KR20220006010A - 보체 경로 억제제 및 혈관신생 억제제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

보체 경로 억제제 및 혈관신생 억제제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체를 제공한다. 상기 단백질은 보체 관련 경로를 억제할 뿐 아니라 신생혈관생성을 효율적으로 조절할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질 이량체는 보체 관련 질환, 구체적으로 황반 변성과 같은 안질환의 치료 및 예방에 효과적으로 활용할 수 있어 산업적 활용 가능성이 높다.

Description

보체 경로 억제제 및 혈관신생 억제제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING COMPLEMENT PATHWAY INHIBITOR AND ANGIOGENESIS INHIBITOR AND USE THEREOF}
보체 경로 억제 단백질 및 혈관신생 억제 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이를 이용한 안질환, 구체적으로 황반 변성 치료용 조성물에 관한 것이다.
황반 변성은 브루크막, 맥락막, 신경 망막 및/또는 망막 색소 상피의 이상과 관련된 중앙 시력의 상실을 특징으로 하는 질병을 의미한다. 망막의 중심에 직경이 약 1/3 내지 1/2 cm인 황반이 존재한다. 망막 아래에, 섬유 조직 내에 묻힌 혈관의 집합체인 맥락막, 및 맥락막층 위에 색소 상피(PE)가 존재한다. 이때, 맥락막 혈관은 망막에 영양을 제공한다. 맥락막 및 PE는 눈의 전방에서 발견된다.
황반 변성 중 하나인 노인성 황반 변성(AMD)은 시야의 중앙부에서 시각의 진행성 상실, 색 식별력의 변화, 및 비정상적인 암 순응 및 민감도와 연관된 질환이다. AMD는 크게 건성 또는 습성 AMD로 구분된다. 건성 AMD는 읽기, 운전 또는 안면 인식과 같은 활동에 사용되는 미세 시력을 위해 요구되는 중앙 망막 또는 황반의 위축성 세포 사멸과 연관된다. 상기 건성 AMD 환자의 약 10-20%는 습성 AMD로서 알려진 AMD의 제2형으로 진행한다.
두 형태의 발병에서 가장 유의한 위험 인자는 연령 및 망막 색소 상피 뒤에서 비정상적인 세포외 침착물인 결정체(drusen)의 침착이다. 결정체는 AMD와 관련된 특징적인 침착물이다. 상기 결정체는 보체 활성화제, 억제제, 활성화-특이적 보체 단편, 및 말단 경로 인자, 예를 들어 세포막 공격 복합체(MAC 또는 C5b-9)를 포함한다고 알려져 있다. 뿐만 아니라, 습성 AMD는 맥락막 혈관신생(CNV)과 연관되어 있다. 새로운 맥락막 혈관 형성의 발병기전은 거의 알려지지 않았지만, 염증, 허혈, 및 혈관신생 인자의 국소 생산과 같은 요소가 중요한 것으로 생각된다.
한편, 보체계는 미생물 감염에 대한 선천 면역의 중대한 성분이고, 정상적으로 혈청 내에 비활성 상태로 존재하는 단백질의 집단을 포함한다. 상기 단백질은 전통적인 경로, 렉틴 경로 및 대체 경로를 통해 활성화된다. 미생물 표면의 분자는 상기 경로를 활성화시켜 C3-전환효소로 알려진 프로테아제 복합체의 형성을 일으킬 수 있다.
보체 경로의 활성화는 백혈구 화학주성, 대식세포, 호중구, 혈소판, 비만세포 및 내피세포의 활성화, 증가된 혈관 투과성, 세포 용해, 및 조직 손상에서 염증 반응을 매개하는 보체 단백질의 생물학적 활성 단편, 예를 들어 C3a 및 C5a과 같은 과민독소(Anaphylatoxin) 및 C5b-9 세포막 공격 복합체(MAC)를 생성한다. 또한, 안질환 중 일부는 보체가 관련되어 있다는 점이 보고된 바 있다(일본특허출원 제2007-536964호). 그러나, 현재까지도 안질환, 특히 황반 변성을 효과적으로 치료하기 위한 약물에 대한 니즈가 증가되고 있어, 황반 변성 치료제에 대한 연구는 계속되고 있는 실정이다.
일본특허출원 제2007-536964호
이에 본 발명자들은 안질환, 특히 황반 변성을 효과적으로 치료 및 예방하기 위하여 연구한 결과, 보체 관련 경로 및 신생혈관 경로를 차단하는 융합 단백질이 황반 변성 치료제로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은 CRIg(Complement receptor of the immunoglobulin superfamily)의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 VEGF(Vascular endothelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질 또는 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
보체 관련 경로 억제 단백질인, CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 융합단백질은 보체 관련 기작을 효율적으로 억제할 뿐 아니라, 신생혈관생성도 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 보체계에 의해 유발되는 안질환 및 신생혈관생성에 의해 유발되는 안질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질은 효율적으로 황반 변성, 특히, 건성 황반 변성 및 습성 황반 변성을 모두 효과적 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 C1.01, C1.02, C1.03, C1.04, C1.05 및 C1.06의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 C1.03m, C1.04m, 및 아필리버셉트(Aflibercept)의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 C1.01m, C1.02m, C1.06m 및 C1.07m의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 토끼 C3, 토끼 C3b, 랫트 C3 및 랫트 C3b의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 융합단백질의 모식도를 나타낸 도이다. 순차적으로 CRIg-Fc(C1.01, 왼쪽), CRIg-Fc-VEGF binder(C1.02, 가운데) 및 VEGF binder-Fc-CRIg(C1.04, 오른쪽)를 의미한다.
도 6a 및 도 6b는 인간 C3b 및 인간 VEGF165에 대한 C1.01 및 C1.02의 결합 친화도를 비아코어 분석을 통해 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 7a 및 도 7b는 마우스 C3b 및 인간 VEGF165에 대한 C1.01m 및 C1.02m의 결합 친화도를 비아코어 분석을 통해 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 8a는 인간 C3b에 대한 C1.01, C1.02, C1.03 및 C1.04의 결합 친화도를 ELISA를 통해 나타낸 그래프이다.
도 8b는 인간 VEGF165에 대한 아필리버셉트, C1.02, C1.04 및 C1.05의 결합 친화도를 ELISA를 통해 나타낸 그래프이다.
도 8c는 마우스 C3b에 대한 결합 친화도를 C1.01, C1.02 및 C1.03 결합 친화도를 ELISA를 통해 나타낸 그래프이다.
도 8d는 인간 C3b, 인간 C2 및 인간 C4에 대한 C1.02의 결합 친화도를 ELISA를 통해 나타낸 그래프이다.
도 9a는 C1.01의 유체학적 반경을 동적 광 산란 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 9b는 C1.02의 유체학적 반경을 동적 광 산란 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 10은 C1.02의 농도에 따른 점도를 나타낸 그래프이다.
도 11a는 C1.01, C1.02 및 C1.06의 대체 보체 경로 억제 효과를 용혈 분석(AH50)을 통하여 나타낸 그래프이다.
도 11b는 C1.02, C1.04, C1.04m 및 C1.05의 대체 보체 경로 억제 효과를 용혈 분석(AH50)을 통하여 나타낸 그래프이다.
도 11c는 C1.01m, C1.02m, C1.06m 및 C1.07m의 대체 보체 경로 억제 효과를 용혈 분석(AH50)을 통하여 나타낸 그래프이다.
도 12a는 C1.01, C1.02 및 C1.06의 고전 보체 경로 억제 효과를 용혈 분석(CH50)을 통하여 나타낸 그래프이다.
도 12b는 C1.02, C1.04, C1.04m 및 C1.05의 고전 보체 경로 억제 효과를 용혈 분석(CH50)을 통하여 나타낸 그래프이다.
도 12c는 C1.01m, C1.02m, C1.06m 및 C1.07m의 고전 보체 경로 억제 효과를 용혈 분석(CH50)을 통하여 나타낸 그래프이다.
도 13는 아필리버셉트, C1.01, C1.02, C1.05, 및 C1.06의 VEGF 신호전달 저해 효과를 리포터 세포를 사용하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 C1.01, C1.02, 및 C1.05의 VEGF 신호전달경로 저해 효과를 상처 치유 분석법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 15a는 C1.02에 대한 인간 및 게잡이원숭이의 C3b의 결합능, 및 C1.06에 대한 인간 및 게잡이원숭이의 C3b의 결합능을 ELISA를 통해 나타낸 그래프이다.
도 15b는 C1.02에 대한 인간, 랫트 및 토끼의 C3b의 결합능, 및 C1.06에 대한 인간, 랫트 및 토끼의 C3b의 결합능을 ELISA를 통해 나타낸 그래프이다.
도 15c는 C1.02에 대한 인간, 게잡이원숭이, 랫트 및 토끼 VEGF의 결합능; 및 C1.01에 대한 인간, 게잡이원숭이, 랫트 및 토끼 VEGF의 결합능을 ELISA를 통해 나타낸 그래프이다.
도 16a는 맥락막 혈관신생 마우스 모델 유도 후, 유도 직후(Day 0) 내지 유도 7일 후(Day 7)의 각 실험군의 맥락막 혈관신생을 형광안저혈관조영술을 통해 확인한 이미지이다.
도 16b는 맥락막 혈관신생 마우스 모델 유도 후, 유도 직후(Day 0), 유도 3일 후(Day 3) 및 유도 7일 후(Day 7)의 각 실험군의 몸무게를 나타낸 그래프이다.
도 16c는 맥락막 혈관신생 마우스 모델 유도 후, 유도 직후(Day 0) 내지 유도 7일 후(Day 7)의 각 실험군당 맥락막 혈관신생의 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 17은 맥락막 혈관신생 토끼 모델 유도 후 7일 및 14일 후의 맥락막혈관신생 강도를 각 실험군별로 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 18a는 맥락막 혈관신생 랫트 모델에서 유도 직후와 유도 10일 후 각 실험군의 맥락막 혈관신생의 유무를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 18b는 맥락막 혈관신생 랫트 모델에서 유도 직후와 유도 10일 후 각 실험군의 혈관 누출(vascular leak) 넓이를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 19는 건성 황반 변성 모델의 각 실험군의 외과립층(ONL)을 나타낸 이미지(도 19a 내지 19c), 외과립층 세포 수(도 19d), 외과립층 넓이(도 19e) 및 망막에서의 C3 발현량(도 19f)을 나타낸 도이다.
도 20a는 토끼에서 안구내 주사를 통한 2,500 ㎍의 C1.02 투여 후의 유리체액 내에서의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 20b는 토끼에서 안구내 주사를 통한 2,500 ㎍의 C1.02 투여 후의 안방수 내에서의 농도를 나타낸 그래프이다.
CRIg 세포외도메인을 포함하는 융합단백질
본 발명의 일 측면은 CRIg(Complement receptor of the immunoglobulin superfamily)의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 VEGF(Vascular endothelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "CRIg"는 VSIG4 유전자에서 코딩되는 면역글로불린 보체 수용체를 의미하며, Protein Z39Ig라고도 명명된다. 상기 CRIg는 보체 수용체의 4종류 중 제4형 보체 수용체에 속하는 수용체로서, 간장 내에서 식균작용을 하는 쿠퍼(Kupffer) 세포와 같은 대식세포의 표면상에 발현된다. 상기 CRIg는 면역글로불린 도메인을 포함하는 세포외 부위와 결합되어 있는 막단백질(Integral Membrane Protein)이다. CRIg은 보체 단편인 C3b와 iC3b와 결합하며, 인체내로 들어온 박테리아나 혈액내의 감염균을 식균세포가 인지하고 제거하도록 기능한다.
상기 CRIg는 CRIg 동형체(isoform) 또는 스플라이싱된 형태(spliced form)를 포함한다. 상기 동형체는, CRIg isoform 1, 2 또는 3을 포함한다. 상기 스플라이싱된 형태는 CRIg(L) 또는 CRIg(S)를 포함한다. 상기 CRIg(L)은 V 및 C2-타입 말단 Ig 도메인을 포함하고, CRIg(S)는 V-타입 도메인만을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 CRIg(S)는 서열번호 20의 서열을 포함할 수 있다.
상기 CRIg 세포외도메인은 수용체의 막관통도메인 및 세포질도메인 부분을 제외한 부분일 수 있다.
상기 CRIg는 CRIg 세포외도메인의 단편을 포함할 수 있다. 상기 CRIg의 세포외도메인의 단편이란, CRIg의 세포외도메인과 동등 또는 유사의 활성을 가지는 절단형을 의미한다. 구체적으로, 상기 단편은 C3b 또는 iC3b와 결합하여 보체 작용 또는 식균 작용을 촉진하는 활성을 가지는 CRIg의 단편을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 CRIg는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 74 또는 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 사람 CRIg은 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 서열번호 151의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 마우스 CRIg은 서열번호 21의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 마우스 CRIg 세포외도메인은 서열번호 75의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 사람 CRIg 세포외도메인은 서열번호 22 또는 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "VEGF(Vascular endothelial growth factor)"는 혈관 내피 성장 인자로서, 혈관 형성을 자극하는 세포에 의해 생성된다. VEGF는 혈관내피세포를 분열 증식시키고, 혈관의 투과성을 증가시켜 혈관 신생에 관여하는 중요한 신호 전달 단백질이다. 상기 VEGF는 습성 AMD에서 망막의 비정상적 혈관 증식을 자극함이 알려져 있다.
또한, 본 명세서에서는 VEGF 또는 VEGF계 단백질을 총칭하여 "VEGF"의 용어로 표현하기도 한다. VEGF계 단백질은 VEGF와 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "활성"은 예를 들어 VEGF 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 VEGF계 단백질은 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PlGF(Placental growth factor) 및 재조합 VEGF로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 VEGF는 VEGF-A, B 또는 PlGF일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어"PlGF(Placental growth factor)"는 2p21-p16 염색체에 의해 코딩되는 막관통 단백질을 의미한다. 상기 PlGF는 VEGFR-1에 선택적인 리간드로 작용하며, 혈관형성을 촉진시키는 것일 수 있다. 상기 PlGF는 VEGF의 아미노산 구성과 40% 이상의 동일성을 가진다. 일 구체예에 있어서, 상기 PlGF는 PlGF-1 또는 PlGF-2일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어 "재조합 VEGF"는 대체 엑손 스플라이싱(alternative exon splicing)을 통해 재조합된 VEGF를 의미한다. 상기 재조합 VEGF는 아미노산의 개수에 따라 VEGF111, VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEFG165, VEGF183, VEGF189 또는 VEGF206일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 VEGF는 VEGF165일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질"은 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 VEGF의 수용체의 세포외도메인을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "VEGF의 수용체"는 VEGF에 결합하는 수용체를 의미한다. 이때, 상기 VEGF 수용체는 VEGF 수용체 1(VEGFR-1), VEGF 수용체 2(VEGFR-2), 및 VEGF 수용체 3(VEGFR-3)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. VEGF 수용체들은 면역글로불린-Ig-유사(immunoglobulin-(Ig)-like) 도메인, 세포외도메인 및 세포내에 분리된 키나아제 도메인을 포함한다. 상기 VEGF 수용체는 VEGF 리간드와 결합화여 활성화함으로서, 이합체화(dimerization) 또는 인산화가 일어나는 것일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 VEGF 수용체는 VEGF 수용체 1 또는 2일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "VEGF 수용체의 세포외도메인"은 상기 VEGF에 결합하는 VEGF 수용체의 도메인을 의미한다. 구체적으로, VEGF 수용체의 막통과영역 및 세포질영역을 제외하고, VEGF의 리간드를 포함하는 세포외도메인 부분을 의미한다.
또한, 상기 VEGF 수용체의 세포외도메인은 VEGF와 결합하는 VEGF의 수용체의 단편일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 VEGF 수용체의 단편은 VEGF가 결합하는 영역인 VEGF 수용체의 도메인 D1, D2, D3 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 VEGF 수용체의 단편은 D2 및 D3을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 VEGF 수용체의 세포외도메인은 VEGF 수용체 1 또는 2의 D2 및 D3 도메인을 포함한다. 또한, 상기 VEGF 수용체의 세포외도메인은 VEGF-A, VEGF-B 또는 PlGF와 결합하여 혈관신생을 억제하는 것일 수 있다. 이때, 상기 VEGF의 수용체의 세포외도메인의 일 구체예는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 VEGF 수용체의 세포외도메인은 상기 서열번호 14를 포함하는 VEGF 수용체 세포외도메인의 일부가 절단되거나 변경된 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "VEGF에 특이적으로 결합하는 항체"는 VEGF와 특이적 결합을 하여 항원-항체 반응을 일으키는 항체 또는 이의 단편을 의미하며, 항-VEGF 항체라고도 명명된다.
상기 항체는 VEGF와 특이적으로 항원-항체 결합을 할 수 있는 분자를 총칭한다. 또한, 상기 항체는 VEGF에 특이적으로 결합할 수 있는 항원결합도메인을 포함하는 한 어떠한 형태로도 이용될 수 있다. 상기 항체 또는 이의 단편은 Fab(Fragment antigen binding), F(ab)2, scFv(Single-chain variable fragment), di-scFv, sdAb(Single domain antibody), 키메릭 항체, 인간화-항체, 인간 항체 또는 이의 변이체 일 수 있다.
상기 항-VEGF 항체는 나노바디 일 수 있다. 이때, 상기 항체는 서열번호 49의 CDR1, 서열번호 50의 CDR2 및 서열번호 51의 CDR3을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 BI-836880 일 수 있다.
상기 항-VEGF 항체는 아필리버셉트, 베바시주맙(Bevacizumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 브로루시주맙(Brolucizumab), 파리시맙(Faricimab), KSI-301, 바누시주맙(Vanucizumab), BI-836880, HuMab G6-31, B20-4.1, BAT-5906, 나비치시주맙(Navicixizumab), 딜파시맙(Dilpacimab), hPV-19 및 AT-001로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 가변 부위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항-VEGF 항체는 아필리버셉트, 베바시주맙, 라니비주맙, 브로루시주맙, KSI-301, 바누시주맙, BI-836880 또는 BAT-5906의 가변 영역을 포함할 수 있다.
이때, 상기 아필리버셉트는 혈관 내의 VEGF-A 및 PlGF를 저해하는 재조합형 인간화 융합단백질을 의미한다. 이때, 상기 아필리버셉트는 안구 내에 직접 주입할 수 있다. 상기 베바시주맙은 혈관 내의 VEGF-A를 저해하여 혈관의 성장을 저해하는 혈관 신생 억제제인 항체이다. 황반 변성 치료의 경우, 상기 베바시주맙은 안구 내에 직접 주입할 수 있다. 상기 라니비주맙은 혈관 신생을 억제하여 습성 황반 변성 치료 효과가 있는 Fab이다. 상기 라무시루맙은 혈관신생을 매개하는 물질 또는 VEGF 수용체 2를 저해하는 항체이다. 상기 브로루시주맙은 VEGF-A에 결합하여 혈관신생을 저해하고, 습식 황반 변성을 치료하는 scFv이다. 상기 파리시맙은 VEGF-A 및 안지오포이에틴-2를 저해하는 이중 특이적 항체이다.
상기 KSI-301은 습식 황반 변성 치료효과가 있는 항체이다. 상기 바누시주맙은 VEGF-A 및 안지오포이에틴-2를 저해하는 이중 특이적 인간화 모노클로랄 항체이다. 상기 BI-836880은 VEGF 및 안지오포이에틴-2를 저해하는 인간화 이중특이적 나노바디(Nanobody)이다. 상기 G6-31은 인간 VEGF를 저해하는 Fab 단편이다. 상기 B20-4.1은 인간 VEGF를 저해하는 scFv 단편이다.
상기 BAT-5906은 습식 황반 변성 치료효과가 있는 항체이다. 상기 나비치시주맙은 항-DLL4/VEGF 이중특이적 항체이다. 상기 딜파시맙은 항-DLL4/VEGF 이중 특이적 항체로, ABT-165라고도 지칭된다. 상기 hPV-19는 항-혈관형성 및 항-종양 활성을 갖는 VEGF에 대한 항체이다. 상기 AT-001은 인간 VEGF 수용체 3를 저해하여 혈관 신생을 억제하는 항체이다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 BI-836880의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 49의 CDR1, 서열번호 50의 CDR2 및 서열번호 51의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 베바시주맙의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 77의 HCDR1, 서열번호 78의 HCDR2, 서열번호 79의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 80의 LCDR1, 서열번호 81의 LCDR2, 서열번호 82의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 라니비주맙의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 83의 HCDR1, 서열번호 84의 HCDR2, 서열번호 85의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 86의 LCDR1, 서열번호 87의 LCDR2, 서열번호 88의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 라무시루맙의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 89의 HCDR1, 서열번호 90의 HCDR2, 서열번호 91의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92의 LCDR1, 서열번호 93의 LCDR2, 서열번호 94의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 파리시주맙의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 101의 HCDR1, 서열번호 102의 HCDR2, 서열번호 103의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 104의 LCDR1, 서열번호 105의 LCDR2, 서열번호 106의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 KSI-301의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 107의 HCDR1, 서열번호 108의 HCDR2, 서열번호 109의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 110의 LCDR1, 서열번호 111의 LCDR2, 서열번호 112의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 배누시주맙의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 113의 HCDR1, 서열번호 114의 HCDR2, 서열번호 115의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 116의 LCDR1, 서열번호 117의 LCDR2, 서열번호 118의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 BAT-5906의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 119의 HCDR1, 서열번호 120의 HCDR2, 서열번호 121의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 122의 LCDR1, 서열번호 123의 LCDR2, 서열번호 124의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 나비치시주맙의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 125의 HCDR1, 서열번호 126의 HCDR2, 서열번호 127의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 128의 LCDR1, 서열번호 129의 LCDR2, 서열번호 130의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 딜파시맙의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 131의 HCDR1, 서열번호 132의 HCDR2, 서열번호 133의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 134의 LCDR1, 서열번호 135의 LCDR2, 서열번호 136의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 hPV-19의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 137의 HCDR1, 서열번호 138의 HCDR2, 서열번호 139의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 140의 LCDR1, 서열번호 141의 LCDR2, 서열번호 142의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 AT-001의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 143의 HCDR1, 서열번호 144의 HCDR2, 서열번호 145의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 146의 LCDR1, 서열번호 147의 LCDR2, 서열번호 148의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-VEGF 항체는 서열번호 36의 중쇄 및 서열번호 37의 경쇄; 서열번호 38의 중쇄 및 서열번호 39의 경쇄; 서열번호 40의 중쇄 및 서열번호 41의 경쇄; 서열번호 43의 중쇄 및 서열번호 44의 경쇄; 서열번호 45의 중쇄 및 서열번호 46의 경쇄; 서열번호 47의 중쇄 및 서열번호 48의 경쇄; 서열번호 64의 중쇄 및 서열번호 65의 경쇄; 서열번호 66의 중쇄 및 서열번호 67의 경쇄; 서열번호 68의 중쇄 및 서열번호 69의 경쇄; 서열번호 70의 중쇄 가변영역 및 서열번호 71의 경쇄 가변영역; 또는 서열번호 72의 중쇄 가변영역 및 서열번호 73의 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
상기 항-VEGF 항체의 단편은 scFv(single chain variable fragment)일 수 있다. 이때, 상기 scFv는 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 펩타이드 링커로 연결된 형태를 의미한다. 구체적으로, 상기 scFv는 서열번호 95의 CDR1, 서열번호 96의 CDR2, 서열번호 97의 CDR3, 서열번호 98의 CDR4, 서열번호 99의 CDR5 및 서열번호 100의 LCDR6을 포함하는 가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 scFv는 서열번호 42의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이때, 상기 scFv의 일 구체예는 브로루시주맙일 수 있다.
상기 항-VEGF 항체는 HuMab G6-31 또는 B20-4.1의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 52의 HCDR1, 서열번호 53의 HCDR2, 서열번호 54의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 55의 LCDR1, 서열번호 56의 LCDR2, 서열번호 57의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체는 서열번호 58의 HCDR1, 서열번호 59의 HCDR2, 서열번호 60의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 61의 LCDR1, 서열번호 62의 LCDR2, 서열번호 63의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 항체를 제한 없이 의미할 수 있다. 다른 한가지 예로, 상기 항체는 미국등록특허 US 9,527,925 B2, 미국등록특허 US 8,268,314 B2 또는 미국공개특허 US 2019-0167790 A1에 개시된 항-VEGF 항체 또는 이의 단편을 사용할 수 있다.
상기 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편과 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 링커를 통해 결합된 것일 수 있다.
또한, 상기 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편과 면역글로불린 단편은 링커를 통해 결합된 것일 수 있다. 상기 링커는 두 개의 단백질을 연결시켜준다. 링커의 일 구체예로는 1개 내지 50개의 아미노산, 알부민 또는 이의 단편, 또는 면역글로불린의 Fc 도메인 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CH1)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM 일 수 있으며, 바람직하게는 IgG1 일 수 있다. 본 명세서에서 Fc 도메인은 힌지 영역을 제외한, CH2 및 CH3 도메인을 포함한 영역을 지칭할 수 있다.
또한, 상기 융합단백질은 하기 구조식 (I) 또는 (II)로 이루어진 것일 수 있다:
N'-X-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-Y-C' (I)
N'-Y-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-X-C' (II)
이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X는 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편이고,
상기 Y는 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질이며,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질, 상기 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편 및 Fc 도메인은 상술한 바와 같다. 상기 Fc 도메인은 면역글로불린 Fc 중쇄의 CH2 및 CH3 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(Glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거(Deglycosylate)된 형태일 수 있다. 또한 무당쇄(Aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(Sialic acid), 퓨코실화(Fucosylation), 당화(Glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄가 변경되거나, Fc 도메인간의 서열이 혼합된 Fc 도메인이거나, 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산이 결실, 변경, 치환 및/또는 부가된 것을 의미한다. 상기 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산의 결실, 변경, 치환 및/또는 부가는 당업자에게 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 Fc 도메인 변이체는 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열이 치환 및/또는 부가된 것일 수 있다.
상기 치환 및/또는 부가에 의해 도입되는 "아미노산"은 라이신(K), 알라닌(A), 알지닌(R), 아스파라진(N), 아스파르트산(D), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 글라이신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프로린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 타이로신(Y) 및 발린(V)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 Fc 도메인 변이는 항체의 활성 또는 기능을 조절하는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 Fc 도메인 변이는 항체의 이펙터 기능(effector function) 또는 항체 세포 독성(antibody cytotoxic activities)을 조절하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Fc 도메인 변이체는 DANG 변이 또는 NG 변이를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 IgG1 Fc 도메인에서 265번째 서열이 D에서 A로 치환된 것, 297번째 서열이 N에서 G로 치환된 것 또는 이의 조합일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Fc 도메인은 서열번호 6, 서열번호 11 및 서열번호 76으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Fc 도메인은 서열번호 28 또는 서열번호 33의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(1)은 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 20 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 펩타이드 링커(1)은 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 하나, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1)는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 한 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(1)이 서열번호 15 또는 17의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(2)는 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(2)는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수) 일 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예로, 상기 펩타이드 링커(2)가 서열번호 16 또는 18의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
바람직하게는, 상기 융합단백질은 구조식 (I)로 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 융합단백질은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 8 및 서열번호 10으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 융합단백질은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 8 및 서열번호 10으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이때, 동일성은, 예를 들어, 퍼센트 상동성, NCBI(National Center of Biotechnology Information)의 BlastN software과 같은 상동성 비교 소프트웨어를 통해 결정될 수 있다.
융합단백질 이량체
본 발명의 또 다른 측면은, CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 융합단백질 두 개가 결합된 이량체를 제공한다.
이때, 이량체를 구성하는 융합단백질 간의 결합은 링커 내에 존재하는 시스테인에 의해 이황화 결합에 의해 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이량체를 구성하는 융합단백질은 동일한 것일 수도 있으나, 서로 상이한 융합단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이량체는 동형이량체(Homodimer)인 것일 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은, CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 8, 또는 서열번호 10과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 30, 및 서열번호 32로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(Signal sequence) 또는 리더 서열(Leader sequence)을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용한 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 상기 신호서열은 ER(Endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열이다.
상기 신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(Signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(Lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(Tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(Signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(Growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 신호서열은 야생형 신호서열을 사용하거나, 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(Baculovirus) 등)이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 명세서에서 사용한 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(Bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
융합단백질을 발현하는 형질전환된 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 숙주세포로 발현벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(Dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(Electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 융합단백질의 치료제로서의 특성을 최적하거나 기타 다른 목적을 위해 호스트 세포가 갖고 있는 당화(Glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려져 있는 방법을 통해 조작하여 융합단백질의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
융합단백질 생산 방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계를 포함하는 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 이의 이량체를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 생산 방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 ii) 상기 배양물로부터 융합단백질 또는 이의 이량체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(Fed batch 또는 Repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
융합단백질 또는 이의 이량체의 용도
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 융합단백질 및 융합단백질 이량체는 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용한 용어, "안질환"은 눈을 발병 부위로 하는 질병을 총칭하는 것일 수 있다. 상기 안질환은 보체 활성 또는 혈관신생으로 인해 촉발 또는 악화되는 안질환 또는 과도한 혈관신생을 주요 병증으로 포함하는 안질환을 의미할 수 있다. 상기 안질환은 노화-관련 황반 변성(AMD), 지도모양 위축증(GA), 맥락막 혈관신생(CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 다른 허혈-관련 망막증, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐색(CRVO), 각막 혈관신생 및 망막 혈관신생으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 상술한 바와 같다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 안질환 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 그 유효성분은 안질환 치료 활성을 나타내거나, 특히, 황반 변성에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 본 명세서에서 사용한 용어 "유효량"이란 안질환의 상태 개선 또는 치료(Treatment) 효과, 특히 황반 변성의 상태 개선 또는 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환 또는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(Clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(Underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능"(예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 안질환 치료 또는 개선과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 치료학적으로 유효한 양은 안질환을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(Phosphate Buffered Saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ug/kg 내지 10 g/kg 범위, 또는 0.01 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본원의 약학 조성물은 유효성분 이외에, 안질환, 특히 황반 변성 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 안질환을 치료하기 위한 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 이의 이량체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 안질환 치료 또는 예방용 약제를 제조하기 위한 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 이의 이량체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 이의 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
상기 융합단백질, 이량체 및 안질환은 상술한 바와 같다. 이때, 상기 개체는 안질환을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 융합단백질 또는 융합단백질 이량체의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질 또는 융합단백질 이량체는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 융합단백질은 보체 경로, 식균 작용 및/또는 혈관신생을 저해할 수 있다. 따라서, 습성 또는 건성 황반 변성과 같은 안질환에 효과적으로 활용할 수 있다. 특히, CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 조합한 경우가, 하나를 포함한 경우보다 효과가 더 높고 시너지 효과 또한 존재하는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 융합단백질은 보체경로 및 혈관신생을 효과적으로 저해하여 건성 및 습성 황반 변성을 효과적으로 치료할 수 있다.
이하, 본원 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본원 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본원 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. CRIg를 포함하는 융합단백질의 제조
Code Format Description 해당서열
C1.01 Fc-fusion hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG 서열번호 1
C1.02 Fc-fusion hu CRIg-hu IgG1 Fc-VEGF binder 서열번호 2
C1.03 Fc-fusion hu IgG1 Fc DANG-hu CRIg 서열번호 3
C1.04 Fc-fusion VEGF binder-hu IgG1 Fc DANG-hu CRIg 서열번호 4
C1.05 Fc-fusion VEGF binder-hu IgG1 Fc DANG 서열번호 5
C1.06 Fc-fusion hu IgG1 Fc DANG 서열번호 6
C1.01m Fc-fusion mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG 서열번호 7
C1.02m Fc-fusion mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG-VEGF binder 서열번호 8
C1.03m Fc-fusion mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg 서열번호 9
C1.04m Fc-fusion VEGF binder-mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg 서열번호 10
C1.06m Fc-fusion mu IgG2a Fc DANG 서열번호 11
C1.07m Fc-fusion mu IgG2a Fc DANG-VEGF binder 서열번호 12
아필리버셉트
(Aflibercept)		 Fc-fusion 아필리버셉트(Aflibercept) 서열번호 13
C1.01(서열번호 1)은 사람 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 283), 링커 및 DANG 변이(D265A, N297G)를 통해 이펙터 기능(effector function)을 제거한 사람 IgG1 Fc로 구성된다.
C1.02(서열번호 2)는 사람 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 283), 링커 및 사람 IgG1 Fc DANG, 링커, 아필리버셉트(Aflibercept)의 VEGF 결합부위로 구성된다.C1.03(서열번호 3)은 사람 IgG1 Fc DANG, 링커 및 사람 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 283)으로 구성된다.
C1.04(서열번호 4)는 아필리버셉트의 VEGF 결합부위와 링커, 사람 IgG1 Fc DANG, 링커 및 사람 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 283)으로 구성된다.
C1.05(서열번호 5)는 아필리버셉트의 VEGF 결합부위, 링커 및 사람 IgG1 Fc DANG으로 구성된다.
C1.06(서열번호 6)은 사람 IgG1 Fc DANG으로 구성된다.
C1.01m(서열번호 7)은 마우스 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 187), 링커 및 DANG 변이(D265A, N297G)를 통해 이펙터 기능을 제거한 마우스 IgG2a Fc로 구성된다.
C1.02m(서열번호 8)은 마우스 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 187), 링커, 마우스 IgG2a Fc DANG, 링커, 및 아필리버셉트(Aflibercept)의 VEGF 결합 부위로 구성된다.
C1.03m(서열번호 9)은 마우스 IgG2a Fc DANG, 링커 및 마우스 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 187)으로 구성된다.
C1.04m(서열번호 10)은 아필리버셉트의 VEGF 결합 부위와 링커, 마우스 IgG2a Fc DANG, 링커 및 마우스 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 187)으로 구성된다.
C1.06m(서열번호 11)은 마우스 IgG2a Fc DANG으로 구성된다.
C1.07m(서열번호 12)은 마우스 IgG2a Fc DANG, 링커 및 아필리버셉트의 VEGF 결합 부위로 구성된다.
[서열번호 1] hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG
RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLP GGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[서열번호 2] hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG -VEGF binder
RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLP GGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGS SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK
[서열번호 3] hu IgG1 Fc DANG -hu CRIg
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGS RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPG
[서열번호 4] VEGF binder-hu IgG1 Fc DANG -hu CRIg
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK GGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGS RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPG
[서열번호 5] VEGF binder-hu IgG1 Fc DANG
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK GGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
[서열번호 6] hu IgG1 Fc DANG
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
[서열번호 7] mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG
HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLP GGGGS EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[서열번호 8] mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG -VEGF binder
HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLP GGGGS EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG GGGGSGGGGS SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK
[서열번호 9] mu IgG2a Fc DANG -mu CRIg
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG GGGGSGGGGS HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPG
[서열번호 10] VEGF binder-mu IgG2a Fc DANG -mu CRIg
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK GGGGS EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG GGGGSGGGGS HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPG
[서열번호 11] mu IgG2a Fc DANG
APNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[서열번호 12] mu IgG2a Fc DANG -VEGF binder
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG GGGGSGGGGS SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK
[서열번호 13] 아필리버셉트(Aflibercept)
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
제조예 2. 인간 단백질(C1.01 내지 C1.06, 및 아필리버셉트), 마우스 단백질(C1.03m 내지 C1.04m)의 제조
제조예 2.1. 벡터 구성과 플라스미드 맥시-프렙
하기 표 2 및 표 3은 사용한 시약 및 장비를 기재하였다.
시약 제조사 Catalog#
pTT5 chempartner
In-Fusion HD cloning kit Clontech 639648
Accuprime pfx DNA polymerase Invitrogen 12344-04
Gel DNA fragment purication Kit TaKaRa D823A
FastDigest® BamHI Fermentas FD0055
FastDigest® EcoRI Fermentas FD0275
장비 및 도구 제조사 모델명
생물 안전 작업대 NUAIRE LabGard class II
원심분리기 Eppendorf 5424
젤 이미징 시스템 Tanon 2500R
PCR을 통해 합성한 DNA 단편을 증폭시키고, PCR 생성물을 젤로 정제하였다. 제한효소 EcoRI와 BamHI로 pTT5 벡터를 자르고 난 후 젤을 정제하였다. In-Fusion Kit를 이용해 각각의 PCR 생성물과 선형 벡터를 연결하였다. 생성된 벡터를 ECOS101 DH5α competent cell에 형질전환 시키고, 100 μg/ml 엠피실린을 함유하는 2xYT 한천 판에 배양하였다. 모든 조작 과정은 표준 형질 전환 프로토콜을 따라 수행하였다. 콜로니 PCR로 양성 재조합체를 확인하고, 재조합 플라스미드를 sequence-verify sequencing를 수행하였다. 단일 콜로니를 선택하여 100 μg/ml 엠피실린을 함유하는 5 mL 2 x YT 배지에 종균을 접종하였다. 37℃에서 8시간 동안 흔들며 배양하였다.
이후, 종균을 1:1,000의 비율로 200 mL의 선택적 2 x YT 배지에 희석하였다. 37℃에서 16시간 동안 흔들면서 배양하였다. 4℃ 4,700 rpm에서 10분동안 원심 분리하여 박테리아 세포를 수확하였다. 12 mL의 RES-EF 용액에 박테리아 펠릿을 재부유시켰다. 그 후, 12 mL의 LYS-EF 용액을 첨가하고, 밀봉한 튜브를 힘차게 뒤집어 완전히 혼합한 뒤, 실온에서 5분간 배양하였다. 12 mL의 NEU-EF 용액을 용해물에 첨가하고, 힘차게 뒤집어 빠르게 완전히 혼합하였다.
NucleoBond® Xtra 컬럼 필터에 용해물을 주입하기 전, 필터의 막힘을 방지하기 위해 용해물 튜브를 3번 정도 뒤집어 침전물의 균질한 현탁을 제조하였다. 그 후, 10 mL의 필터 세척 용액 FIL-EF로 NucleoBond® Xtra 컬럼 필터와 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다. NucleoBond® Xtra 컬럼 필터를 빼내거나 컬럼을 거꾸로 뒤집어 제거하였다. 90 mL의 세척 용액 ENDO로 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다.
45 mL의 세척 용액 WASH-EF로 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다. 15 mL의 용출 용액 ELU로 플라스미드 DNA를 용출시켰다. 용출액은 50 mL 원심분리 튜브에 수집하였다. 10.5 mL의 상온 이소프로판올을 첨가하여 용출된 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 볼텍스 후, 혼합물을 2분간 그대로 방치하였다.
그 후, 5 mL의 70% 에탄올을 펠릿에 첨가하였다. 파이펫 팁을 이용해 튜브에서 에탄올을 조심스럽게 완전히 제거하였다. 펠릿을 상온(20-25℃)에서 건조시켰다. 그 후, DNA 펠릿을 1,000 μl의 H2O로 용해시켰다.
제조예 2.2. 세포 형질 주입과 단백질 발현
하기 표 4에 사용한 재료 및 시약 기재하였다.
재료 및 시약 제조사(Product #)
293F cells Invitrogen(R790-07)
OPM 293 OPM(81075-001)
Pluronic® F-68, 10%(100X) Gibco(24040-032)
1 mg/ml PEI Polyscience(23966)
OPTI MEM I Gibco(31985088)
Peptone(20x) FLUKA(P0521-1KG)
셰이커 플라스크
ISF1-X 배양기 셰이커 Kuhner shaker
완전 배지를 넣은 293F seed strain을 130 rpm, 37℃ 8% CO2의 배양기 셰이커에서 유지하였다. 세포를 0.3 내지 0.4x106 cells/ml의 밀도로 배양하고, 매 2 내지 3일마다 배지를 교환하였다. 형질 주입 24시간 전, 새로 계대 배양한 293F 세포를 2.6x106 cells/ml로 준비하였다. 준비한 세포는 130 rpm, 37℃ 8% CO2의 배양기 셰이커에서 배양하였다. 형질 주입 당일, 새로운 배지를 사용하여 5.0x106 cells/ml의 밀도로 세포를 조정하였다. 3 L 셰이커 플라스크에서 1 L의 총 부피로 수행하였다. 0.4 mg HC 및 0.6 mg LC 플라스미드를 50 ml OPTI MEM I으로 희석하고, 0.22 μm 필터로 여과하였다.
그 후, 2 mg PEI를 50 mL OPTI MEM I으로 희석하여 형질 주입 시약을 준비하였다.희석된 PEI를 DNA 혼합물에 첨가한 뒤, 즉시 혼합하였다. 이후 15분간 상온에서 배양하였다. 2.6x106 cells/ml로 준비한 293F 세포에 DNA-PEI 혼합물을 첨가하였다. 이후 세포는 130 rpm, 37℃ 8% CO2의 배양기 셰이커에서 24시간 동안 계속 배양하였다. 형질 주입 24시간 후, 최종 농도가 0.5%가 되도록 배양액의 1/20에 10% 펩톤을 첨가하였다. 이후 세포는 130 rpm, 37℃ 8% CO2의 배양기 셰이커에서 계속 배양하였다. 형질 주입 후 2 내지 5일 기간에 매일 세포 밀도/생존 능력을 측정하고 기록하였다. 형질 주입 7일 후 또는 세포 생존 능력이 70% 미만에서 정제를 위해 세포를 수확하였다.
제조예 2.3. 단백질 정제
하기 표 5 내지 표 7은 단백질 정제를 위해 사용한 시약, 각 용액의 구성 및 장비를 나타낸 것이다.
시약 제조사 Catalog#
Mabselect SuRe GE Healthcare 11003493
Tris SIGMA 77-86-1
NaCl ACROS ORGANIVS 7647-14-5
Sodium citrate Adamas-beta 76198B
Citric acid GENERAL-Reagent G83162B
Arginine VETEC V900343-500G
Succinic acid Sigma-Aldrich S9512-500G
Triton X-100 ABCONE X10010-1L
TRITON X-114 SIGMA-ALDRICH X114
Millex-GP Filter Unit 0.22 μm Sterile MILLIPORE SLGP033RS
NaOH Merck B146369740
용액 A 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0
용액 B 25 mM Tris, 150 mM NaCl,0.1% Triton X-100, 0.1% Triton X-114 pH 8.0
용액 C 100 mM Sodium Citrate, 150 mM NaCl, pH 3.0
용액 D 1 M Arginine, 400 mM Succinic acid, pH 9.0
용액 E 20 mM PB pH 6.5, 1 M(NH4)2SO4
용액 F 20 mM PB pH 6.5, 25% isopropyl alcohol
최종용액 20 mM HEPES, pH 7.5, 240 mM sucrose 또는 20mM his acetate pH 5.5, 240 mM sucrose
기기 제조사 모델명
AKTA Pure GE Healthcare 29-0182-24
원심분리기 Beckman J-26xp
젤 이미징 시스템 Tanon 2500R
Sartopore 2 filter Sartorius 5445307H9-OO-A
Mabselect sure 컬럼을 이용하여 단백질을 정제하였다. 구체적으로, 2,000xg, 4℃에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 수확하였다. 그 후, Sartopore 2 필터로 상층액을 여과하였다. 용액 A로 평형화된 5 ml MabSelect Sure 컬럼으로 정화된 상층액을 로딩하였다. 그 후, A280 흡광도가 기준치에 도달할 때까지 용액 A로 컬럼을 세척하였다. 10 CV 용액 B로 컬럼을 세척하였다. 10 CV 용액 A로 컬럼을 세척하였다. 6 CV 용액 C로 결합된 단백질을 용출하고, 1/6 부피의 용액 D를 넣어 용출한 물질을 중화하고, SDS-PAGE와 SEC-HPLC 분석을 진행하였다. 그 후, HIC 컬럼을 통한 단백질을 정제하였다.
그 후, 밤새 4℃에서 용액 E에 대해 단백질을 투석하였다. 용액 E로 평형화된 HIC 컬럼에 상층액을 로딩하였다. 그 후, A280 흡광도가 기준치에 도달할 때까지 용액 E로 컬럼을 세척하였다. 기울기 용리(10 CV 용액 F 0%-40%)로 결합된 단백질을 용출하였다. 2 CV 100% 용액 F로 결합된 단백질을 용출하고, SDS-PAGE 분석을 진행하였다.
단백질을 정제한 후 해당 단백질들을 한 군데로 모아준 후, 밤새 4℃에서 최종 용액에 대해 단백질을 투석하였다. 그 후, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 것과 같이, 정제된 C1.01, C1.02, C1.03, C1.04, C1.05, C1.06, C1.03m, C1.04m 및 아필리버셉트(Aflibercept)를 SDS-PAGE로 확인하였다.
제조예 3. 마우스 융합단백질(C1.01m, C1.02m, C1.06m 및 C1.07m)의 제조
제조예 3.1. 단백질의 제조
하기 표 8에 사용한 재료 및 시약을 나타내었다.
재료 및 시약 제조사 Cat. #
Expi293FTM Cells Gibco A14527
Expi293TM Expression System Kit Gibco A14635
MabSelect SuRe GE Lifesciences 17543803
Superdex 200 increase 10/300 GE Lifesciences 28990944
MPCTM Ceramic Hydroxyfluoroapatite Bio-rad 1570200
단백질 서열에 해당하는 DNA 단편을 Genewiz(No. 80-383034849)에서 합성하였다. 해당 DNA 단편을 PCR로 증폭시키고, 선형화된 pcDNA3.3 발현 벡터를 이용하여 투입하였다. 시퀀싱을 통해 구조를 검증한 뒤, 대규모의 플라스미드 제조과정으로 세포 형질 주입을 수행하기에 충분한 양의 DNA를 수득하였다.
먼저 2 L의 세포 배양 배지에서 95% 이상 생존한 2.94x106 cells/mL의 Expi293F 세포를 준비한다. 플라스미드 DNA와 ExpiFectamineTM 293 시약을 먼저 Opti-MEM에 희석한 다음 혼합하여 세포 배양 배지에 첨가하였다. 세포 배양은 150 rpm의 교반 속도로 platform shaker에서 진행하였다. 온도는 37℃ CO2 농도는 8%로 유지하였다. 형질 주입 후 18 내지 20시간이 지나면 인헨서 1과 인헨서 2를 세포 배양 배지에 첨가하였다.
세포 배양 6일 후, 세포를 4,000 rpm, 25℃에서 10분간 원심분리하였다. 정제 및 젤 전기 영동을 수행하기 위해 상층액을 수집하였다. 상층액은 NuPAGETM 4-12% Bis-Tris Protein Gels(ThermoFisher)에 관한 설명에 따라 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 단백질의 분자량 측정을 위하여 단백질 시료와 함께 PageRulerTM Unstained Protein Ladder(ThermoFisher)이 사용되었다. 각 단백질의 남은 상층액은 이후 진행되는 정제 과정에 사용되었다.
단백질 정제는 다음과 같은 공정으로 수행하였다. 구체적으로, 단백질 A 컬럼(Protein A 컬럼)은 MabSelect Sure resin과 사전에 포장되었다. 세포 배양액을 로딩하기 이전에, 컬럼은 0.1 M Tris, pH 7.0으로 평형화 시켰다. 세포 배양액 로딩 후, 컬럼을 0.1 M Tris, pH 7.0으로 세척한 다음 0.1 M glycine, pH 3.5을 이용해 용출하였다. 용출한 물질에 0.1 M Tris, pH 9.0을 첨가하여 중화하였다. 이어서 시료를 PBS 용액(Sangon Biotech, B548117-0500)에서 투석하였다.
시료를 로딩하기 이전에, SEC 컬럼(GE lifesciences, Superdex 200 increase 10/300)은 PBS로 평형화시켰다. 로딩 후, PBS로 시료를 용출하고 크로마토그래피를 통해 수집하였다. 각 피크를 분석하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. 각 시료는 제형 용액(10 mM Sodium phosphate, 0.3 내지 0.4 M NaCl, pH 6.8)에서 투석하였다.
CHT 컬럼은 CHT 레진(Bio-rad, MPCTM Ceramic Hydroxyfluoroapatite)과 사전에 포장되었고, 시료를 로딩하기 전 용액 A(10 mM Sodium phosphate, 30 mM NaCl, pH 6.8)으로 평형화시켰다. 로딩 후, 컬럼을 30% 용액 B(10 mM Sodium phosphate, 1 M NaCl, pH 6.8)로 용출시키고, 30% 내지 90%의 선형 구배 용액 B 및 최종 100% 용액 B로 용출하였다. 용출물은 SDS-PAGE로 특성화되었고, 시료는 제형 용액(10 mM Sodium phosphate, 0.3 내지 0.4 M NaCl, pH 6.8)에서 투석하였다. 최종 단백질은 0.2 μm 필터로 여과하고, 1.5 mL 튜브에 0.5 mL씩 무균 상태로 분주하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 것과 같이, 정제된 C1.01m, C1.02m, C1.06m 및 C1.07m를 SDS-PAGE로 확인하였다.
제조예 3.2. 단백질의 특성 분석
나노 드롭(Nano Drop)을 이용해 단백질의 농도를 280 nm에서 측정하였다. 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC로 확인하였다.
SDS-PAGE 시료는 15 μL의 정제된 단백질과 5 μL의 4x 로딩 버퍼를 혼합하고, 5 분간 끓여 제조하였다. 혼합된 시료의 15 μL를 NuPAGE Bis-Tris Mini Gels 4 내지 12% 겔에 로딩하였다. SEC-HPLC 분석을 진행하기 위해 80μL의 정제된 단백질을 HPLC system 1260 Infinity II의 TSKgel G3000SWxl 컬럼에 로딩하였고, pH 7.0, 50 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨을 실행 버퍼(running buffer)로 사용하였다.
제조예 4. 토끼, 랫트 C3, C3b의 정제
제조예 4.1. 토끼, 랫트 C3의 정제
하기 표 9 내지 표 11는 토끼, 랫트의 C3 정제를 위해 사용한 시약, 용액의 구성 및 장비를 나타낸 것이다.
재료 및 시약 제조사 Cat. #
NaCl ACROS ORGANIVS 7647-14-5
NaOH Merck B146369740
KH2PO4 GENERAL-Reagent 7778-77-0
NaH2PO4 GENERAL-Reagent 7558-80-7
EDTA GENERAL-Reagent 60-00-4
Benzamidine Adamas 618-39-3
PBS Gibco C10010500BT
MgCl2 GENERAL-Reagent 7786-30-3
Factor B Complement Technology A135
Factor D Complement Technology A136
DEAE 컬럼
용액 A 10 mM Potassium phosphate(KH2PO4), 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt(EDTA), 1 mM benzamidine, pH 7.8
용액 B 10 mM Potassium phosphate(KH2PO4), 5 mM EDTA, 1 mM benzamidine, 1 M sodium chloride(NaCl), pH 7.8
MonoS 컬럼
용액A 50 mM Sodium phosphate(NaH2PO4)
용액B 50 mM Sodium phosphate(NaH2PO4), 1 M sodium chloride(NaCl), pH 5.5
S200 컬럼
용액 Phosphate-buffered saline(PBS), pH 7.4
기기 제조사 모델명
AKTA Pure GE Healthcare 29-0182-24
원심분리기 Beckman J-26xp
젤 이미징 시스템 Tanon 2500R
Millex-GP Filter Unit 0.22 μm Sterile MILLIPORE SLGP033RS
DEAE 16/10 FF GE Healthcare 10294207
Mono S 5/50 GL GE Healthcare 10298955
Sephadex S200 GE Healthcare 17104-302
HPLC Waters E2695
단백질 정제에 앞서 혈장의 고분자량의 물질을 제거하기 위한 단계를 수행하였다. 혈장의 부피를 측정한 뒤, 분말 염 결정의 10%(무게/부피비) Na2SO4(무수의)를 교반하면서 단백질 용액에 천천히 첨가하였다. 이후 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. Sorvall Ultracentrifuge를 이용하여 26,892xg, 4℃, 30분간 원심분리한 뒤, 상층액을 얻어 부피를 측정하였다. 얻은 상층액을 5 L DEAE 용액 A로 투석하고, 2시간 뒤 새로운 5 L의 용액으로 교환하였다. 최상의 결과를 얻기 위해, 4℃에서 밤새 투석하였다. 투석이 완료되었는지 확인하기 위해 투석액의 부피, A280, 전도도를 확인하였다. 용액이 탁하거나 침전된 경우, 4,000xg, 4℃에서 15분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 투석액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하고, 정제를 진행하기 전까지 얼음에 보관하였다.
단백질 정제는 음이온 교환 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배재 크로마토그래피 순으로 수행하였다. 투석액을 로딩하기 전 DEAE 컬럼(GE healthcare, HiPrepTM DEAE Fast Flow 16/10)은 용액 A(10 mM KH2PO4, 5 mM EDTA, 1 mM benzamidine, pH 7.8)로 평형화시켰다. 로딩 후, 컬럼을 용액 A로 세척하고, 0 내지 50%의 선형 구배 용액 B(10 mM KH2PO4, 5 mM EDTA, 1 mM benzamidine, 1 M NaCl, pH 7.8)로 용출하였다. SDS-PAGE를 통해 용출물의 구획을 분석하고, C3를 포함한 구획을 모아 A280을 확인하였다. 획득한 용출물은 2L Mono S 용액 A(50 mM Sodium phosphate)에서 4℃ 2시간 동안 투석하였다.
Mono S 컬럼(GE healthcare, Mono S® 5/50 GL)은 투석액을 로딩하기 전 용액 A(50 mM Sodium phosphate)로 평형화시켰다. DEAE 용출액 로딩 후, 컬럼을 용액 A로 세척하고, 0 내지 35%의 선형 구배 용액 B(50 mM Sodium phosphate, 1 M NaCl, pH 5.5)로 용출하였다. SDS-PAGE를 통해 용출물의 구획을 분석하고, 중앙에 위치한 피크 구획을 모아 A280을 확인하였다.
시료를 로딩하기 이전에, SEC 컬럼(GE lifesciences, Superdex 200 increase 10/300)은 PBS로 평형화시켰다. 로딩 후, PBS로 시료를 용출하고 크로마토그래피를 통해 수집하였다. 각 피크를 분석하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. 중앙에 위치한 peak C3 구획들을 모아 A280을 확인하였다.
제조예 4.2. 토끼, 랫트 C3b의 정제
C3를 0.5 mg/mL의 PBS로 희석하여 준비하였다. C3에 0.4 μM factor B, 0.05 μM factor D와 5 mM MgCl2를 첨가하고 25℃에서 30분간 배양하여 C3b로 변환시켰다. C3b는 Superdex 200(60 mL)젤 여과 컬럼을 통해 추가 정제되었다. 다음으로, 토끼 C3, 토끼 C3b, 랫트 C3 및 랫트 C3b의 SDS-PAGE와 SEC-HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 것과 같이, 토끼 C3, 토끼 C3b, 랫트 C3 및 랫트 C3b를 정제하였음을 확인하였다.
실험예 1. 융합단백질의 결합력 확인
실험예 1.1. 비아코어 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석 기법
융합단백질의 결합력을 확인하기 위하여, Biacore 8K(GE Healthcare, 29129951) 기기를 사용하여 제조한 융합단백질의 물성을 분석하였다.
하기 표 12는 사용한 재료 및 시약을 나타낸 것이다.
시약 제조사 Cat #
CM5 sensor chip GE Healthcare 29-1496-03
HBS-EP+ buffer(10 Υ) GE Healthcare BR-1006-69
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1006-33
Human antibody Capture Kit GE Healthcare 29234600
10 mM Glycine 1.5 GE Healthcare BR-1003-54
C3b, C2 및 C4 Complement Technology A114, A112 및 A105
실험예 1.2. CM5 센서 칩에 항 인간 면역글로불린 G(Fc) 항체 고정
100 mL 10x HBS-EP+ 완충액과 900 mL Milli-Q 물을 섞어 1 L 1x HBS-EP+ 완충액을 준비하였다. 420초 동안 50 mM NHS와 200 mM EDC를 1:1 비율로 섞은 후 10 uL/min의 유속으로 CM5 칩을 활성화시켰다. 10,000 RU 정도의 고정 레벨을 도달하기 위해 10 uL/ml의 속도로 400초 동안 25 ug/mL의 항 인간 면역글로불린 G(Fc) 항체(pH 5.0 아세테이트)를 주입시켰다. 남겨진 활성화된 에스테르 그룹들은 10 uL/min의 속도로 420초 동안 1 M 에타놀아민(pH 8.5)을 주입시켜 블로킹시켰다. 기초선을 안정시키기 위해 센서칩을 1xHBS-EP+를 사용하여 10 uL/분의 속도로 16시간 동안 세척하였다.
실험예 1.3. 결합 역동학 측정
기초선 안정화를 위해 샘플 스텝과 재생 스텝으로 이루어진 스타트업 사이클을 3번 수행하였다. 샘플 스텝: 1x HBS-EP+ 완충액을 flow cell에 30 uL/min의 유속으로 120초 동안 주입한후 120초 동안의 분열 단계와 30초 동안의 안정 단계를 거쳤다. 재생 스텝: 30초 동안 30 uL/min의 속도로 10 mM 글리신 pH 1.5가 flow cell에 주입된 후, 30초의 안정화 단계를 가졌다.
그 후, 다음과 같은 방식대로 결합 역동학 측정을 수행하였다:
C3b stock solution은 1x HBS-EP+ 완충액을 사용하여 50 nM로 희석하였다. 인간 VEGF165는 1x HBS-EP+ 완충액을 사용하여 5 nM로 희석하였다. 그후 50 nM 및 5 nM 용액들은 0.78125 nM 및 0.078125 nM로 희석시켰다. 샘플 스텝에서 희석된 항원들은 flow cell에 30 uL/min의 속도로 주입하였다. 2개의 0 nM 항원(1x HBS-EP+ 완충액)을 사용하여 Reference signal에서 제거하였다. 180초 동안 결합시키고, 400초 동안 분리시켰다. 분리 시간 후 60초 동안의 안정화 단계를 수행하였다. 재생 스텝으로는 flow cells에 30 uL/min의 속도로 30초 동안 10 mM의 pH 1.5 글리신(Glycine)을 주입한 후 60초 동안의 안정화 단계를 가졌다.
실험예 1.4. 분석 및 결과
샘플 값에서 reference와 0 nM 값을 뺀 후 Biacore Insight Evaluation Software(Version 2.0.15.12933)와 1:1 결합 모델 곡선 맞춤(binding model for curved fitting)을 이용하여 결합 역동학을 계산하였다.
하기 표 13은 테스트 물질들의 결합 친화도를 나타낸 것이다.
Capture 1 Solution Analyte 1 Solution ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
0.5 ug/ml C1.01 C3b 3.47E+06 1.21E-02 3.47E-09
2 ug/ml C1.02 C3b 3.66E+06 1.59E-02 4.34E-09
2 ug/ml C1.02 human VEGF165 3.94E+06 2.47E-04 6.28E-11
인간 C3b 및 인간 VEGF165에 대한 C1.01 및 C1.02의 결합 친화도 및 마우스 C3b 및 인간 VEGF165에 대한 C1.01m 및 C1.02m의 결합 친화도를 비아코어 분석(biacore analysis)을 통해 확인하였다.
그 결과, 표 13, 도 6 및 도 7에 나타낸 것과 같이, 인간 및 마우스의 C1.01 및 C1.02이 모두 C3b와 높은 결합력을 가지며, 인간 및 마우스 C1.02가 인간 VEGF165와 높은 결합력을 가지는 것을 확인하였다.
실험예 2. 효소면역분석법(ELISA)을 통한 융합단백질의 보체 단백질 및 VEGF와의 결합 친화도 확인
일 구체예의 융합단백질 이량체의 보체 경로 저해 여부를 확인하기 위하여, 효소면역분석법을 통해 C1.01, C1.02, C1.03, C1.04, C1.01m 내지 C1.03m의 C3b 단백질의 결합 여부를 확인하였다.
구체적으로, 인간 C3b 단백질을 플레이트에 고정하고 C1.01, C1.02, C1.03, C1.04, 및 대조군으로써 hIgG1을 결합시켰다. 다음으로, 항-인간 면역글로불린 G 항체 및 항 겨자무과산화효소(HRP) 항체를 순차적으로 결합시켰다. 더불어, 마우스 C3b 단백질을 플레이트에 고정하고 마우스 CRIg을 가지고 있는 C1.01m 내지 C1.03m을 마우스 C3b에 결합시켰다.
그 결과, 도 8a에 나타낸 것과 같이, CRIg을 포함하는 C1.01, C1.02, C1.03 및 C1.04가 농도 의존적인 방법(Concentration dependent manner)으로 인간 C3b에 결합함을 확인하였다. 또한, 도 8c에 나타낸 것과 같이, 마우스 CRIg을 포함하는 C1.01m 내지 C1.03m도 농도 의존적으로 마우스 C3b에 결합함을 확인하였다.
일 구체예의 융합단백질의 항-VEGF 작용 여부를 확인하기 위하여, 효소면역분석법을 통해 융합단백질 및 인간 VEGF165 단백질의 결합 여부를 인간 VEGF165에 대한 아필리버셉트, C1.02, C1.04 및 C1.05의 결합 친화도를 ELISA를 통해 확인하였다.
구체적으로, 인간 VEGF165 단백질을 플레이트에 고정하고 C1.02, C1.04, C1.05, 대조군으로써 아필리버셉트(Aflibercept) 및 hIgG1을 결합시켰다. 다음으로 항 인간 면역글로불린 G 항체와 항 겨자무과산화효소(HRP) 항체를 순차적으로 결합시켰다.
그 결과, 도 8b에 나타낸 것과 같이, 효소면역분석법 확인 결과 항-VEGF를 가지고 있는 아필리버셉트(Aflibercept), C1.02, C1.04, 및 C1.05가 농도 의존적으로 인간 VEGF165에 결합함을 확인하였다.
일 실시예의 융합단백질이 대체 경로의 C3b와 결합하여 대체 경로를 저해하면서도, 고전 경로의 인간 C2 또는 C4 단백질과는 결합하지 않아 고전 경로를 저해하지 않음을 확인하기 위하여, 효소면역분석법을 통해 일 구체예의 융합단백질 C1.01 및 인간 Cb3, C2 및 C4 단백질의 결합 여부를 확인하였다.
구체적으로, 인간 Cb3, C2 또는 C4 단백질을 플레이트에 고정하고 C1.02를 결합시켰다. 다음으로, 항 인간 면역글로불린 G 항체 및 항 겨자무과산화효소(HRP) 항체를 순차적으로 결합시켰다.
그 결과, 도 8d에 나타낸 것과 같이, C1.02는 C3b에 결합하면서도, C2 및 C4에 결합하지 않는 것을 확인하였다.
실험예 3. 동적 광 산란(DLS) 분석
VEGF 바인더의 포함 여부에 따른 융합단백질의 유체학적 반경(hydrodynamic radius)을 확인하기 위하여, C1.01 및 C1.02의 유체학적 반경을 동적 광 산란법으로 분석하였다.
구체적으로, C1.01 및 C1.02를 10분 동안 12,000xg로 원심분리하고, 상층액을 96-well plate에 추가한 후, DLS 분석 장비인 Zetasizer APS(Marlvern)으로 25℃에서 측정하였다.
하기 표 14은 C1.01 및 C1.02의 유체학적 반경을 나타낸 표이다.
C1.01 C1.02
Z-Average(r.nm) Test1 5.828 8.603
Test2 6.058 8.686
Test3 6.078 8.596
Mean 5.988 8.628
그 결과, 표 14, 도 9a 및 9b에 나타낸 것과 같이, VEGF 바인더를 포함하는 C1.02의 유체학적 반경이 포함하지 않는 C1.01에 비해 길게 측정되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 4. C1.02의 점도 측정
C1.02 점도를 농도별로 측정하기 위하여, 마이크로 점도 측정 장비(m-VROC, RheoSence)와 vROC-mB05(RheoSence) chip을 사용하여 33, 65 및 130 mg/ml의 C1.02의 점도를 측정하였다. 더불어, 대조군으로서 사람 혈청 알부민 134 mg/ml의 점도도 측정하였다.
하기 표 15는 측정된 점도를 나타낸 것이다.
시료(농도)
C1.02
(0 mg/ml)		 C1.02
(33 mg/ml)		 C1.02
(65 mg/ml)		 C1.02
(130 mg/ml)		 사람 혈청 알부민
(134 mg/ml)
점도 (cP, mPa-s) 1.235 1.851 3.327 13.912 2.194
그 결과, 표 15 및 도 10에 나타낸 것과 같이, C1.02의 농도가 증가함에 따라 점도가 증가함을 확인하였다.
실험예 5. 용혈 분석을 통한 대체 보체 경로 억제 효과 분석
하기 표 16은 사용한 시약을 나타낸 표이다.
Reagent Vendor
C1q-depleted serum Comptech
Rabbit RBC Yuduo biolody
Gelatin Veronal Buffer(5 mM Barbital) Boston bioproducts
Assay plate Corning
일 구체예의 융합 단백질이 대체 보체 경로를 억제함을 확인하기 위하여, C1.01, C1.02, C1.04, C1.01m, C1.02m 및 C1.04m의 용혈 분석(AH50)을 수행하였다.구체적으로, 토끼 적혈구 3 mL을 TBS로 10분 동안 400xg에서 원심분리기를 사용하여 세척하고, 이 과정을 2번 반복한 후, 토끼 적혈구를 GVB EGTA 완충액으로 10분 동안 400xg에서 원심분리기를 사용하여 다시 한번 세척하였다. 다음으로, 토끼 적혈구의 농도를 GVB EGTA 완충액을 사용하여 1x109 cells/mL로 조정하였다.
민감화된 적혈구를 통해 AH50을 분석하기 위하여, 9% 인간 C1q-결핍 혈청을 96-well plate에 추가하였다(50 uL/well). 또한, 여러 농도의 C1.01, C1.02, C1.01m, 및 C1.02m을 처리하였다. 4℃에서 30분 동안 배양한 후 토끼 적혈구를 추가하였다(2x106/well, 50 uL/well). 37℃에서 1.5시간 동안 배양하고 10분 동안 600xg에서 원심분리하였다. 상층액 110 uL를 수집 후 OD415 값을 측정하였다.
C1.01, C1.02, C1.04, C1.01m, C1.02m 및 C1.04m의 대체 보체 경로 억제 효과를 AH50 용혈 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, 표 16, 도 11a 내지 도 11c에 나타낸 것과 같이, C1.01, C1.02, C1.04, C1.01m, C1.02m 및 C1.04m이 농도 의존적으로 대체 보체 경로에 의한 용혈작용을 억제시키는 것을 확인하였다.
실험예 6. 용혈 분석을 통한 고전적 보체 경로 억제 효과 분석
하기 표 17은 사용한 시약을 나타낸 표이다.
Reagent 제조사
Factor B-Dpl serum Comptech
Sheep RBC Yuduo biolody
Hemolysin Yuduo biolody
Gelatin Veronal Buffer(GVB; 5 mM Barbital) Boston bioproducts
Assay plate Corning
일 구체예의 융합단백질 이량체가 고전 보체 경로를 억제하지 않음을 확인하기 위하여, C1.01, C1.02, C1.04, C1.05, C1.06, C1.01m, C1.02m, C1.04m, C1.06m, 및 C1.07m의 용혈 분석(CH50)을 수행하였다.
구체적으로, 양의 적혈구를 TBS에 10분 동안 400xg로 원심분리하고, 이 과정을 2번 반복한 뒤, 30분 동안 4℃에서 1 mL 20% 양 적혈구와 용혈소를 배양하였다. 다음으로, 10분 동안 400xg에서 원심분리기를 사용하여 양 적혈구를 TBS로 세척하였고, 이 과정을 2번 반복한 뒤, 10분 동안 400xg에서 원심분리기를 사용하여 양 적혈구를 GVB++ 완충액으로 세척하였다. 다음으로, GVB++ 완충액을 사용하여 민감해진 양 적혈구를 1x109/mL의 농도로 조정하였다.
민감화된 적혈구를 통해 CH50을 분석하기 위하여, 3% 또는 4.5% 인간 Factor B-결핍 혈청(factor-B depleted serum)을 96-well plate에 추가한 후(50 μL/well), 여러 농도의 C1.01, C1.02, C1.06, C1.01m, C1.02m, C1.06m, 및 C1.07m을 처리하였다. 4℃에서 30분 동안 배양한 후, 민감해진 양 적혈구를 추가하였다(2.5x106/well, 50 uL/well). 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 10분 동안 600xg에서 원심분리하여 상층액 110 uL를 수집한 후, OD415 값을 측정하였다.
그 결과, 표 16, 도 12a 내지 12c에 나타낸 것과 같이, C1.01, C1.02, C1.04, C1.05, C1.06, C1.01m, C1.02m, C1.04m, C1.06m, 및 C1.07m 모두 고전적 보체 경로에 의한 용혈작용을 억제시키지 않음을 확인하였다.
실험예 7. VEGF 리포터 세포를 이용한 융합단백질의 효능 분석
일 구체예의 융합단백질이 VEGF 단백질을 효과적으로 저해하는지 확인하기 위하여, VEGF 및 VEGF 수용체와의 결합 저해 여부를 확인하였다.
아필리버셉트, C1.01, C1.02, C1.05 및 C1.06의 VEGF 신호전달 저해 효과를 리포터 세포를 사용하여 확인하였다. 구체적으로, VEGF가 결합하면 수용체-매개 신호전달(receptor-mediated signaling)에 의해 발광 빛이 생성되는 VEGF 리포터 세포(GA3001, Promega, USA)를 이용하여 아필리버셉트, C1.02 및 C1.05가 VEGF 및 VEGF 수용체와의 결합을 저해하는지를 발광(luminescence) 정도로 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 것과 같이, 아필리버셉트, C1.02 및 C1.05가 농도 의존적으로 VEGF에 의한 수용체-매개 신호전달을 저해시킴을 확인하였다.
실험예 8. 융합단백질에 의한 상처 치유 분석 평가
일 구체예의 융합단백질 이량체가 VEGF 단백질을 효과적으로 저해하는지 확인하기 위하여 융합단백질 이량체의 상처 치유 능력 저해 효과를 통해 확인하였다.
구체적으로, C1.01, C1.02, 및 C1.05의 VEGF 신호전달경로 저해 효과를 세포 기반 상처 치유 분석법을 통해 확인하였다. 평가를 위해 ARPE-19(Adult Retinal Pigment Epithelial cell line-19)를 사용하였다. ARPE-19 세포들은 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)/F12 배지에 10% Fetal Bovine Serum(FBS)를 사용하여 배양하였다. ARPE-19 세포들(80,000 cells/well)을 24-well plate에 하루동안(overnight) 배양하였다. 다음날 각 well에 고르게 상처를 낸 후 배양액에 VEGF(6 ng/ml) 및 C1.01, C1.02, 및 C1.05(35 nM)을 넣어준 후 24시간 뒤에 각 융합단백질들의 상처 치유 저해 능력을 분석하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 것과 같이, C1.02는 대조군 대비 유의미하게 상처 치유를 저해시켰고(p=0.0031), 이러한 효과는 C1.01(p=0.0146) 및 C1.05(p=0.0482)에 비해 현저하였음을 확인하였다.
실험예 9. 종류 교차 반응성(species cross reactivity) 시험
일 구체예의 융합단백질 이량체의 종류 교차 반응성을 확인하기 위하여, 효소면역분석법을 통해 C1.02가 다른 종 유래의 C3b와 VEGF에 결합하는지를 확인하였다.
C1.02에 대한 인간 및 게잡이원숭이의 C3b의 결합능; 및 C1.06에 대한 인간 및 게잡이원숭이의 C3b의 결합능; 및 C1.02에 대한 인간, 게잡이원숭이, 랫트 및 토끼 VEGF의 결합능; 및 C1.01에 대한 인간, 게잡이원숭이, 랫트 및 토끼 VEGF의 결합능을 ELISA를 통해 확인하였다. 구체적으로, 인간 및 게잡이원숭이, 랫트 또는 토끼의 C3b 또는 VEGF를 플레이트에 고정하고, C1.01, C1.02 또는 C1.06를 결합시켰다. 다음으로, 항 인간 면역글로불린 G 항체 및 항 겨자무과산화효소(HRP) 항체를 순차적으로 결합시켰다.
그 결과, 도 15a 내지 15c에 나타낸 것과 같이, C1.02는 게잡이원숭이, 토끼, 및 랫트 C3b와 VEGF에 결합하여 종류 교차 반응성이 있음을 확인하였다.
실험예 10. 습성 황반 변성 마우스 동물 모델을 활용한 효능 평가
일 구체예의 융합단백질의 습성 황반 변성(Wet Age-related Macular Degeneration) 치료 효과를 확인하기 위하여, 마우스 동물 모델에 맥락막 혈관신생(Choroidal neovascularization)을 유도한 후, 안구 내에 일 실시예의 융합단백질 이량체를 직접 주입하여 효과를 확인하였다.
마우스에 맥락막 혈관신생 표현형을 유도하기 위하여, 유도 전 스펙트럼 영역광간섭단층촬영기(Envisu R2200 SD-OCT System; Bioptigen, Inc., USA)를 통해 마우스에 구조적 이상이 있는지 확인하였다.
다음으로, 마우스 오른쪽 눈에 다이오드 레이저(OcuLight TX - Green 532nm Laser; Iridex Corporate, USA)를 사용하여 부르크막을 관통시켜 3개의 맥락막 혈관신생을 유도하였다(Day 0). 맥락막 혈관신생 유도 후, 스펙트럼 영역광간섭단층촬영기와 형광안저혈관조영술(HRA2 FA system; Heidelberg Engineering GmbH, Germany)을 사용하여 모델이 정상적으로 유발되었는지 확인하였다.
유도 후 즉시 C1.02m(350 μM; 48.3 ㎍/㎕, 2 ㎕), 아필리버셉트 (Eylea; 350 μM; 40.0 ㎍/㎕, 2 ㎕) 또는 vehicle control(2 ㎕)을 안구내 주사(Intravitreal injection)를 통해 주입하였다. 맥락막 혈관신생 유도 직후(Day 0)와 유도 후 7일 후(Day 7)에 스펙트럼 영역광간섭단층촬영기와 형광안저혈관조영촬영기를 사용하여 생체 내 촬영을 하였다. 형광안저혈관조영촬영기 사진에서 각 맥락막 혈관신생 당 혈관 누출(vascular leak)이 있다면 1점, 없다면 0점을 주어 점수를 매긴 후 병변 확률을 계산하였다. 예를 들어, 100% 표기는 세 군데의 맥락막 혈관신생에서 혈관 누출이 관찰됨을 의미한다.
그 결과, 도 16a 내지 도 16c에 나타낸 것과 같이, 투여 7일 후 C1.02m 군은 아필리버셉트 군과 비슷한 보호 효과를 가지며, vehicle 군 대비 유의미한 보호 효과가 있는 것을 확인하였다.
실험예 11. 습성 황반 변성 토끼 동물 모델을 활용한 효능 평가
일 구체예의 융합단백질의 습성 황반 변성(Wet Age-related Macular Degeneration) 치료 효과를 확인하기 위하여, 토끼 동물 모델에 맥락막 혈관신생(Choroidal neovascularization)를 유도한 후, 안구 내 일 구체예의 융합단백질을 직접 주입하여 효과를 확인하였다.
6개의 맥락맥 혈관신생을 유도하였다는 것 이외에는 상기 실험예 10에서 전술한 방법과 유사한 방법으로 토끼에 맥락막 혈관신생을 유도하여 습성 황반 변성 토끼 모델을 제조하였다. 맥락막 혈관신생 유도 후 즉시 C1.01(350 μM; 38.45 ㎍/㎕, 50 ㎕), 아필리버셉트(Aflibercept)(350 μM; 40 ㎍/㎕, 50 ㎕), 또는 vehicle control(50 ㎕)을 안구내 주사를 통해 주입하였다. 맥락막 혈관신생 유도 직후(Day 0)와 유도 후 7일 후(Day 7) 및 14일 후(Day 14) 형광안저혈관조영촬영기를 사용하여 생체 내 촬영을 하였다. 맥락막 혈관신생에서 형광강도를 측정하여 혈관 누출(vascular leak)을 측정하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 것과 같이, 투여 7일 후 C1.01 군은 아필리버셉트 군과 비슷한 보호 효과를 가지며, vehicle 군 대비 유의미한 보호 효과가 있는 것을 확인하였다.
실험예 12. 습성 황반 변성 랫트 동물 모델을 활용한 효능 평가
일 구체예의 융합단백질의 습성 황반 변성 치료 효과를 확인하기 위하여, 랫트 동물 모델에 맥락막 혈관신생을 유도한 후, 안구 내 일 구체예의 융합단백질을 직접 주입하여 효과를 확인하였다.
4개의 맥락맥 혈관신생을 유도하였다는 것 이외에는 상기 실험예 10에서 전술한 방법과 유사한 방법으로 랫트에 맥락막 혈관신생을 유도하여 습성 황반 변성 랫트 모델을 제조하였다. 맥락막 혈관신생 유도 후 즉시 C1.02(350 μM; 54.93 ㎍/㎕, 5 ㎕), 아필리버셉트(350 μM; 40 ㎍/㎕, 5 ㎕) 또는 vehicle control(5 ㎕)을 안구내 주사를 통해 주입한 후 Day 0 및 Day 10에 형광안저혈관조영촬영기와 스펙트럼 영역광간섭단층촬영기를 사용하여 생체 내 촬영을 하였다. 촬영을 통해 유도 직후와 유도 10일 후의 맥락막 혈관신생 유무 및 혈관 누출(vascular leak) 넓이를 정량화하여 나타내었다.
그 결과, 도 18a 및 18b에 나타낸 것과 같이, 투여 10일 후 C1.02 군은 맥락막 혈관신생 숫자 및 혈관 누출 넓이를 유의미하게 감소시켜 아필리버셉트 군과 비슷한 보호 효과를 가지며, vehicle 군 대비 유의미한 보호 효과가 있는 것을 확인하였다.
실험예 13. 건성 황반 변성 마우스 동물 모델을 활용한 효능 평가
일 구체예의 융합단백질의 건성 황반 변성(Dry Age-related Macular Degeneration) 치료 효과를 확인하기 위하여, 마우스 동물 모델에 건성 황반 변성을 유도한 후, 안구 내 일 구체예의 융합단백질을 직접 주입하여 효과를 확인하였다.
먼저, 8주 차 C57BL/6 마우스에 꼬리 정맥주사를 통해 20 mg/kg 아이오딘산 나트륨(NaIO3)을 투여하여 건성 황반 변성 마우스 동물 모델을 유도하였다.
모델 유도 후, C1.02m(260 μM; 36.1 ㎍/㎕, 1.5 ㎕) 또는 vehicle control(1.5 ㎕)을 안구 내 주사를 통해 Day 0 및 Day 7에 투여하였다. 모델 유도 후 2주 뒤 시험 동물들을 안락사시킨 후 안구 적출하여 Davidson 용액에 24시간 동안 4℃에서 고정시켰다. 다음으로, 고정시킨 샘플을 30% 수크로스 용액에 3일 동안 4℃에서 보관하였다. 샘플들을 OCT compound(Cat #4583, Sakura)에 얼린 후 20 ㎛ 두께로 절단하였다. 절단된 조직들은 면역형광법을 사용하여 C3(Cat #MA1-40046, Thermofisher) 단백질을, DAPI(Cat #H-1200, Vector Laboratories) 염색법을 통해 외 과립층(Outer nuclear layer, ONL)을 염색하였다. 염색된 샘플들은 공초점 현미경(LSM700; Zeiss, Germany)을 사용하여 분석하였다. 구체적으로, 건성 황반 변성 모델의 각 실험군의 외과립층(ONL), 외과립층 세포 수, 외과립층 넓이 및 망막에서의 C3 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 19a 내지 도 19f에 나타낸 것과 같이, 외과립층의 세포 수 및 넓이를 측정하였을 때 vehicle 군에 비해 C1.02m 군에서 유의미하게 망막의 퇴화를 억제시키는 것을 확인하였다. 또한 Non-AMD 군에 비해 vehicle 군에서 C3 발현이 유의미하게 상승한 것을 확인하였고, C1.02m 군에서는 C3 발현이 유의미하게 감소한 것을 확인하였다.
실험예 14. C1.02의 약력학 프로파일 분석
일 구체예의 융합단백질 이량체의 약력학 프로파일을 분석하기 위하여, 15 마리의 뉴질랜드 흰토끼들을 그룹당 세 마리씩 5개의 그룹(G01 내지 G05)으로 나누었다. 그룹을 나눈 후, 2,500 ㎍ C1.02(50 ㎕/eye)를 안구 내 주사를 통해 투여하였다.
약력학 프로파일을 분석하기 위한 샘플을 채취하기 위하여, 먼저 각 시간별로 토끼에서 0.5 ㎖의 혈액을 정맥에서 채취하였다. 채취한 혈액 샘플에서 혈장을 분리한 후, -60℃에서 냉동 보관하였다. 또한 각 시간별로 유리체액(0.2 ㎖) 및 안방수(0.2 ㎖)를 채취 후 -60℃에서 냉동 보관하였다.
하기 표 18은 수집된 토끼 샘플을 토끼 그룹, 개체별, 수득 시간별로 나타낸 것이다.
Group Animal Number Dose Route Sample and Tissue Collection Time Points(Days)
1 hr 24 hr 3 days 7 days 14 days
G01 RB1001, RB1002, RB1003 Intravitreal injection Vitreous humor, Aqueous humor, Plasma
G02 RB2001, RB2002, RB2003 Vitreous humor, Aqueous humor, Plasma
G03 RB3001, RB3002, RB3003 Vitreous humor, Aqueous humor, Plasma
G04 RB4001, RB4002, RB4003 Vitreous humor, Aqueous humor, Plasma
G05 RB5001, RB5002, RB5003 Vitreous humor, Aqueous humor, Plasma
효소면역분석법(ELISA)을 사용하여 혈장, 유리체액 및 안방수에서 C1.02의 농도를 측정하였다. 측정된 값들로 non-compartmental pharmacokinetic 분석을 수행하여 약물동태 파라미터들을 구하였다. 하기 표 19는 non-compartmental pharmacokinetic 분석으로 구한 약물동태 파라미터를 나타낸 것이다.
Matrix Aqueous humor Vitreous humor
PK parameters Mean Mean
Cmax(ng/mL) 103705 3204272
Tmax(h) 1.00 1.00
T1/2(h) 114 226
Tlast(h) 168 336
AUC0-last(ng.h/mL) 10206790 545028800
하기 표 20는 토끼에서 안구내 주사를 통한 2,500 ㎍의 C1.02 투여 후의 유리체액 내에서의 농도를 나타낸 그래프이다; RB#은 동물 번호, BQL은 below the quantifiable limit 및 ND는 not determined를 의미한다.
Time(h) RBn001* RBn002 RBn003 Mean SD CV(%)
n=1 1 2789070 3594376 3229369 3204272 403239 12.6
n=2 24 1561470 1336610 2160474 1686185 425856 25.3
n=3 72 1638252 2031203 2506814 2058756 434936 21.1
n=4 168 1659880 1767054 1783308 1736747 67064 3.86
n=5 336 1206629 1286796 317153 936859 538176 57.4
하기 표 21는 토끼에서 안구내 주사를 통한 2,500 ㎍의 C1.02 투여 후의 안방수 내에서의 농도를 나타낸 그래프이다; RB#은 동물 번호, BQL은 below the quantifiable limit 및 ND는 not determined를 의미한다.
Time(h) RBn001* RBn002 RBn003 Mean SD CV(%)
n=1 1 1542 4803 304769 103705 174135 168
n=2 24 84982 54751 85448 75061 17590 23.4
n=3 72 38192 78324 90493 69003 27368 39.7
n=4 168 30505 37937 29392 32612 4646 14.2
n=5 336 BQL** BQL BQL ND*** ND ND
하기 표 22는 토끼에서 안구내 주사를 통한 2,500 ㎍의 C1.02 투여 후의 혈장에서의 농도를 나타낸 그래프이다; RB#은 동물 번호, BQL은 below the quantifiable limit 및 ND는 not determined를 의미한다.
Time(h) RBn001* RBn002 RBn003 Mean SD CV(%)
n=1 1 BQL** BQL BQL ND*** ND ND
n=2 24 BQL BQL BQL ND ND ND
n=3 72 BQL BQL BQL ND ND ND
n=4 168 BQL BQL BQL ND ND ND
n=5 336 BQL BQL BQL ND ND ND
토끼에서 안구내 주사를 통한 2,500 ㎍의 C1.02 투여 후의 유리체액 및 안방수내에서의 C1.02의 농도를 확인하였다.
그 결과, 표 20 내지 표 22, 도 20a 및 도 20b에 나타낸 것과 같이, 2,500 μg의 C1.02를 안구 내 주사를 통해 투여하였을 때 유리체액 내에서의 반감기가 226시간, 그리고 안방수 내에서의 반감기가 114시간인 것을 확인하였다. 혈장 내에서는 유의미한 농도가 관찰되지 않아 약력학 프로파일 분석이 불가능하였다.
<110> Kanaph Therapeutics <120> FUSION PROTEIN COMPRISING COMPLEMENT PATHWAY INHIBITOR AND ANGIOGENESIS INHIBITOR AND USE THEREOF <130> SPD21-050KNP <150> KR 10-2020-0083536 <151> 2020-07-07 <160> 151 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG <400> 1 Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly 1 5 10 15 Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln 20 25 30 Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile 35 40 45 Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln 50 55 60 Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln 65 70 75 80 Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val 85 90 95 Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr 100 105 110 Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr Val Thr Thr 115 120 125 Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg Ile Ser Leu 130 135 140 Gln Cys 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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 465 470 475 480 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly 485 490 495 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe 500 505 510 Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly 515 520 525 Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val 530 535 540 Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg 545 550 555 560 Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr 565 570 575 Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu 580 585 590 Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp 595 600 605 Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys 610 615 620 Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp 625 630 635 640 Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val 645 650 655 Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu 660 665 670 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cctctgatat cgccgtggag tgggagagca atggccagcc tgagaacaat 1140 tacaagacca caccacccgt gctggactcc gatggctctt tctttctgta tagcaagctg 1200 accgtggata agtccagatg gcagcagggc aacgtgtttt cttgtagcgt gatgcacgag 1260 gccctgcaca atcactacac acagaagtcc ctgtctctga gccccggcgg aggtggcggt 1320 tctgggggag gcggaagccg gcctatcctg gaggtgccag agtccgtgac cggaccatgg 1380 aagggcgacg tgaacctgcc ctgcacctac gatcctctgc agggctatac acaggtgctg 1440 gtgaagtggc tggtgcagag gggcagcgac cctgtgacca tcttcctgcg cgacagctcc 1500 ggcgatcaca tccagcaggc caagtaccag ggcaggctgc acgtgtctca caaggtgcct 1560 ggcgatgtga gcctgcagct gtccaccctg gagatggacg atcgcagcca ctatacatgt 1620 gaggtgacct ggcagacacc agacggcaat caggtggtgc gggataagat caccgagctg 1680 agagtgcaga agctgtccgt gtctaagcca accgtgacca caggcagcgg ctacggcttc 1740 acagtgcccc agggcatgag gatctccctg cagtgccagg caaggggctc tccacctatc 1800 agctacatct ggtataagca gcagaccaac aatcaggagc ctatcaaggt ggccaccctg 1860 tccacactgc tgttcaagcc agccgtgatc gccgacagcg gctcctattt ttgtacagca 1920 aagggacaag 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gctcgtgaga 120 cacggctccg atagcgtgac catctttctg agagacagca ccggcgacca tatccagcaa 180 gccaagtata gaggcagact gaaggtgagc cacaaggtgc ccggcgatgt gtctctgcag 240 atcaacacac tgcagatgga tgatagaaac cactatacat gcgaggtcac atggcagacc 300 cccgatggaa accaagtgat tagagacaag atcatcgagc tgagggtgag gaagtacaac 360 ccccctagga tcaacaccga ggctcctacc acactgcaca gctctctgga ggccacaaca 420 atcatgtcca gcaccagcga tctgacaacc aacggaaccg gcaagctgga agagaccatc 480 gccggcagcg gaaggaatct gcccggcgga ggaggcagcg agcctagagg acccacaatt 540 aagccttgcc ccccttgcaa atgtcccgcc cctaatctgc tcggcggccc cagcgtgttc 600 atcttccccc ccaagattaa ggacgtgctg atgatctctc tgtcccccat tgtgacatgc 660 gtggtcgtgg ctgtctccga ggacgacccc gacgtccaga tcagctggtt cgtcaacaat 720 gtggaggtcc ataccgccca gacacagacc catagagagg attacggcag cacactgaga 780 gtggtcagcg ctctgcccat ccaacaccaa gactggatga gcggcaagga gttcaagtgt 840 aaagtgaaca acaaggatct gcccgccccc attgagagga ccatctccaa acctaagggc 900 agcgtgaggg ctcctcaagt gtatgtgctc cccccccccg aggaggaaat gaccaagaag 960 caagtgacac tgacatgcat ggtcaccgac ttcatgcccg aggacatcta cgtggagtgg 1020 accaacaacg gcaagaccga gctgaattac aagaacaccg aacccgtgct ggatagcgat 1080 ggctcctact tcatgtacag caagctgaga gtggagaaaa agaactgggt cgagaggaac 1140 agctacagct gctccgtcgt gcatgagggc ctccacaacc accatacaac caagagcttc 1200 tctaggacac ccggcaaatg a 1221 <210> 30 <211> 1863 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG-VEGF binder <400> 30 caccctacac tgaagacacc cgagtccgtc accggcacat ggaagggaga cgtcaagatc 60 cagtgcatct acgaccccct cagaggctat agacaagtgc tcgtcaaatg gctcgtgaga 120 cacggctccg atagcgtgac catctttctg agagacagca ccggcgacca tatccagcaa 180 gccaagtata gaggcagact gaaggtgagc cacaaggtgc ccggcgatgt gtctctgcag 240 atcaacacac tgcagatgga tgatagaaac cactatacat gcgaggtcac atggcagacc 300 cccgatggaa accaagtgat tagagacaag atcatcgagc tgagggtgag gaagtacaac 360 ccccctagga tcaacaccga ggctcctacc acactgcaca gctctctgga ggccacaaca 420 atcatgtcca gcaccagcga tctgacaacc aacggaaccg gcaagctgga 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ctggtcatcc cttgtagagt cacaagcccc aacattaccg tgaccctcaa gaagttccct 1380 ctggacacac tgattcccga cggcaagagg attatctggg actctaggaa gggcttcatc 1440 atcagcaacg ccacctataa agagatcgga ctgctgacat gcgaggccac agtgaatggc 1500 cacctctaca agaccaacta tctgacccat agacaaacca acaccattat cgacgtggtg 1560 ctgagcccta gccacggcat cgaactcagc gtgggagaga aactggtgct gaattgcacc 1620 gctaggaccg aactcaacgt gggaatcgac ttcaactggg agtacccctc cagcaagcac 1680 cagcacaaga agctcgtgaa tagagatctg aagacccaga gcggaagcga gatgaagaaa 1740 ttcctctcca cactgaccat cgatggcgtg acaaggagcg accaaggact gtacacatgc 1800 gctgcttcca gcggactgat gacaaagaag aacagcacct tcgtgagggt ccacgaaaaa 1860 tga 1863 <210> 31 <211> 1233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg <400> 31 gagcctagag gcccaacaat caagccttgt cctccttgca aatgccctgc tcctaacctg 60 ctgggcggcc ctagcgtctt tatcttccct cctaagatca aagacgtgct gatgatcagc 120 ctgagcccta tcgtgacctg cgtggtggtg gccgtgtctg aggacgatcc tgacgtgcag 180 atcagctggt tcgtgaacaa tgtggaagtg cacacagccc agacacaaac acacagagag 240 gattacggca gcacactgcg cgtggtttcc gccctgccaa tccagcacca ggactggatg 300 agcggcaagg aattcaagtg caaagtgaac aacaaggacc tgcctgcccc tatcgagaga 360 accattagca agcccaaggg atcagttaga gcccctcagg tgtacgtgct gccccccccc 420 gaggaggaaa tgaccaaaaa gcaggtgacc ctgacatgca tggtgactga cttcatgcct 480 gaggacatct acgtggaatg gaccaacaac ggaaagaccg agctcaacta caagaacacc 540 gagcccgtgc ttgattctga cggcagctac ttcatgtaca gcaagctgcg ggtggaaaag 600 aagaactggg tggaaagaaa tagctatagc tgttctgtgg tgcacgaggg cctgcataat 660 caccacacca ccaagtcctt cagccggacc cctggcggcg gcggaggatc cggcggaggc 720 gggagccacc ccaccctgaa aacccccgag agcgtgacag gaacatggaa gggcgatgtc 780 aagatccaat gtatctacga ccccctgaga ggctacagac aggtgctggt gaagtggctg 840 gtcaggcacg gcagcgacag cgtgaccatc tttctgcggg actctacagg agatcacatc 900 cagcaggcca agtaccgggg cagactgaag gtctcccaca aggtgcctgg cgacgtgtcc 960 ctgcagatca acacactgca gatggatgac agaaaccact acacctgcga ggtgacctgg 1020 cagacccctg atggcaacca ggtgatcaga gataagatca tcgagctgcg ggtgcggaag 1080 tacaaccccc cgcggatcaa caccgaggcc ccaaccaccc tccattctag cctggaagct 1140 acaaccatca tgagcagcac cagcgacctg accaccaatg gcacaggcaa gctggaagag 1200 acaatcgccg gctctggcag aaacctgcct ggc 1233 <210> 32 <211> 1863 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of VEGF binder-mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg <400> 32 tccgatactg gcagaccctt cgtcgagatg tacagcgaga ttcctgagat catccacatg 60 acagagggac gggaactggt gattccttgc agagtgacat ctccaaacat cacagtgacc 120 ctgaagaagt ttcctctgga caccctgatc cctgacggca agcgcatcat ctgggacagc 180 agaaagggat tcatcatcag caacgccacc tacaaggaaa tcggcctcct gacctgcgag 240 gccaccgtga acggacacct gtataaaacc aattacctga cacaccggca aacaaacacc 300 atcatcgacg tggtgctgag ccctagccac ggcatcgagc tgagcgtggg cgagaagctg 360 gtgctgaact gcaccgccag aaccgaactg aacgtgggca tcgatttcaa ctgggaatac 420 ccctcctcta agcaccagca taagaaactg gttaatagag atctgaaaac ccagagcggc 480 agcgaaatga aaaagttcct gtctacactg accatcgacg gcgtgaccag aagcgaccag 540 ggcctgtaca cctgtgccgc ttctagcggc ctgatgacca agaagaacag cacattcgtg 600 cgggtgcacg agaagggcgg cggaggtagc gagcctagag gcccaacaat caagccttgt 660 cctccttgca aatgccctgc tcctaacctg ctgggcggcc ctagcgtctt tatcttccct 720 cctaagatca aagacgtgct gatgatcagc ctgagcccta tcgtgacctg cgtggtggtg 780 gccgtgtctg aggacgatcc tgacgtgcag atcagctggt tcgtgaacaa tgtggaagtg 840 cacacagccc agacacaaac acacagagag gattacggca gcacactgcg cgtggtttcc 900 gccctgccaa tccagcacca ggactggatg agcggcaagg aattcaagtg caaagtgaac 960 aacaaggacc tgcctgcccc tatcgagaga accattagca agcccaaggg atcagttaga 1020 gcccctcagg tgtacgtgct gccccccccc gaggaggaaa tgaccaaaaa gcaggtgacc 1080 ctgacatgca tggtgactga cttcatgcct gaggacatct acgtggaatg gaccaacaac 1140 ggaaagaccg agctcaacta caagaacacc gagcccgtgc ttgattctga cggcagctac 1200 ttcatgtaca gcaagctgcg ggtggaaaag aagaactggg tggaaagaaa tagctatagc 1260 tgttctgtgg tgcacgaggg cctgcataat caccacacca ccaagtcctt cagccggacc 1320 cctggcggcg gcggaggatc cggcggaggc gggagccacc ccaccctgaa aacccccgag 1380 agcgtgacag gaacatggaa gggcgatgtc aagatccaat gtatctacga ccccctgaga 1440 ggctacagac aggtgctggt gaagtggctg gtcaggcacg gcagcgacag cgtgaccatc 1500 tttctgcggg actctacagg agatcacatc cagcaggcca agtaccgggg cagactgaag 1560 gtctcccaca aggtgcctgg cgacgtgtcc ctgcagatca acacactgca gatggatgac 1620 agaaaccact acacctgcga ggtgacctgg cagacccctg atggcaacca ggtgatcaga 1680 gataagatca tcgagctgcg ggtgcggaag tacaaccccc cgcggatcaa caccgaggcc 1740 ccaaccaccc tccattctag cctggaagct acaaccatca tgagcagcac cagcgacctg 1800 accaccaatg gcacaggcaa gctggaagag acaatcgccg gctctggcag aaacctgcct 1860 ggc 1863 <210> 33 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of mu IgG2a Fc DANG <400> 33 gcccccaatc tgctgggagg cccttccgtc ttcatcttcc cccccaagat caaggacgtg 60 ctgatgatct ctctgagccc catcgtgaca tgcgtggtgg tggccgtgag cgaggacgat 120 cccgacgtgc agatcagctg gttcgtcaac aacgtggagg tgcataccgc ccaaacacag 180 acccatagag aggactacgg ctccacactg agagtggtgt ccgctctgcc catccagcat 240 caagactgga tgagcggcaa ggagttcaag tgcaaggtga acaacaagga tctgcccgcc 300 cctatcgaga ggaccatctc caagcccaaa ggctccgtga gagctcccca agtgtatgtg 360 ctgcctcccc ccgaggagga gatgaccaag aagcaagtga cactgacatg catggtgacc 420 gatttcatgc ccgaagacat ctacgtggag tggaccaaca acggcaagac cgagctcaac 480 tacaagaaca ccgagcccgt gctcgacagc gacggcagct acttcatgta cagcaagctg 540 agggtcgaga agaaaaactg ggtggagagg aacagctaca gctgtagcgt ggtgcacgag 600 ggactgcaca accaccatac caccaagagc ttctccagaa cacccggcaa gtga 654 <210> 34 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of mu IgG2a Fc DANG-VEGF binder <400> 34 gagcctagag gacccacaat taagccttgc cccccttgca aatgtcccgc ccctaatctg 60 ctcggcggcc ccagcgtgtt catcttcccc cccaagatta aggacgtgct gatgatctct 120 ctgtccccca ttgtgacatg cgtggtcgtg gctgtctccg aggacgaccc cgacgtccag 180 atcagctggt tcgtcaacaa tgtggaggtc cataccgccc agacacagac ccatagagag 240 gattacggca gcacactgag agtggtcagc gctctgccca tccaacacca agactggatg 300 agcggcaagg agttcaagtg taaagtgaac aacaaggatc tgcccgcccc cattgagagg 360 accatctcca aacctaaggg cagcgtgagg gctcctcaag tgtatgtgct cccccccccc 420 gaggaggaaa tgaccaagaa gcaagtgaca ctgacatgca tggtcaccga cttcatgccc 480 gaggacatct acgtggagtg gaccaacaac ggcaagaccg agctgaatta caagaacacc 540 gaacccgtgc tggatagcga tggctcctac ttcatgtaca gcaagctgag agtggagaaa 600 aagaactggg tcgagaggaa cagctacagc tgctccgtcg tgcatgaggg cctccacaac 660 caccatacaa ccaagagctt ctctaggaca cccggcggcg gaggcggatc cggaggaggc 720 ggcagctccg ataccggaag acctttcgtg gagatgtatt ccgagattcc cgagatcatc 780 cacatgaccg agggaagaga gctggtcatc ccttgtagag tcacaagccc caacattacc 840 gtgaccctca agaagttccc tctggacaca ctgattcccg acggcaagag gattatctgg 900 gactctagga agggcttcat catcagcaac gccacctata aagagatcgg actgctgaca 960 tgcgaggcca cagtgaatgg ccacctctac aagaccaact atctgaccca tagacaaacc 1020 aacaccatta tcgacgtggt gctgagccct agccacggca tcgaactcag cgtgggagag 1080 aaactggtgc tgaattgcac cgctaggacc gaactcaacg tgggaatcga cttcaactgg 1140 gagtacccct ccagcaagca ccagcacaag aagctcgtga atagagatct gaagacccag 1200 agcggaagcg agatgaagaa attcctctcc acactgacca tcgatggcgt gacaaggagc 1260 gaccaaggac tgtacacatg cgctgcttcc agcggactga tgacaaagaa gaacagcacc 1320 ttcgtgaggg tccacgaaaa atga 1344 <210> 35 <211> 1293 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of Aflibercept <400> 35 tccgatactg gcagaccctt cgtcgagatg tacagcgaga ttcctgagat catccacatg 60 acagagggac gggaactggt gattccttgc agagtgacat ctccaaacat cacagtgacc 120 ctgaagaagt ttcctctgga caccctgatc cctgacggca agcgcatcat ctgggacagc 180 agaaagggat tcatcatcag caacgccacc tacaaggaaa tcggcctcct gacctgcgag 240 gccaccgtga acggacacct gtataaaacc aattacctga cacaccggca aacaaacacc 300 atcatcgacg tggtgctgag ccctagccac ggcatcgagc tgagcgtggg cgagaagctg 360 gtgctgaact gcaccgccag aaccgaactg aacgtgggca tcgatttcaa ctgggaatac 420 ccctcctcta agcaccagca taagaaactg gttaatagag atctgaaaac ccagagcggc 480 agcgaaatga aaaagttcct gtctacactg accatcgacg gcgtgaccag aagcgaccag 540 ggcctgtaca cctgtgccgc ttctagcggc ctgatgacca agaagaacag cacattcgtg 600 cgggtgcacg agaaggacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 660 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 720 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 780 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 840 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 900 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 960 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1020 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1080 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1140 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1200 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1260 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggt 1293 <210> 36 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of anti-VEGF antibody Bevacizumab <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu 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Asn Ala Asp Lys Gly His Lys 65 70 75 80 Tyr Val Thr Val Val Ala Asn Phe Gly Ala Thr Val Val Glu Lys Ala 85 90 95 Val Leu Val Ser Phe Gln Ser Gly Tyr Leu Phe Ile Gln Thr Asp Lys 100 105 110 Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr Val Phe Tyr Arg Ile Phe Thr Val 115 120 125 Asp Asn Asn Leu Leu Pro Val Gly Lys Thr Val Val Ile Val Ile Glu 130 135 140 Thr Pro Asp Gly Val Pro Ile Lys Arg Asp Ile Leu Ser Ser His Asn 145 150 155 160 Gln Tyr Gly Ile Leu Pro Leu Ser Trp Asn Ile Pro Glu Leu Val Asn 165 170 175 Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala Phe Tyr Glu His Ala Pro Lys Gln 180 185 190 Thr Phe Ser Ala Glu Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro Ser Phe 195 200 205 Glu Val Leu Val Glu Pro Thr Glu Lys Phe Tyr Tyr Ile His Gly Pro 210 215 220 Lys Gly Leu Glu Val Ser Ile Thr Ala Arg Phe Leu Tyr Gly Lys Asn 225 230 235 240 Val Asp Gly Thr Ala Phe Val Ile Phe Gly Val Gln Asp Glu Asp Lys 245 250 255 Lys Ile Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Arg Val Leu Ile Glu Asp Gly 260 265 270 Ser Gly Glu Ala Val Leu Ser Arg Lys Val Leu Met Asp Gly Val Arg 275 280 285 Pro Ser Ser Pro Glu Ala Leu Val Gly Lys Ser Leu Tyr Val Ser Val 290 295 300 Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser Asp Met Val Glu Ala Glu Arg Ser 305 310 315 320 Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro Tyr Gln Ile His Phe Thr Lys Thr 325 330 335 Pro Lys Phe Phe Lys Pro Ala Met Pro Phe Asp Leu Met Val Phe Val 340 345 350 Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala Arg Arg Val Pro Val Val Thr Gln 355 360 365 Gly Ser Asp Ala Gln Ala Leu Thr Gln Asp Asp Gly Val Ala Lys Leu 370 375 380 Ser Val Asn Thr Pro Asn Asn Arg Gln Pro Leu Thr Ile Thr Val Ser 385 390 395 400 Thr Lys Lys Glu Gly Ile Pro Asp Ala Arg Gln Ala Thr Arg Thr Met 405 410 415 Gln Ala Gln Pro Tyr Ser Thr Met His Asn Ser Asn Asn Tyr Leu His 420 425 430 Leu Ser Val Ser Arg Val Glu Leu Lys Pro Gly Asp Asn Leu Asn Val 435 440 445 Asn Phe His Leu Arg Thr Asp Ala Gly Gln Glu Ala Lys Ile Arg Tyr 450 455 460 Tyr Thr Tyr Leu Val Met Asn Lys Gly Lys Leu Leu Lys Ala Gly Arg 465 470 475 480 Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln Asp Leu Val Val Leu Ser Leu Pro Ile 485 490 495 Thr Pro Glu Phe Ile Pro Ser Phe Arg Leu Val Ala Tyr Tyr Thr Leu 500 505 510 Ile Gly Ala Asn Gly Gln Arg Glu Val Val Ala Asp Ser Val Trp Val 515 520 525 Asp Val Lys Asp Ser Cys Val Gly Thr Leu Val Val Lys Gly Asp Pro 530 535 540 Arg Asp Asn Arg Gln Pro Ala Pro Gly His Gln Thr Thr Leu Arg Ile 545 550 555 560 Glu Gly Asn Gln Gly Ala Arg Val Gly Leu Val Ala Val Asp Lys Gly 565 570 575 Val Phe Val Leu Asn Lys Lys Asn Lys Leu Thr Gln Ser Lys Ile Trp 580 585 590 Asp Val Val Glu Lys Ala Asp Ile Gly Cys Thr Pro Gly Ser Gly Lys 595 600 605 Asn Tyr Ala Gly Val Phe Met Asp Ala Gly Leu Thr Phe Lys Thr Asn 610 615 620 Gln Gly Leu Gln Thr Asp Gln Arg Glu Asp Pro Glu Cys Ala Lys Pro 625 630 635 640 Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Leu Met Glu Arg Arg Met Asp 645 650 655 Lys Ala Gly Gln Tyr Thr Asp Lys Gly Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp 660 665 670 Gly Met Arg Asp Ile Pro Met Pro Tyr Ser Cys Gln Arg Arg Ala Arg 675 680 685 Leu Ile Thr Gln Gly Glu Ser Cys Leu Lys Ala Phe Met Asp Cys Cys 690 695 700 Asn Tyr Ile Thr Lys Leu Arg Glu Gln His Arg Arg Asp His Val Leu 705 710 715 720 Gly Leu Ala Arg Ser Asp Val Asp Glu Asp Ile Ile Pro Glu Glu Asp 725 730 735 Ile Ile Ser Arg Ser His Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Thr Ile Glu 740 745 750 Glu Leu Lys Glu Pro Glu Lys Asn Gly Ile Ser Thr Lys Val Met Asn 755 760 765 Ile Phe Leu Lys Asp Ser Ile Thr Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val Ser 770 775 780 Leu Ser Asp Lys Lys Gly Ile Cys Val Ala Asp Pro Tyr Glu Ile Thr 785 790 795 800 Val Met Gln Asp Phe Phe Ile Asp Leu Arg Leu Pro Tyr Ser Val Val 805 810 815 Arg Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg Ala Val Leu Phe Asn Tyr Arg Glu 820 825 830 Gln Glu Lys Leu Lys Val Arg Val Glu Leu Leu His Asn Pro Ala Phe 835 840 845 Cys Ser Met Ala Thr Ala Lys Lys Arg Tyr Tyr Gln Thr Ile Glu Ile 850 855 860 Pro Pro Lys Ser Ser Val Ala Val Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu Lys 865 870 875 880 Ile Gly Leu Gln Glu Val Glu Val Lys Ala Ala Val Phe Asn His Phe 885 890 895 Ile Ser Asp Gly Val Lys Lys Ile Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Met 900 905 910 Arg Val Asn Lys Thr Val Ala Val Arg Thr Leu Asp Pro Glu His Leu 915 920 925 Asn Gln Gly Gly Val Gln Arg Glu Asp Val Asn Ala Ala Asp Leu Ser 930 935 940 Asp Gln Val Pro Asp Thr Asp Ser Glu Thr Arg Ile Leu Leu Gln Gly 945 950 955 960 Thr Pro Val Ala Gln Met Ala Glu Asp Ala Val Asp Gly Glu Arg Leu 965 970 975 Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile 980 985 990 Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala Val His Tyr Leu Asp Gln Thr Glu 995 1000 1005 Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu Lys Arg Gln Glu Ala Leu Glu Leu 1010 1015 1020 Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln Leu Ala Phe Lys Gln Pro Ile Ser 1025 1030 1035 1040 Ala Tyr Ala Ala Phe Asn Asn Arg Pro Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala 1045 1050 1055 Met Trp Ser Arg Ser Phe Ser Leu Ala Ala Asn Leu Ile Ala Ile Asp 1060 1065 1070 Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln 1075 1080 1085 Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu Asp Gly Pro Val Ile His Gln Glu 1090 1095 1100 Met Ile Gly Gly Phe Arg Asn Thr Lys Glu Ala Asp Val Ser Leu Thr 1105 1110 1115 1120 Ala Phe Val Leu Ile Ala Leu Gln Glu Ala Arg Asp Ile Cys Glu Gly 1125 1130 1135 Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Glu Tyr Leu 1140 1145 1150 Glu Ala Ser Tyr Leu Asn Leu Gln Arg Pro Tyr Thr Val Ala Ile Ala 1155 1160 1165 Gly Tyr Ala Leu Ala Leu Met Asn Lys Leu Glu Glu Pro Tyr Leu Thr 1170 1175 1180 Lys Phe Leu Asn Thr Ala Lys Asp Arg Asn Arg Trp Glu Glu Pro Gly 1185 1190 1195 1200 Gln Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu 1205 1210 1215 Leu Leu Leu Lys Asp Phe Asp Ser Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu 1220 1225 1230 Asn Asp Glu Arg Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr 1235 1240 1245 Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala Gln Tyr Arg Ala Asp Val Pro Asp 1250 1255 1260 His Lys Asp Leu Asn Met Asp Val Ser Leu His Leu Pro Ser Arg Ser 1265 1270 1275 1280 Ser Pro Thr Val Phe Arg Leu Leu Trp Glu Ser Gly Ser Leu Leu Arg 1285 1290 1295 Ser Glu Glu Thr Lys Gln Asn Glu Gly Phe Ser Leu Thr Ala Lys Gly 1300 1305 1310 Lys Gly Gln Gly Thr Leu Ser Val Val Thr Val Tyr His Ala Lys Val 1315 1320 1325 Lys Gly Lys Thr Thr Cys Lys Lys Phe Asp Leu Arg Val Thr Ile Lys 1330 1335 1340 Pro Ala Pro Glu Thr Ala Lys Lys Pro Gln Asp Ala Lys Ser Ser Met 1345 1350 1355 1360 Ile Leu Asp Ile Cys Thr Arg Tyr Leu Gly Asp Val Asp Ala Thr Met 1365 1370 1375 Ser Ile Leu Asp Ile Ser Met Met Thr Gly Phe Ile Pro Asp Thr Asn 1380 1385 1390 Asp Leu Glu Leu Leu Ser Ser Gly Val Asp Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr 1395 1400 1405 Glu Met Asp Lys Ala Phe Ser Asn Lys Asn Thr Leu Ile Ile Tyr Leu 1410 1415 1420 Glu Lys Ile Ser His Ser Glu Glu Asp Cys Leu Ser Phe Lys Val His 1425 1430 1435 1440 Gln Phe Phe Asn Val Gly Leu Ile Gln Pro Gly Ser Val Lys Val Tyr 1445 1450 1455 Ser Tyr Tyr Asn Leu Glu Glu Ser Cys Thr Arg Phe Tyr His Pro Glu 1460 1465 1470 Lys Asp Asp Gly Met Leu Ser Lys Leu Cys His Asn Glu Met Cys Arg 1475 1480 1485 Cys Ala Glu Glu Asn Cys Phe Met His Gln Ser Gln Asp Gln Val Ser 1490 1495 1500 Leu Asn Glu Arg Leu Asp Lys Ala Cys Glu Pro Gly Val Asp Tyr Val 1505 1510 1515 1520 Tyr Lys Thr Lys Leu Thr Thr Ile Glu Leu Ser Asp Asp Phe Asp Glu 1525 1530 1535 Tyr Ile Met Thr Ile Glu Gln Val Ile Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val 1540 1545 1550 Gln Ala Gly Gln Glu Arg Arg Phe Ile Ser His Val Lys Cys Arg Asn 1555 1560 1565 Ala Leu Lys Leu Gln Lys Gly Lys Gln Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser 1570 1575 1580 Ser Asp Leu Trp Gly Glu Lys Pro Asn Thr Ser Tyr Ile Ile Gly Lys 1585 1590 1595 1600 Asp Thr Trp Val Glu His Trp Pro Glu Ala Glu Glu Arg Gln Asp Gln 1605 1610 1615 Lys Asn Gln Lys Gln Cys Glu Asp Leu Gly Ala Phe Thr Glu Thr Met 1620 1625 1630 Val Val Phe Gly Cys Pro Asn 1635 <210> 151 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRIg (VSIG4) isoform 2 <400> 151 Met Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val Asp 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro 20 25 30 Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly 35 40 45 Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro 50 55 60 Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala 65 70 75 80 Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val 85 90 95 Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr 100 105 110 Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp 115 120 125 Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr 130 135 140 Val Thr Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg 145 150 155 160 Ile Ser Leu Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile 165 170 175 Trp Tyr Lys Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser 195 200 205 Tyr Phe Cys Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp 210 215 220 Ile Val Lys Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys 225 230 235 240 Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr 245 250 255 Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly 260 265 270 Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala Ile Ile 275 280 285 Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala Tyr Ile 290 295 300 Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu Ala Ala 305 310 315 320 Arg

Claims (22)

  1. CRIg(Complement receptor of the immunoglobulin superfamily)의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 VEGF(Vascular endothelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 링커에 의해 결합된 것인, 융합단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 링커는 펩타이드 링커, 면역글로불린 단편 또는 이의 조합인 것인, 융합단백질.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 면역글로불린 단편은 DANG 변이 또는 NG 변이를 포함하는 것인, 융합단백질.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 면역글로불린 단편은 서열번호 6, 서열번호 11 또는 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편; VEGF 수용체의 세포외도메인을 포함하는 것인, 융합단백질.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 VEGF 수용체는 VEGF 수용체 1 또는 VEGF 수용체 2인 것인, 융합단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 VEGF 수용체의 세포외도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 하기 구조식(I) 또는(II)로 이루어진 것인, 융합단백질:
    N'-X-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-Y-C'(I)
    N'-Y-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-X-C'(II)
    이때, 상기 구조식(I) 및 (II)에 있어서,
    상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
    상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
    상기 X는 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편이고,
    상기 Y는 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질이며,
    상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
    상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 링커(1)이 서열번호 15 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 링커(2)이 서열번호 16 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 융합단백질은 구조식(I)인, 융합단백질.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 8 및 서열번호 10으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인, 융합단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 융합단백질 이량체는 동형이량체(Homodimer)인 것인, 융합단백질 이량체.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 30 및 서열번호 32로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  18. 제16항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  19. 제18항의 벡터가 도입된 형질전환 세포.
  20. 제1항의 융합단백질; 또는 제14항의 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 안질환은 노화-관련 황반 변성(AMD), 지도모양 위축증(GA), 맥락막 혈관신생(CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 다른 허혈-관련 망막증, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐색(CRVO), 각막 혈관신생 및 망막 혈관신생으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것인, 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것인, 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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