離心分離1分鐘。於室溫下靜置直至分離為止，其後將紅血球以外之層回收，利用PBS定容為50 mL，以540×g離心分離5分鐘。
將所回收之血漿、末梢血液單核細胞及粒細胞之組分混合，製備為5×106 個細胞/mL，以5×105 個細胞/100 μL/孔接種後，添加混合有抗CD4抗體之半聚體及抗CCR6抗體之半聚體之抗體組合物20 μL、血漿80 μL，於37℃培養24小時。藉由流式細胞分析法測定相對於CD3陽性T細胞之CD4/CCR6雙陽性細胞之比率。使用實施例7中所使用之抗DNP抗體作為陰性對照。
如圖19A所示，可知本發明之抗體組合物均抗體濃度依賴性地去除CD4/CCR6雙陽性細胞，另一方面，不會去除CD4或CCR6單陽性細胞。
[實施例9-2] 使用具有不同於[實施例9]之胺基酸改型之本發明之抗體組合物，驗證是否可特異性地去除雙陽性細胞。關於評價抗體，示於表23中。
[表23]
抗體組合物名 純化抗體 (CD16a結合增強胺基酸改型) 抗體之CH之結構 鹼基序列序列編號 胺基酸序列序列編號
A 抗CD4抗體之半聚體 (S239D/S298A/E333A/L242C/K334Q IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_D265A_K409R CH 271 272
抗CCR6抗體之半聚體 (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_P329Y_K409R CH 291 292
B 抗CD4抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_S298E_K409R CH 293 294
抗CCR6抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH 251 252
C 抗CD4抗體之半聚體 (AAA/S239D) IgG1_AA_AAA/S239D_S298E_K409R CH 295 296
抗CCR6抗體之半聚體 (AAA/S239D) IgG1_AA_AAA/S239D_P329Y_K409R CH 249 250
D 抗CD4抗體之半聚體 (S239D/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/E333A/L242C/K334C_S298E_K409R CH 297 298
抗CCR6抗體之半聚體 (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_P329Y_K409R CH 291 292
以與[實施例9]同樣之方式實施評價抗體之製備及評價。 如圖19B所示，可知本發明之抗體組合物均抗體濃度依賴性地去除CD4/CCR6雙陽性細胞，另一方面，不會去除CD4或CCR6單陽性細胞。
[實施例10]替換第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之抗原結合域時之ADCC活性 驗證替換第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之抗原結合域時對ADCC活性造成之影響。將評價抗體示於表24。
[表24]
純化抗體名稱 (CD16a結合增強胺基酸改型) 抗體之CH之結構 鹼基序列序列編號 胺基酸序列序列編號
抗CD4抗體之半聚體A (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_D265A_K409R CH 247 248
抗CCR4抗體之半聚體A (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH 251 252
抗CD4抗體之半聚體B (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH 251 252
抗CCR4抗體之半聚體B (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_D265A_K409R CH 247 248
抗CD4抗體之半聚體C (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_D265A_K409R CH 271 272
抗CCR4抗體之半聚體C (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_P329Y_K409R CH 291 292
抗CD4抗體之半聚體D (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_P329Y_K409R CH 291 292
抗CCR4體之半聚體D (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_D265A_K409R CH 271 272
上述抗CD4抗體之半聚體及抗CCR4抗體之半聚體、以及作為陽性對照之抗CD4 IgG1抗體及抗CCR4 IgG1抗體係與[實施例5]及[實施例6]同樣地製備。抗CD4抗體之VH及VL使用表11所示者，抗CCR4抗體之VH及VL使用表14所示者。
分別將抗CD4抗體與抗CCR4抗體之半聚體A～D以濃度成為1.0 μg/mL之方式等量混合，而製備抗體溶液。對於各抗體溶液，對於CD4/CCR4雙陽性細胞(TL-Om1)、CCR4單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL4)測定ADCC活性，將所獲得之結果示於圖20。
如圖20所示，確認到混合有半聚體A～D之任一抗體組合物均對CD4/CCR4雙陽性細胞發揮特異性之ADCC活性。即，表明於替換第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之抗原結合域時亦發揮特異性之ADCC活性。
[實施例10-2] 使用具有不同於[實施例10]之胺基酸改型之本發明之抗體組合物，驗證替換第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之抗原結合域時對ADCC活性造成之影響。將評價抗體示於表25。
[表25]
純化抗體名稱 (CD16a結合增強胺基酸改型) 抗體之CH之結構 鹼基序列序列編號 胺基酸序列序列編號
抗CD4抗體之半聚體E (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_S298E_K409R CH 293 294
抗CCR4抗體之半聚體E (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH 251 252
抗CD4抗體之半聚體F (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH 251 252
抗CCR4抗體之半聚體F (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_S298E_K409R CH 293 294
抗CD4抗體之半聚體G (S239D/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/E333A/L242C/K334C_S298E_K409R CH 297 298
抗CCR4抗體之半聚體G (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_P329Y_K409R CH 291 292
抗CD4抗體之半聚體H (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_P329Y_K409R CH 291 292
抗CCR4抗體之半聚體H (S239D/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/E333A/L242C/K334C_S298E_K409R CH 297 298
上述抗CD4抗體之半聚體及抗CCR4抗體之半聚體、以及作為陽性對照之抗CD4 IgG1抗體及抗CCR4 IgG1抗體係與[實施例5]及[實施例6]同樣地製備。抗CD4抗體之VH及VL使用表11所示者，抗CCR4抗體之VH及VL使用表14所示者。
分別將抗CD4抗體與抗CCR4抗體之半聚體E～F以濃度成為0.1 μg/mL之方式等量混合，製備抗體溶液。對於各抗體溶液，測定其等對CD4/CCR4雙陽性細胞(HH)、CCR4單陽性細胞(L428)、CD4單陽性細胞(TALL1)之ADCC活性，將結果示於圖21。
如圖21所示，確認到混合有半聚體A～D之任一抗體組合物均對CD4/CCR4雙陽性細胞發揮特異性之ADCC活性。即，表明於替換第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之抗原結合域時，亦發揮特異性之ADCC活性。
[實施例11] 驗證本發明之抗體組合物於其他抗原之組合(CCR4及CD70)中是否亦僅對雙陽性細胞特異性地發揮ADCC活性。將評價抗體示於表26。
[表26]
抗體組合物名 純化抗體 (CD16a結合增強胺基酸改型) 抗體之CH之結構 鹼基序列 序列編號 胺基酸序列 序列編號
E 抗CCR4抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_D265A_K409R CH 247 248
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH 251 252
F 抗CCR4抗體之半聚體 (S239D/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_D265A_K409R CH 271 272
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_P329Y_K409R CH 291 292
G 抗CCR4抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_S298E_K409R CH 293 294
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/K326T) IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH 251 252
H 抗CCR4抗體之半聚體 (S239D/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/E333A/L242C/K334C_S298E_K409R CH 297 298
抗CD70抗體之半聚體 (S239D/S298A/E333A/L242C/K334C) IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_P329Y_K409R CH 291 292
上述抗CCR4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體、以及作為陽性對照之抗CCR4 IgG1抗體及抗CD70 IgG1抗體係與[實施例5]及[實施例6]同樣地製備。抗CCR4抗體之VH及VL之鹼基序列及胺基酸序列使用表14所示者，抗CD70抗體之VH及VL之鹼基序列及胺基酸序列使用表11所示者。
分別將抗CCR4抗體與抗CD70抗體之半聚體A～D以濃度成為0.1 μg/mL之方式等量混合，製備抗體溶液。對於各抗體溶液，測定其等對於CCR4/CD70雙陽性細胞(L428)、CCR4單陽性細胞(PEER)、CD70單陽性細胞(SUP-M2)之ADCC活性，將結果示於圖22。
如圖22所示，確認到混合有半聚體A～D之任一抗體組合物對CCR4/CD70雙陽性細胞均發揮特異性之ADCC活性。
[實施例12]CD16a結合分析 驗證僅於其為作為本發明之第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之抗體組合物時才與CD16a結合。 評價抗體使用以下者。 ・[實施例7]所記載之抗DNP抗體之半聚體3(265A) ・[實施例7]所記載之抗DNP抗體之半聚體6(329Y) ・[實施例7]所記載之混合有抗DNP抗體之半聚體3及6之抗體組合物(265A＋329Y) ・[實施例7]所記載之抗DNP抗體(陽性對照) 測定使用BIAcore(BIACORE公司製造)，測定方法係藉由依據J. Immunol. Methods, 200, 121 (1997)之記載的以下方法進行。
使用BIAcore T100(BIACORE公司製造)進行各評價抗體與CD16a之相互作用分析。電泳緩衝液係將HBS-EP＋10X (GE Healthcare)稀釋為10分之1而使用，測定溫度設為25℃。使用利用人類Fab捕捉套組(Human Fab Capture Kit)(GE Healthcare)固定於S系列感測器晶片(Series S Sensor Chip)CM5(GE Healthcare)之晶片。
由該感測器晶片捕捉目標之評價抗體，使經電泳緩衝液稀釋之CD16a相互作用而進行測定。又，使人類Fab捕捉套組(GE Healthcare)附帶之緩衝液進行反應，藉此將由感測器晶片捕捉之評價抗體洗淨，使感測器晶片再生而重複使用。於圖23中示出測定結果。
如圖23所示，於單獨之抗DNP抗體之半聚體3(265A)及單獨之抗DNP抗體之半聚體6(329Y)時未確認到對CD16a之結合活性，僅於抗DNP抗體之半聚體3(265A)與抗DNP抗體之半聚體6(329Y)之抗體組合物時確認到對CD16a之結合活性。
已使用特定之態樣對本發明詳細地進行了說明，但對於業者而言，應清楚能夠在不脫離本發明之意圖與範圍之情況下進行各種變更及變化。再者，本申請案係基於2020年4月1日提出申請之日本專利申請案(日本專利特願2020-066313)及2020年10月29日提出申請之日本專利申請案(日本專利特願2020-181493)主張優先權，且藉由引用將其整體援用於本文中。 [序列表非關鍵文字]
序列編號1：人類CCR6(KG1684)VL之鹼基序列 序列編號2：人類CCR6(KG1684)VL之胺基酸序列 序列編號3：人類CCR6(KG1684)VH之鹼基序列 序列編號4：人類CCR6(KG1684)VH之胺基酸序列 序列編號5：人類IgG1 CK之鹼基序列 序列編號6：人類IgG1 CK之胺基酸序列 序列編號7：人類IgG1 CH之鹼基序列 序列編號8：人類IgG1 CH之胺基酸序列 序列編號9：人類IgG1_P238A CH之鹼基序列 序列編號10：人類IgG1_P238A CH之胺基酸序列 序列編號11：人類IgG1_D265A CH之鹼基序列 序列編號12：人類IgG1_D265A CH之胺基酸序列 序列編號13：人類IgG1_S267L CH之鹼基序列 序列編號14：人類IgG1_S267L CH之胺基酸序列 序列編號15：人類IgG1_P238A/D265A CH之鹼基序列 序列編號16：人類IgG1_P238A/D265A CH之胺基酸序列 序列編號17：人類IgG1_P238A/S267L CH之鹼基序列 序列編號18：人類IgG1_P238A/S267L CH之胺基酸序列 序列編號19：人類IgG1_D265A/S267L CH之鹼基序列 序列編號20：人類IgG1_D265A/S267L CH之胺基酸序列 序列編號21：人類IgG1_P238A/D265A/S267L CH之鹼基序列 序列編號22：人類IgG1_P238A/D265A/S267L CH之胺基酸序列 序列編號23：人類IgG1_K326W CH之鹼基序列 序列編號24：人類IgG1_K326W CH之胺基酸序列 序列編號25：人類IgG1_L328V CH之鹼基序列 序列編號26：人類IgG1_L328V CH之胺基酸序列 序列編號27：人類IgG1_P329Y CH之鹼基序列 序列編號28：人類IgG1_P329Y CH之胺基酸序列 序列編號29：人類IgG1_K326W/L328V CH之鹼基序列 序列編號30：人類IgG1_K326W/L328V CH之胺基酸序列 序列編號31：人類IgG1_K326W/P329Y CH之鹼基序列 序列編號32：人類IgG1_K326W/P329Y CH之胺基酸序列 序列編號33：人類IgG1_L328V/P329Y CH之鹼基序列 序列編號34：人類IgG1_L328V/P329Y CH之胺基酸序列 序列編號35：人類IgG1_K326W/L328V/P329Y CH之鹼基序列 序列編號36：人類IgG1_K326W/L328V/P329Y CH之胺基酸序列 序列編號37：人類IgG1114_AA_AAA_D265A CH之鹼基序列 序列編號38：人類IgG1114_AA_AAA_D265A CH之胺基酸序列 序列編號39：人類IgG1114_AA_AAA_P329Y CH之鹼基序列 序列編號40：人類IgG1114_AA_AAA_P329Y CH之胺基酸序列 序列編號41：人類CD4(艾巴利珠單抗)VL之鹼基序列 序列編號42：人類CD4(艾巴利珠單抗)VL之胺基酸序列 序列編號43：人類CD4(艾巴利珠單抗)VH之鹼基序列 序列編號44：人類CD4(艾巴利珠單抗)VH之胺基酸序列 序列編號45：人類CD70(2H5)VL之鹼基序列 序列編號46：人類CD70(2H5)VL之胺基酸序列 序列編號47：人類CD70(2H5)VH之鹼基序列 序列編號48：人類CD70(2H5)VH之胺基酸序列 序列編號49：人類IgG1114_AA_AAA_S239R CH之鹼基序列 序列編號50：人類IgG1114_AA_AAA_S239R CH之胺基酸序列 序列編號51：人類IgG1114_AA_AAA_D265N CH之鹼基序列 序列編號52：人類IgG1114_AA_AAA_D265N CH之胺基酸序列 序列編號53：人類IgG1114_AA_AAA_D265E CH之鹼基序列 序列編號54：人類IgG1114_AA_AAA_D265E CH之胺基酸序列 序列編號55：人類IgG1114_AA_AAA_S267K CH之鹼基序列 序列編號56：人類IgG1114_AA_AAA_S267K CH之胺基酸序列 序列編號57：人類IgG1114_AA_AAA_E269P CH之鹼基序列 序列編號58：人類IgG1114_AA_AAA_E269P CH之胺基酸序列 序列編號59：人類IgG1114_AA_AAA_Y296P CH之鹼基序列 序列編號60：人類IgG1114_AA_AAA_Y296P CH之胺基酸序列 序列編號61：人類IgG1114_AA_AAA_S298E CH之鹼基序列 序列編號62：人類IgG1114_AA_AAA_S298E CH之胺基酸序列 序列編號63：人類IgG1114_AA_AAA_T299A CH之鹼基序列 序列編號64：人類IgG1114_AA_AAA_T299A CH之胺基酸序列 序列編號65：人類IgG1114_AA_AAA_L235R CH之鹼基序列 序列編號66：人類IgG1114_AA_AAA_L235R CH之胺基酸序列 序列編號67：人類IgG1114_AA_AAA_A327I CH之鹼基序列 序列編號68：人類IgG1114_AA_AAA_A327I CH之胺基酸序列 序列編號69：人類IgG1114_AA_AAA_K326G CH之鹼基序列 序列編號70：人類IgG1114_AA_AAA_K326G CH之胺基酸序列 序列編號71：人類IgG1114_AA_AAA_L328R CH之鹼基序列 序列編號72：人類IgG1114_AA_AAA_L328R CH之胺基酸序列 序列編號73：人類IgG1114_AA_AAA_P329K CH之鹼基序列 序列編號74：人類IgG1114_AA_AAA_P329K CH之胺基酸序列 序列編號75：人類IgG1114_AA_AAA_P329W CH之鹼基序列 序列編號76：人類IgG1114_AA_AAA_P329W CH之胺基酸序列 序列編號77：人類IgG1114_AA_AAA_A330P CH之鹼基序列 序列編號78：人類IgG1114_AA_AAA_A330P CH之胺基酸序列 序列編號79～82：實施例5中所使用之抗CCR4抗體之鹼基序列或胺基酸序列 序列編號83～204：實施例5中所使用之導入有CD16a結合增強胺基酸改型之抗CCR4抗體之鹼基序列或胺基酸序列 序列編號205～222：實施例6中所使用之導入有使IgG1之CH3域彼此之相互作用減弱之胺基酸改型的抗CD4抗體之半聚體之鹼基序列或胺基酸序列 序列編號223～240：實施例6中所使用之導入有使IgG1之CH3域彼此之相互作用減弱之胺基酸改型的抗CD70抗體之半聚體之鹼基序列或胺基酸序列 序列編號241～252：實施例7、實施例9、實施例10、實施例11、實施例12中所使用之抗DNP抗體之VH及VL、以及抗DNP抗體之半聚體1～6之鹼基序列及胺基酸序列 序列編號253～292：實施例8、實施例9-2、實施例11中所使用之導入有CD16a結合增強胺基酸改型之抗CD4抗體之半聚體或抗CD70抗體之半聚體之鹼基序列或胺基酸序列 序列編號293～298：實施例9-2、實施例10-2、實施例11中所使用之導入有CD16a結合增強胺基酸改型之抗CD4抗體之半聚體或抗CCR4抗體之半聚體之半聚體之鹼基序列或胺基酸序列
圖1係表示抗體、VHH-Fc及scFv-Fc之結構之模式圖。 圖2A表示通常之雙特異性抗體之結構之模式圖。 圖2B表示通常之雙特異性抗體之結合形式之模式圖。 圖3表示本發明之抗體組合物之結合形式之一態樣之模式圖。 圖4表示本發明之抗體組合物之結構之一態樣之模式圖。 圖5表示通常之人類IgG與CD16a之結合形式之模式圖。 圖6表示本發明之抗體組合物與CD16a之結合形式之模式圖。 圖7係表示通常之人類IgG1之型式(format)上的胺基酸改型之候選部位之模式圖。 圖8係表示CD16a結合區已被「破壞」之人類IgG1抗CCR6抗體之ADCC活性之圖。 圖9係用以僅對CH2-A與CH2-B分別非對稱地導入上述改型而對ADCC活性進行評價之一價抗體之模式圖。 圖10係表示CD16a結合非對稱改型一價抗體之ADCC活性之圖。 圖11係實施例3中所使用之IgG1114_AA_AAA_D265A(/P329Y)型之IgG半聚體之模式圖。 圖12係對抗CD4抗體之半聚體及抗CD70抗體之半聚體之利用SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)獲得之純化度進行評價之結果。 圖13係對CD4單陽性細胞、CD70單陽性細胞、CD4/CD70雙陽性細胞中之CD4及CD70之抗原表現進行測定所獲得之結果。 圖14係表示抗CD4 IgG1及抗CD70 IgG1及半聚體對於CD4單陽性細胞、CD70單陽性細胞、CD4/CD70雙陽性細胞之ADCC活性的圖。 圖15A係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體時之ADCC活性的圖。 圖15B係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體時之ADCC活性的圖。 圖15C係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體時之ADCC活性的圖。 圖15D係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體時之ADCC活性的圖。 圖15E係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體時之ADCC活性的圖。 圖15F係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體時之ADCC活性的圖。 圖15G係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體時之ADCC活性的圖。 圖15H係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體、抗CD4 IgG1或抗CD70 IgG1時之ADCC活性的圖。 圖16A係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體時之ADCC活性的圖。各圖上示出對各自所添加之半聚體之CH3域導入之胺基酸改型名。 圖16B係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體、抗CD4 IgG1或抗CD70 IgG1時之ADCC活性的圖。各圖上示出各自所添加之抗體之簡稱(半聚體中示出導入至CH3域中之胺基酸改型名)。 圖17係表示將抗DNP抗體(野生型)或各半聚體之混合物1 mg/kg投予至小鼠時之血清中抗體濃度變化之圖。 圖18A係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體時之免疫球蛋白添加系統中的ADCC活性之圖。各圖上示出CD16a結合增強胺基酸改型名作為各自所添加之半聚體之簡稱。 圖18B係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體時之免疫球蛋白添加系統中的ADCC活性之圖。各圖上示出CD16a結合增強胺基酸改型名作為各自所添加之半聚體之簡稱。 圖18C係表示針對CD4/CD70雙陽性細胞(TL-Om1)、CD70單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加半聚體、抗CD4 IgG1或抗CD70 IgG1時之免疫球蛋白添加系統中的ADCC活性之圖。各圖上示出各自所添加之抗體之簡稱(半聚體中示出CD16a結合增強胺基酸改型名)。 圖19A係表示人類血液重構系統中之各半聚體之ADCC活性(細胞存活率)之圖。橫軸表示所添加之抗體之濃度(半聚體中表示混合物之合計濃度)，縱軸表示不添加抗體時之全部CD3陽性T細胞或全部淋巴細胞中之各靶細胞(記載於圖上部)之存在比率(%)。 圖19B係表示人類血液重構系統中之各半聚體之ADCC活性(細胞存活率)之圖。橫軸表示所添加之抗體之濃度(半聚體中表示混合物之合計濃度)，縱軸表示不添加抗體時之全部CD3陽性T細胞或全部淋巴細胞中之各靶細胞(記載於圖上部)之存在比率(%)。 圖20係表示針對CD4/CCR4雙陽性細胞(TL-Om1)、CCR4單陽性細胞(MT-1)、CD4單陽性細胞(CD4/EL-4)添加各半聚體、抗CD4 IgG1或抗CCR4 IgG1時之ADCC活性的圖。 圖21係表示針對CD4/CCR4雙陽性細胞(HH)、CCR4單陽性細胞(L428)、CD4單陽性細胞(TALL1)添加各半聚體、抗CD4 IgG1或抗CCR4 IgG1時之ADCC活性的圖。 圖22係表示針對CCR4/CD70雙陽性細胞(L428)、CCR4單陽性細胞(PEER)、CD70單陽性細胞(SUP-M2)添加各半聚體、抗CCR4 IgG1或抗CD70 IgG1時之ADCC活性的圖。 圖23係表示各半聚體、抗DNP抗體對CD16a之結合活性之圖。
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Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (17)

  1. 一種抗體組合物，其係包含第一IgG半聚體與第二IgG半聚體之針對互不相同之第一抗原及第二抗原者，其為以下之(1A)～(6A)： (1A)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含1個免疫球蛋白輕鏈(以下簡記為L鏈)及1個免疫球蛋白重鏈(以下簡記為H鏈)，上述H鏈包含H鏈可變區、鉸鏈域、CH1域、CH2域及CH3域，於上述CH2域中具有互不相同之第一Fcγ受體IIIA(以下稱為CD16a)結合區及第二CD16a結合區； (2A)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換； (3A)上述第一IgG半聚體包含結合於上述第一抗原之抗原結合域，且於上述第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換； (4A)上述第二IgG半聚體包含結合於上述第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換； (5A)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a) S239D及K326T之胺基酸殘基置換，或 上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(b) S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換； (6A)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體中之至少一者包含CH3域中之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之上述CH3域間相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。
  2. 如請求項1之抗體組合物，其中與針對僅表現上述第一抗原之靶細胞與僅表現上述第二抗原之靶細胞之效應子功能相比，對共同表現上述第一抗原及上述第二抗原之靶細胞特異性地發揮效應子功能而進行毒殺。
  3. 如請求項1或2之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含選自EU索引所表示之Y349A、L351A、T366A、L368A、D399A、F405A、Y407A、K409A及K409R中之至少1個之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之CH3域間相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。
  4. 如請求項3之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之K409R之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之CH3域間之相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含上述(a)S239D及K326T之胺基酸殘基置換。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體之H鏈恆定區(以下簡記為CH)包含序列編號248所表示之胺基酸序列， 上述第二IgG半聚體之CH包含序列編號252所表示之胺基酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體中之結合於Fc區之全部N-糖苷鍵結型糖鏈中，於糖鏈還原末端之N-乙醯葡糖胺上未結合岩藻糖之糖鏈之比率為20%以上。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體組合物，其中上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體之免疫球蛋白亞型為IgG1。
  9. 一種第一IgG半聚體，其係以與第二IgG半聚體締合為特徵者，且上述第一IgG半聚體及第二IgG半聚體為以下之(1B)～(7B)： (1B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體形成針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物； (2B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含1個L鏈及1個H鏈，上述H鏈包含H鏈可變區、鉸鏈域、CH1域、CH2域及CH3域，於上述CH2域中具有互不相同之第一CD16a結合區及第二CD16a結合區： (3B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換； (4B)上述第一IgG半聚體包含結合於上述第一抗原之抗原結合域，且於上述第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換； (5B)上述第二IgG半聚體包含結合於上述第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換； (6B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a) S239D及K326T之胺基酸殘基置換，或 上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(b) S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換； (7B)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體中之至少一者包含CH3域中之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之上述CH3域間相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。
  10. 一種第二IgG半聚體，其係以與第一IgG半聚體締合為特徵者，且上述第一IgG半聚體及第二IgG半聚體為以下之(1C)～(7C)： (1C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體形成針對互不相同之第一抗原及第二抗原之抗體組合物； (2C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含1個L鏈及1個H鏈，上述H鏈包含H鏈可變區、鉸鏈域、CH1域、CH2域及CH3域，於上述CH2域中具有互不相同之第一CD16a結合區及第二CD16a結合區； (3C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之C226A及C229A之胺基酸殘基置換； (4C)上述第一IgG半聚體包含結合於上述第一抗原之抗原結合域，且於上述第一CD16a結合區中包含EU索引所表示之D265A之胺基酸殘基置換； (5C)上述第二IgG半聚體包含結合於上述第二抗原之抗原結合域，且於上述第二CD16a結合區中包含EU索引所表示之P329Y之胺基酸殘基置換； (6C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(a) S239D及K326T之胺基酸殘基置換，或 上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體分別包含EU索引所表示之(b) S239D、S298A、E333A、L242C及K334C之胺基酸殘基置換； (7C)上述第一IgG半聚體及上述第二IgG半聚體中之至少一者包含CH3域中之胺基酸殘基置換作為相較於IgG1亞型之上述CH3域間相互作用而更使CH3域間相互作用減弱之改型。
  11. 一種DNA，其編碼以下之a)或b)之胺基酸序列： a)如請求項9之第一IgG半聚體之胺基酸序列； b)如請求項10之第二IgG半聚體之胺基酸序列。
  12. 一種重組載體，其包含如請求項11之編碼a)之胺基酸序列之DNA及編碼b)之胺基酸序列之DNA之至少一者。
  13. 一種轉形體，其導入有如請求項12之重組載體。
  14. 一種套組，其包含如請求項9之第一IgG半聚體及如請求項10之第二IgG半聚體。
  15. 一種特異性地誘發效應子功能之方法，其係使用如請求項1至8中任一項之抗體組合物者，其與針對僅表現上述第一抗原之靶細胞與僅表現上述第二抗原之靶細胞之效應子功能相比，對共同表現上述第一抗原及上述第二抗原之靶細胞特異性地誘發效應子功能。
  16. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗體組合物。
  17. 如請求項16之醫藥組合物，其係用於癌症、自體免疫疾病或過敏疾病之治療。
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