KR20190031246A - VE-PTP (HPTP-β)를 표적으로 하는 인간화된 단클론성 항체 - Google Patents
VE-PTP (HPTP-β)를 표적으로 하는 인간화된 단클론성 항체 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시는 대상체에서 티로신 포스파타제 억제자를 표적으로 하는 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생과 관련된 눈 질병을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
Description
교차 참조
본 출원은 2016년 7월 20일에 출원된, 미국 가출원 번호 62/364,381, 및 2016년 8월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 62/377,072의 유익을 주장하며, 상기 출원은 각각 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 VE-PTP (HPTP-β)를 표적으로 하는 인간화된 단클론성 항체에 관한 것이다.
비-인간 유기체로부터 생성된 단클론성 항체는 인간에게 투여될 때 면역 반응을 유발할 수 있다. 이런 비-인간 단클론성 항체의 분절은 표적 특이성은 보존하면서 약물 면역원성의 가능성을 감소시키기 위한 인간화 과정을 통해 인간화된 서열로 교체될 수 있다.
참고문헌에 의한 참조
출원서에서 인용된 각각의 특허, 공개공보, 및 비-특허 문헌은 각각이 개별적으로 참조로 포함되는 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구체예에서, 발명은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 화합물을 제공한다.
일부 구체예에서, 발명은 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 또는 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 화합물을 제공한다..
일부 구체예에서, 발명은 a) SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄; 및 b) SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 화합물을 제공한다.
일부 구체예에서, 발명은 a) SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄; 및 b) SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 화합물을 제공한다.
일부 구체예에서, 발명은 a) SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 b) SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 화합물을 제공한다..
도 1은 4개의 인간화된 변종 SEQ ID NO: 9 (VH1), SEQ ID NO: 10 (VH2), SEQ ID NO: 11 (VH3), 및 SEQ ID NO: 12 (VH4)를 가지는 쥐과 VH 서열 (절단된 VH0; SEQ ID NO: 47)의 서열 배열을 도시한다.
도 2는 4개의 인간화된 VL 변종 SEQ ID NO: 20 (VL1), SEQ ID NO: 21 (VL2), SEQ ID NO: 22 (VL3), 및 SEQ ID NO: 23 (VL4)을 가지는 쥐과 VL 서열 (절단된 VL0; SEQ ID NO: 48)의 서열 배열을 도시한다.
도 3은 HPTP-β 세포외재성 도메인 (인간 VE-PTP/HPTP-β ECD)에 대한 단클론성 항체를 생성하기 위해 사용된 하이브리도마 기술을 요약하여 도시한다.
도 4는 인간 내피 세포에서 내인성 인간 VE-PTP (HPTP-β)에 결합된 R15E6의 면역침전 웨스턴 블롯 (좌측 패널) 및 유동 세포분석 결과 (우측 패널)를 도시한다.
도 5는 웨스턴 블롯에 의한 재조합, 6-His 태그의 인간 VE-PTP (HPTP-β), 시노몰구스(cynomolgus) PTP-β, 및 인간 PTP-η 세포외재성 도메인 단백질에 대한 R15E6의 결합 특이성을 도시한다.
도 6은 Tie2의 농도-의존성 인산화의 웨스턴 블롯 (패널 A) 및 정량화 (패널 B) 및 R15E6에 의한 향상된 내피 세포 생존율 (패널 C)을 도시한다.
도 7은 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 마우스 내피 세포에서 Tie2에 대한 (상부 좌측 패널), 마우스 VE-PTP 발현에 대한 (하부 좌측 패널), 및 Akt에 대한 (우측 패널) 래트 항-마우스 VE-PTP 단클론성 항체 109.1의 영향을 도시한다.
도 8은 마우스 내피 세포에서 1시간 인큐베이션 (패널 A) 및 3분 인큐베이션 (패널 B) 후의 마우스 VE-PTP ECD에 대한 다클론성 항체에 의한 Tie2 활성화를 도시한다.
도 9는 마우스 VE-PTP ECD 다클론성 항체에 의한 트롬빈- 및 VEGF-유도 내피 세포 투과율의 시험관내 억제를 도시한다.
도 10은 단클론성 항체 109.1 (패널 A) 및 마우스 VE-PTP ECD 다클론성 항체 (PTP1-8) (패널 B)의 정맥내 투여에 의한 VEGF-유도 피부 혈관 투과의 생체내 억제, 및 대조군 IgG (-) 또는 항-VE-PTP 항체-주입된 마우스 (+) (패널 C)의 폐 용해물로부터의 Tie2의 면역침전을 도시한다.
도 11은 항-마우스 VE-PTP 단클론성 항체 109.1의 안내(intraocular) 투여 후 망막 신생혈관(neovascularization) (패널 A 및 B) 및 맥락막 신생혈관 (패널 C)에 미치는 영향을 도시한다.
도 12는 항-마우스 VE-PTP 단클론성 항체 109.1의 안내 투여 후 망막 신생혈관 (패널 A 및 B) 및 맥락막 신생혈관 (패널 C)의 평균 면적의 정량화를 도시한다.
도 13은 R15E6의 항-인간 VE-PTP (항-HPTP-β) 인간화된 변종의 환원 (패널 A) 및 비환원 (패널 B) SDS-PAGE를 도시한다.
도 14는 HPTP-β에 대한 R15E6 및 HC0LC0의 HC1 변종의 결합을 도시한다.
도 15는 HPTP-β에 대한 R15E6 및 HC0LC0의 HC2 변종의 결합을 도시한다.
도 16은 HPTP-β에 대한 R15E6 및 HC0LC0의 HC3 변종의 결합을 도시한다.
도 17은 HPTP-β에 대한 R15E6 및 HC0LC0의 HC4 변종의 결합을 도시한다.
도 18은 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 다양한 인간화된 항체에 의한 Ang1의 부재시의 Tie2 인산화 (좌측 패널) 및 Akt 활성화 (우측 패널)를 도시한다.
도 19는 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 HC2LC4 및 HC2LC1에 의한 리간드의 존재하의 농도-의존성 Tie2 활성화 (상부 패널) 및 Akt 활성화 (하부 패널)를 도시한다.
도 20은 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 Ang1 및 Ang2의 부재시의 Tie2 인산화 (좌측 패널) 및 Akt 활성화 (우측 패널)를 도시한다.
도 21은 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 HC2LC1 및 HC2LC4에 의한 Ang1 및/또는 Ang2의 존재하의 Tie2 인산화 (패널 A), 인간 VE-PTP (HPTP-β) 발현 (패널 B), 및 Akt 활성화 (패널 C)를 도시한다.
도 22는 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 HC2LC1 단독에 의한 및 과잉 재조합 인간 VE-PTP 세포외재성 도메인 단백질 (βECD 6His 또는 βECD Fc)로의 Akt 활성화를 도시한다.
도 23은 비경구 항체 (R15E6) 및 마우스 IgG1 대조군에 비교한 HC2LC1 및 HC0LC0에 의한 향상된 내피 세포 생존율을 도시한다.
도 24는 마우스 모델에서 망막 박리의 치료를 위한 항-마우스 VE-PTP 항체/아플리버셉트(aflibercept) 조합 치료법의 향상된 효능을 도시한다.
도 25는 비히클에 비교하여 마우스에서 단클론성 항체 109.1의 피하 투여가 허혈성 신생혈관을 감소시킨 것을 도시한다.
도 2는 4개의 인간화된 VL 변종 SEQ ID NO: 20 (VL1), SEQ ID NO: 21 (VL2), SEQ ID NO: 22 (VL3), 및 SEQ ID NO: 23 (VL4)을 가지는 쥐과 VL 서열 (절단된 VL0; SEQ ID NO: 48)의 서열 배열을 도시한다.
도 3은 HPTP-β 세포외재성 도메인 (인간 VE-PTP/HPTP-β ECD)에 대한 단클론성 항체를 생성하기 위해 사용된 하이브리도마 기술을 요약하여 도시한다.
도 4는 인간 내피 세포에서 내인성 인간 VE-PTP (HPTP-β)에 결합된 R15E6의 면역침전 웨스턴 블롯 (좌측 패널) 및 유동 세포분석 결과 (우측 패널)를 도시한다.
도 5는 웨스턴 블롯에 의한 재조합, 6-His 태그의 인간 VE-PTP (HPTP-β), 시노몰구스(cynomolgus) PTP-β, 및 인간 PTP-η 세포외재성 도메인 단백질에 대한 R15E6의 결합 특이성을 도시한다.
도 6은 Tie2의 농도-의존성 인산화의 웨스턴 블롯 (패널 A) 및 정량화 (패널 B) 및 R15E6에 의한 향상된 내피 세포 생존율 (패널 C)을 도시한다.
도 7은 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 마우스 내피 세포에서 Tie2에 대한 (상부 좌측 패널), 마우스 VE-PTP 발현에 대한 (하부 좌측 패널), 및 Akt에 대한 (우측 패널) 래트 항-마우스 VE-PTP 단클론성 항체 109.1의 영향을 도시한다.
도 8은 마우스 내피 세포에서 1시간 인큐베이션 (패널 A) 및 3분 인큐베이션 (패널 B) 후의 마우스 VE-PTP ECD에 대한 다클론성 항체에 의한 Tie2 활성화를 도시한다.
도 9는 마우스 VE-PTP ECD 다클론성 항체에 의한 트롬빈- 및 VEGF-유도 내피 세포 투과율의 시험관내 억제를 도시한다.
도 10은 단클론성 항체 109.1 (패널 A) 및 마우스 VE-PTP ECD 다클론성 항체 (PTP1-8) (패널 B)의 정맥내 투여에 의한 VEGF-유도 피부 혈관 투과의 생체내 억제, 및 대조군 IgG (-) 또는 항-VE-PTP 항체-주입된 마우스 (+) (패널 C)의 폐 용해물로부터의 Tie2의 면역침전을 도시한다.
도 11은 항-마우스 VE-PTP 단클론성 항체 109.1의 안내(intraocular) 투여 후 망막 신생혈관(neovascularization) (패널 A 및 B) 및 맥락막 신생혈관 (패널 C)에 미치는 영향을 도시한다.
도 12는 항-마우스 VE-PTP 단클론성 항체 109.1의 안내 투여 후 망막 신생혈관 (패널 A 및 B) 및 맥락막 신생혈관 (패널 C)의 평균 면적의 정량화를 도시한다.
도 13은 R15E6의 항-인간 VE-PTP (항-HPTP-β) 인간화된 변종의 환원 (패널 A) 및 비환원 (패널 B) SDS-PAGE를 도시한다.
도 14는 HPTP-β에 대한 R15E6 및 HC0LC0의 HC1 변종의 결합을 도시한다.
도 15는 HPTP-β에 대한 R15E6 및 HC0LC0의 HC2 변종의 결합을 도시한다.
도 16은 HPTP-β에 대한 R15E6 및 HC0LC0의 HC3 변종의 결합을 도시한다.
도 17은 HPTP-β에 대한 R15E6 및 HC0LC0의 HC4 변종의 결합을 도시한다.
도 18은 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 다양한 인간화된 항체에 의한 Ang1의 부재시의 Tie2 인산화 (좌측 패널) 및 Akt 활성화 (우측 패널)를 도시한다.
도 19는 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 HC2LC4 및 HC2LC1에 의한 리간드의 존재하의 농도-의존성 Tie2 활성화 (상부 패널) 및 Akt 활성화 (하부 패널)를 도시한다.
도 20은 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 Ang1 및 Ang2의 부재시의 Tie2 인산화 (좌측 패널) 및 Akt 활성화 (우측 패널)를 도시한다.
도 21은 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 HC2LC1 및 HC2LC4에 의한 Ang1 및/또는 Ang2의 존재하의 Tie2 인산화 (패널 A), 인간 VE-PTP (HPTP-β) 발현 (패널 B), 및 Akt 활성화 (패널 C)를 도시한다.
도 22는 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 HC2LC1 단독에 의한 및 과잉 재조합 인간 VE-PTP 세포외재성 도메인 단백질 (βECD 6His 또는 βECD Fc)로의 Akt 활성화를 도시한다.
도 23은 비경구 항체 (R15E6) 및 마우스 IgG1 대조군에 비교한 HC2LC1 및 HC0LC0에 의한 향상된 내피 세포 생존율을 도시한다.
도 24는 마우스 모델에서 망막 박리의 치료를 위한 항-마우스 VE-PTP 항체/아플리버셉트(aflibercept) 조합 치료법의 향상된 효능을 도시한다.
도 25는 비히클에 비교하여 마우스에서 단클론성 항체 109.1의 피하 투여가 허혈성 신생혈관을 감소시킨 것을 도시한다.
본 개시는 예를 들어 혈관 불안정, 혈관신생(angiogenesis), 신생혈관, 혈관 누출, 및 부종을 특징으로 하는 눈 장애의 치료를 위하여 혈관 내피의 단백질 티로신 포스파타제 (VE-PTP 또는 VEPTP) 또는 인간 단백질 티로신 포스파타제-베타 (HPTP-β)를 표적으로 하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 개시된 조성물은 단백질 인산화, 예컨대 Tie2 단백질의 인산화를 촉진함으로써 Tie2 신호전달을 활성화할 수 있다.
VE-PTP는 단백질 티로신 포스파타제 (PTPase)의 수용체-유사 패밀리의 구성원이다. VE-PTP는 세포 부착 분자에 대해 구조적 및 기능적 유사성을 보이는 혈관 내피 세포에서 주로 발견되는 경막 단백질이다. VE-PTP는 예를 들어 제브라피시, 닭, 개, 마우스, 마모셋, 원숭이, 및 인간을 포함한 다양한 종에서 발견된다. VE-PTP의 인간 오르토로그(orthologue)는 HPTP-β이다.
Tie2 (면역글로불린 및 내피 성장 인자 상동성 도메인 2를 가진 티로신 키나아제)는 발달의 전 과정을 통해 주로 혈관의 내피 세포에서 발현되는 막 수용체 티로신 키나아제이다. Tie2 인산화의 원칙적인 조절자는 안지오포이에틴 1 (Ang1) 및 안지오포이에틴 2 (Ang2)이다. Ang1은 Tie2의 작용물질이고, Tie2에 대한 Ang1의 결합은 수용체 인산화를 촉진한다. Ang2는 Tie2의 맥락-의존성(context-dependant) 길항물질 또는 작용물질에서 작용한다. Tie2에 대한 Ang1의 결합은 내인성 Tie2 수용체 인산화의 수준을 증가시키고 고도로 조직화된 혈관신생, 내피 세포 연합의 긴축 (내피 세포 근접성), 향상된 내피세포 생존율, 감소된 내피세포 염증 및 개선된 내피세포 기능을 통해 혈관 안정화를 유도하기 위한 하류 신호전달을 개시한다. 혈관신생 중에, Ang2는 Ang1-Tie2 신호전달의 네거티브 조절자로서 작용한다.
생리적인 조건 하에서, Tie2 인산화의 기간은 Tie2 수용체로부터 포스페이트를 제거하는 VE-PTP (HPTP-β)에 의해 조절된다. VE-PTP (HPTP-β)를 억제함으로써, Tie2 인산화의 수준은 실질적으로 증가하여, 혈관 안정성이 복원된다. VE-PTP (HPTP-β) 억제자, 예를 들어 VE-PTP (HPTP-β)에 결합하는 항체는 VE-PTP (HPTP-β)를 억제함으로써 TiE2 하류 신호전달을 활성화할 수 있다. 억제자에 의한 VE-PTP (HPTP-β)의 억제는 본원에서 기술된 눈 장애가 있는 대상체에서 혈관 안정성을 제공할 수 있다.
본 개시의 VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 인간 VE-PTP (HPTP-β)의 세포외재성 도메인 (SEQ ID NO. 45)에 대해 면역반응성이고 인간 VE-PTP (HPTP-β)의 첫 번째 FN3 반복부 (SEQ ID NO. 46)에 대해 면역반응성인, 하이브리도마 세포주 ATCC 번호 PTA-7580에 의해 생성된 쥐과 단클론성 항체 R15E6를 포함할 수 있다. VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 R15E6, R15E6의 항체 단편의 동일한 또는 실질적으로 동일한 생물학적 특징을 가지는 항체를 포함할 수 있고, 여기서 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중 하나 또는 둘 다, R15E6의 F(ab')2, Fab의 다이머 또는 트라이머, Fv, scFv, 및 R15E6으로부터 유래된 트라이아바디 또는 테트라바디를 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 화합물은 본원에 기술된 임의의 생물학적 활성에 대해 검정될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 화합물의 단편은 Tie2를 활성화할 수 있거나, 또는 효능이 동등한, 증가된, 또는 감소된 수준에서 상응하는 온전한 항체의 생물학적 활성을 제공할 수 있다.
인간 VE-PTP (HPTP-β)의 세포외재성 도메인 (SEQ ID NO: 45):
MLSHGAGLALWITLSLLQTGLAEPERCNFTLAESKASSHSVSIQWRILGSPCNFSLIYSSDTLGAALCPTF
RIDNTTYGCNLQDLQAGTIYNFRIISLDEERTVVLQTDPLPPARFGVSKEKTTSTSLHVWWTPSSGKVTSY
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인간 VE-PTP (HPTP-β)의 첫 번째 FN3 반복부 (SEQ ID NO: 46):
LAEPERCNFTLAESKASSHSVSIQWRILGSPCNFSLIYSSDTLGAALCPTFRIDNTTYGCNLQDLQAGTIY
NFRIISLDEERTVVLQTD
본 개시의 VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 단독으로 또는 다른 아미노산 서열들과 조합하여, 항체, 또는 항체 단편, 변종, 또는 그것의 유도체를 포함할 수 있다. 억제자는 변형, 예를 들어 효소적 절단, 및 번역후 변형이 이루어질 수 있다.
본 개시의 VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 VE-PTP (HPTP-β)의 우성-음성 동위체(isoform)에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 이런 우성-음성 동위체는 내인성 VE-PTP (HPTP-β)와 경합할 수 있는 포스파타제 활성이 결핍된 VE-PTP (HPTP-β)의 형태에 상응할 수 있다. 우성-음성 VE-PTP (HPTP-β)의 기능성 평가는 도입유전자의 전달 및 Tie2 인산화에 미치는 영향의 측정을 통해 일어날 수 있다.
본 개시의 VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 복수의 본 개시의 VE-PTP (HPTP-β) 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 2개의 VE-PTP (HPTP-β) 분자에 동시에 결합할 수 있음으로써, 2개의 VE-PTP (HPTP-β) 분자가 가까이에 있게 된다. VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 3개의 VE-PTP (HPTP-β) 분자에 동시에 결합할 수 있음으로써, 3개의 VE-PTP (HPTP-β) 분자가 가까이에 있게 된다.
본 개시의 VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 또 다른 모이어티 또는 비히클에 공유적으로 또는 비-공유적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 모이어티 또는 비히클은, 예를 들어 억제자의 분해를 억제하고, 반감기를 증가시키고, 흡수를 증가시키고, 독성을 감소시키고, 면역원성을 감소시키고, 및/또는 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다. 모이어티의 비-제한적인 예로는 면역글로불린의 Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리리신, 및 덱스트란과 같은 폴리머, 지질, 스테로이드와 같은 콜레스테롤 기, 탄수화물, 덴드라이머, 올리고당, 및 펩티드를 들 수 있다.
본 발명의 화합물은 Tie2 활성을 복원하고, 예를 들어, Akt/PI3-K 신호전달, Rac1 신호전달, MAPK/Ras 신호전달을 포함하는 하류 신호전달 캐스케이드를 개시하기 위하여 VE-PTP (HPTP-β)를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 NF-κB 신호전달을 억제할 수 있다. Tie2의 활성화는 혈관 안정화로 이어질 수 있고, 그것은, 예를 들어 망막병증, 당뇨성 망막병증, 망막 관류, 눈의 신생혈관, 눈의 혈관 누출, 눈의 부종, 안압, 고안압증, 눈의 염증, 녹내장, 및 눈의 출혈을 포함하여 당뇨병-관련 질병 및 눈 질병의 치료에 유익할 수 있다. 화합물은 또한 예를 들어 상처 치유, 탈안정화된 혈류, 심장 섬유증, 발기 부전, 심근병증, 허혈성 손상, 심장 비대증, 간질성 섬유증, 신장병증(nephropathy), 단백뇨, 사구체 경화증(glomerulosclerosis), 신장 섬유증, 신장병증, 및 뉴런성 염증을 포함하여 말초 동맥 질환의 치료에 효과적일 수 있다.
항체
항체는 2개의 동일한 중쇄 (H) 폴리펩타이드 서열 및 2개의 동일한 경쇄 (L) 폴리펩타이드 서열로 구성된다. 중쇄의 각각은 하나의 N-말단 가변 (VH) 영역 및 3개의 C-말단 불변 (CH1, CH2, 및 CH3) 영역을 포함한다. 경쇄의 각각은 하나의 N-말단 가변 (VL) 영역 및 하나의 C-말단 불변 (CL) 영역을 포함한다. 경쇄 가변 영역은 중쇄 가변 영역과 배열되고 경쇄 불변 영역은 중쇄 불변 영역 CH1과 배열된다. 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 함께 쌍을 이루는 것은 단일한 항원-결합 부위를 형성한다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 결합된다. 2개의 중쇄는 중쇄 동형(isotype)에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 상호 결합된다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 공간배열된 사슬내 이황화 가교를 포함한다.
임의의 척추동물 종으로부터의 경쇄는 불변 영역의 아미노산 서열을 기반으로 카파 또는 람다로 지정될 수 있다. 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 5개 부류의 면역글로불린 (IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM)으로 분류될 수 있고, 각각은 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 각각 지정된 중쇄를 가진다. 알파 및 감마 부류는 추가로 서열의 차이 및 중쇄 불변 영역의 기능을 기반으로 하위부류들로 나누어진다. 인간에 의해 발현된 IgA 및 IgG의 하위부류는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 포함한다.
가변 (V) 영역은 항체 중에서 서열이 광범위하게 다를 수 있는 분절들을 포함한다. 가변 영역은 항원-결합을 매개하고 특정 항체의 그것의 항원에 대한 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성은 가변 영역의 범위에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신, 가변 영역은 각각 9 내지 12개의 아미노산 길이인 초가변 영역으로 불리는 가변성이 심한 더 짧은 영역들에 의해 분리되어 있는 15 내지 30개의 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 상대적으로 변하지 않는 구간으로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 각각 4개의 프레임워크 영역을 포함하여, 대개, f3-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 f3-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 f3-시트 형태를 채택한다. 각 사슬의 초가변 영역은 프레임워크 영역들에 의해 근접하게 함께 보유되며, 다른 사슬로부터의 초가변 영역들과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 포함되지는 않지만, 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC)에서 항체의 참여와 같은, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
초가변 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 아미노산 잔기들, 예를 들어, 경쇄 가변 영역에서 대략 약 잔기 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2), 및 89 내지 97 (L3), 및 중쇄 가변 영역에서 대략 약 1 내지 35 (H1), 50 내지 65 (H2), 및 95 내지 102 (H3), 및/또는 초가변 루프로부터의 잔기들을 포함할 수 있다.
단클론성 항체는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어질 수 있다, 즉 개별적인 항체를 포함하는 집단은 미미한 양으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적인 돌연변이를 제외하고 동일하다. 상이한 에피토프들에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 조제물과 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 단일 에피토프에 대해 지시된다. 특이성에 더불어, 단클론성 항체는 각각이 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다.
본원에서 사용된 단클론성 항체는, 예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체의 상응하는 서열 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 서열과 동일하거나 그것에 상동하는 한편, 그 사슬(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체의 상응하는 서열 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 서열과 동일하거나 그것에 상동하는 키메릭 항체, 뿐만 아니라 그런 항체의 항원-결합 단편일 수 있다.
항체 단편은 멀티머 항체의 일부, 예를 들어, 온전한 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 단편의 비-제한적인 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fab 콘쥬게이트의 다이머 및 트라이머, Fv, scFv, 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 및 테타라바디, 및 선형 항체를 들 수 있다.
에피토프의 비-제한적인 예로는 아미노산, 당, 지질, 포스포릴, 및 설포닐 기를 들 수 있다. 에피토프는 특이적인 삼차원 구조적 특징, 및/또는 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 입체형태이거나 선형일 수 있다.
인간화된 단클론성 항체
VE-PTP를 표적으로 하는 적합한 항체는 다양한 기법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 후보 작용제들은 VE-PTP에 대한 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. VE-PTP에 결합하는 작용제들은 활성, 예를 들어, Tie2의 VE-PTP-매개된 탈인산화의 억제에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 구체예에서, 후보 작용제들은 활성에 대해 먼저 생체내에서 스크리닝된다.
특이적 억제자의 확인에 사용하기 위한 적합한 검정의 선택은 스크리닝될 후보 작용제의 성질에 좌우된다. 예를 들어, 후보들이 Fc 모이어티를 포함하는 항체 또는 펩티바디인 경우에, 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석은 후보 작용제가 VE-PTP를 발현하는 세포에 결합하는 능력에 기반하여 선택되는 것을 허용한다. 세포는 VE-PTP를 내재적으로 발현할 수 있거나 VE-PTP를 발현하도록 유전자 공학처리될 수 있다. 앱타머(aptamer)와 같은 다른 후보 작용제의 경우, 다른 기법이 활용될 수 있다. 예를 들어, VE-PTP에 특이적으로 결합하는 앱타머는 반복된 시험관내 선택 라운드를 통해 특이적 앱타머를 선택하는, 지수적 풍부화에 의한 리간드의 체계적 진화 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX))를 사용하여 선택될 수 있다.
VE-PTP 억제자는 VE-PTP-매개된 활성, 예를 들어, Tie2 탈인산화의 억제에 대해 스크리닝될 수 있다. 웨스턴 블롯팅을 기반으로 한 한 가지 적합한 검정에서, 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVEC)가 다양한 농도의 후보 작용제의 존재 또는 부재하에 혈청 유리 배지에서 배양되고, 세포의 용해물이 제조되고, Tie2 항체로 면역침전되고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분해되고, 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 (PVDF) 막에 전달된다. 막-결합 면역침전된 단백질이 그런 후 연속적으로 항-포스포티로신 항체로 웨스턴 블롯팅되어 Tie2 인산화가 정량화되고 이어서 Tie2 항체로 웨스턴 블롯팅되어 총 Tie2가 정량화된다. Tie2 인산화는 총 Tie2 신호를 초과하는 항-포스포티로신 신호의 비율로서 표시된다. 더 큰 수준의 항-포스포티로신 신호는 후보 작용제에 의한 더 큰 VE-PTP 억제를 가리킨다.
하이브리도마 기술은 특이적 항원을 표적화하는 대다수의 단클론성 항체를 제조하기 위한 방법이다. 하이브리도마 발달은 포유류 숙주, 예컨대 마우스 (쥐과) 또는 토끼를, 면역 반응을 도발하는 항원으로 주입함으로써 시작된다. 항원에 대한 반응으로, 숙주의 B-림프구 (B-세포)는 그 항원에 결합하는 항체를 생성한다. 그런 후 B-세포는 숙주로부터 수득되고 불멸의 B 세포 암세포 (골수종 세포)와 융합되어 하이브리도마로서 알려진 하이브리드 세포주가 생성된다. 하이브리도마는 B 세포의 항체-생성 능력 및 골수종의 과장된 장수 및 재생성을 둘 다 보유한다. 하이브리도마는 하나의 생존성 하이브리도마로 시작하여 배양 중에 유전적으로 동일한 하이브리도마로 구성되는 새로운 배양물을 생성하도록 성장할 수 있고, 그것은 계속해서, 배양당 하나의 항체 (단클론성) 또는 상이한 항체의 혼합물 (다클론성)을 생성한다. 이 과정에 사용된 골수종 세포주는 조직 배양 중에 성장하는 능력 및 항체를 합성하지 못하는 무능력에 대해 선택된다. 배양 후에, 일차 스크리닝 과정이 수행되어 최고의 특이성을 가지는 항체를 생성하는 하이브리도마가 확인되고 선택된다. 항체 스크리닝 기법의 비-제한적인 예로는 ELISA 및 면역세포화학적 스크리닝을 들 수 있다. 그런 후 스크리닝으로부터 확인된 선두 하이브리도마는 반응성, 결합 친화성, 특이성, 및 교차-반응성에 대해 특성화될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시의 화합물의 HPTP-β에 대한 결합 친화성 (KD)은 약 70 pM 내지 약 70 nM, 1 nM 내지 약 70 nM, 또는 적어도 1 nM로 강력하다. 일부 구체예에서, 본 개시의 화합물의 HPTP-β에 대한 결합 친화성 (KD)은 약 4 nM 내지 약 70 nM이다.
다른 재조합 항체 엔지니어링 기법은 포유류보다는 바이러스 또는 효모의 사용을 포함한다. 이런 기법들은 원하는 특이성을 가진 항체가 선택될 수 있는, 약간 상이한 아미노산 서열을 가지는 항체 라이브러리를 생성하기 위하여 면역글로불린 유전자 분절의 신속한 클로닝에 의존한다. 항체 라이브러리는 표적 항원에 대한 특이성, 다양한 환경 조건에서의 안정성, 치료 효능, 및 진단 적용에서의 검출 가능성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
인간 투여를 위해, 비-인간 종으로부터 생성된 단클론성 항체는 추가로 표적 특이성을 보존하는 한편 면역원성의 가능성을 감소시키기 위한 인간화 과정에 의해 최적화될 수 있다. 인간화 과정은 분리된 항체를 생성하는 유전자들의 유전자 서열에 인간 DNA를 통합시키는 것을 포함한다. 그런 후 재조합 DNA는 클로닝되고 새롭게 인간화된 항체의 대규모 제조를 위한 세포에서 발현된다.
인간화된 항체의 예는 변형된 키메릭 항체이다. 키메릭 항체는 상기에서 기술된 것과 같이 생성된다. 키메릭 항체는 상동성 인간 서열로 가변 영역에서 비-인간 서열을 치환하기 위하여 추가로 CDR 외부에서 돌연변이된다. 인간화된 항체의 또 다른 예는 비-인간 CDR 서열이 상응하는 인간 CDR 서열을 교체하기 위하여 인간 항체 스캐폴드의 인간 중쇄 및 경쇄 가변 서열로 도입되는, CDR-그라프팅 항체이다.
인간화된 항체는 포유류 세포, 생물 반응기, 또는 형질전환 동물, 예컨대 마우스, 닭, 양, 염소, 돼지, 및 마모셋에서 제조될 수 있다. 형질전환 동물은 동물의 게놈에 삽입된 인간 항체-생성 게놈의 실질적인 부분을 가질 수 있다.
전체 인간 단클론성 항체는 그것의 항원-결합 잔기가 전체적으로 선택된 인간 면역글로불린 서열 또는 그것의 단편으로부터 유래된 항체에 상응한다. 일부 구체예에서, 이런 선택은 일련의 가변성 항체 도메인이 사상 파지 (filamentous phage) 코트 단백질에서 발현되고 표적 항원에의 결합을 위해 풍부화되는 파지 디스플레이 기법을 사용하여 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 이런 선택은 전체 세트의 내인성 면역글로불린 유전자가 전체 세트의 인간 면역글로불린 유전자로 교체되어 있는, 형질전환 동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 또는 토끼를 사용하여 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 전체 세트의 인간 면역글로불린 유전자는 동물의 게놈에 도입될 수 있고 내인성 항체 제조는 항체의 제조가 결핍되게 만든다.
VE-PTP (HPTP-β)를 표적화하는
인간화된 단클론성 항체
본원에 기술된 VE-PTP (HPTP-β)를 표적화하는 쥐과 단클론성 항체의 인간화 과정은 성숙한 인간 IgG 서열의 항체 구조 및 데이터베이스와 결합된 CDR-그라프팅 기술의 조합을 활용한다. 인간 프레임워크 서열이 CDR 서열을 위한 억셉터 프레임워크로서 사용되었다. 이런 억셉터(acceptor) 서열들은 모두 파지 디스플레이로부터가 아니라 인간 공급원으로부터의 성숙한 인간 IgG로부터 기원한다.
인간 VE-PTP (HPTP-β)의 재조합 세포외재성 도메인에 대하여 발생된 쥐과 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대해 4개의 인간화된 변종이 설계되었다. 설계는 상동성, T-세포 에피토프, 핵심 잔기, 및 예측된 구조를 포함한 인자들을 기반으로 하였다.
본원에서 개시된 서열들은 IMGT 및 Kabat으로부터의 항체 넘버링 시스템을 사용하여 확인되었다. 이 두 가지의 넘버링 시스템은 쥐과 항체의 상이한 잔기들을 CDR에 속하는 것으로서 확인하였고, 조합된 IMGT/Kabat CDR 서열이 CDR-루프 형태의 최적 보유를 위해 사용되었다.
중쇄 서열
SEQ ID NO: 1은 인간 VE-PTP (HPTP-β)를 표적으로 하는 쥐과 단클론성 항체 R15E6의 VH 도메인 (VH0)으로, 쥐과 신호 펩타이드 서열 (밑줄)을 포함한다. SEQ ID NO: 47은 쥐과 신호 펩타이드 서열이 없는 R15E6의 VH 도메인의 절단된 서열이다. SEQ ID NO: 2는 R15E6의 쥐과 VH 도메인에 가장 가까운 인간 생식선 유전자 V-영역, 호모 사피엔스(Homo sapiens) IGHV3-73이다. SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4는 각각 SEQ ID NO: 2에 유사한 추가적인 생식선 V-영역인 호모 사피엔스 IGHV3-72 및 호모 사피엔스 IGHV3-48이다. SEQ ID NO: 1 내지 4의 펩타이드 서열은 표 1에 제시된다.
SEQ ID NO: | 명칭 | 아미노산 서열 |
1 | VH0 | MDFGLSWVFFVVFYQGVHCEVQLVETGGGLVQPKGSMKLSCAASGFTFNANAMNWIRQAPGKGLEWVARIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDAQNMLYLQMNDLKTEDTAMYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSA |
47 | 절단된 VH0 | EVQLVETGGGLVQPKGSMKLSCAASGFTFNANAMNWIRQAPGKGLEWVARIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDAQNMLYLQMNDLKTEDTAMYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSA |
2 | IGHV3-73 | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANSYATAYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTR |
3 | IGHV3-72 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMDWVRQAPGKGLEWVGRTRNKANSYTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR |
4 | IGHV3-48 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR |
인간 IgG 서열의 온라인 데이터베이스가 쥐과 VH 도메인과의 비교를 위해 BLAST 탐색 알고리즘을 사용하여 탐색되었고, 후보 인간 가변 도메인이 상위 200개의 BLAST 결과로부터 선택되었다. 대등한 인간 가변 도메인들은 프레임워크 상동성, 유지 프레임워크 잔기, 및 정석의 루프 구조의 조합을 기반으로 4개의 후보로 축소되었다. 표 2는 4개의 선택된 억셉터 프레임워크인, SEQ ID NO: 5내지 8을 열거한다. SEQ ID NO: 5는 AEX29600이고, SEQ ID NO: 6은 AAC51024이며, SEQ ID NO: 7은 AEX29289이고, SEQ ID NO: 8은 ABA26204이다.
SEQ ID NO: | 명칭 | 아미노산 서열 |
5 | AEX29600 | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANNYATAYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAAYYCIRDYYGATRGFQHWGQGTLVTVSS |
6 | AAC51024 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMDWVRQAPGKGLEWVGRTRNKANSYTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARYVVGATLDYWGQGTLVTVSS |
7 | AEX29289 | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFSFGDYAMNWVRQAPGKGLEWVGFIRSKTYGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDPADFYYYSSGQTGWFDPWGQGTLVTVSS |
8 | ABA26204 | LVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVHYCARDGYSSSWYVDYWGQGTLVTVSS |
쥐과 VH의 CDR을 억셉터 프레임워크 (SEQ ID NO: 5 내지 8)로 그라프팅하는 것은 이 서열들을 표 3에 나타낸 인간화된 변종으로 변환시켰다. SEQ ID NO: 9는 VH1이고, SEQ ID NO: 10은 VH2이며, SEQ ID NO: 11은 VH3이고, SEQ ID NO: 12는 VH4이다.
SEQ ID NO: | 명칭 | 아미노산 서열 |
9 | VH1 | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNANAMNWVRQASGKGLEWVGRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAAYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSS |
10 | VH2 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNANAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSS |
11 | VH3 | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFNANAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSS |
12 | VH4 | LVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNANAMNWIRQAPGKGLEWVSRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVHYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSS |
도 1은 쥐과 VH 서열 (절단된 VH0; SEQ ID NO: 47)과 4개의 인간화된 변종 SEQ ID NO: 9 (VH1), SEQ ID NO: 10 (VH2), SEQ ID NO: 11 (VH3), 및 SEQ ID NO: 12 (VH4)와의 서열 배열을 나타낸다. VH/VK 인터페이스 및 정석의 루프 구조에 중요한 잔기들은 보존되었다.
쥐과 VH에 대한 인간화된 변종의 퍼센트 상동성이 표 4에 제시된다. 인간화된 변종의 상동성의 순위는 VH2>VH1>VH3>VH4이다.
인간화된 변종 | 동일한 아미노산 | 공통 아미노산s |
VH1 (SEQ ID NO: 9) | 89.3 % | 94.3 % |
VH2 (SEQ ID NO: 10) | 90.2 % | 96.7 % |
VH3 (SEQ ID NO: 11) | 87.7 % | 95.1 % |
VH4 (SEQ ID NO: 12) | 86.9 % | 93.4 % |
경쇄 서열
하기 표 5에서, SEQ ID NO: 13은 쥐과 신호 펩타이드 서열 (밑줄)을 포함하는 R15E6의 쥐과 VL 도메인 (VL0)이다. SEQ ID NO: 48은 쥐과 신호 펩타이드 서열이 없는 R15E6의 VL 도메인의 절단된 서열이다. SEQ ID NO: 14는 R15E6의 쥐과 VL 도메인에 가장 가까운 인간 생식선 유전자 V-영역인, 호모 사피엔스 IGKV1-16이다. SEQ ID NO: 15는 IGKV4-1이고 IGKV1-16에 매우 유사하다.
SEQ ID NO: | 명칭 | 아미노산 서열 |
13 | VL0 | MESQTQVFVYMLLWLSGVEGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQHVGTAVAWYQQKPDQSPKQLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPFTFGSGTKLEIK |
48 | 절단된 VL0 | DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQHVGTAVAWYQQKPDQSPKQLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPFTFGSGTKLEIK |
14 | IGKV1-16 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYP |
15 | IGKV4-1 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP |
인간 IgK 서열의 온라인 데이터베이스가 쥐과 VL 도메인과의 비교를 위해 BLAST 탐색 알고리즘을 사용하여 탐색되었고, 후보 인간 가변 도메인들이 상위 200개의 BLAST 결과로부터 선택되었다. 이 대등한 인간 가변 도메인들은 프레임워크 상동성, 유지 프레임워크 잔기 및 정석의 루프 구조의 조합을 기반으로 4개의 후보로 축소되었다. 표 6은 4개의 선택된 억셉터 프레임워크를 열거한다. SEQ ID NO: 16은 AF234256_1이고, SEQ ID NO: 17은 AAD03722이며, SEQ ID NO: 18은 AAY33352이고, SEQ ID NO: 19는 AAZ09113이다.
SEQ ID NO: | 명칭 | 아미노산 서열 |
16 | AF234256_1 | DVVMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQRPGKAPKLLIYAASTLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQLGGYPLTFGGGTKLEIK |
17 | AAD03722 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPYTFGQGTKLEIK |
18 | AAY33352 | DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCRASQGIGSSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCLQHHDYPLTFGGGTKLEIK |
19 | AAZ09113 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVFYSSNNKNYLAWYQQKPEQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSSPLTFGGGTKVEIK |
쥐과 VL의 CDR을 이 억셉터 프레임워크들로 그라프팅하는 것은 이 서열들을 표 7에 나타낸 인간화된 변종으로 변환시켰다. SEQ ID NO: 20은 VL1이고 SEQ ID NO: 21은 VL2이며 SEQ ID NO: 22는 VL3이고 SEQ ID NO: 23은 VL4이다.
SEQ ID NO: | 명칭 | 아미노산 서열 |
20 | VL1 | DVVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQHVGTAVAWYQQRPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQYSSYPFTFGGGTKLEIK |
21 | VL2 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVGTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSSYPFTFGQGTKLEIK |
22 | VL3 | DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCKASQHVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYSSYPFTFGGGTKLEIK |
23 | VL4 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVGTAVAWYQQKPEQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSSYPFTFGGGTKVEIK |
도 2는 쥐과 VL 서열 (절단된 VL0; SEQ ID NO: 48)과 4개의 인간화된 VL 변종 SEQ ID NO: 20 (VL1), SEQ ID NO: 21 (VL2), SEQ ID NO: 22 (VL3), 및 SEQ ID NO: 23 (VL4)과의 서열 배열을 나타낸다. VL/VK 인터페이스 및 정석의 루프 구조에 중요한 잔기들은 보존되었다.
쥐과 VL에 대한 인간화된 변종의 퍼센트 상동성이 표 8에 제시된다. 인간화된 변종의 상동성의 순위는 VL3>VL1>VL2>VL4이다.
인간화된 변종 | 동일한 아미노산 | 공통 아미노산 |
VL1 (SEQ ID NO: 20) | 81.3 % | 88.8 % |
VL2 (SEQ ID NO: 21) | 79.4 % | 88.8 % |
VL3 (SEQ ID NO: 22) | 82.2 % | 86.9 % |
VL4 (SEQ ID NO: 23) | 78.5 % | 89.7 % |
인간화된 항체의 설계: 4 V
H
및 4 V
L
사슬의 조합
마우스 가변 사슬들은, 온전한 항체 단백질의 발현에 대해 IgG4 중쇄의 맥락에서 상기 기술된 것과 같이, 쥐과 CDR 서열을 적합한 인간 항체 도너 서열 위로 그라프팅함으로써 인간화되었다. 전체 길이 인간화된 항체의 패널은 그런 후 발현을 위해 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주에서 코돈-최적화되었다. 상이한 인간 도너 서열들을 사용하여 각각의 가변 사슬에 대해 설계된 4개의 변종은 발현을 위한 16개의 인간 항체의 매트릭스를 생성하였고, 그것들의 중쇄 및 경쇄 쌍이 표 9에 제시된다. 인간 IgG4 불변 도메인에 그라프팅된 전체 마우스 가변 도메인들 (VH0-VL0)을 가진 키메릭 변종이 결합 및 기능 검정에서 양성 대조군으로서 생성되었다.
V H1 -V L1 | SEQ ID NO: 9-SEQ ID NO: 20 | V H3 -V L1 | SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 20 |
V H1 -V L2 | SEQ ID NO: 9-SEQ ID NO: 21 | V H3 -V L2 | SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 21 |
V H1 -V L3 | SEQ ID NO: 9-SEQ ID NO: 22 | V H3 -V L3 | SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 22 |
V H1 -V L4 | SEQ ID NO: 9-SEQ ID NO: 23 | V H3 -V L4 | SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 23 |
V H2 -V L1 | SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO: 20 | V H4 -V L1 | SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 20 |
V H2 -V L2 | SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO: 21 | V H4 -V L2 | SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 21 |
V H2 -V L3 | SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO: 22 | V H4 -V L3 | SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 22 |
V H2 -V L4 | SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO: 23 | V H4 -V L4 | SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 23 |
T-세포 에피토프 스크린
중쇄
MHC 부류 II 분자의 그루브(groove)에 펩타이드 서열의 제공은 CD8+ T-세포의 활성화 및 면역 반응으로 이어진다. 이런 반응을 감소시키기 위하여, 치료 단백질은 MHC 부류 II 분자에 대한 결합 친화성을 감소시킴으로써 T-세포를 활성화할 수 있는 T-세포 에피토프의 통합을 피하기 위해 설계될 수 있다.
인간화 과정이 고친화성을 가진 펩타이드 서열을 제거하였는지를 측정하기 위하여 쥐과 항체 VH 및 VL 및 인간화된 변종 서열이 MHC II 결합 펩타이드에 대해 인 실리코 알고리즘을 사용하여 스크리닝되었다. 표 10은 스크리닝 결과를 나타내는데, 여기서 고친화성 T-세포 에피토프 코어는 굵게 표시된다 (IC50 < 50 nM). 인간 생식선 서열 ICHV3-73, ICHV3-72, 및 ICHV3-48이 또한 비교를 위해 분석되었다. 생식선 서열에 존재하고 인간화된 변종에 매치된 임의의 잠재적 T-세포 에피토프는 이탤릭체로 표시된다. CDR은 밑줄로 표시된다.
SEQ ID NO: | 명칭 | 아미노산 서열 |
2 | IGHV3-73 | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANSYATAYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTR |
3 | IGHV3-72 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMDWVRQAPGKGLEWVGRTRNKANSYTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR |
4 | IGHV3-48 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR |
47 | 절단된 VH0 | EVQLVETGGGLVQPKGSMKLSCAASGFTFNANAMNWIRQAPGKGLEWVARIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDAQNMLYLQMNDLKTEDTAMYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSA |
9 | VH1 | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNANAMNWVRQASGKGLEWVGRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAAYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSS |
10 | VH2 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNANAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSS |
11 | VH3 | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFNANAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSS |
12 | VH4 | LVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNANAMNWIRQAPGKGLEWVSRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVHYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSS |
경쇄 서열
표 11은 스크리닝의 결과를 나타내며, 고친화성 T-세포 에피토프 코어는 굵게 표시된다 (IC50 < 50 nM). 인간 생식선 서열 IGKV1-16 및 IGKV4-1 또한 비교를 위해 분석되었고, 생식선 서열에 존재하고 인간화된 변종에 매치된 임의의 잠재적 T-세포 에피토프는 이탤릭체로 표시된다. CDR은 밑줄로 표시된다.
SEQ ID NO: | 명칭 | 아미노산 서열 |
14 | IGKV1-16 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYP |
15 | IGKV4-1 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP |
48 | 절단된 VL0 | DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQHVGTAVAWYQQKPDQSPKQLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPFTFGSGTKLEIK |
20 | VL1 | DVVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQHVGTAVAWYQQRPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQYSSYPFTFGGGTKLEIK |
21 | VL2 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVGTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSSYPFTFGQGTKLEIK |
22 | VL3 | DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCKASQHVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYSSYPFTFGGGTKLEIK |
23 | VL4 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVGTAVAWYQQKPEQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSSYPFTFGGGTKVEIK |
쥐과 VL0은 인간화된 변종 중 3개에 존재하지 않는, 경쇄의 CDR3/프레임워크 4 영역 내의 T-세포 에피토프를 함유한다.
번역 후 변형
Fv 글리코실화.
N-결합 글리코실화 모티프는 NXS/T이고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 이 모티프는 R15E6 VH 또는 VL의 쥐과 또는 인간화된 변종에 존재하지 않았다.
탈아미드화.
아미노산 모티프 SNG, ENN, LNG, 및 LNN은 아스파르트산을 제공하기 위하여 아스파라긴을 탈아미드화하기 쉽다. 이 4개의 모티프 중 어느 것도 R15E6 VH 또는 VL의 쥐과 또는 인간화된 변종에 존재하지 않았다.
신호 펩타이드.
쥐과 항체 신호 펩타이드들은 CHO 세포에서 고수준의 발현을 초래할 수 있다. 다음의 신호 펩타이드들이 인간화된 변종에 통합될 수 있다.
중쇄 신호 펩타이드 (SEQ ID NO: 24): MGWTLVFLFLLSVTAGVHS
경쇄 신호 펩타이드 (SEQ ID NO: 25): MVSSAQFLGLLLLCFQGTRC
VH 도메인들의 각각은 인간 IgG4 동형 불변 도메인 서열과 인-프레임으로 합성될 수 있고, 이때 안정화시키는 S228P 돌연변이가 있다. 전체 중쇄 서열은 코돈 최적화될 수 있고, DNA 서열은 확인될 수 있다. S228P 돌연변이가 있는 IgG4 불변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 26)은 다음과 같다:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV
PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV
VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF
FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.
VL 도메인들의 각각은 인간 IgK 동형 불변 도메인 서열과 인-프레임으로 합성될 수 있다. 전체 경쇄 서열은 코돈 최적화될 수 있고, DNA 서열은 확인될 수 있다. IgK 불변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 27)은 다음과 같다:
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL
TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
변종 사슬들의 각각은 DNA 서열분석에 의해 확인될 수 있다. 그런 후, 각각의 인간화된 항체의 일시적인 트랜스펙션 및 발현이 수행될 수 있다. 하나의 키메릭 항체가 양성 대조군으로서 사용하기 위해 발현될 수 있고, 쥐과 가변 도메인, 인간 Ig 불변 도메인을 가질 수 있다. 16개의 인간화된 변종만이 인간화된 가변 도메인 및 인간 Ig 불변 도메인을 가진다. 표 12는 인간화된 가변 도메인 및 인간 Ig 불변 도메인을 가지는 16개의 인간화된 변종을 제공하는 중쇄 및 경쇄 쌍을 나타낸다.
키메릭 항체 | HC0-LC0 | |||
인간화된 변종 | HC1-LC1 | HC1-LC2 | HC1-LC3 | HC1-LC4 |
HC2-LC1 | HC2-LC2 | HC2-LC3 | HC2-LC4 | |
HC3-LC1 | HC3-LC2 | HC3-LC3 | HC3-LC4 | |
HC4-LC1 | HC4-LC2 | HC4-LC3 | HC4-LC4 |
표 13 및 표 14는 각각의 인간화된 중쇄 및 경쇄의 전체 아미노산 서열을 열거한다.
SEQ ID NO: | 명칭 | 아미노산 서열 |
28 | HC0 | MGWTLVFLFLLSVTAGVHSEVQLVETGGGLVQPKGSMKLSCAASGFTFNANAMNWIRQAPGKGLEWVARIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDAQNMLYLQMNDLKTEDTAMYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK |
29 | HC1 | MGWTLVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNANAMNWVRQASGKGLEWVGRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAAYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK |
30 | HC2 | MGWTLVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNANAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK |
31 | HC3 | MGWTLVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFNANAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDDSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK |
32 | HC4 | MGWTLVFLFLLSVTAGVHSLVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNANAMNWIRQAPGKGLEWVSRIRTKSNNYATYYAGSVKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVHYCVRDYYGSSAWITYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK |
SEQ ID NO: | 명칭 | 아미노산 서열 |
33 | LC0 | MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQHVGTAVAWYQQKPDQSPKQLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
34 | LC1 | MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDVVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQHVGTAVAWYQQRPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQYSSYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
35 | LC2 | MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVGTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSSYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
36 | LC3 | MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCKASQHVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYSSYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
37 | LC4 | MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVGTAVAWYQQKPEQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSSYPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
표적 서열은 본원에 제공된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성, 적어도 약 81% 상동성, 적어도 약 82% 상동성, 적어도 약 83% 상동성, 적어도 약 84% 상동성, 적어도 약 85% 상동성, 적어도 약 86% 상동성, 적어도 약 87% 상동성, 적어도 약 88% 상동성, 적어도 약 89% 상동성, 적어도 약 90% 상동성, 적어도 약 91% 상동성, 적어도 약 92% 상동성, 적어도 약 93% 상동성, 적어도 약 94% 상동성, 적어도 약 95% 상동성, 적어도 약 96% 상동성, 적어도 약 97% 상동성, 적어도 약 98% 상동성, 적어도 약 99% 상동성, 적어도 약 99.1% 상동성, 적어도 약 99.2% 상동성, 적어도 약 99.3% 상동성, 적어도 약 99.4% 상동성, 적어도 약 99.5% 상동성, 적어도 약 99.6% 상동성, 적어도 약 99.7% 상동성, 적어도 약 99.8% 상동성, 적어도 약 99.9% 상동성, 적어도 약 99.91% 상동성, 적어도 약 99.92% 상동성, 적어도 약 99.93% 상동성, 적어도 약 99.94% 상동성, 적어도 약 99.95% 상동성, 적어도 약 99.96% 상동성, 적어도 약 99.97% 상동성, 적어도 약 99.98% 상동성, 또는 적어도 약 99.99% 상동성을 가질 수 있다.
둘 이상의 펩타이드 또는 핵산 사이의 상동성을 측정하기 위하여 다양한 방법 및 소프트웨어 프로그램, 예컨대 NCBI BLAST, Clustal W, MAFFT, Clustal Omega, AlignMe, Praline, 또는 기타 적합한 방법 또는 알고리즘이 사용될 수 있다.
제약학적 조성물
발명의 제약학적 조성물은 본원에 기술된 임의의 제약학적 화합물과 기타 화학적 구성요소들, 예컨대 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 증점제, 및/또는 부형제와의 조합일 수 있다. 제약학적 조성물은 화합물의 유기체에의 투여를 용이하게 한다. 제약학적 조성물은 제약학적 조성물로서 치료적 유효량으로, 다양한 형태 및 경로에 의해, 이를테면, 예를 들어 정맥내, 근육내, 경구, 비경구, 눈, 및 국소적 투여에 의해 투여될 수 있다.
제약학적 조성물은 예를 들어, 국소적, 경구, 전신적, 유리체내(intravitreal), 전방내(intracameral), 결막밑(subconjunctival), 테논낭밑(subtenon), 안구 뒤(retrobulbar), 안내(intraocular), 후방 공막옆(posterior juxtascleral), 눈 주위, 망막밑(subretinal), 및 맥락막 위공간(suprachoroidal) 투여를 포함한, 임의의 적합한 형태 또는 경로를 통해 눈에 투여될 수 있다. 조성물은 전방(anterior chamber), 후방(posterior chamber), 유리체방(vitreous chamber (유리체내)), 망막 신경(retina proper), 및/또는 망막밑 공간을 포함하여 눈의 임의의 부분에 제형을 주사함으로써 투여될 수 있다. 조성물은 비침습성 방법을 통해 전달될 수 있다. 제제를 투여하는 비침습성 방법은 바늘이 없는 주사 장치를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 다중 투여 경로가 제약학적 조성물의 효율적인 전달을 위해 사용될 수 있다.
제약학적 조성물은 임의의 적합한 눈 세포, 이를테면, 예를 들어, 혈관 내피 세포와 같은 내피 세포, 망막 피그먼트 상피세포 (RPE)와 같은 망막 세포, 각막 세포, 섬유모세포, 성상세포, 신경교 세포, 혈관주위세포, 홍채 상피 세포, 신경 기원 세포, 모양체 상피 세포, 뮬러 세포, 눈을 둘러싼 눈에 부착된 근육 세포, 예컨대 외직근(lateral rectus muscle)의 세포, 안와 지방 세포, 공막(sclera) 및 겉공막(episclera)의 세포, 섬유주대(trabecular meshwork)의 세포, 및 결합 조직 세포를 표적으로 할 수 있다.
제약학적 조성물은 국소적인 방식으로, 예를 들어, 화합물의 기관으로의 직접적인 주사를 통해, 선택적으로 데포(depot)로 또는 지속적인 방출 제제로 또는 이식편으로 투여될 수 있다. 제약학적 조성물은 신속한 방출 제제의 형태로, 연장된 방출 제제의 형태로, 또는 중간 방출 제제의 형태로 제공될 수 있다. 연장된 방출 제제는 조절된 방출 또는 지속적인 지연 방출을 제공할 수 있다.
투여를 위한 제약학적 제제는 수용성 형태로 활성 화합물의 수성 용액을 포함할 수 있다. 활성 화합물의 현탁액은 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균된 발열원이 없는 물로 구성되기 위해 분말 형태로 있을 수 있다.
본원에 제공된 치료 또는 사용의 방법을 실행함에 있어서, 치료적 유효량의 본원에 기술된 화합물은 치료될 질환 또는 질병을 가진 대상체에게 제약학적 조성물로 투여된다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간과 같은 포유류이다. 치료적 유효량은 질환의 심각성, 대상체의 연령 및 상대적인 건강상태, 사용된 화합물의 효능, 및 기타 인자들에 따라 광범위하게 달라질 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 화합물은 단일하게 또는 혼합물의 구성요소로서 하나 이상의 치료제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 항체, 예를 들어 항-VEGF 작용제와 공동 제형되거나 동시 투여될 수 있다. 항-VEGF 작용제는 화합물, 항체, 또는 항체 단편, 변종 또는 그것들의 유도체일 수 있다. 항-VEGF 작용제의 비-제한적인 예로는 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®), 라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis®), 및 아플리버셉트 (Eylea®)를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 화합물은 항-VEGF 작용제로의 치료 전, 중, 또는 후에 사용될 수 있다.
제약학적 조성물은 제약학적으로 사용될 수 있는 조제물로 활성 화합물의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는, 하나 이상의 생리적으로 허용되는 담체를 사용하여 제제화될 수 있다. 제제는 선택딘 투여 경로에 따라 변형될 수 있다. 본원에 기술된 화합물을 포함하는 제약학적 조성물은 예를 들어, 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획, 또는 압축 과정에 의해 제조될 수 있다.
제약학적 조성물은 적어도 하나의 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제 및 본원에 기술된 화합물을 유리-염기 또는 제약학적으로 허용되는 염 형태로 포함할 수 있다. 제약학적 조성물은 가용화제, 안정화제, 등장성 향상제, 완충제, 및 보존제를 함유할 수 있다.
본원에 기술된 화합물을 포함하는 조성물의 제조 방법은 화합물을 하나 이상의 비활성, 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체로 제제화하여 고체, 반고체, 또는 액체 조성물을 형성하는 단계를 포함한다. 고체 조성물은, 예를 들어, 분말, 정제, 분산성 과립, 캡슐, 및 카시에를 포함한다. 액체 조성물은 예를 들어 화합물이 용해되는 용액, 화합물을 포함하는 에멀션, 또는 본원에 개시된 화합물을 포함하는 리포좀, 미셸, 또는나노입자를 함유하는 용액을 포함한다. 반고체 조성물은 예를 들어 겔, 현탁액 및 크림을 포함한다. 조성물은 액체 용액 또는 현탁액, 사용 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로, 또는 에멀션으로서 있을 수 있다. 이런 조성물들은 또한 미량의 무독성의, 보조 물질, 예컨대 습윤 또는 유화제, pH 완충제, 및 기타 제약학적으로 허용되는 첨가제를 함유할 수 있다.
발명에 사용하기에 적합한 투여 형태의 비-제한적 실례로는 액체, 분말, 겔, 나노현탁액, 나노입자, 마이크로겔, 수성 또는 유성 현탁액, 에멀션, 및 그것들의 임의의 조합을 들 수 있다.
발명에 사용하기에 적합한 제약학적으로 허용되는 부형제의 비-제한적 실례로는 결합제, 붕해제, 부착방지제, 정전기 방지제, 계면활성제, 항산화제, 코팅제, 착색제, 가소화제, 보존제, 현탁제, 유화제, 항-미생물제, 구형화제, 및 그것들의 임의의 조합을 들 수 있다.
발명의 조성물은, 예를 들어 즉시 방출 형태 또는 조절된 방출 제제일 수 있다. 즉시 방출 제제는 화합물이 신속하게 작용하는 것을 허용하도록 제제화될 수 있다. 즉시 방출 제제의 비-제한적 실례로는 쉽게 용해될 수 있는 제제를 포함한다. 조절된 방출 제제는 활성제의 방출 속도 및 방출 프로파일이 생리적 및 시간요법적 요구조건에 매치될 수 있도록 조정되었거나, 또는 대안적으로, 예정된 속도로 활성제의 방출을 이루도록 제제화된 제약학적 제제일 수 있다. 조절 방출 제제의 비-제한적 실례로는 과립, 지연 방출 과립, 하이드로겔 (예컨대 합성 또는 천연 기원의 하이드로겔), 기타 겔화제 (예컨대 겔-형성 식이성 섬유), 매트릭스-기반 제제 (예컨대 적어도 하나의 활성 성분이 그 안에 분산되어 있는 폴리머 물질을 포함하는 제제), 매트릭스, 폴리머 혼합물, 및 과립 덩어리 내의 과립을 들 수 있다.
일부에서, 조절된 방출 제제는 지연 방출 형태이다. 지연 방출 형태는 연장된 시간 동안 화합물의 작용을 지연시키기 위하여 제제화될 수 있다. 지연 방출 형태는 하나 이상의 화합물의 유효 용량의 방출을 약 4, 약 8, 약 12, 약 16, 또는 약 24시간 동안 지연시키기 위하여 제제화될 수 있다.
조절된 방출 제제는 지속성 방출 형태일 수 있다. 지속성 방출 형태는 예를 들어 연장된 시간에 걸쳐 화합물의 작용을 지속시키기 위해 제제화될 수 있다. 지속성 방출 형태는 약 4, 약 8, 약 12, 약 16, 또는 약 24시간에 걸쳐 본원에 기술된 임의의 화합물의 유효 용량을 제공하기 위해 (예컨대 생리적으로 유효한 혈액 프로파일을 제공하기 위해) 제제화될 수 있다.
개시된 조성물은 제약학적으로 허용되는 보존제를 선택적으로 포함할 수 있다.
제약학적으로 허용되는 부형제의 비-제한적인 실례는 예를 들어 다음 문헌들: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)에서 찾아볼 수 있고, 이것들은 각각 그 전문이 참조로 포함된다.
본원에 기술된 화합물은 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물로 편리하게 제제화될 수 있다. 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, by E.W. Martin Mack Pub. Co., Easton, PA를 참조하며, 이것은 그 전문이 참조로 포함되고, 전형적인 담체 및 제약학적 조성물을 제조하는 종래 방법을 개시한다. 그러한 담체는 멸균수, 염수, 및 생리적 pH에서의 완충 용액과 같은 용액을 포함하여, 인간 및 비-인간에게 조성물을 투여하기 위한 담체일 수 있다. 제약학적 조성물은 또한 항미생물제, 항염증제, 및 마취제와 같은 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.
제약학적으로 허용되는 담체의 비-제한적인 실례는 염수, 링거액, 및 덱스트로오스 용액을 포함한다. 일부 구체예에서, 용액의 pH는 약 5 내지 약 8일 수 있고, 약 7 내지 약 7.5일 수 있다. 추가로 담체는 화합물을 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반침투성 매트릭스와 같은 지속성 방출 조제물을 포함한다. 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들어 필름, 리포좀, 마이크로입자, 또는 마이크로캡슐의 형태로 있을 수 있다.
개시된 방법은 항체 표적화 VE-PTP (HPTP-β)를 제약학적 조성물의 일부로서 투여하는 것에 관련된다. 국소 투여에 적합한 조성물이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 발명의 조성물은 용액에, 현탁액에, 또는 둘 다에 활성제를 포함하는 액체를 포함할 수 있다. 액체 조성물은 겔을 포함할 수 있다. 액체 조성물은 예를 들어 수성일 수 있다. 조성물은 인시튜 겔화 가능한 수성 조성물이다. 반복하면, 조성물은 인시튜 겔화 가능한 수용액이다. 그러한 조성물은 눈과 또는 눈 외부에서 누액(lacrimal fluid)과 접촉시 겔화를 촉진하기에 효과적인 농도로 겔화제를 포함할 수 있다. 수성 조성물은 안과적으로 부합하는 pH 및 오스몰 농도를 가질 수 있다. 조성물은 결막밑 투여를 위한 활성제를 포함하는 안과용 데포 제제(ophthalmic depot formulation)를 포함할 수 있다. 활성제를 포함하는 마이크로입자가 생체부합성, 제약학적으로 허용되는 폴리머 또는 지질 캡슐화제에 삽입될 수 있다. 데포 제제는 연장된 시간에 걸쳐 모든 또는 실질적으로 모든 활성 물질을 방출하기 위해 조정될 수 있다. 폴리머 또는 지질 매트릭스는, 존재하는 경우에, 모든 또는 실질적으로 모든 활성제의 방출 후에 투여 부위로부터 수송되기에 충분할 정도로 조정될 수 있다. 데포 제제는 제약학적으로 허용되는 폴리머 및 용해된 또는 분산된 활성제를 포함하는 액체 제제일 수 있다. 주사시, 폴리머는 주사 부위에, 예를 들어 겔화 또는 침전이 형성됨으로써 데포를 형성한다. 조성물은 눈의 적합한 위치에, 예컨대 눈과 눈꺼풀 사이 또는 결막낭에 삽입될 수 있는 고체 물품을 포함할 수 있고, 그곳에서 물품은 활성제를 방출한다. 이러한 방식으로 눈에 삽입하기에 적합한 고체 물품은 폴리머를 포함할 수 있고 생체침식성이거나 생체침식성이 아닐 수 있다.
제약학적 제제는 본원에 개시된 작용제들에 더불어 추가적인 담체, 뿐만 아니라 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 및 표면 활성제를 포함할 수 있다.
개시된 조성물의 pH는 약 3 내지 약 12의 범위일 수 있다. 조성물의 pH는 예를 들어, 약 3 내지 약 4, 약 4 내지 약 5, 약 5 내지 약 6, 약 6 내지 약 7, 약 7 내지 약 8, 약 8 내지 약 9, 약 9 내지 약 10, 약 10 내지 약 11, 또는 약 11 내지 약 12 pH 유닛일 수 있다. 조성물의 pH는 예를 들어, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 또는 약 12 pH 유닛일 수 있다. 조성물의 pH는 예를 들어, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 적어도 12 pH 유닛일 수 있다. 조성물의 pH는 예를 들어, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 11, 또는 최대 12 pH 유닛일 수 있다. 만약 pH가 제제를 만드는 당업자가 원하는 범위 밖에 있다면, pH는 충분한 제약학적으로 허용되는 산 및 염기를 사용함으로써 조정될 수 있다.
투여의 의도된 방식에 따라, 제약학적 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 투여 형태, 예컨대 정제, 좌제, 환, 캡슐, 분말, 액체, 현탁액, 로션, 크림, 또는 겔의 형태로, 예를 들어, 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태로 있을 수 있다.
고체 조성물의 경우에, 무독성 고체 담체는, 예를 들어 제약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 소듐 사카린, 탈크, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 및 탄산 마그네슘을 포함한다.
본 개시의 조성물과 조합하기에 적합한 제약학적 활성제의 비-제한적인 실례는 항감염제, 즉 아미노글리코시드, 항바이러스제, 항미생물제, 콜린억제제/진경제, 당뇨병 치료제, 고혈압 강하제, 항신생물제, 심혈관제, 중추신경계제, 응고 변형제, 호르몬, 면역학적 작용제, 면역억제제, 및 안과용 조제물을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 제약학적 조성물은 치료적 유효량의 화합물을 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제, 예를 들어, 염수, 인산염 완충 염수, 인산염 및 아미노산, 폴리머, 폴리올, 당, 완충제, 보존제, 및 기타 단백질과의 혼합 형태로 포함한다. 예시적인 작용제들로는 옥틸페녹시 폴리에톡시 에탄올 화합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 화합물, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 수크로오스, 프룩토오스, 덱스트로오스, 말토오스, 글루코오스, 만니톨, 덱스트란, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 자일리톨, 락토오스, 트레할로오스, 소 또는 인간 혈청 알부민, 시트레이트, 아세테이트, 링거 및 행크 용액, 시스테인, 아르기닌, 카르니틴, 알라닌, 글리신, 리신, 발린, 류신, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌, 및 글로콜을 들 수 있다.
투여 방법 및 치료 방법
본원에 기술된 제약학적 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 적용에서, 조성물은 이미 질환 또는 질병에 걸린 대상체에게, 그 질환 또는 질병의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 저지하기 위해, 또는 그 질병을 치료, 치유, 개선 또는 개량하기 위하여 충분한 양으로 투여될 수 있다. 조성물은 또한 질병의 발달, 수축, 또는 악화 가능성을 줄이기 위해 투여될 수 있다. 이런 사용에 효과적인 양은 질환 또는 질병의 중증도 및 과정, 이전의 치료법, 대상체의 건강 상태, 체중, 및 약물에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 판단에 따라 다를 수 있다.
다중 치료제가 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다. 만약 동시에 투여된다면, 다중 치료제는 단일한, 일원화된 형태로, 또는 다중 형태로, 예를 들어 다중 별도의 환으로서 제공될 수 있다. 작용제들은 함께 또는 별도로, 단일 포장으로 또는 복수의 포장으로 포장될 수 있다. 치료제 중 하나 또는 전부가 다중 용량으로 제공될 수 있다. 동시에 투여되지 않는 경우, 다중 용량 사이의 타이밍은 약 1개월 정도까지 많이 다를 수 있다.
본원에 기술된 치료제는 질환 또는 질병의 발생 전에, 중에, 또는 후에 투여될 수 있고, 치료제를 함유하는 조성물의 투여 시기는 다를 수 있다. 예를 들어, 조성물은 예방제로서 사용될 수 있고 질환 또는 질병의 발생 가능성을 줄이기 위해 질병 또는 질환에 걸릴 성향이 있는 대상체에게 연속해서 투여될 수 있다. 조성물은 증상 중에 또는 증상이 개시된 후 가능한 빨리 대상체에게 투여될 수 있다. 치료제의 투여는 증상이 개신된 후 처음 48시간 이내에, 증상이 개시된 후 처음 24시간 이내에, 증상이 개시된 후 처음 6시간 이내에, 또는 증상이 개시된 후 처음 3시간 이내에 시작될 수 있다. 초기 투여는 임의의 특정 경로를 통해, 예컨대 본원에 기술된 임의의 경로에 의해 본원에 기술된 임의의 제형을 사용하여 이루어질 수 있다. 치료제는 질환 또는 질병의 개시가 검출되거나 예상된 직후 실행가능한 빠르게, 질환의 치료에 필요한 시간 동안, 예컨대, 예를 들자면, 약 1개월 내지 약 3개월 동안 투여될 수 있다. 치료 길이는 각 대상체에 대해 다를 수 있다.
본원에 기술된 제약학적 조성물은 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태로 있을 수 있다. 단위 투여 형태로, 제제는 적절한 양의 하나 이상의 화합물을 함유하는 단위 용량으로 나누어진다. 단위 투여량은 구별되는 양의 제제를 함유하는 포장의 형태로 있을 수 있다. 비-제한적 예는 포장된 주사액, 바이알, 또는 앰플이다. 수성 현탁액 조성물은 단일-용량 비-재밀폐용 용기에 포장될 수 있다. 다중-용량 재밀폐용 용기는, 예를 들어 보존제와 함께 또는 보존제 없이 사용될 수 있다. 주사용 제제는 단위 투여 형태로, 예를 들어, 앰플로, 또는 보존제가 들어있는 다중-용량 용기로 제공될 수 있다.
본원에 제공된 제약학적 조성물은 다른 치료법, 예를 들어 화학요법, 방사선요법, 수술, 항-염증제, 및 선택된 비타민과 함께 투여될 수 있다. 다른 작용제들은 제약학적 조성물보다 전에, 후에, 또는 제약학적 조성물과 동시에 투여될 수 있다.
투약
VE-PTP (HPTP-β) 항체는 대상체의 체중 kg당 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 3 mg/kg 내지 약 7 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다.
VE-PTP (HPTP-β) 항체는 원하는 임의의 간격으로 투여될 수 있다. 화합물의 투여는 화합물을 투여하는 사람 또는 화합물을 받는 대상체 중 어느 하나에 적응된 불규칙적인 투약 스케줄을 가질 수 있다. 예를 들어, 화합물은 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회, 주 5회, 주 6회, 주 7회, 주 8회, 주 9회 또는 주 10회 투여될 수 있다. 매일 투약 사이의 간격은 임의의 시간 간격일 수 있는데, 예를 들어 매시간마다, 2시간마다, 3시간마다, 4시간마다, 5시간마다, 6시간마다, 7시간마다, 8시간마다, 9시간마다, 10시간마다, 11시간마다, 또는 12시간마다일 수 있다. VE-PTP (HPTP-β) 항체의 투여를 위한 투약 스케줄은, 한정하는 것은 아니지만, 매일 1회, 매주 3회, 매주 2회, 매주 1회, 매월 3회, 매월 2회, 매월 1회, 2개월마다 1회, 매년, 매년 2회, 매년 3회, 또는 매년 4회를 포함한다. 일부 구체예에서, VE-PTP (HPTP-β) 항체는 2주마다 투여될 수 있다.
이에 더불어, 투여된 VE-PTP (HPTP-β) 항체의 양은 각 용량에서 동일한 양일 수 있거나 투여량은 용량마다 다를 수 있다. 예를 들어, 아침에는 제 1 양이 투여되고 저녁에는 제 2 양이 투여된다. 투여를 위한 투여량은 항-VEGF 투여의 스케줄에 따라 다를 수 있다.
항-VE-PTP 항체는 임의의 항-VEGF제와 함께 임의의 조합으로, 예를 들어 치료를 시작할 때, 치료 중 임의의 때에 또는 항-VEGF제로의 치료가 끝난 후 임의의 때에 투여될 수 있다. 게다가, VE-PTP (HPTP-β) 억제자의 투여량은 치료 중에 조정될 수 있다. 또한, 항-VEGF제의 양도 치료 중에 조정될 수 있다.
VEGF-조절제의 추가의 비-제한적인 예로는 비-염증성 작용제, 예를 들어 덱사메타손(dexamethasone), 플루오시놀론(fluocinolone), 및 트라이암시놀론(triamcinolone)이 있다. 게다가, 개시된 방법은 항-VEGF제를 전달하는 이식편을 포함할 수 있다. 예를 들어, VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 이식편이 본원에 기술된 질환 또는 질병에 걸린 대상체에게 제공되기 전에, 중에, 또는 후에 동시 투여될 수 있다.
항-VEGF 치료는, 예를 들어, 매월, 3개월마다 1회, 6개월마다 1회, 또는 매년 투여될 수 있고, 이때 VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 치료 사이에 임의의 빈도로 투여된다.
또한 본원에는 본원에 개시된 질환 또는 질병을 치료하는 방법이 개시된다. 그 방법은 대상체에게
a) 치료적 유효량의 VE-PTP (HPTP-β) 억제자; 및
b) 치료적 유효량의 항-VEGF제를 투여하는 단계를 포함하며;
이때 VE-PTP (HPTP-β) 억제자 및 항-VEGF제의 투여는 투여자에 의해 원하는 임의의 방식으로, 예를 들어, 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, 실행될 수 있다.
VE-PTP (HPTP-β) 결합제 또는 항-VEGF제는 필요한 또는 편리한 임의의 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 화합물은 임의의 투여 경로에 의해 대상체에 대해 용량당 약 0.1 mg 내지 약 300 mg, 약 0.1 mg 내지 약 200 mg, 약 0.1 mg 내지 약 100 mg, 약 0.05 mg 내지 약 1.5 mg, 0.1 mg 내지 약 1.5 mg, 약 0.05 mg 내지 약 1 mg, 또는 약 0.1 mg 내지 약 1 mg, 약 0.05 mg, 약 0.06 mg, 약 0.07 mg, 약 0.08 mg, 약 0.09 mg, 약 0.1 mg, 약 0.11 mg, 약 0.12 mg, 약 0.13 mg, 약 0.14 mg, 약 0.15 mg, 약 0.16 mg, 약 0.17, mg, 약 0.18 mg, 약 0.19 mg, 약 0.2 mg, 약 0.21 mg, 약 0.22 mg, 약 0.23 mg, 약 0.24 mg, 약 0.25 mg, 약 0.26 mg, 약 0.27, mg, 약 0.28 mg, 약 0.29 mg, 약 0.3 mg, 약 0.31 mg, 약 0.32 mg, 약 0.33 mg, 약 0.34 mg, 약 0.35 mg, 약 0.36 mg, 약 0.37, mg, 약 0.38 mg, 약 0.39 mg, 약 0.4 mg, 약 0.41 mg, 약 0.42 mg, 약 0.43 mg, 약 0.44 mg, 약 0.45 mg, 약 0.46 mg, 약 0.47, mg, 약 0.48 mg, 약 0.49 mg, 약 0.5 mg, 약 0.51 mg, 약 0.52 mg, 약 0.53 mg, 약 0.54 mg, 약 0.55 mg, 약 0.56 mg, 약 0.57, mg, 약 0.58 mg, 약 0.59 mg, 약 0.6 mg, 약 0.61 mg, 약 0.62 mg, 약 0.63 mg, 약 0.64 mg, 약 0.65 mg, 약 0.66 mg, 약 0.67, mg, 약 0.68 mg, 약 0.69 mg, 약 0.7 mg, 약 0.71 mg, 약 0.72 mg, 약 0.73 mg, 약 0.74 mg, 약 0.75 mg, 약 0.76 mg, 약 0.77, mg, 약 0.78 mg, 약 0.79 mg, 약 0.8 mg, 약 0.81 mg, 약 0.82 mg, 약 0.83 mg, 약 0.84 mg, 약 0.85 mg, 약 0.86 mg, 약 0.87, mg, 약 0.88 mg, 약 0.89 mg, 약 0.9 mg, 약 0.91 mg, 약 0.92 mg, 약 0.93 mg, 약 0.94 mg, 약 0.95 mg, 약 0.96 mg, 약 0.97, mg, 약 0.98 mg, 약 0.99 mg, 약 1 mg, 약 1.5 mg, 약 2 mg, 약 2.5 mg, 약 3 mg, 약 3.5 mg, 약 4 mg, 약 4.5 mg, 약 5 mg, 약 5.5 mg, 약 6 mg, 약 6.5 mg, 약 7 mg, 약 7.5 mg, 약 8 mg, 약 8.5 mg, 약 9 mg, 약 9.5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 약 25 mg, 약 30 mg, 약 35 mg, 약 40 mg, 약 45 mg, 약 50 mg, 약 55 mg, 약 60 mg, 약 65 mg, 약 70 mg, 약 75 mg, 약 80 mg, 약 85 mg, 약 90 mg, 약 95 mg, 약 100 mg, 약 110 mg, 약 120 mg, 약 130 mg, 약 140 mg, 약 150 mg, 약 160 mg, 약 170 mg, 약 180 mg, 약 190 mg 약 200 mg, 약 210 mg, 약 220 mg, 약 230 mg, 약 240 mg, 약 250 mg, 약 260 mg, 약 270 mg, 약 280 mg, 약 290 mg, 또는 약 300 mg의 양으로 투여될 수 있다.
안내 전달
본원에는 본원에 개시된 질환 또는 질병을 가진 대상체에게 발명의 조성물을 안내 전달하기 위한 방법이 개시된다. 전달 방법은 눈 세포에 조성물을 직접 전달하기 위한 침습성 방법을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체를 포함하는 액체 제약학적 조성물이 망막밑 주사를 통해 전달된다. 일부 구체예에서, 항체를 포함하는 액체 제약학적 조성물은 유리체내 또는 피하 주사를 통해 전달된다. 일부 구체예에서, 항체를 포함하는 액체 제약학적 조성물은 전방내 주사를 통해 전달된다. 일부 구체예에서, 조성물은 항체 전달의 효율을 증가시키기 위하여 다중 투여 경로, 예를 들어, 망막밑 및/또는 유리체내를 통해 전달된다. 일부 구체예에서, 망막밑 및/또는 유리체내 주사는 유리체 절제술 전에 시행된다.
안내 주사는 전달의 효율을 개선하기 위하여 및/또는 눈 주변의 손상을 최소화하거나 피하기 위하여 임의의 시간 간격을 두고 수행될 수 있다. 안내 주사를 위한 시간 간격은, 예를 들어, 약 1분 내지 약 60분, 약 1분 내지 약 5분, 약 5분 내지 약 10분, 약 10분 내지 약 15분, 약 15분 내지 약 20분, 약 20분 내지 약 25분, 약 25분 내지 약 30분, 약 30분 내지 약 35분, 약 35분 내지 약 40분, 약 40분 내지 약 45분, 약 45분 내지 약 50분, 약 50분 내지 약 55분, 또는 약 55분 내지 약 60분일 수 있다.
안내 주사는 임의의 속도로 수행될 수 있다. 안내 주사 속도는, 예를 들어, 약 1 μL/분 내지 약 200 μL/분, 약 1 μL/분 내지 약 10 μL/분, 약 10 μL/분 내지 약 20 μL/분, 약 20 μL/분 내지 약 30 μL/분, 약 30 μL/분 내지 약 40 μL/분, 약 40 μL/분 내지 약 50 μL/분, 약 50 μL/분 내지 약 60 μL/분, 약 60 μL/분 내지 약 70 μL/분, 약 70 μL/분 내지 약 80 μL/분, 약 80 μL/분 내지 약 90 μL/분, 약 90 μL/분 내지 약 100 μL/분, 약 100 μL/분 내지 약 110 μL/분, 약 110 μL/분 내지 약 120 μL/분, 약 120 μL/분 내지 약 130 μL/분, 약 130 μL/분 내지 약 140 μL/분, 약 140 μL/분 내지 약 150 μL/분, 약 150 μL/분 내지 약 160 μL/분, 약 160 μL/분 내지 약 170 μL/분, 약 170 μL/분 내지 약 180 μL/분, 약 180 μL/분 내지 약 190 μL/분, 또는 약 190 μL/분 내지 약 200 μL/분일 수 있다.
키트
본 개시는 추가로 본 개시의 조성물을 함유한 키트에 관련된다. 키트는
A) VE-PTP (HPTP-β)를 표적화하는 항체를 포함하는 조성물; 및
B) 대상체에게 조성물을 전달하기 위한 담체를 포함한다.
키트는 치료되는 대상체에게 처방된 투약 양생법에 맞추기 위해 변형될 수 있다. 다음은 안내 주사에 의해 본 개시의 조성물을 받는 대상체에게 사용하기 위한 키트의 비-제한적인 예이다:
A) a) VE-PTP (HPTP-β) 세포외재성 도메인을 표적화하는 항체; 및
b) i) 등장성 작용제; 및
ii) 물
을 포함하는 담체 시스템을 포함하고,
여기서 등장성 작용제는 재구성된 제제가 약 0.5% 내지 약 10%의 질량 대 부피의 등장성 작용제를 포함하게 되는 양으로 존재하는 수성 조성물; 및
B) 수성 조성물을 전달하기 위한 구성요소.
일부 구체예에서, 발명의 키트는
A) 항-VE-PTP 항체를 전달하기 위한 조성물; 및
B) 항-VEGF제를 전달하기 위한 조성물을 포함한다.
키트는 치료되는 대상체에게 처방된 투약 양생법을 조정하기 위해 변형될 수 있다. 다음은 개시된 화합물 및 유리체내로 투여된 항-VEGF제를 포함하는, 정맥내로 전달된 조성물을 받는 환자에게 사용하기 위한 키트의 비-제한적인 예이다. 이 예는 3개월 동안 매일 2회 개시된 화합물의 투약 및 12주째에 라니비주맙의 주사를 제공한다.
A. 각각의 포장이 4개의 바이알을 함유한 3개의 포장. 각 바이알은 7일 동안 5 mg의 개시된 화합물을 매일 2회 제공하기에 충분한 양의 VE-PTP (HPTP-β) 억제자를 포함하고 있다; 및
B. 12주가 끝났을 때 0.5 mg의 라니비주맙을 주사하기 위한 라니비주맙의 바이알.
키트는 요소들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 게다가, 본원에 개시된 항-VE-PTP 항체가 경구로 제공될 때, 충분한 용량의 개시된 화합물을 포함한 단일 용기가 키트로 공급될 수 있다.
키트는 또한 전달된 조성물의 사용 및 폐기를 위한 서면 설명서를 제공할 수 있다. 설명서는 처방된 투약 양생법을 반영하기 위해 키트에 따라 수정될 수 있다. 설명서는 본원에 기술된 임의의 치료법, 화합물, 부형제, 또는 투여 방법을 기술할 수 있다.
개시된 조성물은 예를 들어 약 1.5% 내지 약 90%의 부피에 의한 질량의 담체 시스템을 포함할 수 있다. 등장성 작용제의 비-제한적인 예는 덱스트로오스, 만니톨, 및 글리세린을 포함한다. 제제를 만드는 당업자는 하나 이상의 등장성 작용제를 활용할 수 있다.
키트는 추가로 투여용 장치, 예컨대 주사기, 필터 바늘, 연장 튜브, 캐뉼라, 및 망막밑 주사기를 포함할 수 있다. 투여 경로의 비-제한적인 예는 안내, 비경구, 및 국소 투여를 포함한다. 안내 투여 경로는, 예를 들어, 유리체내, 전방내, 결막밑, 테논낭밑, 안구 뒤, 안내, 후방 공막옆, 눈 주위, 망막밑, 및 맥락막 위공간을 포함할 수 있다. 전달은 예를 들어, 주사기, 바늘, 주입 펌프, 또는 주입기에 의해서일 수 있다. 주사기 및 주입기는, 예를 들어, 단일 용량, 다중 용량, 고정 용량, 또는 가변 용량일 수 있다. 주입기의 비-제한적인 예로는 펜(pen) 주입기, 자동 주입기, 및 전자 패치 주입기 시스템을 포함한다.
키트는 발명의 조성물을 대상체에게 투여하기에 적합한 구성요소들을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 발명의 조성물은 키트에 단위 투여 형태로서 존재한다. 그로써 제제를 만드는 당업자는 고농도의 화합물을 가지는 전달 장치를 제공할 수 있고 전체 용액 중의 양보다 적은 화합물의 양을 제공하기 위하여 전달된 부피를 조정할 수 있다.
설명서 세트가 본원에 기술된 임의의 키트에 포함될 수 있다. 설명서는 투약량, 투약 시기, 키트가 건조 조성물을 함유할 때 조성물의 복원, 및 전달 비히클 및 사용하지 않은 조성물의 폐기 방법에 관련된 것일 수 있다. 설명서는 본원에 기술된 임의의 치료법, 화합물, 부형제, 또는 투여 방법을 기술할 수 있다.
방법
발명은 눈 질환 또는 질병, 예를 들어, 눈의 부종, 당뇨성 황반 부종, 혈관 누출, 나이-관련 황반 변성 (습식형), 나이-관련 황반 변성 (건식형), 맥락막 신생혈관, 당뇨성 망막병증, 눈의 허혈, 포도막염, 망막 정맥 폐색 (중앙 또는 분지), 눈의 외상, 수술 유도 부종, 수술 유도 신생혈관, 낭포성 황반 부종, 눈의 허혈, 및 포도막염의 치료 또는 예방을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 질환 또는 질병은, 그것이 진행성이거나 비-진행성이거나 간에, 급성 질환 또는 질병, 또는 만성 질환 또는 질병의 결과이거나 간에, 눈의 혈관구조의 변화를 특징으로 할 수 있다. 이러한 질환들은 혈장 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 증간된 수준을 특징으로 할 수 있다.
본 개시는 치료를 필요로 하는 대상체에서 눈의 신생혈관을 치료하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 치료적 유효량의, VE-PTP (HPTP-β)를 표적화하는 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, VE-PTP (HPTP-β) 억제자는 누출 및 신생혈관에 맞서 혈관구조를 안정화시킨다.
임상 증상의 개선은, 예를 들어 간접 검안경검사(indirect ophthalmoscopy), 안저 촬영(fundus photography), 플루오레세인 혈관병증(fluorescein angiopathy), 망막전위도검사(electroretinography), 안과 검진(external eye examination), 세극등 생체현미경검사(slit lamp biomicroscopy), 압평 안압측정(applanation tonometry), 두께 측정(pachymetry), 광간섭 단층촬영(optical coherence tomography), 또는 자동굴절검사(autorefraction)에 의해 모니터링될 수 있다. 일부 구체예에서, 개시된 방법은 항-VEGF제를 포함하는 조성물을 포함하여, VE-PTP (HPTP-β) 항체의 투여에 관련된다.
일부 구체예에서, 본 개시의 방법은 누출에 맞서 혈관구조를 안정화시킬 수 있는, VE-PTP (HPTP-β) 항체와 하나 이상의 항-VEGF제의 동시 투여를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시의 방법은 신생혈관에 맞서 혈관구조를 안정화시킬 수 있는, 항-VE-PTP (HPTP-β) 항체와 하나 이상의 항-VEGF제의 동시 투여에 관련된다.
일부 구체예에서, 항-VE-PTP (HPTP-β) 항체는 누출 및 신생혈관에 맞서 혈관구조를 안정화시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 시각이 손상된 눈을 가진 인간 대상체는 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 VE-PTP (HPTP-β) 항체로 치료된다. 임상적 증상의 개선은, 예를 들어, 간접 검안경검사, 안저 촬영, 플루오레세인 혈관병증, 망막전위도검사, 안과 검진, 세극등 생체현미경검사, 압평 안압측정, 두께 측정, 광간섭 단층촬영 및 자동굴절검사에 의해 모니터링될 수 있다. 본원에서 기술된 것과 같이, 투약은 투여자에 의해 결정된 임의의 빈도로 일어날 수 있다. 항-VEGF제 치료가 중단된 후, 후속되는 용량이, 예를 들어 주마다 또는 월마다, 예컨대 반응에 따라 약 2 내지 8주 또는 약 1 내지 12개월 간격의 빈도로 투여될 수 있다.
당뇨병의 직접 또는 간접적인 결과인 질환으로는, 무엇보다, 당뇨성 황반 부종 및 당뇨성 망막병증을 포함한다. 당뇨병의 눈의 혈관구조는 시간이 지남에 따라 불안정해지고 비-증식성 망막병증, 황반 부종 및 증식성 망막병증과 같은 질병으로 이어진다. 유체가 강렬한, 직진방향의 시력이 발생하는 눈 부분인 황반의 중심으로 누출됨에 따라, 유체 및 관련된 단백질의 축적이 황반에 또는 그 아래에 침착되기 시작한다. 이런 침착은 대상체의 중심 시력이 점차로 왜곡되기 시작하는 것을 유발하는 팽윤을 초래한다. 이 질병이 황반 부종이다. 일어날 수 있는 또 다른 질병은 눈의 황반 영역 밖에서, 미세동맥류(microaneurysm)와 같은, 혈관 변화가 관찰될 수 있는 비-증식성 망막병증이다.
이런 질병들은 증가된 신생혈관을 특징으로 하는, 당뇨성 증식성 망막병증과 관련이 있을 수 있다. 새로운 혈관은 부서지기 쉽고 출혈이 일어나기 쉽다. 그 결과는 새로운 혈관의 과잉형성으로 인한 망막의 상흔 및 눈을 통한 빛의 통로의 폐쇄 또는 전체적인 차단이다. 당뇨성 황반 부종을 가진 대상체들은 종종 당뇨성 망막병증의 비-증식성 단계에 걸린다; 그러나, 대상체들은 종종 증식성 단계가 시작될 때에만 황반 부종을 나타내기 시작한다.
당뇨성 망막병증은 일하는 연령대의 미국인들에서 시력 상실의 가장 흔한 원인이다. 심각한 시력 상실은 망막 신생혈관을 복잡하게 하는 견인 망막 박리(tractional retinal detachment)로 인해 발생하지만, 중간 시력 상실의 가장 흔한 원인은 당뇨성 황반 부종 (DME)이다.
VEGF는 저산소증-조절 유전자이며, VEGF 수준은 저산소성 또는 허혈성 망막에서 증가된다. 대부분의 상황에서, Ang2는 Tie2에 결합하지만 인산화를 자극하지 않고, Tie2 길항제로서 작용한다. 눈에서, Ang2는 신생혈관 부위에서 상향조절되고 VEGF에 대한 허용된 인자로서 작용한다. 망막에서 VEGF의 증가된 발현은 망막의 표면적인 또는 중간의 모세혈관상(capillary beds) 또는 맥락막 모세혈관층(choriocapillaris)으로부터의 신생혈관의 발아(sprouting)를 자극하지 않지만, Ang2의 구성성 발현이 일어나는 심층 모세혈관상으로부터의 발아를 자극한다. 망막 표면에서 VEGF 및 Ang2의 동시발현은 표면의 망막 모세혈관으로부터의 신생혈관의 발아를 유발한다.
기존 혈관으로부터 새로운 혈관의 생성 과정인 혈관신생은 발생학적 발달, 월경, 상처 치유, 및 종양 성장을 포함한, 광범위한 생리적 및 병리적 사건에 필수적이다. 전부가 아니라도, 대부분의 종양은 성장하고 증식하기 위해 혈관신생을 필요로 한다. VEGF는 혈관 투과성 및 모세혈관 수를 증가시킴으로써 혈관신생의 주요한 인자일 수 있다.
VEGF는 내피 세포에서 주로 발견되는 단백질이고 혈관형성, 혈관신생, 및 혈관의 투과에서 기능한다. VEGF의 발현은 저산소증, 활성화된 발암유전자, 및 사이토카인에 의해 유도된다. VEGF 활성화는 정상인 세포 및 조직에서 혈관신생으로 이어질 수 있을뿐만 아니라, 종양에서의 혈관신생으로도 이어질 수 있어서, 종양 진행 및 성장을 허용한다. VEGF의 억제는 종양 성장을 억제할 수 있어서 종양 퇴행으로 이어질 수 있다. 다양한 망막병증은 VEGF의 증가된 수준과 관련된다; 눈의 허혈은 산소 부족으로 인한 VEGF 생성의 유도로 이어진다. VEGF의 이런 증가는 망막의 혈관의 과다증식을 유발할 수 있고 실명으로 이어질 수 있다. 개시된 항-VE-PTP (HPTP-β) 항체는 눈의 혈관구조를 안정화시키는 작용을 할 수 있고 VEGF 및 질환이 있는 망막에 존재하는 다른 염증성 작용제들에 의해 유발된 자극에 대응할 수 있다. 일부 구체예에서, 항-VE-PTP (HPTP-β) 항체의 대상체에의 투여는 대상체에 대한 항-VEGF 약물의 투여가 철회된 후에 질환 반전의 수준을 유지할 수 있다.
황반 변성은 망막의 중심에 있는 황색 반점 영역의 세포 및 조직 변성으로 인한 시력의 점차적인 손실 또는 손상을 특징으로 한다. 황반 변성은 종종 비-삼출성 (건식형) 또는 삼출성 (습식형)의 두 유형 중 하나로서 특성화된다. 비록 두 유형이 모두 쌍방향성이고 진행성이지만, 각 유형은 상이한 병리적 과정을 반영할 수 있다. 나이-관련 황반 변성 (AMD)의 습식형은 맥락막 신생혈관의 가장 흔한 형태로 노년층에서 실명을 주도하는 원인이다. AMD는 60세가 넘는 수백만명의 미국인에게 영향을 주며, 노년층에서 새로운 실명의 주도적 원인이다.
맥락막 신생혈관 막 (CNVM)은 광범위한 망막 질환과 관련된 문제이지만, 대부분 보통 나이-관련 황반 변성과 결부된다. CNVM이 있으면, 맥락막 (망막 바로 아래에 있는 혈관-풍부한 조직층)으로부터 나오는 비정상적인 혈관들이 망막 층을 통해 성장한다. 이런 새로운 혈관들은 매우 부서지기 쉽고 쉽게 파괴되어, 망막층 내에 혈액 및 유체가 모이는 원인이 된다.
당뇨병 (진성 당뇨병)은 췌장이 인슐린을 생성하거나 사용하지 못하는 무능력에 의해 유발된 대사성 질환이다. 가장 흔한 유형의 당뇨병은 제 1형 당뇨병 (종종 소아기 발병 진성 당뇨병으로 언급됨) 및 제 2형 당뇨병 (종종 성인기 발병 진성 당뇨병으로 언급됨)이다. 제 1형 당뇨병은 신체가 인슐린 생성 세포의 손실로 인해 인슐린을 생성하지 못하는 것으로부터 유발되며, 현재 사람에게 인슐린을 주사하는 것을 필요로 한다. 제 2형 당뇨병은 일반적으로 세포가 인슐린을 적절하게 사용하지 못하는 질병인, 인슐린 저항으로부터 유발된다. 당뇨병은 다수의 다른 질병, 이를테면 당뇨성 망막병증 및 당뇨성 황반 부종 (DME)을 포함한 눈 질병 또는 질환과 상관이 있을 수 있다.
당뇨성 망막병증은 눈의 후방 (망막)에 있는 광-감지 조직의 혈관에 대한 손상으로부터 유발되는 당뇨병의 합병증이다. 처음에, 당뇨성 망막병증은 증상을 유발하지 않거나 단지 경미한 시력 분제만을 유발할 수 있다. 궁극적으로 당뇨성 망막병증은 실명을 초래할 수 있다. 당뇨성 망막병증은 제 1형 당뇨병 또는 제 2형 당뇨병을 가진 사람이면 누구에게나 일어날 수 있다.
비-증식성 망막병증의 가장 초기 단계에서, 미세동맥류가 망막의 아주 작은 혈관에서 일어난다. 질환이 진행됨에 따라, 이 혈관들은 더 많이 손상되거나 파괴되고 망막의 이런 영역들은 영양을 위해 새로운 혈관이 성장하도록 지역적인 조직에 신호를 보낸다. 이 단계가 증식성 망막병증으로 불린다. 새로운 혈관은 망막을 따라 및 눈의 내부를 채우는 투명한, 유리질 겔의 표면을 따라 성장한다. 관은 얇고, 부서지기 쉬운 벽을 가지며 적절한 시기에 치료되지 않으면, 새로운 혈관은 혈액, 예를 들어 전혈 또는 그것의 일부 구성요소들을 누출할 수 있고, 심각한 시력 상실 및 심지어 실명을 초래할 수 있다. 또한, 유체는 강렬한, 직진방향의 시력이 발생하는 눈 부분인, 황반의 중심으로 누출될 수 있다. 유체 및 관련 단백질은 황반에 또는 그 아래에 침착되고 팽윤되기 시작하며 대상체의 중심 시력은 왜곡된다. 이런 질병은 황반 부종으로 불리고 당뇨성 망막병증의 임의의 단계에서 발생할 수 있지만, 질환이 진행됨에 따라 더 많이 발생할 가능성이 있다.
포도막염은 포도막에 염증이 생기는 질병이다. 눈은 내부가 비어 있고 중심부 공동을 둘러싼 조직에는 3개의 상이한 층이 있다. 최외각은 공막 (눈의 백색 코트)이고 가장 안쪽은 망막이다. 공막과 망막 사이의 중간 층이 포도막으로 불린다. 포도막은 눈에 영양을 공급하는 많은 혈관을 함유한다. 포도막염의 합병증으로는 녹내장, 백내장, 및 새로운 혈관 형성 (신생혈관)을 들 수 있다.
눈의 외상은 눈에 대한 임의의 종류의 물리적 또는 화학적 손상이다. 눈의 외상은 누구에게나 일어날 수 있고, 주요 증상으로는 홍반 또는 아픈 눈의 통증을 들 수 있다. 아주 작은 발사체가 외상을 유발한다면 증상은 일어나지 않는 경향이 있다.
수술-유도 부종은 눈의 망막 또는 다른 부분에서의 수술 후 눈 조직에 팽윤이 발생하는 것이다. 낭포성 황반 부종 (CME)은 이런 현상의 한 실례이다. CME는 백내장 수술을 한 사람에게서뿐만 아니라, 당뇨병, 망막 색소변성증, AMD, 또는 눈에 만성 염증을 유발하는 질병에 걸린 사람들에게서도 발생할 수 있다. CME의 주요 증상은 흐릿한 또는 감소된 중심 시력이다.
눈의 허혈성 증후군 (OIS)은 만성 혈관 부전(vascular insufficiency)으로부터 유발된 신호 및 증상들을 망라한다. 이 질병은 총경동맥 또는 내경동맥의 폐색 또는 협착증으로 인한 눈의 관류전하에 의해 유발된다. OIS는 대체로 전신성 질환, 예컨대 고혈압 또는 당뇨병을 자주 나타내는 사람들인, 50세 내지 80세의 대상체에게 영향을 미친다. OIS의 주요 증상은 안와 통증, 시력 상실, 비대칭성 백내장, 및 빛에 대한 느린 반응이다.
망막 정맥 폐색 (RVO)은 당뇨성 망막병증 후에 나타나는 가장 흔한 망막의 혈관 질환이다. 효과적으로 폐쇄되는 망막 정맥 누출의 영역에 따라, 질병은 대체로 중앙 망막 정맥 페색 (CRVO), 반구 망막 정맥 폐색 (HRVO), 또는 분지 망막 정맥 폐색 (BRVO)로서 분류된다. RVO가 나타나는 것은 망막의 혈관 꼬임, 망막의 출혈 (얼룩 및 불꽃 형상), 면모 반점, 눈 디스크 (optic disc) 팽윤 및 황반 부종으로 구성되는, 안저에서 발견되는 것들의 임의의 조합을 가진 가변적인 무통 시력 상실이다. CRVO에서, 망막의 출혈은 안저의 4사분면 전부에서 나타날 수 있는 한편, 출혈은 HRVO에서는 안저의 상반구 또는 안저의 하반구 중 어느 하나에 제한된다. BRVO에서, 출혈은 폐색된 분지 망막 정맥에 의해 누출된 영역에 크게 국한된다. 시력 상실은 황반 부종 또는 허혈에 이차적으로 일어난다.
본 개시의 조성물은 눈의 혈관구조를 안정화시키는 작용을 하고, 일부 구체예에서, 본 개시의 작용제는 VEGF 및 질환에 걸린 망막에 존재할 수 있는 다른 염증성 작용제들에 의해 유발된 자극에 대응할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시의 항체의 대상체에의 투여는 대상체에 대한 항-VEGF 약물의 투여가 철회된 후 질환 반전의 수준을 유지하기 위해 사용될 수 있다.
대상체의 치료
일부 구체예에서, 본원에 개시된 질환 또는 질병을 가진 대상체에서 본 개시의 조성물의 단일 투여는 눈의 신생혈관을 장기간 억제하기에 충분한 수준으로의 VE-PTP (HPTP-β) 억제자의 지속적인 안내 발현을 초래한다.
예를 들어, 숙주 눈의 세포에서 생성된 VE-PTP (HPTP-β) 억제자의 수준은 적어도 100 pg/mL, 적어도 200 pg/mL, 적어도 300 pg/mL, 적어도 400 pg/mL, 적어도 500 pg/mL, 적어도 600 pg/mL, 적어도 00 pg/mL, 적어도 800 pg/mL, 적어도 900 pg/mL, 적어도 1000 pg/mL, 적어도 2000 pg/mL, 적어도 3000 pg/mL, 적어도 4000 pg/mL, 적어도 5000 pg/mL, 적어도 6000 pg/mL, 적어도 7000 pg/mL, 적어도 8000 pg/mL, 적어도 9000 pg/mL 또는 적어도 10,000 pg/mL일 수 있다. 숙주 눈의 세포에서 생성된 VE-PTP (HPTP-β) 억제자의 수준은 최대 100 pg/mL, 최대 200 pg/mL, 최대 300 pg/mL, 최대 400 pg/mL, 최대 500 pg/mL, 최대 600 pg/mL, 최대 700 pg/mL, 최대 800 pg/mL, 최대 900 pg/mL, 최대 1000 pg/mL, 최대 2000 pg/mL, 최대 3000 pg/mL, 최대 4000 pg/mL, 최대 5000 pg/mL, 최대 6000 pg/mL, 최대 7000 pg/mL, 최대 8000 pg/mL, 최대 9000 pg/mL, 또는 최대 10,000 pg/mL일 수 있다.
단백질 수준은 본 개시의 제약학적 조성물이 투여된 후 적어도 약 0.1, 적어도 약 0.2, 적어도 약 0.3, 적어도 약 0.4, 적어도 약 0.5, 적어도 약 0.6, 적어도 약 0.7, 적어도 약 0.8, 적어도 약 0.9, 적어도 약 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 14, 적어도 약 21, 적어도 약 30, 적어도 약 50, 적어도 약 75, 적어도 약 100, 적어도 약 125, 적어도 약 150, 적어도 약 175, 적어도 약 200, 적어도 약 225, 적어도 약 250, 적어도 약 275, 적어도 약 300, 적어도 약 325, 적어도 약 350, 또는 적어도 약 365 일 후에 측정될 수 있다. 단백질 수준은 본 개시의 제약학적 조성물이 투여된 후 최대 약 0.1, 최대 약 0.2, 최대 약 0.3, 최대 약 0.4, 최대 약 0.5, 최대 약 0.6, 최대 약 0.7, 최대 약 0.8, 최대 약 0.9, 최대 약 1, 최대 약 2, 최대 약 3, 최대 약 4, 최대 약 5, 최대 약 6, 최대 약 7, 최대 약 14, 최대 약 21, 최대 약 30, 최대 약 50, 최대 약 75, 최대 약 100, 최대 약 125, 최대 약 150, 최대 약 175, 최대 약 200, 최대 약 225, 최대 약 250, 최대 약 275, 최대 약 300, 최대 약 325, 최대 약 350, 또는 최대 약 365 일 후에 측정될 수 있다.
중심와(Central Foveal) 두께
또한 본원에는 본원에 개시된 질환 또는 질병을 가진 대상체에서 중심와 두께 (CFT)를 감소시키는 방법이 개시된다. 이 방법은 VE-PTP (HPTP-β)를 표적화하는 항체를 눈에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 항체의 투여는 임의의 방식으로 수행될 수 있다.
중심와 두께의 감소 수준은, 예를 들어, 약 50 μm 내지 약 1000 μm일 수 있다. 중심와 두께의 감소 수준은, 예를 들어, 약 50 μm 내지 약 500 μm, 약 50 μm 내지 약 750 μm, 약 150 μm 내지 약 500 μm, 약 200 μm 내지 약 500 μm, 약 200 μm 내지 약 1000 μm, 약 250 μm 내지 약 650 μm, 또는 약 400 μm 내지 약 700 μm일 수 있다.
시력
본원에는 추가로 본원에 개시된 질환 또는 질병을 가진 대상체의 시력을 증가시키는 방법이 개시된다.
시력은 눈 안의 망막상의 촛점의 선예도(sharpness) 및 뇌의 해석 능력의 민감성에 좌우되는, 시력의 예민함(acuteness) 또는 선명성(clearness)에 좌우된다. 시력은 대상체에게 미리 정해놓은 거리만큼 떨어져 있는 챠트상의 문자, 전형적으로 숫자 또는 글자를 식별하도록 요청함으로써 테스트된다. 챠트 문자는 백색 바탕에 검은색 기호로서 제시된다. 대상체의 눈과 테스트용 챠트 사이의 거리는 렌즈가 초점을 맞추려고 시도하는 방법에서 무한에 근접하기에 충분한 거리로 설정된다. 20 피트, 또는 6 미터가 시각적 시점으로부터 본질적으로 무한대이다. 본 개시에서, 시력의 개선은 챠트로부터 판독할 수 있는 글자의 수의 증가에 의해 평가되었다.
시력을 측정하기 위한 한 가지 비-제한적 테스트는 ESV-3000 ETDRS 실험 장치 및 자동-보정된 테스트 조명의 사용이다. ESV-3000 장치는 LED 광원 기술을 포함한다. 자동-보정 회로는 꾸준하게 LED 광원을 모니터링하고 테스트 휘도를 85 cd/m2 또는 3 cd/m2로 보정한다.
비록 임상 실험을 위해 설계되긴 했지만, 대형-포맷 ETDRS 실험 (최대 20/200)이 4 미터에서 수행되는 경우, 장치는 비-연구 세팅에서, 즉, 안과 질환 모니터링이 수행되는 장소인 병원 또는 클리닉에서 사용될 수 있다. ETDRS를 적절하게 평가하기 위하여, 테스트는 표준화된 조명 조건하에서, 예를 들어 85 cd/m2의 A명소시(photopic) 테스트 수준 하에서 수행되어야 한다. 시력의 득점은 모니터에 의해 선택된 임의의 방식으로 이루어질 수 있다. 기준선 평가를 제공한 후에, 테스트 대상체에 의해 식별될 수 있는 글자의 수의 증가 또는 감소는 치료 중의 시력의 증가 또는 감소의 척도를 제공한다.
본원에는 본원에 개시된 눈 질환 또는 질병을 가진 대상체의 시력을 증가시키는 방법이 개시된다. 이 방법은 눈 질환 또는 질병을 가진 대상체에게 VE-PTP (HPTP-β)를 표적화하는 항체를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 항체의 투여는 본원에 기술된 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 치료된 눈에 의해 인식된 글자 수의 증가는, 예를 들어, 약 1 내지 약 30 글자, 약 5 내지 약 25 글자, 약 5 내지 약 20 글자, 약 5 내지 약 15 글자, 약 5 내지 약 10 글자, 약 10 내지 약 25 글자, 약 15 내지 약 25 글자, 또는 약 20 내지 약 25 글자일 수 있다. 시력의 증가는 약 1 글자, 약 5 글자, 약 10 글자, 약 15 글자, 약 20 글자, 또는 약 25 글자일 수 있다.
실시예
[실시예 1: 하이브리도마 기술을 사용한 VE-PTP (HPTP-β) 세포외재성 도메인에 대한 단클론성 항체의 생성.
도 3의 개략도에서 도시된 인간 VE-PTP (HPTP-β) 또는 마우스 VE-PTP의 N-말단 세포외재성 도메인 (ECD)에 대한 단클론성 항체를 생성하기 위하여 하이브리도마 기술을 사용하였다. 표적 단백질에 대한 항체를 생성하기 위하여 마우스를 인간 VE-PTP (HPTP-β) ECD 단백질로 도전시켰다. 그런 후 B-세포를 비장 및 림프절로부터 수득하고, 하이브리도마 세포주를 생성하기 위하여 골수종 세포와 융합시켰다. 융합된 세포를 항원 노출된 마우스로부터 유래된 유전자를 가진 골수종 세포만이 성장할 수 있는 배지에서 배양하였다. 단일 골수종 세포로부터 유래된 콜로니를 제한 희석에 의해 생성시켰다. 하이브리도마 콜로니에 의해 생성된 항체를 그런 후 인간 VE-PTP (HPTP-β) ECD에의 결합에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 한 개의 하이브리도마, R15E6을 추가의 분석을 위해 선택하였다. R15E6 항체는 도 4에서 면역침전 (IP) 웨스턴 블롯 (좌측 패널) 및 유동 세포분석 (우측 패널)에 의해 나타난 것과 같이, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)로부터의 내인성 인간 VE-PTP (HPTP-β)에 결합하였다. 비드 대조군 (항체가 없는 단백질 A/G 비드; BC) 또는 VEGFR2 또는 Tie2 (R2/T2)에 대한 R15E6의 결합은 관찰되지 않았다.
실시예 2:
HUVECS에서 R15E6으로의 Tie2 활성화.
R15E6은 도 6의 패널 A 및 B에서 도시된 IP 실험에 의해 증명되는 것과 같이 농도-의존성 방식으로 Tie2를 활성화하였다. 항체는 또한 패널 C에서 나타난 것과 같이 HUVEC에서 농도-의존성 방식으로 혈청 고갈된 내피 세포의 생존율을 향상시켰다.
실시예 3:
쥐과 단클론성 및 다클론성 항-마우스 VE-PTP ECD 항체를 이용한 Tie2 활성화 및 세포의 투과성 실험.
시험관내에서 VE-PTP 항체의 치료 효과를 특성화하기 위하여, Tie2 활성화 및 세포의 투과성 실험을 항-마우스 VE-PTP 항체를 사용하여 수행하였다. 마우스 VE-PTP ECD에 대한 단클론성 및 다클론성 항체를, 세포외재성 도메인의 N-말단의 8개의 FN3 반복부의 VE-PTP-Fc 융합 단백질로 래트를 면역화함으로써 생성시켰다. 면역화, 하이브리도마-융합, 및 스크리닝을 상기에서 기술한 것과 같이 수행하였다. 실시예 3에서, 마우스 VE-PTP 의 세포외재성 피브로넥틴 유형 III (FN3)-유사 도메인들에 대한 단클론성 항체 109.1 (mAb 109.1) 및 다클론성 항체 (pAbs)를 추가의 분석을 위해 선택하였다.
도 7은 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바 마우스 내피 세포 (bEnd)에서 Tie2 활성화 (상부 좌측 패널), 마우스 VE-PTP 단백질 발현 (하부 좌측 패널), 및 Akt (우측 패널)에 미치는 mAb 109.1의 영향을 도시한다. mAb 109.1로의 치료는 Tie2 인산화 (pTyr; 상부 좌측 패널)에 의해 나타난 것과 같이 Tie2의 활성화를 초래하였다. Akt는 항체의 농도가 증가할 때 증가된 인산화의 부재에 의해 확인되는 것과 같이 테스트된 마우스 내피 세포에서 본질적으로 활성화되었다 (우측 패널).
마우스 pAb 1-8을 이용한 시험관내 실험 또한 내피 세포에서 Tie2 (Tie-2) 활성화 및 하류 신호전달을 향상시켰다. 배양된 마우스 내피 (bEnd.5) 세포를 pAb 1-8 또는 면역이전 (대조군) 항체로 1시간 동안 처리하고, 계속해서 Tie2에 대해 면역침전시키고, 이어서 항-포스포티로신 항체 (pTyr) 및 Tie2에 대한 항체로 면역블롯팅하였다. 동일한 단백질 함량을 가진 세포 용해물의 부분표본액을 VE-PTP 및 Tie2에 대해 직접 면역블롯팅하였다 (하부 패널들). 도 8은 pAb가 마우스 VE-PTP에 대한 다클론성 항체 또는 면역이전 항체로 1시간 동안 (패널 A) 또는 3분 동안 (패널 B) 처리된 bEnd.5 세포에서 Tie2 활성화를 빠르게 유도한 면역침전 실험을 예시한다.
Tie2 활성화의 혈관-안정화 효과와 일치하게, VE-PTP ECD 항체는 도 9에서 나타난 것과 같이, 시험관내에서 내피 단층의 트롬빈- 및 VEGF-유도된 투과성을 감소시켰다. 250 kD FITC-덱스트란에 대한 세포간 투과성을 트랜스웰 필터에서 성장된 배양된 HUVEC 단층에 대해 측정하였다. 투과성은 트롬빈 (패널 A) 또는 VEGF (패널 B) 중 어느 하나로 유도되었다. PBS-처리된 세포의 투과성을 100%로 설정하였다. VE-PTP 표적화를 위해, 세포를 항-VE-PTP pAb로 처리하였다. 대조군으로서, 세포를 면역이전 항체 (대조군 Ab)로 처리하였다. 데이터는 두 개의 독립적인 실험을 나타낸다.
Tie2 활성화의 혈관-안정화 효과와 일치하게, VE-PTP ECD 항체 또한 도 10에서 나타난 것과 같이 생체내에서 VEGF-유도된 피부 혈관 투과성을 차단하였다. 단클론성 및 다클론성 VE-PTP ECD 항체, mAb 109.1 (패널 A) 및 pAb PTP 1-8 (패널 B)은 둘 다, Miles 검정에 의해 증명되는 바와 같이 VEGF-유도된 피부 혈관 투과성을 억제하였다. Miles 검정은 혈관 누출 및 신생혈관의 특징인, 혈관 투과성의 생체내 모델로서 사용될 수 있다. Miles 검정을 시작하기 30분 전에 마우스를 100 μg의 대조군 IgG 또는 항-마우스 VE-PTP 항체로 정맥내 주사하였다. 그런 후 에반스 블루(Evan's blue)를 마우스의 정맥에 주사하고, 이어서 10분 후에 VEGF (줄무늬 막대) 또는 PBS (진한 검은색 막대)를 피내 주사하였다. 30분 후에, 마우스를 희생시키고 피부 샘플로부터 염료를 추출하여 정량하였다. 데이터 세트를 정규성 및 등분선(equal variance)에 대해 조사하였다. 값을 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로서 나타낸다. 패널 C에서 알 수 있는 것과 같이, 투과성의 차단은 pAb PTP 1-8로 처리된 마우스의 폐 조직에서 증명되는 바 Tie2 인산화와 상관이 있다.
실시예 4:
마우스에서 망막 및 맥락막 신생혈관에 미치는 마우스 VE-PTP ECD 단클론성 항체의 영향.
증식성 당뇨성 망막병증의 측면들을 모방한 허혈성 망막병증 모델에서, VE-PTP ECD 단클론성 항체 (mAb 109.1)는 도 11에서 도시되고 (패널 A) 도 12에서 정량화된 바 (패널 B) 항체의 투여 후에 망막 신생혈관을 유의미하게 감소시켰다. P12에, 허혈성 망막병증이 있는 마우스에게 0.1, 0.5, 또는 2 μg의 mAb 109.1 또는 2 μg의 IgG 동형 대조군 (각각의 경우 n =12마리)의 유리체내 주사를 투여하였다. P17에, 대조군 IgG-주사된 눈에서 대규모의 GSA-염색된 망막 신생혈관이 관찰되었고 2 μg의 항-VE-PTP가 주사된 눈에서는 유의미하게 적은 망막 신생혈관이 관찰되었다. *P < 0.001.
유사하게, 나이-관련 황반 부종의 상이한 측면들 (망막의 혈관종 증식 및 맥락막 신생혈관)을 모방하는 두 개의 모델에서, VE-PTP ECD 단클론성 항체 (mAb 109.1)의 단일한 2 μg의 유리체내 투여가 두 망막 신생혈관을 유의미하게 감소시켰다 (도 11의 패널 B 및 도 12의 패널 B에서의 정량화). P15에, 6마리의 Rho-VEGF 형질전환 마우스에게 한쪽 눈에 0.5 또는 2 μg의 mAb 109.1을 유리체내로 주사하였고 다른 쪽 눈에는 상응하는 용량의 대조군 IgG를 주사하였다. P21에, 대조군 IgG-처리된 눈에서보다 0.5 또는 2 μg의 mAb 109.1로 처리된 눈에서 유의미하게 더 적은 GAS-염색된 망막밑 신생혈관이 관찰되었다. *P = 0.01, IgG 대조군 다른 쪽 눈과 비교된, 쌍을 이루지 않은 t-테스트에 의함. 축척 막대: 100 μm.
2 μg의 mAb 109.1의 유리체내 주사는 대조군 IgG와 비교된 브루크막 (Bruch's membrane) 파열 부위에서 맥락막 신생혈관의 면적을 유의미하게 감소시켰다 (도 11의 패널 C 및 도 12의 패널 C에서의 정량화). *P < 0.001, 본페로닌 교정을 포함한 일원분산 분석에 의함. 축척 막대: 100 μm.
mAb 109.1의 피하 투여는 또한 허혈성 망막병증 마우스 모델에서 허혈성 신생혈관을 감소시켰다. 망막 신생혈관의 평균 면적은 도 25에서 나타난 것과 같이, 비히클과 비교하여 약 30% 감소하였다. 허혈성 망막병증이 있는 마우스에게 2 mg/kg q.o.d. (2일마다) x3의 피하 주사를 투여하였다.
실시예 5:
E마우스에서 항-VEGF제와 조합된 마우스 VE-PTP ECD 단클론성 항체가 망막 박리에 미치는 영향.
본원에서 개시된 항-VE-PTP 항체를 사용하는 조합 치료법의 효과를 평가하기 위하여, Tet/옵신/VEGF 마우스 모델을 사용하였다. Tet/옵신/VEGF 형질전환 마우스는 심각한 망막밑 신생혈관 및 혈관 누출을 나타내고, 인간 VEGF의 유도성 망막 과잉발현에 의해 매개된 삼출성 망막 박리를 유발한다. 도 24는 이중 별표에 의해 표시된 것과 같이, 마우스에서 망막 박리를 예방하기 위한 어느 하나의 치료법 단독과 비교된 항-마우스 VE-PTP 항체 (mAb 109.1) 및 아플리버셉트의 조합의 향상된 효능을 나타낸다. 래트 IgG를 대조군으로서 사용하였다.
실시예 6:
인간 VE-PTP (HPTP-β)에 대한 R15E6으로부터의 인간화된 항체의 생성 및 정제.
R15E6은 중쇄 및 경쇄를 함유한 150 kDa 항체이다. 항체의 16개의 상이한 인간화된 변종을 표 12에서 나타낸 것과 같은 경쇄 서열에 대한 중쇄 서열의 상이한 조합을 사용하여 합성하였다.
실시예 1에서 기술된 R15E6 인간화된 변종을 pVitro DHFR3 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. 중간 규모의 일시적인 트랜스펙션 발현 분석을 수행하여 CHO 세포로부터의 발현 수율을 측정하였다. 현탁액-적응 CHO 세포를, 500 mL 통풍용 플라스크에서 8 mM L-글루타민 및 10 mL/L의 히포크산틴/티미딘이 첨가된 Pro CHO4 혈청-유리 배지에서 2.0 내지 3.0 x 105 세포/mL로 37℃에서 85% CO2로 150 rpm에서 배양하였다. 각 구성물의 최대-prep을 Nucleobond pc500 키트를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 제조하였다. 벡터 DNA를 NanoDrop LiteTM 분광광도계를 사용하여 정량화하였다.
1.0 x 106 세포/mL의 최종 밀도의 세포 100 mL을 500 mL 통풍용 플라스크에서 8 mM L-글루타민 및 10 mL/L의 히포크산틴/티미딘이 첨가된 Pro CHO5 혈청-유리 배지에서 1.25 μg/mL의 플라스미드 DNA로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션된 배양물을 8 내지 11일 동안 37℃에서 85% CO2로 150 rpm에서 인큐베이션한 후 4,000 rpm에서 4℃에서 40분 동안 원심분리함으로써 수득하였다.
원심분리 후에, 배지를 0.8 μm 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 여과하였다. 각각의 배치를 Amersham Biosciences AKTA 크로마토그래피 시스템을 사용하여 정제하였다. 발현된 인간화된 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 1-mL HiTrap 단백질 A 칼럼을 모든 인간화된 항체 정제에 사용하였다. 모든 정제를 융합 항체 인-하우스 세척 및 용출 완충액을 사용하여 수행하였다. 단백질을 칼럼에 로딩한 후, 임의의 결합된 항체를 글리신/Tris 완충액 (pH 3)을 사용하여 용출하였다. 용출된 1 mL 분획을 모두 100 μL의 Tris 완충액 (pH 8.5)으로 중화하였다. 용출 피크에 상응하는 용출 분획을 선택하여 밤새 PBS에서 투석하였다. 투석 후에, 항체의 농도를 NanoDrop LiteTM 분광광도계로 측정하였다.
실시예 7:
인간 VE-PTP (HPTP-β)에 대한 인간화된 항체의 평가.
인간화된 항체의 샘플을 환원 및 비환원 SDS-PAGE (도 13)에 의해 분석하여 중쇄 및 경쇄의 존재 및 항체의 순도를 측정하였다. 마우스/인간 키메릭 항체인 HC0LC0를 쥐과 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 인간 Fc 영역에의 융합에 의해 R15E6으로부터 유도하였다. 두 가지 SDS-PAGE 겔 전부에서, 다음과 같다: 레인 1: SeeBlue Plus2 사전-염색된 단백질 표준; 레인 2: HC0LC0 #1; 레인 3: HC1LC1 #2; 레인 4: HC1LC2 #1; 레인 5: HC1LC3 #1; 레인 6: HC1LC3 #2; 레인 7: HC1LC4 #1; 레인 8: HC2LC1 #1; 레인 9: HC2LC2 #1; 레인 10: HC2LC3 #1; 레인 11: HC2LC3 #2; 레인 12: HC2LC4 #1; 레인 13: HC3LC1 #1; 레인 14: HC3LC2 #1; 레인 15: HC3LC3 #1; 레인 16: HC3LC4 #1; 레인 17: HC4LC1 #1; 레인 18: HC4LC1 #2; 레인 19: HC4LC2 #1; 레인 20: HC4LC3 #1; 레인 21: HC4LC3 #2; 레인 22: HC4LC4 #1; 레인 23: HC4LC4 #2; 및 레인 24: SeeBlue Plus2 사전-염색된 단백질 표준. SDS-PAGE 겔 분석으로 모든 분석된 샘플이 고순도인 것으로 나타났다. 환원 SDS-PAGE에서, 중쇄 및 경쇄를 볼 수 있는데, 중쇄의 경우 50 kDa 및 경쇄의 경우 25 kDa의 예상했던 분자량에서 볼 수 있었다. 비환원 SDS-PAGE에서, 유리 중쇄 또는 경쇄는 각각 50 kDa 또는 25 kDa 근처에서 관찰되지 않았다. 겔들은 모든 HC4 변종 및 HC1LC3, HC2LC3, 및 HC3LC3 변종에 대해 적은 양의 단백질을 나타낸다.
정제된 R15E6을, NanoDrop LiteTM 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 IgG에 대한 표준 기준으로서 13.7의 흡광 계수를 사용하여 정량하였다. 표 16은 SDS-PAGE 분석의 결과를 요약한 것이다. SDS-PAGE 분석과 일치하게, 중쇄의 4개의 변종은 모두 거의 항체를 발현하지 않았다.
실시예 8: 인간 VE-PTP (HPTP-β), 시노몰구스 VE-PTP (cyno PTP-β), 및 인간 HPTP-η에 대한 R15E6 및 인간화된 변종의 선택성
하이브리도마로부터의 항체를 함유한 조직 배양 상층액을 표적 인간 VE-PTP (인간 베타 ½ ECD), cyno VE-PTP (Cyno 베타), 및 인간 HPTP-η (인간 Eta)에 대해 테스트하여 ELISA에 의한 결합 친화성을 측정하였다.
인간 HPTP-β, cyno PTPβ, 및 인간 HPTP-η를 HEK293 세포를 사용하여 독립적으로 제조하고 정제하였다. HEK293 세포를 진동 플라스크에 24시간 동안 시딩한 후 종-특이적 VE-PTP 또는 HPTP-η을 발현하는 플라스미드로 트랜스펙션하였다. HEK293 세포를 혈청이 없는, 화학적으로 규정된 배지를 사용하여 성장시켰다. 종-특이적 VE-PTP 또는 HPTP-η 구성물에 대한 DNA를 HEK293의 30 mL 현탁액에 일시적으로 트랜스펙션하였다. 24시간 후, 세포를 계수하여 세포의 생존성을 평가하였고 생존 가능한 세포 수를 측정하였다. 일시적으로 트랜스펙션 과정 전체를 통해 추가적인 판독을 취하였다. 세포 배양을 일시적 트랜스펙션의 5일째에 수득하였다. 일시적 트랜스펙션으로부터 수득된 조건화 배지 상층액을 원심분리에 의해 정화하였다. 상층액을 0.2 μm 막 필터를 사용하여 여과하였다. 그런 후 단백질을 항-His 태그 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제 후에, 단백질의 PBS (pH 7.4)로의 완충액 교환을 수행하였다. 그런 후, SDS-Gel 모세관 전기영동 (CE-SDS) 분석을 수행하였고 단백질을 정제하였다. DNA 플라스미드 삽입물의 아미노산 서열, DNA 플라스미드 삽입물, 및 상응하는 야생형 서열을 하기 표 15에 나타낸다. 단백질 서열의 신호 펩타이드는 밑줄로 표시된다.
SEQ ID NO: | 명칭 | 서열 |
38 | C-말단 His6 태그를 가진 처음 8개의 FN3 반복부를 함유한 인간 VE-PTP (HPTP-β) (인간 ½ VE-PTP ECD)의 단백질 서열 | MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEPERCNFTLAESKASSHSVSIQWRILGSPCNFSLIYSSDTLGAALCPTFRIDNTTYGCNLQDLQAGTIYNFKIISLDEERTVVLQTDPLPPARFGVSKEKTTSTGLHVWWTPSSGKVTSYEVQLFDENNQKIQGVQIQESTSWNEYTFFNLTAGSKYNIAITAVSGGKRSFSVYTNGSTVPSPVKDIGISTKANSLLISWSHGSGNVERYRLMLMDKGILVHGGVVDKHATSYAFHGLTPGYLYNLTVMTEAAGLQNYRWKLVRTAPMEVSNLKVTNDGSLTSLKVKWQRPPGNVDSYNITLSHKGTIKESRVLAPWITETHFKELVPGRLYQVTVSCVSGELSAQKMAVGRTFPLAVLQLRVKHANETSLSIMWQTPVAEWEKYIISLADRDLLLIHKSLSKDAKEFTFTDLVPGRKYMATVTSISGDLKNSSSVKGRTVPAQVTDLHVANQGMTSSLFTNWTQAQGDVEFYQVLLIHENVVIKNESISSETSRYSFHSLKSGSLYSVVVTTVSGGISSRQVVVEGRTVPSSVSGVTVNNSGRNDYLSVSWLLAPGDVDNYEVTLSHDGKVVQSLVIAKSVRECSFSSLTPGRLYTVTITTRSGKYENHSFSQERTVPDKVQGVSVSNSARSDYLRVSWVHATGDFDHYEVTIKNKNNFIQTKSIPKSENECVFVQLVPGRLYSVTVTTKSGQYEANEQGNGRTIPEKGNSADIQHSGGRSSLEGPRFERTGGGHHHHHH |
39 | 인간 VE-PTP (HPTP-β)의 야생형 단백질 서열 | MLSHGAGLALWITLSLLQTGLAEPERCNFTLAESKASSHSVSIQWRILGSPCNFSLIYSSDTLGAALCPTFRIDNTTYGCNLQDLQAGTIYNFRIISLDEERTVVLQTDPLPPARFGVSKEKTTSTSLHVWWTPSSGKVTSYEVQLFDENNQKIQGVQIQESTSWNEYTFFNLTAGSKYNIAITAVSGGKRSFSVYTNGSTVPSPVKDIGISTKANSLLISWSHGSGNVERYRLMLMDKGILVHGGVVDKHATSYAFHGLTPGYLYNLTVMTEAAGLQNYRWKLVRTAPMEVSNLKVTNDGSLTSLKVKWQRPPGNVDSYNITLSHKGTIKESRVLAPWITETHFKELVPGRLYQVTVSCVSGELSAQKMAVGRTFPDKVANLEANNNGRMRSLVVSWSPPAGDWEQYRILLFNDSVVLLNITVGKEETQYVMDDTGLVPGRQYEVEVIVESGNLKNSERCQGRTVPLAVLQLRVKHANETSLSIMWQTPVAEWEKYIISLADRDLLLIHKSLSKDAKEFTFTDLVPGRKYMATVTSISGDLKNSSSVKGRTVPAQVTDLHVANQGMTSSLFTNWTQAQGDVEFYQVLLIHENVVIKNESISSETSRYSFHSLKSGSLYSVVVTTVSGGISSRQVVVEGRTVPSSVSGVTVNNSGRNDYLSVSWLLAPGDVDNYEVTLSHDGKVVQSLVIAKSVRECSFSSLTPGRLYTVTITTRSGKYENHSFSQERTVPDKVQGVSVSNSARSDYLRVSWVHATGDFDHYEVTIKNKNNFIQTKSIPKSENECVFVQLVPGRLYSVTVTTKSGQYEANEQGNGRTIPEPVKDLTLRNRSTEDLHVTWSGANGDVDQYEIQLLFNDMKVFPPFHLVNTATEYRFTSLTPGRQYKILVLTISGDVQQSAFIEGFTVPSAVKNIHISPNGATDSLTVNWTPGGGDVDSYTVSAFRHSQKVDSQTIPKHVFEHTFHRLEAGEQYQIMIASVSGSLKNQINVVGRTVPASVQGVIADNAYSSYSLIVSWQKAAGVAERYDILLLTENGILLRNTSEPATTKQHKFEDLTPGKKYKIQILTVSGGLFSKEAQTEGRTVPAAVTDLRITENSTRHLSFRWTASEGELSWYNIFLYNPDGNLQERAQVDPLVQSFSFQNLLQGRMYKMVIVTHSGELSNESFIFGRTVPASVSHLRGSNRNTTDSLWFNWSPASGDFDFYELILYNPNGTKKENWKDKDLTEWRFQGLVPGRKYVLWVVTHSGDLSNKVTAESRTAPSPPSLMSFADIANTSLAITWKGPPDWTDYNDFELQWLPRDALTVFNPYNNRKSEGRIVYGLRPGRSYQFNVKTVSGDSWKTYSKPIFGSVRTKPDKIQNLHCRPQNSTAIACSWIPPDSDFDGYSIECRKMDTQEVEFSRKLEKEKSLLNIMMLVPHKRYLVSIKVQSAGMTSEVVEDSTITMIDRPPPPPPHIRVNEKDVLISKSSINFTVNCSWFSDTNGAVKYFTVVVREADGSDELKPEQQHPLPSYLEYRHNASIRVYQTNYFASKCAENPNSNSKSFNIKLGAEMESLGGKCDPTQQKFCDGPLKPHTAYRISIRAFTQLFDEDLKEFTKPLYSDTFFSLPITTESEPLFGAIEGVSAGLFLIGMLVAVVALLICRQKVSHGRERPSARLSIRRDRPLSVHLNLGQKGNRKTSCPIKINQFEGHFMKLQADSNYLLSKEYEELKDVGRNQSCDIALLPENRGKNRYNNILPYDATRVKLSNVDDDPCSDYINASYIPGNNFRREYIVTQGPLPGTKDDFWKMVWEQNVHNIVMVTQCVEKGRVKCDHYWPADQDSLYYGDLILQMLSESVLPEWTIREFKICGEEQLDAHRLIRHFHYTVWPDHGVPETTQSLIQFVRTVRDYINRSPGAGPTVVHCSAGVGRTGTFIALDRILQQLDSKDSVDIYGAVHDLRLHRVHMVQTECQYVYLHQCVRDVLRARKLRSEQENPLFPIYENVNPEYHRDPVYSRH |
40 | 처음 8개의 FN3 반복부를 함유한 인간 ½ VE-PTP ECD의 DNA 서열 (SEQ ID NO: 38) | ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCGAGCCCGAGAGATGCAACTTCACCCTGGCCGAGTCCAAGGCCTCCTCCCACTCCGTGTCTATCCAGTGGCGGATCCTGGGCTCCCCCTGCAACTTCTCTCTGATCTACTCCTCCGACACCCTGGGCGCTGCCCTGTGCCCTACCTTCAGAATCGACAACACCACCTACGGCTGCAACCTGCAGGATCTGCAGGCCGGCACCATCTACAACTTCAAGATCATCTCCCTGGACGAGGAACGGACCGTGGTGCTGCAGACCGATCCTCTGCCTCCTGCCAGATTCGGCGTGTCCAAAGAAAAGACCACCTCCACCGGACTGCACGTGTGGTGGACCCCTTCCAGCGGCAAAGTGACCTCCTACGAGGTGCAGCTGTTCGACGAGAACAACCAGAAAATCCAGGGCGTGCAGATCCAGGAATCCACCTCCTGGAACGAGTACACCTTCTTCAACCTGACCGCCGGCTCCAAGTACAATATCGCCATCACCGCCGTGTCCGGCGGCAAGAGATCCTTCTCCGTGTACACCAACGGCTCCACCGTGCCCAGCCCCGTGAAGGACATCGGCATCTCCACCAAGGCCAACTCCCTGCTGATCTCCTGGTCCCACGGCTCCGGCAACGTGGAACGGTACAGACTGATGCTGATGGACAAGGGCATCCTGGTGCACGGCGGCGTGGTGGATAAGCACGCCACCTCTTACGCCTTCCACGGCCTGACCCCTGGCTACCTGTACAATCTGACCGTGATGACCGAGGCCGCTGGACTGCAGAACTACCGGTGGAAGCTCGTGCGGACCGCCCCCATGGAAGTGTCCAACCTGAAAGTGACCAACGACGGCTCCCTGACCTCTCTGAAAGTGAAGTGGCAGAGGCCCCCTGGCAATGTGGACTCCTACAACATCACCCTGTCCCACAAGGGCACCATCAAAGAATCCCGGGTGCTGGCCCCTTGGATCACCGAGACACACTTCAAAGAACTGGTGCCTGGCCGGCTGTACCAAGTGACCGTGTCCTGTGTGTCTGGCGAGCTGTCCGCCCAGAAAATGGCCGTGGGCAGAACCTTCCCTCTGGCCGTGCTGCAGCTGAGAGTGAAGCACGCTAACGAGACATCCCTGTCCATCATGTGGCAGACCCCCGTGGCCGAGTGGGAGAAGTACATCATCAGCCTGGCCGACCGGGACCTGCTGCTGATCCACAAGTCCCTGAGCAAGGACGCCAAAGAGTTCACCTTCACCGACCTGGTGCCCGGCAGAAAGTACATGGCCACCGTGACCTCCATCTCCGGCGACCTGAAGAACTCCTCCAGCGTGAAGGGCAGGACCGTGCCTGCCCAAGTGACAGACCTGCACGTGGCCAACCAGGGCATGACCTCCTCCCTGTTCACCAACTGGACCCAGGCTCAGGGCGACGTGGAATTCTACCAGGTGCTGCTGATTCATGAGAACGTCGTGATCAAGAACGAGTCCATCTCCTCCGAGACAAGCCGGTACTCCTTCCACTCCCTGAAGTCCGGCAGCCTGTACTCCGTGGTCGTGACCACAGTGTCCGGGGGCATCTCCTCTAGACAGGTGGTGGTGGAAGGCCGCACCGTGCCTAGTTCAGTGTCAGGCGTGACCGTGAACAACAGCGGCCGGAACGACTACCTGTCCGTGTCTTGGCTGCTGGCTCCTGGGGACGTGGACAACTACGAAGTGACCCTGAGCCACGACGGCAAGGTGGTGCAGTCTCTCGTGATCGCCAAGTCCGTGCGCGAGTGCTCCTTCAGCTCTCTGACACCTGGCAGACTGTATACCGTGACCATCACCACCAGATCCGGGAAGTACGAGAACCACAGCTTCTCCCAGGAACGCACAGTGCCCGACAAGGTGCAGGGCGTGTCAGTGTCTAACTCCGCCAGATCTGACTACCTGCGGGTGTCCTGGGTGCACGCTACCGGCGACTTCGACCATTATGAAGTGACAATCAAGAACAAGAACAACTTCATCCAGACCAAGTCCATCCCCAAGTCCGAGAACGAGTGCGTGTTCGTGCAGCTGGTGCCAGGCAGACTGTACTCTGTGACAGTGACCACCAAGTCCGGCCAGTACGAGGCCAACGAGCAGGGCAACGGCAGGACCATCCCTGAGAAGGGCAACTCCGCCGACATCCAGCACTCTGGCGGCAGATCCTCTCTGGAAGGCCCCAGATTCGAGAGAACCGGCGGAGGCCACCACCATCATCACCATTGA |
41 | C-말단 His10 태그를 가진 처음 8개의 FN3 반복부를 함유한 시노몰구스 VE-PTP (Cyno PTP-β) (Cyno 베타 ½ VE-PTP ECD)의 단백질 서열 | MEWSWVFLFFLSVTTGVHSERCNFTLAESKASSHSVSIRWRIWGSPCNFNLTYSSDTLGAASCPPFRLDNTTYGCNLQDLQAGTIYNFRIVSLDGEERTVVLQTDPLPPARFGVSKEKTTSTSLHVWWTPSPGKVTSYEVQLFDENNQKIQGVQIQESTSWNKYTFFNLTAGSKYNITITAVSGGKRSSSVYTNGSTVPSPVKDIGISTKANSLLVSWSHGSGNVERYRLMLMDKGILVHGSVVDRQATSYTFNGLTPGYLYNLTVVTEAAGLQNYKWKLVRTAPMEVSNLKVTNDGSLTSLKVKWQRPPGNVDSYNITLSHKGTIKESRVLAPRVTETHFKELTPGRLYQVTVSCVSGELSAQRMAVGRTFPLPVLQLRVKHANETSLSIIWQPPVAEWEEYIISLADRDLRLIHKSLSKDAKEFTFTDLVPGRKYMATVTSISGDLKNSSSVKGRTVPAQVTDLHVANQGMTSSLFTNWTQAQGDVEFYQVLLIHENVVIKNESIPSETSGYNFHFLKSGSLYSVVVTTVSGGISSRQVVVEGRTVPSSVSGVTVNNSGRNDYLSVSWLPAPGDVDNYEVTLSHDGRVVQSLVIAKSVRECSFSSLTPGRLYTVTITTRSGKYENHSFSQERTVPDKVQGVSVSNSARSDYLRVSWVHATGDFDHYEVTIKNKNNFIETKSIPKSENECVFVQLVPGRLYSVTVTTKSGQYEASEQGNGRTGGGHHHHHHHHHH |
42 | 처음 8개의 FN3반복부를 함유한 Cyno 베타 ½ VE-PTP ECD (SEQ ID NO: 41)의 DNA 서열 | ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCGAGCGGTGCAACTTTACCCTGGCCGAGTCCAAGGCCTCCTCCCACTCCGTGTCTATCCGGTGGCGGATCTGGGGCTCCCCCTGCAACTTCAACCTGACCTACTCCTCCGATACCCTGGGCGCTGCCTCCTGTCCTCCTTTCCGGCTGGACAACACCACCTACGGCTGCAACCTGCAGGATCTGCAGGCCGGCACCATCTACAACTTCCGGATCGTGTCCCTGGACGGCGAGGAACGGACAGTGGTGCTGCAGACCGATCCTCTGCCCCCTGCCAGATTCGGCGTGTCCAAAGAAAAGACCACCTCCACCTCCCTGCACGTGTGGTGGACCCCTAGCCCTGGCAAAGTGACCTCCTACGAGGTGCAGCTGTTCGACGAGAACAACCAGAAAATCCAGGGCGTGCAGATCCAGGAATCCACCTCCTGGAACAAGTACACCTTCTTCAATCTGACCGCCGGCTCCAAGTACAACATCACCATCACCGCCGTGTCCGGCGGCAAGAGATCCTCCTCCGTGTACACCAACGGCTCCACCGTGCCCAGCCCCGTGAAGGACATCGGCATCTCCACCAAGGCCAACTCCCTGCTGGTGTCCTGGTCCCACGGCTCCGGCAACGTGGAACGGTACAGACTGATGCTGATGGACAAGGGCATCCTGGTGCACGGCAGCGTGGTGGATAGACAGGCCACCTCCTACACCTTCAACGGCCTGACCCCCGGCTACCTGTATAACCTGACCGTCGTGACCGAGGCCGCTGGACTGCAGAACTACAAGTGGAAGCTCGTGCGGACCGCCCCCATGGAAGTGTCCAACCTGAAAGTGACCAACGACGGCTCCCTGACCTCTCTGAAAGTGAAGTGGCAGAGGCCCCCTGGCAATGTGGACAGCTACAATATCACCCTGTCCCACAAGGGCACCATCAAAGAATCCCGGGTGCTGGCCCCCAGAGTGACCGAGACACACTTCAAAGAGCTGACCCCTGGCCGGCTGTACCAAGTGACCGTGTCCTGTGTGTCTGGCGAGCTGTCTGCCCAGAGAATGGCCGTGGGCAGAACCTTCCCTCTGCCCGTGCTGCAGCTGAGAGTGAAGCACGCCAACGAGACATCCCTGTCCATCATCTGGCAGCCCCCTGTGGCCGAGTGGGAAGAGTACATCATCAGCCTGGCCGACCGGGACCTGCGGCTGATCCACAAGTCCCTGAGCAAGGACGCCAAAGAGTTCACCTTCACCGACCTGGTGCCTGGCCGGAAGTACATGGCCACCGTGACCTCCATCTCCGGCGACCTGAAGAACTCCTCCAGCGTGAAGGGCAGGACCGTGCCTGCCCAAGTGACAGACCTGCATGTGGCCAACCAGGGCATGACCTCCAGCCTGTTCACCAACTGGACCCAGGCTCAGGGCGACGTGGAATTCTACCAGGTGCTGCTGATCCATGAGAACGTCGTGATCAAGAACGAGTCCATCCCCTCCGAGACAAGCGGCTACAACTTTCACTTCCTGAAGTCCGGCAGCCTGTACTCCGTGGTCGTGACCACAGTGTCCGGGGGCATCTCCTCTAGAAGGTGGTGGTGGAAGGCCGCACCGTGCCTAGTTCAGTGTCAGGCGTGACCGTGAACAACAGCGGCCGGAACGACTACCTGTCCGTGTCTTGGCTGCCTGCCCCTGGGGACGTGGACAACTACGAAGTGACCCTGTCTCACGACGGCCGGGTGGTGCAGTCTCTCGTGATCGCTAAGTCCGTGCGCGAGTGCTCCTTCAGCAGCCTGACACCTGGCAGACTGTATACCGTGACCATCACCACCAGATCCGGGAAGTACGAGAACCACAGCTTCTCCCAGGAACGAACCGTGCCCGACAAGGTGCAGGGCGTGTCAGTGTCTAACTCCGCCAGATCTGACTACCTGAGAGTGTCCTGGGTGCACGCCACCGGCGACTTCGACCATTATGAAGTGACAATCAAGAACAAGAACAACTTCATCGAGACAAAGAGCATCCCCAAGTCCGAGAACGAGTGCGTGTTCGTGCAGCTGGTGCCAGGCAGGCTGTATTCTGTGACAGTGACCACCAAGTCCGGCCAGTACGAGGCCTCTGAGCAGGGCAATGGCAGAACCGGCGGTGGACACCACCATCATCACCATCACCACCATCACTAG |
43 | C-말단 His10 태그를 가진 인간 HPTP-η (인간 HPTP-η ECD)의 단백질 서열 | MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAGGTPSPIPDPSVATVATGENGITQISSTAESFHKQNGTGTPQVETNTSEDGESSGANDSLRTPEQGSNGTDGASQKTPSSTGPSPVFDIKAVSISPTNVILTWKSNDTAASEYKYVVKHKMENEKTITVVHQPWCNITGLRPATSYVFSITPGIGNETWGDPRVIKVITEPIPVSDLRVALTGVRKAALSWSNGNGTASCRVLLESIGSHEELTQDSRLQVNISGLKPGVQYNINPYLLQSNKTKGDPLGTEGGLDASNTERSRAGSPTAPVHDESLVGPVDPSSGQQSRDTEVLLVGLEPGTRYNATVYSQAANGTEGQPQAIEFRTNAIQVFDVTAVNISATSLTLIWKVSDNESSSNYTYKIHVAGETDSSNLNVSEPRAVIPGLRSSTFYNITVCPVLGDIEGTPGFLQVHTPPVPVSDFRVTVVSTTEIGLAWSSHDAESFQMHITQEGAGNSRVEITTNQSIIIGGLFPGTKYCFEIVPKGPNGTEGASRTVCNRTVPSAVFDIHVVYVTTTEMWLDWKSPDGASEYVYHLVIESKHGSNHTSTYDKAITLQGLIPGTLYNITISPEVDHVWGDPNSTAQYTRPSNVSNIDVSTNTTAATLSWQNFDDASPTYSYCLLIEKAGNSSNATQVVTDIGITDATVTELIPGSSYTVEIFAQVGDGIKSLEPGRKSFCTDPASMASFDCEVVPKEPALVLKWTCPPGANAGFELEVSSGAWNNATHLESCSSENGTEYRTEVTYLNFSTSYNISITTVSCGKMAAPTRNTCTTGITDPPPPDGSPNITSVSHNSVKVKFSGFEASHGPIKAYAVILTTGEAGHPSADVLKYTYEDFKKGASDTYVTYLIRTEEKGRSQSLSEVLKYEIDVGNESTTLGYYNGKLEPLGSYRACVAGFTNITFHPQNKGLIDGAESYVSFSRYSDAVSLPQDPGVICGGGHHHHHHHHHH |
44 | C-말단 His10 태그를 가진 인간 HPTP-η의 DNA 서열 (SEQ ID NO: 43) | ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCGCAGGTGGCACCCCTAGTCCAATTCCTGACCCTTCAGTAGCAACTGTTGCCACAGGGGAAAATGGCATAACGCAGATCAGCAGTACAGCAGAATCCTTTCATAAACAGAATGGAACTGGAACACCTCAGGTGGAAACAAACACCAGTGAGGATGGTGAAAGCTCTGGAGCCAACGATAGTTTAAGAACACCTGAACAAGGATCTAATGGGACTGATGGGGCATCTCAAAAAACTCCCAGTAGCACTGGGCCCAGTCCTGTGTTTGACATTAAAGCTGTTTCCATCAGTCCAACCAATGTGATCTTAACTTGGAAAAGTAATGACACAGCTGCTTCTGAGTACAAGTATGTAGTAAAGCATAAGATGGAAAATGAGAAGACAATTACTGTTGTGCATCAACCATGGTGTAACATCACAGGCTTACGTCCAGCGACTTCATATGTATTCTCCATCACTCCAGGAATAGGCAATGAGACTTGGGGAGATCCCAGAGTCATAAAAGTCATCACAGAGCCGATCCCAGTTTCTGATCTCCGTGTTGCCCTCACGGGTGTGAGGAAGGCTGCTCTCTCCTGGAGCAATGGCAATGGCACTGCCTCCTGCCGGGTTCTTCTTGAAAGCATTGGAAGCCATGAGGAGTTGACTCAAGACTCAAGACTTCAGGTCAATATCTCGGGCCTGAAGCCAGGGGTTCAATACAACATCAACCCGTATCTTCTACAATCAAATAAGACAAAGGGAGACCCCTTGGGCACAGAAGGTGGCTTGGATGCCAGCAATACAGAGAGAAGCCGGGCAGGGAGCCCCACCGCCCCTGTGCATGATGAGTCCCTCGTGGGACCTGTGGACCCATCCTCCGGCCAGCAGTCCCGAGACACGGAAGTCCTGCTTGTCGGGTTAGAGCCTGGCACCCGATACAATGCCACCGTTTATTCCCAAGCAGCGAATGGCACAGAAGGACAGCCCCAGGCCATAGAGTTCAGGACAAATGCTATTCAGGTTTTTGACGTCACCGCTGTGAACATCAGTGCCACAAGCCTGACCCTGATCTGGAAAGTCAGCGATAACGAGTCGTCATCTAACTATACCTACAAGATACATGTGGCGGGGGAGACAGATTCTTCCAATCTCAACGTCAGTGAGCCTCGCGCTGTCATCCCCGGACTCCGCTCCAGCACCTTCTACAACATCACAGTGTGTCCTGTCCTAGGTGACATCGAGGGCACGCCGGGCTTCCTCCAAGTGCACACCCCCCCTGTTCCAGTTTCTGACTTCCGAGTGACAGTGGTCAGCACGACGGAGATCGGCTTAGCATGGAGCAGCCATGATGCAGAATCATTTCAGATGCATATCACACAGGAGGGAGCTGGCAATTCTCGGGTAGAAATAACCACCAACCAAAGTATTATCATTGGTGGCTTGTTCCCTGGAACCAAGTATTGCTTTGAAATAGTTCCAAAAGGACCAAATGGGACTGAAGGGGCATCTCGGACAGTTTGCAATAGAACTGTTCCCAGTGCAGTGTTTGACATCCACGTGGTCTACGTCACCACCACGGAGATGTGGCTGGACTGGAAGAGCCCTGACGGTGCTTCCGAGTATGTCTACCATTTAGTCATAGAGTCCAAGCATGGCTCTAACCACACAAGCACGTATGACAAAGCGATTACTCTCCAGGGCCTGATTCCGGGCACCTTATATAACATCACCATCTCTCCAGAAGTGGACCACGTCTGGGGGGACCCCAACTCCACTGCACAGTACACACGGCCCAGCAATGTGTCCAACATTGATGTAAGTACCAACACCACAGCAGCAACTTTAAGTTGGCAGAACTTTGATGACGCCTCTCCCACGTACTCCTACTGCCTTCTTATTGAGAAGGCTGGAAATTCCAGCAACGCAACACAAGTAGTCACGGACATTGGAATTACTGACGCTACAGTCACTGAATTAATACCTGGCTCATCATACACAGTGGAGATCTTTGCACAAGTAGGGGATGGGATCAAGTCACTGGAACCTGGCCGGAAGTCATTCTGTACAGATCCTGCGTCCATGGCCTCCTTCGACTGCGAAGTGGTCCCCAAAGAGCCAGCCCTGGTTCTCAAATGGACCTGCCCTCCTGGCGCCAATGCAGGCTTTGAGCTGGAGGTCAGCAGTGGAGCCTGGAACAATGCGACCCACCTGGAGAGCTGCTCCTCTGAGAATGGCACTGAGTATAGAACGGAAGTCACGTATTTGAATTTTTCTACCTCGTACAACATCAGCATCACCACTGTGTCCTGTGGAAAGATGGCAGCCCCCACCCGGAACACCTGCACTACTGGCATCACAGATCCCCCTCCTCCAGATGGATCCCCTAATATTACATCTGTCAGTCACAATTCAGTAAAGGTCAAGTTCAGTGGATTTGAAGCCAGCCACGGACCCATCAAAGCCTATGCTGTCATTCTCACCACCGGGGAAGCTGGTCACCCTTCTGCAGATGTCCTGAAATACACGTATGAGGATTTCAAAAAGGGAGCCTCAGATACTTATGTGACATACCTCATAAGAACAGAAGAAAAGGGACGTTCTCAGAGCTTGTCTGAAGTTTTGAAATATGAAATTGACGTTGGGAATGAGTCAACCACACTTGGTTATTACAATGGGAAGCTGGAACCTCTGGGCTCCTACCGGGCTTGTGTGGCTGGCTTCACCAACATTACCTTCCACCCTCAAAACAAGGGGCTCATTGATGGGGCTGAGAGCTATGTGTCCTTCAGTCGCTACTCAGATGCTGTTTCCTTGCCCCAGGATCCAGGTGTCATCTGTGGCGGTGGACACCACCATCATCACCATCACCACCATCACTAG |
HPTP-β, cyno PTP-β, 및 HPTP-η 단백질을 코팅 완충액 (pH 9.4) 중의 ELISA 플레이트 위에 코팅하였다. 각 단백질을 50 mM 탄산염-중탄산염 중의 1 μg/mL 단백질 스톡으로서 준비하였다. 코팅된 단백질을 100 μL/웰의 부피로 멸균된, 투명한, 폴리스티렌의, 평평한 바닥 96-웰 플레이트로 부분표본화하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 후에, 플레이트를 200 μL/웰의 1x PBS-T (PBS with 0.05% Tween 20)로 3회 세척하였다. 면역화 단백질은 인간 VE-PTP (HPTP-β)였다. 그런 후 플레이트를 PBS-T 중의 200 μL/웰의 5% 블롯팅 등급 차단제 무지방 건조 우유로 차단하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
일차 항체 샘플을 인간화된 변종 및 네거티브 대조군인 항-hCD20-hIgG4S228P에 대하여, PBS 중의 1 μg/웰의 5% 블롯팅 등급 차단제 무지방 건조 우유를 사용하여 제조하였다. 샘플을 3개 한 조로 테스트하였다. Fab 항체 단편을 IgG 항체로서 처리하였다. 그런 후 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고 100 μL의 일차 항체 조제물을 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
이차 항체 샘플을 과산화효소-콘쥬게이트된 친화성 정제된 당나귀 항-인간 IgG 특이적 이차 항체를 PBS 중의 블롯팅 등급 차단제 무지방 건조 우유로 1:2,000 희석으로 희석함으로써 제조하였다. 그런 후 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고 100 μL의 이차 항체 조제물을 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하였다.
그런 다음, 75 μg/1-StepTM Ultra TMB-ELISA를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 5분 동안 실온에서 전개되도록 놓아두었다. 5분 후에, 50 μL의 2 M 황산을 각 웰에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 그런 후 플레이트를 플레이트 판독기상에서 450 nm의 흡광 파장에서 분석하였다.
도 5는 종-특이적 VE-PTP 및 HPTP-η에 대해 스크리닝된 R15E6의 웨스턴 블롯을 도시한다. R15E6은 인간 VE-PTP에 대해 매우 선택적이었다 (HPTP-β; 레인 1 및 4). 인간 PTP-η 또는 cyno VE-PTP (cyno PTP-β)에 대한 유의미한 결합은 관찰되지 않았다. 표시된 재조합 헥사히스티딘-태그 단백질 (6-His)은 R15E6 및 상업적으로 입수 가능한 6-His 항체로 순차적으로 프로빙되었다. 상업적으로 입수 가능한 6-His 항체는 모든 단백질 표적에 대한 결합을 나타냈고, 인간 VE-PTP (HPTP-β)에 대한 빈약한 선택성을 보였다.
각각의 인간화된 변종을 항원인 인간 VE-PTP (HPTP-β)에 대한 친화성에 대해, ELISA를 사용하여 측정하였다. 100 mg/웰의 VE-PTP (HPTP-β) 항원을 코팅 완충액 (0.5 mM NaHCO3에 0.5 mM Na2CO3을 첨가함으로써 pH 9.6으로 만듬) 중의 96-웰 플레이트 위에 4℃에서 밤새 고정시켰다. 그런 후 코팅 완충액을 제거하고 200 μL/웰의 차단 용액 (3% w/v의 탈지분, PBS)을 첨가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 플레이트를 PBS-T (1% v/v Tween 20)로 4회 세척하였다. PBS-TB (0.05% v/v Tween 20, 0.5% w/v BSA)에서 10,000 ng/mL로부터 9.765 ng/mL로 연속적으로 희석된 정제된 R15E6 변종의 100 μL/웰을 첨가하였다. 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하였다. 그런 후 100 μL/웰의 염소 항-인간 HRP (Fc 특이적)를 1:60,000 PBS의 비율로 첨가하고 플레이트를 추가로 1시간 동안 실온에서 교반하면서 인큐베이션하였다. 그런 후 플레이트를 PBS-T로 6회 및 PBS로 1회 세척하였다. 다음으로, 100 μL/웰의 TMB 기질 용액을 첨가하고 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 웰당 50 μL의 1 M HCl을 첨가하고 플레이트를 즉시 450 nm에서 Tecan Sunrise 플레이트 판독기상에서 판독하였다. ELISA 결과를 도 14 내지 17에 나타낸다. HC1, HC2 및 HC3 변종은 대체로 키메릭 HC0LC0 항체에 비교하여 유사한 결합 특징을 나타냈다. HC4 변종의 결합은 HC0LC0에 비교하여 다른 중쇄 변종보다 훨씬 더 낮았다 (도 17).
각 변종의 샘플을 결합 친화성을 측정하기 위해 추가로 Biacore 분석에 의해 평가하였다. 항체 결합 실험을 Biacore 3000TM 상에서 25℃에서 수행하였다. 검정 완충액: 10 mM HEPES 완충액 (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% P20 (폴리옥시에틸렌소르비탄). 재생 완충액: 10 mM 글리신 HCl (pH 1.75). 콘쥬게이션 완충액: 10 mM 아세트산 나트륨 완충액 (pH 5). 리간드를 포획하기 위해 사용된 유량은 5 μL/분이었다. 동역학 분석을 위한 유량은 50 μL/분이었다. CM5 칩의 유동 세포 1 및 2를 최대량의 염소 항-인간 IgG로 코팅하였다. 대략 150 RU의 테스트 항체를 나타낸 바와 같이 유동 세포 2, 3 및 4에서 포획하였다. 항원은 칩 위로 흐르게 하였다. 항체에 대한 항원의 결합을 실시간으로 모니터링하였다. KD를 관찰된 kon 및 koff 값으로부터 측정하였다.
스카우팅 분석 (scouting analysis)을 표시된 단일 분석물 농도를 사용하여 수행하였다. 이 농도들에서, 결합은 리간드 결합이 약한 경우에도 관찰될 수 있었다. 유동 세포 1 반응을 기준 뺄샘에 사용하였다.
전체 동역학적 분석을 대조군 항체에 대하여 표시된 분석물의 농도 범위로 2-배 연속 희석으로 수행하였다: 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 및 0 nM.
표 17은 Biacore 결합 거멍에 의해 측정된 결합 속도 (ka), 해리 속도 (kd), 최대 결합 용량 (Rmax), 결합 상수 (KA), 및 해리 상수 (KD)를 포함하여, VE-PTP (HPTP-β) ECD에 대한 각각의 인간화된 항체의 결합의 결합 동역학적 파라미터들을 나타낸다. Rmax는 상대 반응 (RU)으로서 측정되었다. 인간화된 후보들은 모두 마우스/인간 키메릭 항체, HC0LC0와 유사한 결합 친화성을 나타냈다.
표 18은 ELISA에 의해 측정된, 부모 항체 (R15E6) 및 무반응성 대조군 (IgG4)과 비교하여 인간화된 항체의 결합 선택성을 보여준다. 0.2 이하의 값은 결합이 없음을 나타낸다. 인간화된 항체 후보, 부모 R15E6, 및 마우스/인간 키메릭 항체 (HC0:LC0)는 모두 인간 PTP-η 및 cyno PTP-β에 대한 유의미한 결합이 없음에 의해 나타난 바와 같이 인간 VE-PTP (HPTP-β)에 대해 고도의 선택성을 나타냈다.
인간 VE-PTP (HPTP-β)를 표적화하기 위해 사용된 인간화된 항체는 자가 인산화에 의해 Tie2 활성을 복원할 수 있고, 예를 들어, PI3K-Akt 통로의 단백질들을 포함한 하류 이펙터들을 개시할 수 있다. 인간 VE-PTP (HPTP-β)에 대한 항체의 결합을 평가하는 것 이외에, 항체가 이 이펙터 단백질들을 활성화하는 능력을 측정하였다. 도 18은 웨스턴 블롯에 의해 측정된 바, 인간화된 변종에 의한 Tie2 리간드 (예컨대, Ang1 또는 Ang2)의 부재시에 Tie2 (좌측 패널) 및 Akt (우측 패널)의 활성화를 도시한다. 인간화된 변종의 활성은 부모의 쥐과 항체 R15E6 및 키메릭 항체 HC0LC0의 그것과 유사하였다. 인간 IgG4를 대조군으로서 사용하였다. 모든 항체를 50 nM에서 테스트하였다. 각 블롯의 상부 패널은 Tie2 또는 Akt 활성화를 나타내는, Tie2 또는 Akt 중 어느 하나의 인산화를 나타낸다. Tie2 및 Akt는 대조군 항체로 처리된 샘플에서보다는 인간화된 항체로 처리된 샘플에서 더 큰 인산화를 나타냈고, 인간화된 항체가 리간드가 없을 때에도 Tie2 및 Akt를 활성화하는 데 효과적이었음을 나타냈다.
도 19는 웨스턴 블롯에 의해 측정된 바 인간화된 항체, HC2LC4 및 HC1LC1에 의한, Tie2 리간드 (예컨대, Ang1 또는 Ang2)가 없을 때의 Tie2 (상부 패널) 및 Akt (하부 패널)의 농도-의존성 활성화를 도시한다. Tie2 및 Akt 신호전달 활성을 저 나노몰 농도의 인간화된 변종으로 관찰하였다. 각 블롯의 상부 패널은 Tie2 또는 Akt 중 어느 하나의 인산화를 나타내며, Tie2 또는 Akt 활성화를 나타낸다. Tie2 및 Akt는 대조군 항체로 처리된 샘플에서 나타난 것보다 인간화된 항체로 처리된 샘플에서 더 큰 인산화를 나타냈다. 이런 결과는 인간화된 항체가 Ang1이 없을 때에도 Tie2 및 Akt를 활성화하는 데 효과적이었음을 나타낸다.
도 20은 웨스턴 블롯에 의해 측정된 바, 인간화된 항체 후보, HC2LC4 및 HC1LC1에 의한, Ang1 및 Ang2가 있을 때의 Tie2 (좌측 패널) 및 Akt (우측 패널)의 활성화를 도시한다. HC2LC4 및 HC1LC1은, 각각 Tie2 및 Akt 인산화의 증가에 의해 나타난 바와 같이, Ang2가 있을 때 Tie2 및 Akt를 둘 다 활성화하였고, Ang1-매개된 Tie2 및 Akt 활성화를 향상시켰다. 모든 항체를 10 nM에서 테스트하였다.
도 21은 웨스턴 블롯에 의해 측정된 바, 인간화된 항체 후보, HC2LC1 및 HC2LC4에 의한, Ang1 또는 Ang2가 있을 때의 Tie2 (패널 A), 인간 VE-PTP (HPTP-β) 발현 (패널 B), 및 Akt (패널 C)의 활성화를 도시한다. HC2LC1 및 HC2LC4는 Ang1 단독, Ang2 단독의 존재시에, 및 Ang1과 Ang2 둘 다의 존재시에 Tie2를 활성화하였다. 항체를 15분 동안 사전 인큐베이션한 후 Ang1 또는 Ang2로 600 ng/mL의 농도에서 10분 동안 자극하였다. 모든 항체를 10 nM에서 테스트하였다.
도 22는 인간화된 항체 후보, HC2LC1을 사용하는 HUVEC에서 Akt의 활성화를 도시한다. 처음 3개 블롯의 상부 패널은 Akt의 인산화를 나타내며, 증가하는 농도의 HC2LC1에서의 Akt 활성화를 나타낸다. 결합 친화성 연구와 일치하게, HC2LC1은 나노몰 농도의 항체로 Akt를 활성화하였다. HC2LC1에 의한 Akt 활성화는 인간 VE-PTP (HPTP-β) 세포외재성 도메인 (βECD 6His 및 βECD Fc)과 항체의 사전 인큐베이션에 의해 차단되었다. 이 결과는 HC2LC1-매개된 Akt 활성화가 인간 VE-PTP (HPTP-β) 세포외재성 도메인에 대한 HC2LC1 결합을 통해 일어나는 것을 나타낸다.
도 23은 부모 항체, R15E6, 및 mIgG1 대조군과 비교된, 인간화된 항체 후보 HC2LC1 및 HC0LC0를 사용하는 혈청-고갈된 HUVEC에서의 향상된 생존율을 도시한다.
구체예
구체예 1. SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 화합물.
구체예 2. 서열이 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 85% 동일한, 구체예 1의 화합물.
구체예 3. 서열이 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 90% 동일한, 구체예 1 또는 2의 화합물.
구체예 4. 서열이 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 95% 동일한, 구체예 1 내지 3 중 어느 하나의 화합물.
구체예 5. 서열이 SEQ ID NO: 9에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 1의 화합물.
구체예 6. 서열이 SEQ ID NO: 9인, 구체예 1 내지 5 중 어느 하나의 화합물.
구체예 7. 서열이 SEQ ID NO: 10에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 1의 화합물.
구체예 8. 서열이 SEQ ID NO: 10인, 구체예 1 내지 4 및 7 중 어느 하나의 화합물.
구체예 9. 서열이 SEQ ID NO: 11에 적어도 80% 동일한, 구체예 1의 화합물.
구체예 10. 서열이 SEQ ID NO: 11인, 구체예 1 내지 4 및 9 중 어느 하나의 화합물.
구체예 11. 서열이 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 1의 화합물.
구체예 12. 서열이 SEQ ID NO: 12인, 구체예 1 내지 4 및 11 중 어느 하나의 화합물.
구체예 13. 서열이 SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 1의 화합물.
구체예 14. 서열이 SEQ ID NO: 29인, 구체예 1의 화합물..
구체예 15. 서열이 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 1의 화합물.
구체예 16. 서열이 SEQ ID NO: 30인, 구체예 1의 화합물.
구체예 17. 서열이 SEQ ID NO: 31에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 1의 화합물.
구체예 18. 서열이 SEQ ID NO: 31인, 구체예 1의 화합물.
구체예 19. 서열이 SEQ ID NO: 32에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 1의 화합물.
구체예 20. 서열이 SEQ ID NO: 32인, 구체예 1의 화합물.
구체예 21. 화합물이 티로신 포스파타제를 억제하는, 구체예 1 내지 20 중 어느 하나의 화합물.
구체예 22. 화합물이 HPTP-β를 억제하는, 구체예 1 내지 21 중 어느 하나의 화합물.
구체예 23. 화합물이 VE-PTP를 억제하는, 구체예 1 내지 22 중 어느 하나의 화합물.
구체예 24. 화합물이 Tie2를 활성화하는, 구체예 1 내지 23 중 어느 하나의 화합물.
구체예 25. 화합물이 Akt를 활성화하는, 구체예 1 내지 24 중 어느 하나의 화합물.
구체예 26. 화합물이 HPTP-β의 세포외재성 도메인에 결합하는, 구체예 1 내지 25 중 어느 하나의 화합물.
구체예 27. 화합물이 HPTP-β의 세포외재성 도메인의 첫 번째 FN3 반복부에 결합하는, 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 화합물.
구체예 28. HPTP-β의 세포외재성 도메인에 대한 화합물의 결합 친화성 (KD)이 약 70 pM 내지 약 70 nM인, 구체예 1 내지 27 중 어느 하나의 화합물.
구체예 29. SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 또는 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 화합물.
구체예 30. 서열이 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 또는 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 85% 동일한, 구체예 29의 화합물.
구체예 31. 서열이 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 또는 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 90% 동일한, 구체예 29 또는 30의 화합물.
구체예 32. 서열이 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 또는 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 95% 동일한, 구체예 29 내지 31 중 어느 하나의 화합물.
구체예 33. 서열이 SEQ ID NO: 20에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 29의 화합물.
구체예 34. 서열이 SEQ ID NO: 20인, 구체예 29 내지 33 중 어느 하나의 화합물.
구체예 35. 서열이 SEQ ID NO: 21에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 29의 화합물.
구체예 36. 서열이 SEQ ID NO: 21인, 구체예 29 내지 32 및 35 중 어느 하나의 화합물.
구체예 37. 서열이 SEQ ID NO: 22에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 29의 화합물.
구체예 38. 서열이 SEQ ID NO: 22인, 구체예 29 내지 32 및 37 중 어느 하나의 화합물.
구체예 39. 서열이 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 29의 화합물.
구체예 40. 서열이 SEQ ID NO: 23인, 구체예 29 내지 32 및 39 중 어느 하나의 화합물.
구체예 41. 서열이 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 29의 화합물.
구체예 42. 서열이 SEQ ID NO: 34인, 구체예 29의 화합물.
구체예 43. 서열이 SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 29의 화합물.
구체예 44. 서열이 SEQ ID NO: 35인, 구체예 29의 화합물.
구체예 45. 서열이 SEQ ID NO: 36에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 29의 화합물.
구체예 46. 서열이 SEQ ID NO: 36인, 구체예 29의 화합물.
구체예 47. 서열이 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 80% 동일한, 구체예 29의 화합물.
구체예 48. 서열이 SEQ ID NO: 37인, 구체예 29의 화합물.
구체예 49. 화합물이 티로신 포스파타제를 억제하는, 구체예 29 내지 48 중 어느 하나의 화합물.
구체예 50. 화합물이 HPTP-β를 억제하는, 구체예 29 내지 49 중 어느 하나의 화합물.
구체예 51. 화합물이 VE-PTP를 억제하는, 구체예 29 내지 50 중 어느 하나의 화합물.
구체예 52. 화합물이 Tie2를 활성화하는, 구체예 29 내지 51 중 어느 하나의 화합물.
구체예 53. 화합물이 Akt를 활성화하는, 구체예 29 내지 52 중 어느 하나의 화합물.
구체예 54. 화합물이 HPTP-β의 세포외재성 도메인에 결합하는, 구체예 29 내지 53 중 어느 하나의 화합물.
구체예 55. 화합물이 HPTP-β의 세포외재성 도메인의 첫 번째 FN3 반복부에 결합하는, 구체예 29 내지 54 중 어느 하나의 화합물.
구체예 56. HPTP-β의 세포외재성 도메인에 대한 화합물의 결합 친화성 (KD)이 약 70 pM 내지 약 70 nM인, 구체예 29 내지 55 중 어느 하나의 화합물.
구체예 57. a) SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄; 및 b) SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 화합물.
구체예 58. 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 85% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 85% 동일한, 구체예 57의 화합물.
구체예 59. 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 90% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 90% 동일한, 구체예 57 또는 58의 화합물.
구체예 60. 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 95% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 95% 동일한, 구체예 57 내지 59 중 어느 하나의 화합물.
구체예 61. 중쇄는 SEQ ID NO: 30이고 경쇄는 SEQ ID NO: 34인, 구체예 57 내지 60 중 어느 하나의 화합물.
구체예 62. 화합물이 티로신 포스파타제를 억제하는, 구체예 57 내지 61 중 어느 하나의 화합물.
구체예 63. 화합물이 HPTP-β를 억제하는, 구체예 57 내지 62 중 어느 하나의 화합물.
구체예 64. 화합물이 VE-PTP를 억제하는, 구체예 57 내지 63 중 어느 하나의 화합물.
구체예 65. 화합물이 Tie2를 활성화하는, 구체예 57 내지 64 중 어느 하나의 화합물.
구체예 66. 화합물이 Akt를 활성화하는, 구체예 57 내지 65 중 어느 하나의 화합물.
구체예 67. 화합물이 HPTP-β의 세포외재성 도메인에 결합하는, 구체예 57 내지 66 중 어느 하나의 화합물.
구체예 68. 화합물이 HPTP-β의 세포외재성 도메인의 첫 번째 FN3 반복부에 결합하는, 구체예 57 내지 67 중 어느 하나의 화합물.
구체예 69. HPTP-β의 세포외재성 도메인에 대한 화합물의 결합 친화성 (KD)이 약 70 pM 내지 약 70 nM인, 구체예 57 내지 68 중 어느 하나의 화합물.
구체예 70. a) SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄; 및 b) SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 화합물.
구체예 71. 중쇄는 SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 85% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 85% 동일한, 구체예 70의 화합물.
구체예 72. 중쇄는 SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 90% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 90% 동일한, 구체예 70 또는 71의 화합물.
구체예 73. 중쇄는 SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 95% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 95% 동일한, 구체예 70 내지 72 중 어느 하나의 화합물.
구체예 74. 중쇄는 SEQ ID NO: 29이고 경쇄는 SEQ ID NO: 35인, 구체예 70 내지 73 중 어느 하나의 화합물.
구체예 75. 화합물이 티로신 포스파타제를 억제하는, 구체예 70 내지 74 중 어느 하나의 화합물.
구체예 76. 화합물이 HPTP-β를 억제하는, 구체예 70 내지 75 중 어느 하나의 화합물.
구체예 77. 화합물이 VE-PTP를 억제하는, 구체예 70 내지 76 중 어느 하나의 화합물.
구체예 78. 화합물이 Tie2를 활성화하는, 구체예 70 내지 77 중 어느 하나의 화합물.
구체예 79. 화합물이 Akt를 활성화하는, 구체예 70 내지 78 중 어느 하나의 화합물.
구체예 80. 화합물이 HPTP-β의 세포외재성 도메인에 결합하는, 구체예 70 내지 79 중 어느 하나의 화합물.
구체예 81. 화합물이 HPTP-β의 세포외재성 도메인의 첫 번째 FN3 반복부에 결합하는, 구체예 70 내지 80 중 어느 하나의 화합물.
구체예 82. HPTP-β의 세포외재성 도메인에 대한 화합물의 결합 친화성 (KD)이 약 70 pM 내지 약 70 nM인, 구체예 70 내지 81 중 어느 하나의 화합물.
구체예 83. a) SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄; 및 b) SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 화합물.
구체예 84. 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 85% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 85% 동일한, 구체예 83의 화합물.
구체예 85. 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 90% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 90% 동일한, 구체예 83 또는 84의 화합물.
구체예 86. 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 95% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 95% 동일한, 구체예 83 내지 85 중 어느 하나의 화합물.
구체예 87. 중쇄는 SEQ ID NO: 30이고 경쇄는 SEQ ID NO: 37인, 구체예 83 내지 86 중 어느 하나의 화합물.
구체예 88. 화합물이 티로신 포스파타제를 억제하는, 구체예 83 내지 87 중 어느 하나의 화합물.
구체예 89. 화합물이 HPTP-β를 억제하는, 구체예 83 내지 88 중 어느 하나의 화합물.
구체예 90. 화합물이 VE-PTP를 억제하는, 구체예 83 내지 89 중 어느 하나의 화합물.
구체예 91. 화합물이 Tie2를 활성화하는, 구체예 83 내지 90 중 어느 하나의 화합물.
구체예 92. 화합물이 Akt를 활성화하는, 구체예 83 내지 91 중 어느 하나의 화합물.
구체예 93. 화합물이 HPTP-β의 세포외재성 도메인에 결합하는, 구체예 83 내지 92 중 어느 하나의 화합물.
구체예 94. 화합물이 HPTP-β의 세포외재성 도메인의 첫 번째 FN3 반복부에 결합하는, 구체예 83 내지 93 중 어느 하나의 화합물.
구체예 95. HPTP-β의 세포외재성 도메인에 대한 화합물의 결합 친화성 (KD)이 약 70 pM 내지 약 70 nM인, 구체예 83 내지 94 중 어느 하나의 화합물.
구체예 96. 구체예 1 내지 95 중 어느 하나의 화합물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 질병을 치료하는 방법.
구체예 97. 질병이 눈 질병인, 구체예 96의 방법.
구체예 98. 질병이 당뇨성 망막병증인, 구체예 96 또는 97의 방법.
구체예 99. 질병이 신생혈관인, 구체예 96 또는 97의 방법.
구체예 100. 질병이 혈관 누출인, 구체예 96 또는 97의 방법.
구체예 101. 질병이 증가된 안압인, 구체예 96 또는 97의 방법.
구체예 102. 질병이 눈의 부종인, 구체예 96 또는 97의 방법.
구체예 103. 질병이 당뇨성 황반 부종인, 구체예 96 또는 97의 방법.
구체예 104. 질병이 눈의 고혈압인, 구체예 96 또는 97의 방법.
구체예 105. 질병이 눈의 염증인, 구체예 96 또는 97의 방법.
구체예 106. 투여가 대상체의 눈에 대한 것인, 구체예 96 내지 105 중 어느 하나의 방법.
구체예 107. 투여가 유리체내 투여인, 구체예 96 내지 106 중 어느 하나의 방법.
구체예 108. 투여가 피하 투여인, 구체예 96 내지 105 중 어느 하나의 방법.
구체예 109. 투여가 국소 투여인, 구체예 96 내지 106 중 어느 하나의 방법.
구체예 110. 대상체가 인간인, 구체예 96 내지 109 중 어느 하나의 방법.
구체예 111. 화합물의 치료적 유효량은 약 0.25 mg 내지 약 200 mg인, 구체예 96 내지 110 중 어느 하나의 방법.
구체예 112. 화합물의 치료적 유효량은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg인, 구체예 96 내지 110 중 어느 하나의 방법.
구체예 113. 화합물의 치료적 유효량은 약 1 mg 내지 약 50 mg인, 구체예 96 내지 110 중 어느 하나의 방법.
구체예 114. 화합물의 치료적 유효량은 약 50 mg 내지 약 200 mg인, 구체예 96 내지 110 중 어느 하나의 방법.
SEQUENCE LISTING
<110> AERPIO THERAPEUTICS, INC.
<120> HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODIES THAT TARGET VE-PTP (HPTP-BETA)
<130> 45725-724.601
<140> PCT/US2017/042855
<141> 2017-07-19
<150> 62/377,072
<151> 2016-08-19
<150> 62/364,381
<151> 2016-07-20
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 1
Met Asp Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln Gly
1 5 10 15
Val His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Lys Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asn Ala Asn Ala Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Gly Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala
85 90 95
Gln Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Ile
115 120 125
Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135 140
<210> 2
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg
100
<210> 3
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20 25 30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg
100
<210> 4
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ala Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ile Arg Asp Tyr Tyr Gly Ala Thr Arg Gly Phe Gln His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20 25 30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Tyr Val Val Gly Ala Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Ser Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Pro Ala Asp Phe Tyr Tyr Tyr Ser Ser Gly Gln
100 105 110
Thr Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Ser Ser Trp Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ala Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Gly
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ala Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Ile Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ala Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Gly
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Ile Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ala Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Gly
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Ile Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 12
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ala Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Gly
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val His
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Ile Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser
1 5 10 15
Gly Val Glu Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser
20 25 30
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln His
35 40 45
Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Gln Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser
100 105 110
Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 14
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
<210> 15
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro
100
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Gly Gly Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His His Asp Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 20
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln His Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln His Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln His Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln His Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 24
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 25
Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys
20
<210> 26
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 27
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 27
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 28
<211> 468
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 28
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Lys Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asn Ala Asn Ala Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Gly Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala
85 90 95
Gln Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Ile
115 120 125
Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
145 150 155 160
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
210 215 220
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Gly Lys
465
<210> 29
<211> 468
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 29
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asn Ala Asn Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Gly Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Ala Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Ile
115 120 125
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465
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<211> 468
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 31
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 36
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 37
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 38
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<210> 39
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Glu Ser Lys Ala Ser Ser His Ser Val Ser Ile Gln Trp Arg Ile Leu
35 40 45
Gly Ser Pro Cys Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Leu Gly
50 55 60
Ala Ala Leu Cys Pro Thr Phe Arg Ile Asp Asn Thr Thr Tyr Gly Cys
65 70 75 80
Asn Leu Gln Asp Leu Gln Ala Gly Thr Ile Tyr Asn Phe Arg Ile Ile
85 90 95
Ser Leu Asp Glu Glu Arg Thr Val Val Leu Gln Thr Asp Pro Leu Pro
100 105 110
Pro Ala Arg Phe Gly Val Ser Lys Glu Lys Thr Thr Ser Thr Ser Leu
115 120 125
His Val Trp Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Val Thr Ser Tyr Glu Val
130 135 140
Gln Leu Phe Asp Glu Asn Asn Gln Lys Ile Gln Gly Val Gln Ile Gln
145 150 155 160
Glu Ser Thr Ser Trp Asn Glu Tyr Thr Phe Phe Asn Leu Thr Ala Gly
165 170 175
Ser Lys Tyr Asn Ile Ala Ile Thr Ala Val Ser Gly Gly Lys Arg Ser
180 185 190
Phe Ser Val Tyr Thr Asn Gly Ser Thr Val Pro Ser Pro Val Lys Asp
195 200 205
Ile Gly Ile Ser Thr Lys Ala Asn Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser His
210 215 220
Gly Ser Gly Asn Val Glu Arg Tyr Arg Leu Met Leu Met Asp Lys Gly
225 230 235 240
Ile Leu Val His Gly Gly Val Val Asp Lys His Ala Thr Ser Tyr Ala
245 250 255
Phe His Gly Leu Thr Pro Gly Tyr Leu Tyr Asn Leu Thr Val Met Thr
260 265 270
Glu Ala Ala Gly Leu Gln Asn Tyr Arg Trp Lys Leu Val Arg Thr Ala
275 280 285
Pro Met Glu Val Ser Asn Leu Lys Val Thr Asn Asp Gly Ser Leu Thr
290 295 300
Ser Leu Lys Val Lys Trp Gln Arg Pro Pro Gly Asn Val Asp Ser Tyr
305 310 315 320
Asn Ile Thr Leu Ser His Lys Gly Thr Ile Lys Glu Ser Arg Val Leu
325 330 335
Ala Pro Trp Ile Thr Glu Thr His Phe Lys Glu Leu Val Pro Gly Arg
340 345 350
Leu Tyr Gln Val Thr Val Ser Cys Val Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gln
355 360 365
Lys Met Ala Val Gly Arg Thr Phe Pro Asp Lys Val Ala Asn Leu Glu
370 375 380
Ala Asn Asn Asn Gly Arg Met Arg Ser Leu Val Val Ser Trp Ser Pro
385 390 395 400
Pro Ala Gly Asp Trp Glu Gln Tyr Arg Ile Leu Leu Phe Asn Asp Ser
405 410 415
Val Val Leu Leu Asn Ile Thr Val Gly Lys Glu Glu Thr Gln Tyr Val
420 425 430
Met Asp Asp Thr Gly Leu Val Pro Gly Arg Gln Tyr Glu Val Glu Val
435 440 445
Ile Val Glu Ser Gly Asn Leu Lys Asn Ser Glu Arg Cys Gln Gly Arg
450 455 460
Thr Val Pro Leu Ala Val Leu Gln Leu Arg Val Lys His Ala Asn Glu
465 470 475 480
Thr Ser Leu Ser Ile Met Trp Gln Thr Pro Val Ala Glu Trp Glu Lys
485 490 495
Tyr Ile Ile Ser Leu Ala Asp Arg Asp Leu Leu Leu Ile His Lys Ser
500 505 510
Leu Ser Lys Asp Ala Lys Glu Phe Thr Phe Thr Asp Leu Val Pro Gly
515 520 525
Arg Lys Tyr Met Ala Thr Val Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu Lys Asn
530 535 540
Ser Ser Ser Val Lys Gly Arg Thr Val Pro Ala Gln Val Thr Asp Leu
545 550 555 560
His Val Ala Asn Gln Gly Met Thr Ser Ser Leu Phe Thr Asn Trp Thr
565 570 575
Gln Ala Gln Gly Asp Val Glu Phe Tyr Gln Val Leu Leu Ile His Glu
580 585 590
Asn Val Val Ile Lys Asn Glu Ser Ile Ser Ser Glu Thr Ser Arg Tyr
595 600 605
Ser Phe His Ser Leu Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Ser Val Val Val Thr
610 615 620
Thr Val Ser Gly Gly Ile Ser Ser Arg Gln Val Val Val Glu Gly Arg
625 630 635 640
Thr Val Pro Ser Ser Val Ser Gly Val Thr Val Asn Asn Ser Gly Arg
645 650 655
Asn Asp Tyr Leu Ser Val Ser Trp Leu Leu Ala Pro Gly Asp Val Asp
660 665 670
Asn Tyr Glu Val Thr Leu Ser His Asp Gly Lys Val Val Gln Ser Leu
675 680 685
Val Ile Ala Lys Ser Val Arg Glu Cys Ser Phe Ser Ser Leu Thr Pro
690 695 700
Gly Arg Leu Tyr Thr Val Thr Ile Thr Thr Arg Ser Gly Lys Tyr Glu
705 710 715 720
Asn His Ser Phe Ser Gln Glu Arg Thr Val Pro Asp Lys Val Gln Gly
725 730 735
Val Ser Val Ser Asn Ser Ala Arg Ser Asp Tyr Leu Arg Val Ser Trp
740 745 750
Val His Ala Thr Gly Asp Phe Asp His Tyr Glu Val Thr Ile Lys Asn
755 760 765
Lys Asn Asn Phe Ile Gln Thr Lys Ser Ile Pro Lys Ser Glu Asn Glu
770 775 780
Cys Val Phe Val Gln Leu Val Pro Gly Arg Leu Tyr Ser Val Thr Val
785 790 795 800
Thr Thr Lys Ser Gly Gln Tyr Glu Ala Asn Glu Gln Gly Asn Gly Arg
805 810 815
Thr Ile Pro Glu Pro Val Lys Asp Leu Thr Leu Arg Asn Arg Ser Thr
820 825 830
Glu Asp Leu His Val Thr Trp Ser Gly Ala Asn Gly Asp Val Asp Gln
835 840 845
Tyr Glu Ile Gln Leu Leu Phe Asn Asp Met Lys Val Phe Pro Pro Phe
850 855 860
His Leu Val Asn Thr Ala Thr Glu Tyr Arg Phe Thr Ser Leu Thr Pro
865 870 875 880
Gly Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Val Leu Thr Ile Ser Gly Asp Val Gln
885 890 895
Gln Ser Ala Phe Ile Glu Gly Phe Thr Val Pro Ser Ala Val Lys Asn
900 905 910
Ile His Ile Ser Pro Asn Gly Ala Thr Asp Ser Leu Thr Val Asn Trp
915 920 925
Thr Pro Gly Gly Gly Asp Val Asp Ser Tyr Thr Val Ser Ala Phe Arg
930 935 940
His Ser Gln Lys Val Asp Ser Gln Thr Ile Pro Lys His Val Phe Glu
945 950 955 960
His Thr Phe His Arg Leu Glu Ala Gly Glu Gln Tyr Gln Ile Met Ile
965 970 975
Ala Ser Val Ser Gly Ser Leu Lys Asn Gln Ile Asn Val Val Gly Arg
980 985 990
Thr Val Pro Ala Ser Val Gln Gly Val Ile Ala Asp Asn Ala Tyr Ser
995 1000 1005
Ser Tyr Ser Leu Ile Val Ser Trp Gln Lys Ala Ala Gly Val Ala
1010 1015 1020
Glu Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Leu Thr Glu Asn Gly Ile Leu Leu
1025 1030 1035
Arg Asn Thr Ser Glu Pro Ala Thr Thr Lys Gln His Lys Phe Glu
1040 1045 1050
Asp Leu Thr Pro Gly Lys Lys Tyr Lys Ile Gln Ile Leu Thr Val
1055 1060 1065
Ser Gly Gly Leu Phe Ser Lys Glu Ala Gln Thr Glu Gly Arg Thr
1070 1075 1080
Val Pro Ala Ala Val Thr Asp Leu Arg Ile Thr Glu Asn Ser Thr
1085 1090 1095
Arg His Leu Ser Phe Arg Trp Thr Ala Ser Glu Gly Glu Leu Ser
1100 1105 1110
Trp Tyr Asn Ile Phe Leu Tyr Asn Pro Asp Gly Asn Leu Gln Glu
1115 1120 1125
Arg Ala Gln Val Asp Pro Leu Val Gln Ser Phe Ser Phe Gln Asn
1130 1135 1140
Leu Leu Gln Gly Arg Met Tyr Lys Met Val Ile Val Thr His Ser
1145 1150 1155
Gly Glu Leu Ser Asn Glu Ser Phe Ile Phe Gly Arg Thr Val Pro
1160 1165 1170
Ala Ser Val Ser His Leu Arg Gly Ser Asn Arg Asn Thr Thr Asp
1175 1180 1185
Ser Leu Trp Phe Asn Trp Ser Pro Ala Ser Gly Asp Phe Asp Phe
1190 1195 1200
Tyr Glu Leu Ile Leu Tyr Asn Pro Asn Gly Thr Lys Lys Glu Asn
1205 1210 1215
Trp Lys Asp Lys Asp Leu Thr Glu Trp Arg Phe Gln Gly Leu Val
1220 1225 1230
Pro Gly Arg Lys Tyr Val Leu Trp Val Val Thr His Ser Gly Asp
1235 1240 1245
Leu Ser Asn Lys Val Thr Ala Glu Ser Arg Thr Ala Pro Ser Pro
1250 1255 1260
Pro Ser Leu Met Ser Phe Ala Asp Ile Ala Asn Thr Ser Leu Ala
1265 1270 1275
Ile Thr Trp Lys Gly Pro Pro Asp Trp Thr Asp Tyr Asn Asp Phe
1280 1285 1290
Glu Leu Gln Trp Leu Pro Arg Asp Ala Leu Thr Val Phe Asn Pro
1295 1300 1305
Tyr Asn Asn Arg Lys Ser Glu Gly Arg Ile Val Tyr Gly Leu Arg
1310 1315 1320
Pro Gly Arg Ser Tyr Gln Phe Asn Val Lys Thr Val Ser Gly Asp
1325 1330 1335
Ser Trp Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Ile Phe Gly Ser Val Arg Thr
1340 1345 1350
Lys Pro Asp Lys Ile Gln Asn Leu His Cys Arg Pro Gln Asn Ser
1355 1360 1365
Thr Ala Ile Ala Cys Ser Trp Ile Pro Pro Asp Ser Asp Phe Asp
1370 1375 1380
Gly Tyr Ser Ile Glu Cys Arg Lys Met Asp Thr Gln Glu Val Glu
1385 1390 1395
Phe Ser Arg Lys Leu Glu Lys Glu Lys Ser Leu Leu Asn Ile Met
1400 1405 1410
Met Leu Val Pro His Lys Arg Tyr Leu Val Ser Ile Lys Val Gln
1415 1420 1425
Ser Ala Gly Met Thr Ser Glu Val Val Glu Asp Ser Thr Ile Thr
1430 1435 1440
Met Ile Asp Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ile Arg Val Asn
1445 1450 1455
Glu Lys Asp Val Leu Ile Ser Lys Ser Ser Ile Asn Phe Thr Val
1460 1465 1470
Asn Cys Ser Trp Phe Ser Asp Thr Asn Gly Ala Val Lys Tyr Phe
1475 1480 1485
Thr Val Val Val Arg Glu Ala Asp Gly Ser Asp Glu Leu Lys Pro
1490 1495 1500
Glu Gln Gln His Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Glu Tyr Arg His Asn
1505 1510 1515
Ala Ser Ile Arg Val Tyr Gln Thr Asn Tyr Phe Ala Ser Lys Cys
1520 1525 1530
Ala Glu Asn Pro Asn Ser Asn Ser Lys Ser Phe Asn Ile Lys Leu
1535 1540 1545
Gly Ala Glu Met Glu Ser Leu Gly Gly Lys Cys Asp Pro Thr Gln
1550 1555 1560
Gln Lys Phe Cys Asp Gly Pro Leu Lys Pro His Thr Ala Tyr Arg
1565 1570 1575
Ile Ser Ile Arg Ala Phe Thr Gln Leu Phe Asp Glu Asp Leu Lys
1580 1585 1590
Glu Phe Thr Lys Pro Leu Tyr Ser Asp Thr Phe Phe Ser Leu Pro
1595 1600 1605
Ile Thr Thr Glu Ser Glu Pro Leu Phe Gly Ala Ile Glu Gly Val
1610 1615 1620
Ser Ala Gly Leu Phe Leu Ile Gly Met Leu Val Ala Val Val Ala
1625 1630 1635
Leu Leu Ile Cys Arg Gln Lys Val Ser His Gly Arg Glu Arg Pro
1640 1645 1650
Ser Ala Arg Leu Ser Ile Arg Arg Asp Arg Pro Leu Ser Val His
1655 1660 1665
Leu Asn Leu Gly Gln Lys Gly Asn Arg Lys Thr Ser Cys Pro Ile
1670 1675 1680
Lys Ile Asn Gln Phe Glu Gly His Phe Met Lys Leu Gln Ala Asp
1685 1690 1695
Ser Asn Tyr Leu Leu Ser Lys Glu Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Val
1700 1705 1710
Gly Arg Asn Gln Ser Cys Asp Ile Ala Leu Leu Pro Glu Asn Arg
1715 1720 1725
Gly Lys Asn Arg Tyr Asn Asn Ile Leu Pro Tyr Asp Ala Thr Arg
1730 1735 1740
Val Lys Leu Ser Asn Val Asp Asp Asp Pro Cys Ser Asp Tyr Ile
1745 1750 1755
Asn Ala Ser Tyr Ile Pro Gly Asn Asn Phe Arg Arg Glu Tyr Ile
1760 1765 1770
Val Thr Gln Gly Pro Leu Pro Gly Thr Lys Asp Asp Phe Trp Lys
1775 1780 1785
Met Val Trp Glu Gln Asn Val His Asn Ile Val Met Val Thr Gln
1790 1795 1800
Cys Val Glu Lys Gly Arg Val Lys Cys Asp His Tyr Trp Pro Ala
1805 1810 1815
Asp Gln Asp Ser Leu Tyr Tyr Gly Asp Leu Ile Leu Gln Met Leu
1820 1825 1830
Ser Glu Ser Val Leu Pro Glu Trp Thr Ile Arg Glu Phe Lys Ile
1835 1840 1845
Cys Gly Glu Glu Gln Leu Asp Ala His Arg Leu Ile Arg His Phe
1850 1855 1860
His Tyr Thr Val Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Thr Thr Gln
1865 1870 1875
Ser Leu Ile Gln Phe Val Arg Thr Val Arg Asp Tyr Ile Asn Arg
1880 1885 1890
Ser Pro Gly Ala Gly Pro Thr Val Val His Cys Ser Ala Gly Val
1895 1900 1905
Gly Arg Thr Gly Thr Phe Ile Ala Leu Asp Arg Ile Leu Gln Gln
1910 1915 1920
Leu Asp Ser Lys Asp Ser Val Asp Ile Tyr Gly Ala Val His Asp
1925 1930 1935
Leu Arg Leu His Arg Val His Met Val Gln Thr Glu Cys Gln Tyr
1940 1945 1950
Val Tyr Leu His Gln Cys Val Arg Asp Val Leu Arg Ala Arg Lys
1955 1960 1965
Leu Arg Ser Glu Gln Glu Asn Pro Leu Phe Pro Ile Tyr Glu Asn
1970 1975 1980
Val Asn Pro Glu Tyr His Arg Asp Pro Val Tyr Ser Arg His
1985 1990 1995
<210> 40
<211> 2283
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 40
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccgag 60
cccgagagat gcaacttcac cctggccgag tccaaggcct cctcccactc cgtgtctatc 120
cagtggcgga tcctgggctc cccctgcaac ttctctctga tctactcctc cgacaccctg 180
ggcgctgccc tgtgccctac cttcagaatc gacaacacca cctacggctg caacctgcag 240
gatctgcagg ccggcaccat ctacaacttc aagatcatct ccctggacga ggaacggacc 300
gtggtgctgc agaccgatcc tctgcctcct gccagattcg gcgtgtccaa agaaaagacc 360
acctccaccg gactgcacgt gtggtggacc ccttccagcg gcaaagtgac ctcctacgag 420
gtgcagctgt tcgacgagaa caaccagaaa atccagggcg tgcagatcca ggaatccacc 480
tcctggaacg agtacacctt cttcaacctg accgccggct ccaagtacaa tatcgccatc 540
accgccgtgt ccggcggcaa gagatccttc tccgtgtaca ccaacggctc caccgtgccc 600
agccccgtga aggacatcgg catctccacc aaggccaact ccctgctgat ctcctggtcc 660
cacggctccg gcaacgtgga acggtacaga ctgatgctga tggacaaggg catcctggtg 720
cacggcggcg tggtggataa gcacgccacc tcttacgcct tccacggcct gacccctggc 780
tacctgtaca atctgaccgt gatgaccgag gccgctggac tgcagaacta ccggtggaag 840
ctcgtgcgga ccgcccccat ggaagtgtcc aacctgaaag tgaccaacga cggctccctg 900
acctctctga aagtgaagtg gcagaggccc cctggcaatg tggactccta caacatcacc 960
ctgtcccaca agggcaccat caaagaatcc cgggtgctgg ccccttggat caccgagaca 1020
cacttcaaag aactggtgcc tggccggctg taccaagtga ccgtgtcctg tgtgtctggc 1080
gagctgtccg cccagaaaat ggccgtgggc agaaccttcc ctctggccgt gctgcagctg 1140
agagtgaagc acgctaacga gacatccctg tccatcatgt ggcagacccc cgtggccgag 1200
tgggagaagt acatcatcag cctggccgac cgggacctgc tgctgatcca caagtccctg 1260
agcaaggacg ccaaagagtt caccttcacc gacctggtgc ccggcagaaa gtacatggcc 1320
accgtgacct ccatctccgg cgacctgaag aactcctcca gcgtgaaggg caggaccgtg 1380
cctgcccaag tgacagacct gcacgtggcc aaccagggca tgacctcctc cctgttcacc 1440
aactggaccc aggctcaggg cgacgtggaa ttctaccagg tgctgctgat tcatgagaac 1500
gtcgtgatca agaacgagtc catctcctcc gagacaagcc ggtactcctt ccactccctg 1560
aagtccggca gcctgtactc cgtggtcgtg accacagtgt ccgggggcat ctcctctaga 1620
caggtggtgg tggaaggccg caccgtgcct agttcagtgt caggcgtgac cgtgaacaac 1680
agcggccgga acgactacct gtccgtgtct tggctgctgg ctcctgggga cgtggacaac 1740
tacgaagtga ccctgagcca cgacggcaag gtggtgcagt ctctcgtgat cgccaagtcc 1800
gtgcgcgagt gctccttcag ctctctgaca cctggcagac tgtataccgt gaccatcacc 1860
accagatccg ggaagtacga gaaccacagc ttctcccagg aacgcacagt gcccgacaag 1920
gtgcagggcg tgtcagtgtc taactccgcc agatctgact acctgcgggt gtcctgggtg 1980
cacgctaccg gcgacttcga ccattatgaa gtgacaatca agaacaagaa caacttcatc 2040
cagaccaagt ccatccccaa gtccgagaac gagtgcgtgt tcgtgcagct ggtgccaggc 2100
agactgtact ctgtgacagt gaccaccaag tccggccagt acgaggccaa cgagcagggc 2160
aacggcagga ccatccctga gaagggcaac tccgccgaca tccagcactc tggcggcaga 2220
tcctctctgg aaggccccag attcgagaga accggcggag gccaccacca tcatcaccat 2280
tga 2283
<210> 41
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 41
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Arg Cys Asn Phe Thr Leu Ala Glu Ser Lys Ala Ser
20 25 30
Ser His Ser Val Ser Ile Arg Trp Arg Ile Trp Gly Ser Pro Cys Asn
35 40 45
Phe Asn Leu Thr Tyr Ser Ser Asp Thr Leu Gly Ala Ala Ser Cys Pro
50 55 60
Pro Phe Arg Leu Asp Asn Thr Thr Tyr Gly Cys Asn Leu Gln Asp Leu
65 70 75 80
Gln Ala Gly Thr Ile Tyr Asn Phe Arg Ile Val Ser Leu Asp Gly Glu
85 90 95
Glu Arg Thr Val Val Leu Gln Thr Asp Pro Leu Pro Pro Ala Arg Phe
100 105 110
Gly Val Ser Lys Glu Lys Thr Thr Ser Thr Ser Leu His Val Trp Trp
115 120 125
Thr Pro Ser Pro Gly Lys Val Thr Ser Tyr Glu Val Gln Leu Phe Asp
130 135 140
Glu Asn Asn Gln Lys Ile Gln Gly Val Gln Ile Gln Glu Ser Thr Ser
145 150 155 160
Trp Asn Lys Tyr Thr Phe Phe Asn Leu Thr Ala Gly Ser Lys Tyr Asn
165 170 175
Ile Thr Ile Thr Ala Val Ser Gly Gly Lys Arg Ser Ser Ser Val Tyr
180 185 190
Thr Asn Gly Ser Thr Val Pro Ser Pro Val Lys Asp Ile Gly Ile Ser
195 200 205
Thr Lys Ala Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Ser His Gly Ser Gly Asn
210 215 220
Val Glu Arg Tyr Arg Leu Met Leu Met Asp Lys Gly Ile Leu Val His
225 230 235 240
Gly Ser Val Val Asp Arg Gln Ala Thr Ser Tyr Thr Phe Asn Gly Leu
245 250 255
Thr Pro Gly Tyr Leu Tyr Asn Leu Thr Val Val Thr Glu Ala Ala Gly
260 265 270
Leu Gln Asn Tyr Lys Trp Lys Leu Val Arg Thr Ala Pro Met Glu Val
275 280 285
Ser Asn Leu Lys Val Thr Asn Asp Gly Ser Leu Thr Ser Leu Lys Val
290 295 300
Lys Trp Gln Arg Pro Pro Gly Asn Val Asp Ser Tyr Asn Ile Thr Leu
305 310 315 320
Ser His Lys Gly Thr Ile Lys Glu Ser Arg Val Leu Ala Pro Arg Val
325 330 335
Thr Glu Thr His Phe Lys Glu Leu Thr Pro Gly Arg Leu Tyr Gln Val
340 345 350
Thr Val Ser Cys Val Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gln Arg Met Ala Val
355 360 365
Gly Arg Thr Phe Pro Leu Pro Val Leu Gln Leu Arg Val Lys His Ala
370 375 380
Asn Glu Thr Ser Leu Ser Ile Ile Trp Gln Pro Pro Val Ala Glu Trp
385 390 395 400
Glu Glu Tyr Ile Ile Ser Leu Ala Asp Arg Asp Leu Arg Leu Ile His
405 410 415
Lys Ser Leu Ser Lys Asp Ala Lys Glu Phe Thr Phe Thr Asp Leu Val
420 425 430
Pro Gly Arg Lys Tyr Met Ala Thr Val Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu
435 440 445
Lys Asn Ser Ser Ser Val Lys Gly Arg Thr Val Pro Ala Gln Val Thr
450 455 460
Asp Leu His Val Ala Asn Gln Gly Met Thr Ser Ser Leu Phe Thr Asn
465 470 475 480
Trp Thr Gln Ala Gln Gly Asp Val Glu Phe Tyr Gln Val Leu Leu Ile
485 490 495
His Glu Asn Val Val Ile Lys Asn Glu Ser Ile Pro Ser Glu Thr Ser
500 505 510
Gly Tyr Asn Phe His Phe Leu Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Ser Val Val
515 520 525
Val Thr Thr Val Ser Gly Gly Ile Ser Ser Arg Gln Val Val Val Glu
530 535 540
Gly Arg Thr Val Pro Ser Ser Val Ser Gly Val Thr Val Asn Asn Ser
545 550 555 560
Gly Arg Asn Asp Tyr Leu Ser Val Ser Trp Leu Pro Ala Pro Gly Asp
565 570 575
Val Asp Asn Tyr Glu Val Thr Leu Ser His Asp Gly Arg Val Val Gln
580 585 590
Ser Leu Val Ile Ala Lys Ser Val Arg Glu Cys Ser Phe Ser Ser Leu
595 600 605
Thr Pro Gly Arg Leu Tyr Thr Val Thr Ile Thr Thr Arg Ser Gly Lys
610 615 620
Tyr Glu Asn His Ser Phe Ser Gln Glu Arg Thr Val Pro Asp Lys Val
625 630 635 640
Gln Gly Val Ser Val Ser Asn Ser Ala Arg Ser Asp Tyr Leu Arg Val
645 650 655
Ser Trp Val His Ala Thr Gly Asp Phe Asp His Tyr Glu Val Thr Ile
660 665 670
Lys Asn Lys Asn Asn Phe Ile Glu Thr Lys Ser Ile Pro Lys Ser Glu
675 680 685
Asn Glu Cys Val Phe Val Gln Leu Val Pro Gly Arg Leu Tyr Ser Val
690 695 700
Thr Val Thr Thr Lys Ser Gly Gln Tyr Glu Ala Ser Glu Gln Gly Asn
705 710 715 720
Gly Arg Thr Gly Gly Gly His His His His His His His His His His
725 730 735
<210> 42
<211> 2210
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 42
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccgag 60
cggtgcaact ttaccctggc cgagtccaag gcctcctccc actccgtgtc tatccggtgg 120
cggatctggg gctccccctg caacttcaac ctgacctact cctccgatac cctgggcgct 180
gcctcctgtc ctcctttccg gctggacaac accacctacg gctgcaacct gcaggatctg 240
caggccggca ccatctacaa cttccggatc gtgtccctgg acggcgagga acggacagtg 300
gtgctgcaga ccgatcctct gccccctgcc agattcggcg tgtccaaaga aaagaccacc 360
tccacctccc tgcacgtgtg gtggacccct agccctggca aagtgacctc ctacgaggtg 420
cagctgttcg acgagaacaa ccagaaaatc cagggcgtgc agatccagga atccacctcc 480
tggaacaagt acaccttctt caatctgacc gccggctcca agtacaacat caccatcacc 540
gccgtgtccg gcggcaagag atcctcctcc gtgtacacca acggctccac cgtgcccagc 600
cccgtgaagg acatcggcat ctccaccaag gccaactccc tgctggtgtc ctggtcccac 660
ggctccggca acgtggaacg gtacagactg atgctgatgg acaagggcat cctggtgcac 720
ggcagcgtgg tggatagaca ggccacctcc tacaccttca acggcctgac ccccggctac 780
ctgtataacc tgaccgtcgt gaccgaggcc gctggactgc agaactacaa gtggaagctc 840
gtgcggaccg cccccatgga agtgtccaac ctgaaagtga ccaacgacgg ctccctgacc 900
tctctgaaag tgaagtggca gaggccccct ggcaatgtgg acagctacaa tatcaccctg 960
tcccacaagg gcaccatcaa agaatcccgg gtgctggccc ccagagtgac cgagacacac 1020
ttcaaagagc tgacccctgg ccggctgtac caagtgaccg tgtcctgtgt gtctggcgag 1080
ctgtctgccc agagaatggc cgtgggcaga accttccctc tgcccgtgct gcagctgaga 1140
gtgaagcacg ccaacgagac atccctgtcc atcatctggc agccccctgt ggccgagtgg 1200
gaagagtaca tcatcagcct ggccgaccgg gacctgcggc tgatccacaa gtccctgagc 1260
aaggacgcca aagagttcac cttcaccgac ctggtgcctg gccggaagta catggccacc 1320
gtgacctcca tctccggcga cctgaagaac tcctccagcg tgaagggcag gaccgtgcct 1380
gcccaagtga cagacctgca tgtggccaac cagggcatga cctccagcct gttcaccaac 1440
tggacccagg ctcagggcga cgtggaattc taccaggtgc tgctgatcca tgagaacgtc 1500
gtgatcaaga acgagtccat cccctccgag acaagcggct acaactttca cttcctgaag 1560
tccggcagcc tgtactccgt ggtcgtgacc acagtgtccg ggggcatctc ctctagaagg 1620
tggtggtgga aggccgcacc gtgcctagtt cagtgtcagg cgtgaccgtg aacaacagcg 1680
gccggaacga ctacctgtcc gtgtcttggc tgcctgcccc tggggacgtg gacaactacg 1740
aagtgaccct gtctcacgac ggccgggtgg tgcagtctct cgtgatcgct aagtccgtgc 1800
gcgagtgctc cttcagcagc ctgacacctg gcagactgta taccgtgacc atcaccacca 1860
gatccgggaa gtacgagaac cacagcttct cccaggaacg aaccgtgccc gacaaggtgc 1920
agggcgtgtc agtgtctaac tccgccagat ctgactacct gagagtgtcc tgggtgcacg 1980
ccaccggcga cttcgaccat tatgaagtga caatcaagaa caagaacaac ttcatcgaga 2040
caaagagcat ccccaagtcc gagaacgagt gcgtgttcgt gcagctggtg ccaggcaggc 2100
tgtattctgt gacagtgacc accaagtccg gccagtacga ggcctctgag cagggcaatg 2160
gcagaaccgg cggtggacac caccatcatc accatcacca ccatcactag 2210
<210> 43
<211> 971
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 43
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ala Gly Gly Thr Pro Ser Pro Ile Pro Asp Pro Ser Val
20 25 30
Ala Thr Val Ala Thr Gly Glu Asn Gly Ile Thr Gln Ile Ser Ser Thr
35 40 45
Ala Glu Ser Phe His Lys Gln Asn Gly Thr Gly Thr Pro Gln Val Glu
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ala Ala Ser Glu Tyr Lys Tyr Val Val Lys His Lys Met Glu Asn Glu
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Pro Val Ser Asp Leu Arg Val Ala Leu Thr Gly Val Arg Lys Ala Ala
195 200 205
Leu Ser Trp Ser Asn Gly Asn Gly Thr Ala Ser Cys Arg Val Leu Leu
210 215 220
Glu Ser Ile Gly Ser His Glu Glu Leu Thr Gln Asp Ser Arg Leu Gln
225 230 235 240
Val Asn Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Gln Tyr Asn Ile Asn Pro
245 250 255
Tyr Leu Leu Gln Ser Asn Lys Thr Lys Gly Asp Pro Leu Gly Thr Glu
260 265 270
Gly Gly Leu Asp Ala Ser Asn Thr Glu Arg Ser Arg Ala Gly Ser Pro
275 280 285
Thr Ala Pro Val His Asp Glu Ser Leu Val Gly Pro Val Asp Pro Ser
290 295 300
Ser Gly Gln Gln Ser Arg Asp Thr Glu Val Leu Leu Val Gly Leu Glu
305 310 315 320
Pro Gly Thr Arg Tyr Asn Ala Thr Val Tyr Ser Gln Ala Ala Asn Gly
325 330 335
Thr Glu Gly Gln Pro Gln Ala Ile Glu Phe Arg Thr Asn Ala Ile Gln
340 345 350
Val Phe Asp Val Thr Ala Val Asn Ile Ser Ala Thr Ser Leu Thr Leu
355 360 365
Ile Trp Lys Val Ser Asp Asn Glu Ser Ser Ser Asn Tyr Thr Tyr Lys
370 375 380
Ile His Val Ala Gly Glu Thr Asp Ser Ser Asn Leu Asn Val Ser Glu
385 390 395 400
Pro Arg Ala Val Ile Pro Gly Leu Arg Ser Ser Thr Phe Tyr Asn Ile
405 410 415
Thr Val Cys Pro Val Leu Gly Asp Ile Glu Gly Thr Pro Gly Phe Leu
420 425 430
Gln Val His Thr Pro Pro Val Pro Val Ser Asp Phe Arg Val Thr Val
435 440 445
Val Ser Thr Thr Glu Ile Gly Leu Ala Trp Ser Ser His Asp Ala Glu
450 455 460
Ser Phe Gln Met His Ile Thr Gln Glu Gly Ala Gly Asn Ser Arg Val
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Gly Ala Ser Arg Thr Val Cys Asn Arg Thr Val Pro Ser Ala Val Phe
515 520 525
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545 550 555 560
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565 570 575
Leu Gln Gly Leu Ile Pro Gly Thr Leu Tyr Asn Ile Thr Ile Ser Pro
580 585 590
Glu Val Asp His Val Trp Gly Asp Pro Asn Ser Thr Ala Gln Tyr Thr
595 600 605
Arg Pro Ser Asn Val Ser Asn Ile Asp Val Ser Thr Asn Thr Thr Ala
610 615 620
Ala Thr Leu Ser Trp Gln Asn Phe Asp Asp Ala Ser Pro Thr Tyr Ser
625 630 635 640
Tyr Cys Leu Leu Ile Glu Lys Ala Gly Asn Ser Ser Asn Ala Thr Gln
645 650 655
Val Val Thr Asp Ile Gly Ile Thr Asp Ala Thr Val Thr Glu Leu Ile
660 665 670
Pro Gly Ser Ser Tyr Thr Val Glu Ile Phe Ala Gln Val Gly Asp Gly
675 680 685
Ile Lys Ser Leu Glu Pro Gly Arg Lys Ser Phe Cys Thr Asp Pro Ala
690 695 700
Ser Met Ala Ser Phe Asp Cys Glu Val Val Pro Lys Glu Pro Ala Leu
705 710 715 720
Val Leu Lys Trp Thr Cys Pro Pro Gly Ala Asn Ala Gly Phe Glu Leu
725 730 735
Glu Val Ser Ser Gly Ala Trp Asn Asn Ala Thr His Leu Glu Ser Cys
740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Met Ala Ala Pro Thr Arg Asn Thr Cys Thr Thr Gly Ile Thr Asp Pro
785 790 795 800
Pro Pro Pro Asp Gly Ser Pro Asn Ile Thr Ser Val Ser His Asn Ser
805 810 815
Val Lys Val Lys Phe Ser Gly Phe Glu Ala Ser His Gly Pro Ile Lys
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Ala Tyr Ala Val Ile Leu Thr Thr Gly Glu Ala Gly His Pro Ser Ala
835 840 845
Asp Val Leu Lys Tyr Thr Tyr Glu Asp Phe Lys Lys Gly Ala Ser Asp
850 855 860
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865 870 875 880
Ser Leu Ser Glu Val Leu Lys Tyr Glu Ile Asp Val Gly Asn Glu Ser
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Lys Gly Leu Ile Asp Gly Ala Glu Ser Tyr Val Ser Phe Ser Arg Tyr
930 935 940
Ser Asp Ala Val Ser Leu Pro Gln Asp Pro Gly Val Ile Cys Gly Gly
945 950 955 960
Gly His His His His His His His His His His
965 970
<210> 44
<211> 2916
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 44
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccgca 60
ggtggcaccc ctagtccaat tcctgaccct tcagtagcaa ctgttgccac aggggaaaat 120
ggcataacgc agatcagcag tacagcagaa tcctttcata aacagaatgg aactggaaca 180
cctcaggtgg aaacaaacac cagtgaggat ggtgaaagct ctggagccaa cgatagttta 240
agaacacctg aacaaggatc taatgggact gatggggcat ctcaaaaaac tcccagtagc 300
actgggccca gtcctgtgtt tgacattaaa gctgtttcca tcagtccaac caatgtgatc 360
ttaacttgga aaagtaatga cacagctgct tctgagtaca agtatgtagt aaagcataag 420
atggaaaatg agaagacaat tactgttgtg catcaaccat ggtgtaacat cacaggctta 480
cgtccagcga cttcatatgt attctccatc actccaggaa taggcaatga gacttgggga 540
gatcccagag tcataaaagt catcacagag ccgatcccag tttctgatct ccgtgttgcc 600
ctcacgggtg tgaggaaggc tgctctctcc tggagcaatg gcaatggcac tgcctcctgc 660
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tcaaataaga caaagggaga ccccttgggc acagaaggtg gcttggatgc cagcaataca 840
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gtggacccat cctccggcca gcagtcccga gacacggaag tcctgcttgt cgggttagag 960
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cctcgcgctg tcatccccgg actccgctcc agcaccttct acaacatcac agtgtgtcct 1260
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attccgggca ccttatataa catcaccatc tctccagaag tggaccacgt ctggggggac 1800
cccaactcca ctgcacagta cacacggccc agcaatgtgt ccaacattga tgtaagtacc 1860
aacaccacag cagcaacttt aagttggcag aactttgatg acgcctctcc cacgtactcc 1920
tactgccttc ttattgagaa ggctggaaat tccagcaacg caacacaagt agtcacggac 1980
attggaatta ctgacgctac agtcactgaa ttaatacctg gctcatcata cacagtggag 2040
atctttgcac aagtagggga tgggatcaag tcactggaac ctggccggaa gtcattctgt 2100
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tattacaatg ggaagctgga acctctgggc tcctaccggg cttgtgtggc tggcttcacc 2760
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ttcagtcgct actcagatgc tgtttccttg ccccaggatc caggtgtcat ctgtggcggt 2880
ggacaccacc atcatcacca tcaccaccat cactag 2916
<210> 45
<211> 1621
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Met Leu Ser His Gly Ala Gly Leu Ala Leu Trp Ile Thr Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Gln Thr Gly Leu Ala Glu Pro Glu Arg Cys Asn Phe Thr Leu Ala
20 25 30
Glu Ser Lys Ala Ser Ser His Ser Val Ser Ile Gln Trp Arg Ile Leu
35 40 45
Gly Ser Pro Cys Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Leu Gly
50 55 60
Ala Ala Leu Cys Pro Thr Phe Arg Ile Asp Asn Thr Thr Tyr Gly Cys
65 70 75 80
Asn Leu Gln Asp Leu Gln Ala Gly Thr Ile Tyr Asn Phe Arg Ile Ile
85 90 95
Ser Leu Asp Glu Glu Arg Thr Val Val Leu Gln Thr Asp Pro Leu Pro
100 105 110
Pro Ala Arg Phe Gly Val Ser Lys Glu Lys Thr Thr Ser Thr Ser Leu
115 120 125
His Val Trp Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Val Thr Ser Tyr Glu Val
130 135 140
Gln Leu Phe Asp Glu Asn Asn Gln Lys Ile Gln Gly Val Gln Ile Gln
145 150 155 160
Glu Ser Thr Ser Trp Asn Glu Tyr Thr Phe Phe Asn Leu Thr Ala Gly
165 170 175
Ser Lys Tyr Asn Ile Ala Ile Thr Ala Val Ser Gly Gly Lys Arg Ser
180 185 190
Phe Ser Val Tyr Thr Asn Gly Ser Thr Val Pro Ser Pro Val Lys Asp
195 200 205
Ile Gly Ile Ser Thr Lys Ala Asn Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser His
210 215 220
Gly Ser Gly Asn Val Glu Arg Tyr Arg Leu Met Leu Met Asp Lys Gly
225 230 235 240
Ile Leu Val His Gly Gly Val Val Asp Lys His Ala Thr Ser Tyr Ala
245 250 255
Phe His Gly Leu Thr Pro Gly Tyr Leu Tyr Asn Leu Thr Val Met Thr
260 265 270
Glu Ala Ala Gly Leu Gln Asn Tyr Arg Trp Lys Leu Val Arg Thr Ala
275 280 285
Pro Met Glu Val Ser Asn Leu Lys Val Thr Asn Asp Gly Ser Leu Thr
290 295 300
Ser Leu Lys Val Lys Trp Gln Arg Pro Pro Gly Asn Val Asp Ser Tyr
305 310 315 320
Asn Ile Thr Leu Ser His Lys Gly Thr Ile Lys Glu Ser Arg Val Leu
325 330 335
Ala Pro Trp Ile Thr Glu Thr His Phe Lys Glu Leu Val Pro Gly Arg
340 345 350
Leu Tyr Gln Val Thr Val Ser Cys Val Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gln
355 360 365
Lys Met Ala Val Gly Arg Thr Phe Pro Asp Lys Val Ala Asn Leu Glu
370 375 380
Ala Asn Asn Asn Gly Arg Met Arg Ser Leu Val Val Ser Trp Ser Pro
385 390 395 400
Pro Ala Gly Asp Trp Glu Gln Tyr Arg Ile Leu Leu Phe Asn Asp Ser
405 410 415
Val Val Leu Leu Asn Ile Thr Val Gly Lys Glu Glu Thr Gln Tyr Val
420 425 430
Met Asp Asp Thr Gly Leu Val Pro Gly Arg Gln Tyr Glu Val Glu Val
435 440 445
Ile Val Glu Ser Gly Asn Leu Lys Asn Ser Glu Arg Cys Gln Gly Arg
450 455 460
Thr Val Pro Leu Ala Val Leu Gln Leu Arg Val Lys His Ala Asn Glu
465 470 475 480
Thr Ser Leu Ser Ile Met Trp Gln Thr Pro Val Ala Glu Trp Glu Lys
485 490 495
Tyr Ile Ile Ser Leu Ala Asp Arg Asp Leu Leu Leu Ile His Lys Ser
500 505 510
Leu Ser Lys Asp Ala Lys Glu Phe Thr Phe Thr Asp Leu Val Pro Gly
515 520 525
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530 535 540
Ser Ser Ser Val Lys Gly Arg Thr Val Pro Ala Gln Val Thr Asp Leu
545 550 555 560
His Val Ala Asn Gln Gly Met Thr Ser Ser Leu Phe Thr Asn Trp Thr
565 570 575
Gln Ala Gln Gly Asp Val Glu Phe Tyr Gln Val Leu Leu Ile His Glu
580 585 590
Asn Val Val Ile Lys Asn Glu Ser Ile Ser Ser Glu Thr Ser Arg Tyr
595 600 605
Ser Phe His Ser Leu Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Ser Val Val Val Thr
610 615 620
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625 630 635 640
Thr Val Pro Ser Ser Val Ser Gly Val Thr Val Asn Asn Ser Gly Arg
645 650 655
Asn Asp Tyr Leu Ser Val Ser Trp Leu Leu Ala Pro Gly Asp Val Asp
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Asn Tyr Glu Val Thr Leu Ser His Asp Gly Lys Val Val Gln Ser Leu
675 680 685
Val Ile Ala Lys Ser Val Arg Glu Cys Ser Phe Ser Ser Leu Thr Pro
690 695 700
Gly Arg Leu Tyr Thr Val Thr Ile Thr Thr Arg Ser Gly Lys Tyr Glu
705 710 715 720
Asn His Ser Phe Ser Gln Glu Arg Thr Val Pro Asp Lys Val Gln Gly
725 730 735
Val Ser Val Ser Asn Ser Ala Arg Ser Asp Tyr Leu Arg Val Ser Trp
740 745 750
Val His Ala Thr Gly Asp Phe Asp His Tyr Glu Val Thr Ile Lys Asn
755 760 765
Lys Asn Asn Phe Ile Gln Thr Lys Ser Ile Pro Lys Ser Glu Asn Glu
770 775 780
Cys Val Phe Val Gln Leu Val Pro Gly Arg Leu Tyr Ser Val Thr Val
785 790 795 800
Thr Thr Lys Ser Gly Gln Tyr Glu Ala Asn Glu Gln Gly Asn Gly Arg
805 810 815
Thr Ile Pro Glu Pro Val Lys Asp Leu Thr Leu Arg Asn Arg Ser Thr
820 825 830
Glu Asp Leu His Val Thr Trp Ser Gly Ala Asn Gly Asp Val Asp Gln
835 840 845
Tyr Glu Ile Gln Leu Leu Phe Asn Asp Met Lys Val Phe Pro Pro Phe
850 855 860
His Leu Val Asn Thr Ala Thr Glu Tyr Arg Phe Thr Ser Leu Thr Pro
865 870 875 880
Gly Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Val Leu Thr Ile Ser Gly Asp Val Gln
885 890 895
Gln Ser Ala Phe Ile Glu Gly Phe Thr Val Pro Ser Ala Val Lys Asn
900 905 910
Ile His Ile Ser Pro Asn Gly Ala Thr Asp Ser Leu Thr Val Asn Trp
915 920 925
Thr Pro Gly Gly Gly Asp Val Asp Ser Tyr Thr Val Ser Ala Phe Arg
930 935 940
His Ser Gln Lys Val Asp Ser Gln Thr Ile Pro Lys His Val Phe Glu
945 950 955 960
His Thr Phe His Arg Leu Glu Ala Gly Glu Gln Tyr Gln Ile Met Ile
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980 985 990
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Glu Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Leu Thr Glu Asn Gly Ile Leu Leu
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Pro Ser Leu Met Ser Phe Ala Asp Ile Ala Asn Thr Ser Leu Ala
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Pro Gly Arg Ser Tyr Gln Phe Asn Val Lys Thr Val Ser Gly Asp
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Ser Trp Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Ile Phe Gly Ser Val Arg Thr
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Lys Pro Asp Lys Ile Gln Asn Leu His Cys Arg Pro Gln Asn Ser
1355 1360 1365
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Gly Tyr Ser Ile Glu Cys Arg Lys Met Asp Thr Gln Glu Val Glu
1385 1390 1395
Phe Ser Arg Lys Leu Glu Lys Glu Lys Ser Leu Leu Asn Ile Met
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Met Leu Val Pro His Lys Arg Tyr Leu Val Ser Ile Lys Val Gln
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Ser Ala Gly Met Thr Ser Glu Val Val Glu Asp Ser Thr Ile Thr
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Glu Lys Asp Val Leu Ile Ser Lys Ser Ser Ile Asn Phe Thr Val
1460 1465 1470
Asn Cys Ser Trp Phe Ser Asp Thr Asn Gly Ala Val Lys Tyr Phe
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Glu Gln Gln His Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Glu Tyr Arg His Asn
1505 1510 1515
Ala Ser Ile Arg Val Tyr Gln Thr Asn Tyr Phe Ala Ser Lys Cys
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Gly Ala Glu Met Glu Ser Leu Gly Gly Lys Cys Asp Pro Thr Gln
1550 1555 1560
Gln Lys Phe Cys Asp Gly Pro Leu Lys Pro His Thr Ala Tyr Arg
1565 1570 1575
Ile Ser Ile Arg Ala Phe Thr Gln Leu Phe Asp Glu Asp Leu Lys
1580 1585 1590
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Ile Thr Thr Glu Ser Glu Pro Leu Phe Gly Ala Ile Glu
1610 1615 1620
<210> 46
<211> 89
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Leu Ala Glu Pro Glu Arg Cys Asn Phe Thr Leu Ala Glu Ser Lys Ala
1 5 10 15
Ser Ser His Ser Val Ser Ile Gln Trp Arg Ile Leu Gly Ser Pro Cys
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Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Leu Gly Ala Ala Leu Cys
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Glu Arg Thr Val Val Leu Gln Thr Asp
85
<210> 47
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ala Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln His Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Gln Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<400> 49
000
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ala Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Gly
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Gln Asn Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Ile Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln His Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Gln Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 52
His His His His His His
1 5
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
10xHis tag
<400> 53
His His His His His His His His His His
1 5 10
Claims (114)
- SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 85% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 90% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 95% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 9에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 9인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 10에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 10인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 11에 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 11인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 12인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 29인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 30인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 31에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 31인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 32에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 32인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 화합물은 티로신 포스파타제를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 화합물은 VE-PTP를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 화합물은 Tie2를 활성화하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 화합물은 Akt를 활성화하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β의 세포외재성 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β의 세포외재성 도메인의 첫 번째 FN3 반복부에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, HPTP-β의 세포외재성 도메인에 대한 화합물의 결합 친화성 (KD)은 약 70 pM 내지 약 70 nM인 것을 특징으로 하는 화합물.
- SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 또는 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 또는 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 85% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 또는 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 90% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 또는 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 95% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 20에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 20인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 21에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 21인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 22에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 22인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 23인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 34인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 35인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 36에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 36인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 80% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 서열은 SEQ ID NO: 37인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 화합물은 티로신 포스파타제를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 화합물은 VE-PTP를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 화합물은 Tie2를 활성화하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 화합물은 Akt를 활성화하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β의 세포외재성 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β의 세포외재성 도메인의 첫 번째 FN3 반복부에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 29 항에 있어서, HPTP-β의 세포외재성 도메인에 대한 화합물의 결합 친화성 (KD)은 약 70 pM 내지 약 70 nM인 것을 특징으로 하는 화합물.
- a) SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄; 및
b) SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 화합물. - 제 57 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 85% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 85% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 57 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 90% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 90% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 57 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 95% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 95% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 57 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 30이고 경쇄는 SEQ ID NO: 34인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 57 항에 있어서, 화합물은 티로신 포스파타제를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 57 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 57 항에 있어서, 화합물은 VE-PTP를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 57 항에 있어서, 화합물은 Tie2를 활성화하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 57 항에 있어서, 화합물은 Akt를 활성화하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 57 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β의 세포외재성 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 57 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β의 세포외재성 도메인의 첫 번째 FN3 반복부에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 57 항에 있어서, HPTP-β의 세포외재성 도메인에 대한 화합물의 결합 친화성 (KD)은 약 70 pM 내지 약 70 nM인 것을 특징으로 하는 화합물.
- a) SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄; 및
b) SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 화합물. - 제 70 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 85% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 85% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 70 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 90% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 90% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 70 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 95% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 95% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 70 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 29이고 경쇄는 SEQ ID NO: 35인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 70 항에 있어서, 화합물은 티로신 포스파타제를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 70 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 70 항에 있어서, 화합물은 VE-PTP를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 70 항에 있어서, 화합물은 Tie2를 활성화하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 70 항에 있어서, 화합물은 Akt를 활성화하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 70 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β의 세포외재성 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 70 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β의 세포외재성 도메인의 첫 번째 FN3 반복부에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 70 항에 있어서, HPTP-β의 세포외재성 도메인에 대한 화합물의 결합 친화성 (KD)은 약 70 pM 내지 약 70 nM인 것을 특징으로 하는 화합물.
- a) SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 중쇄; 및
b) SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 화합물. - 제 83 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 85% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 85% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 83 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 90% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 90% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 83 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 95% 동일하고; 경쇄는 SEQ ID NO: 37에 대해 적어도 95% 동일한 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 83 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO: 30이고 경쇄는 SEQ ID NO: 37인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 83 항에 있어서, 화합물은 티로신 포스파타제를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 83 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 83 항에 있어서, 화합물은 VE-PTP를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 83 항에 있어서, 화합물은 Tie2를 활성화하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 83 항에 있어서, 화합물은 Akt를 활성화하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 83 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β의 세포외재성 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 83 항에 있어서, 화합물은 HPTP-β의 세포외재성 도메인의 첫 번째 FN3 반복부에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 83 항에 있어서, HPTP-β의 세포외재성 도메인에 대한 화합물의 결합 친화성 (KD)은 약 70 pM 내지 약 70 nM인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 필요로 하는 대상체에서 질병을 치료하는 방법으로서,
구체예 1 내지 95 중 어느 하나의 화합물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법. - 제 96 항에 있어서, 질병은 눈 질병인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 질병은 당뇨성 망막병증인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 질병은 신생혈관인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 질병은 혈관 누출인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 질병은 증가된 안압인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 질병은 눈의 부종인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 질병은 당뇨성 황반 부종인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 질병은 눈의 고혈압인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 질병은 눈의 염증인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 투여는 대상체의 눈에 대한 것인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 투여는 유리체내 투여인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 투여는 피하 투여인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 투여는 국소 투여인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 화합물의 치료적 유효량은 약 0.25 mg 내지 약 200 mg인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 화합물의 치료적 유효량은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 화합물의 치료적 유효량은 약 1 mg 내지 약 50 mg인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 96 항에 있어서, 화합물의 치료적 유효량은 약 50 mg 내지 약 200 mg인 것을 특징으로 하는 방법.
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