KR20150118159A - 암의 치료 방법 및 약물 내성의 예방 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 표적 치료제의 치료학적으로 유효한 조합을 포함하는 약학 제품, 및 암의 치료를 위한 상기 조합의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

암의 치료 방법 및 약물 내성의 예방 방법{METHODS OF TREATING CANCER AND PREVENTING DRUG RESISTANCE}

본 발명은 알데하이드 데하이드로게나제(ALDH) 억제제 및 표적 치료법을 사용하여, 암과 같은 병적인 상태를 치료하기 위한 치료법에 관한 것이다.

암 약물에 대한 비교적 빠른 내성의 획득은 성공적인 암 치료법에 여전히 중요한 장애이다. 상기와 같은 약물 내성에 대한 분자적 근거를 밝히기 위한 상당한 노력은 약물 유출, 표적의 약물 결합-결함 돌연변이체의 획득, 대체 생존 경로의 개입, 후성적 변경을 포함한 다양한 기전들을 밝혀내었다. 상기와 같은 기전들은 일반적으로 약물 치료 중에 선택되는 종양 세포 집단내의 드물고 확률적인 내성-부여 유전적 변경의 존재를 반영하는 것으로 여겨진다(문헌[Sharma et al ., Cell 141(1):69-80 (2010)]). 암 치료법에서 점점 더 많이 관찰되는 현상은 소위 "재-치료 반응"이다. 예를 들어, EGFR(상피 성장 인자 수용체) 타이로신 키나제 억제제(TKI)에 의한 치료에 잘 반응하고 나중에 치료 실패를 경험하는 일부 비-소세포 폐암(NSCLC) 환자들은 "약물 휴식" 후에 EGFR TKI 재치료에 대해 2차 반응을 나타낸다(문헌[Kurata et al., Ann . Oncol. 15:173-174 (2004)]; 문헌[Yano et al., Oncol. Res. 15:107-111 (2005)]). 유사한 재-치료 반응들이 다수의 다른 항암제들에 대해 잘 확립되어 있다(문헌[Cara and Tannock, Ann . Oncol. 12:23-27 (2001)]). 상기와 같은 발견은 암 약물에 대한 후천적 내성이 가역적인 "약물-내성" 상태(그의 기전적 근거는 여전히 확립되어 있다)를 수반할 수도 있음을 암시한다.

다양한 인간 종양 세포주내의 가역적으로 "약물-내성"인 세포 집단의 존재는 IGF-1 수용체 신호전달의 개입 및 히스톤 데메틸라제 KDM5A를 필요로 하는 변경된 크로마틴 상태를 통해 유지되는 것으로 나타났다. 일부 특정한 내성-부여 돌연변이가 실제로 후천성 약물 내성을 나타내는 다수의 암 환자들에서 확인되었지만, 약물 내성에 대한 돌연변이 및 비-돌연변이 기전의 상대적인 기여 및 종양 세포 아집단의 역할은 여전히 다소 불명확한 채로 남아있다. 암 세포 집단내 이질성 및 약물 치료에 내성인 암 세포의 출현을 성공적으로 다룰 수 있는 신규의 치료 방법이 필요하다.

본 발명은 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 포함하는 조합을 제공한다. 본 발명은 유효량의 ALDH 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 각 량은 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키기에 유효하다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 각 량은 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 없이(상기 억제제의 부재하에서) 유효량의 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 투여함을 포함하는 표준 치료에 비해 증가된 효능에 유효하다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 각 량은 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 없이(상기 억제제의 부재하에서) 유효량의 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 투여함을 포함하는 표준 치료에 비해 증가된 반응(예를 들어, 완전한 반응)에 유효하다. 상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 다이설피람 및/또는 그의 유도체이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 다이설피람이다. 상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 고시폴 및/또는 그의 유도체이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 고시폴이다.

또한, 본 발명은 유효량의 표적 치료제 및 유효량의 ALDH 억제제를 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제를 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 개인에게서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 암 치료는 유효량의 표적 치료제 및 유효량의 ALDH 억제제를 상기 개인에게 동시에 투여함을 포함하고, 여기에서 상기 암 치료는 상기 표적 치료제 없이(상기 표적 치료제의 부재하에서) 유효량의 상기 표적 치료제를 투여함을 포함하는 표준 치료에 비해 증가된 효능을 갖는다. 더욱이, 본 발명은 유효량의 ALDH 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제에 내성인 암의 발생을 지연 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명은 유효량의 ALDH 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 표적 치료제에 대한 내성이 발생할 가능성이 증가된 암에 걸린 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 유효량의 ALDH 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 암에 걸린 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제에 대한 민감성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 유효량의 ALDH 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 암에 걸린 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 표적 치료제 민감성 기간을 연장시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 유효량의 ALDH 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 암에 걸린 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제에 대한 반응의 지속기간을 연장시키는 방법을 제공한다.

상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 소분자 ALDH 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 소분자 ALDH 억제제는 다이설피람 또는 그의 ALDH-억제 유도체 또는 대사산물이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 N,N-다이에틸[(다이에틸카바모티오일)다이설파닐]카보티오아미드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 N,N-다이에틸[(다이에틸카바모티오일)다이설파닐]카보티오아미드이다. 상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 고시폴 및/또는 그의 ALDH-억제 유도체 또는 대사산물이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 고시폴이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌)이다.

상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 타이로신 키나제 억제제(TKI)이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET 억제제, ALK 억제제, BRAF 억제제, ROS1 억제제 및/또는 MEK 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 수용체 타이로신 키나제 억제제(RTKI)이다. 일부 실시태양에서, 상기 RTKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET 억제제 및/또는 ALK 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 억제제는 항체 억제제, 소분자 억제제, 결합 폴리펩타이드 억제제 및/또는 폴리뉴클레오타이드 길항물질이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 또는 그의 약학적으로 허용되는 염(예를 들어, 에를로티니브)이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 N-(4-(3-플루오로벤질옥시)-3-클로로페닐)-6-(5-((2-(메틸설포닐)에틸아미노)메틸)퓨란-2-일)퀴나졸린-4-아민, 다이-4-메틸벤젠설포네이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염(예를 들어, 라파티니브)이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 (S)-N-(2,3-다이하이드록시프로필)-3-(2-플루오로-4-요오도페닐아미노)이소니코틴아미드) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염(예를 들어, AS703026)이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 베무라페니브이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 3-((R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에톡시)-5-(1-(피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)피리딘-2-아민 또는 그의 약학적으로 허용되는 염(예를 들어, 크리조티니브)이다.

상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 암은 위암, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암(NSCL)), 결장직장암(예를 들어, 결장암 및/또는 직장암), 또는 기저세포 암종이다.

하나의 실시태양에서, 암의 치료를 위해 동반 사용 또는 연속 사용하기 위한 a) 제 1 성분으로서 유효량의 ALDH 억제제, 및 b) 제 2 성분으로서 유효량의 표적화제(표적 치료제)를 포함하는 약학 제품을 제공한다.

또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 ALDH 억제제는 소분자 ALDH 억제제이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 ALDH 억제제는 다이설피람 또는 그의 ALDH-억제 유도체 또는 대사산물이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 ALDH 억제제는 N,N-다이에틸[(다이에틸카바모티오일)다이설파닐]카보티오아미드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 ALDH 억제제는 N,N-다이에틸[(다이에틸카바모티오일)다이설파닐]카보티오아미드이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 ALDH 억제제는 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 ALDH 억제제는 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌)이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 표적 치료제는 타이로신 키나제 억제제(TKI)이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 TKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET 억제제, ALK 억제제, BRAF 억제제, ROS1 억제제 및/또는 MEK 억제제이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 TKI는 수용체 타이로신 키나제 억제제(RTKI)이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 RTKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET 억제제 및/또는 ALK 억제제이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 억제제는 항체 억제제, 소분자 억제제, 결합 폴리펩타이드 억제제 및/또는 폴리뉴클레오타이드 길항물질이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 TKI는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 특히 에를로티니브이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 TKI는 N-(4-(3-플루오로벤질옥시)-3-클로로페닐)-6-(5-((2-(메틸설포닐)에틸아미노)메틸)퓨란-2-일)퀴나졸린-4-아민, 다이-4-메틸벤젠설포네이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 특히 라파티니브이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 TKI는 (S)-N-(2,3-다이하이드록시프로필)-3-(2-플루오로-4-요오도페닐아미노)이소니코틴아미드) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 특히 AS703026이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 TKI는 베무라페니브이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 TKI는 3-((R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에톡시)-5-(1-(피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)피리딘-2-아민 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 특히 크리조티니브이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 나타낸 바와 같은 약학 제품을 제공하며, 여기에서 상기 암은 위암, 폐암, 비소세포 폐암(NSCL), 결장암 및/또는 직장암, 또는 기저세포 암종이다.

본 발명에 개시된 몇몇 조합들의 투여는 개선된 암 치료를 제공하는 것 외에, 상이한 치료를 받은 동일한 환자가 경험한 삶의 질에 비해 상기 환자의 삶의 질을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 개인에게, 본 발명에 개시된 바와 같은 표적 치료제(예를 들어, TKI) 및 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체)의 조합의 투여는 동일한 환자가 치료법으로서 단지 상기 표적 치료제만을 받은 경우 경험하게 되는 삶의 질에 비해 개선된 삶의 질을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 조합에 의한 복합 치료법은 필요한 표적 치료제의 용량을 낮출 수 있으며, 이에 의해 상기 치료제와 관련된 부작용들(예를 들어, 오심, 구토, 탈모, 발진, 식욕 감소, 체중 손실 등)을 줄일 수 있다. 상기 조합은 또한 종양 크기 및 관련된 부작용들, 예를 들어 통증, 기관 기능장애, 체중 손실 등을 감소되게 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 태양은 표적 치료제(예를 들어, TKI)에 의해 암을 치료하는 환자의 삶의 질을 개선시키기 위한 치료학적 용도를 위한 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체)를 제공한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 태양은 표적 치료제에 의해 암 질환을 치료하는 개인의 삶의 질을 개선시키기 위한 치료학적 용도를 위한 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체), 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

도 1A 내지 C. 약물 내성 위암 세포는 높은 수준의 ALDH1A1을 발현한다. (A) ALDH 활성을 알데플루오르 분석(스템 셀 테크놀로지(Stem Cell Technology))을 사용하여 카토(Kato) II 모 세포 및 크리조티니브(1 μM) 내성 세포에서 측정하였다. 보디피 표지된 기질은 ALDH에 의해 상응하는 산으로 산화시 형광을 방출한다. 사진은 크리조티니브 처리에 따른 ALDH^high 세포의 농축을 나타낸다. 모 집단 중 ALDH^high 세포는 화살표로 표시되었다. (B) 19 ADLH 과 구성원들의 RNA 발현 수준을 올리고뉴클레오타이드 기재 미세배열을 사용하여 측정하였다. 카토 II 모 세포를 37 ℃에서 30분 동안 알데플루오르 기질과 함께 배양하고 ALDH^high 및 ALDH^low 세포를 유식 세포측정에 의해 분류하였다. 유전자 발현 분석을 ALDH^high 및 ALDH^low 세포로부터 단리된 RNA를 사용하여 수행하였다. 막대 그래프는 ALDH^high 세포 중의 유일한 하나의 ALDH 과 구성원, ALDH1A1의 차별적인 발현을 예시한다. (C) 각각 ALDH^low 세포 및 모 세포와 비교된 ALDH^high 세포 및 크리조티니브 내성 카토 II 및 GTL-16 세포에서의 ALDH1A1 단백질의 보다 높은 발현 수준을 예시하는 면역블럿.
도 2A 내지 C. ADLH 억제제 다이설피람은 약물 내성 세포를 제거한다. 모 카토 II(A) 및 GTL-16(B) 세포를 25일 동안 1 μM 크리조티니브로 처리하고, 다이설피람 200 nM을 제 1 일(d1)에 또는 크리조티니브 처리 중 상이한 시간 간격으로 가하였다. (C) 모 PC9 세포를 에를로티니브로 처리하고 다이설피람, 200 nM을 에를로티니브 처리 중 상이한 시점들에서 가하였다. 처리당 3회 중복 웰로부터 수행된 정량적인 측정을 나타내는 막대 그래프는 사이토(Syto)60 생육력 분석(문헌[Wilson et al., 2011])에 의해 측정된 바와 같은 약물 내성 세포에 대한 다이설피람의 치사 효과를 나타낸다. 데이터를 처리가 없는 대조군의 분획들로서 나타내고, 오차 막대는 SEM 값을 반영한다.
도 3A 및 B. 다이설피람은 다양한 암 유형의 약물 내성 세포들을 살해한다. (A) 상이한 발암유전자에 중독된, 다양한 조직 기원의 암 세포에 대한 다이설피람 및 표적 암 약물 조합의 효과를 예시한다. 에를로티니브(HCC827 및 HCC4006), 라파티니브(HCC1419, SKBR3 및 MDA-MB-175 v2), MEK 억제제 AS703026(A549 및 EBC-1) 및 BRAF 억제제 베무라페니브(콜로(Colo)-205)에 민감한 암 세포들을 적합한 약물로 단독으로 또는 200 nM 내지 300 nM 다이설피람과 함께 처리하였다. 처리 지속기간은 TKI+다이설피람 처리가 거의 모든 약물 내성 세포를 살해하는데 걸린 시간에 따라 11 내지 25일로 다양하였다. (B) 사이토60 생육력 분석에 의해 측정된 바와 같은 표적 암 약물, 다이설피람 및 이들의 조합의 효과의 정량적인 측정(처리당 3중 웰)을 나타내는 막대 그래프는 일반적으로 약물 내성 세포의 생존에 대한 ALDH에 따른 상기 세포의 의존성을 예시한다. 데이터를 미처리 대조군의 분획들로서 나타내고, 오차 막대는 SEM 값을 반영한다.
도 4A 내지 C. 약물 내성 세포에서 증가된 미토콘드리아 호흡 및 ROS 수준. (A) ROS 수준을 플루오레세인 기재 H2DCFDA 시약(몰레큘라 프로브스(Molecular probes))을 사용하여 검출하고 유식 세포측정에 의해 측정하였다. PC9-유래된 및 GTL-16 유래된 DTP를 48시간 동안 TKI의 존재하에서 다이설피람(200 nM) 및 NAC(5 mM)로 처리하고, TKI, 다이설피람 및 NAC의 효과를 측정하였다. 미처리 모 세포와 비교된 ROS 수준의 변화 배수를 나타내는 막대 그래프는 ROS 스캐빈저로서 ALDH의 역할을 예시한다. (B) GTL-16 및 PC9-유래된 DTP의 각각의 미토콘드리아 호흡 및 해당에 의한 에너지 생산을 측정하기 위한 산소 소비율(OCR) 및 세포외 산성화율(ECAR)을 씨홀스(Seahorse) XF96을 사용하여 측정하였다. 막대 그래프는 약물 내성 세포에서 미토콘드리아 호흡의 증가된 사용을 예시한다. (C) 면역블럿은 GTL-16 및 PC9 약물 내성 세포에서 높은 ROS 수준의 결과로서 증가된 이중 가닥 DNA 중단 및 DNA 수복 기전의 활성화를 예시한다.
도 5A 내지 C. ROS 스캐빈저 N-아세틸 시스테인은 다이설피람의 효과를 역전시킨다. (A) PC9 및 (B) GTL-16 모 세포를 15일 동안 각각 에를로티니브 및 크리조티니브 단독으로 또는 다이설피람, NAC 및 다이설피람+NAC와 함께 처리하였다. 세포 생육력에 대한 이들 처리의 효과를 묘사하는 막대 그래프는 세포 생육력에 대한 다이설피람의 치사 효과를 구제하는 NAC의 능력을 예시한다. (C1-2) GTL-16-유래된 DTP를 48시간 동안 다이설피람 및 NAC로 처리하였다. 면역블럿 데이터는 NAC에 의한, γH2A.x, BimEL, BimS 및 절단된 PARP 수준에 대한 다이설피람 효과의 역전을 설명한다. 다이설피람은 DTP에서 ROS 수준을 증가시키고 세포사멸을 유도한다.
도 6A 및 B. 다이설피람은 종양 재발을 지연시킨다. (A) PC9 모 세포를 에를로티니브 단독으로 또는 다이설피람과 함께 처리하였다. 6일의 TKI 처리 후에, 상기 DTP는 다이설피람이 존재하거나 존재하지 않는 에를로티니브-부재 생육 배지에서 증식이 허용되었다. 상기 세포 생육력 데이터는 처음 6일 다이설피람을 받은 PC9-유래된 DTP의 지연된 증식, 및 후속 4일 동안 다이설피람을 계속해서 받은 경우에 대한 훨씬 더 긴 증식의 지연을 설명한다. 막대 그래프는 3중 웰로부터 측정되고 평균 +/- SD로서 표현된 PC9-유래된 DTP에 대한 DS의 효과를 도시한다. (B) 생체내 데이터는 에를로티니브 단독과 비교된, 에를로티니브 및 다이설피람으로 처리된 이종이식 마우스 모델에서 PC9 유래된 종양의 지연된 재발을 도시한다.
도 7A 내지 C. 다이설피람에 의한 전-처리는 모든 DTP를 살해하기에 충분하지 않다. PC9(A) 및 GTL-16(B) 모 세포를 먼저 3 또는 6일 동안 DS로 처리하고 이어서 DS의 부재하에서 PC9 세포의 경우 에를로티니브로 GTL-16 세포의 경우 크리조티니브로 처리하였다. 사이토60 세포 생육력 염색은 DS에의 짧은 노출이 DTP의 수를 감소시키지만 상기 DTP를 제거하지는 않음을 나타낸다. (C) ALDH1A1 단독의 녹-다운은 GTL16 세포에서 크리조티니브 약물 민감성에 그다지 영향을 미치지 않는다. 그래프는 다수의 shRNA를 사용하는 GTL16 세포에서의 ALDH1A1의 상대적인 발현을 도시한다. 표는 ALDH1A1 녹다운 세포에서 크리조티니브로 처리시 GTL16-유래된 DTP의 상대적인 백분율을 도시한다.
도 8A 내지 C. 약물 처리는 다수의 TKI 억제제를 사용하는 다수의 세포주들에서 다수의 ALDH 과 구성원들의 발현을 유도한다. (A) GTL16-유래된 DTP(크리조티니브로 처리된 모 세포) 및 PC9-유래된 DTP(에를로티니브로 처리된 모 세포)에서 ALDH 과 구성원의 RNA 발현의 상대적인 변화. (B) GTL16 모 세포 및 GTL16-유래된 DTP(크리조티니브로 처리된 모 세포) 및 PC9 모 세포 및 PC9-유래된 DTP(에를로티니브로 처리된 모 세포)에서 ALDH 과 구성원들의 RNA 발현 수준. (C) ALDH1A1은 GTL-16 모 세포에 비해 GTL-16-유래된 DTP(크리조티니브로 처리된 모 세포)를 상향조절한다. 환언하면, ALDH1A1 발현은 PC9-유래된 DTP(에를로티니브로 처리된 모 세포) 또는 PC9 모 세포에서 그다지 발현되지 않으며, PC9 모 세포에 비해 PC9-유래된 DTP(에를로티니브로 처리된 모 세포)에서 ALDH1A1의 발현 수준의 현저한 변화는 없다.
도 9. ALDH 억제제 고시폴은 약물 내성 세포를 현저하게 감소시킨다. (A) 모 PC9 세포를 2 μM 에를로티니브 및 1.5 μM 고시폴로 단독으로 또는 함께 8일 동안 처리하였다. (B) 모 GTL-16 세포를 1 μM 크리조티니브 및 1.5 μM 고시폴로 단독으로 또는 함께 17일 동안 처리하였다. 처리당 3중 웰로부터의 사이토60 분석에 의한 세포 생육력의 정량적인 측정을 나타내는 막대 그래프는 약물 내성 세포에 대해 DS와 유사하지만 보다 약한 고시폴의 효과를 도시한다.

I. 정의

본 발명에 사용되는 바와 같이, "ALDH" 또는 "알데하이드 데하이드로게나제"란 용어는 알데하이드를 산화시킬 수 있는 효소 또는 효소의 부류를 지칭한다. 알데하이드 데하이드로게나제(ALDH)(효소 위원회 1.2.1.3)는 세포내 알데하이드의 산화를 맡고 있는 효소이며 에탄올, 비타민 A, 사이클로포스파미드 및 다른 옥스아자포스포린의 대사에 한 역할을 한다. 인간에서 ALDH 효소의 예는 ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L1, ALDH1L2, ALDH2, ALDH3A1, ALDH3A2, ALDH3B1, ALDH3B2, ALDH4A1, ALDH5A1, ALDH6A1, ALDH7A1, ALDH8A1, ALDH9A1, ALDH16A1, ALDH18A1을 포함한다. "야생형 ALDH"란 용어는 일반적으로 천연 ALDH 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

"HER2", "ErbB2", "c-Erb-B2"란 용어들은 호환적으로 사용된다. 달리 나타내지 않는 한, "ErbB2" "c-Erb-B2" 및 "HER2"란 용어들은 본 발명에 사용될 때 인간 단백질을 지칭하며, "erbB2", "c-erb-B2" 및 "her2"는 인간 유전자를 지칭한다. 인간 erbB2 유전자 및 ErbB2 단백질은, 예를 들어 문헌[Semba et al ., PNAS ( USA ) 82:6497-6501 (1985)] 및 문헌[Yamamoto et al . Nature 319:230-234 (1986)](진뱅크 수탁 번호 X03363)에 개시되어 있다. ErbB2는 4개의 도메인(도메인 1 내지 4)을 포함한다. "야생형 HER2"란 용어는 일반적으로 천연 HER2 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

"EGRF"는 문헌[Ullrich et al, Nature(1984) 309:418425]에 개시되어 있는 수용체 타이로신 키나제 폴리펩타이드 상피 성장 인자 수용체를 의미하며, 한편으로 Her-1 및 c-erbB 유전자 산물뿐만 아니라 그의 변이체, 예를 들어 EGFRvIII로서 지칭된다. EGFR의 변이체는 또한 결실, 치환 및 삽입 변이체, 예를 들어 문헌[Lynch et al . (NEJM 2004, 350:2129)], 문헌[Paez et al . (Science 2004, 304:1497)], 문헌[Pao et al . (PNAS 2004, 101:13306)]에 개시된 변이체들을 포함한다. "야생형 EGFR"이란 용어는 일반적으로 천연 EGFR 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "c-met" 또는 "Met"란 용어는 달리 나타내지 않는 한, 임의의 고유 또는 변형(고유든 합성이든) c-met 폴리펩타이드를 지칭한다. "야생형 c-met"란 용어는 일반적으로 천연 c-met 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "BRAF"란 용어는 달리 나타내지 않는 한, 임의의 고유 또는 변형(고유든 합성이든) BRAF 폴리펩타이드를 지칭한다. "야생형 BRAF"란 용어는 일반적으로 천연 BRAF 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

"ALK"란 용어는 미분화 림프종 키나제를 지칭한다. ALK(미분화 림프종 키나제)(진뱅크 수탁 번호: AB209477, 유니프롯(UniProt) 수탁 번호 Q9UM73)는 수용체 타이로신 키나제이다. 상기 단백질(인간에서 1620 아미노산 길이이다)은 중심 부분에 막관통 도메인을 가지며 카복실-말단 타이로신 키나제 영역 및 아미노-말단 세포외 도메인을 갖는다(문헌[Oncogene. 1997 Jan. 30; 14 (4): 439-49]). ALK에 관한 광범위한 검토를 위해서 문헌[Pulford et al ., J. of Cellular Physiol., 199:330-358, 2004]을 참조하시오. 전장 ALK 서열은 미국특허 US 5,770,421에 개시되어 있다. "야생형 ALK"란 용어는 일반적으로 천연 ALK 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

관심 폴리펩타이드의 "길항물질"(호환적으로 "억제제"를 지칭한다)은 상기 관심 폴리펩타이드의 활성화 또는 기능을 방해하는, 예를 들어 관심 폴리펩타이드에 의해 매개되는 생물 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 중화시키는 작용제이다. 예를 들어, 폴리펩타이드 X의 길항물질은 폴리펩타이드 X에 의해 매개되는 생물 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 중화시키는 임의의 분자를 지칭할 수 있다. 억제제의 예는 항체; 리간드 항체; 소분자 길항물질; 안티센스 및 억제 RNA(예를 들어, shRNA) 분자를 포함한다. 바람직하게, 상기 억제제는 상기 관심 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 소분자이다. 특정 실시태양에서, 억제제는 상기 관심 폴리펩타이드에 대해 약 1,000 nM 이하의 결합 친화성(해리 상수)을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 억제제는 상기 관심 폴리펩타이드에 대해 약 100 nM 이하의 결합 친화성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 억제제는 상기 관심 폴리펩타이드에 대해 약 50 nM 이하의 결합 친화성을 갖는다. 특정 실시태양에서, 억제제는 상기 관심 폴리펩타이드에 공유 결합한다. 특정 실시태양에서, 억제제는 상기 관심 폴리펩타이드의 신호전달을 1,000 nM 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 또 다른 실시태양에서, 억제제는 상기 관심 폴리펩타이드의 신호전달을 500 nM 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 또 다른 실시태양에서, 억제제는 상기 관심 폴리펩타이드의 신호전달을 50 nM 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 길항물질은 상기 관심 폴리펩타이드의 발현 수준 또는 생물 활성을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상까지 감소시키거나 억제한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "표적 치료제"란 용어는 관심 폴리펩타이드(들)에 결합하고 상기 특정한 관심 폴리펩타이드(들)의 활성 및/또는 활성화를 억제하는 치료제를 지칭한다. 상기와 같은 작용제의 예는 상기 관심 폴리펩타이드에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 TKI이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 RTKI이다.

"타이로신 키나제 억제제" 또는 "TKI"는 타이로신 키나제의 타이로신 키나제 활성에 의해 매개되는 활성화 또는 기능을 방해하는, 예를 들어 타이로신 키나제의 타이로신 키나제 활성에 의해 매개되는 생물 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 중화시키는 작용제를 지칭한다.

"수용체 타이로신 키나제 억제제" 또는 "RTKI"는 수용체 타이로신 키나제의 타이로신 키나제 활성에 의해 매개되는 활성화 또는 기능을 방해하는, 예를 들어 수용체 타이로신 키나제의 타이로신 키나제 활성에 의해 매개되는 생물 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 중화시키는 작용제를 지칭한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이 "폴리펩타이드"란 용어는 달리 나타내지 않는 한, 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유의 관심 폴리펩타이드를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 폴리펩타이드뿐만 아니라 세포에서 가공으로부터 생성되는 상기 폴리펩타이드의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 폴리펩타이드의 천연 변이체, 예를 들어 연접 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.

본 발명에서 호환적으로 사용되는 바와 같은, "폴리뉴클레오타이드", 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드들의 중합체들을 지칭하며 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체에 통합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어 메틸화된 뉴클레오타이드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 상기 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형을 상기 중합체의 조립 전에 또는 조립 후에 부여할 수도 있다. 상기 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 합성 후에, 예를 들어 표지와의 접합에 의해 추가로 변형시킬 수도 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡", 천연 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 유사체에 의한 치환, 뉴클레오타이드간 변형, 예를 들어 하전되지 않은 결합(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 결합(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등)을 갖는 것들, 펜던트 부분, 예를 들어 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, ply-L-리신 등)을 함유하는 것들, 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것들, 킬레이터(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것들, 알킬화제를 함유하는 것들, 변형된 결합(예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것들뿐만 아니라 상기 폴리뉴클레오타이드(들)의 변형되지 않은 형태를 포함한다. 더욱이, 당 중에 임의로 존재하는 하이드록실기들 중 임의의 것을, 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 치환하거나, 표준 보호기에 의해 보호하거나, 추가적인 뉴클레오타이드에 대한 추가의 결합을 마련하기 위해 활성화시키거나, 고체 또는 반-고체 지지체에 접합시킬 수도 있다. 5' 및 3' 말단 OH를 인산화시키거나 아민 또는 탄소수 1 내지 20의 유기 캡핑기 부분으로 치환시킬 수 있다. 다른 하이드록실을 또한 표준 보호기로 유도체화할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 당해 분야에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사한 형태들, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵튤로스, 비환상 유사체 및 비염기성 뉴클레오사이드 유사체, 예를 들어 메틸 리보사이드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 결합을 대체 결합기에 의해 치환시킬 수도 있다. 이러한 대체 결합기는 비제한적으로, 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), "(O)NR₂("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂("폼아세탈")(여기에서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알딜을 임의로 함유하는 치환되거나 비치환된 (C₁-C₂₀)알킬이다)에 의해 치환되는 실시태양을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 중의 모든 결합들이 동일할 필요는 없다. 선행의 서술을 RNA 및 DNA를 포함한, 본 발명에서 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용시킨다.

"소분자"란 용어는 약 2000 달톤 이하, 바람직하게는 약 500 달톤 이하의 분자량을 갖는 임의의 분자를 지칭한다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시태양에서, 항체를, 예를 들어 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되는 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제시킨다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토에 대해서, 예를 들어 문헌[Flatman et al ., J. Chromatogr . B 848:79-87 (2007)]을 참조하시오.

본 발명에서 "항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구조물, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 항체 단편(상기 단편이 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한)을 포함한다.

관심 항체의 항-폴리펩타이드 및 관심 폴리펩타이드"에 결합하는 항체"란 용어는 관심 폴리펩타이드에, 상기 항체가 상기 관심 폴리펩타이드를 표적화함에 있어서 진단 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화성으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 관심 항체의 항-폴리펩타이드가 관심 단백질의 관련되지 않은 비-폴리펩타이드에의 결합하는 정도는, 예를 들어 방사성면역분석(RIA)에 의해 측정되는 바와 같이, 상기 항체의 관심 폴리펩타이드에의 결합의 약 10% 미만이다. 몇몇 실시태양에서, 관심 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 ≤1μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들어, 10^-8 M 이하, 예를 들어 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 몇몇 실시태양에서, 관심 항체의 항-폴리펩타이드는 상이한 종들로부터의 관심 폴리펩타이드들 가운데 보존되는 관심 폴리펩타이드의 에피토프에 결합한다.

"차단 항체" 또는 "길항물질 항체"는 결합하는 항원의 생물 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항물질 항체는 상기 항원의 생물 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제시킨다.

"친화성"은 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 짝(예를 들어, 항원) 간의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항체 및 항원)간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 그의 짝 Y에 대한 친화성을 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화성을 당해 분야에 공지된 통상적인 방법, 예를 들어 본 발명에 개시된 방법들에 의해서 측정할 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적인 예시적이고 전형적인 실시태양들을 하기에 개시한다.

"항체 단편"은 완전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 완전한 항체의 일부를 포함하는 상기 완전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 다이아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이성 항체를 포함한다.

기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 상기 기준 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상까지 차단하는, 환원하면 상기 기준 항체가 경쟁 분석에서 상기 항체의 그의 항원에의 결합을 50% 이상까지 차단하는 항체를 지칭한다.

"키메릭" 항체란 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래하는 반면 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종으로부터 유래하는 항체를 지칭한다.

"전장 항체", "완전한 항체" 및 "전체 항체"란 용어들은 본 발명에서 고유의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하는데 호환적으로 사용된다.

본 발명에 사용되는 바와 같이 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 차지하는 개별적인 항체들은 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하나, 예를 들어 천연 돌연변이를 함유하거나 단클론 항체 제제의 생산 중 발생하는 가능한 변형 항체는 제외하며, 상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 따라서, "단클론"이란 수식 어구는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되는 상기 항체의 특성을 가리키며, 임의의 특정 방법에 의한 상기 항체의 생산을 요하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체를 다양한 기법들에 의해서, 예를 들어 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 함유하는 유전자이식 동물을 사용하는 방법, 단클론 항체의 제조를 위한 상기와 같은 방법 및 다른 예시적인 방법들에 의해 제조할 수 있다.

"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 출처로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 상기 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체는 제외한다.

"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 인간화된 항체는 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어, CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 항체의 경우에 상응하고 상기 FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 항체의 경우에 상응한다. 인간화된 항체는 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 임의로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.

"면역접합체"는 비제한적으로 세포독성제를 포함하여 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합한 항체이다.

"개인 반응" 또는 "반응"을, 상기 개인에게 이점을 나타내는 임의의 종점, 예를 들어 비제한적으로 (1) 질병 진행(예를 들어, 암 진행)의 어느 정도의 억제, 예를 들어 지체 및 완전한 정지; (2) 종양 크기의 감소; (3) 인접한 말초 기관 및/또는 조직내로의 암 세포 침윤의 억제(즉 감소, 지체 또는 완전한 정지); (4) 전이의 억제(즉 감소, 지체 또는 완전한 정지); (5) 상기 질병 또는 질환(예를 들어, 암)과 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감; (6) 무진행 생존 시간의 증가; 및/또는 (9) 치료에 이은 주어진 시점에서의 감소된 사망률을 사용하여 평가할 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 동일한"이란 용어는 당해 분야의 숙련가가 2개 값 간의 차이를 상기 값들(예를 들어, Kd 값 또는 발현)에 의해 측정된 생물학적 특징의 상황 내에서 생물학적 및/또는 통계학적 유의수준이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 생각하기에 충분히 높은 정도의 상기 2개 값 간의 유사성을 나타낸다. 상기 2개 값 간의 차이는 기준/비교측정값의 함수로서, 예를 들어 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 및/또는 약 10% 미만이다.

본 발명에 사용되는 바와 같이 "실질적으로 상이한"이란 어구는 당해 분야의 숙련가가 2개 값 간의 차이를 상기 값들(예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 상황 내에서 통계학적 유의수준인 것으로 생각하기에 충분히 높은 정도의 상기 2개 값 간의 차이를 나타낸다. 상기 2개 값 간의 차이는 기준/비교측정 분자에 대한 상기 값의 함수로서, 예를 들어 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 및/또는 약 50% 초과이다.

물질/분자, 예를 들어 약학 조성물의 "유효량"은 필요한 투여량 및 기간 동안, 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다.

물질/분자의 "치료 유효량"은 상기 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자, 및 상기 개인에게서 목적하는 반응을 이끌어내는 상기 물질/분자의 능력에 따라 변할 수 있다. 치료 유효량은 또한 상기 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료학적으로 이로운 효과에 의해 압도되는 양이다. "예방학적 유효량"은 필요한 투여량 및 기간 동안, 목적하는 예방학적 결과를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다. 전형적으로, 반드시는 아니지만, 예방학적 용량은 피실험자에서 질병에 앞서 또는 질병의 보다 초기 단계에서 사용되기 때문에, 상기 예방학적 유효량은 상기 치료학적 유효량보다 적을 것이다.

"약학 제형"이란 용어는, 상기 제형 중에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 유효하게 되도록 하는 형태로 존재하고 상기 제형이 투여되는 피실험자에게 허용될 수 없게 독성인 추가적인 성분들은 함유하지 않는 제제를 지칭한다.

"약학적으로 허용되는 담체"는 피실험자에게 무독성인, 약학 제형 중의 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로 완충제, 안정제 또는 보존제를 포함한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "약학적으로 허용되는 염"이란 어구는 화합물의 약학적으로 허용되는 유기 또는 무기염을 지칭한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "치료"(및 그의 문법적 변형, 예를 들어 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개인의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방학적으로 또는 임상 병리의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 상기 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병적인 결과의 감소, 전이의 방지, 질병 진행속도의 감소, 상기 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 늦춘다.

"항암 치료법"이란 용어는 암 치료에 유용한 치료법을 지칭한다. 항암 치료제의 예는 비제한적으로, 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 치료법에 사용되는 작용제, 혈관형성 방지제, 세포사멸제, 항-튜불린제, 및 암을 치료하는 다른 작용제, 항-CD20 항체, 혈소판 유래된 성장 인자 억제제(예를 들어, 글리벡(Gleevec)(상표)(이마티니브 메실레이트)), COX-2 억제제(예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, 사이토킨, 하기의 표적들 PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 수용체(들), TRAIL/Apo2, 및 다른 생물활성 및 유기 화학제 중 하나 이상에 결합하는 길항물질(예를 들어, 중화 항체) 등을 포함한다. 이들의 조합이 또한, 본 발명에 포함된다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "세포독성제"란 용어는 세포 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포사멸 또는 세포 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹², 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제), 성장 억제제, 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산분해 효소, 항생제, 및 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소(그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하고자 한다. 다른 세포독성제들을 하기에 개시한다. 종양파괴제는 종양 세포의 파괴를 일으킨다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물을 지칭한다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 사이클로포스파미드(사이톡산(CYTOXAN)(등록상표)); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메튜레도파, 및 유레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포아미드, 트라이에틸렌티오포스포아미드 및 트라이메틸로멜라민; 아세토제닌(특히 뷸라타신 및 뷸라타시논); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(드로나비놀, 마리놀(MARINOL)(등록상표)); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히신; 베튤린산; 캄포테신(합성 유사 토포테칸(하이캄틴(HYCAMTIN)(등록상표)), CPT-11(이리노테칸, 캄토사(CAMPTOSAR)(등록상표)), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 살코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라머스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니머스틴, 트로포스파미드, 유라실 머스타드; 니트로소유레아, 예를 들어 카머스틴, 클로로조토신, 포테머스틴, 로머스틴, 니머스틴, 및 라님너스틴; 항생제, 예를 들어 에네디인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마 1I 및 칼리케아미신 오메가I1(예를 들어, 문헌[Nicolaou et al., Angew . Chem Intl . Ed . Engl ., 33: 183-186 (1994)]을 참조하시오); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 다이네미신, 예컨대 다이네미신 A; 에스페라미신; 및 네오카지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 액티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(아드리아마이신(ADRIAMYCIN)(등록상표), 모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사(독실(DOXIL)(등록상표)), 리포솜 독소루비신 TLC D-99(마이오세트(MYOCET)(등록상표)), peg화된 리포솜 독소루비신(예컨대, 카엘릭스(CAELYX)(등록상표)), 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩플로마이신, 포리피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 대사길항물질, 예를 들어 메토트렉세이트, 젬시타빈(젬자(GEMZAR)(등록상표)), 테가퓨어(유프토랄(UFTORAL)(등록상표)), 카페시타빈(젤로다(XELODA)(등록상표)), 에포틸론, 및 5-플루오로유라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모퓨어, 시타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록슈리딘; 안드로젠, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레뷸린산; 에닐유라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK(등록상표) 폴리사카라이드 복합체(JHS 내츄럴 프로덕츠(Natural Products), 미국 오리건주 유진 소재); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로제르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2'-트라이클로로트라이에틸아민; 트라이코테센(특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 유레탄; 빈데신(엘디신(ELDISINE)(등록상표), 필데신(FILDESIN)(등록상표)); 다카바진; 만노머스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 패클리탁셀(탁솔(TAXOL)(등록상표)), 패클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(아브락산(ABRAXANE)(상표)), 및 도세탁셀(탁소테레(TAXOTERE)(등록상표)); 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금제, 예를 들어 시스플라틴, 옥살리플라틴(예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)(등록상표)), 및 카보플라틴; 빈카(튜불린 중합이 미세관을 형성하는 것을 방지한다), 예를 들어 빈블라스틴(벨반(VELBAN)(등록상표)), 빈크리스틴(온코빈(ONCOVIN)(등록상표)), 빈데신(엘디신(등록상표), 필데신(등록상표)), 및 비노렐빈(나벨빈(NAVELBINE)(등록상표)); 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산, 예컨대 벡사로텐(타그레틴(TARGRETIN)(등록상표)); 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트(예를 들어, 보네포스(BONEFOS)(등록상표) 또는 오스탁(OSTAC)(등록상표)), 에티드로네이트(다이드로칼(DIDROCAL)(등록상표)), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트(조메타(ZOMETA)(등록상표)), 알렌드로네이트(포사맥스(FOSAMAX)(등록상표)), 파미드로네이트(아레디아(AREDIA)(등록상표)), 틸루드로네이트(스켈리드(SKELID)(등록상표)), 또는 리세드로네이트(액토넬(ACTONEL)(등록상표)); 트록사시타빈(1,3-다이옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 이상 세포 증식에 관련된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것들, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 상피 성장 인자 수용체(EGF-R); 백신, 예를 들어 테라토프(THERATOPE)(등록상표) 백신 및 유전자 치료 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)(등록상표) 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)(등록상표) 백신, 및 백시드(VAXID)(등록상표) 백신; 국소이성화효소 1 억제제(예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)(등록상표)); rmRH(예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)(등록상표)); BAY439006(소라페니브; 바이엘); SU-11248(수니티니브, 수텐트(SUTENT)(등록상표), 화이자); 페리포신, COX-2 억제제(예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브); 프로테오솜 억제제(예를 들어, PS341); 보르테조밉(벨케이드(VELCADE)(등록상표)); CCI-779; 티피파르니브(R11577); 오라페니브, ABT510; Bcl-2 억제제, 예를 들어 오블리메르센 나트륨(제나센스(GENASENSE)(등록상표)); 픽산트론; EGFR 억제제(하기의 정의를 참조하시오); 타이로신 키나제 억제제(하기의 정의를 참조하시오); 세린-쓰레오닌 키나제 억제제, 예를 들어 라파마이신(시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)(등록상표)); 파르네실트렌스퍼라제 억제제, 예를 들어 로나파르니브(SCH 6636, 사라사(SARASAR)(상표)); 및 상기 중 어느 하나의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 상기 중 2개 이상의 조합, 예를 들어 CHOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 복합 치료법에 대한 약어); 및 폴폭스(FOLFOX)(5-FU 및 류코보린과 겸비된 옥살리플라틴(엘록사틴(ELOXATIN)(상표))에 의한 치료 섭생에 대한 약어)을 포함한다.

본 발명에 정의된 바와 같은 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬들의 효과를 조절하거나, 감소시키거나, 차단하거나, 억제하는 작용을 하는 "호르몬-억제제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 상기 요법제는 호르몬 자체, 예를 들어 비제한적으로, 혼합된 작용물질/길항물질 프로파일을 갖는 항-에스트로젠, 예를 들어 타목시펜(놀바덱스(NOLVADEX)(등록상표)), 4-하이드록시타목시펜, 토레미펜(파레스톤(FARESTON)(등록상표)), 요오독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜(에비스타(EVISTA)(등록상표)), 트라이옥시펜, 케톡시펜 및 선택적인 에스트로젠 수용체 조절제(SERM), 예를 들어 SERM3; 작용물질 성질이 없는 순수한 항-에스트로젠, 예를 들어 풀베스트란트(파슬로덱스(FASLODEX)(등록상표)), 및 EM800(상기와 같은 작용제들은 에스트로젠 수용체(ER) 이량체화를 차단하고, DNA 결합을 억제하고, ER 턴오버를 증가시키고/시키거나, ER 수준을 억제한다); 아로마타제 억제제, 예를 들어 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예를 들어 포르메스탄 및 엑세메스탄(아로마신(AROMASIN)(등록상표)), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예를 들어 아나스트라졸(아리미덱스(ARIMIDEX)(등록상표)), 레트로졸(페마라(FEMARA)(등록상표)) 및 아미노글루테티미드, 및 보로졸(리비솔(RIVISOR)(등록상표)), 메제스트롤 아세테이트(메제이스(MEGASE)(등록상표)), 파드로졸, 및 4(5)-이미다졸을 포함한 다른 아로마타제 억제제; 황체호르몬-방출 호르몬 작용물질, 예를 들어 류프롤리드(루프론(LUPRON)(등록상표) 및 엘리가드(ELIGARD)(등록상표)), 고세렐린, 부세렐린 및 트리프테렐린; 성 스테로이드, 예를 들어 프로제스틴, 예를 들어 메제스트롤 아세테이트 및 메드록시프로제스테론 아세테이트, 에스트로젠, 예를 들어 다이에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로젠/레티노이드, 예를 들어 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티노산 및 펜레티나이드; 오나프리스톤; 항-프로제스테론; 에스트로젠 수용체 하향조절제(ERD); 항-안드로젠, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 바이칼루타미드; 및 상기 중 어느 하나의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 상기 중 2개 이상의 조합일 수 있다.

본 출원에 사용되는 바와 같은 "전구약물"이란 용어는 모 약물에 비해 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고, 보다 활성인 모 형태로 효소적으로 활성화되거나 전환될 수 있는 약학적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)] 및 문헌[Stella et al ., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al ., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]을 참조하시오. 본 발명의 전구약물은 비제한적으로 보다 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 설페이트-함유 전구약물, 펩타이드-함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 글리코실화된 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물, 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로유리딘 전구약물을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 비제한적으로 상술한 화학요법제들을 포함한다.

"성장 억제제"는 본 발명에 사용될 때 세포(예를 들어, 성장이 시험관내 또는 생체내에서 관심 폴리펩타이드의 활성에 의존하는 세포)의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 성장 억제제의 예는 세포주기 진행을 차단하는(S-기 외의 경우에서) 작용제, 예를 들어 G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 고전적인 M-기 차단제는 빈카(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 국소이성화효소 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제들, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로유라실 및 아라-C는 또한 S-기 정지로 확산된다. 추가의 정보를 문헌[The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al . (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13]에서 찾을 수 있다. 탁산(패클리탁셀 및 도세탁셀)은 주목으로부터 유래된 항암 약물들이다. 유럽 주목으로부터 유래된 도세탁셀(탁소테레(등록상표), 롱-푸랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer))은 패클리탁셀(탁솔(등록상표), 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb))의 반합성 유사체이다. 패클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세소관의 조립을 촉진하며, 세포에서 유사분열의 억제를 생성시키는 해중합을 방지함으로써 미세소관을 안정화시킨다.

"방사선 치료법"은 세포가 정상적으로 기능하는 능력을 제한하거나 세포가 대체로 파괴되도록 상기 세포에 충분한 손상을 유도하는 직달 감마선 또는 베타선의 사용을 의미한다. 치료 투여량 및 지속기간을 결정하기 위한 다수의 방법들이 당해 분야에 공지되어 있음을 알 것이다. 전형적인 치료는 일회 투여로서 제공되며 전형적인 투여량은 하루에 10 내지 200 단위(그레이)의 범위이다.

"개인" 또는 "피실험자"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 개인 또는 피실험자는 인간이다.

"동시에"란 용어는 본 발명에서 개별적인 치료 효과들이 제시간에 부분적으로 중복되기에 충분히 가까운 시간적 근접성으로 제공되는, 2개 이상의 치료제의 투여를 지칭하는데 사용된다. 따라서, 동시 투여는 하나 이상의 작용제(들)의 투여가 하나 이상의 다른 작용제(들)의 투여의 중단 후에 계속되는 투여 섭생을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 동시 투여는 동반하여, 연속적으로, 및/또는 동시에 발생한다.

"감소시키거나 억제시킨다"는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 전체적인 감소를 일으키는 능력을 의미한다. 감소시키거나 억제시킨다는 치료되는 질환의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 또는 원발 종양의 크기와 관련될 수 있다.

"패키지 삽입물"이란 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 용량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고를 함유하는, 상기와 같은 치료 제품의 상업적 패키지 중에 통상적으로 포함된 설명서를 지칭하는데 사용된다.

"제조 물품"은 하나 이상의 시약, 예를 들어 질병 또는 질환(예를 들어, 암)의 치료를 위한 약제, 또는 본 발명에 개시된 생물마커를 특이적으로 검출하기 위한 탐침을 포함하는 임의의 제품(예를 들어, 패키지 또는 용기) 또는 키트이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 제품 또는 키트는 본 발명에 개시된 방법을 수행하기 위한 단위로서 홍보되거나, 배급되거나, 판매된다.

당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명에서 "약" 값 또는 매개변수에 대한 언급은 상기 값 또는 매개변수 자체에 관한 실시태양을 포함한다(및 개시한다). 예를 들어, "약 X"에 관한 기술은 "X"의 기술을 포함한다.

본 발명에 개시된 발명의 태양 및 실시태양들은 태양 및 실시태양들로 "이루어지고/지거나" "필수적으로 이루어짐"을 포함하는 것으로 이해한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, 단수형인 "하나의" 및 "상기"는 달리 가리키지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.

II . 방법 및 용도

본 발명은 암을 치료하기 위한 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 사용하는 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 개인에게 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 각 량은 암 민감성 기간을 증가시키고/시키거나 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)에 대한 세포 내성의 발생을 지연시키기에 유효하다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 각 량은 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키기에 유효하다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 각 량은 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 없이(상기 억제제의 부재하에서) 유효량의 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 투여함을 포함하는 표준 치료에 비해 증가된 효능에 유효하다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 각 량은 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 없이(상기 억제제의 부재하에서) 유효량의 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 투여함을 포함하는 표준 치료에 비해 증가된 반응(예를 들어, 완전한 반응)에 유효하다. 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 타이로신 키나제 억제제(TKI)이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET/HGF 억제제, ALK 억제제, BRAF 억제제, ROS1 억제제 및/또는 MEK 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 수용체 타이로신 키나제 억제제(RTKI)이다. 일부 실시태양에서, 상기 RTKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET 억제제 및/또는 ALK 억제제이다.

또한, 본 발명은 개인에게 유효량의 표적 치료제(예를 들어, TKI) 및 유효량의 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체)를 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 개인에게서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 암 치료는 상기 개인에게 유효량의 표적 치료제(예를 들어, TKI) 및 유효량의 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체)를 동시에 투여함을 포함하고, 여기에서 상기 암 치료는 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 없이(상기 억제제의 부재하에서) 유효량의 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 투여함을 포함하는 표준 치료에 비해 증가된 효능을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 TKI이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET/HGF 억제제, ALK 억제제, BRAF 억제제, ROS1 억제제 및/또는 MEK 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 RTKI이다. 일부 실시태양에서, 상기 RTKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET/HGF 억제제 및/또는 ALK 억제제이다.

또한, 본 발명은 개인에게 유효량의 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 유효량의 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)에 내성인 암의 발생을 지연 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 개인에게 유효량의 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 유효량의 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)에 대한 민감성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 TKI이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET/HGF 억제제, ALK 억제제, BRAF 억제제, ROS1 억제제 및/또는 MEK 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 RTKI이다. 일부 실시태양에서, 상기 RTKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET/HGF 억제제 및/또는 ALK 억제제이다.

또한, 본 발명은 암에 걸린 개인에게 유효량의 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 유효량의 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 표적 치료제(예를 들어, TKI) 민감성 기간을 연장시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 암에 걸린 개인에게 유효량의 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 유효량의 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)에 대한 반응의 지속기간을 연장시키는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 TKI이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET/HGF 억제제, ALK 억제제, BRAF 억제제, ROS1 억제제 및/또는 MEK 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 RTKI이다. 일부 실시태양에서, 상기 RTKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET/HGF 억제제 및/또는 ALK 억제제이다.

상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)는 본 발명에 개시된 것들과 같은 항체, 결합 폴리펩타이드, 결합 소분자, 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 다이설피람 및/또는 그의 유도체이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 다이설피람이다. 상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 고시폴 및/또는 그의 ALDH-억제 유도체 또는 대사산물이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 고시폴이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌)이다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 치료법에 대해 내성을 갖는 암은 상기 치료법에 반응하지 않고/않거나 현저한 반응(예를 들어, 부분적인 반응 및/또는 완전한 반응)을 생성시키는 능력이 감소된 암을 포함한다. 내성은 치료 방법의 과정 중에 발생하는 후천적인 내성일 수도 있다. 일부 실시태양에서, 상기 후천적인 약물 내성은 일시적인 및/또는 가역적인 약물 내성이다. 치료법에 대한 일시적인 및/또는 가역적인 약물 내성은 상기 약물 내성이 상기 치료 방법의 중단 후에 상기 치료법에 대한 민감성을 되찾을 수 있음을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 후천적인 내성이 영구적인 내성이다. 치료법에 대한 영구적인 내성은 약물 내성을 부여하는 유전적 변화를 포함한다. 영구적인 내성은 일반적인 화학요법제-사이클로포스포미드, 백금제, 및/또는 탁솔에 의한 치료의 결과로서 발생할 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 치료법에 대해 민감성을 갖는 암은 반응성이고/이거나 현저한 반응(예를 들어, 부분적인 반응 및/또는 완전한 반응)을 생성시킬 수 있는 암을 포함한다.

치료법에 대한 내성의 획득 및/또는 민감성의 유지를 평가하는 측정 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 실시예에 개시되어 있다. 내성의 획득 및/또는 민감성의 유지, 예를 들어 약물 내성의 변화를, 실시예 및 샤르마(Sharma) 등의 문헌에 개시된 바와 같이 약물 내성 지속인자(persister)의 성장을 분석함으로써 평가할 수 있다. 내성의 획득 및/또는 민감성의 유지, 예를 들어 영구적인 내성 및/또는 확대된 내성인자(resister)의 변화를 실시예 및 샤르마 등의 문헌에 개시된 약물 내성 확대된 지속인자의 성장을 분석함으로써 평가할 수 있다. 일부 실시태양에서, 내성은 약물 내성 지속인자 및/또는 약물 내성 확대된 지속인자에서 IC50, EC50의 변화, 또는 종양 성장의 감소에 의해 지시될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 변화는 약 50%, 100% 및/또는 200% 중 어느 하나보다 더 크다. 또한, 내성의 획득 및/또는 민감성의 유지의 변화를 생체내에서, 예를 들어 치료법에 대한 반응, 예를 들어 부분적인 반응 및 완전한 반응, 반응의 지속기간, 및/또는 진행까지의 시간을 평가함으로써 평가할 수 있다. 내성의 획득 및/또는 민감성의 유지의 변화는 개인 집단에서 치료법에 대한 반응, 반응의 지속기간, 및/또는 진행까지의 시간의 변화, 예를 들어 부분적인 반응 및 완전한 반응의 수의 변화에 근거할 수 있다.

상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 암은 고형 종양암이다. 일부 실시태양에서, 상기 암은 위암이다. 일부 실시태양에서, 상기 암은 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암(NSCL))이다. 일부 실시태양에서, 상기 암은 유방암이다. 일부 실시태양에서, 상기 암은 결장직장암(예를 들어, 결장암 및/또는 직장암)이다. 일부 실시태양에서, 상기 암은 기저세포 암종이다. 상기 암들 중 임의의 암의 일부 실시태양에서, 상기 암은 선암종이다. 본 발명에 개시된 복합 치료 방법들 중 임의의 방법에서 암은 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 포함하는 치료 방법을 시작할 때 상기 표적 치료제만을 포함하는 치료 방법에 대해 민감성일 수 있다(민감성의 예는 비제한적으로 반응성이고/이거나 현저한 반응(예를 들어, 부분적인 반응 및/또는 완전한 반응)을 생성시킬 수 있음을 포함한다). 본 발명에 개시된 복합 치료 방법들 중 임의의 방법에서 암은 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및 상기 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 포함하는 치료 방법을 시작할 때 상기 표적 치료제만을 포함하는 치료 방법에 대해 내성이 아닐 수 있다(내성의 예는 비제한적으로 반응성이 아니고/아니거나 현저한 반응(예를 들어, 부분적인 반응 및/또는 완전한 반응)을 생성시키는 능력이 감소되고/되거나 상기 반응을 생성시킬 수 없음을 포함한다).

상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 실시태양들 중 임의의 실시태양에 따른 개인은 인간일 수 있다.

상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기에 나타낸 복합 치료법은 병행 투여(2개 이상의 치료제가 동일하거나 별도의 제형 중에 포함된다), 및 분리된 투여(이 경우에 본 발명의 길항물질의 투여는 추가적인 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 상기 투여와 동시에, 상기 투여에 연속적으로, 상기 투여와 동반하여, 및/또는 상기 투여에 이어서 발생할 수 있다)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 복합 치료법은 방사선 치료법 및/또는 추가적인 치료제를 추가로 포함한다.

본 발명에 개시된 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 임의의 적합한 수단, 예를 들어 경구, 비경구, 폐내, 및 비내, 및 국소 치료가 요구되는 경우, 병변내 투여에 의해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 부분적으로 투여가 짧은지 또는 만성적인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 본 발명에서는 비제한적으로 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여 스케줄이 고려된다.

본 발명에 개시된 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 양호한 의학적 실행과 일관되는 방식으로 제형화하고, 복용시키고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개인 환자의 임상적 조건, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)는 문제의 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와, 필요하지는 않지만, 임의로 제형화한다. 상기와 같은 다른 작용제의 유효량은 상기 제형 중에 존재하는 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 양, 질환 또는 치료제의 유형, 및 상기에 논의된 다른 인자들에 따라 변한다. 이들은 본 발명에 개시된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로에 따라, 또는 본 발명에 개시된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 일반적으로 사용된다.

질병의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명에 개시된 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)(단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)의 적합한 투여량은 치료되는 질병의 유형, 상기 질병의 중증도 및 과정, 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)가 예방 또는 치료 목적으로 사용되는지의 여부, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체)에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변할 것이다. 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체)를 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여한다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여를 위해서, 상기 조건에 따라, 상기 치료를 일반적으로는 질병 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어, 상기 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 수용하도록) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수도 있다. 예시적인 복용 섭생은 투여를 포함한다. 그러나, 다른 복용 섭생이 유용할 수도 있다. 상기 치료법의 진행을 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링한다.

상기 제형들 또는 치료 방법들 중 어느 하나를 상기 ALDH 억제제 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)로서 면역접합체를 사용하여 수행할 수도 있다.

III . 치료 조성물

본 발명은 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)를 포함하는 조합을 제공한다. 하나의 태양에서, 암의 치료를 위해 동시에 또는 연속적으로 사용하기 위한 a) 제 1 성분으로서 유효량의 ALDH 억제제 및 b) 제 2 성분으로서 유효량의 표적화제(표적 치료제)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 조합은 단독으로 투여되는 표적 치료제의 효능을 증가시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 조합은 상기 표적 치료제에 대해 내성인 암의 발생을 지연시키고/시키거나 방지한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 조합은 암에 걸린 개인에게서 상기 표적 치료제 민감성 기간을 연장시킨다.

또한, 본 발명은 본 발명에 개시된 복합 치료 방법에 유용한 ALDH 억제제 및/또는 표적 치료제를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제 및/또는 표적 치료제는 항체, 결합 폴리펩타이드, 결합 소분자 및/또는 폴리뉴클레오타이드이다.

본 발명에 개시된 복합 치료 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L1, ALDH1L2, ALDH2, ALDH3A1, ALDH3A2, ALDH3B1, ALDH3B2, ALDH4A1, ALDH5A1, ALDH6A1, ALDH7A1, ALDH8A1, ALDH9A1, ALDH16A1, 및/또는 ALDH18A1 중 하나 이상을 억제시킨다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 ALDH 억제제는 ALDH의 다수의 이소자임 중 하나 이상의 활성을 억제시킬 수 있는 화합물이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 범-ALDH 억제제이다. ALDH 억제제는 비제한적으로 다이설피람, 코프린, 시안아미드, 1-아미노사이클로프로판올(ACP), 다이드진(즉 4',7-다이하이드록시이소플라본의 7-글루코사이드), 세팔로스포린, 당뇨억제성 설포닐 유레아, 메트로니다졸, 다이에틸다이티오카바메이트, 펜에틸 이소티오시아네이트(PEITC), 프루네틴(4',5-다이하이드록시-7-메톡시이소플라본), 5-하이드록시다이드진(제니스틴), 및 ALDH-억제 활성을 나타내는 이들의 대사산물 또는 유사체들 중 임의의 것을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 다이설피람 또는 그의 ALDH-억제성 대사산물이다. 상기와 같은 대사산물은, 예를 들어 S-메틸 N,N-다이에틸다이티오카바메이트, S-메틸 N,N-다이에틸다이티오카바메이트 설폭사이드, 및 S-메틸 N,N-다이에틸티오카바메이트 설폭사이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 다이설피람이다. 상기 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 고시폴 및/또는 그의 ALDH-억제 유도체 또는 대사산물이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 고시폴이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제는 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌)이다.

ALDH 억제제는 또한 하기 화학식 I의 화합물을 포함한다:

[화학식 I]

상기 식에서,

R₁은 수소, 카복시, 할로, 분지되거나 비분지된 (C₁-C₆)할로알킬, (C₃-C₆)사이클로알콕시, (C₁-C₆)할로알콕시, (C₃-C₆)사이클로할로알콕시, (C₃-C₆)사이클로알콕시알킬, (C₁-C₆)알콕시(C₃-C₆)사이클로알킬, (C₃-C₆)사이클로알킬카보닐, 치환되거나 비치환된 페닐, 페닐(C₁-C₆)알킬, 헤테로사이클릴, 및 헤테로사이클릴옥시, 헤테로사이클릴카보닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기에서 치환체들은 1 내지 4개이고 할로, 아미노카보닐, 아미노티오카보닐, 카복시, 폼일, 하이드록시, 아미노, 카바모일, (C₁-C₃)알킬, (C₁-C₃)할로알킬, (C₁-C₃)알콕시, (C₁-C₃)할로알콕시, (C₁-C₃)알킬아미노, 다이(C₁-C₃)알킬아미노, (C₁-C₂)알콕시(C₁-C₂)알킬, (C₁-C₂)알킬아미노(C₁-C₂)알킬, 다이(C₁-C₂)알킬아미노(C₁-C₂)알킬, (C₁-C₃)알킬카보닐, (C₁-C₃)알콕시카보닐, (C₁-C₃)알킬아미노카보닐 및 다이(C₁-C₃)알킬아미노카보닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R₂는 수소 및 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R₃은 수소, (C₁-C₆)알콕시카보닐, 카복시 및 당으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R₄는 수소 및 하이드록사이드로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R₅는 수소, 카복시, 하이드록시, 할로, 분지되거나 비분지된 (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)할로알킬, (C₂-C₆)알케닐, (C₃-C₆)알카다이에닐, (C₁-C₆)알콕시, (C₃-C₆)사이클로알콕시, (C₁-C₆)할로알콕시, (C₃-C₆)사이클로할로알콕시, (C₂-C₆)알키닐옥시, (C₁-C₆)알콕시(C₁-C₆)알킬, (C₃-C₆)사이클로알콕시알킬, (C₁-C₆)알콕시(C₃-C₆)사이클로알킬, (C₁-C₆)알킬카보닐, (C₃-C₆)사이클로알킬카보닐, (C₁-C₆)알콕시카보닐, (C₄-C₆)알콕시카보닐알킬, (C₁-C₆)하이드록시알킬, 치환되거나 비치환된 페닐, 페닐(C₁-C₆)알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴옥시, 헤테로사이클릴카보닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기에서 치환체들은 1 내지 4개이고 할로, 아미노카보닐, 아미노티오카보닐, 카복시, 폼일, 하이드록시, 아미노, 카바모일, (C₁-C₃)알킬, (C₁-C₃)할로알킬, (C₁-C₃)알콕시, (C₁-C₃)할로알콕시, (C₁-C₃)알킬아미노, 다이(C₁-C₃)알킬아미노, (C₁-C₂)알콕시(C₁-C₂)알킬, (C₁-C₂)알킬아미노(C₁-C₂)알킬, 다이(C₁-C₂)알킬아미노(C₁-C₂)알킬, (C₁-C₃)알킬카보닐, (C₁-C₃)알콕시카보닐, (C₁-C₃)알킬아미노카보닐 및 다이(C₁-C₃)알킬아미노카보닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R₆은 수소 및 하이드록사이드로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R₇은 수소, 할로겐 및 (C₁-C₆)알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된다.

ALDH 억제제는 또한 CAS 등록 번호 1069117-57-2, 1069117-56-1, 1069117-55-0, 1055417-23-6, 1055417-22-5, 1055417-21-4, 1055417-20-3, 1055417-19-0, 1055417-18-9, 1055417-17-8, 1055417-16-7, 1055417-15-6 및 1055417-13-4를 갖는 화합물들, 및 이들의 염을 포함한다.

ALDH 억제제는 또한 하기 화학식의 화합물을 포함한다:

상기 식에서,

R₁, R₂ 및 R₃은 독립적으로 포화되거나 불포화된 선형 또는 분지된 (C₁-C₆)알킬 라디칼, 또는 그의 염을 나타낸다.

ALDH 억제제는 또한 4-아미노-4-메틸-2-펜틴티오산 (S)-메틸 에스터, 및 그의 염을 포함한다.

본 발명에 개시된 복합 치료 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 TKI이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET/HGF 억제제, ALK 억제제, BRAF 억제제, ROS1 억제제 및/또는 MEK 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 TKI는 RTKI이다. 일부 실시태양에서, 상기 RTKI는 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET/HGF 억제제 및/또는 ALK 억제제이다.

본 발명에 개시된 복합 치료 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 EGFR 억제제이다. 예시적인 EGFR 억제제(항-EGFR 항체)는 항체, 예를 들어 니모투주맵(와이엠 바이오사이언시즈)으로서 공지된 인간화된 단클론 항체, 완전 인간 ABX-EGF(파니투뮤맵, 아브제닉스 인코포레이티드(Abgenix Inc.))뿐만 아니라 E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 및 E7.6.3으로서 공지되고 미국특허 US 6,235,883에 개시된 바와 같은 완전 인간 항체; MDX-447(메다렉스 인코포레이티드(Medarex Inc))를 포함한다. 페르투주맵(2C4)은 HER2에 직접 결합하지만 HER2-EGFR 이량체화를 방해하여 EGFR 신호전달을 억제하는 인간화된 항체이다. EGFR에 결합하는 항체의 다른 예는 GA201(RG7160; 로슈 글리카트 아게(Roche Glycart AG)), MAb 579(ATCC CRL HB 8506), MAb 455(ATCC CRL HB8507), MAb 225(ATCC CRL 8508), MAb 528(ATCC CRL 8509)(미국특허 US 4,943,533(Mendelsohn et al .)을 참조하시오) 및 이들의 변이체, 예를 들어 키메라화된 225(C225 또는 세툭시맵; 에르부틱스(ERBUTIX)(등록상표)) 및 개장된 인간 225(H225)(WO 96/40210(임클론 시스템스 인코포레이티드(Imclone Systems Inc.))을 참조하시오); IMC-11F8, 완전 인간, EGFR-표적 항체(임클론); II형 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체(미국특허 US 5,212,290); 미국특허 US 5,891,996에 개시된 바와 같은 EGFR에 결합하는 인간화된 및 키메릭 항체; EGFR에 결합하는 인간 항체, 예를 들어 ABX-EGF(WO 98/50433(아브제닉스)을 참조하시오); EMD 55900(문헌[Stragliotto et al . Eur . J. Cancer 32A:636-640 (1996)]); EMD7200(마투주맵) EGFR 결합에 대해서 EGF 및 TGF-알파 모두와 경쟁하는 EGFR에 대한 인간화된 EGFR 항체; 및 mAb 806 또는 인간화된 mAb 806(문헌[Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)])을 포함한다. 상기 항-EGFR 항체를 세포독성제와 접합시키고, 따라서 면역접합체를 생성시킬 수도 있다(예를 들어, EP 659,439 A2(메르크 파텐트 게엠베하(Merck Patent GmbH))를 참조하시오). 일부 실시태양에서, 상기 항-EGFR 항체는 세툭시맵이다. 일부 실시태양에서, 상기 항-EGFR 항체는 파니투뮤맵이다. 일부 실시태양에서, 상기 항-EGFR 항체는 잘루투뮤맵, 니모투주맵, 및/또는 마투주맵이다.

상기 방법들에 유용한 항-EGFR 항체는 EGFR에 충분한 친화성 및 특이성으로 결합하고 EGFR 활성을 감소시키거나 억제시킬 수 있는 임의의 항체를 포함한다. 상기 선택된 항체는 통상적으로 EGFR에 대해 충분히 강한 결합 친화성을 가질 것이다, 예를 들어 상기 항체는 인간 c-met에 100 nM 내지 1 pM의 Kd 값으로 결합할 수 있다. 항체 친화성을, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기재 분석(예를 들어, PCT 특허출원공개 WO 2005/012359에 개시된 바와 같은 비아코어 분석); 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA); 및 경쟁 분석(예를 들어, RIA)에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항-EGFR 항체를 EGFR/EGFR 리간드 활성이 관련된 질병 또는 상태를 표적화하고 방해하는 치료제로서 사용할 수 있다. 또한, 상기 항체에 대해, 예를 들어 치료제로서 그의 유효성을 평가하기 위해서 다른 생물 활성 분석을 가할 수 있다. 상기와 같은 분석은 당해 분야에 공지되어 있으며 표적 항원 및 상기 항체에 대해 의도된 용도에 따라 변한다. 일부 실시태양에서, EGFR 가지를, 상기 EGFR-발현 세포에 대한 세포 방어 기전을 집중시키기 위해서 백혈구상의 촉발 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자(예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR), 예를 들어 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)에 결합하는 가지와 결합시킬 수도 있다. 이중특이성 항체를 또한 EGFR을 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시키기 위해 사용할 수도 있다. 이들 항체는 EGFR-결합 가지 및 상기 세포독성제(예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 가지를 갖는다. 이중특이성 항체를 전장 항체로서 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')₂ 이중특이성 항체)으로서 제조할 수 있다.

예시적인 EGFR 억제제는 또한 US 5,616,582, US 5,457,105, US 5,475,001, US 5,654,307, US 5,679,683, US 6,084,095, US 6,265,410, US 6,455,534, US 6,521,620, US 6,596,726, US 6,713,484, US 5,770,599, US 6,140,332, US 5,866,572, US 6,399,602, US 6,344,459, US 6,602,863, US 6,391,874, WO 98/14451, WO 98/50038, WO 99/09016, WO 99/24037, WO 99/35146, WO 01/32651, US 6,344,455, US 5,760,041, US 6,002,008, 및/또는 US 5,747,498에 개시된 화합물과 같은 소분자들을 포함한다. 특정한 소분자 EGFR 길항물질은 OSI-774(CP-358774, 에를로티니브, 오에스아이 파마슈티칼스(OSI Pharmaceuticals)); PD 183805(CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 다이하이드로클로라이드, 화이자 인코포레이티드); 이레사(Iressa)(등록상표)(ZD1839, 제피티니브, 아스트라제네카(AstraZeneca)); ZM 105180((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, 제네카(Zeneca)); BIBX-1382(N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-다이아민, 뵈링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim)); PKI-166((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-하이드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785(N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); EKB-569(N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(다이메틸아미노)-2-부텐아미드); 라파티니브(타이커브(Tykerb), 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)); ZD6474(작티마(Zactima), 아스트라제네카); CUDC-101(큐리스(Curis)); 카네르티니브(CI-1033); AEE788(6-[4-[(4-에틸-1-피페라지닐)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민, WO 2003/013541, 노바티스(Novartis)) 및 PKI166(4-[4-[[(1R)-1-페닐에틸]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀, WO 97/02266, 노바티스)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 EGFR 길항물질은 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민 및/또는 그의 약학적으로 허용되는 염(예를 들어, N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민-HCl)이다. 일부 실시태양에서, 상기 EGFR 길항물질은 제피티니브 및/또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다. 일부 실시태양에서, 상기 EGFR 길항물질은 라파티니브 및/또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다. 일부 실시태양에서, 상기 EGFR 길항물질은 제피티니브 및/또는 에를로브티니브이다.

본 발명에 개시된 복합 치료 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 HGF/MET 억제제이다. 예시적인 HGF/MET 억제제(항-HGF 및/또는 항-MET 항체)는 항체, 예를 들어 WO 05/016382에 개시된 항-MET 항체(비제한적으로 항체 13.3.2, 9.1.2, 8.70.2, 8.90.3 포함); 제노아(Genoa)의 CBA에 ICLC 번호 PD 03001로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되거나, HGF 수용체의 β 쇄의 세포외 도메인상의 에피토프를 인식하고 상기 에피토프가 단클론 항체에 의해 인식되는 바와 동일한 항-met 항체; WO 2007/126799에 개시된 항-met 항체(비제한적으로 04536, 05087, 05088, 05091, 05092, 04687, 05097, 05098, 05100, 05101, 04541, 05093, 05094, 04537, 05102, 05105, 04696, 04682 포함); WO 2009/007427에 개시된 항 met 항체(비제한적으로 2007년 3월 14일자로 프랑스 파리 소재의 파스퇴르 연구소, CNCM에 번호 I-3731로서, 2007년 3월 14일자로 번호 I-3732로서, 2007년 7월 6일자로 번호 I-3786으로서, 2007년 3월 14일자로서 번호 I-3724로서 기탁된 항체 포함); WO 2011/0129481에 개시된 항-met 항체; US 2011/0104176에 개시된 항-met 항체; WO 2009/134776에 개시된 항-met 항체; WO 2010/059654에 개시된 항-met 항체; WO 2011/020925에 개시된 항-met 항체(비제한적으로 2008년 3월 12일자로 프랑스 파리 소재의 파스퇴르 연구소, CNCM에 번호 I-3949로서 기탁된 하이브리도마 및 2010년 1월 14일자로 번호 I-4273으로서 기탁된 하이브리도마로부터 분비된 항체 포함); 및/또는 MetMAb(오나르투주맵) 또는 그의 바이오시밀러 버전(WO 2006/015371; 문헌[Jin et al., Cancer Res(2008) 68:4360])을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 MET/HGF 억제제는 오나르투주맵이다.

본 발명에 개시된 복합 치료 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 MET/HGF 억제제는 항-간세포 성장 인자(HGF) 항체, 예를 들어 인간화된 항-HGF 항체 TAK701, 릴로투주맵, 피클라투주맵, 및/또는 WO 2007/143090에 개시된 인간화된 항체 2B8이다. 일부 실시태양에서, 상기 항-HGF 항체는 US 7,718,174 B2에 개시된 항-HGF 항체이다.

본 발명에 개시된 복합 치료 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 MET/HGF 억제제는 SGX-523, 크리조티니브(PF-02341066; 3-[(1R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일피라졸-4-일)피리딘-2-아민; CAS 번호 877399-52-5); JNJ-38877605(CAS 번호 943540-75-8), BMS-698769, PHA-665752(화이자), SU5416, INC-280(인사이트(Incyte); SU11274(수젠(Sugen); [(3Z)-N-(3-클로로페닐)-3-({3,5-다이메틸-4-[(4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-1H-피롤-2-일}메틸렌)-N-메틸-2-옥소인돌린-5-설폰아미드; CAS 번호 658084-23-2]), 포레티니브(GSK1363089), XL880(CAS 번호 849217-64-7; XL880은 MET/HGF 및 VEGFR2 및 KDR의 억제제이다); MGCD-265(메틸젠(MethylGene); MGCD-265는 met, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, Ron 및 Tie-2 수용체들을 표적화한다; CAS 번호 875337-44-3), 티반티니브(ARQ 197; (-)-(3R,4R)-3-(5,6-다이하이드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-1-일)-4-(1H-인돌-3-일)피롤리딘-2,5-다이온; 문헌[Munchi et al, Mol Cancer Ther June 2010 9; 1544]을 참조하시오; CAS 번호 905854-02-6), LY-2801653(릴리(Lilly)), LY2875358(릴리), MP-470, 릴로투뮤맵(AMG 102, 항-HGF 단클론 항체), 항체 223C4 또는 인간화된 항체 223C4(WO 2009/007427), 인간화된 L2G7(인간화된 TAK701; 인간화된 항-HGF 단클론 항체); EMD 1214063(메르크 소로노(Merck Sorono)), EMD 1204831(메르크 세로노(Merck Serono)), NK4, 카보잔티니브(XL-184, CAS 번호 849217-68-1; 카보잔티니브는 M ET/HGF 및 VEGFR2의 이중 억제제이다), MP-470(슈퍼젠(SuperGen); c-KIT, MET, PDGFR, Flt3, 및 AXL의 신규 억제제이다), Comp-1, 피클라투주맵(AV-299; 항-HGF 단클론 항체), E7050(CAS 번호 1196681-49-8; E7050은 이중 MET/HGF 및 VEGFR2 억제제이다(에사이(Esai)); MK-2461(메르크; N-((2R)-1,4-다이옥산-2-일메틸)-N-메틸-N'-[3-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-옥소-5H-벤조[4,5]사이클로헵타[1,2-b]피리딘-7-일]설파미드; CAS 번호 917879-39-1); MK8066(메르크), PF4217903(화이자), AMG208(암젠(Amgen)), SGX-126, RP1040, LY2801653, AMG458, EMD637830, BAY-853474, DP-3590 중 임의의 하나이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 met 억제제는 크리조티니브, 티반티니브, 카보잔티니브, MGCD-265, 피클라투주맵, 인간화된 TAK-701, 릴로투뮤맵, 포레티니브, h224G11, DN-30, GDC-0712, MK-2461, E7050, MK-8033, PF-4217903, AMG208, JNJ-38877605, EMD1204831, INC-280, LY-2801653, SGX-126, RP1040, LY2801653, BAY-853474, 및/또는 LA480 중 임의의 하나 이상이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 met 억제제는 크리조티니브, 티반티니브, 카보잔티니브, MGCD-265, 피클라투주맵, 인간화된 TAK-701, 릴로투뮤맵 및/또는 포레티니브 중 임의의 하나 이상이다. 일부 실시태양에서, 상기 met 억제제는 크리조티니브이다.

본 발명에 개시된 복합 치료 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 BRAF 억제제이다. 예시적인 BRAF 억제제는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 소라페니브, PLX4720, PLX-3603, 다브라페니브(GSK2118436), GDC-0879, RAF265(노바티스), XL281, ARQ736, BAY73-4506, 베무라페니브, 및 WO 2007/002325, WO 2007/002433, WO 2009/111278, WO 2009/111279, WO 2009/111277, WO 2009/111280 및 미국특허 US 7,491,829에 개시된 것들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 BRAF 억제제는 선택적인 BRAF 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 BRAF 억제제는 BRAF V600의 선택적인 억제제이다. 일부 실시태양에서, BRAF V600은 BRAF V600E, BRAF V600K, 및/또는 V600D이다. 일부 실시태양에서, BRAF V600은 BRAF V600R이다. 일부 실시태양에서, 상기 BRAF 억제제는 베무라페니브이다. 일부 실시태양에서, 상기 BRAF 억제제는 베무라페니브이다.

베무라페니브(RG7204, PLX-4032, CAS 등록번호 1029872-55-5)는 다양한 암 세포주들, 예를 들어 흑색종 세포주에서 예정 세포사멸을 야기하는 것으로 나타났다. 베무라페니브는 BRAF/MEK/ERK 경로상의 BRAF/MEK 단계를 중단시킨다(상기 BRAF가 공통의 V600E 돌연변이를 갖는 경우). 베무라페니브는 환자, 예를 들어 FDA에 의해 승인된 바와 같은 흑색종 환자(그의 암은 V600E BRAF 돌연변이(즉 BRAF 단백질상의 아미노산 위치 600번에서, 정상적인 발린이 글루탐산에 의해 치환된다)를 갖는다)에서 작용한다. 흑색종의 약 60%는 V600E BRAF 돌연변이를 갖는다. 상기 V600E 돌연변이는 다양한 다른 암들, 예를 들어 림프종, 결장암, 흑색종, 갑상선암 및 폐암 중에 존재한다. 베무라페니브는 하기의 구조를 갖는다:

젤보라프(ZELBORAF)(등록상표)(베무라페니브)(제넨텍 인코포레이티드(Genentech, Inc.))는 미국에서 승인된 약품이며, FDA-승인된 시험에 의해 검출되는 바와 같이 BRAF V600E 돌연변이를 갖는 절제불가능하거나 전이성인 흑색종이 있는 환자의 치료에 대한 적응증을 갖는다. 젤보라프(베무라페니브)는 상기 BRAF V600E 돌연변이가 없는 흑색종(야생형 BRAF 흑색종) 환자에는 사용이 권장되지 않는다.

본 발명에 개시된 복합 치료 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 ALK 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALK 억제제는 크리조티니브이다. 크리조티니브(또한 PF-02341066 또는 1066으로서 공지됨)는 화이자 인코포레이티드에 의해 개발되고 있는 아미노피리딘 화학물질 시리즈의 Met 및 ALK(미분화 림프종 키나제) 억제제이다(문헌[Zou et al ., Cancer Research 67: 4408-4417, 2007] 및 보충 데이터를 참조하시오). 다른 예시적인 ALK 억제제는, 예를 들어 TAE-684(노바티스로부터; 문헌[Galkin, et al ., Proc. National Acad. Sci. 104(1) 270-275, 2007]을 참조하시오), AP26113(아리아드 파마슈티칼스 인코포레이티드(Ariad Pharmaceuticals, Inc.)), 및 CEP-14083, CEP-14513, 및 CEP-11988(세팔론(Cephalon); 문헌[Wan et al ., Blood 107: 1617-1623, 2006]을 참조하시오); 및 WHI-P131 및 WHI-P154(이엠디 바이오사이언시즈(EMD Biosciences)), 5-클로로-N⁴-[2-(이소프로필설포닐)페닐]-N₂-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}피리미딘-2,4-다이아민 및 2-[(5-브로모-2-{[2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐]아미노}피리미딘-4-일)아미노]-N-메틸벤젠설폰아미드를 포함한다(문헌[Mosse et al ., Clin Cancer Res . 2009 Sep. 15; 15(18):5609-14, 2009]; 문헌[J. of Med . Chem. 49: 1006-1015, 2006]; 문헌[Cancer Research, (US), 2004, 64: 8919-8923, 2004]; 문헌[Proc. Natl . Acad . Sci. 101:13306-13311, 2004]; 문헌[Annual Review of Medicine, (US) 54: 73, 2003]; 문헌[Science 278: 1309-1312, 1997]; 문헌[Oncogene 14 (4): 439-449, 1997]; 문헌[Oncogene 9: 1567-1574, 1994]; 문헌[Am J Pathol 160: 1487-1494, 2002]; 문헌[Am J Pathol 157: 377-384, 2000]; 문헌[Blood 90: 2901-2910, 1997]; 문헌[Am J. Pathol. 156 (3): 781-9, 2000]; 문헌[J Comb Chem. 8: 401-409, 2006] 및 하기의 미국특허출원공개 US 2010/0152182; US 2010/0099658; US 2010/0048576; US 2009/0286778; US 2009/0221555; US 2009/0186801; US 2009/0118216; US 2009/0099193; US 2008/0176881; US 2008/0090776; US 2008/0300273; WO 2005/097765; WO 2005/009389; WO 2005/016894; WO 2004/080980; 및 WO 2004079326을 참조하시오).

본 발명에 개시된 복합 치료 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 표적 치료제는 MEK 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 MEK 억제제는 MEK1 억제제, MEK2 억제제 및/또는 MEK1/2 억제제이다. 예시적인 MEK 억제제는 비제한적으로 트라메티니브(GSK 1120212), MEK162, 셀루메티니브(AZD 6244, ARRY-142886), 피마설티브(MSC1936369B, AS-703026, AS703026), GDC-0973, GDC-0623, PD-325901, GDC-0973, CI-1040, PD035901을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 Mek 억제제는 셀루메티니브, 피마설티브, GDC-0973, GDC-0623 또는 트라메티니브이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 Mek 억제제는 GDC-0973이다.

GDC-0973(XL518)은 인간 종양에서 빈번히 활성화되는 RAS/RAF/MEK/ERK 경로의 핵심 성분인, 미토젠 활성화된 단백질 키나제 키나제(MAPKK)로서 또한 공지된 MEK의 선택적인 억제제이다. 상기 MEK/ERK 경로의 부적합한 활성화는 외인성 성장 인자의 부재하에서 세포 성장을 촉진한다. 고형 종양에 대해 GDC-0973을 평가하는 임상 시험이 진행 중이다. GDC-0973을 PCT 특허출원공개 WO 2007/044515 A1에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. GDC-0973은 (S)-(3,4-다이플루오로-2-(2-플루오로-4-요오도페닐아미노)페닐)(3-하이드록시-3-(피페리딘-2-일)아제티딘-1-일)메탄온이라는 이름 및 하기의 구조를 갖는다:

트라메티니브(GSK 1120212, CAS 등록번호 871700-17-3)는 N-(3-{3-사이클로프로필-5-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-6,8-다이메틸-2,4,7-트라이옥소-3,4,6,7-테트라하이드로피리도[4,3-d]피리미딘-1(2H)-일}페닐)아세트아미드라는 이름 및 하기의 구조를 갖는다:

상기 TKI 및/또는 RTKI 중 어느 하나의 일부 실시태양에서, 상기 억제제는 관심 폴리펩타이드에 특이적인 억제제, 예를 들어 EGFR, HER2, MET/HGF, ALK, BRAF, ROS1 및/또는 MEK에 특이적인 억제제일 수 있다. 상기 TKI 및/또는 RTKI 중 어느 하나의 일부 실시태양에서, 상기 억제제는 상기 TKI 및/또는 RTKI가 하나 이상의 관심 폴리펩타이드를 억제하는 이중 억제제 또는 범 억제제, 예를 들어 EGFR, HER2, MET/HGF, ALK, BRAF, ROS1 및/또는 MEK, 및 하나 이상의 다른 표적 폴리펩타이드에 특이적인 억제제일 수 있다.

A. 항체

본 발명은 본 발명에 개시된 방법들에 사용하기 위한, ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)와 같은 관심 폴리펩타이드에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 상기 실시태양들 중 임의의 실시태양에서, 항체는 인간화된다. 더욱이, 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 항체는 단클론 항체, 예를 들어 키메릭, 인간화된 또는 인간 항체이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아바디, 또는 F(ab')₂ 단편이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 전장 항체, 예를 들어 본 발명에 정의된 바와 같은 "완전한 IgG1" 항체 또는 다른 항체 부류 또는 이소타입이다.

추가의 태양에서, 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 항체는 하기의 섹션들에 개시된 바와 같은 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다:

1. 항체 친화성

몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 ≤1 μM , ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들어, 10^-8 M 이하, 예를 들어 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 하나의 실시태양에서, Kd를 방사성 표지된 항원 결합 분석(RIA)에 의해 측정한다. 하나의 실시태양에서, 상기 RIA를 관심 항체 및 그의 항원의 Fab 버전을 사용하여 수행한다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성을 표지되지 않은 항원의 적정 시리즈의 존재하에서 최소 농도의 (¹²⁵I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시키고, 이어서 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정한다(예를 들어, 문헌[Chen et al ., J. Mol . Biol . 293:865-881(1999)]을 참조하시오). 상기 분석에 대한 조건들을 확립시키기 위해서, 마이크로티터(MICROTITER)(등록상표) 다중웰 플레이트(써모 사이언티픽)를 밤새 50 mM 나트륨 카보네이트(pH 9.6) 중의 포획 항-Fab 항체(카펠 랩스(Cappel Labs)) 5 ㎍/㎖로 코팅하고, 후속으로 실온(약 23 ℃)에서 2 내지 5시간 동안 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단한다. 비-흡착성 플레이트(Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]-항원을 일련의 관심 Fab 희석물과 혼합한다(예를 들어, 문헌[Presta et al ., Cancer Res . 57:4593-4599 (1997)]에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일관되게). 이어서 상기 관심 Fab를 밤새 배양하지만; 상기 배양을 평형에 확실히 도달하도록 보다 오랜 기간(예를 들어, 약 65시간) 동안 계속할 수도 있다. 그 후에, 상기 혼합물을 실온에서 배양을 위해 상기 포획 플레이트로 옮긴다(예를 들어, 1시간 동안). 이어서 상기 용액을 제거하고 상기 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리솔베이트 20(트윈-20(등록상표))으로 8회 세척한다. 상기 플레이트가 건조되면, 150 ㎕/웰의 섬광제(마이크로신트(MICROSCINT)-20(상표); 팩카드(Packard))를 가하고, 상기 플레이트를 10분 동안 탑카운트(TOPCOUNT)(상표) 감마 계수기(팩카드)상에서 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 경쟁 결합 분석에 사용하기 위해 선택한다.

또 다른 실시태양에 따라, Kd를 비아코어(BIACORE)(등록상표) 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 측정한다. 예를 들어, 비아코어(등록상표)-2000 또는 비아코어(등록상표)-3000(비아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 분석을 고정화된 항원 CM5 칩과 함께 약 10 반응 단위(RU)로 25 ℃에서 수행한다. 하나의 실시태양에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 설명에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8로 5 ㎍/㎖(약 0.2 μM)로 희석시킨 후에 약 10 반응 단위(RU)의 커플링된 단백질이 성취되도록 5 ㎕/분의 유량으로 주입한다. 상기 항원 주입에 이어서, 1 M 에탄올아민을 주입하여 반응하지 않은 군들을 차단시킨다. 동역학 측정을 위해서, Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 ㎕/분의 유량으로 25 ℃에서 0.05% 폴리솔베이트 20(트윈-20(상표)) 계면활성제(PBST)와 함께 PBS 중에서 주입한다. 결합률(k_on) 및 해리율(k_off)을, 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 간단한 1 대 1 랭뮤어 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 상기 평형 해리 상수(Kd)를 비 k_off/k_on로서 계산한다. 예를 들어, 문헌[Chen et al ., J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999)]을 참조하시오. 상기 on-률이 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 10⁶ M^-1s^{- 1}를 초과하는 경우, 상기 on-률을 분광계, 예를 들어 정지-흐름(stop-flow) 구비된 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반식 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO(상표) 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정되는 바와 같이 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS(pH 7.2) 중의 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25 ℃에서의 형광 방출 강도(여기 = 295 ㎚; 방출 = 340 ㎚, 16 ㎚ 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 사용함으로써 측정할 수 있다.

2. 항체 단편

몇몇 실시태양에서, 본 발명에서 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv 및 scFv 단편, 및 하기에 개시된 다른 단편들을 포함한다. 몇몇 항체 단편들에 대한 재고찰을 위해서, 문헌[Hudson et al . Nat . Med . 9:129-134 (2003)]을 참조하시오. scFv 단편의 재고찰을 위해서, 예를 들어 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하시오; 또한 WO 93/16185; 및 미국특허 US 5,571,894 및 US 5,587,458을 참조하시오. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')₂ 단편의 논의에 대해서, 미국특허 US 5,869,046을 참조하시오.

다이아바디는 2가이거나 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al ., Nat . Med. 9:129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조하시오. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 개시되어 있다.

단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 몇몇 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(문헌[Domantis, Inc., Waltham, MA]; 예를 들어 미국특허 US 6,248,516 B1을 참조하시오).

항체 단편을 본 발명에 개시된 바와 같은 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 완전 항체의 단백질분해적 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어, 에스케리키아 콜라이 또는 파지)에 의한 생산에 의해 제조할 수 있다.

3. 키메릭 및 인간화된 항체

몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 키메릭 항체이다. 몇몇 키메릭 항체들이, 예를 들어 미국특허 US 4,816,567; 및 문헌[Morrison et al ., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)]에 개시되어 있다. 일례로, 키메릭 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메릭 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 경우로부터 변화된 "부류 변환된" 항체이다. 키메릭 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 키메릭 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성은 유지하면서, 인간화되어 인간에 대한 면역원성이 감소된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어 CDR(또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시태양에서, 인간화된 항체 중의 일부 FR 잔기는 비-인간 항체(예를 들어, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 개선시킨다.

인간화된 항체 및 그의 제조 방법들이, 예를 들어 문헌[Almagro and Fransson, Front . Biosci . 13:1619-1633 (2008)]에 재고찰되어 있으며, 예를 들어 문헌[Riechmann et al ., Nature 332:323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al ., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국특허 US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321 및 US 7,087,409; 및 문헌[Kashmiri et al ., Methods 36:25-34 (2005)](특이성-결정 영역(SDR) 그래프트화를 개시한다); 문헌[Padlan, Mol . Immunol . 28:489-498 (1991)]("재수면화"를 개시한다); 문헌[Dall'Acqua et al ., Methods 36:43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 개시한다); 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)] 및 문헌[Klimka et al ., Br . J. Cancer, 83:252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근을 개시한다)에 추가로 개시되어 있다.

인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 "최적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Sims et al . J. Immunol . 151:2296 (1993)]을 참조하시오); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 공통서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Carter et al . Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992)]; 및 문헌[Presta et al . J. Immunol ., 151:2623 (1993)]을 참조하시오); 인간 성숙(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Front . Biosci . 13:1619-1633 (2008)]을 참조하시오); 및 FR 라이브러리의 선별로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Baca et al., J. Biol . Chem . 272:10678-10684 (1997)] 및 문헌[Rosok et al ., J. Biol . Chem. 271:22611-22618 (1996)]을 참조하시오)을 포함한다.

4. 인간 항체

몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 기법들을 사용하여 생성시킬 수 있다. 인간 항체는 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol. 5: 368-74 (2001)] 및 문헌[Lonberg, Curr . Opin . Immunol . 20:450-459 (2008)]에 일반적으로 개시되어 있다.

인간 항체를, 항원 공격에 반응하여 완전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 완전 항체를 생산하도록 변형시킨 유전자이식 동물에 투여함으로써 제조할 수 있다. 상기와 같은 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 유전자좌가 교체되거나 염색체외에 존재하거나 상기 동물의 염색체내로 무작위 통합된 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 상기와 같은 유전자이식 마우스에서, 상기 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 유전자이식 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법에 대한 재고찰에 대해서, 문헌[Lonberg, Nat . Biotech . 23:1117-1125 (2005)]을 참조하시오. 또한, 예를 들어 제노마우스(XENOMOUSE)(상표) 기술을 개시하는 미국특허 US 6,075,181 및 US 6,150,584; 휴맵(HuMab)(등록상표) 기술을 개시하는 미국특허 US 5,770,429; K-M 마우스(MOUSE)(등록상표) 기술을 개시하는 미국특허 US 7,041,870, 및 벨로시마우스(VelociMouse)(등록상표) 기술을 개시하는 미국특허출원공개 US 2007/0061900을 참조하시오. 상기와 같은 동물에 의해 생성된 완전 항체로부터의 인간 가변 영역들을, 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수도 있다.

인간 항체를 또한 하이브리도마-기재 방법들에 의해 제조할 수 있다. 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 흑색종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주들이 개시되었다(예를 들어, 문헌[Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; 문헌[Brodeur et al ., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 문헌[Boerner et al ., J. Immunol., 147: 86 (1991)]을 참조하시오). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체들이 또한 문헌[Li et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 개시되어 있다. 추가의 방법들은, 예를 들어 미국특허 US 7,189,826(하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생산을 개시한다) 및 문헌[Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)](인간-인간 하이브리도마를 개시한다)에 개시된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트라이오마 기술)이 또한 문헌[Vollmers and Brandlein, Hist . & Histopath., 20(3):927-937 (2005)] 및 문헌[Vollmers and Brandlein, Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3):185-91 (2005)]에 개시되어 있다.

인간 항체를 또한 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리시킴으로써 생성시킬 수 있다. 이어서, 상기와 같은 가변 도메인 서열을 목적하는 인간 불변 도메인과 결합시킬 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법들을 하기에 개시한다.

5. 라이브러리- 유래된 항체

항체를 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해서 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리시킬 수 있다. 예를 들어, 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해서 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 상기와 같은 라이브러리를 선별하는 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 방법들은, 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al. Methods Mol. Biol. 178:1-37(O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 재고찰되어 있으며, 예를 들어 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554]; 문헌[Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]; 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; 문헌[Marks and Bradbury, Methods Mol. Biol. 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]; 문헌[Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; 문헌[Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 문헌[Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 개시되어 있다.

몇몇 파지 디스플레이 방법들에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리들을 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝하고 파지 라이브러리들 중에서 무작위로 재결합시키고, 이어서 문헌[Winter et al ., Ann . Rev . Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 개시된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별할 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편들을 단일-쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 나타낸다. 면역된 출처로부터의 라이브러리들은 하이브리도마를 제작할 필요 없이 상기 면역원에 대한 높은-친화성 항체를 제공한다. 한편으로, 미경험 레퍼토리들을 문헌[Griffiths et al ., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 개시된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대해 단일 출처의 항체를 제공하도록 클로닝(예를 들어, 인간으로부터)시킬 수 있다. 최종적으로, 미경험 라이브러리를 또한 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol., 227: 381-388 (1992)]에 개시된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머들을 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 성취함으로써 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 개시하는 특허 공보들은 예를 들어 미국특허 US 5,750,373, 및 미국특허출원공개 US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936, 및 US 2009/0002360을 포함한다.

인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편들을 본 발명에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편들로 간주한다.

6. 다중특이성 항체

몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대한 결합 특이성들을 갖는 단클론 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 결합 특이성들 중 하나는 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 몇몇 실시태양에서, 이중특이성 항체는 상기 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이성 항체를 또한 사용하여 상기 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)를 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시킬 수 있다. 이중특이성 항체를 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조할 수 있다.

다중특이성 항체의 제조 기법들은 비제한적으로, 상이한 특이성들을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker et al ., EMBO J. 10: 3655 (1991)]을 참조하시오), 및 "구멍-내-매듭(konb-in-hole)" 공학(예를 들어, 미국특허 US 5,731,168을 참조하시오)을 포함한다. 다중특이성 항체를 또한, 항체 Fc-이종이량체 분자의 제조를 위한 정전기적 조종 효과를 조작하고(WO 　2009/089004 A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시키고(예를 들어, 미국특허 US 4,676,980, 및 문헌[Brennan et al ., Science, 229: 81 (1985)]을 참조하시오); 이중특이성 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 사용하고(예를 들어, 문헌[Kostelny et al ., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]을 참조하시오); 이중특이성 항체 단편의 제조를 위한 "다이아바디" 기술을 사용하고(예를 들어, 문헌[Hollinger et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)]을 참조하시오); 단일-쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하고(예를 들어, 문헌[Gruber et al ., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조하시오); 예를 들어 문헌[Tutt et al . J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 개시된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조할 수 있다.

3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체("옥토퍼스 항체 포함")를 또한, 본 발명에 포함시킨다(예를 들어, US 2006/0025576 A1을 참조하시오).

본 발명의 항체 또는 단편은 또한 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어, US 2008/0069820을 참조하시오).

7. 항체 변이체

a) 글리코실화 변이체

몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체를 상기 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 감소하도록 변경시킨다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실을 편의상 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행할 수 있다.

상기 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기에 부착된 탄수화물을 변경시킬 수도 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 이중촉각(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Wright et al . TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조하시오. 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 이중촉각 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 부착된 퓨코스를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체에서 상기 올리고사카라이드의 변형을 몇몇 개선된 성질들을 갖는 항체 변이체를 생성시키기 위해 수행할 수도 있다.

하나의 실시태양에서, Fc 영역에 부착된(직접 또는 간접적으로) 퓨코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 예를 들어, 상기와 같은 항체 중 퓨코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 상기 퓨코스의 양을, 예를 들어 WO 2008/077546에 개시된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정된 바와 같이 Asn297에 부착된 모든 당구조물들(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대해, Asn297에서 상기 당 쇄 중 퓨코스의 평균량을 계산함으로써 측정한다. Asn297은 상기 Fc 영역 중 대략 297번(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라진 잔기를 지칭하나; Asn297은 또한 297번 위치의 상류 또는 하류 대략 ±3 아미노산에, 즉 항체 중 작은 서열 변동으로 인해 294 내지 300번 위치에 위치할 수도 있다. 상기와 같은 퓨코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국특허출원공개 US 2003/0157108(프레스타 엘(Presta, L.)); 미국특허출원공개 US 2004/0093621(쿄와 하코 코교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조하시오. "탈퓨코실화된" 또는 "퓨코스-결핍된" 항체 변이체에 관한 발행물들의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; 문헌[Okazaki et al. J. Mol . Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki et al ., Biotech . Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈퓨코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 퓨코실화 결함 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka et al . Arch . Biochem . Biophys . 249:533-545 (1986)]; 미국특허 출원 US 2003/0157108 A1(프레스타 엘); 및 WO 2004/056312 A1(아담스(Adams) 등, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki et al . Biotech . Bioeng . 87: 614 (2004)]; 문헌[Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng ., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO 2003/085107을 참조하시오)를 포함한다.

이등분된 올리고사카라이드, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중촉각 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 항체 변이체를 추가로 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체의 예는, 예를 들어 WO 2003/011878(장 메레(Jean-Mairet) 등); 미국특허 US 6,602,684(우마나(Umana) 등); 및 US 2005/0123546(우마나 등)에 개시되어 있다. 상기 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체를 또한 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087(파텔(Patel) 등); WO 1998/58964(라주 에스(Raju, S.)); 및 WO 1999/22764(라주 에스)에 개시되어 있다.

b) Fc 영역 변이체

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본 발명에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입시켜 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명은 일부(전부는 아닌) 효과기 기능(이는 항체 변이체를, 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 몇몇 효과기 기능(예를 들어, 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보로 만든다)을 갖는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 분석을, 항체가 FcγR 결합은 없지만(따라서, ADCC 활성이 없는 듯하다) FcRn 결합 능력은 유지함을 확실히 하기 위해 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포, NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단세포는 FcRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포상의 FcR 발현이 문헌[Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol . 9:457-492 (1991)]의 464 페이지, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예들이 미국특허 US 5,500,362(예를 들어, 문헌[Hellstrom, I. et al . Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)]을 참조하시오) 및 문헌[Hellstrom, I et al ., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985)]; 미국특허 US 5,821,337(문헌[Bruggemann, M. et al ., J. Exp. Med . 166:1351-1361 (1987)]을 참조하시오)에 개시되어 있다. 한편으로, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수도 있다(예를 들어, 유식 세포측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 참조하시오). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al . Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수도 있다. C1q 결합 분석을 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 없음을 확인하기 위해서 수행할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조하시오. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석을 수행할 수도 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996)]; 문헌[Cragg, M.S. et al ., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)]을 참조하시오). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정을 또한 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova, S.B. et al ., Int'l . Immunol . 18(12):1759-1769 (2006)]을 참조하시오).

감소된 효과기 기능을 갖는 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허 US 6,737,056). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체(알라닌으로의 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함(미국특허 US 7,332,581))를 포함한다.

FcR에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 몇몇 항체 변이체들이 개시되어 있다(예를 들어, 미국특허 US 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields et al., J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001)]을 참조하시오). 몇몇 실시태양에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 상기 Fc 영역의 298, 333 및/또는 334번 위치(잔기의 EU 넘버링)의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 예를 들어 미국특허 US 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌[Idusogie et al . J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)]에 개시된 바와 같이, Fc 영역에서, 변경된(즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적인 세포독성(CDC)을 생성시키는 변경을 수행한다.

증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체(RcRn)(모 IgG의 태아로의 전달을 맡고 있다)(문헌[Guyer et al ., J. Immunol . 117:587 (1976)] 및 문헌[Kim et al ., J. Immunol. 24:249 (1994)])에의 개선된 결합을 갖는 항체들이 US 2005/0014934 A1(힌튼(Hinton) 등)에 개시되어 있다. 상기 항체들은 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 상기 Fc 영역을 포함한다. 상기와 같은 Fc 변이체들은 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434에서의 치환(미국특허 US 7,371,826)을 갖는 것들을 포함한다. 또한 Fc 영역 변이체의 다른 예들에 관한 문헌[Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국특허 US 5,648,260; 미국특허 US 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조하시오.

c) 시스테인 조작된 항체 변이체

몇몇 실시태양에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "티오MAb"를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근 가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 상기 항체의 접근 가능한 부위에 위치되며 이를 사용하여 본 발명에 추가로 개시된 바와 같이 상기 항체를 다른 부분, 예를 들어 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시켜 면역접합체를 생성시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상을 시스테인으로 치환시킬 수도 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체를 예를 들어 미국특허 US 7,521,541에 개시된 바와 같이 생성시킬 수 있다.

B. 면역접합체

본 발명은 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체, 또는 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이들의 단편), 또는 본 발명에 개시된 방법에 사용하기 위한 방사성 동위원소에 접합된, 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 추가로 제공한다.

하나의 실시태양에서, 면역접합체는 항체가 하나 이상의 약물, 예를 들어 비제한적으로 메이탄시노이드(미국특허 US 5,208,020, 미국특허 US 5,416,064 및 유럽특허 EP 0 425 235 B1); 오리스타틴, 예를 들어 모노메틸오리스타틴 약물 부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국특허 US 5,635,483, 미국특허 US 5,780,588, 및 미국특허 US 7,498,298을 참조하시오); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체(미국특허 US 5,712,374, US 5,714,586, US 5,739,116, US 5,767,285, US 5,770,701, US 5,770,710, US 5,773,001, US 5,877,296; 문헌[Hinman et al ., Cancer Res . 53:3336-3342 (1993)]; 및 문헌[Lode et al ., Cancer Res . 58:2925-2928 (1998)]을 참조하시오); 안트라사이클린, 예를 들어 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz et al ., Current Med . Chem . 13:477-523 (2006)]; 문헌[Jeffrey et al ., Bioorganic & Med . Chem . Letters 16:358-362 (2006)]; 문헌[Torgov et al ., Bioconj . Chem . 16:717-721 (2005)]; 문헌[Nagy et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:829-834 (2000)]; 문헌[Dubowchik et al ., Bioorg. & Med . Chem . Letters 12:1529-1532 (2002)]; 문헌[King et al ., J. Med . Chem . 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국특허 US 6,630,579를 참조하시오); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들어 도세탁셀, 패클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다.

또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편, 예를 들어 비제한적으로 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모텍신 A 쇄, 알파-사르신, 유동 단백질, 다이안틴 단백질, 미국자리공 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센에 접합된, 본 발명에 개시된 항체를 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들을 방사성접합체의 생산에 이용할 수 있다. 예로서, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소가 있다. 상기 방사성접합체를 검출에 사용하는 경우, 상기 접합체는 섬광조영술 연구용 방사성 원자, 예를 들어 Tc^99m 또는 I¹²³, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(또한 자기 공명 영상화, mri로서 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

항체 및 세포독성제의 접합체를 다양한 이작용성 단백질 결합제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)-프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예를 들어, 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어, 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)-헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어, 비스(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌[Vitetta et al ., Science 238:1098 (1987)]에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 예시적인 상기 항체에 대한 방사성핵종 접합용 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조하시오. 상기 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari et al ., Cancer Res . 52:127-131 (1992)]; 미국특허 US 5,208,020)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 면역접합체 또는 ADC는 명백히, 비제한적으로 가교결합제 시약, 예를 들어 비제한적으로 상업적으로 입수할 수 있는(예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 록포드 소재)로부터) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)로 제조된 상기와 같은 접합체를 고려한다.

C. 결합 폴리펩타이드

결합 폴리펩타이드는 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)에, 바람직하게는 특이적으로 결합하고, 또한, 본 발명에 개시된 바와 같은 방법에 사용하기 위해 제공되는 폴리펩타이드이다. 일부 실시태양에서, 상기 결합 폴리펩타이드는 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)의 길항물질이다.

결합 폴리펩타이드를 공지된 폴리펩타이드 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성하거나, 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제할 수 있다. 결합 폴리펩타이드는 대개 적어도 약 5 아미노산 길이이며, 한편으로 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 아미노산 이상의 길이이고, 여기에서 상기와 같은 결합 폴리펩타이드는 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)에, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다.

결합 폴리펩타이드를 널리 공지된 기법을 사용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이에 관하여, 폴리펩타이드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 폴리펩타이드에 대한 폴리펩타이드 라이브러리의 선별 기법들이 당해 분야에 널리 공지되어 있음에 유의한다(예를 들어, 미국특허 US 5,556,762, US 5,750,373, US 4,708,871, US 4,833,092, US 5,223,409, US 5,403,484, US 5,571,689, US 5,663,143; PCT 특허출원공개 WO 84/03506 및 WO 84/03564; 문헌[Geysen et al ., Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; 문헌[Geysen et al ., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A ., 82:178-182 (1985)]; 문헌[Geysen et al ., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; 문헌[Geysen et al ., J. Immunol . Meth ., 102:259-274 (1987)]; 문헌[Schoofs et al ., J. Immunol ., 140:611-616 (1988)], 문헌[Cwirla, S. E. et al . (1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87:6378]; 문헌[Lowman, H.B. et al . (1991) Biochemistry, 30:10832]; 문헌[Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624]; 문헌[Marks, J. D. et al . (1991), J. Mol . Biol ., 222:581]; 문헌[Kang, A.S. et al . (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 88:8363], 및 문헌[Smith, G. P. (1991) Current Opin . Biotechnol ., 2:668]을 참조하시오). 펩타이드 라이브러리들의 생성 및 이들 라이브러리의 선별 방법들이 또한 US 5,723,286, US 5,432,018, US 5,580,717, US 5,427,908, US 5,498,530, US 5,770,434, US 5,734,018, US 5,698,426, US 5,763,192 및 US 5,723,323에 개시되어 있다.

D. 결합 소분자

본 발명은 상술한 방법들에 사용하기 위한 소분자 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 소분자 표적 치료제(예를 들어, 소분자 TKI(예를 들어, 소분자 RTIK))로서 사용하기 위한 결합 소분자들을 제공한다.

결합 소분자는 바람직하게는 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)에, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 본 발명에 정의된 바와 같은 결합 폴리펩타이드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. 결합 유기 소분자를 공지된 방법을 사용하여 확인하고 화학적으로 합성할 수 있다(예를 들어, PCT 특허출원공개 WO 00/00823 및 WO 00/39585를 참조하시오). 결합 유기 소분자는 대개 크기가 약 2000 달톤 미만, 한편으로 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이며, 여기에서 본 발명에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드에, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 상기와 같은 유기 소분자를 널리 공지된 기법을 사용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이에 관하여, 관심 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 분자에 대한 유기 소분자 라이브러리의 선별 기법들이 당해 분야에 널리 공지되어 있음에 유의한다(예를 들어, PCT 특허출원공개 WO 00/00823 및 WO 00/39585를 참조하시오). 결합 유기 소분자는, 예를 들어 알데하이드, 케톤, 옥심, 하이드라존, 세미카바존, 카브아지드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, N-치환된 하이드라진, 하이드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 다이설파이드, 카복실산, 에스터, 아미드, 유레아, 카바메이트, 카보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 설포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 설포네이트, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 다이올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 설폰아미드, 에폭사이드, 아지리딘, 이소시아네이트, 설포닐 클로라이드, 다이아조 화합물, 산 클로라이드 등일 수 있다.

E. 길항물질 폴리뉴클레오타이드

본 발명은 또한 본 발명에 개시된 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드 길항물질을 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 안티센스 핵산 및/또는 리보자임일 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 관심 유전자, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)의 RNA 전사물의 적어도 일부에 상보성인 서열을 포함한다. 그러나, 절대 상보성(바람직하지만)이 필요한 것은 아니다.

본 발명에서 언급된 "RNA의 적어도 일부에 상보성인" 서열은 상기 RNA와 하이브리드화하여 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있기에 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미하며; 따라서, 이중 가닥 안티센스 핵산의 경우에, 상기 듀플렉스 DNA의 단일 가닥을 시험하거나, 트리플렉스 형성을 분석할 수도 있다. 상기 하이브리드화하는 능력은 상기 안티센스 핵산의 길이 및 상보성의 정도 모두에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 상기 하이브리드화 핵산이 클수록, 보다 많은 염기가, 안정한 듀플렉스(또는 가능한 경우 트리플렉스)를 함유하고 여전히 이를 형성할 수 있는 RNA와 합치한다. 당해 분야의 숙련가는 상기 하이브리드화된 복합체의 융점을 측정하는 표준 과정을 사용함으로써 허용되는 정도의 불합치를 확인할 수 있다.

상기 메시지의 5' 단부, 예를 들어 AUG 개시 코돈을 포함하여 상기 코돈까지의 5' 번역되지 않은 서열에 상보성인 폴리뉴클레오타이드는 번역 억제에 가장 효율적으로 작용할 것이다. 그러나, mRNA의 3' 번역되지 않은 서열에 상보성인 서열도 또한 mRNA의 번역 억제에 유효한 것으로 나타났다. 일반적으로 문헌[Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335]을 참조하시오. 따라서, 상기 유전자의 5'- 또는 3'-번역되지 않은, 비-암호화 영역에 상보성인 올리고뉴클레오타이드를 안티센스 접근법에 사용하여 내인성 mRNA의 번역을 억제할 수 있다. 상기 mRNA의 5' 번역되지 않은 영역에 상보성인 폴리뉴클레오타이드는 AUG 개시 코돈의 보체를 포함할 것이다. mRNA 암호화 영역에 상보성인 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 덜 효율적인 번역 억제제이지만, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. mRNA의 5'-, 3'- 또는 암호화 영역에 하이드리드화하도록 설계되든지 간에, 안티센스 핵산은 길이가 6 뉴클레오타이드 이상이어야 하며, 바람직하게는 길이가 6 내지 약 50 뉴클레오타이드 범위의 올리고뉴클레오타이드이다. 특정 태양에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 10 뉴클레오타이드 이상, 17 뉴클레오타이드 이상, 25 뉴클레오타이드 이상 또는 50 뉴클레오타이드 이상이다.

F. 항체 및 결합 폴리펩타이드 변이체

몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체를 고려한다. 예를 들어, 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체를, 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적합한 변형을 도입시킴으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변형은, 예를 들어 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열내 잔기들로부터의 결실, 및/또는 상기 잔기들 내로의 삽입 및/또는 상기 잔기들의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 최종 구조물에 도달할 수 있도록 만들 수 있으나, 최종 구조물은 목적하는 특징, 예를 들어 항원-결합을 가져야 한다.

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체 및/또는 결합 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 치환 돌연변이에 중요한 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을 표 1에서 "바람직한 치환"의 항목하에 나타낸다. 보다 실질적인 변화를 표 1에서 "예시적인 치환"의 항목하에, 하기에 추가로 개시하는 바와 같이 아미노산 측쇄 부류에 관하여 나타낸다. 아미노산 치환을 관심 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드내에 도입시키고 생성물들을 목적하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해서 선별할 수 있다.

원래 잔기	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신	Leu
Leu (L)	노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신	Leu

아미노산들을 공통 측쇄 성질에 따라 분류할 수도 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적인 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류에 대해 교환함을 수반할 것이다.

G. 항체 및 결합 폴리펩타이드 유도체

몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드를 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가적인 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드의 유도체화에 적합한 부분은 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수 중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드에 부착된 중합체들의 수는 변할 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 부착되는 경우, 이들 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 상기 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형을 비제한적으로, 개선시키고자 하는 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드의 특정한 성질, 상기 항체 유도체 및/또는 결합 폴리펩타이드 유도체를 한정된 조건하에서 치료법에 사용할 것인지의 여부 등을 포함한 고려사항을 기준으로 결정할 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 부분에 대한 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드의 접합체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 비제한적으로 통상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 부분을 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩타이드-비단백질성 부분에 근접한 세포를 죽이는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.

IV . ADLH 억제제 및/또는 목적하는 기능을 갖는 표적 치료제의 선별 및/또는 확인 방법

본 발명에 개시된 방법에 사용하기 위한 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 ALDH 및/또는 타이로신 키나제(예를 들어, 수용체 타이로신 키나제)의 추가적인 길항물질, 예를 들어 본 발명에 제공된 항체, 결합 폴리펩타이드, 및/또는 결합 소분자를 당해 분야에 공지된 다양한 분석들에 의해서 그들의 물리/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 선별하거나, 특성화할 수 있다.

다양한 인간 ALDH 과 구성원들(예를 들어, "이소자임")의 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며 상기 서열을 공개적으로 입수할 수 있다. 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 NP.sub.--000680 (ALDH 1, 구성원 A1); 진뱅크 수탁 번호 NP_000684 (ALDH 1, 구성원 A3); 진뱅크 수탁 번호 AAH02967 및 NP.sub.--000681 (ALDH 2); 진뱅크 수탁 번호 NP.sub.--001026976 (ALDH 3, 구성원 A2, 동형 1); 진뱅크 수탁 번호 CA139494 (ALDH 4, 구성원 A1); 진뱅크 수탁 번호 CAA20248 (ALDH 5, 구성원 A1); 진뱅크 수탁 번호 EAW81160 (ALDH 6, 구성원 A1, 동형 CRA_b); 진뱅크 수탁 번호 AAH02515 (ALDH 7, 구성원 A1); 진뱅크 수탁 번호 NP.sub.--072090 (ALDH 8, 구성원 A1, 동형 1); 진뱅크 수탁 번호 NP.sub.--000687 (ALDH 9, 구성원 A1); 진뱅크 수탁 번호 AAG42417 (ALDH 12); 진뱅크 수탁 번호 AAG42417 (ALDH 12); 진뱅크 수탁 번호 NP.sub.--699160 (ALDH 16); 및 진뱅크 수탁 번호 CAI16766 (ALDH 18, 구성원 A1)을 참조하시오.

야생형 ALDH2 및 ALDH2의 C302S 돌연변이체의 결정 구조는 당해 분야에 공지되어 있으며(미국특허 US 8,124,389), 본 발명에 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 ALDH 억제제의 설계 및 제조에 사용될 수 있다.

몇몇 실시태양에서, ALDH 폴리펩타이드의 원자 좌표를 포함하는 메모리를 포함하는 컴퓨터 시스템이 ALDH 폴리펩타이드의 리간드 결합 부위 화합물을 합리적으로 확인하기 위한 모델로서 유용하다. 상기와 같은 화합물을, 예를 들어 드노보, 또는 공지된 화합물의 변형에 의해 설계할 수 있다. 다른 경우에, 결합 화합물을, ALDH 폴리펩타이드의 분자 모델과 "도킹"하는 지를 측정하기 위해 공지된 화합물들을 시험함으로써 확인할 수도 있다. 상기와 같은 도킹 방법은 당해 분야에 일반적으로 널리 공지되어 있다.

ALDH 결정 구조 데이터를 컴퓨터-모델링 기법과 함께 사용하여 상기 결정 구조 데이터의 분석에 의해 다양한 ALDH-결합 화합물의 결합 모델을 개발할 수 있다. 상기 부위 모델은 부위 표면의 3차원 지형뿐만 아니라 반데르 발스 접촉, 정전기적 상호작용, 및 수소-결합 기회를 포함한 인자들을 특성화한다. 이어서, 컴퓨터 시뮬레이션 기법을 사용하여, 비제한적으로 상기 모델 부위와 접촉하도록 설계된 양성자, 하이드록실기, 아민기, 2가 양이온, 방향족 및 지방족 작용기, 아미드기, 알콜기 등을 포함한 작용기들에 대한 상호작용 위치를 지도화한다. 이들 기를 후보 화합물이 상기 부위에 특이적으로 결합할 예상과 함께 약물특이분자단(pharmacophore) 또는 후보 화합물내로 설계할 수 있다. 따라서, 약물특이분자단 설계는, 상기 약물특이분자단이 일반적으로 비-공유 기전을 통해 부위와 상호작용하지만, 상기 약물특이분자단 내에 있는 상기 후보 화합물이 화학적 상호작용, 예를 들어 수소 결합, 반데르 발스, 정전기적 및 공유 상호작용 중 이용가능한 유형 전부 또는 임의의 유형을 통해 부위와 상호작용하는 능력을 고려함을 포함한다.

컴퓨터 모델링 기법을 사용하는 실제 합성 외에 약물특이분자단 또는 후보 화합물이 ALDH 폴리펩타이드에 결합하는 능력을 분석할 수 있다. 상기 표적(예를 들어, ALDH 폴리펩타이드 결합 부위)을 충분한 결합 에너지(일례로, 10^-2 M 또는 보다 엄격한 정도로 상기 표적과의 해리 상수에 상응하는 결합 에너지)로 결합하는 것으로 컴퓨터 모델링에 의해 지시되는 후보들만을 합성하고, 당해 분야의 숙련가들에게 공지되고/되거나 본 발명에 개시된 효소 분석을 사용하여, ALDH 폴리펩타이드에 결합하고 ALDH 효소 기능을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험할 수 있다. 따라서, 상기 컴퓨터 평가 단계는 적합한 친화성으로 ALDH 폴리펩타이드에 결합할 것 같지 않은 화합물의 불필요한 합성을 피한다.

ALDH 약물특이분자단 또는 후보 화합물을 컴퓨터로 평가하고, 화학적 존재 또는 단편을 ALDH 폴리펩타이드상의 개별적인 결합 표적 부위와 결합하는 그의 능력에 대해 선별 및 선택하는 일련의 단계들에 의해 설계할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 ALDH 폴리펩타이드, 보다 특히 ALDH 폴리펩타이드 상의 표적 부위와 결합하는 능력에 대해 화학적 존재 또는 단편을 선별하는 다수의 방법들 중 하나를 사용할 수 있다. 상기 방법은, 예를 들어 당해 분야에 공지된 ALDH 폴리펩타이드 좌표 또는 상기 좌표들의 부분집합을 근거로, 컴퓨터 스크린상의 표적 부위의 시각적 검사에 의해 시작할 수 있다.

유도 암 세포사멸을 증대시키는 ALDH 억제제를 선택하기 위해서, 표적 치료제(예를 들어, TKI)와 함께, 예를 들어 프로피디움 요오드(PI), 트립판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 지시되는 바와 같은 막 완전성의 상실을, 기준과 비교하여 평가할 수 있다. PI 흡수 분석을 보체 및 면역 효과기 세포의 부재하에서 수행할 수 있다. 종양 세포를 배지 단독 또는 ALDH 및/또는 표적 치료제(TKI)의 적합한 조합을 함유하는 배지와 함께 배양한다. 상기 세포를 3일 기간 동안 배양한다. 각각의 처리에 이어서, 세포 덩어리의 제거를 위해 세포를 세척하고 35 ㎜ 여과기-캡핑된 12x75 튜브(튜브당 1 ㎖, 처리군당 3개 튜브)로 분액하였다. 이어서 튜브는 PI(10 ㎍/㎖)를 수용한다. 샘플을 팩스캔(FACSCAN)(등록상표) 유식 세포계 및 팩스콘버트(FACSCONVERT)(등록상표) 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 사용하여 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 측정되는 바와 같이 배지 단독 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI) 단독에 비해 상기 ALDH 억제제는 통계학적 유의수준의 세포사멸을 유도하는 표적 치료제(예를 들어, TKI)와 함께 세포사멸-유도 항체, 결합 폴리펩타이드 또는 결합 소분자로서 선택될 수 있다.

선별 및/또는 확인 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 상기 후보 ALDH 억제제는 항체, 결합 폴리펩타이드, 결합 소분자, 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 실시태양에서, 상기 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체)는 소분자이다.

V. 약학 제형

본 발명에 개시된 바와 같은 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 길항물질의 약학 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기와 같은 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용되는 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 일부 실시태양에서, ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 길항물질은 결합 소분자, 항체, 결합 폴리펩타이드, 및/또는 폴리뉴클레오타이드이다. 약학적으로 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이며, 상기 담체는 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본 발명에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 간질성 약물 분산제, 예를 들어 용해성 중성-활성 히아루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 용해성 PH-20 히아루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20(하이레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 몇몇 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국특허출원공개 2005/0260186 및 2006/0104968에 개시되어 있다. 하나의 태양에서, sHASEGP를 하나 이상의 추가적인 클리코스아미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 병용한다.

예시적인 동결건조된 제형들이 미국특허 US 6,267,958에 개시되어 있다. 수성 항체 제형은 미국특허 US 6,171,586 및 WO 2006/044908에 개시된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.

본 발명의 제형은 또한 치료하려는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 상기와 같은 활성 성분들은 의도하는 목적에 유효한 양으로 함께 적합하게 존재한다.

활성 성분을, 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 거대유화액 중의 각각의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

서방성 제제를 제조할 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 길항물질을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다.

생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.

VI . 제조 물품

본 발명의 또 다른 태양에서, 상술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 상기 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 함께 유지하며 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본 발명에 개시된 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 길항물질이다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택 상태의 치료에 사용됨을 가리킨다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 함유된 조성물을 갖는 제 1 용기(여기에서 상기 조성물은 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 길항물질을 포함한다); 및 (b) 함유된 조성물을 갖는 제 2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 제조 물품은 용기, 상기 용기상의 표지, 및 상기 용기내에 함유된 조성물을 포함하며; 여기에서 상기 조성물은 하나 이상의 시약(예를 들어, 하나 이상의 생물마커 또는 본 발명에 개시된 생물마커 중 하나 이상에 대한 탐침 및/또는 프라이머에 결합하는 1차 항체), 상기 조성물이 샘플 중 하나 이상의 생물마커의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 가리키는 상기 용기상의 표지, 및 샘플 중 하나 이상의 생물마커의 평가를 위한 시약의 사용 설명서를 포함한다. 상기 제조 물품은 상기 샘플을 제조하고 상기 시약들을 사용하는 것에 대한 일련의 설명서 및 자료를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 제조 물품은 시약, 예를 들어 1차 및 2차 항체를 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 2차 항체는 표지, 예를 들어 효소 표지에 접합된다. 일부 실시태양에서, 상기 제조 물품은 본 발명에 개시된 생물마커 중 하나 이상에 대한 하나 이상의 탐침 및/또는 프라이머를 포함한다.

상기 제조 물품 중 임의의 물품의 일부 실시태양에서, ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 길항물질은 항체, 결합 폴리펩타이드, 결합 소분자, 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 실시태양에서, ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 길항물질은 소분자이다. 일부 실시태양에서, ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 길항물질은 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 단클론 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 인간, 인간화된 또는 키메릭 항체이다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 항체 단편이고 상기 항체 단편은 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)와 결합한다.

본 발명의 상기 실시태양에서 제조 물품은 상기 조성물을 사용하여 특정 상태를 치료할 수 있음을 가리키는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.

상기 제조 물품 중의 다른 임의의 성분들은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 차단 완충제, 세척 완충제, 기질 완충제 등), 효소 표지에 의해 화학적으로 변경되는 다른 시약, 예를 들어 기질(예를 들어, 색원체), 에피토프 검색 용액, 대조용 샘플(양성 및/또는 음성 대조군), 대조용 슬라이드(들) 등을 포함한다.

상기 제조 물품 중 임의의 물품이 ALDH 억제제(예를 들어, 다이설피람 및/또는 그의 유도체) 및/또는 표적 치료제(예를 들어, TKI)의 길항물질 대신에 또는 상기 물질 외에 본 발명에 개시된 면역접합체를 포함할 수도 있는 것으로 생각된다.

실시예

하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 다양한 다른 실시태양들을, 상기에 제공된 일반적인 설명을 제공하여 실행할 수 있는 것으로 생각된다.

실시예 1

물질 및 방법

인간 암 세포주 및 시약

인간 암 세포주를 나트륨 피루베이트, 10% 소 태아 혈청 및 항생제 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 37 ℃에서 5% CO₂의 존재하에서 증식시켰다.

ALDH 활성 분석

판매자의 프로토콜에 따라 재구성된, 보디피 표지된 ALDH 기질(알데플루오르 키트(Aldefluor Kit), 스템 셀 테크놀로지(Stem Cell Technology))을 사용하여 ALDH 활성을 검출하였다. 상기 기질을 RPMI 배지(5 ㎕ 기질/㎖ 배지)에서 희석하고 상기 부착 셀에 가하였다. CO₂ 배양기에서 37 ℃에서 30분 배양 후에, 세포를 RPMI 배지로 2회 세척하고 인큐사이트(IncuCyte) HD 시스템(에센 바이오사이언스(Essen BioScience) 및 10배 대물렌즈를 사용하여 상을 촬영하였다.

유식 세포측정 및 RNA 추출

알데플루오르 분석을 사용하여 카토(Kato) II 모 세포에서 ALDH 활성을 검출하였다. 각각 최고 및 최저 ALDH 활성을 갖는, 모 세포의 약 5%를 차지하는 ALDH^high 및 ALDH^low 세포를 유식 세포측정을 사용하여 분류하였다. DEAB(저온 경쟁 기질)의 존재하에서 상기 보디피 표지된 기질과 함께 배양된 카토 II 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. RNAEasy 컬럼(퀴아겐)을 사용하여 추출한 전체 RNA를 미세배열 기재 유전자 발현 분석에 사용하였다.

세포 생육력 분석

상기 세포를 상기 분석 기간의 끝에서 4% 파라폼알데하이드로 고정시키고 생육력을 수중 1:5000 희석된 핵산 색소 사이토(Syto)60(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 사용하여 측정하였다. 상기 형광 강도를 스펙트라맥스(SpectraMax) M5(여기 635 ㎚ 및 방출 695 ㎚; 몰레큘러 디바이스(Molecular Device))를 사용하여 측정하였다. 생육력을 미처리 대조군의 %로서 나타내었다.

약물 내성 세포의 생성

카토 II 및 GTL-16 DTP를, 모 세포를 1 μM 크리조티니브로 30일 동안 처리하여 생성시켰다. PC9 모 세포를 DTP 생성을 위해 9일 동안 2 μM 에를로티니브로 처리하였다. 모든 경우에 배지를 3일마다 교환하였다.

면역블럿팅

단백질을, 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 NP-40 용해 완충제를 사용하여 세포 펠릿으로부터 추출하였다. 단백질을 SDS-PAGE 젤(바이오레드(BioRad))을 사용하여 분리시키고 면역검출을 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다. ALDH1A1에 대한 항체를 R&D 시스템스로부터 구입하였으며, GAPDH, 절단된 PARP 및 포스포-ATM/ATR 기질 항체를 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터 구입하였고, 포스포-γH2A.x 항체를 밀리포어(Millipore)로부터 구입하였다.

ROS 분석

ROS 분석을 플루오레세인의 카복시 유도체, CM-H₂DCFDA(몰레큘러 프로브스)를 사용하여 수행하였다. 재구성된 ROS 지시약을 DTP를 함유하는 플레이트 중의 생육 배지에 가하고 30분간 배양하였다. DTP를 트립시니-EDTA를 사용하여 상기 플레이트로부터 탈착시키고 ROS 수준을 대조군으로서 처리되지 않은 모 세포를 사용하여 유식 세포측정을 사용하여 검출하였다.

이종이식 종양 연구

PC-9, PC-9-GFP, EBC-1 및 GTL-16 세포를 생육 배지(RPMI 1640, 10% 열-불활성화된 송아지 태아 혈청, 2 mM L-글루타민)에서 80% 세포밀집도로 배양하고 이어서 트립신처리하고, PBS로 1회 세척하고, 행크의 균형 염 용액(HBSS) 또는 HBSS와 매트리젤[환원된 생육 인자; 카탈로그 #356231(비디 바이오사이언시즈, 미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재)]과의 1:1 혼합물에 5x10⁷ 세포/㎖의 최종 농도로 재현탁시켰다. 각각의 이종이식 종양 모델을 면역타협된 마우스의 후방 오른쪽 옆구리에 피하(s.c.) 접종된 5x10⁶ 세포(100 ㎕)를 사용하여 확립시켰다. GTL-16 세포를 누드(nu/nu) 마우스(찰스 리버 레보라토리즈, 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재)에, 매트리젤이 없는 HBSS 중에서 이식하였다. PC-9 및 PC-9-GFP 세포를 누드(nu/nu) 마우스(찰스 리버 레보라토리즈, 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재)에, 매트리젤을 갖는 HBSS 중에서 이식하였다. EBC-1 세포를 누드(nu/nu) 마우스(찰스 리버 레보라토리즈, 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재)에, 매트리젤이 없는 HBSS 중에서 이식하였다. 종양 부피가 약 100 내지 200 ㎣에 도달하면, 마우스를 유사한 크기의 종양을 갖는 10 내지 15마리의 동물 군으로 분리시키고, 분류 당일에 처리를 개시하였다. 마우스에게 GDC-0712(제넨텍 인코포레이티드(Genentech, Inc.) - MET 소분자 억제제, 수중에서 제형화된 100 ㎎/㎏으로), 에를로티니브(7.5% 캡티솔 중 50 ㎎/㎏) 및/또는 다이설피람(시그마 - 테트라에틸티우람, 카탈로그 #86720, 잇꽃유 95%, 벤질 알콜 5% 중에서 제형화된 200 ㎎/㎏으로 투여됨), 또는 단지 상응하는 비히클만을 매일(QD) 경구 위관영양(PO)을 통해 투여하였다. 종양 부피를 디지털 캘리퍼스(프레드 브이 파울러 캄파니 인코포레이티드(Fred V. Fowler Company, Inc.)를 사용하여 식 (L x W x W)/2를 사용하여 측정하였다. 종양 성장 억제(%TGI)를 %TGI = 100 x 1 - (AUC 처리/일)/(AUC 비히클/일)이 되도록 하는, 비히클과 비교된, 하루당 각 용량 군의 정합 곡선 아래 면적(AUC)의 백분율로서 계산하였다. 곡선 정합을 R 패키지 nlme, R v2.12.0에서 버전 3.1-97을 사용하여 선형 혼합-효과(LME) 모델을 사용하여 Log 2 변환된 개별 종양 부피 데이터에 적용시켰다.

씨홀스 분석

약 5,000 모 세포 및 15,000 DTP 세포를 XF 96-웰 세포 배양 미세플레이트(씨홀스바이오사이언스(SeahorseBioscience))에서 웰당 도말하고 5% CO₂ 배양기에서 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 디아설피람 및 NAC 처리를 TKI의 존재하에서 48시간 동안 수행하였다. 산소 소비율(OCR) 및 세포외 산성화율(ECAR) 측정을 바이카보네이트-부재, 혈청-부재, 37 ℃ 예온 배지에서 수행하였다. 분석의 완료 후에, 상기 세포를 4% 파라폼알데하이드로 고정시키고, 획스트(Hoechst)로 염색하고, 4 사분면/웰을 몰레큘러 디바이시즈 이미지엑스프레스(ImageXpress) HCS를 사용하여 영상화하고 평균 핵수/사분면을 계수하였다. 막대 그래프는 6개 웰로부터의 표준화된(세포수) OCR 및 ECAR 측정의 평균 +/- SEM을 나타내었다.

결과

암 줄기 세포 마커 유전자 ALDH1A1은 약물 내성 세포에서 상이하게 발현된다

미세배열 기재 유전자 발현 분석을 수행하여 크리조티니브 내성 카토 II 위암종 세포에서 차별적으로 발현되는 유전자들을 확인하였다. 다수의 상향조절된 유전자 ALDH1A1 가운데, 암 줄기세포 마커 유전자가 약물 내성 지속인자(DTP) 집단에서 확인되었다. 알데플루오르 분석(스템 셀 테크놀로지)을 사용하여 생 카토 II 세포에서의 ALDH 활성을 측정하였으며 높은 ALDH 활성이 카토 II 모 세포의 작은(약 5%) 집단(도 1A) 및 1개월의 크리조티니브 처리 후에 거의 모든 카토 II DTP에서 검출되었다. RNA 단리된 ALDH^high 세포 상에서 수행된 미세배열 기재 유전자 발현 분석은 ALDH^low 세포에 비해 약 8배 상향조절된 유전자의 ALDH 과의 유일한 구성원으로서 ALDH1A1을 확인하였다(도 1B). RNA 수준과 일관되게 카토 II 중의 ALDH1A1 단백질 수준이 카토 II 및 GTL-16 세포(위암종)로부터 유래된 ALDH^high 세포 및 DTP에서 검출되었다(도 1C). 크리조티니브 처리는 24시간 내에 카토 II 모 세포에서 ALDH1A1 단백질 수준을 증가시켰으며(도 1C), 그 후에 임의의 약물 유도된 세포사멸이, 절단된 PARP 단백질 산물의 출현에 의해 측정된 바와 같이 검출되었다(데이터 도시 안 됨). 카토 II 및 GTL-16 세포에서 ALDH1A1 발현의 녹다운은 약물 민감성 또는 DTP 형성에 그다지 영향을 미치지 않았다.

다이설피람, ALDH 억제제는 약물 내성 세포를 살해한다

약물 내성에서 ALDH의 역할을 이해하기 위해서, 카토 II 및 GTL-16 모 세포를 다이설피람(DS)이라 칭하는 비가역적인 ALDH 억제제로 처리하였다. DS 및 그의 대사산물은 다수의 ALDH 과 구성원들의 효소 활성을 억제한다(문헌[Koppaka et al., 2012]). 다이설피람은 단독으로는 상기 암 세포의 생육에 그다지 영향을 미치지 않았지만, 크리조티니브와 함께 약물 내성 카토 II 및 GTL-16 세포를 제거하였다(도 2A, 2B). DS의 유사한 효과가, ALDH1A1을 발현하지 않지만 다른 ALDH 과 구성원은 발현하는 비-소세포 폐암종 PC9 세포상에서 관찰되었다(도 2C). 약 20% PC9 DTP가 에를로티니브에서 10일에 걸쳐 유지될 때 그의 약물 내성 성질을 유지하면서 모 PC9 세포처럼 분열을 시작한다. 에를로티니브 내성 PC9 DTP의 이러한 생육 집단을 약물 내성 확대된 지속인자 또는 DTEP라 칭한다(문헌[Sharma et al., 2010])(DTP가 DS에 훨씬 덜 민감한 것과 달리). 도 2의 막대 그래프는 삼중 웰로부터의 데이터를 나타내며 상기 언급된 3개의 세포주 모두로부터의 DTP의 생육력에 대한 DS 및 TKI의 복합 효과를 예시한다. TKI 노출에 앞서 3 내지 6일 동안 DS 단독에 의한 PC9 및 GTL-16 세포의 전-처리는 DTP를 제거하지 못했으며, 이는 ALDH 활성의 연속적인 억제가 DTP의 살해에 중요함을 가리킨다.

다양한 TKI-DS 조합의 유효성을 유방, 결장 및 폐암 기원하고 다양한 발암유전자에 중독된 8개의 다른 암 세포주 상에서 시험하였다. DS 단독은 상기 생육력에 그다지 영향을 미치지 않았지만, 모든 TKI-DS 조합은 상응하는 DTP의 수를 제거하거나 현저하게 감소시킴에 있어서 매우 유효하였다(도 3). 이러한 결과는 일반적으로 약물 내성 세포의 생존에 대한 ALDH 활성에 따른 상기 세포의 의존성을 더욱 강조하며 다양한 유형의 암의 재발의 지연/제거에 있어서 TKI와 조합된 DS의 사용의 잠재적으로 이로운 효과를 함축한다.

약물 내성 세포는 높은 ROS 수준을 갖는다

암 세포는 그의 정상 대응물에 비해 보다 높은 ROS 수준을 가지며, 이는 세포 증식을 촉진시키는 것으로 여겨진다(문헌[Szatrowski et al ., 1991]; 문헌[Boonstra et al ., 2004]). 화학요법 및 방사선요법에의 노출은 암 세포에서 ROS 수준을 훨씬 더 높이 증가시키며, 이는 막지질의 과산화를 통한 다양한 알데하이드 생성물의 발생을 야기할 수 있다. 말론알데하이드 및 4-하이드록시-노넨알(4-HNE)과 같은 이러한 알데하이드 생성물의 일부는 보다 긴 반감기를 가지며 DNA 손상 및 후속의 세포사멸을 야기할 수 있다(문헌[Chiu et al ., 2012]; 문헌[Casares et al ., 2012], 문헌[Li et al ., 2009]). ROS 수준의 증가에 반응하여 CD133+ 교모세포종 줄기세포의 DNA 수복 경로의 신속한 활성화는 방사선에 대한 내성 기준을 제공한다(문헌[Bao et al. 2006]). ROS를 수반하는 유사한 기전들이 약물 내성에서 역할을 하는지의 여부를 측정하기 위해서, 생물에너지학, ROS 수준, DNA 손상의 정도 및 DNA 수복 경로의 활성을 DTP에서 측정하였다. ROS 수준의 6배 이상의 증가가 모 세포에 비해 PC9 및 GTL-16-유래된 DTP 모두에서 관찰되었다(도 4A). 48시간 동안 DS 처리는 DTP에서 ROS 수준의 추가의 증가를 야기하였으며, 이는 상기 배지에 NAC를 가함으로써 역전될 수 있다. 증가된 ROS 수준은 약물 내성 세포 및 활성화된 DNA 수복 기전에서 증가된 산소 소비율(OCR)(도 4B) 및 증가된 이중-가닥 DNA 절단(도 4C)을 도출하였다. 이러한 결과는 ALDH 과 구성원들이 ROS 스캐빈저 역할을 하며, 이는 DTP의 생존에 중요함을 암시한다.

N-아세틸 시스테인은 DTP에 대한 다이설피람의 치사 효과를 구제한다

이어서, 우리는 NAC 처리가 TKI+DS 처리에 의한 DTP의 살해를 예방하기에 충분한지를 물었다. PC9 및 GTL-16 세포를 에를로티니브 및 크리조티니브 각각에 의해 단독으로 또는 DS 및 NAC와 함께 처리하였다. 예상한 바와 같이 DS 및 TKI 조합은 14일 이내에 모든 PC9 DTP를 살해하였으며, 이는 DS 및 TKI와 함께 첨가될 때 NAC에 의해 거의 완전하게 구제되었다(도 5A). 유사한 결과가 GTL-16 DTP에 의해 획득되었으며, 이때 TKI+DS(도 5B)로 처리하는 동안 NAC의 포함은 DS 유도된 사멸로부터 GTL-16 DTP의 약 80%를 구제하였다.

DS 작용 기전을 이해하기 위해서, GTL-16-유래된 DTP를 48시간 동안 DS 및 NAC로 처리하고 상기 추출된 단백질로 면역블럿 실험을 수행하였다. DS 처리는 ALDH1A1 및 NFκB 수준의 감소를 야기하였고 γH2A.x의 수배 증가를 생성시켰으며, 이는 절단된 PARP 수준의 현저한 증가에 의해 밝혀진 바와 같이 DS 처리된 DTP에서의 광범위한 DNA 손상 및 후속의 세포사멸 경로의 활성화를 암시하였다. NAC, ROS 스캐빈저의 존재는 ALDH1A1 및 NFκB 수준을 복원시켰으며 γH2A.x의 증가 및 DTP의 세포사멸을 예방하였다.

다이설피람은 이종이식 마우스 모델에서 종양 재발을 지연시킨다

이종이식 마우스 모델을 사용하여 생체내 종양 재발 지연/제거에서의 DS의 효능을 조사하였다. 생체내 연구에서 PC9에 대한 치료 섭생을 먼저 시험관내 실험으로 시험하였으며, 여기에서 PC9 세포를 에를로티니브 단독으로 또는 DS와 함께 6일 동안 처리하였다. 상기 에를로티니브, DS 및 상기 에를로티니브+DS 군 중 하나에서의 PC9 DTP를 임의의 약물 없이 생육시킨 반면 다른 에를로티니브+DS 군은 DS를 계속해서 제공하였다. 도 6A에 나타낸 바와 같이, PC9 DTP의 생육의 현저한 지연이, 에를로티니브 군에 비해 2개의 약물이 모두 제거된 에를로티니브+DS 군으로부터 관찰되었다. 예상된 바와 같이, PC9 DTP는 계속해서 DS를 제공받은 에를로티니브+DS 하위-군으로부터 생존하지 못했다. 막대 그래프는 삼중 웰로부터의 데이터를 나타내며, 이는 DS의 효과를 예시한다.

상기 PC9 제노그래프 연구를 위해서 상기 마우스에게 PC9 세포를 접종하고 종양을 100 내지 200 ㎣의 크기까지 성장시켰으며, 이어서 이를 4개의 처리군, 즉 비히클 대조군, DS 대조군, TKI 단독 및 TKI+DS 군으로 분류하였다. 상기 처리를 TKI+DS 군의 동물(연구가 끝날 때까지 계속해서 DS를 제공하였다)을 제외하고 11일 후에 멈추었다. 도 6B에 도시된 바와 같이, PC9 종양의 거의 완전한 역행이 에를로티니브 처리시 관찰되었다. 5xTTP로서 측정된 종양 진행 시간(TTP)은 10 PR 및 1CR과 함께 상기 에를로티니브 처리군의 경우 60일인 반면 상기 에를로티니브+DS 군의 경우 9PR 및 6CR과 함께 평균 종양 크기는 상기 종양의 초기 부피 아래였다(P=0.0007). 상기 세포주 데이터와 일치되게, 이종이식 데이터는 TKI 및 DS 조합이 종양 재발을 현저하게 지연시킬 수 있음을 입증하였다.

참고문헌

문헌[Koppaka, V et al. (2012). Pharmacol Rev 64, 520-539].

문헌[Szatrowski, T.P. and Nathan, C. F. (1991) Cancer Research, 51, 794-798].

문헌[Boonstra, J. and Post, J. A. (2004) Gene, 337, 1-13].

문헌[Chiu, W. H. et al. (2012). Biochemical Pharmacology, 83, 1159-1171].

문헌[Li, Y. et al. (2009). Anti-Cancer Drugs, 20, 770-778].

문헌[Bao, S. et al. (2006) Nature 444:756-760].

상기 발명은 이해의 명확성을 목적으로 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 개시되었지만, 상기 명세서 및 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본 발명에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 내용은 명백히 그의 내용 전체가 참고로 인용된다.

Claims (44)

1. 유효량의 알데하이드 데하이드로게나제(ALDH) 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 암을 치료하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   ALDH 억제제 및 표적 치료제의 각 량이 암 민감성의 기간을 증가시키고/시키거나 표적 치료제에 대한 세포 내성의 발생을 지연시키기에 유효한 방법.
3. 개인에게 유효량의 표적 치료제 및 유효량의 ALDH 억제제를 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제를 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키는 방법.
4. 개인에게서 암을 치료하는 방법으로서, 암 치료가 유효량의 표적 치료제 및 유효량의 ALDH 억제제를 상기 개인에게 동시에 투여함을 포함하고, 상기 암 치료가 상기 표적 치료제 없이(상기 표적 치료제의 부재하에서) 유효량의 상기 표적 치료제를 투여함을 포함하는 표준 치료에 비해 증가된 효능을 갖는 방법.
5. 유효량의 ALDH 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제에 내성인 암의 발생을 지연 및/또는 예방하는 방법.
6. 유효량의 ALDH 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 표적 치료제에 대한 내성이 발생할 가능성이 증가된 암에 걸린 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인을 치료하는 방법.
7. 유효량의 ALDH 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 암에 걸린 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제에 대한 민감성을 증가시키는 방법.
8. 유효량의 ALDH 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 암에 걸린 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 표적 치료제 민감성 기간을 연장시키는 방법.
9. 유효량의 ALDH 억제제 및 유효량의 표적 치료제를 암에 걸린 개인에게 동시에 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 상기 표적 치료제에 대한 반응의 지속기간을 연장시키는 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ALDH 억제제가 소분자 ALDH 억제제인 방법.
11. 제 10 항에 있어서,
    소분자 ALDH 억제제가 다이설피람 또는 그의 ALDH-억제 유도체 또는 대사산물인 방법.
12. 제 10 항에 있어서,
    ALDH 억제제가 N,N-다이에틸[(다이에틸카바모티오일)다이설파닐]카보티오아미드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염인 방법.
13. 제 10 항에 있어서,
    ALDH 억제제가 N,N-다이에틸[(다이에틸카바모티오일)다이설파닐]카보티오아미드인 방법.
14. 제 10 항에 있어서,
    ALDH 억제제가 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염인 방법.
15. 제 10 항에 있어서,
    ALDH 억제제가 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌)인 방법.
16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 치료제가 타이로신 키나제 억제제(TKI)인 방법.
17. 제 16 항에 있어서,
    TKI가 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET 억제제, ALK 억제제, BRAF 억제제, ROS1 억제제 및/또는 MEK 억제제인 방법.
18. 제 16 항에 있어서,
    TKI가 수용체 타이로신 키나제 억제제(RTKI)인 방법.
19. 제 18 항에 있어서,
    RTKI가 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET 억제제 및/또는 ALK 억제제인 방법.
20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    억제제가 항체 억제제, 소분자 억제제, 결합 폴리펩타이드 억제제 및/또는 폴리뉴클레오타이드 길항물질인 방법.
21. 제 16 항에 있어서,
    TKI가 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 에를로티니브인 방법.
22. 제 16 항에 있어서,
    TKI가 N-(4-(3-플루오로벤질옥시)-3-클로로페닐)-6-(5-((2-(메틸설포닐)에틸아미노)메틸)퓨란-2-일)퀴나졸린-4-아민, 다이-4-메틸벤젠설포네이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 라파티니브인 방법.
23. 제 16 항에 있어서,
    TKI가 (S)-N-(2,3-다이하이드록시프로필)-3-(2-플루오로-4-요오도페닐아미노)이소니코틴아미드) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 예를 들어, AS703026인 방법.
24. 제 16 항에 있어서,
    TKI가 베무라페니브인 방법.
25. 제 16 항에 있어서,
    TKI가 3-((R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에톡시)-5-(1-(피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)피리딘-2-아민 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 크리조티니브인 방법.
26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 위암, 폐암, 예를 들어, 비소세포 폐암(NSCL), 결장직장암, 예를 들어, 결장암 및/또는 직장암, 또는 기저세포 암종인 방법.
27. 암의 치료를 위해 동반 사용 또는 연속 사용하기 위한, a) 제 1 성분으로서 유효량의 ALDH 억제제, 및 b) 제 2 성분으로서 유효량의 표적화제를 포함하는 약학 제품.
28. 제 27 항에 있어서,
    ALDH 억제제가 소분자 ALDH 억제제인 약학 제품.
29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
    ALDH 억제제가 다이설피람 또는 그의 ALDH-억제 유도체 또는 대사산물인 약학 제품.
30. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
    ALDH 억제제가 N,N-다이에틸[(다이에틸카바모티오일)다이설파닐]카보티오아미드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염인 약학 제품.
31. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
    ALDH 억제제가 N,N-다이에틸[(다이에틸카바모티오일)다이설파닐]카보티오아미드인 약학 제품.
32. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
    ALDH 억제제가 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염인 약학 제품.
33. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
    ALDH 억제제가 2,2'-비스(폼일-1,6,7-트라이하이드록시-5-이소프로필-3-메틸나프탈렌)인 약학 제품.
34. 제 27 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 치료제가 타이로신 키나제 억제제(TKI)인 약학 제품.
35. 제 34 항에 있어서,
    TKI가 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET 억제제, ALK 억제제, BRAF 억제제, ROS1 억제제 및/또는 MEK 억제제인 약학 제품.
36. 제 34 항에 있어서,
    TKI가 수용체 타이로신 키나제 억제제(RTKI)인 약학 제품.
37. 제 36 항에 있어서,
    RTKI가 EGFR 억제제, HER2 억제제, MET 억제제 및/또는 ALK 억제제인 약학 제품.
38. 제 34 항에 있어서,
    억제제가 항체 억제제, 소분자 억제제, 결합 폴리펩타이드 억제제 및/또는 폴리뉴클레오타이드 길항물질인 약학 제품.
39. 제 34 항에 있어서,
    TKI가 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 특히 에를로티니브인 약학 제품.
40. 제 34 항에 있어서,
    TKI가 N-(4-(3-플루오로벤질옥시)-3-클로로페닐)-6-(5-((2-(메틸설포닐)에틸아미노)메틸)퓨란-2-일)퀴나졸린-4-아민, 다이-4-메틸벤젠설포네이트 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 특히 라파티니브인 약학 제품.
41. 제 34 항에 있어서,
    TKI가 (S)-N-(2,3-다이하이드록시프로필)-3-(2-플루오로-4-요오도페닐아미노)이소니코틴아미드) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 특히 AS703026인 약학 제품.
42. 제 34 항에 있어서,
    TKI가 베무라페니브인 약학 제품.
43. 제 34 항에 있어서,
    TKI가 3-((R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에톡시)-5-(1-(피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)피리딘-2-아민 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 특히 크리조티니브인 약학 제품.
44. 제 27 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 위암, 폐암, 비소세포 폐암(NSCL), 결장암 및/또는 직장암, 또는 기저세포 암종인 약학 제품.

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