JP2018048192A - c−Met抗体およびVEGF結合断片が連結された融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 抗−c−Met抗体とVEGF結合断片が連結された融合タンパク質、前
記融合タンパク質を含む二重特異性抗体、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオ
チド、前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体、前記二重特異性抗体を有効成分として含
む医薬組成物、および抗−c−Met抗体にVEGF結合断片を連結するステップを含む
抗がんおよび新生血管抑制効能が改善されたc−MetとVEGFを同時に標的とする二
重特異性抗体の製造方法。
【選択図】 図2A
Description
パク質を含む二重特異性抗体、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記
ポリヌクレオチドを含む形質転換体、前記二重特異性抗体を有効成分として含む医薬組成
物、および抗c−Met抗体にVEGF結合断片を連結する工程を含む抗がんおよび新生
血管抑制効能が改善されたc−MetとVEGFを同時に標的とする融合タンパク質およ
び二重特異性抗体の製造方法に関する。
or Tyrosine Kinase;RTK)であり、そのリガンドである肝細胞成
長因子(Hepatocyte Growth Factor;HGF)と結合して細胞
内シグナル伝達を促して細胞の成長を促すだけではなく、がん細胞に過剰発現されて発が
ん、がん転移、がん細胞移動、がん細胞浸潤、新生血管形成にも広範に関与する。c−M
etは、種々のがんにおいて過剰発現されており、特に、c−Metの過剰発現がある患
者はがんの治療予後が悪い場合がほとんどである。
owth Factor:VEGF)は正常細胞にも存在し、特に、がん細胞から分泌さ
れてその受容体であるVEGFR(VEGF Receptor)と結合して血管新生(
angiogenesis)を引き起こし、がん細胞にはその新たな血管を介して成長に
必要な栄養分が供給される。
重要性が高く、c−MetとVEGFを同時に標的とする抗体およびこれらを用いるがん
治療技術の開発が求められる。
ることである。
を同時に標的とする二重特異性抗体を提供することである。
することである。
ある。
供することである。
む、抗がんおよび新生血管抑制効能が改善されたc−MetとVEGFを同時に標的とす
る二重特異性抗体の製造方法を提供することである。
融合タンパク質を提供する。前記融合タンパク質は、c−MetとVEGFに同時に結合
可能な二重特異性を有することから、c−MetとVEGFを同時に標的としてがん細胞
の成長と血管新生を効果的に阻害して、改善された抗がん効果および/または血管新生阻
害効果を得ることができる。
することによりがん細胞の成長自体を阻害することができ、同時にVEGFを標的とする
ことにより新生血管の形成を遮断し且つがん細胞の成長に欠かせない栄養分の供給を防い
でがん細胞の成長をさらに阻害することにより、がん細胞成長の阻害および/または新生
血管の形成の阻害に際してより一層増進された相乗効果を期待することができる。
結合断片、または前記抗体の変形体とが連結された融合タンパク質が提供される。本発明
の他の例において、前記融合タンパク質を含む、c−MetとVEGFに同時に結合可能
な二重特異性抗体(二重標的抗体とも言う)が提供される。具体的に、VEGF結合断片
と、抗c−Met抗体、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗体の変形体とを含む融合
タンパク質を含む、c−MetとVEGFの二重特異性抗体が提供される。
オチドおよび前記ポリヌクレオチドが取り込まれた形質転換体が提供される。前記形質転
換体は、前記融合タンパク質または二重特異性抗体の産生に使用可能である。
有効成分として含む医薬組成物が提供される。前医薬学組成物は、c−Metおよび/ま
たはVEGF誘発疾病の予防および/または治療効果を有するものであってもよく、例え
ば、抗がん剤または新生血管生成阻害剤であってもよい。
るステップを含むc−Metおよび/またはVEGF誘発疾病の予防および/または治療
方法が提供される。
発現させたり、抗c−Met抗体、前記抗体の抗原結合断片または前記抗体の変形体にV
EGF結合部位を連結する工程を含む、抗がんおよび新生血管抑制効能が改善されたc−
MetとVEGFを同時に標的とする二重特異性抗体の製造方法が提供される。
または前記抗体の変形体にVEGF結合断片を連結して抗がん効能および/または新生血
管形成抑制効能が増進されたc−Met抗体を製造する方法が提供される。
Metおよび/またはVEGFの同時検出用組成物が提供される。
Metおよび/またはVEGF誘発疾病の診断用組成物が提供される。
Growth Factor:VEGF)は正常細胞にも存在し、特に、がん細胞から分
泌されてその受容体であるVEGFR(VEGF Receptor)と結合して血管新
生(angiogenesis)を引き起こし、がん細胞にはその新たな血管を介して成
長に必要な栄養分が供給される。VEGFの過発現は様々な疾病の原因となり、特に、発
がんだけではなく、侵襲、転移などの悪い予後にも関与する。この理由から、VEGFは
抗がん療法に際して重要な標的となる。
めとする哺乳類由来のものであってもよい。例えば、前記VEGFタンパク質は、Gen
Bank寄託番号NM_001025366.2、NM_001025367.2、NM
_001025368.2、NM_001025369.2、NM_001025370
.2、NM_001033756.2、NM_001171622.1、NM_0011
71623.1、NM_001171624.1、NM_001171625.1、NM
_001171626.1、NM_001171627.1、NM_001171628
.1、NM_001171629.1、NM_001171630.1、NM_0012
04384.1、NM_001204385.1、NM_003376.5などに供され
たヌクレオチド配列(mRNA)によってコードされたポリペプチドであってもよい。
ゼを意味する。前記c−Metタンパク質はあらゆる種に由来のものであってもよく、例
えば、ヒトc−Met(例えば、NP_000236)、サルc−Met(例えば、アカ
ゲザル、NP_001162100)などの霊長類由来のもの、またはマウスc−Met
(例えば、NP_032617.2)、ラットc−Met(例えば、NP_113705
.1)などのげっ歯類由来のものなどであってもよい。前記タンパク質は、例えば、Ge
nBank寄託番号NM_000245に供されたヌクレオチド配列によってコードされ
たポリペプチド、またはGenBank寄託番号NM_000236に供されたポリペプ
チド配列によってコードされたタンパク質、またはその細胞外ドメインを含む。受容体チ
ロシンキナーゼc−Metは、例えば、発がん、がん転移、がん細胞移動、がん細胞浸潤
、新生血管生成過程などの種々の機序に関与する。
のみを認識する単一標的抗体であってもよく、この詳細については、後述する。
(CDR)、CDRとFc領域、scFv、(scFv)2、Fab、Fab'またはF
(ab')2などよりなる群から選ばれたものであってもよく、この詳細については、後
述する。
端に好適なペプチドリンカーを介してまたは介さずに連結され得る。また、抗c−Met
抗体の抗原結合断片が用いられる場合、VEGF結合断片は、抗c−Met抗体の抗原結
合断片のN−末端および/またはC−末端の両方に連結可能であり、好適なペプチドリン
カーを介してまたは介さずに連結され得る。
またはヒンジを構成するアミノ酸が変形されたあらゆるヒトおよび動物抗体のFcを含む
ものなどであってもよく、この詳細については、後述する。本発明において、別途の断り
のない限り、抗c−Met抗体は、上述した変形体を含むものであると理解される。
F受容体、抗VEGF抗体などのVEGF結合タンパク質、または前記VEGF結合タン
パク質のVEGF結合部位を含む断片、例えば、抗VEGF抗体の抗原結合断片またはV
EGF受容体のVEGF結合部位であってもよい。例えば、前記抗VEGF抗体はベバシ
ズマブ(bevacizumab)であってもよく、前記抗VEGF抗体の抗原結合断片
は前記抗VEGF抗体の相補性決定領域(CDR)または可変領域、CDRとFc領域の
組み合わせ、scFv、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2などよりなる
群から選ばれたものであってもよい。前記VEGF受容体は、例えば、ヒトのVEGF受
容体1(human VEGF Receptor 1;P17948.2;配列番号1
09)、ヒトのVEGF受容体2(human VEGF Receptor 2;P3
5968.2)、ヒトのVEGF受容体3(human VEGF Receptor
3;P35916.3)などであってもよい。なお、前記VEGF結合タンパク質のVE
GF結合部位を含む断片は、第2Ig様ドメイン2(VIG2)またはVEGF受容体の
うちの前記VIG2部位を含むポリペプチドであってもよい。例えば、ヒトのVEGF受
容体1のVEGF結合部位を含む断片は、第2Ig様ドメイン2(VIG2;例えば、P
17948.2のアミノ酸配列(配列番号109)の129番目から229番目までのア
ミノ酸配列(配列番号110))、または前記配列番号109のアミノ酸のうち前記VI
G2を含んで連続する102〜1338個のアミノ酸を含むポリペプチドなどであっても
よい。
VEGF抗体、前記抗VEGF抗体の相補性決定領域(CDR)、CDRとFc領域、s
cFv、(scFv)2、Fab、Fab'またはF(ab')2などよりなる群から選ば
れた抗VEGF抗体の抗原結合断片、VEGF受容体(例えば、配列番号109)、また
は前記VEGF受容体のVEGF結合部位(例えば、配列番号110のVIG2、または
配列番号109のアミノ酸のうち配列番号110のVIG2を含んで連続する102〜1
338個のアミノ酸を含むポリペプチド)などであってもよい。
−Met抗体、その断片、または変形体のFc部分にVEGF結合断片、例えば、VIG
2を連結したものであってもよい(図1参照)。
F結合断片はリンカーによって連結されたものであってもよい。前記リンカーは、1〜1
00個、好ましくは、2〜50個、より好ましくは5〜30個のアミノ酸長さのペプチド
リンカーであってもよく、例えば、Gly、Asn、Ser、Thr、Alaなどからな
る群から選ばれる1種以上のアミノ酸を含むものであってもよいが、これらに制限されな
い。本発明の一実施形態において、前記リンカーは(GGGGS)nで表わされるもので
あってもよく、前記nは、(GGGGS)(配列番号116)単位体の繰り返し回数であ
り、二重特異性抗体の効能を考慮して1〜10、好ましくは1〜5であってもよい。
連結して二重特異性抗体として製作することにより、c−Met抗体の薬理学的な効果を
より一層増進することを特徴とする。
抗c−Met抗体またはその抗原結合断片であってもよい。特に、前記抗c−Met抗体
は、c−Metの特定の部位、例えば、SEMAドメイン内の特定の部位を連続する5以
上のアミノ酸からなるエピトープを特異的に認識し、結合し得る。前記抗c−Met抗体
は、c−Metに作用して細胞内移行(internalization)および分解(
degradation)を誘導するあらゆる抗体またはその抗原結合断片であってもよ
い。
容体であるc−Metは、細胞外部位、膜透過部位、細胞内部位の3つの部分に分けられ
る。細胞外部位の場合、ジスルフィド結合を通してα−サブユニットとβ−サブユニット
が連結された形であり、HGF結合ドメインであるSEMAドメイン、PSIドメイン(
plexin−semaphorins−integrin homology dom
ain)およびIPTドメイン(immunoglobulin−like fold
shared by plexins and transcriptional fa
ctors domain)からなる。c−Metタンパク質のSEMAドメインは、配
列番号79のアミノ酸配列を含むものであってもよく、c−Metの細胞外部位に存在す
るドメインであり、HGFと結合する部位である。SEMAドメインの特異的な領域、例
えば、c−Metタンパク質のSEMAドメイン(配列番号79)のアミノ酸配列の10
6〜124番目のアミノ酸残基の範囲に相当する、配列番号71のアミノ酸配列を含む領
域は、SEMAドメインのエピトープを持つ2番目と3番目のプロペラ構造の間にあるル
ープ領域である。この領域は、本発明に係る特異的な抗c−Met抗体のエピトープとし
て働く。
erminant)であり、抗体によって認識される抗原の一部分を意味するものである
と解釈される。本発明の一実施形態によれば、前記エピトープは、c−Metタンパク質
のSEMAドメイン(配列番号79)内の連続する5以上のアミノ酸を含む部位、例えば
、c−Metタンパク質のSEMAドメイン(配列番号79)内の106番目から124
番目までに相当する配列番号71内に位置する連続する5個〜19個のアミノ酸を含むも
のであってもよい。例えば、前記エピトープは、配列番号71のアミノ酸配列のうち配列
番号73(EEPSQ)を含んで連続する5〜19個のアミノ酸からなるものであっても
よく、例えば、配列番号71、配列番号72または配列番号73のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドであってもよい。
Aドメイン内の2番と3番のプロペラ構造のドメイン間のループ領域のうちの最外側に位
置する部位に相当し、前記配列番号73のアミノ酸配列を含むエピトープは、本発明の一
実施形態による抗体が比較的に特異的に結合する部位である。
73(EEPSQ)を含んで連続する5〜19個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に
結合するものであってもよく、例えば、配列番号71、配列番号72、または配列番号7
3のアミノ酸配列を含むエピトープに特異的に結合する抗体であってもよい。
CDR−H1、配列番号5のアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号
2のアミノ酸配列内の3番目から10番目までのアミノ酸残基を含む連続する8〜19個
のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むCDR−H2、および配列番号6のアミノ酸配列、
配列番号85のアミノ酸配列または配列番号85のアミノ酸配列内の1番目から6番目ま
でのアミノ酸残基を含む6〜13個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むCDR
−H3、からなる群から選択された1以上の重鎖相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配
列を含む重鎖可変領域と、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR−L1、配列番号8の
アミノ酸配列を含むCDR−L2、および配列番号9のアミノ酸配列、配列番号86のア
ミノ酸配列、または配列番号89のアミノ酸配列内の1番目から9番目までのアミノ酸残
基を含む配列番号89の9〜17個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むCDR
−L3からなる群から選択された1以上の軽鎖相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記配列番号4〜9は、それぞれ下記の一般式I〜一般
式VIで表わされるアミノ酸配列であるものであってもよい:
一般式I
Xaa1−Xaa2−Tyr−Tyr−Met−Ser(配列番号4)、
一般式II
Arg−Asn−Xaa3−Xaa4−Asn−Gly−Xaa5−Thr(配列番号
5)、
一般式III
Asp−Asn−Trp−Leu−Xaa6−Tyr(配列番号6)、
一般式IV
Lys−Ser−Ser−Xaa7−Ser−Leu−Leu−Ala−Xaa8−G
ly−Asn−Xaa9−Xaa10−Asn−Tyr−Leu−Ala(配列番号7)
一般式V
Trp−Xaa11−Ser−Xaa12−Arg−Val−Xaa13(配列番号8
)
一般式VI
Xaa14−Gln−Ser−Tyr−Ser−Xaa15−Pro−Xaa16−T
hr(配列番号9)
前記一般式Iにおいて、Xaa1は存在しないか、あるいは、ProまたはSerであ
り、Xaa2はGluまたはAspであり、
前記一般式IIにおいて、Xaa3はAsnまたはLysであり、Xaa4はAlaま
たはValであり、Xaa5はAsnまたはThrであり、
前記一般式IIIにおいて、Xaa6はSerまたはThrであり、
前記一般式IVにおいて、Xaa7はHis、Arg、GlnまたはLysであり、X
aa8はSerまたはTrpであり、Xaa9はHisまたはGlnであり、Xaa10
はLysまたはAsnであり、
前記一般式Vにおいて、Xaa11はAlaまたはGlyであり、Xaa12はThr
またはLysであり、Xaa13はSerまたはProであり、
前記一般式VIにおいて、Xaa14はGly、AlaまたはGlnであり、Xaa1
5はArg、His、Ser、Ala、GlyまたはLysであり、Xaa16はLeu
、Tyr、PheまたはMetである。
番号23および配列番号24からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであっても
よい。前記CDR−H2は、配列番号2、配列番号25、および配列番号26からなる群
から選ばれるアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記CDR−H3は、配列番号3
、配列番号27、配列番号28、および配列番号85からなる群から選ばれるアミノ酸配
列を含むものであってもよい。
列番号32、配列番号33、および配列番号106からなる群から選ばれるアミノ酸配列
を含むものであってもよい。前記CDR−L2は、配列番号11、配列番号34、配列番
号35、および配列番号36からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであっても
よい。前記CDR−L3は、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15
、配列番号16、配列番号37、配列番号86、および配列番号89からなる群から選ば
れるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
および配列番号24からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR−
H1)、配列番号2、配列番号25、および配列番号26からなる群から選ばれるアミノ
酸配列を含むポリペプチド(CDR−H2)、および配列番号3、配列番号27、配列番
号28、および配列番号85からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド(
CDR−H3)を含む重鎖可変領域と、配列番号10、配列番号29、配列番号30、配
列番号31、配列番号32、配列番号33、および配列番号106からなる群から選ばれ
るアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR−L1)、配列番号11、配列番号34、配
列番号35、および配列番号36からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド(CDR−L2)、および配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15
、配列番号16、配列番号37、配列番号86、および配列番号89からなる群から選ば
れるアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR−L3)を含む軽鎖可変領域と、を含むも
のであってもよい。
ヒトに投与するときに免疫拒絶反応が起こることがあり、このような免疫拒絶反応を抑制
するためにキメラ型抗体(chimeric antibody)が開発された。キメラ
型抗体は、遺伝工学的な方法を用いて抗アイソタイプ(anti−isotype)反応
の原因となる動物由来の抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換したものである。キ
メラ型抗体は、動物由来の抗体に比べて抗アイソタイプ反応においてかなり改善されたが
、依然として動物由来のアミノ酸が可変領域に存在しているため潜在的な抗イディオタイ
プ(anti−idiotypic)反応に対する副作用を抱えている。このような副作
用を改善するために開発されたものが、ヒト化抗体である。これは、キメラ型抗体の可変
領域のうち抗原の結合に重要な役割を果たす相補性決定領域(CDR:compleme
ntaritiy determining regions)部位をヒト抗体骨格(フレ
ームワーク、framework)に移植(挿入)して製作される。
動物由来の抗体のCDR部位を最も上手に取り入れ得る最適化したヒト抗体を選定するこ
とであり、このために、抗体データベースの活用、結晶構造(crystal stru
cture)の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかしながら、たとえ最適
化したヒト抗体骨格に動物由来の抗体のCDR部位を移植するとしても、動物由来の抗体
の骨格に位置して抗原結合に影響するアミノ酸が存在する場合があるため抗原結合力が保
存できない場合が多く存在するため、抗原結合力を復元するためのさらなる抗体工学技術
の適用は欠かせないものであるといえる。
体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。
する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合によって連結されている。抗
体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域とに分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ(
γ)、ミュー(μ)、アルファ(α)、デルタ(δ)およびイプシロン(ε)タイプを有
し、サブカラスとしてガンマ1(γ1)、ガンマ2(γ2)、ガンマ3(γ3)、ガンマ
4(γ4)、アルファ1(α1)およびアルファ2(α2)を有する。軽鎖の不変領域は
カッパ(κ)およびラムダ(λ)タイプを有する。
変領域配列を含むアミノ酸配列を含む可変領域ドメインVHおよび3個の不変領域ドメイ
ンCH1、CH2およびCH3とヒンジを含む全長重鎖およびこの断片をいずれも含む意
味であると解釈される。また、「軽鎖(light chain)」の用語は、抗原に特
異性を与えるために十分な可変領域配列を含むアミノ酸配列を含む可変領域ドメインVL
および不変領域ドメインCLを含む全長軽鎖およびこの断片をいずれも含む意味であると
解釈される。
g region)」の用語は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高度可変領域(hy
pervariable region)のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖は
それぞれ3個のCDRを含んでいてもよい(CDRH1、CDRH2、CDRH3および
CDRL1、CDRL2、CDRL3)。前記CDRは、抗体が抗原またはエピトープに
結合するに際して重要な接触残基(contact residue)を提供することが
できる。一方、本明細書において、用語「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当
業者にとって一般的に公知となっている意味と同じものであり、抗原および抗体が特異的
に相互作用して免疫学的な反応をすることを意味する。
可能な部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、CDR、CDRとFc領域、
scFv、(scFv)2、Fab、Fab'またはF(ab')2であってもよいが、こ
れに限定されない。
び重鎖の最初の不変領域(CH1)を有する構造であり、1つの抗原結合部位を有する。
を有するという点でFabとは相違点がある。
しながら生成される。Fvは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有している最小の
抗体欠片であり、Fv断片を生成する組換え技術は当業者にとって周知である。
変部位が連結されており、一本鎖Fv(single−chain Fv)は、一般に、
ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合によって連結され
るか、あるいは、C末端において直結されているため、二重鎖Fvのようにダイマーと同
じ構造を有することができる。
体をパパインで制限切断すればFabを得ることができ、ペプシンで切断すればF(ab
')2断片を得ることができる)、遺伝子組換え技術を用いて製作することができる。
域であり、CH1およびCH2領域の間に存在し、抗体内抗原結合部位の柔軟性を提供す
る機能をする領域を意味する。
IgG1ヒンジはヒトIgG1ヒンジで置換されるが、動物由来のIgG1ヒンジはヒト
IgG1ヒンジに比べてその長さが短く、2つの重鎖間のジスルフィド結合(disul
fide bond)が3個から2個に減少してヒンジの硬直性(rigidity)が
互いに異なる効果を示す。このため、ヒンジ領域の修飾(modification)は
、ヒト化抗体の抗原結合効率性を増大させることができる。前記ヒンジ領域のアミノ酸配
列を変形するためのアミノ酸の欠失、付加または置換方法は当業者にとって周知である。
−Met抗体または抗原結合断片は1以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、またはそれ以上)のアミノ酸が欠失、付加または置換されてアミノ酸配列が変
形されたヒンジ領域を含むものであってもよい。例えば、前記抗体は、配列番号100(
U7−HC6)、配列番号101(U6−HC7)、配列番号102(U3−HC9)、
配列番号103(U6−HC8)、配列番号104(U8−HC5)、または配列番号1
05(非修飾ヒトヒンジ領域)のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含むものであってもよ
い。
領域は、全ての免疫グロブリンのサブタイプ(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG
(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgMなど)の重鎖不変領域および軽鎖
不変領域であってもよい。
鎖可変領域は、配列番号17、配列番号74、配列番号87、配列番号90、配列番号9
1、配列番号92、配列番号93または配列番号94のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可
変領域は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号75、
配列番号88、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号9
9、または配列番号107のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
220であるハイブリドーマ細胞から産生される、c−Metタンパク質の細胞外部位(
extracellular region)に特異的に結合するモノクローナルモノク
ローナル抗体であってもよい(大韓民国公開特許第2011−0047698号参照;前
記文献は本明細書に参照により取り込まれる)。
れた抗体をいずれも含んでいてもよい。
、1番目から17番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである)または配列番号6
2の18番目から462番目までのアミノ酸配列、配列番号64(これらの中で、1番目
から17番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである)または配列番号64の18
番目から461番目までのアミノ酸配列、および配列番号66(これらの中で、1番目か
ら17番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである)または配列番号66の18番
目から460番目までのアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖と
、配列番号68(これらの中で、1番目から20番目までのアミノ酸配列はシグナルペプ
チドである)または配列番号68の21番目から240番目までのアミノ酸配列を含む軽
鎖からなる抗体、配列番号70(これらの中で、1番目から17番目までのアミノ酸配列
はシグナルペプチドである)または配列番号70の21番目から240番目までのアミノ
酸配列または配列番号108のアミノ酸配列を含む軽鎖と、からなる抗体であってもよい
。
配列番号62のアミノ酸配列または配列番号62の18番目から462番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号68のアミノ酸配列または配列番号68の21番目か
ら240番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号64のアミノ酸配列または配列番号64の18番目から461番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号68のアミノ酸配列または配列番号68の21番目か
ら240番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号66のアミノ酸配列または配列番号66の18番目から460番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号68のアミノ酸配列または配列番号68の21番目か
ら240番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号62のアミノ酸配列または配列番号62の18番目から462番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号70のアミノ酸配列または配列番号70の21番目か
ら240番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号64のアミノ酸配列または配列番号64の18番目から460番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号70のアミノ酸配列または配列番号70の21番目か
ら240番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号66のアミノ酸配列または配列番号66の18番目から460番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号70のアミノ酸配列または配列番号70の21番目か
ら240番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号62のアミノ酸配列または配列番号62の18番目から462番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号108のアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号64のアミノ酸配列または配列番号64の18番目から461番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号108のアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、また
は
配列番号66のアミノ酸配列または配列番号66の18番目から460番目までのアミ
ノ酸配列を含む重鎖および配列番号108のアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体であっ
てもよい。
−L3重鎖可変領域とヒトのカッパ不変領域を含む軽鎖であり、配列番号68のアミノ酸
配列を含むポリペプチドは、前記配列番号70のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおい
て36番目(Kabat番号付けによる、配列番号68内の62番目のアミノ酸位)のヒ
スチジン(histidine)がチロシン(tyrosine)で置換された形のポリ
ペプチドである。前記置換によって、本発明の一実施形態による抗体の産生量が増大され
得る。また、前記配列番号108のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、前記配列番号6
8のアミノ酸配列のうち1番目から20番目までのシグナルペプチドを除く21番目から
240番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいてKabat番号付けによる2
7e位置(Kabat番号付けによる、配列番号108内の32番目の位置;CDR−L
1内部)のセリン(Ser)がトリプトファン(Trp)で置換されたものであり、前記
置換によって、本発明の一態様による抗体の活性(例えば、c−Metへの結合親和度、
c−Met分解活性およびAktリン酸化抑制活性など)がさらに増進され得る。
抗c−Met抗体のFc部分または前記抗体の抗原結合断片のN末端またはC末端にVE
GF結合断片(例えば、VIG2)を上述したリンカーを介してまたは上述したリンカー
を介さずに連結したものであってもよい(図1参照)。
アミノ酸配列、配列番号62の18番目から462番目までのアミノ酸配列、配列番号6
4のアミノ酸配列、配列番号64の18番目から461番目までのアミノ酸配列、配列番
号66のアミノ酸配列、または配列番号66の18番目から460番目までのアミノ酸配
列を含む重鎖、および配列番号68、配列番号68の21番目から240番目までのアミ
ノ酸配列、配列番号70、配列番号70のアミノ酸配列21番目から240番目までのア
ミノ酸配列、または配列番号108のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであってもよい
前記VEGF結合断片(例えば、VIG2またはこれを含むポリペプチドなど)は前記
抗c−Met抗体以外の他の抗c−Met抗体と結合する場合にも抗体効能を増進させる
だけではなく、副作用(agonism)を顕著に減少させることが確認された(図5参
照)。
作用が改善され得るc−Met抗体は、前記抗c−Met抗体以外のあらゆる抗c−Me
t抗体であってもよく、例えば、配列番号112または配列番号114のアミノ酸配列を
含む重鎖および配列番号113または配列番号115のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むも
のであってもよく、より具体的に、配列番号112のアミノ酸配列を含む重鎖および配列
番号113のアミノ酸を有する軽鎖を含むものであってもよく、あるいは、配列番号11
4のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号115のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むもの
であってもよい。
を介して、または介さずに連結された融合タンパク質は、c−MetとVEGFを同時に
標的とする二重特異性抗体の製造のための前駆体として使用可能である。前記医薬組成物
は、前記二重特異性抗体の有効量と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および/または
賦形剤などを含むことができる。
であり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉
、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細
結晶性セルロース、ポリビニールピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロ
ース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステア
リン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群から選ばれた1種以上であってもよ
いが、これに限定されない。前記混合剤または薬学的組成物は、前記成分に加えて、医薬
組成物の製造に汎用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、
懸濁剤、保存剤などよりなる群から選ばれた1種以上をさらに含むことができる。
静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与
および直腸内投与などであってもよい。経口投与時に、タンパク質またはペプチドは消化
されることから、経口用組成物は活性薬剤をコーティング、または剤形化してもよい。な
お、前記組成物は、活性物質を標的細胞に輸送可能な任意の装置を使用して投与すること
ができる。
及ぼすことができる量のことを指す。
類を含む哺乳類であってもよい。
化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与間隔、投
与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によって種々に処方可能である。例えば、
1回投与のための前記二重特異性抗体の有効量は、0.1〜50mg/kg、好ましくは
1〜20mg/kgの範囲であってもよい。前記1回投与のための有効量は、単位服用量
の形態で一つの製剤に処方されてもよく、適切に分量して処方されてもよく、複数の投薬
用容器内に充填して製造されてもよい。
の剤形に剤形化されてもよく、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、精製またはカプセル剤
などの剤形に剤形化されてもよく、剤形化のために分散剤または安定化剤をさらに含んで
いてもよい。
よい。抗体を含むリポソームは当業者に広く知られている方法により製造されてもよい。
前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびポリエチレングリ
コール−誘導化ホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であってもよく、逆相
蒸発法によって製造可能である。例えば、抗体のFab''断片は、ジスルフィド交換反応
を通じてリポソームに接合可能である。ドキソルビシンなどの化学治療剤がさらにリポソ
ームに含まれ得る。
る疾病、例えば、c−Metの複製数の増加および/または発現量の増加および/または
VEGF過発現によって誘発される疾病、代表的に、がんまたはがん転移の予防および/
または治療に使用可能である。前記癌は、c−MetとVEGFを過発現するものであっ
てもよく、これに制限されないが、固形癌、例えば、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小
細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直腸
癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿
道癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、胃癌、膵臓癌、
膠芽腫、子宮頚部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腺腫、乳房癌、結腸癌、大腸癌、子
宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、頭頚部癌、脳癌
、骨肉腫などよりなる群から選ばれた1種以上であってもよい。本発明の一態様において
、前記癌は、脳癌、胃腸癌、腎臓癌、または肺癌(例えば、扁平上皮癌、肺小細胞癌、非
小細胞性肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌など)であってもよい。前記癌は、原発性癌だけで
はなく、転移性癌も含む。さらに他の例において、前記c−MetおよびVEGFによっ
て誘発される疾病は、がん、妊娠糖尿病、糖尿病性網膜症、黄斑変性(例えば、湿性老人
性黄斑変性(wet AMD)など)などであってもよい。
EGF誘発疾病の予防および/または治療を必要とする患者に投与するステップを含むc
−Metおよび/またはVEGF誘発疾病の予防および/または治療方法と関連するもの
である。前記予防および/または治療方法は、前記投与ステップ前にc−Metおよび/
またはVEGF誘発疾病の予防および/または治療を必要とする患者を確認するステップ
をさらに含んでいてもよい。前記予防および/または治療方法によって予防および/また
は治療可能なc−Metおよび/またはVEGF誘発疾病は、上述した通りである。
となく、Cblによって媒介されるプロテアソーム経路ではないリソソーム経路を介して
c−Met分解活性を示すことができる。このように、Cblの突然変異、Cblの発現
量の減少、c−MetのCbl結合部位変異などの要因によってCblが正常に働かない
患者に投与するときにも、Cblと独立して働く他の負調節因子であるLRIG1を介し
てc−Metを抑制することができるため、抗c−Met抗体とVEGF拮抗剤の併用投
与はCblが正常に働かない患者に特に有効に適用され得る。
タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドを含む組換えベク
ターが提供される。また、前記ポリヌクレオチドまたは組換えベクターが取り込まれた組
換え細胞が提供される。前記ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞は、前記融合タ
ンパク質または二重特異性抗体の産生に使用可能である。前記抗c−Met抗体またはこ
の抗原結合断片およびVEGF結合断片は、上述した通りである。
めの手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオ
ファ-ジベクター、アデノウィルスベクター、レトロウィルスベクターおよびアデノ随伴
ウィルスベクターなどのウィルスベクターを含む。前記組換えベクターとして使用可能な
ベクターは、当業界において頻用されるプラスミド(例えば、pSC101、pGV11
06、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、p
UC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14
、pGEXシリーズ、pETシリーズおよびpUC19など)、ファージ(例えば、λg
t4λB、λ−Charon、λΔz1およびM13など)またはウィルス(例えば、S
V40など)を操作して製作可能であるが、本発明はこれに制限されない。
れ得る。用語「作動可能に連結された(operatively linked)」とは
、ヌクレオチド発現調節配列(例えば、プロモータ配列)と他のヌクレオチド配列との間
の機能的な結合を意味する。前記調節配列は、「作動的に連結」されることにより、他の
ヌクレオチド配列の転写および/または翻訳を調節することができる。
クターとして構築可能である。前記発現用ベクターは、当業界において、植物、動物また
は微生物において外来性タンパク質を発現するのに用いられる通常のものを用いることが
できる。前記組換えベクターは、当業界において公知の種々の方法によって構築可能であ
る。
、用いられるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を行
い得る強力なプロモータ(例えば、pLλプロモータ、CMVプロモータ、trpプロモ
ータ、lacプロモータ、tacプロモータ、T7プロモータなど)、翻訳の開始のため
のリボゾーム結合位および転写/翻訳終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿
主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞において作動する複製起点は、f1複製
起点、SV40複製起点、pMB1複製起点、アデノ複製起点、AAV複製起点およびB
BV複製起点などを含むが、これに限定されない。また、哺乳動物細胞のゲノム由来のプ
ロモータ(例えば、メタロチオネインプロモータ)または哺乳動物ウィルス由来のプロモ
ータ(例えば、アデノウィルス後期プロモータ、ワクチニアウィルス7.5Kプロモータ
、SV40プロモータ、サイトメガロウィルスプロモータおよびHSVのtkプロモータ
)が使用可能であり、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
たものであってもよい。前記宿主細胞は、前記組換えベクターを安定的に且つ連続的にク
ローニングまたは発現させ得る細胞であり、当業界において公知のいかなる宿主細胞も用
いることができ、原核細胞として、例えば、E.coli JM109、E.coli
BL21、E.coli RR1、E.coli LE392、E.coli B、E.
coli X1776、E.coli W3110、バチルス・サブティリス、バチルス
・チューリンゲンシスなどのバチルス属菌株、そしてネズミチフス菌、セラチアマルセッ
センスおよび様々なシュードモナス種などの腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転
換させる場合には、宿主細胞として、酵母(Saccharomyce cerevis
iae)、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、Sp2/0、チャイニーズハム
スター卵巣(CHO:Chinese hamster ovary)K1、CHODG4
4、PER.C6、W138、BHK、COS−7、293、HepG2、Huh7、3
T3、RIN、MDCK細胞株などが使用可能であるが、これに制限されない。
スフェクション)は、当業界に周知の導入方法を用いて行うことができる。前記導入方法
としては、例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、CaCl2方法またはエレクトロポ
レーション方法などが採用可能であり、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法
、リン酸カルシウム沈殿沈殿法、エレクトロポレーション法、リポソーム媒介トランスフ
ェクション法および遺伝子ボンバードメント法などが採用可能であるが、これに限定され
ない。
用いて、当業者に周知の方法に従って容易に行うことができる。例えば、前記選択標識が
特定の薬剤耐性遺伝子である場合には、前記薬剤が含有されている培地において形質転換
体を培養することにより形質転換体を容易に選別することができる。
びVEGF結合断片を含む、融合タンパク質の製造方法を提供する。さらに、他の側面に
おいて、抗c−Met抗体、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗体の変形体にVEG
F結合断片を連結する工程を含む、c−Met抑制(抗癌効能)および/または新生血管
形成抑制効能が増進されたc−Met抗体の製造方法が提供される。前記連結は、前記抗
c−Met抗体またはこの抗原結合断片とVEGF結合断片が(リンカーを介してまたは
介さずに)融合された融合タンパク質のアミノ酸配列またはこれをコードする核酸配列を
合成するなどの適切な方法によって行われ得る。前記抗c−Met抗体またはその抗原結
合断片にVEGF結合断片を連結する工程は、c−Met標的抗体またはその断片とVE
GF結合断片とがリンカーを介して結合する連結するものであってもよい。前記リンカー
は、前述のように1〜100個のアミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよい。
(例えば、配列番号109)のIg様ドメイン2:VIG2(例えば、配列番号110)
または配列番号109のアミノ酸のうち配列番号110を含んで連続する102〜133
8個のアミノ酸配列を含むポリペプチド)を連結して二重特異性抗体として製作して両因
子を一括して標的としたとき、c−MetとVEGFのそれぞれを標的とする効果はその
まま維持しながら、相乗効果を示すことを確認した。
体の抗がん効能をより改善する方法であり得る。
長をより有効に阻害することができ、各種の抗c−Met抗体を用いて上述したような二
重特異性抗体を製作する場合にも、単一抗体と比較して卓越した効能が現れることを確認
して(実施例5参照)、本発明において提案される二重特異性抗体の製作方法が抗c−M
et抗体の抗がん効能を増進させるのに一般的に使用可能であることを確認した。
c−Met結合の相対的性質をそのまま維持することを確認した(実施例2参照)。また
、前記二重特異性抗体はVEGF結合部位を含むことにより、VEGFの生物学的な機能
を拮抗する効能を示すことを確認した(実施例3参照)。なお、前記二重特異性抗体の抗
がん効能を動物モデルにおいて試験して、抗c−Met抗体に比べて優れた抗がん効能を
示すことを確認した(実施例4参照)。
部分、CDRの違いなど)の場合にもVIG2を連結して類似する効能を示すことを確認
した(図4A参照)。
体の抗がんおよび抗新生血管効能を増進させるのに一般的に使用可能であることが期待さ
れる。
を同時に検出することができるため、c−MetとVEGFの同時検出用組成物およびc
−MetとVEGF誘発疾病の診断用途にも用いて好適である。
c−Met抗体の抗がん/新生血管抑制効能を増進することができるため、抗がん剤脳が
ん、肺がん、胃腸がんなどに適用可能な抗がん剤および新生血管生成機序による疾病の治
療剤の開発に用いて好適であり、加えて、c−Met/HGFシグナル伝達経路とVEG
F/VEGFRシグナル伝達経路が関与する他の疾病に対する治療剤の開発にも使用可能
である。このように二重特異性抗体を用いることにより、関連薬物の併用投与時と比較し
て服用し易いだけではなく、優れた効能が得られることが期待される。
1.1.c−Metに対するマウス抗体「AbF46」の産生
1.1.1.マウスの免疫化
ハイブリドーマ細胞株の開発に必要な免疫化されたマウスを得るために、5匹のマウス
に1匹当たりに100μgのヒトのc−Met/Fc融合タンパク質(R&Dシステムズ
社製)と同量の完全フロインドアジュバント (Freund'sadjuvant)を混
合して4−6週齢のBALB/cマウス(日本SLC社製)の腹腔内に注射した。2週後
に、上記の方法と同様にして、前記抗原として用いられたヒトのc−Met/Fc融合タ
ンパク質を先に注射した量の半分である50μgを同量の不完全フロインドアジュバント
と混合してマウスの腹腔内に注射した。一週間後に最後の追加免疫が行われ、3日後に前
記マウスの尻尾から採血して血清を得た後、1/1000でPBSに希釈してELISA
でc−Metを認知する抗体の力価(titer)が増大されることを確認した。上記の
結果をもって抗体の量が十分に得られるマウスを選別して下記の細胞融合過程を行った。
細胞融合実験3日前に50μgのリン酸緩衝生理食塩水(PBS:phosphate
buffered solution)にヒトのc−Met/Fc融合タンパク質混合
物をBALB/cマウス(日本SLC社製)の腹腔内に注射し、免疫化されたマウスを麻
酔した後に身体の左側に位置する脾臓を摘出した。摘出した脾臓をメッシュで磨って細胞
を分離し、培養培地(ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、GIBCO、インビト
ロゲン社製)と混合して脾臓細胞懸濁液を作成した。前記懸濁液を遠心分離して細胞層を
回収した。前記得られた脾臓細胞1×108個と骨髓腫細胞(Sp2/0)1×108個
を混合した後、遠心分離して細胞を沈殿させた。前記遠心分離された沈殿物を徐々に懸濁
し、37℃で1分間DMEM中の45%ポリエチレングリコール(PEG)(1mL)で
処理した後、1mLの培養培地(DMEM)に懸濁した。次いで、細胞を10mLのDM
EMに10分間以上浸し、その後37℃で5分間放置した。そして、DMEMで50mL
にし、再び遠心分離した。細胞沈殿物を分離培地(HAT培地)に約1〜2×105/m
Lで再懸濁し、96ウェルプレートに0.1mLずつ分注した後、37℃の二酸化炭素培
養器において培養してハイブリドーマ細胞群を製作した。
ーマ細胞の選別
前記参考例1.1.2に従い製造されたハイブリドーマ細胞群から、c−Metタンパ
ク質にのみ特異的に反応するハイブリドーマ細胞を選別するために、ヒトのc−Met/
Fc融合タンパク質とヒトのFcタンパク質を抗原としたELISA分析方法を用いてス
クリーニングした。
それぞれ50μL(2μg/mL)ずつ加えてプレートの表面に付着させ、未反応抗原は
洗い取った。c−Metには結合しないがFcを認識するする抗体を選別して除去するた
めに、ヒトFcタンパク質を上記の方法と同様にしてプレート表面に付着させた。
マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに50μLずつ加えて1時間かけて反応さ
せた後、リン酸緩衝溶液−ツイーン20(TBST)溶液で十分に洗浄して未反応培養液
を除去した。ここにヤギ抗−マウスIgG−西洋ワサビペルオキシダーゼ(goat a
nti−mouse IgG−HRP)を加えて1時間かけて室温下で反応させた後、T
BST溶液で十分に洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼの基質溶液(オルトフェニレン
ジアミン;OPD)を加えて反応させ、その反応の度合いはELISAリーダーを用いて
450nmにおける吸光度を測定して確認した。
質にのみ特異的に高い結合力を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を繰り返し選
別した。繰り返し選別によって得られたハイブリドーマ細胞株を限界希釈(limiti
ng dilution)してモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞株1個
のクローンを最終的に得た。最終的に選別されたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
を2009年10月9日付けでブダペスト条約下の国際寄託機関である大韓民国ソウル特
別市鍾路区蓮建洞に所在する韓国細胞株研究財団に寄託して受託番号KCLRF−BP−
00220を与えられた(大韓民国公開特許第2011−0047698号参照)。
前記参考例1.1.3において得られたハイブリドーマ細胞を無血清培地において培養
し、培養液からモノクローナル抗体を産生および精製した。
m)入り培養培地(DMEM)50mLにおいて培養された前記ハイブリドーマ細胞を遠
心分離して細胞沈殿物を20mLのPBSで2回以上洗浄してFBSが除去された状態で
、前記細胞沈殿物を培養培地(DMEM)50mLに再懸濁させた後、3日間37℃の二
酸化炭素培養器において培養した。
は直ちに、抗体の分離および精製に用いた。親和性カラム(プロテインGアガロースカラ
ム;米国ファルマシア社製)を装備したAKTA精製機器(GEヘルスケア社製)を用い
て前記準備された培養液50mL〜300mLから抗体を精製した後、タンパク質凝集用
フィルタ(Amicon)を用いてPBSで上澄み液を置換して精製された抗体を保管し
、以下の実施例に用いた。
一般に、マウス抗体は、治療目的でヒトに注入されたときに免疫拒絶反応を示す可能性
が高い。そのため、これを解決するために、前記実施例1に従い製作されたマウス抗体A
bF46から、抗原結合に関連する変異領域(variable region)を除く
不変領域(constant region)をヒトIgG1抗体の配列で置換したキメ
ラ型抗体chAbF46を製作した。
VH−NheI−CH−TGA−XhoI」(配列番号38)から、軽鎖に相当するヌク
レオチド配列は「EcoRI−signal sequence−VL−BsiWI−C
L−TGA−XhoI」(配列番号39)から構成されるようにそれぞれデザインして遺
伝子を合成した。次いで、インビトロゲン社製のOptiCHOTM抗体発現キット(C
at no.12762−019)に含まれているpOptiVECTM−TOPO T
Aクローニングキットに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を含むDNA断片(配列番
号38)を、pcDNATM3.3−TOPO TAクローニングキット(Cat no
.8300−01)に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を含むDNA断片(配列番号
39)をそれぞれEcoRI(NEB、R0101S)とXhoI(NEB、R0146
S)制限酵素を用いてクローニングすることにより、キメラ型抗体の発現のための重鎖を
含むベクターおよび軽鎖を含むベクターをそれぞれ構築した。
.12662)を用いて増幅され、一過性発現はFreestyleTM MAX 29
3発現システム(インビトロゲン社製)を用いて行われた。用いられた細胞株は293−
F細胞であり、FreestyleTM 293発現培地を培地として浮遊培養方式で培
養された。一過性一過性発現の前日に細胞を5×105cells/mlの濃度にして準
備した後、24時間が経過して細胞数が1×106cells/mlになったときに一過
性一過性発現を行った。FreestyleTM MAX試薬(インビトロゲン社製)を
用いたリポソーマル試薬法により形質移入(トランスフェクション)を行い、15mlの
チューブに重鎖DNA:軽鎖DNA=1:1の割合にてDNAを準備してOptiPro
TM SFM(インビトロゲン社製)2mlと混合し(A)、他の15mlのチューブに
FreestyleTM MAX試薬100μLとOptiProTM SFM 2mlを
混合(B)した後、(A)と(B)を混合して15分間インキュベーションした後、前日
に準備した細胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、37℃、80%の
湿度、8%のCO2及び130rpmのインキュベータにおいて5日間培養した。
件下で5時間培養した後、FBS未添加のDMEM培地において48時間37℃、5%の
CO2の条件下で培養した。
プライム(GEヘルスケア社製)を用いて精製した。AKTAプライムにプロテインAカ
ラム(GEヘルスケア社製、17−0405−03)を設けて培養液を5ml/分の流速
で流した後、IgG溶出緩衝液(サーモサイエンティフィック社製、21004)で溶出
させた。得られた溶出物をPBSバッファに交換して最終的にキメラ型抗体AbF46(
以下、chAbF46と命名する)を精製した。
1.3.1.重鎖のヒト化(Heavy chain humanization)
H1−heavyおよびH3−heavyの2種のデザインのために、先ず、Ig B
last(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast
/)を介して前記参考例1.2において精製されたマウス抗体AbF46のVH遺伝子と
最も相同性が高いヒトの生殖細胞系遺伝子を分析した。その結果、VH3−71がアミノ
酸レベルにおいて83%の相同性を有することを確認し、マウス抗体AbF46のCDR
−H1、CDR−H2、CDR−H3をKabat番号付けで定義し、マウス抗体AbF
46のCDR部分がVH3−71の骨格(フレームワーク)に取り込まれるようにデザイ
ンした。このとき、30番(S→T)、48番(V→L)、73番(D→N)、78番(
T→L)のアミノ酸は、元のマウスAbF46抗体のアミノ酸配列に復帰突然変異した。
次いで、H1はさらに83番(R→K)と84番(A→T)のアミノ酸に突然変異を与え
て最終的にH1−heavy(配列番号40)とH3−heavy(配列番号41)を構
築した。
AbF46抗体のマウスフレームワーク配列と配列が非常に類似しているとともに、既存
の最も安定的であると知られているVH3サブタイプを用いてKabat番号付けで定義
されたマウス抗体AbF46のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3を取り込んだ
。これにより、H4−heavy(配列番号42)を構築した。
H1−light(配列番号43)およびH2−light(配列番号44)の2種の
デザインのために、Ig Blast(http://www.ncbi.nlm.ni
h.gov/igblast/)を介して、マウス抗体AbF46のVL遺伝子と最も相
同性が高いヒト生殖細胞系遺伝子を分析した。その結果、VK4−1がアミノ酸レベルに
おいて75%の相同性を有することを確認し、マウス抗体AbF46のCDR−L1、C
DR−L2、CDR−L3をKabat番号付けで定義し、マウス抗体AbF46のCD
R部分がVK4−1のフレームワークに取り込まれるようにデザインした。このとき、H
1−lightは、36番(Y→H)、46番(L→M)、49番(Y→I)の3個のア
ミノ酸を復帰突然変異し、H2−lightは、49番のアミノ酸(Y→I)1個のみを
復帰突然変異して構築した。
www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)を介してマウス抗体A
bF46のVL遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖細胞系遺伝子を分析したところ、前記
VK4−1に加えてVK2−40を選定した。マウス抗体AbF46VLとVK2−40
はアミノ酸レベルにおいて61%の相同性を有することを確認し、マウス抗体AbF46
のCDR−L1、CDR−L2、CDR−L3をKabat番号付けで定義し、マウス抗
体AbF46のCDR部分がVK4−1のフレームワークに取り込まれるようにデザイン
した。このとき、H3−lightは、36番(Y→H)、46番(L→M)、49番(
Y→I)の3個のアミノ酸を復帰突然変異して構築した。
列を探ったところ、既存の最も安定的であると知られているVk1サブタイプを用いてK
abat番号付けで定義されたマウス抗体AbF46のCDR−L1、CDR−L2、C
DR−L3を取り込んだ。このとき、H4−lightは、36番(Y→H)、46番(
L→M)、49番(Y→I)の3個のアミノ酸をさらに復帰突然変異して構築した。
2762−019)に含まれているpOptiVECTM−TOPO TAクローニング
キットに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を含むDNA断片(H1−heavy;配
列番号47、H3−heavy;配列番号48、H4−heavy;配列番号49)をp
cDNATM3.3−TOPO TAクローニングキットに前記軽鎖に相当するヌクレオ
チド配列を含むDNA断片(H1−light;配列番号50、H2−light;配列
番号51、H3−light;配列番号52、H4−light;配列番号53)をそれ
ぞれEcoRI(NEB、R0101S)とXhoI(NEB、R0146S)の制限酵
素を用いて、クローニングすることにより、ヒト化抗体の発現のためのベクターを構築し
た。
.12662)を用いて増幅され、一過性発現はFreestyleTM MAX 29
3発現システム(インビトロゲン社製)を用いて行われた。用いられた細胞株は293−
F細胞であり、FreeStyleTM 293発現培地を培地として浮遊培養方式で培
養された。一過性発現の前日に細胞を5×105cells/mlの濃度にして準備した
後、24時間が経過して細胞数が1×106cells/mlになったときに一過性発現
を行った。FreestyleTM MAX試薬(インビトロゲン社製)を用いたリポソ
ーマル試薬法により形質移入(トランスフェクション)を行い、15mlのチューブに重
鎖DNA:軽鎖DNA=1:1の割合でDNAを準備してOptiProTM SFM(
インビトロゲン社製)2mlと混合し(A)、他の15mlのチューブにFreesty
leTM MAX試薬100μLとOptiProTM SFM 2mlを混合(B)し
た後、(A)と(B)を混合して15分間インキュベーションした後、前日に準備した細
胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、37℃、80%の湿度、8%の
CO2、130rpmのインキュベータにおいて5日間培養した。
GEヘルスケア社製)を用いて精製した。AKTAプライムにプロテインAカラム(GE
ヘルスケア社製、17−0405−03)を設けて培養液を5ml/分の流速で流した後
、IgG溶出緩衝液(サーモサイエンティフィック社製、21004)で溶出した。これ
をPBSバッファに交換して最終的にヒト化抗体AbF46(以下、huAbF46と命
名する)を精製した。一方、以降の実施例において用いたヒト化抗体huAbF46の重
鎖、軽鎖の組み合わせはH4−heavy(配列番号42)およびH4−light(配
列番号46)である。
huAbF46抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いてhuAbF46抗体の
scFvを製作するための遺伝子をデザインした。それぞれの重鎖可変領域および軽鎖可
変領域を「VH−リンカー−VL」の形にし、前記リンカーは「GLGGLGGGGSG
GGGSGGSSGVGS」(配列番号54)のアミノ酸配列を有するようにデザインし
た。このようにしてデザインされたhuAbF46抗体のscFvをコードするポリヌク
レオチド(配列番号55)をバイオニア社に依頼して合成し、これを発現させるためのベ
クターを配列番号56に示す。
を示すことを確認した。
ー遺伝子の製作
1.5.1.標的CDRの選定およびプライマの製作
huAbF46抗体の親和性成熟のために6個の相補性決定部位(complemen
tary determining region、CDR)を前記製作されたマウス抗体
AbF46から「Kabat番号付け」によって定義し、それぞれのCDRは下記の表1
に示す通りである。
た。既存のランダムな配列の取り込み方式では、突然変異を与えたい部位に同じ割合の塩
基(25%A、25%G、25%C、25%T)が取り込まれるようにNコドンを用いた
が、この実施例においては、huAbF46抗体のCDRにランダムに塩基を取り込むた
めに、各CDRのアミノ酸をコードする3個の野生型ヌクレオチドのうち最初と2番目の
ヌクレオチドの85%はそのまま保存し、残りの3個の塩基をそれぞれ5%ずつ取り込む
ような方式を取った。なお、3番目のヌクレオチドは同様に(33%G、33%C、33
%T)が取り込まれるようにプライマーをデザインした。
確認
CDRのランダムな配列の取り込みを用いた抗体ライブラリー遺伝子の構築は、前記参
考例1.5.1などの方法により製作されたプライマーを用いて行った。鋳型としてhu
AbF46抗体のscFvを含むポリヌクレオチドを用いて、図1に示す方法と同様にし
て2個のPCR断片を製作し、これをオーバーラップ・エクステンションPCR(ove
rlap extension PCR)方法を用いて、所望のCDRのみがそれぞれ突
然変異されたhuAbF46抗体のscFvライブラリー遺伝子を確保して製作された6
個のCDRをそれぞれ標的とするライブラリーを構築した。
結合力を確認し、それぞれのライブラリーは野生型に比べてc−Metへの結合力が総じ
て下がる傾向を示したが、c−Metへの結合力が保たれる一部の突然変異を確認した。
前記構築されたライブラリーからc−Metへのライブラリーの結合力を向上させた後
、それぞれの個別クローンからscFvの遺伝子配列を分析した。確保された遺伝子配列
はそれぞれ下記の表2に示す通りであり、これをIgG形式に変換した。下記のクローン
のうちから、L3−1、L3−2、L3−3、L3−5から産生された4種の抗体を選別
して後続の実験を行った。
選別された4種の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは「EcoRI−sign
al sequence−VH−NheI−CH−XhoI」(配列番号38)から構成
され、重鎖の場合、親和性成熟後に抗体のアミノ酸が変更されなかったため、huAbF
46抗体の重鎖をそのまま用いた。但し、ヒンジ領域はヒトIgG1のヒンジではないU
6−HC7ヒンジ(配列番号57)で置換した。軽鎖は「EcoRI−signal s
equence−VL−BsiWI−CL−XhoI」から構成されるようにそれぞれデ
ザインして遺伝子を合成し、親和性成熟後に選別された前記4種の抗体の軽鎖可変領域を
含んでコードするポリヌクレオチド(配列番号58〜配列番号61)をバイオニア社に依
頼して合成した。次いで、インビトロゲン社製のOptiCHOTM抗体発現キット(C
at no.12762−019)に含まれているpOptiVECTM−TOPO T
Aクローニングキットに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を含むDNA断片(配列番
号38)を、pcDNATM3.3−TOPO TAクローニングキット(Cat no
.8300−01)に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を含むDNA断片(L3−1
由来のCDR−L3を含むDNA断片:配列番号58、L3−2由来のCDR−L3を含
むDNA断片:配列番号59、L3−3由来のCDR−L3を含むDNA断片:配列番号
60、L3−5由来のCDR−L3を含むDNA断片:配列番号61)をそれぞれEco
RI(NEB、R0101S)とXhoI(NEB、R0146S)の制限酵素を用いて
クローニングすることにより、親和性成熟された抗体の発現のためのベクターを構築した
。
.12662)を用いて増幅され、一過性発現はFreestyleTM MAX 29
3発現システム(インビトロゲン社製)を用いて行われた。用いられた細胞株は293−
F細胞であり、FreeStyleTM 293発現培地を培地として浮遊培養方式によ
り培養された。一過性発現の前日に細胞を5×105cells/mlの濃度にして準備
した後、24時間が経過して細胞数が1×106cells/mlになったときに一過性
発現を行った。FreestyleTM MAX試薬(インビトロゲン社製)を用いたリ
ポソーマル試薬法により形質移入(トランスフェクション)を行い、15mlのチューブ
に重鎖DNA:軽鎖DNA=1:1の割合でDNAを準備してOptiProTMSFM
(インビトロゲン社製)2mlと混合し(A)、他の15mlのチューブにFreest
yleTM MAX試薬100μLとOptiProTM SFM2mlを混合(B)し
た後、(A)と(B)を混合して15分間インキュベーションした後、前日に準備した細
胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、37℃、80%の湿度、8%の
CO2、130rpmのインキュベータにおいて5日間培養した。
GEヘルスケア社製)を用いて精製した。AKTAプライムにプロテインAカラム(GE
ヘルスケア社製、17−0405−03)を設けて培養液を5ml/分の流速で流した後
、IgG溶出緩衝液(サーモサイエンティフィック社製、21004)で溶出した。これ
をPBSバッファに交換して最終的に親和性成熟された4種の抗体(以下、huAbF4
6−H4−A1(L3−1由来)、huAbF46−H4−A2(L3−2由来)、hu
AbF46−H4−A3(L3−3由来)およびhuAbF46−H4−A5(L3−5
由来)と命名する)を精製した。
の製造
前記参考例1.7において選別された4種の抗体のうち、c−Metとの結合親和性が
最も高く、Aktリン酸化およびc−Met分解の度合いが最も低く測定されたhuAb
F46−H4−A1を対象として、ヒンジ領域または不変領域およびヒンジ領域が置換さ
れた抗体を製作した。
1不変領域からなる重鎖およびhuAbF46−H4−A1の軽鎖可変領域およびヒトの
カッパ(kappa)不変領域からなる軽鎖からなる抗体をhuAbF46−H4−A1
(U6−HC7)と命名し、huAbF46−H4−A1の重鎖可変領域、ヒトのIgG
2ヒンジおよびヒトのIgG1不変領域からなる重鎖およびhuAbF46−H4−A1
の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖からなる抗体をhuAbF46
−H4−A1(IgG2ヒンジ)と命名し、huAbF46−H4−A1の重鎖可変領域
、ヒトのIgG2ヒンジおよびヒトのIgG2不変領域からなる重鎖およびhuAbF4
6−H4−A1の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖からなる抗体を
huAbF46−H4−A1(IgG2 Fc)と命名した。なお、前記3種の抗体は、
産生量の増大のためにヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖の36番のヒスチジンをいずれ
もチロシンで置換した。
−HC7ヒンジおよびヒトのIgG1不変領域からなるポリペプチド(配列番号62)を
コードするポリヌクレオチド(配列番号63)、huAbF46−H4−A1の重鎖可変
領域、ヒトのIgG2ヒンジおよびヒトのIgG1不変領域からなるポリペプチド(配列
番号64)をコードするポリヌクレオチド(配列番号65)、huAbF46−H4−A
1の重鎖可変領域、ヒトのIgG2ヒンジおよびヒトのIgG2不変領域からなるポリペ
プチド(配列番号66)をコードするポリヌクレオチド(配列番号67)、36番のヒス
チジンがチロシンで置換されたhuAbF46−H4−A1の軽鎖可変領域およびヒトの
カッパ不変領域からなるポリペプチド(配列番号68)をコードするポリヌクレオチド(
配列番号69)をバイオニア社に依頼して合成した。次いで、インビトロゲン社製のOp
tiCHOTM抗体発現キット(Cat no.12762−019)に含まれているp
OptiVECTM−TOPO TAクローニングキットに前記重鎖に相当する塩基配列
を含むDNA断片を、pcDNATM3.3−TOPO TAクローニングキット(Ca
t no.8300−01)に前記軽鎖に相当する塩基配列を含むDNA断片を挿入して
、前記抗体の発現のためのベクターを構築した。
.12662)を用いて増幅され、一過性発現はFreestyleTM MAX293
発現システム(インビトロゲン社製)を用いて行われた。用いられた細胞株は293−F
細胞であり、FreeStyleTM 293発現培地を培地として浮遊培養方式により
培養された。一過性発現の前日に細胞を5×105cells/mlの濃度にして準備し
た後、24時間が経過して細胞数が1×106cells/mlになったときに一過性発
現を行った。FreestyleTM MAX試薬(インビトロゲン社製)を用いたリポ
ソーマル試薬法により形質移入(トランスフェクション)を行い、15mlのチューブに
重鎖DNA:軽鎖DNA=1:1の割合にてDNAを準備してOptiProTM SF
M(インビトロゲン社製)2mlと混合し(A)、他の15mlのチューブにFrees
tyleTM MAX試薬100μLとOptiProTM SFM 2mlを混合(B
)した後、(A)と(B)を混合して15分間インキュベーションした後、前日に準備し
た細胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、37℃、80%の湿度、8
%のCO2、130rpmのインキュベータにおいて5日間培養した。
GEヘルスケア社製)を用いて精製した。AKTAプライムにプロテインAカラム(GE
ヘルスケア社製、17−0405−03)を設けて培養液を5ml/分の流速で流した後
、Ig溶出緩衝液(サーモサイエンティフィック社製、21004)で溶出した。これを
PBSバッファに交換して最終的に3種の抗体(huAbF46−H4−A1(U6−H
C7)、huAbF46−H4−A1(IgG2ヒンジ)、huAbF46−H4−A1
(IgG2 Fc))を精製した。これらの中で、本発明による抗c−Met抗体の代表
例としてhuAbF46−H4−A1(IgG2 Fc)を選択して下記の実施例に供し
、便宜上、前記抗体を抗c−Met抗体L3−1Yと命名した。
前記参考例1において製作された抗c−Met抗体を基に重鎖C末端にリンカーが連結
されるように融合した。次いで、リンカーの末端にVEGF受容体1を構成するアミノ酸
のうちIg2ドメイン、すなわち、129番目から229番目までのアミノ酸を連続して
融合してcMetとVEGFに同時に結合可能な抗体を製作した(図1参照)。
ノ酸のうち、VEGF結合に最も重要であると知られているIg2ドメインを構成する1
29番目から229番目までの101個のアミノ酸をコードする遺伝子配列をNCBIデ
ータベースから確保した。
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITV
TLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTC
EATVNGHLYKTNYLTHRQTNTI
Ig2ドメイン(VIG2)塩基配列(配列番号111):
AGTGATACAGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAA
ATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCG
TCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTAC
TTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGA
AAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATAT
CAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGA
AGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTC
ACACATCGACAAACCAATACAATC
前記製作されたc−Met抗体の重鎖とIg2ドメイン(VIG2)を連結するために
、GGGGSが繰り返される構造の「GGGGS」(G4S)(配列番号116)、「G
GGGSGGGGS」((G4S)2)(配列番号117)、または「GGGGSGGG
GSGGGGSGGGGS」((G4S)4)(配列番号118)の3種類のリンカーを
デザインし、これをc−Met抗体とVEGF受容体1のIg2ドメイン(VIG2)と
の間に位置させた。前記抗c−Met抗体の軽鎖をコードする遺伝子、および前記抗c−
Met抗体の重鎖、前記リンカー、および前記VEGF結合断片をコードする遺伝子をバ
イオニア社に依頼して合成し、このとき、最終遺伝子の最後に終止コドン(TGA)を挿
入した。このようにして合成された遺伝子をpOptivecベクター(インビトロゲン
社)にEcoRI/XhoIクローニングサイトを用いて重鎖発現ベクターを製作した。
軽鎖発現ベクターは、前記L3−1Yの製作時に用いられたベクターをそのまま用いた。
2662)を用いて増幅され、前記重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターは4:
1の割合(80μg:20μg)にて293T細胞(2.5×107)に2M CaCl
2を360μl添加してトランスフェクションした。次いで、10%のFBS入りDME
M培地において37℃、5%のCO2の条件下で5時間培養した後、FBS未添加のDM
EM培地において48時間かけて37℃、5%のCO2の条件下で培養した。
ヘルスケア社製)を用いて精製した。AKTAプライムにプロテインAカラム(GEヘル
スケア社製、17−0405−03)を設けて培養液を5ml/分の流速で流した後、I
g溶出緩衝液(サーモサイエンティフィック社製、21004)で溶出した。これをPB
Sバッファに交換して最終的にc−MetとVEGFに同時に結合可能な抗体を精製した
。
2.1.親和性検査
前記製作された二重特異性融合タンパク質の結合速度をBiacore T100イン
スツルメント(GEヘルスケア社製)を用いて分析した。ヒトFab結合剤(GEヘルス
ケア社製)をCM5チップ(GEヘルスケア社製、Cat.No.BR−1005−30
)の表面に製造者の説明書に従って固定化した。約90〜120RUのL3−1Yまたは
MV10AYを捕獲し、様々な濃度のc−Met(R&Dシステムズ社製、Cat.No
.358−MT/CF)を前記捕獲された抗体に注入した。ここに10mMグリシン−H
Cl(pH1.5)溶液を注入して前記表面を再生させた。結合速度を測定するために、
前記実験において得られたデータをBIAevaluationソフトウェア(GEヘル
スケア社製、Biacore T100 evaluation software)を
用いて適用した。
プ(IgG1またはIgG2)とは無関係にL3−1Y(KD<0.01nM)と類似し
ていた。
相対的なc−Metの総量は、抗体がc−Metに結合した場合、抗体の内在化によっ
て、c−Metの分解が起こることを利用して、c−Metの総量の増減を把握して抗体
の影響を評価するものである。c−MetとHGFの結合ががん細胞の成長を促すことは
既に知られており、したがって、合計のc−Met量が減少すれば、がん細胞の成長も低
下することに着目したものである。
otal HGF R/c−Met ELISAキット(R&Dシステムズ社製)を用い
てMKN45胃がん細胞株(JCRB0254;ヘルス・サイエンス・リサーチ・リソー
ス・バンク(HSRRB)、日本国新宿))において実験した。200、000cell
s/mlの細胞を5μg/mlの抗c−Met抗体と混ぜて24時間かけて培養(培地:
10%のウシ胎児血清入りRPMI)した後にELISA実験を行った。最終的にSup
er Aquablue(eBiosciences社製)を用いて反応させ、比色信号
(colorimetric signals)は450nm波長におけるOD値で測定し
た。抗c−Met抗体を処理しない比較群(media)の値を100%として、抗c−
Met抗体を処理した後の値を前記比較群に対する相対値として計算した。
MV10AとMV10AYはそれぞれのc−Met単独標的抗体(single−tar
geted antibody、単一標的抗体とも言う。)であるL3−1およびL3−
1Yに比べて有意的にc−Met分解能が向上している。すなわち、MV10Aのc−M
et分解能(76%)は単独標的抗体L3−1の分解能(68%)に比べて有意的に向上
され(一元配置分散分析法(One−way ANalysis Of VArianc
e; One−way ANOVA)による分析結果、p<0.01)、MV10AYの
場合にも分解能(72%)が単独標的(single targeting)抗体L3−1
Yの分解能(66%)よりも向上していた(一元配置分散分析法による分析結果p<0.
05)。
治療用抗体における安全性と効能をメカニズム基盤実験で検証した。安全性を調べるた
めに、AKTというキナーゼのリン酸化の度合いを定量的ELISA方法により測定した
。AKTによって調節されている細胞作用は、細胞増殖、細胞生存、細胞の大きさの調節
、可用栄養分への反応性、中間代謝過程、血管新生(angiogenesis)、組織
浸潤浸潤(tissue invasion)などを含む。これらのあらゆる過程はがん
の特徴を代表するものであり、数多くの腫瘍発生タンパク質(oncoprotein)
と腫瘍発生抑制物質(tumor suppressor)はAKT経路上において相互
交差的に影響を及ぼし、シグナル伝達と古典的な代謝調節の連結点において細胞の作用を
微細に調節する機能を行う。このため、AKTの活性型であるリン酸化されたAKTの度
合いが高いほど、がん細胞が一層高い活性を示し、この実施例においては、抗体が陽性対
照抗体5D5を処理したときに比べてAKTのリン酸化をどれほど阻害できるかについて
検証した。
n phospho−AKT1(Ser473)chemiluminescent S
andwich ELISAキットを用いた。前日に200、000cells/mlで
培養したCaki−1細胞株(腎明細胞がん細胞株)(HTB−46;アメリカ合衆国培
養細胞系統保存機関(ATCC)、バージニア州マナサス)に無血清DMEM培地(GI
BCO、インビトロゲン社製)に5μg/mlの抗体を混ぜて30分間処理した後、EL
ISAキットを用いて実験した。結果は、パーキンエルマー社製の機械で測定して得た。
AKTのリン酸化の度合いを計算するときには、陽性対照群である5D5(アメリカ合衆
国培養細胞系統保存機関(ATCC)、バージニア州マナサス)によるリン酸化の度合い
を100%とし、その値と比較して他の抗c−Met抗体および二重特異性抗体のリン酸
化誘導の度合いを表示した。
10A、MV10AY)は両方ともそれぞれに対応するc−Met単独標的抗体(L3−
1、L3−1Y)よりもAKTリン酸化を有意的に一層強力に阻害する。すなわち、MV
10AのAKTリン酸化阻害能(5D5対照群に比べて79%)は単独標的抗体L3−1
の阻害能(69%)に比べて有意に向上され(一元配置分散分析法による分析結果p<0
.01)、MV10AYの場合にも阻害能(74%)が単独標的抗体L3−1Yの分解能
(63%)よりも向上した(一元配置分散分析法による分析結果p<0.01)。
ヒト胃がん細胞株MKN45(JCRB0254)をヘルス・サイエンス・リサーチ・
リソース・バンク(HSRRB、日本、新宿)から入手した。前記細胞株を10%(v/
v)のウシ胎児血清(FBS)(GIBCO、Cat.#16000−044)と1%(
v/v)のペニシリン/ストレプトマイシン(GIBCO、Cat.#15410−12
2)を含むRPMI1640培地(GIBCO、Cat.#11875−119)におい
て培養した。細胞株を5%のCO2を含む湿潤大気下の37℃において培養し、細胞が培
養容器内で過密状態(confluence)になる前に継代培養した。CEDEX A
nalyzer(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いて細胞数を測定した。抗
体処理(in vitro)による腫瘍細胞の増殖を調べるために、Celltiter
Glo(CTG:プロメガ社製)発光分析法(ルミネセンス測定法)を用いた。
胎児血清(FBS)入りRPMI1640培地内のMKN45細胞をブラック96ウェル
プレート(コーニング社製、Cat.#Costar 3603)の上に1ウェル当たり
に1×104cellsの濃度で分注し、10%のFBS入りRPMI1640培地を用
いて、最終濃度0.008μg/mL、0.04μg/mL、0.2μg/mL、1μg
/mLに希釈された抗体で処理した。72時間インキューベーティング後に、CTG溶液
100μLを各ウェルに添加した後、室温下で30分間インキューベーティングした。前
記得られた発光信号をEnvision 2104マルチラベルリーダ(パーキンエルマ
ー社製、米国マサチューセッツ州ウオルサム)を用いて記録した。
0A(■)はそれに対応するc−Met単独標的抗体L3−1(□)に比べて0.04μ
g/mL以上の濃度において有意的に優れたMKN45がん細胞株成長抑制効果を有する
(平均と標準偏差表示、二元配置分散分析法(2−way ANOVA)による分析;ボ
ンフェローニの多重比較検定により得られたp値を各濃度点の下に示す。**、p<0.
01;***、p<0.001;****、p<0.0001)。
c−Met単独標的抗体がc−Metに結合する場合、c−Metによる不所望のアゴ
ニズム(拮抗)現象が見られる。これは抗体の安全性と関連するため、二重特異性を有す
ることに伴い、c−Met単独標的抗体の不所望のアゴニズム性質が増大されるか否かを
評価するためにNCI−H441細胞株を用いて試験した。NCI−H441細胞株は、
c−Met単独標的抗体の投与時に、下記の特定の条件下でアゴニズムによる細胞分裂を
示すという性質がある。
640培地(Gibco)に200、000cells/mlで希釈して100μl/w
ellで96ウェルプレートに分注した後に24時間かけて37℃で5%のCO2の条件
下で培養した後、10μg/mlの濃度から1/5系列希釈して6個の濃度勾配で抗c−
Met抗体を処理した。21時間かけて37℃で5%のCO2の条件下で培養した後、5
−ブロモ−2'−ジオキシウリジン(5−bromo−2'−deoxyuridine、
BrdU)を添加して細胞に取り込み、3時間さらに培養した後、BrdUアッセイ(ロ
シュ社製、インディアナ州インディアナポリス)を行った。細胞をプレート上において変
性/固定した後に抗−BrdU抗体を入れて1時間後に基質を添加して370nmにおい
てELISA spectraMaxリーダ(モレキュラーデバイス社製、カリフォルニ
ア州サニーベール)で発色反応を測定した。最終的にBrdUを取り込んでいない細胞の
値をバックグラウンドコントロールとして制限した後、抗c−Met抗体を処理しなかっ
た比較群の値を100%に換算(Y軸)して相対値を計算した。陰性対照群としてはマウ
スのIgGを用い、作動薬(agonist)としてよく知られている5D5抗体(AT
CC Cat.#HB11895ハイブリドーマ細胞から分離精製)を陽性対照群として
用いた。
体L3−1に比べて二重特異性(bispecific)抗体であるMV10AまたはMV10AYは
アゴニズム性質が増大されていなかった。すなわち、抗体安全性に変化がなかった。
genesis)試験)
HuVEC細胞株(ATCC)をHGF(R&Dシステムズ社製)0.4μg/mlと
ともにEGM2 bulletkit培地(Lonza Cat.CC−3162)にお
いて培養した。細胞を5%のCO2を含む湿潤大気下の37℃でインキューベーティング
した後に細胞が培養容器内で過密状態(confluence)になる前に継代培養した
。CEDEX Analyzer(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いて細胞
数を測定した。抗体処理(in vitro)による腫瘍細胞成長阻害の度合いを確認す
るためにXcelligence Real time cell analyzer(
ロシュ社製)を用いてリアルタイム細胞分析法を行った。前記分析法は製造者の説明書に
従って行った。略述すると、前記培養されたHuVEC細胞を16−ウェルE−プレート
の上に1ウェル当たりに1×104cellsの濃度で分注し、24時間後にインキュベ
ーション培地を除去し、無血清培地(EBM培地、ロンザ社製)で希釈された抗体(10
0uL、最終的な抗体濃度10μg/mL)を処理した。発生するインピーダンス値をリ
アルタイムにて測定した。リアルタイム分析は、48時間かけて行った。
Fの影響を単独/二重特異性抗体が抑制可能な度合いをテストすることができた。図2E
から明らかなように、HGFを抑制できないベバシズマブ(韓国ロシュ社製、同量処理)
は、陰性対照群(HGF単独)と同様に、HGFの効果に全く影響しなかった。それにも
拘わらず、c−MetとVEGFRの二重特異性抗体MV10Aは、その母体であるc−
Met単独標的抗体L3−1に比べて一層強力なHGFへの拮抗効果がある(MV10A
は64%抑制、L3−1は45%抑制;HGF単独群に比べて、一元配置分散分析法によ
るp値表示:*、p<0.05;NS、有意性なし)。
3.1.親和性(affinity)検査
VEGFを標的とする二重特異性抗体の結合動態をBiacore T100インスツ
ルメント(GEヘルスケア社製)を用いるSPR方法によって測定した。hVEGF(G
Eヘルスケア社製、28−9583−25)をCM5チップの表面に製造者の説明書に従
って固定化した。約90RUの様々な濃度(6種類の濃度)のMV10AYを捕獲した。
1M NaCl+30mM NaOHを30μl/分の流速で60秒間注入することによ
り、前記表面を再生した。結合動態を決定するために、BIAevaluationソフ
トウェア(GEヘルスケア社製)を用いて前記実験において得られたデータをフィットし
た(KD=0.45nM)。
前記得られた結果を表5に示す。
Xcelligenceリアルタイムセルアナライザ(ロシュ社製)を用いて抗体処理
(in vitro)によるHUVEC増殖の度合いを調べて血管新生抑制効果を調べて
みた。前記分析は、製造者の説明書に従って行った。略述すると、HuVEC細胞株(A
TCC)をVEGF(R&Dシステムズ社製)0.4μg/mlとともにEGM2 bu
lletkit培地(Lonza Cat.CC−3162)において培養した。前記培
養されたHuVEC細胞を16−ウェルE−プレートの上に各ウェル当たりに1×104
cellsの濃度で分注し、24時間後にインキュベーション用培地を除去し、無血清培
地(EBM培地、ロンザ社製)で希釈された抗体(100μL、最終濃度10μg/mL
)を処理した。発生するインピーダンス値をリアルタイムにて測定した。リアルタイム分
析は96時間かけて行った。
性対照群として用いられたベバシズマブ(韓国ロシュ社製、同量処理)は両方ともVEG
Fに依存的な細胞増殖を示し、MV10Aは陽性対照群であるベバシズマブと比較して顕
著な細胞増殖抑制効果を示した(MV10Aは86%抑制、ベバシズマブは61%抑制;
VEGF単独群に比べて、一元配置分散分析法によるp値表示:*、p<0.05;NS
、有意性なし)。
Xcelligenceリアルタイムセルアナライザ(ロシュ社製)を用いて抗体処理
(in vitro)によるHUVECの増殖度合いを調べて血管新生抑制効果を調べて
みた。前記分析は、製造者の説明書に従って行った。略述すると、細胞(HuVEC、A
TCC)10000cells/wellにc−MetとVEGFRのリガンドであるH
GF(R&Dシステムズ社製)0.4μg/mlとVEGF(R&Dシステムズ社製)0
.4μg/mlを処理してEGM2 bulletkit培地(Lonza Cat.C
C−3162)において培養した。前記培養されたHuVEC細胞を16−ウェルE−プ
レートの上に1ウェル当たりに1×104cellsの濃度で分注し、24時間後にイン
キュベーション用培地を除去し、無血清培地(EBM培地、ロンザ社製)で希釈された抗
体(100μL、最終濃度10μg/mL)を処理した。発生するインピーダンス値をリ
アルタイムにて測定した。リアルタイム分析は、48時間かけて行った。
)抗体であるL3−1Y抗体の単独投与およびベバシズマブ(Bevacizumab;
VEGF単一標的)抗体の単独投与時には、有意なHuVEC細胞増殖抑制効果が得られ
なったのに対し、二重特異性抗体であるMV10AYはc−MetとVEGFを同時に標
的とすることにより、HGF−およびVEGF−に依存的なHUVEC細胞増殖に対して
顕著な相乗的抑制効果を示す。すなわち、ベバシズマブの単独使用時に27%抑制、L3
−1Yの単独使用時に16%抑制に留まったが、二重特異性抗体であるMV10Aは72
%抑制効果を示して、単独抗体の使用時に比べて二重特異性抗体の使用時に顕著な相乗的
抑制効果が認められる(ボンフェローニの多重比較検定を用いた一元配置分散分析法検定
(1−way ANOVA test with Bonferonni multip
le comparison test)による有意性表示。棒グラフの上端にHGF+V
EGF単独群に比べてp値表示(***、p<0.001;NS、有意性なし)、各処理
群間の差分はグラフの上端に表示)。
抗体処理(in vitro)による細胞浸潤能の阻害有無を確認するために、上部チ
ャンバと下部チャンバに分けられて上部チャンバにコラーゲンがコードされた細胞浸潤能
分析用プレート(BioCoat Growth Factor Reduced MA
TRIGEL Invasion Chamber;BDサイエンス社製、Cat#.3
54483)を用いて細胞浸潤能(invasion)を試験した。分析は、製造者の説
明書に従って行った。略述すれば、上部チャンバにはHUVEC細胞(ATCC;5×1
04cells/well)を分注し、下部チャンバには抗体(10μg/ml)を処理
し、37℃で培養した(VEGFは、下部チャンバに添加、0.4μg/ml)。24時
間後に、上部チャンバのコラーゲン層を貫いて下部チャンバに下降した細胞をカルセイン
で染色して蛍光顕微鏡(ツァイス社製)で観察した。
群の相対的な蛍光イメージの広さを示すグラフである。VEGFのみを処理した場合に起
こる浸潤を100%とした相対的な値を示す。図3Cの下端は、実際の蛍光イメージを示
す写真である(白色が浸潤を引き起こした細胞である)。図3Cに示すように、MV10
AY二重特異性抗体はVEGF単一標的抗体であるベバシズマブに比べて顕著な浸潤能抑
制効果を示すことが確認された(MV10AYは100%抑制、ベバシズマブは70%抑
制)。
抗体処理(in vitro)による細胞浸潤能の阻害有無を確認するために、上部チ
ャンバと下部チャンバに分けられて上部チャンバにコラーゲンがコードされた細胞浸潤能
分析用プレート(BioCoat Growth Factor Reduced MA
TRIGEL Invasion Chamber;BDサイエンス社製、Cat#.3
54483)を用いて細胞浸潤能を試験した。分析は、製造者の説明書に従って行った。
ell)を分注し、下部チャンバには抗体(10μg/ml)を処理し、37℃で培養し
た(HGF+VEGFは下部チャンバに添加、それぞれ0.4μg/mlずつ)。24時
間後に、上部チャンバのコラーゲン層を貫いて下部チャンバに下降した細胞をカルセイン
で染色して蛍光顕微鏡(ツァイス社製)で観察した。
群の相対的な蛍光イメージの広さを示すグラフである。VEG+HGFを処理した場合に
起こる浸潤を100%とした相対的な値を示す。値が低いほど、浸潤があまり起きていな
いことが分かる。平均と標準偏差を表示し、一元配置分散分析法による分析結果、VEG
F+HGF処理群と比較したときのp値を各グラフの上端に示す(*、p<0.05;*
**、p<0.001)。図3Dの下端は、実際の蛍光イメージを示す写真である(黒色
が浸潤を引き起こした細胞である)。図3Dに示すように、VEGFとHGFの存在下に
おいて、二重特異性抗体MV10AYはc−Met単一標的抗体であるL3−1Y抗体に
比べてHuVEC細胞浸潤に対して顕著に優れた阻害効果を示すことを確認することがで
きる(MV10AYは92%抑制;L3−1Yは79%抑制;ベバシズマブは83%抑制
)。
c−MetとVEGFは両方とも細胞成長だけではなく、がんの転移にも関連する因子
である。それぞれの阻害剤を併用投与するときにがん細胞転移能と関連する細胞の移動に
相乗効果を示すか否かを試験した。抗体処理(in vitro)による転移能阻害能を
評価するために下記の実験を行った。細胞の移動はがんの転移に直接的に関与するため、
下記の分析法は細胞の転移能を評価する方法として汎用される方法である。
法を行った。ストッパーが内蔵された96ウェルプレートの各ウェルにHuVEC細胞(
ATCC)を10000個ずつ接種し、無血清培地(EBM、ロンザ社製)においてHG
F0.4μg/mlとVEGF0.4μg/mlを処理し、24時間をかけて培養した後
にストッパーを除去した。ストッパーは円形のゴム物質であり、ストッパーがあった箇所
には細胞が成長できないため、24時間後にストッパーを除去すれば、その個所にのみ円
形の空間が生成される。
V10AY抗体を様々な濃度(0.05〜5μg/ml)で処理した後、24時間後に蛍
光物質であるカルセインAM(BD)で染色すれば細胞のみが染色され、細胞がない部分
は空間として残る。このため、細胞移動が阻害されるほど、未染色空間が大きくなり、未
染色空間を観察することにより、細胞移動の度合いを測定することができる。蛍光信号の
強さは、マルチラベルリーダ(パーキンエルマー社製、Envision)で読み取り、
これによって得られた値をVEGF+HGF処理群の信号強さ100%として換算して図
3Eに示す。各濃度における平均と標準誤差を示し、VEGF+HGF群に比べての統計
学的有意性を各濃度点の上端に示す(ボンフェローニの多重比較検定を用いた二元配置分
散分析法;*p<0.05;***p<0.001;****p<0.0001)。
Met単一標的抗体(L3−1Y)またはVEGF単一標的抗体ベバシズマブ処理時また
は前記単一標的抗体の併用処理時と比較して顕著に優れた阻害効果を示すことを確認する
ことができる(相乗作用の確認)。これは、抗c−Met抗体に抗VEGF機能を加えた
MV10AY抗体の優越性を確実に示す結果である。
c−Met/HGFとVEGFをそれぞれ抑制するときに抗がん効果が得られると知ら
れているU87−MG脳がん細胞株を用いて、生体内抗がん効果試験を行った。U87−
MG脳がん細胞株(中国科学院の細胞銀行から購入;ATCC Cat.No.HTB−
14)2.5×106個(100μL)をBALB/cヌードマウス(雄性、6−7週齢
、20−25gram)に皮下注射した後、1週間が経過した後に治療群(MV10AY
(■)、MV10AY U3 HC9/IgG1(□)、またはMV10AY U3 H
C9/IgG2(○);投与量:それぞれ0.2mg/kg(点線)または1mg/kg
(実線);投与時期:3−4日おきにまたは10日おきに;投与経路:静脈注射)と対照
群(ビヒクル:PBS 0.2mL、週1回静脈注射で投与)に分けて薬物投与を始めた
。各群あたりのマウスは15匹にした。腫瘍の大きさを1週につき2回測定し、腫瘍の大
きさ(tumor volume)は{(長径(mm))×(短径(mm))2}/2に
よって計算した。治療を始めてから30日後にマウスを安楽死させた後に腫瘍を摘出し、
腫瘍の重さを測定して、前記測定された腫瘍の大きさとともに抗がん効果の評価に用いた
。
部は、実験終了後に最終的に摘出された腫瘍の重さ(tumor weight)を示す
。図4Aから明らかなように、投与を始めてから2週後から全ての治療群において顕著な
腫瘍抑制効果を示した。また、前記3種類の二重特異性抗体間の治療効果には大差なく、
投与量および投与回数を増やした群において一層強力な抑制効果を示した。1mg/kg
を3〜4日ごとに注射した群においては腫瘍がほとんど観察されない程度に完璧な抗がん
効能を示した。(上部グラフは、分散分析法(ANOVA)により繰り返し測定した結果
を示し、**(p<0.01)、****(p<0.0001);下部グラフは、ダネッ
トの多重比較検定を用いた一元配置分散分析法(1−way ANOVA Dunnet
t''multiple comparison test)によるビークル群(vehi
cle group)に対する分析結果を示す、**(p<0.01)、***(p<0
.0001))
c−Met単独標的抗体に比べてc−MetとVEGFを同時に標的とする二重特異性
抗体がより向上した抗がん効果を示すか否かを調べるために、NCI−H441細胞株を
用いて生体内抗がん効果実験を行った。NCI−H441は、c−Met標的による抗が
ん効果とアゴニズム効果を両方とも示す細胞株であり、包括的な抗がん効果を示すのに最
適な細胞株であると決定した。NCI−H441肺がん細胞株(ATCCから購入、Ca
t.# HTB−174)5×106個(100uL)をBALB/cヌードマウス(雄
性、5−6週齢、20−25g)に皮下注射した後、1週間が経過した後に治療群(単独
標的抗体L3−1Y、二重特異性抗体それぞれ5mg/kg、週1回投与)と対照群(ビ
ヒクル:PBS 0.2mL、週1回静脈注射で投与)に分けて薬物投与を始めた。各群
当たりのマウスは15匹にした。腫瘍の大きさを1週につき2回測定し、腫瘍の大きさは
{(長径(mm))×(短径(mm))2}/2により計算した。治療を始めてから26
日後にマウスを安楽死させた後に腫瘍を摘出し、腫瘍の重さを測定して、前記測定された
腫瘍の大きさとともに抗がん効果評価に用いた。
前記得られた結果を図4Bに示す。図4Bの上部は、経時的な腫瘍の大きさを示し、下部
は、実験終了後に最終的に摘出された腫瘍の重さを示す。図4Bに示すように、投与を始
めてから1週間後から両治療群においていずれも統計的に有意的な抗がん効果が観察され
た。特に、L3−1Yに比べてMV10AY治療時よりも強力な抗がん効果が得られた(
上部グラフは、分散分析法(ANOVA)により繰り返し測定した結果を示し、****
(p<0.0001)、下部グラフは、ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分
析法(1−way ANOVA Dunnett''multiple comparis
on test)によるビークル群に対する分析結果を示す、*(p<0.05)、**
*(p<0.0001))。
VIG2を融合した場合、上記の例において示すL3−1やL3−1Y、L3−1YI
gG2に加えて他のCDRを有する抗c−Met抗体の効能も改善されるか否かを確認し
た。
合いを試験して測定され、このときに用いられた抗体を下記表6にまとめて示す。
1−VIG2とAb2−VIG2は、それぞれのc−Met単独標的抗体であるAb1お
よびAb2に比べてc−Met分解能が向上した。すなわち、Ab1−VIG2のc−M
et分解能(83.2%)は、単独標的抗体Ab1の分解能(81.7%)に比べて向上
し、Ab2−VIG2の場合にも分解能(81.9%)が単独標的抗体Ab2の分解能(
70.4%)よりも向上した(t検定析結果p<0.01)。
Claims (22)
- 抗c−Met抗体またはその抗原結合断片およびVEGF結合断片を含む、融合タンパ
ク質。 - 前記抗c−Met抗体またはその抗原結合断片と前記VEGF結合断片との間にリンカ
ーをさらに含む、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記リンカーは、1〜100個のアミノ酸を含むペプチドリンカーである、請求項2に
記載の融合タンパク質。 - 前記VEGF結合断片は、抗VEGF抗体、前記抗VEGF抗体の抗原結合断片、VE
GF受容体または前記VEGF受容体のVEGF結合部位である、請求項1〜3のいずれ
か1項に記載の融合タンパク質。 - 前記VEGF結合断片は、ベバシズマブ、ベバシズマブの抗原結合断片、配列番号10
9を含むVEGF受容体、配列番号110を含むVIG2ポリペプチド、または配列番号
110を含む配列番号109の102〜1338の連続するアミノ酸を含むポリペプチド
である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗c−Met抗体は、c−Metタンパク質のSEMAドメイン内の連続する5以
上のアミノ酸からなるエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片である、請
求項1〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗c−Met抗体は、
配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR−H1、
配列番号5のアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2のアミノ酸
配列内の3番目から10番目までのアミノ酸残基を含む連続する8〜19個のアミノ酸を
含むアミノ酸配列を含むCDR−H2、および
配列番号6のアミノ酸配列、配列番号85のアミノ酸配列、または配列番号85のアミ
ノ酸配列内の1番目から6番目までのアミノ酸残基を含む6〜13個の連続するアミノ酸
を含むアミノ酸配列を含むCDR−H3、
からなる群から選択された少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配
列を含む重鎖可変領域と、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR−L1、配列番号8の
アミノ酸配列を含むCDR−L2、および配列番号9のアミノ酸配列、配列番号86のア
ミノ酸配列、または配列番号89のアミノ酸配列内の1番目から9番目までのアミノ酸残
基を含む配列番号89の9〜17個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むCDR
−L3、
からなる群から選択された1以上の軽鎖相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列を含む
軽鎖可変領域と、
を含み、
前記配列番号4〜9は、それぞれ下記の一般式I〜VIで表わされるアミノ酸配列であ
る抗体または抗原結合断片である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の融合タンパク質
:
一般式I
Xaa1−Xaa2−Tyr−Tyr−Met−Ser(配列番号4)、
一般式II
Arg−Asn−Xaa3−Xaa4−Asn−Gly−Xaa5−Thr(配列番号5
)、
一般式III
Asp−Asn−Trp−Leu−Xaa6−Tyr(配列番号6)、
一般式IV
Lys−Ser−Ser−Xaa7−Ser−Leu−Leu−Ala−Xaa8−Gl
y−Asn−Xaa9−Xaa10−Asn−Tyr−Leu−Ala(配列番号7)
一般式V
Trp−Xaa11−Ser−Xaa12−Arg−Val−Xaa13(配列番号8)
一般式VI
Xaa14−Gln−Ser−Tyr−Ser−Xaa15−Pro−Xaa16−Th
r(配列番号9)
前記一般式Iにおいて、Xaa1は存在しない、あるいは、ProまたはSerであり
、Xaa2はGluまたはAspであり、
前記一般式IIにおいて、Xaa3はAsnまたはLysであり、Xaa4はAlaま
たはValであり、Xaa5はAsnまたはThrであり、
前記一般式IIIにおいて、Xaa6はSerまたはThrであり、
前記一般式IVにおいて、Xaa7はHis、Arg、GlnまたはLysであり、X
aa8はSerまたはTrpであり、Xaa9はHisまたはGlnであり、Xaa10
はLysまたはAsnであり、
前記一般式Vにおいて、Xaa11はAlaまたはGlyであり、Xaa12はThr
またはLysであり、Xaa13はSerまたはProであり、
前記一般式VIにおいて、Xaa14はGly、AlaまたはGlnであり、Xaa1
5はArg、His、Ser、Ala、GlyまたはLysであり、Xaa16はLeu
、Tyr、PheまたはMetである。 - 前記CDR−H1は、配列番号1、配列番号22、配列番号23および配列番号24か
らなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
前記CDR−H2は、配列番号2、配列番号25、および配列番号26からなる群から
選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
前記CDR−H3は、配列番号3、配列番号27、配列番号28、および配列番号85
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
前記CDR−L1は、配列番号10、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配
列番号32、配列番号33、および配列番号106からなる群から選ばれるアミノ酸配列
を含むものであり、
前記CDR−L2は、配列番号11、配列番号34、配列番号35、および配列番号3
6からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
前記CDR−L3は、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配
列番号16、配列番号37、配列番号86、および配列番号89からなる群から選ばれる
アミノ酸配列を含むものである、請求項7に記載の融合タンパク質。 - 前記重鎖可変領域は、配列番号17、配列番号74、配列番号87、配列番号90、配
列番号91、配列番号92、配列番号93または配列番号94のアミノ酸配列を含み、前
記軽鎖可変領域は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番
号75、配列番号88、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配
列番号99、または配列番号107のアミノ酸配列を含む、請求項7または8に記載の融
合タンパク質。 - 前記抗c−Met抗体は、
配列番号62のアミノ酸配列、配列番号62の18番目から462番目までのアミノ酸
配列、配列番号64のアミノ酸配列、配列番号64の18番目から461番目までのアミ
ノ酸配列、配列番号66のアミノ酸配列、または配列番号66の18番目から460番目
までのアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号68のアミノ酸配列、配列番号68の21番目から240番目までのアミノ酸
配列、配列番号70、配列番号70の21番目から240番目までのアミノ酸配列、また
は配列番号108のアミノ酸配列を含む軽鎖とからなる抗体である、請求項7〜9のいず
れか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗c−Met抗体は、配列番号112または配列番号114のアミノ酸配列を含む
重鎖および配列番号113または配列番号115のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求
項1〜10のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗c−Met抗体は、モノクローナル抗体である、請求項1〜11のいずれか1項
に記載の融合タンパク質。 - 前記抗c−Met抗体は、マウス由来の抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体ま
たはヒト抗体である、請求項1から請求項11のうちのいずれか1項に記載の融合タンパ
ク質。 - 前記抗c−Met抗体の抗原結合断片は、scFv、(scFv)2、Fab、Fab
'およびF(ab')2からなる群から選ばれる、請求項1から請求項11のうちのいずれ
か1項に記載の融合タンパク質。 - 請求項1から請求項11のうちのいずれか1項に記載の融合タンパク質を含む、c−M
etとVEGFの二重特異性抗体。 - 請求項15に記載のc−MetとVEGFの二重特異性抗体を有効成分として含む、c
−MetまたはVEGF誘発疾病の予防または治療用組成物。 - 前記c−MetまたはVEGF誘発疾病は、がん、妊娠糖尿病、糖尿病性網膜症、黄斑
変性である、請求項16に記載の予防または治療用組成物。 - 請求項15に記載のc−MetとVEGFの二重特異性抗体を含む、c−Metまたは
VEGF誘発疾病の診断用組成物。 - 抗c−Met抗体またはその抗原結合断片にVEGF結合断片を連結する工程を含む、
融合タンパク質の製造方法。 - 前記VEGF結合断片は、配列番号110のVIG2、または配列番号109のアミノ
酸のうち配列番号110のVIG2を含んで連続する102〜1338個のアミノ酸から
なるポリペプチドである、請求項19に記載の製造方法。 - 前記抗c−Met抗体またはその抗原結合断片にVEGF結合断片を連結する工程にお
いて、c−Met標的抗体またはその断片とVEGF結合断片とがリンカーを介して結合
する、請求項19または20に記載の製造方法。 - 前記リンカーは、1〜100個のアミノ酸からなるペプチドリンカーである、請求項2
1に記載の製造方法。
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