KR20220161337A - 항체 조성물 - Google Patents

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KR20220161337A
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린페이 니와
가츠아키 우사미
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쿄와 기린 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 서로 다른 2종의 항원을 공발현하는 표적 세포에 대하여 보다 특이적으로 이펙터 기능을 발휘해서 상해함과 함께, 개개의 표적 항원에 대한 친화성을 충분히 높게 유지할 수 있는 항체 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 포함하는, 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물 및 항체 조성물을 구성하는 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체에 관한 것이다.

Description

항체 조성물
본 발명은, 항체 조성물 및 그 제조 방법, IgG 반량체 그리고 해당 IgG 반량체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
지금까지 승인된 항체 의약은 다양한 작용 메커니즘을 갖는 것으로 알려진다(비특허문헌 1). 그 대표적인 것으로서는, 증식 인자 등의 리간드와 수용체의 결합을 저해하는 중화 활성, 결합한 수용체를 활성화하는 아고니스트 활성, 그리고 항체 의존성 세포 상해(antibody-dependent cellular cytotoxicity: 이하, ADCC) 활성 및 보체 의존성 세포 상해(complement-dependent cytotoxicity: 이하, CDC) 활성 등, IgG 클래스의 항체 분자가 갖는 이펙터 기능 등이 있다. 이들 중에서도, 리툭시맙(rituximab), 트라스투주맙(trastuzumab)의 임상 시험의 바이오마커 해석으로부터, ADCC 활성은 항체 의약의 임상에 있어서의 중요한 작용 메커니즘인 것이 시사되어 있다(비특허문헌 2, 3).
항체는 2분자의 이뮤노글로불린 중쇄(H쇄) 및 2분자의 이뮤노글로불린 경쇄(L쇄), 합계 4분자의 폴리펩티드쇄를 포함하는 약 150KDa의 4량체 단백질이다. 도 1에 도시하는 바와 같이, 항체는, 항원 결합에 직접 관여해서 항체 클론마다 아미노산 서열이 다른 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역(V)과, 상술한 이펙터 기능이나 혈중 반감기의 제어를 담당하는 Fc 영역(이하, Fc라고도 약기함)을 포함하는 정상 영역으로 나눌 수 있다. Fc는 CH1 내지 CH3 도메인 및 힌지 도메인을 포함한다.
인간 항체는, H쇄 정상 영역의 배열에 따라 기능이 다른 IgG, IgA, IgM, IgD, IgE의 5개의 클래스로 분류된다. 또한 인간 IgG 클래스는 IgG1부터 IgG4까지의 4종의 서브클래스로 나뉜다.
그 중에서도 IgG1 서브클래스의 항체가 가장 높은 ADCC 활성, CDC 활성을 갖는 것이 알려져 있으며(비특허문헌 4), 리툭시맙, 트라스투주맙를 포함하는 많은 항체 의약이 IgG1이다.
한편 IgG4 서브클래스는 다른 서브클래스와 비교해서 이펙터 기능이 약하고, 또한 고유의 힌지 영역의 아미노산 서열을 갖는 것이나, 2개의 CH3 도메인간의 상호 작용이 다른 서브클래스와 비교해서 약한 것에 의한, 「Fab arm exchange」라고 불리는, 체내에서 2개의 H쇄의 가역적인 결합·괴리가 일어나는 것 등의 특징이 알려져 있다(비특허문헌 5, 6).
ADCC 활성은, 암 세포 표면의 막 항원에 결합한 IgG형 항체의 Fc를, 내츄럴 킬러 세포(이하, NK 세포) 등이 Fc 수용체의 일종 FcγRIIIA(이하, CD16a라고도 약기함)를 통해서 인식해서 활성화되고, 그 결과 퍼포린이나 그란자임, Fas와 같은 분자의 발현을 통해서 일어나는, 세포 상해의 메커니즘이다(비특허문헌 1).
X선 결정 구조 해석에 의해, CD16a와 인간 IgG1의 결합 양식은 명확해져 있다(비특허문헌 7, 8). IgG1의 Fc 상에서의 CD16a 결합 영역은, Fc의 구조의 점대칭성으로 인해 2군데 존재하며, 실제로는 Fc와 IgG는 1:1의 수비(stoichiometry)로 결합한다. 그리고 Fc를 구성하는 2개의 CH2 도메인에서는, 각각 다른 영역(이하, CD16a 결합 영역)에서 접하고 있다.
구체적으로는, CD16a는, IgG1의 한쪽의 CH2 도메인 상에서의 L235, G236, G237, P238, S239, D265, V266, S267, H268, E269, E294, Q295, Y296, N297, S298, T299, R301, N325, A327, I332 등과 상호 작용한다. 한편, CD16a는, 동시에 IgG1의 다른 한쪽의 CH2 도메인 상에서의 L235, G236, G237, K326, A327, L328, P329, A330 등에 상호 작용한다(번호는 EU 넘버링에 의한 CH2 도메인 상의 아미노산의 위치를 나타냄)(비특허문헌 7, 8, 9, 10).
항체 의약의 CH2 도메인을 인공적으로 개변하여, CD16a와의 결합능을 상승시킴으로써 ADCC 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 실제로 CH2 도메인의 아미노산의 개변에 의한 ADCC 활성의 증강 예는 수많이 알려진다(비특허문헌 11). IgG1의 한쪽의 H쇄의 CH2 도메인과 다른 한쪽의 H쇄의 CH2 도메인에 다른 아미노산 개변을 가하고, 또한 2개의 H쇄가 디술피드 결합에 의해 결합하고 있는 IgG1 항체가, 높은 ADCC 활성을 갖는 것이 알려져 있다(특허문헌 1).
또한, Fc에 결합하는 N-결합형 복합형 당쇄의 당쇄를 개변함으로써 ADCC 활성을 증강할 수 있는 것도 알려져 있다(비특허문헌 12). 특히 당쇄 개변에 의한 ADCC 활성의 증강 기술은, 모가물리주맙(mogamulizumab)(비특허문헌 13), 오비누투주맙(obinutuzumab)(비특허문헌 14)와 같은 승인 완료된 항체 의약에 응용되고 있다.
이중특이성 항체란, 천연 항체와는 달리, 2종류의 다른 종류의 항원에 결합하는 것을 가능하게 한 인공적인 개변 항체 분자이며, 수많은 분자형이 보고되어 있다(비특허문헌 15).
도 2a에 이중특이성 항체의 구조의 모식도를 나타낸다. 이중특이성 항체의 의약에의 응용으로서, 예를 들어 암 세포와 T 세포 표면의 CD3에 결합하여(이하, CD3 이중특이성 항체), 양자를 가교함으로 인한 암 세포의 상해, 2종의 기능 분자의 중화에 의한 약효의 증강을 들 수 있다(비특허문헌 15).
암이나 자기면역 질환의 치료에 있어서, 병인 세포인 암 세포나 자기 반응성 림프구를 제거하기 위해서, IgG형 항체의 이펙터 기능이나 CD3 이중특이성 항체의 T 세포 리크루트 기능을 발휘하는 항체 의약이 사용되고 있다.
그러나, 이러한 병인 세포는 원래 정상 세포 유래이며, 일반적으로는 단일한 표면 마커 분자로는 정확하게 정상 세포와 구별할 수 있는 경우는 드물다. 따라서 이펙터 기능 등을 이용한 병인 세포의 제거는, 많은 경우, 동일한 항원 분자를 발현하는 정상 세포도 공격해서 부작용으로 이어질 우려가 있다.
예를 들어, 림프종이나 다양한 자기면역 질환의 치료에 사용되는 리툭시맙의 표적 항원인 CD20은 정상 B 세포에, 유방암 치료에 사용되는 트라스투주맙의 표적 항원인 HER2는 심근 세포에 각각 발현한다. 따라서, 이러한 항체 의약에 의해 정상 세포가 파괴됨으로 인한 부작용이 염려된다.
한편, Mazor 등은 개개의 표적 항원에 대한 친화성을 약화시킨 이중특이성 항체가, 양쪽 양성 세포에 대하여 상대적으로 강한 이펙터 기능을 발휘하는 예를 보고하였다(비특허문헌 16).
또한, 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 영역과, 제1 CH2 및 제1 CH3의 어느 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 제1 폴리펩티드를 갖는 제1 항원 결합 분자, 그리고 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 영역과, 제2 CH2 및 제2 CH3의 어느 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 제2 항원 결합 분자를 함유하고, 상기 제1 항원 결합 분자 및 상기 제2 항원 결합 분자가, 공유 결합에 의해 결합하고 있지 않고, 그리고, 액 중에서 혼합한 경우에 호모 2량체보다도 헤테로 2량체를 형성하기 쉬운, 항원 결합 분자의 조합에 관한 보고가 있다(특허문헌 2).
특허문헌 1: 국제 공개 제2013/002362호 특허문헌 2: 국제 공개 제2018/155611호
비특허문헌 1: Carter P. Nat Rev Cancer 2001; 1: 118-29 비특허문헌 2: Cartron G, Dacheux L, Salles G, et al. Blood 2002; 99: 754-8 비특허문헌 3: Weng WK, Levy R. J Clin Oncol 2003; 21: 3940-7 비특허문헌 4: Birch, J.R., Lennox, E.S.(Eds.), Monoclonal Antibodies: Principles and Applications. Wiley-Liss, Inc., New York, p.45.(1995) 비특허문헌 5: Aa1berse RC and Schuurman J, Immunology 2002; 105: 9-19 비특허문헌 6: Labrijn AF, Nat Biotechnol 2009; 27: 767-71 비특허문헌 7: Sondermann P, Nature 2000; 406: 267-73 비특허문헌 8: Radaev S, J Biol Chem 2001; 276: 16469-77 비특허문헌 9: Ferrara C, Proc Natl Acad Sci 2011; 108; 12669-74 비특허문헌 10: Mizushima T, Genes Cells 2011; 16: 1071-80 비특허문헌 11: Strohl WR, Curr Opin Biotechnol 2009; 20: 685-91 비특허문헌 12: Niwa R, J Pharm Sci 2015; 930-41 비특허문헌 13: Beck A, mAbs 2012; 4: 419-25 비특허문헌 14: Goede V, N Engl J Med 2014; 370: 1101-10 비특허문헌 15: Byrne H, Trends Biotechnol 2013; 31: 621-32 비특허문헌 16: Mazor Y, MAbs 2015; 7: 377-89
상기한 부작용의 해결법의 하나로서는, 보다 선택성이 높은 병인 세포의 제거를 위하여, 2종류의 다른 항원을 인식하고 비로소 이펙터 기능을 발휘하는, 이중특이성 항체에 의한 기술을 생각할 수 있다.
그러나, 도 2b에 도시하는 바와 같이, 통상의 이중특이성 항체에 의한 이펙터 기능을 사용해서 표적 세포를 공격할 경우, 2종의 항원을 공발현하는 표적 세포(이하, 양쪽 양성 세포라고도 약기함)뿐만 아니라, 1종류의 표적 항원만을 발현하는 세포(이하, 단일 양성 세포라고도 약기함)에 대하여도 이중특이성 항체가 결합해서 공격할 우려가 있다. 또한, 개개의 표적 항원에 대한 친화성에 관계없이, 양쪽 양성 세포에 대하여 특이적으로 이펙터 기능을 발휘해서 상해하는 항체 기술은 알려져 있지 않다.
따라서, 본 발명자들은, 서로 다른 2종의 항원을 공발현하는 표적 세포에 대하여 보다 특이적으로 이펙터 기능을 발휘해서 상해하는 항체 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 항체 분자의 정상 영역에 있어서, 도 3에 도시한 바와 같이, 통상의 인간 IgG1 항체와 다른 이하에 나타내는 [1] 내지 [3]의 요소를 갖는 항체 조성물에 의해, 상기 과제를 해결할 수 있음을 착상했다.
[1] 서로 다른 제1 항원(항원 분자 X) 및 제2 항원(항원 분자 Y)에 대한 항원 결합 부위를 갖는 항체의 반량체(제1 및 제2 IgG 반량체)의 혼합물일 것. 즉, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 사이에서, H쇄간의 디술피드 결합에 의한 공유 결합이 존재하지 않는 「HL체」의 혼합물일 것.
[2] 항원 분자 X, Y에 대한 각각의 HL체가, 항원 분자 X, Y의 양쪽을 발현하는 표적 세포(X/Y 양쪽 양성 세포)의 표면에 결합한 후에 회합해서 통상의 IgG와 마찬가지의 H2L2체를 형성하여, CD16a 결합 영역을 구성하고, 항체의 활성을 야기할 것.
[3] 단일한 항원 분자만을 발현하는 세포에 대해서는 항체의 활성을 야기하지 않도록, 항원 분자 X 또는 Y에 대한 HL체끼리가 세포 표면에서 회합해서 호모 회합체를 형성해도, CD16a 결합 영역을 구성하지 않을 것.
상기 착상에 기초하여, 본 발명자들은, 하기 (1) 내지 (3)에 대해서 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
(1) 상기 [1]에 대해서는, 도 4에 도시하는 바와 같이, IgG 반량체의 힌지 도메인에서의 일부 또는 전체를 치환 혹은 결실, 또는 수식함으로써, 힌지 도메인에 있어서 H쇄간에 디술피드 결합이 형성되지 않도록 개변한다.
(2) 도 5에 도시한 바와 같이, CD16a는 Fc 중의 2개의 CH2 도메인(도 5 중, CH2-A, CH2-B)에, 각각 별도의 부위(CH2-A의 영역 1, CH2-B의 영역 2)에서 접한다.
따라서 결합에 사용되지 않은 CH2-A의 영역 2 및 CH2-B의 영역 1을, 각각 아미노산의 개변 등에 의해 「파괴」해서 결합 활성을 감약시킨 경우, 그러한 개변 CH2-A를 갖는 HL체끼리의 호모 회합체에는 CH2-A의 영역 2만, 혹은 개변 CH2-B를 갖는 HL체끼리의 호모 회합체에서는 CH2-B의 영역 1만이 존재하지 않게 된다. 따라서, 이들 호모 회합체에는 CD16a는 충분한 친화성을 갖고 결합할 수 없다.
한편, 그러한 개변 CH2-A, 개변 CH2-B를 각각 구성 요소로서 갖는 HL체의 조합(헤테로 회합체)에 의하면, 상기 [2] 및 [3]의 조건을 충족시키는 항체 조성물이 얻어진다.
(3) CD16a 결합 영역이나 그 밖의 Fc 영역에 특정 아미노산 개변을 도입한 IgG 반량체에 의해 형성된 헤테로 회합체에 의하면, X/Y 양쪽 양성 세포에 대한 증강된 이펙터 기능 및/또는 제어된 체내 동태를 나타내는 항체 조성물이 얻어진다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
1. 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 포함하는, 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물이며, 이하의 (1A) 내지 (6A)인 항체 조성물.
(1A) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, 1개의 이뮤노글로불린 경쇄(이하, L쇄라고 약기함) 및 1개의 이뮤노글로불린 중쇄(이하, H쇄라고 약기함)를 포함하고, 상기 H쇄는, H쇄 가변 영역, 힌지 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 CH2 도메인에 있어서 서로 다른 제1 Fcγ 수용체 IIIA(이하, CD16a) 결합 영역 및 제2 CD16a 결합 영역을 갖는다.
(2A) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 상기 제1 IgG 반량체는, 상기 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제1 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 상기 제2 IgG 반량체는, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함하거나, 또는
상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (b) S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체 중 적어도 한쪽은, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, 상기 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
2. 상기 제1 항원만을 발현하는 표적 세포와 상기 제2 항원만을 발현하는 표적 세포에 대한 이펙터 기능과 비교하여, 상기 제1 항원 및 상기 제2 항원을 공발현하는 표적 세포에 대하여 특이적으로 이펙터 기능을 발휘해서 상해하는, 상기 1에 기재된 항체 조성물.
3. 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, EU 인덱스에서 나타내지는, Y349A, L351A, T366A, L368A, D399A, F405A, Y407A, K409A 및 K409R에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 상기 1 또는 2에 기재된 항체 조성물.
4. 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간의 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, EU 인덱스에서 나타내지는 K409R의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 상기 3에 기재된 항체 조성물.
5. 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, 상기 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 상기 1 내지 4의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
6. 상기 제1 IgG 반량체의 H쇄 정상 영역(이하, CH라고 약기함)이 서열 번호 248로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하고,
상기 제2 IgG 반량체의 CH가 서열 번호 252로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 1 내지 5의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
7. 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체에서의, Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하지 않은 당쇄의 비율이 20％ 이상인, 상기 1 내지 6의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
8. 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체의 이뮤노글로불린 서브클래스가 IgG1인, 상기 1 내지 7의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
9. 제2 IgG 반량체와 회합하는 것을 특징으로 하는 제1 IgG 반량체이며, 상기 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체가 이하의 (1B) 내지 (7B)인, 제1 IgG 반량체.
(1B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물을 형성한다.
(2B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, 1개의 L쇄 및 1개의 H쇄를 포함하고, 상기 H쇄는, H쇄 가변 영역, 힌지 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 CH2 도메인에 있어서 서로 다른 제1 CD16a 결합 영역 및 제2 CD16a 결합 영역을 갖는다.
(3B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4B) 상기 제1 IgG 반량체는, 상기 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제1 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5B) 상기 제2 IgG 반량체는, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함하거나, 또는
상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (b) S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(7B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체 중 적어도 한쪽은, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, 상기 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
10. 제1 IgG 반량체와 회합하는 것을 특징으로 하는 제2 IgG 반량체이며, 상기 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체가 이하의 (1C) 내지 (7C)인, 제2 IgG 반량체.
(1C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물을 형성한다.
(2C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, 1개의 L쇄 및 1개의 H쇄를 포함하고, 상기 H쇄는, H쇄 가변 영역, 힌지 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 CH2 도메인에 있어서 서로 다른 제1 CD16a 결합 영역 및 제2 CD16a 결합 영역을 갖는다.
(3C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4C) 상기 제1 IgG 반량체는, 상기 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제1 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5C) 상기 제2 IgG 반량체는, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함하거나, 또는
상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (b) S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(7C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체 중 적어도 한쪽은, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, 상기 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
11. 이하의 a) 또는 b)의 아미노산 서열을 코드하는 DNA.
a) 상기 9에 기재된 제1 IgG 반량체의 아미노산 서열
b) 상기 10에 기재된 제2 IgG 반량체의 아미노산 서열
12. 상기 11에 기재된 a)의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 및 b)의 아미노산 서열을 코드하는 DNA의 적어도 한쪽을 포함하는 재조합 벡터.
13. 상기 12에 기재된 재조합 벡터가 도입된 형질 전환체.
14. 상기 9에 기재된 제1 IgG 반량체 및 상기 10에 기재된 제2 IgG 반량체를 포함하는 키트.
15. 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물을 사용하는, 상기 제1 항원만을 발현하는 표적 세포와 상기 제2 항원만을 발현하는 표적 세포에 대한 이펙터 기능과 비교하여, 상기 제1 항원 및 상기 제2 항원을 공발현하는 표적 세포에 대하여 특이적으로 이펙터 기능을 유도하는 방법.
16. 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물을 포함하는, 의약 조성물.
17. 암, 자기면역 질환 또는 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한, 상기 16에 기재된 의약 조성물.
18. 암, 자기면역 질환 또는 알레르기 질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
19. 암, 자기면역 질환 또는 알레르기 질환의 치료를 위한 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
20. 암, 자기면역 질환 또는 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
21. 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암, 자기면역 질환 또는 알레르기 질환의 치료 방법.
22. 제2 IgG 반량체와 병용하기 위한 제1 IgG 반량체이며, 상기 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체가 이하의 (1B) 내지 (7B)인, 제1 IgG 반량체.
(1B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물을 형성한다.
(2B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, 1개의 L쇄 및 1개의 H쇄를 포함하고, 상기 H쇄는, H쇄 가변 영역, 힌지 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 CH2 도메인에 있어서 서로 다른 제1 CD16a 결합 영역 및 제2 CD16a 결합 영역을 갖는다.
(3B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4B) 상기 제1 IgG 반량체는, 상기 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제1 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5B) 상기 제2 IgG 반량체는, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함하거나, 또는
상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (b) S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(7B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체 중 적어도 한쪽은, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, 상기 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
23. 제1 IgG 반량체와 병용하기 위한 제2 IgG 반량체이며, 상기 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체가 이하의 (1C) 내지 (7C)인, 제2 IgG 반량체.
(1C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물을 형성한다.
(2C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, 1개의 L쇄 및 1개의 H쇄를 포함하고, 상기 H쇄는, H쇄 가변 영역, 힌지 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 CH2 도메인에 있어서 서로 다른 제1 CD16a 결합 영역 및 제2 CD16a 결합 영역을 갖는다.
(3C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4C) 상기 제1 IgG 반량체는, 상기 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제1 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5C) 상기 제2 IgG 반량체는, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함하거나, 또는
상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (b) S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(7C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체 중 적어도 한쪽은, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, 상기 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
24. 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물에 포함되는 제1 또는 제2 IgG 반량체.
25. 상기 9, 10 또는 24에 기재된 IgG 반량체를 사용하여, 제1 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포 특이적으로 이펙터 기능을 유도하는 방법.
26. 제1 항원이 CADM1이며, 제2 항원이 CCR4인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
27. 제1 항원이 EGFR이며, 제2 항원이 HER2인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
28. 제1 항원이 CD52이며, 제2 항원이 CD70인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
29. 제1 항원이 CD2이며, 제2 항원이 CD70인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
30. 제1 항원이 CD19이며, 제2 항원이 CD70인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
31. 제1 항원이 CD2이며, 제2 항원이 CD40 리간드인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
32. 제1 항원이 PD-L1이며, 제2 항원이 CD19, CD30, CCR4, CD20, CD22 및 CD79b에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
33. 제1 항원이 CD8이며, 제2 항원이 CCR4인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
34. 제1 항원이 CTLA-4이며, 제2 항원이 CD4, CCR4 및 GITR에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
35. 제1 항원이 TIGIT이며, 제2 항원이 CD4, CCR4 및 GITR에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
36. 제1 항원이 PD-1이며, 제2 항원이 CD4, CCR4 및 GITR에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
37. 제1 항원이 OX40이며, 제2 항원이 CD127, CD26, CD70 및 CD15s에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
38. 제1 항원이 4-1BB이며, 제2 항원이 CD127, CD26, CD70 및 CD15s에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
39. 제1 항원이 GITR이며, 제2 항원이 CD127, CD26, CD70 및 CD15s에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
40. 제1 항원이 CD40 리간드이며, 제2 항원이 CD127, CD26, CD70 및 CD15s에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
41. 제1 항원이 CD4이며, 제2 항원이 CD69인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
42. 상기 26에 기재된 항체 조성물을 포함하는, ATL의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
43. 상기 27에 기재된 항체 조성물을 포함하는, 위암 및 유방암의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
44. 상기 31에 기재된 항체 조성물을 포함하는, 쇼그렌 증후군의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
45. 상기 32에 기재된 항체 조성물을 포함하는, 림프종 및 백혈병의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
46. 상기 33 내지 36의 어느 하나에 기재된 항체 조성물을 포함하는, 암의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
47. 상기 37 내지 40의 어느 하나에 기재된 항체 조성물을 포함하는, 자기면역 질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
48. 상기 41에 기재된 항체 조성물을 포함하는, ANCA 관련 사구체 신염의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
49. ATL의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 26에 기재된 항체 조성물의 사용.
50. 위암 및 유방암의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 27에 기재된 항체 조성물의 사용.
51. 쇼그렌 증후군의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 31에 기재된 항체 조성물의 사용.
52. 림프종 및 백혈병의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 32에 기재된 항체 조성물의 사용.
53. 암의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 33 내지 36의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
54. 자기면역 질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 37 내지 40의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
55. ANCA 관련 사구체 신염의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 41에 기재된 항체 조성물의 사용.
56. ATL의 치료를 위한 상기 26에 기재된 항체 조성물의 사용.
57. 위암 및 유방암의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 27에 기재된 항체 조성물의 사용.
58. 쇼그렌 증후군의 치료를 위한 상기 31에 기재된 항체 조성물의 사용.
59. 림프종 및 백혈병의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 32에 기재된 항체 조성물의 사용.
60. 암의 치료를 위한 상기 33 내지 36의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
61. 자기면역 질환의 치료를 위한 상기 37 내지 40의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
62. ANCA 관련 사구체 신염의 치료를 위한 상기 41에 기재된 항체 조성물의 사용.
63. ATL의 치료에 사용하기 위한 상기 26에 기재된 항체 조성물.
64. 위암 및 유방암의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 27에 기재된 항체 조성물.
65. 쇼그렌 증후군의 치료에 사용하기 위한 상기 31에 기재된 항체 조성물.
66. 림프종 및 백혈병의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 32에 기재된 항체 조성물.
67. 암의 치료에 사용하기 위한 상기 33 내지 36의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
68. 자기면역 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 37 내지 40의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
69. ANCA 관련 사구체 신염의 치료에 사용하기 위한 상기 41에 기재된 항체 조성물.
70. 상기 26에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, ATL의 치료 방법.
71. 상기 27에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 위암 및 유방암의 적어도 한쪽의 치료 방법.
72. 상기 31에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 쇼그렌 증후군의 치료 방법.
73. 상기 32에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 림프종 및 백혈병의 적어도 한쪽의 치료 방법.
74. 상기 33 내지 36의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
75. 상기 37 내지 40의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자기면역 질환의 치료 방법.
76. 상기 41에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, ANCA 관련 사구체 신염의 치료 방법.
77. 제1 항원이 PD-1이며, 제2 항원이 CD3인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
78. 제1 항원이 PD-1이며, 제2 항원이 CD4인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
79. 제1 항원이 인테그린 α4β7이며, 제2 항원이 CCR6, CXCR3, CD161 및 CD127에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
80. 제1 항원이 인테그린 α4β7이며, 제2 항원이 CD40 리간드인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
81. 제1 항원이 인테그린 α4β1이며, 제2 항원이 CD40 리간드인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
82. 제1 항원이 CXCR5이며, 제2 항원이 CD127인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
83. 제1 항원이 TPO 수용체(c-mpl)이며, 제2 항원이 CD34 또는 CD123인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
84. 제1 항원이 CXCR3이며, 제2 항원이 CD3인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
85. 제1 항원이 CXCR3이며, 제2 항원이 CD127 또는 CD40 리간드인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
86. 제1 항원이 CCR4이며, 제2 항원이 CD127 또는 CD40 리간드인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
87. 제1 항원이 CCR6이며, 제2 항원이 CD127 또는 CD40 리간드인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
88. 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 CD127 또는 CD40 리간드인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
89. 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 CCR4인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
90. 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 ST2인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
91. 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 CCR6 또는 CCR3인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
92. 제1 항원이 CD207이며, 제2 항원이 CD11b 또는 CD1a인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
93. 제1 항원이 CD123이며, 제2 항원이 HLA-DR 또는 ASCT2인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
94. 제1 항원이 CSF1R이며, 제2 항원이 CD14인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
95. 제1 항원이 CSF1R이며, 제2 항원이 CD33인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
96. 제1 항원이 CD19이며, 제2 항원이 CD38인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
97. 제1 항원이 CD3이며, 제2 항원이 IL-23R인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
98. 제1 항원이 CD3이며, 제2 항원이 CX3CR1인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
99. 제1 항원이 CXCR4이며, 제2 항원이 타입 1 콜라겐(Type 1 collagen)인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
100. 제1 항원이 CXCR4이며, 제2 항원이 CD14인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
101. 제1 항원이 CXCR4이며, 제2 항원이 CD16인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
102. 제1 항원이 CLEC10A이며, 제2 항원이 CD14 또는 CD16인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
103. 제1 항원이 CD70이며, 제2 항원이 CD38인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
104. 제1 항원이 CD70이며, 제2 항원이 CD4, CD127 및 TIM-1에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
105. 제1 항원이 CD4이며, 제2 항원이 TIM-1인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
106. 제1 항원이 CD70이며, 제2 항원이 CD52인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
107. 제1 항원이 CB1이며, 제2 항원이 AT1R인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
108. 제1 항원이 CD4 또는 PD-1이며, 제2 항원이 CD153인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
109. 제1 항원이 FcεRI이며, 제2 항원이 CD34 또는 C-KIT인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
110. 제1 항원이 CD34이며, 제2 항원이 CD203 또는 MRGPRX2인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
111. 제1 항원이 CD52이며, 제2 항원이 CD127인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
112. 제1 항원이 CD69이며, 제2 항원이 CD21인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
113. 제1 항원이 CD106이며, 제2 항원이 CD11c, CD19, CD21 및 CD72에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
114. 제1 항원이 4-1BB이며, 제2 항원이 CD11c, CD19, CD21 및 CD72에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
115. 제1 항원이 BLT1이며, 제2 항원이 CD49b인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
116. 제1 항원이 CD226이며, 제2 항원이 CD8인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
117. 제1 항원이 CXCR3이며, 제2 항원이 CD8, CD49a, IL-15R 및 NKG2D에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
118. 제1 항원이 CD49a이며, 제2 항원이 CD8, IL-15R 및 NKG2D에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
119. 제1 항원이 IL-15R이며, 제2 항원이 CD8 또는 NKG2D인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
120. 제1 항원이 NKG2D이며, 제2 항원이 CD8인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
121. 제1 항원이 CD177이며, 제2 항원이 PR3인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
122. 제1 항원이 CD4이며, 제2 항원이 CD127인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
123. 제1 항원이 CD40 리간드이며, 제2 항원이 IL-6인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
124. 제1 항원이 IL-17R이며, 제2 항원이 막형TNF인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
125. 제1 항원이 IL-23R이며, 제2 항원이 CCR6인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
126. 관절 류머티즘의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 77에 기재된 항체 조성물의 사용.
127. 셀리악병의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 78에 기재된 항체 조성물의 사용.
128. 염증성 장질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 79에 기재된 항체 조성물의 사용.
129. 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 80에 기재된 항체 조성물의 사용.
130. 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 81에 기재된 항체 조성물의 사용.
131. 알레르기 질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 82에 기재된 항체 조성물의 사용.
132. 원발성 골수 섬유증의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 83에 기재된 항체 조성물의 사용.
133. 자기면역 질환, 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 84에 기재된 항체 조성물의 사용.
134. 전신성 에리테마토데스의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 85에 기재된 항체 조성물의 사용.
135. 알레르기 질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 86에 기재된 항체 조성물의 사용.
136. 건선의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 87에 기재된 항체 조성물의 사용.
137. 알레르기 질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 88에 기재된 항체 조성물의 사용.
138. 천식, 호산구성 부비강염 및 아토피성 피부염에서 선택되는 적어도 하나의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 89에 기재된 항체 조성물의 사용.
139. 천식 및 호산구성 부비강염의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 90에 기재된 항체 조성물의 사용.
140. 알레르기 질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 91에 기재된 항체 조성물의 사용.
141. 랑게르한스 세포 조직구증(LCH, Langerhans Cell Histiocytosis)의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 92에 기재된 항체 조성물의 사용.
142. 전신성 에리테마토데스의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 93에 기재된 항체 조성물의 사용.
143. 특발성 폐섬유증의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 94에 기재된 항체 조성물의 사용.
144. 암의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 95에 기재된 항체 조성물의 사용.
145. 전신성 에리테마토데스의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 96 또는 97에 기재된 항체 조성물의 사용.
146. 자기면역 질환, 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 98에 기재된 항체 조성물의 사용.
147. 특발성 폐섬유증, 전신성 경화증 및 간경변 등 각종 섬유화 질환에서 선택되는 적어도 하나의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 99에 기재된 항체 조성물의 사용.
148. 특발성 폐섬유증의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 100에 기재된 항체 조성물의 사용.
149. 호중구성 천식, 만성 폐색성 폐질환 및 알츠하이머에서 선택되는 적어도 하나의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 101에 기재된 항체 조성물의 사용.
150. 크론병, 관절 류머티즘 및 천식에서 선택되는 적어도 하나의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 102에 기재된 항체 조성물의 사용.
151. 다발성 경화증 및 시신경 척수염의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 103에 기재된 항체 조성물의 사용.
152. 전신성 에리테마토데스의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 104 또는 105에 기재된 항체 조성물의 사용.
153. 다발성 경화증의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 106에 기재된 항체 조성물의 사용.
154. 간경변의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 107에 기재된 항체 조성물의 사용.
155. 전신성 에리테마토데스의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 108에 기재된 항체 조성물의 사용.
156. 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS, Mast Cell Activation Syndromes)의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 109에 기재된 항체 조성물의 사용.
157. 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS)의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 110에 기재된 항체 조성물의 사용.
158. 다발성 경화증의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 111에 기재된 항체 조성물의 사용.
159. 다발성 경화증, 1형 당뇨병 및 관절 류머티즘에서 선택되는 적어도 하나의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 112에 기재된 항체 조성물의 사용.
160. 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS, Secondary Progressive Multiple Sclerosis), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 113에 기재된 항체 조성물의 사용.
161. 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 114에 기재된 항체 조성물의 사용.
162. 천식의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 115에 기재된 항체 조성물의 사용.
163. 전신성 강피증의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 116에 기재된 항체 조성물의 사용.
164. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 117에 기재된 항체 조성물의 사용.
165. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 118에 기재된 항체 조성물의 사용.
166. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 119에 기재된 항체 조성물의 사용.
167. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 120에 기재된 항체 조성물의 사용.
168. ANCA(항중성구 세포질 항체(Antineutrophil Cytoplasmic Antibody)) 관련 혈관염 및 전신성 에리테마토데스의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 121에 기재된 항체 조성물의 사용.
169. T 세포 의존적인 면역 관련 질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 122에 기재된 항체 조성물의 사용.
170. 면역 관련 질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 123에 기재된 항체 조성물의 사용.
171. 건선성 관절염의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 124에 기재된 항체 조성물의 사용.
172. 쇼그렌 증후군 및 건선의 적어도 한쪽을 포함하는 자기면역 질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 125에 기재된 항체 조성물의 사용.
173. 관절 류머티즘의 치료를 위한 상기 77에 기재된 항체 조성물의 사용.
174. 셀리악병의 치료를 위한 상기 78에 기재된 항체 조성물의 사용.
175. 염증성 장질환의 치료를 위한 상기 79에 기재된 항체 조성물의 사용.
176. 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 80에 기재된 항체 조성물의 사용.
177. 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 81에 기재된 항체 조성물의 사용.
178. 알레르기 질환의 치료를 위한 상기 82에 기재된 항체 조성물의 사용.
179. 원발성 골수 섬유증의 치료를 위한 상기 83에 기재된 항체 조성물의 사용.
180. 자기면역 질환, 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나의 치료를 위한 상기 84에 기재된 항체 조성물의 사용.
181. 전신성 에리테마토데스의 치료를 위한 상기 85에 기재된 항체 조성물의 사용.
182. 알레르기 질환의 치료를 위한 상기 86에 기재된 항체 조성물의 사용.
183. 건선의 치료를 위한 상기 87에 기재된 항체 조성물의 사용.
184. 알레르기 질환의 치료를 위한 상기 88에 기재된 항체 조성물의 사용.
185. 천식, 호산구성 부비강염 및 아토피성 피부염에서 선택되는 적어도 하나의 치료를 위한 상기 89에 기재된 항체 조성물의 사용.
186. 천식 및 호산구성 부비강염의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 90에 기재된 항체 조성물의 사용.
187. 알레르기 질환의 치료를 위한 상기 91에 기재된 항체 조성물의 사용.
188. 랑게르한스 세포 조직구증(LCH)의 치료를 위한 상기 92에 기재된 항체 조성물의 사용.
189.전신성 에리테마토데스의 치료를 위한 상기 93에 기재된 항체 조성물의 사용.
190. 특발성 폐섬유증의 치료를 위한 상기 94에 기재된 항체 조성물의 사용.
191. 암의 치료를 위한 상기 95에 기재된 항체 조성물의 사용.
192. 전신성 에리테마토데스의 치료를 위한 상기 96 또는 97에 기재된 항체 조성물의 사용.
193. 자기면역 질환, 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나의 치료를 위한 상기 98에 기재된 항체 조성물의 사용.
194. 특발성 폐섬유증, 전신성 경화증 및 간경변에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 섬유화 질환의 치료를 위한 상기 99에 기재된 항체 조성물의 사용.
195. 특발성 폐섬유증의 치료를 위한 상기 100에 기재된 항체 조성물의 사용.
196. 호중구성 천식, 만성 폐색성 폐질환 및 알츠하이머에서 선택되는 적어도 하나의 치료를 위한 상기 101에 기재된 항체 조성물의 사용.
197. 크론병, 관절 류머티즘 및 천식에서 선택되는 적어도 하나의 치료를 위한 상기 102에 기재된 항체 조성물의 사용.
198. 다발성 경화증 및 시신경 척수염의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 103에 기재된 항체 조성물의 사용.
199. 전신성 에리테마토데스의 치료를 위한 상기 104 또는 105에 기재된 항체 조성물의 사용.
200. 다발성 경화증의 치료를 위한 상기 106에 기재된 항체 조성물의 사용.
201. 간경변의 치료를 위한 상기 107에 기재된 항체 조성물의 사용.
202. 전신성 에리테마토데스의 치료를 위한 상기 108에 기재된 항체 조성물의 사용.
203. 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS)의 치료를 위한 상기 109에 기재된 항체 조성물의 사용.
204. 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS)의 치료를 위한 상기 110에 기재된 항체 조성물의 사용.
205. 다발성 경화증의 치료를 위한 상기 111에 기재된 항체 조성물의 사용.
206. 다발성 경화증, 1형 당뇨병 및 관절 류머티즘에서 선택되는 적어도 하나의 치료를 위한 상기 112에 기재된 항체 조성물의 사용.
207. 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나의 치료를 위한 상기 113에 기재된 항체 조성물의 사용.
208. 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나의 치료를 위한 상기 114에 기재된 항체 조성물의 사용.
209. 천식의 치료를 위한 상기 115에 기재된 항체 조성물의 사용.
210. 전신성 강피증의 치료를 위한 상기 116에 기재된 항체 조성물의 사용.
211. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 117에 기재된 항체 조성물의 사용.
212. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 118에 기재된 항체 조성물의 사용.
213. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 119에 기재된 항체 조성물의 사용.
214. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 120에 기재된 항체 조성물의 사용.
215. ANCA 관련 혈관염 및 전신성 에리테마토데스의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 121에 기재된 항체 조성물의 사용.
216. T 세포 의존적인 면역 관련 질환의 치료를 위한 상기 122에 기재된 항체 조성물의 사용.
217. 면역 관련 질환의 치료를 위한 상기 123에 기재된 항체 조성물의 사용.
218. 건선성 관절염의 치료를 위한 상기 124에 기재된 항체 조성물의 사용.
219. 쇼그렌 증후군 및 건선의 적어도 한쪽을 포함하는 자기면역 질환의 치료를 위한 상기 125에 기재된 항체 조성물의 사용.
220. 관절 류머티즘의 치료에 사용하기 위한 상기 77에 기재된 항체 조성물.
221. 셀리악병의 치료에 사용하기 위한 상기 78에 기재된 항체 조성물.
222. 염증성 장질환의 치료에 사용하기 위한 상기 79에 기재된 항체 조성물.
223. 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 80에 기재된 항체 조성물.
224. 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 81에 기재된 항체 조성물.
225. 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 82에 기재된 항체 조성물.
226. 원발성 골수 섬유증의 치료에 사용하기 위한 상기 83에 기재된 항체 조성물.
227. 자기면역 질환, 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 상기 84에 기재된 항체 조성물.
228. 전신성 에리테마토데스의 치료에 사용하기 위한 상기 85에 기재된 항체 조성물.
229. 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 86에 기재된 항체 조성물.
230. 건선의 치료에 사용하기 위한 상기 87에 기재된 항체 조성물.
231. 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 88에 기재된 항체 조성물.
232. 천식, 호산구성 부비강염 및 아토피성 피부염에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 상기 89에 기재된 항체 조성물.
233. 천식 및 호산구성 부비강염의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 90에 기재된 항체 조성물.
234. 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 91에 기재된 항체 조성물.
235. 랑게르한스 세포 조직구증(LCH)의 치료에 사용하기 위한 상기 92에 기재된 항체 조성물.
236. 전신성 에리테마토데스의 치료에 사용하기 위한 상기 93에 기재된 항체 조성물.
237. 특발성 폐섬유증의 치료에 사용하기 위한 상기 94에 기재된 항체 조성물.
238. 암의 치료에 사용하기 위한 상기 95에 기재된 항체 조성물.
239. 전신성 에리테마토데스의 치료에 사용하기 위한 상기 96 또는 97에 기재된 항체 조성물.
240. 자기면역 질환, 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 상기 98에 기재된 항체 조성물.
241. 특발성 폐섬유증, 전신성 경화증 및 간경변에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 섬유화 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 99에 기재된 항체 조성물.
242. 특발성 폐섬유증의 치료에 사용하기 위한 상기 100에 기재된 항체 조성물.
243. 호중구성 천식, 만성 폐색성 폐질환 및 알츠하이머에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 상기 101에 기재된 항체 조성물.
244. 크론병, 관절 류머티즘 및 천식에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 상기 102에 기재된 항체 조성물.
245. 다발성 경화증 및 시신경 척수염의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 103에 기재된 항체 조성물.
246. 전신성 에리테마토데스의 치료에 사용하기 위한 상기 104 또는 105에 기재된 항체 조성물.
247. 다발성 경화증의 치료에 사용하기 위한 상기 106에 기재된 항체 조성물.
248. 간경변의 치료에 사용하기 위한 상기 107에 기재된 항체 조성물.
249. 전신성 에리테마토데스의 치료에 사용하기 위한 상기 108에 기재된 항체 조성물.
250. 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS)의 치료에 사용하기 위한 상기 109에 기재된 항체 조성물.
251. 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS)의 치료에 사용하기 위한 상기 110에 기재된 항체 조성물.
252. 다발성 경화증의 치료에 사용하기 위한 상기 111에 기재된 항체 조성물.
253. 다발성 경화증, 1형 당뇨병 및 관절 류머티즘에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 상기 112에 기재된 항체 조성물.
254. 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 상기 113에 기재된 항체 조성물.
255. 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 상기 114에 기재된 항체 조성물.
256. 천식의 치료에 사용하기 위한 상기 115에 기재된 항체 조성물.
257. 전신성 강피증의 치료에 사용하기 위한 상기 116에 기재된 항체 조성물.
258. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 117에 기재된 항체 조성물.
259. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 118에 기재된 항체 조성물.
260. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 119에 기재된 항체 조성물.
261. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 120에 기재된 항체 조성물.
262. ANCA 관련 혈관염 및 전신성 에리테마토데스의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 121에 기재된 항체 조성물.
263. T 세포 의존적인 면역 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 122에 기재된 항체 조성물.
264. 면역 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 123에 기재된 항체 조성물.
265. 건선성 관절염의 치료에 사용하기 위한 상기 124에 기재된 항체 조성물.
266. 쇼그렌 증후군 및 건선의 적어도 한쪽을 포함하는 자기면역 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 125에 기재된 항체 조성물.
267. 상기 77에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 관절 류머티즘의 치료 방법.
268. 상기 78에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 셀리악병의 치료 방법.
269. 상기 79에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장질환의 치료 방법.
270. 상기 80에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽의 치료 방법.
271. 상기 81에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽의 치료 방법.
272. 상기 82에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 알레르기 질환의 치료 방법.
273. 상기 83에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 원발성 골수 섬유증의 치료 방법.
274. 상기 84에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자기면역 질환, 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나의 치료 방법.
275. 상기 85에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 전신성 에리테마토데스의 치료 방법.
276. 상기 86에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 알레르기 질환의 치료 방법.
277. 상기 87에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 건선의 치료 방법.
278. 상기 88에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 알레르기 질환의 치료 방법.
279. 상기 89에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 천식, 호산구성 부비강염 및 아토피성 피부염에서 선택되는 적어도 하나의 치료 방법.
280. 상기 90에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 천식 및 호산구성 부비강염의 적어도 한쪽의 치료 방법.
281. 상기 91에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 알레르기 질환의 치료용 의약 조성물의 제조 때문에.
282. 상기 92에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 랑게르한스 세포 조직구증(LCH)의 치료 방법.
283. 상기 93에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 전신성 에리테마토데스의 치료 방법.
284. 상기 94에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 특발성 폐섬유증의 치료 방법.
285. 상기 95에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
286. 상기 96 또는 97에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 전신성 에리테마토데스의 치료 방법.
287. 상기 98에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자기면역 질환, 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나의 치료 방법.
288. 상기 99에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 특발성 폐섬유증, 전신성 경화증 및 간경변에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 섬유화 질환의 치료 방법.
289. 상기 100에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 특발성 폐섬유증의 치료 방법.
290. 상기 101에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 호중구성 천식, 만성 폐색성 폐질환 및 알츠하이머에서 선택되는 적어도 하나의 치료 방법.
291. 상기 102에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 크론병, 관절 류머티즘 및 천식에서 선택되는 적어도 하나의 치료 방법.
292. 상기 103에 기재된 항체 조성물의 사다발성 경화증 및 시신경 척수염의 적어도 한쪽의 치료 방법.
293. 상기 104 또는 105에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 전신성 에리테마토데스의 치료 방법.
294. 상기 106에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 다발성 경화증의 치료 방법.
295. 상기 107에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 간경변의 치료 방법.
296. 상기 108에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 전신성 에리테마토데스의 치료 방법.
297. 상기 109에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS)의 치료 방법.
298. 상기 110에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS)의 치료 방법.
299. 상기 111에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 다발성 경화증의 치료 방법.
300. 상기 112에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 다발성 경화증, 1형 당뇨병 및 관절 류머티즘에서 선택되는 적어도 하나의 치료 방법.
301. 상기 113에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나의 치료 방법.
302. 상기 114에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나의 치료 방법.
303. 상기 115에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 천식의 치료 방법.
304. 상기 116에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 전신성 강피증의 치료 방법.
305. 상기 117에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료 방법.
306. 상기 118에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료 방법.
307. 상기 119에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료 방법.
308. 상기 120에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료 방법.
309. 상기 121에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, ANCA 관련 혈관염 및 전신성 에리테마토데스의 적어도 한쪽의 치료 방법.
310. 상기 122에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, T 세포 의존적인 면역 관련 질환의 치료 방법.
311. 상기 123에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 면역 관련 질환의 치료 방법.
312. 상기 124에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 건선성 관절염의 치료 방법.
313. 상기 125에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 쇼그렌 증후군 및 건선의 적어도 한쪽을 포함하는 자기면역 질환의 치료 방법.
314. 제1 항원이 CD64이며, 제2 항원이 CD206, CD163 및 CD68에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
315. 제1 항원이 CD163이며, 제2 항원이 CD206 또는 CD68인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
316. 제1 항원이 CD206이며, 제2 항원이 CD68인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
317. 제1 항원이 CD14이며, 제2 항원이 CD48, CD84, CD97 및 CD305에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
318. 제1 항원이 CD15이며, 제2 항원이 CD48, CD84, CD97 및 CD305에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
319. 제1 항원이 CD33이며, 제2 항원이 CD48, CD84, CD97 및 CD305에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
320. 제1 항원이 CD11b이며, 제2 항원이 CD48, CD84, CD97 및 CD305에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
321. 제1 항원이 CCR4이며, 제2 항원이 CADM1, CD30 및 CD70에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
322. 제1 항원이 CD38이며, 제2 항원이 CD138 또는 BCMA인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
323. 제1 항원이 BCMA이며, 제2 항원이 CD56 또는 CS1인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
324. 제1 항원이 CD40 리간드이며, 제2 항원이 CD36, CD62P 및 CD63에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
325. 제1 항원이 TIM-3이며, 제2 항원이 CD123, CD33, CD47, CD70 및 CLEC12A에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
326. 제1 항원이 CD123이며, 제2 항원이 CD33, CD47, CD70 및 CLEC12A에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
327. 제1 항원이 CD5이며, 제2 항원이 CD23인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
328. 제1 항원이 CD10 또는 CD5이며, 제2 항원이 CD20인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
329. 제1 항원이 CD40이며, 제2 항원이 CD80, CD86, ICOS 리간드, 4-1BB 리간드, OX40 리간드, CD70, GITR, PD-L1, PD-L2, B7-DC, B7H3, B7H4, B7H5, B7H6 및 B7H7에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
330. 제1 항원이 PTPRS이며, 제2 항원이 IL-21R, CD38 및 CD32a에서 선택되는 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
331. 제1 항원이 OX40이며, 제2 항원이 CD127 또는 CD40 리간드인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
332. 제1 항원이 OX40이며, 제2 항원이 CD8 또는 NKG2D인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
333. 제1 항원이 OX40이며, 제2 항원이 CD226인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
334. 제1 항원이 OX40이며, 제2 항원이 CRTH2인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
335. 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 CD2, CD7 및 CD45에서 선택되는 어느 하나인, 상기 1 내지 8의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
336. 상기 314 내지 320의 어느 하나에 기재된 항체 조성물을 포함하는 암의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
337. 상기 321 내지 328의 어느 하나에 기재된 항체 조성물을 포함하는 백혈병의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
338. 상기 321 내지 328의 어느 하나에 기재된 항체 조성물을 포함하는 림프종의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
339. 상기 329에 기재된 항체 조성물을 포함하는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
340. 상기 331, 334 및 335의 어느 하나에 기재된 항체 조성물을 포함하는 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
341. 상기 332에 기재된 항체 조성물을 포함하는 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
342. 상기 333에 기재된 항체 조성물을 포함하는 강피증의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
343. 암의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 314 내지 320의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
344. 백혈병의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 321 내지 328의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
345. 림프종의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 321 내지 328의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
346. 염증성 질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 329에 기재된 항체 조성물의 사용.
347. 알레르기 질환의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 331, 334 및 335의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
348. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 332에 기재된 항체 조성물의 사용.
349. 강피증의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 상기 333에 기재된 항체 조성물의 사용.
350. 암의 치료를 위한 상기 314 내지 320의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
351. 백혈병의 치료를 위한 상기 321 내지 328의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
352. 림프종의 치료를 위한 상기 321 내지 328의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
353. 염증성 질환의 치료를 위한 상기 329에 기재된 항체 조성물의 사용.
354. 알레르기 질환의 치료를 위한 상기 331, 334 및 335의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 사용.
355. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료를 위한 상기 332에 기재된 항체 조성물의 사용.
356. 강피증의 치료를 위한 상기 333에 기재된 항체 조성물의 사용.
357. 암의 치료에 사용하기 위한 상기 314 내지 320의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
358. 백혈병의 치료에 사용하기 위한 상기 321 내지 328의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
359. 림프종의 치료에 사용하기 위한 상기 321 내지 328의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
360. 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 329에 기재된 항체 조성물.
361. 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 331, 334 및 335의 어느 하나에 기재된 항체 조성물.
362. 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 상기 332에 기재된 항체 조성물.
363. 강피증의 치료에 사용하기 위한 상기 333에 기재된 항체 조성물.
364. 상기 314 내지 320의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
365. 상기 321 내지 328의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 백혈병의 치료 방법.
366. 상기 321 내지 328의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 림프종의 치료 방법.
367. 상기 329에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 염증성 질환의 치료 방법.
368. 상기 331, 334 및 335의 어느 하나에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 알레르기 질환의 치료 방법.
369. 상기 332에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료 방법.
370. 상기 333에 기재된 항체 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 강피증의 치료 방법.
371. 상기 77에 기재된 항체 조성물을 포함하는 관절 류머티즘의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
372. 상기 78에 기재된 항체 조성물을 포함하는 셀리악병의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
373. 상기 79에 기재된 항체 조성물을 포함하는 염증성 장질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
374. 상기 80에 기재된 항체 조성물을 포함하는 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
375. 상기 81에 기재된 항체 조성물을 포함하는 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
376. 상기 82에 기재된 항체 조성물을 포함하는 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
377. 상기 83에 기재된 항체 조성물을 포함하는 원발성 골수 섬유증의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
378. 상기 84에 기재된 항체 조성물을 포함하는 자기면역 질환, 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
379. 상기 85에 기재된 항체 조성물을 포함하는 전신성 에리테마토데스의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
380. 상기 86에 기재된 항체 조성물을 포함하는 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
381. 상기 87에 기재된 항체 조성물을 포함하는 건선의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
382. 상기 88에 기재된 항체 조성물을 포함하는 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
383. 상기 89에 기재된 항체 조성물을 포함하는 천식, 호산구성 부비강염 및 아토피성 피부염에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
384. 상기 90에 기재된 항체 조성물을 포함하는 천식 및 호산구성 부비강염의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
385. 상기 91에 기재된 항체 조성물을 포함하는 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
386. 상기 92에 기재된 항체 조성물을 포함하는 랑게르한스 세포 조직구증(LCH)의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
387. 상기 93에 기재된 항체 조성물을 포함하는 전신성 에리테마토데스의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
388. 상기 94에 기재된 항체 조성물을 포함하는 특발성 폐섬유증의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
389. 상기 95에 기재된 항체 조성물을 포함하는 암의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
390. 상기 96 또는 97에 기재된 항체 조성물을 포함하는 전신성 에리테마토데스의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
391. 상기 98에 기재된 항체 조성물을 포함하는 자기면역 질환, 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
392. 상기 99에 기재된 항체 조성물을 포함하는 특발성 폐섬유증, 전신성 경화증 및 간경변에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 섬유화 질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
393. 상기 100에 기재된 항체 조성물을 포함하는 특발성 폐섬유증의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
394. 상기 101에 기재된 항체 조성물을 포함하는 호중구성 천식, 만성 폐색성 폐질환 및 알츠하이머에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
395. 상기 102에 기재된 항체 조성물을 포함하는 크론병, 관절 류머티즘 및 천식에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
396. 상기 103에 기재된 항체 조성물을 포함하는 다발성 경화증 및 시신경척수염의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
397. 상기 104 또는 105에 기재된 항체 조성물을 포함하는 전신성 에리테마토데스의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
398. 상기 106에 기재된 항체 조성물을 포함하는 다발성 경화증의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
399. 상기 107에 기재된 항체 조성물을 포함하는 간경변의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
400. 상기 108에 기재된 항체 조성물을 포함하는 전신성 에리테마토데스의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
401. 상기 109에 기재된 항체 조성물을 포함하는 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS)의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
402. 상기 110에 기재된 항체 조성물을 포함하는 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS)의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
403. 상기 111에 기재된 항체 조성물을 포함하는 다발성 경화증의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
404. 상기 112에 기재된 항체 조성물을 포함하는 다발성 경화증, 1형 당뇨병 및 관절 류머티즘에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
405. 상기 113에 기재된 항체 조성물을 포함하는 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
406. 상기 114에 기재된 항체 조성물을 포함하는 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
407. 상기 115에 기재된 항체 조성물을 포함하는 천식의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
408. 상기 116에 기재된 항체 조성물을 포함하는 전신성 강피증의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
409. 상기 117에 기재된 항체 조성물을 포함하는 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
410. 상기 118에 기재된 항체 조성물을 포함하는 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
411. 상기 119에 기재된 항체 조성물을 포함하는 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
412. 상기 120에 기재된 항체 조성물을 포함하는 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
413. 상기 121에 기재된 항체 조성물을 포함하는 ANCA 관련 혈관염 및 전신성 에리테마토데스의 적어도 한쪽의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
414. 상기 122에 기재된 항체 조성물을 포함하는 T 세포 의존적인 면역 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
415. 상기 123에 기재된 항체 조성물을 포함하는 면역 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
416. 상기 124에 기재된 항체 조성물을 포함하는 건선성 관절염의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
417. 상기 125에 기재된 항체 조성물을 포함하는 쇼그렌 증후군 및 건선의 적어도 한쪽을 포함하는 자기면역 질환의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
본 발명의 항체 조성물은, 서로 다른 2종의 항원에 대한 항원 결합 도메인을 갖고, 서로 다른 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성이 감약하고 있는 2종의 IgG 반량체인, 제1 및 제2 IgG 반량체를 포함한다. 이 점에서, 제1 IgG 반량체끼리, 또는 제2 IgG 반량체끼리에 의해 호모 회합체의 항체 구조를 구성해도, CD16a와 결합할 수는 없어, 항체가 갖는 활성을 발휘할 수 없다. 한편, 제1 및 제2 IgG 반량체에 의해 헤테로 회합체의 항체 구조가 구성되면, 제1 IgG 반량체에서의 제2 CD16a 결합 영역과, 제2 IgG 반량체에서의 제1 CD16a 결합 영역을 통해서 CD16a에 대하여 결합 가능하게 된다.
또한, 제1 및 제2 IgG 반량체에서의 힌지 도메인은, 디술피드 결합이 형성되지 않도록 개변되어 있다. 이에 의해, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 사이에서, H쇄간에 있어서의 디술피드 결합이 형성되지 않는다. 따라서, 제1 및 제2 IgG 반량체를 혼합한 경우에는, 제1 및 제2 IgG 반량체를 회합체 또는 반량체의 평형 상태로 존재시키는 것이 가능하게 된다. 이에 의해, 본 발명의 항체 조성물은, 단일 양성 세포와 비교하여, 양쪽 양성 세포에 대하여 보다 특이적으로 이펙터 기능을 발휘해서 상해할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 조성물은, 제1 및 제2 IgG 반량체에서의 CD16a 결합 영역이나 그 밖의 Fc 영역에 특정 아미노산 개변이 도입되어 있다. 이에 의해, 제1 및 제2 IgG 반량체에 의해 형성된 헤테로 회합체는, 양쪽 양성 세포에 대한 증강된 이펙터 기능 및/또는 제어된 체내 동태를 나타낸다.
도 1은 항체, VHH-Fc 및 scFv-Fc의 구조를 도시하는 모식도이다.
도 2a는 일반적인 이중특이성 항체의 구조의 모식도를 나타낸다.
도 2b는 일반적인 이중특이성 항체에 의한 결합 양식의 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 항체 조성물에 의한 결합 양식의 일 양태의 모식도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 항체 조성물의 구조의 일 양태의 모식도를 나타낸다.
도 5는 통상의 인간 IgG와 CD16a의 결합 양식의 모식도를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 항체 조성물과 CD16a의 결합 양식의 모식도를 나타낸다.
도 7은 통상의 인간 IgG1의 포맷 상에서의 아미노산 개변의 후보 부위를 도시하는 모식도이다.
도 8은 CD16a 결합 영역을 「파괴」한 인간 IgG1 항CCR6 항체의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 9는 CH2-A와 CH2-B에만 각각 상기 개변을 비대칭으로 도입해서 ADCC 활성을 평가하기 위한 1가 항체의 모식도이다.
도 10은 CD16a 결합 비대칭 개변 1가 항체의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 11은 실시예 3에서 사용한 IgG1114_AA_AAA_D265A(/P329Y)형의 IgG 반량체의 모식도이다.
도 12는 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체의 SDS-PAGE에 의한 정제도를 평가한 결과이다.
도 13은 CD4 단일 양성 세포, CD70 단일 양성 세포, CD4/CD70 양쪽 양성 세포에서의 CD4 및 CD70의 항원 발현을 측정한 결과이다.
도 14는 CD4 단일 양성 세포, CD70 단일 양성 세포, CD4/CD70 양쪽 양성 세포에 대한 항CD4 IgG1 및 항CD70 IgG1 및 반량체의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 15a는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 15b는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 15c는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 15d는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 15e는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 15f는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 15g는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 15h는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체, 항CD4 IgG1 또는 항CD70 IgG1 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 16a는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 각 그래프 상에 각각 첨가한 반량체의 CH3 도메인에 도입한 아미노산 개변명을 나타낸다.
도 16b는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체, 항CD4 IgG1 또는 항CD70 IgG1 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 각 그래프 상에 각각 첨가한 항체의 약칭(반량체는 CH3 도메인에 도입한 아미노산 개변명)을 나타낸다.
도 17은 항DNP 항체(야생형) 또는 각 반량체의 혼합물 1mg/kg을 마우스에 투여했을 때의, 혈청 중 항체 농도 추이를 도시하는 도면이다.
도 18a는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체 첨가 시의 면역 글로불린 첨가계에서의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 각 그래프 상에 각각 첨가한 반량체의 약칭으로서, CD16a 결합 증강 아미노산 개변명을 나타낸다.
도 18b는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체 첨가 시의 면역 글로불린 첨가계에서의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 각 그래프 상에 각각 첨가한 반량체의 약칭으로서, CD16a 결합 증강 아미노산 개변명을 나타낸다.
도 18c는 CD4/CD70 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CD70 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 반량체, 항CD4 IgG1 또는 항CD70 IgG1 첨가 시의 면역 글로불린 첨가계에서의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 각 그래프 상에 각각 첨가한 항체의 약칭(반량체는 CD16a 결합 증강 아미노산 개변명)을 나타낸다.
도 19a는 인간 혈액 재구성계에 있어서의, 각 반량체의 ADCC 활성(세포 생존율)을 도시하는 도면이다. 횡축은 첨가한 항체의 농도(반량체는 혼합물의 합계 농도), 종축은 항체 비첨가 시의 전체 CD3 양성 T 세포 혹은 전체 림프구 중의, 각 표적 세포(그래프 상부에 기재)의 존재 비율(％)을 나타낸다.
도 19b는 인간 혈액 재구성계에 있어서의, 각 반량체의 ADCC 활성(세포 생존율)을 도시하는 도면이다. 횡축은 첨가한 항체의 농도(반량체는 혼합물의 합계 농도), 종축은 항체 비첨가 시의 전체 CD3 양성 T 세포 혹은 전체 림프구 중의, 각 표적 세포(그래프 상부에 기재)의 존재 비율(％)을 나타낸다.
도 20은 CD4/CCR4 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CCR4 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL-4)에 대한 각 반량체, 항CD4 IgG1 또는 항CCR4 IgG1 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 21은 CD4/CCR4 양쪽 양성 세포(HH), CCR4 단일 양성 세포(L428), CD4 단일 양성 세포(TALL1)에 대한 각 반량체, 항CD4 IgG1 또는 항CCR4 IgG1 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 22는 CCR4/CD70 양쪽 양성 세포(L428), CCR4 단일 양성 세포(PEER), CD70 단일 양성 세포(SUP-M2)에 대한 각 반량체, 항CCR4 IgG1 또는 항CD70 IgG1 첨가 시의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다.
도 23은 각 반량체, 항DNP 항체의 CD16a에의 결합 활성에 대해서 도시하는 도면이다.
1. 항체 조성물의 구조
본 발명에서 항체 분자는 이뮤노글로불린(이하, Ig라고 표기함)이라고도 칭해지며, 인간 항체는, 분자 구조의 차이에 따라, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM의 아이소타입으로 분류된다. 아미노산 서열의 상동성이 비교적 높은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 총칭해서 IgG라고도 한다.
항체 분자는 중쇄(heavy chain, 이하, H쇄라고 기재함) 및 경쇄(light chain, 이하, L쇄라고 기재함)라고 불리는 폴리펩티드로 구성된다. 항체는 2개의 H쇄 및 2개의 L쇄를 포함하는 4량체 단백질이다.
또한, H쇄는 N 말단측으로부터 H쇄 가변 영역(VH라고도 표기함), H쇄 정상 영역(CH라고도 표기함), L쇄는 N 말단측으로부터 L쇄 가변 영역(VL이라고도 표기함), L쇄 정상 영역(CL이라고도 표기함)의 각 영역에 의해 각각 구성된다. CH는 각 서브클래스에 있어서, α, δ, ε, γ 및 μ쇄가 각각 알려져 있다. CL은, λ 및 κ가 알려져 있다.
도메인이란, 항체 분자의 각 폴리펩티드를 구성하는 기능적인 구조 단위를 말한다. 또한, 본 발명에서의 Fc 영역(Fc)이란, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 H쇄 정상 영역의 부분 배열 및 부분 구조를 가리킨다.
CH는, N 말단측으로부터 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 각 도메인에 의해 구성된다. 본 발명에서의 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 Fc는, EU 인덱스[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]에 의해, N 말단으로부터의 아미노산 잔기의 번호로 특정할 수 있다.
구체적으로는, CH1은 EU 인덱스 118 내지 215위의 아미노산 서열, 힌지는 EU 인덱스 216 내지 230위의 아미노산 서열, CH2는 EU 인덱스 231 내지 340위의 아미노산 서열, CH3은 EU 인덱스 341 내지 447위의 아미노산 서열로 각각 특정된다.
본 발명에서의 IgG로서는, 적어도 항원 결합 도메인 및 Fc를 갖는, IgG와 기능이 유사한 인공적인 아종의 개변 분자도 포함한다. 구체적으로는, IgG의 아미노산 잔기가 치환, 결실 혹은 부가, 또는 수식된 개변 분자, 나아가 폴리펩티드나 도메인의 부가체 등을 포함한다. 또한, IgG의 VH, VL, 혹은 Fab를 포함하는 항원 결합 부위의 일부 혹은 전부를, 다른 항원 결합 도메인으로 치환한 것도 포함한다. 구체적으로는, 도 1에 도시되는 단일쇄 Fv(scFv)-Fc, 중쇄 항체의 중쇄 가변 도메인(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)(VHH)-Fc 등도 포함한다(Brinkmann U et al., MABS 2017, 9: 182-212; Fernandes CFC et al., Frontiers in Immunology 2017, 8: 653).
본 발명에서 항체로서는, 하이브리도마로부터 취득되는 모노클로날 항체 이외에, 유전자 재조합 기술에 의해 제작된 유전자 재조합 항체도 포함된다. 유전자 재조합 항체로서는, 인간 항체 정상 영역을 비인간 항체 가변 영역에 결합시킨 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 산생 동물 등을 사용해서 제작되는 인간 항체가 포함된다.
키메라 항체는, 모노클로날 항체를 생산하는 비인간 동물 세포 유래의 하이브리도마로부터, VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 취득하여, 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입해서 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.
인간화 항체란, 비인간 항체 가변 영역의 H쇄 및 L쇄의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하, CDR이라고 약기함)을 인간 항체 가변 영역의 프레임 워크 영역(이하, FR이라고 약기함)에 삽입함으로써 제작되는 항체를 말한다.
인간화 항체(또는, CDR 이식 항체)는, 다음 방법에 의해 제조할 수 있다. 비인간 동물 항체의 VH의 CDR의 아미노산 서열과 임의의 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA와, 비인간 동물 항체의 VL의 CDR의 아미노산 서열과 임의의 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA를 구축한다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 이들 cDNA를 각각 삽입해서 인간화 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시킴으로써 인간화 항체를 제조할 수 있다.
인간 항체는, 원래, 인간 체내에 천연으로 존재할 수 있는 항체 또는 인간 유전자에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 항체를 말하는데, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지 라이브러리, 불사화 인간 말초혈 림프구의 클로닝 또는 인간 항체 산생 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.
인간 항체는, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 마우스(Tomizuka K. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 97, 722-7, 2000)에 원하는 항원을 면역함으로써 취득할 수 있다. 또한, 인간 유래의 B 세포로부터 항체 유전자를 증폭한 phage display 라이브러리를 사용함으로써, 원하는 결합 활성을 갖는 인간 항체를 선택함으로써, 면역을 행하지 않고 인간 항체를 취득할 수 있다(Winter G. et al., Annu Rev Immunol. 12: 433-55. 1994).
또한, EB 바이러스를 사용해서 인간 B 세포를 불사화함으로써, 원하는 결합 활성을 갖는 인간 항체를 생산하는 세포를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다(Rosen A. et al., Nature 267, 52-54. 1977).
인간 체내에 존재하는 항체는, 예를 들어 인간 말초혈로부터 단리한 림프구를, EB 바이러스 등을 감염시킴으로써 불사화한 후, 클로닝함으로써, 해당 항체를 산생하는 림프구를 배양할 수 있고, 배양물 중으로부터 해당 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써, Fab 또는 scFv 등의 항체 단편을 표면에 발현시킨 파지의 라이브러리이다. 해당 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 해서 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 해당 항체 단편은, 또한 유전자 공학적 방법에 의해, 2개의 완전한 H쇄 및 2개의 완전한 L쇄를 포함하는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.
인간 항체 산생 트랜스제닉 동물은, 인간 항체 유전자가 숙주 동물의 염색체 내에 내장된 동물을 말한다. 구체적으로는, 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하여, 해당 ES 세포를 다른 마우스의 초기 배에 이식 후, 발생시킴으로써 인간 항체 산생 트랜스제닉 동물을 제작할 수 있다.
인간 항체 산생 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체의 제작 방법은, 통상의 인간 이외의 포유 동물에서 행하여지고 있는 하이브리도마 제작 방법에 의해 인간 항체 산생 하이브리도마를 취득하여, 배양함으로써 배양물 중에 인간 항체를 산생 축적시킬 수 있다.
VH 및 VL의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 비인간 동물 항체의 CDR을, 인간 항체의 프레임 워크에 이식한 인간화 항체의 아미노산 서열 그리고 인간 항체 유래의 VH 및 VL의 아미노산 서열의 어느 것이어도 된다.
구체적으로는, 하이브리도마 또는 항체 산생 세포가 산생하는 비인간 동물 항체, 인간화 항체 및 인간 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
CL의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 아미노산 서열 또는 비인간 동물 항체의 아미노산 서열의 어느 것이어도 되지만, 인간 항체의 Cκ 또는 Cλ의 아미노산 서열이 바람직하다.
CH로서는, 이뮤노글로불린에 속하면 어떠한 것이어도 되지만, 바람직하게는 인간 IgG 클래스에 속하는 서브클래스, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4)의 어떤 것이든 사용할 수 있다.
「항원 결합 도메인」으로서는, 항체, 리간드 및 수용체 등 기지의 결합 분자의 결합 도메인을 이용해서 재조합한 결합 단백질이어도 되고, 구체적으로는 각 항원에 결합하는 항체의 CDR을 포함하는 재조합 단백질, CDR을 포함하는 항체 가변 영역, 항체 가변 영역 및 각 항원에 결합하는 리간드의 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 본 발명에서는, 항원 결합 도메인은 항체 가변 영역인 것이 바람직하다.
본 발명의 항체 조성물은, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 포함하는, 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물이며, 이하의 1) 내지 6)의 성질을 갖는다.
1) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는 각각, 1개의 L쇄 및 1개의 H쇄를 포함하고, H쇄는 H쇄 가변 영역, 힌지 도메인, CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, CH2 도메인에 있어서 서로 다른 제1 및 제2 CD16a 결합 영역을 갖는다.
2) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체의 힌지 도메인에는 각각, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 사이에서, H쇄간에 있어서의 디술피드 결합을 형성시키지 않기 위한 일부 또는 전체의 치환 혹은 결실, 또는 수식의 개변을 포함한다.
3) 제1 IgG 반량체는, 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에서 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변을 포함한다.
4) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제2 CD16a 결합 영역에서 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변을 포함한다.
5) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는 각각, CD16a 결합 활성을 증강시키는 개변을 포함한다.
6) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체 중 적어도 한쪽은, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변을 포함한다.
「서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물」이란, 제1 항원에 대한 IgG 반량체 및 제2 항원에 대한 IgG 반량체를 포함하는 조성물을 나타낸다.
본 발명의 항체 조성물에서의 IgG 반량체가 취할 수 있는 양태로서는, 예를 들어 모노머의 반량체 및 반량체를 포함하는 회합체를 들 수 있다. 반량체로서는, 예를 들어 제1 IgG 반량체, 제2 IgG 반량체를 들 수 있다. 회합체로서는, 예를 들어 제1 IgG 반량체의 회합체, 제2 IgG 반량체의 회합체, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 회합체를 들 수 있다. 구체적으로는 항체 조성물에 포함되는 제1 및 제2 반량체가, 제1 반량체를 포함하는 회합체 및 제2 반량체를 포함하는 회합체와, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 포함하는 회합체의 평형 상태에 있어도 된다.
본 발명의 「서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물」은, 동일 항원 중의 제1 항원 결정기(에피토프)에 대한 IgG 반량체 및 제2 항원 결정기(에피토프)에 대한 IgG 반량체를 포함하는 항체 조성물도 포함한다.
「IgG 반량체」란, 1개의 L쇄 및 1개의 H쇄를 포함하는 2량체 단백질이며, H쇄는, H쇄 가변 영역, CH1 내지 CH3 도메인 및 힌지 도메인을 포함한다. IgG 반량체의 H쇄의 CH2 도메인에는, 서로 다른 2군데의 CD16a 결합 영역(제1 및 제2 CD16a 결합 영역)이 존재한다.
또한, 「IgG 반량체」란, 항원 결합 도메인 및 Fc를 갖는, IgG와 기능이 유사한 인공적인 아종의 개변 분자의 반량체도 포함한다. 구체적으로는, IgG의 아미노산의 치환, 결실 혹은 부가, 또는 수식된 개변 분자의 반량체, 나아가 폴리펩티드나 도메인의 부가체의 반량체 등을 포함한다. 또한, IgG의 VH, VL, 혹은 Fab를 포함하는 항원 결합 부위의 일부 혹은 전부를, 다른 항원 결합 도메인으로 치환한 것의 반량체, 구체적으로는, 도 1에 도시되는 단일쇄 Fv(scFv)-Fc, VHH-Fc 등의 반량체도 포함한다.
「CD16a 결합 영역」이란, IgG의 Fc에 존재하는 CD16a와 결합하는 영역을 말한다. IgG1의 Fc 상에서의 CD16a 결합 영역은 Fc의 구조의 점대칭성으로 인해 2군데 존재하고, Fc를 구성하는 2개의 폴리펩티드쇄로 구성되는 CH2 도메인에 있어서 각각 다른 영역에서 CD16a와 접하고 있다(도 5 참조).
제1 CD16a 결합 영역으로서는, EU 인덱스에서 나타내지는 235위, 236위, 237위, 238위, 239위, 265위, 266위, 267위, 268위, 269위, 294위, 295위, 296위, 297위, 298위, 299위, 301위, 325위, 327위 및 332위의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 영역을 들 수 있다.
CH2 도메인의 이뮤노글로불린 서브클래스가 IgG1일 경우, 제1 CD16a 결합 영역으로서는, EU 인덱스에서 나타내지는 235위의 Leu, 236위의 Gly, 237위의 Gly, 238위의 Pro, 239위의 Ser, 265위의 Asp, 266위의 Val, 267위의 Ser, 268위의 His, 269위의 Glu, 294위의 Glu, 295위의 Gln, 296위의 Tyr, 297위의 Asn, 298위의 Ser, 299의 Thr, 301위의 Arg, 325위의 Asn, 327위의 Ala 및 332위의 Ile의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 영역을 들 수 있다.
제2 CD16a 결합 영역으로서는, EU 인덱스에서 나타내지는 235위, 236위, 237위, 326위, 327위, 328위, 329위 및 330위의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 영역을 들 수 있다.
CH2 도메인의 이뮤노글로불린 서브클래스가 IgG1일 경우, 제2 CD16a 결합 영역으로서는, EU 인덱스에서 나타내지는 235위의 Leu, 236위의 Gly, 237위의 Gly, 326위의 Lys, 327위의 Ala, 328위의 Leu, 329위의 Pro 및 330위의 Ala의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 영역을 들 수 있다.
「CD16a 결합 활성」이란, IgG의 Fc가 CD16a에 결합하는 활성을 말한다. IgG 반량체의 CD16a 결합 활성은, 2분자의 IgG 반량체를 조합해서 IgG를 구성시킨 후, 유전자 재조합 CD16a 단백질과 반응시켜서, 결합 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다(미국 특허 출원 공개 제2004/0259150호 명세서).
IgG 반량체의 CD16a 결합 활성의 측정 방법의 일 양태로서는, 예를 들어 세포막 상에 발현하고 있는 CD16a에 대한 결합 활성은, 형광 항체법(Cancer Immunol. Immunother., 36, 373, 1993) 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 예를 들어 정제한 CD16a 단백질에 대한 결합 활성은, 문헌 [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., 1995; 효소 면역 측정법, 제3판, 이가쿠쇼인(1987); 개정판, 효소 항체법, 가쿠사이 키카쿠(1985)] 등에 기재된 웨스턴 염색, RIA(방사 면역 검정(Radioimmunoassay)), VIA(바이로 면역 검정(Viroimmunoassay)), EIA(효소 면역 검정(Enzymoimmunoassay)), FIA(형광 면역 검정(Fluoroimmunoassay)), MIA(메탈로 면역 검정(Metalloimmunoassay)) 등의 면역학적 정량 방법에 준해서 실시할 수 있다.
구체적으로는 예를 들어, 정제한 CD16a 단백질에 대한 결합 활성을 EIA에 의해 정량할 경우, 다음과 같이 실시할 수 있다. EIA용 플라스틱 플레이트에 FcγRIIIa를 고정화하고, 항체 조성물을 포함하는 시료와 반응시킨다. 이어서, 적당한 2차 항체를 사용해서 결합한 항체 조성물의 양을 측정한다.
정제한 CD16a 단백질에 대한 결합 활성은, 바이오센서[예를 들어, BIAcore(BIACORE사 제조)]를 사용한 측정[J. Immunol. Methods, 200, 121(1997)]이나 Isothermal Titration Calorimetry법[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 9026(2000)] 등에 의해서도 측정할 수 있다.
또한, IgG 반량체의 CD16a 결합 활성은, IgG 반량체의 Fc에 있어서 후술하는 이펙터 기능(ADCC 활성 등)을 구비시키고, 해당 IgG 반량체를 2분자 조합한 IgG를 구성하여, 해당 IgG의 이펙터 기능을 측정함으로써 확인할 수도 있다.
「이펙터 기능」이란, 항체의 Fc를 통해서 야기되는 항체 의존성의 기능을 말한다. 이펙터 기능으로서는, 예를 들어 ADCC 활성, CDC 활성, 또는 마크로파지 혹은 수지상 세포 등의 식세포에 의한 항체 의존성 파고사이토시스(Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis activity; ADCP 활성)를 들 수 있다. 이펙터 기능의 측정 방법으로서는, 예를 들어, ADCC 활성 및 CDC 활성은, Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)에 기재된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
ADCC 활성 또는 CDC 활성의 측정 방법의 일 양태로서는, 예를 들어 다음의 방법을 들 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 실시예에서 후술하는 방법을 들 수 있다.
1) 이펙터 세포로서 인간 말초혈 단핵구(PBMC) 혹은 인간 CD16a를 유전자 도입해서 안정적으로 발현시킨 세포주와 표적 세포를, 배지(예를 들어, RPMI 배지)를 사용해서 조제한다. CDC 활성 측정의 경우는, 인간 보체 단백질을 적당한 농도로 희석한 용액을 표적 세포와 혼합해서 조정한다.
2) 세포 배양용 용기(예를 들어, 96 well plate)에 항체 용액, 표적 세포, 이펙터 세포를 분주한다. 이펙터 세포와 표적 세포의 수비(E/T비)는 일정하게 한다.
3) CO2 인큐베이터에서 2 내지 6시간 정도 정치한다. 병행해서 100％ 반응 웰에 가용화 용액(예를 들어, 산, 알칼리, 계면 활성제 등을 포함하는 수용액)을 첨가하여, 표적 세포를 완전히 용해한다. 반응 용기를 원심 분리 후, 상청을 채취해서 ELISA 플레이트에 분주한다. 발색 용액을 어플라이해서 반응시킨 후, 정지 용액을 첨가하여, 플레이트 리더로 흡광도(A450)를 측정한다.
4) 이하의 식을 사용해서 ADCC 활성(％) 또는 CDC 활성(％)을 산출한다.
ADCC 활성(％) 또는 CDC 활성(％)=100×(S-E-T)/(Max-T)
S=샘플 반응 웰 흡광도-배지 웰 흡광도
E=이펙터 웰 흡광도-배지 웰 흡광도
T=표적 웰 흡광도-배지 웰 흡광도
Max=100％ 반응 웰-100％ 반응 대조 웰
또한 ADCC 측정용 키트로서, 공지의 키트를 사용할 수 있으며, 예를 들어 CytoTox96(R)Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(프로메가)를 들 수 있다.
ADCC 활성이란, 표적 세포 상의 항원에 결합한 항체가, 항체의 Fc를 통해서 면역 세포의 Fc 수용체와 결합함으로써 면역 세포(내츄럴 킬러 세포 등)를 활성화하여, 표적 세포를 상해하는 활성을 말한다.
Fc 수용체(이하, FcR이라고 기재하는 경우도 있음)란, 항체의 Fc에 결합하는 수용체이며, 항체의 결합에 의해 다양한 이펙터 기능을 유도한다.
FcR은 항체의 서브클래스에 대응하고 있으며, IgG, IgE, IgA, IgM은 각각 FcγR, FcεR, FcαR, FcμR에 특이적으로 결합한다. 또한 FcγR에는, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)의 서브타입이 존재하고, 각각 FcγRIA, FcγRIB, FcγRIC, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA(CD16a), FcγRIIIB의 아이소폼이 존재한다. 이러한 다른 FcγR은 다른 세포 상에 존재하고 있다[Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492(1991)].
인간에게 있어서는, FcγRIIIB는 호중구에 특이적으로 발현하고 있으며, FcγRIIIA는, 단구, Natural Killer 세포(NK 세포) 및 일부 T 세포에 발현하고 있다. FcγRIIIA를 통한 항체의 결합은, NK 세포 의존적인 ADCC를 유도한다.
CDC 활성이란, 표적 세포 상의 항원에 결합한 항체가 혈액 중의 보체 관련 단백질군을 포함하는 일련의 캐스케이드(보체 활성화 경로)를 활성화하여, 표적 세포를 상해하는 활성을 말한다. 또한, 보체의 활성화에 의해 생기는 단백질 단편에 의해 면역 세포의 유주, 활성화를 유도할 수 있다.
CDC 활성의 캐스케이드는, 항체의 Fc와의 결합 도메인을 갖는 C1q가, Fc에 결합하고, 2개의 세린 프로테아제인 C1r 및 C1s와 결합함으로써 C1 복합체를 형성함으로써 개시한다.
「CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성이 감약하고 있다」란, Fc에 있어서 제1 및/또는 제2 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변을 가한 IgG 반량체를 2분자 조합한 IgG의 CD16a 결합 활성 및/또는 이펙터 기능(ADCC 활성 등)이, 개변하기 전의 IgG 반량체를 2분자 조합한 IgG의 CD16a 결합 활성 및/또는 이펙터 기능과 비교하여, 감약하고 있는 것을 말한다.
CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성이 감약하고 있는 일 양태로서는, 예를 들어 상기 개변을 가한 IgG 반량체를 2분자 조합한 IgG의 CD16a 결합 활성이, 상기 개변 전의 IgG 반량체를 2분자 조합한 IgG의 CD16a 결합 활성을 100％로 한 경우, 바람직하게는 60％ 이하, 보다 바람직하게는 50％ 이하, 더욱 바람직하게는 이하 순으로, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하인 것을 들 수 있다.
CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성이 감약하고 있는 일 양태로서는, 예를 들어 상기 개변을 가한 IgG 반량체를 2분자 조합한 IgG의 ADCC 활성이, 상기 개변 전의 IgG 반량체를 2분자 조합한 IgG의 ADCC 활성을 100％로 한 경우, 바람직하게는 80％ 이하, 보다 바람직하게는 70％ 이하, 더욱 바람직하게는 이하 순으로, 60％ 이하, 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하인 것을 들 수 있다.
CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성은, CD16a 결합 영역에서의 개변에 의해 감약시킨다. 본 명세서 중의 「개변」은, 야생형 아미노산 서열로부터의 아미노산 잔기의 개변을 가리키며, 예를 들어 아미노산 잔기의 치환, 결실 혹은 부가, 또는 수식을 의미한다. 본 명세서에서는, 아미노산 잔기의 치환을 아미노산 잔기 치환이라고도 약기한다. 본 명세서에서의 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변은, 본 발명의 항체가 결합하는 항원의 종류에 따라 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 효과를 발휘하는 한, 어느 항원 결합 도메인을 갖는 항체를 어느 개변과 조합해도 된다.
제1 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변으로서, EU 인덱스에서 나타내지는 235위, 236위, 237위, 238위, 239위, 265위, 266위, 267위, 268위, 269위, 294위, 295위, 296위, 297위, 298위, 299위, 301위, 325위, 327위 및 332위의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환을 들 수 있으며, 235위, 238위, 239위, 265위, 266위, 267위, 268위, 269위, 294위, 295위, 296위, 297위, 298위, 299위, 301위, 325위, 327위 및 332위의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환이 바람직하고, 235위, 238위, 239위, 265위, 267위, 269위, 296위, 298위, 299위 및 327위의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환이 보다 바람직하다. 아미노산 잔기 치환의 조합으로서는, 예를 들어 238위 및 265위의 조합(이하, 이러한 조합을 238위/265위 등으로 표기함), 238위/267위, 265위/267위, 및 238위/265위/267위의 아미노산 잔기의 치환을 들 수 있다.
CH2 도메인의 이뮤노글로불린 서브클래스가 IgG1일 경우, 제1 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변으로서는, EU 인덱스에서 나타내지는 235위의 Leu, 236위의 Gly, 237위의 Gly, 238위의 Pro, 239위의 Ser, 265위의 Asp, 266위의 Val, 267위의 Ser, 268위의 His, 269위의 Glu, 294위의 Glu, 295위의 Gln, 296위의 Tyr, 297위의 Asn, 298위의 Ser, 299위의 Thr, 301위의 Arg, 325위의 Asn, 327위의 Ala 및 332위의 Ile에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환을 들 수 있고, 235위의 Leu, 238위의 Pro, 239위의 Ser, 265위의 Asp, 266위의 Val, 267위의 Ser, 268위의 His, 269위의 Glu, 294위의 Glu, 295위의 Gln, 296위의 Tyr, 297위의 Asn, 298위의 Ser, 299위의 Thr, 301위의 Arg, 325위의 Asn, 327위의 Ala 및 332위의 Ile에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환이 바람직하고, 235위의 Leu, 238위의 Pro, 239위의 Ser, 265위의 Asp, 267위의 Ser, 269위의 Glu, 296위의 Tyr, 298위의 Ser, 299위의 Thr 및 327위의 Ala에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환이 보다 바람직하다. 구체적으로는 예를 들어, L235R, P238A, S239R, D265A, D265N, D265E, S267L, S267K, E269P, Y296P, S298E, T299A 및 A327I에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환을 들 수 있다.
제2 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변으로서, EU 인덱스에서 나타내지는 235위, 236위, 237위, 326위, 327위, 328위, 329위 및 330위의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환을 들 수 있고, 326위, 328위, 329위, 330위의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환이 바람직하고, 326위, 328위 및 329위의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환이 보다 바람직하다. 아미노산 잔기 치환의 조합으로서는, 예를 들어 326위/328위, 326위/329위, 328위/329위, 326위/328위/329위의 아미노산 잔기의 치환을 들 수 있다.
CH2 도메인의 이뮤노글로불린 서브클래스가 IgG1일 경우, 제2 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변으로서는, EU 인덱스에서 나타내지는 235위의 Leu, 236위의 Gly, 237위의 Gly, 326위의 Lys, 327위의 Ala, 328위의 Leu, 329위의 Pro 및 330위의 Ala에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환을 들 수 있고, 326위의 Lys, 328위의 Leu, 329위의 Pro 및 330위의 Ala에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환이 바람직하고, 326위의 Lys, 328위의 Leu 및 329위의 Pro에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환이 보다 바람직하다. 구체적으로는, K326W, K326G, L328V, L328R, P329Y, P329K, P329W 및 A330P에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환을 들 수 있다.
제1 IgG 반량체의 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변과, 제2 IgG 반량체의 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변의 조합은, 비대칭인 개변으로 되는 한 특별히 제한되지 않고, 적절히 상기 개변을 조합할 수 있다. 구체적으로는, 하기 아미노산 잔기의 치환의 조합을 들 수 있다.
·제1 IgG 반량체에서의 265위 및 제2 IgG 반량체에서의 329위의 아미노산 잔기 치환
·제1 IgG 반량체에서의 329위 및 제2 IgG 반량체에서의 265위의 아미노산 잔기 치환
·제1 IgG 반량체에서의 238위/267위 및 제2 IgG 반량체에서의 329위의 아미노산 잔기 치환
·제1 IgG 반량체에서의 329위 및 제2 IgG 반량체에서의 238위/267위의 아미노산 잔기 치환
제1 IgG 반량체의 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변(제1 개변)과, 제2 IgG 반량체의 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변(제2 개변)의 조합은, 이하의 표 1에 기재하는 조합이 바람직하고, 제1 개변과 제2 개변이 S267K와 P329Y, Y296P와 P329Y, S298E와 P329Y, D265A와 P329Y 또는 S239R과 P329Y로 되는 조합이 보다 바람직하다.
Figure pct00001
상기한 치환 후의 아미노산 잔기는 서로 치환 가능한 아미노산으로 해도 된다. 이하에, 서로 치환 가능한 아미노산의 예를 나타낸다. 동일군에 포함되는 아미노산은 서로 치환 가능하다.
A군: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌
B군: 아스파라긴산, 글루탐산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산
C군: 아스파라긴, 글루타민
D군: 라이신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산
E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린
F군: 세린, 트레오닌, 호모세린
G군: 페닐알라닌, 티로신
상기 치환되는 아미노산은 천연형이든 비천연형이든 상관없다. 천연형 아미노산으로서는, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-아르기닌, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-시스테인 등을 들 수 있다. 비천연형 아미노산으로서는, 아미노기와 카르복실기를 갖는 다양한 아미노산을 들 수 있지만, 바람직하게는 각종 천연형 아미노산의 유도체가 바람직하다. 많은 비천연형 아미노산은, 각 시약 회사(Sigma-Aldrich사, TCI사 등)로부터 입수할 수 있다. 비천연형 아미노산에 대해서는, 문헌(Chem. Today 2003, 65.; Curr Opin Chem Biol. 2000, 6, 645.)에 많은 개시가 있다.
제1 IgG 반량체에 있어서는 제1 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성이 개변에 의해 감약하고 있고, 또한 제2 IgG 반량체에 있어서는 제2 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성이 개변에 의해 감약하고 있다. 이것으로부터, 제1 IgG 반량체끼리, 또는 제2 IgG 반량체끼리에 의해 호모 회합체의 항체 구조를 구성해도, CD16a와 결합할 수는 없어, 항체가 갖는 활성을 발휘할 수 없다.
한편, 제1 및 제2 IgG 반량체에 의해 헤테로 회합체의 항체 구조가 구성되면, 제1 IgG 반량체에서의 제2 CD16a 결합 영역과, 제2 IgG 반량체에서의 제1 CD16a 결합 영역을 통해서 CD16a에 결합 가능하게 된다(도 5 참조).
제1 및 제2 IgG 반량체는 서로 다른 항원 결합 도메인을 갖는다. 따라서, 제1 및 제2 IgG 반량체를 포함하는 헤테로 회합체의 항체 구조를 구성함으로써, 서로 다른 2종의 항원을 동일 세포 상에 발현하고 있는 표적 세포에 대하여 결합한 경우에만, CD16a가 결합해서 ADCC 활성 등의 이펙터 기능을 특이적으로 발휘할 수 있는 항체 조성물로 된다.
제1 및 제2 IgG 반량체 각각에서의 힌지 도메인이, 일부 또는 전부의 치환 혹은 결실, 또는 수식에 의해 디술피드 결합이 형성되지 않도록 개변되어 있다. 이에 의해, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 사이에서, H쇄간에 있어서의 디술피드 결합이 형성되지 않는다.
따라서, 제1 및 제2 IgG 반량체의 병존에 의해, 제1 및 제2 IgG 반량체를 회합체 또는 반량체의 평형 상태로 존재시키는 것이 가능하게 되어, 양쪽 양성 세포에 대한 높은 특이성을 발휘할 수 있다.
이에 의해, 본 발명의 항체 조성물은, 제1 항원만을 발현하는 표적 세포와 제2 항원만을 발현하는 표적 세포에 대한 이펙터 기능과 비교하여, 제1 항원 및 제2 항원을 공발현하는 표적 세포에 대하여 특이적으로 이펙터 기능을 발휘해서 상해할 수 있다.
본 발명에서, 「제1 항원만을 발현하는 표적 세포와 제2 항원만을 발현하는 표적 세포에 대한 이펙터 기능과 비교하여, 제1 항원 및 제2 항원을 공발현하는 표적 세포에 대하여 특이적으로 이펙터 기능을 발휘한다」란, 제1 항원만을 발현하는 표적 세포 및 제2 항원만을 발현하는 표적 세포(단일 양성 세포)에의 이펙터 기능과 비교하여, 제1 항원 및 제2 항원을 공발현하는 표적 세포(양쪽 양성 세포)에의 이펙터 기능이 강한 것을 말한다.
단일 양성 세포와 비교하여, 양쪽 양성 세포에 대하여 특이적인 이펙터 기능을 나타내는 것은, [1] 양쪽 양성 세포에 대한 높은 특이성 및 [2] 증강된 이펙터 기능의 항에서 설명하는 방법에 의해 평가할 수 있다.
제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 사이에서, H쇄간에 있어서의 디술피드 결합을 형성시키지 않기 위한, 힌지 도메인에서의 일부의 치환으로서는, 예를 들어 EU 인덱스에서 나타내지는 226위 및 229위의 아미노산 잔기 치환을 들 수 있다. 혹은 해당 시스테인 부위를 포함하는 힌지 영역의 일부 혹은 전부의 결손을 들 수 있다. 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 사이에서 H쇄간에 있어서의 디술피드 결합을 형성시키지 않기 위한, 힌지 도메인에서의 일부의 치환으로서는, 구체적으로는 예를 들어, EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환이 바람직하다.
상기 평형 상태로 존재시키기 위해서는, 제1 및 제2 IgG 반량체에서의 H쇄간의 비공유 결합성의 상호 작용이 감약하고 있는 것이 유효하며, 특히 CH3 도메인간 상호 작용이 감약하고 있는 것이 바람직하다.
구체적으로는 예를 들어, 제1 및 제2 IgG 반량체에서의 H쇄의 CH3 도메인간 상호 작용이, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 약한 것이 바람직하다.
CH3 도메인간 상호 작용을, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 감약시키는 방법으로서는, CH3 도메인에 있어서 아미노산 개변(아미노산 잔기의 치환, 결실 혹은 부가, 또는 수식 등)을 도입하는 것이 바람직하고, 특히 아미노산 잔기 치환을 도입하는 것이 바람직하다. CH3 도메인간 상호 작용을, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 감약시키기 위해서 아미노산 개변을 도입하는 CH3 도메인으로서는, IgG1의 CH3 도메인, IgG4의 CH3 도메인을 들 수 있다.
인간 IgG4의 CH3 도메인에서의 EU 인덱스에서 나타내지는 409위의 Arg를 인간 IgG1 유래의 Lys로 치환함으로써, CH3 도메인끼리의 상호 작용이 높아지는 것이 보고되어 있다(Structure 2011 19: 9: 1274-1282). 나아가, 인간 IgG1의 CH3 도메인 내의 특정 아미노산 잔기를 Ala로 치환함으로써, 자유 에너지의 변화로부터 인간 IgG1의 CH3 도메인끼리의 상호 작용에 중요한 아미노산 부위를 동정한 보고가 있다(Biochemistry 1998: 37: 9266-9273).
CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 아미노산 잔기 치환으로서는, 사용하는 CH3 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 CH3 도메인간 상호 작용이 감약하는 것이라면 어느 것이든 되며, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 적어도 한쪽에 도입되어 있으면 되지만, 각각에 도입되어 있는 것이 바람직하다. CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 아미노산 잔기 치환은, 바인딩 ELISA, SPR법 등의 결합 어세이, SDS-PAGE 및 고유 질량 분석(native mass spectrometry) 등 분자량 분석 등을 사용하여, 원하는 아미노산 잔기 치환을 포함하는 분자를 평가함으로써 동정할 수 있다.
CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 아미노산 잔기 치환으로서는, 구체적으로는, CH3 도메인에 있어서, EU 인덱스에서 나타내지는, 349위, 351위, 366위, 368위, 399위, 405위, 407위 및 409위에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 들 수 있다.
보다 구체적으로는, Y349A, L351A, T366A, L368A, D399A, F405A, Y407A, K409A 및 K409R이 바람직하고, L368A, Y407A 및 K409R이 보다 바람직하고, K409R이 가장 바람직하다. 이들 아미노산 잔기 치환은 어느 하나를 도입해도 되고, 2 이상 을 조합해서 도입해도 된다.
2. 항체 조성물의 이펙터 기능의 제어
본 발명의 항체 조성물은, 제1 및 제2 IgG 반량체에서의 Fc에 의존한 이펙터 기능을 부여할 수도 있다. 항체 조성물의 이펙터 기능은, 다양한 방법에 의해 제어할 수 있다.
예를 들어, 제1 및 제2 IgG 반량체가, CH2 도메인에 있어서, 또한 CD16a 결합 활성을 증강시키는 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환을 포함함으로써, 더욱 CD16a 결합 활성을 증강시키는 것이 바람직하다. 이에 의해, 항체 조성물의 이펙터 기능을 증강할 수 있다.
CD16a 결합 활성을 증강시키는 아미노산 잔기 치환은, 제1 및 제2 IgG 반량체 각각에 도입되어 있어도, 어느 한쪽에만 도입되어 있어도 된다. CD16a 결합 활성을 증강시키는 아미노산 잔기 치환이 제1 및 제2 IgG 반량체의 양쪽에 도입되어 있는 경우, 제1 IgG 반량체에서의 아미노산 잔기 치환과 제2 IgG 반량체에서의 아미노산 잔기 치환은 동일해도, 서로 달라도 되지만, 동일한 것이 바람직하다.
항체 조성물의 CD16a 결합 활성을 증강하기 위한 아미노산 잔기 치환이 제1 및 제2 IgG 반량체의 양쪽에 도입되어 있는 경우, 해당 아미노산 잔기 치환은 제1 및 제2 IgG 반량체에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키기 위해서 개변된 영역과는 다른 영역이 된다.
본 발명의 항체 조성물의 이펙터 기능을 제어하는 방법으로서는 이하와 같은 방법을 들 수 있다.
예를 들어, 제1 및 제2 IgG 반량체에 있어서, IgG1 서브클래스의 Fc의 아미노산 서열을 사용하여, EU 인덱스 297위의 Asn에 결합하는 N 결합 복합형 당쇄(이하, 단순히 컴플렉스 당쇄라고 약기하는 경우도 있음)의 환원 말단측에 존재하는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)에 α-1,6 결합하는 푸코오스(코어 푸코오스라고도 함)의 양을 제어하는 방법(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제2002/31140호, 국제 공개 제00/61739호), 또는 항체의 Fc의 아미노산 잔기를 치환함으로써, 항체 조성물의 이펙터 기능을 제어할 수 있다.
1) 당쇄 개변에 의한 이펙터 기능의 제어
제1 및 제2 IgG 반량체의 Fc에 결합하고 있는 컴플렉스 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 부가하는 푸코오스의 함량을 제어함으로써, 항체 조성물의 이펙터 기능을 증강 또는 저하시킬 수 있다.
IgG 반량체의 Fc에 결합하고 있는 N 결합 복합형 당쇄에 부가하는 푸코오스의 함량을 저하시키는 방법으로서는, α1,6-푸코오스 전이효소 유전자(FUT8)가 결손된 CHO 세포를 사용해서 IgG 반량체를 발현함으로써, 푸코오스가 결합하고 있지 않은 IgG 반량체를 취득할 수 있다. 푸코오스가 결합하고 있지 않은 IgG 반량체를 포함하는 항체 조성물은 높은 ADCC 활성을 갖는다.
한편, IgG 반량체의 Fc에 결합하고 있는 N 결합 복합형 당쇄에 부가하는 푸코오스의 함량을 증가시키는 방법으로서는, α1,6-푸코오스 전이효소 유전자를 도입한 숙주 세포를 사용해서 IgG 반량체를 발현시킴으로써, 푸코오스가 결합하고 있는 IgG 반량체를 취득할 수 있다. 푸코오스가 결합하고 있는 IgG 반량체를 포함하는 항체 조성물은, 푸코오스가 결합하고 있지 않은 IgG 반량체를 포함하는 항체 조성물보다도 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
IgG 반량체의 Fc에는, EU 인덱스 297위의 Asn 잔기에 N 결합형 당쇄가 결합하지만, 그 이외의 Fc의 Asn 잔기에 당쇄가 결합하는 것은 알려져 있지 않다. 따라서, 통상, 항체 1분자당 2개의 N-글리코시드 결합 당쇄가 결합하고 있다.
N 결합형 당쇄로서는 하이만노오스형, 컴플렉스형 및 하이브리드형이 알려져 있으며, 어느 N 결합형 당쇄이든 푸코오스가 결합하고 있지 않은 당쇄라면, 푸코오스가 결합하고 있는 당쇄에 비해서 높은 ADCC 활성을 얻을 수 있다.
IgG 반량체의 Fc에 결합하는 컴플렉스 당쇄로서는, 코어 구조(트리만노실 코어 구조)의 비환원 말단측의 만노오스(Man)에, 1개 이상의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 또는 갈락토오스-N-아세틸글루코사민(이하, Gal-GlcNAc라고 표기함)이 α1-2 결합 또는 α1-4 결합하고 있는 당쇄를 들 수 있다.
또한 Gal-GlcNAc의 비환원 말단측에 시알산, 바이섹팅의 N-아세틸글루코사민(이하, bisecting GlcNAc라고 기재함) 등을 갖는 컴플렉스형(복합형) 당쇄를 제시할 수 있다.
본 발명에서, 코어 푸코오스(core-fucose) 또는 α1,6-푸코오스란, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민(이하, GlcNAc라고 기재하는 경우도 있음)의 6위와 푸코오스(이하, Fuc라고 기재하는 경우도 있음)의 1위가 α 결합한 당쇄 구조를 말한다. 또한, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하지 않은 것을, 단순히 푸코오스가 없는 또는 코어 푸코오스가 없는 당쇄라고 한다.
또한, 본 발명에서, 코어 구조 또는 트리만노실 코어 구조(tri-mannosyl core structure)란, Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc 구조를 말한다.
IgG 반량체에 결합하고 있는 당쇄로서, 2개쇄 N-글리코시드 결합 컴플렉스 당쇄(바이안테너리 컴플렉스 당쇄라고도 함)는, 하기 화학식으로 나타내진다.
[화학식 1]
Figure pct00002
제1 및 제2 IgG 반량체는, EU 인덱스 297위의 Asn에 컴플렉스 당쇄가 결합한 Fc를 갖는 것이 바람직하다. 상기 당쇄 구조를 갖고 있으면, 단일 또는 복수의 다른 당쇄 구조를 갖고 있어도 된다. 구체적으로는, 제1 및 제2 IgG 반량체에서의, Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 당쇄(코어 푸코오스가 없는 당쇄)의 비율이 20％ 이상인 항체 조성물을 들 수 있다.
코어 푸코오스가 없는 당쇄의 비율로서는, 항체 조성물의 ADCC 활성이 증가하면, 어느 비율이든 포함되지만, 바람직하게는 20％ 이상, 보다 바람직하게는 51％ 내지 100％, 더욱 바람직하게는 80％ 내지 100％, 특히 바람직하게는 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 가장 바람직하게는 100％의 비율을 들 수 있다.
코어 푸코오스가 없는 당쇄의 비율이 50％란, 예를 들어 제1 및 제2 IgG 반량체에 결합하고 있는 N-글리코시드 결합 당쇄의 한쪽 당쇄에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 분자가 100％ 포함되는 항체 조성물, 또는 제1 및 제2 IgG 반량체에 결합하고 있는 N-글리코시드 결합 당쇄의 양쪽 당쇄에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 분자가 50％ 포함되고, 또한 제1 및 제2 IgG 반량체에 결합하고 있는 N-글리코시드 결합 당쇄의 양쪽 당쇄에 푸코오스가 결합하고 있는 분자가 50％ 포함되는 항체 조성물의 모두가 포함된다.
본 발명에서, 푸코오스가 없는 당쇄로서는, 상기에서 나타내진 화학식 중, 환원 말단측의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않으면, 비환원 말단측의 당쇄의 구조는 어떠한 것이어도 된다.
본 발명에서, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않다(코어 푸코오스가 없다)란, 실질적으로 푸코오스가 결합하고 있지 않은 것을 말한다. 실질적으로 푸코오스가 결합하고 있지 않은 IgG 반량체란, 구체적으로는, 후술에 기재된 당쇄 분석에 있어서, 푸코오스를 실질적으로 검출할 수 없을 정도의 IgG 반량체일 경우를 말한다. 실질적으로 검출할 수 없을 정도란, 측정의 검출 한계 이하인 것을 말한다. 모든 당쇄에 코어 푸코오스가 없는 제1 및 제2 IgG 반량체를 포함하는 항체 조성물은, 가장 높은 ADCC 활성을 갖는다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄가 결합한 Fc를 갖는 IgG 반량체 중에서의, 푸코오스가 없는 당쇄를 갖는 IgG 반량체의 비율은, IgG 반량체로부터 히드라진 분해 또는 효소 소화 등의 공지된 방법[생물화학 실험법 23-당단백질 당쇄 연구법(학회 출판 센터) 다카하시 레이코 편(1989)]을 사용하여, 당쇄를 유리시키고, 유리시킨 당쇄를 형광 표지 또는 동위 원소 표지하여, 표지한 당쇄를 크로마토그래피법으로 분리함으로써 결정할 수 있다.
또한, 컴플렉스 당쇄가 결합한 Fc를 포함하는 IgG 반량체 중에 포함되는, 푸코오스가 없는 당쇄가 결합한 IgG 반량체의 비율은, 유리시킨 당쇄를 HPAED-PAD법(J. Liq. Chromatogr., 6, 1577, 1983)에 의해 분석함으로써 결정할 수 있다.
2) 아미노산 잔기 치환에 의한 이펙터 기능의 제어
본 발명의 항체 조성물은, 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체에서의 Fc의 항체 서브클래스의 변환 또는 Fc의 아미노산 잔기 치환에 의해, ADCC 활성, ADCP 활성 및 CDC 활성 등의 이펙터 기능을 증강 또는 감약시킬 수 있다.
IgG1 서브클래스의 항체는, IgG 서브클래스 중에서 가장 높은 ADCC 활성, CDC 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, CH2 도메인의 이뮤노글로불린 서브클래스는 IgG1인 것이 바람직하다.
Fc의 아미노산 잔기 치환으로서는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2007/0148165호 명세서에 기재된 Fc의 아미노산 서열을 사용함으로써, 항체의 CDC 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, 미국 특허 제6,737,056호 명세서, 미국 특허 제7,297,775호 명세서 및 미국 특허 제7,317,091호 명세서에 기재된 아미노산 잔기 치환을 행함으로써, 항체 조성물의 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 증강시킬 수도 감약시킬 수도 있다.
ADCC 활성을 증강시키는 구체적인 아미노산 잔기 치환으로서는, P247I, A339D, F243L, R292P, Y300L, P396L, T393A, H433P, S239D, S298A, A330L, I332E, E333A 및 K334A 등을 들 수 있다. 한편, ADCC 활성을 감소시키는 구체적인 아미노산 잔기 치환으로서는, L235E, P238A, N297A, K322A 및 P331S 등을 들 수 있다.
상기 어느 것의 아미노산 잔기 치환을 2개 이상 조합해서 ADCC 활성을 증강할 수 있으며, 목적에 따라 치환하는 아미노산 잔기를 증가시킬 수 있다. ADCC 활성을 증강할 수 있는 아미노산 잔기 치환의 조합으로서는, S298A/E333A/K334A/P247L, S298A/E333A/K334A/H268E, S298A/E333A/K334A/P247L/N421K, S298A/E333A/K334A/E294W, S298A/E333A/K334A/K326T, S298A/E333A/R292L/K334E, S298A/E333A/K334A/S239D, S298A/E333A/K334A/K248M, S239D/I332E, S239D/A330F, S239D/K326T, S239D/K326E, S239D/K326I, S239D/I332D, S239E/I332Y, S239E/I332E, S239E/K326T 및 S239E/K326I가 바람직하다.
ADCC 활성을 증강시키는 아미노산 잔기 치환은 항체의 약물 동태에 영향을 줄 수 있기 때문에, 아미노산 잔기 치환을 도입한 항체가 아미노산 잔기 치환을 도입하지 않은 야생형 IgG 항체와 동등한 약물 동태를 갖고 있는 것이 바람직하다. 구체적인 아미노산 치환으로서, S239D, S239E, S239D/K326T, S239D/A330F, S239D/K326E, S239E/I332E, S298A/E333A/K334A, S298A/E333A/K334A/H268E 및 S239D/S298A/E333A/L242C/K334C가 바람직하고, S239D/K326T 및 S239D/S298A/E333A/L242C/K334C가 보다 바람직하다. 동등한 약물 동태란, 최고 혈중 농도(Cmax), 혈중 반감기(t1/2) 또는 혈중 농도-시간 곡선 하 면적(AUC)의 어느 것의 지표에 있어서 야생형 IgG 항체와 비교해서 50％ 이상 150％ 이하를 의미한다.
CDC 활성을 증가시키는 구체적인 아미노산 잔기 치환으로서는, K326A, S267E, H268F, S324T, K274Q, N276K, Y296F, Y300F, K326W, K326Y, E333A, E333S, A339T, D356E, L358M, N384S, K392N, T394F, T394Y, V397M 및 V422I에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환을 들 수 있다.
상기 어느 것의 아미노산 잔기 치환을 2개 이상 조합해서 CDC 활성을 증가시킬 수도 있고, 목적에 따라 치환하는 아미노산 잔기를 증가시킬 수 있다. CDC 활성을 증가시키는 아미노산 잔기 치환으로서 바람직하게는, N276K, A339T, T394F 및 T394Y에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환, N276K 및 A339T의 아미노산 잔기 치환, 그리고 K274Q, N276K, Y296F, Y300F, A339T, D356E, L358M, N384S, V397M 및 V422I의 아미노산 잔기 치환 등을 들 수 있다. 한편, CDC 활성을 감소시키는 구체적인 아미노산 잔기 치환으로서는, L235E, N297A, K322A, P329A 및 P331S 등을 들 수 있다.
또한 T250Q, M428L, M252Y, S254T 또는 T256E 등의 아미노산 잔기 치환을 인간 IgG1 서브클래스의 Fc에 도입함으로써 혈중 반감기를 연장할 수 있다. 또한 N297위에 아미노산 잔기 치환을 도입함으로써 N 결합형 당쇄를 제거한 Fc, 인간 IgG2 혹은 IgG4 서브클래스의 Fc 또는 IgG2와 IgG4의 키메라 Fc 등을 사용함으로써, ADCC 활성, ADCP 활성 및 CDC 활성 등의 세포 상해 활성을 감약 또는 결손시킬 수 있다.
3. 항체 조성물의 제조 방법
본 발명의 항체 조성물의 제조 방법은, 이하의 공정 1 내지 3을 포함하는 제조 방법을 들 수 있다.
공정 1: IgG 반량체의 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터(이하, IgG 반량체 발현용 재조합 벡터라고도 약기함)를 세포에 도입해서 형질 전환체를 얻는 공정.
공정 2: 공정 1에서 얻어진 형질 전환체를 배양하고, 배양물 중에 IgG 반량체를 축적시켜, 배양물로부터 IgG 반량체를 채취하는 공정.
공정 3: 공정 2에서 채취된 IgG 반량체를 포함하는 항체 조성물을 얻는 공정.
이하, 각 공정에 대해서 설명한다.
[공정 1]
공정 1은, 제1 및 제2 IgG 반량체의 적어도 한쪽의 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 세포에 도입해서 형질 전환체를 얻는 공정이다.
공정 (1)은, 구체적으로는, 이하의 공정 (1-1) 내지 (1-3)을 포함한다.
(1-1) 제1 IgG 반량체에서의 제1 CD16a 결합 영역에 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변을 도입하는 공정.
(1-2) 제2 IgG 반량체에서의 제2 CD16a 결합 영역에 CD16a 결합 활성을 감약시키는 개변을 도입하는 공정.
(1-3) 제1 및 제2 IgG 반량체의 힌지 도메인에 있어서 H쇄간에 있어서의 디술피드 결합이 형성되지 않도록, 힌지 도메인의 일부 또는 전부의 치환 혹은 결실, 또는 수식하는 개변을 도입하는 공정.
공정 (1-1)에 대해서는, 예를 들어 제1 IgG 반량체 발현용 재조합 벡터의 제작에 있어서, EU 인덱스에서 나타내지는 235위, 236위, 237위, 238위, 239위, 265위, 266위, 267위, 268위, 269위, 294위, 295위, 296위, 297위, 298위, 299위, 301위, 325위, 327위, 332위의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환하는 공정을, CH2 도메인의 서브클래스에 따라서 적절히 행하는 것을 들 수 있다.
공정 (1-2)에 대해서는, 예를 들어 제2 IgG 반량체 발현용 재조합 벡터의 제작에 있어서, EU 인덱스에서 나타내지는 235위, 236위, 237위, 326위, 327위, 328위, 329위, 330위의 아미노산 잔기에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환하는 공정을, CH2 도메인의 서브클래스에 따라서 적절히 행하는 것을 들 수 있다.
공정 (1-3)에 대해서는, 예를 들어 IgG 반량체 발현용 재조합 벡터의 제작에 있어서, EU 인덱스에서 나타내지는 226위 및 229위의 아미노산 잔기의 치환을 가하는 공정을, 힌지 도메인의 서브클래스에 따라서 적절히 행하는 것을 들 수 있다.
IgG 반량체는, 몰리큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰리큘러·바이올로지, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993, Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 등에 기재된 방법을 사용해서, 예를 들어 이하와 같이 형질 전환체 중에서 발현시켜서 취득할 수 있다.
(1) IgG 반량체 발현용 재조합 벡터의 구축
IgG 반량체 발현용 재조합 벡터란, 본 발명의 항체 조성물을 구성하는 IgG 반량체의 아미노산 서열을 코드하는 유전자가 조합된 동물 세포용 발현 벡터이다.
재조합 벡터는, 동물 세포용 발현 벡터에 IgG 반량체의 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
DNA는, 전체 DNA를 합성해도 되고, 폴리메라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)(PCR법)에 의한 합성도 가능하다(몰리큘러·클로닝 제2판). 또한, 이들 방법을 복수 조합함으로써, IgG 반량체를 코드하는 유전자를 제작할 수도 있다.
동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 발현 벡터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, pcDNAI, pCDM8(후나코시사 제조), pAGE107[일본 특허 공개 평3-22979호 공보; Cytotechnology, 3, 133(1990)], pAS3-3(일본 특허 공개 평2-227075호 공보), pCDM8[Nature, 329, 840(1987)], pcDNAI/Amp(인비트로젠사 제조), pcDNA3.1(인비트로젠사 제조), pREP4(인비트로젠사 제조), pAGE103[J. Biochemistry, 101, 1307(1987)], pAGE210, pME18SFL3, pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호), N5KG1val(미국 특허 제6,001,358호 명세서) 및 Tol2 트랜스포존 벡터(국제 공개 제2010/143698호) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, 사이토메갈로 바이러스(CMV)의 극초기(IE) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터, 또는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 프로모터 혹은 인핸서를 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.
발현 벡터는, 항체 H쇄 및 L쇄가 각각 별도의 벡터 상에 존재하는 타입 혹은 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(이하, 탠덤형이라고 표기함)의 어느 쪽이든 사용할 수 있다.
(2) 가변 영역을 코드하는 cDNA의 취득
임의의 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA는 다음과 같이 해서 취득할 수 있다. 임의의 항체를 산생하는 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로서 사용하여, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 삽입해서 cDNA 라이브러리를 제작한다.
상기 라이브러리로부터, 기존 항체의 정상 영역 또는 가변 영역을 코드하는 DNA를 프로브로서 사용하여, VH를 코드하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 혹은 재조합 플라스미드 및 L쇄 가변 영역을 코드하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 혹은 재조합 플라스미드 상의 목적으로 하는 항체의 VH 및 VL의 전체 염기 서열을 결정하고, 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 추정한다.
임의의 비인간 동물 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 항체가 결합하는 항원을 비인간 동물에게 면역하고, 주지의 방법[몰리큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰리큘러·바이올로지, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996]에 따라서, 면역된 동물의 항체 산생 세포와 미엘로마 세포로 하이브리도마를 제작한다. 이어서 싱글 셀 클로닝한 하이브리도마를 선택하여, 이것을 배양하고, 배양 상청으로부터 정제하여 취득할 수 있다.
비인간 동물로서는, 마우스, 래트, 햄스터 또는 토끼 등, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 것이든 사용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 조제하는 방법으로서는, 예를 들어, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법[Methods in Enzymol., 154, 3(1987)], RNeasy kit(QIAGEN사 제조), 또한 전체 RNA로부터 mRNA를 조제하는 방법으로서는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법[몰리큘러·클로닝: 어·래버러토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989] 등을 들 수 있다.
또한, 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 조제하는 키트로서는, 예를 들어 Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen사 제조), Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제조) 등을 들 수 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리 제작법으로서는, 통상의 방법(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34), 또는 시판하고 있는 키트를 사용하는 방법을 들 수 있다. 시판하고 있는 키트로서는, 예를 들어 Super Script(등록 상표) Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(GIBCO BRL사 제조) 또는 ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene사 제조)를 들 수 있다.
cDNA 라이브러리의 제작 시, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 해서 합성한 cDNA를 내장하는 벡터는, 해당 cDNA를 내장시킬 수 있는 벡터라면 어떠한 것이든 사용할 수 있다.
예를 들어, ZAP Express(Strategies, 5, 58, 1992), pBluescript II SK(+)(Nucleic Acids Research, 17, 9494, 1989), λZAP II(Stratagene사 제조), λgt10, λgt11(DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985), Lambda BlueMid(Clontech사 제조), λExCell, pT7T318U(Pharmacia사 제조), pcD2(Mol. Cell. Biol., 3, 280, 1983) 및 pUC18(Gene, 33, 103, 1985) 등을 사용할 수 있다.
파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로서는 해당 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이라면 어떠한 것이든 사용할 수 있다.
예를 들어, XL1-Blue MRF(Strategies, 5, 81, 1992), C600(Genetics, 39, 440, 1954), Y1088, Y1090(Science, 222, 778, 1983), NM522 저널·오브·몰리큘러·바이올로지(J. Mol. Biol., 166, 1, 1983), K802(J. Mol. Biol., 16, 118, 1966) 및 JM105(Gene, 38, 275, 1985) 등이 사용된다.
cDNA 라이브러리로부터의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA 클론을 선택하는 방법으로서는, 동위 원소 또는 형광 등으로 표지한 프로브를 사용한 콜로니·하이브리다이제이션법 또는 플라크·하이브리다이제이션법(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989)에 의해 선택할 수 있다.
또한, 프라이머를 조제하여, cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서, PCR(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34)에 의해 VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 조제할 수도 있다.
상기 방법에 의해 선택된 cDNA를, 적당한 제한 효소 등으로 절단 후, pBluescript II SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하여, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예를 들어 Sanger 등의 디-데옥시법(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463, 1977) 등의 반응을 행하고, 염기 서열 자동 분석 장치, 예를 들어 ABI PRISM377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용해서 분석함으로써 해당 cDNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 추정하여, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL을 완전히 포함하고 있는 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 확인할 수 있다.
또한, 항체 가변 영역의 아미노산 서열 또는 해당 가변 영역을 코드하는 DNA의 염기 서열이 이미 공지일 경우에는, 이하의 방법을 사용해서 제조할 수 있다.
아미노산 서열이 공지일 경우에는, 코돈의 사용 빈도(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)를 고려해서 해당 가변 영역을 코드하는 DNA의 염기 서열을 설계하고, 설계한 DNA의 염기 서열에 기초하여, 100 내지 150 염기 전후의 길이를 포함하는 몇 개의 합성 DNA를 합성하여, 그것들을 사용해서 PCR법을 행하거나, 완전 길이의 DNA를 합성함으로써 DNA를 얻을 수 있다. 염기 서열이 공지일 경우에는, 그 정보를 기초로 상술과 마찬가지로 하여 DNA를 얻을 수 있다.
(3) 항체의 가변 영역의 아미노산 서열 해석
분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 관해서는, 기지의 항체 VH 및 VL의 아미노산 서열(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 나아가 항체가 속하는 서브 그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 대해서도, 마찬가지의 방법으로 알아낼 수 있다.
(4) 인간화 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA의 구축
인간화 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA는, 이하와 같이 해서 구축할 수 있다. 먼저, 목적으로 하는 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR을 이식하는 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임 워크 영역(이하, FR이라고 표기함)의 아미노산 서열을 선택한다. 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열로서는, 인간 항체인 것이라면, 어떠한 것이든 사용할 수 있다.
예를 들어, Protein Data Bank 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 각 서브 그룹의 공통 아미노산 서열(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) 등을 들 수 있다.
그 중에서도, 충분한 활성을 갖는 인간화 항체를 제작하기 위해서는, 목적으로 하는 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60％ 이상)을 갖는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다.
이어서, 선택한 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열에 목적으로 하는 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하여, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에 보여지는 코돈의 사용 빈도(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)를 고려해서 DNA의 염기 서열로 변환하여, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 코드하는 DNA의 염기 서열을 설계한다. 설계한 DNA의 염기 서열을 완전 합성한다.
또한, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 배열을 도입함으로써, 상술한 3(1)에서 구축한 IgG 반량체 발현용 재조합 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다. PCR 후, 증폭 산물을 pBluescript II SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 상술한 3(2)에 기재된 방법에 의해, 염기 서열을 결정하여, 원하는 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 코드하는 DNA의 염기 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(5) 인간화 항체의 가변 영역의 아미노산 서열의 개변
인간화 항체는, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 것만으로는, 그 항원 결합 활성은 원래의 비인간 동물 항체에 비해서 저하되어버리는 것으로 알려져 있다(BIO/TECHNOLOGY, 9, 266, 1991).
이 원인으로서는, 원래의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL에서는, CDR뿐만 아니라, FR의 몇 가지의 아미노산 잔기가 직접적 혹은 간접적으로 항원 결합 활성에 관여하고 있어, 그러한 아미노산 잔기가 CDR의 이식에 수반해서, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 다른 아미노산 잔기로 변화해버리는 것이 생각되고 있다.
이 문제를 해결하기 위해서, 인간화 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기 또는 CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용시켜서, 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하고, 그것들을 원래의 비인간 동물 항체에서 유래되는 아미노산 잔기로 개변하여, 저하된 항원 결합 활성을 상승시키는 것이 행하여지고 있다(BIO/TECHNOLOGY, 9, 266, 1991).
인간화 항체의 제작에 있어서는, 그러한 항원 결합 활성에 관련된 FR의 아미노산 잔기를 어떻게 효율적으로 동정할지가 가장 중요한 점이며, 그 때문에 X선 결정 해석(J. Mol. Biol., 112, 535, 1977) 혹은 컴퓨터 모델링(Protein Engineering, 7, 1501, 1994) 등에 의한 항체의 입체 구조의 구축 및 해석이 행하여지고 있다.
이들 항체의 입체 구조의 정보는, 인간화 항체의 제작에 많은 유익한 정보를 가져 왔다. 그러나, 모든 항체에 적응 가능한 인간화 항체의 제작법은 아직 확립되어 있지 않다. 현 상황에서는 각각의 항체에 대해서 수종의 개변체를 제작하여, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 등의 다양한 시행 착오가 필요하다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기의 개변은, 개변용 합성 DNA를 사용해서 3(4)에 기재된 PCR법을 행함으로써 달성할 수 있다. PCR 후의 증폭 산물에 대해서 3(2)에 기재된 방법에 의해, 염기 서열을 결정하고, 목적으로 하는 개변이 실시된 것을 확인한다.
(6) IgG 반량체의 발현
상술한 3(1)의 IgG 반량체 발현용 재조합 벡터를 적당한 동물 세포에 도입함으로써 일과성 또는 안정적으로 제1 및 제2 IgG 반량체의 적어도 한쪽을 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
(6-a) 항체 조성물의 일과성 발현
(3) 및 (6)에서 얻어지는 IgG 반량체 발현용 재조합 벡터, 또는 그것들을 개변한 재조합 벡터를 사용해서 항체 조성물의 일과성 발현을 행하여, 제작한 다종류의 항체 조성물의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가할 수 있다.
IgG 반량체 발현용 재조합 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 제1 및 제2 IgG 반량체의 적어도 한쪽을 발현할 수 있는 숙주 세포라면, 어떠한 세포라도 사용할 수 있다. 예를 들어, COS-7 세포[American Type Culture Collection(ATCC) 번호: CRL1651]를 들 수 있다(Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283, 1991).
COS-7 세포에의 IgG 반량체 발현용 재조합 벡터의 도입에는, DEAE-덱스트란법(Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 1991), 또는 리포펙션법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413, 1987) 등을 사용한다.
IgG 반량체 발현용 재조합 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 IgG 반량체의 발현량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third Edition, Academic Press(1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988); 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등을 사용하여 측정한다.
(6-b) IgG 반량체의 안정 발현
(1)에서 얻어진 IgG 반량체 발현용 재조합 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써 IgG 반량체를 안정적으로 발현하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
숙주 세포에의 재조합 벡터의 도입에는, 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이라면 모두 사용할 수 있는데, 예를 들어, 일렉트로포레이션법(Cytotechnology, 3, 133, 1990), 인산칼슘법(일본 특허 공개 평2-227075호 공보), 리포펙션법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 7413, 1987), 인젝션법[매니퓰레이팅·더 마우스·엠브리오·어·래버러토리·매뉴얼], 파티클 건(유전자 총)을 사용하는 방법(일본 특허 제2606856호 명세서, 일본 특허 제2517813호 명세서), DEAE-덱스트란법[바이오매뉴얼 시리즈 4-유전자 도입과 발현·해석법(요도샤) 요코타 다카시·아라이 겐이치 편(1994)], 바이러스 벡터법(매니퓰레이팅·마우스·엠브리오 제2판) 등을 들 수 있다.
재조합 벡터를 도입하는 숙주 세포로서는, 제1 및 제2 IgG 반량체의 적어도 한쪽을 발현시킬 수 있는 숙주 세포라면, 어떠한 세포라도 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 백혈병 세포 나마르바(Namalwa) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈·햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637(일본 특허 공개 소63-299호 공보), 래트 미엘로마 세포, 마우스 미엘로마 세포, 시리안 햄스터 신장 유래 세포, 배아 줄기 세포, 수정란 세포 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어 PER. C6, CHO-K1(ATCC CCL-61), DUKXB11(ATCC CCL-9096), Pro-5(ATCC CCL-1781), CHO-S(Life Technologies, Cat #11619), Lec 13 세포, 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20(ATCC 번호: CRL1662, 또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NS0, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14(ATCC 번호: CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8. 653 세포(ATCC 번호: CRL1580), 디히드로 엽산 환원 효소 유전자(Dihydroforate Reductase, 이하, dhfr이라고 표기함)가 결손된 CHO 세포(CHO/DG44)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)], 시리안 햄스터 세포 BHK, HBT563 세포, 상술 세포주의 아주 세포 및 상술 세포주를 무혈청 배양 하에서 순화한 세포, 비접착 조건 하의 배양 조건에서 순화한 세포 등을 들 수 있다.
IgG 반량체의 생산에 사용하는 세포로서는, Fc에서의 EU 인덱스 297의 Asn에 결합하는 당쇄의 코어 푸코오스양을 저하 또는 결손시키는 세포를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, GDP-L-푸코오스의 합성 또는 골지체에의 수송에 관여하는 효소 또는 코어 푸코오스의 결합에 관여하는 효소가 저하 또는 결손된 세포를 선택하거나, 또는 다양한 인위적 방법에 의해 얻어진 세포를 숙주 세포로서 사용할 수도 있다.
구체적으로는, 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관련하는 효소 활성을 감소 또는 결손시키는 방법, 또는 코어 푸코오스 절단 효소 활성을 증가시키는 방법 등, 코어 푸코오스를 제어한 세포를 제작할 수 있다.
코어 푸코오스 당쇄 수식에 관련하는 효소로서는, 예를 들어 GDP-L-푸코오스의 합성 혹은 수송에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 코어 푸코오스의 결합에 관여하는 효소를 들 수 있다.
GDP-L-푸코오스의 합성 또는 골지체에의 수송에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는 예를 들어, GDP-만노오스 4,6-데히드라타제(이하, GMD라고 표기함), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피메라제(이하, Fx라고 표기함), GDP-베타-L-푸코오스-피로포스포릴라아제(GFPP), 푸코키나제, GDP-L-푸코오스 트랜스포터 등을 들 수 있다.
코어 푸코오스의 결합에 관여하는 효소로서는, 예를 들어 α1,6-푸코실트랜스퍼라제(이하, FUT8이라고 표기함) 등을 들 수 있다.
IgG 반량체를 생산하는 세포로서는, 상술한 1개의 효소 활성을 저하 또는 결손시켜도 되고, 복수의 효소 활성을 조합해서 저하 또는 결손시켜도 되며, 어느 것이어도 된다.
상술한 효소 활성을 저하 또는 결손시키는 방법으로서는, 예를 들어, (a) 효소의 유전자를 표적으로 한 유전자 파괴 방법; (b) 효소의 유전자 도미넌트 네거티브체를 도입하는 방법; (c) 효소에 관한 돌연변이를 도입하는 방법; (d) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 방법; (e) N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위와 푸코오스의 1위가 α 결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 방법 등을 들 수 있다.
렉틴으로서는, 예를 들어 렌즈콩 렉틴 LCA(렌즈콩(Lens Culinaris) 유래의 렌틸 아글루티닌(Lentil Agglutinin)), 완두콩 렉틴 PSA(완두콩(Pisum sativum) 유래의 완두콩 렉틴(Pea Lectin)), 누에콩 렉틴 VFA(누에콩(Vicia faba) 유래의 아글루티닌), 들주발버섯 렉틴 AAL(들주발버섯(Aleuria aurantia) 유래의 렉틴) 등의 α1,6 푸코오스에 결합하는 렉틴을 들 수 있다.
구체적인 세포로서는, 예를 들어 FUT8 유전자가 결손된 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제2002/31140호, 국제 공개 제2000/061739호), 렉틴 내성을 획득한 Lec13(Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55, 1986), GDP-푸코오스 트랜스포터 유전자가 결손된 세포(국제 공개 제2003/085102호), GDP-mannose 4,6-dehydratase(GMD) 유전자가 결손된 세포(국제 공개 제2002/31140호), WGA 렉틴 내성 세포 및 LCA 렉틴 내성 세포(국제 공개 제2002/31140호) 등을 들 수 있다.
상술한 방법 이외에, N 결합형 당쇄의 합성계에 관한 효소인 만노시다아제(mannosidase) I, 만노시다아제 II 등의 효소를 저해함으로써, 하이 만노오스형의 N 결합형 당쇄가 결합하여, 코어 푸코오스양이 감소한 IgG 반량체를 발현시킬 수도 있다.
또한, N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라아제(N-acetylglucosamine transferase) III(GnTIII)을 과잉 발현시킨 숙주 세포를 사용함으로써, bisecting GlcNAc가 결합한 컴플렉스 및 하이브리드 당쇄가 결합하고, 또한 코어 푸코오스양이 감소한 IgG 반량체를 생산할 수도 있다.
재조합 벡터의 도입 후, IgG 반량체를 안정적으로 발현하는 형질 전환체는, G418 황산염(이하, G418이라고 표기함), 시클로헥시미드(이하, CHX라고 약기함), 메토트렉세이트(이하, MTX라고 약기함) 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 선택한다(일본 특허 공개 평2-257891호 공보).
동물 세포 배양용 배지로서는, 예를 들어 RPMI1640 배지(인비트로젠사 제조), GIT 배지(니혼 세이야쿠사 제조), EX-CELL301 배지, EX-CELL302, EX-CELL325 배지(JRH사 제조), IMDM 배지(인비트로젠사 제조), Hybridoma-SFM 배지(인비트로젠사 제조), 또는 이들 배지에 소 태아 혈청(이하, FBS라고 약기함) 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 들 수 있다.
얻어진 형질 전환체를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 IgG 반량체를 발현시켜서 축적시킨다. 배양 상청 중의 IgG 반량체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA법 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, dhfr 유전자 증폭계(일본 특허 공개 평2-257891호 공보) 등을 이용하여, 형질 전환체가 산생하는 IgG 반량체의 발현량을 향상시킬 수 있다.
이상, 동물 세포를 숙주로 한 IgG 반량체의 발현 방법을 나타냈지만, 효모, 곤충 세포, 식물 세포 또는 동물 개체 혹은 식물 개체에 있어서도, 공지 기술에 기초하여 동물 세포와 마찬가지의 방법에 의해 IgG 반량체를 발현시킬 수 있다.
효모를 숙주 세포로 할 경우는, 사카로미세스속, 스키조사카로미세스속, 클루이베로미세스속, 트리코스포론속, 쉬와니오미세스속 등에 속하는 미생물, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀룰란스(Trichosporon pullulans), 쉬반니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius) 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이라면 모두 사용할 수 있는데, 예를 들어, 일렉트로포레이션법(Methods. Enzymol., 194, 182, 1990), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 84, 1929, 1978), 아세트산리튬법(J. Bacteriology, 153, 163, 1983; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 75, 1929, 1978)에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 예를 들어 커런트·프로토콜즈·인·몰리큘러·바이올로지(Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York, 1992), Bio/Technology, 6, 47, 1988 등에 기재된 방법에 의해 IgG 반량체를 발현할 수 있다.
[공정 2]
공정 2는, 공정 1에서 얻어진 형질 전환체를 배양하고, 배양물 중에 IgG 반량체를 생성·축적시켜, 배양물로부터 IgG 반량체를 채취하여 정제하는 공정이다.
제1 및 제2 IgG 반량체는 동일한 형질 전환체로부터 채취해도 되고, 각각을 단독으로 발현하는 형질 전환체로부터 채취해도 된다. 통상적으로는 제1 및 제2 IgG 반량체는, 각각을 단독으로 발현하는 형질 전환체로부터 채취, 정제 후에 혼합해서 항체 조성물을 조제한다.
공정 1에서 조제한 숙주 세포가 IgG 반량체를 발현하는 능력을 갖는 경우에는, 이하에 나타내는 숙주 세포에 IgG 반량체를 도입한 후에, 해당 세포를 배양하고, 해당 배양물로부터 목적으로 하는 IgG 반량체를 채취할 수 있다.
또한, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써, 유전자가 도입된 동물 개체(트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물 개체(트랜스제닉 식물)를 조성하여, 이들 개체를 사용해서 IgG 반량체를 채취해도 된다.
형질 전환체가 동물 개체 또는 식물 개체의 경우는, 통상의 방법에 따라서 사육 또는 재배하고, IgG 반량체를 생성 축적시켜, 해당 동물 개체 또는 식물 개체로부터 해당 IgG 반량체를 채취할 수 있다.
동물 개체를 사용해서 IgG 반량체를 생산시키는 방법으로서는, 예를 들어, 공지의 방법(American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S, 1996; American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S, 1996; Bio/Technology, 9, 830, 1991)에 준해서 유전자를 도입하여 조성한 동물 중에 목적으로 하는 IgG 반량체를 생산시키는 방법을 들 수 있다.
동물 개체의 경우는, 예를 들어 IgG 반량체를 코드하는 DNA를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물을 사육하여, IgG 반량체를 해당 동물 중에 생성, 축적시켜, 해당 동물 중으로부터 IgG 반량체를 채취할 수 있다.
상기 동물 중의 생성 및 축적 장소로서는, 예를 들어 해당 동물의 젖(일본 특허 공개 소63-309192호 공보) 또는 알 등을 들 수 있다. 이때 사용되는 프로모터로서는, 동물에서 발현할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, 유선 세포 특이적인 프로모터인 α카제인 프로모터, β카제인 프로모터, β락토글로불린 프로모터 및 훼이 산성 프로틴 프로모터 등이 적합하게 사용된다.
식물 개체를 사용해서 IgG 반량체를 생산시키는 방법으로서는, 예를 들어 IgG 반량체를 코드하는 DNA를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지의 방법[조직 배양, 20(1994); 조직 배양, 21(1995); Trends in Biotechnology, 15, 45(1997)]에 준해서 재배하고, IgG 반량체를 해당 식물 중에 생성, 축적시켜, 해당 식물 중으로부터 해당 IgG 반량체를 채취하는 방법을 들 수 있다.
IgG 반량체는 이하와 같이 해서 정제할 수 있다. IgG 반량체를 코드하는 유전자를 도입한 형질 전환체에 의해 제조된 IgG 반량체는, 예를 들어 IgG 반량체가, 세포 내에 가용성 단백질로서 발현했을 경우에는, 배양 종료 후, 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤 가울린 호모게나이저, 다이노 밀 등에 의해 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다.
상기 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 효소의 단리 정제법, 즉, 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(미쓰비시 케미컬사 제조) 등 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(Pharmacia사) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸 세파로스, 페닐 세파로스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 친화 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 방법을 단독 혹은 조합해서 사용하여, IgG 반량체를 정제할 수 있다.
본 발명에서는, 친화 크로마토그래피로서, CH 결합체 또는 Fc 결합체를 사용한 친화 크로마토그래피가 사용된다(Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third Edition, Academic Press, 1996; Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
또한, IgG 반량체가 세포 내에 불용체를 형성해서 발현했을 경우는, 마찬가지로 세포를 회수 후 파쇄하여, 원심 분리를 행함으로써, 침전 획분으로서 IgG 반량체의 불용체를 회수한다. 회수한 IgG 반량체의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 해당 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 해당 IgG 반량체를 정상적인 입체 구조로 되돌린 후, 상기와 마찬가지의 단리 정제법에 의해 해당 IgG 반량체를 정제할 수 있다.
IgG 반량체가 세포 밖으로 분비되었을 경우에는, 배양 상청에 해당 IgG 반량체 또는 그의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 해당 배양물을 상기와 마찬가지의 원심 분리 등의 방법에 의해 처리함으로써 배양 상청을 취득하고, 해당 배양 상청으로부터, 상기와 마찬가지의 단리 정제법을 사용함으로써 IgG 반량체를 정제할 수 있다.
CH 결합체 또는 Fc 결합체로서, 구체적으로는, CH 또는 Fc에 결합하는 것이라면 단백질, 수지 등 어떠한 것이어도 되며, 예를 들어 Fc 결합 단백질, 항체 H쇄 정상 영역(CH)에 결합하는 항체 등을 들 수 있다.
Fc 결합 단백질로서, 예를 들어 황색 포도구균(Staphylococcus Aureus) 유래 단백질 A, 용혈성 연쇄상구균(hemolytic Streptococcus) 유래 단백질 G, Fc 수용체 및 해당 서브 클래스(FcγRI, IIA, IIB, IIIA, IIIB) 그리고 이들의 결합 부분 단편 등을 들 수 있다.
CH에 결합하는 항체로서는, 예를 들어 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인에 결합하는 항체를 들 수 있다.
본 발명에서 CH 결합체로서 보다 바람직하게는, 단백질 A, 단백질 G, 항CH1 항체 및 해당 결합 부분 단편을 들 수 있다.
IgG 반량체의 정제 방법으로서, 예를 들어 [공정 1] (6)에서 상술한 형질 전환체를 사용해서 배양한 배양 상청을, 단백질 A 칼럼 또는 단백질 G 칼럼에 로드한 후, 해당 칼럼을 인산 버퍼(phosphase buffer saline, 이하, PBS라고 약기함)를 사용해서 세정한다.
그 후, 저pH(pH2.0 내지 6.0)의 시트르산 버퍼 등으로 칼럼으로부터 IgG 반량체를 용출시키고, 용출액을 알칼리성 Tris 버퍼 등으로 중화한다. 중화된 용출액은 충분량의 PBS 등으로 투석을 행하여, 정제된 IgG 반량체를 취득할 수 있다.
정제한 IgG 반량체의 분자량은, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법[Nature, 227, 680(1970)], 또는 웨스턴 블로팅법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third Edition, Academic Press(1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등을 사용하여 측정할 수 있다.
[공정 3]
공정 3은, 공정 2에서 채취, 정제된, 제1 및 제2 IgG 반량체를 혼합하여, 항체 조성물을 얻는 공정이다. 제1 및 제2 IgG 반량체의 혼합 비율은, 항원에 대한 결합 활성, 항원 양성 배양 세포주에 대한 결합 활성, 각각의 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성의 강도, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 CH3간의 상호 작용 등에 따라 적절히 설정하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 항체 조성물은, 상기 제1 및 제2 IgG 반량체 발현용 재조합 벡터를 숙주 세포에 동시에 발현시켜 정제함으로써, 제1 및 제2 IgG 반량체가 혼합된 항체 조성물로서 제작할 수도 있다. 이 경우, 제1 및 제2 IgG 반량체의 혼합 비율은, 각 반량체를 코드하는 유전자의 발현량을 제어함으로써 원하는 혼합비의 항체 조성물을 제조할 수 있다. 또한, 제1 및 제2 IgG 반량체를 코드하는 유전자는, 동일한 발현용 재조합 벡터로 발현시켜도 되고, 각각 별도의 발현용 재조합 벡터로 각각 발현시켜도 된다.
4. 항체 조성물의 활성 평가
정제한 IgG 반량체의 단백질량, IgG 반량체로 구성되는 항체 조성물의 FcR 결합 활성, C1q 결합 활성, 항원 결합 활성, 또는 ADCC 활성 혹은 CDC 활성 등의 세포 상해 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, Molecular Cloning 2nd Eidition, Current Protocoals in Molecular BioloGy; Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 등에 기재된 공지의 방법을 들 수 있다.
구체적인 예로서는, 항체 조성물의, 항원과의 결합 활성, 항원 양성 배양 세포주에 대한 결합 활성은 ELISA법 및 형광 항체법(Cancer Immunol. Immunother, 36, 373, 1993) 등에 의해 측정할 수 있다. 항원 양성 배양 세포주에 대한 세포 상해 활성은, CDC 활성, ADCC 활성 등을 측정함으로써 평가할 수 있다(Cancer Immunol. Immunother, 36, 373, 1993; 미국 특허 출원 공개 제2004/0259150호 명세서).
항체 조성물이 CD16a에의 결합 활성을 갖는 것은, 유전자 재조합 CD16a 단백질을 제작하여, 결합 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다(미국 특허 출원 공개 제2004/0259150호 명세서).
ADCC 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, 방사성 동위체, 형광 물질 또는 색소 등으로 표지된 표적 세포, 항체 조성물 및 이펙터 세포를 접촉시킨 후, 상해된 표적 세포로부터 유리되는 표지 물질의 활성 또는 유리하는 효소의 생리 활성 등을 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
CDC 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, 방사성 동위체, 형광 물질 또는 색소 등으로 표지된 표적 세포, 항체 조성물 및 보체 성분을 포함하는 혈청 등의 생체 시료를 접촉시킨 후, 상해된 표적 세포로부터 유리되는 표지 물질의 활성 또는 유리하는 효소의 생리 활성을 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
5. 당쇄 구조의 분석
각종 세포에서 발현시킨 IgG 반량체의 당쇄 구조는, 통상의 당단백질의 당쇄 구조의 해석에 준해서 행할 수 있다.
예를 들어, IgG 반량체에 결합하고 있는 당쇄는 갈락토오스(Gal), 만노오스(Man) 혹은 푸코오스(Fuc) 등의 중성 당, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 등의 아미노당 또는 시알산(Sial) 등의 산성 당으로 구성되어 있으며, 당 조성 분석 및 2차원 당쇄 맵법 등을 사용한 당쇄 구조 해석 등의 방법을 사용해서 행할 수 있다.
(1) 중성 당·아미노당 조성 분석
IgG 반량체의 당쇄의 조성 분석은, 트리플루오로아세트산 등으로 당쇄의 산 가수 분해를 행함으로써, 중성 당 또는 아미노당을 유리하여, 그 조성비를 분석할 수 있다.
구체적인 방법으로서, 예를 들어 Dionex사 제조 당 조성 분석 장치를 사용하는 방법을 들 수 있다. BioLC는 HPAEC-PAD(high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection)법(J. Liq. Chromatogr., 6, 1577, 1983)에 의해 당 조성을 분석하는 장치이다.
또한, 2-아미노피리딘에 의한 형광 표지화법으로도 조성비를 분석할 수 있다. 구체적으로는, 공지의 방법[Agric. Biol. Chem., 55(1), 283-284, 1991]에 따라서 산 가수 분해한 시료를 2-아미노피리딜화로 형광 라벨화하여, HPLC 분석해서 조성비를 산출할 수 있다.
(2) 당쇄 구조 해석
IgG 반량체에서의 당쇄의 구조 해석은, 2차원 당쇄 맵법(Anal. Biochem., 171, 73, 1988; 생물화학 실험법 23-당단백질 당쇄 연구법, 학회 출판 센터, 다카하시 레이코 편, 1989년)에 의해 행할 수 있다. 2차원 당쇄 맵법은, 예를 들어 X축에는 역상 크로마토그래피에 의한 당쇄의 유지 시간 또는 용출 위치를, Y축에는 순상 크로마토그래피에 의한 당쇄의 유지 시간 또는 용출 위치를 각각 플롯하여, 기지 당쇄의 그것들의 결과와 비교함으로써 당쇄 구조를 추정하는 방법이다.
구체적으로는, IgG 반량체를 히드라진 분해하여, IgG 반량체로부터 당쇄를 유리하고, 2-아미노피리딘(이하, PA라고 약기함)에 의한 당쇄의 형광 표지(J. Biochem., 95, 197, 1984)를 행한 후, 겔 여과에 의해 당쇄를 과잉의 PA화 시약 등과 분리하여, 역상 크로마토그래피를 행한다. 이어서, 분취한 당쇄의 각 피크에 대해서 순상 크로마토그래피를 행한다. 이들의 결과를 바탕으로, 2차원 당쇄 맵 상에 플롯하여, 당쇄 스탠다드(TaKaRa사 제조), 문헌(Anal. Biochem., 171, 73, 1988)과의 스폿의 비교로부터 당쇄 구조를 추정할 수 있다.
또한 각 당쇄의 MALDI-TOF-MS 등의 질량 분석을 행하여, 2차원 당쇄 맵법에 의해 추정되는 구조를 확인할 수 있다.
IgG 반량체의 Fc의 어느 부분에 당쇄가 결합하고 있는지, 환원 알킬화 처리한 IgG 반량체를 트립신, 펩신, Lys-C, Asp-N 등의 엔도프로테아제로 처리한 것을, 역상 크로마토그래피(LC)로 분리한 후에, 질량 분석계(MS) 등으로 분석함으로써 확인할 수 있다.
즉, 목적으로 하는 IgG 반량체의 Fc의 아미노산 서열에 기초하여, 프로테아제 처리에 의해 생성할 수 있는 펩티드의 분자량 및 당쇄가 결합한 펩티드의 분자량과, MS의 분석값이 일치하는지 여부에 의해, 실제로 당쇄가 결합하고 있는지 여부를 확인할 수 있다.
6. 당쇄 구조의 식별 방법
IgG 반량체에서의 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 코어 푸코오스가 없는 당쇄의 비율은, 상기 5.에 기재된 당쇄 구조의 분석법을 사용함으로써 식별할 수 있다. 또한, 렉틴을 사용한 면역학적 정량 방법을 사용함으로써도 식별할 수 있다.
렉틴을 사용한 면역학적 정량 방법을 사용한 IgG 반량체에서의 당쇄 구조의 식별은, 문헌 [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., (1995); 효소 면역 측정법, 제3판, 이가쿠쇼인(1987); 개정판, 효소 항체법, 가쿠사이 키카쿠(1985)] 등에 기재된 웨스턴 염색, RIA(방사 면역 검정), VIA(바이로 면역 검정), EIA(효소 면역 검정), FIA(형광 면역 검정), MIA(메탈로 면역 검정) 등의 면역학적 정량 방법에 준해서, 예를 들어 이하와 같이 행할 수 있다.
IgG 반량체의 당쇄 구조를 인식하는 렉틴을 표지하고, 표지한 렉틴과 시료인 항체 조성물을 반응시킨다. 이어서, 표지한 렉틴과 항체 조성물의 복합체의 양을 측정한다.
IgG 반량체의 당쇄 구조의 식별에 사용되는 렉틴으로서는, 예를 들어 WGA(T. 불가리스(vulgaris) 유래의 소맥배아 아글루티닌(wheat-germ agglutinin)), ConA(C. 엔시포미스(ensiformis) 유래의 콘카나발린(concanavalin) A), RIC(R. 커뮤니스(communis) 유래의 독소), L-PHA(P. 불가리스 유래의 백혈구 아글루티닌(leukoagglutinin)), LCA(렌즈콩 유래의 렌틸 아글루티닌), PSA(완두콩 유래의 완두콩 렉틴), AAL(들주발버섯 렉틴), ACL(줄맨드라미 렉틴(Amaranthus caudatus Lectin)), BPL(보히니아 퓨퓨리어 렉틴(Bauhinia purpurea Lectin)), DSL(독말풀 렉틴(Datura stramonium Lectin)), DBA(돌리코스 비플로루스 아글루티닌(Dolichos biflorus Agglutinin)), EBL(딱총나무 발크 렉틴(Elderberry Balk Lectin)), ECL(에리스리나 크리스타갈리 렉틴(Erythrina cristagalli Lectin)), EEL(화살나무 렉틴(Euonymus europaeus Lectin)), GNL(갈란투스 니발리스 렉틴(Galanthus nivalis Lectin)), GSL(그리포니아 심플리시폴리아 렉틴(Griffonia simplicifolia Lectin)), HPA(헬릭스 포마티아 아글루티닌(Helix pomatia Agglutinin)), HHL(히파스트럼 하이브리드 렉틴(Hippeastrum Hybrid Lectin)), 자칼린(Jacalin), LTL(로투스 테트라고놀로부스 렉틴(Lotus tetragonolobus Lectin)), LEL(토마토 렉틴(Lycopersicon esculentum Lectin)), MAL(다릅나무 렉틴(Maackia amurensis Lectin)), MPL(오세이지 오렌지 렉틴(Maclura pomifera Lectin)), NPL(나팔 수선화 렉틴(Narcissus pseudonarcissus Lectin)), PNA(땅콩 아글루티닌(Peanut Agglutinin)), E-PHA(강낭콩 에리트로아글루티닌(Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin)), PTL(프소포카르푸스 테트라고놀로부스 렉틴(Psophocarpus tetragonolobus Lectin)), RCA(피마자 아글루티닌(Ricinus communis Agglutinin)), STL(감자 렉틴(Solanum tuberosum Lectin)), SJA(회화나무 아글루티닌(Sophora japonica Agglutinin)), SBA(콩 아글루티닌(Soybean Agglutinin)), UEA(울렉스 유로페우스 아글루티닌(Ulex europaeus Agglutinin)), VVL(비시아 빌로사 렉틴(Vicia villosa Lectin)), WFA(등나무 아글루티닌(Wisteria floribunda Agglutinin))를 들 수 있다.
코어 푸코오스를 특이적으로 인식하는 렉틴을 사용하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 예를 들어 렌즈콩 렉틴 LCA(렌즈콩 유래의 렌틸 아글루티닌), 완두콩 렉틴 PSA(완두콩 유래의 완두콩 렉틴), 누에콩 렉틴VFA(누에콩 유래의 아글루티닌) 및 들주발버섯 렉틴 AAL(들주발버섯 유래의 렉틴)을 들 수 있다.
7. 본 발명의 항체 조성물의 사용
본 발명의 항체 조성물은, 서로 다른 항원에 대한 항원 결합 도메인을 갖는 제1 및 제2 IgG 반량체로 구성됨으로써, 서로 다른 2종의 항원을 인식할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물은, 다른 2종류의 표적으로 하는 항원에 맞춘 분자 형체를 취할 수 있기 때문에, 해당 2종류의 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포에 대하여 높은 특이성을 발휘할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물을 의약 조성물에 사용하는 경우에는, 이하에 나타내는 [1] 내지 [3]의 성질을 구비하는 것이 바람직하다. 이하에 나타내는 [1] 내지 [3]의 성질은, 본 발명에서의 우수한 항체 조성물을 선발하기 위한 지표가 될 수 있다.
[1] 양쪽 양성 세포에 대한 높은 특이성
[2] 증강된 이펙터 기능
[3] 야생형 IgG 항체와 동등한 혈중 반감기
이하, 각 성질에 대해서 설명한다.
[1] 양쪽 양성 세포에 대한 높은 특이성
단일 양성 세포와 비교해서 양쪽 양성 세포에 대한 높은 특이성을 갖는 본 발명의 항체 조성물은, 예를 들어 이하의 공정 (1a) 내지 (1d)를 포함하는 방법에 의해 선발할 수 있다.
(1a) 힌지 영역에서의 H쇄간의 디술피드 결합을 결손시키는 아미노산 개변, 제1 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 아미노산 개변, 및 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 아미노산 개변을 각각 도입한 제1 IgG 반량체를 제작한다.
(1b) (1a)와 마찬가지로 하여, 힌지 영역에서의 H쇄간의 디술피드 결합을 결손시키는 아미노산 개변, 제2 CD16a 결합 영역에서의 CD16a 결합 활성을 감약시키는 아미노산 개변, 및 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 아미노산 개변을 각각 도입한 제2 IgG 반량체를 제작한다.
(1c) 제1 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포, 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포 및 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포를 준비한다.
각 세포의 항원 발현량을 조절한 세포를 사용하기 위해서, 각 항원의 트랜스펙턴트를 조제해도 된다. 각 세포에 대하여, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 혼합한 항체 조성물의 이펙터 기능을 평가한다.
(1d) (1c)에 의해 평가한 결과에 기초하여, 각 단일 양성 세포에의 이펙터 기능과 비교해서, 양쪽 양성 세포에의 이펙터 기능이 강한 항체 조성물을 선택함으로써, 단일 양성 세포와 비교해서 양쪽 양성 세포에 대한 높은 특이성을 갖는 항체 조성물을 취득한다.
구체적인 방법으로서는, 예를 들어, [실시예 3]에서 후술하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 이펙터 기능이 ADCC 활성일 경우, 이하와 같이 해서 각 단일 양성 세포에의 이펙터 기능과 비교하여, 양쪽 양성 세포에의 이펙터 기능이 강한 항체 조성물을 선택함으로써, 단일 양성 세포와 비교해서 양쪽 양성 세포에 대한 높은 특이성을 갖는 항체 조성물을 취득할 수 있다.
1-i) 표적 세포로서, 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포, 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포와, 제1 항원 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포를 사용한다. 플로 사이토미터를 사용하여, 각 세포에서의 제1 항원 및 제2 항원의 발현량을 측정하여, 목적으로 하는 항원이 세포에 발현하고 있는 것을 확인한다.
1-ii) 이펙터 세포로서 인간 말초혈 단핵구(PBMC) 혹은 인간 CD16a를 코드하는 유전자를 도입해서 안정적으로 발현시킨 인간 CD16a 발현 세포주와, 표적 세포를, 배지(예를 들어, RPMI 배지)를 사용해서 조제한다.
1-iii) CO2 인큐베이터에서 2 내지 6시간 정도 정치한다. 병행해서 100％ 반응 웰에 가용화 용액(예를 들어, 산, 알칼리, 계면 활성제 등을 포함하는 수용액)을 첨가하여, 표적 세포를 완전히 용해한다. 반응 용기를 원심 분리 후, 상청을 채취해서 ELISA 플레이트에 분주한다. 발색 용액을 어플라이해서 반응시킨 후, 정지 용액을 첨가하여, 플레이트 리더로 흡광도(A450)를 측정한다.
1-iv) 이하의 식을 사용해서 ADCC 활성(％)을 산출한다.
ADCC 활성(％)=100×(S-E-T)/(Max-T)
S=샘플 반응 웰 흡광도-배지 웰 흡광도
E=이펙터 웰 흡광도-배지 웰 흡광도
T=표적 웰 흡광도-배지 웰 흡광도
Max=100％ 반응 웰-100％ 반응 대조 웰
1-vi) 양성 대조의 항체로서, 통상 IgG1형의 제1 항원에 대한 항체 및 제2 항원에 대한 항체를 사용한다. 통상 IgG1형의 제1 항원에 대한 항체가 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포에 대하여, 통상 IgG1형의 제2 항원에 대한 항체가 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포에 대하여, 각각 ADCC 활성을 발휘하는 것을 확인한다.
한편, 제1 항원에 대한 항체의 반량체와 제2 항원에 대한 항체의 반량체를 혼합한 항체 용액이, 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포 및 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포에 대해서는 ADCC 활성을 나타내지 않고, 제1 항원 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포에 대해서만 특이적으로 ADCC 활성을 발휘할 경우, 각 단일 양성 세포에의 이펙터 기능과 비교하여, 양쪽 양성 세포에의 이펙터 기능이 강한 항체 조성물이라고 평가한다.
「제1 항원에 대한 항체의 반량체와 제2 항원에 대한 항체의 반량체를 혼합한 항체 용액이, 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포 및 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포에 대해서는 ADCC 활성을 나타내지 않고, 제1 항원 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포에 대해서만 특이적으로 ADCC 활성을 발휘하는」 것의 일 양태로서는, 예를 들어 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포 및 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포에 대한 ADCC 활성이 음성 대조에 있어서의 ADCC 활성과 동등 정도이고, 또한 제1 항원 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포에 대한 ADCC 활성이 양성 대조와 동등 정도인 경우를 들 수 있다. 다른 양태로서는, 예를 들어 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포 및 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포에 대한 ADCC 활성이 양성 대조에 있어서의 ADCC 활성보다 감약하고 있고, 또한 제1 항원 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포에 대한 ADCC 활성이 양성 대조와 동등 정도인 경우를 들 수 있다.
여기서, ADCC 활성이 동등 정도란, 대상의 ADCC 활성에 대하여, 바람직하게는 ±0 내지 50％, 보다 바람직하게는 ±0 내지 30％의 범위 내인 것을 말하며, ADCC 활성이 감약하고 있다란, 대상의 ADCC 활성에 대하여, 바람직하게는 0 내지 60％, 보다 바람직하게는 0 내지 30％의 범위 내인 것을 말한다.
본 평가 시의 음성 대조로서, 제1 항원에 대한 항체 및 제2 항원에 대한 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 제1 항원에 대한 항체는, 양쪽 양성 세포 및 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포에 대한 이펙터 기능을 나타내고, 제2 항원에 대한 항체는, 양쪽 양성 세포 및 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포에 대한 이펙터 기능을 나타낸다.
또한, 각 항원 발현 세포 대신에 각 항원을 고정한 비즈 등을 평가에 사용할 수 있다. 예를 들어, 제1 항원 및 제2 항원을 고정한 양쪽 양성 비즈, 제1 항원만을 고정한 단일 양성 비즈 및 제2 항원만을 고정한 단일 양성 비즈를 준비한다. 각 비즈에 대하여 본 발명의 항체 조성물을 첨가한 후에, 또한 재조합 CD16a 단백질을 첨가한다. 그 후, 양쪽 양성 비즈와 2개의 단일 양성 비즈 상에 결합한 항체 조성물에 대한 재조합 CD16a 단백질의 결합 활성을 조사함으로써, 목적으로 하는 양쪽 항원에의 높은 선택성을 갖는 항체 조성물을 선발할 수 있다. 재조합 CD16a 단백질과의 상호 작용을 측정하는 방법으로서는, 바인딩 ELISA법, 표면 플라스몬 공명법 등을 사용할 수 있다.
[2] 증강된 이펙터 기능
증강된 이펙터 기능을 갖는 본 발명의 항체 조성물은, 예를 들어 이하의 공정 (2a) 내지 (2c)를 포함하는 방법에 의해 선발할 수 있다.
(2a) 상기 [1]에 기재된 방법으로 선발한, 단일 양성 세포와 비교해서 양쪽 양성 세포에 대한 높은 특이성을 갖는 항체 조성물의 이펙터 기능을 증강한다.
상기 [1]에 기재된 방법으로 선발한 양쪽 양성 세포에의 높은 특이성을 갖는 본 발명의 항체 조성물의 이펙터 기능을 증강하는 수단으로서는, 예를 들어 CD16a 결합 활성을 증강하는 아미노산 개변을 하는 것, 및/또는 Fc에 결합하고 있는 코어 푸코오스의 함량을 저하 또는 결손시키는 것을 들 수 있다.
CD16a 결합 활성을 증강하기 위한 아미노산 잔기 치환을 도입할 경우, 당해 아미노산 잔기는, IgG 반량체의 헤테로 회합체에 있어서 형성되는 CD16a 결합 영역에 포함되는 아미노산 잔기라면 어느 것이든 된다.
또한, 당해 아미노산 잔기 치환은, 제1 및 제2 IgG 반량체의 양쪽에 도입해도, 어느 한쪽에 도입해도 된다. 단, 본 발명의 효과를 발휘하기 위해서는, 동일한 IgG 반량체에 있어서, CD16a 결합 활성을 증강하기 위한 아미노산 잔기 치환의 위치와 CD16a 결합 활성을 감약시키는 아미노산 잔기 치환의 위치는 다른 것이 바람직하다.
바꾸어 말하면, 서로 다른 IgG 반량체라면, CD16a 결합 활성을 증강하기 위한 아미노산 잔기 치환의 위치와 CD16a 결합 활성을 감약시키는 아미노산 잔기 치환의 위치가 동일해도 된다.
어느 위치에 CD16a 결합 활성을 증강하기 위한 아미노산 잔기 치환을 도입할지는, CD16a 결합 활성을 감약시키는 아미노산 잔기 치환의 위치와 조합해서 다양한 IgG 반량체를 포함하는 헤테로 회합체를 제작하여, ADCC 활성 등을 측정하고, 해당 활성이 양쪽 양성 세포에의 특이적인 활성인 것을 평가해서 결정할 수 있다.
CD16a 결합 활성을 증강하기 위한 아미노산 잔기 치환에 더하여, Fc에 결합하고 있는 코어 푸코오스의 함량을 저하 또는 결손시킴으로써, 이펙터 기능을 증강할 수 있다.
(2b) (2a)에서 이펙터 기능을 증강한 항체 조성물에 대하여, 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포 및 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포, 제1 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포에 대한 이펙터 기능(예를 들어, ADCC 활성 등)을 평가한다.
(2c) (2b)에 의해 평가한 결과에 기초해서, 각 단일 양성 세포에의 이펙터 기능과 비교하여, 양쪽 양성 세포에의 이펙터 기능이 강한 항체 조성물을 선택함으로써, 양쪽 양성 세포에 대한 특이적인 이펙터 기능이 증강된 항체 조성물을 취득한다.
상기한 방법에 의해, 이펙터 기능이 증강되고, 또한 양쪽 양성 세포에 대한 높은 특이성을 나타내는 항체 조성물을 선발할 수 있다.
양쪽 양성 세포에의 특이적인 이펙터 기능이 증강된 항체 조성물은, 인간 혈액 중을 모방한 평가계에 의해, 보다 임상 효과에 가까운 이펙터 기능을 평가할 수 있다. 인간 혈액 중을 모방한 평가계로서는, 예를 들어 인간 알부민, 면역 글로불린, 인간 혈장이나 인간 혈청 등 혈액의 단백질 성분과, 인간 NK 세포, 인간 말초혈 단핵구(PBMC) 또는 인간 과립구 등을 첨가한 ADCC 평가계, 인간 전체 혈액을 사용한 세포 상해 활성 평가계 등을 들 수 있다.
인간 혈액 중을 모방한 평가계의 구체적인 방법으로서는, 예를 들어, [실시예 8]에서 후술하는 ADCC 평가계를 사용하는 방법, 및 [실시예 9]에서 후술하는 세포 상해 활성 평가계를 사용하는 방법을 들 수 있다.
ADCC 평가계를 사용하는 방법으로서는, 구체적으로는 예를 들어, 다음 방법을 들 수 있다. 상기한 1-ii)에서, 면역 글로불린을 최종 농도로 바람직하게는 0.01 내지 10질량％, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10질량％, 더욱 바람직하게는 1 내지 4질량％가 되도록 첨가하여, 인간 체내를 모방한 평가계를 구축한 것 이외는, 1-i) 내지 1-vi)과 마찬가지로 하여 ADCC 활성을 측정 및 평가한다.
인간 혈액 재구성계에 의한 세포 상해 활성 평가계를 사용하는 방법으로서는, 구체적으로는 예를 들어 다음 방법을 들 수 있다.
2-i) 표적 세포로서, 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포, 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포와, 제1 항원 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포를 사용한다. 플로 사이토미터를 사용하여, 각 세포에서의 제1 항원 및 제2 항원의 발현량을 측정하여, 목적으로 하는 항원이 세포에 발현하고 있는 것을 확인한다.
2-ii) 인간 혈액을 원심 분리하여, 상청을 회수함으로써 혈장을 취득한다. 또한, 적혈구 제거제(예를 들어, Hetasep: Stemcell technology, #07806)를 사용해서 인간 혈액으로부터 말초혈 단핵구와 과립구의 획분을 취득한다.
2-iii) 2-ii)에서 회수한 혈장과 말초혈 단핵구와 과립구의 획분을 섞어, 세포 배양 플레이트에 파종한 후, 제1 항원에 대한 항체의 반량체 및 제2 항원에 대한 항체의 반량체를 혼합한 항체 조성물을 첨가하여, 37℃에서 12 내지 48시간 정도 배양한다.
2-iv) 플로 사이토메트리법으로, 제1 항원 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포의 비율을 측정한다. 음성 대조로서, 야생형 IgG 항체를 사용한다.
그 결과, 제1 항원에 대한 항체의 반량체 및 제2 항원에 대한 항체의 반량체를 혼합한 항체 조성물이 항체 농도 의존적으로 제1 항원 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포를 제거하는 한편, 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포 및 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포를 각각 제거하지 않을 경우에, 양쪽 양성 세포에의 특이적인 이펙터 기능이 증강되어 있다고 평가한다.
양쪽 양성 세포를 제거한다는 것은, 본 발명의 항체 조성물을 첨가한 경우의 제1 항원 및 제2 항원을 발현하는 양쪽 양성 세포의 비율이 음성 대조에 있어서의 비율보다 낮은 것을 말한다. 양쪽 양성 세포의 비율이 낮다는 것은, 음성 대조의 양쪽 양성 세포의 비율에 대하여, 바람직하게는 0 내지 70％, 보다 바람직하게는 0 내지 50％의 범위 내인 것을 말한다.
단일 양성 세포를 제거하지 않는다는 것은, 본 발명의 항체 조성물을 첨가한 경우의 제1 항원을 발현하는 단일 양성 세포 및 제2 항원을 발현하는 단일 양성 세포의 비율이 음성 대조에 있어서의 비율과 동등 정도인 것을 말한다. 단일 양성 세포의 비율이 동등 정도란, 음성 대조의 단일 양성 세포의 비율에 대하여, 바람직하게는 ±0 내지 40％, 보다 바람직하게는 ±0 내지 20％의 범위 내인 것을 말한다.
본 평가에 의해, 인간 혈액 중에서도 증강된 이펙터 기능을 나타내는 항체 조성물을 선발할 수 있다.
(3a) [1] 및 [2]에서 상기한 방법을 사용해서 선발된, 양쪽 양성 세포에의 높은 특이성과 증강된 이펙터 기능을 겸비하는 항체 조성물을, 마우스·원숭이 등의 동물을 사용해서 PK 시험(Pharmacokinetics, 약역학 시험)을 행한다.
음성 대조로서, 야생형 IgG 항체를 사용한다.
(3b) (3a)의 PK 시험의 결과, 야생형 IgG 항체와 가까운 동태를 나타내는 항체 조성물을 야생형 IgG 항체와 동등한 혈중 반감기를 갖는 항체 조성물로서 선발한다. 구체적인 방법으로서는, 예를 들어, [실시예 7]에서 후술하는 방법을 들 수 있다.
PK 시험의 방법으로서는, 구체적으로는, 예를 들어 다음의 방법을 들 수 있다.
3-i) 마우스(예를 들어, BALB/c 마우스)에 양쪽 양성 세포에의 높은 특이성과 증강된 이펙터 기능을 겸비하는 항체 조성물(바람직하게는 0.1 내지 10mg/kg)을 미정맥 중에 투여 후, 바람직하게는 1시간, 4시간, 24시간, 72시간 후의 혈액을 채취한다. 이소플루란 마취 하에서 란셋을 사용해서 볼을 찔러 혈액을 회수 후, 미량 채혈관[예를 들어, BD사 제조 마이크로테이너(등록 상표)]으로 바람직하게는 4000 내지 16000rpm, 실온, 바람직하게는 5 내지 20분간 원심함으로써 혈청을 회수한다. 양성 대조의 항체로서, 야생형 IgG 항체를 사용한다.
3-ii) 혈청 중에 존재하는 항체 농도를 측정한다. 혈청 중의 항체 농도는 공지의 방법으로 측정할 수 있어, 예를 들어 AlphaLISA Human Kappa light chain immunoassay kit(AL3023, PerkinElmer)를 사용하여 측정할 수 있으며, 검량선은 키트 내의 Kappa light chain으로 작성할 수 있다.
3-iii) 3-ii)에서 측정한 항체 농도로부터 산출할 수 있는, 혈중 반감기(t1/2)가 양성 대조의 야생형 IgG와 비교해서 바람직하게는 50％ 내지 150％의 범위에 있는 것을, 야생형 IgG 항체와 동등한 혈중 반감기를 갖는 항체 조성물이라고 평가한다.
동물을 사용한 PK 시험 대신에, 항체의 물리화학적인 특징으로서 시차 주사 칼로리메트리(DSC: Differential Scanning Calorimetry)에 의한 변성 중점(Tm)값을 측정함으로써도, 긴 혈중 반감기를 갖는 항체 조성물을 선발할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물 중, 야생형 IgG 항체와 동등한 Tm값(변성 중점 온도)을 갖는 것은, 양호한 PK를 나타낸다. Tm값을 측정하는 구체적인 방법으로서는, 예를 들어, [실시예 7]에서 후술하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는, 시차 주사 형광 정량법(DIFFERENTIAL Scanning Fluorimetry: DSF)으로 측정하는 것이 가능하고, 측정 기기로서는, 예를 들어 NanoTemper사의 Prometheus NT.48을 들 수 있다. 항체의 Tm값의 측정은, 바람직하게는 10℃ 내지 30℃에서 개시하여, 80℃ 내지 100℃까지 승온하고, 그 승온 속도는, 바람직하게는 0.5℃ 내지 2℃/분으로 함으로써 측정할 수 있다.
또한, 항체와 FcRn(태아성 Fc수용체)의 pH6.0에서의 결합 활성이 높을수록, 혈중 반감기가 길어지는 것으로 알려져 있다. 그 때문에, FcRn과의 결합 활성을 측정함으로써, 긴 혈중 반감기를 갖는 항체 조성물을 선발할 수 있다. FcRn과의 결합 활성은, 예를 들어 J. Immunol. 2002; 169: 5171-80에 개시되어 있는 방법으로 측정할 수 있다.
상기한 [1] 내지 [3]의 평가에 의해, 의약품에 사용하는 경우에 바람직한 성질을 구비하는 항체 조성물을 선발할 수 있다. 이러한 성질을 구비한 바람직한 본 발명의 항체 조성물이 갖는 아미노산 잔기 치환의 조합으로서는, 표 2에 나타내는 조합이 바람직하고, 표 3A 및 표 3B에 나타내는 조합이 보다 바람직하고, 표 4에 나타내는 조합이 가장 바람직하다.
Figure pct00003
[표 3A]
Figure pct00004
[표 3B]
Figure pct00005
즉, 표 3A 및 표 3B에 나타내는 아미노산 잔기 치환의 조합은, 이하와 같다.
<제1 IgG 반량체>
1) C226A, C229A, D265A, S239D, K326T, L368A
2) C226A, C229A, D265A, S239D, K326T, Y407A
3) C226A, C229A, D265A, S239D, K326T, K409R
4) C226A, C229A, D265A, S239D, S298A, E333A, L242C, K334C, L368A
5) C226A, C229A, D265A, S239D, S298A, E333A, L242C, K334C, Y407A
6) C226A, C229A, D265A, S239D, S298A, E333A, L242C, K334C, K409R
7) C226A, C229A, S298E, S239D, K326T, L368A
8) C226A, C229A, S298E, S239D, K326T, Y407A
9) C226A, C229A, S298E, S239D, K326T, K409R
10) C226A, C229A, S298E, S239D, E333A, L242C, K334C, L368A
11) C226A, C229A, S298E, S239D, E333A, L242C, K334C, Y407A
12) C226A, C229A, S298E, S239D, E333A, L242C, K334C, K409R
<제2 IgG 반량체>
1) C226A, C229A, P329Y, S239D, K326T, L368A
2) C226A, C229A, P329Y, S239D, K326T, Y407A
3) C226A, C229A, P329Y, S239D, K326T, K409R
4) C226A, C229A, P329Y, S239D, S298A, E333A, L242C, K334C, L368A
5) C226A, C229A, P329Y, S239D, S298A, E333A, L242C, K334C, Y407A
6) C226A, C229A, P329Y, S239D, S298A, E333A, L242C, K334C, K409R
본 발명의 항체 조성물은, 상기 제1 IgG 반량체 [1) 내지 6)]에 관해서, 각각 동일한 숫자의 상기 제2 IgG 반량체 [1) 내지 6)]을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 항체 조성물은, 상기 제1 IgG 반량체 [7) 내지 12)]에 관해서, 이하의 조합으로 되도록 상기 제2 IgG 반량체를 포함하는 것이 바람직하다.
·제1 IgG 반량체 7)과 제2 IgG 반량체 1)
·제1 IgG 반량체 8)과 제2 IgG 반량체 2)
·제1 IgG 반량체 9)와 제2 IgG 반량체 3)
·제1 IgG 반량체 10)과 제2 IgG 반량체 4)
·제1 IgG 반량체 11)과 제2 IgG 반량체 5)
·제1 IgG 반량체 12)와 제2 IgG 반량체 6)
보다 구체적으로는, 본 발명의 항체 조성물이 갖는 아미노산 잔기 치환의 조합의 바람직한 형태로서, 예를 들어 이하의 <1> 내지 <12>를 들 수 있다.
<1>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 (a)S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 L368A를 포함한다.
<2>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 각각 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 (a)S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 Y407A를 포함한다.
<3>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 각각 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 (a)S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 K409R을 포함한다.
<4>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 각각 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 (b) S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 L368A를 포함한다.
<5>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 (b) S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 Y407A를 포함한다.
<6>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 (b) S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 K409R을 포함한다.
<7>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 S298E의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 K409R을 포함한다.
<8>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 S298E의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 L368A를 포함한다.
<9>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 각각 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 S298E의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 Y407A를 포함한다.
<10>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 각각 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 S298E의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체는 EU 인덱스에서 나타내지는 S239D, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함하고, 제2 IgG 반량체는, EU 인덱스에서 나타내지는 S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 L368A를 포함한다.
<11>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 S298E의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체는 EU 인덱스에서 나타내지는 S239D, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함하고, 제2 IgG 반량체는, EU 인덱스에서 나타내지는 S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 Y407A를 포함한다.
<12>
(2A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(3A) 제1 IgG 반량체는, 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 제1 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 S298E의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(4A) 제2 IgG 반량체는, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에 있어서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(5A) 제1 IgG 반량체는 EU 인덱스에서 나타내지는 S239D, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함하고, 제2 IgG 반량체는, EU 인덱스에서 나타내지는 S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
(6A) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체는, 각각 EU 인덱스에서 나타내지는 K409R을 포함한다.
Figure pct00006
또한, 본 발명의 항체 조성물은, 표 5에 나타내는 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 포함하는 항체 조성물이 바람직하다. 표 5에서, 각 서열 번호는, CH 도메인의 아미노산 서열의 서열 번호를 나타낸다.
Figure pct00007
본 발명의 일 양태로서 상술 항체 조성물을 구성하는 제1 IgG 반량체 또는 제2 IgG 반량체를 들 수 있다.
본 발명의 제1 IgG 반량체로서는, 원하는 제1 항원 및 제2 항원이 발현하는 양쪽 양성 세포에 있어서 제2 IgG 반량체와 회합하여, 양쪽 양성 세포 특이적으로 이펙터 기능을 발휘할 수 있는 점에서, 제2 IgG 반량체와 회합하는 것을 특징으로 하는 제1 IgG 반량체를 들 수 있다. 본 발명의 제1 IgG 반량체는, 제2 IgG 반량체와의 병용, 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체를 포함하는 항체 조성물의 제조, 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체를 포함하는 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 제조에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제2 IgG 반량체로서는, 원하는 제1 항원 및 제2 항원이 발현하는 양쪽 양성 세포에 있어서 제1 IgG 반량체와 회합하여, 양쪽 양성 세포 특이적으로 이펙터 기능을 발휘할 수 있는 점에서, 제1 IgG 반량체와 회합하는 것을 특징으로 하는 제2 IgG 반량체를 들 수 있다. 본 발명의 제2 IgG 반량체는, 제1 IgG 반량체와의 병용, 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체를 포함하는 항체 조성물의 제조, 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체를 포함하는 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 제조에 사용할 수 있다.
상기 예시한 항체 조성물에 포함되는 제1 IgG 반량체 또는 제2 IgG 반량체는, 각각 대응하는 IgG 반량체와 회합하는 것을 특징으로서 갖는 IgG 반량체이기 때문에, 본 발명의 제1 또는 제2 IgG 반량체에 포함된다.
또한, 본 발명의 제1 또는 제2 IgG 반량체는, 어느 항원에 특이적으로 결합하는 IgG 반량체이어도 되며, 제1 IgG 반량체가 결합하는 항원과 제2 IgG 반량체가 결합하는 항원이 다르면 된다.
본 발명의 항체 조성물이 결합하는 항원으로서는, 어느 항원이어도 되며, 바람직하게는 암, 면역 질환, 알레르기 질환 또는 순환기 질환 등에 관한 항원 분자를 들 수 있다. 예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 증식 인자 및 해당 수용체 그리고 CD 항원 등을 들 수 있다.
사이토카인 또는 증식 인자의 수용체로서는, 예를 들어 인터페론(이하, IFN이라고 기재함)-α, IFN-β, IFN-γ, 인터류킨(이하, IL이라고 기재함)-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, IL-27, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구/마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 또는 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF)에 대한 수용체 등을 들 수 있다.
케모카인 수용체로서는, 예를 들어 SLC, ELC, I-309, TARC, MDC, MIP-3α, CTACK에 대한 수용체를 들 수 있다.
증식 인자의 수용체로서는, 예를 들어 표피 성장 인자(Epidermal Growth Factor)(EGF), 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor)(VEGF), 앙기오포이에틴(angiopoietin), 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast Growth Factor)(FGF), 간세포 성장 인자(Hepatocyte Growth Factor)(HGF), 혈소판유래 성장 인자(Platelet-Derived Growth Factor)(PDGF), 인슐린형 성장 인자(Insulin-like Growth Factor)(IGF), 에리스로포이에틴(erythropoietin)(EPO), 트론보포이에틴(Tronbopoietin)(TPO), TGFβ, 이프린(Iephrin), 앙기오포이에틴(angiopoietin), 프리즐드 리간드(Frizzled ligand), SDF-1에 대한 수용체 등을 들 수 있다.
분화 클러스터(Cluster of Differentiation)(이하, CD라고 기재함) 항원으로서는, CD1a, CD1c(BDCA1), CD1d, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26(DPP-4), CD27, CD28, CD30, CD32, CD32a, CD33, CD34, CD37, CD38, CD39, CD40, CD43, CD44, CD45, CD47, CD48, CD49, CD49a, CD49b, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD59, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD66a(CEACAM1), CD66b(NCA-95), CD66c(NCA-50/90), CD66d(CGM1), CD66e(CEA), CD66f(PSG), CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CD75, CD76, CD77, CD78, CD79a, CD79b, CD80(B7.1), CD81, CD82, CD83, CD84(SLAMF5), CD85a(ILT-5), CD85b(ILT8), CD85c(LIR8), CD85d(ILT4), CD85f(ILT11), CD85g(ILT7), CD85h(ILT1), CD85i(LIR6a), CD85j(ILT2), CD85k(ILT3), CD85m(ILT10), CD86(B7.2), CD87, CD89, CD94(NKG2), CD95(Fas), CD97, CD98, CD103, CD106, CD107a(LAMP1), CD114(G-CSFR), CD115(M-CSFR, CSF1R), CD116(GM-CSFR), CD117(SCF-R, C-KIT), CD119(IFNGR1), CD121a(IL-1R1), CD122(IL-2Rb), CD123(IL-3Ra), CD124(IL-4Ra), CD125(IL-5Ra), CD126(IL-6Ra), CD127(IL-7Ra), CD134(OX40), CD135(FLT3), CD137(4-1BB), CD138(Syndecan-1), CD140(PDGFR), CD146(MUC18), CD147(EMMRRIN), CD152(CTLA-4), CD153(CD30 리간드), CD158a(KIR2DL1), CD158b1(KIR2DL2), CD158b2(KIR2DL3), CD158c(KIR2DS6), CD158d(KIR2DL4), CD158e1(KIR3DL1), CD158e2(KIR3DS1), CD158f(KIR2DL5), CD158g(KIR2DS5), CD158h(KIR2DS1), CD158i(KIR2DS4), CD158j(KIR2DS2), CD158k(KIR3DL2), CD159a(NKG2A), CD159c(NKG2C), CD161(NKRP1A), CD162(PSGL-1), CD163, CD169(SIGLEC1), CD177, CD178(FasL), CD183(CXCR3), CD184(CXCR4), CD185(CXCR5), CD191(CCR1), CD193(CCR3), CD194(CCR4), CD195(CCR5), CD196(CCR6), CD197(CCR7), CD198(CCR8), CD199(CCR9), CD200(OX2), CD206(MMR), CD207(Langerin), CD209(DC-SIGN), CD212(IL-12Rβ1), CD213a1(IL-13Ra1), CD213a2(IL-13Ra2), CD215(IL-15RA), CD217(IL-17R), CD218a(IL-18Ra), CD218b(IL-18Rβ), CD223(LAG3), CD226(DNAM-1), CD229(SLAMF3), CD252(OX40L), CD269(BCMA), CD272(BTLA), CD274(PD-L1), CD275(ICOS 리간드), CD276(B7H3), CD278(ICOS), CD279(PD-1), CD281(TLR1), CD282(TLR2), CD283(TLR3), CD284(TLR4), CD286(TLR6), CD288(TLR8), CD289(TLR9), CD294(CRTH2), CD301(CLEC10A, MGL), CD302(DCL1), CD303(BDCA2), CD304(BDCA4), CD305, CD314(NKG2D), CD317(BST2), CD319(CS1), CD324(E-cadherin), CD326(EpCAM), CD357(GITR), CD358(DR6), CD360(IL-21R), CD365(TIM-1), CD366(TIM-3), CD369(DECTIN-1), CD370(CLEC9A), CD371(CLEC12A), 사람 백혈구 항원(human leukocyte antigen)(HLA)-Class II(예를 들어, HLA-DR) 및 HLA-I 등을 들 수 있다.
또한, 종양의 병태 형성에 관련된 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항체의 항원으로서는, 예를 들어 강글리오시드 GM1, GM2, GD2, GD3, Lewis X(CD15s), Lewis Y, CD3, CD4, CD40, CD40 리간드, B7 패밀리 분자(예를 들어, CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6, B7-H7), B7 패밀리 분자의 리간드(예를 들어, CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 또는 BTLA), OX-40, OX-40 리간드, CD137, 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor)(TNF) 수용체 패밀리 분자(예를 들어, DR3, DR4, DR5, BAFFR, LIGHT, TNFR1 또는 TNFR2), TNF-관련 세포 자멸사 유발 리간드 수용체(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor)(TRAIL) 패밀리 분자, TRAIL 패밀리 분자의 수용체 패밀리(예를 들어, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3 또는 TRAIL-R4), 핵 인자 카파 B 리간드의 수용체 액티베이터(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)(RANK), RANK 리간드, CD25, 엽산 수용체, Mesothelin, SIGLEC8, 사이토카인·케모카인 수용체[예를 들어, IL-1RII, IL-12Rβ2, IL-17RB, IL-23R, IL-27Rα, IL-31R, IL-33Rα, IL-36R, 종양 증식 인자(transforming growth factor)(TGF) βRII, CCR2, CCR10, CXCR1, CXCR2, 류코트리엔 B4 수용체(BLT1)], NK 세포 수용체(예를 들어, NKG2D, E4BP4, NKp30, NKp44, NKp46, AhR), T 세포 수용체(예를 들어, TCRα/β, TCR Vβ11, TCRγ/δ, TSLPR, SLAM, SLAMF6, LAP, GARP, SR-A1, CD200R, DCR3, TIGIT), B 세포 수용체(예를 들어, BLYS, APRIL, TSLPR), 수지상 세포 수용체(예를 들어, FCER1A, TLR7, CADM1, XCR1, BTLA, SIRPA, DCIR, TROP2, AXL, SIGLEC6, SIGLEC15, CX3CR1, S100A8, S100A9, ASGR1), 아미노산 트랜스포터(예를 들어, ASCT2), 세린 프로테아제(예를 들어, Proteinase-3, PR3) 등을 들 수 있다.
수용체형 티로신 키나아제로서는, 예를 들어 EGF 수용체, 인슐린 수용체, IGF-1 수용체, NGF 수용체, PDGF 수용체, M-CSF 수용체, FGF 수용체, VEGF 수용체 및 Eph 수용체 등을 들 수 있다. 티로신 키나아제 회합형 수용체로서는, 예를 들어 사이토카인 수용체 및 Fc 수용체 등을 들 수 있다. 또한, 세포 접착 분자로서는, 예를 들어 카드헤린 및 인테그린 등을 들 수 있다. G 단백 공액형 수용체로서는, 예를 들어 아데노신 수용체, 칸나비노이드 수용체 및 글루카곤 수용체 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어 수용체형 티로신 키나아제로서, 표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor)(EGFR), V-ERB-B2 조류 적혈구 백혈병 바이러스 종양 유전자 동종(Avian Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog)2(HER2), V-ERB-B2 조류 적혈구 백혈병 바이러스 종양 유전자 동종3(HER3), V-ERB-B2 조류 적혈구 백혈병 바이러스 종양 유전자 동종4(HER4), 인슐린 수용체(Insulin Receptor)(INSR), 인슐린형 성장 인자I 수용체(Insulin-like Growth FactorI Receptor) (IGF1R), 신경 성장 인자 수용체(Nerve Growth Factor Receptor)(NGFR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체(Platelet-derived Growth Factor Receptor), 알파(Alpha)(PDGFRA), 혈소판 유래 성장 인자 수용체, Beta(PDGFRB), 콜로니-자극 인자 수용체(Colony-stimulationg Factor Receptor)(CSF1R), 콜로니-자극 인자2 수용체, 알파(CSF2RA), 콜로니-자극 인자3 수용체, 과립성 백혈구(Granulocyte)(CSF3R), 섬유 모세포 성장 인자 수용체(Fibroblast Growth Factor Receptor)1(FGFR1), 섬유 모세포 성장 인자 수용체2(FGFR2), 섬유 모세포 성장 인자 수용체3(FGFR3), 섬유 모세포 성장 인자 수용체4(FGFR4), 키나아제 삽입 도메인 수용체(Kinase Insert Domain Receptor)(KDR), 에프린 수용체(Ephrin Receptor) EphA1(EPHA1), 에프린 수용체 EphA2(EPHA2), 에프린 수용체 EphA3(EPHA3) 등을 들 수 있다.
또한, 티로신 키나아제 회합형 수용체로서, 인터류킨(Interleukin)-1 수용체1(IL-1R1), 인터류킨-1 수용체 보조 단백질(IL-1RAP), 인터류킨-1 수용체형 1(IL-1RL1, ST2), 간세포 성장 인자 수용체(Hepatocyte Growth factor Receptor)(c-Met), 마크로파지 자극 1 수용체(Macrophage Stimulating 1 Receptor)(RON), 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR), 접합 접착 분자형(Junctional Adhesion Molecule-Like)(JAML), 넥틴형 단백질(Nectin-like protein) 5(Necl-5), 종양 괴사 인자 수용체(Tumor Necrosis Factor Receptor) 1(TNF-R1), 종양 괴사 인자 수용체 2(TNF-R2), TNF-관련 세포 자멸사 유발 리간드 수용체 1(TRAIL-R1), TNF-관련 세포 자멸사 유발 리간드 수용체 2(TRAIL-R2), 사멸 수용체(Death Receptor) 3(DR3), 사멸 수용체 6(DR6), NF-kB의 수용체 액티베이터(Receptor Activator of NF-kB)(RANK), 신경 성장 인자 수용체(NGFR), 림포톡신 베타 수용체(Lymphotoxin-beta Receptor)(LTβR), OX40(TNFRSF4), Fas(TNFRSF6), 4-1BBL(TNFRSF9), Fn14(TNFRSF12A), TACI(TNFRSF13B), BAFF-R(TNFRSF13C), HVEM(TNFRSF14), BCMA(TNFRSF17), GITR(TNFRSF18), TROY(TNFRSF19), 엑토디스플라신 A1 수용체(Ectodysplasin A1 Receptor)(EDAR), 엑토디스플라신 A2 수용체(XEDAR), 림프양 조직으로 발현되는 수용체(Receptor Expressed in Lymphoid Tissues)(RELT), CD3, CD27, CD30, CD40, FcαRI, FcγRIII 및 FcεRI, Fc IgG의 프래그먼트(Fragment of IgG), 수용체 트랜스포터(Receptor Transpoter), 알파(FCGRT) 등을 들 수 있다.
또한, 세포 접착 분자로서는, 인테그린(Integrin), Alpha9(ITGA9), P-셀렉틴 글리코프로틴 리간드(P-selectin Glycoprotein Ligand)-1(PSGL-1), 카데린(Cadherin)11(CDH11), 점막 혈관 어드레션 세포 접착 분자(Mucosal Vascular Addression Cell Adhesion Molecule)1(MADCAM1), 인테그린, 알파4(ITGA4), 인테그린, 베타4(ITGB4), 인테그린, 알파4베타7, 인테그린, 알파4베타1, 콜라겐(Type I Collagen), G 단백 공액형 수용체로서는, Adenosine A2A Receptor(ADORA2A), 아데노신 A2B 수용체(Adenosine A2B Receptor)(ADORA2B), 반발 유도 분자(Repulsive Guidance Moleculea)(RGMA), 글루카곤 수용체(Glucagon Receptor)(GCGR), 프로락틴 수용체(Prolactin Receptor)(PRLR), 글루카곤형 펩타이드1 수용체(Glucagon-like Peptide1 Receptor)(GLP1R), 칸나비노이드 수용체(Cannnabinoid Receptor)1(CB1), Mas-related G protein Coupled Receptor-X2(MRGPRX2) 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물은, 상기 항원 분자를 표면에 발현하는 세포가 관여하는 질환의 치료에 사용되는 것이 바람직하고, 암, 자기면역 질환, 알레르기 질환의 치료에 사용되는 것이 보다 바람직하다.
암으로서는, 예를 들어 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 뇌종양, 유방암, 자궁체암, 자궁경암, 난소암, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 담낭암, 담관암, 췌장암, 부신암, 소화관 간질 종양, 중피종, 두경부암, 신장암, 폐암, 육종, 전립선암, 정소종양, 방광암, 피부암, 소아암 등을 들 수 있다. 또한 억제성 면역 세포를 제거함으로 인한 다양한 암 치료도 포함된다.
자기면역 질환 혹은 알레르기로서는, 예를 들어 길랭-바레 증후군, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 만성 위염, 만성 위축성 위염, 자기면역성 간염, 원발성 담즙성 담관염, 궤양성 대장염, 크론병, 자기면역성 췌염, 고안동맥염, 굿패스쳐 증후군, 급속 진행성 사구체 신염, IgA 신증, 거적아구성 빈혈, 자기면역성 용혈성 빈혈, 자기면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 바세도우병, 하시모토병, 원발성 갑상선 기능 저하증, 돌발성 애디슨병, I형 당뇨병, 만성 원판상 에리테마토데스, 국한성 강피증, 천포창, 농포성 건선, 관절증성 건선, 심상성 건선, 유천포창, 임신성 포진, 선상 IgA 수포성 피부증, 후천성 표피 수포증, 원형 탈모증, 심상성 백반, 하라다병, 자기면역성 시신경증, 자기면역성 내이장애, 돌발성 무정자증, 습관성 유산, 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 항인지질 항체 증후군, 다발성 근염, 피부 근염, 강피증, 쇼그렌 증후군, IgG4 관련 질환, 혈관염 증후군, 혼합성 결합 조직병, 자기면역성 용혈성 빈혈, 부적합 수혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 아토피성 피부염, 다발성 동맥염, 알레르기성 비염(화분증), 알레르기성 결막염, 알레르기성 위장염, 기관지 천식, 소아 천식, 음식물 알레르기, 약물 알레르기, 담마진, 아나필락시스 쇼크, 이식 거부, 접촉성 피부염, 베체트병 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체 조성물이 결합하는 제1 항원과 제2 항원의 구체적인 조합 및 표적 세포, 그리고 해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상이 되는 질환을 이하에 예시한다. 또한, 이러한 예시에 대해서 표 6A 내지 표 6E에 대응 관계를 나타낸다.
c1) 제1 항원이 CADM1이며, 제2 항원이 CCR4이며, 표적 세포가 ATL(Adult T-cell Leukemia-lymphoma) 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, ATL을 들 수 있다.
c2) 제1 항원이 EGFR이며, 제2 항원이 HER2이며, 표적 세포가 암 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물로서는, 위암 또는 유방암 등의 고형 암을 들 수 있다.
c3) 제1 항원이 CD52이며, 제2 항원이 CD70이며, 표적 세포가, 활성화 T 세포, 활성화 B 세포 또는 활성화 APC인, 항체 조성물.
c4) 제1 항원이 CD2이며, 제2 항원이 CD70이며, 표적 세포가 활성화 T 세포인 항체 조성물.
c5) 제1 항원이 CD19이며, 제2 항원이 CD70이며, 표적 세포가 활성화 B 세포인, 항체 조성물.
c6) 제1 항원이 CD2이며, 제2 항원이 CD40 리간드이며, 표적 세포가 활성화 이펙터 T 세포(활성화 Teff)인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 쇼그렌 증후군을 들 수 있다.
c7) 제1 항원이 PD-L1이며, 제2 항원이 CD19, CD30, CCR4, CD20, CD22 및 CD79b에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 림프종인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 림프종을 들 수 있다.
c8) 제1 항원이 PD-L1이며, 제2 항원이 CD19, CD30, CCR4, CD20, CD22 및 CD79b에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 백혈병인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 백혈병을 들 수 있다.
c9) 제1 항원이 CD8이며, 제2 항원이 CCR4이며, 표적 세포가 제어성 T 세포(Treg)인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다. 해당 의약 조성물은, 암 면역 요법에 사용하는 것이 바람직하다.
c10) 제1 항원이 CTLA-4이며, 제2 항원이 CD4, CCR4 및 GITR에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 제어성 T 세포(Treg)인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다. 해당 의약 조성물은, 암 면역 요법에 사용하는 것이 바람직하다.
c11) 제1 항원이 TIGIT이며, 제2 항원이 CD4, CCR4 및 GITR에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 제어성 T 세포(Treg)인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다. 해당 의약 조성물은, 암 면역 요법에 사용하는 것이 바람직하다.
c12) 제1 항원이 PD-1이며, 제2 항원이 CD4, CCR4 및 GITR에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 제어성 T 세포(Treg)인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다. 해당 의약 조성물은, 암 면역 요법에 사용하는 것이 바람직하다.
c13) 제1 항원이 OX40이며, 제2 항원이 CD127, CD26, CD70 및 CD15s에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 이펙터 T 세포(Teff)인 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 자기면역 질환을 들 수 있다.
c14) 제1 항원이 4-1BB이며, 제2 항원이 CD127, CD26, CD70 및 CD15s에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 이펙터 T 세포(Teff)인 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 자기면역 질환을 들 수 있다.
c15) 제1 항원이 GITR이며, 제2 항원이 CD127, CD26, CD70 및 CD15s에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 이펙터 T 세포(Teff)인 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 자기면역 질환을 들 수 있다.
c16) 제1 항원이 CD40 리간드이며, 제2 항원이 CD127, CD26, CD70 및 CD15s에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 이펙터 T 세포(Teff)인 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 자기면역 질환을 들 수 있다.
c17) 제1 항원이 CD4이며, 제2 항원이 CD69이며, 표적 세포가 조직 상주 메모리 T(TRM) 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, ANCA(Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibody) 관련 사구체 신염을 들 수 있다.
c18) 제1 항원이 PD-1이며, 제2 항원이 CD3이며, 표적 세포가 말초 도움(Peripheral helper) T(TPH) 세포 및 PD-1highCD8 양성 T 세포의 적어도 한쪽인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 관절 류머티즘을 들 수 있다.
c19) 제1 항원이 PD-1이며, 제2 항원이 CD4이며, 표적 세포가 PD-1 양성 T 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 셀리악병을 들 수 있다.
c20) 제1 항원이 인테그린 α4β7이며, 제2 항원이 CCR6, CXCR3 및 CD161에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 이펙터 T 세포(Teff) 및 자연 림프구(ILC, Innate Lymphoid Cell)에서 선택되는 적어도 하나인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 염증성 장질환을 들 수 있다.
c21) 제1 항원이 인테그린 α4β7이며, 제2 항원이 CD127이며, 표적 세포가 모든 자연 림프구(ILC) 및 Treg 이외의 장관에 침윤하는 T 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 염증성 장질환을 들 수 있다.
c22) 제1 항원이 인테그린 α4β7이며, 제2 항원이 CD40 리간드이며, 표적 세포가 국소 유주 활성화 T 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c23) 제1 항원이 인테그린 α4β1이며, 제2 항원이 CD40 리간드이며, 표적 세포가 국소 유주 활성화 T 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 다발성 경화증 및 염증성 장질환의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c24) 제1 항원이 CXCR5이며, 제2 항원이 CD127이며, 표적 세포가 자연 림프구(ILC)인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 알레르기 질환을 들 수 있다.
c25) 제1 항원이 TPO 수용체(c-mpl)이며, 제2 항원이 CD34이며, 표적 세포가 이상 증식 조혈 줄기세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 원발성 골수 섬유증을 들 수 있다.
c26) 제1 항원이 TPO 수용체(c-mpl)이며, 제2 항원이 CD123이며, 표적 세포가 CD123 양성 백혈병 줄기세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 원발성 골수 섬유증을 들 수 있다.
c27) 제1 항원이 CXCR3이며, 제2 항원이 CD3이며, 표적 세포가 CX3CR1 양성 세포(세포 상해성 이펙터 T 세포 등, NK 세포는 제외함)인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 자기면역 질환(예를 들어, 크론병 등), 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나를 들 수 있다.
c28) 제1 항원이 CXCR3이며, 제2 항원이 CD127 또는 CD40 리간드이며, 표적 세포가 Th1 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 전신성 에리테마토데스를 들 수 있다.
c29) 제1 항원이 CCR4이며, 제2 항원이 CD127 또는 CD40 리간드이며, 표적 세포가 Treg 이외의 CCR4 양성 T 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 알레르기 질환을 들 수 있다.
c30) 제1 항원이 CCR6이며, 제2 항원이 CD127 또는 CD40 리간드이며, 표적 세포가 Th17 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 건선을 들 수 있다.
c31) 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 CD127 또는 CD40 리간드이며, 표적 세포가 Th2 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 알레르기 질환을 들 수 있다.
c32) 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 CCR4이며, 표적 세포가 Th2 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 천식, 호산구성 부비강염 및 아토피성 피부염에서 선택되는 적어도 하나를 들 수 있다.
c33) 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 ST2이며, 표적 세포가 Tpath2 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 천식 및 호산구성 부비강염의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c34) 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 CCR6이며, 표적 세포가 Th2/Th17 세포(중증 천식에서만 나타나는 헤테로 세포)인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 알레르기 질환을 들 수 있다.
c35) 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 CCR3이며, 표적 세포가 호산구, 호염기구, Th2 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 알레르기 질환을 들 수 있다.
c36) 제1 항원이 CD207이며, 제2 항원이 CD11b 또는 CD1a이며, 표적 세포가 랑게르한스 세포 전구 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 랑게르한스 세포 조직구증(LCH, Langerhans Cell Histiocytosis)을 들 수 있다.
c37) 제1 항원이 CD123이며, 제2 항원이 HLA-DR이며, 표적 세포가 형질 세포양 수지상 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 전신성 에리테마토데스를 들 수 있다.
c38) 제1 항원이 CD123이며, 제2 항원이 ASCT2이며, 표적 세포가 형질 세포양 수지상 세포, Th1 세포 및 Th17 세포에서 선택되는 적어도 하나인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 전신성 에리테마토데스를 들 수 있다.
c39) 제1 항원이 CSF1R이며, 제2 항원이 CD14이며, 표적 세포가 단구계 골수 유래 억제 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 특발성 폐섬유증을 들 수 있다.
c40) 제1 항원이 CSF1R이며, 제2 항원이 CD33이며, 표적 세포가 골수 유래 억제 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다.
c41) 제1 항원이 CD19이며, 제2 항원이 CD38이며, 표적 세포가 플라스마 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 전신성 에리테마토데스를 들 수 있다.
c42) 제1 항원이 CD3이며, 제2 항원이 IL-23R이며, 표적 세포가 Th1 세포, Th17 세포 및 Tfh 세포에서 선택되는 적어도 하나인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 전신성 에리테마토데스를 들 수 있다.
c43) 제1 항원이 CD3이며, 제2 항원이 CX3CR1이며, 표적 세포가 CX3CR1 양성 세포(예를 들어, 세포 상해성 이펙터 T 세포 등. NK 세포는 제외함)인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 자기면역 질환(예를 들어, 크레인 병 등), 동맥 경화 및 허혈성 심질환에서 선택되는 적어도 하나를 들 수 있다.
c44) 제1 항원이 CXCR4이며, 제2 항원이 Type 1 collagen이며, 표적 세포가 섬유 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 특발성 폐섬유증, 전신성 경화증 및 간경변 등 각종 섬유화 질환에서 선택되는 적어도 하나를 들 수 있다.
c45) 제1 항원이 CXCR4이며, 제2 항원이 CD14이며, 표적 세포가 단구 및 섬유 세포의 적어도 한쪽인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 특발성 폐섬유증을 들 수 있다.
c46) 제1 항원이 CXCR4이며, 제2 항원이 CD16이며, 표적 세포가 활성화 호중구인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 호중구성 천식, 만성 폐색성 폐질환 및 알츠하이머에서 선택되는 적어도 하나를 들 수 있다.
c47) 제1 항원이 CLEC10A이며, 제2 항원이 CD14 또는 CD16이며, 표적 세포가 중간(intermediate) 단구인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 크론병, 관절 류머티즘 및 천식에서 선택되는 적어도 하나를 들 수 있다.
c48) 제1 항원이 CD70이며, 제2 항원이 CD38이며, 표적 세포가 활성화 T 세포 및 활성화 B 세포의 적어도 한쪽인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 다발성 경화증 및 시신경 척수염의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c49) 제1 항원이 CD70이며, 제2 항원이 CD4, CD127 및 TIM-1에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 Th1 세포, Th17 세포 및 형질 세포양 수지상 세포에서 선택되는 적어도 하나인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 전신성 에리테마토데스를 들 수 있다.
c50) 제1 항원이 CD4이며, 제2 항원이 TIM-1이며, 표적 세포가 Th1 세포, Th17 세포 및 형질 세포양 수지상 세포에서 선택되는 적어도 하나인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 전신성 에리테마토데스를 들 수 있다.
c51) 제1 항원이 CD70이며, 제2 항원이 CD52이며, 표적 세포가 활성화 T 세포 및 활성화 B 세포의 적어도 한쪽인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 다발성 경화증을 들 수 있다.
c52) 제1 항원이 CB1이며, 제2 항원이 AT1R이며, 표적 세포가 GPCR 헤테로머 발현 나쁜 별 아교 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 간경변을 들 수 있다.
c53) 제1 항원이 CD4 또는 PD-1이며, 제2 항원이 CD153이며, 표적 세포가 노화 T 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 전신성 에리테마토데스를 들 수 있다.
c54) 제1 항원이 FcεRI이며, 제2 항원이 CD34 또는 C-KIT이며, 표적 세포가 마스트 세포 및 마스트 세포 전구 세포의 적어도 한쪽인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS, Mast Cell Activation Syndromes)을 들 수 있다.
c55) 제1 항원이 CD34이며, 제2 항원이 CD203 또는 MRGPRX2이며, 표적 세포가 마스트 세포 전구 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 담마진, 음식물 알레르기 및 비만 세포증에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 마스트 세포 활성화 증후군(MCAS)을 들 수 있다.
c56) 제1 항원이 CD52이며, 제2 항원이 CD127이며, 표적 세포가 Treg 이외의 T 세포 및 B 세포의 적어도 한쪽인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 다발성 경화증을 들 수 있다.
c57) 제1 항원이 CD69이며, 제2 항원이 CD21이며, 표적 세포가 활성화 성숙 생(mature naive) B 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 다발성 경화증, 1형 당뇨병 및 관절 류머티즘에서 선택되는 적어도 하나를 들 수 있다.
c58) 제1 항원이 CD106이며, 제2 항원이 CD11c, CD19, CD21 및 CD72에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 여포 수지상 세포(follicular dendritic cells)인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS, Secondary Progressive Multiple Sclerosis), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나를 들 수 있다.
c59) 제1 항원이 4-1BB이며, 제2 항원이 CD11c, CD19, CD21 및 CD72에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 여포 수지상 세포(follicular dendritic cells)인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 2차 진행형 다발성 경화증(SPMS), 항TNF 치료가 유효하지 않은 관절 류머티즘, 이식 및 전신성 에리테마토데스에서 선택되는 적어도 하나를 들 수 있다.
c60) 제1 항원이 BLT1이며, 제2 항원이 CD49b이며, 표적 세포가 BLT1 양성 CD8 양성 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 천식을 들 수 있다.
c61) 제1 항원이 CD226이며, 제2 항원이 CD8이며, 표적 세포가 CD226 양성 CD8 양성 이펙터 메모리(effector memory) 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 전신성 강피증을 들 수 있다.
c62)제1 항원이 CXCR3이며, 제2 항원이 CD8, CD49a, IL-15R 및 NKG2D에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 이펙터 메모리 CD8 양성 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c63) 제1 항원이 CD49a이며, 제2 항원이 CD8, IL-15R 및 NKG2D에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 이펙터 메모리 CD8 양성 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c64) 제1 항원이 IL-15R이며, 제2 항원이 CD8 또는 NKG2D이며, 표적 세포가 이펙터 메모리 CD8 양성 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c65) 제1 항원이 NKG2D이며, 제2 항원이 CD8이며, 표적 세포가 이펙터 메모리 CD8 양성 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c66) 제1 항원이 CD177이며, 제2 항원이 PR3이며, 표적 세포가 혈관 외에 침윤하고 있는 호중구 및 PR3 제시 호중구의 적어도 한쪽인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, ANCA(Antineutrophil Cytoplasmic Antibody) 관련 혈관염 및 전신성 에리테마토데스의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c67) 제1 항원이 CD4이며, 제2 항원이 CD127이며, 표적 세포가 Treg 이외의 CD4 양성 T 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, T 세포 의존적인 면역 관련 질환을 들 수 있다.
c68) 제1 항원이 CD40 리간드이며, 제2 항원이 IL-6이며, 표적 세포가 활성화 T 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 면역 관련 질환을 들 수 있다.
c69) 제1 항원이 IL-17R이며, 제2 항원이 막형 TNF이며, 표적 세포가 IL17R 및 막형 TNF 발현 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 건선성 관절염을 들 수 있다.
c70) 제1 항원이 IL-23R이며, 제2 항원이 CCR6이며, 표적 세포가 Th17 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 쇼그렌 증후군 및 건선의 적어도 한쪽을 포함하는 자기면역 질환을 들 수 있다.
c71) 제1 항원이 CD64이며, 제2 항원이 CD206, CD163 및 CD68에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 M2 마크로파지인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다.
c72) 제1 항원이 CD163이며, 제2 항원이 CD206 또는 CD68이며, 표적 세포가 M2 마크로파지인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다.
c73) 제1 항원이 CD206이며, 제2 항원이 CD68이며, 표적 세포가 M2 마크로파지인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다.
c74) 제1 항원이 CD14이며, 제2 항원이 CD48, CD84, CD97 및 CD305에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 골수 유래 억제성 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다.
c75) 제1 항원이 CD15이며, 제2 항원이 CD48, CD84, CD97 및 CD305에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 골수 유래 억제성 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다.
c76) 제1 항원이 CD33이며, 제2 항원이 CD48, CD84, CD97 및 CD305에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 골수 유래 억제성 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다.
c77) 제1 항원이 CD11b이며, 제2 항원이 CD48, CD84, CD97 및 CD305에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 골수 유래 억제성 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 암을 들 수 있다.
c78) 제1 항원이 CCR4이며, 제2 항원이 CADM1, CD30 및 CD70에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 종양 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 백혈병 및 림프종의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c79) 제1 항원이 CD38이며, 제2 항원이 CD138 또는 BCMA이며, 표적 세포가 종양 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 백혈병 및 림프종의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c80) 제1 항원이 BCMA이며, 제2 항원이 CD56 또는 CS1이며, 표적 세포가 종양 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 백혈병 및 림프종의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c81) 제1 항원이 CD40 리간드이며, 제2 항원이 CD36, CD62P 및 CD63에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 이상 거핵구인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 백혈병 및 림프종의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c82) 제1 항원이 TIM-3이며, 제2 항원이 CD123, CD33, CD47, CD70 및 CLEC12A에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 종양 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 백혈병 및 림프종의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c83) 제1 항원이 CD123이며, 제2 항원이 CD33, CD47, CD70 및 CLEC12A에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 종양 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 백혈병 및 림프종의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c84) 제1 항원이 CD5이며, 제2 항원이 CD23이며, 표적 세포가 종양 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 백혈병 및 림프종의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c85) 제1 항원이 CD10 또는 CD5이며, 제2 항원이 CD20이며, 표적 세포가 종양 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 백혈병 및 림프종의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c86) 제1 항원이 CD40이며, 제2 항원이 CD80, CD86, ICOS 리간드, 4-1BB 리간드, OX40 리간드, CD70, GITR, PD-L1, PD-L2, B7-DC, B7H3, B7H4, B7H5, B7H6 및 B7H7에서 선택되는 하나이며, 표적 세포가 활성화 항원 제시 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 염증성 질환을 들 수 있다.
c87) 제1 항원이 PTPRS이며, 제2 항원이 IL-21R이며, 표적 세포가 형질 세포양 수지상 세포(pDC, plasmacytoid dendritic cells), T 세포 및 B 세포에서 선택되는 적어도 하나인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 자기면역 질환을 들 수 있다.
c88) 제1 항원이 PTPRS이며, 제2 항원이 CD38이며, 표적 세포가 형질 세포양 수지상 세포(pDC), 활성화 T 세포, B 세포 및 형질 세포에서 선택되는 적어도 하나인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 자기면역 질환을 들 수 있다.
c89) 제1 항원이 PTPRS이며, 제2 항원이 CD32a이며, 표적 세포가 형질 세포양 수지상 세포(pDC) 및 마이엘로이드 세포의 적어도 한쪽인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 자기면역 질환을 들 수 있다.
c90) 제1 항원이 OX40이며, 제2 항원이 CD127 또는 CD40 리간드이며, 표적 세포가 Treg 이외의 helper T 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 알레르기 질환을 들 수 있다.
c91) 제1 항원이 OX40이며, 제2 항원이 CD8 또는 NKG2D이며, 표적 세포가 CD8 memory T 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 심상성 백반 및 건선의 적어도 한쪽을 들 수 있다.
c92) 제1 항원이 OX40이며, 제2 항원이 CD226이며, 표적 세포가 CD8 memory T 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 강피증을 들 수 있다.
c93) 제1 항원이 OX40이며, 제2 항원이 CRTH2이며, 표적 세포가 활성화 Th2 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 알레르기 질환을 들 수 있다.
c94) 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 CD2이며, 표적 세포가 Th2 세포 및 자연 림프구(ILC2 세포)의 적어도 한쪽인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 알레르기 질환을 들 수 있다.
c95) 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 CD7이며, 표적 세포가 Th2 세포 및 자연 림프구(ILC2 세포)의 적어도 한쪽인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 알레르기 질환을 들 수 있다.
c96) 제1 항원이 CRTH2이며, 제2 항원이 CD45이며, 표적 세포가 CRTH2 양성 혈구 세포인, 항체 조성물.
해당 항체 조성물을 포함하는 의약 조성물의 치료 대상 질환으로서는, 알레르기 질환을 들 수 있다.
[표 6A]
Figure pct00008
[표 6B]
Figure pct00009
[표 6C]
Figure pct00010
[표 6D]
Figure pct00011
[표 6E]
Figure pct00012
본 발명의 항체 조성물을 함유하는 의약 조성물은, 치료약으로서 단독으로 투여하는 것도 가능하기는 하지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 1개 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에 있어서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는, 치료 시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 및 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 항체 조성물 제제의 경우, 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다.
투여 형태로서는, 예를 들어 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로서는, 예를 들어 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다.
유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은, 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜 혹은 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 호마유 혹은 올리브유, 대두유 등의 유류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 또는 스트로베리 플레이버 혹은 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 사용해서 제조할 수 있다.
캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등은, 유당, 포도당, 자당 혹은 만니톨 등의 부형제, 전분 혹은 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘 혹은 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스 혹은 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면 활성제, 또는 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용해서 제조할 수 있다.
비경구 투여에 적당한 제제로서는, 예를 들어 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다.
주사제는, 염용액 혹은 포도당 용액 또는 양자의 혼합물을 포함하는 담체 등을 사용해서 조제된다. 또는, 항체 조성물을 통상법에 따라서 동결 건조하고, 이것에 염화나트륨을 첨가함으로써 분말 주사제를 조제할 수도 있다.
좌제는 카카오 버터, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용해서 조제된다.
또한, 분무제는 해당 항체 조성물 그 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 해당 항체 조성물을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용해서 조제된다.
담체로서, 구체적으로는, 유당, 글리세린 등이 예시된다. 해당 항체 조성물 및 사용하는 담체의 성질에 따라, 에어로졸, 드라이 파우더 등의 제제가 가능하다. 또한, 이러한 비경구제에 있어서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
투여량 또는 투여 횟수는, 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 유효 성분의 양으로서, 통상 성인 1일당 10㎍/kg 내지 20mg/kg이다.
또한, 항체 조성물의 각종 종양 세포에 대한 항종양 효과를 검토하는 방법은, 인비트로 실험으로서는, CDC 활성 측정법, ADCC 활성 측정법 등을 들 수 있고, 인비보 실험으로서는, 마우스 등의 실험 동물에서의 종양계를 사용한 항종양 실험 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 양태로서는, 제1 및 제2 IgG 반량체를 포함하는 키트를 들 수 있다. 키트에는, 임의로, 적당한 용기(예를 들어, 보틀, 바이알, 시험관), 설명 등이 기재된 라벨, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 설명서를 포함하는, 기타 재료를 포함하고 있어도 된다.
상기 키트에 있어서는, 유효 성분인 IgG 반량체 이외에, 예를 들어 멸균수, 생리 식염수, 식물유, 계면 활성제, 지질, 용해 보조제, 완충제, 단백질 안정제(예를 들어, BSA 또는 젤라틴 등), 보존제, 블로킹 용액, 반응 용액, 반응 정지액, 시료를 처리하기 위한 시약 등이 필요에 따라서 혼합되어 있어도 된다.
상기 키트의 사용 양태로서는, 예를 들어 (1) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체를 미리 혼합한 뒤에 투여하는 방법, 그리고 (2) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체를 따로따로 투여하는 방법을 들 수 있다. 상기 (2) 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체를 따로따로 투여하는 방법으로서는, 예를 들어, 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 방법을 들 수 있다. 제1 IgG 반량체 및 제2 반량체의 양 및 비율은 적절히 조정할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양태로서, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 포함하고, 또한 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물의 제조에 사용하기 위한 제1 IgG 반량체를 들 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태로서, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 포함하고, 또한 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물의 제조에 사용하기 위한 제2 IgG 반량체를 들 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 제2 IgG 반량체와 병용하는 제1 IgG 반량체를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 일 양태로서, 제1 IgG 반량체와 병용하는 제2 IgG 반량체를 들 수 있다. 여기서, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 「병용한다」란, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 동시 또는 순차적으로 투여하고, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 포함하고, 또한 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 반량체를 포함하는 항체 조성물로 하는 것을 말한다. 제1 반량체와 제2 반량체를 동시 또는 순차적으로 투여하는 경우, 주사용 바이알에서 혼화하는 경우, 링거 백 내에서 혼화하는 경우, 또는 직접 환자에게 투여하는 경우, 어느 형태로 투여되는 경우든 본 발명의 항체 조성물의 사용에 포함된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 발명자들은 본 발명에서의 항체 분자의 정상 영역에는, 통상의 인간 IgG1 항체와 다른 하기 요소가 필요하다고 착상했다.
1) 도 4에 도시하는 바와 같이, 다른 항원 분자 X 및 Y에 대한 항체의 반량체의 혼합물일 것, 즉 힌지 영역에서의 H쇄간의 디술피드 결합에 의한 공유 결합이 존재하지 않는 「HL체」일 것.
2) 도 3에 도시한 바와 같이, 항원 분자 X, Y에 대한 각각의 HL체가, X, Y 양쪽을 발현하는 표적 세포 표면에 결합한 후에 회합해서 통상의 IgG와 마찬가지의 H2L2체를 형성하고, CD16a 결합 영역을 구성하여, 항체의 이펙터 기능(예를 들어, ADCC 활성)을 야기할 것.
3) 도 3에 도시한 바와 같이, 단일한 항원 분자만을 발현하는 세포에 대해서는 항체의 활성을 야기하지 않도록, X 혹은 Y에 대한 HL체끼리가 세포 표면에서 회합해도 CD16a 결합 영역을 구성하지 않을 것.
본 실시예에서, 상기 1)에 대해서는 힌지 도메인의 시스테인을 알라닌으로 치환함으로써 시도했다.
X선 결정 구조 해석에 의해, 인간 IgG1의 Fc와 CD16a는 비대칭인 결합 양식을 나타내는 것으로 알려져 있다(Nature 2000; 406: 267-73, J Biol Chem 2001; 276: 16469-77, Mizushima T, Genes Cells 2011; 16: 1071-80). 따라서, 본 발명자들은, 상기 2) 및 3)을 달성하기 위해서, 상기 HL체의 CH2 도메인에, 이러한 비대칭의 결합 양식을 이용한 하기에 설명하는 아미노산 개변을 도입하는 것을 착상했다.
도 5에 도시하는 바와 같이, CD16a는 Fc 중의 2개의 CH2 도메인에, 각각 별도의 부위에서 접한다. 가령 2개의 CH2 도메인을 CH2-A, CH2-B라고 명명하고, CH2-A 상에서의 CD16a와의 상호 작용 부위를 영역 1, CH2-B 상에서의 CD16a와의 상호 작용 부위를 영역 2로 한다.
영역 1로서는 L235, G236, G237, P238, S239, D265, V266, S267, H268, E269, E294, Q295, Y296, N297, S298, T299, R301, N325, A327 및 I332 등이 알려져 있다. 또한, 영역 2로서는 L235, G236, G237, K326, A327, L328, P329 및 A330 등이 알려져 있다.
도 5에 도시하는 바와 같이, Fc의 구조의 대칭성에 의해, 실제의 Fc와 CD16a가 결합하고 있는 결합 영역의 반대측에, CH2-A의 영역 2 및 CH2-B의 영역 1을 포함하는, 실제로는 CD16a와의 결합에 사용되지 않은 결합 영역이 또 하나 존재한다.
도 6에 도시하는 바와 같이, 이 CD16a와의 결합에 사용되지 않은 CH2-A의 영역 2 및 CH2-B의 영역 1을, 각각 아미노산 개변을 도입해서 「파괴」한다. 이 경우, 그러한 개변 CH2-A를 갖는 HL체(X)끼리, 혹은 개변 CH2-B를 갖는 HL체(Y)끼리가 호모 회합해서 H2L2체를 구성한 경우(XX, YY)에는, 영역 1밖에, 혹은 영역 2밖에 존재하지 않게 된다. 따라서, 이들 호모 회합체는, CD16a는 충분한 친화성을 갖고 결합할 수 없을 가능성이 생각된다. 이에 반해, 그러한 개변 CH2-A, 개변 CH2-B를 각각 구성 요소로서 갖는 HL체가 헤테로 회합한 H2L2체(XY)는, 상기 2) 및 3)의 조건을 충족할 가능성이 생각된다.
[실시예 1]
CD16a 결합을 「파괴」한 인간 IgG1 항CCR6 항체의 제작
CD16a의 결합을 감약시킬 수 있는 CH2 상의 부위를 특정하기 위해서, 상기 영역 1 또는 영역 2를 아미노산 개변에 의해 「파괴」한 항체를 제작했다. 즉, 도 7에 도시하는 바와 같이, 통상의 인간 IgG1의 포맷 상에서, 후보가 되는 부위의 아미노산 잔기를 개변했다.
이 경우 재조합 항체로서 인간 IgG1을 발현시키기 위해서 2개의 H쇄는 발현 벡터 상에서 동일한 유전자로 코드되어 CH2-A와 CH2-B의 구별이 없이 양쪽에 동시에 아미노산 잔기가 개변되고, CD16a의 결합 부위는 표리의 2군데가 동시에 파괴되기 때문에, ADCC 활성이 감약하는 개변 부위를 탐색하게 된다.
또한, 본 실시예에서, 특별히 설명이 없는 한 항체 분자는 모두, H쇄 297위의 아스파라긴에 결합하는 N-결합형 당쇄의 α1,6 푸코오스가 결합하고 있지 않은, ADCC 활성이 증강되어 있는 항체를 제작했다. 그 때문에 항체를 발현하기 위한 숙주 세포에는, 푸코오스 전이 효소(FUT8) 녹아웃 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호)를 사용했다.
(1) CD16a 결합을 「파괴」한 인간 IgG1 항CCR6 항체 발현 벡터의 제작
도 5 및 6에 CH2 도메인 상의 「영역 1」 및 「영역 2」의 모식도를 나타낸다. 도 6에 도시하는 바와 같이, CD16a에 대한 결합을 「파괴」하기 위해서, CH2 도메인 상의 「영역 1」에서 CD16a와 결합하는 아미노산 부위 P238, D265, S267, CH2 도메인 상의 「영역 2」에서 CD16a와 결합하는 아미노산 부위 K326, L328, P329에 대하여, 아미노산 개변을 도입한 인간 IgG1 항인간 CCR6 항체(국제 공개 제2013/005649호)의 발현 벡터를 구축했다. 구축에 사용한 항체의 유전자 서열과 아미노산 서열을 표 7에 나타낸다.
Figure pct00013
서열 번호 1, 3, 5, 7에 나타내는 염기 서열을 포함하는, 인간 IgG1 항인간 CCR6 항체 발현 벡터 pCI-IgG1_KG1684를 주형으로 사용하고, PrimeSTAR Max DNA Polymerase(다카라 바이오) 및 개변 부위를 도입한 프라이머(시그마 올리고)를 사용하여, PrimeSTAR Max DNA Polymerase의 첨부 문서에 따라서 PCR 반응을 행했다.
PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 사용하여, 98℃, 1분간 열변성 후, 98℃에서 10초간, 58℃에서 5초간, 72℃에서 5초간의 반응을 30사이클 행했다. 0.8％ 아가로오스 겔을 사용한 전기 영동에 반응액을 제공하여, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)를 사용해서 증폭 단편을 회수했다. In-Fusion HD Cloning Kit(클론테크)를 사용해서 플라스미드 pCI vector(프로메가)와 연결 반응을 행하고, 해당 반응액을 사용해서 대장균 DH5α 컴피턴트 세포(다카라 바이오)를 형질 전환했다.
얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems)을 사용해서 첨부의 설명서에 따라서 반응 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석했다.
(2) CD16a 결합을 「파괴」한 인간 IgG1 항CCR6 항체의 발현
이하의 방법으로, 숙주 세포에 (1)에서 제작된 발현 벡터를 도입했다. 숙주 세포에는, FUT8 녹 아웃 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호)를 사용했다. 플라스미드 도입의 방법은 첨부의 설명서에 따랐다.
배양액량은 200mL로 행하고, 37℃, 5％ CO2, 125rpm의 설정 조건 하에서, 5일간 배양했다. 배양 후, 세포 현탁액의 원심 분리를 행하여, 0.2㎛ 필터(Thermo Scientific)를 통해서 개변 항체를 포함하는 배양 상청을 회수했다.
각 항체의, 정제한 항체 샘플의 명칭을 표 8에 나타낸다.
Figure pct00014
(3) CD16a 결합을 「파괴」한 인간 IgG1 항CCR6 항체의 정제
이하에 나타내는, MabSelect SuRe(GE 헬스케어)를 사용한 어피니티 정제에 의해, 개변 항체를 정제했다. 레진을 PBS로 평형화한 후, (2)에서 취득된 배양 상청을 로드하여, PBS로 2회 세정했다. 세정 후, 용출 버퍼(100mM 시트르산, pH3.5)를 사용해서 항체를 용출하고, 중화 버퍼(2M Tris-HCl, pH8.0)를 1/10양 첨가해서 중화했다.
계속해서, Amicon Ultra-4 Centerifugal Filter Units(밀리포어)을 사용해서 한외 여과에 의한 농축 및 버퍼(10mM 시트르산, 150mM NaCl, pH6.0) 치환을 행하고, Nanodrop 8000(Thermo Scientific)을 사용해서 280nM에서의 흡광도(A280)를 측정하고, 항체 용액의 농도 측정 및 조제를 행했다.
(4) CD16a 결합을 「파괴」한 인간 IgG1 항CCR6 항체의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
각종 CD16 결합을 결손한 인간 IgG1 항CCR6 항체 정제 샘플의 정제도를 평가하기 위해서, 약 1㎍의 항체 정제 샘플을 사용하여, 공지의 방법[Nature, 227680(1970)]에 따라서 SDS 변성 폴리아크릴아미드 전기 영동(이하, SDS-PAGE라고 표기함)을 행했다.
그 결과, 환원 조건 하에서, 각종 CD16 결합을 결손한 인간 IgG1 항CCR6 항체는, 통상 IgG1형과 마찬가지로, H쇄가 약 50킬로달톤(이하, kDa이라고 표기함), L쇄가 약 25kDa 부근에 밴드가 인정되었다. 또한, 비환원 조건에서는, 약 150kDa 부근에 밴드가 인정되므로, 제작한 항CCR6 도메인 교환 항체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성되어 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 CD16 결합을 결손한 인간 IgG1 항CCR6 항체의 정제 샘플 중에는, 각각 H쇄 및 L쇄로 구성되는 목적으로 하는 IgG 분자가 충분한 비율로 포함되는 것이 확인되었다.
(5) CD16a 결합 영역을 「파괴」한 인간 IgG1 항CCR6 항체의 ADCC 활성
이펙터 세포로서 NK 세포주인 NK-92(ATCC)에 인간 CD16a(Val형)를 코드하는 DNA를 유전자 도입해서 안정적으로 발현시킨 NK-92/CD16 트랜스펙턴트를, 표적 세포로서 인간 CCR6/CHO 트랜스펙턴트를 사용했다. 배양하고 있던 각각의 세포를 회수·세포를 카운트하여, 각각 8×105cells/mL, 2×105cells/mL가 되도록 RPMI 배지(5％ FBS/1％PS를 첨가한 페놀레드 프리인 RPMI1640 배지)를 사용해서 조제했다.
96well plate에 항체 용액을 50μL/well씩 연속 분주기로 분주 후, 표적 세포를 50μL/well씩 분주했다. 이펙터 세포를 50μL/well씩 분주하고, 1800rpm으로 2분간 원심 분리하여, 세포가 균등하게 파종되어 있는 것을 확인했다.
CO2 인큐베이터에서 37℃, 3시간 15분간 정치 후, Total 컨트롤에 10분의 1양의 가용화 용액을 분주하여, 37℃, 45분간 정치했다. 1800rpm으로 2분간 원심 분리 후, 상청 50μL를 ELISA 플레이트에 분주했다. 기질(분)을 현탁 버퍼 12mL에 녹여서 발색 용액을 제작하여, 발색 용액을 50μL/well씩 어플라이해서 반응시켰다. 정지 용액 50μL/well을 첨가하여, 플레이트 리더로 흡광도(A450)를 측정했다.
또한 ADCC 측정용 키트로서, CytoTox 96(R) Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(프로메가)를 사용했다. 이하의 식을 사용해서 ADCC 활성(％)을 산출했다.
ADCC 활성(％)=100×(S-E-T)/(Max-T)
S=샘플 반응 웰 흡광도-배지 웰 흡광도
E=이펙터 웰 흡광도-배지 웰 흡광도
T=표적 웰 흡광도-배지 웰 흡광도
Max=100％ 반응 웰-100％ 반응 대조 웰
결과를 도 8에 나타낸다. 도 8에 도시하는 바와 같이, CH2의 영역 1에서는 IgG1_D265A, IgG1_P238A/S267L, IgG1_D265A/S267L을 포함하는 개변체가, 표적 세포에 대하여 현저하게 ADCC 활성이 감약하는 것이 확인되었다.
또한 CH2의 영역 2에서는, IgG1_P329Y, IgG1_K326W/P329Y, IgG1_L328V/P329Y, IgG1_K326W/L328V/P329Y를 포함하는 개변체가, 현저하게 ADCC 활성이 감약하는 것이 확인되었고, 어느 개변체에 있어서든 P329Y 개변이 포함되는 것을 알았다.
이상의 결과로부터, CH2 도메인 상의 「영역 1」에서는, D265A 또는 P238A/S267L의 아미노산 개변을 도입함으로써, CH2 도메인 상의 「영역 2」에서는 적어도 P329Y의 아미노산 개변을 도입함으로써, CD16a 결합 부위를 파괴할 수 있는 것이 명확해졌다.
[실시예 2]
CD16a 결합 비대칭 개변을 도입한 인간 IgG1 항CCR6 1가 항체의 제작
실시예 1에서, CD16a와 Fc의 비대칭 결합 부위를 파괴할 수 있는 아미노산 서열의 일례로서, CH2-A에서는 「영역 1」 유래의 D265A 또는 P238A/S267L, CH2-B에서는 「영역 2」 유래의 P329Y를 선택했다.
본 항에서는, CH2-A와 CH2-B에만 각각 상기 개변을 비대칭으로 도입해서 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 2분자의 H쇄를 코드하는 개별 유전자를 발현시켜, 그것들을 헤테로 회합시킬 수 있는 「1가 항체」(국제 공개 제2011/108502호)를 기본 골격으로 사용하는 것으로 했다. 도 9에 이러한 1가 항체의 일 양태의 모식도를 나타낸다. 도 9 중, 상기 헤테로 회합체는 「비대칭 개변체 #1」이다.
(1) CD16a 결합 비대칭 개변 1가 항체 발현 벡터의 제작
CH2-A(D265A 또는 P238A/S267L), CH2-B(P329Y)를 비대칭 혹은 대칭으로 도입한 인간 IgG1 항CCR6 1가 항체(국제 공개 제2011/108502호)의 발현 벡터를 구축했다.
인간 IgG1 항CCR6 1가 항체 발현 벡터 pCI-mvG1_KG1684를 주형으로 사용하고, PrimeSTAR Max DNA Polymerase(다카라 바이오) 및 개변 부위를 도입한 프라이머(시그마 올리고)를 사용하여, PrimeSTAR Max DNA Polymerase의 첨부 문서에 따라서 PCR 반응을 행했다.
PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 사용하여, 98℃, 1분간 열변성 후, 98℃에서 10초간, 58℃에서 5초간, 72℃에서 5초간의 반응을 30사이클 행했다.
0.8％ 아가로오스 겔을 사용한 전기 영동에 반응액을 제공하여, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)를 사용해서 증폭 단편을 회수했다. In-Fusion HD Cloning Kit(클론테크)를 사용해서 플라스미드 pCI vector(프로메가)와 연결 반응을 행하고, 해당 반응액을 사용해서 대장균 DH5α 컴피턴트 세포(다카라 바이오)를 형질 전환했다.
얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems)을 사용해서 첨부의 설명서에 따라서 반응 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석했다.
(2) CD16a 결합 비대칭 개변 1가 항체의 발현
실시예 1의 제2항과 마찬가지의 방법으로, 당해 항체의 발현을 행하여, 항체를 포함하는 배양 상청을 회수했다. 각 정제 항체 샘플과 그 개변 부위를 표 9에 나타낸다. 또한, 개변 부위에서의 아미노산 잔기 치환은 실시예 1과 마찬가지의 방법에 의해 행했다.
Figure pct00015
(3) CD16a 결합 비대칭 개변 1가 항체의 정제
실시예 1의 제3항과 마찬가지의 방법으로 당해 항체의 정제를 행했다. 용출 버퍼는 100mM 시트르산, pH3.9를 사용했다. 그 후, AKTA FPLC(GE 헬스케어) 및 Superdex High-performance Column(GE 헬스케어)을 사용하여, 해당 항체 용액으로부터 단량체 획분을 분취했다. AKTA 시스템 구멍 직경 0.22㎛의 멤브레인 필터(Millex-GV, 밀리포어)로 여과 멸균함으로써 정제 항체를 얻었다. Nanodrop 8000(Thermo Scientific)을 사용해서 280nm에서의 흡광도(A280)를 측정했다.
(4) CD16a 결합 비대칭 개변을 도입한 인간 IgG1 항CCR6 1가 항체의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
각종 CD16a 결합 비대칭 개변을 도입한 인간 IgG1 항CCR6 1가 항체 정제 샘플의 정제도를 평가하기 위해서, 항체 정제 샘플 약 1㎍을 사용해서 SDS-PAGE를 행했다.
그 결과, 환원 조건 하에서, 모든 개변체는, 야생형 1가 항체와 마찬가지로, H쇄 및 Fc 융합 L쇄가 약 50kDa 부근에 밴드가 인정되었다. 또한, 비환원 조건에서는, 약 100kDa 부근에 밴드가 인정되었으므로, 제작한 비대칭 개변체 및 대칭 개변체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성되어 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 CD16a 결합 비대칭 개변을 도입한 인간 IgG1 항CCR6 1가 항체의 정제 샘플 중에는, 각각 H쇄 및 Fc 융합 L쇄로 구성되는 목적으로 하는 1가 항체 분자가 충분한 비율로 포함되는 것이 확인되었다.
(5) CD16a 결합 비대칭 개변 1가 항체의 ADCC 활성
실시예 1의 제5항과 마찬가지의 방법으로, ADCC 활성을 측정했다. 결과를 도 10 나타낸다. 도 10에 도시하는 바와 같이, CD16a 결합의 비대칭 개변을 도입한 1가 항체(비대칭 개변체 #1 내지 4)는, 항체 농도 의존적으로 표적 세포를 상해하는 것이 확인되었다. 한편, CD16a 결합의 대칭 개변을 도입한 1가 항체(대칭 개변체 #1 내지 #5)는, 표적 세포에 대하여 ADCC 활성을 나타내지 않는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, CD16a 결합의 비대칭 개변을 도입한 1가 항체는 인간 CD16a에 대한 결합 활성이 유지되어, 표적 세포에 대하여 ADCC 활성을 발휘할 수 있는 것이 확인되었다.
한편 양쪽의 CH2 도메인에 동일한 개변을 도입한 경우는 ADCC 활성이 상실되므로, 동일한 개변 CH2를 갖는 항체가 세포 표면 상에서 특이항체적인 회합을 한 경우에는 ADCC 활성이 유도되지 않는 것이 확인되었고, 본 발명이 목표로 하는 2개의 항원에 세포 표면 상에서 헤테로 회합해서 비로소 ADCC 활성을 발휘하는 HL 항체를 구성하기 위한 개변 CH2 도메인이 발견되었다.
[실시예 3]
본 실시예에서는, 실시예 1, 2에서 얻어진 헤테로 회합해서 비로소 ADCC 활성을 유도할 수 있는 개변 CH2를, 다른 항원에 대한 2종류의 항체의 반량체(HL체)에 탑재하여, 2종류의 항원을 공발현하는 표적 세포 특이적으로 ADCC 활성을 유도할 수 있는지 여부를 검증했다.
CH3 도메인끼리의 상호 작용은 J Immunol 2011; 187: 3238-3246에서 보고되어 있다. 인간 IgG1의 CH3 도메인의 상호 작용(KD값)은 3.0×10-9M, 인간 IgG4의 CH3 도메인의 KD값은 4.8×10-8M로, 인간 IgG4의 CH3 도메인의 상호 작용은 IgG1보다도 약 6 내지 7배 약하다.
이 성질과 힌지 영역에서의 H쇄간의 디술피드 결합을 절단하는 아미노산 개변(C226A/C229A:AA)을 이용함으로써 항체의 반량체의 제작을 시도했다. 반량체의 H쇄 정상 영역은 인간 IgG1을 기본 골격으로 하고, CH3 도메인만을 인간 IgG4 배열로 교환하고, 또한 힌지 영역에 아미노산 개변(AA)을 더한 도메인 교환 항체(이하, IgG1114_AA형이라고 칭함)를 사용했다.
이에 더하여, ADCC 활성을 강화하기 위해서 공지의 ADCC 활성 증강 아미노산 개변을 CH2 도메인에 실시하고, 또한 Asn297에 결합하는 N-결합형 당쇄의 α1,6 푸코오스를 제거, 마지막으로 CD16a 결합 비대칭 아미노산 개변을 도입했다. 도 11에, IgG1114_AA_AAA_D265A(/P329Y)형의 IgG 반량체의 모식도를 나타낸다. 2종류의 모델 항원으로서, CD4와 CD70을 사용했다.
상기에 나타내는 개변을 조합한, 항CD4 항체(J. Immunol. 1992; 149: 1779-1787) 및 항CD70 항체(국제 공개 제2007/03637호)를 이하의 수순에 따라서 제작했다. IgG1114_AA형에 공지의 ADCC 활성 증강 아미노산 개변(S298A/E333A/K334A:AAA) 개변, CD16a 결합 비대칭 아미노산 개변(D265A 혹은 P329Y)을 도입한 아미노산 서열로 구성되는 H쇄 정상 영역을 갖는 항CD4 및 CD70 항체를 IgG1114_AA_AAA_D265A(/P329Y)형 항CD4 항체의 반량체, IgG1114_AA_AAA_D265A(/P329Y)형 항CD70 항체의 반량체라고 각각 칭한다.
설계된 각종 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체의 각 도메인이 유래하는 서브클래스, 및 H쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 대응을 표 10에 나타낸다. 또한, 사용한 CD4 및 CD70에 대한 항체의 염기 서열과 아미노산 서열을 표 11에 나타낸다.
Figure pct00016
Figure pct00017
(1) 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체 발현 벡터의 제작
인간 IgG1 항CD4 항체 발현 벡터 pCI-IgG1_CD4(이발리주맙(ibalizumab))(서열 번호 5, 7, 41, 43), 혹은 인간 IgG1 항CD70 항체 발현 벡터 pCI-IgG1_CD70(2H5)(서열 번호 5, 7, 45, 47)로부터, 제한 효소 NheI 및 NotI를 사용하여, 약 9kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제했다.
정제한 DNA 단편과, 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인, 힌지 도메인(C226A/C229A 개변을 가한 것), CH2 도메인(S298A/K333A/E334A 개변, D265A 혹은 P329Y 개변을 가한 것), 인간 IgG4 항체의 CH3 도메인을 포함하는 인공 합성 유전자를 In-Fusion HD Cloning Kit(클론테크)를 사용해서 연결 반응을 행하고, 해당 반응액을 사용해서 대장균 DH5α 컴피턴트 세포(다카라 바이오)를 형질 전환했다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하여, 파스맥으로 DNA의 염기 서열을 해석했다.
(2) 각종 항CD4 IgG1 항체 및 항CD70 IgG1 항체 그리고 이들 항체의 반량체의 발현
실시예 1의 제2항과 마찬가지의 방법으로, 당해 항체의 발현을 행하여, 항체를 포함하는 배양 상청을 회수했다.
정제한 항체 샘플의 명칭을 표 12에 나타낸다.
Figure pct00018
(3) 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체의 정제
실시예 1의 제3항과 마찬가지의 방법으로, 당해 항체의 정제를 행하여, 항체 용액의 농도 측정 및 조제를 행했다.
(4) 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
조제한 각종 항체 샘플의 정제도를 평가하기 위해서, 항체 정제 샘플 약 1㎍을 사용하여 SDS-PAGE를 행했다. 결과를 도 12에 나타낸다.
도 12에 도시하는 바와 같이, 정제한 항체는 모두, 환원 조건 하에서 H쇄가 약 50kDa, L쇄가 약 25kDa 부근에 밴드가 인정되었다. 또한, 비환원 조건에서는, 항CD4 IgG1 항체 및 항CD70 IgG1 항체는 약 150kDa, 항CD4 반량체 및 항CD70 반량체는 약 75kDa 부근에 밴드가 인정되므로, 제작한 항CD4 IgG1 항체 및 항CD70 IgG1 항체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성된 항체 구조인 것, 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성되어, 반량체를 형성하기 쉬운 항체 구조로 되어 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체 정제 샘플 중에는, 목적으로 하는 항체 분자가 충분한 비율로 포함되는 것이 확인되었다.
(5) 항CD4 IgG1 항체 및 항CD70 IgG1 항체, 그리고 이들 항체의 반량체의 CD4/CD70 양쪽 양성 세포, CD4 및 CD70 단일 양성 세포에 대한 ADCC 활성
실시예 1의 제5항과 마찬가지의 방법으로 ADCC 활성을 측정했다. 표적 세포는, CD4 단일 양성 세포로서 CD4/EL-4 트랜스펙턴트, CD70 단일 양성 세포로서 MT-1, CD4/CD70 양쪽 양성 세포로서 TL-Om1을 사용했다. 이들 세포에 있어서의 CD4 및 CD70의 발현량을, 플로 사이토미터를 사용하여 측정한 결과를 도 13 나타낸다.
도 13에 도시하는 바와 같이, 목적으로 하는 항원이 세포에 발현하고 있는 것이 확인되었다. 또한, ADCC 활성 평가의 결과를 도 14에 나타낸다. 양성 대조의 항체로서, 항CD4 IgG1 항체 및 항CD70 IgG1 항체를 사용했다.
도 14에 도시하는 바와 같이, 예상대로, CD4/EL-4 트랜스펙턴트에 대해서는 항CD4 항체가, MT-1에 대해서는 항CD70 항체가, TL-Om1에 대해서는 항CD4 항체 및 항CD70 항체가 ADCC 활성을 발휘하는 것으로 나타났다.
한편, 항CD4 항체의 반량체 1과 항CD70 항체의 반량체 2를 혼합한 항체 용액, 혹은 항CD4 항체의 반량체 2와 항CD70 항체의 반량체 1을 혼합한 항체 용액은, CD4 및 CD70 단일 양성 세포에 대해서는 ADCC 활성을 나타내지 않고, CD4/CD70 양쪽 양성 세포에 대해서만 특이적으로 ADCC 활성을 발휘하는 것으로 나타났다.
[실시예 4]
제1 CD16a 결합 영역에서, EU 인덱스에서 나타내지는 235위, 239위, 265위, 267위, 269위, 296위, 298위, 299위, 327위를, 제2 CD16a 결합 영역에서, EU 인덱스에서 나타내지는 326위, 328위, 329위, 330위를 각각 아미노산 잔기 개변함으로써 CD16a 결합을 파괴한 개변 CH2를, 다른 항원에 대한 2종류의 항체의 반량체(HL체)에 탑재하여, 2종류의 항원을 공발현하는 표적 세포 특이적으로 ADCC 활성을 유도할 수 있는지 여부를 검증했다.
설계된 각종 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체는, 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 조제하여, ADCC 활성을 평가했다. 항CD4 반량체와 항CD70 반량체를 혼합한 항체 용액은 1㎍/mL가 되도록 첨가했다. 동일하게, 양성 대조의 항체로서 사용한, 항CD4 IgG1 항체 및 항CD70 IgG1 항체도 1㎍/mL가 되도록 첨가했다. 설계된 각종 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체의 각 도메인이 유래하는 서브클래스 및 H쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 대응을 표 13에 나타낸다.
Figure pct00019
도 15a 내지 도 15h에 도시하는 바와 같이, 제1 CD16a 결합 영역을 아미노산 개변한 CH2를 탑재한 항CD4 항체의 반량체와, 제2 CD16a 결합 영역을 아미노산 개변한 CH2를 탑재한 항CD70 항체의 반량체를 혼합한 항체 용액은, CD4 및 CD70 단일 양성 세포에 대해서는 ADCC 활성을 나타내지 않고, CD4/CD70 양쪽 양성 세포에 대해서만 특이적으로 ADCC 활성을 발휘하는 것으로 나타났다.
[실시예 5] CD16a 결합 증강 아미노산 개변의 탐색
CD16a에 대한 결합을 높이는, 공지의 아미노산 개변은, S298A/E333A/K334A 개변 이외에 많이 알려져 있다(국제 공개 제99/51642호, 국제 공개 제2006/020114호, 국제 공개 제2004/099249호, 국제 공개 제2004/063351호, 국제 공개 제2013/118858호). 본 실시예에서는 S298A/E333A/K334A 개변 이외의 CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 확인했다.
(1) CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 도입한 인간 IgG1 항CCR4 항체 발현 벡터의 제작
인간 IgG1 항 인간 CCR4 항체(국제 공개 제2005/053741호)에 CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 도입한 항체의 발현 벡터를 구축했다. 인간 IgG1 항CCR4 항체 발현 벡터 pCI-IgG1_CCR4(KM2160)(서열 번호 5, 7, 79, 81)로부터, 제한 효소 NheI 및 NotI를 사용하여, 약 9kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제했다.
정제한 DNA 단편과, CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 도입한 항체 Fc를 포함하는 인공 합성 유전자를 In-Fusion HD Cloning Kit(클론테크)를 사용해서 연결 반응을 행하고, 해당 반응액을 사용해서 대장균 DH5α 컴피턴트 세포(다카라 바이오)를 형질 전환했다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하여, 파스맥으로 DNA의 염기 서열을 해석했다.
(2) CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 도입한 인간 IgG1 항CCR4 항체의 발현
이하의 방법으로, 숙주 세포에 (1)에서 제작된 발현 벡터를 도입했다. 숙주 세포에는, FUT8 녹 아웃 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호)를 사용했다. 플라스미드 도입의 방법은 첨부의 설명서에 따랐다.
배양액량은 200mL로 행하고, 37℃, 5％ CO2, 125rpm의 설정 조건 하에서 5일간 배양했다. 배양 후, 세포 현탁액의 원심 분리를 행하여, 0.2㎛ 필터(Thermo Scientific)를 통해서 개변 항체를 포함하는 배양 상청을 회수했다.
(3) CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 도입한 인간 IgG1 항CCR4 항체의 정제
이하에 나타내는, MabSelect SuRe(GE 헬스케어)를 사용한 어피니티 정제에 의해 개변 항체를 정제했다. 레진을 PBS로 평형화한 후, (2)에서 취득된 배양 상청을 로드하여, PBS로 2회 세정했다. 세정 후, 용출 버퍼(100mM 시트르산, pH3.5)를 사용해서 항체를 용출하고, 중화 버퍼(2M Tris-HCl, pH8.0)를 1/10양 첨가해서 중화했다.
계속해서, Amicon Ultra-4 Centerifugal Filter Units(밀리포어)을 사용해서 한외 여과에 의한 농축 및 버퍼(10mM 시트르산, 150mM NaCl, pH6.0) 치환을 행하고, Nanodrop 8000(Thermo Scientific)을 사용해서 280nM에서의 흡광도(A280)를 측정하여, 항체 용액의 농도 측정 및 조제를 행했다.
(4) CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 도입한 인간 IgG1 항CCR4 항체의 정제도의 평가
조제한 각종 항체 샘플의 정제도를 평가하기 위해서, 항체 정제 샘플 약 1㎍을 사용하여, 겔 전기 영동(LabChip GX, 퍼킨 엘머)을 행한 결과, 정제한 항체는 모두, 환원 조건 하에서 H쇄가 약 50kDa, L쇄가 약 25kDa 부근에 밴드가 인정되었다. 또한, 비환원 조건에서는, 약 150kDa 부근에 밴드가 인정되므로, 제작한 항CCR4 IgG1 항체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성된 항체 구조인 것이 확인되었다.
(5) CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 도입한 인간 IgG1 항CCR4 항체의 ADCC 활성
실시예 1의 (5)와 마찬가지의 방법으로, ADCC 활성을 측정했다. 표적 세포로서, TL-Om1(CCR4 양성 세포)을 사용했다. 사용한 항CCR4 항체의 VH 및 VL의 염기 서열 및 아미노산 서열의 서열 번호를 표 14에, CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 도입한 항CCR4 항체의 CH의 염기 서열 및 아미노산 서열을 표 15 및 표 16에 각각 나타낸다.
Figure pct00020
ADCC 활성 평가의 결과를 이하 표 15 및 16에 나타낸다. S298A/E333A/K334A(AAA) 개변을 갖는 IgG1 항체 0.1㎍/mL에서의 ADCC 활성을 100으로 해서, 각종 아미노산 개변을 도입한 항체의 ADCC 활성을 산출했다.
Figure pct00021
Figure pct00022
표 15 및 16에 나타내는 바와 같이, S298A/E333A/K334A(AAA) 이외에도 본 발명의 항체 조성물에 적응할 수 있는 CD16a 결합 증강 아미노산 개변이 확인되었다.
[실시예 6] IgG1의 CH3 도메인에서의 아미노산 치환
실시예 3에서, IgG1114_AA_AAA_D265A(/P329Y)의 IgG 반량체를 사용하여, CD4/CD70 양쪽 양성 세포 특이적으로 ADCC 활성을 발휘하는 것을 나타냈다. 여기에서 사용되고 있는 항체의 Fc 영역의 CH3 도메인에 상당하는 부분은 인간 IgG4의 배열을 사용하고 있다.
CH3 도메인끼리의 상호 작용은, J Immunol 2011: 187: 3238-3246에서 보고되어 있으며, 인간 IgG1의 CH3 도메인의 상호 작용(KD값)은 3.0×10-9M, 인간 IgG4의 CH3 도메인의 KD값은 4.8×10-8M로, 인간 IgG4의 CH3 도메인의 상호 작용은 인간 IgG1보다도 약 6 내지 7배 약하다.
또한, 인간 IgG4의 CH3 도메인의 R409를 인간 IgG1의 K로 치환함으로써, CH3 도메인끼리의 상호 작용이 높아지는 것이 보고되어 있다(Structure 201119: 9: 1274-1282).
나아가, 인간 IgG1의 CH3 도메인 내의 아미노산을 Ala로 치환함으로써, 자유 에너지의 변화로부터 인간 IgG1의 CH3 도메인끼리의 상호 작용에 중요한 아미노산 부위를 동정한 보고도 있다(Biochemistry 1998: 37: 9266-9273). 이것으로부터, 인간 IgG1의 CH3 도메인에 공지의 아미노산 개변을 가함으로써, 인간 IgG1의 CH3 도메인끼리의 상호 작용을 감약시키는 것이 가능하다.
그래서, 인간 IgG1의 CH3 도메인에 아미노산 개변을 가하여, 인간 IgG1의 CH3 도메인끼리의 상호 작용을 감약시킴으로써, 양쪽 양성 세포 특이적으로 ADCC 활성을 발휘할지 여부를 검증했다.
IgG1의 CH3 도메인끼리의 상호 작용을 감약시킨, 항CD4 항체(J. Immunol. 1992; 149; 1779-1787) 및 항CD70 항체(국제 공개 제2007/03637호)를 이하의 수순에 따라서 제작했다.
설계된 각종 항CD4 및 항CD70 반량체의 각 도메인이 유래하는 서브클래스 및 H쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 대응을 표 17에 나타낸다. 인간 IgG1형에, 힌지 영역에서의 H쇄간의 디술피드 결합을 절단하는 아미노산 개변으로서 C266A/C229A:AA, ADCC 활성 증강 아미노산 개변으로서 S239D/I332E:DE, CD16a 결합 비대칭 아미노산 개변으로서 D265A, CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 아미노산 개변으로서 K409R 개변을 도입한 아미노산 서열로 구성되는 H쇄 정상 영역을 갖는 경우, 「IgG1_AA_DE_D265A_K409R」이라고 기재한다.
Figure pct00023
(1) 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체 발현 벡터의 제작
인간 IgG1 항CD4 항체 발현 벡터 pCI-IgG1_CD4(이발리주맙)(서열 번호 5, 7, 41, 43), 혹은 인간 IgG1 항CD70 항체 발현 벡터 pCI-IgG1_CD70(2H5)(서열 번호 5, 7, 45, 47)으로부터, 제한 효소 NheI 및 NotI를 사용하여, 약 9kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제했다.
정제한 DNA 단편과, 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인, 힌지 도메인(C226A/C229A 개변을 가한 것), CH2 도메인(S239D/I332E 개변 및 D265A 또는 P329Y 개변을 가한 것) 및 CH3 도메인(CH3 도메인 상호 작용을 감약시키는 아미노산 개변을 가한 것)을 포함하는 인공 합성 유전자를 In-Fusion HD Cloning Kit(클론테크)를 사용해서 연결 반응을 행하고, 해당 반응액을 사용해서 대장균 DH5α 컴피턴트 세포(다카라 바이오)를 형질 전환했다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하여, 파스맥으로 DNA의 염기 서열을 해석했다.
(2) 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체의 발현
실시예 5와 마찬가지의 방법으로, 숙주 세포에 (1)에서 제작된 발현 벡터를 도입했다.
(3) 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체의 정제
실시예 5와 마찬가지의 방법으로 개변 항체를 정제했다.
(4) 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
실시예 5와 마찬가지의 방법으로, 조제한 각종 항체 샘플의 정제도를 평가한 결과, 정제한 항체는 모두, 환원 조건 하에서 H쇄가 약 50kDa, L쇄가 약 25kDa 부근에 밴드가 인정되었다. 또한, 비환원 조건에서는, 항CD4 IgG1 항체 및 항CD70 IgG1 항체는 약 150kDa, 항CD4 반량체 및 항CD70 반량체는 약 75kDa 부근에 밴드가 인정되므로, 제작한 항CD4 및 항CD70 IgG1 항체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성된 항체 구조인 것, 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성되어, 반량체를 형성하기 쉬운 항체 구조로 되어 있는 것이 확인되었다.
(5) 항CD4 IgG1 항체 및 항CD70 IgG1 항체, 그리고 이들 항체의 반량체의 CD4/CD70 양쪽 양성 세포, CD4 및 CD70 단일 양성 세포에 대한 ADCC 활성
실시예 5와 마찬가지의 방법으로, CH3 도메인끼리의 상호 작용을 감약시키는 아미노산 개변을 가한 항CD4 항체의 반량체와 항CD70 항체의 반량체를 혼합한 항체 조성물의 ADCC 활성을 평가했다. 대조 항체로서, 항CD4 IgG1 항체 및 항CD70 IgG1 항체를 사용했다.
도 16a 및 b에 도시하는 바와 같이, 인간 IgG1의 CH3 도메인끼리의 상호 작용을 감약시키는 아미노산 개변을 가한 항CD4 항체의 반량체와 항CD70 항체의 반량체를 혼합한 항체 용액에서는, CD4 및 CD70 단일 양성 세포에 대한 ADDC 활성과 비교하여, CD4/CD70 양쪽 양성 세포에 대한 ADCC 활성쪽이 강하여, CD4/CD70 양쪽 양성 세포 특이적인 것으로 나타났다.
[실시예 7] 마우스 동태 시험 및 CH2 도메인의 열 안정성의 측정
(마우스 동태 시험)
실시예 1 내지 3에서 얻어진 CD16a 결합 비대칭 개변(D265A 및 P329Y), 실시예 5에서 얻어진 각종 CD16a 결합 증강 개변 및 실시예 6에서 얻어진 인간 IgG1의 CH3 도메인끼리의 상호 작용을 감약시키는 아미노산 개변(K409R)을 조합한 항체 조성물의 동태 시험을 실시했다. 가변 영역에는, 특정 단백질에 반응하지 않는, Clin Cancer Res. 11(8): 3126-3135, 2005에 기재된 항 2,4-디니트로페놀(dinitrophenol)(DNP) IgG1 항체(클론명 DNP2)의 개변 영역을 코드하는 DNA 단편을 사용했다. 항DNP 항체의 VH 및 VL에 대해서, 염기 서열 및 아미노산 서열을 표 18에 나타낸다. 또한, 평가에 사용한 항DNP 항체의 반량체 1 내지 6의 염기 서열 및 아미노산 서열을 표 19에 나타낸다.
Figure pct00024
Figure pct00025
항DNP IgG1 항체 및 항DNP 항체의 반량체는 실시예 6에 기재된 방법과 마찬가지의 방법으로 제작했다. 정제한 항체는 모두, 환원 조건 하에서 H쇄가 약 50kDa, L쇄가 약 25kDa 부근에 밴드가 인정되었다. 또한, 비환원 조건에서는, 항DNP 항체는 약 150kDa, 항DNP 항체의 반량체는 약 75kDa 부근에 밴드가 인정되므로, 제작한 항DNP 항체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성된 항체 구조인 것, 항DNP 항체의 반량체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성되어, 반량체를 형성하기 쉬운 항체 구조로 되어 있는 것이 확인되었다.
항DNP 항체의 반량체 1과 4, 반량체 2와 5 또는 반량체 3과 6을 각각 혼합해서 본 발명의 항체 조성물을 조제했다. BALB/c 마우스에 해당 항체 조성물(1mg/kg)을 미정맥 중에 투여 후, 1시간, 4시간, 24시간, 72시간 후의 혈액을 채취했다. 이소플루란 마취 하에서 란셋을 사용해서 볼을 찔러 혈액을 회수 후, 마이크로테이너(등록 상표)(BD)로 8000rpm, 실온, 10분간 원심 분리함으로써 혈청을 회수했다.
혈청 중에 존재하는 항체량을 AlphaLISA Human Kappa light chain immunoassay kit(AL3023, PerkinElmer)를 사용해서, 혈청 중의 항체 농도를 측정했다. 키트 내의 Kappa light chain으로 검량선을 그렸다. 결과를 도 17에 나타낸다.
도 17에 도시하는 바와 같이, 본 발명의 항체 조성물의 동태는 CD16a 결합 증강 아미노산 개변의 차이에 따라 다양한 동태를 나타내는 것을 알았다. 그 중에서도, S239D/K326T를 갖는 본 발명의 항체 조성물은, 항DNP IgG1 항체에 가까운 동태를 나타내는 것을 알았다.
(CH2 도메인의 Tm값의 측정)
반량체에 도입한 다양한 CD16a 결합 증강 아미노산 개변이 CH2 도메인의 열 안정성에 미치는 영향을 검토하기 위해서, 시차 주사 형광 정량법(Differential Scanning Fluorimetry: DSF)으로 Tm값의 측정을 행했다. CD16a 결합 증강 아미노산 개변이 도입되어 있는 표 20에 나타내는 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체를 [실시예 6]과 마찬가지로 조제했다. 조제한 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체 CH2 도메인의 Tm값을, NanoTemper사 제조 Prometheus NT.48을 사용하여, 승온 속도 조건을 20 내지 95℃, 1℃/분의 조건에서 측정했다.
Figure pct00026
도 17에서 도시한 마우스 PK 시험의 결과와 표 20의 Tm값을 아울러 고찰하면, CH2 도메인의 Tm값이 높은 CD16a 결합 증강 아미노산 개변일수록 혈중 반감기가 긴 경향이 있다. 이에 의해, Tm값을 측정함으로써, 혈중 반감기가 양호한 본 발명의 항체 조성물을 선발할 수 있는 것을 알았다.
[실시예 8] 면역 글로불린을 첨가한 ADCC 활성 시험
실시예 1의 (5)에 기재되는 ADCC 평가계에 대하여, 헌혈 베노글로불린(일본 혈액 제제 기구, #867279694)을 최종 농도로 8질량％가 되도록 첨가함으로써, 인간 체내를 모방한 평가계를 구축했다. 평가한 항체 조성물에 대해서 표 21에 나타낸다.
Figure pct00027
상기 항CD4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체는, [실시예 6]과 마찬가지로 조제했다. 항CD4 항체의 VH 및 VL 및 항CD70 항체의 VH 및 VL은 표 11에 나타내는 것을 사용했다.
실시예 5와 마찬가지의 방법으로, 항CD4 항체의 반량체와 항CD70 항체의 반량체를 혼합한 항체 조성물의 ADCC 활성을 평가했다. 양성 대조의 항체로서, 항CD4 IgG1 항체 및 항CD70 IgG1 항체를 사용했다.
도 18a 내지 c에 도시하는 바와 같이, 본 발명의 항체 조성물은 헌혈 베노글로불린 존재 하에서도, CD4/CD70 양쪽 양성 세포에 대한 특이적인 ADCC 활성을 발휘하는 것이 확인되었다.
[실시예 9] 인간 혈액 재구성계에 의한 ADCC 활성
인간 체내의 상태에 접근시킨 인간 혈액 성분을 포함하는 평가계를 사용하여, 양쪽 양성 세포를 특이적으로 제거할 수 있는지 검토를 행했다. 평가 항체에 대해서 표 22에 나타낸다.
Figure pct00028
(1) 항CD4 항체의 반량체 및 항CCR6 항체의 반량체 발현 벡터의 제작
실시예 5(1)과 마찬가지의 방법으로 벡터를 제작했다.
(2) 항CD4 IgG1 항체 및 항CCR6 IgG1 항체(KG1684) 그리고 이들 항체의 반량체의 발현
실시예 5(2)와 마찬가지의 방법으로 항체를 발현시켰다.
(3) 항CD4 항체의 반량체 및 항CCR6 항체의 반량체의 정제
실시예 5(3)과 마찬가지의 방법으로 항체를 정제했다.
(4) 항CD4 항체의 반량체 및 항CCR6 항체의 반량체의 정제도의 평가
실시예 5(4)와 마찬가지의 방법으로 각 항체의 정제도를 평가한 결과, 정제한 항체는 모두, 환원 조건 하에서 H쇄가 약 50kDa, L쇄가 약 25kDa 부근에 밴드가 인정되었다. 또한, 비환원 조건에서는, 항CD4 IgG1 항체 및 항CCR6 IgG1 항체는 약 150kDa, 항CD4 항체의 반량체 및 항CCR6 항체의 반량체는 약 75kDa 부근에 밴드가 인정되므로, 제작한 항CD4 IgG1 항체 및 항CCR6 IgG1 항체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성된 항체 구조인 것, 항CD4 항체의 반량체 및 항CCR6 항체의 반량체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성되어, 반량체를 형성하기 쉬운 항체 구조로 되어 있는 것이 확인되었다.
(5) 항CD4 항체의 반량체 및 항CCR6 항체의 반량체를 혼합한 항체 조성물의 CD4/CCR6 양쪽 양성 세포에 대한 ADCC 활성
인간 혈액 50mL 중, 20mL를 혈장을 위해서, 30mL를 말초혈 단핵구와 과립구의 획분 회수를 위해서 각각 사용했다. 혈장을 취득하기 위해서, 15mL 원침관에서, 4℃, 2000rpm으로 20분간 원심 분리하여, 상청을 회수했다.
말초혈 단핵구와 과립구의 획분 회수를 위해서, 10mL의 혈액에 대하여 2mL Hetasep(Stemcell technology, #07806)를 첨가하여, 잘 혼화한 후에, 실온에서 50×g로 1분간 원심 분리했다. 분리될 때까지 실온에서 정치한 후, 적혈구 이외의 층을 회수하고, PBS로 50mL까지 만들어, 540×g로 5분간 원심 분리했다.
회수한 혈장과 말초혈 단핵구와 과립구의 획분을 섞어, 5×106cells/mL로 조제하고, 5×105cells/100μL/well로 파종한 후, 항CD4 항체의 반량체 및 항CCR6 항체의 반량체를 혼합한 항체 조성물 20μL, 혈장 80μL를 첨가하여, 37℃에서 24시간 배양했다. 플로 사이토메트리법으로, CD3 양성 T 세포당 CD4/CCR6 양쪽 양성 세포의 비율을 측정했다. 음성 대조로서, 실시예 7에서 사용한 항DNP 항체를 사용했다.
도 19a에 도시하는 바와 같이, 본 발명의 항체 조성물은, 모두 항체 농도 의존적으로 CD4/CCR6 양쪽 양성 세포를 제거하는 한편, CD4 혹은 CCR6 단일 양성 세포는 제거하지 않는 것을 알았다.
[실시예 9-2]
[실시예 9]와는 다른 아미노산 개변을 갖는 본 발명의 항체 조성물을 사용하여, 양쪽 양성 세포를 특이적으로 제거할 수 있는지 검증했다. 평가 항체에 대해서 표 23에 나타낸다.
Figure pct00029
[실시예 9]와 마찬가지로 하여 평가 항체의 조제 및 평가를 실시했다.
도 19b에 도시하는 바와 같이, 본 발명의 항체 조성물은, 모두 항체 농도 의존적으로 CD4/CCR6 양쪽 양성 세포를 제거하는 한편, CD4 혹은 CCR6 단일 양성 세포는 제거하지 않는 것을 알았다.
[실시예 10] 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 항원 결합 도메인을 교체했을 때의 ADCC 활성
제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 항원 결합 도메인을 교체했을 때 ADCC 활성에 미치는 영향을 검증했다. 평가 항체를 표 24에 나타낸다.
Figure pct00030
상기 항CD4 항체의 반량체 및 항CCR4 항체의 반량체, 그리고 양성 대조인 항CD4 IgG1 항체 및 항CCR4 IgG1 항체는 [실시예 5] 및 [실시예 6]과 마찬가지로 조제했다. 항CD4 항체의 VH 및 VL은 표 11에, 항CCR4 항체의 VH 및 VL은 표 14에 나타내는 것을 사용했다.
각각 항CD4 항체와 항CCR4 항체의 반량체 A 내지 D를 농도 1.0㎍/mL가 되도록 등량으로 혼합하여, 항체 용액을 조제했다. 각각의 항체 용액을 CD4/CCR4 양쪽 양성 세포(TL-Om1), CCR4 단일 양성 세포(MT-1), CD4 단일 양성 세포(CD4/EL4)에 대하여 ADCC 활성을 측정한 결과를 도 20에 나타낸다.
도 20에 도시되는 바와 같이, 반량체 A 내지 D를 혼합한 어느 항체 조성물이든, CD4/CCR4 양쪽 양성 세포에 대한 특이적인 ADCC 활성을 발휘하는 것이 확인되었다. 즉, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 항원 결합 도메인을 교체했을 때도, 특이적인 ADCC 활성을 발휘하는 것으로 나타났다.
[실시예 10-2]
[실시예 10]과는 다른 아미노산 개변을 갖는 본 발명의 항체 조성물을 사용하여, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 항원 결합 도메인을 교체했을 때 ADCC 활성에 미치는 영향을 검증했다. 평가 항체를 표 25에 나타낸다.
Figure pct00031
상기 항CD4 항체의 반량체 및 항CCR4 항체의 반량체, 그리고 양성 대조인 항CD4 IgG1 항체 및 항CCR4 IgG1 항체는 [실시예 5] 및 [실시예 6]과 마찬가지로 조제했다. 항CD4 항체의 VH 및 VL은 표 11에, 항CCR4 항체의 VH 및 VL은 표 14에 나타내는 것을 사용했다.
각각 항CD4 항체와 항CCR4 항체의 반량체 E 내지 F를 농도 0.1㎍/mL가 되도록 등량으로 혼합하여, 항체 용액을 조제했다. 각각의 항체 용액을 CD4/CCR4 양쪽 양성 세포(HH), CCR4 단일 양성 세포(L428), CD4 단일 양성 세포(TALL1)에 대하여 ADCC 활성을 측정한 결과를 도 21에 나타낸다.
도 21에 도시되는 바와 같이, 반량체 A 내지 D를 혼합한 어느 항체 조성물이든, CD4/CCR4 양쪽 양성 세포에 대한 특이적인 ADCC 활성을 발휘하는 것이 확인되었다. 즉, 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 항원 결합 도메인을 교체했을 때도, 특이적인 ADCC 활성을 발휘하는 것으로 나타났다.
[실시예 11]
본 발명의 항체 조성물이, 다른 항원의 조합(CCR4 및 CD70)에 있어서도, 양쪽 양성 세포에 대해서만 특이적으로 ADCC 활성을 발휘하는지 여부의 검증을 행했다. 평가 항체를 표 26에 나타낸다.
Figure pct00032
상기 항CCR4 항체의 반량체 및 항CD70 항체의 반량체, 그리고 양성 대조인 항CCR4 IgG1 항체 및 항CD70 IgG1 항체는, [실시예 5] 및 [실시예 6]과 마찬가지로 조제했다. 항CCR4 항체의 VH 및 VL의 염기 서열 및 아미노산 서열은 표 14에, 항CD70 항체의 VH 및 VL의 염기 서열 및 아미노산 서열은 표 11에 나타내는 것을 사용했다.
각각 항CCR4 항체와 항CD70 항체의 반량체 A 내지 D를 농도 0.1㎍/mL가 되도록 등량으로 혼합하여, 항체 용액을 조제했다. 각각의 항체 용액을 CCR4/CD70 양쪽 양성 세포(L428), CCR4 단일 양성 세포(PEER), CD70 단일 양성 세포(SUP-M2)에 대하여 ADCC 활성을 측정한 결과를 도 22에 나타낸다.
도 22에 도시되는 바와 같이, 반량체 A 내지 D를 혼합한 어느 항체 조성물이든, CCR4/CD70 양쪽 양성 세포에 대한 특이적인 ADCC 활성을 발휘하는 것이 확인되었다.
[실시예 12] CD16a 결합 해석
본 발명인 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체의 항체 조성물일 때에만, CD16a에 결합하는 것을 검증했다.
평가 항체로서 이하를 사용했다.
·[실시예 7]에 기재된 항DNP 항체의 반량체 3(265A)
·[실시예 7]에 기재된 항DNP 항체의 반량체 6(329Y)
·[실시예 7]에 기재된 항DNP 항체의 반량체 3 및 6을 혼합한 항체 조성물(265A+329Y)
·[실시예 7]에 기재된 항DNP 항체(양성 대조)
측정에는, BIAcore(BIACORE사 제조)를 사용하고, 측정 방법은 J. Immunol. Methods, 200, 121(1997)의 기재에 준하는 이하의 방법으로 행했다.
BIAcore T100(BIACORE사 제조)을 사용하여, 각 평가 항체와 CD16a의 상호 작용 해석을 행했다. 런닝 버퍼에는 HBS-EP+10X(GE 헬스케어)를 10분의 1로 희석해서 사용하고, 측정 온도는 25℃로 했다. Series S Sensor Chip CM5(GE 헬스케어)에, Human Fab Capture Kit(GE 헬스케어)로 고정화한 칩을 사용했다.
이 센서 칩에 목적으로 하는 평가 항체를 캡쳐하여, 런닝 버퍼로 희석한 CD16a를 상호 작용시켜서 측정을 행했다. 또한, Human Fab Capture Kit(GE 헬스케어) 부속의 버퍼를 반응시킴으로써, 센서 칩에 캡쳐한 평가 항체를 세정하여, 센서 칩을 재생해서 반복 사용했다. 도 23에 측정 결과를 나타낸다.
도 23에 도시하는 바와 같이, 항DNP 항체의 반량체 3(265A) 단독 및 항DNP 항체의 반량체 6(329Y) 단독일 때는 CD16a에의 결합 활성은 확인되지 않고, 항DNP 항체의 반량체 3(265A)과 항DNP 항체의 반량체 6(329Y)의 항체 조성물일 때만, CD16a에의 결합 활성이 확인되었다.
본 발명을 특정 양태를 사용해서 상세하게 설명했지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 변형이 가능한 것은, 당업자에게 있어서 명확하다. 또한, 본 출원은, 2020년 4월 1일자로 출원된 일본 특허 출원(일본 특허 출원 제2020-066313) 및 2020년 10월 29일자로 출원된 일본 특허 출원(일본 특허 출원 제2020-181493)에 기초하고 있으며, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1: 인간 CCR6 (KG1684) VL의 염기 서열
서열 번호 2: 인간 CCR6 (KG1684) VL의 아미노산 서열
서열 번호 3: 인간 CCR6 (KG1684) VH의 염기 서열
서열 번호 4: 인간 CCR6 (KG1684) VH의 아미노산 서열
서열 번호 5: 인간 IgG1 CK의 염기 서열
서열 번호 6: 인간 IgG1 CK의 아미노산 서열
서열 번호 7: 인간 IgG1 CH의 염기 서열
서열 번호 8: 인간 IgG1 CH의 아미노산 서열
서열 번호 9: 인간 IgG1_P238A CH의 염기 서열
서열 번호 10: 인간 IgG1_P238A CH의 아미노산 서열
서열 번호 11: 인간 IgG1_D265A CH의 염기 서열
서열 번호 12: 인간 IgG1_D265A CH의 아미노산 서열
서열 번호 13: 인간 IgG1_S267L CH의 염기 서열
서열 번호 14: 인간 IgG1_S267L CH의 아미노산 서열
서열 번호 15: 인간 IgG1_P238A/D265A CH의 염기 서열
서열 번호 16: 인간 IgG1_P238A/D265A CH의 아미노산 서열
서열 번호 17: 인간 IgG1_P238A/S267L CH의 염기 서열
서열 번호 18: 인간 IgG1_P238A/S267L CH의 아미노산 서열
서열 번호 19: 인간 IgG1_D265A/S267L CH의 염기 서열
서열 번호 20: 인간 IgG1_D265A/S267L CH의 아미노산 서열
서열 번호 21: 인간 IgG1_P238A/D265A/S267L CH의 염기 서열
서열 번호 22: 인간 IgG1_P238A/D265A/S267L CH의 아미노산 서열
서열 번호 23: 인간 IgG1_K326W CH의 염기 서열
서열 번호 24: 인간 IgG1_K326W CH의 아미노산 서열
서열 번호 25: 인간 IgG1_L328V CH의 염기 서열
서열 번호 26: 인간 IgG1_L328V CH의 아미노산 서열
서열 번호 27: 인간 IgG1_P329Y CH의 염기 서열
서열 번호 28: 인간 IgG1_P329Y CH의 아미노산 서열
서열 번호 29: 인간 IgG1_K326W/L328V CH의 염기 서열
서열 번호 30: 인간 IgG1_K326W/L328V CH의 아미노산 서열
서열 번호 31: 인간 IgG1_K326W/P329Y CH의 염기 서열
서열 번호 32: 인간 IgG1_K326W/P329Y CH의 아미노산 서열
서열 번호 33: 인간 IgG1_L328V/P329Y CH의 염기 서열
서열 번호 34: 인간 IgG1_L328V/P329Y CH의 아미노산 서열
서열 번호 35: 인간 IgG1_K326W/L328V/P329Y CH의 염기 서열
서열 번호 36: 인간 IgG1_K326W/L328V/P329Y CH의 아미노산 서열
서열 번호 37: 인간 IgG1114_AA_AAA_D265A CH의 염기 서열
서열 번호 38: 인간 IgG1114_AA_AAA_D265A CH의 아미노산 서열
서열 번호 39: 인간 IgG1114_AA_AAA_P329Y CH의 염기 서열
서열 번호 40: 인간 IgG1114_AA_AAA_P329Y CH의 아미노산 서열
서열 번호 41: 인간 CD4 (이발리주맙) VL의 염기 서열
서열 번호 42: 인간 CD4 (이발리주맙) VL의 아미노산 서열
서열 번호 43: 인간 CD4 (이발리주맙) VH의 염기 서열
서열 번호 44: 인간 CD4 (이발리주맙) VH의 아미노산 서열
서열 번호 45: 인간 CD70 (2H5) VL의 염기 서열
서열 번호 46: 인간 CD70 (2H5) VL의 아미노산 서열
서열 번호 47: 인간 CD70 (2H5) VH의 염기 서열
서열 번호 48: 인간 CD70 (2H5) VH의 아미노산 서열
서열 번호 49: 인간 IgG1114_AA_AAA_S239R CH의 염기 서열
서열 번호 50: 인간 IgG1114_AA_AAA_S239R CH의 아미노산 서열
서열 번호 51: 인간 IgG1114_AA_AAA_D265N CH의 염기 서열
서열 번호 52: 인간 IgG1114_AA_AAA_D265N CH의 아미노산 서열
서열 번호 53: 인간 IgG1114_AA_AAA_D265E CH의 염기 서열
서열 번호 54: 인간 IgG1114_AA_AAA_D265E CH의 아미노산 서열
서열 번호 55: 인간 IgG1114_AA_AAA_S267K CH의 염기 서열
서열 번호 56: 인간 IgG1114_AA_AAA_S267K CH의 아미노산 서열
서열 번호 57: 인간 IgG1114_AA_AAA_E269P CH의 염기 서열
서열 번호 58: 인간 IgG1114_AA_AAA_E269P CH의 아미노산 서열
서열 번호 59: 인간 IgG1114_AA_AAA_Y296P CH의 염기 서열
서열 번호 60: 인간 IgG1114_AA_AAA_Y296P CH의 아미노산 서열
서열 번호 61: 인간 IgG1114_AA_AAA_S298E CH의 염기 서열
서열 번호 62: 인간 IgG1114_AA_AAA_S298E CH의 아미노산 서열
서열 번호 63: 인간 IgG1114_AA_AAA_T299A CH의 염기 서열
서열 번호 64: 인간 IgG1114_AA_AAA_T299A CH의 아미노산 서열
서열 번호 65: 인간 IgG1114_AA_AAA_L235R CH의 염기 서열
서열 번호 66: 인간 IgG1114_AA_AAA_L235R CH의 아미노산 서열
서열 번호 67: 인간 IgG1114_AA_AAA_A327I CH의 염기 서열
서열 번호 68: 인간 IgG1114_AA_AAA_A327I CH의 아미노산 서열
서열 번호 69: 인간 IgG1114_AA_AAA_K326G CH의 염기 서열
서열 번호 70: 인간 IgG1114_AA_AAA_K326G CH의 아미노산 서열
서열 번호 71: 인간 IgG1114_AA_AAA_L328R CH의 염기 서열
서열 번호 72: 인간 IgG1114_AA_AAA_L328R CH의 아미노산 서열
서열 번호 73: 인간 IgG1114_AA_AAA_P329K CH의 염기 서열
서열 번호 74: 인간 IgG1114_AA_AAA_P329K CH의 아미노산 서열
서열 번호 75: 인간 IgG1114_AA_AAA_P329W CH의 염기 서열
서열 번호 76: 인간 IgG1114_AA_AAA_P329W CH의 아미노산 서열
서열 번호 77: 인간 IgG1114_AA_AAA_A330P CH의 염기 서열
서열 번호 78: 인간 IgG1114_AA_AAA_A330P CH의 아미노산 서열
서열 번호 79 내지 82: 실시예 5에서 사용한 항CCR4 항체의 염기 서열 또는 아미노산 서열
서열 번호 83 내지 204: 실시예 5에서 사용한, CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 도입한, 항CCR4 항체의 염기 서열 또는 아미노산 서열
서열 번호 205 내지 222: 실시예 6에서 사용한, IgG1의 CH3 도메인끼리의 상호 작용을 감약시키는 아미노산 개변을 도입한, 항CD4 항체의 반량체의 염기 서열 또는 아미노산 서열
서열 번호 223 내지 240: 실시예 6에서 사용한, IgG1의 CH3 도메인끼리의 상호 작용을 감약시키는 아미노산 개변을 도입한, 항CD70 항체의 반량체의 염기 서열 또는 아미노산 서열
서열 번호 241 내지 252: 실시예 7, 실시예 9, 실시예 10, 실시예 11, 실시예 12에서 사용한, 항DNP 항체의 VH 및 VL, 그리고 항DNP 항체의 반량체 1 내지 6의 염기 서열 및 아미노산 서열
서열 번호 253 내지 292: 실시예 8, 실시예 9-2, 실시예 11에서 사용한, CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 도입한, 항CD4 항체의 반량체 또는 항CD70 항체의 반량체의 염기 서열 또는 아미노산 서열
서열 번호 293 내지 298: 실시예 9-2, 실시예 10-2, 실시예 11에서 사용한, CD16a 결합 증강 아미노산 개변을 도입한, 항CD4 항체의 반량체 또는 항CCR4 항체의 반량체의 반량체의 염기 서열 또는 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Kirin Co., Ltd. <120> Antibody composition <130> W531386 <150> JP2020-066313 <151> 2020-04-01 <150> JP2020-181493 <151> 2020-10-29 <160> 298 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of CCR6 (KG1684) VL <400> 1 gatatcgtga tgacacaatc cccactgtcc ctgcctgtca cccctggaga gcctgcctcc 60 atctcttgcc ggtcaagtca gagccttgta catactgatg gaaacaccta cttgcattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctcatct atcgggtttc caacagattt 180 tctggggtgc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggga cagatttcac cctcaagatc 240 agcagggttg aggccgagga cgtgggagtt tattactgct cacaaagaac atactttcct 300 ctcacgttcg gtcaggggac caagctggag atcaaa 336 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of CCR6 (KG1684) VL <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 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Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of IgG1_P238A/S267L CH <400> 17 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 gcgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgctc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag 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ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 20 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_D265A/S267L CH <400> 20 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 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agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 22 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_P238A/D265A/S267L CH <400> 22 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser 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aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 24 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_K326W CH <400> 24 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 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the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1114_AA_AAA_S267K CH <400> 56 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Ala 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp 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Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1114_AA_AAA_E269P CH <400> 58 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Ala 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Pro Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser 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Description of the artificial sequence: base sequence of IgG1114_AA_AAA_K326G CH <400> 69 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacagcgcca ccggcgccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacggagcc ctcccagccc ccatcgcggc aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 780 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of the artificial sequence: base sequence of IgG1_AAA_H268E CH <400> 95 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc gaggaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcggc aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt 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Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of IgG1_AAA_K326T CH <400> 97 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacacagcc ctcccagccc ccatcgcggc aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag 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gcagtacaac 540 gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcgga aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 108 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_S298A/E333A/K334E CH <400> 108 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 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cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtgctcgt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcggc aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 118 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_AAA_E283L CH <400> 118 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 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acid sequence of IgG1_AAA_E294W CH <400> 122 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Trp Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 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Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_AAA_Q295T CH <400> 124 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Thr Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln 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cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgagcgga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcggc aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 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cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggatgtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcggc aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 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gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctccttcc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcggc aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 134 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_AAA_F243L CH <400> 134 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val 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sequence of IgG1_AAA_K248M CH <400> 135 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc atggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcggc aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 136 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_AAA_K248M CH <400> 136 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Met Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 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Description of the artificial sequence: base sequence of IgG1_AAA_E258H CH <400> 137 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 cacgtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcggc aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 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ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 142 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_S239D CH <400> 142 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 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agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 144 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_S239E CH <400> 144 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 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acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggatgtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacatagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 166 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of 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the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_S239E/I332Y CH <400> 168 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Glu Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu 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<400> 177 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggaagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccgatgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg 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sequence: base sequence of IgG1_S239E/I332T CH <400> 179 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggaagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccactgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 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Description of the artificial sequence: amino acid sequence of CD4_IgG1_AA_DE_D265A_K409R CH <400> 206 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Ala 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 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artificial sequence: base sequence of CD70_IgG1_AA_DE_P329Y_D399A CH <400> 233 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacagcgcca ccggcgccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggatgtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctctacgccc ccgaagagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 780 gccgtggagt 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<220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_AA_AAA/S239D_D265A_K409R CH <400> 246 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Ala 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 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tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacagcgcca ccggcgccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggatgtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggccgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacacagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agccggctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc 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IgG1_AA_S239D/K326T_P329Y_K409R CH <400> 251 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacagcgcca ccggcgccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggatgtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacacagcc ctctacgccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact 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Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of IgG1_AA_S239D/K326E_D265A_K409R CH <400> 253 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacagcgcca ccggcgccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggatgtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggccgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacgaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 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caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcggc aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agccggctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 258 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_AA_AAA/H268E_D265A_K409R CH <400> 258 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn 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agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agccggctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 280 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_AA_S298A/E333A/K334E_P329Y_K409R CH <400> 280 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val 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gcaaggtctc caacaaagcc ctctacgccc ccgaagagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agccggctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 282 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_AA_S239E/I332E_P329Y_K409R CH <400> 282 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr 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tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacagcgcca ccggcgccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggatgtct tctgcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctctacgccc ccatcgcgtg taccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agccggctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 292 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IgG1_AA_S239D/S298A/E333A/L242C/K334C_P329Y_K409R CH <400> 292 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Ala 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Cys Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 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ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacagcgcca ccggcgccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggatgtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gagacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacacagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agccggctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 294 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of S239D/K326T_S298E_K409R_CH <400> 294 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Ala 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Glu Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 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tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacagcgcca ccggcgccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggatgtct tctgcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gagacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcgtg taccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agccggctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc 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Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Glu Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 297 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of S239D/E333A/L242C/K334C_S298E_K409R_CH <400> 297 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacagcgcca ccggcgccag cacctgaact cctgggggga 360 ccggatgtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 gagacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcggc aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agccggctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 298 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of S239D/E333A/L242C/K334C_S298E_K409R_CH <400> 298 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Ala 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Glu Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims (17)

  1. 제1 IgG 반량체와 제2 IgG 반량체를 포함하는, 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물이며, 이하의 (1A) 내지 (6A)인 항체 조성물.
    (1A) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, 1개의 이뮤노글로불린 경쇄(이하, L쇄라고 약기함) 및 1개의 이뮤노글로불린 중쇄(이하, H쇄라고 약기함)를 포함하고, 상기 H쇄는, H쇄 가변 영역, 힌지 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 CH2 도메인에 있어서 서로 다른 제1 Fcγ 수용체 IIIA(이하, CD16a) 결합 영역 및 제2 CD16a 결합 영역을 갖는다.
    (2A) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (3A) 상기 제1 IgG 반량체는, 상기 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제1 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (4A) 상기 제2 IgG 반량체는, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (5A) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함하거나, 또는
    상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (b) S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (6A) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체 중 적어도 한쪽은, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, 상기 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 항원만을 발현하는 표적 세포와 상기 제2 항원만을 발현하는 표적 세포에 대한 이펙터 기능과 비교하여, 상기 제1 항원 및 상기 제2 항원을 공발현하는 표적 세포에 대하여 특이적으로 이펙터 기능을 발휘해서 상해하는, 항체 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, EU 인덱스에서 나타내지는, Y349A, L351A, T366A, L368A, D399A, F405A, Y407A, K409A 및 K409R에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 항체 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간의 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, EU 인덱스에서 나타내지는 K409R의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 항체 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, 상기 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 항체 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 IgG 반량체의 H쇄 정상 영역(이하, CH라고 약기함)이 서열 번호 248로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 제2 IgG 반량체의 CH가 서열 번호 252로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체에서의, Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 당쇄의 비율이 20％ 이상인, 항체 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체의 이뮤노글로불린 서브클래스가 IgG1인, 항체 조성물.
  9. 제2 IgG 반량체와 회합하는 것을 특징으로 하는 제1 IgG 반량체이며, 상기 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체가 이하의 (1B) 내지 (7B)인, 제1 IgG 반량체.
    (1B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물을 형성한다.
    (2B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, 1개의 L쇄 및 1개의 H쇄를 포함하고, 상기 H쇄는, H쇄 가변 영역, 힌지 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 CH2 도메인에 있어서 서로 다른 제1 CD16a 결합 영역 및 제2 CD16a 결합 영역을 갖는다.
    (3B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (4B) 상기 제1 IgG 반량체는, 상기 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제1 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (5B) 상기 제2 IgG 반량체는, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (6B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함하거나, 또는
    상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (b) S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (7B) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체 중 적어도 한쪽은, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, 상기 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
  10. 제1 IgG 반량체와 회합하는 것을 특징으로 하는 제2 IgG 반량체이며, 상기 제1 IgG 반량체 및 제2 IgG 반량체가 이하의 (1C) 내지 (7C)인, 제2 IgG 반량체.
    (1C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 서로 다른 제1 항원 및 제2 항원에 대한 항체 조성물을 형성한다.
    (2C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, 1개의 L쇄 및 1개의 H쇄를 포함하고, 상기 H쇄는, H쇄 가변 영역, 힌지 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 CH2 도메인에 있어서 서로 다른 제1 CD16a 결합 영역 및 제2 CD16a 결합 영역을 갖는다.
    (3C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 C226A 및 C229A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (4C) 상기 제1 IgG 반량체는, 상기 제1 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제1 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 D265A의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (5C) 상기 제2 IgG 반량체는, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 또한 상기 제2 CD16a 결합 영역에서 EU 인덱스에서 나타내지는 P329Y의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (6C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (a) S239D 및 K326T의 아미노산 잔기 치환을 포함하거나, 또는
    상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체는 각각, EU 인덱스에서 나타내지는 (b) S239D, S298A, E333A, L242C 및 K334C의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
    (7C) 상기 제1 IgG 반량체 및 상기 제2 IgG 반량체 중 적어도 한쪽은, IgG1 서브클래스의 CH3 도메인간 상호 작용보다도 CH3 도메인간 상호 작용을 감약시키는 개변으로서, 상기 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
  11. 이하의 a) 또는 b)의 아미노산 서열을 코드하는 DNA.
    a) 제9항에 기재된 제1 IgG 반량체의 아미노산 서열
    b) 제10항에 기재된 제2 IgG 반량체의 아미노산 서열
  12. 제11항에 기재된 a)의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 및 b)의 아미노산 서열을 코드하는 DNA의 적어도 한쪽을 포함하는 재조합 벡터.
  13. 제12항에 기재된 재조합 벡터가 도입된 형질 전환체.
  14. 제9항에 기재된 제1 IgG 반량체 및 제10항에 기재된 제2 IgG 반량체를 포함하는 키트.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물을 사용하는, 상기 제1 항원만을 발현하는 표적 세포와 상기 제2 항원만을 발현하는 표적 세포에 대한 이펙터 기능과 비교하여, 상기 제1 항원 및 상기 제2 항원을 공발현하는 표적 세포에 대하여 특이적으로 이펙터 기능을 유도하는 방법.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물을 포함하는, 의약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 암, 자기면역 질환 또는 알레르기 질환의 치료에 사용하기 위한, 의약 조성물.
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