KR101671378B1 - ｃ-Ｍｅｔ에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 단편 및 그 용도를 제공한다.
c-Met, 항체, 암, 혈관신생

Description

ｃ-Ｍｅｔ에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도{c-Met specific antibodies and uses thereof}
c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 단편 및 그 용도에 관한 것이다.
c-Met은 간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor, HGF)의 수용체이며, HGF는 c-Met 수용체 티로신 키나제의 세포외 부위에 결합하여 다양한 정상세포와 종 양세포에서 분열, 운동, 형태발생, 혈관형성을 유발하는 사이토카인의 일종이다. c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)로 그 자체가 암유발 유전자이며 때로는 리간드인 HGF와 상관 없이도 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침습, 신생혈관 생성 등과 같은 종양과 관련된 여러 가지 기작에 관여하기 때문에 최근 항암 타겟으로 주목받는 단백질이다.
특히 c-Met은 기존에 알려진 항암제의 작용 기작에서 약물 내성에 관여됨이 알려지면서 더욱 더 개인맞춤형 치료에 중요성이 인식되고 있다. EGFR (ERBB1)을 표적으로 하는 대표적인 항암 치료제인 얼비툭스(Erbitux) 또는 타세바(Tarceva)와 같은 약물은 암 발생 기작과 관련된 신호 전달을 차단함으로써 작동한다. 또한 유 방암 치료제로 잘 알려진 허셉틴(Herceptin)은 ERBB2 (HER2)를 표적으로 세포의 증식에 필요한 신호 전달을 차단함으로써 작동한다. 그러나 상기 약물에 대한 내성이 있는 환자 중, c-Met 단백질의 과발현 등으로 항암제의 작동을 피해 세포의 증식을 유도하는 다른 신호 전달 기작이 활성화된다는 연구들이 최근 발표되고 있다. 이러한 이유로 인해, c-Met은 항암제와 관련하여 다수의 제약사들이 주목하고 있는 표적 분자가 되고 있다.
관련 기술은 c-Met의 작용을 저해하는 항체 치료제를 개시하고 있다. 그러나, 상기 관련 기술은, 항체가 원래의 구조를 가진 경우 c-Met 분자들이 이량체화(dimerization)가 되도록 유발함으로써, 암을 유발하는 문제점이 발견되었다.
c-Met의 작용을 저해하는 항체 치료제를 개시하는 다른 관련 기술은 c-Met의 리간드인 HGF c-Met에 결합하지 못하도록 저해하는 기능은 있으나, 항체 자체의 결합에 의해 리간드와 상관없이 c-Met을 이량체화시켜 오히려 암을 유발하는 신호가 전달되도록 하는 효능제(agonist)로 작용하는 부작용이 발견이 되었다.
또 다른 관련 기술은 c-Met의 이량체화를 방지하기 위해 원래는 효능제 (agonist)인 양팔 항체 (two-armed antibody)를 유전자 재조합 방식으로 변형시킨 c-Met에 대한 한팔 길항(one-armed antagonistic) 항체를 개시하고 있으며, 현재 이에 대한 임상시험 단계의 제품 개발이 진행되고 있다. 그러나 상기 관련 기술에서도 상기 항체는 화학요법과 병용치료일 경우에만 효과를 보이며, 항체를 단독으로 처리하는 경우에는 항암 효과가 크지 않은 것으로 확인되었다.
따라서, 종래 기술에 의하더라도, c-Met의 작용을 저해하는 새로운 치료용 길항 항체(antagonistic antibody) 의 개발이 여전히 요구되고 있다.
c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
약학적 유효량의 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
약학적 유효량의 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 혈관신생으로 인한 질환 또는 암 치료 방법을 제공한다.
약학적 유효량의 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 경우에는 암 세포의 형성 또는 성장이 억제되는 특징을 나타내는 동물 모델을 제공한다.
일 양상은 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.
용어, "c-Met" 또는 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 의미한다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.
용어, "세포외 부위(extracellular region)"는 세포의 세포막을 관통하는(transmembrane) 단백질에서 세포의 외부에 위치하는 단백질의 영역을 의미한다. 또한, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ 1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "단일클론 항체"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단일클론 항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.
상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 면역원인 c-Met 단백질을 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.
상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1-100 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2-5주마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리 콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B세포와 골수종세포를 1:1-10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다. 최종적으로, c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다.
한편, 상기 단일클론 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있으며, 예를 들어, IgG1 타입일 수 있다. 또한, 상기 항체의 경쇄 불변 영역은 λ 또는 κ 형일 수 있다. 또한, 항원으로 사용되는 상기 c-Met 단백질은 인간 또는 마우스 유래인 것일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부 터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
용어 “항체(antibody)”는 c-Met 단백질의 세포외 부위에 대한 특이 항체로서, c-Met 단백질의 세포외 부위에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. 완전한 항체에 대한 설명은 상기 언급한 바와 같다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.
또한, 용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
상기 항체는 단일클론 항체, 이특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항체는 인간화 항체(humanized antibody) 또는 인간 항체(human antibody)일 수 있다. 비-인간, 예를 들어, 마우스의 인간화 항체는 마우스의 면역글로불린으로부터 유도되는 최소 서열을 포함하는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린의 쇄 또는 그의 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 서브서열일 수 있다.
비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 인간화는 필수적으로 설치류 동물의 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체에 상응하는 서열 대신 치환시켜 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 인간화 항체는 키메릭 항체이며, 실질적으로 온전한 인간 항체의 가변 영역보다 적은 영역이 비-인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 골격(framework, FR) 잔기가 설치류 동물의 항체에 있는 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간화 항체일 수 있다.
상기 인간 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변 및 불변영역의 서열이 인간으로부터 유래한 항체를 의미하며, 인간 항체는 파아지 디스플레이 라이브러리를 포함한 당업자에게 널리 알려진 다양한 기술, 예를 들어, 유전적 재조합 기술과 세포공학 기술을 이용하여 생성될 수 있다.
상기 인간 항체는 이펙터 부분이 인간 면역계의 다른 부분과 더욱 양호하게 상호작용할 수 있고, 인간 면역계가 인간 항체를 외부 물질로 인식하지 않아서 생체 내로 유입된 항체에 대한 면역 반응이 전체 외래 비-인간 항체 또는 부분 외래 키메라 항체 등에 비하여 덜 할 수 있다. 또한, 생체 내로 유입된 인간 항체는 자연 발생 인간 항체와 실질적으로 동일한 반감기를 가지므로 투여되는 복용량과 회수를 줄일 수 있다.
한편, 용어 "키메릭"은 항체 또는 항원-결합 부위가 2 개의 상이한 종으로부터 유래한 서열들을 포함하는 것을 의미한다.
상기 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, c-Met 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열번호에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기와 같은 특성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고, 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며, 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다. 따라서, 상기 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 및 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
한편, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 상기 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 서열번호의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 최소 70%의 상동성, 최소 80%의 상동성 또는 최소 90%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다. 서열의 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 통해, 인터넷 상에서 blastp, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램을 이용할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
용어 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
또한, 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한 다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에 는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
한편, 상기 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 발현할 수 있는 벡터는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환 (co-transfomation) 및 표적 형질전환 (targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
다른 양상은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
상기 숙주세포는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.
즉, 상기 숙주세포는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포의 게놈 상에 포함하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된 재조합 벡터를 포함하는 것이다.
상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
또 다른 양상은 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마(수탁번호 KCLRF-BP-00220) 세포를 제공한다.
상기 하이브리도마 세포의 제조 방법은 상기한 바와 같다. 또한, 하기 실시예에 따라 제조된 상기 하이브리도마 세포는 2009년 10월 9일자로 부다페스트 조약 하의 국제 기탁기관인 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank)에 기탁하였다(수탁번호: KCLRF-BP-00220). 한편, 기탁된 하이브라도마 세포는 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 상기 수탁 번호를 참조하여 일반인들에게 분양이 가능하다. 즉, 기탁물들은 기탁 시료 관리를 위한 가장 최근의 요청 이후 적어도 5년의 기간 동안, 어떤 경우에는 기탁일 이후 적어도 30년의 기간 동안 또는 그 기탁물의 개시를 공표하는 어느 특허의 강제 가능한 시기 동안, 그 기탁물의 생존을 유지하고 오염되지 않도록 모든 주의를 다하여 보관한다. 기탁자에게는 기탁물의 상태 때문에 요청시 수탁기관이 시료를 분양할 수 없을 경우에는 그 기탁물을 대체해야 하는 의무가 있다. 대상이 되는 기탁물에 대한 일반인의 입수 가능성을 제한하는 모든 제약들은 그 기탁물을 개시하고 있는 특허가 허여되면 완전히 없어지게 된다.
다른 양상은 약학적 유효량의 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 암의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 상기 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은, 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함한다. 상기 암은 예를 들어, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만 성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 다양한 유형의 두경부암을 포함하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 조성물은 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 혈관신생(angiogenesis)은 기존의 혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정으로, 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 비정상적으로 성장함으로써 질환이 야기될 수 있다. 상기 혈관신생으로 인한 질환은 예를 들면, 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암의 침윤과 전이를 포함하나 이에 한정하지 않는다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것일 수 있다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 c-Met 단백질의 길항제(antagonist) 작용을 하는 것일 수 있다.
용어 "길항제"는 본 명세서에서 가장 광범위한 의미로 사용되며, 표적물 (예를 들어, c-Met)의 생물학적 활성 중 하나 이상을 부분적으로나 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 포함하는 개념으로 해석된다. 예를 들어, "길항제" 항체는 항체가 결합하는 항원 (예를 들어, c-Met)의 생물학적 활성을 억제시키거나 감소시키는 항체를 의미한다. 즉, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하여 세포 내 신호 전달을 저해함으로써 종양세포의 증식을 억제하여 암의 치료 효능을 발휘할 수 있다. 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 기작에 의해 혈관신생을 억제할 수 있다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 의한 암 치료의 효능 및 혈관신생 억제 효능은 독립적으로, 또는 조합하여 나타날 수 있다.
상기 조성물이 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데, 또는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분 말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
한편, 상기 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.
다른 양상은 약학적 유효량의 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 혈관신생으로 인한 질환 또는 암 치료 방법을 제공한다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
상기 암 치료 방법에 사용되는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 인간 또는 개, 고양이, 마우스와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.
또 다른 양상은 c-Met을 발현하는 암 세포주가 접종되어 암이 형성되어 있고, 약학적 유효량의 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 경우에는 혈관신생 또는 암 세포의 형성 또는 성장이 억제되는 특징을 나타내는 동물 모델을 제공한다.
상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 이식되는 암 세포는 상기 동물 모델과 같은 종으로부터 유래한 암 세포 또는 다른 종의 동물로부터 유래한 암 세포일 수 있다. 예를 들면, 상기 암 세포는 뇌종양 세포주의 하나인 U87-MG일 수 있다. 한편, 상기 동물 모델로 이용되는 동물은 인간을 제외한 어떠한 동물도 가능하다. 상기 동물은 포유 동물, 예를 들면, 마우스일 수 있다. 상기 동물 모델을 이용하여, 상기 치료 방법을 적용함으로써, 상기 약학적 조성물을 이용한 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 치료 여부를 확인할 수 있다.
c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원 결정 단편 및 이를 포함하는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 의하면, 혈관신생으로 인한 질환 또는 암을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: c- Met 에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 제작 및 단일클론 항체 AbF46 의 생산
(1) 마우스의 면역화
하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 쥐에 한마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 항원(먼저 주사한 양의 절반)을 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)와 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포융합과정을 수행하였다.
(2) 세포 융합 및 하이브리도마의 제조
세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양배지(DMEM)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1 x 108 개와 골수종세포(Sp2 /0) 1 x 108 개를 혼합한 다음 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양배지(DMEM)에 들어있는 45 % 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1~2×105/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37 ℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
(3) c-Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별
상기 (2)에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.
마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다. 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하 였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 SAIT-MET-AbF46라 명명하고, 이를 한국 세포주 은행에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다.
(4) 단일클론 항체의 생산 및 정제
상기 (3)에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.
먼저 10% FBS이 포함된 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 AbF46 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖을 세포 침전물에 재현탁시킨 후 3일 동안 37 ℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 이후 원심분리를 통해 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여 4 ℃에 보관하거나 바로 모아서 50 ㎖ 내지 300 ㎖의 배양액으로부터 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Health)를 이용하여 항체를 순수 정제한 후 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실험에 사용하였다.
상기 실시예 1의 단일클론 항체의 생산 과정을 도 1에 나타내었다.
실시예 2: 단일클론 항체 AbF46 의 이소타입 확인
실시예 1에서 얻은 세포주에 의해 생산되는 항체의 이소타입(isotype)을 확인하기 위하여 BD Pharmingen 키트(BD Biosciences)를 사용하여 아래와 같이 마우스의 각 이소타입 항체에 대한 ELISA 실험을 수행하였다. 그 결과 단일클론 항체 AbF46는 IgG1에 대한 반응치가 827.0으로 가장 높게 판명되었으며, 경쇄는 카파(κ)임이 결정되었다 (표 1).
mAb IgA IgE IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM 판정 경쇄
AbF46 5.0 43.5 827.0 6.0 11.0 3.0 4.0 827.0 IgG1 κ
실시예 3: 단일클론 항체 AbF46 의 이종간 인지력 확인
실시예 1에서 제조된 인간의 c-Met 단백질에 대한 단일클론 항체 AbF46가 마우스의 c-Met 항원을 인지하는지 여부를 ELISA 방법을 이용하여 확인하였다. 이를 위하여 인간과 마우스의 c-Met/Fc 융합 단백질 (R&D Systems)을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 정제된 단일클론 항체 AbF46를 각각 웰에 50 ng씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST-T) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 인간과 마우스의 c-Met 단백질에 단일클론 항체 AbF46가 결합되는지를 판독하였다.
그 결과, 종래의 인간의 c-Met에 대한 단일클론 항체 5D5(Genetech 사)는 마우스의 c-Met 단백질에 대한 인지 정도가 낮은데 반하여, 단일 클론 항체 AbF46는 인간의 c-Met 단백질을 인지함과 동시에 마우스의 c-Met 단백질도 인지할 수 있음을 확인하였다(표 2). 이는 단일클론 항체 AbF46을 동물 실험에 사용하는데 매우 유리할 수 있다.
항원 5D5 AbF46
인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 0.3729 0.3793
마우스의 c-Met/Fc 융합 단백질 0.1126 0.3328
실시예 4: 단일클론 항체 AbF46 의 친화력 측정
실시예 1에서 제조된 단일클론 항체 AbF46의 인간 c-Met에 대한 항체 친화력(affinity)을 측정하기 위하여 표면 플라스몬 공명 장치(Surface Plasmon Resonance, SPR, Biacore)를 사용하였다. CM5 칩 상에 인간 c-Met 단백질을 고정시킨 후, 단일클론 항체 AbF46을 마이크로유동 챔버 내로 흘려서 도 2에서 나타낸 바와 같이 ka(on) 값 및 kb(off) 값을 구하였다. 이후, 상기 값으로부터 Kd 값을 계산하였다. 도 2에서, 붉은색 선은 AbF46 항체로 실험한 실측치를 나타내고, 검정색 선은 이론치를 나타낸다. 단일클론 항체 AbF46의 Kd 값은 4 nM으로 판명되었다. 또한 실험의 신뢰성을 나타내는 Chi2 값은 0.822이었다(Biacore 분석 방법에서 Chi2 값이 1 이하이면 매우 신뢰성이 높은 것으로 판단함.). 이러한 결과로 볼 때, 단일클론 항체 AbF46는 인간의 c-Met 단백질과 친화력이 충분히 높음을 알 수 있었다. 참고로 Genentech 사의 임상 2상 제품으로 개발중인 항체인 OA-5D5 (One-armed 5D5)의 Kd 값은 8.27 nM이라고 알려져 있다.
실시예 5: 단일클론 항체 AbF46 의 암세포 증식 억제 효과
실시예 1에서 제조한 단일클론 항체 AbF46의 암세포 증식 억제에 의한 항암 효과를 확인하기 위하여 HGF를 생산하고 c-Met 분자를 세포 표면에 발현하는 U87-MG 세포를 이용한 인 비트로(in vitro) 세포증식 분석법을 수행하였다.
96-웰 플레이트에 웰당 5 x 103개의 U87-MG 세포를 100 ㎕의 10% FBS/DMEM 배양액과 분주하고 48시간 동안 배양하였다. 이후 HGF 50 ng/㎖을 처리하고 단일클론 항체 AbF46를 처리하지 않거나, 5 ㎍/㎖ 또는 10 ㎍/㎖을 처리한 후 0.05%의 FBS를 포함한 배지(DMEM)에서 48시간 동안 배양하였다. 이후 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Inc.)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도로 세포의 수를 정량하였다.
도 3에 나타난 바와 같이 단일클론 항체 AbF46는 HGF에 의한 암세포의 증식을 억제할 뿐만 아니라, HGF를 처리하지 않은 세포에 비해서도 세포의 증식을 억제하는 효과를 보였다.
실시예 6: 단일클론 항체 AbF46 의 신생혈관 생성 억제 효과
실시예 1에서 제조한 단일클론 항체 AbF46의 신생혈관 생성 억제 기작에 의한 항암 효과를 살펴보기 위해, BD BioCoatTM Angiogenesis System-Endothelial Cell Tube Formation (BD Biosciences)를 사용하여 HUVEC 세포를 이용한 튜브 형성 분석법(tube formation assay)을 수행하였다.
c-Met은 암 증식뿐만 아니라 암 주변에 생성되는 혈관을 이루는 내피세포 에서도 발현이 증가되는 것으로 알려져 있으며, 본 실험 시스템에 의해 HGF 처리에 의하여 튜브의 형성이 증가되는지를 먼저 관찰한 후, 단일클론 항체 AbF46의 효능을 확인하였다.
도 4에 나타난 바와 같이 단일클론 항체 AbF46를 처리한 경우에는 혈관생성의 지표인 튜브의 형성이 현저히 저해되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 종래의 신생혈관 억제제인 아바스틴(Avastin) (Genentech)과 동량의 항체를 처리하여 비교한 결과, 단일클론 항체 AbF46는 아바스틴에 비해 신생혈관 억제 효과가 더욱 우수함을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 7: 단일클론 항체 AbF46 의 암 모델 동물실험
실시예 1에서 제조한 단일클론 항체 AbF46의 암 치료 효과를 확인하기 위하여 c-Met의 리간드인 HGF를 자가 분비 방법(autocrine)으로 분비하는 U87-MG 세포를 투여한 이종 이식 마우스 동물 모델을 대상으로 인 비보(in vivo)에서 단일클론 항체 AbF46의 투여에 의하여 종양의 크기가 감소되는지 여부를 확인하였다.
마우스 동물 모델은 3 x 106개의 뇌종양 세포주 U87-MG 세포 50 ㎕를 6주령의 자성 BALB/C 누드 마우스에 피하주사하여 4-5주 경과 후에 암이 발생되는 마우스를 각 그룹당 6마리씩을 선별하여 실험에 사용하였다. 단일클론 항체 AbF46는 암세포가 생성되고 4-5주 후에 복강 주사에 의해 마우스에 투여하였다.
도 5a 및 도 5b에서 나타낸 바와 같이 단일클론 항체 AbF46는 종양 생성 후 2주 동안 4회 복강 주사에 의해 투여되었으며 0.2 mg/kg의 농도에서는 치료 효과가 보이지 않았으나, 1 mg/kg 농도에서는 종양의 크기가 대조군에 비하여 현저히 감소되었으며, 5 mg/kg 농도에서는 종양의 크기가 대조군에 비하여 10배 이상 감소된 상태에서 더 이상 증가되지 않는 것으로 확인되었다.
특히, 도 5a에서 보이는 바와 같이 단일클론 항체 AbF46는 U87-MG 세포에서 분비되는 것으로 알려진 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)의 작용으로 암 생성과 함께 나타나는 비장 비대화 (splenomegaly) 현상까지 방지하는 효과를 보이고 있다. 이는 단일클론 항체 AbF46가 마우스 모델에서 체내에 특별한 독성 없이 c-Met의 작용을 방해하는 다양한 기작에 관여하여 결과적으로 인 비보에서 더욱 뛰어난 항암 효과를 보인다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 단일클론 항체 AbF46 의 CDR 서열
실시예 1에서 제조한 단일클론 항체 AbF46의 항원 인식에 결정적인 역할을 하는 중쇄 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 표 3에 나타내었다. 이는 종래의 c-Met을 인지하는 것으로 알려진 항체들의 CDR 서열과 일치되지 않는 것으로 확인되었으며, 본 실시예를 통해 얻어진 신규한 서열로 확인되었다(서열번호 1 내지 서열번호 3 및 서열번호 5 내지 서열번호 7).
CDR1 CDR2 CDR3
AbF46 중쇄 CDR 서열 DYYMS(서열번호 1) FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 2) DNWFAYWGQGTLV(서열번호 3)
AbF46 경쇄 CDR 서열 KSSQSLLASGNQNNYLA(서열번호 5) WASTRVS(서열번호 6) LTFGAGTKLE(서열번호 7)
도 1은 단일클론 항체 AbF46의 생산 과정을 나타낸다.
도 2는 표면 플라스몬 공명 장치를 사용하여 인간 c-Met에 대한 단일클론 항체 AbF46의 친화력을 측정한 결과이다.
도 3은 단일클론 항체 AbF46가 HGF에 의한 암세포의 증식을 억제하는 결과를 나타낸다.
도 4는 단일클론 항체 AbF46가 혈관생성을 저해함을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 U87-MG 세포를 투여한 이종 이식 마우스 동물 모델을 대상으로 단일클론 항체 AbF46 투여 시 인 비보에서 종양의 크기가 감소되는지 여부를 확인한 결과이다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> c-Met specific antibodies and uses thereof <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of monoclonal antibody AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of monoclonal antibody AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of monoclonal antibody AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 1 5 10 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of monoclonal antibody AbF46 <400> 4 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asp Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 of monoclonal antibody AbF46 <400> 5 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 of monoclonal antibody AbF46 <400> 6 Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of monoclonal antibody AbF46 <400> 7 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 1 5 10 <210> 8 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of monoclonal antibody AbF46 <400> 8 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg <210> 9 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of monoclonal antibody AbF46 <400> 9 gaggtgaagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gattactaca tgagctgggt ccgccagcct 120 ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataattc ccaaagcatc 240 ctctatcttc aaatggacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtgcaaga 300 gataactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctct 348 <210> 10 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of monoclonal antibody AbF46 <400> 10 gacattttga tgacccagtc tccatcctcc ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctttta gctagtggca accaaaataa ctacttggcc 120 tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct aaaatgctga taatttgggc atccactagg 180 gtatctggag tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacggattt cactctgacc 240 atcaacagtg tgcaggctga agatctggct gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct 300 ccgctcacgt tc 312

Claims (26)

  1. 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 IgG1 타입인 것인 단일클론 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 c-Met 단백질은 인간 또는 마우스 유래인 것인 단일클론 항체.
  4. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 각각 표시되는 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은,
    서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 8의 95 내지 111번째 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴 클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 재조합 벡터.
  12. 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포.
  13. c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포.
  14. 약학적 유효량의 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 c-Met 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는,
    류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 당뇨성 망막병증, 단백뇨증, 동맥경화증, 재협착증, 및 알츠하이머 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 제14항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 c-Met 단백질의 길항제(antagonist) 작용을 하는 것인 약학적 조성물.
  18. 삭제
  19. 제14항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 약학적 조성물.
  20. 약학적 유효량의 제14항의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유 동물의 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 당뇨성 망막병증, 단백뇨증, 동맥경화증, 재협착증, 알츠하이머 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암 치료 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
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