JP7107914B2 - VE-PTP(HPTP-β)を標的化するヒト化モノクローナル抗体 - Google Patents

VE-PTP(HPTP-β)を標的化するヒト化モノクローナル抗体 Download PDF

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Description

相互参照
この出願は、2016年7月20日に出願された米国仮出願第62/364,381号、および2016年8月19日に出願された米国仮出願第62/377,072号(これらの各々は、その全体が参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
非ヒト生物から生成されたモノクローナル抗体は、ヒトに投与されると、免疫応答を引き起こす可能性がある。これらの非ヒトモノクローナル抗体のセグメントは、標的特異性を保存しながら薬物免疫原性の可能性を低減させるために、ヒト化プロセスを介してヒト化配列と置き換えることができる。
参照による組み込み
本出願において引用される各々の特許、刊行物、および非特許文献は、各々が個々に参照により組み込まれたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本発明は、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12と少なくとも80%同一である配列を含む化合物を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、配列番号20、配列番号21、配列番号22、または配列番号23と少なくとも80%同一である配列を含む化合物を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、a)配列番号30と少なくとも80%同一である配列を含む重鎖と、b)配列番号34と少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、a)配列番号29と少なくとも80%同一である配列を含む重鎖と、b)配列番号35と少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、a)配列番号30と少なくとも80%同一である配列を含む重鎖と、b)配列番号37と少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物を提供する。
図1は、ネズミV配列(切断VH0;配列番号47)と、4つのヒト化バリアントの配列番号9(VH1)、配列番号10(VH2)、配列番号11(VH3)および配列番号12(VH4)との配列アラインメントを示す。
図2は、ネズミV配列(切断VL0;配列番号48)と、4つのヒト化Vバリアントの配列番号20(VL1)、配列番号21(VL2)、配列番号22(VL3)および配列番号23(VL4)との配列アラインメントを示す。
図3は、HPTP-β細胞外ドメイン(ヒトVE-PTP/HPTP-β ECD)に対するモノクローナル抗体を生成するために使用されるハイブリドーマ技術をまとめている。
図4は、ヒト内皮細胞において内因性ヒトVE-PTP(HPTP-β)に結合したR15E6の免疫沈降ウェスタンブロット(左パネル)およびフローサイトメトリー結果(右パネル)を示す。
図5は、ウェスタンブロットによる、組換え、6-Hisタグ付きヒトVE-PTP(HPTP-β)、カニクイザルPTP-β、およびヒトPTP-η細胞外ドメインタンパク質に対するR15E6の結合特異性を示す。
図6は、Tie2の濃度依存性リン酸化のウェスタンブロット(パネルA)および定量化(パネルB)およびR15E6による増強した内皮細胞生存度(パネルC)を示す。
図7は、ウェスタンブロットによって決定した、マウス内皮細胞におけるTie2(左上パネル)、マウスVE-PTP発現(左下パネル)、およびAkt(右パネル)に対する、ラット抗マウスVE-PTPモノクローナル抗体109.1の効果を示す。
図8は、マウス内皮細胞における1時間のインキュベーション(パネルA)および3分のインキュベーション(パネルB)後の、マウスVE-PTP ECDに対するポリクローナル抗体によるTie2活性化を示す。
図9は、マウスVE-PTP ECDポリクローナル抗体によるトロンビンおよびVEGFにより誘導された内皮細胞透過性のin vitroでの阻害を示す。
図10は、モノクローナル抗体109.1(パネルA)およびマウスVE-PTP ECDポリクローナル抗体(PTP1-8)(パネルB)の静脈内投与による、VEGFにより誘導された皮膚血管透過性のin vivoでの阻害、ならびに対照IgG(-)または抗VE-PTP抗体を注射したマウス(+)の肺溶解物からのTie2の免疫沈降(パネルC)を示す。
図11は、抗マウスVE-PTPモノクローナル抗体109.1の眼内投与後の網膜新血管形成(パネルAおよびB)および脈絡膜新血管形成(パネルC)に対する効果を示す。
図12は、抗マウスVE-PTPモノクローナル抗体109.1の眼内投与後の網膜新血管形成(パネルAおよびB)および脈絡膜新血管形成(パネルC)の平均面積の定量化を示す。
図13は、R15E6の抗ヒトVE-PTP(抗HPTP-β)ヒト化バリアントの還元(パネルA)および非還元(パネルB)SDS-PAGEを示す。
図14は、R15E6およびHC0LC0のHC1バリアントの、HPTP-βへの結合を示す。
図15は、R15E6およびHC0LC0のHC2バリアントの、HPTP-βへの結合を示す。
図16は、R15E6およびHC0LC0のHC3バリアントの、HPTP-βへの結合を示す。
図17は、R15E6およびHC0LC0のHC4バリアントの、HPTP-βへの結合を示す。
図18は、ウェスタンブロットによって決定した、種々のヒト化抗体による、Ang1の非存在下でのTie2リン酸化(左パネル)およびAkt活性化(右パネル)を示す。
図19は、ウェスタンブロットによって決定した、HC2LC4およびHC2LC1による、リガンドの非存在下での濃度依存性Tie2活性化(上パネル)およびAkt活性化(下パネル)を示す。
図20は、ウェスタンブロットによって決定した、HC2LC4およびHC2LC1による、Ang1およびAng2の存在下でのTie2リン酸化(左パネル)およびAkt活性化(右パネル)を示す。
図21は、ウェスタンブロットによって決定した、HC2LC1およびHC2LC4による、Ang1および/またはAng2の存在下でのTie2リン酸化(パネルA)、ヒトVE-PTP(HPTP-β)発現(パネルB)、およびAkt活性化(パネルC)を示す。
図22は、ウェスタンブロットによって決定した、単独での、および過剰の組換えヒトVE-PTP細胞外ドメインタンパク質(βECD 6HisまたはβECD Fc)と共のHC2LC1によるAkt活性化を示す。
図23は、非経口抗体(R15E6)およびマウスIgG1対照と比較した、HC2LC1およびHC0LC0による内皮細胞生存度の向上を示す。
図24は、マウスモデルにおける網膜剥離の処置のための抗マウスVE-PTP抗体/アフリベルセプト併用療法の有効性の向上を示す。
図25は、モノクローナル抗体109.1の皮下投与が、ビヒクルと比較してマウスにおける虚血性新血管形成を低減させたことを示す。
本開示は、例えば、血管不安定性、血管新生、新血管形成、血管漏出、および浮腫によって特徴付けられる眼障害を処置するための、血管内皮プロテインチロシンホスファターゼ(VE-PTPまたはVEPTP)またはヒトプロテインチロシンホスファターゼ-ベータ(HPTP-β)を標的化するための組成物および方法を提供する。本明細書に開示される組成物は、Tie2タンパク質のリン酸化などのタンパク質リン酸化を促進することによって、Tie2シグナル伝達を活性化することができる。
VE-PTPは、プロテインチロシンホスファターゼ(PTPase)の受容体様ファミリーのメンバーである。VE-PTPは、細胞接着分子との構造的および機能的類似性を示す、主に血管内皮細胞において見出される膜貫通タンパク質である。VE-PTPは、例えば、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、イヌ、マウス、マーモセット、サル、およびヒトを含む種々の種において見出される。VE-PTPのヒトオルソログはHPTP-βである。
Tie2(免疫グロブリンおよび上皮増殖因子相同ドメイン2を有するチロシンキナーゼ)は、発生の全体にわたって主に血管内皮細胞において発現される膜受容体チロシンキナーゼである。Tie2リン酸化の主要な調節因子は、アンジオポエチン1(Ang1)およびアンジオポエチン2(Ang2)である。Ang1はTie2のアゴニストであり、Ang1のTie2への結合は受容体リン酸化を促進する。Ang2は、Tie2の状況依存的なアンタゴニストまたはアゴニストにおいて作用する。Ang1のTie2への結合は、内因性Tie2受容体リン酸化のレベルを増加させ、高度に組織化された血管新生による血管安定化、内皮細胞間結合の締め付け(tightening)(内皮細胞近接)、内皮生存能の増強、内皮炎症の低減および内皮機能の改善を誘導するように下流シグナル伝達を開始する。血管新生の間、Ang2はAng1-Tie2シグナル伝達の負の調節因子として作用する。
生理的条件下では、Tie2リン酸化の持続時間は、Tie2受容体からホスフェートを除去するVE-PTP(HPTP-β)によって調節される。VE-PTP(HPTP-β)を阻害することによって、Tie2リン酸化のレベルが実質的に増加し、血管安定性を回復させる。VE-PTP(HPTP-β)阻害剤、例えば、VE-PTP(HPTP-β)に結合する抗体は、VE-PTP(HPTP-β)を阻害することによってTie2下流シグナル伝達を活性化することができる。阻害剤によるVE-PTP(HPTP-β)の阻害は、本明細書に記載される眼障害を有する被験体における血管安定性をもたらすことができる。
本開示のVE-PTP(HPTP-β)阻害剤は、ヒトVE-PTP(HPTP-β)の細胞外ドメイン(配列番号45)に対して免疫反応性であり、ヒトVE-PTP(HPTP-β)の第1のFN3リピート(配列番号46)に対して免疫反応性である、ハイブリドーマ細胞株ATCC No.PTA-7580によって産生されるネズミモノクローナル抗体R15E6を含むことができる。VE-PTP(HPTP-β)阻害剤は、R15E6と同じまたは実質的に同じ生物学的特性を有する抗体、R15E6の抗体断片を含むことができ、断片は、重鎖および軽鎖可変領域のうちの一方または両方、R15E6のF(ab’)2、Fab、Fv、scFvの二量体または三量体、ならびにR15E6に由来するダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、またはテトラボディ(tetrabody)を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物の断片は本明細書に記載される任意の生物活性についてアッセイされ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物の断片は、Tie2を活性化することができるか、または等効力(equipotent)のレベル、増加したレベル、もしくは減少したレベルにて対応するインタクトな抗体の生物活性を提供することができる。
Figure 0007107914000001
Figure 0007107914000002
本開示のVE-PTP(HPTP-β)阻害剤は、単独で、または他のアミノ酸配列と組み合わせて抗体、またはその抗体断片、バリアント、もしくは誘導体を含むことができる。阻害剤は、修飾、例えば、酵素的開裂、および翻訳後修飾を受けてもよい。
本開示のVE-PTP(HPTP-β)阻害剤は、VE-PTP(HPTP-β)のドミナントネガティブアイソフォームに結合することができる。一部の実施形態では、このドミナントネガティブアイソフォームは、内因性VE-PTP(HPTP-β)と競合し得るホスファターゼ活性が欠損しているVE-PTP(HPTP-β)の形態に対応することができる。ドミナントネガティブVE-PTP(HPTP-β)の機能評価は、導入遺伝子の送達およびTie2リン酸化に対する効果の決定により行うことができる。
本開示のVE-PTP(HPTP-β)阻害剤は、複数のVE-PTP(HPTP-β)結合部位を含むことができる。一部の実施形態では、VE-PTP(HPTP-β)阻害剤は、2つのVE-PTP(HPTP-β)分子に同時に結合することができ、それによって2つのVE-PTP(HPTP-β)分子を近接させる。VE-PTP(HPTP-β)阻害剤は、3つのVE-PTP(HPTP-β)分子に同時に結合することができ、それによって3つのVE-PTP(HPTP-β)分子を近接させる。
本開示のVE-PTP(HPTP-β)阻害剤は、別の部分またはビヒクルに共有結合または非共有結合によってコンジュゲートされ得る。部分またはビヒクルは、例えば、阻害剤の分解を阻害し、半減期を増加させ、吸収を増加させ、毒性を低減させ、免疫原性を低減させ、および/または生物活性を増加させることができる。部分の非限定的な例には、免疫グロブリンのFcドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリリシン、およびデキストランなどのポリマー、脂質、ステロイドなどのコレステロール基、炭水化物、デンドリマー、オリゴ糖、ならびにペプチドが含まれる。
本発明の化合物は、Tie2活性を回復させるためにVE-PTP(HPTP-β)を標的化し、例えば、Akt/PI3-Kシグナル伝達、Rac1シグナル伝達、MAPK/Rasシグナル伝達を含む、下流のシグナル伝達カスケードを開始するために使用され得る。一部の実施形態では、本発明の化合物はNF-κBシグナル伝達を阻害することができる。Tie2の活性化は血管安定化をもたらすことができ、これは、例えば、網膜症、糖尿病性網膜症、網膜灌流、眼新血管形成、眼血管漏出、眼の浮腫、眼内圧、高眼圧症、眼の炎症、緑内障、および眼出血を含む、糖尿病関連状態および眼の状態の処置に有益であり得る。化合物はまた、例えば、創傷治癒、不安定な血流、心臓線維症、勃起不全、心筋症、虚血性傷害、心臓肥大、間質性線維症、腎症、アルブミン尿症、糸球体硬化症、腎線維症、神経障害、およびニューロン炎症を含む、末梢動脈疾患の処置に有効であり得る。
抗体
抗体は、2つの同一の重鎖(H)ポリペプチド配列および2つの同一の軽鎖(L)ポリペプチド配列からなる。重鎖の各々は、1つのN末端可変(V)領域および3つのC末端定常(C1、C2、およびC3)領域を含む。軽鎖の各々は、1つのN末端可変(V)領域および1つのC末端定常(C)領域を含む。軽鎖可変領域は重鎖可変領域と整列し、軽鎖定常領域は重鎖定常領域CH1と整列する。重鎖可変領域および軽鎖可変領域の対合は単一の抗原結合部位を一緒に形成する。各軽鎖は、1つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結される。2つの重鎖は、重鎖アイソタイプに応じて、1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋を含む。
任意の脊椎動物種由来の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパまたはラムダと指定することができる。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、5つのクラスの免疫グロブリン(IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM)に分類され得、各々は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと指定される重鎖を有する。アルファおよびガンマのクラスは、重鎖定常領域の配列および機能の差に基づいてサブクラスにさらに分けられる。ヒトによって発現されるIgAおよびIgGのサブクラスには、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2が含まれる。
可変(V)領域は、抗体間で配列が広範囲に異なり得るセグメントを含む。可変領域は抗原結合を媒介し、その抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は可変領域の範囲にわたって均一に分布していない。代わりに、可変領域は、各々9~12アミノ酸長である超可変領域と呼ばれる極度の可変性のより短い領域によって分離された15~30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域の各々は、主にf3シート構成を取り、3つの超可変領域によって接続される4つのフレームワーク領域を含み、これらは、f3シート構造を接続するループ、および一部の場合、f3シート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖における超可変領域はフレームワーク領域によって近接して一緒に保持され、他方の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害(ADCC)における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
超可変領域は、相補性決定領域(CDR)由来のアミノ酸残基、例えば、軽鎖可変領域ではおよそ24~34(L1)、50~56(L2)、および89~97(L3)の残基、重鎖可変領域ではおよそ1~35(H1)、50~65(H2)、および95~102(H3)の残基、ならびに/または超可変ループ由来の残基を含むことができる。
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得ることができ、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在する可能性がある起こり得る天然に存在し得る変異を除いて同一である。異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は単一のエピトープに対する。特異性に加えて、モノクローナル抗体は、各々が他の抗体によって汚染されずに合成され得るという点で有益である。
本明細書に使用されるモノクローナル抗体は、例えば、キメラ抗体であって、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、一方で、鎖の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である、キメラ抗体、ならびにそのような抗体の抗原結合性断片であってもよい。
抗体断片は、多量体抗体の一部、例えば、インタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含むことができる。抗体断片の非限定的な例には、Fab、Fab’、F(ab’)、Fabコンジュゲートの二量体、および三量体、Fv、scFv、ミニボディ(minibody)、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、ならびに線状抗体が含まれる。
エピトープの非限定的な例には、アミノ酸、糖、脂質、ホスホリル、およびスルホニル基が含まれる。エピトープは、特定の三次元構造特性および/または特定の電荷特性を有することができる。エピトープは、コンフォメーション性であってもよいか、または線状であってもよい。
ヒト化モノクローナル抗体
VE-PTPを標的化する適切な抗体は様々な技術を使用して同定することができる。例えば、候補薬剤は、VE-PTPへの結合についてスクリーニングされてもよい。VE-PTPに結合する薬剤は、活性、例えば、Tie2のVE-PTP媒介性脱リン酸化の阻害についてスクリーニングされてもよい。一部の実施形態では、候補薬剤は、最初に活性についてin vivoでスクリーニングされる。
特定の阻害剤の同定に使用するために適したアッセイの選択は、スクリーニングされる候補薬剤の性質に依存する。例えば、候補がFc部分を含む抗体またはペプチボディ(peptibody)である場合、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析により、候補薬剤を、VE-PTPを発現する細胞に結合する能力に基づいて選択することが可能となる。細胞は内因的にVE-PTPを発現することができるか、またはVE-PTPを発現するように遺伝子操作されてもよい。アプタマーなどの他の候補薬剤について、他の技術が利用されてもよい。例えば、VE-PTPに特異的に結合するアプタマーは、in vitro選択の反復ラウンドを介して特定のアプタマーを選択する、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(SELEX)を使用して選択することができる。
VE-PTP阻害剤は、VE-PTP媒介性活性、例えば、Tie2脱リン酸化の阻害についてスクリーニングされてもよい。ウェスタンブロッティングに基づく1つの適切なアッセイにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)が、種々の濃度の候補薬剤の存在下または非存在下にて無血清培地中で培養され、細胞の溶解物が調製され、Tie2抗体により免疫沈降され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離され、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に移される。次いで膜結合免疫沈降タンパク質を、Tie2リン酸化を定量化するために抗ホスホチロシン抗体により、その後全Tie2を定量化するためにTie2抗体により連続的にウェスタンブロットする。Tie2リン酸化は、全Tie2シグナルに対する抗ホスホチロシンシグナルの比として表される。抗ホスホチロシンシグナルのレベルが大きいほど、候補薬剤によるVE-PTP阻害が大きくなることが示される。
ハイブリドーマ技術は、特定の抗原を標的化する多数のモノクローナル抗体を産生するための方法である。ハイブリドーマの発生は、マウス(ネズミ)またはウサギなどの哺乳動物宿主に、免疫応答を誘発する抗原を注射することによって開始する。抗原に応答して、宿主におけるBリンパ球(B細胞)は抗原に結合する抗体を産生する。次いでB細胞は宿主から採取され、ハイブリドーマとして公知のハイブリッド細胞株を産生するために不死のB細胞がん細胞(骨髄腫細胞)と融合される。ハイブリドーマは、B細胞の抗体産生能力ならびに骨髄腫の増大した寿命および再現性の両方を保持する。ハイブリドーマは、遺伝的に同一のハイブリドーマからなる新たな培養物を産生するために1つの生存ハイブリドーマ細胞で開始する培養物中で増殖することができ、次に培養物につき1つの抗体(モノクローナル)または異なる抗体の混合物(ポリクローナル)を産生する。このプロセスに使用される骨髄腫細胞株は、組織培養物中で増殖する能力および抗体を合成することができないことのために選択される。培養後、一次スクリーニングプロセスが、最も高い特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを同定し、選択するために実施される。抗体スクリーニング技術の非限定的な例には、ELISAおよび免疫細胞化学的スクリーニングが含まれる。次いでスクリーニングから同定されたリードのハイブリドーマが、反応性、結合親和性、特異性、および交差反応性について特徴付けられ得る。
一部の実施形態では、本開示の化合物のHPTP-βに対する結合親和性(K)は、約70pM~約70nM、1nM~約70nM、または少なくとも約1nMと同程度の強さである。一部の実施形態では、本開示の化合物のHPTP-βに対する結合親和性(K)は約4nM~約70nMである。
他の組換え抗体操作技術は哺乳動物以外のウイルスまたは酵母の使用を含む。これらの技術は、所望の特異性を有する抗体が選択され得るわずかに異なるアミノ酸配列を有する抗体ライブラリーを作製するために免疫グロブリン遺伝子セグメントの迅速クローニングに依存する。抗体ライブラリーは、標的抗原に対する特異性、種々の環境条件における安定性、治療有効性、および診断適用における検出可能性を増強するために使用され得る。
ヒト投与に関して、非ヒト種から生成されたモノクローナル抗体は、標的特異性を保存しながら免疫原性の可能性を低減させるためにヒト化プロセスによってさらに最適化され得る。ヒト化プロセスは、単離された抗体を産生する遺伝子の遺伝子配列へのヒトDNAの組み込みを含む。次いで組換えDNAはクローニングされ、新たにヒト化された抗体の大規模産生のために細胞内で発現される。
ヒト化抗体の例は修飾キメラ抗体である。キメラ抗体は上記のように生成される。キメラ抗体はさらに、可変領域内の非ヒト配列を相同ヒト配列と置換するためにCDRの外側で変異される。ヒト化抗体の別の例は、非ヒトCDR配列が、対応するヒトCDR配列を置き換えるためにヒト抗体足場のヒト重鎖および軽鎖可変配列内に導入される、CDR移植抗体である。
ヒト化抗体は、哺乳動物細胞、バイオリアクター、またはマウス、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびマーモセットなどのトランスジェニック動物において産生され得る。トランスジェニック動物は、動物のゲノム内に挿入されたヒト抗体産生ゲノムの実質的な部分を有することができる。
完全ヒトモノクローナル抗体は、その抗原結合残基が、選択を受けるヒト免疫グロブリン配列またはその断片に完全に由来する抗体に相当する。一部の実施形態では、この選択は、一連の可変抗体ドメインが、糸状ファージコートタンパク質上で発現され、標的抗原への結合について濃縮されるファージディスプレイ技術を使用して行うことができる。一部の実施形態では、この選択は、トランスジェニック動物、例えば、マウス、ラット、またはウサギを使用して行うことができ、内因性免疫グロブリン遺伝子の全セットが、ヒト免疫グロブリン遺伝子の全セットと置き換えられる。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子の全セットは動物のゲノム内に導入され得、内因性抗体産生は、抗体の産生を不十分にする。
VE-PTP(HPTP-β)を標的化するヒト化モノクローナル抗体
本明細書に記載されるVE-PTP(HPTP-β)を標的化するネズミモノクローナル抗体のヒト化プロセスは、抗体構造と合わせたCDR移植技術と成熟ヒトIgG配列のデータベースの組み合わせを利用する。ヒトフレームワーク配列は、CDR配列のためのアクセプターフレームワークとして使用された。これらのアクセプター配列は全て、ヒト供給源由来の成熟ヒトIgGに由来し、ファージディスプレイに由来しなかった。
4つのヒト化バリアントが、ヒトVE-PTP(HPTP-β)の組換え細胞外ドメインに対して惹起されたネズミモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインのために設計された。設計は、相同性、T細胞エピトープ、重要な残基、および予測される構造を含む要因に基づいた。
本明細書に開示される配列はIMGTおよびKabatからの抗体番号付けシステムを使用して同定された。これらの2つの番号付けシステムは、ネズミ抗体の異なる残基をCDRに属するものと同定し、組み合わせたIMGT/Kabat CDR配列を、CDRループコンフォメーションの最適な保持のために使用した。
重鎖配列
配列番号1は、ヒトVE-PTP(HPTP-β)を標的化するネズミモノクローナル抗体R15E6(VH0)のVドメインであり、ネズミシグナルペプチド配列(下線)を含む。配列番号47は、ネズミシグナルペプチド配列を含まないR15E6のVドメインの切断配列である。配列番号2は、R15E6のネズミVドメインに最も近いヒト生殖系列遺伝子V領域である、Homo sapiens IGHV3-73である。配列番号3および配列番号4は、それぞれHomo sapiens IGHV3-72およびHomo sapiens IGHV3-48であり、配列番号2と類似するさらなる生殖系列V領域である。配列番号1~4のペプチド配列は表1に示される。
Figure 0007107914000003
ヒトIgG配列のオンラインデータベースを、BLAST検索アルゴリズムを使用してネズミVドメインとの比較のために検索し、候補ヒト可変ドメインを上位200のBLAST結果から選択した。同等のヒト可変ドメインを、フレームワーク相同性の組み合わせに基づいて4つの候補に減らし、フレームワーク残基および標準ループ構造を維持した。表2は、4つの選択されたアクセプターフレームワークである、配列番号5~8を列挙する。配列番号5はAEX29600であり、配列番号6はAAC51024であり、配列番号7はAEX29289であり、配列番号8はABA26204である。
Figure 0007107914000004
ネズミVのCDRをアクセプターフレームワーク(配列番号5~8)に移植すると、これらの配列を表3に示されるヒト化バリアントに変換した。配列番号9はVH1であり、配列番号10はVH2であり、配列番号11はVH3であり、配列番号12はVH4である。
Figure 0007107914000005
図1は、4つのヒト化バリアントである、配列番号9(VH1)、配列番号10(VH2)、配列番号11(VH3)、および配列番号12(VH4)とのネズミV配列(切断VH0;配列番号47)の配列アラインメントを示す。V/V界面に重要な残基および標準ループ構造は保存された。
ネズミVとのヒト化バリアントの相同パーセントは表4に示される。ヒト化バリアントの相同性のランク付けは、VH2>VH1>VH3>VH4である。
Figure 0007107914000006
軽鎖配列
以下の表5において、配列番号13は、ネズミシグナルペプチド配列(下線)を含む、R15E6のネズミVドメイン(VL0)である。配列番号48は、ネズミシグナルペプチド配列を有さないR15E6のVドメインの切断配列である。配列番号14は、R15E6のネズミVドメインに最も近いヒト生殖系列遺伝子V領域である、Homo sapiens IGKV1-16である。配列番号15はIGKV4-1であり、IGKV1-16と非常に類似している。
Figure 0007107914000007
ヒトIgK配列のオンラインデータベースを、BLAST検索アルゴリズムを使用してネズミVLドメインとの比較のために検索し、候補ヒト可変ドメインを上位200のBLAST結果から選択した。これらの同等のヒト可変ドメインを、フレームワーク相同性の組み合わせに基づいて4つの候補に減らし、フレームワーク残基および標準ループ構造を維持した。表6は、4つの選択されたアクセプターフレームワークを列挙する。配列番号16はAF234256_1であり、配列番号17はAAD03722であり、配列番号18はAAY33352であり、配列番号19はAAZ09113である。
Figure 0007107914000008
ネズミVのCDRをこれらのアクセプターフレームワークに移植すると、これらの配列を表7に示されるヒト化バリアントに変換した。配列番号20はVL1であり、配列番号21はVL2であり、配列番号22はVL3であり、配列番号23はVL4である。
Figure 0007107914000009
図2は、4つのヒト化Vバリアントである、配列番号20(VL1)、配列番号21(VL2)、配列番号22(VL3)、および配列番号23(VL4)とのネズミV配列(切断VL0;配列番号48)の配列アラインメントを示す。V/V界面に重要な残基および標準ループ構造は保存された。
ネズミVとのヒト化バリアントの相同パーセントは表8に示される。ヒト化バリアントの相同性のランク付けは、VL3>VL1>VL2>VL4である。
Figure 0007107914000010
ヒト化抗体の設計:4つのVおよび4つのV鎖の組み合わせ
マウス可変鎖を、インタクトな抗体タンパク質の発現のためのIgG4重鎖の文脈において上記したようにネズミCDR配列を適切なヒト抗体ドナー配列に移植することによってヒト化した。次いで全長ヒト化抗体のパネルを、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株における発現のためにコドン最適化した。異なるヒトドナー配列を使用して各可変鎖のために設計した4つのバリアントは、発現のための16個のヒト抗体のマトリクスを産生し、その重鎖および軽鎖の対合を表9に示す。ヒトIgG4定常ドメインに移植した完全マウス可変ドメイン(VH0-L0)を有するキメラバリアントを、結合および機能アッセイにおける陽性対照として作製した。
Figure 0007107914000011
T細胞エピトープスクリーニング
重鎖。
MHCクラスII分子の溝におけるペプチド配列の提示は、CD8+T細胞の活性化および免疫原性応答をもたらす。この応答を低減させるために、治療用タンパク質は、MHCクラスII分子への結合の親和性を低減することによって、T細胞を活性化し得るT細胞エピトープの組み込みを回避するように設計され得る。
ネズミ抗体VおよびVならびにヒト化バリアント配列を、ヒト化プロセスが、in silicoアルゴリズムを使用して高親和性を有するペプチド配列を取り出したことを決定するために、MHC II結合ペプチドについてスクリーニングした。表10はスクリーニングの結果を示し、太字は高親和性T細胞エピトープコアである(IC50<50nM)。ヒト生殖系列配列ICHV3-73、ICHV3-72、およびICHV3-48もまた、比較のために分析した。生殖系列配列に存在し、ヒト化バリアントにおいて一致する任意の潜在的T細胞エピトープをイタリック体で示す。CDRには下線が引かれている。
Figure 0007107914000012
軽鎖配列
表11はスクリーニングの結果を示し、太字は高親和性T細胞エピトープコアである(IC50<50nM)。ヒト生殖系列配列IGKV1-16およびIGKV4-1もまた、比較のために分析し、生殖系列配列に存在し、ヒト化バリアントにおいて一致する任意の潜在的T細胞エピトープをイタリック体で示す。CDRには下線が引かれている。
Figure 0007107914000013
ネズミVL0は、軽鎖のCDR3/フレームワーク4領域内にT細胞エピトープを含有し、これはヒト化バリアントのうちの3つには存在しない。
翻訳後修飾
Fvグリコシル化。
N-結合型グリコシル化モチーフはNXS/Tであり、ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸である。このモチーフはR15E6 VまたはVのネズミまたはヒト化バリアントには存在しなかった。
脱アミド。
アミノ酸モチーフSNG、ENN、LNG、およびLNNは、アスパラギン酸を生じるようにアスパラギンの脱アミドを行う傾向があり得る。これらの4つのモチーフのいずれも、R15E6VまたはVのネズミまたはヒト化バリアントには存在しなかった。
シグナルペプチド。
ネズミ抗体シグナルペプチドは、CHO細胞において、より高いレベルの発現を生じ得る。以下のシグナルペプチドがヒト化バリアントに組み込まれ得る。
重鎖シグナルペプチド(配列番号24):MGWTLVFLFLLSVTAGVHS
軽鎖シグナルペプチド(配列番号25):MVSSAQFLGLLLLCFQGTRC
ドメインの各々は、安定化S228P変異を有する、ヒトIgG4アイソタイプ定常ドメイン配列とインフレームで合成され得る。重鎖配列全体をコドン最適化することができ、DNA配列を検証することができる。S228P変異を有するIgG4定常ドメインのアミノ酸配列(配列番号26)は以下の通りである:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
ドメインの各々は、ヒトIgKアイソタイプ定常ドメイン配列とインフレームで合成され得る。次いで軽鎖配列全体をコドン最適化することができ、DNA配列を検証することができる。IgK定常ドメインのアミノ酸配列(配列番号27)は以下の通りである:
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
バリアント鎖の各々は、DNA配列決定分析によって検証することができる。次いでヒト化抗体の各々の一過性トランスフェクションおよび発現を追跡することができる。1つのキメラ抗体は、陽性対照として使用するために発現することができ、ネズミ可変ドメイン、ヒトIg定常ドメインを有することができる。16個のヒト化バリアントは、ヒト化可変ドメインおよびヒトIg定常ドメインのみを有する。表12は、ヒト化可変ドメインおよびヒトIg定常ドメインを有する16個のヒト化バリアントを生じる重鎖および軽鎖の対合を示す。
Figure 0007107914000014
表13および表14は、各ヒト化重鎖および軽鎖の完全アミノ酸配列を列挙する。
Figure 0007107914000015
Figure 0007107914000016
Figure 0007107914000017
標的配列は、本明細書に提供されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約80%の相同性、少なくとも約81%の相同性、少なくとも約82%の相同性、少なくとも約83%の相同性、少なくとも約84%の相同性、少なくとも約85%の相同性、少なくとも約86%の相同性、少なくとも約87%の相同性、少なくとも約88%の相同性、少なくとも約89%の相同性、少なくとも約90%の相同性、少なくとも約91%の相同性、少なくとも約92%の相同性、少なくとも約93%の相同性、少なくとも約94%の相同性、少なくとも約95%の相同性、少なくとも約96%の相同性、少なくとも約97%の相同性、少なくとも約98%の相同性、少なくとも約99%の相同性、少なくとも約99.1%の相同性、少なくとも約99.2%の相同性、少なくとも約99.3%の相同性、少なくとも約99.4%の相同性、少なくとも約99.5%の相同性、少なくとも約99.6%の相同性、少なくとも約99.7%の相同性、少なくとも約99.8%の相同性、少なくとも約99.9%の相同性、少なくとも約99.91%の相同性、少なくとも約99.92%の相同性、少なくとも約99.93%の相同性、少なくとも約99.94%の相同性、少なくとも約99.95%の相同性、少なくとも約99.96%の相同性、少なくとも約99.97%の相同性、少なくとも約99.98%の相同性、または少なくとも約99.99%の相同性を有することができる。
NCBI BLAST、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline、または別の適切な方法もしくはアルゴリズムなどの、種々の方法およびソフトウェアプログラムが、2つまたはそれよりも多いペプチドまたは核酸の間の相同性を決定するために使用され得る。
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載される任意の医薬化合物と、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、および/または賦形剤などの他の化学成分との組み合わせであってもよい。医薬組成物は化合物の生物への投与を容易にする。医薬組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、経口、非経口、眼科、および局所投与を含む種々の形態および経路によって、医薬組成物として治療有効量で投与され得る。
医薬組成物は、例えば、局所、経口、全身、硝子体内、腔内(intracameral)、結膜下、テノン嚢下、眼球後方、眼内、後強膜近傍(posterior juxtascleral)、眼周囲、網膜下、および脈絡膜上投与を含む任意の適切な形態または経路を介して眼に投与され得る。組成物は、前眼房、後眼房、硝子体腔(硝子体内)、網膜固有(retina proper)、および/または網膜下腔を含む眼の任意の部分に製剤を注射することによって投与され得る。組成物は非侵襲的方法によって送達され得る。製剤を投与する非侵襲的様式は無針注射デバイスを使用することを含んでもよい。複数の投与経路が医薬組成物の効率的な送達のために利用され得る。
医薬組成物は、例えば、血管内皮細胞などの内皮細胞、網膜色素上皮(retinal pigment epilthelium)(RPE)などの網膜の細胞、角膜細胞、線維芽細胞、星状細胞、グリア細胞、周皮細胞、虹彩上皮細胞、神経起源の細胞、毛様体上皮細胞、ミュラー細胞、外直筋の細胞などの眼を囲み、眼に付着した筋細胞、眼窩脂肪細胞、強膜および上強膜の細胞、小柱網の細胞、ならびに結合組織細胞を含む任意の適切な眼細胞を標的化することができる。
医薬組成物は、局所的に、例えば、器官への直接の化合物の注射を介して、任意選択でデポーもしくは持続放出製剤またはインプラントで投与され得る。医薬組成物は、急速放出製剤の形態、延長放出製剤の形態、または中間放出製剤の形態で提供され得る。急速放出形態は即時放出を提供することができる。延長放出製剤は制御放出または持続遅延放出を提供することができる。
投与のための医薬製剤は水溶性形態で活性化合物の水溶液を含むことができる。活性化合物の懸濁物は油性注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。水性注射懸濁物は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁物の粘度を増加させる物質を含有することができる。懸濁物はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、適切な安定剤または化合物の溶解度を増加させる薬剤を含有することができる。あるいは、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質を含まない水を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
本明細書に提供される処置または使用方法を実行する際に、本明細書に記載される化合物の治療有効量が、医薬組成物中で、処置される疾患または状態を有する被験体に投与される。一部の実施形態では、被験体はヒトなどの哺乳動物である。治療有効量は、疾患の重症度、被験体の年齢および関連する健康、使用される化合物の効力、および他の要因に依存して広範に変化し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物は、単独でまたは混合物の成分として1つもしくは複数の治療剤と組み合わせて使用され得る。例えば、本開示のVE-PTP(HPTP-β)阻害剤は、抗体、例えば、抗VEGF剤と共製剤化(co-formulate)または共投与(co-administer)され得る。抗VEGF剤は、化合物、抗体、またはその抗体断片、バリアント、もしくは誘導体であってもよい。抗VEGF剤の非限定的な例には、ベバシズマブ(Avastin(登録商標))、ラニビズマブ(Lucentis(登録商標))、およびアフリベルセプト(Eylea(登録商標))が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物は、抗VEGF剤による処置の前、間、または後に使用され得る。
医薬組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物の加工処理を容易にする、賦形剤および助剤を含む1種または複数の生理学的に許容される担体を使用して製剤化され得る。製剤は、選択される投与経路に応じて修飾されてもよい。本明細書に記載される化合物を含む医薬組成物は、例えば、混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、または圧縮プロセスによって製造され得る。
医薬組成物は、少なくとも1種の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤および遊離塩基または薬学的に許容される塩形態として本明細書に記載される化合物を含むことができる。医薬組成物は、可溶化剤、安定剤、張度増強剤、緩衝液、および防腐剤を含有することができる。
本明細書に記載される化合物を含む組成物を調製する方法は、化合物を1種または複数の不活性の薬学的に許容される賦形剤または担体と共に製剤化して、固体、半固体、または液体組成物を形成するステップを含む。固体組成物には、例えば、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセル、およびカシェ剤が含まれる。液体組成物には、例えば、化合物が溶解される溶液、化合物を含むエマルション、または本明細書に開示される化合物を含むリポソーム、ミセル、もしくはナノ粒子を含有する溶液が含まれる。半固体組成物には、例えば、ゲル、懸濁物およびクリームが含まれる。組成物は、液体溶液もしくは懸濁物、使用前の液体中での溶解もしくは懸濁に適した固体形態であってもよいか、またはエマルションとしてでもよい。これらの組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝化剤、および他の薬学的に許容される添加剤などの、少量の非毒性の補助物質を含有することができる。
本発明に使用するのに適した剤形の非限定的な例には、液体、粉末、ゲル、ナノ懸濁物、ナノ粒子、ミクロゲル(microgel)、水性または油性懸濁物、エマルション、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
本発明に使用するのに適した薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例には、結合剤、崩壊剤、付着防止剤(anti-adherent)、静電防止剤、界面活性剤、酸化防止剤、コーティング剤、着色剤、可塑剤、防腐剤、懸濁剤、乳化剤、抗菌剤、球形化剤(spheronization agent)、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
本発明の組成物は、例えば、即時放出形態または制御放出製剤であってもよい。即時放出製剤は、化合物が急速に作用することを可能にするように製剤化され得る。即時放出製剤の非限定的な例には、容易に溶解可能な製剤が含まれる。制御放出製剤は、活性剤の放出速度および放出プロファイルが生理学的および時間治療的要件と一致し得るように適合されているか、または代替として、プログラムされた速度で活性剤の放出をもたらすように製剤化されている医薬製剤であってもよい。制御放出製剤の非限定的な例には、顆粒、遅延放出顆粒、(例えば、合成または天然起源の)ヒドロゲル、他のゲル化剤(例えば、ゲル形成食物繊維)、マトリクスベースの製剤(例えば、少なくとも1種の活性成分が分散されたポリマー材料を含む製剤)、マトリクス内の顆粒、ポリマー混合物、および粒状塊が含まれる。
一部の場合には、制御放出製剤は遅延放出形態である。遅延放出形態は化合物の作用を長期間遅延させるように製剤化され得る。遅延放出形態は、有効用量の1つまたは複数の化合物の放出を、例えば、約4、約8、約12、約16、または約24時間遅延させるように製剤化され得る。
制御放出製剤は持続放出形態であってもよい。持続放出形態は、例えば、化合物の作用を長期間にわたって持続するように製剤化され得る。持続放出形態は、約4、約8、約12、約16、または約24時間にわたって本明細書に記載される有効用量のいずれかの化合物を提供する(例えば、生理学的に有効な血液プロファイルを提供する)ように製剤化され得る。
開示される組成物は、任意選択で、薬学的に許容される防腐剤を含むことができる。
薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版(Easton、Pa.: Mack Publishing Company、1995年);Hoover, John E.、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania 1975年;Liberman, H.A.およびLachman, L.編、 Pharmaceutical Dosage Forms、Marcel Decker、New York、N.Y.、1980年;およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems、第7版(Lippincott Williams & Wilkins 1999年)に見出すことができ、それらの各々はその全体が参照により組み込まれる。
本明細書に記載される化合物は、便宜上、1つまたは複数の薬学的に許容される担体からなる医薬組成物に製剤化され得る。例えば、その全体が参照により組み込まれる、E.W. Martin Mack Pub. Co.、Easton、PAによるRemington’s Pharmaceutical Sciences、最新版を参照のこと。それは、医薬組成物を調製する典型的な担体および従来の方法を開示している。そのような担体は、滅菌水、生理食塩水、および生理的pHにおける緩衝溶液などの溶液を含む、ヒトおよび非ヒトへの組成物の投与のための担体であってもよい。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、および麻酔薬などの1種または複数のさらなる活性成分を含むことができる。
薬学的に許容される担体の非限定的な例には、生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液が含まれる。一部の実施形態では、溶液のpHは約5~約8であってもよく、約7~約7.5であってもよい。さらなる担体には、化合物を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスなどの持続放出調製物が含まれる。マトリクスは、成形物品、例えば、フィルム、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルの形態であってもよい。
開示される方法は、医薬組成物の一部としてVE-PTP(HPTP-β)を標的化する抗体を投与することに関する。局所投与に適した組成物が使用され得る。一部の実施形態では、本発明の組成物は、溶液、懸濁物、または両方に活性剤を含む液体を含むことができる。液体組成物はゲルを含むことができる。液体組成物は、例えば、水性であってもよい。組成物は、in situでゲル化可能な水性組成物である。繰り返しとして、組成物は、in situでゲル化可能な水溶液である。そのような組成物は、眼または眼の外側の涙液と接触するとゲル化を促進するのに有効な濃度でゲル化剤を含むことができる。水性組成物は、眼科用に適合可能な(ophthalmically-compatible)pHおよび質量オスモル濃度を有することができる。組成物は、結膜下投与のための活性剤を含む眼科用デポー製剤を含むことができる。活性剤を含む微粒子は、生体適合性の薬学的に許容されるポリマーまたは脂質カプセル化剤に包埋され得る。デポー製剤は、全てまたは実質的に全ての活性物質を長期間にわたって放出するように適合され得る。ポリマーまたは脂質マトリクスは、存在する場合、全てまたは実質的に全ての活性剤の放出後、投与部位から輸送されるように十分に分解するように適合され得る。デポー製剤は、薬学的に許容されるポリマーおよび溶解または分散された活性剤を含む液体製剤であってもよい。注射の際に、ポリマーは、例えば、ゲル化または沈殿によって注射部位でデポーを形成する。組成物は、物品が活性剤を放出する場所である、眼と瞼との間または結膜嚢内などの眼の適切な位置に挿入され得る固体物品を含むことができる。このような様式での眼への移植に適した固体物品は、ポリマーを含んでもよく、生体内分解性(bioerodible)であっても、生体内非分解性であってもよい。
医薬製剤は、本明細書に開示される薬剤に加えて、さらなる担体、ならびに増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、および界面活性剤を含むことができる。
開示される組成物のpHは約3~約12の範囲であってもよい。組成物のpHは、例えば、約3~約4、約4~約5、約5~約6、約6~約7、約7~約8、約8~約9、約9~約10、約10~約11、または約11~約12のpH単位であってもよい。組成物のpHは、例えば、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、または約12のpH単位であってもよい。組成物のpHは、例えば、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11または少なくとも12のpH単位であってもよい。組成物のpHは、例えば、多くとも3、多くとも4、多くとも5、多くとも6、多くとも7、多くとも8、多くとも9、多くとも10、多くとも11、または多くとも12のpH単位であってもよい。pHが処方者によって所望される範囲外である場合、pHは、十分な薬学的に許容される酸および塩基を使用することによって調整され得る。
意図される投与様式に応じて、医薬組成物は、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル、粉末、液体、懸濁物、ローション、クリーム、またはゲルなどの、固体、半固体または液体剤形の形態、例えば、正確な投薬量の単回投与に適した単位剤形であってもよい。
固体組成物について、非毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムが含まれる。
本開示の組成物との組み合わせに適した薬学的に活性な薬剤の非限定的な例には、抗感染剤、すなわち、アミノグリコシド、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗コリン作用剤(anti-cholinergic)/抗痙攣薬(anti-spasmotic)、抗糖尿病剤、降圧剤、抗新生物剤、心血管作動剤(cardiovascular agent)、中枢神経系剤、凝固修飾剤、ホルモン、免疫学的薬剤、免疫抑制剤、および眼科用調製物が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、薬学的に許容される担体および/または賦形剤、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸塩およびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、防腐剤、および他のタンパク質と混合した治療有効量の化合物を含む。例示的な薬剤には、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、リンガーおよびハンクス溶液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ならびにグリコールが含まれる。
投与方法および処置方法
本明細書に記載される医薬組成物は予防的および/または治療的処置のために投与され得る。治療的適用において、組成物は、疾患または状態を既に患っている被験体に、疾患または状態の症状を治療するか、もしくは少なくとも部分的に停止させるか、または状態を治療し、治癒し、改善するか、もしくは好転させる(ameliorate)のに十分な量で投与され得る。組成物はまた、状態を発生させる、状態に罹る、または状態を悪化させる可能性を低下させるために投与され得る。この使用に有効な量は、疾患または状態の重症度および経過、以前の療法、被験体の健康状態、体重、および薬物に対する応答、ならびに処置する医師の判断に基づいて変化させてもよい。
複数の治療剤は任意の順序でまたは同時に投与され得る。同時の場合、複数の治療剤が、単一の統一された形態で、または例えば、複数の別個の丸剤としての複数の形態で提供され得る。薬剤は一緒にまたは別々に、単一のパッケージまたは複数のパッケージに包装され得る。治療剤の1つまたは全ては複数回用量で与えられ得る。同時でない場合、複数回用量の間のタイミングは約1ヶ月程度まで変化させてもよい。
本明細書に記載される治療剤は、疾患または状態の発生の前、間、または後に投与されてもよく、治療剤を含有する組成物を投与するタイミングは変化させてもよい。例えば、組成物は予防薬として使用されてもよく、疾患または状態の発生の可能性を低下させるために状態または疾患になる傾向を有する被験体に継続的に投与されてもよい。組成物は、症状の発症の間、または発症後可能な限り速やかに被験体に投与されてもよい。治療剤の投与は、症状の発症から最初の48時間以内、症状の発症から最初の24時間以内、症状の発症から最初の6時間以内、または症状の発症から3時間以内に開始され得る。最初の投与は、任意の実用的な経路を介して、例えば、本明細書に記載される任意の製剤を使用して本明細書に記載される任意の経路によって行われ得る。治療剤は、疾患または状態の発症が検出されたか、または疑われた後、実行可能な限り速やかに、および疾患の処置に必要な期間の間、例えば、約1ヶ月~約3ヶ月などで投与されてもよい。処置の長さは、被験体ごとに変化させてもよい。
本明細書に記載される医薬組成物は、正確な投薬量の単回投与に適した単位剤形であってもよい。単位剤形において、製剤は、適切な量の1つまたは複数の化合物を含有する単位用量に分割される。単位投薬量は個別の量の製剤を含有するパッケージの形態であってもよい。非限定的な例は、包装された注射剤、バイアル、またはアンプルである。水性懸濁組成物は単回用量の再閉鎖できない容器に包装され得る。複数回用量の再閉鎖可能な容器は、例えば、防腐剤と組み合わせて、または防腐剤を有さずに使用され得る。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプル、または防腐剤を有する複数回用量の容器で提示され得る。
本明細書に提供される医薬組成物は、他の療法、例えば、化学療法、放射線、外科手術、抗炎症剤、および選択されたビタミンと併用して投与されてもよい。他の薬剤は、医薬組成物の前、後、または同時に投与されてもよい。
投薬
VE-PTP(HPTP-β)抗体は、被験体の体重に基づいて、約0.01mg/kg~約50mg/kg、約0.1mg/kg~約10mg/kg、約1mg/kg~約10mg/kg、約5mg/kg~約10mg/kg、約1mg/kg~約5mg/kg、または約3mg/kg~約7mg/kgの投薬量で投与されてもよい。
VE-PTP(HPTP-β)抗体は所望の任意の間隔で投与されてもよい。化合物の投与は、化合物を投与するヒトまたは化合物を受容する被験体のいずれかに合わせるために不規則な投薬スケジュールを有してもよい。例えば、化合物は、週に1回、週に2回、週に3回、週に4回、週に6回、週に6回、週に7回、週に8回、週に9回または週に10回投与されてもよい。毎日の投薬の間の間隔は、例えば、1時間毎、2時間毎、3時間毎、4時間毎、5時間毎、6時間毎、7時間毎、8時間毎、9時間毎、10時間毎、11時間毎、または12時間毎の任意の時間間隔であってもよい。VE-PTP(HPTP-β)抗体の投与についての投薬スケジュールには、1日1回、週3回、週2回、週1回、月3回、月2回、月1回、隔月1回、年1回、年2回、年3回、または年4回が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、VE-PTP(HPTP-β)抗体は隔週で投与されてもよい。
さらに、投与されるVE-PTP(HPTP-β)抗体の量は各用量において同じ量であってもよく、または投薬量は用量間で変化させてもよい。例えば、第1の量は午前に投薬され、第2の量は晩に投与される。投与のための投薬量は、抗VEGF投与のスケジュールに応じて変化させてもよい。
抗VE-PTP抗体は、例えば、処置の開始時、処置の間の任意の時点または抗VEGF剤による処置が終了した後の任意の時点に、任意の組み合わせで任意の抗VEGF剤と組み合わせて投与されてもよい。さらに、VE-PTP(HPTP-β)阻害剤の投薬量は処置の間に調整されてもよい。また、抗VEGF剤の量も処置の間に調整されてもよい。
VEGF調節剤のさらなる非限定的な例には、非炎症剤(non-inflammatory agent)、例えば、デキサメタゾン、フルオシノロン、およびトリアムシノロンが含まれる。さらに、開示される方法は、抗VEGF剤を送達するインプラントを含んでもよい。例えば、VE-PTP(HPTP-β)阻害剤は、本明細書に記載される疾患または状態を患っている被験体にインプラントが提供される前、間、または後のいずれかに共投与されてもよい。
抗VEGF処置は、例えば、毎月、3ヶ月毎に1回、6ヶ月毎に1回、または毎年投与されてもよく、VE-PTP(HPTP-β)阻害剤は処置の間に任意の頻度で投与される。
本明細書に開示される疾患または状態を処置する方法も本明細書に開示される。この方法は、
a)治療有効量のVE-PTP(HPTP-β)阻害剤、および
b)治療有効量の抗VEGF剤
を被験体に投与するステップを含み、
VE-PTP(HPTP-β)阻害剤および抗VEGF剤の投与は、例えば、本明細書にさらに記載されるように、投与者によって所望される任意の様式で行われてもよい。
VE-PTP(HPTP-β)結合剤または抗VEGF剤は必要または簡便な任意の量で投与されてもよい。例えば、本明細書に記載される化合物は、任意の投与経路によって被験体に対して1用量当たり、約0.1mg~約300mg、約0.1mg~約200mg、約0.1mg~約100mg、約0.05mg~約1.5mg、0.1mg~約1.5mg、約0.05mg~約1mg、または約0.1mg~約1mg、約0.05mg、約0.06mg、約0.07mg、約0.08mg、約0.09mg、約0.1mg、約0.11mg、約0.12mg、約0.13mg、約0.14mg、約0.15mg、約0.16mg、約0.17mg、約0.18mg、約0.19mg、約0.2mg、約0.21mg、約0.22mg、約0.23mg、約0.24mg、約0.25mg、約0.26mg、約0.27mg、約0.28mg、約0.29mg、約0.3mg、約0.31mg、約0.32mg、約0.33mg、約0.34mg、約0.35mg、約0.36mg、約0.37mg、約0.38mg、約0.39mg、約0.4mg、約0.41mg、約0.42mg、約0.43mg、約0.44mg、約0.45mg、約0.46mg、約0.47mg、約0.48mg、約0.49mg、約0.5mg、約0.51mg、約0.52mg、約0.53mg、約0.54mg、約0.55mg、約0.56mg、約0.57mg、約0.58mg、約0.59mg、約0.6mg、約0.61mg、約0.62mg、約0.63mg、約0.64mg、約0.65mg、約0.66mg、約0.67mg、約0.68mg、約0.69mg、約0.7mg、約0.71mg、約0.72mg、約0.73mg、約0.74mg、約0.75mg、約0.76mg、約0.77mg、約0.78mg、約0.79mg、約0.8mg、約0.81mg、約0.82mg、約0.83mg、約0.84mg、約0.85mg、約0.86mg、約0.87mg、約0.88mg、約0.89mg、約0.9mg、約0.91mg、約0.92mg、約0.93mg、約0.94mg、約0.95mg、約0.96mg、約0.97mg、約0.98mg、約0.99mg、約1mg、約1.5mg、約2mg、約2.5mg、約3mg、約3.5mg、約4mg、約4.5mg、約5mg、約5.5mg、約6mg、約6.5mg、約7mg、約7.5mg、約8mg、約8.5mg、約9mg、約9.5mg、約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約65mg、約70mg、約75mg、約80mg、約85mg、約90mg、約95mg、約100mg、約110mg、約120mg、約130mg、約140mg、約150mg、約160mg、約170mg、約180mg、約190mg、約200mg、約210mg、約220mg、約230mg、約240mg、約250mg、約260mg、約270mg、約280mg、約290mg、または約300mgの量で投与されてもよい。
眼内送達
本明細書に開示される疾患または状態を有する被験体に本発明の組成物を眼内送達するための方法が本明細書に開示される。送達方法は、眼細胞に組成物を直接送達するための侵襲的方法を含むことができる。一部の実施形態では、抗体を含む液体医薬組成物は網膜下注射によって送達される。一部の実施形態では、抗体を含む液体医薬組成物は硝子体内または皮下注射によって送達される。一部の実施形態では、抗体を含む液体医薬組成物は腔内注射によって送達される。一部の実施形態では、組成物は、抗体送達の効率を増加させるために、複数の投与経路、例えば、網膜下および/または硝子体内によって送達される。一部の実施形態では、網膜下および/または硝子体内注射の前に硝子体切除術が先行する。
眼内注射は、送達の効率を改善し、および/または周囲組織への損傷を最小化もしくは回避するために任意の時間間隔にわたって実施され得る。眼内注射のための時間間隔は、例えば、約1分~約60分、約1分~約5分、約5分~約10分、約10分~約15分、約15分~約20分、約20分~約25分、約25分~約30分、約30分~約35分、約35分~約40分、約40分~約45分、約45分~約50分、約50分~約55分、または約55分~約60分であってもよい。
眼内注射は任意の速度で実施され得る。眼内注射の速度は、例えば、約1μL/分~約200μL/分、約1μL/分~約10μL/分、約10μL/分~約20μL/分、約20μL/分~約30μL/分、約30μL/分~約40μL/分、約40μL/分~約50μL/分、約50μL/分~約60μL/分、約60μL/分~約70μL/分、約70μL/分~約80μL/分、約80μL/分~約90μL/分、約90μL/分~約100μL/分、約100μL/分~約110μL/分、約110μL/分~約120μL/分、約120μL/分~約130μL/分、約130μL/分~約140μL/分、約140μL/分~約150μL/分、約150μL/分~約160μL/分、約160μL/分~約170μL/分、約170μL/分~約180μL/分、約180μL/分~約190μL/分、または約190μL/分~約200μL/分であってもよい。
キット
本開示はさらに本開示の組成物を含有するキットに関する。キットは、
A)VE-PTP(HPTP-β)を標的化する抗体を含む組成物、および
B)組成物を被験体に送達するための担体
を含むことができる。
キットは、処置される被験体のために処方される投薬レジメンに適合するように修飾されてもよい。以下は、眼内注射によって本開示の組成物を受容する被験体に使用するためのキットの非限定的な例である:
A)水性組成物であって、
a)VE-PTP(HPTP-β)細胞外ドメインを標的化する抗体、および
b)担体系であって、
i)張度剤(tonicity agent)、および
ii)水
を含み、
張度剤は、再構成された製剤が張度剤の体積に対して約0.5質量%~約10質量%を構成するような量で存在する、担体系
を含有する、水性組成物、ならびに
B)水性組成物を送達するための成分。
一部の実施形態では、本発明のキットは、
A)抗VE-PTP抗体を送達するための組成物、および
B)抗VEGF剤を送達するための組成物
を含む。
キットは、処置される被験体のために処方される投薬レジメンに適合するように修飾されてもよい。以下は、開示される化合物を含む静脈内に送達される組成物および硝子体内に投与される抗VEGF剤を受容する患者に使用するためのキットの非限定的な例である。この例は、3ヶ月間1日2回の開示された化合物の投薬、および12週目にラニビズマブの注射を提供する。
A.各パッケージが4個のバイアルを含む、3個のパッケージ。各バイアルは、開示された化合物5mgを7日間毎日2回注射するのに十分な量のVE-PTP(HPTP-β)阻害剤を含む;および
B.ラニビズマブ0.5mgを提供する12週目の終わりに注射するためのラニビズマブのバイアル。
キットは要素の任意の組み合わせを含んでもよい。さらに、本明細書に開示される抗VE-PTP抗体が経口で提供される場合、十分な用量の開示される化合物を有する単一の容器がキットと共に供給されてもよい。
キットはまた、送達される組成物を使用し、処分するための書面による指示を提供してもよい。指示は、処方される投薬レジメンを反映するようにキットごとに変更されてもよい。指示は、本明細書に記載される任意の療法、化合物、賦形剤、または投与方法を記載していてもよい。
開示される組成物は、例えば、担体系の体積に基づいて約1.5質量%~約90質量%を構成してもよい。張度剤の非限定的な例には、デキストロース、マンニトール、およびグリセリンが含まれる。処方者は1つより多い張度剤を利用することができる。
キットは、シリンジ、フィルター針、延長管状材料、カニューレ、および網膜下注射器などの投与のためのデバイスをさらに含んでもよい。投与経路の非限定的な例には、眼内、非経口、および局所が含まれる。眼内投与経路には、例えば、硝子体内、腔内、結膜下、テノン嚢下、眼球後方、眼内、後強膜近傍、眼周囲、網膜下、および脈絡膜上が含まれ得る。送達は、例えば、シリンジ、針、注入ポンプ、または注射器によってでもよい。シリンジおよび注射器は、例えば、単回用量、複数回用量、固定用量、または可変用量であってもよい。注射器の非限定的な例には、ペン型注射器、自動注射器、および電気パッチ注射器(electronic patch injector)システムが含まれる。
キットは、被験体への本発明の組成物の投与に適した成分を含むことができる。一部の実施形態では、本発明の組成物は単位剤形としてキットに存在する。したがって、処方者は、より高い濃度の化合物を有する送達デバイスを提供し、送達体積を調整して、溶液全体における量よりも少ない量の化合物を提供することができる。
本明細書に記載される任意のキットに一組の指示が含まれてもよい。指示は、投薬量、投薬のタイミング、キットが乾燥組成物を含有する場合の組成物の再構成、ならびに送達ビヒクルおよび未使用組成物の処分方法に関連し得る。指示は、本明細書に記載される任意の療法、化合物、賦形剤、または投与方法を記載していてもよい。
方法
本発明は、眼の疾患または状態、例えば、眼の浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、血管漏出、加齢性黄斑変性(湿潤型)、加齢性黄斑変性(乾燥型)、脈絡膜新血管形成、糖尿病性網膜症、眼虚血、ブドウ膜炎、網膜静脈閉塞(中心または分枝)、眼外傷、手術誘発性浮腫、手術誘発性新血管形成、類嚢胞黄斑浮腫、眼虚血、およびブドウ膜炎を処置または予防するための組成物および方法を提供する。これらの疾患または状態は、進行性であるか、非進行性であるかに関わらず、急性疾患もしくは状態、または慢性疾患もしくは状態の結果に関わらず、眼血管系の変化によって特徴付けられ得る。これらの疾患は、血漿中の血管内皮増殖因子(VEGF)のレベルの増加によって特徴付けられ得る。
本開示は、それを必要とする被験体における眼新血管形成を処置する方法であって、治療有効量のVE-PTP(HPTP-β)標的化抗体を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、VE-PTP(HPTP-β)阻害剤は漏出および新血管形成に対して血管系を安定化する。
臨床症状の改善は、例えば、倒像眼底検査、眼底撮影法(fundus photography)、フルオレセイン血管障害、網膜電図記録、外眼検査(external eye examination)、細隙灯生体顕微鏡検査、圧平眼圧測定(applanation tonometry)、角膜厚測定(pachymetry)、光干渉断層撮影、またはオートリフラクション(autorefraction)によってモニターされ得る。一部の実施形態では、開示される方法は、抗VEGF剤を含む組成物を含む、VE-PTP(HPTP-β)抗体の投与に関する。
一部の実施形態では、本開示の方法は、漏出に対して血管系を安定させることができる、1つまたは複数の抗VEGF剤とのVE-PTP(HPTP-β)抗体の共投与を含む。
一部の実施形態では、本開示の方法は、新血管形成に対して血管系を安定させることができる、1つまたは複数の抗VEGF剤との抗VE-PTP(HPTP-β)抗体の共投与を対象とする。
一部の実施形態では、抗VE-PTP(HPTP-β)抗体は、漏出および新血管形成に対して血管系を安定させることができる。
一部の実施形態では、少なくとも1つの視覚障害がある眼を有するヒト被験体は、約0.1mg~約100mgのVE-PTP(HPTP-β)抗体により処置される。臨床症状の改善は、例えば、倒像眼底検査、眼底撮影法、フルオレセイン血管障害、網膜電図記録、外眼検査、細隙灯生体顕微鏡検査、圧平眼圧測定、角膜厚測定、光干渉断層撮影およびオートリフラクションによってモニターされ得る。本明細書に記載されるように、投薬は投与者によって決定される任意の頻度で行うことができる。抗VEGF剤処置の中断後、その後の用量は、例えば、毎週または毎月、例えば、応答に応じて約2~8週または約1~12ヶ月離した頻度で投与されてもよい。
糖尿病の直接的または間接的な結果である疾患には、とりわけ、糖尿病性黄斑浮腫および糖尿病性網膜症が含まれる。糖尿病患者の眼の血管系は時間をわたって不安定になり、非増殖網膜症、黄斑浮腫、および増殖網膜症などの状態をもたらす。鮮明かつ真っすぐな視覚が生じる眼の部分である黄斑の中心に体液(fluid)が漏出すると、体液および関連タンパク質の蓄積が黄斑の上または下に沈着し始める。この沈着は被験体の中心視を徐々に歪ませる腫脹を生じる。この状態が黄斑浮腫である。発生する可能性がある別の状態は、眼の黄斑部の外側に微細動脈瘤などの血管変化が観察され得る非増殖網膜症である。
これらの状態は、増加した新血管形成によって特徴付けられる糖尿病性増殖網膜症と関連する可能性がある。新たな血管は脆く、出血しやすい。その結果は、網膜の瘢痕および新たな血管の過剰形成に起因する、眼を通る光路の閉塞または完全な遮断である。糖尿病性黄斑浮腫を有する被験体は、多くの場合、糖尿病性網膜症の非増殖期を患うが、被験体は、多くの場合、増殖期の開始時に黄斑浮腫を発現し始めるだけである。
糖尿病性網膜症は、就業年齢のアメリカ人における視力喪失の最も一般的な原因である。重度の視力喪失は網膜新血管形成を悪化させる牽引性網膜剥離に起因して発生するが、中等度の視力喪失の最も一般的な原因は糖尿病性黄斑浮腫(DME)である。
VEGFは低酸素調節遺伝子であり、VEGFレベルは低酸素または虚血性網膜において増加する。ほとんどの状況下で、Ang2はTie2に結合するが、リン酸化を刺激せず、Tie2アンタゴニストとして作用する。眼において、Ang2は新血管形成部位において上方調節され、VEGFについての許容因子として作用する。網膜におけるVEGFの増加した発現は網膜または脈絡毛細管板の表在または中間の毛細血管床からの新血管形成の発芽を刺激しないが、Ang2の構成的発現が発生する深部毛細血管床からの発芽を刺激する。網膜の表面におけるVEGFおよびAng2の共発現は表在の網膜毛細血管からの新血管形成の発芽を引き起こす。
既存の血管から新たな血管を生じるプロセスである血管新生は、胎生発育、月経、創傷治癒、および腫瘍成長を含む、広範囲の生理学的および病理学的事象に必須である。全てではないにしても、ほとんどの腫瘍は成長および増殖するために血管新生を必要とする。VEGFは、血管透過性および毛細血管の数を増加させることによる血管新生における主要な因子であり得る。
VEGFは、内皮細胞に主に見出され、脈管形成、血管新生、および血管の透過化において機能を有するタンパク質である。VEGFの発現は、低酸素症、活性化がん遺伝子、およびサイトカインによって誘導される。VEGF活性化は、正常なヒト細胞および組織における血管新生をもたらし得るが、腫瘍における血管新生ももたらし得、腫瘍の進行および成長を可能にする。VEGFの阻害は腫瘍成長を阻害することができ、腫瘍退縮をもたらす。様々な網膜症は、VEGFのレベルの増加に関連し、眼における虚血は酸素の欠乏に起因してVEGF産生の誘導をもたらす。VEGFのこの増加は、網膜における血管の過剰増殖を引き起こし得、失明をもたらし得る。開示された抗VE-PTP(HPTP-β)抗体は、眼の血管系を安定させるように作用することができ、罹患した網膜に存在するVEGFおよび他の炎症性作用物質によって引き起こされる刺激に対抗することができる。一部の実施形態では、被験体への抗VE-PTP(HPTP-β)抗体の投与は、被験体への抗VEGF薬の投与が中止された後、疾患の逆転のレベルを維持することができる。
黄斑変性は、網膜の中心における黄斑部の細胞および組織変性に起因する視力の漸進的な喪失または障害によって特徴付けられる。黄斑変性は、多くの場合、非滲出性(乾燥型)または滲出性(湿潤型)の2つの型のうちの1つとして特徴付けられる。両方の型は両側性で進行性であるが、各々の型は異なる病理学的プロセスを反映し得る。加齢性黄斑変性(AMD)の湿潤型は、脈絡膜新血管形成の最も一般的な型であり、高齢者における失明の主な原因である。AMDは、60歳を超える何百万人ものアメリカ人が罹患し、高齢者の間での新たな失明の主な原因である。
脈絡膜新生血管膜(CNVM)は多種多様の網膜疾患に関連する問題であるが、最も一般的には加齢性黄斑変性に関連している。CNVMでは、脈絡膜(網膜直下の血管が豊富な組織層)に由来する異常血管が網膜層を通って成長する。これらの新たな血管は非常に脆く、容易に破れ、血液および体液を網膜の層内に溜める。
糖尿病(真性糖尿病)は、膵臓がインスリンを産生または使用できないことによって引き起こされる代謝性疾患である。最も一般的な糖尿病の型は、1型糖尿病(多くの場合、若年発症型糖尿病と称される)および2型糖尿病(多くの場合、成人発症型糖尿病と称される)である。1型糖尿病は、インスリン産生細胞の喪失に起因して身体がインスリンを産生することができないことによって生じ、現在、ヒトにインスリンを注射することを必要とする。2型糖尿病は一般に、細胞がインスリンを適切に使用することができない状態である、インスリン耐性から生じる。糖尿病は、糖尿病性網膜症および糖尿病性黄斑浮腫(DME)を含む眼の状態または疾患を含む、多数の他の状態と相関し得る。
糖尿病性網膜症は、眼の後方(網膜)における光感受性組織の血管に対する損傷から生じる糖尿病の合併症である。最初、糖尿病性網膜症は、症状を全く引き起こさないか、または軽度の視力の問題しか引き起こさない可能性がある。最終的に、糖尿病性網膜症は失明に至る可能性がある。糖尿病性網膜症は1型糖尿病または2型糖尿病を有するいずれのヒトにも発生し得る。
非増殖網膜症の最も初期の段階では、微細動脈瘤が網膜の非常に小さな血管に発生する。疾患が進行するにつれて、これらの血管の多くが損傷されるか、または遮断され、網膜のこれらの領域が、栄養物のための新たな血管を成長させるために、局部組織にシグナルを送る。この段階は増殖網膜症と呼ばれる。新たな血管は、網膜に沿って、および眼の内側を満たす透明な硝子体ゲルの表面に沿って成長する。血管は薄く、脆い壁を有し、時宜にかなった処置をしないと、新たな血管は血液、例えば、全血またはその一部の構成成分を漏出し得、重度の視力喪失および失明さえも生じ得る。また、鮮明かつ真っすぐな視覚視覚が生じる眼の部分である黄斑の中心に体液が漏出し得る。体液および関連タンパク質が黄斑の腫脹の上または下に沈着し始めると、被験体の中心視が歪められる。この状態は黄斑浮腫と呼ばれ、糖尿病性網膜症のどの段階でも発生し得るが、疾患が進行するにつれて発生する可能性が高くなる。
ブドウ膜炎は、ブドウ膜が炎症を起こした状態である。眼は内側が中空であり、中心腔を囲む組織の3つの異なる層を有する。最も外側は強膜(眼の白い被膜)であり、最も内側は網膜である。強膜と網膜との間の中間層はブドウ膜と呼ばれる。ブドウ膜は、眼に栄養を与える多くの血管を含有する。ブドウ膜炎の合併症には、緑内障、白内障、および新たな血管の形成(新血管形成)が含まれる。
眼外傷は、眼に対するあらゆる種類の物理的または化学的損傷である。眼外傷は誰もが罹患する可能性があり、主要な症状には、罹患した眼における充血(redness)または疼痛が含まれる。この症状は、非常に小さな発射物が外傷を引き起こす場合には、発生しない傾向がある。
手術により誘発される浮腫は、網膜または眼の他の部分に対する手術後の眼組織における腫脹の発生である。類嚢胞黄斑浮腫(CME)はこの現象の一例である。CMEは、白内障の手術を受けたことのあるヒトだけでなく、糖尿病、網膜色素変性症、AMD、または眼の慢性炎症を引き起こす状態のヒトにも発生し得る。CMEの主な症状は、霧視または中心視力の低下である。
眼虚血症候群(OIS)は、慢性血管不全から生じる徴候および症状を包含する。この状態は、総頸動脈または内頸動脈の閉塞または狭窄に起因する眼の低潅流によって引き起こされる。OISは一般に、高血圧または糖尿病などの全身性疾患を示すことが多い50~80歳の被験体が罹患する。OISの主な症状は、眼窩痛、視力喪失、視野の変化、非対称白内障、および光に対する緩慢な反応である。
網膜静脈閉塞(RVO)は、糖尿病性網膜症後の最も一般的な網膜血管疾患である。有効に閉塞された網膜静脈ドレナージの領域に依存して、状態は、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、半側網膜静脈閉塞症(HRVO)、または網膜静脈分枝閉塞症(BRVO)として広範に分類される。RVOの発現は、網膜血管の蛇行、網膜出血(斑状および火炎状)、綿花状白斑、視神経乳頭腫脹および黄斑浮腫からなる眼底所見のいずれかの組み合わせを伴う、様々な無痛性の視力喪失を伴う。CRVOにおいて、網膜出血は眼底の4四分円部分全てに見出され得るが、出血はHRVOにおいて上側または下側眼底半球のいずれかに制限される。BRVOにおいて、出血は、閉塞した分枝網膜静脈によって排出される領域に主に局在する。視力喪失は黄斑浮腫または虚血に続発して発生する。
本開示の組成物は眼血管系を安定化させるように作用し、一部の実施形態では、本開示の薬剤は、VEGFおよび罹患した網膜に存在し得る他の炎症性作用物質によって引き起こされる刺激に対抗することができる。一部の実施形態では、被験体への本開示の抗体の投与は被験体への抗VEGF薬の投与が中止された後に、疾患の逆転のレベルを維持するために使用され得る。
被験体の処置
一部の実施形態では、本明細書に開示される疾患または状態を有する被験体における本開示の組成物の単回投与は、眼新血管形成の長期の抑制に十分なレベルでのVE-PTP(HPTP-β)阻害剤の持続的な眼内発現をもたらす。
例えば、宿主眼細胞において産生されるVE-PTP(HPTP-β)阻害剤のレベルは、少なくとも100pg/mL、少なくとも200pg/mL、少なくとも300pg/mL、少なくとも400pg/mL、少なくとも500pg/mL、少なくとも600pg/mL、少なくとも00pg/mL、少なくとも800pg/mL、少なくとも900pg/mL、少なくとも1000pg/mL、少なくとも2000pg/mL、少なくとも3000pg/mL、少なくとも4000pg/mL、少なくとも5000pg/mL、少なくとも6000pg/mL、少なくとも7000pg/mL、少なくとも8000pg/mL、少なくとも9000pg/mLまたは少なくとも10,000pg/mLであってもよい。宿主眼細胞において産生されるVE-PTP(HPTP-β)阻害剤のレベルは、多くとも100pg/mL、多くとも200pg/mL、多くとも300pg/mL、多くとも400pg/mL、多くとも500pg/mL、多くとも600pg/mL、多くとも700pg/mL、多くとも800pg/mL、多くとも900pg/mL、多くとも1000pg/mL、多くとも2000pg/mL、多くとも3000pg/mL、多くとも4000pg/mL、多くとも5000pg/mL、多くとも6000pg/mL、多くとも7000pg/mL、多くとも8000pg/mL、多くとも9000pg/mL、または多くとも10,000pg/mLであってもよい。
タンパク質レベルは、本開示の医薬組成物を投与してから、少なくとも約0.1、少なくとも約0.2、少なくとも約0.3、少なくとも約0.4、少なくとも約0.5、少なくとも約0.6、少なくとも約0.7、少なくとも約0.8、少なくとも約0.9、少なくとも約1、少なくとも約2、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約14、少なくとも約21、少なくとも約30、少なくとも約50、少なくとも約75、少なくとも約100、少なくとも約125、少なくとも約150、少なくとも約175、少なくとも約200、少なくとも約225、少なくとも約250、少なくとも約275、少なくとも約300、少なくとも約325、少なくとも約350、または少なくとも約365日後に測定され得る。タンパク質レベルは、本開示の医薬組成物を投与してから、多くとも約0.1、多くとも約0.2、多くとも約0.3、多くとも約0.4、多くとも約0.5、多くとも約0.6、多くとも約0.7、多くとも約0.8、多くとも約0.9、多くとも約1、多くとも約2、多くとも約3、多くとも約4、多くとも約5、多くとも約6、多くとも約7、多くとも約14、多くとも約21、多くとも約30、多くとも約50、多くとも約75、多くとも約100、多くとも約125、多くとも約150、多くとも約175、多くとも約200、多くとも約225、多くとも約250、多くとも約275、多くとも約300、多くとも約325、多くとも約350、または多くとも約365日後に測定され得る。
中心窩厚(Central Foveal Thickness)
本明細書に開示される疾患または状態を有する被験体における中心窩厚(CFT)を減少させる方法も本明細書に開示される。方法は、VE-PTP(HPTP-β)標的化抗体を眼に投与するステップを含み、抗体の投与は任意の様式で行われてもよい。
中心窩厚の減少のレベルは、例えば、約50μm~約1000μmであってもよい。中心窩厚の減少のレベルは、例えば、約50μm~約500μm、約50μm~約750μm、約150μm~約500μm、約200μm~約500μm、約200μm~約1000μm、約250μm~約650μm、または約400μm~約700μmであってもよい。
視力
本明細書に開示される疾患または状態を有する被験体の視力を上昇させる方法が、本明細書にさらに開示される。
視力は、視覚の鋭さ(acuteness)または鮮やかさ(clearness)であり、眼内の網膜焦点の鮮明さおよび脳の解釈部分(interpretative faculty)の感度に依存する。視力は視覚処理システムの空間分解能の尺度である。視力は、設定距離からの図表上の特徴、典型的には数字または文字を識別することを被験体に要求することによって試験される。図表の特徴は白色の背景に対して黒色の記号として表される。被験体の眼と試験図表との間の距離は、水晶体が焦点を合わせようとする仕方で無限遠に近づくのに十分な距離に設定される。20フィート、または6メートルが、視覚的遠近法から本質的に無限遠である。本開示では、視力の改善は、図表から読み取ることができる文字の数の増加によって評価された。
視力を測定するための1つの非限定的な試験は、ESV-3000 ETDRS試験デバイスおよび自己較正試験照明の使用である。ESV-3000デバイスはLED光源技術を組み込んでいる。自動較正回路はLED光源を常時モニターし、試験輝度を85cd/mまたは3cd/mに較正する。
大型ETDRS試験(最大で20/200)が4メートルで実施される臨床試験用に設計されているが、デバイスは、非研究環境、すなわち、眼疾患モニタリングが行われる病院または診療所において使用され得る。ETDRSを適切に評価するために、試験は、標準化された照明条件下、例えば、85cd/mの明所視試験レベルで行われるべきである。視力のスコア付けは、モニターによって選択される任意の様式において達成され得る。ベースライン評価を提供した後、試験被験体が識別できる文字の数の増加または減少は、処置の間の視力の上昇または低下の尺度となる。
本明細書に開示される眼の疾患または状態を有する被験体における視力を上昇させる方法が、本明細書に開示される。この方法は、VE-PTP(HPTP-β)標的化抗体を、眼の疾患または状態を有する被験体に投与するステップを含み、抗体の投与は本明細書に記載される任意の様式で行われ得る。処置された眼によって認識される文字の数の増加は、例えば、約1~約30文字、約5~約25文字、約5~約20文字、約5~約15文字、約5~約10文字、約10~約25文字、約15~約25文字、または約20~約25文字であり得る。視力の上昇は、約1文字、約5文字、約10文字、約15文字、約20文字、または約25文字であり得る。
(実施例1:ハイブリドーマ技術を使用したVE-PTP(HPTP-β)細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体の生成。)
ハイブリドーマ技術を使用して、図3の概略図に示されるように、ヒトVE-PTP(HPTP-β)またはマウスVE-PTPのN末端細胞外ドメイン(ECD)に対するモノクローナル抗体を生成した。マウスをヒトVE-PTP(HPTP-β)ECDタンパク質によりチャレンジして、標的タンパク質に対する抗体を生成した。次いでB細胞を脾臓およびリンパ節から採取し、骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞株を産生した。融合細胞を、抗原曝露マウスに由来する遺伝子を有する骨髄腫細胞のみが成長することができる培地中で培養した。単一の骨髄腫細胞に由来するコロニーを限界希釈によって生成した。次いでハイブリドーマコロニーによって産生された抗体を、ELISAによってヒトVE-PTP(HPTP-β)ECDへの結合についてスクリーニングした。1つのハイブリドーマであるR15E6をさらなる分析のために選択した。R15E6抗体は、図4における免疫沈降(IP)ウェスタンブロット(左パネル)およびフローサイトメトリー(右パネル)によって示されるように、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)由来の内因性ヒトVE-PTP(HPTP-β)に結合した。ビーズ対照(抗体を含まないプロテインA/Gビーズ;BC)またはVEGFR2もしくはTie2(R2/T2)へのR15E6の結合は観察されなかった。
(実施例2:R15E6によるHUVECにおけるTie2活性化。)
R15E6は、図6のパネルAおよびBに示されるIP実験によって実証されるように、濃度依存的にTie2を活性化した。抗体はまた、パネルCに示されるように、HUVECにおいて濃度依存的に血清飢餓内皮細胞の生存度を向上させた。
(実施例3:ネズミモノクローナルおよびポリクローナル抗マウスVE-PTP ECD抗体を用いたTie2活性化および細胞透過性実験。)
in vitroでのVE-PTP抗体の治療効果を特徴付けるために、Tie2活性化および細胞透過性実験を、抗マウスVE-PTP抗体を使用して実施した。マウスVE-PTP ECDに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を、細胞外ドメインのN末端8FN3リピートのVE-PTP-Fc融合タンパク質でラットを免疫化することによって生成した。免疫化、ハイブリドーマ融合、およびスクリーニングは、上記のように実施した。実施例3では、マウスVE-PTPの細胞外フィブロネクチンIII型(FN3)様ドメイン1~8に対するモノクローナル抗体109.1(mAb 109.1)およびポリクローナル抗体(pAb)をさらなる分析のために選択した。
図7は、ウェスタンブロットによって決定した、マウス内皮細胞(bEnd)におけるTie2活性化(左上パネル)、マウスVE-PTPタンパク質発現(左下パネル)、およびAkt(右パネル)に対するmAb 109.1の効果を示す。mAb 109.1による処理は、Tie2リン酸化(pTyr;左上パネル)によって示されるように、Tie2の活性化をもたらした。Aktは、抗体の濃度の増加に伴うリン酸化の増加の非存在によって確認されるように、試験したマウス内皮細胞において構成的に活性化された(右パネル)。
マウスpAb 1-8を用いたin vitro実験もまた、内皮細胞におけるTie2(Tie-2)活性化および下流シグナル伝達を増強した。培養したマウス内皮(bEnd.5)細胞をpAb1-8または免疫前(対照)抗体により1時間処理し、続いてTie2について免疫沈降させ、その後、抗ホスホチロシン抗体(pTyr)およびTie2に対する抗体で免疫ブロットした。同一のタンパク質含量を有する細胞溶解物のアリコートをVE-PTPおよびTie2について直接免疫ブロットした(下パネル)。図8は、pAbが、マウスVE-PTPに対するポリクローナル抗体または免疫前抗体により1時間(パネルA)または3分間(パネルB)処理したbEnd.5細胞においてTie2活性化を急速に誘導した免疫沈降実験を示す。
Tie2活性化の血管安定化効果と一致して、VE-PTP ECD抗体は、図9に示すように、in vitroで内皮単層のトロンビンおよびVEGFにより誘導される透過性を低減させた。250kDのFITC-デキストランについての傍細胞透過性を、トランスウェルフィルター中で成長させた培養HUVEC単層について決定した。透過性はトロンビン(パネルA)またはVEGF(パネルB)のいずれかにより誘導した。PBS処理細胞の透過性は100%に設定した。VE-PTP標的化のために、細胞を抗VE-PTP pAbにより処理した。対照として、細胞を免疫前抗体(対照Ab)により処理した。データは2つの独立した実験を表す。
Tie2活性化の血管安定化効果と一致して、VE-PTP ECD抗体もまた、図10に示すように、in vivoでVEGFにより誘導される皮膚血管透過性を遮断した。モノクローナルおよびポリクローナルVE-PTP ECD抗体、mAb 109.1(パネルA)およびpAb PTP 1-8(パネルB)の両方は、Milesアッセイによって実証されるように、VEGFにより誘導される皮膚血管透過性を阻害した。Milesアッセイは、血管漏出および新血管形成の特性である、血管透過性のin vivoモデルとして使用され得る。Milesアッセイを開始する30分前に、100μgの対照IgGまたは抗マウスVE-PTP抗体をマウスに静脈内注射した。次いでエバンスブルーをマウスに静脈内注射し、その後、10分後にVEGF(縞模様の棒)またはPBS(中実の黒色の棒)を皮内注射した。30分後、マウスを屠殺し、染料を皮膚試料から抽出し、定量化した。データセットを正規性および等分散について調べた。値は平均±平均の標準誤差(SEM)として提示する。パネルCに示すように、透過性の遮断は、pAb PTP1-8により処置したマウスの肺組織において実証されるように、Tie2リン酸化と相関する。
(実施例4:マウスにおける網膜および脈絡膜新血管形成に対するマウスVE-PTP ECDモノクローナル抗体の効果。)
増殖性糖尿病性網膜症の態様を模倣する虚血性網膜症モデルにおいて、VE-PTP ECDモノクローナル抗体(mAb 109.1)は、図11(パネルA)に示し、図12(パネルA)において定量化したように、抗体の投与後、網膜新血管形成を有意に低減させた。P12にて、虚血性網膜症を有するマウスに、0.1、0.5、もしくは2μgのmAb 109.1または2μgのIgGアイソタイプ対照(各々についてn≧12)を硝子体内注射により投与した。P17にて、広範なGSA染色された網膜新血管形成を、対照のIgGを注射した眼において観察し、有意に少ない網膜新血管形成を、2μgの抗VE-PTPを注射した眼において観察した。P<0.001。
同様に、湿潤型加齢性黄斑浮腫の異なる態様(網膜血管腫増殖および脈絡膜新血管形成)を模倣する2つのモデルにおいて、VE-PTP ECDモノクローナル抗体(mAb 109.1)の単回の2μgの硝子体内投与は、両方の網膜新血管形成を有意に低減させた(図11のパネルBおよび図12のパネルBにおいて定量化した)。P15にて、6匹のRho-VEGFトランスジェニックマウスに、一方の眼に0.5または2μgのmAb 109.1を硝子体内注射し、他方の眼に対応する用量の対照IgGを与えた。P21にて、有意に少ないGSA染色された網膜下新血管形成を、対照IgGにより処置した眼においてよりも、0.5または2μgのmAb 109.1により処置した眼において観察した。IgG対照の他方の眼との比較について独立t検定によりP=0.01。スケールバー:100μm。
2μgのmAb 109.1の硝子体内注射により、対照IgGと比較して、ブルッフ膜破裂部位における脈絡膜新血管形成の面積が有意に低減した(図11のパネルCおよび図12のパネルCにおいて定量化した)。Bonferroniの補正を伴う一元ANOVAによりP<0.001。スケールバー:100μm。
mAb 109.1の皮下投与もまた、虚血性網膜症マウスモデルにおいて虚血性新血管形成を低減させた。網膜新血管形成の平均面積は、図25に示すように、ビヒクルと比較して約30%低減した。虚血性網膜症を有するマウスに、2mg/kgのq.o.d(1日おき)×3の皮下注射を投与した。
(実施例5:マウスにおける網膜剥離に対する抗VEGF剤と組み合わせたマウスVE-PTP ECDモノクローナル抗体の効果。)
本明細書に開示される抗VE-PTP抗体を使用した併用療法の効果を評価するために、Tet/オプシン/VEGFマウスモデルを使用した。Tet/オプシン/VEGFトランスジェニックマウスは、重度の網膜下新血管形成および血管漏出を発生し、ヒトVEGFの誘導性網膜過剰発現によって媒介される滲出性網膜剥離をもたらす。図24は、ダブルアスタリスクによって示されるように、マウスにおける網膜剥離を阻止するためのいずれかの療法単独と比較して、抗マウスVE-PTP抗体(mAb 109.1)およびアフリベルセプトの組み合わせの増強した有効性を示す。ラットIgGを対照として使用した。
(実施例6:ヒトVE-PTP(HPTP-β)に対するR15E6由来のヒト化抗体の生成および精製。)
R15E6は重鎖および軽鎖を含有する150kDaの抗体である。抗体の16個の異なるヒト化変種を、表12に示すように、重鎖配列と軽鎖配列の異なる組み合わせを使用して合成した。
実施例1に記載されるR15E6ヒト化バリアントを、pVitro DHFR3哺乳動物発現ベクターにクローニングした。中規模の一過性トランスフェクション発現分析を実施してCHO細胞からの発現収量を決定した。懸濁物に適応したCHO細胞を、500mLの通気フラスコ中の8mMのL-グルタミンおよび10mL/Lのヒポキサンチン/チミジンを補充したPro CHO4無血清培地中で、37℃、150rpmにて85%COで2.0~3.0×10細胞/mLにて培養した。各構築物のマキシプレップ(Maxi-prep)を、Nucleobond pc500キットを使用して、製造業者の指示に従って調製した。ベクターDNAを、NanoDrop Lite(商標)分光光度計を使用して定量化した。
1.0×10細胞/mLの最終密度にて100mLの細胞を、500mLの通気フラスコ中の8mMのL-グルタミンおよび10mL/Lのヒポキサンチン/チミジンを補充したPro CHO5無血清培地中で、1.25μg/mLのプラスミドDNAを用いて一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした培養物を、37℃、150rpmにて85%COで8~11日間インキュベートし、その後、4,000rpm、4℃にて40分間、遠心分離により採取した。
遠心分離後、培地を、0.8μmの酢酸セルロースフィルターを通して濾過した。各バッチを、Amersham Biosciences AKTAクロマトグラフィーシステムを使用して精製した。発現したヒト化抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。1mLのHiTrapプロテインAカラムを全てのヒト化抗体精製のために使用した。全ての精製は、Fusion Antibodies所内の洗浄および溶出緩衝液を使用して実施した。タンパク質をカラムに充填した後、あらゆる結合した抗体を、グリシン/トリス緩衝液(pH3)を使用して溶出した。溶出した1mL画分の全てを100μLのトリス緩衝液(pH8.5)により中和した。溶出ピークに対応する溶出画分を、PBS中での一晩の透析のために選択した。透析後、抗体の濃度をNanoDrop Lite(商標)分光光度計により測定した。
(実施例7:ヒトVE-PTP(HPTP-β)に対するヒト化抗体の評価。)
ヒト化抗体の試料を還元および非還元SDS-PAGE(図13)によって分析して、重鎖および軽鎖の存在ならびに抗体の純度を決定した。マウス/ヒトキメラ抗体、HC0LC0は、ネズミ重鎖および軽鎖可変領域のヒトFc領域との融合によってR15E6に由来した。両方のSDS-PAGEゲルにおいて、レーン1:SeeBlue Plus2予め染色したタンパク質標準物;レーン2:HC0LC0 #1;レーン3:HC1LC1 #2;レーン4:HC1LC2 #1;レーン5:HC1LC3 #1;レーン6:HC1LC3 #2;レーン7:HC1LC4 #1;レーン8:HC2LC1 #1;レーン9:HC2LC2 #1;レーン10:HC2LC3 #1;レーン11:HC2LC3 #2;レーン12:HC2LC4 #1;レーン13:HC3LC1 #1;レーン14:HC3LC2 #1;レーン15:HC3LC3 #1;レーン16:HC3LC4 #1;レーン17:HC4LC1 #1;レーン18:HC4LC1 #2;レーン19:HC4LC2 #1;レーン20:HC4LC3 #1;レーン21:HC4LC3 #2;レーン22:HC4LC4 #1;レーン23:HC4LC4 #2;およびレーン24:SeeBlue Plus2予め染色したタンパク質標準物。SDS-PAGEゲル分析により、全ての分析試料の高純度が示された。還元SDS-PAGEにおいて、重鎖および軽鎖は目に見え、重鎖については50kDa、軽鎖については25kDaの推定分子量である。非還元SDS-PAGEにおいて、遊離重鎖も遊離軽鎖も、それぞれおよそ50kDaまたは25kDaにて観察されなかった。ゲルは、全てのHC4バリアントならびにHC1LC3、HC2LC3およびHC3LC3バリアントについて低量のタンパク質を示す。
精製したR15E6を、NanoDrop Lite(商標)分光光度計を使用して、280nmでのIgGについての標準基準として13.7の吸光係数を使用して定量化した。表16はSDS-PAGE分析の結果をまとめている。SDS-PAGE分析と一致して、重鎖の4個のバリアントの全ては抗体をほとんどまたは全く発現しなかった。
Figure 0007107914000018
(実施例8:ヒトVE-PTP(HPTP-β)、カニクイザルVE-PTP(cyno PTP-β)、およびヒトHPTP-ηに対するR15E6およびヒト化バリアントの選択性。)
ハイブリドーマ由来の抗体を含有する組織培養上清を、標的ヒトVE-PTP(ヒトベータ1/2ECD)、cyno VE-PTP(Cynoベータ)、およびヒトHPTP-η(ヒトエータ)に対して試験して、ELISAによって結合親和性を決定した。
ヒトHPTP-β、cyno PTPβ、およびヒトHPTP-ηを独立に産生し、HEK293細胞を使用して精製した。HEK293細胞を振盪フラスコ中に播種して24時間置いた後、種特異的VE-PTPまたはHPTP-ηを発現するプラスミドをトランスフェクトした。HEK293細胞を、無血清の化学的に定義された培地を使用して成長させた。種特異的VE-PTPまたはHPTP-η構築物についてのDNAを、HEK293の30mLの懸濁物に一過性にトランスフェクトした。24時間後、細胞を計数して、細胞の生存度を評価し、生存細胞数を決定した。一過性トランスフェクションプロセスの間中、さらなる読み取りを行った。一過性トランスフェクションの5日目に細胞培養物を採取した。一過性トランスフェクションから採取した馴化培地上清を遠心分離によって清澄化した。上清を、0.2μmのメンブレンフィルターを使用して濾過した。次いでタンパク質を抗Hisタグアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製後、タンパク質のPBS(pH7.4)への緩衝液交換を実施した。次いで、SDS-ゲルキャピラリー電気泳動(CE-SDS)分析を実施し、タンパク質を精製した。DNAプラスミド挿入物のアミノ酸配列、DNAプラスミド挿入物、および対応する野生型配列を以下の表15に示す。タンパク質配列のシグナルペプチドには下線が引かれている。
Figure 0007107914000019
Figure 0007107914000020
Figure 0007107914000021
Figure 0007107914000022
Figure 0007107914000023
Figure 0007107914000024
Figure 0007107914000025
Figure 0007107914000026
Figure 0007107914000027
Figure 0007107914000028
HPTP-β、cyno PTP-β、およびHPTP-ηタンパク質を、コーティング緩衝液(pH9.4)中のELISAプレート上にコーティングした。各タンパク質を、50mMの炭酸塩-重炭酸塩中の1μg/mLのタンパク質ストックとして調製した。コーティングしたタンパク質を、滅菌透明ポリスチレン平底96ウェルプレートに100μL/ウェルの体積にてアリコートに分けた。プレートを4℃にて一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、プレートを200μL/ウェルの1×PBS-T(0.05%Tween 20を含むPBS)により3回洗浄した。免疫化タンパク質はヒトVE-PTP(HPTP-β)であった。次いでプレートを、PBS-T中の5%ブロッティンググレードブロッカー脱脂粉乳200μL/ウェルによりブロックし、室温にて1時間インキュベートした。
一次抗体試料を、PBS中の5%ブロッティンググレードブロッカー脱脂粉乳1μg/ウェルを使用して、ヒト化バリアントおよび陰性対照である、抗hCD20-hIgG4S228Pについて調製した。試料を3連で試験した。Fab抗体断片をIgG抗体として処理した。次いでプレートをPBS-Tにより3回洗浄し、100μLの一次抗体調製物を各ウェルに添加した。次いでプレートを室温にて1時間インキュベートした。
ペルオキシダーゼがコンジュゲートし、アフィニティー精製されたロバ抗ヒトIgG特異的二次抗体を、PBS中のブロッティンググレードブロッカー脱脂粉乳中で1:2,000希釈にて希釈することによって二次抗体試料を調製した。次いでプレートをPBS-Tにより3回洗浄し、100μLの二次抗体調製物を各ウェルに添加した。次いでプレートを室温にて1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをPBS-Tにより3回洗浄した。
次いで75μgの1-Step(商標)Ultra TMB-ELISAを各ウェルに添加し、プレートを室温にて5分間発色させた。5分後、50μLの2M硫酸を各ウェルに添加して反応を停止させた。次いでプレートを450nmの吸光度波長にてプレートリーダーにより分析した。
図5は、種特異的VE-PTPおよびHPTP-ηに対してスクリーニングしたR15E6のウェスタンブロットを示す。R15E6はヒトVE-PTP(HPTP-β;レーン1および4)に対して高度に選択的であった。ヒトPTP-ηまたはcyno VE-PTP(cyno PTP-β)への有意な結合は観察されなかった。示された組換えヘキサヒスチジンタグ付きタンパク質(6-His)を、R15E6および市販の6-His抗体を用いて逐次的にプローブした。市販の6-His抗体は全てのタンパク質標的への結合を示し、ヒトVE-PTP(HPTP-β)に対して不十分な選択性を示した。
各ヒト化バリアントを、ELISAを使用して、抗原、ヒトVE-PTP(HPTP-β)に対する親和性について測定した。100mg/ウェルのVE-PTP(HPTP-β)抗原を、4℃にて一晩、コーティング緩衝液(0.5mMのNaCOの添加によってpHを9.6にした0.5mMのNaHCO)中の96ウェルMaxisorpプレート上に固定した。次いでコーティング緩衝液を除去し、200μL/ウェルのブロック溶液(3%w/vセミスキムミルク(semi-skimmed milk)粉末、PBS)を添加し、室温にて2時間撹拌した。プレートをPBS-T(1%v/v Tween20)により4回洗浄した。100μL/ウェルを、PBS-TB(0.05%v/v Tween20、0.5%w/v BSA)中で10,000ng/mLから9.765ng/mLまで連続希釈した精製したR15E6バリアントに添加した。室温にて2時間撹拌した後、プレートをPBS-Tにより4回洗浄した。次いで1:60,000PBSの比にて100μL/ウェルのヤギ抗ヒトHRP(Fc特異的)を添加し、プレートを室温にて撹拌しながらさらに1時間インキュベートした。次いでプレートをPBS-Tにより6回洗浄し、PBS中で1回洗浄した。次に、100μL/ウェルのTMB基質溶液を添加し、37℃にて10分間インキュベートした。1ウェル当たり50μLの1M HClを添加し、プレートを450nmにてTecan Sunriseプレートリーダーにより直ちに読み取った。ELISAの結果を図14~17に示す。HC1、HC2およびHC3バリアントは一般に、キメラHC0LC0抗体と比較して同様の結合特性を示した。HC4バリアントの結合は、HC0LC0と比較して他の重鎖バリアントとの結合よりはるかに低かった(図17)。
各バリアントの試料を、結合親和性を決定するためにBiacore分析によってさらに評価した。抗体結合実験を25℃にてBiacore 3000(商標)により実施した。アッセイ緩衝液:10mM HEPES緩衝液(pH7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%P20(ポリオキシエチレンソルビタン)。再生緩衝液:10mMグリシンHCl(pH1.75)。コンジュゲーション緩衝液:10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)。リガンドを捕捉するために使用した流量は5μL/分であった。動態分析のための流量は50μL/分であった。CM5チップのフローセル1および2を最大量のヤギ抗ヒトIgGによりコーティングした。およそ150RUの試験抗体を、示したようにフローセル2、3、および4上で捕捉した。抗原をチップの上に流した。抗体への抗原の結合をリアルタイムでモニターした。Kを、観察したkonおよびkoff値から決定した。
探索分析(scouting analysis)を、示したように単一の検体濃度を使用して実施した。これらの濃度では、たとえリガンド結合が弱くても結合を観察することができる。フローセル1の応答を、基準を差し引くために使用した。
完全な動態分析を、以下に示した検体の濃度範囲:50、25、12.5、6.25、3.125、および0nMで2倍連続希釈した対照抗体について実施した
表17は、Biacore結合アッセイによって決定した、結合速度(k)、解離速度(k)、最大結合能力(Rmax)、結合定数(K)、および解離定数(K)を含む、VE-PTP(HPTP-β)ECDへの各ヒト化抗体の結合の結合動態パラメータを示す。Rmaxを相対応答(RU)として測定した。ヒト化候補の全ては、マウス/ヒトキメラ抗体、HC0LC0と同様の結合親和性を示した。
Figure 0007107914000029
表18は、ELISAによって決定した、親抗体(R15E6)および不活性対照(IgG4)と比較したヒト化抗体の結合選択性を示す。0.2未満またはそれと等しい値は、結合がないことを示す。ヒト化抗体候補、親R15E6、およびマウス/ヒトキメラ抗体(HC0:LC0)の全ては、ヒトPTP-ηおよびcyno PTP-βへの有意な結合がないことによって示されるように、ヒトVE-PTP(HPTP-β)に対して高い選択性を示した。
Figure 0007107914000030
ヒトVE-PTP(HPTP-β)を標的化するために使用したヒト化抗体は、自己リン酸化によりTie2活性を回復させ、例えば、PI3K-Akt経路におけるタンパク質を含む、下流エフェクターを開始することができる。ヒトVE-PTP(HPTP-β)への抗体の結合を評価することに加えて、これらのエフェクタータンパク質を活性化する抗体の能力を測定した。図18は、ウェスタンブロットによって決定した、ヒト化バリアントによる、Tie2リガンド(例えば、Ang1またはAng2)の非存在下でのTie2(左パネル)およびAkt(右パネル)の活性化を示す。ヒト化バリアントの活性は、親ネズミ抗体R15E6およびキメラ抗体HC0LC0の活性と同様であった。ヒトIgG4を対照として使用した。全ての抗体を50nMにて試験した。各ブロットの上パネルは、Tie2またはAkt活性化を示す、Tie2またはAktのいずれかのリン酸化を示す。Tie2およびAktは、対照抗体で処理した試料よりも、ヒト化抗体で処理した試料においてより高いリン酸化を示し、ヒト化抗体が、リガンドの非存在下でさえTie2およびAktを活性化するのに有効であったことを示した。
図19は、ウェスタンブロットによって決定した、ヒト化抗体、HC2LC4およびHC1LC1による、Tie2リガンド(例えば、Ang1またはAng2)の非存在下でのTie2(上パネル)およびAkt(下パネル)の濃度依存性活性化を示す。Tie2およびAktシグナル伝達活性をヒト化バリアントの低ナノモル濃度にて観察した。各ブロットの上パネルは、Tie2またはAkt活性化を示す、Tie2またはAktのいずれかのリン酸化を示す。Tie2およびAktは、対照抗体で処理した試料において示されたものよりも、ヒト化抗体で処理した試料においてより高いリン酸化を示した。この結果は、ヒト化抗体が、Ang1の非存在下でさえTie2およびAktを活性化するのに有効であったことを示す。
図20は、ウェスタンブロットによって決定した、ヒト化抗体候補、HC2LC4およびHC1LC1による、Ang1およびAng2の存在下でのTie2(左パネル)およびAkt(右パネル)の活性化を示す。HC2LC4およびHC1LC1は、Ang2の存在下でTie2およびAktの両方を活性化し、それぞれTie2およびAktのリン酸化の増加によって示されるように、Ang1媒介性Tie2およびAkt活性化を増強した。全ての抗体を10nMにて試験した。
図21は、ウェスタンブロットによって決定した、ヒト化抗体候補、HC2LC1およびHC2LC4による、Ang1またはAng2の存在下でのTie2(パネルA)、ヒトVE-PTP(HPTP-β)発現(パネルB)、およびAkt(パネルC)の活性化を示す。HC2LC1およびHC2LC4は、Ang1単独、Ang2単独の存在下、ならびにAng1およびAng2の両方の存在下でTie2を活性化した。抗体を15分間プレインキュベートし、次いで600ng/mLの濃度にて10分間、Ang1またはAng2によって刺激した。全ての抗体を10nMにて試験した。
図22は、ヒト化抗体候補、HC2LC1を使用したHUVECにおけるAktの活性化を示す。最初の3つのブロットの上パネルは、漸増濃度のHC2LC1にて、Akt活性化を示す、Aktのリン酸化を示す。結合親和性試験と一致して、HC2LC1は抗体のナノモル濃度にてAktを活性化した。HC2LC1によるAkt活性化は、ヒトVE-PTP(HPTP-β)細胞外ドメイン(βECD 6HisおよびβECD Fc)との抗体のプレインキュベーションによってブロックされた。この結果は、HC2LC1媒介性Akt活性化が、ヒトVE-PTP(HPTP-β)細胞外ドメインへのHC2LC1結合を介して生じることを示す。
図23は、親抗体、R15E6、およびmIgG1対照と比較して、ヒト化抗体候補HC2LC1およびHC0LC0を使用した、血清飢餓HUVECにおける向上した生存度を示す。
実施形態
実施形態1.配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12と少なくとも80%同一である配列を含む化合物。
実施形態2.配列が、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12と少なくとも85%同一である、実施形態1の化合物。
実施形態3.配列が、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12と少なくとも90%同一である、実施形態1~2のいずれか1つの化合物。
実施形態4.配列が、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12と少なくとも95%同一である、実施形態1~3のいずれか1つの化合物。
実施形態5.配列が、配列番号9と少なくとも80%同一である、実施形態1の化合物。
実施形態6.配列が配列番号9である、実施形態1~5のいずれか1つの化合物。
実施形態7.配列が、配列番号10と少なくとも80%同一である、実施形態1の化合物。
実施形態8.配列が配列番号10である、実施形態1~4および7のいずれか1つの化合物。
実施形態9.配列が、配列番号11と少なくとも80%同一である、実施形態1の化合物。
実施形態10.配列が配列番号11である、実施形態1~4および9のいずれか1つの化合物。
実施形態11.配列が、配列番号12と少なくとも80%同一である、実施形態1の化合物。
実施形態12.配列が配列番号12である、実施形態1~4および11のいずれか1つの化合物。
実施形態13.配列が、配列番号29と少なくとも80%同一である、実施形態1の化合物。
実施形態14.配列が配列番号29である、実施形態1の化合物。
実施形態15.配列が、配列番号30と少なくとも80%同一である、実施形態1の化合物。
実施形態16.配列が配列番号30である、実施形態1の化合物。
実施形態17.配列が、配列番号31と少なくとも80%同一である、実施形態1の化合物。
実施形態18.配列が配列番号31である、実施形態1の化合物。
実施形態19.配列が、配列番号32と少なくとも80%同一である、実施形態1の化合物。
実施形態20.配列が配列番号32である、実施形態1の化合物。
実施形態21.チロシンホスファターゼを阻害する、実施形態1~20のいずれか1つの化合物。
実施形態22.HPTP-βを阻害する、実施形態1~21のいずれか1つの化合物。
実施形態23.VE-PTPを阻害する、実施形態1~22のいずれか1つの化合物。
実施形態24.Tie2を活性化する、実施形態1~23のいずれか1つの化合物。
実施形態25.Aktを活性化する、実施形態1~24のいずれか1つの化合物。
実施形態26.HPTP-βの細胞外ドメインに結合する、実施形態1~25のいずれか1つの化合物。
実施形態27.HPTP-βの細胞外ドメインの最初のFN3リピートに結合する、実施形態1~26のいずれか1つの化合物。
実施形態28.HPTP-βの細胞外ドメインに対する化合物の結合親和性(K)が約70pM~約70nMである、実施形態1~27のいずれか1つの化合物。
実施形態29.配列番号20、配列番号21、配列番号22または配列番号23と少なくとも80%同一である配列を含む化合物。
実施形態30.配列が、配列番号20、配列番号21、配列番号22または配列番号23と少なくとも85%同一である、実施形態29の化合物。
実施形態31.配列が、配列番号20、配列番号21、配列番号22または配列番号23と少なくとも90%同一である、実施形態29~30のいずれか1つの化合物。
実施形態32.配列が、配列番号20、配列番号21、配列番号22または配列番号23と少なくとも95%同一である、実施形態29~31のいずれか1つの化合物。
実施形態33.配列が、配列番号20と少なくとも80%同一である、実施形態29の化合物。
実施形態34.配列が配列番号20である、実施形態29~33のいずれか1つの化合物。
実施形態35.配列が、配列番号21と少なくとも80%同一である、実施形態29の化合物。
実施形態36.配列が配列番号21である、実施形態29~32および35のいずれか1つの化合物。
実施形態37.配列が、配列番号22と少なくとも80%同一である、実施形態29の化合物。
実施形態38.配列が配列番号22である、実施形態29~32および37のいずれか1つの化合物。
実施形態39.配列が、配列番号23と少なくとも80%同一である、実施形態29の化合物。
実施形態40.配列が配列番号23である、実施形態29~32および39のいずれか1つの化合物。
実施形態41.配列が、配列番号34と少なくとも80%同一である、実施形態29の化合物。
実施形態42.配列が配列番号34である、実施形態29の化合物。
実施形態43.配列が、配列番号35と少なくとも80%同一である、実施形態29の化合物。
実施形態44.配列が配列番号35である、実施形態29の化合物。
実施形態45.配列が、配列番号36と少なくとも80%同一である、実施形態29の化合物。
実施形態46.配列が配列番号36である、実施形態29の化合物。
実施形態47.配列が、配列番号37と少なくとも80%同一である、実施形態29の化合物。
実施形態48.配列が配列番号37である、実施形態29の化合物。
実施形態49.チロシンホスファターゼを阻害する、実施形態29~48のいずれか1つの化合物。
実施形態50.HPTP-βを阻害する、実施形態29~49のいずれか1つの化合物。
実施形態51.VE-PTPを阻害する、実施形態29~50のいずれか1つの化合物。
実施形態52.Tie2を活性化する、実施形態29~51のいずれか1つの化合物。
実施形態53.Aktを活性化する、実施形態29~52のいずれか1つの化合物。
実施形態54.HPTP-βの細胞外ドメインに結合する、実施形態29~53のいずれか1つの化合物。
実施形態55.HPTP-βの細胞外ドメインの最初のFN3リピートに結合する、実施形態29~54のいずれか1つの化合物。
実施形態56.HPTP-βの細胞外ドメインに対する化合物の結合親和性(K)が約70pM~約70nMである、実施形態29~55のいずれか1つの化合物。
実施形態57.a)配列番号30と少なくとも80%同一である配列を含む重鎖と、b)配列番号34と少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物。
実施形態58.重鎖が配列番号30と少なくとも85%同一であり、軽鎖が配列番号34と少なくとも85%同一である、実施形態57の化合物。
実施形態59.重鎖が配列番号30と少なくとも90%同一であり、軽鎖が配列番号34と少なくとも90%同一である、実施形態57~58のいずれか1つの化合物。
実施形態60.重鎖が配列番号30と少なくとも95%同一であり、軽鎖が配列番号34と少なくとも95%同一である、実施形態57~59のいずれか1つの化合物。
実施形態61.重鎖が配列番号30であり、軽鎖が配列番号34である、実施形態57~60のいずれか1つの化合物。
実施形態62.チロシンホスファターゼを阻害する、実施形態57~61のいずれか1つの化合物。
実施形態63.HPTP-βを阻害する、実施形態57~62のいずれか1つの化合物。
実施形態64.VE-PTPを阻害する、実施形態57~63のいずれか1つの化合物。
実施形態65.Tie2を活性化する、実施形態57~64のいずれか1つの化合物。
実施形態66.Aktを活性化する、実施形態57~65のいずれか1つの化合物。
実施形態67.HPTP-βの細胞外ドメインに結合する、実施形態57~66のいずれか1つの化合物。
実施形態68.HPTP-βの細胞外ドメインの最初のFN3リピートに結合する、実施形態57~67のいずれか1つの化合物。
実施形態69.HPTP-βの細胞外ドメインに対する化合物の結合親和性(K)が約70pM~約70nMである、実施形態57~68のいずれか1つの化合物。
実施形態70.a)配列番号29と少なくとも80%同一である配列を含む重鎖と、b)配列番号35と少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物。
実施形態71.重鎖が配列番号29と少なくとも85%同一であり、軽鎖が配列番号35と少なくとも85%同一である、実施形態70の化合物。
実施形態72.重鎖が配列番号29と少なくとも90%同一であり、軽鎖が配列番号35と少なくとも90%同一である、実施形態70~71のいずれか1つの化合物。
実施形態73.重鎖が配列番号29と少なくとも95%同一であり、軽鎖が配列番号35と少なくとも95%同一である、実施形態70~72のいずれか1つの化合物。
実施形態74.重鎖が配列番号29であり、軽鎖が配列番号35である、実施形態70~73のいずれか1つの化合物。
実施形態75.チロシンホスファターゼを阻害する、実施形態70~74のいずれか1つの化合物。
実施形態76.HPTP-βを阻害する、実施形態70~75のいずれか1つの化合物。
実施形態77.VE-PTPを阻害する、実施形態70~76のいずれか1つの化合物。
実施形態78.Tie2を活性化する、実施形態70~77のいずれか1つの化合物。
実施形態79.Aktを活性化する、実施形態70~78のいずれか1つの化合物。
実施形態80.HPTP-βの細胞外ドメインに結合する、実施形態70~79のいずれか1つの化合物。
実施形態81.HPTP-βの細胞外ドメインの最初のFN3リピートに結合する、実施形態70~80のいずれか1つの化合物。
実施形態82.HPTP-βの細胞外ドメインに対する化合物の結合親和性(K)が約70pM~約70nMである、実施形態70~81のいずれか1つの化合物。
実施形態83.a)配列番号30と少なくとも80%同一である配列を含む重鎖と、b)配列番号37と少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖とを含む化合物。
実施形態84.重鎖が配列番号30と少なくとも85%同一であり、軽鎖が配列番号37と少なくとも85%同一である、実施形態83の化合物。
実施形態85.重鎖が配列番号30と少なくとも90%同一であり、軽鎖が配列番号37と少なくとも90%同一である、実施形態83~84のいずれか1つの化合物。
実施形態86.重鎖が配列番号30と少なくとも95%同一であり、軽鎖が配列番号37と少なくとも95%同一である、実施形態83~85のいずれか1つの化合物。
実施形態87.重鎖が配列番号30であり、軽鎖が配列番号37である、実施形態83~86のいずれか1つの化合物。
実施形態88.チロシンホスファターゼを阻害する、実施形態83~87のいずれか1つの化合物。
実施形態89.HPTP-βを阻害する、実施形態83~88のいずれか1つの化合物。
実施形態90.VE-PTPを阻害する、実施形態83~89のいずれか1つの化合物。
実施形態91.Tie2を活性化する、実施形態83~90のいずれか1つの化合物。
実施形態92.Aktを活性化する、実施形態83~91のいずれか1つの化合物。
実施形態93.HPTP-βの細胞外ドメインに結合する、実施形態83~92のいずれか1つの化合物。
実施形態94.HPTP-βの細胞外ドメインの最初のFN3リピートに結合する、実施形態83~93のいずれか1つの化合物。
実施形態95.HPTP-βの細胞外ドメインに対する化合物の結合親和性(K)が約70pM~約70nMである、実施形態83~94のいずれか1つの化合物。
実施形態96.それを必要とする被験体において状態を処置する方法であって、治療有効量の実施形態1~95のいずれか1つの化合物を被験体に投与するステップを含む、方法。
実施形態97.状態が眼の状態である、実施形態96の方法。
実施形態98.状態が糖尿病性網膜症である、実施形態96または97の方法。
実施形態99.状態が新血管形成である、実施形態96~97のいずれか1つの方法。
実施形態100.状態が血管漏出である、実施形態96~97のいずれか1つの方法。
実施形態101.状態が眼内圧上昇である、実施形態96~97のいずれか1つの方法。
実施形態102.状態が眼の浮腫である、実施形態96~97のいずれか1つの方法。
実施形態103.状態が糖尿病性黄斑浮腫である、実施形態96または97の方法。
実施形態104.状態が高眼圧症である、実施形態96または97のいずれか1つの方法。
実施形態105.状態が眼の炎症である、実施形態96または97の方法。
実施形態106.投与が被験体の眼に対するものである、実施形態96~105のいずれか1つの方法。
実施形態107.投与が硝子体内である、実施形態96~106のいずれか1つの方法。
実施形態108.投与が皮下である、実施形態96~105のいずれか1つの方法。
実施形態109.投与が局所である、実施形態96~106のいずれか1つの方法。
実施形態110.被験体がヒトである、実施形態96~109のいずれか1つの方法。
実施形態111.化合物の治療有効量が、約0.25mg~約200mgである、実施形態96~110のいずれか1つの方法。
実施形態112.化合物の治療有効量が、約1mg/kg~約10mg/kgである、実施形態96~110のいずれか1つの方法。
実施形態113.化合物の治療有効量が、約1mg~約50mgである、実施形態96~110のいずれか1つの方法。
実施形態114.化合物の治療有効量が、約50mg~約200mgである、実施形態96~110のいずれか1つの方法。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12と少なくとも80%同一である配列を含む化合物。
(項目2)
前記配列が、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12と少なくとも85%同一である、項目1に記載の化合物。
(項目3)
前記配列が、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12と少なくとも90%同一である、項目1に記載の化合物。
(項目4)
前記配列が、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12と少なくとも95%同一である、項目1に記載の化合物。
(項目5)
前記配列が、配列番号9と少なくとも80%同一である、項目1に記載の化合物。
(項目6)
前記配列が配列番号9である、項目1に記載の化合物。
(項目7)
前記配列が、配列番号10と少なくとも80%同一である、項目1に記載の化合物。
(項目8)
前記配列が配列番号10である、項目1に記載の化合物。
(項目9)
前記配列が、配列番号11と少なくとも80%同一である、項目1に記載の化合物。
(項目10)
前記配列が配列番号11である、項目1に記載の化合物。
(項目11)
前記配列が、配列番号12と少なくとも80%同一である、項目1に記載の化合物。
(項目12)
前記配列が配列番号12である、項目1に記載の化合物。
(項目13)
前記配列が、配列番号29と少なくとも80%同一である、項目1に記載の化合物。
(項目14)
前記配列が配列番号29である、項目1に記載の化合物。
(項目15)
前記配列が、配列番号30と少なくとも80%同一である、項目1に記載の化合物。
(項目16)
前記配列が配列番号30である、項目1に記載の化合物。
(項目17)
前記配列が、配列番号31と少なくとも80%同一である、項目1に記載の化合物。
(項目18)
前記配列が配列番号31である、項目1に記載の化合物。
(項目19)
前記配列が、配列番号32と少なくとも80%同一である、項目1に記載の化合物。
(項目20)
前記配列が配列番号32である、項目1に記載の化合物。
(項目21)
チロシンホスファターゼを阻害する、項目1に記載の化合物。
(項目22)
HPTP-βを阻害する、項目1に記載の化合物。
(項目23)
VE-PTPを阻害する、項目1に記載の化合物。
(項目24)
Tie2を活性化する、項目1に記載の化合物。
(項目25)
Aktを活性化する、項目1に記載の化合物。
(項目26)
HPTP-βの細胞外ドメインに結合する、項目1に記載の化合物。
(項目27)
HPTP-βの細胞外ドメインの最初のFN3リピートに結合する、項目1に記載の化合物。
(項目28)
HPTP-βの細胞外ドメインに対する前記化合物の結合親和性(K )が約70pM~約70nMである、項目1に記載の化合物。
(項目29)
配列番号20、配列番号21、配列番号22または配列番号23と少なくとも80%同一である配列を含む化合物。
(項目30)
前記配列が、配列番号20、配列番号21、配列番号22または配列番号23と少なくとも85%同一である、項目29に記載の化合物。
(項目31)
前記配列が、配列番号20、配列番号21、配列番号22または配列番号23と少なくとも90%同一である、項目29に記載の化合物。
(項目32)
前記配列が、配列番号20、配列番号21、配列番号22または配列番号23と少なくとも95%同一である、項目29に記載の化合物。
(項目33)
前記配列が、配列番号20と少なくとも80%同一である、項目29に記載の化合物。
(項目34)
前記配列が配列番号20である、項目29に記載の化合物。
(項目35)
前記配列が、配列番号21と少なくとも80%同一である、項目29に記載の化合物。
(項目36)
前記配列が配列番号21である、項目29に記載の化合物。
(項目37)
前記配列が、配列番号22と少なくとも80%同一である、項目29に記載の化合物。
(項目38)
前記配列が配列番号22である、項目29に記載の化合物。
(項目39)
前記配列が、配列番号23と少なくとも80%同一である、項目29に記載の化合物。
(項目40)
前記配列が配列番号23である、項目29に記載の化合物。
(項目41)
前記配列が、配列番号34と少なくとも80%同一である、項目29に記載の化合物。
(項目42)
前記配列が配列番号34である、項目29に記載の化合物。
(項目43)
前記配列が、配列番号35と少なくとも80%同一である、項目29に記載の化合物。
(項目44)
前記配列が配列番号35である、項目29に記載の化合物。
(項目45)
前記配列が、配列番号36と少なくとも80%同一である、項目29に記載の化合物。
(項目46)
前記配列が配列番号36である、項目29に記載の化合物。
(項目47)
前記配列が、配列番号37と少なくとも80%同一である、項目29に記載の化合物。
(項目48)
前記配列が配列番号37である、項目29に記載の化合物。
(項目49)
チロシンホスファターゼを阻害する、項目29に記載の化合物。
(項目50)
HPTP-βを阻害する、項目29に記載の化合物。
(項目51)
VE-PTPを阻害する、項目29に記載の化合物。
(項目52)
Tie2を活性化する、項目29に記載の化合物。
(項目53)
Aktを活性化する、項目29に記載の化合物。
(項目54)
HPTP-βの細胞外ドメインに結合する、項目29に記載の化合物。
(項目55)
HPTP-βの細胞外ドメインの最初のFN3リピートに結合する、項目29に記載の化合物。
(項目56)
HPTP-βの細胞外ドメインに対する前記化合物の結合親和性(K )が約70pM~約70nMである、項目29に記載の化合物。
(項目57)
a)配列番号30と少なくとも80%同一である配列を含む重鎖と、
b)配列番号34と少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖と
を含む、化合物。
(項目58)
前記重鎖が配列番号30と少なくとも85%同一であり、前記軽鎖が配列番号34と少なくとも85%同一である、項目57に記載の化合物。
(項目59)
前記重鎖が配列番号30と少なくとも90%同一であり、前記軽鎖が配列番号34と少なくとも90%同一である、項目57に記載の化合物。
(項目60)
前記重鎖が配列番号30と少なくとも95%同一であり、前記軽鎖が配列番号34と少なくとも95%同一である、項目57に記載の化合物。
(項目61)
前記重鎖が配列番号30であり、前記軽鎖が配列番号34である、項目57に記載の化合物。
(項目62)
チロシンホスファターゼを阻害する、項目57に記載の化合物。
(項目63)
HPTP-βを阻害する、項目57に記載の化合物。
(項目64)
VE-PTPを阻害する、項目57に記載の化合物。
(項目65)
Tie2を活性化する、項目57に記載の化合物。
(項目66)
Aktを活性化する、項目57に記載の化合物。
(項目67)
HPTP-βの細胞外ドメインに結合する、項目57に記載の化合物。
(項目68)
HPTP-βの細胞外ドメインの最初のFN3リピートに結合する、項目57に記載の化合物。
(項目69)
HPTP-βの細胞外ドメインに対する前記化合物の結合親和性(K )が約70pM~約70nMである、項目57に記載の化合物。
(項目70)
a)配列番号29と少なくとも80%同一である配列を含む重鎖と、
b)配列番号35と少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖と
を含む、化合物。
(項目71)
前記重鎖が配列番号29と少なくとも85%同一であり、前記軽鎖が配列番号35と少なくとも85%同一である、項目70に記載の化合物。
(項目72)
前記重鎖が配列番号29と少なくとも90%同一であり、前記軽鎖が配列番号35と少なくとも90%同一である、項目70に記載の化合物。
(項目73)
前記重鎖が配列番号29と少なくとも95%同一であり、前記軽鎖が配列番号35と少なくとも95%同一である、項目70に記載の化合物。
(項目74)
前記重鎖が配列番号29であり、前記軽鎖が配列番号35である、項目70に記載の化合物。
(項目75)
チロシンホスファターゼを阻害する、項目70に記載の化合物。
(項目76)
HPTP-βを阻害する、項目70に記載の化合物。
(項目77)
VE-PTPを阻害する、項目70に記載の化合物。
(項目78)
Tie2を活性化する、項目70に記載の化合物。
(項目79)
Aktを活性化する、項目70に記載の化合物。
(項目80)
HPTP-βの細胞外ドメインに結合する、項目70に記載の化合物。
(項目81)
HPTP-βの細胞外ドメインの最初のFN3リピートに結合する、項目70に記載の化合物。
(項目82)
HPTP-βの細胞外ドメインに対する前記化合物の結合親和性(K )が約70pM~約70nMである、項目70に記載の化合物。
(項目83)
a)配列番号30と少なくとも80%同一である配列を含む重鎖と、
b)配列番号37と少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖と
を含む、化合物。
(項目84)
前記重鎖が配列番号30と少なくとも85%同一であり、前記軽鎖が配列番号37と少なくとも85%同一である、項目83に記載の化合物。
(項目85)
前記重鎖が配列番号30と少なくとも90%同一であり、前記軽鎖が配列番号37と少なくとも90%同一である、項目83に記載の化合物。
(項目86)
前記重鎖が配列番号30と少なくとも95%同一であり、前記軽鎖が配列番号37と少なくとも95%同一である、項目83に記載の化合物。
(項目87)
前記重鎖が配列番号30であり、前記軽鎖が配列番号37である、項目83に記載の化合物。
(項目88)
チロシンホスファターゼを阻害する、項目83に記載の化合物。
(項目89)
HPTP-βを阻害する、項目83に記載の化合物。
(項目90)
VE-PTPを阻害する、項目83に記載の化合物。
(項目91)
Tie2を活性化する、項目83に記載の化合物。
(項目92)
Aktを活性化する、項目83に記載の化合物。
(項目93)
HPTP-βの細胞外ドメインに結合する、項目83に記載の化合物。
(項目94)
HPTP-βの細胞外ドメインの最初のFN3リピートに結合する、項目83に記載の化合物。
(項目95)
HPTP-βの細胞外ドメインに対する前記化合物の結合親和性(K )が約70pM~約70nMである、項目83に記載の化合物。
(項目96)
状態の処置を必要とする被験体において状態を処置する方法であって、治療有効量の項目1~95のいずれか一項に記載の化合物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
(項目97)
前記状態が眼の状態である、項目96に記載の方法。
(項目98)
前記状態が糖尿病性網膜症である、項目96に記載の方法。
(項目99)
前記状態が新血管形成である、項目96に記載の方法。
(項目100)
前記状態が血管漏出である、項目96に記載の方法。
(項目101)
前記状態が眼内圧上昇である、項目96に記載の方法。
(項目102)
前記状態が眼の浮腫である、項目96に記載の方法。
(項目103)
前記状態が糖尿病性黄斑浮腫である、項目96に記載の方法。
(項目104)
前記状態が高眼圧症である、項目96に記載の方法。
(項目105)
前記状態が眼の炎症である、項目96に記載の方法。
(項目106)
前記投与が前記被験体の眼に対するものである、項目96に記載の方法。
(項目107)
前記投与が硝子体内である、項目96に記載の方法。
(項目108)
前記投与が皮下である、項目96に記載の方法。
(項目109)
前記投与が局所である、項目96に記載の方法。
(項目110)
前記被験体がヒトである、項目96に記載の方法。
(項目111)
前記化合物の前記治療有効量が、約0.25mg~約200mgである、項目96に記載の方法。
(項目112)
前記化合物の前記治療有効量が、約1mg/kg~約10mg/kgである、項目96に記載の方法。
(項目113)
前記化合物の前記治療有効量が、約1mg~約50mgである、項目96に記載の方法。
(項目114)
前記化合物の前記治療有効量が、約50mg~約200mgである、項目96に記載の方法。

Claims (41)

  1. a)配列番号54であるCDR-H1配列、配列番号55であるCDR-H2配列および配列番号56であるCDR-H3配列を含む重鎖であって、CDR-H1配列、CDR-H2配列、およびCDR-H3配列は、配列番号9~11のいずれか1つと少なくとも91%同一である配列内に含まれている、重鎖、ならびに
    b)配列番号57であるCDR-L1配列、配列番号58であるCDR-L2配列および配列番号59であるCDR-L3配列を含む軽鎖
    を含む、抗体であって、前記抗体がヒトプロテインチロシンホスファターゼ-ベータ(HPTP-β)に結合する、抗体。
  2. 前記抗体がHPTP-βを阻害する、請求項1に記載の抗体。
  3. 前記抗体がHPTP-βの細胞外ドメインの第1のフィブロネクチンIII型(FN3)リピートに結合する、請求項1または2に記載の抗体。
  4. CDR-H1配列、CDR-H2配列、およびCDR-H3配列は、配列番号9~11のいずれか1つである配列内に含まれている、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体。
  5. CDR-H1配列、CDR-H2配列、およびCDR-H3配列は、配列番号9と少なくとも91%同一である配列内に含まれている、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体。
  6. CDR-H1配列、CDR-H2配列、およびCDR-H3配列は、配列番号10と少なくとも91%同一である配列内に含まれている、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体。
  7. CDR-H1配列、CDR-H2配列、およびCDR-H3配列は、配列番号11と少なくとも91%同一である配列内に含まれている、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体。
  8. a)配列番号54であるCDR-H1配列、配列番号55であるCDR-H2配列および配列番号56であるCDR-H3配列を含む重鎖、ならびに
    b)配列番号57であるCDR-L1配列、配列番号58であるCDR-L2配列および配列番号59であるCDR-L3配列を含む軽鎖であって、CDR-L1配列、CDR-L2配列、およびCDR-L3配列は、配列番号20~23のいずれか1つと少なくとも90%同一である配列内に含まれている、軽鎖
    を含む、抗体であって、前記抗体がHPTP-βに結合する、抗体。
  9. 前記抗体がHPTP-βを阻害する、請求項8に記載の抗体。
  10. 前記抗体がHPTP-βの細胞外ドメインの第1のFN3リピートに結合する、請求項8または9に記載の抗体。
  11. CDR-L1配列、CDR-L2配列、およびCDR-L3配列は、配列番号20~23のいずれか1つである配列内に含まれている、請求項8~10のいずれか一項に記載の抗体。
  12. CDR-L1配列、CDR-L2配列、およびCDR-L3配列は、配列番号20と少なくとも90%同一である配列内に含まれている、請求項8~10のいずれか一項に記載の抗体。
  13. CDR-L1配列、CDR-L2配列、およびCDR-L3配列は、配列番号21と少なくとも90%同一である配列内に含まれている、請求項8~10のいずれか一項に記載の抗体。
  14. CDR-L1配列、CDR-L2配列、およびCDR-L3配列は、配列番号22と少なくとも90%同一である配列内に含まれている、請求項8~10のいずれか一項に記載の抗体。
  15. CDR-L1配列、CDR-L2配列、およびCDR-L3配列は、配列番号23と少なくとも90%同一である配列内に含まれている、請求項8~10のいずれか一項に記載の抗体。
  16. 治療有効量の請求項1~15のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  17. 眼科投与のために製剤化される、請求項16に記載の医薬組成物。
  18. 硝子体内投与のために製剤化される、請求項16に記載の医薬組成物。
  19. 静脈内投与のために製剤化される、請求項16に記載の医薬組成物。
  20. 皮下投与のために製剤化される、請求項16に記載の医薬組成物。
  21. 局所投与のために製剤化される、請求項16に記載の医薬組成物。
  22. 前記抗体の前記治療有効量が、約0.25mg~約200mgである、請求項16~21のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 前記抗体の前記治療有効量が、約1mg~約50mgである、請求項16~21のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  24. 状態の処置を必要とする被験体の状態を処置するための、請求項16~23のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  25. 前記被験体が糖尿病性網膜症を有する、請求項24に記載の医薬組成物。
  26. 前記被験体が増殖網膜症、請求項24に記載の医薬組成物。
  27. 前記被験体が新血管新生を有する、請求項24に記載の医薬組成物。
  28. 前記被験体が血管漏出を有する、請求項24に記載の医薬組成物。
  29. 前記被験体が眼内圧上昇を有する、請求項24に記載の医薬組成物。
  30. 前記被験体が緑内障を有する、請求項24に記載の医薬組成物。
  31. 前記被験体が眼の浮腫を有する、請求項24に記載の医薬組成物。
  32. 前記被験体が糖尿病性黄斑浮腫を有する、請求項24に記載の医薬組成物。
  33. 前記被験体が高眼圧症を有する、請求項24に記載の医薬組成物。
  34. 前記被験体が眼の炎症を有する、請求項24に記載の医薬組成物。
  35. 前記医薬組成物が前記被験体の眼に投与されることを特徴とする、請求項24~34のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  36. 前記医薬組成物が硝子体内投与されることを特徴とする、請求項24~34のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  37. 前記医薬組成物が皮下投与されることを特徴とする、請求項24~34のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  38. 前記医薬組成物が静脈内投与されることを特徴とする、請求項24~34のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  39. 前記医薬組成物が局所投与されることを特徴とする、請求項24~34のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  40. 前記抗体の前記治療有効量が、前記被験体の約1mg/kg~約10mg/kgである、請求項24~39のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  41. 前記被験体がヒトである、請求項24~40のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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