EA013224B1 - Клетки, продуцирующие композиции антител - Google Patents

Клетки, продуцирующие композиции антител Download PDF

Info

Publication number
EA013224B1
EA013224B1 EA200300443A EA200300443A EA013224B1 EA 013224 B1 EA013224 B1 EA 013224B1 EA 200300443 A EA200300443 A EA 200300443A EA 200300443 A EA200300443 A EA 200300443A EA 013224 B1 EA013224 B1 EA 013224B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
activity
antibody
acid sequence
fucose
Prior art date
Application number
EA200300443A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200300443A1 (ru
Inventor
Ютака Канда
Мицуо Сатох
Казуясу Накамура
Казухиса Утида
Тоехиде Синкава
Наоко Ямане
Еми Хосака
Казуя Ямано
Мотоо Ямасаки
Нобуо Ханай
Original Assignee
Киова Хакко Кирин Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=18788817&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA013224(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. filed Critical Киова Хакко Кирин Ко., Лтд.
Publication of EA200300443A1 publication Critical patent/EA200300443A1/ru
Publication of EA013224B1 publication Critical patent/EA013224B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Описываются клетки, используемые для продукции композиций антител, например антител, обладающих высокой антителозависимой клеточной цитотоксической активностью, полезных при различных заболеваниях, фрагментов антител и слитых белков, имеющих Fc-область антитела; способ получения композиции антител с использованием таких клеток; композиции антител и их применение. В вышеописанных композициях антител доля углеводных цепей, не содержащих фукозу, связанную с N-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце углеводной цепи, в общем количестве сложных углеводных цепей, присоединенных через N-гликозидную связь, связанных с Fc-областью, составляет 20% или более. Кроме того, описываются новые GDP-маннозо-4,6-дегидрогеназа, GDP-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимераза, 4-редуктаза, GDP-бета-L-фукозопирофосфорилаза, альфа-1,6-фукозилтрансфераза и ДНК, кодирующие указанные соединения.

Description

Настоящее изобретение относится к клеткам, продуцирующим молекулы антител, применимые при различных заболеваниях, фрагменты антител и слитые белки с Ес-областями антител или подобным, способу получения композиции антител с использованием таких клеток, композиции антител и ее применению.
Уровень техники
Так как антитела обладают высокой активностью связывания, специфичностью связывания и высокой устойчивостью в крови, предпринимаются попытки их применения для диагностики, профилактики и лечения различных болезней у людей [Мопос1опа1 Ληΐίόοάίοδ: Рг1пс1р1с5 апб Аррйсабопк, ^йеу-Шк, 1пс., С11ар1ег 2.1 (1995)]. Также предпринимаются попытки получения гуманизированных антител, таких как человеческие химерные антитела или человеческие антитела с привитым гипервариабельным участком (называемым далее в описании СОЕ), из антител, полученных от животных, иных, чем человек, используя методы генетической рекомбинации. Человеческое химерное антитело представляет собой антитело, в котором его вариабельная область (называемая далее в описании У-областью) образуется от антитела животного, иного, чем человек, а его константная область (называемая далее в описании С-областью) образуется от человеческого антитела. Человеческое СЭЕ-привитое антитело представляет собой антитело, в котором СОК человеческого антитела заменена на СОК антитела, полученного от животного, иного, чем человек.
Показано, что среди антител, полученных от млекопитающих, присутствуют пять классов антител, а именно 1дМ, 1дЭ, 1дО, 1дЛ и 1дЕ. Антитела класса человеческого ДО используют, главным образом, для диагностики, профилактики и лечения различных болезней человека, поскольку они обладают функциональными характеристиками, такими как длительное время полужизни в крови, различными эффекторными функциями и т.п. [Мопос1опа1 АпбЬоб1е8: Рг1пс1р1е8 апб Аррйсабопк, ^йеу-Шк, 1пс., Сйар1ет 1 (1995)]. Человеческие антитела класса ДО далее подразделяются на следующие 4 подкласса: 1дО1, 1§С2, 1дО3 и 1дС4. До настоящего времени проводится большое число исследований по антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активности (далее называемой АНСС-активностью) и комплементзависимой цитотоксической активности (далее называемой СЭС-активностью) как эффекторным функциям антител класса 1дО и сообщается, что среди антител класса человеческого ДО подкласс 1дО1 имеет наивысшую АЭСС-активность и СЭС-активность [Сйетюа1 1ттипо1оду, 65, 88 (1997)]. В свете изложенного выше, большинство противоопухолевых гуманизированных антител, включая коммерчески доступные ритуксан и герцептин, требующих высоких эффекторных функций для проявления своего действия, являются антителами подкласса человеческого 1дС1.
Проявление АЭСС-активности и СЭС-активности антител подкласса человеческого 1дО 1 требует связывания Ес-области антитела с рецептором антитела, существующим на поверхности эффекторной клетки, такой как киллерная клетка, натуральная киллерная клетка, активированный макрофаг или подобная клетка (называемая далее ЕсуЕ). и связываются различные компоненты комплемента. Что касается связывания, предполагается, что важными являются некоторые аминокислотные остатки в шарнирной области и второй домен С-области (называемый далее Су2-доменом) антитела [Еиг. 1. 1ттипо1оду, 23, 1098 (1993), 1ттипо1оду, 86, 319 (1995), Сйетюа1 1ттипо1оду, 65, 88 (1997)], и что связывание цепи сахаров с Су2-доменом [Сйетюа1 1ттипо1оду, 65, 88 (1997)] также является важным.
Что касается углеводной цепи, то Воуаб е1 а1. проверили влияние углеводной цепи на АЭССактивность и СЭС-активность, обрабатывая человеческие СЭЕ-привитые антитела САМРАТН-1Н (подкласс человеческого 1§С1), продуцированные клетками яичника китайского хомячка (клетки СНО) или клетками миеломы мыши N80 (клетки N80), различными ферментами, гидролизующими сахара, и сообщили, что удаление салициловой кислоты нередуцирующего конца не оказывает влияния на обе активности, но на одну СЭС-активность влияет дополнительное удаление галактозного остатка, и активность снижается примерно на 50%, и что полное удаление углеводной цепи вызывает исчезновение обеих активностей [Мо1еси1аг 1ттипо1оду, 32, 1311 (1995)]. ЫГе1у е1 а1. также анализировали углеводные цепи, связанные с СЭЕ-привитыми антителами САМРАТН-1Н (подкласс человеческого ДО1), продуцированными клетками СНО, клетками N80 или клетками миеломы крысы ΥΟ, измеряли их АЭСС-активность, и сообщили, что САМРАТН-1Н, продуцированные клетками ΥΟ, показывают наивысшую АЭСС-активность, причем приходят к мысли, что для такой активности важен Ν-ацетилглюкозамин (далее называемый в данном описании также 61сNАс) в позиции посередине [О1усоЬю1оду, 5, 813 (1995); XV О 99/54342]. Такие сообщения показывают, что строение углеводной цепи играет важную роль в эффекторных функциях человеческих антител подкласса ДО1 и что возможно получение антител с более высокой эффекторной функцией путем изменения строения углеводной цепи. Однако в действительности структуры углеводных цепей разнообразные и сложные, и нельзя сказать, что идентифицирована структура, действительно важная для эффекторной функции.
Углеводные цепи гликопротеинов на основании формы связывания с белковой группой грубо подразделяют на два типа, а именно углеводные цепи, которые связываются с аспарагином (углеводные цепи, присоединенные через Ν-гликозидные связи) и углеводные цепи, которые связываются с другими
- 1 013224 аминокислотами, такими как серин, треонин (углеводные цепи, присоединенные через О-гликозидные связи). Углеводные цепи, присоединенные через Ν-гликозидные связи, имеют различное строение [Βίοейеш1са1 Ехрептеп1а1юп Мсбюб 23 - Мсбюб (о г §1ибушд С1усорго1с1п 8идаг С11аш (Саки)и1зи 8Ьиррап СеШег). ебйеб Ьу Ее1ко ТакаЬазЫ (1989)], но известно, что они имеют обычную основную коровую структуру, показанную приведенной далее структурной формулой (I).
4ΘΙοΝΑο
Структурная формула (I)
Конец углеводной цепи, который связывается с аспарагином, называют редуцирующим концом, а противоположный - нередуцирующим концом. Известно, что углеводная цепь, присоединяемая через Ν-гликозидную связь, относится к чисто выраженному маннозному типу, в котором только манноза связывается с нередуцирующим концом коровой структуры; комплексному типу, в котором со стороны нередуцирующего конца коровой структуры имеется по меньшей мере одна боковая цепь галактозо-Νацетилглюкозамина (называемого далее 6а1-61сNΑс), и сторона нередуцирующего конца Са1-С1сNΑс имеет структуру сиаловой кислоты, срединного Ν-ацетилглюкозамина или подобную структуру; гибридному типу, в котором со стороны нередуцирующего конца коровой структуры имеются ветвления как чисто маннозного типа, так и комплексного типа; и т.п.
В Рс-области антитела типа 1дС присутствуют два сайта связывания углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. В сывороточном 1дС к сайту связывания углеводной цепи, как правило, присоединяется цепь сахаров комплексного типа с множеством ветвлений, в которой содержание сиаловой кислоты или срединного Ν-ацетилглюкозамина низкое. Известно, что существуют различные точки зрения на присоединение галактозы к нередуцирующему концу углеводной цепи комплексного типа и присоединение фукозы к Ν-ацетилглюкозамину на редуцирующем конце [ВюсЬетщбу, 36, 130 (1997)].
Предполагается, что такая структура углеводной цепи определяется генами углеводной цепи, а именно геном гликозилтрансферазы, синтезирующей углеводную цепь, и геном гликолитического фермента, гидролизующего углеводную цепь.
Синтез углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, описывается ниже.
Гликопротеины модифицируются углеводной цепью в просвете эндоплазматического ретикулума (далее называемого ЕВ). Во время стадии биосинтеза углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, относительно большая углеводная цепь переносится к полипептидной цепи, которая наращивается в просвете ЕВ. При трансформации углеводная цепь сначала присоединяется последовательно к фосфатным группам длинноцепного липидного носителя, содержащего примерно 20 а-изопреновых звеньев, который называют долихолфосфатом (далее в данном описании также называется Ρ-Όο1). Иными словами, Ν-ацетилглюкозамин переносится к долихолфосфату, образуя таким образом ΟΒΝΑ^Ρ-Ρ-Όοΐ, и затем переносится еще один С1сNΑс с образованием С1сНАс-С1сНАс-Р-Р-Бо1. Затем переносятся пять манноз (далее манноза также называется Мап) с образованием посредством этого (Маη)5-(С1сNΑс)2-Ρ-Ρ-^ο1, и затем переносятся четыре Мап и три глюкозы (далее глюкоза также называется С1с). Таким образом, формируется предшественник углеводной цепи (С1с)з-(Маη)9-(С1сNΑс)2-Ρ-ΡΌο1, называемый коровым олигосахаридом. Предшественник углеводной цепи, содержащий 14 сахаров, переносится как масса к полипептиду с последовательностью аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин в просвете ЕВ. При реакции высвобождается долихолфосфат (Р-Р-Όοΐ), связанный с коровым олигосахаридом, но снова становится долихолфосфатом при гидролизе пирофосфатазой и возвращается в цикл. Подгонка углеводной цепи начинается сразу же после присодинения углеводной цепи к полипептиду. То есть удаляются 3 С1с и 1 или 2 Мап на ЕВ, и известно, что к удалению имеют отношение а-1,2глюкозидаза I, а-1,3-глюкозидаза II и а-1,2-маннозидаза.
Гликопротеин, подвергшийся подгонке на ЕВ, переносится к комплексу Гольджи и модифицируется различным образом. В цис-части комплекса Гольджи присутствуют Ν-ацетилглюкозаминфосфотрансфераза, имеющая отношение к присоединению маннозафосфата, Ν-ацетилглюкозамин-П фосфодиэфир-а-Ы-ацетилглюкозаминидаза и α-маннозидаза I и снижают число остатков Мап до 5. В средней части комплекса Гольджи присутствуют Ν-ацетилглюкозаминтрансфераза I (СпТ!), имеющая отношение к присоединению первого внешнего С1сNΑс присоединяемой через Ν-гликозидную связь углеводной цепи комплексного типа, α-маннозидаза II, имеющая отношение к удалению 2 Мап, Ν-ацетилглюкозаминтрансфераза II (СпТП), имеющая отношение к присоединению второго С1сNΑс с внешней стороны, и а-1,6-фукозилтрансфераза, имеющая отношение к присоединению фукозы к редуцирующему концу Ν-ацетилглюкозамина. В транс-части комплекса Гольджи присутствует галактозотрансфераза, имеющая отношение к присоединению сиаловой кислоты, такой как Ν-ацетилнейраминовая кислота, или подобной кислоты. Известно, что присоединенная через Ν-гликозидную
- 2 013224 связь углеводная цепь формируется за счет активностей таких различных ферментов.
Вообще, большинство гуманизированных антител, для которых рассматривается применение в лекарственных средствах, получают с использованием методов генной рекомбинации, и их получают с использованием в качестве клеток-хозяев клеток СНО, происходящих из тканей яичника китайского хомячка. Но, как описано выше, так как строение углеводной цепи играет весьма важную роль в эффекторной функции антител и наблюдаются различия в структуре углеводной цепи гликопротеинов, экспрессированных клетками-хозяевами, желательна разработка клетки-хозяина, которую можно использовать для продукции антител с более высокой эффекторной функцией.
Для того чтобы модифицировать структуру углеводной цепи полученного гликопротеина, предприняты попытки использовать различные способы, такие как 1) применение ингибитора против фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, 2) отбор мутанта, 3) введение гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, и подобные способы. Конкретные примеры приводятся ниже.
Примерами ингибитора против фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, являются туникамицин, селективно ингибирующий образование ΟΙοΝΑο-Ρ-Ρ-ΩοΙ. что является первой стадией образования корового олигосахарида, являющегося предшественником присоединенной через Ν-гликозидную связь углеводной цепи, кастаноспермин и Ν-метил-Кдезоксинойиримицин, представляющие собой ингибиторы гликозидазы I, бромкондулит, являющийся ингибитором гликозидазы II, 1-дезоксинойиримицин и 1,4-диокси-1,4-имино-О-маннит, являющиеся ингибиторами маннозидазы I, свайнсонин, являющийся ингибитором маннозидазы II, и подобные соединения. Примерами ингибиторов, специфических для гликозилтрансферазы, являются дезоксипроизводные субстратов против Ν-ацетилглюкозаминтрансферазы V (СпТУ) и подобные соединения [С1усоЫо1оду 8спс5 2 - ΩοδΙίην οί 8идат СЬаш ίη Се11 (КобапкЬа 8аеп!Шс), ебйеб Ьу Ка!§и!ака 8епсЫто Накотап апб Акйа КоЬа1а (1993)]. Также известно, что 1-дезоксинойиримицин ингибирует синтез углеводной цепи комплексного типа и повышает соотношение углеводных цепей чисто маннозного типа и гибридного типа. Действительно, сообщается, что изменили структуру углеводной цепи ЦС и изменились свойства, такие как антигенсвязывающая активность и подобные, когда в среду добавили ингибиторы [Мо1еси1аг ^шипок, 26, 1113 (1989)].
Мутанты в связи с активностью фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, главным образом, отбирают и получают в виде лектинневосприимчивой клеточной линии. Например, мутанты клеток СНО с различными структурами углеводной цепи получают как лектинневосприимчивую клеточную линию с использованием такого лектина, как \УСА (агглютинин зерна пшеницы, полученный из Т. уи1дат18), СопА (конканавалин А, полученный из С. епкйогшщ), ШС (токсин, полученный из В. соттипщ), Ь-РНА (лейкоагглютинин, полученный из Р. уи1дат18), ЬСА (лентилагглютинин, полученный из Ь. сийпапк), Р8А (лектин гороха, полученный из Р. кайуит) или подобного [8отайс Се11 Мо1. Сепе!., 12, 51 (1986)].
Примером модификации структуры углеводной цепи продукта, полученного введением в клеткухозяина гена фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, является сообщение о том, что белок, в котором к нередуцирующему концу углеводной цепи присоединено некоторое количество сиаловой кислоты, можно получить путем введения крысиной в-галактозид-а-2,6сиалилтрансферазы в клетку СНО [I. Вю1. СЬет., 261, 13848 (1989)].
Также подтверждается, что Н-антиген (Риса1-2Са1в1), в котором фукоза (называемая далее также Рис) присоединена к нередуцирующему концу углеводной цепи, экспрессируется путем введения человеческой в-галактозид-2-а-фукозилтрансферазы в мышиную Ь-клетку [8с1епсе, 252, 1668 (1991)]. Кроме того, на основывании знаний о том, что присоединение расположенного посередине Ν-ацетилглюкозамина углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, важно для АЭСС-активности, Итапа е! а1. получили клетки СНО, экспрессирующие в-1,4-№ацетилглюкозаминтрансферазу III (СпТШ), и сравнили их с родительской клеточной линией на экспрессию СпТШ. Подтвердилось, что экспрессии СпТШ не отмечается в родительской клеточной линии клеток СНО [I. Вю1. СЬет., 261, 13370 (1984)], и что антитела, экспрессированные с использованием полученных экспрессирующих СпТШ клеток СНО, имеют АЭСС-активность в 16 раз более высокую, чем антитела, экспрессированные с использованием родительской клеточной линии [С1усоЬю1оду, 5, 813 (1995); XVО 99/54342]. В то же время Итапа е! а1. также получили клетки СНО, в которые введена в-1,4-№ацетилглюкозаминтрансфераза V (СпТУ), и сообщили, что избыточная экспрессия СпТШ или СпТУ показывает токсичность для клеток СНО.
Описание изобретения
Таким образом, для того чтобы модифицировать структуру углеводной цепи гликопротеина, который получают, предпринята попытка регулирования активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи в клетке-хозяине, но в действительности структуры углеводных цепей разнообразные и сложные и определение физиологических ролей углеводных цепей может быть недостаточным, так что испытания и ошибки повторяются. В частности, хотя понемногу обнаруживается, что на
- 3 013224 эффекторную функцию антител в значительной степени влияет структура углеводной цепи, действительно важная структура углеводной цепи пока не конкретизирована. Соответственно, для разработки лечебных средств ожидается идентификация углеводной цепи, влияющей на эффекторную функцию антител, и разработка клетки-хозяина, к которой можно добавлять такую углеводную цепь.
Целью настоящего изобретения является клетка-хозяин, которая продуцирует композицию антител и может регулировать структуру углеводной цепи, связанной с молекулой антитела, клетка, которая может продуцировать композицию антител с высокой ЛОСС-активностью, способ получения композиции антител с использованием таких клеток и композиция антител, полученная таким способом получения. Настоящее изобретение относится к изложенному далее в разделах (1)-(61).
(1) Клетка СНО, полученная из ткани яичника китайского хомячка, в которую вводят ген, кодирующий молекулу антитела, продуцирующая композицию антител, содержащую молекулу антитела со сложными углеводными цепями, присоединенными через Ν-гликозидные связи, связанными с Ес-областью, где в композиции среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи, связанных с Ес-областью, доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет 20% или более.
(2) Клетка СНО согласно (1), где углеводная цепь, с которой не связана фукоза, представляет собой сложную углеводную цепь, присоединенную через Ν-гликозидную связь, в которой положение 1 фукозы не связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце.
(3) Клетка СНО согласно (1) или (2), где молекула антитела принадлежит к классу ЦС.
(4) Клетка СНО согласно любому из разделов (1)-(3), где активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, и/или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связывается через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, уменьшена или устранена.
(5) Клетка СНО согласно (4), где фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы. представляет собой фермент, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь) и (с):
(a) СМО (СПР-маннозо-4,6-дегидратаза);
(b) Ех (СПР-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимераза,4-редуктаза);
(c) СЕРР (СОР-бета-Ь-фукозопирофосфорилаза).
(6) Клетка СНО согласно (5), где СМЭ представляет собой белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:65;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:65, и кодирующая белок, обладающий СМЭ-активностью.
(7) Клетка СНО согласно (5), где СМЭ представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь) и (с):
(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:71;
(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:71, и обладающий СМЭ-активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:71, и обладающий СМЭактивностью.
(8) Клетка СНО согласно (5), где Ех представляет собой белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:48;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:48, и кодирующая белок, обладающий Ех-активностью.
(9) Клетка СНО согласно (5), где Ех представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь) и (с):
(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:72;
(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:72, и обладающий Ех-активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:72, и обладающий Ех-активностью.
(10) Клетка СНО согласно (5), где СЕРР представляет собой белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(а) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:51;
- 4 013224 (Ь) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕО ΙΌ N0:51, и кодирующая белок, обладающий ОЕРР-активностью.
(11) Клетка СНО согласно (5), где ОЕРР представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь) и (с):
(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:73;
(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:73, и обладающий ОЕРР-активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 ΙΌ N0:73, и обладающий ОЕРРактивностью.
(12) Клетка СНО согласно (4), где фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Жацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Жгликозидную связь, представляет собой а-1,6-фукозилтрансферазу.
(13) Клетка СНО согласно (12), где а-1,6-фукозилтрансфераза представляет собой белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:1;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:1, и кодирующая белок, обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью.
(14) Клетка СНО согласно (12), где а-1,6-фукозилтрансфераза представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь) и (с):
(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:23;
(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:23, и обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 ΙΌ N0:23, и обладающий α-1,6фукозилтрансферазной активностью.
(15) Клетка СНО согласно любому из разделов (4)-(14), где ферментативная активность уменьшена или устранена методом, выбранным из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь), (с), (б) и (е):
(a) метод прерывания гена, имеющий целью ген, кодирующий фермент;
(b) метод введения доминантотрицательного мутанта гена, кодирующего фермент;
(c) метод введения мутации в фермент;
(б) метод ингибирования транскрипции или трансляции гена, кодирующего фермент;
(е) метод отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему углеводную цепь, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Жацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Жгликозидную связь.
(16) Клетка СНО согласно любому из разделов (4)-(15), невосприимчивая, по меньшей мере, к лектину, узнающему углеводную цепь, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Жацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N гликозидную связь.
(17) Клетка СНО согласно любому из разделов (4)-(16), продуцирующая композицию антител с более высокой антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью, чем композиция антител, продуцированная ее родительской клеткой СНО.
(18) Клетка СНО согласно (17), продуцирующая композицию антител с более высокой антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью, чем композиция антител, в которой среди всех присоединенных через Жгликозидную связь связанных с Ес-областью сложных углеводных цепей, содержащихся в композиции антител, доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Жацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет менее 20%.
(19) Клетка СНО согласно (18), где углеводная цепь, с которой не связана фукоза, представляет собой сложную углеводную цепь, присоединенную через Жгликозидную связь, в которой положение 1 фукозы не связывается через α-связь с положением 6 Жацетилглюкозамина на редуцирующем конце.
(20) Способ получения композиции антител, предусматривающий культивирование клеток СНО согласно любому из разделов (1)-(19) в среде для продукции и накапливания композиции антител в культуре и выделение композиции антител из культуры.
(21) Композиция антител, которую получают с использованием способа согласно (20).
(22) Композиция антител, содержащая молекулу антитела со сложными углеводными цепями, присоединенными через Жгликозидные связи, связанными с Ес-областью, которую продуцирует клетка СНО, где среди всех присоединенных через Жгликозидные связи связанных с Ес-областью сложных уг
- 5 013224 леводных цепей в композиции доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет 20% или более.
(23) Клетка, в которой активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, и/или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, уменьшена или устранена методом генной инженерии.
(24) Клетка согласно (23), где фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, представляет собой фермент, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь) и (с):
(a) ΟΜΌ (СПР-маннозо-4,6-дегидратаза);
(b) Рх (СПР-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимераза,4-редуктаза);
(c) СРРР (ΟΌΡ-бета-Ь-фукозопирофосфорилаза).
(25) Клетка СНО согласно (24), где ΟΜΌ представляет собой белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕО ГО N0:65;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:65, и кодирующая белок, обладающий ΟΜΌ-активностью.
(26) Клетка согласно (24), где 0ΜΌ представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь) и (с):
(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:71;
(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:71, и обладающий ΟΜΌ-активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 ГО N0:71, и обладающий 0ΜΌактивностью.
(27) Клетка согласно (24), где Рх представляет собой белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:48;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:48, и кодирующая белок, обладающий Рх-активностью.
(28) Клетка согласно (24), где Рх представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь) и (с):
(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:72;
(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:72, и обладающий Рх-активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 ГО N0:72, и обладающий Рхактивностью.
(29) Клетка согласно (24), где ОРРР представляет собой белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:51;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:51, и кодирующая белок, обладающий ОРРР-активностью.
(30) Клетка согласно (24), где ОРРР представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь) и (с):
(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:73;
(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:73, и обладающий ОРРР-активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 ГО N0:73, и обладающий ОРРР-активностью.
(31) Клетка СНО согласно (23), где фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, представляет собой а-1,6-фукозилтрансферазу.
- 6 013224 (32) Клетка согласно (31), где а-1,6-фукозилтрансфераза представляет собой белок, кодированный ДНК, выбранной из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь), (с) и (б):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕО Ш N0:1;
(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:2;
(c) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:1, и кодирующая белок, обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(б) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:2, и кодирующая белок, обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью.
(33) Клетка согласно (31), где а-1,6-фукозилтрансфераза представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь), (с), (б), (е) и (ί):
(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:23;
(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:24;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:23, и обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(б) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:24, и обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(е) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 Ш N0:23, и обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(ί) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 Ш N0:24, и обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью.
(34) Клетка согласно любому из разделов (23)-(33), где метод генной инженерии представляет собой метод, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь), (с) и (б):
(a) метод прерывания гена, имеющий целью ген, кодирующий фермент;
(b) метод введения доминантотрицательного мутанта гена, кодирующего фермент;
(c) метод введения мутации в фермент;
(б) метод ингибирования транскрипции и/или трансляции гена, кодирующего фермент.
(35) Клетка согласно любому из разделов (23)-(34), невосприимчивая, по меньшей мере, к лектину, узнающему углеводную цепь, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь.
(36) Клетка согласно любому из разделов (23)-(35), представляющая собой клетку, выбранную из группы, состоящей из приведенных далее (а)-(1):
(a) клетка СНО, полученная из ткани яичника китайского хомячка;
(b) клетка клеточной линии миеломы крысы УВ2/3НЬ.Р2.О11.16Ад.20;
(c) клетка клеточной линии миеломы мыши N80;
(б) клетка клеточной линии миеломы мыши 8Р2/0-Ад14;
(е) клетка ВНК, полученная из ткани почек сирийского хомячка;
(ί) антителопродуцирующая гибридомная клетка;
(д) клетка клеточной линии лейкоза человека №ипа1\уа;
(11) эмбриональная стволовая клетка;
(ί) оплодотворенная яйцеклетка.
(37) Клетка согласно любому из разделов (23)-(36), в которую введен ген, кодирующий молекулу антитела.
(38) Клетка согласно (37), где молекула антитела принадлежит к классу 1дС.
(39) Способ получения композиции антител, предусматривающий культивирование клеток согласно (37) или (38) в среде для продукции и накапливания композиции антител в культуре и выделение композиции антител из культуры.
(40) Способ согласно (39), который дает композицию антител с более высокой антигензависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью, чем композиция антител, полученная из родительской клеточной линии.
(41) Композиция антител, полученная с использованием способа согласно (39) или (40).
(42) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или растение или их потомства, содержащие геном, модифицированный так, что активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, и/или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетил- 7 013224 глюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, уменьшена.
(43) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или растение или их потомства согласно (42), где нарушен ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, и/или ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
(44) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или растение или их потомства согласно (42) или (43), где фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, представляет собой фермент, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь) и (с):
(a) ΟΜΌ (СОР-маннозо-4,6-дегидратаза);
(b) Рх (6ОР-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимераза,4-редуктаза);
(c) ОРРР (бИР-бета-Ь-фукозопирофосфорилаза).
(45) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или растение или их потомства согласно (44), где ΟΜΌ представляет собой белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕО Ш N0:65;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 5>Е0 Ш N0:65, и кодирующая белок, обладающий ΟΜΌ-активностью.
(46) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или растение или их потомства согласно (44), где Рх представляет собой белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 5>Е0 Ш N0:48;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:48, и кодирующая белок, обладающий Рх-активностью.
(47) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или растение или их потомства согласно (44), где ОРРР представляет собой белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:51;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:51, и кодирующая белок, обладающий ОРРР-активностью.
(48) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или растение или их потомства согласно (42) или (43), где фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, представляет собой а-1,6-фукозилтрансферазу.
(49) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или растение или их потомства согласно (48), где а-1,6-фукозилтрансфераза представляет собой белок, кодированный ДНК, выбранной из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь), (с) и (й):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:1;
(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 Ш N0:2;
(c) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 5>Е0 Ш N0:1, и кодирующая белок, обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(й) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 5>Е0 Ш N0:2, и кодирующая белок, обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью.
(50) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или растение или их потомства согласно любому из разделов (42)-(49), где трансгенное животное, не являющееся человеком, представляет собой животное, выбранное из группы, состоящей из крупного рогатого скота, овцы, козы, свиньи, лошади, мыши, крысы, домашней птицы, обезьяны и кролика.
(51) Способ получения композиции антител, предусматривающий введение гена, кодирующего молекулу антитела, трансгенному животному, не являющемуся человеком, или растению или их потомствам согласно любому из разделов (42)-(50); выращивание животного или растения; выделение из выращенного животного или растения ткани или биологической жидкости, содержащей введенные антитела; и выделение композиции антител из выделенной ткани или биологической жидкости.
(52) Способ согласно (51), где молекула антитела принадлежит к классу 1дС.
(53) Способ согласно (51) или (52), который дает композицию антител с более высокой антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью, чем композиция антител, полученная от животного, не являющегося человеком, или растения или их потомств, чей геном не модифицирован.
(54) Композиция антител, полученная с использованием способа согласно любому из разделов (51)-(53).
- 8 013224 (55) Лекарственный препарат, содержащий в качестве активного ингредиента композицию антител согласно любому из разделов (21), (22), (41) и (54).
(56) Лекарственный препарат согласно (55), являющийся диагностическим лекарственным средством, профилактическим лекарственным средством или лечебным лекарственным средством против болезней, сопровождаемых опухолями, болезней, сопровождаемых аллергиями, болезней, сопровождаемых воспалениями, аутоиммунных заболеваний, болезней органов кровообращения, болезней, сопровождаемых вирусными инфекциями, или болезней, сопровождаемых бактериальными инфекциями.
(57) Белок, выбранный из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь), (с), (б), (е), (1), (д), (й), (ί) и (]):
(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8ЕО ΙΌ N0:71;
(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:71, и обладающий ΟΜΌ-активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:72;
(б) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:72, и обладающий Ех-активностью;
(е) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:73;
(1) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:73, и обладающий ОЕРР-активностью;
(д) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:23;
(й) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:23, и обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(ί) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:24;
(ί) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:24, и обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью.
(58) ДНК, кодирующая белок согласно (57).
(59) ДНК, выбранная из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь), (с), (б) и (е):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:1;
(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:2;
(c) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:65;
(б) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:48;
(е) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:51.
(60) Геномная ДНК, выбранная из группы, состоящей из приведенных далее (а), (Ь) и (с):
(a) геномная ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:3;
(b) геномная ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:67;
(c) геномная ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:70.
(61) Вектор-мишень для гомологичной рекомбинации, содержащий полноразмерную ДНК согласно любому из разделов (58)-(60) или ее часть.
Клетка СНО ткани яичника китайского хомячка, в которую согласно настоящему изобретению введен ген, кодирующий молекулу антитела, может представлять собой любую клетку СНО до тех пор, пока она является клеткой СНО, полученной из ткани яичника китайского хомячка, в которую введен ген, кодирующий молекулу антитела, продуцирующую композицию антител, содержащих сложные углеводные цепи, присоединенные через ^гликозидную связь, связанные с Ес-областью молекулы антитела, где среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через ^гликозидную связь, связанных с Есобластью, в композиции доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с №ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет 20% или более.
В настоящем изобретении молекула антитела является любой молекулой до тех пор, пока она содержит Ес-область антитела. Примерами являются антитело, фрагмент антитела, слитый белок, содержащий Ес-область, и т. п.
Антитело представляет собой белок, продуцируемый в живом организме путем иммунной реакции как результата экзогенной стимуляции антигена, и обладает активностью специфического связывания с антигеном. Примерами антител являются антитела, секретируемые гибридомными клетками, полученными из клеток селезенки животного, иммунизированного антигеном; антитела, полученные методом генетической рекомбинации, а именно антитела, полученные введением в клетку-хозяина экспрессирующего вектора антитела со встроенным геном антитела; и т.п. Конкретными примерами являются антитела, продуцируемые гибридомами, гуманизированные антитела, человеческие антитела и т. п.
Гибридома представляет собой клетку, полученную слиянием В-клетки, полученной иммунизацией
- 9 013224 антигеном млекопитающего, иного, чем человек, и миелоидной клетки, полученной от мыши, или подобной клетки, которая может продуцировать моноклональные антитела с нужной антигенной специфичностью.
Примерами гуманизированного антитела являются человеческое химерное антитело, человеческое антитело с привитым СИЯ и т.п.
Человеческое химерное антитело представляет собой антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи антитела (называемую далее НУ или УН, причем тяжелая цепь является Н-цепью) и вариабельную область легкой цепи антитела (называемую далее ЬУ или УЬ, причем легкая цепь является Ь-цепью), обе от животного, иного, чем человек, константную область тяжелой цепи человеческого антитела (также называемую далее СН) и константную область легкой цепи человеческого антитела (также называемую далее СЬ). В качестве животного, иного, чем человек, можно использовать любое животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик или подобное, до тех пор, пока от него можно получить гибридому.
Человеческое химерное антитело можно получить, получая кДНК, кодирующие УН и УЬ, из гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела, встраивая их в экспрессирующий вектор для клетки-хозяина, имеющей гены, кодирующие СН человеческого антитела и СЬ человеческого антитела, чтобы посредством этого сконструировать экспрессирующий вектор человеческого химерного антитела, и затем вводя вектор в клетку-хозяина для экспрессии антител.
В качестве СН человеческого химерного антитела можно использовать любую СН до тех пор, пока она принадлежит к человеческому иммуноглобулину (обозначаемому далее Ыд). Но предпочтительны СН, принадлежащие к классу ЫдС, и можно использовать любой подкласс, принадлежащий к классу ЫдС, такой как ЫдС1, ЫдС2. ЫдС3 и ЫдС4. Также в качестве СЬ человеческого химерного антитела можно использовать любую СЬ до тех пор, пока она принадлежит к классу Ыд, и также можно использовать СЬ, принадлежащие к классу к или классу λ.
Человеческое антитело с привитым СОЯ представляет собой антитело, в котором аминокислотные последовательности СЭЯ УН и УЬ антитела, полученного от животного, иного, чем человек, привиты в соответствующих позициях УН и УЬ человеческого антитела.
Человеческое антитело с привитым СЭЯ можно получить путем конструирования кДНК, кодирующих У-области, в которых СЭЯ УН и УЬ антитела, полученного от животного, иного, чем человек, привиты в СЭЯ УН и УЬ человеческого антитела, встраивания их в экспрессирующий вектор для клетки-хозяина, имеющей гены, кодирующие СН человеческого антитела и СЬ человеческого антитела, чтобы посредством этого сконструировать экспрессирующий вектор человеческого СЭЯ-привитого антитела, и последующего введения вектора в клетку-хозяина для экспрессии человеческих СЭЯ-привитых антител.
В качестве СН человеческого антитела с привитым СЭЯ можно использовать любую СН до тех пор, пока она принадлежит к классу Ыд, но предпочтительны СН класса ЫдС, и можно использовать любой подкласс, принадлежащий к классу ЫдС, такой как ЫдС1, ЫдС2, ЫдС3 и ЫдС4. Также в качестве СЬ человеческого СЭЯ-привитого антитела можно использовать любую СЬ до тех пор, пока она принадлежит к классу Ыд, и также можно использовать СЬ, принадлежащие к классу к или классу λ.
Человеческое антитело по происхождению является природным антителом, существующим в организме человека, но к нему также относятся антитела, полученные из фаговой библиотеки человеческих антител, человеческие антитела, продуцируемые трансгенным животным, и человеческие антитела, продуцируемые трансгенным растением, которые получают, основываясь на последних достижениях генной инженерии, клеточной инженерии и развитии методов инженерии.
Что касается антител, существующих в организме человека, то можно культивировать лимфоциты, способные продуцировать антитела, путем выделения лимфоцитов периферийной крови человека, иммортализации их путем заражения вирусом ЕВ или подобным и последующего клонирования, и можно выделить антитела из культуры в чистом виде.
Фаговая библиотека человеческих антител представляет собой библиотеку, в которой фрагменты антител, такие как ЕаЬ, одноцепочечные антитела и подобные экспрессируются на поверхности фага путем встраивания гена, кодирующего антитело, полученное из В-клетки человека, в фаговый ген. Фаги, экспрессирующие фрагменты антител с нужной антигенсвязывающей активностью, можно выделить из библиотеки, используя их активность в отношении связывания с антигениммобилизованным субстратом в качестве маркера. Затем методами генной инженерии фрагмент антитела можно превратить в молекулу человеческого антитела, содержащую две полные Н-цепи и две полные Ь-цепи.
Трансгенное животное, не являющееся человеком, продуцирующее человеческие антитела, представляет собой животное, в клетки которого введен ген человеческого антитела. Конкретно, трансгенное животное, продуцирующее человеческие антитела, можно получить путем введения гена человеческого антитела в клетки Е8 мыши, трансплантированием клеток Е8 в эмбрион на ранней стадии развития другой мыши и последующего его выращивания. Трансгенное животное также можно получить путем введения гена человеческого химерного антитела в оплодотворенную яйцеклетку и выращивания ее. Что
- 10 013224 касается способа получения человеческих антител от трансгенного животного, продуцирующего человеческие антитела, то человеческие антитела можно получать и накапливать в культуре посредством получения продуцирующих человеческие антитела гибридом методом получения гибридом, осуществляемым, как правило, на млекопитающих, иных, чем люди, и последующего их культивирования.
Примерами трансгенных не являющихся людьми животных являются крупный рогатый скот, овцы, козы, свиньи, лошади, мыши, крысы, домашняя птица, обезьяны, кролики и т.п.
В настоящем изобретении также предпочтительно, что антитело представляет собой антитело, узнающее связанный с опухолью антиген, антитело, узнающее антиген, связанный с аллергией или воспалением, антитело, узнающее антиген, связанный с аутоиммунным заболеванием, или антитело, узнающее антиген, связанный с вирусной или бактериальной инфекцией, и предпочтительно человеческое антитело, принадлежащее к классу 1дС.
Фрагмент антитела представляет собой фрагмент, содержащий Рс-область антитела. Примерами фрагмента антитела являются мономер Н-цепи, димер Н-цепи и т.п.
Слитый белок, содержащий Рс-область, представляет собой композицию, в которой антитело, содержащее Рс-область антитела или фрагмент антитела, слито с белком, таким как фермент, цитокин или подобный белок.
В настоящем изобретении примером углеводной цепи, связывающейся с Рс-областью молекулы антитела, является углеводная цепь, присоединенная через Ν-гликозидную связь. Примером углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, является цепь комплексного типа, в которой со стороны нередуцирующего конца коровой структуры имеется одно или несколько параллельных ветвлений галактозоА-ацетилглюкозамина (называемого далее СаЮк^Лс), и со стороны нередуцирующего конца Са1-С1сNΑс имеется такая структура, как сиаловая кислота, расположенный посередине Ν-ацетилглюкозамин или подобная структура.
В одном из вариантов антитела Рс-область имеет позиции, с которыми связывается углеводная цепь, присоединенная через Ν-гликозидную связь, что будет описано далее. Соответственно, связываются две углеводные цепи на одну молекулу антитела. Так как углеводная цепь, присоединенная через Νгликозидную связь, связывающаяся с антителом, включает любую углеводную цепь, имеющую коровую структуру, представленную структурной формулой (I), возможен ряд комбинаций углеводных цепей для двух углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидную связь, которые связываются с молекулой антитела. Соответственно, идентичность веществ можно установить с точки зрения углеводной структуры, связанной с Рс-областью.
В настоящем изобретении композиция, содержащая молекулы антитела, имеющего в Рс-области сложные углеводные цепи, присоединенные через Ν-гликозидные связи (называемая далее композиция антител настоящего изобретения), может содержать антитела с одной и той же структурой углеводной цепи или антитела с разными структурами углеводных цепей до тех пор, пока от композиции получают эффект настоящего изобретения.
В настоящем изобретении доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце углеводной цепи, среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи, соединенных с Рс-областью, содержащихся в композиции антител, представляет собой отношение числа углеводных цепей, в которых фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, к общему числу сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи, соединенных с Рс-областью, содержащихся в композиции.
В настоящем изобретении углеводная цепь, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, представляет собой углеводную цепь, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином через α-связь на редуцирующем конце углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примером является сложная углеводная цепь, присоединенная через Ν-гликозидную связь, в которой положение 1 фукозы не связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина.
Композиция антител показывает высокую АЭСС-активность, когда доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи, соединяющихся с Рс-областью, содержащихся в композиции антител настоящего изобретения, составляет предпочтительно 20% или более, предпочтительнее 25% или более, еще предпочтительнее 30% или более, более предпочтительно 40% или более и наиболее предпочтительно 50% или более. Когда концентрация антител снижается, снижается АЭСС-активность, но высокую АЭСС-активность можно получить даже в том случае, когда концентрация антител низкая, до тех пор, пока доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет 20% или более.
Долю углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, содержащейся в композиции, которая содержит молекулу антитела, имеющую в Рс-области сложные углеводные цепи, присоединенные через Ν-гликозидные связи, можно определить, высвобождая углеводную цепь из молекулы антитела с использованием известного способа, такого как
- 11 013224 гидразинолиз, ферментативное расщепление или подобный способ [В1осйет1са1 ЕхрейтеШайои Ме1йойк 23 - Ме1йой Гог ЗГийушд С1усорго1е1п Зидаг Сйаш (Гараи Заеиййс Зоаейек Ргекк), еййей Ьу Рс1ко Такайа8Й1 (1989)], помечая флуоресцентной меткой или радиоизотопом высвобожденную углеводную цепь и затем выделяя помеченную углеводную цепь хроматографией. Высвобожденную углеводную цепь также можно установить, анализируя ее методом ΗΡΑΕΌ-ΡΑΌ [1. Ыс.|. Сйтота1одт., 6, 1557 (1983)].
В настоящем изобретении клетка СНО, полученная из ткани яичников китайского хомячка, включает любую клетку, которая представляет собой клеточную линию, полученную из ткани яичников китайского хомячка (СпсеШ1ик дйкеик). Примерами являются клетки СНО, описанные в таких публикациях, как 1оитиа1 о! Ехрейтеи1а1 Мейюше, 108, 945 (1958); Ргос. ЫаЙ. Асай. 8с1. ИЗА, 60, 1275 (1968); Сеиейск, 55, 513 (1968); Сйготокота, 41, 129 (1973); Ме1йойк ίη Се11 Заеисе, 18, 115 (1996); йай1айои йекеагсй, 148, 260 (1997); Ргос. ЫаЙ. Асай. За. ИЗА, 77, 4216 (1980); Се11, 6, 121 (1975); Мо1еси1аг Се11 Сеиейск, Арреий1х I, II (р. 883-900) и т.п. Кроме того, в качестве примеров можно также назвать СНО-К1 (АТСС ССЬ-61), ΌυΧΒ11 (АТСС ССЬ-9096) и Рго-5 (АТСС ССЬ-1781), зарегистрированные в АТСС (Американская коллекция типовых культур), и коммерчески доступные СНО-З (ЫГе Тесйиойодхек, кат. № 11619) или клеточные сублинии, полученные адаптацией клеток с использованием различных сред.
В настоящем изобретении фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, может представлять собой любой фермент до тех пор, пока он представляет собой фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, как источник поставки фукозы для углеводной цепи. Фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы. представляет собой фермент, влияющий на синтез внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы.
Внутриклеточный углеводонуклеотид СОР-фукоза поставляется каскадом реакций синтеза йе иоуо или каскадом реакций реутилизационного синтеза. Таким образом, все ферменты, имеющие отношение к таким каскадам реакций синтеза, относятся к ферментам, имеющим отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы.
Примерами фермента, имеющего отношение к каскаду реакций синтеза йе иоуо внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, являются СПР-маннозо-4,6-дегидратаза (далее называемая СМО), СОР-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимеразо-4,6-редуктаза (далее называемая Ех) и подобные ферменты.
Примерами фермента, имеющего отношение к каскаду реакций реутилизационного синтеза внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, являются СОР-бета-Ь-фукозопирофосфорилаза (далее называемая СЕРР), фукокиназа и подобные ферменты.
К ферментам, влияющим на синтез внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, также относятся фермент, влияющий на активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, и фермент, влияющий на структуру веществ как субстратов фермента. В настоящем изобретении примерами СМО являются белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ГО N0:65;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ГО N0:65, и кодирующая белок, обладающий СМЭ-активностью, белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную ЗЕО ГО N0:71, белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:71, и обладающий СМО-активностью, белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной ЗЕО ГО N0:71, и обладающий СМЭактивностью, и подобные белки.
Также примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность СМО, являются ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ГО N0:65, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ГО N0:65, и кодирующая аминокислотную последовательность с СМЭ-активностью. В настоящем изобретении примерами Ех являются белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ГО N0:48;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ГО N0:48, и кодирующая белок, обладающий Ех-активностью, белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную ЗЕО ГО N0:72, белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную ЗЕО ГО N0:72, и обладающий Ех-активностью, белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной ЗЕО ГО N0:72, и обладающий Ех-активностью, и подобные белки.
- 12 013224
Также примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность Рх, являются ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:48, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:48, и кодирующая аминокислотную последовательность с Рх-активностью. В настоящем изобретении примерами ОЕРР являются белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:51;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:51, и кодирующая белок, обладающий ОЕРР-активностью, белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:73, белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:73, и обладающий ОЕРР-активностью, белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной ЗЕО ΙΌ N0:73, и обладающий ОЕРР-активностью, и подобные белки.
Также примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность ОЕРР, являются ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:51, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:51, и кодирующая аминокислотную последовательность с Ех-активностью.
В настоящем изобретении ферментом, имеющим отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы через α-связь связано с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, является любой фермент до тех пор, пока он представляет собой фермент, имеющий отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь. Ферментом, имеющим отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, называют фермент, влияющий на реакцию связывания положения 1 фукозы через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь.
Примерами фермента, имеющего отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, являются α-1,6-фукозилтрансфераза, α-Ь-фукозидаза и подобные ферменты.
Примерами также являются фермент, влияющий на активность фермента, имеющего отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, и фермент, влияющий на структуру веществ как субстратов фермента.
В настоящем изобретении примерами α-1,6-фукозилтрансферазы являются белок, кодированный ДНК, выбранной из числа приведенных далее (а), (Ь), (с) или (ά):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:1;
(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:2;
(c) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:1, и кодирующая белок, обладающий α-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(ά) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:2, и кодирующая белок, обладающий α-1,6-фукозилтрансферазной активностью, белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:23, белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:24, белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:23, и обладающий α-1,6-фукозилтрансферазной активностью, белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную ЗЕО ΙΌ N0:24, и обладающий α-1,6-фукозилтрансферазной активностью, белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной ЗЕО ΙΌ N0:23, и обладающий α-1,6фукозилтрансферазной активностью, белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомоло
- 13 013224 гию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Ер ΙΌ N0:24, и обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью, и подобные белки.
Также примером ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность 1,6-фукозилтрансферазы, является ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕР ΙΌ N0:1 или 2, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8 Ер ΙΌ N0:1 или 2, и кодирующая аминокислотную последовательность с 1,6фукозилтрансферазной активностью.
В настоящем изобретении ДНК, которая гибридизирует в строгих условиях, получают, например, таким способом, как гибридизация колоний, гибридизация в бляшках или Саузерн-блоттинг, с использованием в качестве зонда ДНК, такой как ДНК с нуклеотидной последовательностью, представленной 8ЕР ΙΌ N0:1, 2, 48, 51 или 65, или ее частичного фрагмента, и конкретно включает ДНК, которую можно идентифицировать путем осуществления гибридизации при 65°С в присутствии 0,7-1,0 М хлорида натрия с использованием фильтра, на котором иммобилизуют колоние- или бляшкообразованные фрагменты ДНК, с последующим промыванием фильтра при 65°С с использованием раствора 0,1-2 X 88С (причем композиция раствора 1 X 88С содержит 150 мМ хлорида натрия и 15 мМ цитрата натрия). Гибридизацию можно осуществить согласно способам, описанным, например, в Мо1еси1аг С1ошид, А ЬаЬога1оту Мапиа1, 2иб Еб., Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ртейй (1989) (далее данная публикация упоминается как Мо1еси1аг С1ошид, 8есоиб Ебйюи), Сштеи! РгоЮсоР ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1о11п АПеу & 8оий, 1987-1997 (далее данная публикация упоминается как СиггеШ Рто1осо1й ш Мо1еси1аг Вю1оду); ЭХА С1ошид 1: Соге Тес11шс.|ие5. А Ргас1юа1 Арртоасй, 8есоиб Ебйюи, 0хГогб Ишуегайу (1995) и т.п. Примерами ДНК, способной к гибридизации, являются ДНК, имеющие по меньшей мере 60% или большую, предпочтительно 70% или большую, предпочтительнее 80% или большую, еще предпочтительнее 90% или большую, более предпочтительно 95% или большую и наиболее предпочтительно 98% или большую гомологию с нуклеотидной последовательностью, представленной 8Ер ΙΌ N0:1, 2, 48, 51 или 65.
В настоящем изобретении белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Ер ΙΌ N0:23, 24, 71, 72 или 73, и обладающий а-1,6-фукозилтрансферазную активностью, СМО-активностью, Рх-активностью или СРРР-активностью, можно получить, например, путем введения сайтнаправленной мутации в ДНК, кодирующую белок, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной 8Ер ΙΌ N0:1, 2, 65, 48 или 51, соответственно, с использованием сайтнаправленного мутагенеза, описанного, например, в Мо1еси1аг С1ошид, 8есоиб Еб11юи; СиггегИ Рто1осо1й ш Мо1еси1аг Вю1оду; ШсШс Аабй Вейеатсй, 10, 6487 (1982); Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А, 79, 6409 (1982); Сеие, 34, 315 (1985); Шекю Ашбй Вейеатсй, 13, 4431 (1985); Ргос. Асаб. 8сЕ И8А, 82, 488 (1985) и т.п. Число удаленных, замененных, встроенных и/или добавленных аминокислот равно единице или большему числу, и оно конкретно не лимитируется, но является числом аминокислот, которые можно удалить, заменить или добавить известным методом, таким как сайтнаправленный мутагенез, например оно составляет от 1 до нескольких десятков, предпочтительно 1-20, предпочтительнее 1-10 и наиболее предпочтительно 1-5.
Также в настоящем изобретении, для того чтобы сохранилась а-1,6-фукозилтрансферазная активность, СМО-активность, Рх-активность или СРРР-активность белка, он имеет по меньшей мере 80% или большую, предпочтительно 85% или большую, предпочтительнее 90% или большую, еще предпочтительнее 95% или большую, более предпочтительно 97% или большую и наиболее предпочтительно 99% или большую гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Ер ΙΌ N0:23, 24, 71, 72 или 73, вычисленную с использованием аналитической программы, такой как ВЬА8Т [1. Мо1. Вю1., 215, 403 (1990)], РА8ТА [МеШобй ш Еи7ушо1оду, 183, 63 (1990)], или подобной программы.
Примерами клеток СНО настоящего изобретения являются клетки, в которых ферментативная активность уменьшена или устранена.
Клетки, в которых ферментативная активность уменьшена или устранена, включают клетки, в которых уменьшена или устранена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, где положение 1 фукозы через α-связь связано с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь. В качестве способа получения таких клеток можно использовать любой метод до тех пор, пока с его помощью можно уменьшить или устранить ферментативную активность, представляющую интерес. Примерами метода уменьшения или устранения ферментативной активности являются:
(a) метод прерывания гена, имеющий целью ген, кодирующий фермент, (b) метод введения доминантотрицательного мутанта гена, кодирующего фермент, (c) метод введения мутации в фермент, (б) метод ингибирования транскрипции и/или трансляции гена, кодирующего фермент, (е) метод отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему углеводную цепь, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирую
- 14 013224 щем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, и подобные методы.
В данном случае лектинневосприимчивую клеточную линию можно получить культивированием клеточной линии в среде, содержащей предварительно установленную концентрацию лектина, и последующим отбором клеточной линии, которая приобретает такое свойство, что степень ее выживания становится выше по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно в 3 раза и предпочтительнее в 5 раз или более, чем у родительской клеточной линии, со статистической значимостью. Такую линию также можно получить путем культивирования клеточной линии в среде, содержащей лектин, и последующего отбора клеточной линии, которую можно культивировать при определенной степени выживания, например степени выживания 80%, при концентрации лектина выше по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно в 5 раз, предпочтительнее в 10 раз и наиболее предпочтительно в 20 раз или более, чем в случае родительской клеточной линии.
В качестве лектина, узнающего структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно использовать любой лектин, узнающий углеводную цепь. Примерами являются лектин Ьеик си1шап5 ЬСА (лентилагглютинин, полученный из Ьеи5 сийпап5). лектин гороха Р8А (лектин гороха, полученный из Р15иш кабуиш), лектин кормовых бобов УРА (агглютинин, полученный из У1С1а ГаЬа), лектин А1ешта аитаиба ААЬ (лектин, полученный из А1ешта аитаийа) и т.п.
Клетки СНО настоящего изобретения могут продуцировать композицию антител с более высокой АЭСС-активностью, чем у композиции антител, продуцированной родительской линией СНО перед применением способа уменьшения или устранения ферментативной активности, представляющей интерес.
Также клетки СНО настоящего изобретения могут продуцировать композицию антител с более высокой АЭСС-активностью, чем АЭСС-активность композиции антител, в которой среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи, соединяющихся с Рс-областью, содержащихся в композиции антител настоящего изобретения, доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет менее 20%.
Примером родительской клеточной линии, используемой в настоящем изобретении, являются клетки, в которых не снижена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Конкретно, используют клетки, не обработанные с целью снижения или устранения активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
В настоящем изобретении АЭСС-активность является цитотоксической активностью, при которой антитело, связанное с антигеном клеточной поверхности опухолевой клетки в живом организме, активирует эффекторную клетку через Рс-рецептор, существующий в Рс-области антитела, и поверхность эффекторной клетки, и посредством этого блокирует опухолевую клетку и т.п. [Моиос1оиа1 АийЬоФек: Ргшс1р1е8 аиб АррИсабоик, ^Пеу-Шк, 1ис., Сйар1ет 2.1 (1955)]. Примерами эффекторной клетки являются киллерная клетка, природная киллерная клетка, активированный макрофаг и подобные клетки.
Настоящее изобретение также относится к клетке, в которой методом генной инженерии уменьшена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь (далее называемой клеткахозяин настоящего изобретения). Клетка-хозяин настоящего изобретения полезна в качестве клеткихозяина для продукции композиции антител с высокой АЭСС-активностью.
Клетка-хозяин настоящего изобретения может представлять собой любую клетку до тех пор, пока она может экспрессировать молекулу антитела. Примерами являются дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого, растительная клетка и т.п.
Примерами таких клеток являются клетки, которые будут рассматриваться далее в разделе 3. Среди животных клеток предпочтительными примерами являются клетки СНО, полученные из ткани яичника китайского хомячка, клетки клеточной линии миеломы крысы УБ2/3НЬ.Р2.О11.16Ад20, клетки клеточной линии миеломы мыши Ν80, мышиные миелоидные клетки 8Р2/0-Ад14, клетки ВНК, полученные из ткани почек сирийского хомячка, продуцирующие антитела гибридомные клетки, клетки клеточной линии лейкоза человека №ша1га, эмбриональные стволовые клетки, оплодотворенные яйцеклетки и т.п.
- 15 013224
Ниже настоящее изобретение описано подробнее.
1. Получение клетки-хозяина настоящего изобретения.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить методами, описанными далее.
(1). Метод прерывания гена, имеющий целью ген, кодирующий фермент.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить с использованием метода прерывания гена, имея целью фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ООР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь. Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ОЭР-фукозы. являются ΟΜΌ, Рх, ОРРР, фукокиназа и подобные белки. Примерами фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, являются а-1,6-фукозилтрансфераза, α-Ь-фукозидаза и т.п.
Ген, используемый в данном случае, включает ДНК и РНК.
Способ прерывания гена может представлять собой любой способ до тех пор, пока он может привести к прерыванию гена фермента-мишени. Примерами являются антисмысловой способ, рибосомный способ, способ гомологических рекомбинаций, способ ΚΌ0, способ ΚNΑ^, способ с использованием ретровирусов, способ с использованием транспозонов и подобные способы. Ниже способы описываются конкретно.
(а). Получение клетки-хозяина настоящего изобретения антисмысловым способом или рибосомным способом.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить рибосомным способом, описанным в Се11 ТесЬио1оду, 12, 239 (1993); В10/ТЕСН\01.0С1¥. 17, 1097 (1999); Нит. Μο1. ОеиеЕ, 5, 1083 (1995); Се11 ТесЬио1оду, 13, 255 (1994); Ргос. №И. Асаё. 8с1. И8А, 96, 1886 (1999), или подобным способом, например, имея целью фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ОЭРфукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь.
Получают кДНК или геномную ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через №гликозидную связь.
Определяют нуклеотидную последовательность полученной кДНК или геномной ДНК.
На основе определенной последовательности ДНК задают соответствующую длину антисмысловой генной или рибосомной конструкции, содержащей часть ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ООР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, часть ее нетранслируемой области или интрон.
Для того чтобы экспрессировать антисмысловой ген или рибосому в клетке, получают рекомбинантный вектор, вводя фрагмент или полноразмерную полученную ДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора.
Получают трансформант путем введения рекомбинантного вектора в клетку-хозяина, подходящую для экспрессирующего вектора.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить отбором трансформанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ОЭР-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь. Клетку-хозяина настоящего изобретения также можно получить отбором трансформанта на основании структуры углеводной цепи гликопротеина на клеточной мембране или структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела.
В качестве клетки-хозяина, используемой для получения клетки-хозяина настоящего изобретения, можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она имеет ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ООР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь. Примерами являются клетки-хозяева, которые будут описаны далее в разделе 3.
В качестве экспрессирующего вектора используют вектор, который может автономно реплициро
- 16 013224 ваться в клетке-хозяине или который можно интегрировать в хромосому и содержащий промотор в такой позиции, что создаваемые антисмысловой ген или рибосому можно переносить. Примерами являются экспрессирующие векторы, которые будут описаны далее в разделе 3.
Что касается способа введения гена в различные клетки-хозяева, то можно использовать способы введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, описанные далее в разделе 3.
Описанный далее способ может служить примером способа отбора трансформанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭРфукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Жацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Жгликозидную связь.
Способ отбора трансформанта
Примерами способа отбора клеток, в которых уменьшена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы. или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Жацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Жгликозидную связь, являются биохимические способы или методы генной инженерии, описанные в №\ν В1осйет1са1 ЕхрептегИаНоп Зепек 3 - ЗассЕапбек Ι, С1усорго1ет (Токуо Кадаки Όο,μη), ебПеб Ьу 1арапе§е ВюсЕетюа1 5оае1у (1988); Се11 Епдепееппд, Зирр1етеп1, Ехрептеп1а1 РгоЮсо1 Зепек, О1усоЬ1о1оду Ехрептеп1а1 РгоЮсок С1усорго1ет, О1усо11р1б апб Рго1еод1усап (ЗЦуипкЕа), ебйеб Ьу №юуик| ТатдисЫ, Акет1 Зи/икт К1уо§Ы Еигика^а апб Ка/иуик! Зида^ата (1996); Мо1еси1аг С1ошпд, Зесопб Еб1Еоп; Сштеп! РгоЮсоЕ ш Мо1еси1аг Вю1оду; и подобные способы. Примеры биохимических способов включают способ, при котором ферментативную активность оценивают с использованием ферментспецифического субстрата, и т. п. Примерами методов генной инженерии являются анализ методом Нозернблоттинга, ВТ-РСВ и подобные, при которых измеряют количество мРНК гена, кодирующего фермент.
Примерами способа отбора трансформанта на основании структуры углеводной цепи гликопротеина на клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбора трансформанта на основании структуры углеводной цепи продуцируемых молекул антител являются способы, которые будут описаны далее в разделах 5 и 6.
Примером способа получения кДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Жацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи сахаров, присоединенной через Жгликозидную связь, является способ, описанный далее.
Получение кДНК
Получают полную РНК или мРНК из ткани или клеток человека или животного, не являющегося человеком.
Из полученных полных РНК или мРНК получают библиотеку кДНК.
Получают вырожденные праймеры на основе аминокислотной последовательности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Жацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Жгликозидную связь, или методом ПЦР (РСВ) с использованием в качестве матрицы полученной бибилиотеки кДНК получают фрагмент гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Жацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Жгликозидную связь.
ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Жацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Жгликозидную связь, можно получить путем скрининга библиотеки кДНК с использованием полученного фрагмента гена в качестве зонда.
Что касается мРНК человеческих или отличных от человеческих ткани или клетки, то можно использовать коммерчески доступный продукт (например, произведенный С.'1оп1ес11) или ее можно получить из тканей или клеток человека или животного, не являющегося человеком, как в примерах. Примеры способа получения полной РНК из тканей или клеток человека или животного, не являющегося человеком, включают способ с гуанидинтиоцианатом и трифторацетатом церия [Ме1об§ ш Епгуто1оду, 154, 3 (1987)], кислотный способ с гуанидинтиоцианатом, фенолом и хлороформом (АСРС) [Апа1уЕса1 ВюсйетщЦу, 162, 156 (1987); Ехрептеп1а1 Мебюте, 9, 1937 (1991)] и подобные способы.
Также примерами способа получения мРНК из полной РНК, например РНК поли(А)+, является ко
- 17 013224 лоночный способ с олиго(бТ), иммобилизованным на целлюлозе (Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб Εάίΐίοη), и подобные способы.
Кроме того, мРНК можно получить с использованием набора, такого как набор Рак! Тгаск ιηΚ.ΝΛ 1ко1а!1оп (производимый 1пу1!годеп), набор Цшск Ргер ιηΡΝΛ РигШсайоп (производимый Рйагтас1а) или подобного набора.
Из полученной мРНК тканей или клеток человека или животного, не являющегося человеком, получают библиотеку кДНК. Примерами способа получения библиотек кДНК являются способы, описанные в Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб Ебйюп; Сштеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду; А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есопб Ебйюп (1989); и подобные способы или способы с использованием коммерчески доступных наборов, таких как набор Зирегкспр! Р1акт1б 8ук!ет £ог сЭНА 8уп!йек1к апб Р1акт1б С1ошпд (производимый Ьйе Тесйпо1од1ек), набор ΖΛР-с^NΛ 8уп!йек1к (производимый 8ТВАТАСЕИЕ), и подобные наборы.
В качестве клонирующего вектора для применения при получении библиотеки кДНК можно использовать любой вектор, такой как фаговый вектор, плазмидный вектор, или подобный, до тех пор, пока он может автономно реплицироваться в ЕксйепсЫа сой К12. Примерами являются ΖАР Ехргекк [производимый 8ТВАТАСЕИЕ, 8!га!е§1ек, 5, 58 (1992)], рВ1иекспр! II 8К(+) ^исЮс Ас1бк Кекеагсй, 17, 9494 (1989)], ЬатЬба ΖАР II (производимый 8ТВАТАСЕИЕ), λ§!10 и λ§! 11 [ЭХА С1ошпд, А Ргас!юа1 Арргоасй, 1, 49 (1985)], /_Тпр1Е.х (изготовленный С1оп!есй), λΕxСе11 (производимый Рйагтас1а), рсИ2 [Мо1. Се11. Вю1., 3, 280 (1983)], рИС18 [Сепе, 33, 103 (1985)] и подобные векторы.
В качестве микроорганизма-хозяина можно использовать любой микроорганизм, но предпочтительно используют ЕксйепсЫа сой. Примерами являются ЕксйепсЫа со11 ХЬ1-В1ие МКР' [производимая 8ТКА.ТАСЕИЕ, 8!га!е§1ек, 5, 81 (1992)], ЕксйепсЫа со11 С600 [Сепейск, 39, 440 (1954)], ЕксйепсЫа сой Υ1088 [8с1епсе, 222, 778 (1983)], ЕксйепсЫа сой Υ1090 [8аепсе, 222, 778 (1983)], ЕксйепсЫа сой ИМ522 [б. Мо1. Вю1., 166, 1 (1983)], ЕксйепсЫа сой К802 [б. Мо1. Вю1., 16, 118 (1966)], ЕксйепсЫа сой ДМ105 [Сепе, 38, 275 (1985)] и т.п.
Библиотеку кДНК можно использовать как таковую при последующих анализах и для того, чтобы получить полноразмерную кДНК настолько рационально, насколько возможно, путем уменьшения доли неполной кДНК, и библиотеку кДНК, полученную с использованием олигокэпового метода, разработанного 8идапо е! а1. [Сепе, 138, 171 (1994); Сепе, 200, 149 (1997); Рго!ет, Кис1е1с Ас1б апб Рго!ет, 41, 603 (1996); Ехрептеп!а1 Мебюте, 11, 2491 (1993); сЭКА С1ошпд (Уобо-кйа) (1996); Ме!йобк £ог Ргераппд Сепе ЫЬгапек Аобо-кйа) (1994)], можно использовать в описанном далее анализе.
Получают вырожденные праймеры для 5'-концевых и 3'-концевых нуклеотидных последовательностей, предполагаемых для кодирования аминокислотной последовательности, на основе аминокислотной последовательности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СИР-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, и ДНК амплифицируют ПЦР [РСК Рго!осо1к, Асабетю Ргекк (1990)] с использованием полученной библиотеки кДНК в качестве матрицы, и получают фрагмент гена, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СИР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Можно подтвердить, что полученный фрагмент гена представляет собой ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СИР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи сахаров, присоединенной через Ν-гликозидную связь, способом, используемым, как правило, для анализа нуклеотидов, такого как дидезокси-способ 8апдег е! а1. [Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 14, 5463 (1977)], с помощью анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК АВГРК18М 377 (производимый РЕ Вюкук!ет), или подобного устройства.
ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СИР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно получить, осуществляя гибридизацию колоний или гибридизацию в бляшках (Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб Ебйюп) для кДНК или библиотеки кДНК, синтезированных из мРНК, содержащейся в тканях или клетках человека или животного, не являющегося человеком, с использованием фрагмента гена в качестве ДНК-зонда.
Также ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СИР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно получить, осуществляя скрининг методом ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК или библиотеки кДНК,
- 18 013224 синтезированных из мРНК, содержащейся в тканях или клетках человека или животного, не являющегося человеком, и с использованием праймеров, используемых для получения фрагмента гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Нуклеотидную последовательность полученной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, анализируют от ее конца и определяют способом, используемым, как правило, для анализа нуклеотидов, таким как дидезокси-способ 8апдет с1 а1. [Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 74, 5463 (1977)], с помощью анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК ЛБ1РЯ18М 377 (производимый РЕ Вюкуйет), или подобного устройства.
Ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, также можно определить из генов в базах данных путем поиска в таких базах данных нуклеотидных последовательностей, как СепВапк, ЕМВЬ, ΌΌΒΙ и подобных, с использованием поисковой программы, такой как ВЬА8Т, на основе определенной нуклеотидной последовательности кДНК.
Примерами нуклеотидной последовательности гена, полученного таким способом, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, являются нуклеотидные последовательности, представленные 8ЕЦ Ш ΝΟ:48, 51 или 65. Примерами нуклеотидной последовательности гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются нуклеотидные последовательности, представленные 8ЕЦ Ш ΝΟ:1 или 2.
Также кДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно получить методом химического синтеза с помощью синтезатора ДНК, такого как синтезатор ДНК модели 392, производимый Реткш Е1тег, или подобного синтезатора с использованием фосфорамидитного способа на основании определенной нуклеотидной последовательности ДНК.
В качестве примера способа получения геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, приводится способ, описанный ниже.
Получение геномной ДНК
Примеры способа получения геномной ДНК включают известные способы, описанные в Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопй Ебйюп; Сштеп! РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду; и подобные. Кроме того, геномную ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, также можно выделить с использованием такого набора, как Сепоте ΌΝΑ ЫЬтату 8стеешпд 8у51ет (производимого Сепоте Зу^етф, наборов ишуег8а1 Сепоте \Уа1кег™ (производимых СЕОНТЕСН) или подобных наборов.
Примерами нуклеотидной последовательности полученной таким способом геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, являются нуклеотидные последовательности, представленные 8ЕЦ Ш ΝΟ:67 или 70. Примером нуклеотидной последовательности геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, является нуклеотидная последовательность, представленная 8ЕЦ Ш ΝΟ:3.
Кроме того, клетку-хозяина настоящего изобретения также можно получить без использования экспрессирующего вектора путем непосредственного введения в клетку-хозяина антисмыслового олигонуклеотида или рибосомы, которые создаются на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано
- 19 013224 через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Антисмысловой олигонуклеотид или рибосому можно получить обычным способом или с использованием синтезатора ДНК. Конкретно, их можно получить на основе сведений о последовательности олигонуклеотида с соответствующей последовательностью из 5-150 оснований, предпочтительно 5-60 оснований и предпочтительнее 10-40 оснований из числа нуклеотидных последовательностей кДНК и геномной ДНК, кодирующих фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, путем синтеза олигонуклеотида, соответствующего последовательности, комплементарной олигонуклеотиду (антисмысловому олигонуклеотиду) или рибосоме, соответствующей последовательности олигонуклеотида.
Примерами олигонуклеотида являются олиго-РНК и производные олигонуклеотидов (называемые далее в данном описании производными олигонуклеотидов).
Примерами производных олигонуклеотидов являются производные олигонуклеотидов, в которых фосфодиэфирная связь в олигонуклеотиде превращается в фосфоротиоатную связь, производное олигонуклеотида, в котором фосфодиэфирная связь в олигонуклеотиде превращается в Н3'-Р5'-фосфоамидатную связь, производное олигонуклеотида, в котором рибоза и фосфодиэфирная связь в олигонуклеотиде превращаются в связь пептид-нуклеиновая кислота, производное олигонуклеотида, в котором урацил в олигонуклеотиде замещается С-5-пропинилурацилом, производное олигонуклеотида, в котором урацил в олигонуклеотиде замещается С-5-тиазолурацилом, производное олигонуклеотида, в котором цитозин в олигонуклеотиде замещается С-5-пропинилцитозином, производное олигонуклеотида, в котором цитозин в олигонуклеотиде замещается цитозином, модифицированным феноксазином, производное олигонуклеотида, в котором рибоза в олигонуклеотиде замещается 2'-О-пропилрибозой, и производное олигонуклеотида, в котором рибоза в олигонуклеотиде замещается 2'-метоксиэтоксирибозой [Се11 Тес11по1оду, 16, 1463 (1997)].
(Ь). Получение клетки-хозяина настоящего изобретения методом гомологичных рекомбинаций.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить путем модификации гена-мишени в хромосоме методом гомологичных рекомбинаций с использованием в качестве гена-мишени гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Ген-мишень в хромосоме можно модифицировать, используя способ, описанный в Машри1айпд 111е Мойке ЕтЬгуо, А ЬаЬога1огу Мапиа1, 8есопй Εάίΐίοη, Со14 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк (1994) (далее в описании упоминается как Машри1айпд 1Не Мойке ЕтЬгуо, А ЬаЬога1огу Мапиа1); Сепе Тагдейпд, А Ргасйса1 Арргоасй, ЖЬ Ргекк о£ ΟχίοΓά ипуегкйу Ргекк (1993); В1отапиа1 8епек 8, Сепе Тагдейпд, Ргерагайоп о£ МШаШ М1се икшд Е8 Се11к, Уобо-кйа (1995) (далее в описании упоминается как Ргерагайоп о£ Ми1ап1 М1се икшд Е8 Се11к); или подобный способ, например следующий.
Получают геномную ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
На основе нуклеотидной последовательности геномной ДНК получают вектор-мишень для гомологичной рекомбинации гена-мишени, который модифицируют (например, структурного гена фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, или гена промотора).
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить введением полученного вектора-мишени в клетку-хозяина и отбором клеток, в которых произошла рекомбинация между геном-мишенью и вектором-мишенью.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она имеет ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются клетки-хозяева, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примеры способа получения геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации
- 20 013224 углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через №гликозидную связь, включают способы, описанные при получении геномной ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы.
Примерами нуклеотидной последовательности геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, являются нуклеотидные последовательности, представленные 8ЕО ΙΌ N0:67 или 70. Примером нуклеотидной последовательности геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, является нуклеотидная последовательность, представленная 8Е0 ΙΌ N0:3.
Вектор-мишень для использования при гомологичной рекомбинации гена-мишени можно получить согласно способу, описанному в Сепе Тагдейпд, А Ргасбса1 Арргоасй, 1КЬ Рге§5 οί 0х£огб Ишуегкйу Рге§5 (1993); В1отапиа1 8епе5 8, Сепе Тагдейпд, Ргерагайоп οί Мп1ап1 М1се Н51пд Е8 Се1к, Уобо-кйа (1995), или подобным способом. Вектор-мишень можно использовать или по типу замещения, или по типу встраивания.
Для того чтобы ввести вектор-мишень в различные клетки-хозяева, можно использовать способы введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примерами способа эффективного отбора гомологичного рекомбинанта являются такие способы, как положительный отбор, промоторный отбор, отрицательный отбор или отбор по поли-А, описанные в Сепе Тагдебпд, А РгасДса1 Арргоасй, 1КЬ Рге55 о£ 0хйгб Ишуегайу Рге§8 (1993); Вютапиа1 8епе§ 8, Сепе ТагдеДпд, РгерагаДоп о£ Мп1ап1 М1се иапд Е8 Се1к, Уобо-кйа (1995), или подобные способы. Примерами способа отбора из отобранных клеточных линий гомологичного рекомбинанта, представляющего интерес, являются способ гибридизации по Саузерну для геномной ДНК (Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб Ебйюп), ПЦР [РСК РгоЮсоН Асабепйс Рге§8 (1990)] и подобные способы.
(с). Получение клетки-хозяина настоящего изобретения способом ΒΌ0.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить способом ΒΌ0 (РНК-ДНК-олигонуклеотид), имея целью ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, например, следующим образом.
Получают кДНК или геномную ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь.
Определяют нуклеотидную последовательность полученной кДНК или геномной ДНК.
На основании определенной последовательности ДНК создают и синтезируют конструкцию К00 соответствующей длины, содержащую часть ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через №гликозидную связь, или часть ее нетранслируемой области или интрон.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить введением синтезированной КН0 в клетку-хозяина и последующим отбором трансформанта, в котором произошла мутация в ферменте-мишени, а именно ферменте, имеющем отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или ферменте, имеющем отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь. Примерами являются клетки-хозяева, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примерами способа введения КН0 в различные клетки-хозяева являются способы введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примеры способа получения ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутри
- 21 013224 клеточного углеводонуклеотида СИР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, включают способы, описанные при получении ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы.
Примеры способа получения геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СИР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через №гликозидную связь, включают способы, описанные при получении геномной ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы.
Нуклеотидную последовательность ДНК можно определить, расщепляя ее соответствующими рестрикционными ферментами, клонируя фрагменты в плазмиду, такую как рВ1иебспр1 8К(-) (производимую 81га1адепе). или подобную, подвергая клоны реакции, обычно используемой в качестве способа анализа нуклеотидной последовательности, такой как в дидезокси-способе [Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А, 74, 5463 (1977)], 8аидег е1 а1., или подобному взаимодействию, и затем анализируя клоны с использованием автоматического анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК А.Ь.Р. (производимый Рйагтас1а), или подобного устройства.
КН0 можно получить обычным способом или с использованием синтезатора ДНК.
Примерами способа отбора клеток, в которых за счет введения ΚΌΌ в клетки-хозяева произошла мутация в гене, кодирующем фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СИР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, являются способы прямого обнаружения мутаций в хромосомных генах, описанные в Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопй ЕйШоп, Сиггеп! Рго1осо1б 1п Мо1еси1аг Вю1оду, и подобные способы;
способы, описанные в разделе 1(1)(а) для отбора трансформанта через оценку активности введенного фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СИР-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь; способ отбора трансформанта с использованием углеводной структуры гликопротеина на клеточной мембране, который будет описан далее в разделе 1(5); и способ отбора трансформанта на основе углеводной структуры полученной молекулы антитела, который будет описан далее в разделе 5 или 6, и подобные способы.
Конструкцию КЭ0 можно создать согласно способам, описанным в 8с1епсе, 273, 1386 (1996); №1иге Мейюте, 4, 285, (1998); Нера1о1оду, 25, 1462, (1997); Сепе Тйегару, 5, 1960, (1999); 1. Мо1. Мей., 75, 829, (1997); Ргос. №И. Асай. 8ск И8А, 96, 8774, (1999); Ргос. N311. Асай. 8ск И8А, 96, 8768, (1999); №с. Аайб. Кеб., 27, 1323, (1999); 1п\еб1. Оета1о1., 111, 1172, (1998); \а1иге Вю1есй., 16, 1343, (1998); №1иге Вю1есй., 18, 43, (2000); №11иге Вю1ес11.. 18, 555, (2000); и подобными способами.
(й). Получение клетки-хозяина настоящего изобретения способом КNА^.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить способом КNА^ (интерференции РНК), имея целью ген фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, например, следующим образом.
Получают кДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь.
Определяют нуклеотидную последовательность полученной кДНК.
На основе определенной последовательности ДНК создают генную конструкцию КNА^ соответствующей длины, содержащую кодирующую часть ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, или часть ее нетранслируемой области.
Для того чтобы в клетке экспрессировался ген КNА^, получают рекомбинантный вектор, встраивая фрагмент или полноразмерную полученную ДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора.
Получают трансформант, вводя рекомбинантный вектор в клетку-хозяина, подходящую для экспрессирующего вектора.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить отбором трансформанта на основе актив
- 22 013224 ности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΘΌΡ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, или структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране или продуцируемой молекуле антитела.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΘΌΡ-фукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь. Примерами являются клетки-хозяева, которые будут описаны далее в разделе 3.
В качестве экспрессирующего вектора используют вектор, который может автономно реплицироваться в клетке-хозяине, или который можно интегрировать в хромосому, и содержащий промотор в такой позиции, что создаваемый ген ΚΉΛί можно переносить. Примерами являются экспрессирующие векторы, которые будут описаны далее в разделе 3.
Что касается способа введения гена в различные клетки-хозяева, то можно использовать способы введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, описанные далее в разделе 3.
Примерами способа отбора трансформанта на основе активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΘΌΡ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 N ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N гликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а).
Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы, которые будут описаны далее в разделе 5 или 6.
Примеры способа получения ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΘΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через №гликозидную связь, включают способы, описанные при получении ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы.
Кроме того, клетку-хозяина настоящего изобретения также можно получить без использования экспрессирующего вектора непосредственным введением гена ΚΉΛί. созданного на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΘΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 ^ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь.
Ген КНА! можно получить обычным способом или с использованием синтезатора ДНК.
Конструкцию гена КПА! можно создать согласно способам, описанным в №111.11^ 391, 806 (1998); Ρι-ос. Ыаб. Асаб. δα. И8А, 95, 15502 (1998); Ыа1иге, 395, 854 (1998); Ρι-ос. №11. Асаб. 8οΐ. И8А, 96, 5049 (1999); Се11, 95, 1017 (1998); Ρι-ос. Ыаб. Асаб. 8οΐ. И8А, 95, 1451 (1999); Ρι-ос. ЫаЙ. Асаб. δα. И8А, 95, 13959 (1998); №1иге Се11 Бю1., 2, 70 (2000); и подобными способами.
(е). Получение клетки-хозяина настоящего изобретения способом с использованием транспозонов.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить, вызывая мутацию с использованием системы транспозонов, описанной в №|1иге Оепе1., 25, 35 (2000), или подобной системы, с последующим отбором мутанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΘΌΡ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, или структуры углеводной цепи гликопротеина продуцируемой молекулы антитела или в клеточной мембране.
Система транспозонов представляет собой систему, в которую вводят мутацию случайным встраиванием в хромосому экзогенного гена, где экзогенный ген, расположенный между транспозонами, обычно используют в качестве вектора для индуцирования мутации, и в то же время в клетку вводят вектор, экспрессирующий транспозазу, для случайного встраивания гена в хромосому.
Можно использовать любую транспозазу до тех пор, пока она подходит для последовательности используемого транспозона.
В качестве экзогенного гена можно использовать любой ген до тех пор, пока он может индуцировать мутацию в ДНК клетки-хозяина.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, жи
- 23 013224 вотная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ООР-фукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь. Примерами являются клетки-хозяева, которые будут описаны далее в разделе 3. Для введения гена в различные клетки-хозяева можно использовать способ введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клетокхозяев, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примерами способа отбора мутанта на основе активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ООР-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через №гликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а).
Примерами способа отбора мутанта на основе структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбора мутанта на основе структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы, которые будут описаны далее в разделах 5 или 6.
(2). Способ введения доминантотрицательного мутанта гена, кодирующего фермент.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить, имея целью ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ООР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, с использованием метода введения доминантотрицательного мутанта гена, кодирующего фермент. Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ООР-фукозы, являются СМЭ. Ех, ОЕРР, фукокиназа и подобные ферменты. Примерами фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь, являются α-1,6фукозилтрансфераза, α-Ь-фукозидаза и подобные ферменты.
Ферменты катализируют специфические реакции со специфичностью к субстрату, и доминантотрицательные мутанты ферментов можно получить, разрушая активный центр ферментов, катализирующих каталитическую активность со специфичностью к субстрату. Способ получения доминантотрицательного мутанта конкретно описывается ниже с выбором среди мишеней-ферментов ОМИ.
В результате анализа трехмерной структуры ОМИ, полученного из Е. со11, показано, что 4 аминокислоты (треонин в позиции 133, глутаминовая кислота в позиции 135, тирозин в позиции 157 и лизин в позиции 161) важны для ферментативной активности (З1гис1иге, 8, 2, 2000). Иными словами, когда получали мутантов заменой 4 аминокислот на другие аминокислоты на основании информации о трехмерной структуре, ферментативная активность всех мутантов существенно понижалась. С другой стороны, изменения способности ОМИ связываться с коферментом ОМИ НЛЭР и его субстратом ОИР-маннозой в мутантах едва отмечались. Соответственно, доминантотрицательный мутант можно получить, заменяя 4 аминокислоты, регулирующие ферментативную активность ОМИ. Например, в ОМЭ (ЗЕО ΙΌ N0:65), полученном из клеток СНО, доминантотрицательный мутант можно получить, заменяя треонин в позиции 155, глутаминовую кислоту в позиции 157, тирозин в позиции 179 и лизин в позиции 183 на другие аминокислоты, сравнивая гомологию и предсказывая трехмерную структуру с использованием информации об аминокислотной последовательности, основанной на результатах для ОМИ, полученного из Е. со11. Так, ген, в который введена замена аминокислоты, можно получить методом сайтнаправленного мутагенеза, описанным в Мо1еси1аг С1ошпд, Зесоий ЕйШои, Сиггеп! РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, или подобным методом.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить согласно способу, описанному в Мо1еси1аг С1ошпд, Зесопй ЕйШоп, Сиггеп! РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, или подобному способу с использованием полученного гена доминантотрицательного мутанта фермента-мишени, например, следующим образом.
Получают ген, кодирующий доминантотрицательный мутант (называемый далее геном доминантотрицательного мутанта) фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ООР-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь.
На основе полученной полноразмерной ДНК гена доминантотрицательного мутанта получают при необходимости фрагмент ДНК соответствующей длины, содержащий часть, кодирующую белок.
Получают рекомбинантный вектор, встраивая фрагмент ДНК или полноразмерную ДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора.
- 24 013224
Получают трансформант, вводя рекомбинантный вектор в клетку-хозяина, подходящую для экспрессирующего вектора.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить отбором трансформанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, или структуры углеводной цепи гликопротеина продуцируемой молекулы антитела или в клеточной мембране.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются клетки-хозяева, которые будут описаны далее в разделе 3.
В качестве экспрессирующего вектора можно использовать вектор, который может автономно реплицироваться в клетке-хозяине или может интегрироваться в хромосому и содержит промотор в позиции, где можно осуществить транскрипцию ДНК, кодирующей доминантотрицательный мутант, представляющий интерес. Примерами являются экспрессирующие векторы, которые будут описаны далее в разделе 3.
Для введения гена в различные клетки-хозяева можно использовать способ введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примерами способа отбора трансформанта на основе активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а).
Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы, которые будут описаны далее в разделах 5 или 6.
(3). Способ введения мутации в фермент.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить введением мутации в ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, и последующим отбором клеточной линии, представляющей интерес, в которой произошла мутация в ферменте.
Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, являются СМБ. Рх, 6ΡΡΡ, фукокиназа и подобные ферменты. Примерами фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются α-1,6-фукозилтрансфераза, α-Ь-фукозидаза и подобные ферменты.
Примерами способа являются: 1) способ, при котором нужную клеточную линию отбирают среди мутантов, полученных индуцирующей мутацию обработкой родительской клеточной линии мутагеном, или спонтанно образующихся мутантов, основываясь на активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, 2) способ, при котором нужную клеточную линию отбирают среди мутантов, полученных индуцирующей мутацию обработкой родительской клеточной линии мутагеном, или спонтанно образующихся мутантов, основываясь на структуре углеводной цепи продуцированной молекулы антитела, и 3) способ, при котором нужную клеточную линию отбирают среди мутантов, полученных индуцирующей мутацию обработкой родительской клеточной линии мутагеном, или спонтанно образующихся мутантов, основываясь на структуре углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране.
В качестве индуцирующей мутацию обработки можно использовать любую обработку до тех пор, пока она может вызывать точечную мутацию, или делецию, или мутацию со сдвигом рамки в ДНК клеток родительской клеточной линии.
Примерами являются обработка этилнитрозомочевиной, нитрозогуанидином, бензопиреном или акридиновым пигментом и обработка излучением. В качестве мутагенов также можно использовать раз
- 25 013224 личные алкилирующие агенты и канцерогены. Примерами способа, позволяющего мутагену воздействовать на клетки, являются способы, описанные в ТЦкие Си1!иге ТесЬшдиек, 3гб еббюп (Акакига 8Ьо!еп), еббеб Ьу 1арапеке ТЦкие Си1!иге Аккоаабоп (1996), №11иге Сепе!., 24, 314 (2000), и подобные способы.
Примерами спонтанно образующихся мутантов являются мутанты, спонтанно образованные непрерывным субкультивированием в обычных условиях культивирования клеток без применения специальной обработки, вызывающей мутации.
Примерами способа измерения активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а). Примерами способа выяснения структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы, которые будут описаны далее в разделах 5 или 6. Примерами способа выяснения структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе (5).
(4) . Способ ингибирования транскрипции и/или трансляции гена, кодирующего фермент.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить ингибированием транскрипции и/или трансляции гена-мишени методом антисмысловой РНК/ДНК [Вюкаепсе апб Шбикйу, 50, 322, (1992); СЬешЩгу, 46, 681, (1991); В1о!есЬпо1оду, 9, 358, (1992); Тгепбк ш Вю!есЬпо1оду, 10, 87, (1992); Тгепбк ш В1о!есЬпо1оду, 10, 152, (1992); Се11 Епдепееппд, 16, 1463, (1997)], методом тройной спирали [Тгепбк ш В1о!есЬпо1оду, 10, 132, (1992)] или подобным методом с использованием в качестве мишени гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, являются СМО, Рх, СРРР, фукокиназа и подобные ферменты. Примерами фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются а-1,6-фукозилтрансфераза, α-Ь-фукозидаза и подобные ферменты.
(5) . Способ отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить с использованием способа отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Примерами способа отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются способы, описанные в 8ота!ю Се11 Мо1. Сепе!., 12, 51 (1986), и подобные способы. В качестве лектина можно использовать любой лектин до тех пор, пока он представляет собой лектин, узнающий структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются лектин Ьепк сиЕпапк ЬСА (лентилагглютинин, полученный из Ьепк сиНпапк), лектин гороха Р8А (лектин гороха, полученный из Р18ит кабуит), лектин кормовых бобов УРА (агглютинин, полученный из У1С1а ίаЬа), лектин А1еипа аигапба ААЬ (лектин, полученный из А1еипа аигапба) и т.п.
Конкретно, клеточную линию, невосприимчивую к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно отобрать путем культивирования клеток в течение 1 суток - 2 недель, предпочтительно от 1 суток до 1 недели, с использованием среды, содержащей лектин в концентрации от 1 мкг/мл до 1 мг/мл, субкультивирования выживших клеток или пикирования колонии и переноса их в сосуд для культивирования клеток и последующего непрерывного культивирования с использованием лектинсодержащей среды. Примером клеточной линии, полученной таким способом, является СНО/ССВ4-ЬСА №да-13 (РЕВМ ВР-7756), полученная в примере 14(2), описанном далее.
2. Получение трансгенного, не являющегося человеком животного или растения или их потомств по настоящему изобретению.
Трансгенное, не являющееся человеком животное или растение или их потомства по настоящему изобретению представляют собой трансгенное, не являющееся человеком животное или растение или их
- 26 013224 потомства, в которых геномный ген модифицирован таким образом, что можно регулировать активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи молекулы антитела, и их можно получить согласно способу, подобному способу в разделе 1, с использованием в качестве мишени гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
В трансгенном животном, не являющемся человеком, можно получить эмбриональные стволовые клетки настоящего изобретения, в которых регулируется активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, применяя способ, подобный способу раздела 1, к эмбриональным стволовым клеткам предназначенного для этого животного, не являющегося человеком, такого как крупный рогатый скот, овца, коза, свинья, лошадь, мышь, крыса, домашняя птица, обезьяна, кролик или подобного животного.
Конкретно, получают клон мутантов, в котором ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, инактивирован или заменен любой последовательностью известным методом гомологичной рекомбинации [например, описанным в №!иге, 326, 6110, 295 (1987); Се11, 51, 3, 503 (1987) или подобным]. С использованием полученного клона мутантов методом инъекции химер в бластоцисту оплодотворенной яйцеклетки животного или методом агрегации химер можно получить химерную особь, содержащую клон эмбриональных стволовых клеток и обычные клетки. Химерную особь скрещивают с обычной особью, так что можно получить трасгенное, не являющееся человеком животное, у которого во всех клетках организма уменьшена или устранена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Также можно получить оплодотворенную яйцеклетку настоящего изобретения, в которой уменьшена или устранена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, применяя способ, подобный способу раздела 1, к оплодотворенной яйцеклетке представляющего интерес животного, не являющегося человеком, такого как крупный рогатый скот, овца, коза, свинья, лошадь, мышь, крыса, домашняя птица, обезьяна, кролик или подобного животного.
Трансгенное, не являющееся человеком животное, у которого уменьшена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно получить путем трансплантации полученной оплодотворенной яйцеклетки в яйцевод или матку псевдобеременной самки с использованием способа трансплантации эмбрионов, описанного в Машри1абид Мойке ЕтЬгуо, 8есоиб ЕбШои, или подобного способа с последующим рождением животным детенышей.
В трансгенном растении каллюс настоящего изобретения, в котором активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно получить, применяя способ, подобный способу, описанному в разделе 1, к каллюсу или клеткам растения, представляющего интерес.
Трансгенное растение, в котором уменьшена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно получить культивированием полученного каллюса с использованием среды, содержащей ауксин и цитокинин, и редифференцировать его согласно известному способу [Т1ккие СиНиге, 20, (1994); Т1ккие СиНиге, 21, (1995); Тгеибк ш В1о1есЬио1оду, 15, 45, (1997)].
- 27 013224
3. Способ получения композиции антител.
Композицию антител можно получить экспрессированием ее в клетках-хозяевах способом, описанным в Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб ЕбШоп; Сиггеп1 Рто1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду; ЛпйЬоб1е8, А ЬаЬота1огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1оту, 1988 (публикация далее упоминается как АпПЬобхек); Мопос1опа1 АпПЬобхек: Рг1пс1р1е8 апб РтасПсе, ТЫгб Ебйюп, Асаб. Ртекк, 1993 (публикация далее упоминается как Мопос1опа1 АпПЬобхек) и АпПЬобу Епдепеетшд, А Ртасйсе Арртоасй, 1ЕЬ Ртекк а! ОхГогб Ишуегайу Ргекк (публикация далее упоминается как АпПЬобу Епдепеегшд), например, следующим образом.
Получают полноразмерную кДНК, кодирующую молекулу антитела, и получают фрагмент ДНК соответствующей длины, содержащий часть, кодирующую молекулу антитела.
Получают рекомбинантный вектор, встраивая фрагмент ДНК или полноразмерную кДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора.
Трансформант, продуцирующий молекулы антител, можно получить, вводя рекомбинантный вектор в клетки-хозяева, подходящие для экспрессирующего вектора.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую дрожжевую клетку, животную клетку, клетку насекомого, растительную клетку или подобную до тех пор, пока она может экспрессировать ген, представляющий интерес.
Клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого, растительная клетка или подобная, в которую методом генной инженерии введен фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, связанную с Ес-областью молекулы антитела, также можно использовать в качестве клетки-хозяина.
В качестве экспрессирующего вектора используют вектор, который может автономно реплицироваться в клетке-хозяине или может интегрироваться в хромосому и содержит промотор в такой позиции, что можно переносить ДНК, кодирующую молекулу антитела.
Из ткани или клеток человека или животного, не являющегося человеком, можно получить кДНК с использованием, например, зонда-праймера, специфического для молекулы антитела, представляющей интерес, согласно способам, описанным при получении ДНК в разделе 1(1)(а).
Когда в качестве клетки-хозяина используют дрожжевую клетку, примерами экспрессирующего вектора являются ΥΕρ13 (АТСС 37115), ΥЕр24 (АТСС 37051), ΥСр50 (АТСС 37419) и подобные векторы.
Можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в дрожжах. Примерами являются промотор гена гликолитического метаболического пути, такой как ген гексозокиназы, и т.п., промотор РН05, промотор РОК, промотор ОАР, промотор АЭН, промотор да1 1, промотор да1 10, промотор белков теплового шока, промотор МЕ α1, промотор СИР 1 и подобные.
Примерами клеток-хозяев являются микроорганизмы, принадлежащие к роду 8ассйатотусек, роду 8сЫ7окассйатотусек, роду К1иууеготусек, роду Тпсйокрогоп, роду 8сйтапшотусек и подобным, такие как 8ассйатотусек сегеуШае, 8сЫхо5ассЬаготусе5 ротЬе, К1иууеготусек 1ас11к, ТпсЬокрогоп ри11и1ап8 и 8с11\\'апшотусе5 а11иушк и т.п.
В качестве способа введения рекомбинантного вектора можно использовать любой способ до тех пор, пока он позволяет вводить ДНК в дрожжи. Примерами являются электропорация [МеЙюбк ш ЕпгутоДду, 194, 182 (1990)], сферопластовый способ [Ргос. №11. Асаб. 8ск и8А, 84, 1929 (1978)], литийацетатный способ [1. Вас1етю1., 153, 163 (1983)], способ, описанный в Ргос. №11. Асаб. 8ск и8А, 75, 1929 (1978), и подобные способы.
Когда в качестве клетки-хозяина используют животную клетку, примерами экспрессирующего вектора являются рсЭНАЕ рсЭМ8 (доступные от ЕипакокЫ), рАОЕ107 [опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 22979/91; Су1о1есйпо1оду, 3, 133, (1990)], рА83-3 (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 227075/90), рСЭМ8 [№1ите, 329, 840, (1987)], рс^NЛI/Лтр (производимый 1пуйтодеп), рЕЕР4 (производимый 1пу11годеп), рАОЕ103 [1. ВюсйетШту, 101, 1307 (1987)], рАОЕ210 и подобные векторы.
Можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в животной клетке. Примерами являются промотор 1Е (немедленно-раннего) гена цитомегаловируса (СМУ), ранний промотор 8У40, промотор ретровируса, промотор металлотионеина, промотор теплового шока, промотор 8Еа и т.п. Также вместе с промотором можно использовать энхансер 1Е гена СМУ человека.
Примерами клетки-хозяина являются клетки человека, такие как клетки №та1та, клетки обезьяны, такие как клетки СО8, клетки китайского хомячка, такие как клетки СНО или НВТ5637 (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 299/88), клетки миеломы крысы, клетки миеломы мыши, клетки, полученные из почек сирийского хомячка, эмбриональные стволовые клетки, оплодотворенные яйцеклетки и т.п.
В качестве способа введения рекомбинантного вектора можно использовать любой способ до тех пор, пока он позволяет вводить ДНК в животную клетку. Примерами являются электропорация [Су1о1ес1то1оду, 3, 133 (1990)], кальцийфосфатный способ (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 227075/90), способ липофекции [Ргос. №а11. Асаб. 8с1. и8А, 84, 7413 (1987)], инъекционный способ [Мащри1а1шд 1Не Мойке ЕтЬгуо, А ЬаЬота1оту Мапиа1], способ с использованием инжектора частиц (ген
- 28 013224 ная пушка) (патент Японии № 2606856, патент Японии № 2517813), ИЕАЕ-декстрановый способ [Вютаииа1 8епей 4 - Сеие ТгаийГег аиб Ехргеййюи Аиа1уй15 (Уобо-ййа), ебйеб Ьу ТакайЫ Уоко!а аиб КешсЫ Ага1 (1994)], способ с вирусным вектором (Машри1а!тд Моийе ЕтЬгуо, 8есоиб ЕбШои) и подобные способы.
Когда в качестве клетки-хозяина используют клетку насекомого, белок можно экспрессировать способом, описанным в Сиггеи! Рго!осо1й ш Мо1еси1аг Вю1оду, Васи1оу1ги5 Ехргеййюи Уес!огй, А ЬаЬога!огу Маииа1, XV. Н. Ргеетаи аиб Сотраиу, №\ν Уогк (1992), В1о/Тескио1оду, 6, 47 (1988), или подобным способом.
Иными словами, белок можно экспрессировать путем одновременного введения в клетку насекомого вектора, вводящего рекомбинантный ген, и бакуловируса, получить в супернатанте культуры клеток насекомого рекомбинантный вирус, и затем инфицировать клетку насекомого рекомбинантным вирусом.
Примерами вводящего ген вектора, используемого в таком способе, являются рУЬ1392, рУЬ1393, рВ1иеВасШ (все производятся Шуйгодеи) и подобные векторы.
Примерами бакуловируса являются вирус ядерного полиэдроза АнЮдгарйа саПГогшса, которым заражено насекомое семейства Вага!йга.
Примерами клеток насекомого являются ооциты 8Г19 и 8Г21 8робор!ега Ггищрегба [Сиггеи! Рго!осо1й 1и Мо1еси1аг В 1о1оду, Васи1оу1ги5 Ехргеййюи Уес!огй, А ЬаЬога!огу Маииа1, XV.Н. Ргеетаи аиб Сотраиу, №\ν Уогк (1992)], ооциты Нр11 5 Тпсйорйыа и (производимые Шуйгодеи) и подобные клетки.
Примерами способа одновременного введения вектора, вводящего рекомбинантный ген, и бакуловируса для получения рекомбинантного вируса являются кальцийфосфатный способ (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 227075/90), способ липофекции [Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 84, 7413 (1987)] и подобные способы.
Когда в качестве клетки-хозяина используют растительную клетку, примерами экспрессирующего вектора являются Т1-плазмида, вирус табачной мозаики и подобные векторы.
В качестве промотора можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в растительной клетке. Примерами являются промотор 358 вируса мозаики цветной капусты (СаМУ), промотор актина 1 риса и подобные промоторы.
Примерами клеток-хозяев являются клетки таких растений, как табак, картофель, томат, морковь, соя, рапс, люцерна, рис, пшеница, ячмень и т.д., и подобные клетки.
В качестве способа введения рекомбинантного вектора можно использовать любой способ до тех пор, пока он позволяет вводить ДНК в растительную клетку. Примерами являются способ с использованием АдгоЬас!егшт (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 140885/84, опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 70080/85, А0 94/00977), электропорация (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 251887/85), способ с использованием инжектора частиц (генная пушка) (патент Японии № 2606856, патент Японии № 2517813) и подобные способы.
В качестве способа экспрессии гена выделение продукции, экспрессию слитого белка Рс-области с другим белком и т.п. можно осуществлять согласно способу, описанному в Мо1еси1аг С1ошид, 8есоиб ЕбШои, или подобным способом в дополнение к способу прямой экспрессии.
Когда ген экспрессируется бактерией, дрожжами, животной клеткой, клеткой насекомого или растительной клеткой, в которые введен ген, имеющий отношение к синтезу углеводной цепи, можно получить молекулу антитела, к которой с помощью введенного гена добавлена углеводная цепь.
Композицию антител можно получить культивированием полученного трансформанта в среде для продукции и накопления молекул антител в культуре и последующим выделением их из полученной культуры. Способ культивирования трансформанта с использованием среды можно осуществить согласно общему способу, который используют для культивирования клеток-хозяев.
Средой для культивирования полученного трансформанта с использованием в качестве клеток-хозяев прокариот, таких как ЕйсйепсШа сой и т.п., или эукариот, таких как дрожжевые клетки и т.п., может быть или природная среда или синтетическая среда до тех пор, пока она содержит вещества, такие как источник углерода, источник азота, неорганические соли и т.п., которые могут ассимилироваться организмом, и в ней может эффективно осуществляться культивирование трансформанта.
В качестве источника углерода можно использовать источники, которые могут усваиваться организмом. Примерами являются углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, содержащая их меласса, крахмал, гидролизат крахмала и т.п.; органические кислоты, такие как уксусная кислота, пропионовая кислота и т.п.; спирты, такие как этанол, пропанол и т.п.; и подобные вещества.
Примерами источника азота являются аммиак, аммониевые соли неорганических кислот или органических кислот, такие как хлорид аммония, сульфат аммония, ацетат аммония, фосфат аммония и т.п.; другие азотсодержащие соединения; пептон; мясной экстракт; дрожжевой экстракт; кукурузный настой; гидролизат казеина; соевая мука; гидролизат соевой муки; различные ферментированные клетки и их гидролизаты и подобные источники.
Примерами неорганических веществ являются дигидрофосфат калия, дикалийгидрофосфат, фосфат магния, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, сульфат меди, карбонат кальция и подобные вещества.
- 29 013224
Культивирование обычно осуществляют в аэробных условиях, таких как при культивировании при встряхивании, глубинном культивировании при аэрации с перемешиванием или подобных условиях. Температура культивирования составляет предпочтительно 15-40°С, и время культивирования, как правило, составляет от 16 ч до 7 суток. Во время культивирования поддерживают рН на уровне 3,0-9,0. Регулируют рН с использованием неорганической или органической кислоты, раствора щелочи, мочевины, карбоната кальция, аммиака или подобных веществ.
При необходимости в среду во время культивирования можно добавить антибиотик, такой как ампициллин, тетрациклин или подобный.
Когда культивируют микроорганизм, трансформированный рекомбинантным вектором, полученным с использованием в качестве промотора индуцируемого промотора, в среду при необходимости можно добавлять индуктор. Например, когда культивируют микроорганизм, трансформированный рекомбинантным вектором, полученным с использованием 1ас-промотора, в среду можно добавить изопропил-в-Э-тиогалактопиранозид, а когда культивируют микроорганизм, трансформированный рекомбинантным вектором, полученным с использованием Ггр-промотора, в среду можно добавить индолакриловую кислоту.
Когда культивируют трансформант, полученный с использованием в качестве клеток-хозяев животных клеток, примерами среды являются обычно используемые среда РРМ! 1640 [Тйе 1оита1 о! 1йе Атепсаи Мейюа1 АккоааГюи, 199, 519 (1967)], среда Игла МЕМ [Заеисе, 122, 501 (1952)], модифицированная по Дульбекко среда МЕМ [У1го1оду, 8, 396 (1959)], среда 199 [Ргосеейтд о! 1йе ЗоаеГу Гог Гйе Вю1одюа1 Мейюте, 73, 1 (1950)] и среда Уиттена [Пеуе1ортеиГа1 Еидеиеегтд ЕхрептеиГаГюи Маииа1 - РгерагаГюи о! Тгаикдешс Мюе (Койа-кйа), еййей Ьу М. КаГкйик1 (1987)], среды, в которые добавлена фетальная телячья сыворотка, и подобные среды.
Культивирование, как правило, осуществляют при рН 6-8 и 30-40°С в течение 1-7 суток в присутствии 5% СО2. При необходимости в среду во время культивирования можно добавить антибиотик, такой как канамицин, пенициллин или подобный.
Примерами среды для применения при культивировании трансформанта, полученного с использованием в качестве клеток-хозяев клеток насекомых, являются обычно используемые среда ТИМ-ЕН (производимая Рйагттдеи), среда ЗГ-900 ΙΙ ЗЕМ (производимая Ь1!е ТесйиокдГек), ЕхСе11 400 и ЕхСе11 405 (обе производятся ГРН Вюкаеисек), среда Грейса для клеток насекомых [МаГиге, 195, 788 (1962)] и подобные среды.
Культивирование, как правило, осуществляют при рН среды 6-7 и 25-30°С в течение 1-5 суток.
Кроме того, если в данном случае требуется, в среду во время культивирования можно добавить антибиотики, такие как гентамицин.
Трансформант, полученный с использованием в качестве клеток-хозяев растительных клеток, можно культивировать как клетки или путем дифференциации их в клетках или органе растения. Примерами среды для культивирования трансофрманта являются обычно используемые среда МигакЫде и Зкоод (МЗ) и среда Уайта, среды, в которые добавлены растительные гормоны, такие как ауксин, цитокинин и т.п., и подобные среды.
Культивирование, как правило, осуществляют при рН 5-9 и 20-40°С в течение 3-60 суток.
При необходимости в среду во время культивирования можно добавить антибиотик, такой как канамицин, гигромицин или подобный.
Соответственно, композицию антител можно получить культивированием трансформанта, полученного из микроорганизма, животных клеток или растительных клеток, содержащих рекомбинантный вектор, в который встроена ДНК, кодирующая молекулу антитела, согласно общему способу культивирования, посредством которого получают и накапливают композицию антител, и последующим выделением композиции антител из культуры.
В качестве способа экспрессии гена выделение продукции, экспрессию слитого белка и т. п. можно осуществить согласно способу, описанному в Мо1еси1аг С1ошид, Зесоий Еййюи, в добавление к способу прямой экспрессии.
Примерами способа получения композиции антител являются способ внутриклеточной экспрессии в клетках-хозяевах, способ внеклеточной секреции от клеток-хозяев и способ получения на внешней оболочке мембраны клеток-хозяев. Способ можно выбрать, заменяя используемую клетку-хозяина или структуру получаемой композиции антител.
Когда композицию антител настоящего изобретения получают в клетках-хозяевах или на внешней оболочке мембраны клеток-хозяев, ее можно положительно секретировать вне клеток согласно способу Раи1кои еГ а1. [I. Вю1. Сйет., 264, 17619 (1989)], способу Бо\\'е еГ а1. [Ргос. №Г1. Асай. За. иЗА, 86, 8227 (1989), Сеие Пеуе1ор., 4, 1288 (1990)], способам, описанным в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 336963/93 и в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 823021/94, и подобным способом.
Иными словами, молекулы антитела, представляющие интерес, можно секретировать из клеток-хозяев вне клеток, встраивая ДНК, кодирующую молекулу антитела, и ДНК, кодирующую сигнальный пептид, под
- 30 013224 ходящий для экспрессии молекулы антитела, в экспрессирующий вектор с использованием метода генетической рекомбинации, вводя экспрессирующий вектор в клетки-хозяева с последующей экспрессией молекул антитела.
Также продуцируемое количество можно увеличить согласно способу, описанному в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 227075/90, с использованием системы амплификации гена, использующей ген дигидрофолатредуктазы.
Кроме того, композицию антител также можно получить с использованием отдельного животного с введенным геном (трансгенного животного, не являющегося человеком) или отдельного растения (трансгенного растения), сконструированного редифференциацией животной или растительной клетки, в которую введен ген.
Когда трансформант представляет собой отдельное животное или отдельное растение, композицию антител можно получить согласно общему способу его выращивания или культивирования для продукции и накапливания посредством этого композиции антител с последующим выделением композиции антител из отдельного животного или растения.
Примером способа получения композиции антител с использованием животной особи является способ, при котором композицию антител, представляющую интерес, получают в животном, созданном путем введения гена согласно известному способу [Атепсап .^ита ο£ С11шса1 ΜΠι/Ιίοΐ! 63, 6278 (1996); Вю/ТесЬм^^у, 9, 830 (1991)].
В случае животной особи композицию антител можно получить, выращивая трансгенное животное, не являющееся человеком, в которое введена ДНК, кодирующая молекулу антитела, для продуцирования и накапливания посредством этого композиции антител в животном с последующим выделением композиции антител из животного. Примерами места в организме животного, где продуцируется и накапливается композиция, являются молоко (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 309192/88) и яйца животного. В качестве промотора, используемого в таком случае, можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в организме животного. Предпочтительными примерами являются специфические промоторы клеток молочной железы, такие как промотор α-казеина, промотор β-казеина, промотор β-лактоглобулина, промотор кислого белка молочной сыворотки и подобные промоторы.
Примером способа получения композиции антител с использованием отдельного растения является способ, при котором композицию антител получают, культивируя трансгенное растение, в которое известным способом введена ДНК, кодирующая молекулу антитела |Т|ззие Сибиге, 20 (1994); ТБзие Си11иге, 21 (1995); Тгепбз ш ΒίοΙ^ΗποΙο^, 15, 45 (1997)], для продуцирования и накапливания композиции антител в растении и извлекая затем композицию антител из растения.
Что касается очистки композиции антител, продуцированной трансформантом, в который введен ген, кодирующий молекулу антитела, например, когда композиция антител экспрессируется внутри клетки в растворенном состоянии, то клетки после культивирования извлекают центрифугированием, суспендируют в водном буферном растворе, затем разрушают с использованием ультразвукового генератора, пресса Френча, гомогенизатора МапФп 6аи1ш, бугютЫ или подобного устройства и получают бесклеточный экстракт. Очищенный продукт композиции антител можно получить из супернатанта, полученного центрифугированием бесклеточного экстракта, используя общие методы выделения ферментов в чистом виде, такие как экстракция растворителями; высаливание; обессоливание с помощью сульфата аммония и т.п.; осаждение органическим растворителем; анионообменная хроматография с использованием такой смолы, как диэтиламиноэтилсефароза (БЕАЕ-сефароза), ЭШОК НРА-75 (производимая Мб8иЬ18Й1 Сйетюа1) и т.п.; катионообменная хроматография с использованием такой смолы, как 8-сефароза РР (производимая £1131411303) и т.п.; гидрофобная хроматография с использованием такой смолы, как бутилсефароза, фенилсефароза и т.п.; гель-фильтрация с использованием молекулярных сит; аффинная хроматография; хроматофокусирование; электрофорез, такой как изоэлектрическое фокусирование, и т.п., и подобные методы, которые можно использовать одни или в комбинации.
Также, когда композиция антител экспрессируется внутри клеток путем образования нерастворимых включений, клетки извлекают, разрушают и центрифугируют теми же способами, и нерастворимую массу композиции антител извлекают в виде осажденной фракции. Выделенную нерастворимую массу композиции антител солюбилизируют с использованием агента, денатурирующего белки. Композицию антител переводят в нормальную трехмерную структуру, растворяя или диализуя солюбилизированный раствор, и затем получают очищенную композицию антител тем же способом выделения в чистом виде.
Когда композиция антител секретируется вне клеток, композицию антител или их производные можно выделить из культурального супернатанта. Иными словами, культуру обрабатывают таким методом, как центрифугирование, или подобным методом, и получают растворимую фракцию, и очищенный препарат композиции антител можно получить из растворимой фракции тем же способом выделения в чистом виде.
Примеры полученной таким образом композиции антител включают в себя антитело, фрагмент антитела, слитый белок, содержащий Рс-фрагмент антитела и т. п.
В качестве примера получения композиции антител ниже подробно описывается способ получения
- 31 013224 композиции гуманизированных антител, но композиции других антител также можно получать способом, подобным описанному.
(1) . Конструирование вектора для экспрессии гуманизированных антител.
Вектор для экспрессии гуманизированных антител представляет собой экспрессирующий вектор для животной клетки, в который встроены гены, кодирующие С-области тяжелой цепи (Н-цепи) и легкой цепи (Ь-цепи) человеческого антитела, который можно сконструировать клонированием каждого из генов, кодирующих С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела, в экспрессирующий вектор для животной клетки.
С-области человеческого антитела могут представлять собой Н-цепь и Ь-цепь любого человеческого антитела. Примерами являются С-область, принадлежащая к подклассу 1дО1 в Н-цепи человеческого антитела (называемая далее ’ЪСу1), С-область, принадлежащая к классу к в Ь-цепи человеческого антитела (называемая далее ’ЪСк), и подобные С-области.
В качестве генов, кодирующих С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела можно использовать хромосомную ДНК, содержащую экзон и интрон, или также можно использовать кДНК.
В качестве экспрессирующего вектора для животной клетки можно использовать любой вектор до тех пор, пока ген, кодирующий С-область человеческого антитела, можно встроить в него и экспрессировать в нем. Примерами являются рАОЕ107 [СуГоГесйпо1оду, 3, 133 (1990)], рАОЕ103 [1. Вюсйет., 101, 1307 (1987)], РН8О274 [Оепе, 27, 223 (1984)], рКСК [Ргос. N011. Асаё. 8οΐ. И8А, 78, 1527 (1981)], р8О1 β ё2-4 [СуГоГесйпо1оду, 4, 173 (1990)] и подобные векторы. Примерами промотора и энхансера в экспрессирующем векторе для животной клетки являются ранний промотор и энхансер 8У40 |1. Вюсйет., 101, 1307 (1987)], промотор ЬТК вируса лейкоза Молони мыши [Вюсйет. Вюрйук. Рек. Соттип., 149, 960 (1987)], промотор Н-цепи иммуноглобулина [Се11, 41, 479 (1985)], энхансер [Се11, 33, 717 (1983)] и т.п.
Экспрессирующий вектор гуманизированного антитела может быть или типа, в котором гены, кодирующие Н-цепь и Ь-цепь антитела, существуют на отдельных векторах, или типа, в котором оба гена существуют на одном и том же векторе (тандемный тип). Что касается легкости конструирования экспрессирующего вектора гуманизированных антител, легкости введения в животные клетки и баланса между количествами экспрессии Н- и Ь-цепей антитела в животных клетках более предпочтителен тандемный тип экспрессирующего вектора гуманизированного антитела [Э. 1ттипо1. Μеΐйοё8, 167, 271 (1994)].
Сконструированный экспрессирующий вектор гуманизированных антител можно использовать для экспрессии в животных клетках человеческих химерных антител и человеческих СЭР-привитых антител.
(2) . Получение кДНК, кодирующей У-область антитела, полученного от животного, иного, чем человек.
кДНК, кодирующую У-области Н-цепи и Ь-цепи антитела, полученного от животного иного, чем человек, такого как мышиное антитело, можно получить следующим образом.
Синтезируют кДНК, экстрагируя мРНК из гибридомных клеток, продуцирующих представляющие интерес мышиные антитела. Синтезированную кДНК клонируют в вектор, такой как фаг или плазмида, и получают библиотеку кДНК. Каждые рекомбинантный фаг или рекомбинантную плазмиду, содержащие кДНК, кодирующую У-область Н-цепи, и рекомбинантный фаг или рекомбинантную плазмиду, содержащие кДНК, кодирующую У-область Ь-цепи, выделяют из библиотеки с использованием части С-области или части У-области существующего мышиного антитела в качестве зонда. Определяют полные нуклеотидные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи представляющего интерес мышиного антитела на рекомбинантном фаге или рекомбинантной плазмиде, и из нуклеотидных последовательностей расшифровывают полные аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи.
В качестве животного, иного, чем человек, можно использовать любое животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик или подобное животное, до тех пор, пока в нем можно получить гибридомные клетки.
Примерами способа получения полной РНК из гибридомных клеток являются способ с гуанидинтиоцианатом и трифторацетатом цезия [Μеίйοё8 ίη Епхуто1оду. 154, 3 (1987)] и подобные способы, и примерами способа получения мРНК из полной РНК являются колоночный способ с олиго(ёТ), иммобилизованным на целлюлозе (Μο1еси1а^ С1ошпд, 8есопё Её111оп), и подобные способы. Кроме того, примерами набора для получения мРНК из гибридомных клеток являются набор Рак! Тгаск т^А [5о1а11оп (производимый 1пу1Ггодеп), набор Ошск Ргер т^А РигШсаёоп (производимый Ркагтааа) и подобные наборы.
Примерами способа синтеза кДНК и получения библиотеки кДНК являются обычные способы (Уо1еси1аг С1ошпд, 8есопё ЕёШоп, СиггепГ РгоГосо18 ίη Μο1еси1а^ Вю1оду, 8ирр1етеп1 1-34), способы с использованием коммерчески доступных наборов, таких как ЗирегксёрГ™, Р1акт1ё 8у81ет Гог с^NА 8уп111е818 апё Р1азт1ё С1ошпд (производимые О1ВС0 ВРЬ) или набор ΖАΡ-с^NА 8упГйе818 (производимый 81га!адепе), и подобные наборы.
При получении библиотеки кДНК вектор, в который в качестве матрицы встраивают кДНК, синтезированную с использованием мРНК, экстрагированной из гибридомных клеток, может представлять
- 32 013224 собой любой вектор до тех пор, пока можно встроить кДНК. Примерами являются ΖАΡ Ехргекк [8!га!ед1е8, 5, 58 (1992)], рВ1иексг1р( ΙΙ δΚ(+) |Иис1е1с Ас1бк Векеагсй, 17, 9494 (1989)], λζηρΙΙ (производимый 8!га!адепе), Ьд!10 и Ьд!11 ΙΩΧΆ С1ошпд, А Ρ^асбса1 Арргоасй, Ι, 49 (1985)], лямбда В1иеМ1б (производимый С1оп!есй), А.ЕхСе11, рТ7Т3 18И (производимые Ρйа^тас^а), рсЬ2 [Мо1. Се11. Вю1., 3, 280 (1983), риС18 [Сепе, 33, 103 (1985)] и подобные векторы.
В качестве ЕксйепсЫа соб, в которую вводят библиотеку кДНК, сконструированную из фагового или плазмидного вектора, можно использовать любую ЕксйепсЫа соб до тех пор, пока можно вводить, экспрессировать и поддерживать библиотеку кДНК. Примерами являются ХЬ1-В1ие МВЕ' [8!га!ед1е5, 5, 81 (1992)], С600 [Сепебск, 39, 440 (1954)], Υ1088 и Υ1090 [8аепсе, 222, 778 (1983)], ММ522 [1. Мо1. Вю1., 166, 1 (1983)], К802 [1. Мо1. Вю1., 16, 118 (1966)], ЛМ105 [Сепе, 38, 275 (1985)] и т.п.
В качестве способа отбора из библиотеки кДНК клона кДНК, кодирующей У-области Н-цепи и Ь-цепи антитела, полученного от животного, иного, чем человек, можно использовать гибридизацию колоний или гибридизацию в бляшках с использованием зонда, меченного изотопом или флуоресцентной меткой (Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб Еб1боп). Кодирующую У-области Н-цепи и Ь-цепи кДНК также можно получить, получая праймеры и осуществляя полимеразную цепную реакцию (далее называемую ПЦР, Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб Еб1боп; Сиггеп! Ριπ^^Ε ш Мо1еси1аг Вю1оду, 8ирр1ешеп! 1-34) с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной из мРНК, или библиотеки кДНК.
Нуклеотидные последовательности кДНК можно определить, расщепляя отобранные кДНК соответствущими рестрикционными ферментами, клонируя фрагменты в плазмиду, такую как рВ1ие5спр1 δΚ(-) (производимую 8ба!адепе) или подобную, осуществляя взаимодействие обычно используемого способа анализа нуклеотидных последовательностей, такое как в дидезокси-способе ртос. №б. Асаб. δα. И8А, 74, 5463 (1977)], 8апдег е! а1., или подобное взаимодействие, и затем анализируя клоны с использованием автоматического анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК А.Ь.Е. (производимый Ρйа^тас^а), или подобное устройство. Кодируют или нет полученные кДНК полные аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи антитела, содержащего секреторную сигнальную последовательность, можно подтвердить, расшифровывая полные аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи из определенных нуклеотидных последовательностей и сравнивая их с полными аминокислотными последовательностями У-областей Н-цепей и Ь-цепей известных антител [8едиепсе§ о1 Ρ^оΐе^п8 о1 ЕппшТОодУб бИеге^Е υδ Ьер. Неайй апб 8егу1сек (1991)].
(3) . Анализ аминокислотной последовательности У-области антитела, полученного от животного, иного, чем человек.
Что касается полных аминокислотных последовательностей У-областей Н-цепи и Ь-цепи антитела, содержащего секреторную сигнальную последовательность, то можно установить длину секреторной сигнальной последовательности и ^концевых аминокислотных последовательностей, и также можно найти подгруппы, к которым они принадлежат, сравнивая их с полными аминокислотными последовательностями У-областей Н-цепей и Ь-цепей известных антител [8едиепсе§ о1 Ρ^оΐе^п8 о1 Iттипо1од^са1 бИеге^Е υδ Ьер. Неабй апб Нитап 8егу1сек (1991)]. Кроме того, также можно найти аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи каждого СОВ, сравнивая их с полными аминокислотными последовательностями У-областей Н-цепей и Ь-цепей известных антител Рес.|иепсе5 о1 Ρ^оΐе^п8 о1 Iттипо1од1са1 бИеге^Е υδ Ьер. Неайй апб Нитап δе^ν^се8 (1991)].
(4) . Конструирование вектора для экспрессии человеческих химерных антител.
Вектор для экспрессии человеческих химерных антител можно сконструировать путем клонирования кДНК, кодирующих У-области Н-цепи и Ь-цепи антитела, полученного от животного, иного, чем человек, перед генами, кодирующими С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела, в векторе для экспрессии гуманизированных антител, сконструированном в разделе 3(1). Например, вектор для экспрессии человеческих химерных антител можно сконструировать, соединяя каждую из кДНК, кодирующих У-области Н-цепи и Ь-цепи антитела, полученного от животного, иного, чем человек, с синтетической ДНК, содержащей нуклеотидные последовательности в 3'-концах У-областей Н-цепи и Ь-цепи антитела, полученного от животного, иного, чем человек, и нуклеотидными последовательностями в 5'-концах С-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела, и имеющей также в обоих концах последовательность, узнаваемую соответствующим рестрикционным ферментом, и клонируя их перед генами, кодирующими С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела, содержащимися в сконструированном векторе для экспрессии гуманизированных антител, описанном в разделе 3(1).
(5) . Конструирование кДНК, кодирующей У-область человеческого антитела с привитым СОВ.
кДНК, кодирующие У-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела с привитым СОВ, можно получить следующим образом. Сначала отбирают аминокислотные последовательности каркасных участков (называемых далее ЕВ) У-областей Н-цепи и Ь-цепи антитела, полученного от животного, иного, чем человек. В качестве аминокислотных последовательностей ЕВ У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела можно использовать любые аминокислотные последовательности до тех пор, пока они получены из человеческого антитела. Примерами являются аминокислотные последовательности ЕВ У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческих антител, зарегистрированные в базе данных, такой как ΡιόΚηι
- 33 013224
Ьа1а Ваик, и т.п., аминокислотные последовательности, обычные в каждой подгруппе РЯ У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческих антител [8едиеисек оГ Рго1ешк оГ 1ттиио1одюа1 1и1егек1, И8 Ьер. НеаИй аиб Нитаи 8егу1сек (1991)], и подобные аминокислотные последовательности. Но для того чтобы получить человеческое антитело с привитым СОЯ, обладающее сильной активностью, предпочтительно отобрать аминокислотную последовательность с максимально возможной гомологией (по меньшей мере 60% или большей) с аминокислотными последовательностями У-областей Н-цепи и Ь-цепи антитела, представляющего интерес, полученного от животного, иного, чем человек.
Затем аминокислотные последовательности СОЯ У-областей Н-цепи и Ь-цепи антитела, представляющего интерес, полученного от животного, иного, чем человек, прививают к отобранным аминокислотным последовательностям У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела для создания аминокислотных последовательностей У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела с привитым СОЯ. Созданные аминокислотные последовательности превращают в последовательности ДНК, учитывая частоту применения кодона, обнаруженного в нуклеотидных последовательностях генов антитела [8есщеисек оГ Рго1ешк оГ 1ттипо1ощса1 1и1егек1, И8 Ьер. НеаПЬ аиб Нитаи Зетсек (1991)], и создают последовательности ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела с привитым СОЯ. На основе созданных последовательностей ДНК синтезируют некоторые синтетические фрагменты ДНК длиной примерно в 100 оснований и осуществляют ПЦР с использованием их. В таком случае предпочтительно создавать 6 синтетических ДНК в каждой Н-цепи и Ь-цепи с точки зрения эффективности реакции ПЦР и длин ДНК, которые можно синтезировать.
Также их можно легко клонировать в вектор для экспрессии гуманизированных человеческих антител, сконструированный в разделе 3(1), вводя последовательности для узнавания соответствующей рестриктазой в 5'-концы синтетической ДНК, присутствующие на обоих концах. После ПЦР амплифицированный продукт клонируют в плазмиду, такую как рВ 1иексг1р1 8К(-) (производимую 81га!адеие) или подобную, и определяют нуклеотидные последовательности способом, описанным в разделе 3(2), и посредством этого получают плазмиду с последовательностями ДНК, кодирующими аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи нужного человеческого антитела с привитым СОЯ.
(6) . Конструирование вектора для экспрессии человеческих антител с привитыми СОЯ.
Вектор для экспрессии человеческих антител с привитыми СОЯ можно сконструировать, клонируя кДНК, кодирующие У-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела с привитым СОЯ, сконструированные в разделе 3(5), перед генами, кодирующими С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела в векторе для экспрессии гуманизированных антител, описанном в разделе 3(1). Например, вектор для экспрессии человеческих антител с привитыми СОЯ можно сконструировать, вводя последовательности узнавания соответствующей рестриктазой в 5'-концы обоих концов фрагмента синтетической ДНК из числа фрагментов синтетической ДНК, используемых при осуществлении ПЦР в разделе 3(5) для конструирования У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела с привитым СОЯ, с тем, чтобы клонировать их перед генами, кодирующими С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела в векторе для экспрессии гуманизированных антител, описанном в разделе 3(1), таким образом, что они могут экспрессироваться в подходящей форме.
(7) . Устойчивое продуцирование гуманизированных антител.
Трансформант, способный устойчиво продуцировать человеческие химерные антитела и человеческие антитела с привитыми СОЯ (те и другие далее называются гуманизированными антителами), можно получить, вводя векторы для экспрессии гуманизированных антител, описанные в разделах 3(4) и (6), в соответствующие животные клетки.
Примерами способа введения вектора для экспрессии гуманизированных антител в животную клетку являются электропорация [опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 257891/90, Су1о1есйио1о§у, 3, 133 (1990)] и подобные способы.
В качестве животной клетки, в которую вводят вектор для экспрессии гуманизированных антител, можно использовать любую клетку до тех пор, пока она представляет собой животную клетку, которая может продуцировать гуманизированные антитела.
Примерами являются клетки миеломы мыши, такие как клетка Ν80 и клетка 8Р2/0, клетки яичников китайского хомячка, такие как клетка СНО/бЫг- и клетка СНО/ЭС44, клетки миеломы крысы, такие как клетка ΥΒ2/0 и клетка 1Я983Р, клетки ВНК, полученные из почек сирийского хомячка, клетки миеломы человека, такие как клетка ХатаНга, и подобные клетки, и предпочтительны клетки яичников китайского хомячка СНО/ЭС44, клетки миеломы крысы ΥΒ2/0 и клетки-хозяева настоящего изобретения, описанные в разделе 5.
После введения вектора для экспрессии гуманизированных антител трансформант, способный устойчиво продуцировать гуманизированные антитела, можно отобрать, используя среду для культивирования животных клеток, содержащую такое вещество, как сульфат С418 (называемый далее С418; производится 8ЮМА), и подобные вещества, согласно способу, описанному в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 257891/90. Примерами среды для культивирования животных клеток являются среда ЯРМ1 (производимая Νίκκιιί Рйагтасеибса1), среда 61Т (производимая №йои Рйагтасеибса1), среда ЕХ-СЕЬЬ 302 (производимая 1ЯН), среда 1МОМ (производимая 61ВСО ВЯЬ), среда Н1Ьп
- 34 013224 йота-ЗЕМ (производимая ОГВС0 ВКЕ), среды, полученные добавлением к указанным средам различных добавок, таких как сыворотка плода коровы (называемая далее ЕВЗ), и подобные среды. Гуманизированные антитела можно получать и накапливать в культуральном супернатанте, культивируя полученный трансформант в среде. Уровень экспрессии и антигенсвязывающую активность гуманизированных антител в культуральном супернатанте можно определить таким способом, как твердофазный иммуноферментный анализ [далее называемый ЕЫЗЛ; ЛпйЬой1е8: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬога1огу, СНар1ег 14 (1998), Мопос1опа1 АпйЬойкк: Рппаркк апй Ргасйсе, Асайетк Рге§8 Ытйей (1996)], или подобными способами. Также можно повысить уровень экспрессии гуманизированных антител трансформантом, используя систему амплификации генов ЭНЕЕ согласно способу, описанному в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 257891/90.
Гуманизированные антитела можно очистить от культурального супернатанта с использованием колонки для протеина А [АпйЬойкк: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬогакгу, СНар1ег 14 (1998), Мопос1опа1 АпйЬойкк: Рг1пс1р1ез апй Ргасйсе, Асайетк Рге§8 Ытйей (1996)]. Кроме того, можно также использовать способы очистки, обычно применяемые для очистки белков. Например, очистку можно осуществить, сочетая гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию и ультрафильтрацию. Молекулярную массу Н-цепи, Ь-цепи или молекулы антитела в целом очищенных гуманизированных антител можно измерить, например, методом электрофореза в полиакриламидном геле [называемым далее ЗОЗ-РАОЕ; №1иге, 227, 680 (1970)], методом Вестерн-блоттинга [АпйЬойкк: А ЬаЬогакгу Мапиа1, Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬогакгу, СНар1ег 14 (1998), Мопос1опа1 АпйЬойкк: Рппар1е8 апй Ргасйсе, Асайетк Рге55 Ытйей (1996)], или подобным методом.
Таким образом, описаны способы получения композиции антител с использованием животных клеток в качестве клеток-хозяев, но, как описано выше, композицию антител также можно получить с помощью дрожжевых клеток, клеток насекомых, растительных клеток, отдельного животного или отдельного растения теми же способами, что и в случае животных клеток.
Когда клетка-хозяин обладает от природы способностью экспрессировать молекулы антител, композицию антител настоящего изобретения можно получить с использованием способа, описанного в разделе 1, культивируя клетки, и затем выделяя из полученной культуры в чистом виде композицию антител, представляющих интерес.
4. Оценка активности композиции антител.
В качестве способа измерения количества очищенной композиции антител активности связывания с антителами и эффекторной функции очищенной композиции антител можно использовать известный способ, описанный в Мопос1опа1 АпйЬойкз, АпйЬойу Епдепееппд, и подобные способы.
Например, когда композиция антител является гуманизированными антителами, активность связывания с положительной на антиген культивированной клеточной линией можно измерить способами, такими как ЕМЗА, иммунофлуоресцентный способ [Сапсег Iттиηо1. IттиπоιΗе^.. 36, 373 (1993)], и подобными способами. Цитотоксическую активность против положительной на антиген культивированной клеточной линии можно оценить, измеряя СОС-активность, АЭСС-активность [Сапсег Iттиηо1. IттипоШег., 36, 373 (1993)], и подобными способами.
Также безопасность и лечебное действие композиции антител на человека можно оценить с использованием соответствующего вида животной модели, относительно близкой человеку, такой как Масаса Еа8ски1ап8, или подобного животного.
5. Анализ углеводных цепей, связывающихся с молекулами антител, экспрессированными в различных клетках.
Структуру углеводной цепи, связывающейся с молекулой антитела, экспрессированной в различных клетках, можно проанализировать согласно общему анализу строения углеводных цепей гликопротеинов. Например, углеводная цепь, связанная с молекулой ЦО, содержит нейтральный сахар, такой как галактоза, манноза, фукоза, или подобный, аминосахар, такой как №ацетилглюкозамин, или подобный, и кислый углевод, такой как сиаловая кислота, или подобный, и ее можно проанализировать способом, таким как анализ структуры углеводной цепи, или подобным, с использованием анализа состава углевода, двухмерное картирование углеводной цепи, или подобного способа.
(1). Анализ составов нейтральных сахаров и аминосахаров.
Состав углеводной цепи, связывающейся с молекулой антитела, можно проанализировать, осуществляя кислотный гидролиз углеводных цепей с помощью кислоты, такой как трифторуксусная кислота или подобная, для высвобождения нейтрального сахара или аминосахара и измеряя композиционное соотношение.
Примером является способ с использованием углеводного анализатора (ВкЬС), производимого Окпех. ВкЬС представляет собой прибор, анализирующий состав углеводов методом НРАЕС-РАЭ (высокоэффективная анионообменная хроматография с амперометрической импульсной детекцией) [1. Ыц. СЬготакдг., 6, 1577 (1983)].
Композиционное соотношение также можно анализировать методом с флуоресцентным мечением с использованием 2-аминопиридина. Конкретно, композиционное соотношение можно вычислить согласно известному способу [Адпс. Вю1. СЕет., 55(1), 283-284 (1991)], помечая подвергнутый кислотному
- 35 013224 гидролизу образец флуоресцентной меткой путем 2-аминопиридилирования и затем анализируя состав методом ВЭЖХ.
(2). Анализ структуры углеводной цепи.
Структуру углеводной цепи, связывающейся с молекулой антитела, можно проанализировать методом двухмерного картирования углеводной цепи [Апа1. ВшсНет., 171, 73 (1988), Вюс11е1шса1 ЕхрептепГаПоп Мебюбк 23 - МеЛобк £ог 81ибушд С1усорго1еш 8идаг СЕашк (1арап 8с1еп(1Пс 8ос1е11ек Ргекк) еббеб Ьу Яе1ко ТакабакЫ (1989)]. Способ двухмерного картирования углеводной цепи представляет собой способ расшифровки структуры углеводной цепи, например, откладывая время удерживания или позицию элюирования углеводной цепи при хроматографии с обращенной фазой по оси X и время удерживания или позицию элюирования углеводной цепи при хроматографии с нормальной фазой по оси Υ, соответственно, и сравнивая их с такими же результатами для известных углеводных цепей.
Конкретно, углеводные цепи высвобождают из антител, подвергая антитела гидразинолизу, и подвергают высвобожденные углеводные цепи флуоресцентному мечению 2-аминопиридином (называемым далее РА) [I. ВшсНет., 95, 197 (1984)], и затем углеводные цепи отделяют от избытка реагента для обработки РА гель-фильтрацией и подвергают хроматографии с обращенной фазой.
Затем каждый пик отделенных углеводных цепей подвергают хроматографии с нормальной фазой. Структуру углеводной цепи можно расшифровать, строя графики результатов двухмерного картирования углеводной цепи и сравнивая их с зонами эталона углеводной цепи (производимого Такага 81шхо) или литературными данными [Апа1. ВшсНет., 171, 73 (1988)].
Структуру, расшифрованную способом двухмерного картирования углеводной цепи, можно подтвердить, осуществляя также масс-спектрометрию, например МΑ^^I-ТΟЕ-М8, каждой углеводной цепи, или подобным способом.
6. Способ иммунологического определения для распознавания структуры углеводной цепи молекулы антитела.
Композиция антител содержит молекулы антител, в которых углеводные цепи, связывающиеся с Ес-областью антитела, различаются по структуре. Композиция антител, в которой доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет 20% или более всех сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи, связывающиеся с Ес-областью, в композиции антител, обладает сильной АЭСС-активностью. Композицию антител можно идентифицировать, используя способ анализа структуры углеводной цепи молекулы антител, описанный в разделе 5. Ее также можно идентифицировать способом иммунологического определения с использованием лектина.
Структуру углеводной цепи молекулы антитела можно идентифицировать способом иммунологического определения с использованием лектина согласно известному способу иммунологического определения, такому как окрашивание по Вестерну, 1ЯА (радиоиммуноанализ), У1А (вироиммуноанализ), Е1А (иммуноферментный анализ), Е1А (иммунофлуоресцентный анализ), М1А (металлоиммуноанализ) и т.п., описанным в Мопос1опа1 АпбЬоб1ек: Рппс1р1ек апб Аррбсабопк, Убеу-Шк, 1пс. (1995); Гтшипоаккау, 3гб Еб., ГдакиЕош (1987); Епхуте АпбЬобу МеНоб, Яеу1кеб ЕбШоп, Сакика1 К1каки (1985); и подобным способом.
Помечают лектин, узнающий структуру углеводной цепи молекулы антитела, содержащуюся в композиции антител, и меченый лектин взаимодействует с композицией антител, являющейся образцом. Затем измеряют количество комплекса меченого лектина с молекулами антитела.
Примерами лектина, используемого для идентификации структуры углеводной цепи молекулы антитела, являются УСА (агглютинин зерна пшеницы, полученный из Т. уи1дапк), СопА (конканавалин А, полученный из С. епкбогтщ), Я1С (токсин, полученный из Я. сошшишк), Ь-РНА (лейкоагглютинин, полученный из Р. уи1даг1к), ЬСА (лентилагглютинин, полученный из Ь. сибпапк), Р8А (лектин гороха, полученный из Р. кабуит), ААЬ (лектин А1еипа аигапба), АСЬ (лектин Атагапбшк саибаШк), ВРЬ (лектин ВаиЫша ригригеа), Э8Ь (лектин ЭаШга Затопит), ЭВА (агглютинин ЭобсЕок ЫДогик), ЕВЬ (лектин плодов черной бузины), ЕСЬ (лектин ЕгуИппа спйадаШ), ЕЕЬ (лектин Еиопутик еогораеик), ΟΝΕ (лектин Са1ап1Еик пуаШ), С8Ь (лектин СпДоша ктрбсбоба), НРА (агглютинин НеЕх ротаба), ННЬ (лектин гибрида Нрреакбит), 1аса1ш, ЬТЬ (лектин Ьо1ик 1ебадопо1оЬик), ЬЕЬ (лектин Ьусорегкюоп екси1еηΐиш), МАЬ (лектин МаасИа атигепкхк), МРЬ (лектин Мабига ротбега), ΝΓΕ (лектин ΝηΐΌίκκιικ ркеибопагаккик), РNΑ (агглютинин арахиса), Е-РНА (эритроагглютинин РНакео1ик уи1дапк), РТЬ (лектин РкорЕосагрик 1е1гадопо1оЬик), ЯСА (агглютинин Яюшик сошшишк), 8ТЬ (лектин 8о1апит ГнЬегокит), 81А (агглютинин 8орНога _)арошса), 8ВА (агглютинин сои), ИЕА (агглютинин И1ех еигораеик), УУЪ (лектин УШа уШока) и УЕА (агглютинин УШепа ДопЬипба).
Предпочтительно использовать лектин, специфически узнающий структуру углеводной цепи, где фукоза связывается с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются лектин Ьепк сибпапк ЬСА (лентилагглютинин, полученный из Ьепк сибпапк), лектин гороха Р8А (лектин гороха, полученный из Р1кит кабуит), лектин кормовых бобов УЕА (агглютинин, полученный из УШа £аЬа) и лектин А1еипа аигапба ААЬ (лектин, полученный из А1еипа аигапба).
- 36 013224
7. Применение молекул антител настоящего изобретения.
Композиция антител настоящего изобретения обладает сильной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью. Антитела с сильной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью полезны для предупреждения и лечения различных заболеваний, в том числе раковых заболеваний, воспалительных заболеваний, иммунных болезней, таких как аутоиммунные заболевания, аллергии и т.п., болезней органов системы кровообращения и вирусных и бактериальных инфекций.
В случае злокачественных опухолей наблюдается рост злокачественных клеток. Обычные противоопухолевые средства ингибируют рост злокачественных клеток. Напротив, антитела с сильной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью могут лечить злокачественные опухоли, повреждая злокачественные клетки через свое убивающее действие на клетки, и поэтому являются более эффективными в качестве лечебного средства, чем обычные противоопухолевые средства. В настоящее время в лечебном средстве против злокачественных опухолей действие одного лечебного средства на основе антител является недостаточным, так что осуществляют комбинированную терапию с химиотерапией [8с1епсе, 280, 1197 (1998)]. Если обнаружится более сильное противоопухолевое действие одной композиции антител настоящего изобретения, зависимость от химиотерапии будет снижаться и будет ослабевать побочное действие.
При иммунных болезнях, таких как воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, аллергии и т.п., болезненные реакции ш у1уо индуцируются высвобождением иммуноцитами молекул медиаторов, так что аллергическую реакцию можно ингибировать удалением иммуноцитов с использованием антител с сильной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью.
Примерами заболеваний системы кровообращения являются артериосклероз и подобные заболевания. Артериосклероз в настоящее время лечат с использованием катетера-баллона, но заболевания органов системы кровообращения можно предотвращать и лечить путем ингибирования роста артериальных клеток при перестройке после лечения с использованием антител с сильной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью.
Различные заболевания, в том числе вирусные и бактериальные инфекции, можно предупреждать и лечить, ингибируя пролиферацию клеток, зараженных вирусом или бактериями, с использованием антител с сильной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью.
Примеры антигена, распознающего антиген, связанный с опухолью, антигена, распознающего антиген, связанный с аллергией и воспалением, антигена, распознающего антиген, связанный с заболеванием органов кровообращения, антигена, распознающего антиген, связанный с вирусной или бактериальной инфекцией, приведены ниже.
Примерами антител, узнающих связанный с опухолью антиген, являются антитела против СЭ2 (ΟΗ3 е! а1., АпЕсапсег Кек., 13, 331-336, 1993), антитела против СЭ3 (ΟΙιΙη е! а1., Сапсег Iттиηο1. Ιιηιηιιпо!йег., 36, 260-266, 1993), антитела против СМ2 №1катига е! а1., Сапсег Кек., 54, 1511-1516 (1994), антитела против НЕК-2 (Сайег е! а1., Ргос. №ΐ1. Асай. δα. И8А, 89, 4285-4289, 1992), антитела против СЭ52 (Сайег е! а1., Ргос. №ΐ1. Асай. δα. И8А, 89, 4285-4289, 1992), антитела против МАСЕ (1ипдЬ1и!й е! а1., ВгШкй 1. Сапсег, 83, 493-497, 2000), антитела против НМ1.24 (Юно е! а1., Мо1еси1аг Iттиηο1., 36, 387-395,
1999) , антитела против белка, родственного паратиреоидному гормону (РТНгР) (Юд-Иа е! а1., Сапсег, 88, 2909-2911, 2000), антитела против фактора роста основных фибробластов и антитела против ЕСЕ8 (Ма1кихак| е! а1., Ргос. №111. Асай. δα. И8А, 86, 9911-9915, 1989), антитела против рецептора фактора роста основных фибробластов и антитела против рецептора ЕСЕ8 (Кио е! а1., 1. Вю1. Сйет., 265, 16455-16463, 1990), антитела против инсулиноподобного фактора роста (Уао е! а1., 1. №игока. Кек., 40, 647-659, 1995), антитела против рецептора инсулиноподобного фактора роста (Уао е! а1., 1. №игока. Кек., 40, 647-659, 1995), антитела против РМ8А (Мигрйу е! а1., 1. Иго1оду, 160, 2396-2401, 1998), антитела против фактора роста сосудистых эндотелиальных клеток (Ргек!а е! а1., Сапсег Кек., 57, 4593-4599, 1997), антитела против рецептора фактора роста сосудистых эндотелиальных клеток (Каппо е! а1., Οηсοдеηе, 19, 2138-2146,
2000) и подобные антитела.
Примерами антител, узнающих антиген, связанный с аллергиями или воспалением, являются антитела против интерлейкина 6 (АЬгатк е! а1., Iттиηο1. Кеу., 127, 5-24, 1992), антитела против рецептора интерлейкина 6 (8а!о е! а1., Мо1еси1аг Iттиηο1., 31, 371-381, 1994), антитела против интерлейкина 5 (АЬгатк е! а1., Iттиηο1. Кеу., 127, 5-24, 1992), антитела против рецептора интерлейкина 5 и антитела против интерлейкина 4 (Вюгй е! а1., Су!окте, 3, 562-567, 1991), антитела против фактора некроза опухоли (Тетрек! е! а1., НуЬпйота, 13, 183-190, 1994), антитела против рецептора фактора некроза опухоли (Атгап1 е! а1., Мо1еси1аг Рйагтасо1., 58, 237-245, 2000), антитела против ССК-4 (СатрЬе11 е! а1., №!иге, 400, 776-780, 1999), антитела против хемокинов (Реп е! а1., 1. Iттиηο. Ме!й., 174, 249-257, 1994), антитела против рецепторов хемокинов (Аи е! а1., 1. Ехр. Мей., 186, 1373-1381, 1997) и подобные антитела. Примерами антител, узнающих антиген, связанный с заболеванием органов системы кровообращения, являются антитела против СрПЬ/Ша (Со е! а1., 1. Тттипок, 152, 2968-2976, 1994), антитела против тромбоцитарного фактора роста (Еегпк е! а1., 8аепсе, 253, 1129-1132, 1991), антитела против рецептора тромбоцитарного фактора роста (8йи1тап е! а1., 1. Вю1. Сйет., 272, 17400-17404, 1997), антитела против фак
- 37 013224 тора свертывания крови (Ре!ег е! а1., С1гси1абоп, 101, 1158-1164, 2000) и подобные антитела.
Примерами антител, узнающих антиген, связанный с вирусной или бактериальной инфекцией, являются антитела против др120 (Тидаппоу е! а1., 81гис!иге, 8, 385-395, 2000), антитела против СЭ4 (8Ни1хеКоорк е! а1., I. ВЬеита!о1оду, 25, 2065-2076, 1998), антитела против ССК4 и антитела против веротоксина (КагпаН е! а1., I. С1т. МюгоЬю1., 37, 396-399, 1999) и подобные антитела.
Указанные антитела можно получить от государственных организаций, таких как АТСС (Американская коллекция типовых культур), ВКЕМ Сепе Вапк при Институте физических и химических исследований, Национальный институт биологических наук и технологий человека, Агенство по техническим наукам и технологии (настоящее название Международный депозитарий патентованных микроорганизмов, Национальный институт современных технических наук и технологий) и подобных организаций, или частных компаний, торгующих реагентами, таких как Эапирроп РЬагтасеибса1, В & Ό 8У8ТЕМ8, РЬагМтдеп, Сокто Вю, ЕипакокЫ и подобных.
Лекарственный препарат, содержащий композицию антител настоящего изобретения, можно вводить как отдельный лекарственный препарат, но, как правило, предпочтительно предоставлять ее в виде фармацевтической композиции, полученной соответствующим способом, хорошо известным в области фармации, смешивая ее по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем.
Желательно выбирать способ введения, наиболее эффективный при лечении. Примерами являются пероральное введение и парентеральное введение, такое как буккальное, трахеальное, ректальное, подкожное, внутримышечное, внутривенное или подобное. Для препарата антител предпочтительно внутривенное введение.
Лекарственными формами являются спреи, капсулы, таблетки, гранулы, сиропы, эмульсии, суппозитории, инъекции, мази, пластыри и т.п.
Примерами фармацевтического препарата, подходящего для перорального введения, являются эмульсии, сиропы, капсулы, таблетки, порошки, гранулы и т.п.
Жидкие препараты, такие как эмульсии и сиропы, можно получить с использованием в качестве добавок воды; сахаридов, таких как сахароза, сорбит, фруктоза и т.п.; гликолей, таких как полиэтиленгликоль, пропиленгликоль и т.п.; масел, таких как сезамовое масло, оливковое масло, соевое масло и т.п.; антисептиков, таких как эфиры п-оксибензойной кислоты и т.п.; отдушек, таких как земляничная отдушка, перечная мята и т.п.; и подобных добавок.
Капсулы, таблетки, порошки, гранулы и т.п. можно получить с использованием в качестве добавок наполнителей, таких как лактоза, глюкоза, сахароза, маннит и т.п.; веществ, способствующих рассыпанию, таких как крахмал, альгинат натрия и т.п.; смазывающих веществ, таких как стеарат магния, тальк и т.п.; связующих веществ, таких как поливиниловый спирт, гидроксипропилцеллюллоза, желатин и т.п.; поверхностно-активных веществ, таких как эфиры жирных кислот и т.п.; пластификаторов, таких как глицерин и т. п.; и подобных веществ.
Примерами фармацевтического препарата, подходящего для парентерального введения, являются инъекции, суппозитории, спреи и т. п.
Инъекции можно получить с использованием носителя, такого как солевой раствор, раствор глюкозы, смесь того и другого или подобного раствора. Также можно получить инъекции в виде порошка лиофилизацией композиции антител обычным способом, и затем добавляя к порошку хлорид натрия.
Суппозитории можно получить с использованием носителя, такого как масло какао, гидрогенизированный жир, карбоновая кислота, или подобного носителя.
Также можно получить спреи с использованием композиции антител как таковой или с использованием носителя, который не раздражает слизистые оболочки щеки или дыхательных путей пациента и может облегчить поглощение композиции антител за счет диспергирования ее на мелкие частицы.
Примерами носителя являются лактоза, глицерин и т.п. В зависимости от свойств композиции антител и носителя возможно получение таких фармацевтических препаратов, как аэрозоли, сухие порошки и т.п. Кроме того, в парентеральные препараты также можно добавлять компоненты, указанные в качестве примеров добавок для пероральных препаратов.
Хотя лечебная доза или частота введения изменяются в зависимости от объективного лечебного действия, способа введения, периода лечения, возраста, массы тела и подобных факторов, как правило, она составляет от 10 до 20 мкг/кг в сутки для взрослого человека.
Также в качестве способа проверки противоопухолевого действия композиции антител против различных опухолевых клеток испытания ш У1!го включают способ измерения СЭС-активности, способ измерения АЭСС-активности и т.п., и испытания ш у1уо включают эксперименты на противоопухолевое действие с использованием системы опухолей в подопытном животном, таком как мышь и т.п., и подобные способы.
Измерения СЭС-активности и АЭСС-активности и эксперименты на противоопухолевое действие можно осуществлять согласно способам, описанным в Сапсег [ттипо1оду IттиηοΐЬе^ару, 36, 373, (1993); Сапсег ВекеагсЬ, 54, 1511, (1994), и подобными способами.
Настоящее изобретение ниже будет описано подробнее на основе примеров, однако примеры являются только простым пояснением и не ограничивают объем настоящего изобретения.
- 38 013224
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает картины электрофореза ЗЭЗ-РАСЕ пяти очищенных химерных антител против СЭ3 (с использованием градиентного геля от 4 до 15%). Фиг. 1А и 1В показывают результаты электрофореза в условиях невосстановления и условиях восстановления соответственно. Полосы 1-7 показывают картины электрофореза высокомолекулярных маркеров, химерных антител УВ2/0-СЭ3, химерных антител СН0/ЭС44-СП3, химерных антител ЗР2/0-СО3, химерных антител Х30-СЭ3 (302), химерных антител Х30-СЭ3 (ШТ) и низкомолекулярных маркеров соответственно.
Фиг. 2 - активности связывания с СЭ3 пяти очищенных химерных антител против СЭ3, измеренные с изменением концентрации антител. Ордината и абсцисса показывают активность связывания с ШЭЗ и концентрацию антител соответственно, о , · , и , и Δ показывают активности химерных антител УВ2/0-СЭ3, химерных антител СН0/ЭС4 4-СЭ3, химерных антител ЗР2/0-СО3, химерных антител Х30-СЭ3 (302) и химерных антител Х30-СЭ3 (СГТ) соответственно.
Фиг. 3 - АЭСС-активности пяти очищенных химерных антител против СЭ3 в отношении клеточной линии меланомы человека С-361. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, цитотоксическую активность и концентрацию антител, о , · , и . и Δ показывают активность химерных антител УВ2/0-СЭ3, химерных антител СН0/ПС44-СЭ3, химерных антител ЗР2/0-СО3, химерных антител Х30-СЭ3 (302) и химерных антител Х30-СЭ3 (ШТ) соответственно.
Фиг. 4 - картины электрофореза ЗЭЗ-РАСЕ трех очищенных антител с привитыми СОВ против ЫЬ5Βα (с использованием градиентного геля от 4 до 15%). Фиг. 4А и 4В показывают результаты электрофореза в условиях невосстановления и условиях восстановления соответственно. Полосы 1-5 показывают картины электрофореза высокомолекулярных маркеров, антител с СОВ УВ2/0-ЫЬ-5В, антител с СОВ СН0/б-ЫЬ-5В, антител с СОВ ХЗ0-ЫЕ-5В и низкомолекулярных маркеров соответственно.
Фиг. 5 - активности связывания с трех очищенных антител с привитыми СОВ против ЫЬ5Βα, измеренные с изменением концентрации антител. Ордината и абсцисса показывают активность связывания с ЫЬ-5Ва и концентрацию антител соответственно, θ, · и показывают активности антител с СОВ УВ2/0-ЫЬ-5В, антител с СОВ СН0/б-ЫЬ-5В и антител с СОВ ХЗ0-ЫЕ-5В соответственно.
Фиг. 6 - АЭСС-активности трех очищенных антител с привитыми СОВ против ЫЬ-5В« в отношении мышиной Т-клеточной линии СТЬЬ-2(й5В), экспрессирующей ЫЬ-5В. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, цитотоксическую активность и концентрацию антител, о , и и показывают активность антител с СОВ УВ2/0-ЫЬ-5В, антител с СОВ СН0/б-ЫЬ-5В и антител с СОВ N30-11^5В соответственно.
Фиг. 7 - ингибирование активностей трех очищенных антител с привитыми СОВ против ЫЬ-5В« на модели вызванного ЫЬ-5 повышения концентрации эозинофилов у Масаса Га8е1си1ап8. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, число эозинофилов в периферической крови и число дней (день начала введения антител и ЫЬ-5 принимают за день 0). 101 и 102, 301, 302 и 303, 401, 402 и 403 и 501, 502 и 503 показывают результаты в группе, которой антитела не вводили, в группе, которой вводили антитела с СОВ УВ2/0-ЫЬ-5В, в группе, которой вводили антитела с СОВ СН0/б-ЫЬ-5В, и в группе, которой вводили антитела с СОВ №0-ЫЬ-5В, соответственно.
Фиг. 8 - картины элюирования при ВЭЖХ с обращенной фазой РА-обработанной углеводной цепи (слева) и картины элюирования, полученные при обработке РА-обработанной углеводной цепи α-Ьфукозидазой и последующем анализе методом ВЭЖХ с обращенной фазой (справа), очищенных антител с привитыми СЭВ против ЫЬ-5В«, продуцированных УВ2/0 (фиг. 8А), и очищенных антител с привитыми СЭВ против ЫЬ-5В«, продуцированных N30 (фиг. 8В). Ординаты и абсциссы показывают, соответственно, относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования.
Фиг. 9 - картину элюирования, полученную при обработке РА-обработанной углеводной цепи из очищенных антител с привитыми СЭВ против ЫЬ-5В«, продуцированных клеточной линией СН0/б, и анализа ее ВЭЖХ с обращенной фазой. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования.
На фиг. 10 фиг. 10А показывает активности связывания с СЭ3 неадсорбированной фракции и части адсорбированной фракции, измеренные при изменении концентрации антител. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, активность связывания с ШЭЗ и концентрацию антител. · и о/Л показывают неадсорбированную фракцию и часть адсорбированной фракции соответственно. Фиг. 10В показывает АЭСС-активность неадсорбированной фракции и части адсорбированной фракции в отношении линии меланомы человека С-361. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, цитотоксическую активность и концентрацию антител. · и о показывают неадсорбированную фракцию и часть адсорбированной фракции соответственно.
Фиг. 11 показывает картины элюирования, полученные при анализе методом ВЭЖХ с обращенной фазой РА-обработанных углеводных цепей из неадсорбированной фракции и части адсорбированной фракции. Фиг. 11А и 11В показывают картину элюирования неадсорбированной фракции и картину элюирования части адсорбированной фракции соответственно. Ординаты и абсциссы показывают, соот- 39 013224 ветственно, относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования.
Фиг. 12 - картины элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из 6 химерных антител против СЭ3 (фиг. 12А-12Р), полученные при их анализе методом ВЭЖХ с обращенной фазой. Ординаты и абсциссы показывают, соответственно, относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования.
Фиг. 13 - активность связывания с СЭ3 6 химерных антител против СЭ3 с различным содержанием углеводных цепей без α-1,6-фукозы, измеренную при изменении концентрации антител. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, активность связывания с СЮЗ и концентрацию антител.
Δ, д и χ показывают активность химерных антител против СЭЗ (50%), химерных антител против СЭ3 (45%), химерных антител против СЭ3 (29%), химерных антител против СЭ3 (24%), химерных антител против СЭ3 (13%) и химерных антител против СЭ3 (7%) соответственно.
Фиг. 14 - АЭСС-активность шести видов химерных антител против СЭ3 с различным содержанием углеводных цепей без α-1,6-фукозы против клеточной линии меланомы человека С-361 с использованием эффекторных клеток донора А. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, цитотоксическую активность и концентрацию антител. ·, и, ·, Δ , * и X показывают активность химерных антител против СЭ3 (50%), химерных антител против СЭ3 (45%), химерных антител против СЭ3 (29%), химерных антител против СЭ3 (24%), химерных антител против СЭ3 (13%) и химерных антител против СЭ3 (7%) соответственно.
Фиг. 15 - АЭСС-активность шести видов химерных антител против СЭ3 с различным содержанием углеводных цепей без α-1,6-фукозы против клеточной линии меланомы человека С-361 с использованием эффекторных клеток донора В. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, цитотоксическую активность и концентрацию антител. ·, и, , Δ , А и X показывают активность химерных антител против СЭ3 (50%), химерных антител против СЭ3 (45%), химерных антител против СЭ3 (29%), химерных антител против СЭ3 (24%), химерных антител против СЭ3 (13%) и химерных антител против СЭ3 (7%) соответственно.
Фиг. 16 - картины элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из шести видов химерных антител против СЭ3, полученные при анализе их ВЭЖХ с обращенной фазой. Ординаты и абсциссы показывают, соответственно, относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования.
Фиг. 17 - активности связывания с ССК4 шести видов химерных антител против ССК4 с различным содержанием углеводных цепей без α-1,6-фукозы, измеренные при изменении концентрации антител. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, активность связывания с ССК4 и концентрацию антител. , и , Λ , Δ , · и о показывают активности химерных антител против ССК4 (46%), химерных антител против ССК4 (39%), химерных антител против ССК4 (27%), химерных антител против ССК4 (18%), химерных антител против ССК4 (9%) и химерных антител против ССК4 (8%) соответственно.
Фиг. 18 - АЭСС-активности химерных антител против ССК4 с различным содержанием углеводных цепей без α-1,6-фукозы против клеток ССК4/ЕБ-4 с использованием эффекторных клеток донора А. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, цитотоксическую активность и концентрацию антител.
, ·—ι , А . α , · и о показывают активности химерных антител против ССК4 (46%), химерных антител против ССК4 (39%), химерных антител против ССК4 (27%), химерных антител против ССК4 (18%), химерных антител против ССК4 (9%) и химерных антител против ССК4 (8%) соответственно. Также фиг. 18А и 18В показывают результаты, полученные с использованием эффекторных клеток донора А и донора В, соответственно.
Фиг. 19 - АЭСС-активности химерных антител против ССК4 с различным содержанием углеводных цепей без α-1,6-фукозы против клеток ССК4/ЕБ-4 с использованием эффекторных клеток донора В. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, цитотоксическую активность и концентрацию антител.
О д д и о показывают активности химерных антител против ССК4 (46%), химерных антител против ССК4 (39%), химерных антител против ССК4 (27%), химерных антител против ССК4 (18%), химерных антител против ССК4 (9%) и химерных антител против ССК4 (8%) соответственно.
Фиг. 20 - конструирование плазмид СНРТ8-рСК2.1 и УВРТ8-рСК2.1.
Фиг. 21 - конструирование плазмид СНАс-рВ8 и УВАс-рВ8.
Фиг. 22 - конструирование плазмид СНРТ8б-рСК2.1 и УВРТ8б-рСК2.1.
Фиг. 23 - конструирование плазмид СНАсб-рВ8 и УВАсб-рВ8.
Фиг. 24 - результаты определения продукта транскрипции РИТ8 в каждой линии клеток-хозяев с использованием конкурентной КТ-РСК. Показано количество продукта транскрипции РИТ8 в каждой линии клеток-хозяев, когда в качестве эталона и внутреннего стандарта используют последовательность крысиной РиТ8. и показывают результаты, когда в качестве клеток-хозяев используют клеточную линию СНО и клеточную линию УВ2/0 соответственно.
Фиг. 25 - конструирование плазмиды т£ЕИТ8-рСК2.1.
- 40 013224
Фиг. 26 - конструирование плазмиды рВ8т£ЕИТ8.
Фиг. 27 - конструирование плазмиды рАСЕт£ЕИТ8.
Фиг. 28 - результаты анализа, с использованием конкурентной КТ-РСК, уровней экспрессии гена РИТ8 клеточной линией, сверхэкспрессирующей ген. Ордината показывает величины отношения количеств продукта транскрипции РИТ8 к количествам продукта транскрипции β-актина.
Фиг. 29 - АЭСС-активности химерных антител против СЭ3, выделенных в чистом виде из клеточной линии, сверэкспрессирующей ген РИТ8, против клеточной линии меланомы человека С-361. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, цитотоксическую активность и концентрацию антител.
Фиг. 30 - картины элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из антител, продуцированных клеточными линиями с введенными т£ЕИТ8-6 и рАСЕ249, полученные их анализом ВЭЖХ с обращенной фазой. Фиг. 30А и 30В показывают картины элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из антител, продуцированных клеточной линией с введенной т£ЕИТ8-6, и РА-обработанных углеводных цепей, полученных из антител, продуцированных клеточной линией с введенной рАСЕ249, соответственно. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, относительную интенсивность флуоресценции и концентрацию антител.
Фиг. 31 - картину элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из герцептина, полученную их анализом ВЭЖХ с обращенной фазой. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, относительную интенсивность флуоресценции и концентрацию антител.
Фиг. 32 - конструирование плазмиды СН£ЕИТ8-рСК2.1.
Фиг. 33 - конструирование плазмиды р1охРРиго.
Фиг. 34 - конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-1.
Фиг. 35 - конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-2.
Фиг. 36 - конструирование плазмиды р5сРИТ8дЕ2-3.
Фиг. 37 - конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-3.
Фиг. 38 - конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-4.
Фиг. 39 - конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-5.
Фиг. 40 - конструирование плазмиды рК0РИТ8Риго.
Фиг. 41 - результаты геномных анализов по Саузерну 151. АРиТ8 2-46-1 и 151.АРиТ8 2-46 как клеточных линий СНО, разрушенных α-1,6-фукозилтрансферазой.
Фиг. 42 - АЭСС-активности химерных антител против ССК4, выделенных в чистом виде из клеточной линии, разорванной аллельным геном РИТ8. Ордината и абсцисса показывают цитотоксическую активность и концентрацию антител. А и показывают активность очищенных антител, полученных из клеток СНО 5-03, продуцирующих химерные антитела против ССК4, и очищенных антител, полученных из 151.ДРИТ8 2-46-1, соответственно.
Фиг. 43 - АЭСС-активности человеческих химерных антител против ССК4, продуцированных невосприимчивыми к лектину клеточными линиями. Ордината и абсцисса показывают цитотоксическую активность и концентрацию антител, и , , ▼ и А показывают активность антител, продуцированных штаммом 5-03, СН0/ССК4-ЬСА, СН0/ССК4-ААБ и СН0/ССК4-РНА, соответственно.
Фиг. 44 - АЭСС-активности человеческих химерных антител против ССК4, продуцированных невосприимчивыми к лектину клеточными линиями. Ордината и абсцисса показывают цитотоксическую активность и концентрацию антител, и , Δ и · показывают активность антител, продуцированных УВ2/0 (КМ2760 # 58-35-16), 5-03 и СН0/ССК4-ЬСА, соответственно.
Фиг. 45 - картины элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из очищенных человеческих химерных антител против ССК4, полученные анализом ВЭЖХ с обращенной фазой. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования. Фиг. 45А, 45В, 45С и 45Ό показывают результаты анализов антител, продуцированных штаммом 5-03, антител, продуцированных СН0/ССК4-БСА, антител, продуцированных СН0/ССК4ААЬ, и антител, продуцированных СН0/ССК4-РНА, соответственно.
Фиг. 46 - 1-ю стадию
СНО (всего 6 стадий).
Фиг. 47 - 2-ю стадию
СНО (всего 6 стадий).
Фиг. 48 - 3-ю стадию
СНО (всего 6 стадий).
Фиг. 49 - 4-ю стадию
СНО (всего 6 стадий).
Фиг. 50 - 5-ю стадию
СНО (всего 6 стадий).
Фиг. 51 - 6-ю стадию
СНО (всего 6 стадий).
Фиг. 52 - невосприимчивость СН0/ССК4-БСА с экспрессированной СМЭ в отношении лектина конструирования экспрессирующего конструирования экспрессирующего конструирования экспрессирующего конструирования экспрессирующего конструирования экспрессирующего конструирования экспрессирующего вектора вектора вектора вектора вектора вектора
СМИ,
СМИ,
СМИ,
СМИ,
СМИ,
СМИ, полученного полученного полученного полученного полученного полученного из из из из из из клеток клеток клеток клеток клеток клеток
- 41 013224
ЬСА. Измерения осуществляют дважды, принимая уровень выживаемости группы клеток, культивированных без добавления лектина ЬСА, за 100%. На чертеже 249 показывает уровень выживаемости СНО/ССВ4-ЬСА, введенных экспрессирующим вектором рАСЕ249, в отношении лектина ЬСА. СМБ показывают невосприимчивость СНО/ССВ4-БСА, введенных экспрессирующим вектором для СМБ рАСЕ249, в отношении лектина ЬСА.
Фиг. 53 - АБСС-активности химерных антител против ССВ4, продуцированных клетками экспрессированных СМБ клеточных линий СНО/ССВ4-БСА с экспрессированной СМБ. Ордината и абсцисса показывают цитотоксическую активность и концентрацию антител.
Фиг. 54 - стадию получения плазмиды СНО-СМБ, на которой 5'-конец клона 34-2 вводят в 5'-конец клона 22-8 кДНК СМБ, полученного из клеток СНО.
Фиг. 55 - картину элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из человеческих химерных антител против ССВ4, выделенных в чистом виде СНО/ССВ4-БСА с экспрессированным геном СМБ, полученную их анализом ВЭЖХ с обращенной фазой. Ордината и абсцисса показывают, соответственно, относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования.
Пример 1. Получение человеческих химерных антител против ганглиозида СБ3.
1. Конструирование тандемного экспрессирующего вектора рС1иЬНСМ4 для человеческих химерных антител против ганглиозида СБ3.
Конструируют плазмиду рСЫ641ЬСМ40, лигируя фрагмент примерно в 4,03 т.п.о., содержащий кДНК Ь-цепи, полученный расщеплением экспрессирующего вектора для Ь-цепи рСЫ641ЬСМ4 [I. Иптшю1. Меΐйοά8, 167, 271 (1994)] для человеческого химерного антитела против СБ3 (называемого далее химерное антитело против СБ3) рестриктазами М1и[ (производимой Такага 81ιιιζο) и 8аП (производимой Такага 8Ηυζο), с фрагментом примерно в 3,40 т.п.о., содержащим ген невосприимчивости к С418 и сплайсинг-сигнал, полученный расщеплением экспрессирующего вектора рАСЕ107 [Суΐοΐесйπο1οду, 3, 133, (1990)] для животной клетки, рестриктазами М1и[ (производимой Такага 81ιιιζο) и 8аИ (производимой Такага 8Ηυζο), с использованием набора БНА Ьща1юп (производимого Такага 8Ηυζο), и затем трансформируя Е. сο1^ НВ101 ^ο^υ^ С^пш^, 8есοηά Ебйюп) лигированным продуктом.
Затем фрагмент примерно в 5,68 т.п.о., содержащий кДНК Ь-цепи, полученный расщеплением сконструированной плазмиды рСЫ641ЬСМ40 рестриктазой СЫ (производимой Такага 8Ηυζο), затуплением его концов с использованием набора БНА В1ипбпд (производимого Такага 81ιιιζο) и последующим его расщеплением МЫ (производимой Такага 8Ηυζο), лигируют с фрагментом примерно в 8,40 т.п.о., содержащим кДНК Н-цепи, полученным расщеплением экспрессирующего вектора для Н-цепи химерного антитела против СБ3 рСЫ641НСМ4 [I. Iттиηο1. Меΐйοά8, 167, 271 (1994)] рестриктазой Х1ю! (производимой Такага 8Ηυζο), затуплением его концов с использованием набора БХА В1ипйпд (производимого Такага 81ιιιζο) и последующим его расщеплением МЫ (производимой Такага 8Ηυζο), с использованием набора БНА Ьща1юп (производимого Такага 8Ηυζο), и затем трансформируют Е. сο1^ НВ101 (Мексики С^пш^, 8есοηά Еббюп) лигированным продуктом, и посредством этого получают тандемный экспрессирующий вектор рСЫ641ЬНСМ4 для человеческих химерных антител против ганглиозида СБ3.
2. Получение клеток, устойчиво продуцирующих химерные антитела против СБ3.
Клетки, способные устойчиво продуцировать химерные антитела против СБ3, получают так, как описано ниже, с использованием тандемного экспрессирующего вектора рСЫ641ЬНСМ4 для химерных антител против ганглиозида СБ3, сконструированного в разделе 1 примера 1.
(1). Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток миеломы крысы УВ2/0.
После введение 5 мкг экспрессирующего вектора рСЫ641ЬНСМ4 для химерных антител против ганглиозида СБ3 в 4х106 клеток миеломы крысы УВ2/0 [АТСС СВЬ-1662, IV. КПтапп е( а1., I. Се11. ВЫ., 93, 576-582 (1982)] электропорацией [СуΐοΐесЫο1οду, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 40 мл ΚΡМI1640-РΒ8(10) (среда ВΡМI1640, содержащая 10% РВ8 (производится ЫВСО ВВЬ)) и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого 8ит^ΐοтο Ваке1йе) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 добавляют С418 до концентрации 0,5 мг/мл с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых образуются колонии трансформантов, показывающих невосприимчивость к С418, и отмечается рост колоний, извлекают культуральный супернатант, и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против СБ3 методом ЕЫ8А, описанным в разделе 3 примера 1.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против СБ3, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ЛНРВ, каждый из них суспендируют в среде ΚΡМI1640-РΒ8(10), содержащей 0,5 мг/мл С418 и 50 нМ ингибитора ЛНРВ метотрексата (называемого далее МТХ; производит 8ЮМА), и получают плотность 1-2х105 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого Сгетег) по 2 мл на лунку. Трансформанты, показывающие невосприимчивость к 50 нМ МТХ, подвергают культивированию при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2. В культуральных супернатантах в лунках, в которых отмечают рост трансформантов, измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против СБ3 методом ЕЫ8А, опи
- 42 013224 санным в разделе 3 примера 1. Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против СЭ3, то повышают концентрацию МТХ до 100 и затем до 200 нМ, и, наконец, тем же способом, какой описан выше, получают трансформанты, способные расти в среде РРМП640-ЕВЗ(10), содержащей 0,5 мг/мл С418 и 200 нМ МТХ, и продуцировать химерные антитела против СЭ3 в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают подходящие клеточные линии и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена а-1,6-фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
Полученный клон 7-9-51 трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против СЭ3, депонирован 5 апреля 1999 г. как ЕЕРМ ВР-6691 в №Гюиа1 ЬкГйиГе о! Вюкаеисе аий Нитаи Тесйио1оду, Адеису о! Iηйик^ι^а1 Заеисе аий Тесйио1оду (Н1дакй1 1-1-3, ТкикиЬа, ШагакЕ 1араи (настоящее название Иетайиа! РаГеиГ 0гдаткт Оероккагу, №Гюиа1 ШкйГиГе о! Айуаисей Нгйикг^П Заеисе аий Тесйио1оду (АКТ ТкикиЬа СеиГга1 6, 1-1, Н1дакй1 1-Сйоте ТкикиЬа-кЫ, ЛагакЕкеи, .Гараи)).
(2) . Получение клеток, продуцирующих антитела, с использованием клеток СН0/ЭС44.
После введение 4 мкг экспрессирующего вектора рСЫ641ЬНСМ4 для химерных антител против СЭ3 в 1,6х106 клеток СН0ГОС44 [С. иг1аиЬ аий Ь.А. Сйакш, Ргос. №11. Асай. За., 77, 4216-4220 (1980)] электропорацией [СуГоГесйио1оду, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 10 мл НИЭМ-ЕВЗ (10) [среда [МЭМ, содержащая 10% ЕВЗ и добавку НТ в концентрации 1х(производится СШС0 ВРЬ)] и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого Гетак1 С1акк) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 добавляют С418 для получения концентрации 0,5 мг/мл с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых образуются колонии трансформантов, показывающих невосприимчивость к С418, и отмечается рост колоний, извлекают культуральный супернатант и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против СЭ3 методом ЕЫЗА, описанным в разделе 3 примера 1.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против СЭ3, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ЭНЕР, каждый из них суспендируют в среде IМ^М-йЕΒЗ(10) [среда IМ^М, содержащая 10% диализованной сыворотки плода коровы (называемой далее йЕВЗ; производится СШС0 ВРЬ)], содержащей 0,5 мг/мл С418 и 10 нМ МТХ, и получают плотность 1-2х105 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого !етак1 С1акк) по 0,5 мл на лунку. Трансформанты, показывающие невосприимчивость к 10 нМ МТХ, подвергают культивированию при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2. Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают их рост, то повышают концентрацию МТХ до 100 нМ, и, наконец, тем же способом, какой описан выше, получают трансформанты, способные расти в среде IМ^М-йЕΒЗ (10), содержащей 0,5 мг/мл С418 и 100 нМ МТХ, и продуцировать химерные антитела против СЭ3 в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают подходящие клеточные линии и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена α-1,6фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
(3) . Получение клеток, продуцирующих антитела, с использованием клеток миеломы мыши №0.
После введения 5 мкг экспрессирующего вектора рСЫ641ЬНСМ4 для химерных антител против СЭ3 в 4х106 клеток миеломы мыши №0 электропорацией [СуГоГесйио1оду, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 40 мл среды ЕХ-СЕЬЬ302-ЕВЗ(10) (среда ЕХ-СЕЬЬ302, содержащая 10% ЕВЗ и 2 мМ Ьглутамина [далее называемого Ь-С1и; производится СШС0 ВРЬ]) и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого ЗитПото ВакейГе) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 добавляют С418 для получения концентрации 0,5 мг/мл с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых образуются колонии трансформантов, показывающих невосприимчивость к С418, и отмечается рост колоний, извлекают культуральный супернатант и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против СЭ3 методом ЕЫЗА, описанным в разделе 3 примера 1.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против СЭ3, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ЭНЕР, каждый из них суспендируют в среде ЕХ-СЕЕЬ302-йЕВЗ(10) (среда ЕХ-СЕЕБ302, содержащая 10% йЕВЗ и 2 мМ Ь-С1и), содержащей 0,5 мг/мл С418 и 50 нМ МТХ, и получают плотность 1-2х105 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого Сгешег) по 2 мл на лунку. Трансформанты, показывающие невосприимчивость к 50 нМ МТХ, подвергают культивированию при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2. В культуральных супернатантах в лунках, в которых отмечают рост трансформан
- 43 013224 тов, измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против СЭ3 методом ЕЬГ8А, описанным в разделе 3 примера 1. Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против ОЭ3, то повышают концентрацию МТХ до 100 и затем до 200 нМ, и, наконец, тем же способом, какой описан выше, получают трансформанты, способные расти в среде ЕХ-СЕЬЬ302-бЕВ8(10), содержащей 0,5 мг/мл О418 и 200 нМ МТХ, и продуцировать химерные антитела против ОЭ3 в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают элитные клеточные линии, и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена а-1,6-фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
3. Измерение активности связывания антител с ОЭ3 (ЕЫ8А).
Активность связывания антител с ОЭ3 измеряют так, как описано ниже.
В 2 мл этанольного раствора, содержащего 10 мкг дипальмитоилфосфатидилхолина (производимого 8ГОМА) и 5 мкг холестерина (производимого 8ГОМА), растворяют 4 нмоль СЭ3. В каждую лунку 96-луночного планшета для ЕЬГ8А (производимого Огетег) распределяют 20 мкл раствора (в конечной концентрации 40 пмоль/лунку) с последующей сушкой на воздухе, добавляют 100 мкл/лунку РВ8, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (называемого далее В8А, производит 8ГОМА) (такая смесь далее называется 1% В8А-РВ8), и затем осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 ч для блокирования оставшихся активных групп. После удаления 1% В8А-РВ8 культуральный супернатант трасформанта или разведенный раствор человеческих химерных антител распределяют по 50 мкл/лунку и осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 ч. После реакции каждую лунку промывают РВ8, содержащим 0,05% твина 20 (производимого \Уако Риге СНеписа1 1пбик1г1ек) (такая смесь далее называется твин-РВ8), добавляют в качестве раствора второго антитела 50 мкл/лунку раствора меченных пероксидазой козьих антител против человеческого ДО (Н&Ь) (производимого Атепсап Отбех), разведенного в 3000 раз 1% В8А-РВ8, и затем осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 ч. После реакции и последующей промывки твин-РВ8 добавляют 50 мкл/лунку раствора субстрата АВТ8 [раствор, полученный растворением 0,55 г аммониевой соли 2,2'-азино-бис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) в 1 л 0,1 М цитратного буфера (рН 4,2) и добавлением к раствору перед применением 1 мкл/мл пероксида водорода (далее используют такой же раствор)] для проявления окраски, и затем измеряют поглощение при 415 нм (далее называется ΟΌ415).
4. Очистка химерных антител против ОЭ3.
(1) . Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток Υβ2/0, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против ОЭ3, полученный в разделе 2(1) примера 1, суспендируют в среде НуЬпбота-8ЕМ, содержащей 0,2% В8А, 200 нМ МТХ и 100 нМ трииодтиронина (называемого далее Т3; производит 8ГОМА), получают плотность клеток 3х105 клеток/мл и клетки культивируют с использованием бутыли емкостью 2,0 л, содержимое которой перемешивается при вращении (производимой Гетак1 О1акк), при перемешивании со скоростью 50 об/мин. После культивирования при 37°С в течение 10 суток в камере с регулируемой температурой извлекают культуральный супернатант. Химерные антитела против ОЭ3 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки с Ргокер-А (производимой Вюргосекктд) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против ОЭ3 называют химерными антителами ΥВ2/0-О^3.
(2) . Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток СНО/ЭО44, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против ОЭ3, полученный в разделе 2(2) примера 1, суспендируют в среде ЕХ-СЕЬЬ302, содержащей 3 мМ Ь-О1п, 0,5% концентрированного раствора жирной кислоты (называемого далее СЭЬС; производит О1ВСО ВЕЬ) и 0,3% плюроника Е68 (называемого далее РЕ68; производит О1ВСО ВЕЬ), получают плотность клеток 1 х 106 клеток/мл и суспензию распределяют по 50 мл на 175-мм2 матрасы (производимые Огетег). После культивирования при 37°С в течение 4 суток в инкубаторе с 5% СО2 извлекают культуральный супернатант. Химерные антитела против ОЭ3 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки с Ргокер-А (производимой Вюргосекыпд) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против ОЭ3 называют химерными антителами СНО/ЭО44-ОЭ3.
(3) . Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток N80, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против ОЭ3, полученный в разделе 2(3) примера 1, суспендируют в среде ЕХ-СЕЬЬ302, содержащей 2 мМ Ь-О1п, 0,5 мг/мл О418, 200 нМ МТХ и 1% ЕВ8, получают плотность клеток 1х106 клеток/мл и суспензию распределяют по 200 мл на 175-мм2 матрасы (производимые Огетег). После культивирования при 37°С в течение 4 суток в
- 44 013224 инкубаторе с 5% СО2 извлекают культуральный супернатант. Химерные антитела против СЭ3 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки с Ргойер-А (производимой Вюргосеййтд) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против СЭ3 называют химерными антителами N80-603 (302).
Также клон трансформированных клеток суспендируют в среде ΟΙΈ содержащей 0,5 мг/мл С418 и 200 нМ МТХ, получают плотность клеток 3х105 клеток/мл и суспензию распределяют по 200 мл на 175-мм2 матрасы (производимые Сгетег). После культивирования при 37°С в течение 10 суток в инкубаторе с 5% СО2 извлекают культуральный супернатант. Химерные антитела против СО3 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки Ргойер-А (производимой Вюргосеййтд) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против СО3 называют химерными антителами N80-003 (СИТ).
(4). Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток 8Р2/0, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против СО3 (КМ-871, РЕКМ ВР-3512), описанный в опубликованной, не прошедшей экспертизу заявке на патент Японии № 304989/93 (ЕР 533199), суспендируют в среде СЮ содержащей 0,5 мг/мл С418 и 200 нМ МТХ, получают плотность клеток 3х105 клеток/мл, и суспензию распределяют по 200 мл на 175-мм2 матрасы (производимые Сгетег). После культивирования при 37°С в течение 8 суток в инкубаторе с 5% СО2 извлекают культуральный супернатант. Химерные антитела против СО3 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки Ргойер-А (производимой Вюргосеййшд) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против СО3 называют химерными антителами 8Р2/0-СО3.
5. Анализ очищенных химерных антител против СО3.
Каждый из пяти видов химерных антител против СО3 (4 мкг), продуцированных разными животными клетками и выделенных из них в чистом виде, полученных в разделе 4 примера 1, подвергают 8О8-РАСЕ согласно известному способу [№^1^, 227, 680 (1970)] и анализируют на молекулярную массу и степень очистки, результаты приводятся на фиг. 1. Как видно на фиг. 1, в каждом из очищенных химерных антител против СО3 отмечают одну полосу, соответствующую молекулярной массе примерно в 150 килодальтон (далее обозначаются кД), в условиях невосстановления, и в условиях восстановления отмечают две полосы примерно в 50 и 25 кД. Молекулярные массы почти совпадают с молекулярными массами, установленными из нуклеотидных последовательностей кДНК Н-цепи и Ь-цепи антитела (Н-цепь примерно 49 кД, Ь-цепь примерно 23 кД, вся молекула примерно 144 кД), и также совпадают с сообщениями, утверждающими, что антитело типа Ιβϋ имеет молекулярную массу примерно 150 кД в условиях невосстановления и распадается до Н-цепей с молекулярной массой примерно 50 кД и Ь-цепей с молекулярной массой примерно 25 кД в условиях восстановления из-за разрушения в молекуле дисульфидной связи (называемой далее связь 8-8) [Аи!1Ьоб1ей: А ЬаЬога!огу Маииа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу, СНар1ег 14 (1998); Моиос1оиа1 Аи!1Ьоб1ей: Ргшс1р1е5 аиб РгасЕсе, Асабетю Ргейй Ытйеб (1996)], так что подтверждается, что каждое химерное антитело против СО3 экспрессируется и очищается как молекула антитела с правильной структурой.
Пример 2. Оценка активности химерных антител против СО3.
1. Активность связывания химерных антител против СО3 с СО3 (ЕЫ8А).
Активность пяти видов очищенных химерных антител против СО3, полученных в разделе 4 примера 1 в отношении связывания с СО3 (производимым 8гю\\· Вгаиб М11к Ргобис!й), измеряют методом ЕЫ8А, описанным в разделе 3 примера 1. Фиг. 2 показывает результаты проверки активности связывания, измеренной при изменении концентрации добавляемых химерных антител против СО3. Как видно на фиг. 2, пять видов химерных антител против СО3 показывают почти одинаковую активность связывания с СО3. Результаты показывают, что антигенсвязывающие активности указанных антител постоянны, независимо от животных клеток, продуцирующих антитела, и способов их культивирования. Также из сравнения химерных антител N80^03 (302) с химерными антителами Н80-СО3 (ШТ) предполагается, что активности связывания постоянны независимо от среды, используемой при культивировании.
2. Цитотоксическая активность (АОСС-активность) 1и νίΙΐΌ химерных антител против СО3.
Для того чтобы оценить ш νίΙΐΌ цитотоксическую активность пяти видов очищенных химерных антител против СО3, полученных в разделе 4 примера 1, измеряют АОСС-активность согласно способу, описанному далее.
(1). Получение раствора клеток-мишеней.
Культивированную клеточную линию меланомы человека С-361 (АТСС СКЕ 1424) культивируют с использованием среды КРМП640-РВ8(10), получают 1 х 106 клеток и клетки метят радиоактивным изотопом путем взаимодействия их с эквивалентом 3,7 МБк радиоактивного вещества при 37°С в течение 1 ч. По завершении реакции клетки три раза промывают, суспендируя их в среде КРМП640РВ8(10) и центрифугируя, ресуспендируют в среде и затем инкубируют при 4°С в течение 30 мин на льду для спонтанного растворения радиоактивного вещества. После центрифугирования осадок доводят до содержания клеток 2х 105 клеток/мл, добавляя 5 мл среды КРМП640-РВ8(10), и используют в качестве
- 45 013224 раствора клеток-мишеней.
(2) . Получение раствора эффекторных клеток.
У здорового человека берут 50 мл венозной крови и осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого Такеба Рйагтасеи!юа1). Смесь центрифугируют для выделения слоя одноядерных клеток с использованием Ьутрйортер (производимого Жсотеб РНагта А8) согласно инструкциям изготовителя. После промывки средой КРМП640-РВ8(10) путем трехкратного центрифугирования полученный осадок снова суспендируют и с использованием среды получают раствор с плотностью клеток 2х106 клеток/мл и используют в качестве раствора эффекторных клеток.
(3) . Измерение АОСС-активности.
В каждую лунку 96-луночного планшета с И-образными лунками (производимого Ра1соп) помещают 50 мкл раствора клеток-мишеней, полученного выше в (1) (1х104 клеток/лунку). Затем добавляют 100 мкл раствора эффекторных клеток, полученного выше в (2) (2х105 клеток/лунку, отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням становится равным 20:1). Затем добавляют каждое из химерных антител против СЭ3. получают конечную концентрацию от 0,0025 до 2,5 мкг/мл и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 4 ч. По завершении реакции планшет центрифугируют и измеряют количество 51Сг в супернатанте с использованием счетчика γ-квантов. Количество спонтанно высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же операции, используя только одну среду вместо раствора эффекторных клеток и раствора антител и измеряя количество 51Сг в супернатанте. Количество всего высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же операции, используя только одну среду вместо раствора антител, добавляя 1н. соляную кислоту вместо раствора эффекторных клеток и измеряя количество 51Сг в супернатанте. АОСС-активность вычисляют из следующего уравнения (II):
5|Сг в образце супернатанта - спонтанно высвободившийся 51Сг
АВСС-активность (%) =----------------------------------------------------------------..................к 100 (II) общий высвободившийся 5|Сг - спонтанно высвободившийся 5|Сг
Результаты приводятся на фиг. 3. Как видно из фиг. 3, из пяти видов химерных антител против СЭ3 химерные антитела Υβ2/0ΑΟ3 показывают наиболее сильную АОСС-активность, за ними следуют химерные антитела 8Р2/0-СО3, химерные антитела Ν80-6Ω3 и химерные антитела СНО-СЭ3 в указанном порядке. Не обнаружено различия в АОСС-активности между химерными антителами Ν80-6Ω3 (302) и химерными антителами Ν80-6Ω3 (ИТ), полученными с использованием разных сред при культивировании. Вышеприведенные результаты показывают, что АОСС-активность антител сильно изменяется в зависимости от вида животных клеток, используемых при их получении. Так как их антигенсвязывающие активности идентичны, считается, что механизм такого явления состоит в том, что оно вызывается различиями в структурах, связывающихся с Рс-областью антитела.
Пример 3. Получение человеческих антител с привитыми СОК против α-цепи рецептора интерлейкина 5 человека.
1. Получение клеток, устойчиво продуцирующих человеческие антитела с привитыми СОК против α-цепи рецептора интерлейкина 5 человека.
(1). Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток миеломы крысы ΥВ2/0.
С использованием экспрессирующего вектора для человеческих антител с привитыми СОК против α-цепи рецептора интерлейкина 5 человека (называемых далее антитела с привитыми СОК против ЫЬ5Ка) рКАNТΕX1259НV3^V0, описанного в №О 97/10354, получают, как описано ниже, клетки, способные устойчиво продуцировать антитела с привитыми СОК против ЫЬ-5Ка.
После введения 5 мкг экспрессирующего вектора рКА№ГЕХ1259НУ3ЬУ0 для антител с привитыми СОК против ЫЬ-5Ка в 4х106 клеток миеломы крысы ΥΕ2/0 электропорацией [Су!о!есйпо1оду, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 40 мл КРМП640-РВ8(10) и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого 8итйото Ваке11!е) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 добавляют С418 до концентрации 0,5 мг/мл с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых образуются колонии трансформантов, показывающих невосприимчивость к С418, и отмечается рост колоний, извлекают культуральный супернатант и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность антител с привитыми СОК против ЫЬ-5Ка методом ЕЫ8А, описанным в разделе 2 примера 3.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование антител с привитыми СОК против ЫЬ-5Ка, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ОНРК, каждый из них суспендируют в среде КРМП640-РВ8(10), содержащей 0,5 мг/мл С418 и 50 нМ МТХ, и получают плотность 1-2х105 клеток/мл, суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого Стешет) по 2 мл на лунку. Трансформанты, показывающие невосприимчивость к 50 нМ МТХ, подвергают культивированию при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2. В культуральных супернатантах в лунках, в которых отмечают рост трансформантов, измеряют антигенсвязывающую активность антител с привитыми СОК против ЫЬ-5Ка методом ЕЫ8А, описанным в разделе 2 примера 3. Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование антител с
- 46 013224 привитыми СОК. против ΗΙΕ-5Κα, то повышают концентрацию МТХ до 100 и затем до 200 нМ, и, наконец, тем же способом, какой описан выше, получают трансформанты, способные расти в среде КРМП640-ЕВЗ(10), содержащей 0,5 мг/мл О418 и 200 нМ МТХ, и продуцировать антитела с привитыми СОК против 1ιΙΕ-5Ρα в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают элитные клеточные линии и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена α-1,6-фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию. Полученный клон № 3 трансформированных клеток, продуцирующих антитела с привитыми СОК против ЫЬ5Κα, депонирован 5 апреля 1999 г. как ЕЕКМ ВР-6690 в №1Еопа1 ИъЦЦЦе оГ Вюкшепсе апй Нитап ТесНпо1оду, Адепсу оГ МиМк-й Заепсе апй ТесНпо1оду (ШдакЫ 1-1-3, ТкикиЬа, Шагак! 1арап) (настоящее название ЕЦетаНогий Ра!еп! 0гдаш§т Оерокйагу, №11юпа1 Емкий оГ Айуапсей Шйийпа! Зшепсе апй ТесНпо1оду (АКТ ТкикиЬа Сеп!га1 6, 1-1, ШдазЫ 1-СНоте ТкикиЬа-кЫ, Кагакккеп, 1арап)).
(2) . Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток СН0/йНГг-.
После введения 4 мкг экспрессирующего вектора рКА№ГЕХ1259НУ3ЬУ0 для антител с привитыми СОК против ΗΙΕ-5Κα, описанного в XV0 97/10354, в 1,6х106 клеток СН0/йНГг- электропорацией [Су1о1есНпо1оду, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 10 мл ШВМ-ЕВЗ(10) и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого Гетак1 О1а§8) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 добавляют О418 до получения концентрации 0,5 мг/мл с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых образуются колонии трансформантов, показывающих невосприимчивость к О418, и отмечается рост колоний, извлекают культуральный супернатант и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность антител с привитыми СОК против 1ιΙΕ-5Εα методом ЕМЗА, описанным в разделе 2 примера 3.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование антител с привитыми СОК против ΜΕ-5Ηα, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ОНЕК, каждый из них суспендируют в среде ШВМ-йЕВЗ(10), содержащей 0,5 мг/мл О418 и 10 нМ МТХ, получают плотность клеток 1-2х105 клеток/мл и суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого Ι\νηΕί О1а§8) по 0,5 мл на лунку. Трансформанты, показывающие невосприимчивость к 10 нМ МТХ, подвергают культивированию при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2. Что касается трансформантов в лунках, в которых отмечают их рост, то повышают концентрацию МТХ до 100 и затем до 500 нМ, и наконец, тем же способом, какой описан выше, получают трансформанты, способные расти в среде ШВМ-йЕВЗ(10), содержащей 0,5 мг/мл О418 и 500 нМ МТХ, и продуцировать антитела с привитыми СОК против 1ιΙΕ-5Ρα в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают элитные клеточные линии и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена α-1,6-фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
(3) . Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток миеломы мыши ХЗ0.
Получают экспрессирующйй вектор для антител с привитыми СОК против 1ιΙΕ-5Ρα согласно способу УаггагИоп е! а1. [ВIΟ/ТЕСНNΟ^ΟОΥ, 10, 169 (1992)] и с использованием кДНК Н-цепи и кДНК Ь-цепи на экспрессирующем векторе рКА№ТЕХ1259НУ3ЬУ0 для антител с привитыми СОК против ШЬ-ЗЯ», описанном в ν0 97/10354, и трансформируют клетки ХЗ0 для получения трансформантов, способных продуцировать антитела с привитыми СОК против 1ιΙΕ-5Ρα в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают элитные клеточные линии и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена α-1,6-фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
2. Измерение активности связывания антител с ЫЕ-5КО. (ЕМЗА).
Активность связывания антител с 1ιΙΕ-5Ρα измеряют так, как описано ниже.
Получают раствор, разводя в РВЗ мышиные антитела против 1ιΙΕ-5Ρα КМ1257, описанные в ν0 97/10354, получают концентрацию 10 мкг/мл и по 50 мкл полученного раствора распределяют в каждую лунку 96-луночного планшета для ЕМЗА (производимого Огетег), затем осуществляют взаимодействие при 4°С в течение 20 ч. По завершении реакции добавляют 100 мкл/лунку 1% ВЗА-РВЗ и затем осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 ч для блокирования оставшихся активных групп. После удаления 1% ВЗА-РВЗ раствор, полученный разведением 1% ВЗА-РВЗ растворимого 11^-5^(/., описанного в ν0 97/10354, с получением концентрации 0,5 мкг/мл распределяют по 50 мкл/лунку и осуществляют взаимодействие при 4°С в течение 20 ч. По завершении реакции каждую лунку промывают твин-РВЗ, культуральные супернатанты трансформантов или разбавленные растворы
- 47 013224 очищенных человеческих антител с привитыми СОЯ распределяют 50 мкл/лунку и осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 2 ч. По завершении реакции каждую лунку промывают твин-РВ8, добавляют в качестве раствора второго антитела 50 мкл/лунку раствора меченных пероксидазой козьих антител против человеческого Ιβ6 (Н&Ь) (производимого Атепсаи Оиа1ех), разведенного в 3000 раз 1% В8А-РВ8, и затем осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 ч. По завершении реакции и после последующей промывки твин-РВ8 добавляют 50 мкл/лунку раствора субстрата АВТ8 для проявления окраски и затем измеряют поглощение ОЭ415.
3. Очистка антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Κα.
(1) . Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток УВ2/0, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих антитела с привитыми СОЯ против Ы^-5Яα, полученный в разделе 1(1) примера 3, суспендируют в среде С1Т, содержащей 0,5 мг/мл 6418 и 200 нМ МТХ, получают плотность клеток 3х105 клеток/лунку и распределяют по 200 мл на 175-мм2 матрасы (производимые Сгешег). После культивирования клеток при 37°С в течение 8 суток в инкубаторе с 5% СО2 извлекают культуральный супернатант. Антитела с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Κα очищают от культурального супернатанта с использованием ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Очищенные антитела с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Κα называют антителами УВ2/0-ЫЬ-5Я СОЯ.
(2) . Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток СНО/бЫг-, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих антитела с привитыми СОЯ против Ы^-5Яα, полученный в разделе 1(2) примера 3, суспендируют в среде ЕХ-СЕЬЬ302, содержащей 3 мМ Ь-61и, 0,5% СЬЬС и 0,3% РР68, получают плотность клеток 3х106 клеток/мл и культивируют с использованием бутыли емкостью 4 л, содержимое которой перемешивается при ее вращении (производимой Ι\ν;·ι1<ί 61:-188), при перемешивании со скоростью 100 об/мин. После культивирования клеток при 37°С в течение 10 суток в камере с регулируемой температурой извлекают культуральный супернатант. Антитела с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Κα очищают от культурального супернатанта с использованием ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Очищенные антитела с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Κα называют антителами СНО/б-ЫЬ-5Я СОЯ.
(3) . Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток Ν80, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих антитела с привитыми СОЯ против Ы^-5Яα, полученный в разделе 1(3) примера 3, культивируют согласно способу Уаггаи1ои е1 а1. (ВЮ/ТЕСННОЕ-ОбУ, 10, 169, (1992)], и затем извлекают культуральный супернатант. Антитела с привитыми СОЯ против ЫЬ-5Яа очищают от культурального супернатанта с использованием ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Очищенные антитела с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Εα называют антителами Ν80-11ΙΕ-5Ε СОЯ.
4. Анализ очищенных антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Εα.
Согласно известному способу ЩаШге, 227, 680 (1970)] по 4 мкг каждого из трех видов антител с привитыми СОЯ против Ы^-5Яα, продуцированных каждым из видов животных клеток и выделенных из них в чистом виде, полученных в разделе 3 примера 3, подвергают 8Э8-РА6Е для анализа на молекулярную массу и степень очистки. Результаты приводятся на фиг. 4. Как видно из фиг. 4, в молекулярной массе обнаруживаются одна полоса примерно в 150 кД в условиях невосстановления и две полосы примерно в 50 и примерно в 25 кД в условиях восстановления в каждом образце очищенных антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Εα. Молекулярные массы почти сопадают с молекулярными массами, установленными из нуклеотидных последовательностей кДНК Н-цепи и Ь-цепи антитела (Н-цепь примерно 49 кД, Ь-цепь примерно 23 кД, вся молекула примерно 144 кД), и также совпадает с сообщениями, утверждающими, что антитело Ιβ6 имеет молекулярную массу примерно 150 кД в условиях невосстановления и распадается до Н-цепей с молекулярной массой примерно 50 кД и Ь-цепей с молекулярной массой примерно 25 кД в условиях восстановления из-за разрушения в молекуле дисульфидной связи 8-8 [Аи11Ьоб1ек: А ЬаЬогаФгу Маииа1, Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬогаФгу, СЬар1ег 14, (1998); Моиос1оиа1 АиЬЬоб1е8: Ргшс1р1е8 аиб РгасЬсе, Асабетю Ргекк Ытйеб (1996)], так что подтверждается, что каждое антитело с привитым СОЯ против 1ιΙΕ-5Εα экспрессируется и очищается как молекула антитела с правильной структурой.
Пример 4. Оценка активности антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Εα.
1. Активность связывания антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Εα с 1ιΙΕ-5Εα (ЕЫ8А).
Активность трех видов очищенных антител с привитыми СОЯ против ΗΙΕ-5Κα, полученных в разделе 3 примера 3, в отношении связывания с 1ιΙΕ-5Εα измеряют методом ЕЫ8А, описанным в разделе 2 примера 3. Фиг. 5 показывает результаты проверки активности связывания, измеренной при изменении концентрации добавляемых антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Εα. Как видно на фиг. 5, три вида антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Εα показывают почти одну и ту же активность связывания с
- 48 013224
ЫЬ-5Яа. Результаты показывают, что антигенсвязывающие активности указанных антител постоянны, независимо от животных клеток, продуцирующих антитела, и способов их культивирования, что схоже с результатами, полученными в разделе 1 примера 2.
2. Цитотоксическая активность (АИСС-активность) ш νίΙΐΌ антител с привитыми СОЯ против ЫЬ5Яа.
Для того чтобы оценить ш νίΙΐΌ цитотоксическую активность трех видов очищенных антител с привитыми СОЯ против ЫЬ-5Яа, полученных в разделе 3 примера 3, измеряют АИСС-активность согласно способу, описанному далее.
(1) . Получение раствора клеток-мишеней.
Мышиную Т-клеточную линию СТТЬ-2(й5Я), экспрессирующую цепь ЫЬ-5Яа и β-цепь, описанную в XV 0 97/10354, культивируют с использованием среды ЯΡΜI1640-РВ§(10), получают плотность клеток 1х106 клеток/0,5 мл и клетки метят радиоактивным изотопом путем взаимодействия их с эквивалентами 3,7 МБк радиоактивного вещества №251Сг04 при 37°С в течение 1,5 ч. По завершении реакции клетки три раза промывают, суспендируя их в среде ЯΡΜI1640-РВ§(10) и центрифугируя, ресуспендируют в среде и затем инкубируют при 4°С в течение 30 мин на льду для спонтанного растворения радиоактивного вещества. После центрифугирования осадок доводят до содержания клеток 2х105 клеток/мл, добавляя 5 мл среды ЯΡΜI1640-РВ§(10), и используют в качестве раствора клеток-мишеней.
(2) . Получение раствора эффекторных клеток.
У здорового человека берут 50 мл венозной крови и осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого Такеёа РЬагтасеиёса1). Смесь центрифугируют для отделения слоя одноядерных клеток с использованием Ро1утогрйргер (производимого Шсотеё Рйагта А8) согласно инструкциям изготовителя. После промывки средой ЯΡΜI1640-РВ§(10) путем трехкратного центрифугирования полученные клетки снова суспендируют и с использованием среды получают раствор с плотностью клеток 9х106 клеток/мл и используют в качестве раствора эффекторных клеток.
(3) . Измерение АЭСС-активности.
В каждую лунку 96-луночного планшета с И-образными лунками (производимого Ра1соп) помещают 50 мкл раствора клеток-мишеней, полученного выше в (1) (1х104 клеток/лунку). Затем добавляют 100 мкл раствора эффекторных клеток, полученного выше в (2) (9х105 клеток/лунку, отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням становится равным 90:1). Затем добавляют каждое из антител с привитыми СИЯ против ЫЬ-5Яа, получают конечную концентрацию от 0,001 до 0,1 мкг/мл и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 4 ч. По завершении реакции планшет центрифугируют и измеряют количество 51Сг в супернатанте с использованием счетчика γ-квантов. Количество спонтанно высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же операции, используя только одну среду вместо раствора эффекторных клеток и раствора антител и измеряя количество 51Сг в супернатанте. Количество общего высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же операции, используя только одну среду вместо раствора антител, и добавляя 1н. соляную кислоту вместо раствора эффекторных клеток, и измеряя количество 51Сг в супернатанте.
АЭСС-активность вычисляют из приведенного выше уравнения (II).
Результаты приводятся на фиг. 6. Как видно из фиг. 6, из трех видов антител с привитыми СИЯ против ЫЬ-5Яа антитела УВ2/0-ЫЬ-5Я СИЯ показывают наиболее сильную АЭСС-активность, за ними следуют антитела СН0/ё-ЫЬ-5Я СИЯ и антитела №0-ЫЬ-5Я СИЯ в указанном порядке. Подобно результатам, полученным в разделе 2 примера 2, вышеприведенные результаты показывают, что АЭССактивность антител сильно изменяется в зависимости от вида животных клеток, используемых при их получении. Кроме того, так как антитела, продуцированные клетками ΥΒ2/0, показывают самую сильную АИСС-активность в обоих случаях двух видов гуманизированных антител, показано, что антитела с сильной АЭСС-активностью можно получить с использованием клеток ΥΒ2/0.
3. Оценка ш νί\Ό активности антител с привитыми СИЯ против ЫЬ-5Яа.
Для того чтобы оценить ш у1уо активность трех видов очищенных антител с привитыми СИЯ против ЫЬ-5Яа, полученных в разделе 3 примера 3, проверяют согласно описанному далее способу ингибирующую активность на модели Масаса Га8еюи1агк с нарастанием эозинонофилии, вызванной ЫЬ-5.
Масаса ГакеюЫагк под кожу на спине вводят ЫЬ-5 (способ получения описан в ХУ0 97/19354) в дозе 1 мкг/кг, начиная в первый день и один раз в день всего 14 раз. Каждый вид антител с привитыми СИЯ против ЫЬ-5Яа вводят внутривенно в дозе 0,3 мг/кг за один час до введения ЫЬ-5 в день ноль. Группу, которой антитела не вводят, используют как контроль. В каждой из групп, которым вводят антитела, используют трех животных Масаса ГакеюЫагк (№№ 301, 302, 303, 401, 402, 403, 501, 502 и 503) и двух животных (№ 101 и 102) используют в группе, которой антитела не вводят. Начиная со времени за 7 дней до начала введения и до 42 дней после введения периодически берут примерно 1 мл крови из подкожной вены задней конечности или бедренной вены и измеряют число эозинофилов в 1 мкл периферической крови. Результаты приводятся на фиг. 7. Как видно из фиг. 7, повышение числа эозинофилов в крови полностью ингибируется в группе, которой вводили антитела ΥΒ2/0-ΗΙΕ-5Ρ СИЯ. С другой стороны,
- 49 013224 отмечают полную ингибирующую активность у одного животного в группе, которой вводили антитела СНО/б-ЫЬ-5В СЭВ, но у двух животных ингибирующая активность недостаточная. В группе, которой вводили антитела №0-ЫЬ-5В СЭВ, полную ингибирующую активность не отмечают, и их действие является недостаточным.
Приведенные выше результаты показывают, что активность ш у1уо антител сильно изменяется в зависимости от животных клеток, используемых при их получении. Кроме того, так как между степенью активности ш у1уо антител с привитыми СЭВ против ЬI^-5Вα и степенью их АЭСС-активности, описанной в разделе 2 примера 4, обнаруживается положительная корреляция, это указывает, что степень АЭСС-активности заметно важна для выражения их активности.
На основании приведенных выше результатов ожидается, что антитела с сильной АЭСС-активностью также полезны в клинической области в случае различных заболеваний человека.
Пример 5. Анализ углеводной цепи, усиливающей АЭСС-активность.
1. Получение углеводных цепей, меченных 2-аминопиридином (РА-обработанных углеводных цепей).
Гуманизированные антитела настоящего изобретения подвергают кислотному гидролизу с соляной кислотой для удаления сиаловой кислоты. После полного удаления соляной кислоты углеводные цепи отщепляют от белка гидразинолизом [Ме!Ьоб οί Епгуто1оду, 83, 263, (1982)]. Гидразин удаляют и осуществляют Ν-ацетилирование, добавляя водный раствор ацетата аммония и уксусный ангидрид. После лиофилизации присоединяют флуоресцентную метку 2-аминопиридин [I. ВюсЬет., 95, 197 (1984)]. Углеводные цепи с флуоресцентными метками (РА-обработанные углеводные цепи) отделяют от примесей с использованием колонки с 8итретбех Рерббе НВ 10/30 (производимым РЬаттааа). Фракцию углеводных цепей сушат с использованием центробежного концентратора и используют в качестве очищенных РА-обработанных углеводных цепей.
2. Анализ ВЭЖХ с обращенной фазой РА-обработанных углеводных цепей антител с привитыми СЭВ против ЬI^-5Вα.
Согласно способу, описанному в разделе 1 примера 5, различные антитела с привитыми СЭВ против ΗΓ-τΡα, полученные в примере 3, подвергают обработке для получения РА-обработанных углеводных цепей и осуществляют анализ методом ВЭЖХ с обращенной фазой с колонкой с СЭС-ОЭ8 (производимым 81итабхи). Избыточное количество α-Ь-фукозидазы (полученной из почек коровы, производится 8ЮМА) добавляют к РА-обработанным углеводным цепям для расщепления (37°С, 15 ч) и затем анализируют продукты реакции ВЭЖХ с обращенной фазой (фиг. 8). С использованием эталонов РА-обработанных углеводных цепей, производимых Такага 8Ьи/о, подтверждают, что соединенные с аспарагином углеводные цепи элюируются за время от 30 до 80 мин. Вычисляют долю углеводных цепей, у которых сдвигаются позиции элюирования при ВЭЖХ с обращенной фазой (углеводных цепей, элюированных за 48-78 мин) за счет расщепления α-Ь-фукозидазой. Результаты приводятся в табл. 1.
Таблица 1
Клетки, продуцирующие антитела Углеводные цепи с присоединенной а-1,6-фукозой (%)
ΥΒ2/0 47
N50 73
Примерно 47% антител с привитыми СЭВ против ЬI^-5Вα, продуцированных клетками УВ2/0, и примерно 73% антител с привитыми СЭВ против ЬI^-5Вα, продуцированных клетками Ν80, представляют собой углеводные цепи, в которых положение 1 фукозы связано с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце через α-связь в присоединенной через Ν-гликозидную связь углеводной цепи (далее называются углеводные цепи с α-1,6-фукозой). Таким образом, доля углеводных цепей, в которых положение 1 фукозы не связано с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце через α-связь в присоединенной через Ν-гликозидную связь углеводной цепи (называемых далее углеводными цепями без α-1,6-фукозы), выше в антителах, продуцированных клетками УВ2/0, чем в антителах, продуцированных клетками Ν80.
3. Анализ моносахаридного состава очищенных антител с привитыми СЭВ против ЬI^-5Вα.
Углеводные цепи антител с привитыми СЭВ против ЬI^-5Вα, продуцированных клетками УВ2/0, клетками Ν80 и клетками СНО/б, гидролизуют до моносахаридов кислотным гидролизом с трифторуксусной кислотой и осуществляют анализ моносахаридного состава с использованием ВюЬС (производимого Эюпех).
В углеводных цепях, присоединенных через Ν-гликозидную связь, имеются 3 маннозных звена в одной углеводной цепи в присоединенной через Ν-гликозидную связь углеводной цепи комплексного типа. Относительные доли каждого моносахарида, полученные вычислением с числом для маннозы 3, приводятся в табл. 2.
- 50 013224
Таблица 2
Клетки, продуцирующие антитела Гис С1сЫАс Мал АБССактивность(%)★
ΥΒ2/0 0, 60 4, 98 0, 30 3, 00 42,27
N30 1, 06 3,94 0,66 3,00 16,22
СНО/сИтЕг’ 0, 85 3, 59 0,49 3,00 25,73
СНО/бЬЕг” 0, 91 3,80 0,27 3,00 25,73
* Концентрация антител 0,01 мкг/мл
Так как относительные доли фукозы возрастают в ряду ΥВ2/0<СН0/б<Nδ0, углеводные цепи, полученные в антителах, продуцированных клетками Υβ2/0, показывают наименьшее содержание фукозы, как видно из представленных результатов.
4. Анализ углеводных цепей антител, продуцированных клетками СН0/бЫг-.
Из очищенных антител с привитыми СОВ против Ы^-5Вα, продуцированных клетками СН0/бЫг-, получают РА-обработанные углеводные цепи и осуществляют анализ методом ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием колонки СЬС-Θϋδ (производимой δΐιίπκ^ζιι) (фиг. 9). На фиг. 9 время элюирования от 35 до 45 мин соответствует углеводным цепям без фукозы, и время элюирования от 45 до 60 мин соответствует углеводным цепям с фукозой. Подобно случаю с антителами, продуцированными клетками миеломы мыши №0, антитела с привитыми СОВ против Ы^-5Вα, продуцированные клетками СН0/бЫг-, имеют меньшее содержание цепей без фукозы, чем антитела, продуцированные клетками миеломы крысы ΥВ2/0.
Пример 6. Выделение антител с сильной АЭСС-активностью.
Антитела с привитыми СОВ против Ы^-5Вα, продуцированные клетками миеломы крысы ΥВ2/0, отделяют с использованием колонки с лектином, связывающимся с углеводными цепями с фукозой. Осуществляют ВЭЖХ с использованием ЬС-6А, производимого δΐάτ^ζι.!, при скорости потока 1 мл/мин и при комнатной температуре как температуре колонки. После уравновешивания 50 мМ трис-сульфатным буфером (рН 7,3) впрыскивают очищенные антитела с привитыми СОВ против Ы^-5Вα и затем элюируют с линейным градиентом плотности (60 мин) 0,2 М α-метилманнозида (производимого №1са1а1 Теэдие). Антитела с привитыми СОВ против Ы^-5Вα выделяются в неадсорбированную фракцию и адсорбированную фракцию. Когда берут образцы неадсорбированной фракции и части адсорбированной фракции и определяют их активность связывания с Ы^-5Вα, они показывают подобные активности связывания (фиг. 10А). Когда измеряют АОСС-активность, неадсорбированная фракция показывает более сильную АЭСС-активность (в 100-1000 раз), чем часть адсорбированной фракции (фиг. 10В). Кроме того, из неадсорбированной фракции и части адсорбированной фракции получают РА-обработанные углеводные цепи и осуществляют анализ методом ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием колонки ίΤΟ-0ϋδ (производимой δΐιίπκ^ζιι) (фиг. 11). В неадсорбированной фракции имеет место, главным образом, связывание антител с углеводными цепями без фукозы, а в части адсорбированной фракции имеет место, главным образом, связывание антител с углеводными цепями с фукозой.
Пример 7. Оценка активности химерных антител против СЭ3 с различной долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы.
1. Получение химерных антител против СЭ3 с различной долей углеводных цепей без α-1,6фукозы.
Согласно способу, описанному в разделе 2(1) примера 1, получают трансформированные клоны, происходящие от клеток ΥВ2/0, способных продуцировать химерные антитела против СЭ3. Антитела получают из трансформированных клонов, полученных из клеток Υβ2/0, и называют их серией 1, серией 2 и серией 3. Каждую углеводную цепь, связанную с химерными антителами против СЭ3 серии 1, 2 и 3, анализируют согласно способу, описанному в примере 11(6), и обнаруживают, что доли углеводных цепей без α-1,6-фукозы составляют 50, 45 и 29% соответственно. В данном случае указанные образцы называют химерными антителами против СЭ3 (50%), химерными антителами против СЭ3 (45%) и химерными антителами против СЭ3 (29%).
Также углеводные цепи химерных антител против ΘΌ3, продуцированных клетками СН0/0С44, полученных в разделе 2(2) примера 1, анализируют согласно способу примера 11(6), и обнаруживают, что доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы составляет 7%. В данном случае образец называют химерными антителами против СЭ3 (7%).
Химерные антитела против СЭ3 (45%) и химерные антитела против СЭ3 (7%) смешивают в соотношении [химерные антитела против СЭ3 (45%)]: [химерные антитела против СЭ3 (7%)] = 5:3 или 1:7. Углеводные цепи образцов анализируют согласно способу, описанному в примере 10(6), и обнаруживают, что получают образцы с долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы 24 и 13% (вычисленная величина). В данном случае их называют химерными антителами против СЭ3 (24%) и химерными антителами против СЭ3 (13%).
- 51 013224
Результаты анализа углеводных цепей каждого образца показаны на фиг. 12. Доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы показана в виде среднего значения результатов двух анализов углеводных цепей.
2. Оценка активности связывания с СЭ3 (ЕЫ8А).
Активность связывания шести видов химерных антител против СЭ3 с различной долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы, полученных в разделе 1 примера 7, с СЭ3 (производимым 8по\у Вгапй М11к Ргойис!к), измеряют ЕЫЗА, описанным в разделе 3 примера 1. В результате все шесть видов химерных антител против СЭ3 показывают почти одну и ту же активность связывания с СЭ3, как видно из фиг. 13, и обнаруживают, что доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы не влияет на антигенсвязывающую активность антител.
3. Оценка АЭСС-активности на клеточной линии меланомы человека.
АЭСС-активность химерных антител против СЭ3 измеряют на клеточной линии меланомы человека С-361 (АТСС СКЬ 1424) так, как описано далее.
(1) . Получение суспензии клеток-мишеней.
Получают 1х106 клеток клеточной линии меланомы человека С-361, добавляют к ним эквивалент 3,7 МБк радиоактивного вещества Νι251ΟΟ4, смесь вводят во взаимодействие при 37°С в течение 1 ч и клетки метятся радиоизотопом. По завершении реакции клетки три раза промывают, суспендируя их в среде с последующим центрифугированием, ресуспендируют в среде и затем инкубируют при 4°С в течение 30 мин на льду для осуществления спонтанного отделения радиоактивного вещества. После центрифугирования клетки доводят до содержания 2х105 клеток/мл, добавляя 5 мл среды, и используют в качестве суспензии клеток-мишеней.
(2) . Получение суспензии человеческих эффекторных клеток.
У здорового человека берут 50 мл периферической крови и осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого 8Ытайхн Рйагтасеи!юа1). С использованием Ьутрйоргер (производимого ΛΧΙ8 ЗНГЕЬО) смесь центрифугируют (800 д, 20 мин) согласно инструкциям изготовителя для отделения слоя одноядерных клеток. Клетки промывают трехкратным центрифугированием (1200 об/мин, 5 мин) с использованием среды и снова суспендируют в среде, получают суспензию с плотностью клеток 2х106 клеток/мл и используют в качестве суспензии человеческих эффекторных клеток.
(3) . Измерение АЭСС-активности.
Суспензию клеток-мишеней, полученную в (1), распределяют по 50 мкл (1х 104 клеток/лунку) в каждую лунку 96-луночного планшета с И-образными лунками (производимого Еа1соп). Затем в лунки добавляют 100 мкл суспензии человеческих эффекторных клеток, полученной в (2) (2х105 клеток/лунку, отношение человеческих эффекторных клеток к клеткам-мишеням составляет 20:1). Затем добавляют каждое из химерных антител против СИ-3, получают конечную концентрацию от 0,0005 до 5 мкг/мл и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 4 ч. По завершении реакции планшет центрифугируют и измеряют количество 51Сг в супернатанте с использованием счетчика γ-квантов. Количество спонтанно высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же процедуры, используя одну среду вместо суспензии человеческих эффекторных клеток и раствора антител и измеряя количество 51 Сг в супернатанте. Количество общего высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же процедуры, используя одну среду вместо раствора антител, и добавляя 1 моль/л соляную кислоту вместо суспензии человеческих эффекторных клеток, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. Цитотоксическую активность (%) вычисляют с использованием уравнения (ΙΙ).
Фиг. 14 и 15 показывают результаты измерения АОСС-активности шести видов химерных антител против СИ3 с различной долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы в разных концентрациях (0,0005-5 мкг/мл) с использованием эффекторных клеток двух здоровых доноров (А и В) соответственно. Как видно на фиг. 14 и 15, АЭСС-активность химерных антител против СИ3 проявляет тенденцию повышаться пропорционально доле углеводных цепей без α-1,6-фукозы при каждой концентрации антител. АПСС-активность снижается, когда концентрация антител низкая. При концентрации антител 0,05 мкг/мл антитела, в которых доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы составляет 24, 29, 45 или 50%, показывают почти одинаковую сильную АПСС-активность, но АЭСС-активность низкая у антител (13%) или (7%), в которых доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы менее 20%. Получают такие же результаты, когда заменяют донора эффекторных клеток.
Пример 8. Оценка активности химерных антител против ССК4 с различной долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы.
1. Получение клеток, устойчиво продуцирующих химерные антитела против ССК4.
Клетки, способные устойчиво продуцировать химерные антитела против ССК4, получают так, как описано далее, с использованием экспрессирующего вектора тандемного типа рКА№ТЕХ2160 для химерных антител против ССК4, описанного в ΑΟ 01/64754.
(1). Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток миеломы крысы УВ2/0.
После введения 10 мкг экспрессирующего вектора рКА№ТЕХ2160 для химерных антител против ССК4 в 4х106 клеток миеломы крысы УВ2/0 (АТСС СКЬ 1662) электропорацией [Су!о!есйпо1оду, 3, 133
- 52 013224 (1990)] клетки суспендируют в 40 мл НуЬпйота-8РМ-РВ8(5) [среда НуЬпйота-8РМ (производимая Ιπνί1годеп). содержащая 5% РВ8 (производимой РАА ЬаЬогаФпек)] и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого 8итйото ВакеШе) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 добавляют С418, получая концентрацию 0,5 мг/мл, и затем осуществляют культивирование в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых образуются колонии трансформантов, показывающих невосприимчивость к С418, и отмечается образование колоний, извлекают культуральный супернатант и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против ССК4 методом ЕЬ18А, описанным в разделе 2 примера 8.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против ССК4, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ИНРК, каждый из них суспендируют в среде НуЬпйота-8РМ-РВ8(5), содержащей 1 мг/мл С418 и 50 нМ ингибитора ИНРК МТХ (производимого 81СМА), и получают плотность клеток 1-2х105 клеток/мл и суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого Сгетег) по 1 мл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2 стимулируют трансформанты, показывающие невостриимчивость к 50 нМ МТХ. В культуральных супернатантах в лунках, в которых отмечают рост трансформантов, измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против ССК4 методом ЕЫ8А, описанным в разделе 2 примера 8.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против ССК4, то повышают концентрацию МТХ тем же способом и получают, наконец, трансформанты, способные расти в среде НуЬпйота-8РМ-РВ8(5), содержащей 200 нМ МТХ, и продуцировать химерные антитела против ССК4 в большом количестве. Из полученных трансформантов получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением и полученную клонированную клеточную линию называют КМ2760 № 58-35-16. В данном случае с использованием способа определения продукта транскрипции гена α-1,6-фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
(2). Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток СН0/ЭС44.
После введения 4 мкг экспрессирующего вектора рКА№ГЕХ2160 для химерных антител против ССК4 в 1,6х106 клеток СН0/ИС44 электропорацией [Су1о1есйио1оду, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 10 мл 1МИМ-йРВ8(10)-НТ(1) [среда 1МИМ (производимая 1иуйгодеи), содержащая 10% йРВ8 (производимой 1пу11годеп) и добавку НТ концентрации 1х(производимой 1пу|1годеп)| и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого 1теак1 С1а55) по 100 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 среду заменяют на 1МОМ-йРВ8(10) (среда 1М0М, содержащая 10% диализованной РВ8) с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых отмечается рост из-за образования трансформанта, показывающего рост, независимый от НТ, извлекают культуральный супернатант и в супернатанте измеряют уровень экспрессии химерных антител против ССК4 методом ЕЫ8А, описанным в разделе 2 примера 8.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против ССК4, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ОНРК, каждый из них суспендируют в среде 1МПМ-йРВ8(10), содержащей 50 нМ МТХ, получают плотность клеток 1-2х105 клеток/мл и суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого 1теак1 С1а55) по 0,5 мл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2 стимулируют трансформанты, показывающие невосприимчивость к 50 нМ МТХ. Что касается трансформантов в лунках, в которых отмечают их рост, то повышают концентрацию МТХ до 200 нМ тем же способом, и получают, наконец, трансформант, способный расти в среде 1МОМ-йРВ8(10), содержащей 200 нМ МТХ, и продуцировать химерные антитела против ССК4 в большом количестве. Полученный трансформант называют 5-03. В данном случае с использованием способа определения продукта транскрипции гена α-1,6-фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
2. Антигенсвязывающая активность в отношении неполного пептида ССК4 (ЕЫ8А).
Соединение 1 (8ЕО Ш N0:25) отбирают как человеческий пептид внеклеточной области ССК4, способный к взаимодействию с химерными антителами против ССК4. Для того чтобы использовать его при измерении активности методом ЕЫ8А, получают конъюгат с В8А (бычий сывороточный альбумин) (производимым №1сакн Тебсще) способом, описанным далее, и используют в качестве антигена. Итак, 100 мл ДМСО-раствора, содержащего 25 мг/мл 8МСС Щ-гидроксисукцинимидный эфир 4-Щ-малеимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты (производимый 81дта), при перемешивании при встряхивании добавляют по каплям к 900 мл раствора РВ8, содержащего 10 мг В8А, и затем осторожно перемешивают в течение 30 мин. Загружают 1 мл реакционного раствора в колонку для гель-фильтрации, такую как колонка NАΡ-10, или подобную, уравновешенную 25 мл РВ8, и затем элюируют 1,5 мл РВ8, и
- 53 013224 полученный элюат используют в качестве раствора ВЗА-ЗМСС (концентрацию ВЗА вычисляют на основе измерений А280). Затем добавляют 250 мл РВЗ к 0,5 мг соединения 1 и затем полностью растворяют, добавляя 250 мл ДМФА, и к полученному раствору при встряхивании добавляют раствор ВЗА-ЗМСС с последующим осторожным перемешиванием в течение 3 ч. Реакционный раствор диализуют против РВЗ при 4°С в течение ночи, добавляют азид натрия, получают конечную концентрацию 0,05%, смесь фильтруют через фильтр 0,22 мм и используют в качестве раствора конъюгата ВЗА-соединение 1.
Полученный конъюгат распределяют при концентрации 0,05 мкг/мл по 50 мкл/лунку в 96-луночный планшет для ЕЖ (производимый Сгешег) и инкубируют для прилипания при 4°С в течение ночи. После промывки каждой лунки РВЗ в них добавляют 1% ВЗА-РВЗ по 100 мкл/лунку и оставляют для взаимодействия при комнатной температуре для блокирования оставшихся активных групп. После промывки каждой лунки РВЗ, содержащим 0,05% твина 20 (называемым далее твин-РВЗ), добавляют культуральный супернатант трансформанта по 50 мкл/лунку и оставляют для взаимодействия при комнатной температуре на 1 ч. По завершении реакции каждую лунку промывают твин-РВЗ и затем добавляют по 50 мкл/лунку раствор меченных пероксидазой козьих антител против человеческого ^СЦ) (производимый Атепсап Оиа1ех), разведенный 6000 раз 1% ВЗА-РВЗ, и оставляют для взаимодействия при комнатной температуре на 1 ч. По завершении реакции и последующей промывки твин-РВЗ добавляют по 50 мкл/лунку раствор субстрата АВТЗ для проявления окрашивания и через 20 мин реакцию останавливают, добавляя 5% раствор ЗЭЗ по 50 мкл/лунку. Затем измеряют поглощение 0Ό4ι5. Химерные антитела против ССВ4, полученные в разделе 1 примера 8, показывают активность связывания с ССВ4.
3. Очистка химерных антител против ССВ4.
(1) . Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток УВ2/0, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против ССВ4 КМ2760 # 58-35-16, полученный в разделе 1(1) примера 8, суспендируют в среде НуЬпбота-ЗЕМ (производимой Iην^ί^οдеηе), содержащей 200 нМ МТХ и 5% Эащо СЕ21 (производимого Уако Риге СЬетка1 ШбикШек), получают плотность клеток 2х105 клеток/мл и подвергают клетки культивированию с подпиткой при встряхивании с использованием бутыли, содержимое которой перемешивается при вращении (производимой Ι\ν;·ι1<ί С1а88), при постоянной температуре в камере 37°С. После культивирования в течение 8-10 суток химерные антитела против ССВ4 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки с Ргокер-А (производимой М1Шроге) и гель-фильтрацией. Очищенные химерные антитела против ССВ4 называют химерными антителами КМ2760-1.
(2) . Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток СН0/ЭС44, и очистка антител.
Клеточную линию трансформанта 5-03, продуцирующую химерные антитела против ССВ4, полученную в разделе 1(2) примера 8, культивируют при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 с использованием среды ПМОМ-бЕВЗ/И)) на 182-мм2 матрасе (производимом Сгешег). Когда плотность клеток через несколько дней достигнет уровня слияния, культуральный супернатант отбрасывают и клетки промывают 25 мл РВЗ и затем смешивают с 35 мл среды ЕХСЕЬЬ 301 (производимой 1ВН). После культивирования при 37°С в течение 7 суток в инкубаторе с 5% СО2 культуральный супернатант извлекают. Химерные антитела против ССВ4 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки с Ргокер-А (производимой М1Шроге) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против ССВ4 называют химерными антителами КМ3060.
Когда методом ЕЫЗА измеряют активность связывания КМ2760-1 и КМ3060 с ССВ4, они показывают эквивалентную активность связывания.
4. Анализ очищенных химерных антител против ССВ4.
Каждый из двух видов химерных антител против ССВ4 (4 мкг), продуцированных разными животными клетками и выделенных из них в чистом виде, полученных в разделе 1 данного примера, подвергают ЗЭЗ-РЛСЕ согласно известному способу [№1иге, 227, 680 (1970)] и анализируют на молекулярную массу и степень очистки. В каждом из очищенных химерных антител против ССВ4 обнаруживают в условиях невосстановления одну полосу, соответствующую молекулярной массе примерно 150 кД, и в условиях восстановления две полосы примерно в 50 и 25 кД. Молекулярные массы почти сопадают с молекулярными массами, установленными из нуклеотидных последовательностей кДНК Н-цепи и Ь-цепи антитела (Н-цепь примерно 49 кД, Ь-цепь примерно 23 кД, вся молекула примерно 144 кД), и совпадают с сообщениями, утверждающими, что антитело типа ЦС имеет молекулярную массу примерно 150 кД в условиях невосстановления и распадается до Н-цепей с молекулярной массой примерно 50 кД и Ь-цепей с молекулярной массой примерно 25 кД в условиях восстановления из-за разрушения в молекуле дисульфидной связи (называемой далее связь 8-8) [Ап11Ьоб1е8: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬогаФгу, СЕар1ег 14, (1998); Мопос1опа1 АпйЬоб1е8: Рг1пс1р1ез апб Ргасбсе, Асабетк Рге§8 Ытйеб (1996)], причем таким образом подтверждается, что каждое химерное антитело против ССВ4 экспрессируется и очищается как молекула антитела с правильной структурой.
5. Получение химерных антител против ССВ4 с разной долей углеводных цепей без «-1,6-фукозы.
- 54 013224
Углеводные цепи, соединенные с химерными антителами против ССЕ4 КМ2760-1, полученными из клеток Υβ2/0, полученными в разделе 3(1) примера 8, и с химерными антителами против ССЕ4 КМ3060, полученными из клеток СНО/ЭО44, полученными в разделе 3(2) примера 8, анализируют согласно способу примера 10(6). Доля углеводных цепей без а-1,6-фукозы составляет 87 и 8% в КМ2760 и КМ3060 соответственно. Далее такие образцы называются химерными антителами против ССЕ4 (87%) и химерными антителами против ССЕ4 (8%).
Химерные антитела против ССЕ4 (87%) и химерные антитела против ССЕ4 (8%) смешивают в соотношении [химерные антитела против ССЕ4 (87%)]: [химерные антитела против ССЕ4 (8%)] = 1:39, 16:67, 22:57, 32:47 или 42:37. Углеводные цепи указанных образцов анализируют согласно способу примера 10(6). Доля углеводных цепей без а-1,6-фукозы составляет 9, 18, 27, 39 и 46% соответственно. Далее такие образцы называются химерными антителами против ССЕ4 (9%), химерными антителами против ССЕ4 (18%), химерными антителами против ССЕ4 (27%), химерными антителами против ССЕ4 (39%) и химерными антителами против ССЕ4 (46%).
Результаты анализа углеводных цепей каждого образца приводятся на фиг. 16. Доля углеводных цепей без а-1,6-фукозы показана как среднее значение результатов двух анализов углеводных цепей.
6. Оценка активности связывания с неполным пептидом ССЕ4 (ЕЬГ8А).
Активность связывания с неполным пептидом ССЕ4 шести видов различных химерных антител против ССЕ4 с разной долей углеводных цепей без а-1,6-фукозы, полученных в разделе 5 примера 8, измеряют согласно способу, описанному в разделе 2 примера 8.
В результате обнаружено, как видно на фиг. 17, что шесть видов химерных антител против ССЕ4 показывают почти одинаковую активность связывания с ССЕ4, и что доля углеводных цепей без а-1,6-фукозы не влияет на антигенсвязывающую активность антител.
7. Оценка АПСС-активности в отношении клеточной линии, хорошо экспрессирующей человеческий ССЕ4.
Л^СС-активность химерных антител против ССЕ4 против хорошо экспрессирующей человеческий ССЕ4 клеточной линии ССЕ4/ЕЭ-4 (ЛУО 01/64754) измеряют так, как описано далее.
(1) . Получение суспензии клеток-мишеней.
Получают клетки (1,5х106) экспрессирующей человеческий ССЕ4 клеточной линии ССЕ.4/ЕЬ-4, описанной в \УО 01/64754, и добавляют к ним эквивалент 5,55 МБк радиоактивного вещества М-ь^СгО.·! с последующим взаимодействием при 37°С в течение 1,5 ч, посредством чего клетки метятся радиоизотопом. По завершении реакции клетки три раза промывают, суспендируя их в среде с последующим центрифугированием, ресуспендируют в среде и затем инкубируют при 4°С в течение 30 мин на льду для осуществления спонтанного отделения радиоактивного вещества. После центрифугирования клетки доводят до содержания 2х105 клеток/мл, добавляя 7,5 мл среды, и используют в качестве суспензии клетокмишеней.
(2) . Получение суспензии человеческих эффекторных клеток.
У здорового человека берут 60 мл периферической крови, добавляют к ним 0,6 мл гепариннатрия (производимого 81ιίιηίζιι РНагтасеи11са1), и затем осторожно перемешивают. С использованием Ьутрйоргер (производимого АХГ8 8НГЕЬЭ) смесь центрифугируют (800 д, 20 мин) согласно инструкциям изготовителя для отделения слоя одноядерных клеток. Клетки промывают трехкратным центрифугированием (1400 об/мин, 5 мин) с использованием среды и затем снова суспендируют в среде, получают суспензию с плотностью клеток 5х106 клеток/мл и используют в качестве суспензии человеческих эффекторных клеток.
(3) . Измерение АЭСС-активности.
Суспензию клеток-мишеней, полученную в (1), распределяют по 50 мкл (1х104 клеток/лунку) в каждую лунку 96-луночного планшета с И-образными лунками (производимого Еа1соп). Затем в лунки добавляют 100 мкл суспензии человеческих эффекторных клеток, полученной в (2) (5х105 клеток/лунку, отношение человеческих эффекторных клеток к клеткам-мишеням составляет 50:1). Затем добавляют каждое из химерных антител против ССЕ4, получают конечную концентрацию от 0,0001 до 10 мкг/мл, и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 4 ч. По завершении реакции планшет центрифугируют и измеряют количество 51Сг в супернатанте с использованием счетчика у-квантов. Количество спонтанно отделившегося 51Сг вычисляют с помощью той же процедуры, используя одну среду вместо суспензии человеческих эффекторных клеток и раствора антител, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. Количество общего отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя ту же процедуру с использованием 1 моль/л соляной кислоты вместо раствора антител и суспензии человеческих эффекторных клеток, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. Л^СС-активность (%) вычисляют на основании уравнения (ГГ).
Фиг. 18 и 19 показывают результаты измерения АЭСС-активности химерных антител против ССЕ4 с различной долей углеводных цепей без а-1,6-фукозы в разных концентрациях (0,001-10 мкг/мл) с использованием эффекторных клеток двух здоровых доноров (А и В) соответственно. Как видно на фиг. 18 и 19, АЭСС-активность химерных антител против ССЕ4 проявляет тенденцию повышаться пропорционально доле углеводных цепей без а-1,6-фукозы при каждой концентрации антител. АЭСС-активность
- 55 013224 снижается, когда концентрация антител низкая. При концентрации антител 0,01 мкг/мл антитела, в которых доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы составляет 27, 39 или 46%, показывают почти одинаковую сильную АЭСС-активность, но АЭСС-активность низкая у антител, в которых доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы менее 20%. Получают такие же результаты, когда заменяют донора эффекторных клеток.
Пример 9. Определение продукта транскрипции гена α-1,6-фукозилтрансферазы в линии клетокхозяев.
(1) . Получение одноцепочечной кДНК из различных клеточных линий.
Образцы одноцепочечной кДНК получают из клеток 0ΉΟ/Ο644 с устраненным геном дигидрофолатредуктазы (бЫг), полученных из яичника китайского хомячка, и клеток миеломы крысы ΥΒ2/0 процедурой, описанной далее.
Клетки СНΟ/^С44 суспендируют в среде 1МОМ (производимой Ьйе ТесЬпо1од1ек) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (производимой Ьйе ТесЬпо1од1ек) и добавки НТ концентрации 1х (производимой Ьйе ТесЬпо1од1ек) и 15 мл суспензии инокулируют в колбу Т75 для адгезионного культивирования клеток (производимую Сгетег) при плотности 2х105 клеток/мл. Также клетки ΥΒ2/0 суспендируют в среде ЯРМ1 1640 (производимой Ь1£е ТесЬпо1од1ек) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (производимой Ь1£е ТесЬпо1од1ек) и 4 ммоль/л Е-СЕ-Ν (производимого Ьйе ТесЬпо1од1ек) и 15 мл суспензии инокулируют в колбу Т75 для суспензионного культивирования клеток (производимую Сгетег) при плотности 2х105 клеток/мл. Клетки культивируют при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 и 1х107 соответствующих клеток-хозяев извлекают в 1-й, 2-й, 3-й, 4-й и 5-й день культивирования, экстрагируют полную РНК с использованием ЯNΑкеаку (производит О1АСЕХ) согласно инструкциям изготовителя.
Полную РНК растворяют в 45 мкл стерильной воды, добавляют к раствору 1 мкл Е01 Япаке-Егее Э№1кс (производимой Рготеда), 5 мкл приложенного 10х буфера для ДНКазы и 0,5 мкл ингибитора рибонуклеазы ЯЫакт (производимого Рготеда), и затем проводят взаимодействие при 37°С в течение 30 мин для разрушения геномной ДНК в образце как примеси. По завершении реакции полную РНК очищают вновь с использованием ЯNΑеаку (производимой О1АСЕХ) и растворяют в 50 мкл стерильной воды.
В 20 мкл реакционной смеси с использованием олиго(бТ) в качестве праймера синтезируют одноцепочечную кДНК из 3 мкг образца каждой полученной полной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием системы предварительной амплификации 8иРЕЯ8СЯ1РТ™ для синтеза первой цепи кДНК (производимой Ьйе ТесЬпо1од1ек) и согласно инструкциям изготовителя. Реакционный раствор концентрации 1х используют для клонирования α-1,6-фукозилтрансферазы (иногда называемой далее ЕиТ8) и β-актина, полученных из соответствующих клеток-хозяев, и водный раствор разведенного в 50 раз реакционного раствора используют для определения уровня транскрипции каждого гена методом конкурентной ПЦР, и раствор хранят до применения при -80°С.
(2) . Получение неполных фрагментов кДНК ЕИТ8 китайского хомячка и крысиной ЕИТ8.
Каждый неполный фрагмент кДНК ЕИТ8 китайского хомячка и крысиной ЕИТ8 получают следующей процедурой (фиг. 20).
Сначала создают праймеры (показанные в 8ЕЦ Ш ΝΟ: 4 и 5), специфические для нуклеотидных последовательностей, обычных для кДНК ЕИТ8 человека |Л. ВтсНет., 121, 626, (1997)] и кДНК ЕИТ8 свиньи [I. Вю1. СНет., 221, 27810 (1995)].
Затем получают 25 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8йи7о), 0,2 ммоль/л бИТР и 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕЦ Ш ΝΟ: 4 и 5)], содержащего 1 мкл каждой кДНК, полученной из клеток СНО, и кДНК, полученной из клеток ΥΒ2/0 - обе получены в разделе (1) через 2 дня после культивирования, и осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81шхо). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин как едином цикле, и заключительном нагреванием при 72°С в течение 10 мин.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и очищают специфический амплифицированный фрагмент в 979 п.о. с использованием набора СЕХЕСЕЕАХ 8рт (производимого ВЮ 101) и элюируют 10 мкл стерильной воды (далее указанный способ используют для очистки фрагментов ДНК из агарозного геля). Используют 4 мкл амплифицированного фрагмента для встраивания в плазмиду рСЯ2.1 согласно инструкциям изготовителя набора ТОРО ТА С1ошпд (производимого Гпуйгодеп) и трансформируют реакционным раствором Е. сой ХЬ1-В1ие согласно способу Со1еп е1 а1. [Ргос. Νη11. Асаб. 8сг И8А, 69, 2110 (1972)] (далее для трансформации Е. сой используют такой способ). Образцы плазмидной ДНК выделяют из 6 клонов со встроенной кДНК из числа полученных невосприимчивых к канамицину колоний согласно известному способу [ИисШс Ас1бк Яекеагсй, 7, 1513, (1979)] (далее для выделения плазмиды используют указанный способ).
Нуклеотидную последовательность каждой кДНК, встроенной в плазмиду, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) и набора В1дПуе ТегттаЮг Сус1е 8едиепстд
- 56 013224
Р8 Кеабу Кеасйои (производимого Регкт Е1тег) согласно способу, изложенному в инструкциях изготовителей. Подтверждается, что все встроенные кДНК, последовательности которых определяют указанным способом, кодируют неполные последовательности открытой рамки считывания (0КР) РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8 (показанные в 8ЕР ΙΌ N0:6 и 7). Из них отбирают образцы плазмидных ДНК, совершенно не содержащих в последовательностях ошибок считывания ПЦР. В данном случае такие плазмиды называют СНРиТ8-рСК2.1 и УВРиТ8-рСК2.1.
(3) . Получение кДНК β-актина китайского хомячка и крысиного β-актина.
Получают кДНК β-актина китайского хомячка и крысиного β-актина процедурой, описанной далее (фиг. 21).
Сначала из геномной последовательности β-актина китайского хомячка (СеиВаик, И20114) и геномной последовательности крысиного β-актина Щи^ею Аабй Кейеагсй, 11, 1759 (1983)] создают прямой праймер, специфический для обычной последовательности, содержащей кодон инициации трансляции (показана в 8ЕР ΙΌ N0:8), и обратные праймеры, специфические для соотвествующих последовательностей, содержащих кодон терминации трансляции (показаны в 8ЕР ΙΌ N0:9 и 10).
Затем получают 25 мкл реакционного раствора [буфер Κ0Ό #1 (производимый ТоуоЬо), 0,2 ммоль/л бЭТР, 1 ммоль/л МдС12, 0,4 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕР ΙΌ N0:8 и 9 или 8ЕО ΙΌ N0:8 и 10) и 5% ДМСО], содержащего 1 мкл каждой кДНК, полученной из клеток СНО, и кДНК, полученной из клеток УВ2/0 - обе получены в разделе (1) через 2 дня после культивирования, и осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Κ0Ό (производимой ТоуоЬо). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 25 циклами нагревания при 98°С в течение 15 с, 65°С в течение 2 с и 74°С в течение 30 с как едином цикле.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и очищают специфический амплифицированный фрагмент в 1128 п.о. Фрагмент ДНК подвергают 5'-концевому фосфорилированию ДНК с использованием МЕСАЬАВЕЬ (производит Такага 81шхо) согласно инструкциям изготовителя. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора с использованием способа осаждения этанолом и растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Отдельно 3 мкг плазмиды рВ1ие5спр! ΙΙ К8(+) (производимой 8!га!адеие) растворяют в 35 мкл НЕВиГГег 2 (производимого №\ν Еид1аиб Вю1аЬй) и добавляют к раствору 16 единиц рестриктазы ЕсоКУ (производимой Такага 81шхо) для осуществления реакции расщепления при 37°С в течение 3 ч. К реакционному раствору добавляют 35 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,5 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. со11 С15 (производимой Такага 8йи7о), и затем осуществляют взаимодействие при 65°С в течение 30 мин для дефосфорилирования посредством этого конца ДНК. Реакционный раствор экстрагируют смесью фенол/хлороформ, затем осаждают этанолом и извлеченный фрагмент ДНК растворяют в 100 мкл стерильной воды.
Каждые 4 мкл амплифицированного фрагмента, полученного из кДНК китайского хомячка, или амплифицированного фрагмента (1192 п.о.), полученного из кДНК крысы, смешивают с 1 мкл фрагмента ЕсоКУ-ЕсоКУ (примерно 3,0 т.п.о.), полученного из плазмиды рВ1ие5спр1 ΙΙ К8(+), и 5 мкл Ыдайои Н1дй (производимого ТоуоЬо) для реакции лигирования, осуществляемой при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. со11 ХЫ-ВЫе и из полученных невосприимчивых к ампициллину клонов, соответственно, выделяют образцы плазмидной ДНК известным способом.
Нуклеотидную последовательность каждой кДНК, встроенной в плазмиду, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) и набора ВрЭуе ТегттаЮг Сус1е 8едиеистд Р8 Кеабу Кеасйои (производимого Регкт Е1тег) согласно способу, изложенному в инструкциях изготовителей. Подтверждается, что все встроенные кДНК, последовательности которых определяют указанным способом, кодируют полные последовательности 0КР β-актина китайского хомячка или β-актина крысы. Из них отбирают образцы плазмидных ДНК, совершенно не содержащих в последовательностях ошибок считывания оснований методом ПЦР. В данном случае такие плазмиды называют СНАс-рВ8 и УВАс-рВ8.
(4) . Получение эталона РИТ8 и внутреннего стандарта.
Для того чтобы измерить уровень транскрипции мРНК гена РИТ8 в каждом виде клеток, СНРТ8рСК2.1 и УВРТ8-рСК2.1 как плазмиды, в которых в рСК2.1 встроены, соответственно, полученные в разделе (2) неполные фрагменты РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8 расщепляют рестриктазой ЕсоКЗ, и полученные линейные ДНК используют в качестве эталонов для получения калибровочной кривой. СНРТ8б-рСК2.1 и УВРТ8б-рСК2.1, полученные из СНРТ8-рСК2.1 и УВРТ8-рСК2.1 делецией 203 п.о. между 8са! и НтбШ, внутренние нуклеотидные последовательности РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8, соответственно, расщепляют рестриктазой ЕсоК! и полученные линейные ДНК используют в качестве внутренних стандартов для определения количества РИТ8. Подробности описаны ниже.
Эталоны РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8 получают следующим образом. В 40 мкл №ЕВиГГег 2 (производимого №\ν Еид1аиб Вю1аЬй) растворяют 2 мкг плазмиды СНРТ8-рСК2.1, добавляют к раствору 24 единицы рестриктазы ЕсоК! (производимой Такага 81шхо) и затем осуществляют расщепление при 37°С в течение 3 ч. Отдельно 2 мкг плазмиды УВЕТ8-рСК2.1 растворяют в 40 мкл НЕВиЕГег 2
- 57 013224 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), добавляют к раствору 24 единицы рестриктазы ΕсοРI (производимой Такага Зйихо) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Когда часть каждого реакционного раствора подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле, подтверждается, что фрагмент ΕсοРI-ΕсοРI (примерно 1 т.п.о.), содержащий каждый из неполных фрагментов кДНК ЕиТ8 китайского хомячка и крысиной ЕиТ8, отделен от плазмид СНЕТ8-рСР2.1 и УВЕТ8-рСР2.1 реакциями расщепления рестриктазами. Каждый из реакционных растворов разбавляют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой ЗЮМА), получают концентрацию 0,02, 0,2, 1, 2, 10, 20 и 100 фг/мкл и используют в качестве эталонов ЕиТ8 китайского хомячка и крысиной ЕиТ8.
Внутренние стандарты ЕиТ8 китайского хомячка и крысиной ЕиТ8 получают следующим образом (фиг. 22). Получают реакционный раствор [буфер Κ0Ό #1 (производимый ТоуоЬо), 0,2 ммоль/л йЭТР, 1 ммоль/л МдС12, 0,4 мкмоль/л генспецифических праймеров (ЗЕО ΙΌ N0:11 и 12) и 5% ДМСО], содержащий 5 нг СНЕТ8-рСР2.1 или УВЕТ8-рСР2.1, и осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Κ0Ό (производимой ТоуоЬо). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 4 мин с последующими 25 циклами нагревания при 98°С в течение 15 с, 65°С в течение 2 с и 74°С в течение 30 с как едином цикле. После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и очищают специфический амплифицированный фрагмент в 4,7 т.п.о. Фосфорилируют 5'-конец ДНК с использованием МЕСАЬАВЕЬ (производит Такага Зйихо) согласно инструкциям изготовителя и затем фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора с использованием способа осаждения этанолом и растворяют в 50 мкл стерильной воды. Полученный фрагмент ДНК (5 мкл, примерно 4,7 т.п.о.) и 5 мкл Ыдайои Н1дй (производит ТоуоЬо) смешивают и затем проводят реакцию самоциклизации при 16°С в течение 30 мин.
С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ЭН5а и из полученных невосприимчивых к ампициллину клонов выделяют образцы плазмидной ДНК согласно известному способу. Нуклеотидную последовательность каждой плазмидной ДНК определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) и набора В1дЭуе ТегттаГог Сус1е Зециеистд ЕЗ Реайу РеасГюи (производимого Регкт Е1тег) и подтверждается, что внутренняя нуклеотидная последовательность в 203 п.о. между ЗсаI и НшйШ ЕиТ8 китайского хомячка крысиной ЕиТ8 удалена. Полученные плазмиды называют СНЕТ8й-рСР2.1 или УВЕТ8й-рСР2.1 соответственно.
Затем 2 мкг плазмиды СНЕТ8й-рСР2.1 растворяют в 40 мкл ХЕВиНс!· 2 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), добавляют к раствору 24 единицы рестриктазы ΕсοРI (производимой Такага Зйихо) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Отдельно 2 мкг плазмиды УВЕТ8й-рСР2.1 растворяют в 40 мкл NΕΒиГГе^ 2 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), добавляют к раствору 24 единицы рестриктазы ΕсοРI (производимой Такага Зйихо) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Когда часть каждого реакционного раствора подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле, подтверждается, что фрагмент ΕсοРI-ΕсοРI (примерно 800 п.о.), содержащий фрагмент, из которого удалены 203 п. о. внутренних нуклеотидных последовательностей неполных фрагментов ЕиТ8 китайского хомячка или крысиной ЕиТ8, отделен от плазмид СНЕТ8й-рСР2.1 или УВЕТ8й-рСР2.1 реакциями расщепления рестриктазами. Из реакционных растворов получают разведения 2 фг/мл с использованием 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой ЗЮМА) и используют в качестве внутренних стандартов ЕиТ8 китайского хомячка или крысиной ЕиТ8.
(5). Получение эталона и внутреннего стандарта β-актина.
Для того чтобы измерить уровень транскрипции мРНК гена β-актина в разных клетках-хозяевах, СНАс-рВЗ и УВАс-рВЗ как плазмиды, в которых в рВ1иекспрГ ΙΙ КЗ (+) встроены полноразмерные 0РЕ каждой кДНК β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, соответственно, полученные в разделе (3), расщепляют рестриктазами НшйШ и РкП и рестриктазами НшйШ и Крик соответственно, и расщепленные линейные ДНК используют в качестве эталонов для получения калибровочной кривой. СНАсй-рВЗ и УВАсй-рВЗ, полученные из СНАс-рВЗ и УВАс-рВЗ делецией 180 п.о. между ЭгаШ и ЭгаШ внутренней нуклеотидной последовательности β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, расщепляют рестриктазами НшйШ и РкП и рестриктазами НшйШ и Крик соответственно, и расщепленные линейные ДНК используют в качестве внутренних стандартов для определения количества β-актина. Подробности описаны ниже.
Эталоны β-актина китайского хомячка и β-актина крысы получают следующим образом. В 40 мкл кЕВиЛс!· 2 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк) растворяют 2 мкг плазмиды СНАс-рВЗ, добавляют к раствору 25 единиц рестриктазы НшйШ (производимой Такага Зйихо) и 20 единиц рестриктазы РкП (производимой Такага Зйихо) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Отдельно 2 мкг плазмиды УВАс-рВЗ растворяют в 40 мкл NΕΒиГ!е^ 2 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), к раствору добавляют 25 единиц рестриктазы НшйШ (производимой Такага Зйихо) и 25 единиц рестриктазы Крй (производимой Такага Зйихо) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Часть каждого реакционного раствора подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и подтверждается, что фрагмент НтйШ-РШ и фрагмент Нт^И-Кр^ (примерно 1,2 т.п.о.), содержащие полноразмерную 0РЕ каждой кДНК β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, отделены от плаз
- 58 013224 мид СНАс-рВ8 и УВАс-рВ8 реакциями расщепления рестриктазами. Каждый из реакционных растворов разбавляют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой 8ЮМА), получают концентрации 2, 1 пг/мкл, 200, 100 и 20 фг/мкл и используют в качестве эталонов β-актина китайского хомячка и β-актина крысы.
Внутренние стандарты β-актина китайского хомячка и β-актина крысы получают следующим образом (фиг. 23). В 100 мкл ХЕВцйег 3 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), содержащего 100 нг/мкл В8А (производимого №\ν ЕпДапб Рюк-Фз), растворяют 2 мкг СНАс-рВ8, добавляют к раствору 10 единиц рестриктазы БгаШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬз) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Осаждением этанолом из реакционного раствора извлекают фрагменты ДНК, концы ДНК заменяют на затупленные концы с использованием набора БНА В1ипбпд (производимого Такага 81ιιιζο) согласно инструкциям изготовителя и затем реакционный раствор делят на две равные части. Сначала к одной части реакционного раствора добавляют 35 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,5 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. той С15 (производимой Такага 8Ηυζο), и затем осуществляют взаимодействие при 65°С в течение 30 мин для дефосфорилирования концов ДНК. Фрагмент ДНК извлекают, осуществляя обработку дефосфорилированием, экстрагирование смесью фенол/хлороформ и обработку осаждением этанолом, и затем растворяют его в 10 мкл стерильной воды. Остальную часть реакционного раствора подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле для очистки фрагмента ДНК примерно в 1,1 т.п.о., содержащего неполный фрагмент ОВР β-актина китайского хомячка.
Дефосфорилированный фрагмент БгаШ-БгаШ (4,5 мкл), 4,5 мкл фрагмента БгаШ-БгаШ в примерно 1,1 т.п.о. и 5 мкл Ь1да1юп Шдй (производит ТοуοЬο) смешивают и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. Используя реакционный раствор, трансформируют Е. сο1^ БН5« и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидные ДНК согласно известному способу. Определяют нуклеотидную последовательность каждой плазмидной ДНК с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Ρе^к^η Е1тег) и набора В1дБуе ТегттаЮг Сус1е 8ес.|иепсйщ Р8 Веабу Веас1юп (производимого Ρе^к^η Е1тег) и подтверждается, что 180 п.о. БгаШ-БгаШ β-актина китайского хомячка, встроенного в плазмиду, удалены. Плазмиду называют СНАсб-рВ8.
Также плазмиду, из которой удален БгаШ-БгаШ в 180 п.о. β-актина крысы, получают через те же стадии получения СНАсб-рВ8. Плазмиду называют УВАсб-рВ8.
Далее, 2 мкг плазмиды СНАсб-рВ8 растворяют в 40 мкл НЕВиГГег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬз), добавляют к раствору 25 единиц рестриктазы НтбШ (производимой Такага 81ιιιζο) и 20 единиц рестриктазы ΡδΒ (производимой Такага 81ιιιζο) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Отдельно 2 мкг плазмиды УВАсб-рВ8 растворяют в 40 мкл НЕВиГГег 2 (производимого №\ν ЕпДапб Вю1аЬз), добавляют к раствору 25 единиц рестриктазы НтбШ (производимой Такага 81ιιιζο) и 24 единицы рестриктазы Крп! (производимой Такага 81ιιιζο) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Часть каждого реакционного раствора подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и подтверждается, что фрагмент НтЛИ-ЕШ и фрагмент НшбШ-Крп! (примерно 1,0 т.п.о.), содержащие фрагмент, в котором удалены 180 п.о. внутренней нуклеотидной последовательности полноразмерной ОВР каждой кДНК β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, отделены от плазмид СНАсб-рВ8 и УВАсб-рВ8 реакциями расщепления рестриктазами. Из реакционных растворов получают разведения 200 фг/мл с использованием 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой 8ЮМА), и используют в качестве внутренних стандартов β-актина китайского хомячка и β-актина крысы.
(6). Определение уровня транскрипции методом конкурентной ПЦР.
Конкурентную ПЦР осуществляют с использованием в качестве матриц ДНК внутреннего стандарта РИТ8, полученного в разделе (4), и кДНК, полученной от клетки-хозяина, полученной в разделе (1), определяемое содержание продукта транскрипции РИТ8 в линии клеток-хозяев вычисляют из относительного содержания продукта амплификации, полученного с каждой матрицы. С другой стороны, так как считается, что ген β-актина непрерывно транскрибируется в каждой клетке и уровень его транскрипции в клетках приблизительно одинаковый, уровень транскрипции гена β-актина определяют как меру эффективности реакции синтеза кДНК в каждой линии клеток-хозяев. Иными словами, ПЦР осуществляют с использованием в качестве матриц ДНК внутреннего стандарта β-актина, полученного в разделе (5), и кДНК, полученной от клетки-хозяина, полученной в разделе (1), определяемое содержание продукта транскрипции β-актина в линии клеток-хозяев вычисляют из относительного содержания продукта амплификации, полученного с каждой матрицы. Подробности описаны ниже.
Продукт транскрипции РИТ8 определяют следующей процедурой. Сначала создают набор специфических к последовательностям праймеров (показаны в 8ЕЦ Ю NΟ:13 и 14), обычных для внутренних последовательностей неполных последовательностей ОВР РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8, полученных в разделе (2).
Затем осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81ιιιζο) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер ЕхТад (производимый Такага 8Ηυζο), 0,2 ммоль/л
- 59 013224 бЫТР, 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕЦ ГО ΝΟ:13 и 14) и 5% ДМСО], содержащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК, полученной из каждой соответствующей клеточной линии в разделе (1), и 5 мкл (10 фг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 32 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин как едином цикле.
Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов, где вместо кДНК, полученной из каждой линии клеток-хозяев, добавляют 5 мкл (0,1, 1, 5, 10, 50, 100, 500 фг или 1 пг) плазмиды эталона РИТ8, полученной в разделе (4), и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции РИТ8.
Продукт транскрипции β-актина определяют следующей процедурой. Сначала создают два набора соответствующих генспецифических праймеров, обычных для внутренних последовательностей полноразмерных ОКР β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, полученных в разделе (3) (первые показаны 8ЕО ГО ΝΟ:15 и 16, и последние показаны 8ЕЦ ГО ΝΟ:17 и 18).
Затем осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Е.хТас.| (производимой Такага 81шхо) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер Е.хТас.| (производимый Такага ЗНи/о), 0,2 ммоль/л бЭТР, 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕЦ ГО ΝΟ:15 и 16 или 8ЕЦ ГО ΝΟ:17 и 18) и 5% ДМСО], содержащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК, полученной из соответствующей клеточной линии в разделе (1), и 5 мкл (1 пг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 17 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин как едином цикле.
Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов, где вместо кДНК, полученной из каждой линии клеток-хозяев, добавляют 5 мкл (10, 5, 1 пг, 500 или 100 фг) плазмиды эталона β-актина, полученной в разделе (5), и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции β -актина.
Таблица 3
Ген-мишень набор праймеров* Размер (п.о.) продукта амплификации ПЦР
Мишень Конкурент
гит 8 г: 5' -бтссАтсстсАтсстссАстетее-з' Й: 5'-САССААТ6АТАТСТССА56ТТСС-3' 638 431
β-актин {кит.X) Г: 5'-САТАТСССТССССТССТТСТССАС-З' К; 5'-САЗСААССААСССТССААААСАСС-3' 789 609
β-актин (крыса) Г ·. 5' -САТАТСССТССССТСбТССТСбАС- 3' Е: 5'-САбСААеСААСССТССААСАСАСС-З' 789 609
*Р: прямой праймер, К: обратный праймер.
Путем осуществления ПЦР с использованием набора праймеров, описанного в табл. 3, можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Мишень табл. 3, из каждого продукта транскрипции гена и каждого эталона, и можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Конкурент табл. 3, из каждого внутреннего стандарта.
Каждый раствор (7 мкл) после ПЦР подвергают электрофорезу в 1,75% агарозном геле и затем гель окрашивают, замачивая его в течение 30 мин в 8ΥВК Сгееп I №.1с1е1с Ас1б Се1 8!аш (производит Мо1еси1аг РгоЬек) концентрации 1 х. Количество амплифицированного фрагмента ДНК измеряют, вычисляя интенсивность люминесценции каждой амплифицированной ДНК с использованием формирователя флуороизображения (Р1иог1шадег 8Σ; производится Мо1еси1аг Оупатю).
Количество амплифицированного продукта, полученного ПЦР с использованием плазмиды эталона в качестве матрицы, измеряют тем же способом и получают калибровочную кривую, откладывая измеренные количества против количества плазмиды эталона. С использованием калибровочной кривой из количества амплифицированного продукта, когда в качестве матрицы используют каждую кДНК, полученную из экспрессирующей клеточной линии, вычисляют количество кДНК гена, представляющего интерес, в каждой клеточной линии, и полученное количество определяют как уровень транскрипции мРНК в каждой клеточной линии.
Количество продукта транскрипции РИТ8 в каждой линии клеток-хозяев, когда в эталоне и внутреннем стандарте используют последовательность крысиной РИТ8, показано на фиг. 24. На протяжении периода культивирования клеточная линия СНО показывает уровень транскрипции в 10 или более раз более высокий, чем уровень транскрипции для клеточной линии ΥВ2/0. Такая тенденция также отмечается, когда в эталоне и внутреннем стандарте используют последовательность РИТ8 китайского хомячка.
Также уровни транскрипции РИТ8 приводятся в табл. 4 как относительные величины количества
- 60 013224 продукта транскрипции β-актина. На протяжении периода культивирования уровень транскрипции РИТ8 в клеточной линии УВ2/0 составляет примерно 0,1% уровня β-актина, в то время как в клеточной линии СНО он составляет 0,5-2%.
Результаты показывают, что количество продукта транскрипции в клеточной линии УВ2/0 существенно меньше, чем количество продукта транскрипции в клеточной линии СНО.
Таблица 4
Клеточная линия Дни культивирования
1-ий 2-ой 3-ий 4-ый 5-ый
СНО 1,95 0,90 0,57 0,52 0,54
ΪΒ2/0 0,12 0,11 0, 14 0,08 0,07
Пример 10. Определение продукта транскрипции гена α-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8) в клеточной линии, продуцирующей химерные антитела против ганглиозида СЭ3.
(1) . Получение одноцепочечной кДНК из различных клеточных линий, продуцирующих антитела.
Одноцепочечную кДНК получают из продуцирующих химерные антитела против ганглиозида СЭ3 клеточных линий ЭСНЮ1-20 и 61-33 следующим образом. ЭСНЮ1-20 представляет собой клон трансформанта, полученный из клеток СНО/ЭС44, описанный в разделе 2(2) примера 1. Также клон 61-33 представляет собой клон, полученный осуществлением бессывороточной адаптации клеточного трансформанта 7-9-51, полученного из УВ2/0 (РЕВМ ВР-6691, Шегпабопа! Ра!еп! Огдашкт Эерокйагу, Νι!юпа1 ШкиШе οί Абуапсеб ШбикМа! 8с1епсе апб ТесЬпо1оду (АКТ ТкикиЬа Сепба1 6, 1-1, Н1дакЬ1 1-СЬоте ТкикиЬа-кЫ, Катакз-кеп 305-8566, 1арап)), с последующим осуществлением выделения отдельной клеточной линии двумя ограничивающими разведениями.
Клетки ЭСНЮ1-20 суспендируют в среде ЕХСЕЬЬ 302 (производимой 1ВН ВIО8СIΕNСΕ8) с добавлением 3 ммоль/л (производимого ЫГе ТесЬпо1од1ек), 0,3% плюроника Р-68 (производимого
ЫГе ТесЬпо1од1ек) и 0,5% концентрата жирной кислоты (производимого ЫГе ТесЬпо1од1ек) и 15 мл суспензии инокулируют в колбу Т75 для суспензионного культивирования клеток (производимую Сгетег) при плотности клеток 2х105 клеток/мл. Также клетки 61-33 суспендируют в среде НуЬпбота-8РМ (производимой ЫГе ТесЬпо1од1ек) с добавлением 0,2% бычьего сывороточного альбумина (производимого ЫГе ТесЬпо1од1ек) (называемого далее В8А) и 15 мл суспензии инокулируют в колбу Т75 для суспензионного культивирования клеток (производимую Сгетег) при плотности клеток 2х105 клеток/мл. Клетки культивируют при 37°С в инкубаторе с 5% СО2, в 1, 2, 3, 4 и 5 дни культивирования извлекают 1 х 107 соответствующих клеток-хозяев и экстрагируют полную РНК с использованием ВNΑеаку (производит РЫСЕЩ согласно инструкциям изготовителя.
Полную РНК растворяют в 45 мкл стерильной воды и к раствору добавляют 1 мкл В^I ВЫаке-РгееЭ№ке (производимой Рготеда), 5 мкл прилагаемого буфера для ДНКазы 10х и 0,5 мкл ингибитора рибонуклеазы В№кш (производимого Рготеда) и затем проводят взаимодействие при 37°С в течение 30 мин для разрушения геномной ДНК, являющейся примесью в образце. По завершении реакции полную РНК очищают снова с использованием ВNΑеаку (производит ЦЫСЕХ) и растворяют в 50 мкл стерильной воды.
В 20 мкл реакционной смеси с использованием олиго(бТ) в качестве праймера синтезируют одноцепочечную кДНК из 3 мкг образца каждой полученной полной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием системы предварительной амплификации 8иРЕВ8СВГРТ™ для синтеза первой цепи кДНК (производимой ЫГе ТесЬпо1од1ек) и согласно инструкциям изготовителя. Реакционный раствор разводят в 50 раз водой и хранят до применения при -80°С.
(2) . Определение уровней транскрипции каждого гена конкурентной ПЦР.
Уровень транскрипции каждого гена в кДНК, полученной из клеточной линии, продуцирующей антитела, полученной в разделе (1), определяют конкурентной ПЦР согласно примеру 9(6).
Уровень транскрипции мРНК, полученной из гена РИТ8, в каждой клеточной линии, продуцирующей антитела, определяют следующей процедурой.
СНРТ8-рСВ2.1 и УВРТ8-рСВ2.1 как плазмиды, в которых в рСВ2.1 встроены неполные фрагменты кДНК, полученные в примере 9(2) из РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8, соответственно, расщепляют рестриктазой ΕсοВI и полученные линейные ДНК используют в качестве эталонов при получении калибровочной кривой для определения уровня транскрипции РИТ8.
СНРТ8б-рСВ2.1 и УВРТ8б-рСВ2.1, полученные в примере 9(4) делецией 203 п.о. между 8а^ и НтбШ внутренней нуклеотидной последовательности РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8, соответственно, расщепляют рестриктазой ЕсоВ! и полученные линейные ДНК используют в качестве внутренних стандартов при получении калибровочной кривой для определения количества РИТ8.
ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81шхо) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8Ьи/о), 0,2 ммоль/л бЭТР, 0,5 мкмоль/л праймеров, специфических для гена РИТ8 (8ЕЦ ГО NО:13 и 14) и 5% ДМСО], содер
- 61 013224 жащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК, полученной из каждой клеточной линии, продуцирующей антитела, полученной в разделе (1), и 5 мкл (10 фг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 32 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин как едином цикле.
Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов, где вместо кДНК, полученной из каждой клеточной линии, продуцирующей антитела, добавляют 5 мкл (0,1, 1, 5, 10, 50, 100, 500 или 1 пг) плазмиды эталона ЕИТ8 и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции ЕИТ8. В данном случае для разведения эталонной плазмиды используют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимую 81СМА).
С другой стороны, так как считается, что ген β-актина постоянно транскрибируется в каждой клетке, и уровень его транскрипции в клетках приблизительно одинаковый, уровень транскрипции β-актина определяют как показатель эффективности реакции синтеза кДНК в каждой клеточной линии, продуцирующей антитела.
СНАс-рВ8 и УВАс-рВ8 как плазмиды, полученные в примере 9(3), в которых в рВ1иексг1р( II К8(+) встроены полноразмерные 0КР каждой кДНК β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, соответственно, расщепляют рестриктазами НшбШ и Крп1 и рестриктазами НшбШ и Крп1 и образцы полученных линейных ДНК используют в качестве эталонов при получения калибровочной кривой для определения уровня транскрипции β-актина.
СНАсб-рВ8 и УВАсб-рВ8, полученные в примере 9(5) делецией 180 п.о. между Эга1 и Эга1 внутренней нуклеотидной последовательности β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, соответственно, расщепляют рестриктазами НшбШ и Крп1 и полученные линейные ДНК используют в качестве внутренних стандартов для определения количества β-актина.
ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы Е.хТас.| (производимой Такага 81шхо) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер Е.хТац (производимый Такага Чш/о), 0,2 ммоль/л бЭТР, 0,5 мкмоль/л праймеров, специфических для β-актина (8ЕО ΙΌ N0:17 и 18) и 5% ДМСО], содержащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК, полученной из каждой клеточной линии, продуцирующей антитела, и 5 мкл (1 пг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 17 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин как едином цикле. Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов, где вместо кДНК, полученной из каждой клеточной линии, продуцирующей антитела, добавляют 10, 5, 1 пг, 500 или 100 фг эталонной плазмиды β-актина и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции β-актина. В данном случае для разведения эталонной плазмиды используют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой 81СМА).
Путем осуществления ПЦР с использованием набора праймеров, описанного в табл. 3, можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Мишень табл. 3, из каждого продукта транскрипции гена и каждого эталона и можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Конкурент табл. 3, из каждого внутреннего стандарта.
Каждый раствор (7 мкл) после ПЦР подвергают электрофорезу в 1,75% агарозном геле и затем гель окрашивают, замачивая его в течение 30 мин в 8УВК Сгееп I №с1ею Ас1б Се1 81аш (производит Мо1еси1аг Ргоуек) концентрации 1 х. Количество амплифицированного фрагмента ДНК измеряют, вычисляя интенсивность люминесценции каждой амплифицированной ДНК с использованием формирователя флуороизображения (Е1иог1тадег 8Ι; производится Мо1еси1аг Оупатю).
Количество амплифицированного продукта, полученного ПЦР с использованием эталонной плазмиды в качестве матрицы, измеряют тем же способом и получают калибровочную кривую, откладывая измеренные количества против количества эталонной плазмиды. С использованием калибровочной кривой из количества амплифицированного продукта, когда в качестве матрицы используют каждую кДНК, полученную из экспрессирующей клеточной линии, вычисляют количество кДНК гена, представляющего интерес, в каждой клеточной линии и полученную величину определяют как уровень транскрипции мРНК в каждой клеточной линии.
Уровни транскрипции ЕИТ8 приводятся в табл. 5 как относительные величины количества продукта транскрипции β-актина. На протяжении периода культивирования уровень транскрипции ЕИТ8 в продуцирующей антитела клеточной линии 61-33, полученной из клеток УВ2/0, составлет примерно 0,3% или меньше от уровня β-актина, в то время как в клетках, продуцирующих антитела, полученных из клеток СНО, он составляет 0,7-1,5%.
Результаты показывают, что количество продукта транскрипции в продуцирующей антитела клеточной линии, полученной из клеток УВ2/0, существенно меньше, чем количество продукта транскрипции в клетках, продуцирующих антитела, полученных из клеток СНО.
- 62 013224
Таблица 5
Клеточная линия Дни культивирования
1-ий 2-ой 3-ий 4-ый 5-ый
ОСНЮ1-20 0,75 0, 73 0, 99 1,31 1, 36
61-33 0,16 0,19 0,24 0,38 <0,10
Пример 11. Получение клеточной линии, сверхэкспрессирующей ген мышиной α-06-фукозилтрансферазы (ЕИТ8).
(1). Конструирование экспрессирующей плазмиды для мышиной α-1,6-фукозилтрансферазы (ЕИТ8).
Экстрагируют полную РНК из 1 х 107 клеток миеломы мыши Νδ0 (КСВ0213, Се11 Вапк, ТИе ИчкШШе оГ Рйик1са1 апй Сйеш1са1 Кекеагсй), субкультивированных с использованием среды (производимой
Ь1£е Тесйпо1од1ек), содержащей 10% сыворотки плода коровы (производимой и Ге Тесйпо1од1ек), с использованием КNΛеаку (производит согласно инструкциям изготовителя. Полную РНК растворяют в 45 мкл стерильной воды и к раствору добавляют 1 мкл ΒΟΙ К№ке-Егее-О№ке (производимой Рготеда), 5 мкл прилагаемого буфера для ДНКазы 10х и 0,5 мкл ингибитора рибонуклеазы К№кш (производимого Рготеда) и затем проводят взаимодействие при 37°С в течение 30 мин для разрушения геномной ДНК, являющейся примесью в образце. По завершении реакции полную РНК очищают снова с использованием КNΛеаку (производит ОМСЕХ) и растворяют в 50 мкл стерильной воды. В 20 мкл реакционной смеси с использованием олиго(йТ) в качестве праймера синтезируют одноцепочечную кДНК из 3 мкг образца каждой полученной полной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием системы предварительной амплификации ЗИРЕКЗСКГРТ™ для синтеза первой цепи кДНК (производимой Ь1£е Тесйпо1од1ек) и согласно инструкциям изготовителя.
Получают кДНК мышиной ЕИТ8 следующей процедурой (фиг. 25).
Сначала из последовательности кДНК мышиной ЕИТ8 (СепВапк, АВ025198) создают прямой праймер, специфический для последовательности, содержащей кодон инициации трансляции (показан 8ЕО ΙΌ ΝΟ:19), и обратный праймер, специфический для последовательности, содержащей кодон терминации трансляции (показан 8ЕО ΙΌ ΝΟ:20).
Затем получают 25 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТац (производимый Такага ЗИи/о), 0,2 ммоль/л й№ТР, 4% ДМСО и 0,5 мкмоль/л специфических праймеров (8ЕО ΙΌ ΝΟ:19 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:20)], содержащего 1 мкл кДНК, полученной из клеток Νδ0, и осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы ЕхТац (производимой Такага 81шхо). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин как едином цикле и заключительном нагревании при 72°С в течение 10 мин.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и очищают специфический амплифицированный фрагмент в 1728 п.о. Используют 4 мкл фрагмента ДНК для встраивания в плазмиду рСК2.1 согласно инструкциям изготовителя, приложенным к набору ТОРО ТА С1ошпд (производимому Шуйгодеп), и реакционным раствором трансформируют Е. сой ОН5(/.. Плазмидные ДНК выделяют согласно известному способу из 6 клонов со встроенными кДНК из числа полученных колоний, невосприимчивых к канамицину.
Нуклеотидную последовательность каждой кДНК, встроенной в плазмиду, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) и набора В|дЭуе ТегттаЮг Сус1е 8ес.|иепстд ЕЗ Кеайу Кеасйоп (производимого Регкш Е1тег) согласно инструкциям изготовителя. Подтверждается, что все встроенные кДНК, последовательности которых определены, кодируют полную последовательность ΟΡΡ мышиной ЕИТ8. Из них отбирают плазмидную кДНК совершенно без ошибок считывания оснований ПЦР в последовательностях (ее последовательнось ДНК и аминокислотная последовательность показаны в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2 и 24 соответственно). В последовательности также отмечают несоответствие в 3 основания из-за замены аминокислоты, когда проводят сравнение с последовательностью мышиной ЕИТ8, зарегистрированной в СепВапк. В данном случае плазмиду называют шГЕИТ8-рСК2.1.
Затем конструируют плазмиду рВ8шГΕυТ8. содержащую полную последовательность ΟΠΕ1 мышиной ЕИТ8, как следует далее (фиг. 26). Сначала 1 мкг плазмиды рВ1иекспр! ΙΙ КЗ(+) растворяют в 35 мкл кЕВиГГег 2 (производимого №\ν Епд1апй Вю1аЬк), добавляют к раствору 20 единиц рестриктазы ЕсоШ (производимой Такага 81шхо) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. К реакционному раствору добавляют 35 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,5 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. сой С15 (производимой Такага ЗИи/о), и затем проводят реакцию при 65°С в течение 30 мин для дефосфорилирования концов ДНК. Реакционный раствор экстрагируют смесью фенол/хлороформ, затем осаждают этанолом и извлеченный фрагмент ДНК растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Отдельно 1 мкг плазмиды шГЕИТ8-рСК2.1 растворяют в 35 мкл КЕВиГГег 2 (производимого №\ν Епд1апй Вю1аЬк), добавляют к раствору 20 единиц рестриктазы ЕсоШ (производимой Такага 81шхо) и
- 63 013224 затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,7 т.п.о., содержащий полную последовательность 0ВЕ кДНК мышиной ЕиТ8.
Полученный фрагмент ЕсоВI-ЕсоВI (1 мкл, 2,9 т.п.о.), полученный из плазмиды рВ1иексг1р( ΙΙ Κδ(+), 4 мкл фрагмента ЕсоВЕЕсоШ (1,7 т.п.о.), полученного из плазмиды тГЕиТ8-рСВ2.1, и 5 мкл Ыдабоп Н1дй (производит ТоуоЬо) смешивают, и проводят реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ОН5(/. и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидные ДНК согласно известному способу. В данном описании плазмиду называют рВδт£ЕυТ8.
С использованием рВδт£ЕυТ8 и рАСЕ249 конструируют экспрессирующий вектор для мышиной ЕиТ8 следующей процедурой (фиг. 27). рАСЕ249 представляет собой производное рАСЕ248 [1. Вю1. Сйет., 269, 14730 (1994)] как вектор, в котором из рАСЕ248 удален фрагмент δрЫ-δрЫ (2,7 т.п.о.), содержащий экспрессирующее звено для гена дигидрофолатредуктазы (бйГг).
В 50 мкл универсального буфера Н (производимого Такага δйиζо) растворяют 1 мкг рАСЕ249, к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы δа1I (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом и растворяют в 35 мкл буфера ХЕВийег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), добавляют к раствору 20 единиц рестриктазы ВатШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления к реакционному раствору добавляют 35 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,5 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. сой С15 (производимой Такага δйиζо) и затем проводят реакцию при 65°С в течение 30 мин для дефосфорилирования концов ДНК. Реакционный раствор экстрагируют смесью фенол/хлороформ, затем осаждают этанолом и извлеченный фрагмент ДНК растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Отдельно 1 мкг рВδтίΕυТ8 растворяют в 50 мкл универсального буфера Н (производимого Такага δйиζо), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы δο1Ι (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом и растворяют в 35 мкл буфера ХЕВийег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), добавляют к раствору 20 единиц рестриктазы ВатШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,7 т.п.о., содержащий полную последовательность 0ВЕ кДНК мышиной ЕиТ8.
Полученный фрагмент ВатШ-ЗаП (1 мкл, 6,5 т.п.о.), полученный из плазмиды рАСЕ249, 4 мкл фрагмента ВатНI-δа1I (1,7 т.п.о.), полученного из плазмиды рВδт£ΕυТ8, и 5 мкл Ыдабоп Н1дй (производит ТоуоЬо) смешивают и затем проводят реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ОН5(/. и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном описании плазмиду называют рАСЕтГЕиТ8.
(2). Получение клеточной линии, сверхэкспрессирующей ген мышиной α-1,6-фукозилтрансферазы (ЕиТ8).
Устойчивую экспрессирующую ген ЕиТ8 клеточную линию получают введением экспрессирующего вектора для мышиной ЕиТ8 рАСЕтГЕиТ8, сконструированного в разделе (1), в 61-33. 61-33 представляет собой клон, полученный осуществлением бессывороточной адаптации трансформированных клеток 7-9-51 (ЕЕВМ ВΡ-6691, Iηΐе^ηаΐ^оηа1 Ρаΐепΐ 0гдапйт Оерокйагу, №бопа1 йЩЩЦе оГ Абуапсеб δαепсе апб Тесйпо1оду, полученных из клетки ΥВ2/0, с высоким выходом продуцирующей химерное антитело против СЭ3, с последующим выделением отдельной клетки по методу двойных лимитирующих разведений.
Плазмиду рАСЕтГЕиТ8 переносят в 61-33 описанной далее процедурой согласно методу электропорации [Су!о!есйпо1оду, 3, 133, (1990)]. Сначала 30 мкг плазмиды рАСЕтГЕиТ8 растворяют в 600 мкл буфера ХЕВцЕГег 4 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), добавляют к раствору 100 единиц рестриктазы Е^й (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Реакционный раствор осаждают этанолом и извлеченную линейную плазмиду переводят в водный раствор концентрации 1 мкг/мл. Затем 61-33 суспендируют в буфере Κ-ΡΕδ (137 моль/л КС1, 2,7 моль/л №С1, 8,1 моль/л №2№04, 1,5 моль/л КНР0/1, 4,0 моль/л МдС12), получают плотность клеток 2х107 клеток/мл и 200 мкл клеточной суспензии (4х106 клеток) смешивают с 10 мкл (10 мкг) линейной плазмиды. Смесь клетки-ДНК переносят в кювету Сепе Ριι1^γ (межэлектродное расстояние 2 мм) (производимую ВЮ-ВАО) и затем осуществляют электропорацию с использованием устройства для гибридизации Сепе Ριι1^γ (производимого ВЮ-ВАО) при напряжении импульса 0,2 кВ и емкости 250 мкФ. Клеточную суспензию смешивают с 10 мл среды НуЬббота^ЕМ (производимой ЬгГе Тесйпо1од1е8) с добавлением 5% диализованной сыворотки плода коровы (производимой Ы£е Тесйпо1од1е8) и 0,2% ВЗА (производимого ЬгГе Тесйпо1од1е8) и распределяют в лунки 96-луночного планшета для применения для
- 64 013224 суспензии клеток (производимого Огешег) по 100 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% СО2 извлекают 50 мкл клеточного супернатанта и в лунки добавляют по 100 мкл среды НуЬпйота-ЗЕМ (производимой ЫГе ТесНпо1од1е5) с добавлением 0,5 мг/мл гигромицина В (производимого Риге СНет1са1 Ыйц^пек), 5% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе ТесНпо1о§1е5) и 0,2% ВЗА (производимого ЫГе ТесНпо1од1е5). Клетки культивируют в течение 3 недель, повторяя стадию замены среды с интервалами в 3-4 дня, и получают 14 клеточных линий, показывающих невосприимчивость к гигромицину.
С другой стороны, получают клеточную линию отрицательного контроля, вводя в 61-33 плазмиду рАОЕ249 как исходный вектор рАОЕтГЕИТ8. Согласно описанной выше процедуре 10 мкг плазмиды рАОЕ249, превращенной в линейную форму рестриктазой ЕкрЕ вводят в 4х106 клеток 61-33 с использованием электропорации. Клетки смешивают с 15 мл среды НуЬпйота-ЗЕМ (производимой ЫГе ТесНпо1о§1е5) с добавлением 5% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе ТесНпо1о§1е5) и 0,2% ВЗА (производимого ЫГе ТесЬпо1од1е8), переносят в колбу Т75 для суспензии клеток (производимую Огешег) и затем культивируют при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% СО2. После культивирования половину культурального супернатанта (7,5 мл) удаляют центрифугированием при 800 об/мин в течение 4 мин, клетки суспендируют в 7,5 мл среды НуЬпйота-ЗЕМ (производимой ЫГе ТесНпо1од1е5) с добавлением 0,5 мг/мл гигромицина В (производимого Vако Риге СНе1тса1 ЫйнкМек), 5% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе ТесНпо1од1е5) и 0,2% ВЗА (производимого ЫГе ТесНпо1о§1е5) и переносят в колбу Т75 для суспензии клеток (производимую Огешег). Клетки культивируют в течение 3 недель, повторяя стадию замены среды с интервалами в 3-4 дня, и получают клеточную линию, невосприимчивую к гигромицину.
(3). Анализ уровня экспрессии гена α-1,6-фукозилтрансферазы (ЕИТ8) в клеточных линиях, сверхэкспрессирующих ген.
С использованием 6 клеточных линий, произвольно отобранных среди 14 клеточных линий, сверхэкспрессирующих ЕИТ8, полученных из 61-33 в разделе (2), и клеточной линии отрицательного контроля сравнивают уровни экспрессии ЕИТ8 с использованием конкурентной КТ-РСК.
Каждую из таких сверхэкспрессирующих клеточных линий суспендируют в среде НуЬпйота-ЗЕМ (производимой ЫГе ТесНпо1о§1е5) с добавлением 0,5 мг/мл гигромицина В (производимого Vако Риге Скетка1 Ыйц^пек), 5% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе ТесНпо1од1е5) и 0,2% ВЗА (производимого ЫГе ТесЬпо1од1е8), получают плотность клеток 3х 105 клеток/мл и затем клетки переносят в колбу Т75 для применения для суспензии клеток (производимую Огешег). После культивирования при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% СО2 1 х 107 интактных клеток извлекают и экстрагируют полную РНК с использованием КУАеаку (производит ОМОЕН) согласно инструкциям изготовителя. Полную РНК растворяют в 45 мкл стерильной воды и к раствору добавляют 0,5 Е/мкл ΒΟΙ КЫаке-ЕгееЭШе (производимой Рготеда), 5 мкл прилагаемого буфера для ДНКазы 10х и 0,5 мкл ингибитора рибонуклеазы КМЫп (производимого Рготеда) и затем проводят взаимодействие при 37°С в течение 30 мин для разрушения геномной ДНК, являющейся примесью в образце. По завершении реакции полную РНК очищают снова с использованием КЫАеаку (производит ОМОЕХ) и растворяют в 50 мкл стерильной воды.
В 20 мкл реакционной смеси с использованием олиго(йТ) в качестве праймера синтезируют одноцепочечную кДНК из 2,5 мкг полученной полной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием системы предварительной амплификации ЗИРЕКЗСКТРТ™ для синтеза первой цепи кДНК (производимой ЫГе ТесНпо1о§1е5) и согласно инструкциям изготовителя. Реакционный раствор разбавляют в 50 раз водой и определяют уровень транскрипции каждого гена конкурентной ПЦР согласно примеру 9(6).
Уровень транскрипции мРНК, полученной из гена ЕИТ8, в каждой экспрессирующей клеточной линии определяют следующим образом.
УВЕТ8-рСК2.1 как плазмиду, в которой в рСК2.1 встроен неполный фрагмент кДНК крысиной ЕИТ8, полученный в примере 9(2), расщепляют рестриктазой ЕсоКЕ и полученную линейную ДНК используют в качестве эталона при получении калибровочной кривой для определения уровня транскрипции ЕИТ8.
Из УВЕТ8-рСК2.1, полученных в примере 9(4), УВЕТ8й-рСК2.Е полученную делецией 203 п.о. между ЗсаI и НшйШ внутренней нуклеотидной последовательности ЕИТ8, расщепляют рестриктазой ЕсоК! и полученную линейную ДНК используют в качестве внутреннего стандарта для определения ЕИТ8.
ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы ЕхТац (производимой Такага ЗНихо) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер ЕхТац (производимый Такага ЗНихо), 0,2 ммоль/л йЭТР, 0,5 мкмоль/л праймеров, специфических для гена ЕИТ8 (ЗЕЦ ΙΌ N0:13 и 14) и 5% ДМСО], содержащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК, полученной из соответствующей экспрессирующей клеточной линии, полученной выше, и 5 мкл (10 фг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 32 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин как едином цикле.
- 65 013224
Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов, где вместо кДНК, полученной из каждой экспрессирующей клеточной линии, добавляют 5 мкл (0,1, 1, 5, 10, 50, 100, 500 фг или 1 пг) эталонной плазмиды ЕИТ8 и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции ЕИТ8. В данном случае для разведения эталонной плазмиды используют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой ЗЮМА).
С другой стороны, так как считается, что ген β-актина постоянно транскрибируется в каждой клетке и уровень его транскрипции в клетках приблизительно одинаковый, уровень транскрипции β-актина определяют как показатель эффективности реакции синтеза кДНК в каждой экспрессирующей клеточной линии.
УВАс-рВЗ как плазмиду, в которой в рВ1иексг1р( ΙΙ КЗ(+) встроена полная последовательность 0ВЕ кДНК β-актина крысы, полученная в примере 9(3), расщепляют рестриктазами НшбШ и Крп! и полученную линейную ДНК используют в качестве эталона при получении калибровочной кривой для определения уровня транскрипции β-актина.
УВАсб-рВЗ, полученную из УВАс-рВЗ делецией 180 п.о. между Όγ;·ιΙ и Όγ;·ιΙ внутренней нуклеотидной последовательности β-актина крысы, расщепляют рестриктазами НшбШ и Крп! и полученную линейную ДНК используют в качестве внутренних стандартов при получении калибровочной кривой для определения количества β-актина.
ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы ЕхТац (производимой Такага З1шхо) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер ЕхТац (производимый Такага ЗНихо), 0,2 ммоль/л бЭТР, 0,5 мкмоль/л праймеров, специфических для β-актина (ЗЕЦ ΙΌ N0:17 и 18) и 5% ДМСО], содержащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК, полученной из каждой экспрессирующей клеточной линии, и 5 мкл (1 пг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 17 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин как едином цикле.
Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов, где вместо кДНК, полученной из каждой экспрессирующей клеточной линии, добавляют 10, 5, 1 пг, 500 или 100 фг эталонной плазмиды β-актина и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции β-актина. В данном случае для разведения эталонной плазмиды используют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой ЗЮМА).
Путем осуществления ПЦР с использованием набора праймеров, описанного в табл. 3, можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Мишень табл. 3, из каждого продукта транскрипции гена и каждого эталона и можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Конкурент табл. 3, из каждого внутреннего стандарта.
Каждый раствор (7 мкл) после ПЦР подвергают электрофорезу в 1,75% агарозном геле и затем гель окрашивают, замачивая его в течение 30 мин в ЗУВВ Сгееп Ι ШсШс Ас1б Се1 З1а1п (производит Мо1еси1аг РгоЬек) концентрации 1 х. Количество амплифицированного фрагмента ДНК измеряют, вычисляя интенсивность люминесценции каждого амплифицированного фрагмента ДНК с использованием формирователя флуороизображения (Е1иог1тадег З^ производится Мо1еси1аг Оупаннс).
Количество амплифицированного продукта, полученного ПЦР с использованием эталонной плазмиды в качестве матрицы, измеряют тем же способом и получают калибровочную кривую, откладывая измеренные величины против количества эталонной плазмиды. С использованием калибровочной кривой из количества амплифицированного продукта, когда в качестве матрицы используют каждую кДНК, полученную из экспрессирующей клеточной линии, вычисляют количество кДНК гена, представляющего интерес, в каждой клеточной линии и полученную величину определяют как уровень транскрипции мРНК в каждой клеточной линии.
Фиг. 28 показывает уровни транскрипции ЕИТ8 как относительные величины от количества продукта транскрипции β-актина. Три клеточные линии шГЕЦТ8-1, шГЕИТ8-2 и шГЕИТ8-4 и клеточная линия с введенной рАСЕ249 являются клеточными линиями с относительно небольшим уровнем транскрипции ЕИТ8, эквивалентным 0,3-10% уровня транскрипции β-актина. С другой стороны, три другие клеточные линии шГЕИТ8-3, шГЕИТ8-6 и шГЕИТ8-7 являются клеточными линиями с относительно высоким уровнем транскрипции ЕИТ8, эквивалентным 20-40% уровня транскрипции β-актина.
(4). Очистка антител, продуцированных клеточной линией, сверхэкспрессирующей ген «-1,6-фукозилтрансферазы (ЕИТ8).
Каждую из шести клеточных линий, сверхэкспрессирующих ген ЕИТ8, и одну клеточную линию отрицательного контроля, полученные в разделе (2), суспендируют в среде НуЬпбоша-ЗЕМ (производимой Ь1Ее Тес1шо1од1е5) с добавлением 200 нмоль/л МТХ, 0,5 мг/мл гигромицина В (производимого Уако Риге С11еннса1 ЕгбиЦпех) и 0,2% ВЗА (производимого Ь1Ее Тесйпо1од1е8), получают плотность клеток 2х105 клеток/мл и затем 100 мл всей суспензии инокулируют в три колбы Т225 для применения при культивировании клеток в суспензии (производимые IУАКI). После культивирования при 37°С в течение 7-9 суток в инкубаторе с 5% СО2 подсчитывают число интактных клеток и подтверждают, что их
- 66 013224 жизнеспособность почти одинаковая (у каждой 30% или менее), и затем извлекают каждую клеточную суспензию. Каждую клеточную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин при 4°С в течение 10 мин и извлеченный супернатант центрифугируют при 10000 об/мин при 4°С в течение 1 ч, затем фильтруют с использованием блока для фильтрации РЕ8 (производимого NА^ΟЕNЕ) с диаметром пор 0,22 мкм и емкостью 150 мл.
В колонку диаметром 0,8 см помещают Ргокер-А ШдйСарасйу (производит ЬюРЯ0СЕ88ШО) на высоту 2 см и промывают 10 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,0) и 10 мл буфера 1 моль/л глицин/№10Н - 0,15 моль/л глицин/№1С1 (рН 8,6) для того, чтобы уравновесить носитель. Затем через такую колонку пропускают 100 мл каждого культурального супернатанта и промывают 50 мл буфера 1 моль/л глицин/№10Н - 0,15 моль/л №С1 (рН 8,6). После промывки элюируют антитела, адсорбированные на Ргокер-А, с использованием 2,5 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,0), элюат фракционируют на фракции по 500 мкл и каждую фракцию нейтрализуют, смешивая ее со 100 мкл 2 моль/л трис-НС1 (рН 8,5). Две фракции, содержащие антитела в высокой концентрации (всего 1,2 мл), отбирают ВСА-способом [Апа1. Вюсйет., 150, 76 (1985)], объединяют и затем диализуют против 10 моль/л цитратного буфера (рН 6,0) при 4°С в течение всего дня и ночи. После диализа раствор антител извлекают и подвергают стерилизации фильтрованием с использованием фильтра с размером пор 0,22 мкм ΜΠ^ ОУ (производимого 1^1^-^0^).
(5). Цитотоксическая активность (АЭСС-активность) ш νίΙΐΌ антител, продуцированных клеточной линией, сверхэкспрессирующих ген мышиной а-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8).
Для того чтобы оценить ш νίΙΐΌ цитотоксическую активность антител против ОЭ3, полученных в чистом виде в разделе (4), измеряют АЭСС-активность с использованием ОП3-положительных клеток культивированной клеточной линии меланомы человека О-361 (ЯСВ0991, Се11 Вапк, Т1е 1п8111и1е оГ Рйу8юа1 апё Сйетюа1 Яекеагсй).
Клетки О-361, субкультивированные в среде ΚΓΜΙ1640 (производимой ЫГе ТесЬпо1од1е8), содержащей 10% сыворотки плода коровы (производимой ЫГе ТесНпо1од1е8) (называемой далее Κ₽ΜΙ1640РВ8(10)), суспендируют в 500 мкл ΚΡΜI1640-РВ8(10) при плотности клеток 1х106 клеток, добавляют к ним эквивалент 3,7 МБк №251Сг04 и затем культивируют при 37°С в течение 30 мин для мечения клеток радиоизотопом. После центрифугирования при 1200 об/мин в течение 5 мин супернатант отбрасывают и клетки-мишени суспендируют в 5 мл среды ЯΡΜI1640-РВ8(10). Повторяют три раза стадию промывки и затем суспензию клеток инкубируют в течение 30 мин на льду для осуществления спонтанного отделения радиоактивного вещества. Снова дважды повторяют стадию промывки, затем клетки суспендируют в 5 мл среды ЯΡΜI1640-РВ8(10) и посредством этого получают суспензию клеток-мишеней 2х105 клеток/мл.
С другой стороны, у здорового человека берут 30 мл периферической крови и осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого 81ιίιηίζι.ι Рйагтасеиёса1) и затем смешивают с 30 мл физиологического раствора (производимого 0кика Рйагтасеиёса1). После смешивания 10 мл смеси осторожно нагружают на 4 мл Ьутрйоргер (производит NΥС0ΜЕ^ ΡНАЯΜА А8) и центрифугируют при комнатной температуре при 2000 об/мин в течение 30 мин. Отделившиеся фракции одноядерных клеток собирают из центрифужных пробирок, объединяют и затем суспендируют в 30 мл ^1^11640-^8(10). После центрифугирования при комнатной температуре при 1200 об/мин в течение 5 мин супернатант отбрасывают и клетки-мишени суспендируют в 20 мл ЯΡΜI1640-РВ8(10). Дважды повторяют стадию промывки и затем с использованием ЯΡΜI1640-РВ8(10) клетки получают суспензию эффекторных клеток 2х 106 клеток/мл.
Суспензию клеток-мишеней распределяют по 50 мкл (1х104 клеток/лунку) в каждую лунку 96луночного планшета с И-образными лунками (производимого Ра1соп). Затем в каждую лунку добавляют 100 мкл суспензии эффекторных клеток (2х 105 клеток/лунку) и посредством этого доводят отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням до 20:1. Затем с использованием 10 М цитратного буфера (рН 6,0) получают ряд разведенных растворов - 0,01, 0,1, 1 и 10 мкг/мл каждого из антител против ОЭ3, полученных в разделе (4), и по 50 мкл разведенных растворов добавляют в лунки, получая конечные концентрации 0,0025, 0,025, 0,25 и 2,5 мкг/мл соответственно. После осуществления взаимодействия при 37°С в течение 4 ч в атмосфере с 5% СО2 планшет центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин. Переносят 50 мкл супернатанта из каждой лунки в пробирку для Я1А диаметром 12 мм (производимую Ι\νΛΚΙ) и измеряют количество 51Сг в супернатанте с использованием автоматического счетчика гаммаквантов ΜINАX-γ 5550 (производимого РАСКАЯО).
Также количество спонтанно отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя такое же взаимодействие в реакционной смеси, в которую вместо суспензии эффекторных клеток и раствора антител добавляют 150 мкл ЯΡΜI1640-РВ8(10). Количество общего отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя такое же взаимодействие в реакционной смеси, в которую вместо суспензии эффекторных клеток и раствора антител добавляют 100 мкл 1 моль/л соляной кислоты и 50 мкл ЯΡΜI1640-РВ8(10). С использованием полученных величин вычисляют АОСС-активность (%) на основании формулы (ΙΙ), приведенной в разделе 2(3) примера 2.
- 67 013224
Фиг. 29 показывает АЭСС-активность каждого вида антител против ОЭ3 в отношении клеток О-361. Три клеточные линии тГЕиТ8-1, тГЕиТ8-2 и тГЕиТ8-4 с низким уровнем экспрессии ЕИТ8, как видно на фиг. 28, демонстрируют сильную АПСС-активность, эквивалентную АОСС-активности клеточной линии с введенной рАОЕ249 отрицательного контроля. С другой стороны, три другие клеточные линии ШГЕИТ8-3, ШГЕИТ8-6 и ШГЕИТ8-7 с высоким уровнем экспрессии ЕИТ8, как видно на фиг. 28, демонстрируют низкую АЭСС-активность, эквивалентную АЭСС-активности антител против ОЭ3, полученных из клеток СНО. На основании полученных результатов показано, что АЭСС-активность полученных антител можно регулировать, регулируя уровень экспрессии ЕИТ8 в клетках-хозяевах.
(6). Анализ углеводных цепей антител, продуцированных клеточной линией, сверхэкспрессирующих ген мышиной а-1,6-фукозилтрансферазы (ЕИТ8).
Анализируют углеводные цепи антител против ОЭ3, очищенных в разделе (4). Углеводные цепи, связывающиеся с антителами, продуцированными клеточными линиями с введенными тГЕИТ8-6 и рАОЕ249, отщепляют от белков, подвергая антитела гидразинолизу [Ме!Ноб о Г Еηζуто1оду, 83, 263 (1982)]. После удаления гидразина выпариванием при пониженном давлении осуществляют №ацетилирование, добавляя водный раствор ацетата аммония и уксусный ангидрид. После сушки вымораживанием осуществляют флуоресцентное мечение 2-аминопиридином [1. Вюсйет., 95, 197, (1984)]. Группу углеводных цепей с флуоресцентной меткой (группу РА-обработанных углеводных цепей) отделяют от избытка реагентов с использованием колонки с 8ирегбех РерОбе НЕ 10/30 (производимым РНагшааа). Фракции углеводных цепей сушат с использованием центробежного концентратора и используют как группу очищенных РА-обработанных углеводных цепей. Затем группу очищенных РА-обработанных углеводных цепей подвергают анализу методом ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием колонки с СЬС-ОЭ8 (производимым 8Ытабζи) (фиг. 30). При вычислении по площади пика содержание углеводных цепей без а-1,6-фукозы в тГЕИТ8-6 составляет 10% и содержание углеводных цепей, связанных с α1,6-фукозой, составляет 90%. Содержание углеводных цепей без а-1,6-фукозы в рАОЕ249 составляет 20% и содержание углеводных цепей, связанных с а-1,6-фукозой, составляет 80%. На основании полученных результатов обнаружено, что содержание углеводных цепей, связанных с а-1,6-фукозой, в полученных антителах возрастает за счет сверхэкспрессии гена ЕИТ8.
Фиг. 30 показывает картины элюирования, полученные при осуществлении анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой каждого вида РА-обработанных углеводных цепей, полученных из антител, продуцированных клеточными линиями с введенными тГЕИТ8-6 и рАОЕ249. Фиг. 30А и 30В показывают картины элюирования для тГЕИТ8-6 и рАОЕ249 соответственно. Относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования размещают как ординаты и абсциссы соответственно. С использованием натрийфосфатного буфера (рН 3,8) как буфера А и натрийфосфатного буфера (рН 3,8)+0,5% 1-бутанола как буфера В осуществляют анализ с градиентом, указанным далее.
Время (минуты) 0 80 90 90,1 120
Буфер В (%) 0 60 60 0 0
Пики (ί)-(ίχ) на фиг. 30 и 31 показывают структуры, приведенные далее.
(ϊ) (ЭсМАсД1-2Мапа1
Мал β I —4С1сМАс β 1 —4С1сМАс—РА / αςΝΑοβΙ-2Мтаг (ϋ) ΟβΙβ 1 -401οΝΑοβ1- 2Мап«1 * Мал β 1 -4С1сйАс β 1 -4О1сЫАс -РА /3
ΟΙοΝΑο β 1 - 2Мап а 1' (ίίί) (ίν)
ΟΙϋΝΑεβΙ—2Мапа1 ’ Μηβ 1 -«ΙεΝΑβ β 1 -4С1сЫАс-РА
6а1 β 1 -ΌεΝΑε β 1 -2№η а 1'
Са1 β 1—461οΝΑεβ 1-2Μίΐα1 ’ Мш|51-<йс№с/31-КЭсйАс-РА /3
6а101-2№ηαΓ
- 68 013224 (ν) αοΝΑεβ1-2Κ&ηα1
Мап/З 1—443εΝΑεβ 1-43εΝΑβ--ΡΑ (νϋ) (νϋί)
ΟοΝΑεβΙ-2МапСИ
6а1|91-4ас1Ш)81
Μχιβ 1—ΟεΝΑε/? 1-40ΕΝΑ:—ΡΑ αάΝΑεβΙ-2Μηα1' аеЫАс/З!-2Мюа1
0а1£ 1-ОЙ4М 1-2№ηαί
Са1 β 1-ОЙШ β 1-2МЯ1 οι 1, №η0 (-«εΝΑεβ Ι^ΟΚΝΑε-ΡΑ
Нюа1\
МапД 1 -40ΙοΝΑο31 -«3εΝΑ£-ΡΑ
0а1 β 1 -4αοΝΑεβ 1 —2Мап а 1' (ЯсЫАс^-гМта!
(ίχ) 6
ΟΕΝΑεί?!—4 Мап£1—461сНАс|81—401сНАс—ΡΑ /3 асЦАс01-2МапаГ
61сКАс, Са1, Маи, Рис и РА обозначают Ν-ацетилглюкозамин, галактозу, маннозу, фукозу и группу пиридиламино соответственно. На фиг. 30 и 31 долю группы углеводных цепей без α-1,6-фукозы вычисляют из площади, занимаемой пиками (ί)-(ίν) из числа (ί)-(ίχ), и долю группы углеводных цепей, связанных с α-1, 6-фукозой, вычисляют из площади, занимаемой пиками (ν)-(ίχ) из числа (ί)-(ίχ).
Пример 12. Получение гена α-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8) клеток СНО.
(1). Получение последовательности кДНК α-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8) клеток СНО.
Из одноцепочечной кДНК, полученной в примере 9(1) из клеток СНО/ЭС44 на 2-й день культивирования, получают кДНК РИТ8 китайского хомячка следующим образом (фиг. 32).
Сначала из последовательности кДНК мышиной РИТ8 (беиВаик, АВ025198) создают прямой праймер, специфический для 5'-концевой нетранслируемой области (показан в 8ЕО ΙΌ NО:21), и обратный праймер, специфический для 3'-концевой нетранслируемой области (показан в 8ЕО ΙΌ NО:22).
Затем получают 25 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8Ыи7о), 0,2 ммоль/л бЭТР, 4% ДМСО и 0,5 мкмоль/л специфических праймеров (8ЕО ΙΌ NО:21 и 22)], содержащего 1 мкл кДНК, полученной из клеток СНО/ОС44, и осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81шхо). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин как едином цикле и заключительным нагреванием при 72°С в течение 10 мин.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и очищают специфический амплифицированный фрагмент примерно в 2 т.п.о. Используют 4 мкл фрагмента ДНК для встраивания в плазмиду рСЯ2.1 согласно инструкциям изготовителя, приложенным к набору ТОРО ТА С1ошид (производимому ^йгодеи), и реакционным раствором трансформируют Е. сой ОН5«. Плазмидные ДНК выделяют согласно известному способу из 8 клонов со встроенной кДНК из числа полученных колоний, невосприимчивых к канамицину.
Нуклеотидную последовательность каждой кДНК, встроенной в плазмиду, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) и набора В1дОуе ТегттаЮг Сус1е 8едиеистд Р8 Яеабу Яеасйои (производимого Регкт Е1тег) согласно инструкциям изготовителя. Подтверждается, что все встроенные кДНК кодируют последовательность, содержащую полную ОКЕ РИТ8 клеток СНО. Из них отбирают плазмидную ДНК совершенно без ошибок считывания оснований ПЦР в последовательностях. В данном случае плазмиду называют СНГЕИТ8-рСЯ2.1. Определенная нуклеотидная последовательное и аминокислотная последовательность кДНК РИТ8 СНО показаны в 8ЕО ΙΌ NО:1 и 23 соответственно.
- 69 013224 (2). Получение геномной последовательности α-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8) клеток СНО.
С использованием в качестве зонда фрагмента 0КР полноразмерной кДНК РИТ8 клеток СНО, полученной в разделе (1), получают геномный клон РИТ8 клеток СНО согласно известному способу скрининга генома, описанному, например, в Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопй Еййюп, Сиггеп! Рго!осо1§ ίπ Мо1еси1аг Вю1о1ду, А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есопй Еййюп (1989). Затем после расщепления полученного геномного клона с использованием рестриктаз осуществляют гибридизацию по Саузерну с использованием в качестве зонда фрагмента АГа1-8аи3А1 (примерно 280 п.о.), содержащего кодон инициации кДНК РИТ8 клеток СНО, и затем из фрагментов рестриктаз, показывающих положительную реакцию, отбирают фрагмент ХЬа1-ХЬа1 (примерно 2,5 т.п.о.) и фрагмент 8ас1-8ас1 (примерно 6,5 т.п.о.), встроенные в рВ1иебсг1р1 II К8(+) (производимую 81га1одепе), соответственно.
Нуклеотидную последовательность каждого полученного геномного фрагмента определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкш Е1тег) и набора ВщЭуе Тегтта1ог Сус1е 8есщепстд Р8 Кеайу Кеасйоп (производимого Регкт Е1тег) согласно инструкциям изготовителя. Посредством этого подтверждается, что фрагмент ХЬа1-ХЬа1 кодирует последовательность предыдущего интрона примерно в 2,5 т.п.о., содержащего экзон 2 РИТ8 клеток СНО, и фрагмент 8ас1-8ас1 кодирует последовательность последующего интрона примерно в 6,5 т.п.о., содержащего экзон 2 РИТ8 клеток СНО. В данном случае плазмиду, содержащую фрагмент ХЬа1-ХЬа1, называют рРИТ8ГдЕ2-2, и плазмиду, содержащую фрагмент 8ас1-8ас1, называют рРИТ8ГдЕ2-4. Определенная нуклеотидная последовательность (примерно 9,0 т.п.о.) области генома, содержащей экзон 2 РИТ8 клеток СНО, показана в 8ЕО ΙΌ N0:3.
Пример 13. Получение клеток СНО, в которых ген α-1,6-фукозилтрансферазы разорван, и получение антител с использованием таких клеток.
Получают клетки СНО, из которых удалена геномная область, содержащая экзон 2 гена α-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8) клеток СНО, и оценивают АЭСС-активность антител, продуцированных такими клетками.
1. Конструирование векторной плазмиды рК0РИТ8Риго, обеспечивающей локализацию экзона 2 гена α-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8) китайского хомячка.
(1) . Конструирование плазмиды р1охРРиго.
Плазмиду р1охРРиго конструируют следующей процедурой (фиг. 33).
В 35 мкл №ВиГГег 4 (производимого №\ν Епд1апй Вю1аЬ§) растворяют 1,0 мкг плазмиды рК08е1ес!Риго (производимой Ьехюоп), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы А§с1 (производимой №\ν Епд1апй Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,5 т.п.о., содержащий экспрессирующий элемент гена невосприимчивости к пуромицину.
С другой стороны, 1,0 мкг плазмиды р1охР, описанной в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 314512/99, растворяют в 35 мкл №ВиГГег 4 (производимого №\ν Епд1апй Вю1аЬ§), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы А§с1 (производимой №\ν Епд1апй Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 2,0 т.п.о.
Полученный фрагмент А5с1-А5с1 (4,5 мкл, примерно 1,5 т.п.о.), образованный от плазмиды рК08е1ес!Риго, 0,5 мкл фрагмента А5с1-А5с1 (примерно 2,0 т.п.о.), образованного от плазмиды р1охР, и 5,0 мкл Ыдайоп Н1дй (производимого ТоуоЬо) смешивают и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. со11 ОН5« и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют р1охРРиго.
(2) . Конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-1.
Плазмиду рК0РИТ8дЕ2-1 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 34), с использованием плазмиды рРИТ8ГдЕ2-2, полученной в примере 12(2), содержащей участок генома РИТ8 китайского хомячка, содержащий экзон 2.
В 35 мкл №ВиГГег 1 (производимого №\ν Епд1апй Вю1аЬ§), содержащего 100 мкг/мл В8А (производимого №те Епд1апй Вю1аЬ§), растворяют 2,0 мкг плазмиды рРИТ8ГдЕ2-2, к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы 8ас1 (производимой №\ν Епд1апй Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 35 мкл №ВиГГег 2 (производимого №\ν Епд1апй Вю1аЬ§), содержащего 100 мкг/мл В8А (производимого №те Епд1апй Вю1аЬ§), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ЕсоКУ (производимой №те Епд1апй Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,5 т.п.о.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды ЫТМИ828 (производимой №\ν Епд1апй Вю1аЬ§) растворяют в 35 мкл NЕВиГГе^ 1 (производимого №\ν Епд1апй Вю1аЬ§), содержащего 100 мкг/мл В8А (производимого №\ν Епд1апй Вю1аЬ§), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы 8ас1 (производимой №\ν Епд1апй Вю1аЬ§)
- 70 013224 и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 35 мкл NΕΒиГ!е^ 2 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), содержащего 100 мкг/мл ВЗА (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ЕсоРУ (производимой №\ν Еид1аий Вю1аЬк) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 2,8 т.п.о.
Полученный фрагмент ЕсоРУ-ЗаН (4,5 мкл, примерно 1,5 т.п.о.), образованный от плазмиды рЕиТ8!дЕ2-2, 0,5 мкл фрагмента ЕсоРУ-ЗаЯ (примерно 2,8 т.п.о.), образованного от плазмиды ЫТМиЗ28, и 5,0 мкл ЫдаГюи Н1дй (производимого ТоуоЬо) смешивают и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ОН5</. и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рК0ЕиТ8дЕ2-1.
(3) . Конструирование плазмиды рК0ЕиТ8дЕ2-2.
Плазмиду рК0ЕиТ8дЕ2-2 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 35), с использованием плазмиды рК0ЕиТ8дЕ2-1, полученной в разделе (2).
В 30 мкл NΕΒи!!е^ 2 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), содержащего 100 мкг/мл ВЗА (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), растворяют 2,0 мкг плазмиды рК0ЕиТ8дЕ2-1, к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ЕсоРУ (производимой №\ν Еид1аий Вю1аЬк) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 30 мкл NΕΒи!!е^ 1 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), содержащего 100 мкг/мл ВЗА (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы Крй (производимой №\ν Еид1аий Вю1аЬк) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,5 т.п.о.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды р1охРРиго растворяют в 30 мкл NΕΒи!!е^ 4 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы Нра1 (производимой №\ν Еид1аий Вю1аЬк) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 30 мкл NΕΒи!!е^ 1 (производимого Еид1аий Вю1аЬк), содержащего 100 мкг/мл ВЗА (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы Крй (производимой №\ν Еид1аий Вю1аЬк) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 3,5 т.п.о.
Часть (4,0 мкл) полученного фрагмента ЕсоРУ-Крй (примерно 1,5 т.п.о.), образованного от плазмиды рК0ЕиТ8дЕ2-1, 1,0 мкл фрагмента Нра^^й (примерно 3,5 т.п.о.), образованного от плазмиды р1охРРиго, и 5,0 мкл Ыдайои Н1дй (производимого ТоуоЬо) смешивают и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ЭН5а и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рК0ЕиТ8дЕ2-2.
(4) . Конструирование плазмиды рксЕиТ8дЕ2-3.
Плазмиду рксЕиТ8дЕ2-3 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 36), с использованием плазмиды рЕиТ8!дЕ2-4, полученной в примере 12(2), содержащей участок генома ЕиТ8 китайского хомячка, содержащий экзон 2.
В 35 мкл NΕΒи!!е^ 1 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк) растворяют 2,0 мкг плазмиды рЕиТ8!дЕ2-4, к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы НраИ (производимой №\ν Еид1аий Вю1аЬк) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и затем концы ДНК заменяют на тупые концы с использованием В1цийид Н1дй (производимого ТоуоЬо) согласно инструкциям изготовителя. Извлекают фрагмент ДНК, осуществляя экстрагирование смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, растворяют в 35 мкл NΕΒи!!е^ 2 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы НшйШ (производимой №\ν Еид1аий Вю1аЬк) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 3,5 т.п.о.
С другой стороны, 1,0 мкг плазмиды ЫТМиЗ39 (производимой №\ν Еид1аий Вю1аЬк) растворяют в 35 мкл NΕΒи!!е^ 2 (производимого №\ν Еид1аий Вю1аЬк), раствор смешивают с 20 единицами рестриктазы ЕсоРУ (производимой №\ν Еид1аий Вю1аЬк) и 20 единицами рестриктазы НшйШ (производимой №\ν Еид1аий Вю1аЬк) и осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 2,8 т.п.о.
Полученный фрагмент НраП-НтйШ (4,0 мкл примерно 3,5 т.п.о.), образованный от плазмиды рЕиТ8!дЕ2-4, 1,0 мкл фрагмента ЕсоРУ-НшйШ (примерно 2,8 т.п.о.), образованного от плазмиды ЫТМиЗ39, и 5,0 мкл Ыдайои Н1дй (производимого ТоуоЬо) смешивают и затем осуществляют реакцию
- 71 013224 лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ΌΗ5α и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют р§сЕиТ8дЕ2-3.
(5) . Конструирование плазмиды рК0ЕИТ8дЕ2-3.
Плазмиду рК0ЕИТ8дЕ2-3 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 37), с использованием плазмиды рЕИТ8ПдЕ2-4, полученной в примере 12(2), содержащей участок гена ЕИТ8 китайского хомячка, содержащий экзон 2.
В 35 мкл НЕВиПсг для ЕсоК1 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) растворяют 2,0 мкг плазмиды рЕИТ8ПдЕ2-4, к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ЕсоК1 (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и 20 единиц рестриктазы НшбШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,8 т.п.о.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды рВШекспр! II К8(+) (производимой 81га1адепе) растворяют в 35 мкл НЕВиПсг для ЕсоШ (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ЕсоШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и 20 единиц рестриктазы НшбШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 3,0 т.п.о.
Полученный фрагмент НшбШ-ЕсоШ (4,0 мкл примерно 1,8 т.п.о.), образованный от плазмиды рЕИТ8ПдЕ2-4, 1,0 мкл фрагмента НшбШ-ЕсоШ (примерно 3,0 т.п.о.), образованного от плазмиды рВ1ие5спр1 II К8(+), и 5,0 мкл ЫдаДоп Н1дй (производимого ТоуоЬо) смешивают и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ОН5« и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рК0ЕИТ8дЕ2-3.
(6) . Конструирование плазмиды рК0ЕИТ8дЕ2-4.
Плазмиду рК0ЕИТ8дЕ2-4 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 38), с использованием плазмид р8сЕИТ8ПдЕ2-3 и рК0ЕИТ8дЕ2-3, полученных в разделах (4) и (5).
В 35 мкл НЕВиПсг для 8аП (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), содержащего 100 мкг/мл В8А (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), растворяют 1,0 мкг плазмиды р§сЕиТ8дЕ2-3, к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы 8аИ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 30 мкл ИЕВиППег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), содержащего 100 мкг/мл В8А (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы НшбШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 3,6 т.п.о.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды рК0ЕИТ8дЕ2-3 растворяют в 35 мкл НЕВиПсг для 8аЛ (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы 8аП (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом и растворяют в 35 мкл НЕВцППег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы НшбШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления к раствору добавляют 35 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,5 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. сой С15 (производимой Такага 8йи7о), и затем осуществляют взаимодействие при 65°С в течение 30 мин для дефосфорилирования концов ДНК. Фрагмент ДНК извлекают, осуществляя экстрагирование смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Полученный фрагмент 8аП-НшбШ (4,0 мкл примерно 3,1 т.п.о.), образованный от плазмиды р§сЕиТ8дЕ2-3, 1,0 мкл фрагмента 8а11-НшбШ (примерно 4,8 т.п.о.), образованного от плазмиды рК0ЕИТ8дЕ2-3, и 5,0 мкл ЫдаДоп Н1дй (производимого ТоуоЬо) смешивают и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ОН5« и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рК0ЕИТ8дЕ2-4.
(7) . Конструирование плазмиды рК0ЕИТ8дЕ2-5.
Плазмиду рК0ЕИТ8дЕ2-5 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 39), с использованием плазмид рК0ЕИТ8ПдЕ2-2 и рК0ЕИТ8дЕ2-4, полученных в разделах (3) и (6).
В 30 мкл НЕВиППег 4 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) растворяют 1,0 мкг плазмиды рК0ЕИТ8дЕ2-2, к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы 8таI (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 25°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 30 мкл КЕВиППег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ВатШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепле
- 72 013224 ния к раствору добавляют 30 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,0 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. сой С15 (производимой Такага 81шхо) и затем осуществляют взаимодействие при 65°С в течение 1 ч для дефосфорилирования концов ДНК. По завершении дефосфорилирования фрагмент ДНК извлекают, осуществляя экстрагирование смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды рК0РИТ8дЕ2-4 растворяют в 30 мкл НЕВиГГег 4 (производимого №\ν Еид1аиб В1о1аЬй), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы 8таI (производимой №\ν Еид1аиб Вю1аЬй) и осуществляют реакцию расщепления при 25°С в течение 2 ч. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом и растворяют в 30 мкл НЕВиЕГег 2 (производимого №\ν Еид1аиб Вю1аЬй), к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ВатШ (производимой №\ν Еид1аиб Вю1аЬй) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 5,2 т.п.о.
Полученный фрагмент 8таI-ВатНI (0,5 мкл примерно 5,0 т.п.о.), образованный от плазмиды рК0РИТ8дЕ2-2, 4,5 мкл фрагмента 8таI-ВатНI (примерно 5,4 т.п.о.), образованного от плазмиды рК0РИТ8дЕ2-4, и 5,0 мкл БраНои Н1дй (производимого ТоуоЬо) смешивают и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 15 ч. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. со11 ЭН5а и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рК0РИТ8дЕ2-5.
(8). Конструирование плазмиды рК0РиТ8Риго.
Плазмиду рК0РиТ8Риго конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 40), с использованием плазмиды рК0РиТ8дЕ2-5, полученной в разделе (7).
В 50 мкл НЕВиЕГег 4 (производимого Κον Еид1аиб Вю1аЬй) растворяют 1,0 мкг плазмиды рК08е1ес!ОТ (производимой Бехюои), к раствору добавляют 16 единиц рестриктазы КйгП (производимой №\ν Еид1аиб Вю1аЬй) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,2 т.п.о., содержащий экспрессирующий элемент дифтерийного токсина.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды рК0РИТ8дЕ2-5 растворяют в 50 мкл НЕВиЕГег 4 (производимого №\ν Еид1аиб Вю1аЬй), к раствору добавляют 16 единиц рестриктазы КйгП (производимой №\ν Еид1аиб Вю1аЬй) и осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления к раствору добавляют 30 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,0 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. сой С15 (производимой Такага 81шхо) и затем осуществляют взаимодействие при 65°С в течение 1 ч для дефосфорилирования концов ДНК. По завершении дефосфорилирования фрагмент ДНК извлекают, осуществляя экстрагирование смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Полученный фрагмент КйгП-КйгП (1,0 мкл примерно 1,2 т.п.о.), образованный от плазмиды рК08е1ес!ОТ, 1,0 мкл фрагмента КйгП-КйгП (примерно 10,4 т.п.о.), образованного от плазмиды рК0РИТ8дЕ2-5, 3,0 мкл стерильной воды и 5,0 мкл ЫдаЕои Н1дй (производимого ТоуоЬо) смешивают и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ЭН5а и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рК0РИТ8Риго.
2. Получение клеток СНО, в которых разорвана одна копия геномной области, содержащей экзон 2 гена а-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8).
(1). Введение вектора, обеспечивающего локализацию.
Обеспечивающий локализацию участка генома РИТ8 китайского хомячка вектор рК0РиТ8Риго, сконструированный в разделе 1 данного примера, вводят в штамм 5-03, полученный в разделе 1(2) примера 8.
Ген плазмиды рК0РИТ8Риго вводят в штамм 5-03 так, как описано ниже, согласно способу электропорации [Су!о!есйио1оду, 3, 133 (1990)]. Сначала 150 мкг плазмиды рК0РиТ8Риго растворяют в 1,8 мл НЕВиГГег для 8аП (производимого №\ν Еид1аиб Вю1аЬй), к раствору добавляют 600 единиц рестриктазы 8аП (производимой №\ν Еид1аиб Вю1аЬй), затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 5 ч и получают линейный фрагмент. Реакционный раствор экстрагируют смесью фенол/хлороформ, затем осаждают этанолом и извлеченную линейную плазмиду переводят в водный раствор концентрации 1 мкг/мкл. Отдельно штамм 5-03 суспендируют в буфере К-РВ8 (137 ммоль/л КС1, 2,7 ммоль/л №С1, 8,1 ммоль/л Ка2НР04, 1,5 ммоль/л КН2Р04, 4,0 ммоль/л МдС12) и получают плотность клеток 8х107 клеток/мл. После смешивания 200 мкл клеточной суспензии (1,6 х106 клеток) с 4 мкл (4 мкг) линейной плазмиды весь объем смеси клетки-ДНК переносят в кювету Сеие Ри1йег (межэлектродное расстояние 2 мм) (производимую ВЮ-КАО) и затем осуществляют электропорацию с использованием устройства для гибридизации Сеие Рикег (производимого ВЮ-КАО) при напряжении импульса 350 В и емкости 250 мкФ. После осуществления таким образом электропорации с использованием 30 кювет клеточную суспензию суспендируют в среде ^ОМ (производимой БгГе Тес1то1още5) с добавлением 10%
- 73 013224 сыворотки плода коровы (производимой ЫГе Тес1шо1ощек) и добавки НТ (производимой ЫГе Тес1шо1од1ек) в концентрации 1х и инокулируют в 30 чашек для адгезионных культур диаметром 10 см (производимых Еа1соп). После культивирования при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% СО2 культуральные супернатанты удаляют и добавляют по 10 мл среды ГМОМ (производимой ЫГе Тес1шо1ощек) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 81СМА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе Тес1шо1ощек). После культивирования в течение 10 суток с повторением стадии замены среды с интервалами в 3-4 дня получают клеточные линии, невосприимчивые к пуромицину.
(2) . Получение клеточных линий с введенным вектором, обеспечивающим локализацию.
Из невосприимчивых к пуромицину клеточных линий, полученных в разделе (1), получают произвольно 900 колоний так, как описано далее.
Сначала из 10-см чашки, в которой образовалась колония невосприимчивых к пуромицину клеточных линий, удаляют культуральный супернатант, в чашку добавляют 7 мл фосфатного буфера и затем чашку помещают под стереоскопический микроскоп. Затем каждую колонию соскребают, отсасывают с использованием Р|реЦетап (производимой 6ΙΕ8ΟΝ) и переносят в 96-луночный планшет с круглодонными лунками (производимый Еа1соп). После обработки трипсином каждый клон инокулируют в 96-луночный планшет с плоскодонными лунками для применения для адгезионных культур (производимый Гетак1 С1акк) и культивируют в течение 1 недели с использованием среды ГМОМ (производимой ЫГе Тес1шо1ощек) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 8ГСМА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе ТесЬпо1од1ек).
После культивирования каждый клон в планшете подвергают обработке трипсином и затем смешивают с двумя объемами среды для сушки вымораживанием (20% ДМСО, 40% сыворотки плода коровы, 40% ГМОМ). Половину смеси инокулируют в 96-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионных культур (производимый Ι\νη1<ί С1акк) как планшет-реплику, в то время как оставшуюся половину смеси подвергают криоконсервации как планшет-основу. Планшет-реплику культивируют в течение 1 недели с использованием среды ГМОМ (производимой ЫГе Тес1шо1ощек) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 8ГСМА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе ТесЬпо1од1ек).
(3) . Диагностика гомологичной рекомбинации геномной ПЦР.
Диагностику гомологичной рекомбинации в 900 клонах, полученных в разделе (2), осуществляют геномной ПЦР.
Сначала из планшета-реплики, полученного в разделе (2), получают геномную ДНК каждого клона согласно известному способу [Апа11йса1 ВюсйетЫту, 201, 331 (1992)] и растворяют в течение ночи в 30 мкл ТЕ-РНКазного буфера (рН 8,0) (10 ммоль/л трис-НС1, 1 ммоль/л ЭДТК, 200 мкг/мл РНКазы А). Также создают праймер (показанный в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:26), связывающийся с последовательностью вне гомологичного участка, обеспечивающего локализацию вектора из геномного участка ЕИТ8, полученного в примере 12, и праймер (показанный в 8ЕЦ ГО ΝΟ:27), связывающийся с последовательностью 1охР в векторе.
С использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81шхо) получают 25 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8йи7о), 0,2 ммоль/л бЫТР и 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕЦ ГО ΝΟ:26 и 27)], содержащего 10 мкл раствора каждой полученной выше геномной ДНК, и осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 38 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин как едином цикле.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле и специфически амплифицированный фрагмент примерно в 1,7 т.п.о., содержащий пограничный участок между геномным участком клетки СНО и гомологичным участком вектора, обеспечивающего локализацию, идентифицируют как положительный клон. Таким способом обнаруживают один положительный клон.
(4) . Диагностика гомологичной рекомбинации геномным блоттингом по Саузерну.
Диагностику гомологичной рекомбинации в 1 клоне, положительный сигнал которого подтвержден в разделе (3), осуществляют геномным блоттингом по Саузерну.
Из планшетов-основ, криоконсервированных в разделе (2), отбирают 96-луночный планшет, содержащий положительный клон, обнаруженный в разделе (3), и инкубируют при 37°С в течение 10 мин в атмосфере с 5% СО2. После инкубации клетки из лунки, соответствующей положительному клону, собирают и инокулируют в 24-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионной культуры (производимый Сгетег). После культивирования в течение 1 недели с использованием среды ГМОМ (производимой ЫГе Тес11по1ощек) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 8ГСМА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе Тес11по1ощек) клетки инокулируют в 6-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионной культуры (производимый Сгешег). Геномную ДНК получают из клона в планшете согласно известному способу [МисШс Ас1бк Яекеагсй, 3, 2303, (1976)] и растворяют в течение ночи в 150 мкл ТЕ-РНКазного буфера (рН 8,0) (10 ммоль/л
- 74 013224 трис-НС1, 1 ммоль/л ЭДТК, 200 мкг/мл РНКазы А).
В 120 мкл ХЕВийег 3 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬк), растворяют 12 мкг полученной геномной ДНК, к раствору добавляют 25 единиц рестриктазы РкЙ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬк) и осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение ночи. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом, растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера (рН 8,0) (10 ммоль/л трис-НС1, 1 ммоль/л ЭДТК) и затем раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле. После электрофореза геномную ДНК переносят на нейлоновую мембрану согласно известному способу [Ргос. Νη11. Асаб. 8с1. И8А, 76, 3683 (1979)]. По завершении переноса нейлоновую мембрану греют при 80°С в течение 2 ч.
Отдельно получают зонд, используемый при блоттинге по Саузерну, как описано далее. Сначала создают праймеры (8ЕЦ ГО ΝΟ:28 и 29), связывающиеся с последовательностью вне участка, обеспечивающего локализацию вектора, гомологичного геномному участку РИТ8, полученного в примере 12. Затем с использованием ДНК-полимеразы Е.хТас.| (производимой Такага 81шхо) получают 20 мкл реакционного раствора [буфер Е.хТас.| (производимый Такага Зки/о), 0,2 ммоль/л бNТР и 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕЦ ГО ΝΟ:28 и 29)], содержащего 4 нг плазмиды рРИТ8£дЕ2-2, полученной в примере 12(2), и осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 25 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 74°С в течение 1 мин как едином цикле. После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 1,75% (мас./об.) агарозном геле и очищают зондовый фрагмент ДНК примерно в 230 п.о. Раствор полученного зондового фрагмента ДНК (5 мкл) метят радиоизотопом с использованием 1,75 МБк [а-32Р]бСТР и Медарпте ^NА ЬаЬеШпд 8ук!ет, бСТР (производимой Атегкйат Рйагтас1а Вю!есй).
Гибридизацию осуществляют следующим образом. Сначала нейлоновую мембрану помещают в герметично закрывающийся роллер-флакон и осуществляют предварительную гибридизацию при 65°С в течение 3 ч, добавив 15 мл раствора для гибридизации [5х 88РЕ, 50х раствора Денхардта, 0,5% (мас./об.) 8Ό8, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося]. Затем зондовую ДНК, меченную 32Р, денатурируют нагреванием и помещают во флакон. Затем нейлоновую мембрану греют при 65°С в течение ночи.
После гибридизации нейлоновую мембрану смачивают в 50 мл 2х 88С-0,1% (мас./об.) 8Ό8 и греют при 65°С в течение 15 мин. После двукратного повторения стадии промывки мембрану смачивают в 50 мл 0,2х 88С-0,1% (мас./об.) 8Ό8 и греют при 65°С в течение 15 мин. После промывки нейлоновую мембрану помещают на рентгеновскую пленку при -80°С на двое суток для проявления.
Обработкой рестриктазой РкН из аллеля РИТ8 дикого типа получают фрагмент ДНК примерно в 4,4 т.п.о. С другой стороны, фрагмент ДНК примерно в 6,0 т.п.о. получают из аллеля, в котором образуется гомологичная рекомбинация с вектором, обечпечивающим локализацию.
Таким способом находят такие специфические фрагменты примерно в 4,4 т.п.о. и примерно в 6,0 т.п.о. из геномной ДНК положительного клона в разделе (3). Так как количественное соотношение фрагментов составляет 1:1, подтверждается, что клон представляет собой клон, в котором 1 копия аллеля РИТ8 разорвана. Далее такой клон называется штаммом 1к!.ДРИТ8 2-46.
3. Делеция гена невосприимчивости к лекарственному средству из клеток СНО, в которых 1 копия гена а-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8) разрушена.
(1) . Введение экспрессирующего вектора рекомбиназы Сге.
Экспрессирующий вектор рекомбиназы Сге рВ8185 (производимый Ы£е Тес1по1од1ек) вводят в штамм 1к!.АГиТ8 2-46, полученный в разделе 2 данного примера.
Ген плазмиды рВ8185 вводят в штамм 1к!.АГиТ8 2-46, как описано далее, согласно способу электропорации [Су!о!ес1по1оду, 3, 133 (1990)]. Сначала штамм 1к!.АГиТ8 2-46 суспендируют в буфере К-РВ8 (137 ммоль/л КС1, 2,7 ммоль/л №С1, 8,1 ммоль/л Nа2НРΟ4, 1,5 ммоль/л КН2РΟ4, 4,0 ммоль/л МдС12) и получают плотность клеток 8х107 клеток/мл. После смешивания 200 мкл клеточной суспензии (1,6х106 клеток) с 4 мкг плазмиды рВ8185 весь объем смеси клетки-ДНК переносят в кювету Сепе Ри1кег (межэлектродное расстояние 2 мм) (производимую ВЮ-КАЭ) и затем осуществляют перенос гена с использованием устройства для гибридизации Сепе Ри1кег (производимого ВЮ-КАЭ) при напряжении импульса 350 В и емкости 250 мкФ. После переноса гена клеточную суспензию суспендируют в 10 мл среды ШЭМ (производимой Шс Тес1по1од1ек) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (производимой Ы£е Тес1по1од1ек) и добавки НТ (производимой Ы£е Тес1по1од1ек) в концентрации 1х, и затем разводят 20000 раз с использованием той же среды. Клетки инокулируют в 7 чашек для адгезионных культур диаметром 10 см (производимых Ра1соп) и культивируют при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% СО2. После культивирования культуральные супернатанты удаляют и добавляют по 10 мл среды ГМЭМ (производимой Ь1£е Тес1по1од1ек) с добавлением 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой Ьйе Тес1по1од1ек). Культивирование осуществляют в течение 10 суток с повторением замены среды с интервалами в 3-4 дня.
(2) . Получение клеточных линий с введенным экспрессирующим вектором рекомбиназы Сге.
- 75 013224
Из клеточной линии, полученной в разделе (1), получают произвольно 400 колоний так, как описано далее.
Сначала из 10-см чашки удаляют культуральный супернатант, в чашку добавляют 7 мл фосфатного буфера и затем чашку помещают под стереоскопический микроскоп. Затем каждую колонию соскребают, отсасывают с использованием Ρ^реΐΐетаπ (производимой С!Ь8ОН) и переносят в 96-луночный планшет с круглодонными лунками (производимый Ра1сοη). После обработки трипсином каждый клон инокулируют в 96-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионных культур (производимый Гетак1 С1азз) и культивируют в течение 1 недели с использованием среды ГМЭМ (производимой ЫГе Тес11ηο1οβ^е5) с добавлением 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе ТесйгюФ81е8).
После культивирования каждый клон в планшете подвергают обработке трипсином и затем смешивают с двумя объемами среды для сушки вымораживанием (20% ДМСО, 40% сыворотки плода коровы, 40% !МБМ). Половину смеси инокулируют в 96-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионных культур (производимый ΕνηΚί С1азз) и получают планшет-реплику, в то время как оставшуюся половину смеси подвергают криоконсервации как планшет-основу.
Затем планшет-реплику культивируют в течение 6 суток с использованием среды [МБМ (производимой ЫГе Тес11ηο1οβ^е5) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 8ЮМА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе Тесйηο1οβ^е5). Положительный клон, из которого ген невосприимчивости к пуромицину, помещенный между последовательностями 1οχΡ, удален экспрессией рекомбиназы Сге, погибает в присутствии пуромицина. Методом отбора обнаруживают 91 положительный клон.
(3). Диагностика удаления гена невосприимчивости к лекарственному средству геномным блоттингом по Саузерну.
Диагностику удаления гена невосприимчивости к лекарственному средству геномным блоттингом по Саузерну осуществляют для 6 произвольных клонов из числа положительных клонов, обнаруженных в разделе (2).
Из планшетов-основ, криоконсервированных в разделе (2), отбирают 96-луночные планшеты, содержащие 6 положительных клонов и инкубируют при 37°С в течение 10 мин в атмосфере с 5% СО2. После инкубации клетки из лунок, соответствующих каждому положительному клону, собирают и инокулируют в 24-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионной культуры (производимый Сгешег). После культивирования в течение 1 недели с использованием среды кМЭМ (производимой ЫГе Тес11ηο1οβ^е5) с добавлением 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе ТесйгюФщез) клетки инокулируют в 6-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионной культуры (производимый Сгетег). Геномную ДНК получают из каждого клона в планшете согласно известному способу [ИисЫс Аабз Векеагсй, 3, 2303 (1976)] и растворяют в течение ночи в 150 мкл ТЕ-РНКазного буфера (рН 8,0) (10 ммоль/л трис-НС1, 1 ммоль/л ЭДТК, 200 мкг/мл РНКазы А).
В 120 мкл ИЕВиГГег для ВатШ (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬз) растворяют 12 мкг полученной геномной ДНК, к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ВатИ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение ночи. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом, растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера (рН 8,0) (10 ммоль/л трис-НС1, 1 ммоль/л ЭДТК) и затем раствор подвергают электрофорезу в 0,4% (мас./об.) агарозном геле. После электрофореза геномную ДНК переносят на нейлоновую мембрану согласно известному способу Рюс. №111. Асаб. 8с1. И8А, 76, 3683 (1979)]. По завершении переноса нейлоновую мембрану греют при 80°С в течение 2 ч.
С другой стороны, получают зонд, используемый при блоттинге по Саузерну, как описано далее. Сначала создают праймеры (8ЕЦ ГО NΟ:30 и 31), связывающиеся с последовательностью вне участка обеспечивающего локализацию вектора, гомологичного геномному участку РИТ8, полученного в примере 12. Затем осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 8Ηυζο), приготовив 20 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8Ηυζο), 0,2 ммоль/л 6ΝΈΡ и 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕЦ ГО NΟ:30 и 31)], содержащего 4 нг плазмиды рРИТ8£дЕ2-2, полученной в примере 12(2). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 25 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 74°С в течение 1 мин как едином цикле. После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 1,75% (мас./об.) агарозном геле и очищают зондовый фрагмент ДНК примерно в 230 п.о. Часть полученного раствора зондовой ДНК (5 мкл) метят радиоизотопом с использованием 1,75 МБк [α-32Ρ]бСТΡ и Медарпте БНА ЬаЬеШпд 8у51ет, бСТΡ (производимой Атегзйат ΡΙκ-ιππιοι Вю1есй).
Гибридизацию осуществляют следующим образом. Сначала нейлоновую мембрану помещают в роллер-флакон и осуществляют предварительную гибридизацию при 65°С в течение 3 ч, добавив 15 мл раствора для гибридизации [5х 88ΡЕ, 50х раствора Денхардта, 0,5% (мас./об.) 8Ό8, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося]. Затем зондовую ДНК, меченную 32Р, денатурируют нагреванием, помещают во флакон и
- 76 013224 нейлоновую мембрану греют при 65°С в течение ночи.
После гибридизации нейлоновую мембрану смачивают в 50 мл 2х 88С-0,1% (мас./об.) 8Ό8 и греют при 65°С в течение 15 мин. После двукратного повторения стадии промывки мембрану смачивают в 50 мл 0,2х 88С-0,1% (мас./об.) 8Ό8 и греют при 65°С в течение 15 мин. После промывки нейлоновую мембрану помещают на рентгеновскую пленку при -80°С на двое суток для проявления.
Обработкой рестриктазой ВатШ из аллеля РИТ8 дикого типа получают фрагмент ДНК примерно в 19,0 т.п.о. Также фрагмент ДНК примерно в 12,5 т.п.о. получают из аллеля, в котором образуется гомологичная рекомбинация с вектором, обеспечивающим локализацию. Кроме того, когда ген невосприимчивости к пуромицину (примерно 1,5 т.п.о.) уделен из аллеля, в котором образуется гомологичная рекомбинация, при той же обработке образуется фрагмент ДНК примерно в 11,0 т.п.о.
Таким способом находят такие специфические фрагменты примерно в 19,0 т.п.о. и примерно в 11,0 т.п.о. из геномной ДНК 5 клонов из 6. Так как количественное соотношение указанных фрагментов составляет 1:1, подтверждается, что ген невосприимчивости к пуромицину удален из клеточных линий, в которых 1 копия геномного участка РИТ8 разорвана. Далее один из таких клонов называется 1к!.ДРИТ8 2-46-1. Результаты геномного блоттинга по Саузерну штамма 1к!.ДРИТ8 2-46-1, 1к!.ДРИТ8 2-46 и 5-03 также показаны на фиг. 41. Также штамм 1к!.ДРИТ8 2-46-1 под названием 2-46-1 депонирован 26 сентября 2001 г. как РЕВМ ВР-7755 в Щета^а! Ра!еп! Огдашкт Эерокйагу, №Шопа1 ^бШе оГ Абуапсеб И'1бик!па1 8с1епсе апб ТесЬпо1оду (АЫТ ТкикиЬа Сеп!га1 6, 1-1, Н1дакЫ 1-СЬоте ТкикиЬа-кЫ, ^агай-кеп 3058566 1арап).
4. Очистка антител, продуцированных клеточной линией с разорванным геном α-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8).
1к!.ДРИТ8 2-46-1, полученный в разделе 3 данного примера разрывом одной копии аллеля РТИ8, суспендируют в среде ГМЭМ (производимой ЫГе ТесЬпо1од1ек) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 8ЮМА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫГе ТесЬпо1о§1ек), получают плотность клеток 2х105 клеток/мл и затем 60 мл всей суспензии инокулируют в 2 колбы Т182 для адгезионного культивирования клеток (производимые Сгетег). После культивирования в течение 3 суток супернатант отбрасывают и заменяют в целом на 60 мл среды ЕХСЕЬЬ301 (производимой 1ВН Вюкшепсек).
После культивирования при 37°С в течение 7 суток в инкубаторе с 5% СО2 подсчитывают число интактных клеток и подтверждается, что их жизнеспособность почти одинаковая (у всех 30% или менее), и затем извлекают все клеточные суспензии. Клеточную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин при 4°С в течение 10 мин и извлеченный супернатант центрифугируют при 10000 об/мин при 4°С в течение 1 ч и затем фильтруют с использованием блока для фильтрации РЕ8 (производимого НАЬСЕНЕ) емкостью 150 мл с диаметром пор 0,22 мкм.
В колонку диаметром 0,8 см помещают Ргокер-А Н1дЬСарас1!у (производит Ь^οРВОСΕ88INС) на высоту 2 см и промывают 10 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,0) и 10 мл буфера 1 моль/л глицин/гЫаОН-О,15 моль/л Хао (рН 8,6) для того, чтобы уравновесить носитель. Затем через такую колонку пропускают 100 мл каждого культурального супернатанта и промывают 50 мл буфера 1 моль/л глицин/гЫаОН-0,15 моль/л №С1 (рН 8,6). После промывки элюируют антитела, адсорбированные на Ргокер-А, с использованием 2,5 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,0), элюат фракционируют на фракции по 500 мкл и каждую фракцию нейтрализуют, смешивая ее со 100 мкл 2 моль/л трис-НС1 (рН 8,5). Две фракции, содержащие антитела в высокой концентрации (всего 1,2 мл), отбирают ВСА-способом [Апа1. ВюсЬет., 150, 76 (1985)], объединяют и затем диализуют против буфера (10 моль/л цитрата)-0,15 моль/л ΝηΟ (рН 6,0) при 4°С в течение суток. После диализа раствор антител извлекают и подвергают стерилизации фильтрованием с использованием фильтра с размером пор 0,22 мкм М111ех СУ (производимого МШЫРОВЕ).
5. Цитотоксическая активность (АЭСС-активность) ш У1!го антител, продуцированных клеточной линией с разорванным геном α-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8).
Для того чтобы оценить ш У1!го цитотоксическую активность антител, полученных в чистом виде в разделе 4 данного примера, измеряют АЭСС-активность с использованием ССВ4-положительной клеточной линии ССВ4/ЕБ-4, описанной в примере 8.
Клетки ССВ4/ЕБ-4, субкультивированные в среде ВРМП640 (производимой ЫГе ТесЬпо1о§1ек), содержащей 10% сыворотки плода коровы (производимой ЫГе Тес1то1ощек) (называемой далее ВРМП640-РВ8(10)), суспендируют в 500 мкл ВРМП640-РВ8(10) при плотности 1х 106 клеток, добавляют к ним 3,7 МБк №251СгО4 и затем культивируют при 37°С в течение 90 мин для мечения клеток радиоизотопом. После центрифугирования при 1200 об/мин в течение 5 мин супернатант отбрасывают и клетки-мишени суспендируют в 5 мл среды ВРМП640-РВ8(10). Повторяют три раза стадию промывки и затем клеточную суспензию инкубируют в течение 30 мин на льду для спонтанного отделения радиоактивного вещества. Снова дважды повторяют стадию промывки, затем клетки суспендируют в 5 мл среды ВРМП640-РВ8(10) и посредством этого получают суспензию клеток-мишеней 2х105 клеток/мл.
- 77 013224
Отдельно у здорового человека берут 30 мл периферической крови, осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого ЗЕши/и РНагтасеи11са1) и затем смешивают с 30 мл физиологического раствора (производимого 015ика Рйагтасеийса1). После их смешивания 10 мл смеси осторожно нагружают на 4 мл Ьушрйоргер (производит ХУС0МЕЭ РНАВМА АЗ) и центрифугируют при комнатной температуре при 2000 об/мин в течение 30 мин. Отделившиеся фракции одноядерных клеток собирают из центрифужных пробирок, объединяют и затем суспендируют в 30 мл ВРМП640-ЕВЗ(10). После центрифугирования при комнатной температуре при 1200 об/мин в течение 15 мин супернатант отбрасывают и клетки суспендируют в 20 мл ВРМП640-ЕВЗ(10). Дважды повторяют стадию промывки и затем с использованием ВРМП640-ЕВЗ(10) получают суспензию эффекторных клеток плотностью 2,5х106 клеток/мл.
Суспензию клеток-мишеней распределяют по 50 мкл (1х104 клеток/лунку) в каждую лунку 96луночного планшета с И-образными лунками (производимого Еа1соп). Затем в каждую лунку добавляют 100 мкл суспензии эффекторных клеток (2,5х105 клеток/лунку) и посредством этого доводят отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням до 25:1. Затем с использованием ВРМП640-ЕВЗ(10) получают ряд разведенных растворов - 0,01, 0,1, 1 и 10 мкг/мл каждого из антител против ССВ4, полученных в разделе 5 примера 13, и по 50 мкл разведенных растворов добавляют в лунки, получая конечные концентрации 0,0025, 0,025, 0,25 и 2,5 мкг/мл соответственно. После осуществления взаимодействия при 37°С в течение 4 ч в атмосфере с 5% СО2 планшет центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин. Переносят 75 мкл супернатанта из каждой лунки в пробирку для ВЖ диаметром 12 мм (производимую IУАКI) и измеряют количество отделившегося 51Сг с использованием автоматического счетчика гамма-квантов МШАХ-у 5550 (производимого РАСКАВЭ).
Также вычисляют количество спонтанно отделившегося 51Сг, осуществляя такое же взаимодействие в реакционной смеси, в которую вместо суспензии эффекторных клеток и раствора антител добавляют 150 мкл ВРМП640-ЕВЗ(10). Количество общего отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя такое же взаимодействие в реакционной смеси, в которую вместо суспензии эффекторных клеток и раствора антител добавляют 100 мкл 1н. соляной кислоты и 50 мкл ВРМП640-ЕВЗ(10). С использованием полученных величин вычисляют АОСС-активность на основании уравнения (ΙΙ).
Фиг. 42 показывает АОСС-активность каждого вида антител против ССВ4. Антитела, полученные из штамма 181.АЕИТ8 2-46-1, в котором 1 копия аллеля ЕТИ8 разорвана, демонстрируют значительно более сильную АОСС-активность, чем антитела, продуцированные штаммом 5-03, представляющим собой клеточную линию СНО до разрыва гена. Также не отмечают изменений в антигенсвязывающей активности указанных антител. Такие результаты подтверждают, что АОСС-активность полученных антител можно улучшить путем разрыва аллеля ЕТИ8 в клетках-хозяевах.
Пример 14. Получение клеток СН0/ЭС44, невосприимчивых к лектину, и получение антител с использованием таких клеток.
(1). Получение клеток СН0/ЭС44, невосприимчивых к лектину.
Клетки СН0/ЭС44 выращивают до тех пор, пока они не достигнут стадии, непосредственно предшествующей слиянию, культивируя их на 75-см2 матрасе для адгезионных культур (производимом Сгешег) с использованием среды IМ^М-ЕВ3(10) [среда IМ^М, содержащая 10% сыворотки плода коровы (ЕВЗ) и добавки НТ (производимой СкВС0 ВВЬ) в концентрации 1х]. После промывки клеток 5 мл РВЗ по Дульбекко (производимым Iην^ΐ^οдеη) к ним добавляют 1,5 мл 0,05% трипсина (производимого ^у^оде^, разбавленного РВЗ по Дульбекко, и инкубируют при 37°С в течение 5 мин для отделения клеток от дна матраса. Отделившиеся клетки извлекают операцией центрифугирования, обычно используемой при культивировании клеток, и суспендируют в среде кМОМ-ЕВЗ^), получают плотность клеток 1х 105 клеток/мл и затем к клеткам добавляют 0,1 мкг/мл алкилирующего агента Жметил-Н'-нитро-Инитрозогуанидина (называемого далее ММЫС, производит З1дша) или его не добавляют. После инкубации при 37°С в течение 3 суток в инкубаторе с 5% СО2 (производимом ТАВАР) культуральный супернатант отбрасывают и клетки снова промывают, отслаивают и извлекают теми же операциями, суспендируют в среде IМ^М-ЕВ3(10), затем инокулируют в 96-луночный культуральный планшет для адгезионных культур (производимый IУАКI С1а§8) и получают плотность клеток 1000 клеток/лунку. В каждую лунку добавляют в конечной концентрации в среде 1 мг/мл агглютинина Ьепк сиНпапк (далее называется ЬСА, производится Уес!ог), 1 мг/мл агглютинина А1еипа аигапйа (лектин А1еипа аигапба; далее называется ААЬ, производится Уес1ог) или 1 мг/мл агглютинина фасоли обыкновенной (лейкоагглютинин РЬа8ео1и8 уи1дап§; далее называется Ь-РНА, производится Уес1ог). После культивирования при 37°С в течение 2 недель в инкубаторе с 5% СО2 получают видимые колонии как невосприимчивые к лектину СН0/ЭС44. Что касается полученных СН0/ЭС44, то ЬСА-устойчивую клеточную линию называют СН0-ЬСА, ААЕ-устойчивую клеточную линию называют СНО-ААЬ и Ь-РНА-устойчивую клеточную линию называют СНО-РНА. Когда проверяют невосприимчивость указанных клеточных линий к различным видам лектина, обнаруживается, что СН0-ЬСА невосприимчива также к ААЬ, а СН0-ААЬ невосприимчива также к ЬСА. Кроме того, СН0-ЬСА и СН0-ААЬ также показывают невосприимчивость к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, идентичную структуре углеводной цепи, узнаваемой
- 78 013224
ЬСА и ААЬ, а именно лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано с положением 6 остатка N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце через α-связь в углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь. Конкретно, обнаружено, что СН0-ЬСА и СН0-ААЕ могут демонстрировать невосприимчивость и выживание даже в среде с добавлением 1 мг/мл в конечной концентрации агглютинина гороха (агглютинин Ркиш кайуцт; далее называется РЗА, производится Уес!ог). Кроме того, даже когда алкилирующий агент МИКО не добавляют, возможно получение клеточных линий, невосприимчивых к лектину, увеличением числа обрабатываемых клеток. Далее указанные клеточные линии используют при анализах.
(2) . Получение клеток, продуцирующих человеческие химерные антитела против ССК4.
Экспрессирующую плазмиду для человеческих химерных антител против ССК4 ρКАNТЕX2160 вводят в три клеточные линии, невосприимчивые к лектину, полученные в (1), способом, описанным в примере 8, осуществляют амплификацию гена с помощью лекарственного средства МТХ и получают клеточную линию, продуцирующую человеческие химерные антитела против ССК4. Измеряя количество синтезарованных антител методом ЕЫЗА, описанным в примере 8-2, из каждой линии СН0-ЬСА, СН0-ААЕ и СНО-РНА получают трансформанты, экспрессирующие антитела. Что касается каждого полученного трансформанта, то трансформант, полученный из СН0-ЬСА, называют СН0/ССК4-ЕСА, трансформант, полученный из СН0-ААЬ, называют СН0/ССК4-ААЬ, и трансформант, полученный из СНО-РНА, называют СН0/ССК4-РНА. Также СН0/ССК4-ЕСА под названием №да-13 депонирован 26 сентября 2001 г. как ЕЕКМ ВР-7756 в Щетайопа! Ра!еп! 0гдаш8т Оерокйагу, Nаΐ^оηа1 ЕМНШе оГ Айуапсей Е^йикИлгН Заепсе апй ТесНпо1оду (АЫТ ТкикиЬа Сепйа1 6, 1-1, Н|дакН| 1-СНоте ТкикиЬа-кНг ΙΕπгакккеп 305-8566 1арап).
(3) . Продуцирование антител с сильной АОСС-активностью клетками СНО, невосприимчивыми к лектину.
С использованием трех трансформантов, полученных в (2), получают очищенные антитела с использованием способа, описанного в примере 8-3. Антигенсвязывающую активность каждого типа очищенных человеческих химерных антител против ССК4 оценивают с использованием ЕЫЗА, описанного в примере 8-2. Антитела, продуцированные всеми трансформантами, показывают антигенсвязывающую активность, подобную активности антител, продуцированных рекомбинантной клеточной линией (штамм 5-03), полученной в примере 8 с использованием обычных клеток СН0/ОО44 в качестве хозяев. С использованием таких очищенных антител АОСС-активность каждого типа человеческих химерных антител против ССК4 оценивают согласно способу, описанному в примере 8-7. Результаты приводятся на фиг. 43. При сравнении с антителами, продуцированными штаммом 5-03, в антителах, продуцированных СН0/ССК4-ЕСА и СН0/ССК4-ААЕ, наблюдают АОСС-активность выше примерно в 100 раз. С другой стороны, не отмечают существенного повышения АЭСС-активности в антителах, продуцированных СН0/ССК4-РНА. Также, когда АОСС-активности антител, продуцированных СН0/ССК4-ЕСА и УВ2/0 сравнивают согласно способу, описанному в примере 8-7, обнаруживают, что антитела, продуцированные СН0/ССК4-ЕСА, показывают более сильную АОСС-активность, чем антитела, продуцированные 5-03, подобно случаю с антителами КМ2760-1, продуцированными клеточной линией УВ2/0, полученными в примере 8-1 (фиг. 44).
(4) . Анализ углеводных цепей антител, продуцированных клетками СНО, невосприимчивыми к лектину.
Анализируют углеводные цепи человеческих химерных антител против ССК4, очищенных в (3). Раствор очищенных антител каждого типа обменивают на 10 мМ раствор КН2Р04 с использованием ИЙта Егее 0,5-10К (производимого М1Шроге). Обмен осуществляют таким способом, что коэффициент обмена становится 80 крат или больше. Концентрацию антител после обмена раствора измеряют с использованием иУ-1600 (производимого ЗНЕпайхи). Коэффициент молярного поглощения вычисляют из аминокислотной последовательности каждого антитела на основании приведенного далее уравнения (ΙΙΙ) [Айуапсек ш Рго!ет СйетШгу, 12, 303 (1962)], и определяют концентрацию, принимая поглощение при 280 нм за 1,38 мг/мл.
- 79 013224
моль/л = А х п1 + В х п2 + С х пЗ (III)
моль/мл = Е1 моль/л/МП
моль/л * коэффициент поглощения при 280 нм (МГ'Нмл.сц-1)
Е1 моль/мл ♦ коэффициент молярного поглощения при 280 нм
<М-'· -см’1)
А: коэффициент молярного поглощения триптофана при
280 нм = 5550 (М'1-см‘1)
В: коэффициент молярного поглощения тирозина 280 нм = 1340 (Г-Г'-см’1) при
С: коэффициент молярного поглощения цистина при
280 нм = 200 (М^-см-1)
п1: число триптофана на 1 молекулу антитела
п2 : число тирозина на 1 молекулу антитела
пЗ: число цистина на 1 молекулу антитела
МН: молекулярная масса антитела (г/моль)
В пробирку Нуйгас1иЬ δ-204 помещают 100 мкг каждого антитела и сушат с использованием центробежного испарителя.
Высушенный образец в пробирке подвергают гидразинолизу с использованием Нуйгас1иЬ, производимого Но1пеп. Образец вводят во взаимодействие с гидразином при 110°С в течение 1 ч с использованием реагента гидразинолиза, производимого НоИпеп |Ме11юй оГЕп7уто1оду, 33, 263 (1982)]. По завершении реакции гидразин выпаривают при пониженном давлении и в пробирке восстанавливают комнатную температуру, оставляя ее на 30 мин. Затем добавляют 250 мкл агента ацетилирования, производимого Но1пеп, и 25 мкл уксусного ангидрида и затем все тщательно перемешивают для взаимодействия при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем добавляют еще 250 мкл агента ацетилирования и 25 мкл уксусного ангидрида и затем тщательно перемешивают для взаимодействия при комнатной температуре в течение 1 ч. Образец замораживают при -80°С в лиофильной сушилке и проводят сушку вымораживанием в течение примерно 17 ч. Углеводные цепи извлекают из лиофилизованного образца с использованием набора Се11и1оке Сагййде С1усап Ргерагайоп, производимого Такага 811ихо Со., Ь!й. Раствор образца углеводной цепи сушат с использованием центробежного испарителя и затем подвергают флуоресцентному мечению 2-аминопиридином [1. Вюсйет., 95, 197 (1984)]. Раствор 2-аминопиридина получают, добавляя 760 мкл НС1 на 1г 2-аминопиридина (раствор 1 х РА) и разбавляя раствор в 10 раз водой, очищенной обратным осмосом (10-кратно разведенный раствор РА). Получают раствор цианоборогидрида натрия, добавляя 20 мкл раствора 1 х РА и 430 мкл воды, очищенной обратным осмосом, на 10 г цианоборогидрида натрия. К образцу добавляют 67 мкл 10-кратно разведенного раствора РА и затем осуществляют взаимодействие при 100°С в течение 15 мин, реакционная смесь охлаждается спонтанно, затем к ней добавляют еще 2 мкл раствора цианоборогидрида натрия и затем осуществляют взаимодействие при 90°С в течение 12 ч для флуоресцентного мечения образца углеводных цепей. Группу углеводных цепей с флуоресцентной меткой (РА-обработанная группа углеводных цепей) отделяют от избытка реагента с использованием колонки с Зирегйех РерЕйе НК 10/30 (производимым Рйагтааа). Данную стадию осуществляют с использованием 10 мМ раствора бикарбоната аммония как элюента при скорости потока 0,5 мл/мин и при температуре колонки, равной комнатной температуре, и с использованием детектора флуоресценции с длиной волны возбуждения 320 нм и длиной волны флуоресценции 400 нм. Элюат извлекают через 20-30 мин после добавления образца, сушат с использованием центробежного испарителя и используют как очищенные РА-обработанные углеводные цепи. Затем осуществляют анализ очищенных РА-обработанных углеводных цепей методом ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием колонки с СЬС-ΟΌδ (производимым ЗЫтай/и, 06,0 нм х 159 нм). Данную стадию осуществляют при температуре колонки 55°С и скорости потока 1 мл/мин с использованием детектора флуоресценции с длиной волны возбуждения 320 нм и длиной волны флуоресценции 400 нм. Колонку уравновешивают 10 мМ натрийфосфатным буфером (рН 3,8) и осуществляют элюирование в течение 80 мин 0,5% 1-бутанолом с линейным градиентом плотности. Каждую РА-обработанную углеводную цепь идентифицируют анализом после затухания источника каждого пика выделенных РА-обработанных углеводных цепей с использованием времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с участием матрицы (анализ методом МΛ^^I-ТΟΕ-М§), сравнивая позиции элюирования с эталонами РА-обработанных углеводных цепей, производимыми Такага ЗИи/о, и анализом ВЭЖХ с обращенной фазой после расщепления каждой РА-обработанной углеводной цепи с использованием различных ферментов (фиг. 45). Содержание каждой углеводной цепи вычисляют по площади пика РА-обработанной углеводной цепи при анализе методом ВЭЖХ с обращенной фазой. РА-обработанные углеводные цепи, чьи редуцирующие
- 80 013224 концы не являются N-ацетилглюкозамином, исключают из вычисления площади пика, поскольку они являются примесями или побочными продуктами при получении РА-обработанных углеводных цепей.
Анализ осуществляют так же, как в примере 11(6), с использованием натрийфосфатного буфера (рН 3,8) как буфера А и натрийфосфатного буфера (рН 3,8)+0,5% 1-бутанола как буфера В.
На фиг. 45 вычислены доля группы углеводных цепей без α-1,6-фукозы из площади, занимаемой пиками (ί)-(ίν) из числа пиков (ί)-(νίίί) и доля группы углеводных цепей, связанных с α-1,6-фукозой, из площади, занимаемой пиками (ν)-(νίίί) из числа пиков (ί)-(νίίί).
Результаты анализа структуры углеводных цепей очищенных человеческих химерных антител против ССВ4, продуцированных клеточными линиями, невосприимчивыми к лектину, приводятся в табл. 6. Результаты показывают анализ углеводных цепей очищенных человеческих химерных антител против ССВ4, продуцированных клеточными линиями, невосприимчивыми к лектину. В таблице показана доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы (%), вычисленная из площадей пиков путем анализа по способу, описанному в примере 11(6).
Таблица 6
Клетки, продуцирующие антитела Сложные двухцепочечные углеводные цепи без а-1,6-фукозы (%)
Штамм 5-03 9
Штамм СНО/ССК4-ЦСА 48
Штамм СН0/ССК4-ААЪ 27
Штамм СНО/ССК4-РНА 8
При сравнении с антителами, продуцированными штаммом 5-03, доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы повышается с 9 до 48% в антителах, продуцированных СН0/ССВ4-ЬСА, при вычислении по площади анализируемых пиков. Доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы повышается с 9 до 27% в антителах, продуцированных СН0/ССВ4-ААЬ. С другой стороны, изменения в характере углеводных цепей и доле углеводных цепей без α-1,6-фукозы в клеточной линии, невосприимчивой к РНА, при сравнении со штаммом 5-03 обнаруживаются с трудом.
Пример 15. Анализ клеточной линии СНО, невосприимчивой к лектину.
1. Анализ уровня экспрессии фермента СМЭ в клеточной линии СН0/ССВ4-ЬСА, продуцирующей человеческие химерные антитела против ССВ4.
Уровень экспрессии каждого из генов СМЭ (С^Ρ-маннозо-4,6-дегидратазы), СЕΡΡ (С^Ρ-кето-6дезоксиманнозо-3,5-эпимеразы, 4-редуктазы) и ЕХ (С^Ρ-бета-^-фукозопирофосфорилазы), известных как ферменты биосинтеза фукозы, и ЕиТ8 (α-1,6-фукозилтрансферазы) как фукозотрансферазы в клеточной линии СН0/ССВ4-ЬСА, продуцирующей человеческие химерные антитела против ССВ4, полученной в примере 14, анализируют с использованием метода ВТТСВ.
(1) . Получение РНК из различных клеточных линий.
Каждый вид клеток СН0/ЭС44, клеточную линию 5-03, полученную в примере 8-1(2), и клеточную линию СН0/ССВ4-ЬСА, продуцирующую человеческие химерные антитела против ССВ4, полученную в примере 14(2), субкультивируют при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 и затем культивируют в течение 4 суток. После культивирования из 1х 107 клеток каждой клеточной линии получают полную РНК с использованием набора В№аку ΡιόΙβΛ М1ш (производимого О^СЕХ) согласно инструкциям изготовителя. Затем синтезируют одноцепочечную кДНК из 5 мкг каждой РНК в 20 мкл реакционного раствора с использованием системы для синтеза первой цепи ЗОТЕВ ЗСВШТ для ВТТСВ (производимой ИВС0 ВВЬ) согласно инструкциям изготовителя.
(2) . Анализ уровня экспрессии гена СМЭ с использованием ВТТСВ.
Для того чтобы амплифицировать кДНК СМЭ методом ΡСВ на основе последовательности кДНК СМЭ, полученной из клеток СНО, показанной в примере 17-1, получают 24-мерный синтетический ДНК-праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в ЗЕЦ ΙΌ N0:32, и 26-мерный синтетический ДНК-праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в ЗЕЦ ΙΌ N0:33.
Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1 х буфер ЕхТас.| (производимый Такага Зй^о), 0,2 мМ бЛГВ, 0,5 единиц полимеразы ЕхТад (производимой Такага 31и^о) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров ЗЕЦ ΙΌ N0:32 и 33], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из каждой клеточной линии в разделе (1), и осуществляют ПЦР с использованием ЭКА Тйегта1 Сус1ег 480 (производимого Ρе^к^η Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После осуществления электрофореза в агарозном геле 10 мкл реакционного раствора ПЦР фрагменты ДНК окрашивают с использованием СуЬег Сгееп (производимого ВМА) и затем определяют количество фрагмента ДНК примерно в 350 п.о. с использованием Е1иог Епадег δΙ (производимого Мо1еси1аг Оупатюк).
(3) . Анализ уровня экспрессии гена СЕΡΡ с использованием ВТТСВ.
Для того чтобы амплифицировать кДНК СЕΡΡ методом ПЦР на основе последовательности кДНК
- 81 013224
ОРРР, полученной из клеток СНО, показанной в примере 16-2, получают 27-мерный синтетический ДНК-праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕС ΙΌ N0:34, и 23-мерный синтетический ДНК-праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕС ΙΌ N0:35.
Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер ЕхТад (производимый Такага 8й^о), 0,2 мМ ёХГР, 0,5 единиц полимеразы ЕхТад (производимой Такага 81и^о) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8ЕС ΙΌ N0:34 и 35], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из каждой клеточной линии в разделе (1), и осуществляют ПЦР с использованием ^NА Тйегша1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 24 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После осуществления электрофореза в агарозном геле 10 мкл реакционного раствора ПЦР фрагменты ДНК окрашивают с использованием СуЬег Огееп (производного ВМА) и затем определяют количество фрагмента ДНК примерно в 600 п.о. с использованием Р1иог Епадег 8Ι (производимого Μο1еси1а^ Пупатюк).
(4) . Анализ уровня экспрессии гена РХ с использованием ЯТ-РСЯ.
Для того чтобы амплифицировать кДНК РХ методом РСЯ на основе последовательности кДНК РХ, полученной из клеток СНО, показанной в примере 16-1, получают 28-мерный синтетический ДНК-праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕС ΙΌ N0:36, и 28-мерный синтетический ДНК-праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕС ΙΌ N0:37.
Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1 х буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8й^о), 0,2 мМ ёХТР, 0,5 единиц полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81и^о) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8ЕС ΙΌ N0:36 и 8ЕС ΙΌ N0:37], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из каждой клеточной линии в разделе (1), и осуществляют ПЦР с использованием ^NА Тйегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 22 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После осуществления электрофореза в агарозном геле 10 мкл реакционного раствора ПЦР фрагменты ДНК окрашивают с использованием СуЬег Огееп (производимого ВМА) и затем определяют количество фрагмента ДНК примерно в 300 п.о. с использованием Р1иог Епадег 8Ι (производимого Μο1еси1а^ Оупатюк).
(5) . Анализ уровня экспрессии гена РИТ8 с использованием ЯТ-РСЯ.
Для того чтобы амплифицировать кДНК РИТ8 методом ПЦР, получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8й^о), 0,2 мМ ёХГР, 0,5 единиц полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81и^о) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8ЕС ΙΌ N0:13 и 14], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из каждой клеточной линии в разделе (1), и осуществляют ПЦР с использованием ^NА Тйегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 20 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После осуществления электрофореза в агарозном геле 10 мкл реакционного раствора ПЦР фрагменты ДНК окрашивают с использованием СуЬег Огееп (производного ВМА) и затем определяют количество фрагмента ДНК примерно в 600 п.о. с использованием Р1иог Епадег 8Ι (производимого Μο1еси1а^ Оупатюк).
(6) . Анализ уровня экспрессии гена β-актина с использованием ЯТ-РСЯ.
Для того чтобы амплифицировать кДНК β-актина методом ПЦР, получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8й^о), 0,2 мМ ёХГР, 0,5 единиц полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81и.^о) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8ЕС ΙΌ N0:15 и 16], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из каждой клеточной линии в разделе (1) , и осуществляют ПЦР с использованием ^NА Тйегша1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 14 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После осуществления электрофореза в агарозном геле 10 мкл реакционного раствора ПЦР фрагменты ДНК окрашивают с использованием СуЬег Огееп (производимого ВМА) и затем определяют количество фрагмента ДНК примерно в 800 п.о. с использованием Р1иог Епадег 8Ι (производимого Μο1еси1а^ Оупатюк).
(7) . Уровни экспрессии генов ОЫЭ, ОРРР, РХ и РИТ8 в каждой клеточной линии.
Количество ПЦР-амплифицированного фрагмента каждого гена в штамме 5-03 и СН0/ССЯ4-ЬСА вычисляют путем деления величин, соответствующих количествам ПЦР-амплифицированных фрагментов, полученных из кДНК ОЫЭ, ОРРР, РХ и РИТ8 в каждой клеточной линии, определенных в разделах (2) -(6), на величину, соответствующую количеству ПЦР-амплифицированного фрагмента, полученного из кДНК β-актина в каждой клеточной линии, и принимая количество ПЦР-амплифицированных фрагментов в клетках СН0/ОО4 4 за 1. Результаты приводятся в табл. 7.
- 82 013224
Таблица 7
СМО СГРР ГХ ?ит8
Штамм СНО/ОС44 1 1 1 1
Штамм 5-03 1,107 0,793 1, 093 0,901
Клетки СН0/ССК4-ЬСА, невосприимчивые к ЬСА, полученные из штамма 5-03 0,160 0,886 0, 920 0,875
Как видно из табл.7, уровень экспрессии гена в СН0/ССК4-ЙСА снижается до примерно 1/10 по сравнению с другими клеточными линиями. В данном случае осуществляют два независимых испытания и используют средние величины.
2. Анализ с использованием продуцирующих человеческие химерные антитела против ССК4 СН0/ССК4-БСА, в которых усилена экспрессия СМО.
(1). Конструирование экспрессирующего вектора рАСЕ249СМО для гена СМО, полученного из клеток СНО.
На основе последовательности кДНК СМЭ, полученной из клеток СНО в примере 17-1, получают 28-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕО ГО N0:38, и 29-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ГО N0:39. Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер ЕхТад (производимый Такага 8йи/о), 0,2 мМ йкТР, 0,5 единиц полимеразы Ех Тад (производимой Такага 8йихо) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8Е0 ГО N0:38 и 39], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК СМЭ, полученной из СНО в разделе 1(1) данного примера, и осуществляют ПЦР с использованием ^NА Тйегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 8 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 58°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин как едином цикле и затем 22 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. По завершении реакции реакционный раствор ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 600 п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого В10 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент ДНК соединяют с вектором рТ7В1ие(К) (производимым №хадеп) с использованием набора ^NА Ыдайоп (производимого Такага 8йи/о), с использованием полученной рекомбинантной плазмиды трансформируют Е. сой ОН5« (производимую ТоуоЬо) и получают плазмиду т1-С (ср. фиг. 46).
Затем на основе полученной из клеток СНО последовательности кДНК СМЭ, полученной в примере 17-1, получают 45-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ГО N0:40, и 31-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е0 ГО N0:41. Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер ЕхТад (производимый Такага 8йи/о), 0,2 мМ йкТР, 0,5 единиц полимеразы Ех Тад (производимой Такага 81шхо) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8Е0 ГО N0:40 и 41], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК СМЭ, полученной из клеток СНО в разделе 1(1) данного примера, и осуществляют ПЦР с использованием ^NА Тйегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 8 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 57°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин как едином цикле и затем 22 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. По завершении реакции реакционный раствор ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 150 п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент ДНК соединяют с вектором рТ7В1ие(К) (производимым №хадеп) с использованием набора ^NА Ыдайоп (производимого Такага 8йи/о), с использованием полученной рекомбинантной плазмиды трансформируют Е. сой ОН5« (производимую ТоуоЬо) и получают плазмиду АТС (ср. фиг. 47).
Затем 3 мкг плазмиды СН0-СМО, полученной в примере 17-1, вводят во взаимодействие с рестриктазой 8ас! (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсоГО (производимой Такага 8йихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат ДНК фракционируют электрофорезом в агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК примерно в 900 п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Плазмиду т1-С (1,4 мкг) вводят во взаимодействие с рестриктазой 8ас! (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсоГО (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК примерно в 3,1 т.п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные фрагменты ДНК лигируют с использованием набора ^NА Ыдайоп (производимого Такага 8йи/о), с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ОН5« и получают плаз- 83 013224 миду АТ-Щ-) (ср. фиг. 48).
Затем 2 мкг плазмиды АТ-Ы(-) вводят во взаимодействие с рестриктазой ВатШ (производимой Такага Зйихо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсоР! (производимой Такага Зйихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 1 т.п.о. с использованием набора Сеие С1еаи ΙΙ (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Плазмиду рВ1иекспрГ ЗК(-) (3 мкг; производит ЗГгаГадеие) вводят во взаимодействие с рестриктазой ВатН (производимой Такага Зйихо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ΕсοРI (производимой Такага Зйихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК примерно в 3 т.п.о. с использованием набора Сеие С1еаи ΙΙ (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные фрагменты ДНК лигируют с использованием набора ЫдаГюи (производимого Такага Зйихо), с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ЭН5а и получают плазмиду АТ-М-) в РВЗ (ср. фиг. 49).
Затем 2 мкг плазмиды АТ-Ы(-) в РВЗ вводят во взаимодействие с рестриктазой НшйШ (производимой Такага Зйихо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ΕсοРI (производимой Такага Зйихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 4 т.п.о. с использованием набора Сеие С1еаи ΙΙ (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Часть плазмиды АСТ (2 мкг) вводят во взаимодействие с рестриктазой НшйШ (производимой Такага Зйихо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ΕсοРI (производимой Такага Зйихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК примерно в 150 п.о. с использованием набора Сеие С1еаи ΙΙ (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные соответствующие фрагменты ДНК лигируют с использованием набора ^NΑ ЫдаГюи (производимого Такага Зйихо), с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ЭН5а и получают плазмиду АТ в РВЗ (ср. фиг. 50).
Затем 2 мкг плазмиды рАСЕ249 вводят во взаимодействие с рестриктазами НшйШ и ВатН (обе производятся Такага Зйихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 6,5 т.п.о. с использованием набора Сеие С1еаи ΙΙ (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Плазмиду АТ (2 мкг) в РВЗ вводят во взаимодействие с рестриктазами НшйШ и ВатШ (обе производятся Такага Зйихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК примерно в 1,2 т.п.о. с использованием набора Сеие С1еаи ΙΙ (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные соответствующие фрагменты ДНК лигируют с использованием набора ^NΑ Ыдайои (производимого Такага Зйихо), с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ЭН5а и получают плазмиду рАСЕ249СМО (ср. фиг. 51).
(2) . Устойчивая экспрессия гена СМО в СН0/ССР4-БСА.
Экспрессирующий вектор рАСЕ2 49СМО (5 мкг) для гена СМО, полученного из клеток СНО, переводят в линейную форму расщеплением его рестриктазой ΕφΙ (производимой NΕА ΕNС^ΑN^ ВЮЬАВЗ) и вводят в 1,6х106 клеток СН0/ССР4-БСА электропорацией [СуГоГесйио1оду, 3, 133 (1990)]. Затем клетки суспендируют в 30 мкл среды IМ^М-йΕΒЗ(10) [среда IМ^М (производимая СШС0 ВРЬ) с добавлением 10% йЕВЗ], содержащей 200 нМ МТХ (производимого ЗЮМА), и культивируют с использованием 182-см2 матраса (производимого Сгетег) при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2. После культивирования среду заменяют на среду ПМОМ-йЕВЗ (10), содержащую 0,5 мг/мл гигромицина и 200 нМ МТХ (производимого ЗЮМА), затем культивируют в течение 19 суток и получают колонии трансформантов, невосприимчивых к гигромицину.
Тем же способом в СН0/ССР4-БСА вводят вектор рАСЕ249 и получают колонии трансформантов, невосприимчивых к гигромицину.
(3) . Культивирование СН0/ССР4-БСА с экспрессированным геном СМО, и очистка антител.
С использованием среды IМ^М-йΕΒЗ(10), содержащей 200 нМ МТХ (производимого ЗЮМА), культивируют трансформированные клетки, экспрессирующие СМО, с использованием 182-см2 матраса (производимого Сгетег) при 37°С в инкубаторе с 5% СО2. Через несколько суток, когда плотность клеток достигнет стадии слияния, культуральный супернатант отбрасывают и клетки промывают 25 мл буфера РВЗ (производимого СШС0 ВРЬ) и смешивают с 35 мл среды ЕХСЕЬЬ301 (производимой ГРН). После культивирования при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 в течение 7 суток культуральный супернатант извлекают. Химерные антитела против ССР4 очищают с использованием Ргокер-А (производимого М11йроге) согласно инструкциям изготовителя.
Тем же способом культивируют трансформированные клетки с введенным вектором рАСЕ249 и за
- 84 013224 тем извлекают химерные антитела против ССЯ4, очищенные от культурального супернатанта.
(4) . Измерение невосприимчивости к лектину в трансформированных клетках.
Трансформированные клетки, экспрессирующие СМО, полученные в разделе (2), суспендируют в среде ГМОМ-бЕВ8(10), содержащей 200 нМ МТХ (производимого 8ГСМА) и 0,5 мг/мл гигромицина, получают плотность клеток 6х104 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого Ι\νη1<ί С1акк) по 50 мкл/лунку. Затем в планшет добавляют среду, полученную суспендированием ЬСА (агглютинин Ьепк сийпапк; производится УесГог ЬаЬога1опек) в концентрациях 0, 0,4, 1,6 или 4 мг/мл в среде ГМПМ-бЕВ8(10), содержащей 200 нМ МТХ (производимого 8ГСМА) и 0,5 мг/мл гигромицина, по 50 мкл/лунку, и затем осуществляют культивирование при 37°С в течение 96 ч в инкубаторе с 5% СО2. После культивирования добавляют У8Т-Г (производится ВоеЕппдег) по 10 мкл/лунку и инкубируют при 37°С в течение 30 мин в инкубаторе с 5% СО2 для появления окраски, затем измеряют поглощение при 450 и 595 нм (обозначаемое далее ΟΌ450 и ΟΌ595 соответственно). Таким же способом проводят измерения с трансформированными клетками с введенным вектором рАСЕ249. Осуществляют два независимых испытания.
Фиг. 52 показывает число выживших клеток в каждой лунке в процентах, когда величину, вычисленную вычитанием ΟΌ595 из ΟΌ450, измеренных выше, используют как число выживших клеток каждой группы клеток, и число выживших клеток в каждой лунке без ЬСА принимают за 100%. Как видно на фиг. 52, падение невосприимчивости к ЬСА отмечают в ΟΉΟ/Ο’Ο’Κ4-ΕΟΆ с экспрессированным СМО, и уровень выживаемости в присутствии 0,8 мг/мл ЬСА составляет примерно 20%. С другой стороны, в ΟΉΟ/ΟΌ’Κ4-ΕΟΆ с введенным вектором рАСЕ249 уровень выживаемости в присутствии 0,2 мг/мл ЬСА составляет 100%, уровень выживаемости составляет 80% даже в присутствии 0,8 мг/мл ЬСА. На основании таких результатов предполагается, что уровень экспрессии гена СМО в СНΟ/ССЯ4-^СΑ падает, и в результате получают невосприимчивость к ЬСА.
(5) . Цитотоксическая активность (АЭСС-активность) ш уПго химерных антител против ССЯ4, полученных из ί.ΉΟ/ί.’ί.Έ4-Εί.Ά с экспрессированным СМО.
Для того чтобы оценить ш уПго цитотоксическую активность очищенных химерных антител против ССЯ4, полученных в разделе (3), АЭСС-активность измеряют согласно способам, описанным далее.
ί). Получение суспензии клеток-мишеней.
Добавляют эквивалент 3,7 МБк радиоактивного вещества Ν-κΆγΟ.-ι к 1х 106 клеткам ССЯ4/ЕЬ-4 (ср. пример 8-7), культивированным с использованием среды, полученной добавлением 500 мкг/мл сульфата С418 (производимого ЫасаЫ Текцие) к среде ЯРМГ1640-ЕВ8(10), и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 90 мин, посредством чего клетки метят радиоизотопом. По завершении реакции клетки три раза промывают, суспендируя их в среде ЯРМГ1640-ЕВ8(10) с последующим центрифугированием, ресуспендируют в среде и затем инкубируют при 4°С в течение 30 мин на льду для осуществления спонтанного отделения радиоактивного вещества. После центрифугирования клетки доводят до содержания 2х105 клеток/мл, добавляя 5 мл среды ЯРМГ1640-ЕВ8(10), и используют в качестве суспензии клеток-мишеней.
(ίί). Получение суспензии эффекторных клеток.
У здорового человека берут 50 мл венозной крови и осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого Такеба Рйа^шасеиΐ^са1). С использованием ЕутрЕоргер (производит Ыусогаеб Ркагта А8) смесь центрифугируют согласно инструкциям изготовителя для отделения слоя одноядерных клеток. Клетки промывают трехкратным центрифугированием с использованием среды ЯРМГ1640-ЕВ8(10) и затем снова суспендируют в среде, получают суспензию с плотностью клеток 2х106 клеток/мл и используют в качестве суспензии эффекторных клеток.
(ίίί). Измерение АЭСС-активности.
Суспензию клеток-мишеней, полученную в (ί), распределяют по 50 мкл (1х 104 клеток/лунку) в каждую лунку 96-луночного планшета с И-образными лунками (производимого Еа1соп). Затем в лунки добавляют 100 мкл суспензии эффекторных клеток, полученной в (ίί) (2х105 клеток/лунку, отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням составляет 25:1). Затем добавляют каждое из химерных антител против ССЯ4 (химерные антитела против ССЯ4, очищенные в разделе (3), и КМ2760-1 и КМ3060), получают конечную концентрацию от 0,0025 до 2,5 мкг/мл и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 4 ч. По завершении реакции планшет центрифугируют и измеряют количество 51 Сг в супернатанте с использованием счетчика γ-квантов. Количество спонтанно отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя ту же процедуру с использованием одной среды вместо суспензии эффекторных клеток и раствора антител, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. Количество общего отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя ту же процедуру с использованием одной среды вместо раствора антител, и добавляя 1н. соляную кислоту вместо суспензии эффекторных клеток, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. АЭСС-активность вычисляют на основании уравнения (ГГ).
Результаты измерения АЭСС-активности приводятся на фиг. 53. Как видно на фиг. 53, АЭССактивность очищенных химерных антител против ССЯ4, полученных из ί.ΉΟ/ί.'ί.Έ4-Εί.Ά с экспрессированным СМО, снижается так же, как в случае КМ3060, полученных в примере 8. С другой стороны,
- 85 013224
АБСС-активность очищенных химерных антител против ССВ4, полученных из СНО/ССВ4-БСА с введенным вектором рАСЕ249, имеет уровень, подобный АБСС-активности очищенных химерных антител против ССВ4, полученных из СНО/ССВ4-БСА. На основании таких результатов предполагается, что уровень экспрессии гена СМБ в СНО/ССВ4-БСА падает и в результате можно получить антитела с сильной АБСС-активностью.
(б). Анализ углеводных цепей химерных антител против ССВ4, полученных из СНО/ССВ4-БСА с экспрессированным СМБ.
Углеводные цепи, связывающиеся с очищенными химерными антителами против ССВ4, полученными в разделе (3), анализируют согласно способу, описанному в примере 14(4), и результаты анализа приводятся на фиг. 55. По сравнению с очищенными химерными антителами против ССВ4, полученными из СНО/ССВ4-БСА в примере 14, доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы в очищенных химерных антителах, полученных из СНО/ССВ4-БСА с экспрессированным СМБ, снижается до 9% при вычислении из площади пиков. Таким образом, видно, что доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы в антителах, продуцированных клетками, снижается до уровня, подобного уровню в антителах, продуцированных 5-03, за счет экспрессии гена СМБ в СНО/ССВ4-БСА.
Пример 16. Получение различных генов, кодирующих ферменты, имеющих отношение к синтезу углеводных цепей в клетках СНО.
1. Определение последовательности кДНК РХ, полученной из клеток СНО.
(1) . Экстрагирование полной РНК из клеток СНО/БС44.
Клетки СНО/БС44 суспендируют в среде кОБМ, содержащей 10% сыворотки плода коровы (производимой ЫГе Тесйπο1οд^ез) и добавки НТ концентрации 1х (производимой Ь1£е Тесйηο1οβ^ез). и 15 мл суспензии инокулируют в колбу Т75 для адгезионных культур (производимую Сгетег), получают плотность клеток 2х105 клеток/лунку. На другой день после культивирования при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 1х107 клеток извлекают и из них экстрагируют полную РНК с использованием КААеазу (производится Ц^СЕ^ согласно инструкциям изготовителя.
(2) . Получение полной одноцепочечной кДНК из клеток СНО/БС44.
Полную РНК, полученную в (1), растворяют в 45 мкл стерильной воды и к раствору добавляют 1 мкл ВЦ1 Р№зе-Ргее Б№зе (производимой Ρ^οтеда), 5 мкл 10х прилагаемого буфера для ДНКазы и 0,5 мкл ингибитора рибонуклеазы Р№зт (производимого Ρ^οтеда), затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 30 мин для разрушения геномной ДНК, загрязняющей образец. По завершении реакции полную РНК очищают с использованием ВNΑеазу (производится и растворяют в мкл стерильной воды.
В 20 мкл реакционной смеси с использованием в качестве праймера олиго(бТ) синтезируют одноцепочечную кДНК из 3 мкг образцов полученной полной РНК, осуществляя реакцию обратной транскрипции с использованием системы предварительной амплификации для синтеза первой цепи кДНК 8υΡЕВ8СВIΡТ™ (производимой ЫГе Тесйηο1οβ^ез) согласно инструкциям изготовителя. При клонировании СРΡΡ и РХ используют 50-кратно разведенный водный раствор реакционного раствора. Его хранят до применения при -80°С.
(3) . Получение неполного фрагмента кДНК РХ, полученной от китайского хомячка.
Неполный фрагмент кДНК РХ, полученной от китайского хомячка, получают следующей процедурой.
Сначала создают праймеры (показанные в 8ЕЦ ГО NΟ:42 и 43), специфические для обычных нуклеотидных последовательностей, зарегистрированных в доступной базе данных, а именно кДНК РХ человека (СепВапк, инвентарный № И58766) и мышиной кДНК (СепВапк, инвентарный № М30127).
Затем получают 25 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8Ηυζο), 0,2 ммоль/л 6ΝΈΡ и 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕЦ 1Б NΟ:42 и 43)], содержащего 1 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из СНО/БС44, полученной в разделе (2), и осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81ιιιζο). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 58°С в течение 2 мин и 72°С в течение 3 мин как едином цикле и заключительным нагреванием при 72°С в течение 10 мин.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле, амплифицированный фрагмент в 301 п.о. очищают с использованием набора ЦиаехП Се1 Ех1гас1юп (производимого О|адеп) и элюируют 20 мкл стерильной воды (далее для очистки фрагментов ДНК из агарозного геля используют такой способ). Для встраивания в плазмиду рСВ2.1 используют 4 мкл амплифицированного фрагмента согласно инструкциям, приложенным к набору ТОРО ТА С^п^д (производимому Iπν^ΐ^οдеπ), и реакционным раствором трансформируют Е. №ί БН5« способом по С'о11еп е1 а1. Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А, 69, 2110 (1972)] (далее для трансформации Е. №ί используют указанный способ). Плазмидную ДНК выделяют из нескольких полученных невосприимчивых к канамицину колоний согласно известному способу [№с1ею Ас1бз Везеагсй, 7, 1513 (1979)] (далее для выделения плазмиды используют указанный способ) и получают 2 колонии, в которые встроены, соответственно, неполные фрагменты кДНК
- 86 013224
РХ. Их называют клоном 8 рСКРХ и клоном 12 рСКРХ.
Нуклеотидную последовательность кДНК, встроенной в каждый клон 8 РХ и клон 12 РХ, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкш Е1тег) и набора В|дЭуе Тегтта!ог Сус1е 8ес.|иепстд Р8 Кеабу Кеасйоп (производимого Регкш Е1тег) согласно инструкциям изготовителя. Подтверждается, что каждая встроенная кДНК, последовательность которой определена, кодирует неполную последовательность открытой рамки считывания (ΟΒΒ) РХ китайского хомячка.
(4) . Синтез одноцепочечной кДНК для КАСЕ.
Образцы одноцепочечной кДНК для 5'- и 3'-КАСЕ получают из полной РНК СНΟ/^С44, экстрагированной в разделе (1), с использованием набора для амплификации кДНК 8МАКТ™ КАСЕ (производимого С^ΟNТΕСН) согласно инструкциям изготовителя. В данном случае в качестве обратной транскриптазы используют обратную транскриптазу Ро\уег8спр1™ (производимую ^ΟΝΊΈ^).
Каждую одноцепочечную кДНК после получения разводят в 10 раз буфером трицин-ЭДТК, прилагаемым к набору, и используют в качестве матрицы при ПЦР.
(5) . Определение методом КАСЕ полноразмерной кДНК РХ, полученной от китайского хомячка.
На основе неполной последовательности РХ, полученной от китайского хомячка, определенной в разделе (3), создают праймеры РХС8Р1-1 (8ЕЦ ГО ΝΟ:44) и РХС8Р1-2 (8ЕЦ ГО ΝΟ:45) для РХ-специфической 5'-КАСЕ китайского хомячка и праймеры РХС8Р2-1 (8ЕЦ ГО ΝΟ:46) и РХС8Р2-2 (8ЕЦ ГО ΝΟ:47) для РХ-специфической 3'-КАСЕ китайского хомячка.
Затем осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием набора Абуап!аде2 РСК (производимого ^ΟΝΊΈ^), приготовив 50 мкл реакционного раствора [буфер Абуап!аде2 РСК (производимый ίΤΟΝΊΈίΉ), 0,2 мМ όΝΊ^, 0,2 мкмоль/л РХ-специфических праймеров для КАСЕ и 1х концентрация обычных праймеров (производимых С^ΟNТΕСН)], содержащего 1 мкл полученной из ί.ΉΟ/Ο644 одноцепочечной кДНК для КАСЕ, полученной в разделе (4).
ПЦР осуществляют, повторяя 20 циклов нагревания при 94°С в течение 5 с, 68°С в течение 10 с и 72°С в течение 2 мин как в едином цикле.
По завершении реакции 1 мкл реакционного раствора разводят в 50 раз буфером трицин-ЭДТК и 1 мкл разведенного раствора используют в качестве матрицы. Снова получают реакционный раствор и осуществляют ПЦР в тех же условиях. Матрицы, комбинация праймеров, используемых при первой и второй ПЦР, и длина фрагментов ДНК, амплифицированных ПЦР, приводятся в табл. 8.
Таблица 8 Комбинация праймеров, используемых при ПЦР КАСЕ кДНК РХ китайского хомячка, и размер продуктов ПЦР
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 1% агарозном геле, и представляющий интерес специфический амплифицированный фрагмент очищают с использованием набора ЦзаехП Се1 Ех!гасйоп (производимого Ц1адеп) и элюируют 20 мкл стерильной воды. В плазмиду рСК2.1 встраивают 4 мкл амплифицированного фрагмента и с использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ЭН5а согласно инструкциям, приложенным к набору ТОРО ТА С1ошпд (производимому Iην^!годеп).
Из оказавшихся невосприимчивыми к канамицину нескольких колоний выделяют плазмидные ДНК и получают 5 клонов кДНК, содержащих 5'-область РХ китайского хомячка. Их называют клон 25 РХ5', клон 26 РХ5', клон 27 РХ5', клон 28 РХ5', клон 31 РХ5' и клон 32 РХ5'.
Таким же способом получают 5 клонов кДНК, содержащих 3'-область РХ китайского хомячка. Такие клоны РХ3' называют клон 1 РХ3', клон 3 РХ3', клон 6 РХ3', клон 8 РХ3' и клон 9 РХ3'.
Нуклеотидную последовательность части кДНК каждого клона, полученного 5'- и 3'-КАСЕ, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) способом, описанным в инструкциях изготовителя. Сравнивая нуклеотидные последовательности кДНК, определенные таким способом, исключают ошибки считывания нуклеотидных оснований из-за ПЦР и определяют полноразмерную нуклеотидную последовательность кДНК РХ китайского хомячка. Установленная последовательность показана в 8ЕЦ ГО ΝΟ:48.
- 87 013224
2. Определение последовательности кДНК СРРР, полученной из клеток СНО.
(1) . Получение неполного фрагмента кДНК СРРР, полученной от китайского хомячка.
Неполный фрагмент кДНК СРРР, полученной от китайского хомячка, получают следующей процедурой.
Сначала сравнивают нуклеотидные последовательности кДНК СРРР человека (СеиВаик, инвентарный № АР017445), последовательности мышиной Е8Т, обладающие высокой гомологией с этой последовательностью (СеиВаик, инвентарные №№ АИ67195, АА422658, ВЕ304325 и ΛΙ466474), и последовательности крысиной Е8Т (СеиВаик, инвентарные №№ ВР546372, АЮ58400 и АА144783), зарегистрированные в общей базе данных, и создают праймеры СРРР РА9 и СРРР КУ9 (8ЕР ΙΌ N0:49 и 50), специфические для крысиной СРРР, на хорошо сохранившейся области среди трех указанных видов.
Затем осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 8ки/о), приготовив 25 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8ки/о), 0,2 мМ бЭТР и 0,5 мкмоль/л СРРР-специфических праймеров СРРР РА9 и СРРР КУ9 (8ЕР ΙΌ N0:49 и 50)], содержащего 1 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из СН0/ОС44, полученной в разделе (2). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 58°С в течение 2 мин и 72°С в течение 3 мин как едином цикле и заключительным нагреванием при 72°С в течение 10 мин.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле и амплифицированный фрагмент в 1,4 т.п.о. очищают с использованием набора ОшаехП Се1 Ехйасйои (производимого 0|адег1) и элюируют 20 мкл стерильной воды. Для встраивания в плазмиду рСК2.1 используют 4 мкл амплифицированного фрагмента согласно инструкциям, приложенным к набору ТОРО ТА С1ошид (производимому Шуйгодеи), и с использованием реакционного раствора трансформируют Е. со11 ЭН5а.
Плазмидную ДНК выделяют из нескольких оказавшихся невосприимчивыми к канамицину колоний и получают 3 колонии, в которые интегрированы, соответственно, неполные фрагменты кДНК СРРР. Их называют клоном 8 СРРР, клоном 11 СРРР и клоном 12 СРРР.
Нуклеотидную последовательность кДНК, встроенной в каждый клон 8 СРРР, клон 11 СРРР и клон 12 СРРР, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) и набора В1дОуе ТегттаЮг Сус1е 8едиеистд Р8 Кеабу Кеасйои (производимого Регкт Е1тег) согласно инструкциям изготовителя. Подтверждается, что каждая встроенная кДНК, последовательность которой определена, кодирует неполную последовательность открытой рамки считывания (0КР) СРРР китайского хомячка.
(2) . Определение методом КАСЕ полноразмерной кДНК СРРР, полученной от китайского хомячка.
На основе неполной последовательности СРРР, полученной от китайского хомячка, определенной в разделе 2(1), создают праймеры СРРР С8Р1-1 (8 ЕС) ΙΌ N0:52) и СРРР С8Р1-2 (8 ЕС) ΙΌ N0:53) для СРРР-специфической 5'-КАСЕ китайского хомячка и праймеры СРРР С8Р2-1 (8ЕР ΙΌ N0:54) и СРРР С8Р2-2 (8ЕР ΙΌ N0:55) для СРРР-специфической 3'-КАСЕ китайского хомячка.
Затем осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием набора Абуаи!аде2 РСК (производимого С^0NТЕСН), приготовив 50 мкл реакционного раствора [буфер Абуаи!аде2 РСК (производимый СЕ0ЭТЕСН), 0,2 мМ бЭТР, 0,2 мкмоль/л СРРР-специфических праймеров для КАСЕ и 1х концентрация обычных праймеров (производимых СЕ0№ГЕСН)], содержащего 1 мкл полученной из СН0/ЭС44 одноцепочечной кДНК для КАСЕ, полученной в разделе (4).
ПЦР осуществляют, повторяя 20 циклов нагревания при 94°С в течение 5 с, 68°С в течение 10 с и 72°С в течение 2 мин как единый цикл.
По завершении реакции 1 мкл реакционного раствора разводят в 50 раз буфером трицин-ЭДТК и 1 мкл разведенного раствора используют в качестве матрицы. Снова получают реакционный раствор и осуществляют ПЦР в тех же условиях. Матрицы, комбинация праймеров, используемых при первой и второй ПЦР, и длина фрагментов ДНК, амплифицированных ПЦР, приводятся в табл. 9.
- 88 013224
Таблица 9
Комбинация праймеров, используемых при ПЦР ВАСЕ кДНК СРРР китайского хомячка, и размер продуктов ПЦР
5'- КАСЕ СГРР-специф. праймеры Обычные праймеры Размер ПЦР-
амплифиц. продукта
Первая Вторая СРРРСЗР1-1 СЕРРСЗР1-2 □РМ (универе, прайм, смесь) ΝϋΡ (внутрипраймерный универе, праймер) 1100 п.о.
З'-ВАСЕ СЕРР“Специф. праймеры Обычные праймеры Размер амплифиц. ПЦРпродукта
Первая Вторая срррсзр2-1 СРРРСЗР2-2 □РМ (универе, прайм, смесь) ΝυΡ (внутрипраймерный универе, праймер) 1400 п.о.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 1% агарозном геле и представляющий интерес специфический амплифицированный фрагмент очищают с использованием набора О|аехП Се1 Ех!гас!юп (производимого О1адеп) и элюируют 20 мкл стерильной воды. В плазмиду рСВ2.1 встраивают 4 мкл амплифицированного фрагмента и с использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ОН5« согласно инструкциям, приложенным к набору ТОРО ТА С1ошпд (производимому 6113!годеп).
Из полученных невосприимчивых к канамицину нескольких колоний выделяют плазмидные ДНК, и получают 4 клона кДНК, содержащих 5'-область СРРР китайского хомячка. Их называют клон 1 СРРР5', клон 2 СРРР5', клон 3 СРРР5' и клон 4 СРРР5'.
Таким же способом получают 5 клонов кДНК, содержащих 3'-область СРРР китайского хомячка. Их называют клоном 10 СРРР3', клоном 16 СРРР3' и клоном 20 СРРР3'.
Нуклеотидную последовательность кДНК каждого клона, полученного 5'- и 3'-ВАСЕ, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкш Е1тег) согласно способу, описанному в инструкциях изготовителя. Сравнивая нуклеотидные последовательности кДНК после определенния нуклеотидных последовательностей, исключают ошибки считывания нуклеотидных оснований из-за ПЦР и определяют полноразмерную нуклеотидную последовательность кДНК СРРР китайского хомячка. Установленная последовательность показана в 8ЕЦ ГО NО:51.
Пример 17. Получение гена СМЭ, получаемого из клеток СНО.
1. Определение последовательности кДНК СМЭ, получаемого из клеток СНО.
(1). Получение кДНК гена СМЭ, получаемого из клеток СНО (получение неполной кДНК с исключением 5'- и 3'-концевых последовательностей).
Проводят в порядке запроса поиск кДНК СМЭ, происходящей от грызунов, в общей базе данных (ВЬА8Т) с использованием последовательности кДНК СМЭ человека (СепВапк, инвентарный № АР042377), зарегистрированной в СепВапк, и получают три вида последовательностей мышиной Е8Т (СепВапк, инвентарные №№ ВЕ986856, ВР158988 и ВЕ284785). Путем лигирования указанных последовательностей Е8Т получают расшифрованную последовательность кДНК мышиной СМЭ.
На основе последовательности кДНК мышиной СМЭ получают 28-мерный праймер с последовательностью, представленной 8ЕЦ ГО NО:56, 27-мерный праймер с последовательностью, представленной 8ЕЦ ГО NО:57, 25-мерный праймер с последовательностью, представленной 8ЕЦ ГО NО:58, 24-мерный праймер с последовательностью, представленной 8ЕЦ ГО NО:59, и 25-мерный праймер с последовательностью, представленной 8ЕЦ ГО NО:60.
Затем, для того чтобы амплифицировать кДНК СМЭ, полученной из клеток СНО, осуществляют ПЦР следующим способом. Получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер ЕхТас.| (производимый Такага ЗНихо), 0,2 мМ бЭТР, 0,5 единиц полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 8Нихо) и 0,5 мкМ двух синтетических ДНК-праймеров], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из клеток СНО, полученной в примере 15-1(1). В данном случае в качестве синтетических ДНК-праймеров используют комбинации 8ЕЦ ГО NО:56 с 8ЕЦ ГО NО:57, 8ЕЦ ГО NО:58 с 8ЕЦ ГО NО:57, 8ЕЦ ГО NО:56 с 8ЕЦ ГО NО:59 и 8ЕЦ ГО NО:56 с 8ЕЦ ГО NО:60. Реакцию осуществляют с использованием ЭНА ТЬегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкш Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле.
Раствор после ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле и обнаруживают, что в продукте ПЦР амплифицированным является фрагмент ДНК примерно в 1,2 т.п.о., когда используют синтетические ДНК-праймеры 8ЕЦ ГО NО:56 и 57, в продукте ПЦР амплифицированным является фрагмент примерно в 1,1 т.п.о., когда используют синтетические ДНК-праймеры 8ЕЦ ГО NО:57 и 59, в продукте ПЦР амплифицированным является фрагмент примерно в 350 п.о., когда используют синтетические
- 89 013224
ДНК-праймеры 8Е0 ГО N0:56 и 59, и в продукте ПЦР амплифицированным является фрагмент примерно в 1 т.п.о., когда используют синтетические ДНК-праймеры 8Е0 ГО N0:56 и 60. Фрагменты ДНК извлекают с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные фрагменты ДНК лигируют с вектором рТ7В1ие(К) (производимым Nονадеη) с использованием набора ^NА Ыдайоп (производимого Такага 81шхо) и с использованием полученных образцов рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ОН (производимую ТоуоЬо), посредством чего получают плазмиды 22-8 (имея фрагмент ДНК примерно в 1,2 т.п.о., амплифицированный из синтетических ДНК-праймеров 8Е0 ГО N0:56 и 8Е0 ГО N0:57), 23-3 (имея фрагмент ДНК примерно в 1,1 т.п.о., амплифицированный из синтетических ДНК-праймеров 8Е0 ГО N0:58 и 8Е0 ГО N0:57), 31-5 (имея фрагмент ДНК примерно в 350 п.о., амплифицированный из синтетических ДНК-праймеров 8Е0 ГО N0:56 и 8Е0 ГО N0:59) и 34-2 (имея фрагмент ДНК примерно в 1 т.п.о., амплифицированный из синтетических ДНК-праймеров 8Е0 ГО N0:56 и 8Е0 ГО N0:60). Последовательность кДНК СМО из клеток СНО, содержащуюся в указанных плазмидах, определяют обычным способом с использованием секвенатора ДНК АВI РШ8М 377 (производимого Регкш Е1тег) (так как последовательность из 28 оснований после кодона инициации метионина со стороны 5'-конца и последовательность из 27 оснований перед кодоном инициации со стороны 3'-конца происходят от последовательностей синтетических олиго-ДНК, они являются последовательностями кДНК мышиной СМО).
Кроме того, для того чтобы получить плазмиду, в которой фрагменты кДНК СМО из клеток СНО, содержащиеся в плазмидах 22-8 и 34-2, соединяются, осуществляют следующие стадии. Плазмиду 22-8 (1 мкг) вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсоШ (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат подвергают электрофорезу в агарозном геле и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 4 т.п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Плазмиду 34-2 (2 мкг) вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсоШ при 37°С в течение 16 ч, гидролизат подвергают электрофорезу в агарозном геле и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 150 п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные фрагменты ДНК, соответственно, подвергают дефосфорилированию концов с использованием Са1П !п1е8(1пе А1кайпе Рйо8рйа1а§е (производимой Такага 8йи/о), затем лигируют с использованием набора ^NА Ыдайоп (производимого Такага 8йи/о), с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ΰΕα (производимую ТоуоЬо) и получают плазмиду СН0-СМО (ср. фиг. 54).
(2) . Определение 5'-концевой последовательности кДНК СМО, полученной из клеток СНО.
Из нуклеотидных последовательностей некодирующей области со стороны 5'-конца кДНК СМО человека и мыши, полученных в клетках СНО, получают 24-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной 8Е0 ГО N0:61, и из последовательности кДНК СМО, полученной в клетках СНО, получают 32-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной 8Е0 ГО N0:62, и для амплификации кДНК осуществляют ПЦР следующим способом. Итак, получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер ЕхТад (производимый Такага 8йц/о), 0,2 мМ бЭТР, 0,5 единиц полимеразы Ех Тад (производимой Такага 81шхо) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8Е0 ГО N0:61 и 8Е0 ГО N0:62], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК, полученной в примере 15-1(1), и в нем осуществляют реакцию с использованием ^NА Тйегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 20 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 55 °С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин как едином цикле, и еще 18 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После фракционирования электрофорезом в агарозном геле извлекают фрагмент ДНК примерно в 300 п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент лигируют с вектором рТ7В1ие(К) (производимым №уадеп) с использованием набора ^NА Ыдайоп (производимого Такага 8йи/о), с использованием полученных образцов рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ОН/α (производимую ТоуоЬо) и посредством этого получают плазмиду 5'СМО. С использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкш Е1тег) определяют нуклеотидную последовательность из 28 оснований после инициирующего метионина кДНК СМО, полученной из клеток СНО, содержащейся в плазмиде.
(3) . Определение 3'-концевой последовательности кДНК СМО, полученной из клеток СНО.
Для того чтобы получить 3'-концевую последовательность кДНК СМО, полученной из клеток СНО, осуществляют способ КАСЕ следующим образом. Из РНК, полученной в примере 15-1(1), с использованием набора для амплификации кДНК 8МАКТ™ КАСЕ (производимого С^0NТЕСН) получают одноцепочечную кДНК для 3'-КАСЕ согласно инструкциям изготовителя. В данном случае в качестве обратной транскриптазы используют обратную транскриптазу Ро\уег8спр1''™ (производимую С^0NТЕСН).
Одноцепочечную кДНК после получения разводят в 10 раз буфером трицин-ЭДТК, прилагаемым к набору, и используют в качестве матрицы при ПЦР.
Затем получают 20 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТад (производимый Такага 8йц/о), 0,2 мМ бЭТР, 0,5 единиц полимеразы Ех Тад (производимой Такага 8йц/о), 0,5 мкМ 25-мерного синтетического
- 90 013224
ДНК-праймера, показанного в ЗЕЦ ΙΌ N0:63 [полученного на основе последовательности кДНК СМО, полученной в клетках СНО, определенной в разделе (1)] и 1х концентрация универсальной праймерной смеси (прилагаемой к набору для амплификации кДНК ЗМАВТ™ ВАСЕ; производит С^0NТЕСН], содержащего 1 мкл кДНК для 3'-ВАСЕ в качестве матрицы, и осуществляют ПЦР с использованием ЭХА ТЕегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1шег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле.
По завершении реакции 1 мкл реакционного раствора ПЦР разводят в 20 раз буфером трицинЭДТК (производимым С^0NТЕСН). Затем получают 20 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТац (производимый Такага ЗЕи/о), 0,2 мМ б№ТР, 0,5 единиц полимеразы Ех Тац (производимой Такага ЗЕи/о), 0,5 мкМ 25-мерного синтетического ДНК-праймера, показанного в ЗЕЦ ΙΌ N0:64 [полученного на основе последовательности кДНК СМО, полученной в клетках СНО, определенной в разделе (1)] и 0,5 мкМ универсального внутрипраймерного праймера (прилагаемого к набору для амплификации кДНК ЗМАВТ™ ВАСЕ; производит С^0NТЕСН], содержащего 1 мкл разведенного в 20 раз водного раствора в качестве матрицы], и осуществляют реакцию с использованием ЭКА ТЕегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1шег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле.
По завершении реакции реакционный раствор ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 700 п.о. с использованием набора Сепе С1еап ΙΙ (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент лигируют с вектором рТ7В1ие(В) (производимым Nονадеη) с использованием набора Ыдайоп (производимого Такага
ЗЕи/о) и с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ОН5« (производимую ТоуоЬо), причем посредством этого получают плазмиду 3'СМО. С использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1шег) определяют нуклеотидную последовательность из 27 оснований перед кодоном терминации кДНК СМЭ, полученной из клеток СНО, содержащейся в плазмиде.
Последовательность полноразмерной кДНК гена СМО, полученной в СНО, определенная в разделах (1), (2) и (3), и соответствующая аминокислотная последовательность представлены ЗЕЦ ΙΌ N0:65 и 71 соответственно.
2. Определение геномной последовательности, содержащей ген СМО, полученной из клеток СН0/СЭ44.
Из последовательности кДНК мышиной СМО, определенной в примере 17-1, получают 25-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной ЗЕЦ ΙΌ N0:66. Затем получают геномную ДНК, происходящую из клеток СНО, следующим способом. КС861, полученную из клеток СН0/СП44, суспендируют в среде IМ^М-бЕВ3(10)-НТ(1) [среда IМ^М-бЕВ3(10), содержащая добавку НТ концентрации 1х (производимую Iην^ί^οдеη)], получают плотность клеток 3х105 клеток/мл и суспензию распределяют в лунки 6-луночного планшета с плоскодонными лунками для адгезионных культур (производимого Сгешег) по 2 мл/лунку. После культивирования клеток при 37°С в инкубаторе с 5% С02 до тех пор, пока клетки на планшете не начинают сливаться, геномную ДНК из клеток на планшете получают известным способом Ас1б8 Векеагсй, 3, 2303 (1976)] и растворяют в течение ночи в
150 мкл буфера ТЕ-ВЫаке (рН 8,0) (10 ммоль/л трис-НС1, 1 ммоль/л ЭДТК, 200 мкг/мл РНКазы А).
Получают реакционный раствор (20 мкл) [1х буфер Ех Тац (производимый Такага ЗЕи/о), 0,2 мМ бNТР, 0,5 единиц полимеразы Ех Тац (производимой Такага ЗЕи/о) и 0,5 мкМ синтетических ДНКпраймеров ЗЕЦ ΙΌ N0:59 и ЗЕЦ ΙΌ N0:66], содержащий 100 нг геномной ДНК, полученной из клеток СН0/ОС44, и осуществляют ПЦР с использованием ЭкА ТЕегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкш Е1шег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. По завершении реакции реакционный раствор ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 100 п.о. с использованием набора Сепе С1еап ΙΙ (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент ДНК лигируют с вектором рТ7В1ие(В) (производимым Nονадеη) с использованием набора ^NЛ Ыдайоп (производимого Такага ЗЕи/о), с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ОН5« (производимую ТоуоЬо), причем посредством этого получают плазмиду ех3. С использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкш Е1шег) определяют нуклеотидную последовательность геномной ДНК, полученной из клеток СНО, содержащейся в плазмиде. Результат показан в ЗЕЦ ΙΌ N0:67.
Затем на основе последовательности кДНК СМО, полученной из клеток СНО, определенной в примере 17-1, получают 25-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной ЗЕЦ ΙΌ N0:68, и 25-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной ЗЕЦ ΙΌ N0:69. Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер Ех Тац (производимый Такага ЗЕи/о), 0,2 мМ б№ТР, 0,5 единиц полимеразы Ех Тац (производимой Такага ЗЕи/о) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров ЗЕЦ ΙΌ N0:68 и ЗЕЦ ΙΌ N0:69], содержащего 100 нг геномной ДНК, полученной из СН0/ОС44, и осуществляют ПЦР с использованием ^NЛ ТЕегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1шег) нагревани
- 91 013224 ем при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле.
По завершении реакции реакционный раствор ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 200 п.о. с использованием набора Сепе С1еап ΙΙ (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент ДНК лигируют с вектором рТ7В1ие(В) (производимым Nоνадеη) с использованием набора ^NА Ыдайоп (производимого Такага Зй^о), с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ОН/α (производимую ТоуоЬо), причем посредством этого получают плазмиду ех4. С использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Ρе^к^η Е1тег) определяют нуклеотидную последовательность геномной ДНК, полученной из клеток СНО, содержащейся в плазмиде. Результат показан в ЗЕЦ ΙΌ N0:70.
Пример 18. Анализ углеводных цепей обычных доступных антител.
Углеводные цепи обычных доступных антител против НЕВ2/пеи герцептина (производимого СЕNЕNТЕСН и Восйе), продуцированных клетками СНО как клетками-хозяевами, анализируют согласно способу примера 10(6) (фиг. 31). При вычислении из площади пика диаграммы элюирования содержание углеводных цепей герцептина без α-1,6-фукозы составляет 16% и содержание углеводных цепей, связанных с α-1,6-фукозой, составляет 84%. Осуществляют такой же анализ для других коммерчески доступных антител ритуксана (производимого СЕNЕNТЕСН, Восйе и ГОЕС) и зенапакса (производимого Восйе и ΡΌΕ), и в них содержание углеводных цепей без α-1,6-фукозы меньше, чем в герцептине.
Фиг. 31 представляет собой график, показывающий картину элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из герцептина, полученный при их анализе ВЭЖХ с обращенной фазой.
Относительная интенсивность флуоресценции и время элюирования откладывают по осям ординат и абсцисс соответственно. Условия анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой такие же, как в примере 11(6), и анализ структуры углеводных цепей и вычисление доли группы углеводных цепей, не содержащих α-1,6-фукозу, осуществляют так же, как в примере 11(6).
Промышленная применимость
Настоящее изобретение относится к клеткам, способным продуцировать композицию антител, способу получения композиции антител с использованием таких клеток, композиции антител и ее применению.
Текст на естественном языке списка последовательностей пояснение к синтетической
5Е<2 10 N0:4
5Е0 ю N0:5
ЗЕО ю N0:8
3Ξ0 ю N0:9
ЗЕО ю N0:10
ЗЕО ю N0:11
ЗЕО ю N0:12
ЗЕО ю N0:13
5Е0 ю N0:14
ЗЕ<2 ю N0:15
5Е0 ю N0:16
5Е<2 10 N0:17
синтетическая ДНК синтетическая ДНК пояснение к синтетическом синтетическая ДНК пояснение к синтетической синтетическая ДНК пояснение к синтетическом синтетическая ДНК последовательности:
последовательности:
последовательности последовательности пояснение к синтетическом последовательности синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности:
синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности:
синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности синтетическая ДНК пояснение к синтетическом пояснение к синтетической последовательности последовательности
- 92 013224
ЗЕО
N0:18
ЗЕО
N0:19
ЗЕО
N0:20
ЗЕО
N0:21
ЗЕО
N0:22
ЗЕО
N0:26 синтетическая ДНК пояснение к синтетической синтетическая ДНК пояснение к синтетическом синтетическая ДНК пояснение к синтетическом синтетическая ДНК пояснение к синтетическом синтетическая ДНК пояснение к синтетическом синтетическая ДНК пояснение к синтетическом синтетическая ДНК последовательности:
последовательности последовательности последовательности:
последовательности:
последовательности:
ЗЕО
N0:27 пояснение к синтетическом последовательности
ЗЕО
N0:28 синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО
Ιϋ
N0:29 пояснение к синтетическом последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО
N0:30 пояснение к синтетическом последовательности:
ЗЕО
N0:31
ЗЕО
N0:32
ЗЕО
N0:33
ЗЕО
N0:34 синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности:
синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности:
ЗЕО
N0:35
ЗЕО
N0: 36
ЗЕО
N0: 37 синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности синтетическая днк пояснение к синтетическом последовательности:
синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности:
синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
- 93 013224
ЗЕО
N0:38 пояснение к синтетическом последовательности
ЗЕО
N0:39
ЗЕО
N0:40 синтетическая ДНК пояснение к синтетическом синтетическая ДНК пояснение к синтетическом синтетическая ДНК последовательности:
последовательности
ЗЕО
N0:41 пояснение к синтетической последовательности:
ЗЕО
N0:42 синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО
N0:43 пояснение к синтетическом последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО
N0:44 пояснение к синтетическом последовательности синтетическая ДНК
ЗЕО
N0:45 пояснение к синтетическом последовательности:
ЗЕО
N0:46 синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности:
ЗЕО
N0:47
ЗЕО
N0:49
ЗЕО
N0:50
ЗЕО
N0:52
ЗЕО
N0:53
ЗЕО
N0:54
ЗЕО
N0:55
ЗЕО
N0:56 синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности:
синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО
N0:57 пояснение к синтетическом последовательности:
- 94 013224
ЗЕО
N0:53
5Е0
N0:59
ЗЕ<2
N0:60 синтетическая ДНК пояснение к синтетической синтетическая днк пояснение к синтетической синтетическая ДНК пояснение к синтетической синтетическая ДНК последовательности последовательности последовательности:
5Е<2
N0:61 пояснение к синтетической последовательности
5Е<2
N0:62
5Е<2
N0:63
ЗЕО
N0:64
ЗЕС
N0:66
ЗЕО
N0:68
ΞΕΏ
N0:69 синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности:
синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности:
синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности синтетическая ДНК пояснение к синтетическом последовательности:
синтетическая ДНК
- 95 013224
Список последовательностей <110> ΚΥΟΪΑ НАККО ΚΟΟΥΟ СО., СТО.
<120 > Клетки, продуцирующие композицию антител <130> р-38524 <150> 2000-308526 <151> 2000-10-06 <160> 73 <170> РаТепНп Уег. 2.1 <210> 1 <211> 2008 <212> ДНК <213> Сг1се1и1из кгхаеиз <400> 1 аасаеааасЕ ΐβΐΐΐΐοοΐε ТгТеесТаас Тв-аЕсТссеа вааеасадаа еввакЧ^аа ΐ8808ΐ+85β КаТйс1са1 ΐοΐίΐΐΐ^οο οβΐΐίΒΕΐΐο кагайааЕеа ссасссТвас ЕсааавсТйВ абсвсТТааа асаасааааТ скааТассае ааявсссТа! 1ва1савв£е ваасаесНв Нааввссаа аеаасава!! сГееваааве βΐοβΐββββΐ с4Гаа§еа£8 ΐΐίΐΐΐοΐ8θ ааавТеааК вааеаааТХа са1вса£а18 аааНсШ! ееаШавеа Тас1ассТса вТсааасава Хввавсаев!
Таваассака вТасаа^Т! ТссааМсТТ 60 ас!с1ваааа ва^веМсс 120
18Е88ёасс1 1а11£1111а таТаввТвв^ 180 саТТс1аеса еакаасГс!с саа^аШсН 240 «аадасПка вваваа^с ΐ^Εΐοΐοΐο 300 асавсЪасай ваававЕссв ТвТШаваа 360
ВааааНаса авааасаавс 1ав8аа1еаГ 420 аеваШвааа а1вваесГаа а§авс1;с1в8 480 ааваааТТав аавваааска асТссааа#а 540 са1са!вааа вв^сЬаЕсаТ васаваТс1а 600 вавТввсвя® аааааваавс сааайаТсТ® 660
- 96 013224
асаеаес£вк 1сса8С8вав аа1аасака! с18саваа1с ссаавеасбв саесааавсс 720
авааа£с188 1а1в1аа1а1 саасаааввс 18к88С1а1в 8а181саас1 сса1са1в1в 780
8111ас1вС1 1са1еа118С 11а1в8сасс саесваасас 1са1с1188а а1с1са8аа! 840
188С8С1а18 С1ас188а88 а1ВЕеа8ас1 818111а8ас с181аав18а 8аса1есаса 900
васавв1с18 ВсеЮЮсас 1В8асас188 1сав81еаа8 18ааевасаа ааа1811саа 960
вкВЕксеаес 1сссса118к а8асавсс1с са1сс1081с с1сс11ас11 асссИввс! 1020
вкассаваав ассИвсава 1сеас1сс18 а£ае1сса1в 81еа1сс1вс ав1818818Е 1080
81а1ссса81 1181сааа1а с11еа1ссв1 ссасаассИ 88с188ааав 8вааа1аеаа 1140
вааассасса аваавсИвв сИсаааса! СсавИаИв 8381003181 савасвсас! 1200
8асааав1Е8 ваасаваавс аессИсса! сссаНеавЕ аа1аса18£1 асасвИеаа 1260
Вааса1111с а£с11с1С8а асвсаваа18 ааав1Е8а1а аааааавав! 81а1с1ВЕсс 1320
аскваквасс οΐΐοΙΐΐΒΐΐ ааавеавЕса аавасааав! ас1ссаа11а 1еаа111а11 1380
аеквакааск с1а111с11в В1савс188а с1асасаасс ва1асасава аазИсасИ 1440
ев888С8ква 1сс18ва1а1 асас111с1с 1ссса88с1в ас11сс1181 81в1ас1111 1500
1са1ссса8Е 1с1в1а8ЕК1 18С11а18аа а1са1всааа сас1вса1сс 18318сс1с1 1560
8083301100 аИсШака 1васа1с1ас 1а1111в8ав вссааааквс ссасаассав 1620
а118са£111 аЮсЮасса асс1сеаас1 аааваевааа 1сссса188а асс1е8ава1 1680
а1са11Е818 188с188ааа сса11в8аа! 8811ас1с1а аав8181саа са8аааас1а 1740
ввзаааасав £сс181ассс 11сс1асааа £1сС8ава8а ава1а8ааас ав1сааа1ас 1800
сс1аса1а1с с18аавс18а аааабавава 188а8181аа ваваИааса асаваа111а 1860
ЕИсавасса 1с1савссаа всаваавасс савас1ааса 1а18811са1 18зсаваса1 1920
вскссесасс ааеавсаавк ВВеаассс1с а£а1£с1£са с18818Езас 8сс1с111в1 1980
- 97 013224 зааевесЪес гвгдсссгса авссса-Ье 2008 <210> 2 <211> 1728 <212> ДНК <213> Миз тизсиХиз <400> 2 аХЕсевеса! ввасбввИс οΐ££ο§ΐΐΒ£ аМа^всСса ΐΐοΐΐΐΐΐ£ο сЪевейвэсс 60 ίΐΒΐΐβίΐίΐ агаФаввЕдв ΐοΗίΐίεβίΐ С£ава1аа1;Е ассасссгда ФсасФссаес 120 ававаасЬсФ ссаадаНс! гдсааадсН даасдсПаа аасадсаааа 1£аадас11д 180 οΐΕββίοΐοΐ ссдаа^асса дааддсссса Идассаддд дасадсЕаса 240 ддаадавЕсс ^д-ЦИада аваасадсИ дИааддсса ааваасада! ЕдааааПас 300 ааеааасаае с1адааа1££ (сЬдввдаад ва^саХдааа €с11аадаад даввак^ваа 360 ааЪддадсга аа£а£<йс1£ εΐΐίΐίΐοίβ сааадсдаас 1даадааа11 ааадсаИба 420
Еааддааакв аас!ссааад асаФдсадаФ даааМсИЛ 1ввагИад£ асасса1даа 480 аддЕсЕаЕса 1васава1с1 а1ас1асс1с ад!сааасав акввадсадв ΒΒθΐΐΒΕΟβΐ 540 вааааававв ссааада1с1 дасавадсгд дгссавсвва ваа!ааса1а 1с1ссадааЕ 600 сс1ааддас1 дсавсааавс савдаадсЕд дгд1д1ааса Есаа^ааавв сГ£18вс1аЬ 660
ЕЕ11в1саас Фссаксасд! ΒίίοΐβοΐΕί Иса-СдаИд с^1а1ддсас ссавсвааса 720 οΐοβίοΐΐΒΒ аагс^саваа 11ддсдс1аг дсЕас-Свд1д да! веда дас гептада 780 сс^вкаад^в адаса1д!ас аваса£а!с! ££сс!с1:сса с!£дасас!£ д!садд!даа 840 д!ааа!васа ааааса!!са а£!дд1;с£ав с!ссссаИв гадасадсс! сса!сс!сдд 900 сс!сс!!ас! !ассас!ввс !в!!сса£аа вассМесад ассдас!сс! аавад!сса! 960
ЕЕ^васссСв са£!£!£д!£ £8!д!ссса£ !!1д!сааа! ас!!ва!!се !ссасаасс! 1020
- 98 013224
1ёес£§еааа аввааа’гава адаавссасс ааваавсЩ 8с11саааса 1ссав£1а11 1080
8Ва§1сса18 Фсавасвсас авасааав!® вваасаваав савссИсса ссссаЪсвав 1140
вав£аса1£8 1асас81:£еа адааса!!!! савс£1с1св сасвса$аа£ всаавгвва! 1200
ааааааавав 1а1а1с188С £ас£ва£еа1 сс^асГКв! £аааввав8с ааавасааав 1260
£ас1ссаа£1 а£ваа£ЬХа£ ЕавТяагаас ΐοΐθίίΐοΐΐ ввбсавсгвв асгасасаа! 1320
сввбасасав ааааПсас! ΐοβββεΐβΐβ а£сс£вва£а 1асасШс1; с1сасав8с£ 1380
8ас111с1ав ΐβΐΒΐβοΐίί 1£са£сссав βΐοίβΐοΒδΒ •ЫвсНаХва аа£са£всаа 1440
ассс18саФс с18а±есс1с Ьвсваа<Л1с οβΐΐοΐΐίβΒ а!васа1с1а οίβίίΐΐΒεβ 1500
8£ссаааа!£ сссасаа!са Ββΐΐβοΐβίΐ 1а1сс1саса аассЪсваас Гваававваа 1560
а£Фссаа£88 аасс18ва8а 1а1сагхк81; В^явс^зваа асса^ввва ΧΒΒΐίδΐΐοΐ 1620
ааавв£а£са асаеаааасФ Хвваааааса ΒΒΟΐΐβΐβΐο ссбссЪасаа авгссвавав 1680
аава^а^ааа са&1саав£а 1сссаса1а1; сс1£аавс18 аааааХав 1728
<210> 3 <211> 9196 <212> ДНК <213> Сг1се1и1из еНзеиз
<400> 3 1с1аеасса8 βοϊββΙοϊοβ аас1сасава ваассасс1в сс1с£вссас οίβββΐεσΐΕ 60
88а££ааа88 ЪвФвсассас сассвсссвв св£аааа£са ^аНФТЬбаа 1а!!81ва!а 120
а£1£аса££а ЪааНв^аав 1ааааа11И савссФаИ! 1е11а1аса1. 1И18Св1аа 180
βΐίβί+οίίΐ ΐΐΐ£333£ΐί 1!в£!в1сса !аа!ав1с!а &вваааса!а аа&11а1аа1 240
ΐΐίίδίοίθΐ ВХаШвса! а1а£а£с£а1 ΐΐββΐοΐοοΐ аа1в£ссавв ааа!ааа1ав 300
88ΐ3ΐβΐ33ΐ аисИсааса 1818б1агва £а8аа££££1 сав£вс1а1а ΐβΗβΙΐβίίθ 360
- 99 013224
савсааакЪк ХХаХХааХХс аХаХеХссаХ аХХХсааХХХ ХХХаХвааХХ аХХаааХХва 420
аХссХХаавс ХвссаваасХ авааХХХХаХ ХХХааХсавв аавссссааа ХсХвХХсаХХ 480
сХХХсХаХаХ аХв^ЕКааав ЕХаавссХса сХаасХва4£ сХХсассХвХ ХХХаваасаХ 540
ЕйХссааваа £8838ΐΐ3ΐ8 ХаавйЕваа! ХасаавХвХв аваааасХсс Хаваааасаа 600
ВаХвавХсХХ ЕХвассХХав ХХХсХХХааа аасасааааХ ХсХХввааХв ХвХХХХсаХв 660
ХХссХсссав еХ£ваХавва еХвавХХХаХ ХХсаваХХаХ ХХаХХасаас ХввсХвХХвХ 720
ХасХХвХХХС ХаХдХсХХХа Хаваааааса ХаХХХХХХХХ весасаХвса ВсХХвХссХХ 780
аХваХХХХаХ асХХвХеХва сХсХХаасХс ХсававХаХа ааХХвХсХва ХвеХаХвааХ 840
ааавХХевсХ аХХвХаХвае асХХсагссс асХХсааХХа ХХВВсХХсаХ ХсХсХсаваХ 900
сссассассХ ссаваеХввХ ааасаасХХв аассаХХааа савасХХХав ХсХХХаХХХк 960
ааХваХаваХ 8888аХаХса ЕаХХХаХавв сасавввХХХ Хваваааввв авааввХааа 1020
савХаеавХХ Хаасаасаас ааааазХаХа сХХХвХааас ВХаааасХаХ ХХаХХааавХ 1080
акХавасаае асаХХаааХа ххссххееиа ХХавХвсХХХ ХХвааХХХХв сХХХсаааХа 1140
аХавХсавХЕ аеХаХасссс ХсссссаХХс ХаХаХХХХав саваааХсав ааХаааХввХ 1200
8ХХХсХб84а саХХсХХХХв ХававааХХХ аХХХХсХХХе ΒΒΧΐΧΧΧβΧβ саХХХааавХ 1260
сааХаааааХ ХааекХХсав ХааХаваааа аааасХсХва ХХХХХввааХ ссссХХХсХХ 1320
савсХХХХсХ аХХХааХсХс ХХааХваХаа ХХХааХХХвХ бВссаХвХвв ХсааавХаХа 1380
ХавссХХвХа ХаХвХаааХв ХХХХаассаа ссХвссХХХа савХаасХаХ аХааХХХХаХ 1440
ХсХаХааХаХ аХеасХХХХс ХХссаХаесХ ХХававХХвс ссавХсасХХ ХаавХХасаХ 1500
ХХХсаХаХаХ ЕХХсХХХйХе ВВаяваваХа аХХХХаХХХс ХаававааХс сХаавсаХас 1560
ХваХХваваа аХввсаааса ааасасаХаа ХХааавсХва Хаааваасва асаХХХвваб 1620
- 100 013224
ФФФааааФас аФаессассс ФааввЕШа асФвФФвФФа 8сеШШ1; 88ааФФФФФа 1680 ФФа^ФФсаФа ФаваааааФв гаФФФФаФсз ФеасаФФФсс аФаФаФ^ФаФ аФааФаФаФФ 1740 ФасаФсаФаФ ссассФвФаа ФФаФФавФв!· ФФФФаааФаФ аФФФвааааа аФааФввФсФ 1800 ЕЕФФФваФсс аФФФваассФ ФФФваФвФФФ 8εΦεΦΕ8Φί& ссааФФгвФФ ЕаФввФФаФв 1860 аФаассФФФв сФФсФсФаав вФФсаавФса в^КавааФ аФвФссФсФа ааааф§аса§ 1920 ЕФФвсэзеФФ аавФавФвав аФваса£Сва ваФеЕавФва ФвавааФФФв Фа§аааФваа 1980 ФФсасФФаФа сФваваасФФ вФФФФвсФФФ ФаваФааФва асафаффавс сФваавФаса 2040 ФавссвааФФ ЕаФФааФФаф ФсаааеаФаФ ааФсФФФФаа ФсссФаФааа ававвФаФФа 2100 сасаасааФФ сааваааваФ авааФФавас ФФссавФаФФ вкавФваасс аФФФвФФаФс 2160 аввФаваасс сФаасвФвЪе Фв8448асФФ ааавФвФФФа сФФФФФассФ ваФасФввЕФ 2220 авсфааффвф сФФФсавссФ ссФвессааа ваФассаФва аавФсаасФФ асвФФв^аФФ 2280 сФаФаФсФса аасаасФсае ввФвФФФсФФ асФсФФФсса са£саФвФа£ авсссавваа 2340 8сасаеваса аваааесФгс сФссФФвФаФ сассагваае аФсФФФФФвФ аававФсаФс 2400 асадФаФасс авававасФа аФФФФвФсФв аавсаФсаФв ФеФФваааса асавааасфф 2460 аФФФФссФвФ вФввсФаасф а^аассадае ФасааФвФФФ ссааФФсФФФ вавсФссвав 2520 аавасаваав ввавФФвааа сФсФвааааФ есвввсаЬвв асФввФФссФ ввсвФФ£8аФ 2580 ФаФвсФсаФФ сфффффвссф ееЕЕвасси βΐΐβΐΐίΐβΐ аФаввФЕВФс аФФФввФФсв 2640 аваФааФвас сасссФвасс аФФсФаесав аваасФсФсс ааваФФсФФв сааавсФвва 2700 £с§сФФаааа саасааааФв аавасФФвав вавааФввсФ вавФеФсФсс едЪайвШе 2760 аааФасФсаа вва^ФФваФв аааФасФвФВ сфФвассПФ аввФаФаввв ФсФсавФсФв 2820 сФвФФваааа аФаФааФФФс ФасааассвФ сФФФвФаааа ФФФФаавФаФ ФвФавсаеас 2880 ФФФФФаааав ФсавйваФас аФсФаФаФае ФсааФаФаве ФФФасаФаеФ ФвсааФсФФа 2940
- 101 013224
кккквсакак вааксавкак акаваавсав кввсакккак аквсккаквк квсакккаса 3000
аккаквккка васваасаса ааскккаквк вакккввакк авквсксакк аааккккккк 3060
аккскаквва скасаасава васакааакк ккваааввск кавккаскск каааккскка 3120
квакваааав саааааккса кквккааака ваасавквса кссввааквк ВВВкааккак 3180
квссакаккк скаекскаск ааааакквкв всакаасквк ксааавксак савкквкккв 3240
вааавссааа Вкскваккка ааквваааас акааасаакв акакскаккк скавакасск 3300
ккааскквса йккасквавк ккасаавккв ксквасааск кквваккскс ккаскксака 3360
кскааваакв аксаквквка савквсккас квксасккка ааааасквса ЙКВСкаваса 3420
квсавакакв ааваскккеа саккаваквк ВВкааккввс аскассавса авквВ'Ьакка 3480
авакасавск ваакакакка сккккквавв аасакааккс аквааквваа авкввавсак 3540
кавававеак вссккскввс ксксссасас сасквккквс акссакквса ккксасаскв 3600
сккккаваас ксаваквккк сакакввкак акквквкаас ксассаксав ккккаксккк 3660
аааквкскак е^акеакаак вкквкаквкк аасаскккка сааааасааа кваавссака 3720
кссксввкв^ ваекквквак ВВ^вВ'Ьаакк Вксасаакав ваккакксав сааввааска 3780
авксавввас ааваавкввв свакаскккв кквваккааа ксаккккаск вваавкксак 3840
саввваввв* каккааэ^кк вквекскккв аасквааакк акаквквакк саккаккскк 3900
йакккаввсс кквскаакав кааскаксак ккаккввваа ккквксакак вквссааккк 3960
Вксакееесс авасавсвкв ккккаскваа кккскавака кскккаквав аккскавкас 4020
квкккксавс саккккасае аквааваакс ккаааааакв ккааакаакк каеккквссс 4080
ааеаккакас бккаасааак ввкаваасск кскккваакк скввсавкак ВВскасасав 4140
ксс£ааскск какскксска авскваааас авааааавса аквасссава аааккккакк 4200
- 102 013224
БаааавБсБс аввававасБ БсссаБссБв авааваБсБс ББББсссБББ БаБааБЕБав 4260
ВСБССБВваБ ааБсасБваа НЛБсБссаБ вНссаБсБа БавБасБвББ эбеесбвееб 4320
БссББББББс ББассасааа εΐβΐοΐίεΐί Ш8с181а1 ваааваааа! βΐεΐΐδίΐΒΐ 4380
ааБвБваааБ БсБсБвБссс БвсавввБсс саса1сс8сс БсааБсссаа аБааасасас 4440
айабкс1£1а ББааБЬаБеа аасШБея!: савББввсБа вввсББсББа ББВЕСБавсБ 4500
Οΐβΐΰΐίββΐ БаББааасса БаасБасБаБ БвБаавБаББ БссэБеБееБ сББаБсББас 4560
сааввааавЕ ВБссавевас сБсББасБсс БсБевсвБвБ 1£8сая1ваа ваввававав 4620
сваБББссБа ΐΐΐ8ίεΐοΐ8 сББаББББсБ ВаББсБвсБс авсБаБвБса сББссБ§ссБ 4680
ЕбссааБсаЕ ссааБсавБЕ ББББаББсаБ БавссааБаа аавааасаББ Басасаваав 4740
васББссссе аБсаквИай ББвБаБдадБ БсББсавааа аБсаБавБаБ сМББаа-Бас 4800
БааБББББаБ ааааааББаа ББвБаББваа ааББаБвБЕБ аБаБвБвБсБ ЕБеБвБсеяБ 4860
ББйБвсБсаБ аадБавсаБв ваеБвсаваа ваввваагса ваБсББББББ Еаавввасаа 4920
ававБББаИ саваББасаБ Шаавв^Ва БааБв^айва ББвсааввББ аЕсаасаБвВ 4980
саваааБвБе ааваавсБвб БсасаББаса БссававБса ававИавава ВсааБвааББ 5040
ваБвсаБвса ΐίοοΐεΐβοΐ савсБсасББ ББссБвваес БвавсБваББ вЕаавссаБс 5100
ΐΒβίεΐοΐΐΐ есйеЯВаасЬ аасБсааавв саавББсааа ассБвББсББ аавгаБаавс 5160
саБсБсБсса вБсссБсаБа ΐβΒΐεΐοΐΐβ адасасБББс БББаБаББсБ БдБасаБава 5220
ааББеааББс сБаасаасБв саББсаааББ асааааБавБ ББББаааадс БваБаБааБа 5280
ааБвБаааБа сааБсБаеаа саБББББаБа ааБааесаБа ББаасБсавБ аааааБаааБ 5340
ЗсаБее^аБ БББссББсаБ БаввваавБа БВ^сБсссса ВВсБеББсБс БагаББсБас 5400
БавБааБесБ Βΐΐΐβΐβοβο саБссасаев ΒδΐίΐΐπΐΙΐ БааавсБаав асаБеааБва 5460
БвгасаБвсБ ДООДсаН БавасБББББ БссББасБаБ ааББеавсБа ВБаБББББвБ 5520
- 103 013224
3ΐ3ΐοΐ8ΐΐ3 аИсава1аа аз81аа41Гс Шв^ваЪаа 5580
а88са1;а1аа аЗДзаа&Ш заааасаааа 8сс18ааа£8 аса^ЦЙНа аеаТЕсаваа 5640
саакааПМ сааааесае!: 1асссаасШ 1ссааа1аса βΐοΐβοβεΐΐ ΐΐϋΐΐΕΗΐβΐ 5700
ΕΐββΐΗΗθΐΐ Еакасаааеа ааГаесасаХ Шаааа1а£ οΐβΐΐΐβοΐο ΐΐ83ίΐΐΐί·ί 5760
•Ы-ЬсаааИ!; βεβοΐαβΐΐο βοΐββΐΐεΐΕ ΐδΐββδΒίίβ 188с4есааа са£сЫЛвас 5820
ΐοΐίΒβΐΐβε 8§аа4сса8® а1£а£1(ас£ Ь8£4188Сса ааа1с11в££ οοβΐΐοΐδΒΕ 5880
ΐΐίοΐίοίοΐ а1с4ак8Га8 сгаесасаае •Е1ааав8181 весавхаггв ваавЕс^сЬс 5940
а££1а£а1а£ ίΪ0Ϊ3Ϊ3ΪΪ0 ίεΐβΐΐίΐΐΐ •ЬссЬсЬк^са ίβΐβΐΐΐΕΟί ΐΐοΐεΐΐΐΐβ 6000
£18а411с£а сгДОавШ; Еа1ас££ас1 ΐΐοίΐβοβοί мствееа шаш^с 6060
ГЕХГскааеа шгсЗДавса авКсаХаТс βοΐββΐΐΐΐβ аса8£18с££ сШ481аа£ 6120
а^аеасГяаа ΐ^οοοοΐΐβί £48ааа18с£ Ь88ва£са8а аас+саваИ ΐΕββοΐΐΐΐϋ 6180
11Ш1аа£а 1±1сса£саа ЕШасеаес 18аа18ксс1; ваГссааеаа 1а1£ааа1сг 6240
ββββΐβοΐΐί 8ааз1с1£за асЪНЪаеае 18а£ааавс£ ХсссШааа £18311^8^8 6300
ΐΐοίβίβΐΐί ίΐ18®033£8 (хаассШХс βίΐΒίΐΗΐεε аа4£а84£аа са1а1111са 6360
3ΐΐΐΐΐΐίκΐ. ЗДваФсЬзН 3Ϊ8ίΐίΪ83Ϊ с1;8асса1а1 41а1ааааЪ1 Ηβίΐΐββΐΐ 6420
ΐδββΐβΐΐΒΐ βοΐεΐίβοίΐ аШНаШ ΙΙβίΐΐΙΐβο ΐΐβΐΐΐΐοΐβ 8ссааа4£аа 6480
аНа^аЪкс! £1а1£аг111 аеНбвааЗД ИасХ4£г£8 8сг£а81аас ίβεοΐΐΊΐκΐ 6540
188*8аа48С Ыаадааааа Ο8Ϊ8Ϊ88^οΐ ас18а4а11е 841с1аа1с·! 1а1а1а£са1 6600
β^ΐδΐΐΐεΐΐ аеДОавива ΐΐβΐβοΐββΐ; саяа11§£с1 18а8£4£а18 сааа^в^ааа 6660
а1аПГа£а£ 8θΐΐ8ΐΐΐΐ8 £1е1с1аава асааа£1а18 οΐΐ§οΐ8ΐοί сс!а1сё8££ 6720
οΙ.£ΒΐΙΐΐΐο са!1са£с1с £1саа8ске£ ΐίί8Ϊ8ΐ8ίΐ ваа£ас1аас 1сс81ас1а£ 6780
- 104 013224
сИеИИс! 8183311880 сссНИсаа а88111сИ1 1011111111 111аа888ас 6840
аасаавШа ИсаеаНас аИИаазс! 8а1аа181а1 8а11всаа88 11а1сааса1 6900
8§савааа£8 18аа8аа£С1 аеесасаИа са1ссаса1Е 8а81саа8а8 саеаваксаз 6960
18аа11аа18 са18С811сс 181881саас 1сас1111сс 1а11с11а8а 1а81с1Э88а 7020
1са1ааасс1 88883а!а81 £01ассасаа 1888са1а1с сасИасИс а811са18са 7080
а1еаассаа£ 8саса1ссас авзааааас! ВаШаеаса асс1с1са11 8аеас1с11с 7140
сса£а18а11 аяас18181с ааеИеасаа 11аааас1а1 сасасс18аа 8сса1сас1а 7200
81ааа1а1аа 18аааа1£11 8а11а1сасс а1аа11са1с 181а1ссс11 1811а1181а 7260
8а1111818а ав11сс1а11 саа81ссс18 ИссИсеИ ааааасс181 ИШазИа 7320
аа1а881111 11а81811сс 181с181ааа 1ас111111а ааеНзЕага 11а1111саа 7380
8ΐβΐ£ίΐθΐθ сса81с111в 8С11813111 1са1ссс11с аа!аса1а1а 1111181аа! 7440
11а1111111 1а111ааа11 авааасаааа с18С1111ас а181сак1с1 са811ссс1с 7500
1ССС1СССС1 сс1сссс18с 1ссссасс1а ЗЕсессааИ ссаас1сс11 1с11с1сссс 7560
айваа88§18 а55ссс1сса 188888ааа1 е11саа181с 181са1а1са 1118838038 7620
88сс1а8асс с!сссса818 1810138831 8а8а8а81а1 ссс1с1а181 88аеа888С1 7680
сссаааеНс а1118181ас 1а888<1ааз 1ас1£а1сса с1а1са8188 сссса1а8а1 7740
181сс88асс 1ссааас18а οΐΐοοίοοΐί са888ае1с1 ееаасавИс 1а18С18£11 7800
1сссава1а1 са81с18888 1сса18Э8са азссс11£11 са881са811 8И1с181а8 7860
вШссссав ссс£81с118 ассссШбс 1са1сас11с ΐοοοΐοΐοίε саас188а11 7920
сса£а£11са 8010381811 1а8с181888 181с18са1с 18с11сса1с а£с1ас188а 7980
Ьгадяесбс! аЕ8а188Са1 а1аае£1а81 са1са81с1с а11а!сава8 ааевесНИ 8040
аа8й1а8сс! 0118311311 8с11а8а118 Иав118888 1саасс1181 а881с1с188 8100
- 105 013224
аса^ёасаё аа11с1с£Н ааасс£а£аа 1ЕЕс1ссс1;с ΐ8*8εΐ8εΐ3 ίοοοίΐΐΐοί 8160
££с£с£са1с сеМссёссс с£вас1а£а£ сНсс££с£с сс£са£в1сс 1сс£с£сссс 8220
1сссс£1с£с οοοΐΐοΐοΐΐ 1с££с£аас£ ссс£с£сссс £ссасссасе а£сссса!1а 8280
ЕсМаХвава ΐοΐΐείοοίΐ аШЪавсаа мссИШя вс£а£ааааг ЕааШааШХ 8340
га^а^ЕсМа ΐβΐοβΕΕ^ΐΐ а1Шввс1а Е1аШв1а1 εΐΒΐΐΐεβΐΐ ΒβΙβΐίΐΐΙβ 8400
асс£1аа11в аса£вЬа£сс г1а1а£££ав асасаваНЛ аааХаШва ββΐΐΐΐίΐΐί 8460
ίΐΐΐίΐΐίϋ ££аааваШ аШа-И£11 ΐβΐΒΐεΉοΐ ЕссЬЕса^Ес саваававве 8520
сассаваСсХ са££сааЕ§1 ΕΕΐΐ£·£Ε380 сасса1в£££ Квс^ЕЕеаа Мваас^саЕ 8580
£асс1с£вка авансае1са Е1£с£с11;аа СС£С££а£СС а-ЬсЬсЬссав сссс1£аав£ 8640
βΐΐΐοίΐίΐθ ааеавва^ав сае1£са£са ίΐίΐΐοοοΐΐ ЕвассааЕва с1сс£асс1С 8700
асЪзаа-Щ! ΐΐΐθβοοβίΐ £а1а1£1аа1 £с1££1асса Β8ΐΐί303ΐΐ ΐΐοΐίΐΐΗΐο 8760
ΐΐΕΟΐβββΐί ΐοΐΐοεοΐΕΐ •Ы£1с1са1с 1οίΐ3ΐΐΐίί Εΐθΐ£ΐ£Ε83 ΐΐβΐΗΐεΕδο 8820
ΐΐΐΐΒΐΐίΐΐ сгвМШас ав1ааЕ1гаг а£сааа!1аа ааНаШ1а ΐΕΒ33Ϊ8Ββ£ 8880
В^Е^еас^а οβΐείβΐβίο Ьв^Есасса! ΒΐΕΟΐΒβοοί ее^сНеесс авааваа88£ 8940
Εΐοβΐβίΐοί с^вааасСЕЕ Са1ЬЕ1££а1 йИасваас! Есса£а££££ вс£авваа1с 9000
ааассссавс 1сс1с1£Еаа аавсавссас ΐΕϋΐοΐεβΕΟ сас£ва£1сс СсСсМсаав 9060
саЕЕ£ЕакЕС саас111£аа 1ЕЕ££ассае ГвваЩавае 1εοί1βΐ3ΐο 1с1авсассс 9120
а1ваааа£1Л а1вса£1вс1 а£а1Е££с£1 Е^сасНсаЕ саИв^ва саеавасавв 9180
авеаХсссаа еаессс 9196
<210> 4 <211> 25 <212> ДНК
- 106 013224 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 4 ас^саТс-Щ ваа1с1сава аСТев 25 <210> 5 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 5 οΐίββοοβΐΐ ίοΐβΐοΐίοΐ οΐοβ 24 <210> 6 <211> 979 <212> ДНК <213> Сг1се1и1иа £Г15еиз <400> 6 βοΐοβΐοίΐβ вааТЫсава аИ£8С£с1а ТвсТасТвеа οΐ^βΐΐΐθ^ 60 ассСвгаакг ваеасагвса савасавз^с ΐΒβεθΐοΐοο асЕввасас! вЗ^аев^За 120 ав^вааввас ааааа£в1£с аа818§1сеа всТссссаТТ вТавасавсс 1сса1сс1с8 180 ΐοοΐοοΐΐβο НасссЫвв ЫвЫссаеа авассМвса ва^васЬсс ТвававТсса 240 ΐεεΐβθίοοΐ. всае^в^ЗЗ^ вввЪаЫсса вШ^Исааа 1асЩа1:сс вЬссасаасс 300 £18£с18ваа авззаааБав аавааассас сааваавсН: ввсИсааас а!ссавТ1а1 360
188ав1ссаг вХсавасвса сГвасааавТ ввзаасаваа всавссЫсс а1ссса£1ва 420
8§аа1аса1:в в1асасе1£в ааваасаСИ Ιοββοΐίοίο ваасесаваа Гвааав^гва 480
- 107 013224
1аааааааеа В181;а1с188 ссас^ва^ва οοοΐΐχΐΐΐβ Нааавващ? сааавасааа 540
81ас£ссаак 1а£ваа1:1£а 4£а££ва1аа с1с1а111с1 -ЬвЕ^савс!® васЦасасаа 600
ссдаЪасаса еааааНсас ΐΐΟΒΚΒΒΟΒί ва1сс1вва1 а1асас11Лс 1с1сссаввс 660
^βοΐΐοοΐΐ ΚίΕΐβΐβοΙΐ ΐΐΐθ3ΐβ0ββ 88ΐοΐΕΪ0β8 8ΐΐΕ<:ΐΐ3Ϊ8 ааа1са18са 720
аасасХвсак сс1ва1всс1 с1всааасИ ссайсШа ва^васаХсХ ас1а1и1вв 780
аедссааааЕ всссасаасс ава11всав1 ШаХсс1сас саасс1с8аа с^ааававва 840
аа!сссса1в ваасс-Ьввав а£а1са11вв 18ΐ88«ί88β аассаНвва а^ввШасЬс 900
Саааез^к^с аасаваааас Хаввааааас а88сс181ас сс1£сс!аса аав^ссеаеа 960
£ааяа1а§аа асввЪсаав 979
<210> 7 <211> 979 <212> ДНК <213> Ка11из погуевхсиз
<400> 7 ас1са£с-ие вааСс1сава а^ВЕСВсХа ΐ£0ΐ30ΐ£βΐ вваГвееава οΐ8ΐ8ΐΐΐ®8 60
асс1£1аа£1; еаваса^вса савасава1с Ь8всс1с1сс ас188асас! вВ^саеёЪеа 120
ае1ваа1кас ааааа!а11с аа^ввгева 8с1сссса1Х ё^авасавсс 11са1ссЬс8 180
ёссЬссИас 1кассас188 сХВ^Хссаеа аеассггвса Ва1С8ас1св Хаававксса 240
ίββίΒβίοοΐ всав^в^ке^ ЕёКШссса В14св1сааа 1аШ£аис В^ссасаасс 300
«ВВС^аваа ааевааакав ааваавссас сааваавсИ ВвсХ1сааас а1сса£1:са1 360
-18Вае1:сса1 В^саеаскса савасааав! ВВВаасавае ВсаессИсс аксссаХсва 420
а£ав1аса18 ΒίβοΒΐΒΐίΕ ааеааса!!! ΐοβΒοΐΙοΐο всасвсаваа ί8033ΒΪ88& 480
1ааааааа$а ΒΐΒίΗΐοΐΒΒ с1ассва1ва οοοΐβοΐίΐβ Наааеваее сааавасааа 540
- 108 013224
В^асЬссааФ Га^вааШа £1аЕ1£а1аа είοίβΐΐΐοΐ ФвеФсавсЬв дас^асасаа 600
1с8Е1асаса вааааНсас Ысв888С8^ еаЬссЬвва!; аЬасасШс Фсгс1саввс 660
1&асИсс1а в^Я^асИ ГНсаСссса εεΐοίβΐΟΒί вгЩсФгаФв ааа!са1вса 720 аассс^вса! ссЬеакесс! с1£сааас1;1 ссаСТсЫйа еаГ^асаСс! ас1аШ1вв 780 аеессааааФ есссасаасс аваИкссв! 11а1сс1сас ааасс!сваа сФва^авка 840 аа11ссаа!в ваасс1в8а8 а1а1саЬ1вв 18^88^883 аасса!1888 βΐβΒίΐβΙΐο 900 (ааа&£18^с аасаваааас Иввааааас аввс11а1а1 сссСссГаса аав1сс£ава 960 ваавакаеаа асввЮаав 979 <210> 8 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 8 аавЪа^аавс НасаХвва! 8ас£а1а1св οϊβοβοϊοβϊ 40 <210> 9 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 9 аШаасФес аввааесаИ 1£СВ£Г£вас ва^еваквев 40 <210> 10 <211> 40
- 109 013224 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 10 аШаагеЪа сс^аадсаП кес^йсас ваквиавбве 40 <210> 11 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 11 сЬссаа44а1 раШайа 8Ϊ8 23 <210> 12 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 12 £&а181(1;£а аессаавсИ сЬТев 25 <210> 13 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 13
- 110 013224
ΒΐοοβΐΒΒΐΒ акссСзса^ βΐβ® 24 <210> 14 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 14 сассаа18а! акскссаввТ Тсс 23 <210> 15 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
Опыг^яыыа гчлгпААпеа'гАпь.иГкГггы гиитдтыиасюл ηΐ—ΐί/' <400> 15 ва!а1свс1в οβοΐοβΐΐβί свае 24 <210> 16 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 16 савваавваа вдекеваааа вавс 24 <210> 17 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 111 013224 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 17
ΚβΐΗΐΟβοΐΒ свсТсвТсвТ свае 24 <210> 18 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 18 сав§аавёаа $а#с 24 <210> 19 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 19 аТвсйввсаТ сГвв 24 <210> 20 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 20 с-ЬаНШса всПсавеа! а1е1В88 27
- 112 013224 <210> 21 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 21 вкскваавса ЬкаШвИв аавс 24 <210> 22 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 22
Вквавкасак ксакквкаск вкв 23 <210> 23 <211> Б75 <212> РКТ <213> Сг1секи1из вгхзеиз <400> 23
Мек Агв А1а Тгр ТЬг (Иу Зег Тгр Агв Тгр Не Мек Ьеи Пе Ьеи РЬе
1 5 10 15
А1а Тгр 01 у ТЬг Ьеи Ьеи РЬе Туг Не С1у С1у ΗΪ3 Ьеи Уа1 Агв Азр
20 25 30
Азп Азр Η13 Рго Азр ΗΪ3 Зег Зег Агв С1и Ьеи Зег Ьуз Пе Ьеи А1а
35 40 45
Ьуз Ьеи 01и Агв Ьеи Ьуз (Ип δΐη Азп 01и Азр Ьеи Агв Агв Мек А1а
50 55 60
б1и Зег Ьеи Агв Пе Рго С1и С1у Рго Не Азр С1п С1у ТЬг А1а ТЬг
- 113 013224
61у Агв Уа1 Аге Уа1 Ьеи С1и (Ли (Лп Ьеи Уа1 Ьуз А1а Ьуз (Ли 61п
85 90 95
Не 61и Азп Туг Ьуз Ьуз С1п А1а Аге Азп Азр Ьеи (Лу Ьуз Азр ΗΪ5
100 105 110
(Ли Не Ьеи Агв Агв Аге Не 61и Азп 01 у А1а Ьуз (Ли Ьеи Тгр РЬе
115 120 125
РЬе Ьеи 01п Зег С1и Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи (Ли (Лу Азп (Ли
130 135 140
Ьеи С1п Агв Н1з А1а Азр (Ли Не Ьеи Ьеи Азр Ьеи (Лу ΗΪ3 Н18 С1и
145 150 155 160
Агв Зег Не МеХ ТЬг Азр Ьеи Туг Туг Ьеи Зег С1п ТЬг Азр (Лу А1а
165 170 175
С1у С1и Тгр Аге С1и Ьуз С1и А1а Ьуз Азр Ьеи ТЬг 61и Ьеи Уа1 С1п
Агв Аге 11е ТЬг Туг Ьеи θΐη Азп Рго Ьуз Азр Суз Зег Ьуз А1а Агв 195 200205
Ьуз Ьеи Уа1 Суз Азп Не Азп Ьуз С1у Суз 61у Туг С1у Суз С1п Ьеи 210 215220
Шз ΗΪ3 Уа1 Уа1 Туг Суз РЬе МеХ Не А1а Туг С1у ТЬг С1п Агв ТЫ
225 230 235240
Ьеи Не Ьеи 61и Зег С1п Азп Тгр Агв Туг А1а ТЬг С1у 61у Тгр С1и
245 250 255
ТЬг Уа1 РЬе Агв Рго Уа1 Зег (Ли ТЫ Суз ТЫ Азр Аге Зег (Лу Ьеи
260 265 270
Зег ТЫ 61у Шз Тгр Зег б1у С1и Уа1 Ьуз Азр Ьуз Азп Уа1 С1п Уа1
275 280 285
Уа1 (Ли Ьеи Рго Не Уа1 Азр Зег Ьеи Н1з Рго Аге Рго Рго Туг Ьеи
290 295 300
- 114 013224
Рго Ьеи А1а Уа1 Рго 61и Азр Ьеи А1а Авр Аге Ьеи Ьеи Аге Уа1 Ηίβ
305 310 315 320
61у Авр Рго А1а Уа1 Тгр Тгр Уа1 Бег 61п РЬе Уа1 Ьув Туг Ьеи Не
325 330 335
Аге Рго 61п Рго Тгр Ьеи 61и Аге 61и Не С1и 61и ТЬг ТЫ Ьуз Ьуз
340 345 350
Ьеи С1у РЬе Ьуз Н1з Рго Уа1 11е С1у Уа1 Н1з Уа1 Аге Аге ТЬг Авр
355 360 365
Ьув Уа1 С1у ТЬг 61и А1а Л1а РЬе Ηίβ Рго Не 61и С1и Туг Μβΐ Уа1
370 375 380
Н1з Уа1 61 и 61и ΗΪ3 РЬе С1п Ьеи Ьеи 61и Аге Аге Ме! Ьуз Уа1 Авр
385 390 395 400
Ьув Ьув Аге Уа1 Туг Ьеи А1а ТЬг Азр Азр Рго Бег Ьеи Ьеи Ьув С1и
405 410 415
А1а Ьув ТЫ Ьуз Туг Бег Азп Туг С1и РЬе Не Бег Азр Азп Бег Пе
420 425 430
Бег Тгр Бег А1а С1у Ьеи Шв Авп Аге Туг ТЫ 61и Азп Бег Ьеи Аге
435 440 445
61у Уа1 Не Ьеи Азр Не ΗΪ8 РЬе Ьеи Бег С1п А1а Азр РЬе Ьеи Уа1
450 455 460
Сув ТЬг РЬе Бег Бег С1п Уа1 Суз Аге Уа1 А1а Туг 61и Пе Ме! С1п
465 470 475 480
ТЫ Ьеи Шв Рго Авр А1а Бег А1а Азп РЬе Н18 Бег Ьеи Авр Азр 11е
485 490 495
Туг Туг РЬе С1у 61у 61п Авп А1а Н1з Авп С1п Не А1а Уа1 Туг Рго
500 505 510
ΗΪ3 С1п Рго Аге ТЬг Ьув 61и С1и Не Рго Ме! С1и Рго 61у Азр Не
515 520 525
- 115 013224
11е С1у Уа1 АЬа СЬу Азп Н1з Тгр Азп СЬу Туг 5ег Ьуз СЬу УаЬ Азп
530 535 540
Агд Ьуз Ьеи СЬу Ьуз ТЬг СЬу Ьеи Тут Рго Зег Туг Ьуз УаЬ Агд СЬи
545 550 555 560
Ьуз Ιΐθ С1и ТЬг УаЬ Ьуз Туг Рго ТЬг Туг Рго СЬи А1а СЬи Ьуз
565 570 575
<210> 24 <211> 575 <212> РКТ <213> Миз тизсиЬиз <400> 24
Ме! Агд А1а Тгр ТЬг СЬу Зег Тгр Агд Тгр 11е Ме! Ьеи Не Ьеи РЬе
1 5 10 15
АЬа Тгр СЬу ТЬг Ьеи Ьеи РЬе Туг Не СЬу СЬу Η1Ξ Ьеи УаЬ Агд Азр
20 25 30
Азп Азр Н1з Рго Азр ΗΪ3 Зег Зег Агд С1и Ьеи Зег Ьуз 11е Ьеи АЬа
35 40 45
Ьуз Ьеи СЬи Агд Ьеи Ьуз СЬп С1п Азп С1и Азр Ьеи Агд Агд Ме! АЬа
50 55 60
61и 5ег Ьеи Агд Пе Рго С1и СЬу Рго Не Азр С1п С1у ТЬг АЬа ТЬг
65 70 75 80
СЬу Агд УаЬ Агд УаЬ Ьеи С1и СЬи С1п Ьеи Уа1 Ьуз АЬа Ьуз СЬи СЬп
85 90 95
Не СЬи Азп Туг Ьуз Ьуз СЬп АЬа Агд Азп СЬу Ьеи СЬу Ьуз Азр Н1з
100 105 110
СЬи Не Ьеи Агд Агд Агд Не СЬи Азп СЬу А1а Ьуз СЬи Ьеи Тгр РЬе
115 120 125
РЬе Ьеи СЬп Зег СЬи Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи Ьуз Η1Ξ Ьеи СЬи С1у Азп С1и
130 135 140
- 116 013224
Ьеи СЬп Аге НЬз АЬа Азр СЬи Не Ьеи Ьеи Азр Ьеи СЬу НЬз Ηίε СЬи
145 150 155 160
Агк Бег Не Μβΐ ТЬг Азр Ьеи Туг Туг Ьеи 8ег СЬп ТЬг Азр СЬу АЬа
Ь65 Ь70 175
СЬу Азр Тгр Аге СЬи Ьуз СЬи АЬа Ьуз Азр Ьеи ТЬг СЬи Ьеи УаЬ СЬп
180 185 190
Аге Аге ЬЬе ТЬг Туг Ьеи СЬп Азп Рго Ьуз Азр Суз Бег Ьуз АЬа Агв
Ь95 200 205
Ьуз Ьеи УаЬ Суз Азп ЬЬе Азп Ьуз СЬу Суз СЬу Туг СЬу Суз СЬп Ьеи
210 215 220
НЬз НЬз УаЬ УаЬ Туг Суз РЬе Мег ЬЬе АЬа Туг СЬу ТЬг СЬп Агв ТЬг
225 230 235 240
Ьеи Не Ьеи СЬи Бег СЬп Азп Тгр Аге Туг АЬа ТЬг СЬу СЬу Тгр СЬи
245 250 255
ТЬг УаЬ РЬе Аге Рго УаЬ 5ег СЬи ТЬг Суз ТЬг Азр Аге Бег СЬу Ьеи
260 265 270
5ег ТЬг СЬу НЬз Тгр 8ег СЬу СЬи УаЬ Азп Азр Ьуз Азп ЬЬе СЬп УаЬ
275 280 285
УаЬ СЬи Ьеи Рго ЬЬе УаЬ Азр Бег Ьеи НЬз Рго Аге Рго Рго Туг Ьеи
290 295 300
Рго Ьеи АЬа УаЬ Рго СЬи Азр Ьеи АЬа Азр Аг® Ьеи Ьеи Аге УаЬ НЬз
305 ЗЬО ЗЬ5 320
СЬу Азр Рго АЬа УаЬ Тгр Тгр УаЬ 5ег СЬп РЬе УаЬ Ьуз Туг Ьеи ЬЬе
325 330 335
Ага Рго СЬп Рго Тгр Ьеи СЬи Ьуз СЬи ЬЬе СЬи СЬи АЬа ТЬг Ьуз Ьуз
340 345 350
Ьеи СЬу РЬе Ьуз НЬз Рго УаЬ ЬЬе СЬу УаЬ НЬз УаЬ АГ£ Аге ТЬг Азр
355 360 365
- 117 013224
Ьуз Уа1 С1у ТЬг А1а А1а РЬе Н1з Рго Пе С1и С1и Туг Ме! Уа1
370 375 380
Н1з Уа1 (Ли С1и Η1Ξ РЬе С1п Ьеи Ьеи А1а Агв Аге Ме! 61п Уа1 Азр
385 390 395 400
Ьуз Ьуз Аге Уа1 Туг Ьеи А1а ТЬг Азр Азр Рго ТЬг Ьеи Ьеи Ьуз С1и
405 410 415
А1а Ьуз ТЬг Ьуз Туг Зег Азп Туг (Ии РЬе Пе Зег Азр Азп Зег Пе
420 425 430
Зег Тгр 8ег А1а С1у Ьеи Нхз Азп Аге Туг ТЬг (Ии Азп Зег Ьеи Аге
435 440 445
С1у Уа1 11е Ьеи Азр Пе ΗΪ3 РЬе Ьеи Зег (Ип А1а Азр РЬе Ьеи Уа1
450 455 460
Суз ТЬг РЬе Зег Зег С1п Уа1 Суз Аге Уа1 А1а Туг (Ии Пе Ме! 61п
465 470 475 480
ТЬг Ьеи ΗΪ8 Рго Азр А1а Зег А1а Азп РЬе Ηίε Зег Ьеи Азр Азр Пе
485 490 495
Туг Тут РЬе (Ну С1у С1п Азп А1а Ηίδ Азп (Ип Пе А1а Уа1 Туг Рго
500 505 510
Н13 Ьуз Рго Агв ТЬг (Ии (Ии (Ии Пе Рго Ме! С1и Рго (Лу Азр Пе
515 520 525
Пе (Ну Уа1 А1а С1у Азп ΗΪ5 Тгр Азр (Ну Туг Зег Ьуз (Лу Пе Азп
530 535 540
Аге Ьуз Ьеи 01 у Ьуз ТЬг 61у Ьеи Туг Рго Зег Туг Ьуз Уа1 Аге (Ни
545 550 555 560
Ьуз Пе 61и ТЬг Уа1 Ьуз Туг Рго ТЬг Туг Рго С1и А1а (Ни Ьуз
565 570 575 <210> 25 <211> 18 <212> РКТ
- 118 013224 <213> Ново 8ар1еп5 <400> 25
Аар С1и Зег Не Туг Бег Аап Туг Туг Ьеи Туг С1и Зег 11е Рго Ьуа 15 10 15
Рго Суа <210> 26 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 26 с118181вас 1с11аас1с1 саван 25 <210> 27 <2П> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 27 сссЮвава! аасИснба! а^с 23 <210> 28 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 28
- 119 013224
ЕЕ^аддссСс ас!аас!д 18 <210> 29 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 29 са!адаааса ад!аасааса дссад 25 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
ДНК
Искусственная последовательность
<400>
дадас!!сад сссас!!саа !!а!!ддс 28 <210> 31 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 31 даддссас!! дгдгадсдсс аад!д 25 <210> 32 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 120 013224 <220>
<223> Описание искусственной последовательности; синтетическая ДНК <400> 32 а88аа88188 С£с1са1сас £88° 24 <210> 33 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 33
1ааеессаса а£1с11аа11 вса1сс 26 <210> 34 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 34 савв881811 сссИгакка ее^Яваа 27 <210> 35 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 35 сссс1сасвс а1ваа8сс18 838 23
- 121 013224 <210> 36 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 36
ВЕсавеавас сассИвсва вТасссас 28 <210> 37 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 37
88с£с1В8сг гасссееаеа 8833^888 28 <210> 38 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 38 ааааввссГс аеТга£18аа οίεΐβΐΒΒ 28 <210> 39 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 122 013224 <223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 39 свсвваксск саа^св-Щв ВВккВВксс 29 <210> 40 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 40 сссаавсккв ссассакввс ксасвскссс вскавсквсс свавс 45 <210> 41 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 41 ссввааккск вссаавкакв авссаксскв в 31 <210> 42 <211> 17 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 42 вссякссава авв^ВВ^ 17 <210> 43
- 123 013224 <211> 17 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 43
ЕФсФФ£Фсае еяааваф 17 <210> 44 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 44
Квсаввавас сассФФ£С£а ефйсссас 28 <210> 45 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 45
8Е£Ф888сФе ФассФФсФвЕ аасайВЕС 28 <210> 46 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК
- 124 013224 <400> 46
88С8С1££С1 Сасссекава В£аа1в88 28 <210> 47 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 47 еваа188ё1е 111£1с1сс1с сааава1£С 28 <210> 48 <211> 1316 <212> ДНК <213> Сг1се1и1ив етлзеиз <400> 48
8СССС8СССС с1ссасс1в£ асс£а8а81а 8С18£аваа1 181£сассв£ аа£1авс1с1 60
18§ас1В£1В 8аассс18С8 савв^всавс аасаа18££1 вавссссавв £а1сса8Еав 120
8а1сс1а818 аса£8££8с! с1££ас1В81 ЕЕЕсававс! а1сса£ааев 1881С£са£а 180
1£8С£С1£8С Насссввае а££аа1£В£1 811181с1сс 1ссааава1в сава1с1еас 240
88а1£са8са сааасссаав ссс1£11сса 8аа8£1аса8 сссассса!в 1са1сса1с1 300
1£с1всаа18 81а£8аВ8СС ИИссвваа 1а1сааа1ас аасИвеаН 1с1£ва££аа 360
Ваа1£1всас а1саа1£аса асв1сс18са с1са80111с ва£в1£££Са с1С£саа£в1 420
£В1с1сс1£С с1£1ссасс1 £1а1с11ссс 1£асаа£асс асс!а1сс1а 118а1вааас 480
аа18а1ссас аа1£81ссас сссасавсав саа1И1£88 1ас1с£1а1£ ссаававяа! 540
Ва11£асе1в саваасаввв сс!ас11сса Еса8са18вс 1всасс11са с1£С1£1са1 600
ссс1ассаа! В1с1118£ас с!са1васаа с11сааса11 8аа£а18£сс а1е1£с1всс 660
- 125 013224 !ддсс!са!с са!ааее!дс а!с1вдссаа дадЕааЕдд! ЕсадссНда οΐβΐίΐ££β®720
Еасадддааа ссасддадвс ав!!са!с!а с!сас!Е8ас с!авсссвдс !с!!са!с!д780
88!сс!дсдд дад!асаа!д аад!!дадсс са!са!сс!с !сад!д88св аддаадаЕда840 ад^сЬсса!! ааддаддсад с!да8дс!д! адЕддаддсс а!ддас!1с! вЕВВВЕаав!900 сас!!!!да! ЕсаасааадЕ садаЕдддса д!а!аадаад асадссадса а!ддсаадс!960
ХсдддссЕас ИвссЕда!! !ссд!!!сас асссИсаад садвс!д!да аввавассЕд1020 !дсс!дд!!с ассдасаасЕ аЕдадсаддс ссддаадЕда адсаЕдддас аадсдвеЕдс1080
ЕсадсЕддса аЕвсссадЕс адЕаддсЕдс адЕсЕсаЕса ЕЕЕдсЕЕдЕс ааваасЕдад1140 дасадЕаЕсс адсаассЕда дссасаЕдсЕ ддЕсЕсЕсЕд ссадддддсЕ ЕсаЕдсадсс1200 аЕссадЕавд дсссаЕдЕЕЕ дЕссаЕссЕс дддддааддс садассааса ссЕЕдЕЕЕдЕ1260 сЕдсЕЕсЕдс сссаассЕса дЕдсаЕссаЕ дсЕддЕссЕд сЕдЕсссЕЕд ЕсЕада1316 <210> 49 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 49 даЕссЕдсЕв вдассааааЕ Едд 23 <210> 50 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК
- 126 013224 <400> 50 сХХаасаХсс сааввзаХвс Хв <210>
<211>
<212>
<213>
1965
ДНК
Сг1сеХи1из вНзеиз <400> асЕЕВеВВСХ сссвваавсе
ВЕВассаХвв сеХсХсХвсв сваавсвавс сХвсвеаавс ί8θ880Εθίΐ
ХХссваваХв ававвсааас сХв^ВЕсаас
ХЕЕЕаааХХс ¢888318^8
120
ХХвХааХаас авсавсХвас гааааесаев авсХХвс!Ха саавсаасав
ХХвХсввава
180 адсХваавав аааввааХХв ссссХХввав
ХХаасХасса
ХвХХХХсасХ ваХссХссХ®
240 ваассааааХ
ХвеаааХвва
ЕЕаХсаасас
ХХХвХХсХсХ
ХсавХессХв вааавссХсХ
300 аХввавасаа
ВХввааХХсс
ХХсасавХсс
ХвХХааХХса сХсХвв^вВС
ХасавХсаас
360 васХХсссаа
Хвсаавсвс!
ХХаввзаааа
ХсХХсасввс
ХХХассасХХ
ВВХваессса
420
ХХХаХсаваХ
ВХХвеасХХа ааасХаксса
ХвХасаХвеа
ХХХссссХса свсаХваавс
480 сХввавХХХХ
ВВХсассХеХ
ВсаеаХваХа
ХХваасХаХа савсаХХввв
ЕасХсХвавХ
540 есаХХвсаХХ
ХвавсавссХ
ЕВсХХХасХе сссХавссса
ХссаХсХавХ сХЕ8сХ8£ав
600 всассасаса
ХЕВавХаХХХ
ВХаХХевасХ сХвссввХХс ХХХвсаасаХ
ВВУвассХав
660 акХасавеса аХессассвХ
ХХссХссаХа авсссавсаХ ХваааасаХв сассасХХХа
720 аХвссвХвса ХавасХавва авсХХХввХс аасаввасХХ вавХЕВЕВВ!
ЕасассассХ
780 еХсаХссаХХ всасХсХеав
ХаХвХсХаса саваХаессХ аХХХХасаХв £аХса1ааа1
840 савссааааа всХасХ1£аХ
ХХсХаХвааа
ЕХвХаввесс асХваасХвХ ваааХаваХв
900 ссХаХвв^ва сХХХсХвсав
ВсасХвввас сХввавсаас ХвсававХас ассаавааса
960
- 127 013224
сс!сасасе! саСТааавав ваа!сасас1 ΙβΐΐΒ8308ΐ ваевсавааа а!а!1:ссасс 1020
!сс!саав8В аасасссСТв аа!в!1б!!8 !сс!1аа!аа с!ссавв!!! !а!саеа!1;8 1080
ваасаасвва 8вав!а1;с!8 с1аса!1!са с1!ссаа1вв !!св!1асав ВсавадСТве 1140
8с!!8саа!с са!авс!!!с βεΐβΐοϋΐο сааа!в!дсс !8аавас1сс са^вавааас 1200
0θΐ£ΐβ!θ3ΐ !сасаеса!с с!ваа!!сав ва1;вс1в1;8! 88сссс!ввс Иса8гвг!а£ 1260
аа!а!!ссав а!1ав8асс! 8ав8!8!сса !с!свваааа с18са!!а!с авсввНСТв 1320
!са!аваааа 3βοΐ8ΐΐοΐ8 ссссса^е!! с!1!св1Е18 οΐοίΐΐββΒΐ 8!в8ава1аа 1380
а£§васас1Х аваа!а!!са βοΐθίΒΕΐβ! «ввса^вва авасаасИв ааваасавТв 1440
СТаааассаГ аГсаваГага аава1всТ1с 88ΐΐΟίΐΪΒ8 ΗβΐοΐΕΐΐΐο с!васНв!! 1500
!ава!а!118 ваасс!!ааа 8с!а18еаав аас!а1!!!с авваа8!аав асвса£с!8а 1560
ессС^евас ГвсГсвааЪ! ΐΐοοοΐΕΐοΙ ΕΐΐοΙίοΐοί вав!8ав1:св Е^всавса! 1620
ссс!!в88а! в!!ааа!всс аИсвааасс аИсвсса!! савсСТвакс аас!!саавс 1680
ЪвСТВГсса! ссав8аза!в с!1с!с!вса аава!в!а88 аваса!вс1:! ΒΟΐΐ3Οβ88Β 1740
авсаас!с1! 1с!авааа!с авИсааава ваааасав!с 18а!!с88ав ааа!с!!ааа 1800
!асаа!ееа! ИЛВсСТвеа аасавваИв сааа!всавв са!а!!с!а! ава!с!с1вв 1860
ΒΐΐοΐΐοΐΐΙ с!1!с!сссс ΐοΐοΐούΐΐΐ сс!!1ссс1! гва-Ьв^ааГе асааавв^аа 1920
ааабзвссас !!с18а!88а аааааааааа аааааааааа ааааа 1965
<210> 52 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК
- 128 013224 <400> 52 ссс!!ва8йа ВВ^ВВШ 27 <210> 53 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 53 сас1ва®сса евевссасас аеса!сс 27 <210> 54 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 54 ссссТсасвс а!вааесс18 еав 23 <210> 55 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 55 !8ссасс81! !сс!сса!аа йссса^с 27 <210> 56 <2П> 28 <212> днк
- 129 013224 <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 56 а18вс1саа8 сЬсссвсбаа {Евсеева 28 <210> 57 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 57
1саагс£111 86611881 сс 1са18ав 27 <210> 58 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 58
1сс8888а18 8С8а8а1888 саавс 25 <210> 59 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 59 снеасакее с1с1вв8с1с саав 24
- 130 013224 <2102 60 <211> 25 <2122 ДНК <2132 Искусственная последовательность <2202 <2232 Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <4002 60 ссас41са8£ οββίοββΐδβ ΐβΐΐΐ 25 <2102 61 <211> 24 <2122 ДНК <2132 Искусственная последовательность <2202 <2232 Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <4002 61 свсЪсасссв сс£8ае8С8а са18 24 <2102 62 <2112 32 <2122 ДНК <2132 Искусственная последовательность <2202 <2232 Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <4002 62
88са88£8с£ 8ίοββΐ8388 1сасса1а81 ес 32 <2102 63 <2112 24 <2122 ДНК <2132 Искусственная последовательность
- 131 013224 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 63
ВВ8йсса!ЕС 0338830181 в!св 24 <210> 64 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 64 а181егс183 1к11асаааа ίΒθΐβ 25 <210> 65 <211> 1504 <2Ь2> ДНК <213> СгЬсе1и1из вНзеиз <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(1119) <400> 65 а!е вс! сас £С1 ссс 8°1 а8с 1ес осе аве 1сс аев аас ΐοΐ 888 вас48
Ме! А1а НЬз А1а Рго А1а Зег Суз Рго Зег Зег Агв Азп Зег СЬуАзр
1015
88с ва! аав ВВС аав ссс авв аав 81В 8С8 с!с а!с асв ввс а!с асс96
СЬу Азр Ьуз С1у Ьуз Рго Агв Ьуз УаЬ АЬа Ьеи 11е ТЬг СЬу ИеТЬг
2530
ВВС сав ва! вес 1са 1ас Не вся ваз 11с с!в с!в бав ааа вва 1асЬ44
С1у СЬп Азр СЬу Зег Туг Ьеи АЬа СЬи РЬе Ьеи Ьеи СЬи Ьуз СЬуТуг
4045 вае 811 са! вва 311 в!а све сва 1сс ав! 1са 111 аа! аса ββί с§а192
СЬи УаЬ НЬз СЬу 1Ье УаЬ Агв Агв Зег Зег Зег РЬе Азп ТЬг СЬу Агв
- 132 013224
50 55 60
ЭХХ Ваа саг гга гаг аав ааг сса сав вс г саг агг ваа ЕЕа аас агя 240
Не (Ии Шз Беи Туг Буз Азп Рго СЬп АЬа НЬз ЬЬе СЬи 61у Азп Мег
65 70 75 80
аае ххв сас гаг ввг Вас сгс асе вас авс асе гве сХа яга ааа аХс 288
Буз Беи ΗΪ3 Туг СЬу Азр Беи ТЬг Азр бег ТЬг Суз Ьеи УаЬ Буз Не
85 90 95 100
аХс аах ваа вхс ааа ссг аса ЕаЕ аге гас ааг егг ввг Ясс сав авс 336
Не Азп (Ли УаЬ Буз Рго ТЬг СЬи ЬЬе Туг Азп Беи СЬу АЬа СЬп 8ег
105 110 115
саХ §гс аав ахх гсс ххх Вас гга Еса 838 гас асг Еса яаг вгг ЯаХ 384
НЬз УаЬ Буз Пе 5ег РЬе Азр Беи АЬа (Ии Туг ТЬг АЬа Азр УаЬ Азр
120 125 130
Εΐΐ ВЕС асе ггв сев ехг с1в ваг Вса агг аав асг гяг Еве сХХ 432
СЬу УаЬ СЬу ТЬг Беи Агв Беи Беи Азр АЬа 11е Буз ТЬг Суз СЬу Беи
135 140 145
аХа ааг ХсХ вгв аав ггс гас сав Вес гса асг авг ваа сГя гаг ЕЕа 480
ЬЬе Азп 8ег УаЬ Буз РЬе Туг СЬп АЬа 8ег ТЬг 8ег СЬи Беи Туг СЬу
150 155 160
ааа вгв саа ваа ага ссс сав ааа вав асе асе ссг ггс Хаг сса аВЕ 528
Буз УаЬ СЬп (Ии Не Рго СЬп Буз С1и ТЬг ТЬг Рго РЬе Туг Рго Аге
165 170 175 180
1С8 ссс гаг Ева вса Есс ааа егг гаг все 1аг гве агг яга ягв аас 576
5ег Рго Туг СЬу АЬа АЬа Буз Беи Туг АЬа Туг Тгр Не УаЬ УаЬ Азп
185 190 195
XXX сеа гав вег гаг ааг сгс ггг Все 8Ϊ8 аас 88е агг сХс ггс ааХ 624
РЬе Агв СЬи А1а Туг Азп Беи РЬе АЬа Уа1 Азп С1у Не Ьеи РЬе Азп
200 205 210
саг £ав а®Х ссг ава ава В£а вег ааг ггг вгг асг сва ааа агг авс 672
НЬз СЬи 8ег Рго Аге Аге СЬу АЬа Азп РЬе УаЬ ТЬг Агв Ьуз Не 8ег
215 220 225
сее гса вха вег аая агг гас егг ЕЕа саа сХя ваа г^г ггс авг ххв 720
- 133
Аге Зег УаЬ АЬа Ьуз Не Туг Ьеи СЬу СЬп Ьеи СЬи Суз РЬе Зег Ьеи
230 235 240
кеа ааф сФв вас £сс ааа сеа 8ас *88 88С саФ есс аав вас ФаФ ВФс 768
СЬу Азп Ьеи Азр АЬа Ьуз Агв Азр Тгр СЬу НЬз АЬа Ьуз Азр Туг УаЬ
245 250 255 260
ёае есФ аФв *88 сФв аФ£ ФФа саа ааФ еаФ Еаа сса 838 вас ФФФ е*с 816
С1и А1а МеФ Тгр Ьеи МеФ Ьеи С1п Азп Азр СЬи Рго СЬи Азр РЬе УаЬ
265 270 275
афа £Сф асФ 888 ваа ВФФ саФ авФ £ФС С£Ф 8аа ФФФ ефф вав ааа Феа 864
Не А1а ТЬг СЬу СЬи УаЬ НЬз Зег УаЬ Аге СЬи РЬе УаЬ СЬи Ьуз 8ег
280 285 290
ФФС аФв сас аФФ 8£а аав асе аФФ 8*8 Фее ваа ееа аав ааФ ваа ааФ 912
РЬе Меф НЬз Не СЬу Ьуз ТЬг Ие УаЬ Тгр СЬи СЬу Ьуз Азп СЬи Азп
295 300 305
йаа вФе вес ава *8* ааа 838 асе вес ааа аФФ саФ 8*8 асФ 8*8 ваФ 960
С1и УаЬ СЬу Агв Суз Ьуз СЬи ТЬг С1у Ьуз Не НЬз УаЬ ТЬг УаЬ Азр
310 315 320
сФв ааа Фас Фас сва сса асФ ваа 8Ϊ8 вас ФФс сФв сае ееа Вас ф£С 1008
Ьеи Ьуз Туг Туг Агв Рго ТЬг СЬи УаЬ Азр РЬе Ьеи СЬп СЬу Азр Суз
325 330 335 340
Фсс аав ВСЕ сав сае ааа СФ8 аас *88 аав ссс сес еФФ 8сс ФФФ Еас 1056
Зег Ьуз АЬа СЬп СЬп Ьуз Ьеи Азп Тгр Ьуз Рго Аге УаЬ АЬа РЬе Азр
345 350 355
еак сФв 8*8 авв вав аФв 8*8 саа вес еаФ 6*8 8ав сфе аФв ава асе 1104
СЬи Ьеи УаЬ Аге СЬи Меф УаЬ С1п АЬа Азр УаЬ СЬи Ьеи МеФ Аге ТЬг
360 365 370 аас ссс аас есс Феа есассФсФас ааааааафФс всваеасаФв еасФаФвеФе 1159 Аап Рго Азп А1а
375 саеавссаес саассавав* ссавссасФс сФвавассаФ свассаФааа сссФсвасФе 1219 ссФвФеФсвФ ссссасавсФ ааваесФеве ссасаве*** в*еввсасса веасвевеас 1279 асФссаеавс ФаавессасФ ФсесФФФФв* саааввсФсс ФсФсааФваФ ФФФевваааФ 1339 сааеааеФФФ ааааФсасаФ асФсаФФФФа сФФеаааФФа ФеФсасФава саасФФаааФ 1399
- 134 013224
ББББвавБсЕ ЕваваЕЕвЕЕ ЕЕЕсЕсЕЕЕЕ сЕЕаЕЕаааЕ ваЕсЕБЕсЕа Бвасссавса 1459 аааааааааа ааааааввка ЕаЕааааааа аааааааааа ааааа 1504 <210> 66 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 66 аЕваавЕЕвс асЕаЕвб^ва ссЕса 25 <210> 67 <211> 59 <212> ДНК <213> Сг1сеБи1иа втЯзеиз ссвасавсас сЕессЕавйа ааааЕсаЕса аЕваавЕсаа ассЕасавае аЕсЕасааЕ 59 <210> 68 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 68 васЕЕавсав авЕасасЕвс а§аЕв 25 <210> 69 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 135 013224 <223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 69 ассккввака еааавввв^в βΐοΐο 25 <210> 70 <211> 125 <212> ДНК <213> Сг1секи1из вггзеиз <400> 70
Тквакввавк Тввсассккв сдвскксквв аквсааккаа васкквкввс сккакааакк 60 сквкваавкк скассаввсс ксааскавкв аасквкаквв аааа§квсаа вааакасссс 120 авааа 125 <210> 71 <211> 376 <212> РКТ <213> Сг1секи1из вгхзеиз <400> 71
Мек А1а ΗΪ3 А1а Рго А1а Зег Суз Рго Зег Зег Агв Азп Зег 61 у Азр
1 5 10 15
С1у Азр Ьуз С1у Ьуз Рго Агв Ьуз Уа1 А1а Ьеи Пе ТЬг С1у Пе ТЬг
20 25 30
61у С1п Азр 61у Зег Туг Ьеи А1а С1и РЬе Ьеи Ьеи С1и Ьуз 61у Туг
35 40 45
С1и Уа1 НЬз 61у Пе Уа1 Агв Агв Зег Зег Зег РЬе Азп ТЬг С1у Агв
50 55 60
Не 61и Ηίβ Ьеи Туг Ьуз Азп Рго 61п А1а ΗΪ3 Пе (Ни С1у Азп Мек
65 70 75 80
Ьуз Ьеи НЬз Туг 61у Азр Ьеи ТЬг Азр Зег ТЬг Суз Ьеи ¥а1 Ьуз Пе
85 90 95 100
Пе Азп С1и Уа1 Ьуз Рго ТЬг С1и Пе Туг Азп Ьеи С1у А1а С1п Зег
105 110 115
- 136 013224
Н1з Уа1 Ьуз Не Зег РЬе Азр Ьеи А1а С1и Туг ТЬг А1а Азр Уа1 Азр
120 125 130
С1у Уа1 (Иу ТЬг Ьеи Аге Ьеи Ьеи Азр А1а Пе Ьуз ТЬг Суз С1у Ьеи
135 140 145
11е Азп Зег Уа1 Ьуз РЬе Туг (Ип А1а Зег ТЬг Зег (Ии Ьеи Туг (Иу
150 155 160
Ьуз Уа1 (Ип (Ии 11е Рго (Ип Ьуз С1и ТЬг ТЬг Рго РЬе Туг Рго Аге
165 170 175 180
Зег Рго Туг С1у А1а А1а Ьуз Ьеи Туг А1а Туг Тгр Пе Уа1 Уа1 Азп
185 190 195
РЬе Аге (Ии А1а Туг Азп Ьеи РЬе А1а Уа1 Азп С1у Пе Ьеи РЬе Азп
200 205 210
Н1з С1и Зег Рго Аге Аге (Иу А1а Азп РЬе Уа1 ТЬг Аге Ьуз Пе Зег
215 220 225
Аге Зег Уа1 А1а Ьуз Пе Туг Ьеи (Иу (Ип Ьеи (Ли Суз РЬе Зег Ьеи
230 235 240
С1у Азп Ьеи Азр А1а Ьуз Аге Азр Тгр С1у Η13 А1а Ьуз Азр Туг Уа1
245 250 255 260
С1и А1а Ме! Тгр Ьеи Ме! Ьеи (Ип Азп Азр (Ии Рго С1и Азр РЬе Уа1
265 270 275
Пе А1а ТЬг (Иу (Ии Уа1 Н15 Зег Уа1 Аге (Ии РЬе Уа1 (Ии Ьуз Зег
280 285 290
РЬе Ме! (Из Пе 61у Ьуз ТЬг Пе Уа1 Тгр (Ии (Иу Ьуз Азп (Ли Азп
295 300 305
С1и Уа1 (Иу Аге Суз Ьуз (Ли ТЬг С1у Ьуз Пе ΗΪ3 Уа1 ТЬг Уа1 Азр
310 315 320
Ьеи Ьуз Туг Туг Аге Рго ТЬг (Ии Уа1 Азр РЬе Ьеи (Ип С1у Азр Суз
325 330 335 340
- 137 013224
Зег Ьуз А1а (Ип С1п Ьуз Ьеи Азп Тгр Ьуз Рго Агв Уа1 А1а РЬе Азр
345 350 355
(Ии Ьеи Уа1 Аге (Ии Ме! Уа1 (Ип А1а Азр Уа1 С1и Ьеи Ме! Агв ТЬг
360 365 370
Азп Рго Азп А1а
375 <210> 72 <211> 321 <212> РКТ <213> Сг1се!и1из вНзеиз <400> 72
Ме! 61у (Ли Рго (Ип (Иу Зег Аге Агв 11е Ьеи Уа1 ТЬг (Иу 61у Зег
1 5 10 15
(Иу Ьеи Уа1 С1у Агв А1а Не 61п Ьуз Уа1 Уа1 А1а Азр 61у А1а (Иу
20 25 30
Ьеи Рго С1у 01и (Ии Тгр Уа1 РЬе Уа1 5ег Бег Ьуз Азр А1а Азр Ьеи
35 40 45
ТЬг Азр А1а А1а (Ип ТЬг (Ип А1а Ьеи РЬе 61п Ьуз ¥а1 (Ип Рго ТЬг
50 55 60
Н1з Уа1 Не Н15 Ьеи А1а А1а Ме! Уа1 (Иу С1у Ьеи РЬе Агв Азп Не
65 70 75 80
Ьуз Туг Азп Ьеи Азр РЬе Тгр Агв Ьуз Азп Уа1 Н18 Не Азп Азр Азп
85 90 95
Уа1 Ьеи ΗΪ5 Зег А1а РЬе (Ии Уа1 (Иу ТЬг Агв Ьуз Уа1 Уа1 Зег Суз
100 105 НО
Ьеи Зег ТЬг Суз Не РЬе Рго Азр Ьуз ТЬг ТЬг Туг Рго Не Азр (Ии
115 120 125
ТЬг Ме! Не ΗΪ8 Азп С1у Рго Рго Н18 Зег Зег Азп РЬе С1у Туг Зег
130 135 140
- 138 013224
Туг А1а Ьуз Аге Ме! Пе Азр Уа1 61п Азп Аге А1а Туг РЬе 61п 01п
145 150 155 160
Н1з С1у Суз ТЬг РЬе ТЬг А1а Уа1 Пе Рго ТЬг Азп Уа1 РЬе С1у Рго
165 170 175
Н15 Азр Азп РЬе Азп Пе С1и Азр б1у Н1з Уа1 Ьеи Рго С1у Ьеи Пе
180 185 190
ΗΪ3 Ьуз Уа1 ΗΪ3 Ьеи А1а Ьуз 5ег Азп С1у Зег А1а Ьеи ТЬг Уа1 Тгр
195 200 205
61у ТЬг С1у Ьуз Рго Аге Аге 61п РЬе Пе Туг Зег Ьеи Азр Ьеи А1а
210 215 220
Аге Ьеи РЬе 11е Тгр Уа1 Ьеи Аге 61и Туг Азп С1и Уа1 С1и Рго Пе
225 230 235 240
Не Ьеи 5ег ¥а1 С1у 61и С1и Авр С1и Уа1 Зег Пе Ьуз О1и А1а А1а
245 250 255
С1и А1а Уа1 Уа1 61и А1а Ме! Азр РЬе Суз С1у (Ни УаЬ ТЬг РЬе Азр
260 265 270
Зег ТЬг Ьуз 5ег Азр С1у С1п Туг Ьуз Ьуз ТЬг А1а Зег Азп С1у Ьуз
275 280 285
Ьеи Аге А1а Туг Ьеи Рго Азр РЬе Аге РЬе ТЬг Рго РЬе Ьуз С1п А1а
290 295 300
Уа1 Ьуз С1и ТЬг Суз А1а Тгр РЬе ТЬг Азр Авп Туг С1и С1п А1а Аге
305 310 315 320
Ьуз <210> 73 <211> 590 <212> РКТ <213> Сг1сеЬи1из ег1зекз <400> 73
Ме! А1а Зег Ьеи Аге 61и А1а Зег Ьеи Аге Ьуз Ьеи Аге Аге РЬе Зег
- 139 013224
1 5 10 15
С1и Μβΐ Аге 61у Ьув Рго Уа1 А1а ТЬг 61у Ьуа РЬе Тгр Азр Уа1 Уа1
20 25 30
Уа1 11е ТЬг А1а А1а Азр 61 и Ьуз 61п 61и Ьеи А1а Туг Ьуз 61п 61п
35 40 45
Ьеи Зег 61и Ьуз Ьеи Ьуз Аге Ьуз 61и Ьеи Рго Ьеи 61у Уа1 Азп Туг
50 55 60
Н1з Уа1 РЬе ТЬг Азр Рго Рго 61у ТЬг Ьуз Пе 61у Аал 61у 61у Зег
65 70 75 80
ТЬг Ьеи Суз Зег Ьеи 61п Суз Ьеи 61и Зег Ьеи Тут 61у Азр Ьув Тгр
85 90 95
Азп Зег РЬе ТЬг Уа1 Ьеи Ьеи Не ΗΪ3 Зег 61у 61у Туг Зег 61п Аге
100 105 110
Ьеи Рго Авп А1а Зег А1а Ьеи 61у Ьув Пе РЬе ТЬг А1а Ьеи Рго Ьеи
11 С ЮЛ 1 ОЕ
лжи Ιύιχΐ
С1у 61и Рго Пе Туг 61п Μβΐ Ьеи Авр Ьеи Ьуа Ьеи А1а Μβΐ Туг Μβΐ
130 135 140
Азр РЬе Рго Зег Аге Μβΐ Ьуз Рго 61у Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг Суз А1а Аар
145 150 155 160
Азр Пе 61и Ьеи Туг Зег Не 61у Аар Зег С1и Зег Пе А1а Рке 61и
165 170 175
61п Рго С1у РЬе ТЬг А1а Ьеи А1а Ηίβ Рго Зег Зег Ьеи А1а Уа1 61у
180 185190
ТЬг ТЬг ΗΪ3 С1у Уа1 РЬе Уа1 Ьеи Аар 5ег А1а 61у Зег Ьеи 61п Н1в 195 200205
61у Аар Ьеи 61и Туг Аге 61п Суа ΗΪ8 Аге РЬе Ьеи Ηϊβ Ьуа Рго Зег 210 215220
Не 61и Авп Ме! Н1з ΗΪ3 РЬе Азп А1а Уа1 Н1з Аге Ьеи 61у Зег РЬе
225 230 235240
- 140 013224
С1у С1п С1п Азр Ьеи Зег 61у (Лу Азр ТЬг ТЬг Суз ΗΪ3 Рго Ьеи Ηίβ
245 250 255
Зег (Ли Туг Уа1 Т/г ТЬг Азр Зег Ьеи РЬе Туг Не! Азр Н18 Ьуз Зег
260 265 270
А1а Ьуз Ьуз Ьеи Ьеи Азр РЬе Туг С1и Зег Уа1 С1у Рго Ьеи Азп Суз
275 280 285
(Ли Пе Азр А1а Туг С1у Азр РЬе Ьеи С1п А1а Ьеи (Ну Рго С1у А1а
290 295 300
ТЬг А1а С1и Туг ТЬг Ьуз Азп ТЬг Зег ΗΪ3 Уа1 ТЬг Ьуз (Ли (Ли Зег
305 310 315 320
ΗΪ5 Ьеи Ьеи Азр Ме! Аге С1п Ьуз Не РЬе Н18 Ьеи Ьеи Ьуз С1у ТЬг
325 330 335
Рго Ьеи Азп Уа1 Уа1 Уа1 Ьеи Азп Азп Зег АГВ РЬе Туг Н1з Пе С1у
340 345 350
ТЬг ТЬг 61и С1и Туг Ьеи Ьеи Ηΐδ РЬе ТЬг Зег Азп (Лу Зег Ьеи С1п
355 360 365
А1а С1и Ьеи С1у Ьеи С1п Зег Пе А1а РЬе Зег Уа1 РЬе Рго Азп Уа1
370 375 380
Рго С1и Азр Зег ΗΪ3 (Ли Ьуз Рго Суз Уа1 Пе Η18 Зег Пе Ьеи Азп
385 390 395 400
Зег 61у Суз Суз Уа1 А1а Рго (Лу Зег Уа1 Уа1 С1и Туг Зег Аге Ьеи
405 410 415
61у Рго С1и Уа1 Зег Не Зег (Ли Азп Суз Пе 11е Зег (Лу Зег Уа1
420 425 430
Пе С1и Ьуз А1а Уа1 Ьеи Рго Рго Суз Зег РЬе Уа1 Суз Зег Ьеи Зег
435 440 445
Уа1 01и Пе Азп С1у ΗΪ3 Ьеи (Ли Туг Зет ТЬг Ме! Уа1 РЬе (Лу Ме!
450 455 460
- 141 013224
61и Азр Азп Ьеи Ьуз Азп Зег Уа1 Ьуз ТЬг Не 5ег Азр Пе Ьуз Мег
465 470 475 480
Беи 61п РЬе РЬе 61у Уа1 Суз РЬе Ьеи ТЬг Суз Ьеи Азр Пе Тгр Азп
485 490 495
Беи Буз А1а Ме! С1и С1и Ьеи РЬе Зег С1у Зег Ьуз ТЬг 61п Ьеи Зег
500 505 510
Беи Тгр ТЬг А1а Агв Не РЬе Рго Уа1 Суз Зег Зег Ьеи Зег 61и Зег
515 520 525
Уа1 А1а А1а Зег Ьеи 61у Мег Ьеи Азп А1а 11е Агв Азп ΗΪ3 Зег Рго
530 535 540
РЬе Зег Ьеи Зег Азп РЬе Ьуз Ьеи Ьеи Зег Пе С1п 61и Мег Ьеи Ьеи
545 550 555 560
Суа Ьуз Азр Уа1 61у Азр Мег Ьеи А1а Туг Агв С1и 61п Ьеи РЬе Ьеи
565 570 575
61и 11е. Зег Зег Ьуз Агв Ьуз 61п Зег Азр Зег 61 и Ьуз Зег
580 585 590
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (40)

1. Клетка, полученная из ткани яичника китайского хомячка (СНО), в которую введен ген, кодирующий молекулу антитела, содержащего сложные углеводные цепи, присоединенные к Ес-области посредством N-гликозидных связей, где доля углеводных цепей, в которых фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на восстанавливающем конце углеводной цепи, относительно всего количества сложных углеводных цепей, присоединенных к Ес-области посредством N-гликозидных связей, в антителах составляет 20% или более, благодаря уменьшению или устранению активности фермента, ответственного за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида С^Ρ-фукозы, и/или активности фермента, ответственного за модификацию углеводной цепи, в которой фукоза по первому положению соединена посредством α-связи с N-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь к Ес-области антитела, причем клетка продуцирует композицию антител с более высокой антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью по сравнению с композицией антител, продуцируемой родительской линией.
2. Клетка СНО по п.1, где сложные углеводные цепи, присоединенные к Ес-области посредством ^гликозидной связи, в которых фукоза не связана с N-ацилглюкозамином, представляют собой сложные углеводные цепи, в которых фукоза по первому положению не соединена посредством α-связи с N-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце.
3. Клетка СНО по любому из пп.1 или 2, где молекула антитела принадлежит классу ЦС.
4. Клетка СНО по любому из пп.1-3, где фермент, ответственный за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида С^Ρ-фукозы, представляет собой фермент, выбранный из группы, состоящей из:
(a) СМЭ (С^Ρ-маннозо-4,6-дегидратаза);
(b) Ех (С^Ρ-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимераза,4-редуктаза);
(c) СЕΡΡ (С^Ρ-бета-^-фукозопирофосфорилаза).
5. Клетка СНО по п.4, где СМЭ представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, состоящей из:
(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность ЗЕЦ ΙΌ N0:65;
(b) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность ЗЕЦ ΙΌ N0:65, и кодирующей белок, обладающий СМЭ-активностью.
6. Клетка СНО по п.4, где СМЭ представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из:
(a) белка, содержащего аминокислотную последовательность ЗЕЦ ΙΌ N0:71;
(b) белка, содержащего аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность ЗЕЦ ΙΌ N0:71, и обладающего СМО-активностью;
(c) белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0:71 по меньшей мере на 80%, и обладающего СМЭ-активностью.
- 142 013224
7. Клетка СНО по п.4, где Рх представляет собой белок, кодированный ДНК, выбранной из группы, состоящей из:
(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО NО:48;
(b) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО NО:48, и кодирующей белок, обладающий Рх-активностью.
8. Клетка СНО по п.4, где Рх представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из:
(a) белка, содержащего аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:72;
(b) белка, содержащего аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:72, и обладающего Рх-активностью;
(c) белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NО:72 по меньшей мере на 80%, и обладающего Рх-активностью.
9. Клетка СНО по п.4, где СРРР представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, состоящей из:
(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО NО:51;
(b) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО NО:51, и кодирующей белок, обладающей СРРР-активностью.
10. Клетка СНО по п.4, где СРРР представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из:
(a) белка, содержащего аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:73;
(b) белка, содержащего аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:73, и обладающего 6РРР-активностью;
(c) белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NО:73 по меньшей мере на 80%, и обладающего СРРР-активностью.
11. Клетка СНО по любому из пп.1-3, где фермент, ответственный за модификацию углеводной цепи, в которой фукоза по первому положению соединена посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь к Рс-области антитела, представляет собой α-1,6-фукозилтрансферазу.
12. Клетка СНО по п.11, где α-1,6-фукозилтрансфераза представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, состоящей из:
(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО NО:1;
(b) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО NО:1, и кодирующей белок, обладающий α-1,6-фукозилтрансферазной активностью.
13. Клетка СНО по п.11, где α-1,6-фукозилтрансфераза представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из:
(a) белка, содержащего аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:23;
(b) белка, содержащего аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:23, и обладающего α-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NО:23 по меньшей мере на 80%, и обладающий α-1,6фукозилтрансферазной активностью.
14. Клетка СНО по любому из пп.1-13, где ферментативная активность уменьшена или устранена методом, выбранным из группы, состоящей из:
(a) метода направленного разрушения гена, кодирующего фермент;
(b) метода введения доминантно-отрицательного мутантного гена, кодирующего фермент;
(c) метода введения мутации в фермент;
(б) метода ингибирования транскрипции и/или трансляции гена, кодирующего фермент;
(е) метод отбора клеточной линии, резистентной к лектину, распознающему углеводную цепь, в которой фукоза по первому положению соединена посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь к Рс-области антитела.
15. Клетка СНО по п.14, резистентная к лектину, распознающему углеводную цепь, в которой фукоза по первому положению соединена посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь к Рс-области антитела.
16. Клетка СНО по п.15, продуцирующая композицию антител с более высокой антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью, чем композиция антител, продуцируемая соответствующей родительской клеткой СНО, в которую встроен ген, кодирующий молекулу антитела и которая не обладает устойчивостью к лектину.
17. Клетка СНО по любому из пп.1-16, где композиция антител, продуцируемая клетками СНО, об
- 143 013224 ладает более высокой антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью, чем другие композиции антител, в которых среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных посредством ^гликозидной связи к Ес-области, доля углеводных цепей, в которых фукоза не связана с №ацетилглюкозамином на восстанавливающем конце углеводной цепи, составляет менее 20%.
18. Клетка СНО по п.17, где сложные углеводные цепи, присоединенные к Ес-области посредством ^гликозидной связи, в которых фукоза не связана с №ацилглюкозамином, представляют собой сложные углеводные цепи, в которых фукоза по первому положению не соединена посредством α-связи с №ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце.
19. Способ получения композиции антител, предусматривающий культивирование клетки СНО по любому из пп.1-18 в подходящей среде и выделение накапливающейся композиции антител из культуральной среды.
20. Композиция антител, которая получена с использованием способа по п.19.
21. Композиция антител по п.20, которая обладает более высокой антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью по сравнению с композицией антител, продуцируемой родительской линией.
22. Лекарственное средство, содержащее в качестве активного ингредиента композицию антител по любому из пп.20 или 21.
23. Лекарственное средство по п.22, где лекарственное средство является диагностическим лекарственным средством, профилактическим лекарственным средством или лечебным лекарственным средством против болезней, связанных с опухолями, болезней, связанных с аллергией, болезней, связанных с воспалением, аутоиммунных заболеваний, болезней органов кровообращения, болезней, связанных с вирусными инфекциями, или болезней, связанных с бактериальными инфекциями.
24. Клетка, в которую введен ген, кодирующий молекулу антитела, содержащего сложные углеводные цепи, присоединенные к Ес-области посредством ^гликозидных связей, где доля углеводных цепей, в которых фукоза не связана с №ацетилглюкозамином на восстанавливающем конце углеводной цепи, относительно всего количества сложных углеводных цепей, присоединенных к Ес-области посредством ^гликозидных связей, в антителах составляет 20% или более, благодаря уменьшению или устранению активности фермента, ответственного за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, и/или активности фермента, ответственного за модификацию углеводной цепи, в которой фукоза по первому положению соединена посредством α-связи с №ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, присоединенной через ^гликозидную связь к Ес-области антитела, причем клетка продуцирует композицию антител с более высокой антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью по сравнению с композицией антител, продуцируемой родительской линией.
25. Клетка по п.24, где фермент, ответственный за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, представляет собой фермент, выбранный из группы, состоящей из:
(a) СМО (СПР-маннозо-4,6-дегидратаза);
(b) Ех (СПР-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимераза,4-редуктаза);
(c) СЕРР (СОР-бета-Ь-фукозопирофосфорилаза).
26. Клетка СНО по п.25, где СМЭ представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, состоящей из:
(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 5>ЕЦ ГО N0:65;
(b) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 5>ЕЦ ГО N0:65, и кодирующей белок, обладающий СМЭ-активностью.
27. Клетка по п.25, где СМЭ представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из:
(a) белка, содержащего аминокислотную последовательность 5>ЕЦ ГО N0:71;
(b) белка, содержащего аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность 5>ЕЦ ГО N0:71, и обладающего СМО-активностью;
(c) белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности 5>ЕЦ ГО N0:71, и обладающего СМЭ-активностью.
28. Клетка по п.25, где Ех представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, состоящей из:
(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 5>ЕЦ ГО N0:48;
(b) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 5>ЕЦ ГО N0:48, и кодирующей белок, обладающий Ех-активностью.
29. Клетка по п.25, где Ех представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из:
(a) белка, содержащего аминокислотную последовательность 5>ЕЦ ГО N0:72;
(b) белка, содержащего аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность 5>ЕЦ ГО N0:72, и обладающего Ех-активностью;
- 144 013224 (с) белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична с аминокислотной последовательности 8ЕД ГО ΝΌ:72, и обладающего Ех-активностью.
30. Клетка по п.25, где СЕРР представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, состоящей из:
(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕД ГО ΝΌ:51;
(b) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕД ГО ΝΌ:51, и кодирующей белок, обладающий СЕРР-активностью.
31. Клетка по п.25, где СЕРР представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из:
(a) белка, содержащего аминокислотную последовательность 8ЕД ГО ΝΌ:73;
(b) белка, содержащего аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность 8ЕД ГО ΝΌ:73, и обладающего СЕРР-активностью;
(c) белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности 8ЕД ГО ΝΌ:73, и обладающего СЕРР-активностью.
32. Клетка СНО по п.24, где фермент, ответственный за модификацию углеводной цепи, в которой фукоза по первому положению соединена посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь к Ес-области антитела, представляет собой а-1,6-фукозилтрансферазу.
33. Клетка по п.32, где а-1,6-фукозилтрансфераза представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, состоящей из:
(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕД ГО ΝΌ:1;
(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕД ГО ΝΌ:2;
(c) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕД ГО ΝΌ:1, и кодирующей белок, обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(б) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕД ГО ΝΌ:2, и кодирующей белок, обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью.
34. Клетка по п.32, где а-1,6-фукозилтрансфераза представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из:
(a) белка, содержащего аминокислотную последовательность 8ЕД ГО ΝΌ:23;
(b) белка, содержащего аминокислотную последовательность, 8ЕД ГО ΝΌ:24;
(c) белка, содержащего аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность 8ЕД ГО ΝΌ:23, и обладающего а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(б) белка, содержащего аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность 8ЕД ГО ΝΌ:24, и обладающего а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(е) белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности 8 ЕД ГО ΝΌ:23, и обладающего α-1,6фукозилтрансферазной активностью;
(Г) белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности 8 ЕД ГО ΝΌ:24, и обладающего α-1,6фукозилтрансферазной активностью.
35. Клетка по любому из пп.24-34, в котором уменьшение или устранение активности фермента достигается методом, выбранным из группы, состоящей из:
(a) метода прерывания гена, имеющего целью ген, кодирующий фермент;
(b) метода введения доминант-отрицательного мутанта гена, кодирующего фермент;
(c) метода введения мутации в фермент;
(б) метода ингибирования транскрипции и/или трансляции гена, кодирующего фермент.
36. Клетка по любому из пп.24-35, невосприимчивая к лектину, распознающему углеводную цепь, в которой фукоза по первому положению соединена посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь к Ес-области антитела.
37. Клетка по любому из пп.24-36, представляющая собой клетку, выбранную из группы, состоящей из приведенных далее (а)-(1):
(a) клетка СНО, полученная из ткани яичника китайского хомячка;
(b) клетка клеточной линии миеломы крысы ΥВ2/3Н^.Р2.С11.16Лд.20;
(c) клетка клеточной линии миеломы мыши Ν8Ό;
(б) клетка клеточной линии миеломы мыши 8Р2/0-Ад14;
(е) клетка ВНК, полученная из ткани почек сирийского хомячка;
(Г) антителопродуцирующая гибридомная клетка;
(д) клетка клеточной линии лейкоза человека №ипа1\уа;
- 145 013224 (й) эмбриональная стволовая клетка;
(ΐ) оплодотворенная яйцеклетка.
38. Клетка по любому из пп.24-37, где молекула антитела принадлежит к классу ЕС.
39. Способ получения композиции антител, предусматривающий культивирование клеток по любому из пп.24-38 в подходящей среде и выделение полученной композиции антител из культуральной среды.
40. Композиция антител, полученная с использованием способа по п.39.
EA200300443A 2000-10-06 2001-10-05 Клетки, продуцирующие композиции антител EA013224B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000308526 2000-10-06
PCT/JP2001/008804 WO2002031140A1 (fr) 2000-10-06 2001-10-05 Cellules produisant des compositions d'anticorps

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200300443A1 EA200300443A1 (ru) 2003-10-30
EA013224B1 true EA013224B1 (ru) 2010-04-30

Family

ID=18788817

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300443A EA013224B1 (ru) 2000-10-06 2001-10-05 Клетки, продуцирующие композиции антител
EA200600469A EA013563B1 (ru) 2000-10-06 2001-10-05 Трансгенное животное, продуцирующее антитела с измененными углеводными цепями, способ получения антител и содержащее антитела лекарственное средство

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600469A EA013563B1 (ru) 2000-10-06 2001-10-05 Трансгенное животное, продуцирующее антитела с измененными углеводными цепями, способ получения антител и содержащее антитела лекарственное средство

Country Status (14)

Country Link
EP (5) EP2314686B2 (ru)
JP (12) JP4290423B2 (ru)
KR (1) KR100877676B1 (ru)
CN (3) CN102311986B (ru)
AU (2) AU9419801A (ru)
BR (1) BR0114475A (ru)
CA (3) CA2953239A1 (ru)
DK (1) DK2314686T4 (ru)
EA (2) EA013224B1 (ru)
ES (3) ES2620359T3 (ru)
HU (2) HU231090B1 (ru)
MX (1) MXPA03002974A (ru)
PL (1) PL218428B1 (ru)
WO (1) WO2002031140A1 (ru)

Families Citing this family (901)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US8093357B2 (en) 2002-03-01 2012-01-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
CN102911987B (zh) * 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
AU2003236020B2 (en) * 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
JPWO2003084569A1 (ja) * 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
US20050031613A1 (en) * 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
WO2003085118A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
WO2004022597A1 (ja) 2002-09-04 2004-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3の血中可溶化ｎ端ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞに対する抗体
DK2345671T3 (en) 2002-09-27 2016-02-15 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
CL2003002461A1 (es) * 2002-11-27 2005-01-07 Dow Chemical Company Agroscien Inmunoglobulina que comprende al menos un glicano afucosilado, composicion que la contiene, secuencia nucleotidica y vector que la comprende, procedimiento para producir dicha inmunoglobulina en plantas.
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
WO2004081048A1 (ja) 2003-03-13 2004-09-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 変異受容体に対するアゴニスト活性を有するリガンド
JP2004298180A (ja) * 2003-03-18 2004-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ゲノムが改変されたマウス
JP2010220615A (ja) * 2003-03-18 2010-10-07 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd ゲノムが改変されたマウス
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2005017155A1 (ja) 2003-06-18 2005-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha フコーストランスポーター
FR2858235B1 (fr) 2003-07-31 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation d'anticorps optimises en adcc pour traiter les patients faibles repondeurs
EP1652923B1 (en) 2003-08-08 2011-10-12 Perseus Proteomics Inc. Gene overexpressed in cancer
EP1666501A4 (en) * 2003-08-11 2008-12-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-HM1.24 ANTIBODIES WITH MODIFIED SUGAR CHAIN
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8883147B2 (en) 2004-10-21 2014-11-11 Xencor, Inc. Immunoglobulins insertions, deletions, and substitutions
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
WO2005035577A1 (ja) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ガングリオシドｇｄ３に特異的に結合する抗体組成物
WO2005035582A1 (ja) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Ｃｃｒ４に特異的に結合する抗体組成物
WO2005035583A1 (ja) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Ｉｌ－５受容体に特異的に結合する抗体組成物
AU2004279742A1 (en) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
CA2542125A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
KR101017336B1 (ko) * 2003-10-09 2011-02-28 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 안티트롬빈 ⅲ 조성물의 제조 방법
AU2004280064A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genomically modified cell neutralized to serum-free system
AU2004279736A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition specifically binding to ganglioside GM2
JPWO2005035741A1 (ja) * 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
WO2005035581A1 (ja) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ヒトVEGF受容体Flt-1に特異的に結合する抗体組成物
US7691810B2 (en) * 2003-10-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Method of producing recombinant antithrombin III composition
FR2861395B1 (fr) 2003-10-23 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Facteur viii viralement securise a faible teneur en multimeres superieurs
CA2548817A1 (en) 2003-12-04 2005-06-23 Xencor, Inc. Methods of generating variant proteins with increased host string content and compositions thereof
JPWO2005053742A1 (ja) * 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
US8491902B2 (en) 2003-12-04 2013-07-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Medicament comprising recombinant antibody against chemokine receptor CCR4
US7329353B2 (en) 2004-01-23 2008-02-12 Amgen Inc. LC/MS method of analyzing high molecular weight proteins
EP1737890A2 (en) 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
MY145073A (en) 2004-07-09 2011-12-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-glypican 3 antibody
EP1919950A1 (en) 2004-07-15 2008-05-14 Xencor, Inc. Optimized fc variants
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
US20060223147A1 (en) * 2004-08-05 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Process for producing glycoprotein composition
EP1800693B1 (en) 2004-08-24 2013-07-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Adjuvant therapy with the use of anti-glypican 3 antibody
WO2006046751A1 (ja) 2004-10-26 2006-05-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 糖鎖改変抗グリピカン３抗体
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
KR101027427B1 (ko) 2004-11-12 2011-04-11 젠코어 인코포레이티드 ＦcRn에 대하여 증가된 결합력을 갖는 Ｆc 변이체
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
CN105535967B (zh) 2005-02-15 2022-05-03 杜克大学 抗cd19抗体及其在肿瘤学中的应用
WO2006109696A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換え卵胞刺激ホルモン組成物
WO2006109695A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換えハプトグロビン組成物
WO2006109698A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換えエリスロポイエチン組成物
AU2006244445B2 (en) 2005-05-05 2013-04-18 Duke University Anti-CD19 antibody therapy for autoimmune disease
US8217147B2 (en) 2005-08-10 2012-07-10 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
WO2007041635A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
JP4860703B2 (ja) 2005-10-06 2012-01-25 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化された抗ｃｄ３０抗体
US20070087005A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Lazar Gregory A Anti-glypican-3 antibody
AU2007205935B2 (en) 2006-01-17 2013-07-11 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for humanization and optimization of N-glycans in plants
EP2540741A1 (en) 2006-03-06 2013-01-02 Aeres Biomedical Limited Humanized anti-CD22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
US20080118978A1 (en) 2006-04-28 2008-05-22 Takashi Sato Anti-tumor agent
MY157757A (en) 2006-07-18 2016-07-15 Sanofi Aventis Antagonist antibody against epha2 for the treatment of cancer
WO2008020586A1 (en) 2006-08-14 2008-02-21 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibody
PT2059536E (pt) 2006-08-14 2014-04-14 Xencor Inc Anticorpos otimizados que visam cd19
WO2008036688A2 (en) 2006-09-18 2008-03-27 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
CA2665528C (en) 2006-10-12 2018-01-23 The University Of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
JP5378795B2 (ja) 2006-10-20 2013-12-25 中外製薬株式会社 抗ｈｂ−ｅｇｆ抗体を有効成分として含む医薬組成物
AR063975A1 (es) 2006-11-28 2009-03-04 Centelion Fusiones fc con receptor para fgf soluble modificadas con actividad biologica mejorada
EP2103628A4 (en) 2006-12-14 2012-02-22 Forerunner Pharma Res Co Ltd MONOCLONAL ANTIBODY ANTI-CLAUDIN 3, AND TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER USING SUCH ANTIBODY
CN101563460A (zh) * 2006-12-22 2009-10-21 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 选择方法
EP2123676A4 (en) 2007-01-05 2011-01-05 Univ Tokyo DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER USING ANTI-PRG-3 ANTIBODIES
EP2119780B1 (en) 2007-01-24 2015-03-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genetically recombinant antibody composition having enhanced effector activity
US20110236374A1 (en) 2007-01-24 2011-09-29 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genetically recombinant antibody composition capable of binding specifically to ganglioside gm2
EP2468776A3 (en) 2007-02-09 2012-11-14 Genentech, Inc. Anti-Robo4 antibodies and uses therefor
EP3118221B1 (en) 2007-02-26 2019-08-21 Oxford BioTherapeutics Ltd Proteins
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
CN101641115B (zh) 2007-03-08 2013-04-24 卡罗拜奥斯制药公司 用于实体瘤治疗的EphA3抗体
WO2008114733A1 (ja) 2007-03-16 2008-09-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 抗Claudin-4抗体
JP5575636B2 (ja) 2007-05-07 2014-08-20 メディミューン，エルエルシー 抗ｉｃｏｓ抗体ならびに、腫瘍、移植および自己免疫疾患の治療におけるその使用
JP2010527356A (ja) 2007-05-14 2010-08-12 メディミューン，エルエルシー 好酸球レベルを低下させる方法
EP2708557A1 (en) 2007-05-30 2014-03-19 Xencor, Inc. Method and compositions for inhibiting CD32B expressing cells
CN101821288A (zh) 2007-06-21 2010-09-01 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
US8722858B2 (en) 2007-06-25 2014-05-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-Prominin-1 antibody having ADCC activity or CDC activity
US7919313B2 (en) † 2007-07-12 2011-04-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for inactivating alpha 1,6 fucosyltransferase (FUT8) gene expression
WO2009018386A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
HUE032301T2 (en) 2007-08-30 2017-09-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-EPHA2 antibody
PH12018501459A1 (en) 2007-09-26 2019-11-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified antibody constant region
AU2008321840B2 (en) 2007-11-14 2014-02-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-GPR49 antibody
TWI468417B (zh) 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
EP2604628A3 (en) 2007-12-21 2013-08-21 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4R) - 173
SI2235059T1 (sl) 2007-12-26 2015-06-30 Xencor, Inc. Fc variante s spremenjeno vezjo na fcrn
US9274119B2 (en) 2008-01-11 2016-03-01 The University Of Tokyo Anti-CLDN6 antibody
ES2613963T3 (es) 2008-01-18 2017-05-29 Medimmune, Llc Anticuerpos manipulados con cisteína para conjugación específica de sitio
CN106349390B (zh) 2008-04-02 2019-12-10 宏观基因有限公司 Bcr-复合体-特异性抗体和其使用方法
PL2247304T3 (pl) 2008-04-02 2017-01-31 Macrogenics, Inc. Przeciwciała specyficzne wobec HER2/neu oraz sposoby ich zastosowania
CL2009000647A1 (es) 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
DK2708559T3 (en) 2008-04-11 2018-06-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of repeatedly binding two or more antigen molecules
ES2828627T3 (es) 2008-04-25 2021-05-27 Kyowa Kirin Co Ltd Anticuerpo multivalente estable
JPWO2009142186A1 (ja) * 2008-05-20 2011-09-29 株式会社カネカ 細胞障害性組成物
US9226934B2 (en) 2008-06-02 2016-01-05 The University Of Tokyo Anti-cancer drug
WO2010033279A2 (en) 2008-06-04 2010-03-25 Macrogenics, Inc. Antibodies with altered binding to fcrn and methods of using same
KR20110039220A (ko) 2008-06-30 2011-04-15 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 항ｃｄ27 항체
JP5730570B2 (ja) 2008-07-17 2015-06-10 協和発酵キリン株式会社 抗システムａｓｃアミノ酸トランスポーター２（ａｓｃｔ２）抗体
JP5662149B2 (ja) 2008-08-13 2015-01-28 協和発酵キリン株式会社 遺伝子組換えプロテインｓ組成物
EP2331578B1 (en) 2008-09-17 2014-06-04 Xencor, Inc. Novel compositions and methods for treating ige-mediated disorders
CA2735900A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune, Llc Antibodies directed to dll4 and uses thereof
KR20110084196A (ko) 2008-09-26 2011-07-21 유레카 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포계 및 단백질
PE20110707A1 (es) 2008-10-14 2011-10-11 Genentech Inc Variantes de inmunoglobulinas
CA2743469C (en) 2008-11-12 2019-01-15 Medimmune, Llc Antibody formulation
CN106432503B (zh) 2008-12-19 2020-03-06 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
JP5756292B2 (ja) 2008-12-22 2015-07-29 中外製薬株式会社 抗ｈｓ６ｓｔ２抗体及びその用途
EP3318573A1 (en) 2008-12-23 2018-05-09 F. Hoffmann-La Roche AG Mmunoglobulin variants with altered binding to protein a
EP2385114A4 (en) 2008-12-25 2012-08-08 Univ Tokyo CANCER TREATMENT DIAGNOSIS WITH ANTI-TM4SF20 ANTIBODY
HUE029946T2 (en) 2008-12-26 2017-04-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Anti-CD4 antibody
WO2010074192A1 (ja) 2008-12-26 2010-07-01 国立大学法人東京大学 抗lgr7抗体を用いる癌の診断および治療
WO2010084408A2 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Oxford Biotherapeutics Ltd. Pta089 protein
WO2010102244A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Treatment of leukemias and chronic myeloproliferative diseases with antibodies to epha3
EP2233500A1 (en) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
TWI461211B (zh) 2009-03-20 2014-11-21 Genentech Inc 抗－ｈｅｒ抗體
US8124740B2 (en) 2009-03-25 2012-02-28 Genentech, Inc. Anti- α5 β1 antibodies and uses thereof
JP5616428B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-29 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 三価の二重特異性抗体
US8575316B2 (en) 2009-04-09 2013-11-05 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-Siglec-15 antibody
ES2571235T3 (es) 2009-04-10 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para el tratamiento de un tumor sanguíneo que utiliza el anticuerpo anti-TIM-3
WO2010119691A1 (ja) 2009-04-16 2010-10-21 国立大学法人東京大学 抗tmprss11e抗体を用いた癌の診断と治療
EP2423228B1 (en) 2009-04-20 2015-12-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody containing igg2 having amino acid mutation introduced therein
EP2949673A1 (en) 2009-04-27 2015-12-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-il-3ra antibody for use in treatment of blood tumor
AR076875A1 (es) 2009-05-15 2011-07-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo contra receptor de la tirosina quinasa (anti-axl)
WO2010137654A1 (ja) 2009-05-29 2010-12-02 株式会社未来創薬研究所 Egfファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物
PL2438171T3 (pl) * 2009-06-02 2015-04-30 Regeneron Pharma Komórki z niedoborem fukozylacji
JP6039181B2 (ja) 2009-06-11 2016-12-07 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 タンパク質の生産方法
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
AU2010270979B2 (en) 2009-06-22 2015-04-23 Medimmune, Llc Engineered Fc regions for site-specific conjugation
WO2011014457A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Genentech, Inc. Combination treatments
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
CN102597234B (zh) 2009-08-07 2014-10-29 协和发酵麒麟株式会社 人源化抗淀粉样-b寡聚体抗体
EP2463369A4 (en) 2009-08-07 2013-09-18 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd HUMANIZED ANTIBODIES AGAINST AMYLOID B OLIGOMERS
CN102574917A (zh) 2009-08-17 2012-07-11 株式会社未来创药研究所 含有抗hb-egf抗体作为有效成分的药物组合物
DK2473522T3 (en) 2009-09-02 2016-11-28 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
AU2010293383B2 (en) 2009-09-10 2014-12-18 Kyowa Kirin Co., Ltd. Medicament including antibody composition specifically bound to human CC chemokine receptor 4 (CCR4)
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
MY160680A (en) * 2009-09-22 2017-03-15 Probiogen Ag Process for producing molecules containing specialized glycan structures
US8697073B2 (en) 2009-09-30 2014-04-15 Fujifilm Ri Pharma Co., Ltd. Anti-podoplanin antibody, and pharmaceutical composition containing anti-podoplanin antibody
TW201116297A (en) 2009-10-02 2011-05-16 Sanofi Aventis Antibodies that specifically bind to the EphA2 receptor
RU2583298C2 (ru) 2009-10-07 2016-05-10 Макродженикс, Инк. ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ Fc-УЧАСТОК, КОТОРЫЕ ДЕМОНСТРИРУЮТ ПОВЫШЕННУЮ ЭФФЕКТОРНУЮ ФУНКЦИЮ БЛАГОДАРЯ ИЗМЕНЕНИЯМ СТЕПЕНИ ФУКОЗИЛИРОВАНИЯ, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
US20120282177A1 (en) 2009-11-02 2012-11-08 Christian Rohlff ROR1 as Therapeutic and Diagnostic Target
EP3279215B1 (en) 2009-11-24 2020-02-12 MedImmune Limited Targeted binding agents against b7-h1
WO2011071577A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Genentech, Inc. Anti-vegf-c antibodies and methods using same
PL2516465T3 (pl) 2009-12-23 2016-11-30 Przeciwciała anty-bv8 i ich zastosowania
WO2011091078A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Xencor, Inc. Antibody fc variants with enhanced complement activity
TR201806936T4 (tr) 2010-01-29 2018-06-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dll3 antikoru.
WO2011097527A2 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Xencor, Inc. Immunoprotection of therapeutic moieties using enhanced fc regions
RU2577125C2 (ru) 2010-02-10 2016-03-10 Фуджифилм Ри Фарма Ко., Лтд. Меченное радиоактивным металлом антитело против кадгерина
EP2533810B1 (en) 2010-02-10 2016-10-12 ImmunoGen, Inc. Cd20 antibodies and uses thereof
EP2536748B1 (en) 2010-02-18 2014-08-20 Genentech, Inc. Neuregulin antagonists and use thereof in treating cancer
US20120321557A1 (en) 2010-02-26 2012-12-20 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-icam3 antibody and use thereof
EP2543727B1 (en) 2010-03-02 2016-08-31 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Modified antibody composition
NZ602161A (en) 2010-03-04 2014-12-24 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
BR112012022044A2 (pt) 2010-03-24 2020-08-25 Genentech Inc ''anticorpo,imunoconjugado,formulação farmacêutica,uso do anticorpo,método de tratamento,anticorpo biespecifico isolado e célula hospedeira''.
JP5767207B2 (ja) 2010-03-26 2015-08-19 協和発酵キリン株式会社 新規修飾部位導入抗体および抗体フラグメント
EP2552957A4 (en) 2010-03-29 2013-11-20 Zymeworks Inc ANTIBODIES HAVING ENHANCED OR DELETED EFFECTIVE FUNCTION
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
WO2011150454A1 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Monash University ANTIBODIES DIRECTED TO THE UNPROCESSED RECEPTOR TYROSINE KINASE c-MET
TR201807750T4 (tr) * 2010-06-11 2018-06-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Anti-TIM-3 antikoru.
TW201204388A (en) 2010-06-18 2012-02-01 Genentech Inc Anti-Axl antibodies and methods of use
DK3323830T3 (da) 2010-06-19 2023-09-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-gd2 antibodies
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
US9485812B2 (en) 2010-07-08 2016-11-01 Honda Motor Co., Ltd. High frequency heating coil
MX2013000083A (es) 2010-07-09 2013-02-26 Genentech Inc Anticuerpos de anti-neuropilina y metodos de uso.
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
JP5964300B2 (ja) 2010-08-02 2016-08-03 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 共有結合型ダイアボディおよびその使用
CN103153341B (zh) 2010-08-03 2015-05-27 霍夫曼-拉罗奇有限公司 慢性淋巴细胞性白血病(cll)生物标志物
WO2012019061A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
JP2013541937A (ja) 2010-08-05 2013-11-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 抗ｍｈｃ抗体−抗ウイルス性サイトカイン融合タンパク質
SI2603530T1 (en) 2010-08-13 2018-02-28 Roche Glycart Ag Anti-FAP antibodies and methods of use
TW201209063A (en) 2010-08-13 2012-03-01 Roche Glycart Ag Anti-tenascin-C A2 antibodies and methods of use
WO2012025536A1 (en) 2010-08-25 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against il-18r1 and uses thereof
EP2608807A1 (en) 2010-08-27 2013-07-03 Stem Centrx, Inc. Notum protein modulators and methods of use
SG10201408229WA (en) 2010-08-31 2015-02-27 Genentech Inc Biomarkers and methods of treatment
SG10201506959SA (en) 2010-09-03 2015-10-29 Stemcentrx Inc Novel modulators and methods of use
WO2012043747A1 (ja) 2010-09-30 2012-04-05 独立行政法人理化学研究所 グリオーマの治療方法、グリオーマの検査方法、所望の物質をグリオーマに送達させる方法、及びそれらの方法に用いられる薬剤
EP3828205A1 (en) 2010-10-01 2021-06-02 Oxford BioTherapeutics Ltd Anti-ror1 antibodies
EP2625197B1 (en) 2010-10-05 2016-06-29 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
KR101814852B1 (ko) 2010-10-29 2018-01-04 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 신규 항 dr5 항체
CN103228674B (zh) 2010-11-10 2019-07-05 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于神经疾病免疫疗法的方法和组合物
EP2644698B1 (en) 2010-11-17 2018-01-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
CN108715614A (zh) 2010-11-30 2018-10-30 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
AU2011360938B2 (en) 2010-12-08 2016-07-28 Abbvie Stemcentrx Llc Novel modulators and methods of use
SG10201602874VA (en) 2010-12-15 2016-05-30 Kek High Energy Accelerator Protein production method
ES2656079T3 (es) 2010-12-15 2018-02-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para producir proteínas
EP3447491A3 (en) 2010-12-16 2019-06-05 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnosis and treatments relating to th2 inhibition
EP2655418B1 (en) 2010-12-20 2017-10-04 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-mesothelin antibodies and immunoconjugates
US20120195910A1 (en) 2010-12-22 2012-08-02 Genentech, Inc. Anti-pcsk9 antibodies and methods of use
US9085772B2 (en) 2010-12-27 2015-07-21 National University Corporation Nagoya University Method for suppressing receptor tyrosine kinase-mediated pro-survival signaling in cancer cell
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
FR2971250A1 (fr) 2011-02-07 2012-08-10 Univ Nantes Anticorps anti-gb3 utiles dans le traitement des maladies associees a l'angiogenese
SA112330278B1 (ar) 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
MX341921B (es) 2011-02-28 2016-09-07 Hoffmann La Roche Proteinas de union a antigeno.
MX346663B (es) * 2011-03-06 2017-03-27 Merck Serono Sa Lineas de celulas de bajo nivel de fucosa y usos de las mismas.
MX354359B (es) 2011-03-29 2018-02-28 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
CN103596983B (zh) 2011-04-07 2016-10-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗fgfr4抗体及使用方法
WO2012144208A1 (ja) 2011-04-18 2012-10-26 国立大学法人東京大学 抗itm2a抗体を用いる癌の診断および治療
SI2699602T1 (sl) 2011-04-19 2017-06-30 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecifična protitelesa anti-igf-1r in anti-erbb3
DK2703486T3 (en) 2011-04-25 2018-05-28 Daiichi Sankyo Co Ltd ANTI-B7-H3 ANTIBODY
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
CA2833212C (en) 2011-05-12 2020-06-09 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
CN103596980B (zh) 2011-05-16 2017-08-08 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Fgfr1激动剂及使用方法
NZ618016A (en) 2011-05-21 2015-05-29 Macrogenics Inc Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
JPWO2012176779A1 (ja) 2011-06-20 2015-02-23 協和発酵キリン株式会社 抗ｅｒｂＢ３抗体
CN103649125A (zh) 2011-06-22 2014-03-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 利用包含mhc i类的复合物通过循环中的病毒特异性细胞毒性t细胞清除靶细胞
PL2726094T3 (pl) 2011-06-28 2017-06-30 Oxford Biotherapeutics Ltd Cel terapeutyczny i diagnostyczny
MX2013014687A (es) 2011-06-30 2014-02-17 Genentech Inc Formulaciones de anticuerpo anti-c-met.
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
WO2013022855A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points and immunofiltering
JP2014526891A (ja) 2011-08-17 2014-10-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド ニューレグリン抗体とその使用
RU2014109038A (ru) 2011-08-23 2015-09-27 Рош Гликарт Аг Антитела к хондроитинсульфат протеогликану меланомы
EP2748197A2 (en) 2011-08-26 2014-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
CN103930781A (zh) 2011-09-15 2014-07-16 霍夫曼-拉罗奇有限公司 促进分化的方法
CN103930111A (zh) 2011-09-19 2014-07-16 霍夫曼-拉罗奇有限公司 包含c-met拮抗剂和b-raf拮抗剂的组合治疗
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
MX366968B (es) 2011-09-30 2019-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno que induce la inmunorespuesta al antigeno objetivo.
WO2013052155A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating liver conditions using notch2 antagonists
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
DK2766392T3 (da) 2011-10-10 2019-10-07 Xencor Inc Fremgangsmåde til oprensning af antistoffer
CN103917556B (zh) 2011-10-14 2018-02-06 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗HtrA1抗体及使用方法
WO2013056148A2 (en) 2011-10-15 2013-04-18 Genentech, Inc. Methods of using scd1 antagonists
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
US20140302511A1 (en) 2011-10-28 2014-10-09 Pharmalogicals Research Pte. Ltd. Cancer stem cell-specific molecule
MX2014004991A (es) 2011-10-28 2014-05-22 Genentech Inc Combinaciones terapeuticas y metodos para tratar el melanoma.
PT2773671T (pt) 2011-11-04 2021-12-14 Zymeworks Inc Geração de anticorpo heterodimérico estável com mutações no domínio fc
CN104066748A (zh) 2011-11-21 2014-09-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗c-met抗体的纯化
WO2013083497A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody formulation
WO2013087789A1 (en) 2011-12-13 2013-06-20 Glykos Finland Ltd. Antibody isoform arrays and methods thereof
EP3354660A1 (en) 2011-12-22 2018-08-01 F. Hoffmann-La Roche AG Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
SG10201601882PA (en) 2011-12-22 2016-04-28 Hoffmann La Roche Expression Vector Organization, Novel Production Cell Generation Methods And Their Use For The Recombinant Production Of Polypeptides
BR112014013035A2 (pt) 2011-12-22 2018-10-09 Hoffmann La Roche métodos de seleção de células, conjuntos de expressão bicistrônica, células eucarióticas, vetores lentivirais, uso de vetor lentiviral, bibliotecas de ventores lentivirais e de células eucarióticas, métodos de seleção de células, fluxos de trabalho e uso de célula
EP3539982A3 (en) 2011-12-23 2020-01-15 Pfizer Inc Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
WO2013096791A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Genentech, Inc. Process for making high concentration protein formulations
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
RU2014133547A (ru) 2012-01-18 2016-03-10 Дженентек, Инк. Способы применения модуляторов fgf19
TW201335187A (zh) 2012-01-18 2013-09-01 Genentech Inc 抗ｌｒｐ５抗體及使用方法
KR20140119777A (ko) 2012-01-31 2014-10-10 제넨테크, 인크. 항-ig-e m1'' 항체 및 그의 사용 방법
SG11201404751UA (en) 2012-02-09 2014-09-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified fc region of antibody
JP6545959B2 (ja) 2012-02-11 2019-07-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｒスポンジン転位およびその使用方法
TR201808458T4 (tr) 2012-02-15 2018-07-23 Hoffmann La Roche FC-reseptör bazlı afinite kromatografisi.
EP3626254A1 (en) 2012-03-16 2020-03-25 University Health Network Soluble toso protein and its use in treating autoimmune disorders
US20130259867A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
JP6280031B2 (ja) 2012-03-29 2018-02-14 中外製薬株式会社 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
ES2660472T3 (es) 2012-03-30 2018-03-22 Daiichi Sankyo Company, Limited Anticuerpo anti-Siglec-15 modificado con CDR
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
EP2832855A4 (en) 2012-03-30 2016-02-24 Daiichi Sankyo Co Ltd NEW ANTI-SIGLEC ANTIBODY-15
JP6188681B2 (ja) 2012-04-09 2017-08-30 第一三共株式会社 抗ｆｇｆｒ２抗体
WO2013155346A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 The Regents Of The University Of California Diagnostic tools for response to 6-thiopurine therapy
AU2013254313B2 (en) 2012-04-27 2017-03-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-ROBO4-antibody
EP2844300B1 (en) 2012-05-01 2018-10-17 Genentech, Inc. Anti-pmel17 antibodies and immunoconjugates
AU2013258834B2 (en) 2012-05-10 2017-09-07 Zymeworks Bc Inc. Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the Fc domain
WO2013170191A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Genentech, Inc. Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide
US9416189B2 (en) 2012-05-11 2016-08-16 Microbial Chemistry Research Foundation Anti-CXADR antibody
JP6294311B2 (ja) 2012-05-23 2018-03-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 治療薬の選択方法
RU2743463C2 (ru) 2012-05-30 2021-02-18 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Специфичная к ткани-мишени антигенсвязывающая молекула
KR101566539B1 (ko) 2012-06-08 2015-11-05 국립암센터 신규한 Ｔｈ2 세포 전환용 에피토프 및 이의 용도
AR091462A1 (es) 2012-06-15 2015-02-04 Genentech Inc Anticuerpos anti-pcsk9, formulaciones, dosificacion y metodos de uso
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
KR102143476B1 (ko) 2012-07-02 2020-08-12 쿄와 기린 가부시키가이샤 항ｂｍｐ９ 항체를 유효 성분으로 하는, 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈에 대한 치료제
EP3339328A1 (en) 2012-07-04 2018-06-27 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-biotin antibodies and methods of use
EP2869848B1 (en) 2012-07-04 2016-09-21 F. Hoffmann-La Roche AG Covalently linked antigen-antibody conjugates
CN104394886B (zh) 2012-07-04 2017-05-24 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗茶碱抗体及使用方法
MX356162B (es) 2012-07-05 2018-05-16 Genentech Inc Sistema de expresion y secrecion.
JP6310845B2 (ja) 2012-07-06 2018-04-11 学校法人 聖マリアンナ医科大学 Ｈｔｌｖ−１関連脊髄症患者の治療方法および治療剤
MX2015000359A (es) 2012-07-09 2015-04-14 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-cd79b.
CN104428007B (zh) 2012-07-09 2018-03-16 基因泰克公司 包含抗cd22抗体的免疫缀合物
ES2661572T3 (es) 2012-07-09 2018-04-02 Genentech, Inc. Inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-CD79b
CA2873889A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Genentech, Inc. Anti-cd22 antibodies and immunoconjugates
HUE056217T2 (hu) 2012-07-13 2022-02-28 Roche Glycart Ag Bispecifikus anti-VEGF/anti-ANG-2 antitestek és ezek alkalmazása szemészeti érbetegségek kezelésében
AU2013295848B2 (en) 2012-07-25 2018-05-24 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-KIT antibodies and uses thereof
GB201213652D0 (en) 2012-08-01 2012-09-12 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
EA031631B1 (ru) 2012-09-27 2019-01-31 Чугаи Сеияку Кабушики Каиша Способ лечения или предупреждения злокачественного новообразования, способ отбора пациента, способ тестирования предрасположенности к злокачественному новообразованию у субъекта, гибридный полипептид и его применения
EP2905290B1 (en) 2012-10-05 2019-12-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. Heterodimeric protein composition
KR102584005B1 (ko) 2012-10-11 2023-09-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 글리신아미드 화합물의 제조 방법
JP6272230B2 (ja) 2012-10-19 2018-01-31 第一三共株式会社 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体−薬物コンジュゲート
WO2014071358A2 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Foundation Medicine, Inc. Novel ntrk1 fusion molecules and uses thereof
WO2014072306A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
TWI657095B (zh) 2012-11-13 2019-04-21 美商建南德克公司 抗血球凝集素抗體及使用方法
CN105025923B (zh) 2012-12-06 2018-03-27 国立大学法人金泽大学 间皮瘤的治疗方法
TWI614266B (zh) 2012-12-07 2018-02-11 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 抗ｆｏｌｒ１抗體
EP3557260B1 (en) 2012-12-21 2022-05-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
CN104884474A (zh) 2012-12-21 2015-09-02 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含i类mhc的二硫键连接多价多功能蛋白质
KR20160007478A (ko) 2013-01-10 2016-01-20 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
EP2943511B1 (en) 2013-01-14 2019-08-07 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP2945969A1 (en) 2013-01-15 2015-11-25 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
CA2898326C (en) 2013-01-18 2022-05-17 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
WO2014116749A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Genentech, Inc. Anti-hcv antibodies and methods of using thereof
EP2953974B1 (en) 2013-02-05 2017-12-20 EngMab Sàrl Bispecific antibodies against cd3epsilon and bcma
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
JP6357113B2 (ja) 2013-02-08 2018-07-11 株式会社医学生物学研究所 ヒトｎｒｇ１タンパク質に対する抗体
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
KR20150118159A (ko) 2013-02-22 2015-10-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 치료 방법 및 약물 내성의 예방 방법
US20140242083A1 (en) 2013-02-26 2014-08-28 Roche Glycart Ag Anti-mcsp antibodies
KR20150143458A (ko) 2013-03-06 2015-12-23 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 항-C-MET 탠덤 Fc 이중특이적 항체
CN105246511A (zh) 2013-03-06 2016-01-13 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗和预防癌症药物抗性的方法
EP2968565A2 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Genentech, Inc. Methods of treating cancer and preventing cancer drug resistance
EP2970474B1 (en) 2013-03-14 2017-12-20 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
CN105246508A (zh) 2013-03-14 2016-01-13 基因泰克公司 Mek抑制剂化合物与her3/egfr抑制剂化合物的组合及使用方法
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
JP2016520528A (ja) 2013-03-15 2016-07-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 癌の治療及び抗癌剤耐性の防止方法
AU2014232501C1 (en) 2013-03-15 2021-04-22 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR20150131177A (ko) 2013-03-15 2015-11-24 제넨테크, 인크. 항-CRTh2 항체 및 그의 용도
WO2014145907A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Xencor, Inc. Targeting t cells with heterodimeric proteins
TR201809571T4 (tr) 2013-03-15 2018-07-23 Hoffmann La Roche Ll-22 polipeptidleri ile ıl-22 fc füzyon proteinleri ve kullanım yöntemleri.
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
CA2903576C (en) 2013-03-15 2021-06-08 Nai-Kong V. Cheung High affinity anti-gd2 antibodies
CA2905798C (en) 2013-03-15 2023-01-24 Genentech, Inc. Biomarkers and methods of treating pd-1 and pd-l1 related conditions
US9260527B2 (en) 2013-03-15 2016-02-16 Sdix, Llc Anti-human CXCR4 antibodies and methods of making same
JP6568514B2 (ja) 2013-03-15 2019-08-28 エーシー イミューン エス．エー． 抗タウ抗体及び使用方法
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014236815B2 (en) 2013-03-15 2019-04-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
WO2014174596A1 (ja) 2013-04-23 2014-10-30 株式会社医学生物学研究所 ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子に対する機能性モノクローナル抗体
EP3327034A1 (en) 2013-04-29 2018-05-30 F. Hoffmann-La Roche AG Fcrn-binding abolished anti-igf-1r antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
EP2992010B1 (en) 2013-04-29 2021-03-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor binding modified asymmetric antibodies and methods of use
MY172430A (en) 2013-04-29 2019-11-25 Hoffmann La Roche Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use
TWI573805B (zh) 2013-05-20 2017-03-11 建南德克公司 抗轉鐵蛋白受體抗體及其使用方法
KR20160015286A (ko) 2013-05-31 2016-02-12 제넨테크, 인크. 항-세포벽 테이코산 항체 및 접합체
ES2793174T3 (es) 2013-05-31 2020-11-13 Genentech Inc Anticuerpos antiteicoicos de pared y conjugados
BR112015032414A2 (pt) 2013-06-24 2017-11-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd agente terapêutico compreendendo anticorpo antiepirregulina humanizado como ingrediente ativo para carcinoma de pulmão de célula não pequena excluindo adenocarcinoma
SI3027651T1 (sl) 2013-08-01 2019-05-31 Five Prime Therapeutics, Inc. Afukozilirana protitelesa proti fgfr2iiib
CA2922889A1 (en) 2013-09-17 2015-03-26 Genentech, Inc. Methods of using anti-lgr5 antibodies
MX2016003643A (es) 2013-09-30 2016-12-20 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpo anti-lps o11.
TWI664977B (zh) 2013-10-08 2019-07-11 第一三共股份有限公司 抗ｆｇｆｒ２抗體及其與其他藥劑之組合
KR20160068855A (ko) 2013-10-11 2016-06-15 제넨테크, 인크. Nsp4 억제제 및 사용 방법
PE20160561A1 (es) 2013-10-11 2016-06-03 Oxford Biotherapeutics Ltd Anticuerpos conjugados contra ly75 para el tratamiento de cancer
ES2764833T3 (es) 2013-10-11 2020-06-04 The United States Of America Represented By The Sec Dep Of Health And Human Services Anticuerpos contra TEM8 y su uso
BR112016006929A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-19 Hoffmann La Roche Anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de preparação de anticorpo, de tratamento de pacientes e de geração de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
RU2016114074A (ru) 2013-10-18 2017-11-23 Дженентек, Инк. Анти-rspo антитела и способы применения
EP3060685B1 (en) 2013-10-23 2019-05-01 F. Hoffmann-La Roche AG Method of predicting the response of an asthma patient to therapy
EP3070167A4 (en) 2013-11-06 2017-06-07 Osaka University Antibody having broad neutralizing activity in group 1 influenza a virus
NZ717673A (en) 2013-11-21 2020-02-28 Hoffmann La Roche Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
EP3763813A1 (en) 2013-12-04 2021-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
KR20160098328A (ko) 2013-12-13 2016-08-18 제넨테크, 인크. 항-cd33 항체 및 면역접합체
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
HUE047699T2 (hu) 2013-12-17 2020-05-28 Hoffmann La Roche Eljárások rákbetegségek kezelésére PD-1-tengelyhez kötõdõ antagonisták és taxánok alkalmazásával
CN110156893B (zh) 2013-12-17 2023-03-03 基因泰克公司 抗cd3抗体及使用方法
US20150210772A1 (en) 2013-12-17 2015-07-30 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and an anti-cd20 antibody
EP3083687A2 (en) 2013-12-17 2016-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
TWI728373B (zh) 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
RU2743077C2 (ru) 2013-12-25 2021-02-15 Дайити Санкио Компани, Лимитед Конъюгат анти-trop2 антитело-лекарственное средство
BR112016013347B1 (pt) 2013-12-26 2023-12-12 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Anticorpo monoclonal humano neutralizante anti-il-33, composição farmacêutica, inibidor da expressão de citocinas, molécula de ácido nucleico, vetor, célula bacteriana transgênica, método de produção e uso dos mesmos
TW201609093A (zh) 2013-12-27 2016-03-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Ｆｇｆｒ門控蛋白變異基因及以其爲標的之醫藥
BR112016012666A2 (pt) 2014-01-03 2017-09-26 Hoffmann La Roche conjugado, anticorpos, formulação farmacêutica e usos de conjugado
JP6476194B2 (ja) 2014-01-03 2019-02-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 二重特異性抗ハプテン／抗血液脳関門受容体抗体、それらの複合体、及び血液脳関門シャトルとしてのそれらの使用
MX2016008191A (es) 2014-01-03 2017-11-16 Hoffmann La Roche Conjugados de toxina polipeptidica-anticuerpo unidos covalentemente.
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
RU2694659C2 (ru) 2014-01-06 2019-07-16 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Одновалентные модули-переносчики через гематоэнцефалический барьер
EP3835318A1 (en) 2014-01-15 2021-06-16 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
EP3096797A1 (en) 2014-01-24 2016-11-30 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of using anti-steap1 antibodies and immunoconjugates
CN105829346B (zh) 2014-01-31 2019-08-23 第一三共株式会社 抗her2抗体－药物偶联物
AU2015214264B2 (en) 2014-02-04 2018-12-20 Curis, Inc. Mutant Smoothened and methods of using the same
CN106163548A (zh) 2014-02-08 2016-11-23 健泰科生物技术公司 治疗阿尔茨海默氏病的方法
AU2015213741B2 (en) 2014-02-08 2020-10-08 Genentech, Inc. Methods of treating Alzheimer's Disease
TW201902515A (zh) 2014-02-12 2019-01-16 美商建南德克公司 抗jagged1抗體及使用方法
KR20160124165A (ko) 2014-02-21 2016-10-26 제넨테크, 인크. 항-il-13/il-17 이중특이적 항체 및 그의 용도
AU2015225867B2 (en) 2014-03-07 2020-02-06 University Health Network Methods and compositions for modifying the immune response
US10435694B2 (en) 2014-03-14 2019-10-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US20170107294A1 (en) 2014-03-21 2017-04-20 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
EP3122900A1 (en) 2014-03-24 2017-02-01 F. Hoffmann-La Roche AG Cancer treatment with c-met antagonists and correlation of the latter with hgf expression
SG10202008629XA (en) 2014-03-28 2020-10-29 Xencor Inc Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
CR20160500A (es) 2014-03-31 2016-12-14 Genentech Inc Anticuerpos anti-ox40 y métodos de uso
WO2015153514A1 (en) 2014-03-31 2015-10-08 Genentech, Inc. Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
ES2859648T3 (es) 2014-04-10 2021-10-04 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado anticuerpo-fármaco anti-HER3
WO2015164615A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 University Of Oslo Anti-gluten antibodies and uses thereof
US11760807B2 (en) 2014-05-08 2023-09-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha GPC3-targeting drug which is administered to patient responsive to GPC3-targeting drug therapy
MX2016015162A (es) 2014-05-22 2017-03-03 Genentech Inc Anticuerpos anti - gpc3 e inmunoconjugados.
JP2017524371A (ja) 2014-05-23 2017-08-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｍｉｔバイオマーカーとその使用方法
AU2015271749B2 (en) 2014-06-03 2018-03-01 Xbiotech Inc. Compositions and methods for treating and preventing Staphylococcus aureus infections
MX2016016233A (es) 2014-06-11 2017-03-31 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 y sus usos.
US20230190750A1 (en) 2014-06-13 2023-06-22 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
EP3164419A1 (en) 2014-06-26 2017-05-10 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-brdu antibodies and methods of use
WO2016007235A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Genentech, Inc. Anti-pd-l1 antibodies and diagnostic uses thereof
CN106488775A (zh) 2014-07-11 2017-03-08 基因泰克公司 Notch途径抑制
AU2015292326A1 (en) 2014-07-24 2017-02-23 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
EP3186284B1 (en) 2014-08-28 2022-04-06 BioAtla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
SG10201809668TA (en) 2014-09-12 2018-11-29 Genentech Inc Anti-her2 antibodies and immunoconjugates
TW201625689A (zh) 2014-09-12 2016-07-16 建南德克公司 抗－ｂ７－ｈ４抗體及免疫結合物
EP3191520B1 (en) 2014-09-12 2020-01-01 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
CN107124870A (zh) 2014-09-17 2017-09-01 基因泰克公司 包含抗her2抗体和吡咯并苯并二氮杂*的免疫缀合物
EP3689910A3 (en) 2014-09-23 2020-12-02 F. Hoffmann-La Roche AG Method of using anti-cd79b immunoconjugates
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3207057A2 (en) 2014-10-16 2017-08-23 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
WO2016070001A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of treating conditions with antibodies that bind b7-h4
BR112017009151A2 (pt) 2014-11-03 2018-03-06 Genentech, Inc. ensaios para detectar subgrupos imunológicos de célula t e métodos de uso dos mesmos
WO2016073380A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Genentech, Inc. Method and biomarkers for predicting efficacy and evaluation of an ox40 agonist treatment
WO2016071376A2 (en) 2014-11-06 2016-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use
BR112017006591A2 (pt) 2014-11-06 2018-01-16 Hoffmann La Roche polipeptídeo heterodimérico, formulação farmacêutica e uso de um polipeptídeo heterodimérico
WO2016073282A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and tigit inhibitors
WO2016077369A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Genentech, Inc. Animal model for nephropathy and agents for treating the same
EA201791029A1 (ru) 2014-11-10 2017-12-29 Дженентек, Инк. Антитела против интерлейкина-33 и их применение
EP3875481A1 (en) 2014-11-14 2021-09-08 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
US20160166685A1 (en) 2014-11-17 2016-06-16 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
EP3221362B1 (en) 2014-11-19 2019-07-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
CN107250158B (zh) 2014-11-19 2022-03-25 基因泰克公司 抗转铁蛋白受体/抗bace1多特异性抗体和使用方法
US10882920B2 (en) 2014-11-19 2021-01-05 Genentech, Inc. Antibodies against BACE1 and use thereof for neural disease immunotherapy
ES2835823T3 (es) 2014-11-20 2021-06-23 Hoffmann La Roche Politerapia de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T para CD3 y para el receptor de folato 1 (FolR1) y antagonistas de la unión al eje de PD-1
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
IL252480B2 (en) 2014-11-26 2023-12-01 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
JP2017536830A (ja) 2014-11-26 2017-12-14 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３及びｃｄ３８に結合するヘテロ二量体抗体
WO2016090040A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Anti-staphylococcus aureus antibody rifamycin conjugates and uses thereof
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
JP6742314B2 (ja) 2014-12-03 2020-08-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗黄色ブドウ球菌抗体リファマイシン複合体及びその使用
EP3227336B1 (en) 2014-12-05 2019-07-03 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd79b antibodies and methods of use
WO2016094566A2 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Genentech, Inc. Blood brain barrier receptor antibodies and methods of use
LT3233921T (lt) 2014-12-19 2021-12-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antikūnai ir panaudojimo būdai
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US20160200815A1 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
KR20170128234A (ko) 2015-01-16 2017-11-22 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ror1에 특이적인 항체 및 키메라 항원 수용체
EP3247723A1 (en) 2015-01-22 2017-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A combination of two or more anti-c5 antibodies and methods of use
JP2018512597A (ja) 2015-02-04 2018-05-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 突然変異体スムースンド及びその使用方法
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
WO2016130539A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Multi-specific antibodies with affinity for human a33 antigen and dota metal complex and uses thereof
EP3261665A1 (en) 2015-02-24 2018-01-03 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
MX2017011486A (es) 2015-03-16 2018-06-15 Genentech Inc Métodos de detección y cuantificación de il-13 y sus usos en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades asociadas a th2.
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
PL3271389T3 (pl) 2015-03-20 2020-08-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizujące przeciwciała wiążące się z gp120 i ich stosowanie
US10023635B2 (en) 2015-03-23 2018-07-17 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to ICOS
US10472412B2 (en) 2015-03-25 2019-11-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific multivalent fusion proteins
US20180208658A1 (en) 2015-04-03 2018-07-26 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
SI3286315T1 (sl) 2015-04-24 2021-09-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek identifikacije bakterij, ki obsegajo vezavne polipeptide
CR20200517A (es) 2015-04-28 2021-01-12 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp PROTEINA DE UNION A RGma Y SUS USO
EP3288981A1 (en) 2015-05-01 2018-03-07 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
WO2016179194A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Jounce Therapeutics, Inc. Lilra3 and method of using the same
MA42043A (fr) 2015-05-07 2018-03-14 Agenus Inc Anticorps anti-ox40 et procédés d'utilisation de ceux-ci
CN116196414A (zh) 2015-05-11 2023-06-02 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗狼疮性肾炎的组合物和方法
HRP20201900T4 (hr) 2015-05-12 2024-06-07 F. Hoffmann - La Roche Ag Terapeutski i dijagnostički postupci kod raka
WO2016181357A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 Zumutor Biologics, Inc. Afucosylated protein, cell expressing said protein and associated methods
JP2018520658A (ja) 2015-05-29 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗エボラウイルス糖タンパク質抗体及びその使用
IL294138A (en) 2015-05-29 2022-08-01 Genentech Inc Therapeutic and diagnostic methods for cancer
JP2018516933A (ja) 2015-06-02 2018-06-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｉｌ−３４抗体を使用して神経学的疾患を治療するための組成物及び方法
WO2016196975A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
JP6793134B2 (ja) 2015-06-05 2020-12-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
EP3303397A1 (en) 2015-06-08 2018-04-11 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cancer using anti-ox40 antibodies and pd-1 axis binding antagonists
AU2016274585A1 (en) 2015-06-08 2017-12-14 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using anti-OX40 antibodies
EP3307780A1 (en) 2015-06-15 2018-04-18 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
AR105026A1 (es) 2015-06-16 2017-08-30 Genentech Inc ANTICUERPOS MADURADOS POR AFINIDAD Y HUMANIZADOS PARA FcRH5 Y MÉTODOS PARA SU USO
TW201718647A (zh) 2015-06-16 2017-06-01 建南德克公司 抗-cll-1抗體及使用方法
EP3916018A1 (en) 2015-06-16 2021-12-01 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
KR20180018538A (ko) 2015-06-17 2018-02-21 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 탁산을 사용하여 국소적 진행성 또는 전이성 유방암을 치료하는 방법
AU2016280159A1 (en) 2015-06-17 2017-12-07 Genentech, Inc. Anti-HER2 antibodies and methods of use
LT3313879T (lt) 2015-06-24 2022-03-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Antikūnai prieš transferino receptorių su pritaikytu giminingumu
JP2018520153A (ja) 2015-06-29 2018-07-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 臓器移植における使用のためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体
ES2938186T3 (es) 2015-06-29 2023-04-05 Daiichi Sankyo Co Ltd Procedimiento de fabricación selectiva de un conjugado anticuerpo-fármaco
AU2016288461B2 (en) 2015-06-29 2021-10-07 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for performing histochemical assays for human pro-epiregulin and amphiregulin
BR112018001955B1 (pt) 2015-08-03 2021-05-11 Engmab Sárl anticorpo monoclonal que se liga às células b humanas (bcma), composição farmacêutica e seu uso
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
WO2017040342A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Genentech, Inc. Anti-hypusine antibodies and uses thereof
TWI751300B (zh) 2015-09-18 2022-01-01 日商中外製藥股份有限公司 Il-8 結合抗體及其用途
JP6904947B2 (ja) 2015-09-22 2021-07-21 スプリング バイオサイエンス コーポレーション 抗ｏｘ４０抗体及びその診断用途
SG10201911226QA (en) 2015-09-23 2020-01-30 Genentech Inc Optimized variants of anti-vegf antibodies
AU2016326738B2 (en) 2015-09-24 2023-08-31 Abvitro Llc HIV antibody compositions and methods of use
TWI836305B (zh) 2015-09-24 2024-03-21 日商第一三共股份有限公司 抗ｇａｒｐ抗體及其製造方法及用途
JP6764474B2 (ja) 2015-09-25 2020-09-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔｉｇｉｔ抗体及び使用方法
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
TWI819458B (zh) 2015-10-02 2023-10-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 雙特異性抗‐人類cd20/人類轉鐵蛋白受體抗體及使用方法
US10392441B2 (en) 2015-10-07 2019-08-27 United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services IL-7R-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
CA2998208A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Jounce Therapeutics, Inc. Gene signatures for determining icos expression
KR20180069065A (ko) 2015-10-29 2018-06-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-변이체 fc-부위 항체 및 사용 방법
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
CN108289951A (zh) 2015-10-30 2018-07-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-因子d抗体和缀合物
EP3368578B1 (en) 2015-10-30 2021-03-17 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof
CN115010805A (zh) 2015-11-03 2022-09-06 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) Hiv-1 gp41中和抗体及其用途
EP3371217A1 (en) 2015-11-08 2018-09-12 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of screening for multispecific antibodies
RU2021107536A (ru) 2015-11-23 2021-07-02 Файв Прайм Терапьютикс, Инк. Ингибиторы fgfr2 отдельно или в комбинации с иммуностимулирующими агентами в лечении рака
US11623957B2 (en) 2015-12-07 2023-04-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
TWI747936B (zh) 2015-12-18 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 抗ｃ５抗體及使用方法
CA3006529A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
CN108602883A (zh) 2016-01-20 2018-09-28 基因泰克公司 用于阿尔茨海默氏病的高剂量治疗
AU2017213826A1 (en) 2016-02-04 2018-08-23 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
KR20180119632A (ko) 2016-02-29 2018-11-02 제넨테크, 인크. 암에 대한 치료 및 진단 방법
EP4112641A1 (en) 2016-03-15 2023-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-gpc3 antibodies
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
JP6887613B2 (ja) * 2016-03-31 2021-06-16 国立大学法人東北大学 がん微小環境を標的とした抗ポドカリキシン抗体
US20170319688A1 (en) 2016-04-14 2017-11-09 Genentech, Inc. Anti-rspo3 antibodies and methods of use
KR20230162730A (ko) 2016-04-15 2023-11-28 바이오아트라, 인코퍼레이티드 항 Axl항체 및 이의 면역접합체와 이것들의 용도
AU2017250296A1 (en) 2016-04-15 2018-11-01 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
AU2017248766A1 (en) 2016-04-15 2018-11-01 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
UA123323C2 (uk) 2016-05-02 2021-03-17 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Димерний злитий поліпептид
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
CN109071640B (zh) 2016-05-11 2022-10-18 豪夫迈·罗氏有限公司 经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法
US11254742B2 (en) 2016-05-13 2022-02-22 Bioatla, Inc. Anti-Ror2 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
US20200123237A1 (en) 2016-05-18 2020-04-23 Genmab B.V. Antibodies and methods of use thereof in treatment of infectious disease
JP2019522633A (ja) 2016-05-20 2019-08-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｒｏｔａｃ抗体コンジュゲート及び使用方法
US20170370906A1 (en) 2016-05-27 2017-12-28 Genentech, Inc. Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates
ES2963807T3 (es) 2016-06-08 2024-04-02 Xencor Inc Tratamiento de enfermedades relacionadas con la IgG4 con anticuerpos anti-CD19 de reticulación a CD32B
IL263542B1 (en) 2016-06-14 2024-06-01 Xencor Inc Bispecific antibodies inhibit immunological checkpoint
WO2017223405A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
WO2018005706A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
EP3484923A1 (en) 2016-07-15 2019-05-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods and materials for assessing response to plasmablast- and plasma cell-depleting therapies
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
KR102553195B1 (ko) 2016-07-29 2023-07-07 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 항-cd19 항체에 대한 항-이디오타입 항체
MX2018015721A (es) 2016-07-29 2019-05-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos biespecificos que exhiben actividad de funcion de cofactor fviii alternativa mejorada.
NL2017270B1 (en) 2016-08-02 2018-02-09 Aduro Biotech Holdings Europe B V New anti-hCTLA-4 antibodies
JP6527643B2 (ja) 2016-08-05 2019-06-05 中外製薬株式会社 Ｉｌ−８関連疾患の治療用又は予防用組成物
EP3497129A1 (en) 2016-08-08 2019-06-19 H. Hoffnabb-La Roche Ag Therapeutic and diagnostic methods for cancer
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US11168148B2 (en) 2016-09-07 2021-11-09 The Regents Of The University Of California Antibodies to oxidation-specific epitopes
WO2018053032A1 (en) 2016-09-13 2018-03-22 Humanigen, Inc. Epha3 antibodies for the treatment of pulmonary fibrosis
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
JP6976315B2 (ja) 2016-09-19 2021-12-08 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 補体因子に基づくアフィニティークロマトグラフィー
AU2017330405B2 (en) 2016-09-23 2024-02-01 Genentech, Inc. Uses of IL-13 antagonists for treating atopic dermatitis
MX2019003768A (es) 2016-10-03 2019-06-24 Juno Therapeutics Inc Moleculas de enlace especificas de hpv.
EP3522933B1 (en) 2016-10-05 2021-12-15 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for preparing antibody drug conjugates
AU2017339517B2 (en) 2016-10-06 2024-03-14 Foundation Medicine, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
US20190330368A1 (en) 2016-10-07 2019-10-31 Daiichi Sankyo Company, Limited Therapy for drug-resistant cancer by administration of anti-her2 antibody/drug conjugate
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
AU2017342559B2 (en) 2016-10-14 2022-03-24 Xencor, Inc. Bispecific heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ralpha Fc-fusion proteins and PD-1 antibody fragments
CN110267678A (zh) 2016-10-29 2019-09-20 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗mic抗体和使用方法
CN110461868A (zh) 2016-11-01 2019-11-15 根马布私人有限公司 多肽变体及其用途
MY195110A (en) 2016-11-02 2023-01-10 Jounce Therapeutics Inc Antibodies to PD-1 and uses Thereof
CN110167964B (zh) 2016-11-02 2023-12-01 百时美施贵宝公司 组合用于治疗多发性骨髓瘤的针对bcma和cd3的双特异性抗体和免疫药物
TWI791471B (zh) 2016-11-15 2023-02-11 美商建南德克公司 用於用抗ｃｄ２０/抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
EP3468991A1 (en) 2016-11-21 2019-04-17 cureab GmbH Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
TW201825119A (zh) 2016-11-30 2018-07-16 日商協和醱酵麒麟有限公司 使用抗ccr4抗體及抗pd-1抗體治療癌症之方法
AR110321A1 (es) 2016-12-07 2019-03-20 Genentech Inc Anticuerpos antitau y métodos de uso
JP2020511937A (ja) 2016-12-07 2020-04-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
AU2017375946A1 (en) 2016-12-12 2019-06-20 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using anti-PD-l1 antibodies and antiandrogens
CA3046293A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and immune checkpoint inhibitor
US11618785B2 (en) 2016-12-22 2023-04-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-CD3 antibody and molecules comprising the antibody
JOP20190134A1 (ar) 2016-12-23 2019-06-02 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لنيوروبيلين وطرق استخدامها
AU2017388346A1 (en) 2016-12-26 2019-07-11 Kagoshima University Antibody capable of binding to myelin oligodendrocyte glycoprotein
TW201825515A (zh) 2017-01-04 2018-07-16 美商伊繆諾金公司 Ｍｅｔ抗體以及其免疫結合物及用途
MX2019004692A (es) 2017-01-06 2019-11-08 Eutilex Co Ltd Anticuerpos 4-1bb anti-humano y usos de los mismos.
WO2018132597A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting histone h3 peptide/mhc complexes and uses thereof
EP3572428A4 (en) 2017-01-17 2020-12-30 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-GPR20 ANTIBODY AND ANTI-GPR20 ANTIBODY MEDICINAL CONJUGATE
JPWO2018139404A1 (ja) 2017-01-24 2019-11-14 協和キリン株式会社 放射線障害の治療又は予防剤並びに治療又は予防方法
AU2018218753A1 (en) 2017-02-07 2019-09-26 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-GPRC5D antibody and molecule containing same
US11021535B2 (en) 2017-02-10 2021-06-01 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
AR110873A1 (es) 2017-02-10 2019-05-08 Genentech Inc Anticuerpos contra triptasa, composiciones de estos y usos de estos
MX2019009346A (es) 2017-02-10 2019-10-02 Genmab Bv Variantes de polipeptidos y usos de los mismos.
EP3882271A3 (en) 2017-02-10 2022-01-05 Eutilex Co., Ltd. Ifn-gamma-inducible regulatory t cell convertible anti-cancer (irtca) antibody and uses thereof
TW201834696A (zh) 2017-02-28 2018-10-01 學校法人近畿大學 藉由投予抗her3抗體－藥物複合體之egfr－tki抗性之非小細胞肺癌的治療方法
ES2953595T3 (es) 2017-03-01 2023-11-14 Hoffmann La Roche Procedimientos diagnósticos y terapéuticos para el cáncer
EP3590535A4 (en) 2017-03-02 2020-12-30 St. Marianna University School of Medicine PREVENTIVE OR THERAPEUTIC AGENT AGAINST HTLV-1 ASSOCIATED MYELOPATHY WITH THE USE OF LOW DOSE ANTI-CCR4 ANTIBODIES
CA3056248A1 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Genentech, Inc. Optimized antibody compositions for treatment of ocular disorders
JP2020515543A (ja) 2017-03-28 2020-05-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 神経変性疾患の治療方法
HUE054316T2 (hu) 2017-03-29 2021-08-30 Shionogi & Co Gyógyászati készítmény rák kezelésére
JOP20190203A1 (ar) 2017-03-30 2019-09-03 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لـ tigit وطرق استخدامها
US11306152B2 (en) 2017-03-30 2022-04-19 Tohoku University Anti-podoplanin antibody
TW201839400A (zh) 2017-04-14 2018-11-01 美商建南德克公司 用於癌症之診斷及治療方法
MX2019012419A (es) 2017-04-21 2019-12-05 Genentech Inc Uso de antagonistas de klk5 para el tratamiento de una enfermedad.
JP7295030B2 (ja) 2017-04-26 2023-06-20 ユーリカ セラピューティックス， インコーポレイテッド グリピカン３を特異的に認識するコンストラクト及びその使用
CN110799541A (zh) 2017-04-27 2020-02-14 特沙诺有限公司 针对淋巴细胞活化基因-3(lag-3)的抗体药剂及其用途
US11116835B2 (en) 2017-05-10 2021-09-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Epstein Barr virus antibodies, vaccines, and uses of the same
TW202330036A (zh) 2017-05-15 2023-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之製造方法
EP3624837A1 (en) 2017-05-16 2020-03-25 Five Prime Therapeutics, Inc. Anti-fgfr2 antibodies in combination with chemotherapy agents in cancer treatment
WO2019006472A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Xencor, Inc. TARGETED HETETRODIMERIC FUSION PROTEINS CONTAINING IL-15 / IL-15RA AND ANTIGEN-BINDING DOMAINS
TW201908341A (zh) 2017-07-18 2019-03-01 日商協和醱酵麒麟有限公司 抗人類ccr1單株抗體
KR20240006698A (ko) 2017-07-21 2024-01-15 제넨테크, 인크. 암에 대한 치료 및 진단 방법
PL3658589T3 (pl) 2017-07-26 2024-03-18 Forty Seven, Inc. Przeciwciała anty-sirp-alfa i powiązane sposoby
SG11202000759XA (en) 2017-07-27 2020-02-27 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-cd147 antibody
EP3673918A4 (en) 2017-08-23 2021-05-19 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTIBODY-DRUG CONJUGATE PREPARATION AND ASSOCIATED LYOPHILIZATION
WO2019040780A1 (en) 2017-08-25 2019-02-28 Five Prime Therapeutics Inc. ANTI-B7-H4 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
WO2019044947A1 (ja) 2017-08-31 2019-03-07 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの改良製造方法
CN117838881A (zh) 2017-08-31 2024-04-09 第一三共株式会社 制备抗体-药物缀合物的新方法
JP7382922B2 (ja) 2017-09-20 2023-11-17 中外製薬株式会社 Ｐｄ－１系結合アンタゴニストおよびｇｐｃ３標的化剤を使用する併用療法のための投与レジメン
TWI820044B (zh) 2017-09-29 2023-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－吡咯并苯二氮呯衍生物複合體
MX2020003536A (es) 2017-10-03 2020-09-14 Juno Therapeutics Inc Moleculas de union especifica a virus de papiloma humano (hpv).
TW201927336A (zh) 2017-10-05 2019-07-16 日商第一三共股份有限公司 細胞毒性ｔ細胞耗竭用組成物
CA3078974A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Immunowake Inc. Vegfr-antibody light chain fusion protein
BR112020008323A2 (pt) 2017-11-01 2020-11-03 Juno Therapeutics Inc anticorpos e receptores de antígenos quiméricos específicos para antígeno de maturação de células b
KR20200075860A (ko) 2017-11-06 2020-06-26 제넨테크, 인크. 암의 진단 및 치료 방법
JP7311425B2 (ja) 2017-11-08 2023-07-19 協和キリン株式会社 ＣＤ４０とＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3082383A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
US10875915B2 (en) 2017-12-01 2020-12-29 Pfizer Inc. Anti-CXCR5 antibodies and compositions and uses thereof
US11485779B2 (en) 2017-12-12 2022-11-01 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-BMP10 monoclonal antibody or fragment thereof
US12006356B2 (en) 2017-12-15 2024-06-11 Juno Therapeutics, Inc. Anti-CCT5 binding molecules and chimeric antigen receptors comprising the same
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
US20190211098A1 (en) 2017-12-22 2019-07-11 Genentech, Inc. Use of pilra binding agents for treatment of a disease
SG11202004806SA (en) 2017-12-22 2020-06-29 Jounce Therapeutics Inc Antibodies to lilrb2
CN111542543B (zh) 2017-12-28 2023-12-22 南京传奇生物科技有限公司 针对pd-l1的抗体及其变体
CA3082280A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
EP3724223A1 (en) 2018-01-02 2020-10-21 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
JP7426724B2 (ja) 2018-01-05 2024-02-02 エイシー イミューン ソシエテ アノニム ミスフォールドされたｔｄｐ－４３結合分子
TWI802633B (zh) 2018-01-15 2023-05-21 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對pd-1之單域抗體及其變異體
CA3088649A1 (en) 2018-01-16 2019-07-25 Lakepharma, Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
MA51676A (fr) 2018-01-26 2021-05-05 Hoffmann La Roche Protéines de fusion il-22 fc et procédés d'utilisation
KR20200125590A (ko) 2018-01-26 2020-11-04 제넨테크, 인크. 조성물 및 사용 방법
AU2019214183B2 (en) 2018-02-01 2022-04-07 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Fully human anti-B cell maturation antigen (BCMA) single chain variable fragment, and application thereof
AR115360A1 (es) 2018-02-08 2021-01-13 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno y métodos de uso
KR102417088B1 (ko) 2018-02-09 2022-07-07 제넨테크, 인크. 비만 세포 매개 염증성 질환에 대한 치료 및 진단 방법
WO2019158645A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 Abba Therapeutics Ag Anti-human pd-l2 antibodies
BR112020016986A2 (pt) 2018-02-21 2021-03-02 Five Prime Therapeutics, Inc. formulações de anticorpo contra b7-h4
MA51907A (fr) 2018-02-21 2021-05-26 Hoffmann La Roche Posologie pour un traitement avec des protéines de fusion il-22 fc
AU2019226034A1 (en) 2018-02-21 2020-10-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to HIV-1 Env and their use
SG11202007820QA (en) 2018-02-21 2020-09-29 Five Prime Therapeutics Inc B7-h4 antibody dosing regimens
CN111836831A (zh) 2018-02-26 2020-10-27 豪夫迈·罗氏有限公司 用于抗tigit拮抗剂抗体和抗pd-l1拮抗剂抗体治疗的给药
AU2019228600A1 (en) 2018-03-02 2020-09-24 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-H4 antibodies and methods of use thereof
CA3093205A1 (en) 2018-03-05 2019-09-12 Saitama Medical University Pharmaceutical composition for treating or preventing heterotopic ossification
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
JP2021515583A (ja) 2018-03-14 2021-06-24 ベイジン シュアンイー ファーマサイエンシーズ カンパニー， リミテッド 抗クローディン１８．２抗体
JP7377590B2 (ja) 2018-03-14 2023-11-10 ノビミューン エスアー 抗ｃｄ３イプシロン抗体およびそれを使用する方法
SG11202009010RA (en) 2018-03-15 2020-10-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use
EP3774917A4 (en) 2018-03-30 2022-01-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AGAINST LAG-3 AND USES THEREOF
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
MA52193A (fr) 2018-04-05 2021-02-17 Juno Therapeutics Inc Récepteurs de lymphocytes t et cellules modifiées les exprimant
CN110373374B (zh) * 2018-04-12 2023-07-07 上海颢哲信息科技有限公司 一种降低抗体核心岩藻糖基化的方法和组合物
JP2021521784A (ja) 2018-04-18 2021-08-30 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＦｃ融合タンパク質とＰＤ−１抗原結合ドメインを含むＰＤ−１標的化ヘテロダイマー融合タンパク質およびそれらの使用
US11505595B2 (en) 2018-04-18 2022-11-22 Xencor, Inc. TIM-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15RA Fc-fusion proteins and TIM-3 antigen binding domains
US20210230255A1 (en) 2018-04-27 2021-07-29 Fondazione Ebri Rita Levi-Montalcini Antibody directed against a tau-derived neurotoxic peptide and uses thereof
CA3098486A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
EP3804764A4 (en) 2018-05-28 2022-04-06 Daiichi Sankyo Company, Limited TREATMENT OF HER2 MUTANT CANCER BY ADMINISTRATION OF ANTI-HER2 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
KR20210018192A (ko) 2018-05-31 2021-02-17 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항인간 tlr7 항체
JP2021525806A (ja) 2018-06-01 2021-09-27 タユー ファシャ バイオテック メディカル グループ カンパニー， リミテッド 疾患または状態を処置するための組成物およびそれらの使用
EP3805400A4 (en) 2018-06-04 2022-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule showing changed half-life in cytoplasm
US20210127649A1 (en) * 2018-06-07 2021-05-06 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Transgenic mouse for aglycosylated antibody production and use of aglycosylated antibody produced therefrom
CN112469440A (zh) 2018-06-18 2021-03-09 优瑞科生物技术公司 靶向前列腺特异性膜抗原(psma)的构建体和其用途
US20200030443A1 (en) 2018-06-23 2020-01-30 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor
JP7397445B2 (ja) 2018-06-26 2023-12-13 協和キリン株式会社 Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ３に結合する抗体
US11965035B2 (en) 2018-06-26 2024-04-23 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody binding to chondroitin sulfate proteoglycan 5
SG11202013138RA (en) 2018-07-02 2021-01-28 Amgen Inc Anti-steap1 antigen-binding protein
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
PE20211858A1 (es) 2018-07-13 2021-09-21 Genmab As Variantes de anticuerpos anti-cd38 y sus usos
JP2021526845A (ja) 2018-07-13 2021-10-11 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ３８抗体を使用したトロゴサイトーシスを介した治療
WO2020018789A1 (en) 2018-07-18 2020-01-23 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, an antimetabolite, and a platinum agent
MX2021000745A (es) 2018-07-20 2021-03-26 Surface Oncology Inc Composiciones anti-cd112r y metodos.
AU2019311557A1 (en) 2018-07-25 2021-02-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
BR112021001509A2 (pt) 2018-07-31 2021-04-27 Daiichi Sankyo Company, Limited agente terapêutico para um tumor de cérebro metastásico
SG11202101152QA (en) 2018-08-03 2021-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule containing two antigen-binding domains that are linked to each other
CN112512587A (zh) 2018-08-06 2021-03-16 第一三共株式会社 抗体药物缀合物和微管蛋白抑制剂的组合
CA3051549A1 (en) 2018-08-09 2020-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing binding affinity of an antibody variant to the neonatal fc receptor
CN112839960A (zh) 2018-08-10 2021-05-25 中外制药株式会社 抗cd137抗原结合分子及其应用
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
EP3842546A4 (en) 2018-08-23 2022-06-29 Daiichi Sankyo Company, Limited Sensitivity marker for antibody-drug conjugate
CA3110254C (en) * 2018-08-29 2023-08-29 United Biopharma Inc Afucosylated antibodies and manufacture thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
EP4268831A3 (en) 2018-09-12 2024-05-22 Fred Hutchinson Cancer Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
KR20210063330A (ko) 2018-09-19 2021-06-01 제넨테크, 인크. 방광암에 대한 치료 및 진단 방법
KR20210062005A (ko) 2018-09-20 2021-05-28 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 her3 항체-약물 콘쥬게이트 투여에 의한 her3 변이암의 치료
JP7475687B2 (ja) 2018-09-21 2024-04-30 国立大学法人 東京医科歯科大学 ヒトｈｍｇｂ１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体、及びそれを含有するアルツハイマー病を治療又は予防するための医薬組成物
JP7475336B2 (ja) 2018-09-21 2024-04-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド トリプルネガティブ乳癌のための診断方法
TW202028467A (zh) 2018-09-28 2020-08-01 日商協和麒麟股份有限公司 抗體組合物
WO2020072821A2 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
JP2022503886A (ja) 2018-10-05 2022-01-12 ファイブ プライム セラピューティクス， インコーポレイテッド 抗ｆｇｆｒ２抗体製剤
AU2019361923A1 (en) 2018-10-15 2021-06-03 Five Prime Therapeutics, Inc. Combination therapy for cancer
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
EP3867646A1 (en) 2018-10-18 2021-08-25 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic and therapeutic methods for sarcomatoid kidney cancer
WO2020089437A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Engmab Sàrl Combination therapy
SG11202104993SA (en) 2018-11-14 2021-06-29 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-cdh6 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
MX2021005751A (es) 2018-11-16 2021-10-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anticuerpos contra mucina 16 y métodos de uso de los mismos.
KR20210100656A (ko) 2018-12-05 2021-08-17 제넨테크, 인크. 암 면역요법을 위한 진단 방법 및 조성물
MX2021006573A (es) 2018-12-06 2021-07-15 Genentech Inc Tratamiento conjunto de linfoma difuso de linfocitos b grandes que comprende un inmunoconjugado anti-cd79b, un agente alquilante y un anticuerpo anti-cd20.
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
KR20210102341A (ko) 2018-12-11 2021-08-19 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 컨쥬게이트와 parp 저해제의 조합
EP3883609A2 (en) 2018-12-20 2021-09-29 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Ebola virus glycoprotein-specific monoclonal antibodies and uses thereof
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
EP3898667A2 (en) 2018-12-20 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Modified antibody fcs and methods of use
CA3120474A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 23Andme, Inc. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
US20220040324A1 (en) 2018-12-21 2022-02-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and kinase inhibitor
US20220064312A1 (en) 2018-12-27 2022-03-03 Shionogi & Co., Ltd. Novel Anti-CCR8 Antibody
MX2021007797A (es) 2018-12-28 2021-10-26 Kyowa Kirin Co Ltd Anticuerpo biespecifico que se une al receptor de transferrina (tfr).
WO2020141145A1 (en) 2018-12-30 2020-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-rabbit cd19 antibodies and methods of use
TW202043272A (zh) 2019-01-14 2020-12-01 美商建南德克公司 使用pd-1軸結合拮抗劑及rna疫苗治療癌症之方法
EP3915581A4 (en) 2019-01-24 2023-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha NOVEL CANCER ANTIGENS AND ANTIBODIES OF THESE ANTIGENS
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
PE20212198A1 (es) 2019-01-29 2021-11-16 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos y receptores quimericos de antigenos especificos para receptor 1 huerfano tipo receptor tirosina-cinasa (ror1)
EP3931220A1 (en) 2019-02-27 2022-01-05 F. Hoffmann-La Roche AG Dosing for treatment with anti-tigit and anti-cd20 or anti-cd38 antibodies
SG11202109406TA (en) 2019-03-01 2021-09-29 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
CA3126728A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Genentech, Inc. Methods for detecting and quantifying membrane-associated proteins on extracellular vesicles
WO2020186176A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Genentech, Inc. Treatment of cancer with her2xcd3 bispecific antibodies in combination with anti-her2 mab
EP3943108A4 (en) 2019-03-19 2023-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING AN ANTIGEN-BINDING DOMAIN WHOSE ANTIGEN-BINDING ACTIVITY IS ALTERED DEPENDING ON THE MTA, AND BANK FOR OBTAINING SUCH ANTIGEN-BINDING DOMAIN
JPWO2020196474A1 (ru) 2019-03-25 2020-10-01
EP3949987A4 (en) 2019-03-25 2023-02-22 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-HER2 ANTIBODY PYRROLOBENZODIAZEPINE DERIVATIVE CONJUGATE
EP3949988A4 (en) 2019-03-27 2022-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF AN ANTIBODY-DERIVATIVE CONJUGATE OF PYRROLOBENZODIAZEPINE AND A PARP INHIBITOR
WO2020198731A2 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Danisco Us Inc Engineered antibodies
AU2020258480A1 (en) 2019-04-19 2021-10-21 Genentech, Inc. Anti-mertk antibodies and their methods of use
CN114269376A (zh) 2019-05-03 2022-04-01 豪夫迈·罗氏有限公司 用抗pd-l1抗体治疗癌症的方法
EP3962523A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
MX2021013825A (es) 2019-05-14 2022-01-18 Genentech Inc Procedimientos de uso de inmunoconjugados anti-cd79b para tratar el linfoma folicular.
WO2020230899A1 (ja) 2019-05-15 2020-11-19 協和キリン株式会社 Ｃｄ４０とｆａｐに結合するバイスペシフィック抗体
TW202108625A (zh) 2019-05-15 2021-03-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd40及gpc3結合之雙專一性抗體
US20230085439A1 (en) 2019-05-21 2023-03-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Antibodies that bind human metapneumovirus fusion protein and their use
BR112021023487A2 (pt) 2019-05-23 2022-02-08 Ac Immune Sa Moléculas de ligação anti-tdp-43 e usos das mesmas
AU2020285681A1 (en) 2019-05-29 2022-01-27 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage of an antibody-drug conjugate
EA202290208A1 (ru) 2019-07-02 2022-03-25 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Эмерика, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретэри, Дипартмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТ EGFRvIII, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
JPWO2021020282A1 (ru) 2019-07-26 2021-02-04
CA3148740A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Aprinoia Therapeutics Limited Antibodies that bind to pathological tau species and uses thereof
EP4028054A1 (en) 2019-09-12 2022-07-20 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
TW202124425A (zh) 2019-09-13 2021-07-01 日商協和麒麟股份有限公司 DcR3改型體
WO2021055694A1 (en) 2019-09-20 2021-03-25 Genentech, Inc. Dosing for anti-tryptase antibodies
PE20221110A1 (es) 2019-09-27 2022-07-11 Genentech Inc Administracion de dosis para tratamiento con anticuerpos antagonistas anti-tigit y anti-pd-l1
EP4045090A1 (en) 2019-10-18 2022-08-24 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
EP4049675A4 (en) 2019-10-25 2023-11-22 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF ANTI-GARP ANTIBODY AND IMMUNOREGULATOR
CN115066613A (zh) 2019-11-06 2022-09-16 基因泰克公司 用于治疗血液癌症的诊断和治疗方法
JP2023504736A (ja) 2019-12-06 2023-02-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｇｐｒｃ５ｄ標的結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体ならびに関連する組成物および方法
WO2021113776A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to bcma-targeted binding domains and related compositions and methods
KR20220113790A (ko) 2019-12-13 2022-08-16 제넨테크, 인크. 항-ly6g6d 항체 및 사용 방법
CN115279388A (zh) 2019-12-20 2022-11-01 百时美施贵宝公司 岩藻糖基化抑制剂用于生产无岩藻糖基化抗体的用途
AR120898A1 (es) 2019-12-26 2022-03-30 Univ Osaka Agente para tratar o prevenir neuromielitis óptica en fase aguda
CN113045655A (zh) 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
US20230058982A1 (en) 2019-12-27 2023-02-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-ctla-4 antibody and use thereof
CN110818795B (zh) 2020-01-10 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗tigit抗体和使用方法
EP4091632A1 (en) 2020-01-15 2022-11-23 Osaka University Agent for prevention or treatment of diabetic autonomic neuropathy
US20230090965A1 (en) 2020-01-15 2023-03-23 Osaka University Prophylactic or therapeutic agent for dementia
IL294453A (en) 2020-01-16 2022-09-01 Genmab As Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2022050954A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
MX2022009391A (es) 2020-01-31 2022-09-26 Genentech Inc Metodos para inducir linfocitos t especificos para neoepitopo con un antagonista de union al eje de pd-1 y una vacuna de arn.
JP2023513059A (ja) 2020-01-31 2023-03-30 ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション 抗ミューラー管ホルモン受容体２抗体及び使用方法
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
US11692038B2 (en) 2020-02-14 2023-07-04 Gilead Sciences, Inc. Antibodies that bind chemokine (C-C motif) receptor 8 (CCR8)
TW202140561A (zh) 2020-02-14 2021-11-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd3結合之雙特異性抗體
EP4093762A1 (en) 2020-02-20 2022-11-30 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Epstein-barr virus monoclonal antibodies and uses thereof
WO2021170071A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-cd137 constructs, multispecific antibody and uses thereof
BR112022016491A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-11 Shanghai Henlius Biotech Inc Construto anti-cd137 e usos do mesmo
IL296256A (en) 2020-03-13 2022-11-01 Genentech Inc Antibodies against interleukin-33 and uses thereof
CN117551194A (zh) 2020-03-19 2024-02-13 基因泰克公司 同种型选择性抗TGF-β抗体及使用方法
TW202144419A (zh) 2020-03-24 2021-12-01 美商建南德克公司 Ｔｉｅ２結合劑及其使用方法
JP7285495B2 (ja) 2020-03-30 2023-06-02 国立大学法人三重大学 二重特異的抗体
EP4130036A4 (en) 2020-03-30 2024-05-15 National Cancer Center ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
TW202204401A (zh) 2020-04-01 2022-02-01 日商協和麒麟股份有限公司 抗體組合物
EP4127724A1 (en) 2020-04-03 2023-02-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
IL297541A (en) 2020-04-24 2022-12-01 Genentech Inc Methods for using anti-cd79b immunoconjugates
AU2021262744A1 (en) 2020-04-27 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Isoform-independent antibodies to lipoprotein(a)
CN115885050A (zh) 2020-04-28 2023-03-31 基因泰克公司 用于非小细胞肺癌免疫疗法的方法和组合物
EP4146283A1 (en) 2020-05-03 2023-03-15 Levena (Suzhou) Biopharma Co., Ltd. Antibody-drug conjugates (adcs) comprising an anti-trop-2 antibody, compositions comprising such adcs, as well as methods of making and using the same
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
KR20230010749A (ko) 2020-05-17 2023-01-19 아스트라제네카 유케이 리미티드 Sars-cov-2 항체 및 이를 선택 및 이용하는 방법
EP4157881A1 (en) 2020-05-27 2023-04-05 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing nerve growth factor and uses thereof
KR20230018425A (ko) 2020-05-29 2023-02-07 23앤드미 인코포레이티드 항-cd200r1 항체 및 이의 사용 방법
CN116529260A (zh) 2020-06-02 2023-08-01 当康生物技术有限责任公司 抗cd93构建体及其用途
CA3185858A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-cd93 constructs and uses thereof
WO2021252977A1 (en) 2020-06-12 2021-12-16 Genentech, Inc. Methods and compositions for cancer immunotherapy
CA3181820A1 (en) 2020-06-16 2021-12-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating triple-negative breast cancer
BR112022025801A2 (pt) 2020-06-18 2023-10-03 Hoffmann La Roche Métodos para tratar um paciente e para tratar um paciente com escc avançado, kit, anticorpo, uso de um anticorpo e uso de um antagonista de ligação
CN116234824A (zh) 2020-06-22 2023-06-06 阿尔米雷尔有限公司 抗il-36抗体及其使用方法
CN116670285A (zh) 2020-06-23 2023-08-29 江苏康缘药业股份有限公司 抗cd38抗体及其用途
WO2021260582A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
WO2021260578A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and cdk9 inhibitor
WO2021260583A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
KR20230043109A (ko) 2020-06-24 2023-03-30 아스트라제네카 유케이 리미티드 항체-약물 접합체 및 atr 억제제의 조합
JP2023539715A (ja) 2020-06-24 2023-09-19 アストラゼネカ ユーケー リミテッド 抗体－薬物コンジュゲートとａｔｍ阻害剤との組合わせ
US20230256092A1 (en) 2020-06-30 2023-08-17 Shionogi & Co., Ltd. Combined use of anti-ccr8 antibody and chemotherapeutic agent
KR20230041023A (ko) 2020-07-17 2023-03-23 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 제조 방법
KR20230042055A (ko) 2020-07-20 2023-03-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 her2 항체-약물 콘주게이트와 her 이량체화 저해제의 조합
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
AU2021315665A1 (en) 2020-07-29 2023-03-16 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-CD93 constructs and uses thereof
WO2022031749A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for lymphoma
WO2022029660A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to ror1-targeted binding domains and related compositions and methods
MX2023001440A (es) 2020-08-07 2023-03-06 Genentech Inc Proteinas de fusion del ligando para flt3 y metodos de uso.
JP2023537078A (ja) 2020-08-10 2023-08-30 アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド ＣＯＶＩＤ－１９を治療及び防止するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体
WO2022034228A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Ac Immune Sa Humanized anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
IL300666A (en) 2020-08-19 2023-04-01 Xencor Inc ANTI–CD28 COMPOSITIONS
WO2022043517A2 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Cureab Gmbh Anti-golph2 antibodies for macrophage and dendritic cell differentiation
KR20230066094A (ko) 2020-09-12 2023-05-12 아스트라제네카 유케이 리미티드 항-her2 항체-약물 접합체 치료법을 위한 채점 방법
AU2021341526A1 (en) 2020-09-14 2023-04-27 Ichnos Sciences SA Antibodies that bind to il1rap and uses thereof
IL301547A (en) 2020-10-05 2023-05-01 Genentech Inc Dosage for treatment with bispecific anti-FCRH5/anti-CD3 antibodies
US20230372527A1 (en) 2020-10-09 2023-11-23 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
CN116685325A (zh) 2020-10-20 2023-09-01 豪夫迈·罗氏有限公司 Pd-1轴结合拮抗剂和lrrk2抑制剂的组合疗法
AU2021366287A1 (en) 2020-10-20 2023-04-13 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to Gremlin-1 and uses thereof
WO2022093981A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ptpn22 inhibitors and pd-l1 binding antagonists
WO2022098628A2 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Genentech, Inc. Subcutaneous dosing of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
MX2023005132A (es) 2020-11-04 2023-05-25 Genentech Inc Dosificacion para el tratamiento con anticuerpos biespecificos anti-cd20/anti-cd3.
EP4240493A2 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and anti-cd79b antibody drug conjugates
WO2022102634A1 (ja) 2020-11-11 2022-05-19 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートと抗ＳＩＲＰα抗体の組み合わせ
EP4245322A1 (en) 2020-11-12 2023-09-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment for mesothelioma through administration of anti-b7-h3 antibody-drug conjugate
AU2021387127A1 (en) 2020-11-30 2023-06-22 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Her2 targeting agent
JPWO2022124247A1 (ru) 2020-12-09 2022-06-16
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
WO2022132904A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
WO2022140797A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
MX2023008285A (es) 2021-01-13 2023-09-12 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Conjugado de anticuerpo anti-dll3-farmaco.
JP2024503657A (ja) 2021-01-13 2024-01-26 メモリアル スローン－ケタリング キャンサー センター 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
WO2022162203A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Vaccinvent Gmbh Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
CN117120084A (zh) 2021-01-28 2023-11-24 维肯芬特有限责任公司 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段
CA3206395A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Hassan JUMAA-WEINACHT Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
IL304955A (en) 2021-02-09 2023-10-01 Us Health Antibodies targeting the spike protein of a coronavirus
CA3210753A1 (en) 2021-02-09 2022-08-18 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Human monoclonal antibodies against pneumococcal antigens
IL305181A (en) 2021-02-15 2023-10-01 Takeda Pharmaceuticals Co Cell therapy compositions and methods for modulating TGF-B signaling
AR124914A1 (es) 2021-02-18 2023-05-17 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Nuevo anticuerpo anti-pad4
US20220378929A1 (en) 2021-02-25 2022-12-01 MediBoston Limted Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
US20240181073A1 (en) 2021-03-03 2024-06-06 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-Drug Conjugates Comprising an Anti-BCMA Antibody
EP4301472A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Dynamicure Biotechnology LLC Anti-vista constructs and uses thereof
CN117157319A (zh) 2021-03-09 2023-12-01 Xencor股份有限公司 结合cd3和cldn6的异二聚抗体
JP2024518013A (ja) 2021-03-10 2024-04-24 イミュノウェイク インコーポレイテッド 免疫調節分子及びその使用
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
BR112023018621A2 (pt) 2021-03-15 2023-10-24 Hoffmann La Roche Métodos para tratar nefrite lúpica, esgotar células b periféricas, kits para tratar nefrite lúpica e anticorpos anti-cd20 tipo ii
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
CN117616041A (zh) 2021-03-25 2024-02-27 当康生物技术有限责任公司 抗-igfbp7构建体及其用途
IL305818A (en) 2021-03-29 2023-11-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Multispecific stable compound and its use
AR125344A1 (es) 2021-04-15 2023-07-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-c1s
TW202243689A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及抗ｃｄ７８ｂ抗體藥物結合物的組合治療之給藥
TW202310876A (zh) 2021-05-12 2023-03-16 美商建南德克公司 使用抗ｃｄ７９ｂ免疫結合物治療瀰漫性大ｂ細胞淋巴瘤之方法
TW202306993A (zh) 2021-05-14 2023-02-16 美商建南德克公司 Ｔｒｅｍ２之促效劑
TW202306994A (zh) 2021-06-04 2023-02-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ddr2抗體及其用途
EP4351582A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 F. Hoffmann-La Roche AG Combination of a particular braf inhibitor (paradox breaker) and a pd-1 axis binding antagonist for use in the treatment of cancer
WO2022266660A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
TW202311291A (zh) 2021-06-25 2023-03-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ctla-4抗體的用途
IL309115A (en) 2021-06-25 2024-02-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-CTLA-4 antibodies
WO2023283611A1 (en) 2021-07-08 2023-01-12 Staidson Biopharma Inc. Antibodies specifically recognizing tnfr2 and uses thereof
KR20240058075A (ko) 2021-07-14 2024-05-03 스테이드슨 (베이징) 바이오팔마슈티칼스 캄퍼니 리미티드 Cd40을 특이적으로 식별하는 항체 및 이의 응용
WO2023004386A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Genentech, Inc. Brain targeting compositions and methods of use thereof
WO2023019092A1 (en) 2021-08-07 2023-02-16 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
CN117897409A (zh) 2021-08-13 2024-04-16 基因泰克公司 抗类胰蛋白酶抗体的给药
CN117858905A (zh) 2021-08-19 2024-04-09 豪夫迈·罗氏有限公司 多价抗变体fc区抗体及使用方法
KR20240049285A (ko) 2021-08-26 2024-04-16 쿄와 기린 가부시키가이샤 Cd116 및 cd131에 결합하는 이중 특이적 항체
IL310382A (en) 2021-08-27 2024-03-01 Genentech Inc Methods for treating tau pathologies
WO2023034750A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
AR127743A1 (es) 2021-09-06 2024-02-28 Genmab Bv Anticuerpos capaces de unirse a cd27, variantes y usos de los mismos
WO2023042097A1 (en) 2021-09-15 2023-03-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate for use in methods of treating chemotherapy-resistant cancer
CA3232223A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Ying Fu Synthetic humanized llama nanobody library and use thereof to identify sars-cov-2 neutralizing antibodies
TW202321308A (zh) 2021-09-30 2023-06-01 美商建南德克公司 使用抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ３８抗體及ｐｄ—１軸結合拮抗劑治療血液癌症的方法
KR20240082388A (ko) 2021-10-08 2024-06-10 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 프리필드 시린지 제제의 조제 방법
AU2022368385A1 (en) 2021-10-18 2024-04-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-cd37 antibody-drug conjugate
TW202342095A (zh) 2021-11-05 2023-11-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 用於治療和預防ｃｏｖｉｄ—１９之組成物
AU2022379952A1 (en) 2021-11-05 2024-05-16 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigens, and their uses
WO2023086807A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
TW202334202A (zh) 2021-11-16 2023-09-01 瑞士商Ａｃ免疫有限公司 用於治療和診斷的新分子
TW202337494A (zh) 2021-11-16 2023-10-01 美商建南德克公司 用莫蘇妥珠單抗治療全身性紅斑狼瘡（ｓｌｅ）之方法及組成物
CA3238116A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Matthew Simon SUNG Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
TW202334238A (zh) 2021-11-30 2023-09-01 日商第一三共股份有限公司 蛋白酶分解性遮蔽抗體
WO2023109901A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use
WO2023109900A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies, multispecific antibodies and methods of use
TW202333800A (zh) 2021-12-28 2023-09-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及rasg12c抑制劑之組合
TW202339805A (zh) 2021-12-28 2023-10-16 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及atr抑制劑之組合
AR128222A1 (es) 2022-01-07 2024-04-10 Johnson & Johnson Entpr Innovation Inc MATERIALES Y MÉTODOS DE PROTEÍNAS DE UNIÓN A IL-1b
WO2023139292A1 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Cambridge Enterprise Limited Tau therapy
WO2023154824A1 (en) 2022-02-10 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that broadly target coronaviruses
AR128540A1 (es) 2022-02-16 2024-05-22 Ac Immune Sa Moléculas de unión anti-tdp-43 humanizadas y usos de las mismas
WO2023159182A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Rakuten Medical, Inc. Anti-programmed death-ligand 1 (pd-l1) antibody molecules, encoding polynucleotides, and methods of use
WO2023173026A1 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2023175483A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Astrazeneca Uk Limited A scoring method for an anti-trop2 antibody‑drug conjugate therapy
US20230414750A1 (en) 2022-03-23 2023-12-28 Hoffmann-La Roche Inc. Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
WO2023192827A1 (en) 2022-03-26 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023192881A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023191816A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023194565A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
WO2023201299A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
TW202404637A (zh) 2022-04-13 2024-02-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體之醫藥組成物及使用方法
WO2023203177A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof
TW202400140A (zh) 2022-04-27 2024-01-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物與ezh1及/或ezh2抑制劑之組合
WO2023209177A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same
TW202406934A (zh) 2022-05-03 2024-02-16 美商建南德克公司 抗Ｌｙ６Ｅ抗體、免疫結合物及其用途
WO2023219613A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023218378A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of an antibody specific for a tumor antigen and a cd47 inhibitor
WO2023228095A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage regimen of an anti-cdh6 antibody-drug conjugate
WO2023235699A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to lilrb4 and uses thereof
WO2023240058A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for cancer
WO2023237706A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Cross-specific antibodies, uses and methods for discovery thereof
WO2024015897A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020432A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020407A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Staidson Biopharma Inc. Antibodies specifically recognizing b- and t-lymphocyte attenuator (btla) and uses thereof
WO2024020564A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024023750A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and bispecific checkpoint inhibitor
WO2024030829A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind to the underside of influenza viral neuraminidase
WO2024028732A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Cd98 binding constructs for treating brain tumors
WO2024028731A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Transferrin receptor binding proteins for treating brain tumors
WO2024037633A2 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd Formulations comprising g-csf and uses thereof
WO2024044779A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3)
WO2024049949A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
WO2024054929A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof
WO2024054822A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineered sars-cov-2 antibodies with increased neutralization breadth
WO2024064826A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
WO2024091991A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for multiple myeloma
WO2024097741A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Gilead Sciences, Inc. Anticancer therapies using anti-ccr8 antibody, chemo and immunotherapy combinations
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
WO2024100200A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Cis Pharma Ag Anti-l1-cam antibodies and their uses for diagnostic and therapeutic applications
WO2024108053A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof
WO2024116094A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugates and dnmt inhibitors
CN116200329B (zh) * 2023-02-22 2023-08-29 洛阳赛奥生物工程技术有限公司 一种无血清昆虫培养基及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997027303A1 (fr) * 1996-01-24 1997-07-31 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Alpha-1-6 fucosyltransferases
WO1997037683A1 (en) * 1996-04-10 1997-10-16 Cytel Corporation Nucleic acids encoding gdp-fucose pyrophosphorylase
US5728568A (en) * 1996-11-22 1998-03-17 Genetics Institute, Inc. Human GDP-mannose 4,6 dehydratase
WO1999054342A1 (en) * 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO1999064618A1 (en) * 1998-06-08 1999-12-16 Dcv, Inc., Doing Business As Bio-Technical Resources Vitamin c production in microorganisms and plants
WO2000061739A1 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5613352A (en) 1979-07-02 1981-02-09 Tokan Kogyo Co Ltd Easily openable container
DE3382838T2 (de) 1983-01-13 2004-04-15 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Transgene dicotyledone Pflanzenzellen und Pflanzen
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
JPS60123857A (ja) 1983-12-09 1985-07-02 Konishiroku Photo Ind Co Ltd 画像形成方法
EP0429093B1 (de) 1984-05-11 2001-08-08 Syngenta Participations AG Transformation von Pflanzenerbgut
ZA872705B (en) 1986-04-22 1987-10-05 Immunex Corporation Human g-csf protein expression
IL84459A (en) 1986-12-05 1993-07-08 Agracetus Apparatus and method for the injection of carrier particles carrying genetic material into living cells
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
JP2928287B2 (ja) 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
JPH02257891A (ja) 1989-03-31 1990-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 組換え動物細胞による蛋白質の製造
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
JP3131322B2 (ja) 1991-12-17 2001-01-31 協和醗酵工業株式会社 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
US5591616A (en) 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
JP3154564B2 (ja) * 1992-09-07 2001-04-09 科学技術振興事業団 モノクローナル抗体の改変方法
ES2233974T3 (es) 1995-09-11 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticuerpo contra la cadena alfa del receptor de la interleucina 5 humana.
JP4550947B2 (ja) * 1997-03-19 2010-09-22 協和発酵キリン株式会社 ガングリオシドｇｍ２に対するヒト型相補性決定領域（ｃｄｒ）移植抗体
JP3991294B2 (ja) 1998-05-06 2007-10-17 株式会社ヴァレオサーマルシステムズ 自動車用空気調和装置のファンユニット
JP2000308526A (ja) 1999-04-28 2000-11-07 Yoshihiro Inomura 鐙型ブラシ
CN100455599C (zh) 2000-03-03 2009-01-28 协和发酵工业株式会社 基因重组抗体及其抗体片段
JP5623683B2 (ja) * 2000-03-22 2014-11-12 フィトン ホールディングス，リミティド ライアビリティ カンパニー 動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
AU2004279736A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition specifically binding to ganglioside GM2
JP6109648B2 (ja) * 2013-05-29 2017-04-05 株式会社ぐるなび 鉄道を利用した商品販売支援システム

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997027303A1 (fr) * 1996-01-24 1997-07-31 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Alpha-1-6 fucosyltransferases
WO1997037683A1 (en) * 1996-04-10 1997-10-16 Cytel Corporation Nucleic acids encoding gdp-fucose pyrophosphorylase
US5728568A (en) * 1996-11-22 1998-03-17 Genetics Institute, Inc. Human GDP-mannose 4,6 dehydratase
WO1999054342A1 (en) * 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO1999064618A1 (en) * 1998-06-08 1999-12-16 Dcv, Inc., Doing Business As Bio-Technical Resources Vitamin c production in microorganisms and plants
WO2000061739A1 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Furukawa Kiyoshi, Seitai ni okeru Totanpakushitsu Tousa no Kinou Kaiseki, Tanpakushitau Kakusan Kouso, 1998, vol. 43, No. 16, pp. 2309-2317 *
Shitara K. et al. Anew veator for the high level expression of chimeric antibodies in myeloma cells, Journal of Immunological Methods, 1994, vol. 167, pp. 271-278 *

Also Published As

Publication number Publication date
HUS2000035I1 (hu) 2022-11-28
JP2008113663A (ja) 2008-05-22
CA2424602A1 (en) 2003-04-02
JP2011092203A (ja) 2011-05-12
CA2424602C (en) 2012-09-18
CA2785941A1 (en) 2002-04-18
EP1331266B1 (en) 2017-01-04
JP2016185163A (ja) 2016-10-27
CA2953239A1 (en) 2002-04-18
PL362520A1 (en) 2004-11-02
CN103333860A (zh) 2013-10-02
EA200600469A1 (ru) 2006-08-25
CN102311986A (zh) 2012-01-11
JP4740931B2 (ja) 2011-08-03
JP6010147B2 (ja) 2016-10-19
JPWO2002031140A1 (ja) 2004-02-19
ES2651952T3 (es) 2018-01-30
JP6523404B2 (ja) 2019-05-29
JP2014043455A (ja) 2014-03-13
WO2002031140A1 (fr) 2002-04-18
JP5384601B2 (ja) 2014-01-08
JP6270930B2 (ja) 2018-01-31
KR100877676B1 (ko) 2009-01-09
JP5384677B2 (ja) 2014-01-08
JP2015131807A (ja) 2015-07-23
DK2314686T3 (en) 2017-09-11
EP1331266A1 (en) 2003-07-30
JP4290423B2 (ja) 2009-07-08
JP4741011B2 (ja) 2011-08-03
AU2001294198B9 (en) 2008-08-07
CN1894406A (zh) 2007-01-10
EP2314685B1 (en) 2017-09-20
MXPA03002974A (es) 2004-05-05
HUP0402066A2 (hu) 2005-01-28
JP2012087131A (ja) 2012-05-10
JP5815641B2 (ja) 2015-11-17
PL218428B1 (pl) 2014-12-31
HU231090B1 (hu) 2020-07-28
ES2639222T5 (es) 2023-11-24
EP3263702A1 (en) 2018-01-03
JP5301525B2 (ja) 2013-09-25
JP2012085655A (ja) 2012-05-10
JP5547754B2 (ja) 2014-07-16
HUP0402066A3 (en) 2012-09-28
JP2012075441A (ja) 2012-04-19
JP2018078890A (ja) 2018-05-24
EP3690043A1 (en) 2020-08-05
CN103333860B (zh) 2015-07-08
AU9419801A (en) 2002-04-22
EP2314686A1 (en) 2011-04-27
BR0114475A (pt) 2003-12-23
EP1331266A4 (en) 2005-07-13
EA200300443A1 (ru) 2003-10-30
KR20030081312A (ko) 2003-10-17
JP2009142288A (ja) 2009-07-02
CN102311986B (zh) 2015-08-19
EA013563B1 (ru) 2010-06-30
DK2314686T4 (da) 2023-08-21
EP2314686B1 (en) 2017-07-05
AU2001294198B2 (en) 2007-11-29
JP5770783B2 (ja) 2015-08-26
ES2639222T3 (es) 2017-10-25
JP2013231032A (ja) 2013-11-14
AU2001294198C1 (en) 2019-04-04
CA2785941C (en) 2017-01-10
EP2314686B2 (en) 2023-06-21
EP2314685A1 (en) 2011-04-27
ES2620359T3 (es) 2017-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013224B1 (ru) Клетки, продуцирующие композиции антител
JP4628679B2 (ja) Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
ES2418360T3 (es) Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
CN101287765B (zh) 基因修饰的抗体组成物
KR101913440B1 (ko) 개변 항체 조성물
US7291491B2 (en) Polypeptides
EP1498491A1 (en) METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO Fc GAMMA RECEPTOR IIIa
WO2003084569A1 (fr) Medicament contenant une composition anticorps
JPWO2003055993A1 (ja) Ｃｄ２０に特異的に結合する抗体組成物
CN105392885A (zh) 用于产生双等位基因敲除的方法和组合物
WO2003085118A1 (fr) Procede de production de composition anticorps
WO2005035778A1 (ja) α1,6-フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するRNAを用いた抗体組成物の製造法
WO2005035577A1 (ja) ガングリオシドｇｄ３に特異的に結合する抗体組成物
WO2000027885A1 (fr) Nouveau popypeptide chimerique
EP1676910A1 (en) Genomically modified cell
WO2007099988A1 (ja) α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ変異体とその用途
WO2001000848A1 (fr) Polypeptide utile
JPWO2005035583A1 (ja) Ｉｌ−５受容体に特異的に結合する抗体組成物
WO2022006503A9 (en) Methods to glycoengineer proteins
CN105821003A (zh) 基因工程细胞及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
ND4A Extension of term of a eurasian patent