KR102049990B1

KR102049990B1 - c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질

Info

Publication number: KR102049990B1
Application number: KR1020130033872A
Authority: KR
Inventors: 송윤정; 송호영; 이승현; 김경아; 정윤주
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2019-12-03
Also published as: US20140294837A1; US9650443B2; JP2018048192A; EP2784092A3; EP2784092B1; EP2784092A2; JP6636684B2; KR20140119317A; JP2014193864A

Abstract

항-c-Met 항체와 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 포함하는 이중 표적 항체, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환체, 상기 이중 표적 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물, 및 항-c-Met 항체에 VEGF 결합 단편을 연결시키는 단계를 포함하는 항암 및 신생혈관 억제 효능이 개선된 c-Met와 VEGF를 동시에 표적으로 하는 이중 표적 항체의 제조 방법이 제공된다.

Description

c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질{Fusion protein comprising anti-c-Met antibody and VEGF binding fragment}

항-c-Met 항체와 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 포함하는 이중 표적 항체, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환체, 상기 이중 표적 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물, 및 항-c-Met 항체에 VEGF 결합 단편을 연결시키는 단계를 포함하는 항암 및 신생혈관 억제 효능이 개선된 c-Met와 VEGF를 동시에 표적으로 하는 이중 표적 항체의 제조 방법에 관한 것이다.

　c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용체 타이로신 카이네이즈 (Receptor Tyrosine Kinase; RTK)로써 그 리간드인 간세포성장인자(Hepatocyte Growth Factor; HGF)와 결합하여 세포 내 신호전달을 촉진시켜 세포의 성장을 촉진할 뿐 아니라 암세포에 과 발현되어 암 발생, 암 전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생 혈관 형성에도 광범위하게 관여한다. c-Met은 많은 종류의 암에서 과 발현되고 있으며, 특히 c-Met의 과발현이 있는 환자들은 암의 치료 예후가 나쁜 (Poor prognosis) 경우가 대부분이다.

　혈괄내피세포 성장인자(Vascular Endothelial Cell Growth Factor: VEGF)는 정상세포에서도 존재하며 특히 암세포에서 분비되어 그 수용체인 VEGFR(VEGF Receptor)과 결합하여 혈관신생(angiogenesis)를 일으키며 암세포는 그 새로운 혈관을 통해 성장에 필요한 양분을 공급받는다.

　그러므로, c-Met과 VEGF는 모두 항암제 개발에 있어서 표적으로서 중요성이 높다.

그러나, c-Met와 VEGF를 동시에 표적으로 하는 항체 및 이를 이용하는 암 치료 기술에 대해서 아직까지 제안된 바 없다.

본 발명자들은 항암 효과가 보다 우수하고 치료 예후가 양호한 암 치료 기술을 개발하던 중, c-Met와 VEGF를 동시에 표적으로 하는 이중 표적(bispecific) 항체를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 일 예는 항-c-Met 항체와 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질을 제공한다.

다른 예는 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 c-Met와 VEGF를 동시에 표적으로 하는 이중 표적 항체를 제공한다.

다른 예는 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또 다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

또 다른 예는 상기 이중 표적 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 예는　항-c-Met 항체에 VEGF 결합 단편을 연결시키는 단계를 포함하는, 항암 및 신생혈관 억제 효능이 개선된 c-Met와 VEGF를 동시에 표적으로 하는 이중 표적 항체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 c-Met과 VEGF에 동시에 결합할 수 있는 이중 표적 항체를 제공함으로써 c-Met와 VEGF를 동시에 표적하여 암세포의 성장과 혈관 신생을 효과적으로 저해하여, 개선된 항암 효과 및/또는 혈관 신생 저해 효과를 얻을 수 있다.

상기 c-Met과 VEGF를 동시에 결합 가능한 이중 표적 항체는 c-Met을 표적함으로써 암세포의 성장 자체를 저해할 수 있으며, 동시에 VEGF를 표적함으로써 신생 혈관 형성을 차단하고 암세포 성장에 필수적인 영양분의 공급을 막아 암세포의 성장을 또다시 저해함으로써, 암세포 성장 저해 및/또는 신생 혈관 형성 저해에 있어서 보다 증진된 상승 효과를 기대할 수 있다.

일 예에서, VEGF 결합 단편과, 항-c-Met 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체의 변형체가 연결된 융합 단백질이 제공된다.다른 예에서, 상기 융합 단백질의 c-Met과 VEGF에 동시에 결합할 수 있는 이중 표적 항체로서의 용도가 제공된다. 구체적으로, VEGF 결합 단편과, 항-c-Met 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체의 변형체가 연결된 융합 단백질을 포함하는, c-Met과 VEGF의 이중 표적 항체가 제공된다.

또 다른 예에서는 상기 융합 단백질을 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 형질전환체가 제공된다. 상기 형질전환체는 상기 융합 단백질 또는 이중 표적 항체의 생산에 사용될 수 있다.

또 다른 예에서는 상기 융합 단백질 또는 이중 표적 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공된다. 상기 약학 조성물은 c-Met 및/또는 VEGF 유발 질병의 예방 및/또는 치료 효과를 갖는 것일 수 있으며, 예컨대, 항암제 또는 신생 혈관 생성 저해제일 수 있다.

또 다른 예에서, 상기 이중 표적 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 c-Met 및/또는 VEGF 유발 질병의 예방 및/또는 치료 방법이 제공된다.

또 다른 예에서는, 상기 형질 전환체를 배양하여 융합 단백질을 발현시키거나, 항-c-Met 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편 또는 상기 항체의 변형체에 VEGF 결합 부위를 연결하는 단계를 포함하는, 항암 및 신생혈관 억제 효능이 개선된 c-Met와 VEGF를 동시에 표적으로 하는 이중 표적 항체의 제조 방법이 제공된다.

또 다른 예에서, 항-c-Met 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체의 변형체에 VEGF 결합 단편을 연결시켜 항암 효능 및/또는 신생 혈관 형성 억제 효능이 증진된 c-Met 항체를 제조하는 방법이 제공된다.

또 다른 예에서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 c-Met 및/또는 VEGF의 동시 검출용 조성물이 제공된다.

또 다른 예에서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 c-Met 및/또는 VEGF 유발 질병의 진단용 조성물이 제공된다.

상기 "혈관 내피 세포 성장 인자(Vascular Endothelial Cell Growth Factor: VEGF)"는 정상세포에서도 존재하며, 특히 암세포에서 분비되어 그 수용체인 VEGFR(VEGF Receptor)과 결합하여 혈관신생을 일으키며 암세포는 그 새로운 혈관을 통해 성장에 필요한 양분을 공급받는다. VEGF의 과발현은 다양한 질병의 원인이되며, 특히 암의 발생뿐 아니라, 침습, 전이 등의 나쁜 예후에도 관여한다. 이러한 이유로, VEGF는 항암 요법에 있어서 중요한 표적이 된다.

상기 VEGF은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유류에서 유래하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 VEGF 단백질은 GenBank Accession Number NM_001025366.2, NM_001025367.2, NM_001025368.2, NM_001025369.2, NM_001025370.2, NM_001033756.2, NM_001171622.1, NM_001171623.1, NM_001171624.1, NM_001171625.1, NM_001171626.1, NM_001171627.1, NM_001171628.1, NM_001171629.1, NM_001171630.1, NM_001204384.1, NM_001204385.1, NM_003376.5 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

상기 항-c-Met 항체는 c-Met을 특이적으로 인지하는 단백질로서, c-Met만을 인지하는 단일 표적 항체일 수 있으며, 상세한 내용은 후술되는 바와 같다.

상기 항-c-Met 항체의 항원 결합 단편은 후술하는 항-c-Met 항체의 상보성 결정 영역(CDR), CDR와 Fc 영역, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 상세한 내용은 후술되는 바와 같다

항-c-Met 항체가 사용되는 경우 VEGF 결합 단편은 항-c-Met 항체의 C-말단에 적절한 펩타이드 링커에 의하거나 의하지 않고 연결될 수 있다. 또한, 항-c-Met 항체의 항원 결합 단편이 사용되는 경우, VEGF 결합 단편은 항-c-Met 항체의 항원 결합 단편의 N-말단 및/또는 C-말단에 모두 연결 가능하며, 적절한 펩타이드 링커에 의하거나 의하지 않고 연결될 수 있다

상기 항체의 변형체는 자연계에 존재하는 인간 및 동물 항체의 이소타입, 및/또는 힌지(hinge)를 구성하는 아미노산이 변형된 모든 인간 및 동물 항체의 Fc를 포함하는 것 등일 수 있으며, 상세한 내용은 후술되는 바와 같다. 본 발명에서 별도의 언급이 없는 한, 항 c-Met 항체는 상기와 같은 변형체를 포함하는 것으로 이해된다.

상기 VEGF 결합 단편은 VEGF와 결합하는 분자, 예컨대 VEGF 수용체, 항 VEGF 항체 등의 VEGF 결합 단백질, 또는 상기 VEGF 결합 단백질의 VEGF 결합 부위를 포함하는 단편, 예컨대 항 VEGF 항체의 항원 결합 단편 또는 VEGF 수용체의 VEGF 결합 부위일 수 있다. 예컨대, 상기 항 VEGF 항체는 베바시주맙(Bevacizumab)일 수 있고, 상기 항 VEGF 항체의 항원 결합 단편은 상기 항 VEGF 항체의 상보성 결정 영역(CDR), CDR와 Fc 영역, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 VEGF 수용체는 예컨대 인간의 VEGF 수용체 1(human VEGF Receptor 1; P17948.2; 서열번호 109), 인간의 VEGF 수용체 2(human VEGF Receptor 2; P35968.2), 인간의 VEGF 수용체 3(human VEGF Receptor 3; P35916.3 등일 수 있다. 또한, 상기 VEGF 결합 단백질의 VEGF 결합 부위를 포함하는 단편은 second Ig-like domain 2 (VIG2) 또는 VEGF 수용체 중의 상기 VIG2 부위를 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 예컨대, 인간의 VEGF 수용체 1의 VEGF 결합 부위를 포함하는 단편은 second Ig-like domain 2 (VIG2; 예컨대, P17948.2의 아미노산 서열(서열번호 109)의 129번째부터 229번째까지의 아미노산 서열(서열번호 110)), 또는 상기 서열번호 109 중의 상기 VIG2를 포함하여 연속하는 102 내지 1338개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 등일 수 있다. .

따라서, 한 구체예에서, 상기 VEGF 결합 단편은 베바시주맙(Bevacizumab) 등의 항 VEGF 항체, 상기 항 VEGF 항체의 상보성 결정 영역(CDR), CDR와 Fc 영역, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂등으로 이루어진 군에서 선택된 항 VEGF 항체의 항원 결합 단편, VEGF 수용체 (예컨대, 서열번호 109), 또는 상기 VEGF 수용체의 VEGF 결합 부위 (예컨대, 서열번호 110의 VIG2, 또는 서열번호 109 중의 서열번호 110의 VIG2를 포함하여 연속하는 102 내지 1338개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드) 등일 수 있다.

구체예에서, 상기 융합 단백질 또는 이중 표적 항체는 후술하는 항-c-Met 항체, 그의 단편, 또는 변형체의 Fc 부분에 VEGF 결합 단편, 예컨대 VIG2를 연결시킨 것일 수 있다 (도 1 참조).

상기 항-c-Met 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체의 변형체와, VEGF 결합 단편은 링커로 연결된 것일 수 있다. 상기 링커는 1 내지 100개, 구체적으로 2 내지 50개, 보다 구체적으로 5 내지 30개의 아미노산 길이의 펩타이드 링커일 수 있으며, 예컨대, Gly, Asn, Ser, Thr, Ala 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다일 구체예에서, 상기 링커는 (GGGGS)n으로 표현되는 것일 수 있으며, 상기 n은 (GGGGS) 단위체의 반복 회수로서, 이중 표적 항체의 효능을 고려하여, 1 내지 10, 구체적으로 1 내지 5일 수 있다

본 발명은 c-Met 항체 또는 그 단편에 VEGF 결합 단편 (예컨대 VIG2)을 연결시켜 이중표적항체로 제작함으로써 c-Met 항체의 약리학적 효과를 보다 증진시킨 것을 특징으로 한다.

상기 융합 단백질 또는 이중 표적 항체에 사용되는 항-c-Met 항체는 모든 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 구체적으로 상기 항-c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하거나 c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그 항원 결합 단편일 수 있다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.

용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체가 비교적 특이적으로 결합하는 부위이다.

따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하고,

상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 것일 수 있다:

일반식 Ⅰ

Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),

일반식 Ⅱ

Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr (서열번호 5),

일반식 Ⅲ

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr (서열번호 6),

일반식 Ⅳ

Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)

일반식 Ⅴ

Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃ (서열번호 8)

일반식 Ⅵ

Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr (서열번호 9)

상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa₁은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa₂는 Glu 또는 Asp이며,

상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa₃은 Asn 또는 Lys이며, Xaa₄는 Ala 또는 Val이고, Xaa₅는 Asn 또는 Thr이며,

상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆은 Ser 또는 Thr이고,

상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa₇은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa₈은 Ser 또는 Trp이고, Xaa₉은 His 또는 Gln이며, Xaa₁₀는 Lys 또는 Asn이고,

상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa₁₁은 Ala 또는 Gly이며, Xaa₁₂은 Thr 또는 Lys이고, Xaa₁₃는 Ser 또는 Pro이며,

상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa₁₄은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa₁₅는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa₁₆는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.

일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.

원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

상기 항원 결합 단편은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, CDR, CDR와 Fc 영역, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.

F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.

이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.

동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

이에, 본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 효율성을 증진시키기 위하여, 상기 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 아미노산 서열이 변형된 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 서열번호 100(U7-HC6), 서열번호 101(U6-HC7), 서열번호 102(U3-HC9), 서열번호 103(U6-HC8) 또는 서열번호 104(U8-HC5)의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0017698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).

상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0017698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 62(이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64(이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 66(이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 68(이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체, 서열번호 70(이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열 또는 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체일 수 있다.

예컨대, 상기 항 c-Met 항체는

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체,

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체,

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체,

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체,

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체,

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체,

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체,

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체, 또는

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 이루어진 항체

일 수 있다.

한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호 13의 CDR-L3 중쇄 가변 영역과 인간의 카파 불변영역을 포함하는 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩타이드다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, cMet에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.

구체예에서, 상기 융합 단백질 또는 이중 표적 항체는 상기한 바와 같은 항-c-Met 항체의 Fc 부분 또는 상기 항체의 항원 결합 단편의 N 말단 또는 C 말단에 VEGF 결합 단편 (예컨대 VIG2)을 상기한 바와 같은 링커를 통하거나 통하지 않고 연결시킨 것일 수 있다 (도 1 참조).

구체예에서, 상기 융합 단백질 또는 이중 표적 항체는 서열번호 62의 아미노산 서열, 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열, 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열, 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호 68, 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70, 서열번호 70의 아미노산 서열 중 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 또는 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 것일 수 있다

상기 VEGF 결합 단편 (예컨대, VIG2 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드 등)은 상기한 항 c-Met 항체 이외의 다른 항 c-Met 항체와 결합하는 경우에도 항체 효능을 증진시킬 뿐 아니라, 부작용 (agonism)이 현저하게 감소시키는 것으로 확인되었다 (도 5 참조).

구체적으로, 상기한 바와 같이 VEGF 결합 단편이 결합함으로써 항체 효능 및 부작용이 개선될 수 있는 c-Met 항체는 상기한 항 c-Met 항체 이외의 모든 항 c-Met 항체일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 112 또는 서열번호 114의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 113 또는 서열번호 115의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 서열번호 112의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 113의 아미노산을 갖는 경쇄를 포함하거나 서열번호 114의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 115의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 것일 수 있다.

상기 VEGF 결합 단편과, 항-c-Met 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편이 링커를 통하거나 통하지 않고 연결된 융합 단백질은 c-Met과 VEGF를 동시에 표적으로 하는 이중 표적 항체의 제조를 위한 전구체로서 사용 가능하다. 상기 약학 조성물은 상기 이중 표적 항체의 유효량과, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 및/또는 부형제 등을 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용 가능한 담체는, 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 혼합제 또는 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물의 투여 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류일 수 있다.

1회 투여를 위한 상기 약학 조성물 내의 유효성분인 이중 표적 항체의 유효량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 1회 투여를 위한 상기 이중 표적 항체의 유효량은 0.1 내지 50 ㎎/kg, 구체적으로 1 내지 20 ㎎/kg 범위일 수 있다. 상기 1회 투여를 위한 유효량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

특히, 상기 약학 조성물은 이중 표적 항체를 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.

본 발명에서 제안되는 약학 조성물은 c-Met 및 VEGF에 의하여 유발되는 질병, 예컨대, c-Met의 복제수 증가 및/또는 발현량 증가 및/또는 VEGF 과발현에 의하여 유발되는 질병, 대표적으로 암의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 상기 암은 c-Met과 VEGF을 과발현하는 것일 수 있고, 이에 제한되지 않지만, 고형암, 예컨대, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 c-Met 및 VEGF에 의하여 유발되는 질병은 임신성 당뇨, 당뇨성 망막병증, 황반변성 (예컨대 습성 노인성 황반 변성 (wet AMD), 등) 등일 수 있다.

또 다른 예는 상기 이중 표적 항체의 치료적 유효량을 c-Met 및/또는 VEGF 유발 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 c-Met 및/또는 VEGF 유발 질병의 예방 및/또는 치료 방법과 관련된 것이다. 상기 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 c-Met 및/또는 VEGF 유발 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 예방 및/또는 치료 방법에 의하여 예방 및/또는 치료 가능한 c-Met 및/또는 VEGF 유발 질병은 상기한 바와 같다.

또한, 상기 항 c-Met 항체는 대표적인 RTK 음성 조절제인 Cbl에 비의존적으로 Cbl에 의해 매개되는 프로테아좀 경로가 아닌 라이소좀 경로로 c-Met 분해 활성을 나타내므로, Cbl에 돌연변이가 발생하거나 Cbl의 발현양이 작거나, c-Met의 Cbl 결합부위 변이 등의 요인으로 Cbl이 정상적으로 작용하지 못하는 환자들에게 투여시에도, Cbl과 독립적으로 작용하는 다른 음성 조절제인 LRIG1을 매개로 하여 c-Met를 억제할 수 있으므로, 항 c-Met 항체와 VEGF 길항제의 병용 투여는 Cbl가 정상적으로 작용하지 못하는 환자들에게 특히 유용하게 적용될 수 있다.

또 다른 측면에서, 항-c-Met 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체의 변형체에 VEGF 결합 단편을 연결시키는 단계를 포함하는, c-Met 억제(항암 효능) 및/또는 신생 혈관 형성 억제 효능이 증진된 c-Met 항체의 제조 방법이 제공된다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

기존의 항-c-Met 항체에 VEGF에 결합할 수 있는 부분 (예컨대, human VEGF Receptor 1(예컨대, 서열번호 109) 의 Ig-like domain 2: VIG2(예컨대, 서열번호 110) 또는 서열번호 109 중의 서열번호 110을 포함하여 연속하는 102 내지 1338개의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드)을 연결시켜 이중 표적 항체로 제작하여 두 인자를 한번에 표적했을 때, c-Met과 VEGF 각각을 표적하는 효과는 그대로 유지하면서, 상승 효과를 보임을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 제안되는 이중 표적 항체의 제작 기술은 항-c-Met 항체의 항암 효능을 보다 개선하는 방법일 수 있다.

위와 같이 만들어진 이중 표적 항체는, 항-c-Met 항체에 비해 암세포의 성장을 더 효과적으로 저해할 수 있으며, 다양한 종류의 항-c-Met 항체를 이용하여 상기한 바와 같은 이중 표적 항체를 제작하는 경우에도 단일항체와 비교하여 우월한 효능이 나타남을 확인하여(실시예 5 참조), 본 발명에서 제안되는 이중 표적 항체의 제작 방법이 항-c-Met 항체의 항암 효능을 증진시키는 데 일반적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

상기 이중 표적 항체는 기존의 항-c-Met 항체의 항암 및 항 신생혈관 효능을 포함한 c-Met 결합 관련 성질을 그대로 유지함을 확인 하였다 (실시예 2 참조). 또한, 상기 이중 표적 항체는 VEGF 결합 부위를 포함함으로써 VEGF의 생물학적인 기능을 길항하는 효능을 나타냄을 확인 하였다 (실시예 3 참조). 또한, 상기 이중 표적 항체의 항암 효능을 동물 모델에서 시험하여, 항-c-Met 항체에 비하여 월등한 항암 효능을 보임을 확인하였다 (실시예 4 참조).

또한, 다양한 형태의 항-c-Met 항체들(linker 상이, 길이 상이, Fc 부분 변형, CDR 상이 등)의 경우에도 VIG2를 연결시켜 유사한 효능을 보임을 확인하였다 (도 4a 참조).

따라서, VEGF 결합 부위를 항-c-Met 항체에 붙이는 방법은 항-c-Met 항체의 항암 및 항 신생 혈관 효능을 증진시키는 데 일반적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 상기 융합 단백질 및/또는 이중 표적 항체는 c-Met과 VEGF의 동시 검출이 가능하므로, c-Met과 VEGF의 동시 검출용 조성물 및 c-Met과 VEGF 유발 질병의 진단용도로도 유용하다.

본 발명에서 제공되는 항-c-Met 항체에 VEGF 결합 부위를 연결하는 기술은 항-c-Met 항체의 항암/신생혈관 억제 효능을 증진시킬 수 있으므로, 항암제 뇌암, 폐암, 위암 등에 적용 가능한 항암제 및 신생혈관 생성 (angiogenesis) 기작에 의한 질병의 치료제의 개발에 유용하게 사용될 수 있으며, 이 외에도 c-Met/HGF 신호전달체계와 VEGF/VEGFR 신호전달체계가 관여하는 다른 질병에 대한 치료제 개발에도 사용될 수 있다. 이와 같이 이중 표적 항체를 사용함으로써, 관련 약물의 병용 투여시와 비교하여 복용이 간편한 것은 물론이고, 우수한 효능을 달성할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 이중표적항체의 일예를 모식적으로 보여주는 것이다.
도 2a는 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 친화도를 보여주는 그래프이다.
도 2b는 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 c-Met 분해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 2c는 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 Akt 인산화 억제 정도를 보여주는 그래프이다.
도 2d는 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 MKN45 세포주의 성장 저해 정도를 보여주는 그래프이다.
도 2e는 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 NCI-H441 세포주의 성장 저해 정도를 보여주는 그래프이다.
도 2f는 HGF 첨가시 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 HUVEC 증식 억제 정도를 보여주는 그래프이다.
도 3a는 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 친화도를 보여주는 그래프이다.
도 3b는 VEGF 첨가시 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 HUVEC 증식 억제 정도를 보여주는 그래프이다.
도 3c는 VEGF+HGF 첨가시 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 HUVEC 증식 억제 정도를 보여주는 그래프이다.
도 3d는 VEGF 첨가시 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 HUVEC 침투능 저해 정도를 보여주는 그래프이다.
도 3e는 VEGF+HGF 첨가시 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 HUVEC 침투능 저해 정도를 보여주는 그래프이다.
도 3f는 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 세포 이동(migration) 저해 정도를 보여주는 그래프이다.
도 4a는 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 U87-MG 뇌암세포에 대한 생체내 항암 효과를 보여주는 결과이다.
도 4b는 일 실시예에서 제작된 이중표적항체의 NCI-H441 폐암세포에 대한 생체내 항암 효과를 보여주는 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따라 VIG2를 융합한 다양한 c-Met 항체의 c-Met 분해 활성을 VIG2을 융합하지 않은 c-Met 항체와 비교하여 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: 항 c- Met 항체의 제작

1.1. c- Met 에 대한 마우스 항체 ' AbF46' 의 생산

1.1.1. 마우스의 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 마우스에 한 마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 상기 항원으로 사용된 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 앞서 주사한 양의 절반인 50 ㎍을 동량의 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)과 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 하기의 세포융합과정을 수행하였다.

1.1.2. 세포 융합 및 하이브리도마의 제조

세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양 배지(DMEM, GIBCO, Invitrogen)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1 x 10⁸개와 골수종세포(Sp2/0) 1 x 10⁸개를 혼합한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상기 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양 배지(DMEM)에 들어있는 45% 폴리에틸렌글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양 배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리 배지(HAT 배지)에 1~2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.

1.1.3. c- Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 참고예 1.1.2에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.

마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다.

상기 참고예 1.1.2에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 상기 준비된 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응 정도는 ELISA Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

위와 같은 반응 정도 확인에 의하여, 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 2009년 10월 9일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국 세포주연구재단에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다 (한국 공개특허 제2011-0047698 참조).

1.1.4. 단일클론 항체의 생산 및 정제

상기 참고예 1.1.3에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.

먼저 10%(v/v) FBS가 포함된 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서, 상기 세포 침전물을 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에 재현탁시킨 후, 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

이후, 원심분리하여, 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여, 4℃에 보관하거나 바로 모아서 항체의 분리 정제에 사용하였다. 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 상기 준비된 배양액 50 ㎖ 내지 300 ㎖로부터 항체를 순수 정제한 후, 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실시예에 사용하였다.

1.2. c- Met 에 대한 키메릭 항체 chAbF46 의 제작

일반적으로 마우스 항체는 치료 목적으로 인간에게 주입되었을 때 면역거부반응(immunogenicity)을 보일 가능성이 높으므로, 이를 해결하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터, 항원 결합에 관련된 변이 영역(variable region)을 제외한 불변 영역(constant region)을 인간 IgG1 항체의 서열로 치환하는 키메릭 항체 chAbF46을 제작하였다.

중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-TGA-XhoI'(서열번호 38)로, 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VL- BsiWI-CL-TGA-XhoI'(서열번호 39)로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 39)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 키메릭 항체의 발현을 위한 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터를 각각 구축하였다.

상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 Freestyle^TM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle^TM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle^TM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO₂ _,130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

이후, 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출시켰다. 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하여 최종적으로 키메릭 항체 AbF46(이하, chAbF46로 명명함)을 정제하였다.

1.3. 키메릭 항체 chAbF46 으로부터 인간화 항체 huAbF46 의 제작

1.3.1. 중쇄의 인간화( Heavy chain humanization )

H1-heavy 및 H3-heavy 2종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 상기 참고예 1.2에서 정제된 마우스 항체 AbF46의 VH 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, VH3-71이 아미노산 레벨에서 83%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR 부분이 VH3-71의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 30번(S→T), 48번(V→L), 73번(D→N), 78번(T→L) 아미노산은 원래 마우스 AbF46 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 이후, H1은 추가로 83번(R→K)과 84번(A→T) 아미노산에 돌연변이를 주어 최종적으로 H1-heavy(서열번호 40)와 H3-heavy(서열번호 41)를 구축하였다.

H4-heavy의 디자인을 위하여 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, AbF46 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사함과 동시에, 기존의 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이를 통하여 H4-heavy (서열번호 42)를 구축하였다.

1.3.2. 경쇄의 인간화( Light chain humanization )

H1-light(서열번호 43) 및 H2-light(서열번호 44) 2종의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, VK4-1이 아미노산 레벨에서 75%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H1-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하였으며, H2-light는 49번 아미노산(Y→I) 1개만을 back-mutation 하여 구축하였다.

H3-light(서열번호 45)의 디자인을 위하여, Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석한 결과 중, 상기 VK4-1 이외에 VK2-40을 선정하였다. 마우스 항체 AbF46 VL과 VK2-40은 아미노산 레벨에서 61%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H3-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하여 구축하였다.

H4-light(서열번호 46)의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 기존의 가장 안정하다고 알려진 Vk1 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 도입하였다. 이때, H4-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 추가로 back-mutation 하여 구축하였다.

이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-heavy; 서열번호 47, H3-heavy; 서열번호 48, H4-heavy; 서열번호 49)을 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-light; 서열번호 50, H2-light; 서열번호 51, H3-light; 서열번호 52, H4-light; 서열번호 53)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 AbF46(이하, huAbF46로 명명함)을 정제하였다. 한편, 이후 실시예에서 사용한 인간화 항체 huAbF46의 중쇄, 경쇄 조합은 H4-heavy (서열번호 42) 및 H4-light(서열번호 46)이다.

1.4. huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 제작

huAbF46 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 이용하여 huAbF46 항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 각각의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS'(서열번호 54)의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 huAbF46 항체의 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 55)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였으며, 이를 발현시키기 위한 벡터를 서열번호 56에 나타내었다.

이후, 상기 벡터로부터 발현된 결과물을 분석하여, c-Met에 특이적인 결합력을 보임을 확인하였다.

1.5. 친화도 성숙( affinity maturation )을 위한 라이브러리 유전자의 제작

1.5.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작

huAbF46 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)를 상기 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 1과 같다.

CDR	아미노산 서열
CDR-H1	DYYMS(서열번호 1)
CDR-H2	FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 2)
CDR-H3	DNWFAY(서열번호 3)
CDR-L1	KSSQSLLASGNQNNYLA(서열번호 10)
CDR-L2	WASTRVS(서열번호 11)
CDR-L3	QQSYSAPLT(서열번호 12)

항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 huAbF46 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오타이드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오타이드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오타이드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.

1.5.2. huAbF46 항체의 라이브러리 제작 및 c- Met 에 대한 결합력 확인

CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 참고예 1.5.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 주형으로 huAbF46 항체의 scFv를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여, 도 1에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하여 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들을 구축하였다.

이렇게 제작된 라이브러리는 야생형과 각 라이브러리의 c-Met에 대한 결합력을 확인하였으며,　각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 c-Met에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 c-Met에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.

1.6. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별

상기 구축된 라이브러리로부터 c-Met에 대한 라이브러리의 결합력을 향상시킨 후, 각각의 개별 클론으로부터 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 2와 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다. 하기 클론 중에서, L3-1, L3-2, L3-3, L3-5으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.

클론 이름	도출된 라이브러리	CDR 서열
H11-4	CDR-H1	PEYYMS(서열번호 22)
YC151	CDR-H1	PDYYMS(서열번호 23)
YC193	CDR-H1	SDYYMS(서열번호 24)
YC244	CDR-H2	RNNANGNT(서열번호 25)
YC321	CDR-H2	RNKVNGYT(서열번호 26)
YC354	CDR-H3	DNWLSY(서열번호 27)
YC374	CDR-H3	DNWLTY(서열번호 28)
L1-1	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 29)
L1-3	CDR-L1	KSSRSLLSSGNHKNYLA(서열번호 30)
L1-4	CDR-L1	KSSKSLLASGNQNNYLA(서열번호 31)
L1-12	CDR-L1	KSSRSLLASGNQNNYLA(서열번호 32)
L1-22	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 33)
L2-9	CDR-L2	WASKRVS(서열번호 34)
L2-12	CDR-L2	WGSTRVS(서열번호 35)
L2-16	CDR-L2	WGSTRVP(서열번호 36)
L3-1	CDR-L3	QQSYSRPYT(서열번호 13)
L3-2	CDR-L3	GQSYSRPLT(서열번호 14)
L3-3	CDR-L3	AQSYSHPFS(서열번호 15)
L3-5	CDR-L3	QQSYSRPFT(서열번호 16)
L3-32	CDR-L3	QQSYSKPFT(서열번호 37)

1.7. 선별된 항체의 IgG 로의 변환

선별된 4종의 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI'(서열번호 38)로 구성되며, 중쇄의 경우 친화도 성숙 후에 항체의 아미노산이 변경되지 않았으므로, huAbF46 항체의 중쇄를 그대로 사용하였다. 다만, 힌지 영역(hinge region)은 인간 IgG1의 힌지가 아닌 U6-HC7 힌지(서열번호 57) 로 치환하였다. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였으며, 친화도 성숙 후에 선별된 상기 4종 항체의 경쇄 가변영역을 포함하여 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 58 내지 서열번호 61)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(L3-1 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 58, L3-2 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 59, L3-3 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 60, L3-5 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 61)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체(이하, huAbF46-H4-A1(L3-1 유래), huAbF46-H4-A2 (L3-2 유래), huAbF46-H4-A3 (L3-3 유래), 및 huAbF46-H4-A5(L3-5 유래)로 명명함)를 정제하였다.

1.8. 불변영역 및/또는 힌지영역이 치환된 huAbF46 - H4 -A1의 제조

상기 참고예 1.7에서 선별된 4종의 항체 중에서, c-Met과의 결합친화도가 가장 높고, Akt 인산화 및 c-Met 분화 정도가 가장 낮은 것으로 측정된 huAbF46-H4-A1을 대상으로, 힌지영역 또는 불변영역 및 힌지영역이 치환된 항체를 제작하였다.

huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파(kappa) 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(U6-HC7)으로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge)로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)로 각각 명명하였다. 또한, 한편, 상기 3종의 항체는 생산량 증대를 위하여 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄의 36번 히스티딘 (histidine)을 모두 티로신 (tyrosine)으로 치환하였다.

상기 3종 항체를 제작하기 위해, huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 62)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 63), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 64)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 65), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 66)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 67), 36번 히스티틴이 티로신으로 치환된 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 68)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 69)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 3종의 항체(huAbF46-H4-A1(U6-HC7), huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge), huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))를 정제하였다. 이 중에서 본 발명에 따른 항 c-Met 항체를 대표하여 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)을 선택하여 하기의 실시예에 사용하였으며, 편의상 상기 항체를 항 c-Met 항체 L3-1Y로 명명하였다.

실시예 1: 융합 단백질의 제조

상기 참고예에서 제작된 항 c-Met 항체들을 기반으로 하여 중쇄 c-말단에 링커가 연결되도록 융합하였다. 이 후, 링커의 말단에 VEGF 수용체 1을 구성하는 아미노산 중 Ig2 도메인, 즉 129번부터 229번까지의 아미노산을 연속해서 융합하여 cMet과 VEGF에 동시에 결합할 수 있는 항체들을 제작하였다 (도 1 참조).

VEGF 수용체 1(P17948.2; 서열번호 109)을 구성하는 1338개의 아미노산 중 VEGF 결합에 가장 중요하다고 알려진 Ig2 도메인을 구성하는 129번부터 229번까지 101개의 아미노산을 코딩하는 유전자 서열을 NCBI 데이터베이스로부터 확보하였다.

Ig2 도메인(VIG2) 아미노산 서열 (서열번호 110):

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTI

Ig2 도메인(VIG2) 염기서열 (서열번호 111):

AGTGATACAGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCAATACAATC

상기 제작된 c-Met 항체의 중쇄와 Ig2 도메인(VIG2)을 연결하기 위하여, GGGGS가 반복되는 구조 중 'GGGGS'(G4S), 'GGGGSGGGGS'((G4S)2), 또는 'GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS'((G4S)4)의 3가지의 링커를 디자인하였고, 이를 c-Met 항체와 VEGF 수용체 1의 Ig2 도메인(VIG2) 사이에 위치하도록 하였으며, 디자인된 최종 유전자의 마지막에 stop codon (TGA)를 삽입한 유전자를 바이오니아에 합성 의뢰하였다. 이렇게 합성된 유전자를 pOptivec 벡터(Invitrogen)에 EcoRI/XhoI 클로닝 site를 이용하여 중쇄 발현벡터를 제작하였다. 경쇄발현 벡터는 상기 L3-1Y 제작시에 사용된 벡터를 그대로 사용하였다.

구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 상기 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터는 4:1의 비율(80 ug:20 ug)로 293T 세포(2.5 x 10⁷)에 2M CaCl₂를 360 ul 첨가하여 트랜스펙션(transfection)하였다. 이후, 10% FBS가 첨가된DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 cMet과 VEGF에 동시에 결합할 수 있는 항체들을 정제하였다.

이와 같이 제작된 항체들을 정리하면 다음과 같다:

	명명	중쇄	힌지	불변부위	링커	경쇄	VEGF 결합 단편
단독표적 항체	L3-1	서열번호 62	U6 HC7 (서열번호 101)	IgG1	-	서열번호 70	-
단독표적 항체	L3-1Y	서열번호 62	U6 HC7 (서열번호 101)	IgG1	-	서열번호 68	-
이중표적 항체	MV10A	서열번호 62	U6-HC7 (서열번호 101)	IgG1	(G4S)₂	서열번호 70	VIG2 (서열번호 111)
	MV10AY	서열번호 62	U6-HC7 (서열번호 101)	IgG1	(G4S)₂	서열번호 68	VIG2 (서열번호 111)
	MV10AY U3 HC9/ IgG1	서열번호 64	U3 HC9 (서열번호 102)	IgG1	(G4S)₂	서열번호 68	VIG2 (서열번호 111)
	MV10AY U3 HC9/ IgG2	서열번호 66	U3 HC9 (서열번호 102)	IgG2	(G4S)₂	서열번호 68	VIG2 (서열번호 111)

실시예 2: 융합 단백질의 c- Met 표적 및 분해 활성

2.1. 친화도( affinity ) 검사

상기 제작된 이중표적 융합 단백질의 결합 역학(binding kinetics)을 Biacore T100 instrument(GE Healthcare)를 사용하여 분석하였다. 인간 Fab 결합제(GE Healthcare)를 CM5 칩 (GE Healthcare, Cat. No. BR-1005-30 )의 표면에 제조자 설명서에 따라서 고정화시켰다. 약 90~120 RU의 L3-1Y 또는 MV10AY를 포획하고, 다양한 농도의 c-Met (R&D Systems, Cat. No. 358-MT/CF)을 상기 포획된 항체에 주입하였다. 여기에 10mM Glycine-HCl(pH 1.5) 용액을 주입하여 상기 표면을 재생시켰다(regenerated). 결합 역학을 측정하기 위하여, 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation software (GE Healthcare, Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.

상기 BIAevaluation software 사용하여 얻어진 결과를 아래의 표 4와 도 2a에 나타내었다:

Sample	R _max (RU)	K _D (nM)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)
L3-1Y	89.63	<0.01	7.7x10⁵	<1.2x10^-5
MV10AY	89.59	<0.01	6.8x10⁵	<1.4x10^-5
MV10AY U3 HC9/IgG2	102.5	<0.01	7.2x10⁵	<6.9x10^-5

MV10AY의 c-Met에 대한 친화도는, 항-c-Met 항체의 백본 이소타입(IgG1 또는 IgG2)과 무관하게 L3-1Y (K_D <0.01nM)와 유사하였다.

2.2. c- Met 분해 ELISA ( MKN45 )

상대적인 c-Met총양은 항체가 c-Met에 결합하여 내재화를 일으켜 c-Met의 분해(degradation)가 일어나는 것을 이용하여 총 c-Met양의 증감을 파악하여 항체의 효능을 검사하는 것이다. c-Met과 HGF의 결합이 암세포의 성장을 촉진시키는 것은 이미 알려져 있으며 따라서 총 c-Met양이 감소하면 암세포의 성장도 저하되는 데서 착안한 것이다.

c-Met 양은 정량적 ELISA 방법으로 측정하였으며 이 경우에는 human total HGF R/c-Met ELISA kit(R&D systems)을 사용하여 MKN45 위암 세포주(JCRB0254; Health Science Research Resource Bank (HSRRB, Shinjuku, Japan))에서 실험하였다. 200,000 cells/ml의 세포를 5ug/ml의 항 c-Met 항체와 섞어 24시간 동안 배양(배지: RPMI with 10% Fetal Bovine Serum)한 후에 ELISA 실험을 진행하였다. 최종적으로 Super Aquablue (eBiosciences)를 사용하여 반응시켰으며 colorimetric signals은 450nm 파장에서의 OD값으로 측정하였다. 항 c-Met 항체를 처리하지 않은 비교군(media)의 값을 100%으로 하여, 항 c-Met 항체를 처리한 후의 값을 상기 비교군에 대한 상대값으로 계산하였다.

상기 얻어진 결과를 도 2b에 나타내었다. 도 2b에서 확인되는 바와 같이, 이중표적항체인 MV10A와 MV10AY는 각각의 c-Met 단독 표적 항체인 L3-1 및 L3-1Y에 비해 유의적으로 c-Met 분해능이 향상한 것을 볼 수 있다. 즉, MV10A의c-Met 분해능(76%)은 단독 표적 항체 L3-1의 분해능(68%)에 비해 유의하게 향상되었으며 (1-way ANOVA 분석결과p<0.01), MV10AY 의 경우에도 분해능(72%)이 단독 표적 항체 L3-1Y의 분해능(66%)보다 향상되었다 (1-way ANOVA 분석결과p<0.05).

2.3. Akt 인산화 ( Caki ) (항체의 agonism 시험)

치료용 항체에 있어 안전성과 효능을 메커니즘 기반 실험으로 검증하였다. 안전성을 보기 위해 AKT라는 키나아제의 인산화 정도를 정량적 ELISA 방법으로 측정하였다. AKT에 의해 조절되고 있는 세포작용들은 세포증식, 세포생존, 세포크기 조절, 가용 영양분에 대한 반응성, 중간 대사과정, 혈관신생(angiogenesis), 조직침투(tissue invasion) 등을 포함한다. 이 모든 과정들은 암의 특징을 대표하는 것으로 수많은 종양발생단백질(oncoprotein)과 종양발생 억제물질(tumor suppressor)은 AKT 경로 상에서 상호 교차적으로 영향을 미치며, 신호전달과 고전적인 대사조절의 연결점에서 세포의 작용을 미세하게 조절하는 기능을 수행한다. 따라서 AKT의 활성형인 인산화된 AKT의 정도가 높을 수록 암세포가 더욱 활성형인 것으로, 본 실시예에서는 항체가 양성대조항체 5D5 를 처리했을 때 대비 AKT의 인산화를 얼마나 저해할 수 있는지를 살펴보았다.

AKT의 인산화 되는 자리는 Ser 473이며 Cell signaling사의 PathScan phospho-AKT1 (Ser473) chemiluminescent Sandwich ELISA kit을 사용하였다. 하루 전날 200,000 cells/ml로 배양한 Caki-1 신장암 세포주(HTB-46; American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA)에 무혈청 DMEM 배지 (GIBCO, Invitrogen)에 5ug/ml의 항체를 섞어 30분간 처리한 후 ELISA kit을 사용하여 실험하였다. 결과는 Perkins Elmer사 기계로 측정하여 얻었다. AKT의 인산화 정도를 계산할 때는 positive control인 5D5(American Type Culture Collection; ATCC, Manassas, VA)에 의한 인산화 정도를 100%로 잡았으며, 그 값과 비교하여 다른 항 c-Met항체 및 이중표적 항체의 인산화 유도 정도를 표시하였다.

상기 얻어진 결과를 도 2c에 나타내었다. 도 2c에서 확인되는 바와 같이, 이중표적 항체 (MV10A, MV10AY)는 모두 각각에 상응하는c-Met 단독 표적 항체 (L3-1, L3-1Y) 보다 AKT 인산화를 유의적으로 더 강력히 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, MV10A의AKT 인산화 저해능(5D5 대조군 대비 79%)은 단독 표적 항체 L3-1의 저해능(69%)에 비해 유의하게 향상되었으며 (1-way ANOVA 분석결과p<0.01), MV10AY 의 경우에도 저해능(74%)이 단독 표적 항체 L3-1Y의 분해능(63%)보다 향상되었다 (1-way ANOVA 분석결과p<0.01).

2.4. MKN45 성장 저해 시험 (항체 효능 시험)

인간 위암세포주 MKN45 (JCRB0254)를 Health Science Research Resource Bank (HSRRB, Shinjuku, Japan)로부터 입수하였다. 상기 세포주를 10%(v/v) fetal bovine serum (FBS, GIBCO Cat. #16000-044)과 1%(v/v) penicillin/streptomycin (GIBCO, Cat. #15410-122)을 포함하는 RPMI1640 배지 (GIBCO, Cat. #11875-119)에서 배양하였다. 세포주를 5% CO₂를 포함하는 습윤 대기 하의 37℃에서 배양하였으며, confluence 전에 계대배양(subculture) 하였다. CEDEX Analyzer (Roche Diagnostics)를 사용하여 세포수를 측정하였다. 항체 처리(in vitro)에 따른 종양 세포 증식을 조사하기 위하여 Celltiter Glo (CTG: Promega 사) 발광분석법(luminescent assay)을 사용하였다.

상기 분석법은 제조자의 설명서에 따라서 수행하였다. 약술하면, FBS 10%(v/v) 함유 RPMI1640 배지 내의 MKN45 세포를 블랙 96-웰 플레이트(Corning Incorporated, Cat. #Costar 3603) 상에 각 웰당 1x10⁴ cells의 농도로 분주하고, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지를 이용, 최종 농도 0.008ug/mL, 0.04ug/mL, 0.2ug/mL, 1ug/mL으로희석된 항체로 처리하였다. 72시간 인큐베이팅 후 CTG 용액 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가한 후, 실온에서 30분간 인큐베이팅하였다. 상기 얻어진 발광 신호를 Envision 2104 Multi-label Reader (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA)를 사용하여 기록하였다.

상기 얻어진 결과를 도 2d에 나타내었다. 도 2d에서 확인되는 바와 같이, 이중 타겟 항체 MV10A (■)는 그의 상응하는 c-Met 단독 표적 항체 L3-1(□)에 비해 0.04ug/mL 이상의 농도에서 유의적으로 우수한 MKN45 암세포주 성장 억제 효과를 가짐을 알 수 있다 (평균과 표준 편차 표시, 2-way ANOVA 분석; Bonferroni multiple comparison test 상 얻어진 p value를 각 농도 점 아래 표시 하였다. **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001).

2.5. NCI - H441 성장 시험 (항체의 agonism 시험)

c-Met 단독 표적 항체가 c-Met 에 결합하는 경우, 원하지 않는 c-Met의 agonism (길항) 현상을 볼 수 있다. 이는 항체의 안전성과 연관이 되므로, 이중표적 특이성을 가지게 되면서 c-Met 단독 표적 항체가 원치 않는 agonism 성질이 증가되지 않는지 여부를 평가하기 위하여 NCI-H441 세포주를 이용하여 시험하였다. NCI-H441 세포주는 c-Met 단독표적항체 투여시, 아래에 기재된 특정 조건에서 agonism에 의한 세포 분열을 보이는 성질이 있다.

NCI-H441 세포주(ATCC Cat.# HTB-174)를 무혈청 RPMI1640 배지(Gibco)에 200,000 cells/ml로 희석하여 100 ul/well로 96well plate에 분주한 뒤에 24시간 동안 37℃에서 5% CO₂의 조건으로 배양한 후, 10 ug/ml의 농도부터 1/5 serial dilution 하여 6개의 농도구배로 항 c-Met 항체를 처리하였다. 21시간 동안 37℃에서 5% CO₂의 조건으로 배양한 후, 5-브로모-2'-디옥시우리딘(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)을 첨가하여 세포에 incorporation시키고, 3시간을 추가로 배양한 후, BrdU assay(Roche, Indianapolis, IN)를 진행하였다. 세포를 플레이트 상에서 denaturation/fixation한 후에 항-BrdU 항체를 넣고 1시간 후에 기질을 첨가하여 370 nm에서 ELISA spectraMax reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 발색반응을 측정하였다. 최종적으로 BrdU를 incorporation 하지 않은 세포의 값을 background control로 하여 제한 후, 항 c-Met 항체를 처리하지 않은 비교군의 값을 100%로 환산(Y축)하여 상대값을 계산하였다. 음성 대조군으로는 마우스의 IgG를 사용하였으며, 작용제(agonist)로 잘 알려진 5D5 항체(ATCC Cat. # HB11895 하이브리도마 세포에서 분리 정제)를 양성 대조군으로 사용하였다.

상기 얻어진 결과를 도 2e에 나타내었다. 도 2e에서 확인되는 바와 같이, c-Met 단독 표적 항체 L3-1에 비해 이중특이항체인 MV10A 또는 MV10AY가 agonism 성질이 증가하지 않았음, 즉 항체 안전성에 변화가 없음을 알 수 있다.

2.6. HUVEC 증식 억제 시험 (+ HGF ) (혈관신생 저해( anti - angiogenesis ) 시험)

HuVEC 세포주(ATCC)를 HGF(R&D systems) 0.4 ug/ml와 함께 EGM2 bulletkit medium (Lonza Cat. CC-3162)에서 배양하였다. 세포를 5% CO₂를 포함하는 습윤 대기 하의 37℃에서 인큐베이팅한 후 confluence 전에 계대배양 하였다. CEDEX Analyzer (Roche Diagnostics)를 사용하여 세포수를 측정하였다. 항체 처리(in vitro)에 따른 종양 세포 성장 저해 정도를 확인하기 위하여 Xcelligence Real time cell analyzer (Roche)을 이용하여 실시간 세포 분석법(Real time cell analysis)을 수행하였다. 상기 분석법은 제조사 설명서에 따라서 수행하였다. 약술하면, 상기 배양된 HuVEC 세포를 16-웰 E-플레이트 상에 각 웰당 1x10⁴ cells의 농도로 분주하고, 24시간 후에 인큐베이팅션 배지를 제거하고, 무혈청 배지(EBM medium, Lonza 사로 희석된 항체 (100uL, 최종 항체 농도 10ug/mL)를 처리하였다. 발생하는 임피던스 값을 실시간으로 측정하였다. 실시간 분석은 48시간 동안 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 2f에 나타내었다. 상기 시험 결과로 HUVEC의 성장에 대한 HGF의 영향을 단독/이중 표적 항체들이 억제할 수 있는 정도를 테스트할 수 있었다. 도 2f에서 확인되는 바와 같이, HGF를 억제하지 못하는 Bevacizumab (Roche Korea, 동량 처리)은 음성대조군(HGF only)과 마찬가지로 HGF의 효과에 전혀 영향을 주지 않았다. 그럼에도 불구하고, c-Met 과 VEGFR 이중 표적 항체 MV10A는 그 모체인 c-Met 단독 표적 항체 L3-1에 비해 더 강력한 HGF 에 대한 길항 효과가 있음을 알 수 있었다 (MV10A 64% 억제, L3-1 45% 억제; HGF only 군에 대비, 1-way ANOVA 에 의한 p value 표시: *, p<0.05; NS, 유의성 없음).

실시예 3: 융합 단백질의 VEGF 표적 및 억제 활성

3.1. 친화도( affinity ) 검사

VEGF를 표적으로 하는 이중특이적 항체의 결합 동태(binding kinetics)를 Biacore T100 instrument(GE Healthcare)를 사용하는 SPR 방법에 의하여 측정하였다. hVEGF (GE Healthcare, 28-9583-25)을 CM5 칩 표면에 제조사 설명서에 따라서 고정화시켰다. 약 90 RU의 다양한 농도(6가지 농도)의 MV10AY를 포획하였다. 1M NaCl+30mM NaOH을 30 ul/min의 유속으로 60초간 주입함으로써 상기 표면을 재생(regeneration)시켰다. 결합 동태를 결정하기 위하여, BIAevaluation software (GE Healthcare)를 사용하여 상기 실험에서 얻어진 데이터를 fitting하였다 (K_D==0.45 nM).

상기 얻어진 결과를 도 3a에 나타내었다.

3.2. HUVEC 증식 억제 시험(+ VEGF )

Xcelligence Real time cell analyzer(Roche)를 사용하여 항체 처리 (in vitro)에 따른 HUVEC 증식 정도를 조사하여 혈관신생 억제효과를 조사하였다. 상기 분석은 제조자 설명서에 따라서 수행하였다. 약술하면, HuVEC 세포주(ATCC)를 VEGF(R&D systems) 0.4 ug/ml와 함께 EGM2 bulletkit medium (Lonza Cat. CC-3162)에서 배양하였다. 상기 배양된 HuVEC 세포를 16-웰 E-플레이트 상에 각 웰당 1x10⁴ cells의 농도로 분주하고, 24시간 후에 인큐베이팅션 배지를 제거하고, 무혈청 배지 (EBM media, Lonza)로 희석된 항체(100uL, 최종 농도 10ug/mL)를 처리하였다. 발생하는 임피던스 값을 실시간으로 측정하였다. 실시간 분석은 96시간 동안 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 3b에 나타내었다. 도 3b에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 항체와 양성 대조군으로 사용된 Bevasizumab (Roche Korea, 동량 처리)은 모두VEGF 의존적 세포 증식을 나타내었으며, MV10A는 양성대조군인 Bevacizumab과 비교하여 현저한 세포 증식 억제 효과를 나타내었다 (MV10A 86% 억제, Bevacizumab 61% 억제; VEGF only 군에 대비, 1-way ANOVA 에 의한 p value 표시: *, p<0.05; NS, 유의성 없음).

3.3. HUVEC 증식 억제 시험(+ VEGF + HGF )

Xcelligence Real time cell analyzer(Roche)를 사용하여 항체 처리 (in vitro)에 따른 HUVEC 증식 정도를 조사하여 혈관신생 억제효과를 조사하였다. 상기 분석은 제조자 설명서에 따라서 수행하였다. 약술하면, 세포(HuVEC, ATCC) 10000 cells/well에 c-Met과 VEGFR의 리간드인 HGF(R&D systems) 0.4 ug/ml와 VEGF (R&D systems) 0.4 ug/ml를 처리하여 EGM2 bulletkit medium (Lonza Cat. CC-3162)에서 배양하였다. 상기 배양된 HuVEC 세포를 16-웰 E-플레이트 상에 각 웰당 1x10⁴ cells의 농도로 분주하고, 24시간 후에 인큐베이팅션 배지를 제거하고, 무혈청 배지(EBM media, Lonza)로 희석된 항체(100uL, 최종 농도 10ug/mL)를 처리하였다. 발생하는 임피던스 값을 실시간으로 측정하였다. 실시간 분석은 48시간 동안 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 3c에 나타내었다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, 단일 표적(c-Met) 항체인 L3-1Y항체 단독 투여 및 Bevacizumab (VEGF 단일 표적) 항체 단독 투여시 유의미한 HuVEC 세포 증식 억제 효과를 얻지 못한 반면, 이중 표적 항체인 MV10AY는 c-Met과 VEGF 를 동시 타게팅함으로써HGF- 및 VEGF-의존적 HUVEC 세포 증식에 대하여 현저한 synergistic 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 즉 Bevacizumab 단독 사용시 27% 억제, L3-1Y 단독 사용시 16% 억제에 그쳤으나, 이중표적항체인 MV10A는 72% 억제효과를 나타내어, 단독 항체 사용시보다 이중표적항체 사용 시에 현저한 synergistic 억제 효과가 관찰된다 (1-way ANOVA test with Bonferonni multiple comparison test 에 의한 유의성 표시. 바그래프 상단에HGF+VEGF only 군에 대비p value 표시(***, p<0.001; NS, 유의성 없음), 각 처리그룹간의 차이는 그래프 상단에 표시).

3.4. HUVEC 의 침투능 ( invasion ) 저해 시험(+ VEGF )

항체 처리(in vitro)에 따른 세포 침투능 저해 여부를 확인하기 위하여, 상부 챔버와 하부 챔버로 나뉘어져 상부 챔버에 콜라겐이 코딩된 세포 침투능 분석용 플레이트(BioCoat Growth Factor Reduced MATRIGEL Invasion Chamber; BD science, Cat#. 354483)를 사용하여 세포 침투능(invasion)을 시험하였다. 분석은 제조자의 설명서에 따라서 수행하였다. 약술하면, 상부 챔버에는 HUVEC 세포 (ATCC; 5x10⁴ cells/well)를 분주하고, 하부 챔버에는 항체(10 ug/ml)를 처리하고 37℃에서 배양하였다 (VEGF는 Lower chmaber에 첨가, 0.4ug/ml). 24시간 후, 상부 챔버의 콜라겐 층을 뚫고 하부 챔버로 내려온 세포를 calcein으로 염색하여 형광현미경(ZEISS)으로 관찰하였다.

상기 얻어진 결과와 형광 이미지를 도 3d에 나타내었다. 도 3d에서 상부는 각 항체 처리군의 상대적 형광 이미지 넓이를 나타낸 그래프이다. VEGF만을 처리했을 경우에 일어나는 invasion을 100%로 잡은 상대적인 값을 나타냈다. 도 3d하단은 실제의 형광 이미지를 보여주는 사진이다 (하얀색이 ivasion 을 일으킨 세포들). 도 3d에 나타낸 바와 같이, MV10AY 이중특이 항체는 VEGF 단일 표적 항체인 Bevacizumab 에 비해 현저한 침투능 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다 (MV10AY 100% 억제, Bevacizumab 70% 억제).

3.5. HUVEC 의 침투능 저해 시험 (+ VEGF + HGF )

항체 처리(in vitro)에 따른 세포 침투능 저해 여부를 확인하기 위하여, 상부 챔버와 하부 챔버로 나뉘어져 상부 챔버에 콜라겐이 코딩된 세포 침투능 분석용 플레이트(BioCoat Growth Factor Reduced MATRIGEL Invasion Chamber; BD science, Cat#. 354483)를 사용하여 세포 침투능(invasion)을 시험하였다. 분석은 제조자의 설명서에 따라서 수행하였다.

약술하면, 상부 챔버에는 HUVEC 세포 (ATCC; 5x10⁴ cells/well)를 분주하고, 하부 챔버에는 항체(10 ug/ml)를 처리하고 37℃에서 배양하였다 (HGF+VEGF는 Lower chmaber에 첨가, 각각 0.4ug/ml씩). 24시간 후, 상부 챔버의 콜라겐 층을 뚫고 하부 챔버로 내려온 세포를 calcein으로 염색하여 형광현미경(ZEISS)으로 관찰하였다.

상기 얻어진 결과와 형광이미지를 도 3e에 나타내었다. 도 3e에서 상부는 각 항체 처리군의 상대적 형광 이미지 넓이를 나타낸 그래프이다. VEG+HGF를 처리했을 경우에 일어나는 invasion을 100%로 잡은 상대적인 값을 나타냈다. 값이 낮을수록 invasion이 덜 일어난 것을 알 수 있다. 평균과 표준편차를 표시했으며, 1-way ANOVA 분석 결과 VEGF+HGF 처리군 대비 p 값을 각 그래프 상단에 표시하였다 (*, p<0.05; ***, p<0.001)도 3e하단은 실제의 형광 이미지를 보여주는 사진이다(까만색이 ivasion 을 일으킨 세포들). 도 3e에 나타낸 바와 같이 VEGF과 HGF 존재하에서, 이중표적항체 MV10AY는 c-Met 단일 표적 항체인 L3-1Y항체에 비해HuVEC 세포 침투에 대하여 현저하게 우수한 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있다 (MV10AY 92% 억제; L3-1Y 79% 억제; Bevacizumab 83% 억제).

3.6. HUVEC 전이능 ( migration ) 저해 시험 (+ VEGF + HGF )

c-Met과 VEGF는 모두 세포 성장뿐 아니라 암의 전이에도 관련된 인자이다. 각각의 저해제를 병용 투여시 암세포 전이능과 관련된 세포의 이동(migration)에 상승 효과를 나타내는지를 시험하였다. 항체 처리 (in vitro)에 따른 전이능 저해 능력 평가를 위해 다음과 같은 실험을 하였다. 세포의 이동은 암의 전이에 직접적으로 관여하므로 다음 분석법은 세포의 전이능을 평가하는 방법으로 범용되는 방법이다.

Oris 96-웰 플레이트(Platypus, OrisTM Cell migration assay) 방법을 수행하였다. 스토퍼(stopper)가 내장된 96-웰 플레이트의 각 웰에 HuVEC 세포 (ATCC)를 10000개씩 시딩하고 무혈청 배지(EBM, Lonza)에서 HGF 0.4 ug/ml와 VEGF 0.4 ug/ml를 처리하고 24시간 동안 배양 후 스토퍼를 제거하였다. 스토퍼는 원형의 고무물질로서 스토퍼가 있었던 자리에는 세포가 자라지 못하므로 24시간 후 스토퍼를 제거하면 그 자리만 원형의 공간이 생성되게 된다.

스토퍼 제거 후 항 c-Met 항체 L3-1Y, 항 VEGF 항체 Bevacizumab, MV10AY 항체를 다양한 농도(0.05 내지 5 ug/ml)로 처리한 후, 24시간 후에 형광물질인 calcein AM(BD)으로 염색하면, 세포만 염색되고, 세포가 없는 부분은 공간으로 남아있게 된다. 따라서, 세포 이동이 저해될수록 염색되지 않은 공간의 크기가 크게 나타나며, 염색되지 않은 공간을 관찰함으로써 세포 이동 정도를 측정할 수 있다. 형광신호 세기는 multilabel reader(Perkin-Elmer, Envision)로 판독하였으며, 이에 의해 얻어진 값을 VEGF+HGF 처리군의 신호세기 100%로 하여 환산하여 도 3f 에 나타내었다. 각 농도에서의 평균과 표준오차를 나타냈으며, VEGF+HGF 군 대비 통계학적 유의성을 각 농도 점 상단에 표시하였다 (2-way ANOVA with Bonferonni multiple comparison test; * p<0.05; *** p<0.001; **** p<0.0001).

시험된 모든 범위의 항체의 처리량에서 이중표적항체인 MV10AY는 c-Met 단일표적항체 (L3-1Y) 또는 VEGF 단일표적항체 Bevacizumab 처리시 또는 상기 단일표적항체의 병용 처리시와 비교하여 현저하게 우수한 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있다 (synergism 확인). 이는 항 c-Met 항체에 항 VEGF 기능을 더한 MV10AY 항체의 우월성을 확실히 보이는 결과이다.

실시예 4: 융합 단백질의 항암 효과 ( in vivo )

c-Met/HGF 와 VEGF 를 각각 억제시 항암 효과를 볼 수 있는 것으로 알려진 U87-MG 뇌암세포주를 이용, 생체내 항암 효과 시험을 하였다. U87-MG 뇌암세포주(purchased from cell bank of Chinese Academy of Sciences; ATCC catalog no. HTB-14) 2.5x10⁶개(100uL)를 BALB/c Nude마우스(male, 6-7주, 20-25 gram에 피하주사한 후, 1주일 경과 후 치료 군 (MV10AY (■), MV10AY U3 HC9/IgG1 (□), 또는 MV10AY U3 HC9/IgG2 (○); 투여량: 각각 0.2mg/kg (점선) 또는 1mg/kg (실선); 투여 시기: 3-4일마다 또는 10일마다; 투여경로: 정맥 주사) 과 대조군(vehicle: PBS 0.2mL 주 1회 정맥주사로 투여)으로 나누어 약물 투여를 시작하였다. 각 그룹당 마우스는 15마리로 하였다. 1주에 2회 종양의 크기를 측정하였으며, 종양의 크기 (tumor volume)는 {(장경 (mm))x(단경(mm))²}/2로 계산하였다. 치료 시작 30일 후 마우스를 안락사시킨 후 종양을 적출하고, 종양의 무게를 측정하여, 상기 측정된 종양 크기와 함게 항암 효과 평가에 사용하였다.

상기 얻어진 결과를 도 4a에 나타내었다. 도 4a의 상부는 시간에 따른 종양 크기(tumor volume)를 나타낸 것이고, 하부는 실험 종료 후 최종 적출된 종양 무게(tumor weight)를 나타낸 것이다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, 투여 시작 2주 후부터 모든 치료군에서 현저한 종양 억제 효과를 보였다. 또한 상기 3종의 이중표적항체 간의 치료 효과 차이는 크지 않았으며, 투여량 및 투여 횟수를 증가시킨 그룹에서 더욱 강력한 억제 효과를 보였다. 1mg/kg 을 매 3-4일 주사한 그룹에서는 종양이 거의 보이지 않을 정도로 완벽한 항암 효능을 보였다. (상부 그래프 repeated measures ANOVA 분석, ** (p<0.01), **** (p<0.0001); 하부 그래프Vehicle group과의 1-way ANOVA Dunnett? multiple comparison test 분석, ** (p<0.01), *** (p<0.0001))

c-Met 단독 표적 항체에 비해 c-Met과 VEGF를 동시에 표적하는 이중특이 항체가 더 향상된 항암 효과를 보일 수 있는지 알기 위해NCI-H441 세포주를 이용하여 생체내 항암 효과 실험을 하였다. NCI-H441은 c-Met 표적에 의한 항암 효과와 agonism 효과를 모두 보이는 세포주로, 포괄적인 항암 효과를 보는데 제일 적합한 세포주라고 결정하였다. NCI-H441 폐암세포주(purchased from ATCC, Cat. # HTB-174) 5x10⁶ 개(100uL)를 BALB/c Nude마우스 (male, 5-6주, 20-25g)에 피하주사한 후1주일 경과 후 치료 군 (단독표적 항체 L3-1Y, 이중표적 항체 각각 5mg/kg, 주 1회 투여) 과 대조 군(vehicle: PBS 0.2mL 주 1회 정맥주사로 투여)으로 나누어 약물 투여를 시작했다. 각 그룹당 마우스는 15마리로 하였다. 1주에 2회 종양의 크기를 측정하였으며, 종양의 크기 (tumor volume)은 {(장경(mm))x(단경(mm))²}/2로 계산하였다. 치료 시작 26일 후 마우스를 안락사 시킨 후 종양을 적출, 종양의 무게를 측정하여, 상기 측정된 종양 크기와 함게 항암 효과 평가에 사용하였다.

상기 얻어진 결과를 도 4b에 나타내었다. 도 4b의 상부는 시간에 따른 종양 크기(tumor volume)를 나타낸 것이고, 하부는실험 종료 후 최종 적출된종양 무게(tumor weight)를 나타낸 것이다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 투여 시작 1주일 후부터 두 치료군에서 모두 통계적으로 유의한 항암 효과가 관찰되었다. 특히, L3-1Y에 비해 MV10AY 치료시 보다 강력한 항암 효과를 볼 수 있었다 (상부 그래프 repeated measures ANOVA, **** (p<0.0001); 하부 그래프 1-way ANOVA with Dunnett? multiple comparison test 분석 vs the Vehicle group, * (p<0.05), *** (p<0.0001)).

실시예 5: 다양한 항-c- Met 항체를 포함하는 융합 단백질

VIG2를 융합한 경우 위의 예에서 보여준 L3-1이나 L3-1Y, L3-1Y IgG2 외에 다른 CDR을 가진 항 c-Met 항체의 효능도 개선이 되는지 확인하였다.

항 c-Met 항체의 효능은 상기 실시예 2.2와 동일한 방법으로 c-Met 분해 정도를 시험하여 측정되었으며, 이 때 사용된 항체를 아래의 표 5에 정리하였다.

명명	중쇄	경쇄	링커	VEGF 결합 단편
Ab1	서열번호 112	서열번호 113	-	-
Ab1-VIG2	서열번호 112	서열번호 113	(G4S)₂	VIG2 (서열번호 110)
Ab2	서열번호 114	서열번호 115	-	-
Ab2-VIG2	서열번호 114	서열번호 115	(G4S)₂	VIG2 (서열번호 110)

상기 얻어진 결과를 도 5 에 나타내었다. 도 5 에서 확인되는 바와 같이, 이중표적항체인 Ab1-VIG2 와 Ab2-VIG2 는 각각의 c-Met 단독 표적 항체인 Ab1 및 Ab2에 비해 c-Met 분해능이 향상한 것을 볼 수 있다. 즉, Ab1-VIG2 의c-Met 분해능(83.2%)은 단독 표적 항체 Ab1의 분해능(81.7%)에 비해 향상되었으며, Ab2-VIG2 의 경우에도 분해능(81.9%)이 단독 표적 항체 Ab2의 분해능(70.4%)보다 향상되었다 (t-test 분석결과p<0.01).

한국세포주연구재단

KCLRFBP00220

20091009

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Fusion protein comprising anti-c-Met antibody and VEGF binding fragment <130> DPP20122723KR <160> 115 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X is Asn or Lys <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is Ala or Val <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X is Asn or Thr <400> 5 Arg Asn Xaa Xaa Asn Gly Xaa Thr 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X is Ser or Thr <400> 6 Asp Asn Trp Leu Xaa Tyr 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is His, Arg, Gln or Lys <220> <221> UNSURE <222> (12) <223> X is His or Gln <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> X is Lys or Asn <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> X is Ser or Trp <400> 7 Lys Ser Ser Xaa Ser Leu Leu Ala Xaa Gly Asn Xaa Xaa Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> X is Ala or Gly <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is Thr or Lys <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X is Ser or Pro <400> 8 Trp Xaa Ser Xaa Arg Val Xaa 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> X is Gly, Ala or Gln <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> X is Arg, His, Ser, Ala, Gly or Lys <220> <221> UNSURE <222> (8) <223> X is Leu, Tyr, Phe or Met <400> 9 Xaa Gln Ser Tyr Ser Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 of AbF46 <400> 10 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 of AbF46 <400> 11 Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of AbF46 <400> 12 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-1 clone <400> 13 Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-2 clone <400> 14 Gly Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-3 clone <400> 15 Ala Gln Ser Tyr Ser His Pro Phe Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-5 clone <400> 16 Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Phe Thr 1 5 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp 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Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 20 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln 85 90 95 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caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 49 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H4-heavy <400> 49 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caccttcact gattactaca tgagctgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg 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gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000 agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060 tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120 acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180 gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240 ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300 ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360 tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 3840 aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 3900 gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 3960 cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 4020 atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 4080 tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 4140 ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 4200 ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 4260 ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacgggcagt caggcaacta 4320 tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 4380 tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 4440 aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 4500 tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 4560 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 4620 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 4680 agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4740 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4800 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4860 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4920 tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 4980 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5040 ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5100 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5160 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5220 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5280 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5340 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5400 aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 5460 ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5520 acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aattaaccct cactaaaggg 5580 aacaaaagct ggctagt 5597 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-HC7 hinge <400> 57 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 58 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-1 clone <400> 58 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtacacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 59 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 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<400> 62 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Leu Gly 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ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 agctgcgatt gccactgtcc tccatgtcca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1410 <210> 64 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG1 <400> 64 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 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taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagaggaag 720 tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg actcgag 1407 <210> 66 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2 <400> 66 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 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gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatgact cgag 1404 <210> 68 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 68 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 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ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416 <210> 77 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain of anti-c-Met antibody (AbF46 or huAbF46-H1) <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (7)..(90) <223> signal sequence <220> <221> misc_difference <222> (91)..(432) <223> VL - light chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (430)..(435) <223> BsiWI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference 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antibody L3-11Y <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 109 <211> 1338 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human VEGFR-1 <400> 109 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro 20 25 30 Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr 35 40 45 Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro 50 55 60 Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala 65 70 75 80 Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr 85 90 95 Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val 100 105 110 Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile 115 120 125 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 130 135 140 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 145 150 155 160 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 180 185 190 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 195 200 205 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 210 215 220 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val 225 230 235 240 Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr 245 250 255 Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys 260 265 270 Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His 275 280 285 Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys 290 295 300 Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys 305 310 315 320 Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val 325 330 335 Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser 340 345 350 Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val 355 360 365 Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu 370 375 380 Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala 385 390 395 400 Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys 405 410 415 Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu 420 425 430 Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser 435 440 445 Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gln Pro Thr Ile 450 455 460 Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys 465 470 475 480 Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Ala Asp Ser 485 490 495 Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln Arg Met Ala Ile Ile 500 505 510 Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp Ser Arg 515 520 525 Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn Lys Val Gly Thr Val 530 535 540 Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp Val Pro Asn Gly Phe His 545 550 555 560 Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser 565 570 575 Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr Trp Ile Leu Leu 580 585 590 Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser Ile Ser Lys Gln Lys 595 600 605 Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu Asn Leu Thr Ile Met 610 615 620 Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn 625 630 635 640 Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys Lys Glu Ile Thr Ile Arg 645 650 655 Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His Thr Val 660 665 670 Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly Val Pro 675 680 685 Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys Ile Gln Gln Glu 690 695 700 Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ile Glu Arg 705 710 715 720 Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln 725 730 735 Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln Gly Thr Ser 740 745 750 Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr Cys Thr Cys Val Ala 755 760 765 Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Phe Ile Arg Lys Met Lys 770 775 780 Arg Ser Ser Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr Leu Ser Ile Ile Met Asp 785 790 795 800 Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp 805 810 815 Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly Lys Ser 820 825 830 Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Gln Ala Ser Ala Phe Gly 835 840 845 Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys 850 855 860 Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys 865 870 875 880 Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly 885 890 895 Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu Tyr Cys 900 905 910 Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe 915 920 925 Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys 930 935 940 Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Val 945 950 955 960 Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gln Glu Asp Lys Ser 965 970 975 Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu 980 985 990 Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg 995 1000 1005 Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala 1010 1015 1020 Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val Lys Ile Cys Asp 1025 1030 1035 1040 Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr Val Arg Lys 1045 1050 1055 Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe 1060 1065 1070 Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Leu 1075 1080 1085 Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Val Gln 1090 1095 1100 Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu Arg Glu Gly Met Arg Met Arg 1105 1110 1115 1120 Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu Ile Tyr Gln Ile Met Leu Asp Cys 1125 1130 1135 Trp His Arg Asp Pro Lys Glu Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu 1140 1145 1150 Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gln Ala Asn Val Gln Gln Asp Gly Lys Asp 1155 1160 1165 Tyr Ile Pro Ile Asn Ala Ile Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr 1170 1175 1180 Ser Thr Pro Ala Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Ala 1185 1190 1195 1200 Pro Lys Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala 1205 1210 1215 Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu 1220 1225 1230 Pro Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gln Gly Asp Ser Ser Thr 1235 1240 1245 Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser Lys 1250 1255 1260 Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Asp Leu Arg Val Thr Ser Lys Ser Lys 1265 1270 1275 1280 Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys His Ser Ser 1285 1290 1295 Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr Tyr Asp His Ala 1300 1305 1310 Glu Leu Glu Arg Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro Pro Pro Asp Tyr Asn 1315 1320 1325 Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile 1330 1335 <210> 110 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Ig2 domain(VIG2) of human VEGF receptor 1 <400> 110 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile 100 <210> 111 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coding sequence of VIG2 <400> 111 agtgatacag gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60 actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120 ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180 agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240 gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300 atc 303 <210> 112 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of anti-c-Met antibody 1 <400> 112 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Val Asn Pro Asn Arg Arg Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asn Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 113 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain of anti-c-Met antibody 1 <400> 113 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Ser Ile 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Tyr Ser Gly Tyr Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys 210 215 <210> 114 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of anti-c-Met antibody 2 <400> 114 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 115 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain of anti-c-Met antibody 2 <400> 115 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Ala Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims

항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질로서,
상기 VEGF 결합 단편은 서열번호 109 중의 서열번호 110을 포함하여 연속하는 101 내지 1338개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드인, 융합 단백질.
제1항에 있어서,
VEGF 결합 단편은 서열번호 110의 VIG2 (second Ig-like domain 2)인, 융합 단백질.
삭제
제1항에 있어서,
항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 VEGF 결합 단편 사이에 링커를 추가로 포함하는, 융합 단백질.
제4항에 있어서,
상기 링커는 1 내지 100개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커인, 융합 단백질.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1,
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2,
서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3,
서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1,
서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및
서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3를 포함하거나,
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1,
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2,
서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3,
서열번호 106의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1,
서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및
서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3를 포함하는 것인,
융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편은,
서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 또는 서열번호 107의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역
을 포함하는 것인, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열, 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열, 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열, 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄, 및
서열번호 68의 아미노산 서열, 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70, 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 또는 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체인,
융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 112의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 113의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하거나,
서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 115의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 것인,
융합 단백질.
제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는 단일클론 항체인, 융합 단백질.
제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체 또는 인간화 항체인, 융합 단백질.
제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체의 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 융합 단백질.
제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는, c-Met과 VEGF의 이중 표적 항체.
제15항의 c-Met과 VEGF의 이중 표적 항체를 유효성분으로 포함하는, 암, 임신성 당뇨, 당뇨성 망막병증, 및 황반변성으로 이루어진 군에서 선택된 c-Met 또는 VEGF 유발 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
제16항에 있어서,
상기 c-Met 또는 VEGF 유발 질병은 암인, 예방 또는 치료용 조성물.
제15항의 c-Met과 VEGF의 이중 표적 항체를 포함하는, 암, 임신성 당뇨, 당뇨성 망막병증, 및 황반변성으로 이루어진 군에서 선택된 c-Met 또는 VEGF 유발 질병의 진단용 조성물.
항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 VEGF 결합 단편을 연결시키는 단계를 포함하고,
상기 VEGF 결합 단편은 서열번호 109 중의 서열번호 110을 포함하여 연속하는 101 내지 1338개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드인,
효능이 개선된 항 c-Met 항체의 제조 방법.
제19항에 있어서,
상기 VEGF 결합 단편은 서열번호 110의 VIG2인, 효능이 개선된 항 c-Met 항체의 제조 방법.
제19항에 있어서,
상기 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 VEGF 결합 단편을 연결시키는 단계는 상기 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 VEGF 결합 단편을 링커를 통하여 연결시키는 것인,
효능이 개선된 항 c-Met 항체의 제조 방법.
제21항에 있어서,
상기 링커는 1 내지 100개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커인, 효능이 개선된 항 c-Met 항체의 제조 방법.