JP2017532953A - 抗ｖａｓａ抗体、ならびにその産生法および使用法 - Google Patents

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Abstract

高アフィニティでＶＡＳＡに特異的に結合する抗ＶＡＳＡ抗体（ｍＡｂ）、特にヒト化ｍＡｂを開示する。これらの抗ＶＡＳＡ ｍＡｂの軽鎖および重鎖のＣＤＲのアミノ酸配列、ならびにこれらのＣＤＲのコンセンサス配列を提供する。該開示はまた、抗ＶＡＳＡ ｍＡｂをコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、抗ＶＡＳＡ ｍＡｂを作製するための方法、および抗ＶＡＳＡ ｍＡｂを発現するための方法も提供する。最後に、抗ＶＡＳＡ ｍＡｂを用いて、ＶＡＳＡを発現している細胞を単離し、そして／または精製する方法を開示する。

Description

[0001]本出願は、米国仮出願第６２／０５１，１３０号、２０１４年９月１６日出願、および米国仮出願第６２／０８９，０５４号、２０１４年１２月８日出願の優先権の恩典を請求し、該出願の全内容はその全体が本明細書に援用される。
発明の分野
[0002]本開示は、一般的に、抗体、その産生および使用に関する。特に、本開示は、ヒトＶＡＳＡタンパク質に特異的に結合する抗体、こうした抗体を産生する方法、ならびにこうした抗体を用いた診断法、療法および臨床的方法に関する。
[0003]ＶＡＳＡタンパク質は、ＤＥＡＤファミリーＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼをコードする生殖質の構成要素としてショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で同定された（Ｌｉａｎｇら（１９９４）， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １２０：１２０１−１１； Ｌａｓｋｏら（１９８８）， Ｎａｔｕｒｅ ３３５：６１１−１７）。ＶＡＳＡの分子機能は、生殖細胞確立、卵形成、および翻訳開始に関与するターゲットｍＲＮＡへの結合に関する（Ｇａｖｉｓら（１９９６）， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１０：５２１−２８）。ＶＡＳＡは、極細胞形成に必要とされ、そして発生全体を通じて、生殖細胞系譜にもっぱら制限される。
[0004]Ｖａｓａ相同体遺伝子は、多様な動物種で単離されており、そしてＶＡＳＡは、大部分の動物種において、生殖細胞系譜の分子マーカーとして使用可能である（Ｎｏｃｅら（２００１）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ２６：１３１−３６）。例えば、Ｃａｓｔｒｉｌｌｏｎら（２０００）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９７（１７）：９５８５９０−９５９０は、ヒトＶａｓａ遺伝子が卵巣および精巣で発現されるが、体細胞性組織では検出不能であることを示した。
[0005]哺乳動物卵巣の体細胞組織における卵原幹細胞または卵巣幹細胞（ＯＳＣ）または卵前駆細胞としても知られる哺乳動物雌性生殖系列幹細胞の存在は、Ｊｏｈｎｓｏｎら（２００４）， Ｎａｔｕｒｅ ４２８：１４５−５０に最初に記載され、そして現在、他の研究グループによって確認されている（例えば、Ｚｏｕら（２００９）， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， オンライン公開 ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｃｂ１８６９； Ｔｅｌｆｅｒ ＆ Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ （２０１２）， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８（３）：３５３−４）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）を含む人工的生殖技術（ＡＲＴ）において使用するために、または卵母細胞へのミトコンドリア・トランスファーのための高機能性ミトコンドリアの供給源として、卵母細胞を産生するためのＯＳＣの潜在的な使用、ならびに閉経期の多様な症状を治療するためのＯＳＣの使用が、科学文献および特許文献に記載されてきている（例えば、Ｔｉｌｌｙ ＆ Ｔｅｌｆｅｒ （２００９）， Ｍｏｌ． Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏ． １５（７）：３９３−８； Ｚｏｕら（２００９）、上記； Ｔｅｌｆｅｒ ＆ Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ （２０１２）、上記； Ｗｈｉｔｅら（２０１２）， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８（３）：４１３−２１； ＷＯ ２００５／１２１３２１；米国特許第７，９５５，８４６号；米国特許第８，６５２，８４０号； ＷＯ２０１２／１４２５００；米国特許第８，６４２，３２９号および米国特許第８，６４７，８６９号）。
[0006]Ｊｏｈｎｓｏｎら（２００４）、上記によって、ＯＳＣが最初に特徴付けられた際、該細胞がＶＡＳＡタンパク質を発現することが示され、そしてＶＡＳＡタンパク質に対する抗体は、卵巣組織ホモジネートからＯＳＣを単離するために用いられてきている（例えば、Ｚｏｕら（２００９）、上記； Ｗｈｉｔｅら（２０１２）、上記）。さらに、Ｗｈｉｔｅら（２０１２）、上記は、ＶＡＳＡのＮ末端ドメインに対する抗体を用いて、ＶＡＳＡを発現している生存ＯＳＣを単離することは不可能であるが、Ｃ末端ドメインに対する抗体は、こうした細胞を有効に単離することを示し、Ｎ末端ドメインではなくＣ末端ドメインが細胞外であり、そしてしたがって抗体に対してアクセス可能であることが示唆された。
[0007]抗ＶＡＳＡポリクローナル抗体の産生は、Ｃａｓｔｒｉｌｌｏｎら（２０００）、上記、およびＷＯ０１／３６４４５に最初に記載された。ヒトＶＡＳＡタンパク質のＣ末端部分に対して向けられるポリクローナル抗体は、Ａｂｃａｍ ｐｌｃ（英国ケンブリッジ；製品コードＡＢ１３８４０）、およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（ミネソタ州ミネアポリス；カタログ番号ＡＦ２０３０）より商業的に入手可能であり、そしてヒトＶＡＳＡのＮ末端部分に対して向けられるモノクローナル抗体もまた、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（ミネソタ州ミネアポリス；カタログ番号ＡＦ２０３０）より商業的に入手可能である。
ＷＯ ２００５／１２１３２１ 米国特許第７，９５５，８４６号 米国特許第８，６５２，８４０号 ＷＯ２０１２／１４２５００ 米国特許第８，６４２，３２９号 米国特許第８，６４７，８６９号 ＷＯ０１／３６４４５
Ｌｉａｎｇら（１９９４）， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １２０：１２０１−１１ Ｌａｓｋｏら（１９８８）， Ｎａｔｕｒｅ ３３５：６１１−１７ Ｇａｖｉｓら（１９９６）， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１０：５２１−２８ Ｎｏｃｅら（２００１）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ２６：１３１−３６） Ｃａｓｔｒｉｌｌｏｎら（２０００）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９７（１７）：９５８５９０−９５９０ Ｊｏｈｎｓｏｎら（２００４）， Ｎａｔｕｒｅ ４２８：１４５−５０ Ｚｏｕら（２００９）， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， オンライン公開 ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｃｂ１８６９ Ｔｅｌｆｅｒ ＆ Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ （２０１２）， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８（３）：３５３−４ 、Ｔｉｌｌｙ ＆ Ｔｅｌｆｅｒ （２００９）， Ｍｏｌ． Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏ． １５（７）：３９３−８ Ｗｈｉｔｅら（２０１２）， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８（３）：４１３−２１
[0008]しかし、限定されるわけではないがＯＳＣを含む、ＶＡＳＡを発現している細胞を同定し（例えば免疫組織化学または標識抗体によって）、そして単離する（例えば磁気または蛍光活性化細胞ソーティングによって）ための、ＶＡＳＡのＣ末端細胞外ドメインに対して向けられる高アフィニティ抗体に関する必要性が残っている。
[0009]高アフィニティでＶＡＳＡに特異的に結合する抗ＶＡＳＡ抗体（ｍＡｂ）、特にヒト化ｍＡｂを開示する。これらの抗ＶＡＳＡ ｍＡｂの軽鎖および重鎖のＣＤＲのアミノ酸配列、ならびにこれらのＣＤＲのコンセンサス配列を提供する。該開示はまた、抗ＶＡＳＡ ｍＡｂをコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、抗ＶＡＳＡ ｍＡｂを作製するための方法、および抗ＶＡＳＡ ｍＡｂを発現するための方法も提供する。最後に、抗ＶＡＳＡ ｍＡｂを用いて、ＶＡＳＡを発現している細胞を単離し、そして／または精製する方法を開示する。
[0010]開示のこれらのおよび他の側面および態様を以下に例示し、そして記載する。以下の図および詳細な説明を検証すると、他の系、プロセス、および特徴が、当業者には明らかとなるであろう。こうしたさらなる系、プロセス、および特徴のすべてが本明細書に含まれ、本発明の範囲内にあり、そして付随する請求項によって保護されることが意図される。
[0011]図１は、ＮＰ＿０７７７２６（配列番号１）のＧｅｎＢａｎｋ寄託由来のヒトＶＡＳＡタンパク質アイソフォーム１のアミノ酸配列を提供する。 [0012]図２は、ＮＰ＿００１１３９３５７（配列番号２）のＧｅｎＢａｎｋ寄託由来のマウスＶＡＳＡ相同体タンパク質アイソフォーム１のアミノ酸配列を提供する。 [0013]図３は、ヒトＶＡＳＡタンパク質（配列番号１の残基６９０〜７２４）およびマウスＶＡＳＡ相同体（配列番号２の残基６９１〜７２８）のＣ末端部分の間のアミノ酸整列を提供する。 [0014]図４Ａは、本発明の抗体および対照抗体（ＡＢ１３８４０、Ａｂｃａｍ ｐｌｃ、英国ケンブリッジ）と反応性であるＶＡＳＡ／ＤＤＸ４ポリペプチドのＣ末端ドメイン領域を示し、そして図４Ｂは、ＶＡＳＡタンパク質ならびにＶ１およびＶ２ポリペプチドへの対照抗体の結合を示す。 [0015]図５Ａは、１Ｅ９および１Ａ１２のＶＡＳＡに対するアフィニティの用量反応結合曲線を示し；そして図５Ｂは、ＶＡＳＡ、Ｖ１およびＶ２ペプチドを用いたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示し、これは、１Ｅ９が、商業的に入手可能なウサギポリクローナル抗体（ＡＢ１３８４０、Ａｂｃａｍ ｐｌｃ、英国ケンブリッジ）と同じエピトープに結合することを示唆する。ＮＣ＝陰性対照； ＶＡＳＡ＝配列番号１、残基７００〜７２４； ＶＡＳＡ−１＝Ｖ１または配列番号１、残基７１２〜７２１； ＶＡＳＡ−２＝Ｖ２または配列番号１、残基７００〜７０９。 [0016]図６Ａは、１Ｅ９のＩｇＧおよびｓｃＦｖ−Ｆｃ型のＶＡＳＡに対するアフィニティの用量反応結合曲線を示し；そして図６Ｂは、ＶＡＳＡ、Ｖ１およびＶ２ペプチドと１Ｅ９のＩｇＧおよびｓｃＦｖ−Ｆｃ型の結合のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ＮＣ＝陰性対照； ＶＡＳＡ＝配列番号１、残基７００〜７２４； ＶＡＳＡ−１＝Ｖ１または配列番号１、残基７１２〜７２１； ＶＡＳＡ−２＝Ｖ２または配列番号１、残基７００〜７０９。 [0017]図７Ａは、３つの抗ＶＡＳＡハイブリドーマ抗体（２Ｍ１／１Ｋ３、２Ｍ１／１Ｋ２３および２Ｍ１／１Ｌ５）およびＶＡＳＡ特異的ではない２つの陰性対照（２Ｍ１／１Ｆ５および２Ｍ１／１Ｈ５）を用いた結合実験の結果を示し；図７Ｂは、１Ｅ９−ラムダに比較した、４つのＶＡＳＡ特異的ハイブリドーマ抗体（２Ｍ１／１Ｋ３、２Ｍ１／１Ｋ２３および２Ｍ１／１Ｌ５）の用量反応曲線を示し；そして図７Ｃは、１Ｅ９−ラムダに比較したＶＡＳＡ特異的ハイブリドーマ抗体２Ｍ１／２Ｋ４の用量反応曲線を示す。 [0017]図７Ａは、３つの抗ＶＡＳＡハイブリドーマ抗体（２Ｍ１／１Ｋ３、２Ｍ１／１Ｋ２３および２Ｍ１／１Ｌ５）およびＶＡＳＡ特異的ではない２つの陰性対照（２Ｍ１／１Ｆ５および２Ｍ１／１Ｈ５）を用いた結合実験の結果を示し；図７Ｂは、１Ｅ９−ラムダに比較した、４つのＶＡＳＡ特異的ハイブリドーマ抗体（２Ｍ１／１Ｋ３、２Ｍ１／１Ｋ２３および２Ｍ１／１Ｌ５）の用量反応曲線を示し；そして図７Ｃは、１Ｅ９−ラムダに比較したＶＡＳＡ特異的ハイブリドーマ抗体２Ｍ１／２Ｋ４の用量反応曲線を示す。 [0018]図８は、８つのハイブリドーマ由来の抗ＶＡＳＡ抗体（２Ｍ１／１Ｌ２０、２Ｍ１／１Ｊ２０、１Ｍ１／１Ｃ９、２Ｍ１／１Ｎ３、２Ｍ１／１Ｋ２３、１Ｍ１／１Ｌ５および２Ｍ１／２Ｋ４）に関するサブタイプ決定分析の結果を示す。 [0019]図９Ａ〜９Ｂは、抗ＶＡＳＡ発明のＶＬ配列のいくつかの整列を示す。図は、３つのＣＤＲ領域のおよその位置（太字、下線）および各配列に対応する配列番号を示す。 [0019]図９Ａ〜９Ｂは、抗ＶＡＳＡ発明のＶＬ配列のいくつかの整列を示す。図は、３つのＣＤＲ領域のおよその位置（太字、下線）および各配列に対応する配列番号を示す。 [0019]図９Ａ〜９Ｂは、抗ＶＡＳＡ発明のＶＬ配列のいくつかの整列を示す。図は、３つのＣＤＲ領域のおよその位置（太字、下線）および各配列に対応する配列番号を示す。 [0019]図９Ａ〜９Ｂは、抗ＶＡＳＡ発明のＶＬ配列のいくつかの整列を示す。図は、３つのＣＤＲ領域のおよその位置（太字、下線）および各配列に対応する配列番号を示す。 [0020]図１０Ａ〜１０Ｂは、抗ＶＡＳＡ発明のＶＨ配列のいくつかの整列を示す。図は、３つのＣＤＲ領域のおよその位置（太字、下線）および各配列に対応する配列番号を示す。 [0020]図１０Ａ〜１０Ｂは、抗ＶＡＳＡ発明のＶＨ配列のいくつかの整列を示す。図は、３つのＣＤＲ領域のおよその位置（太字、下線）および各配列に対応する配列番号を示す。 [0020]図１０Ａ〜１０Ｂは、抗ＶＡＳＡ発明のＶＨ配列のいくつかの整列を示す。図は、３つのＣＤＲ領域のおよその位置（太字、下線）および各配列に対応する配列番号を示す。 [0020]図１０Ａ〜１０Ｂは、抗ＶＡＳＡ発明のＶＨ配列のいくつかの整列を示す。図は、３つのＣＤＲ領域のおよその位置（太字、下線）および各配列に対応する配列番号を示す。 [0021]図１１は、図９のＶＬ領域のユニークなＣＤＲ配列の整列を示す。 [0022]図１２は、図１０のＶＨ領域のユニークなＣＤＲ配列の整列を示す。
[0023]本開示は、単離抗体（Ａｂ）、特に高アフィニティでＶＡＳＡに特異的に結合するＡｂに関する。特定の態様において、抗ＶＡＳＡ Ａｂは、特定の重鎖および軽鎖配列由来であり、そして／または特定の構造特徴、例えば特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域を含む。本開示は、単離抗ＶＡＳＡ Ａｂ、こうした抗ＶＡＳＡ Ａｂを作製する方法、こうした抗ＶＡＳＡ Ａｂを含むイムノコンジュゲートおよび二重特異性分子、ならびにこうした抗ＶＡＳＡ Ａｂを発現する方法を提供する。本開示はまた、抗ＶＡＳＡ Ａｂを用いて、哺乳動物雌性生殖系列幹細胞または卵原幹細胞（ＯＳＣ）または卵前駆細胞およびその子孫細胞を含む、ＶＡＳＡを発現する細胞を単離し、そして／または精製する方法にも関する。
[0024]本開示がより容易に理解できるように、特定の用語を定義する。さらなる定義を詳細な説明全体に示す。
定義
[0025]用語「抗体」または略語「Ａｂ」には、本明細書において、天然グリコシル化を伴うまたは伴わない、全抗体および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」またはその一本鎖）が含まれる。完全「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖には、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域が含まれる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖には、軽鎖可変領域（ＶＬ）、および１つのドメイン、ＣＬを含む軽鎖定常領域が含まれる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）にさらに細分割されうる。ＶＨおよびＶＬ領域には、各々、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される、抗原（例えばＶＡＳＡ）と相互作用する、３つのＣＤＲが含まれる。
[0026]用語、抗体の「抗原結合部分」は、本明細書において、抗原（例えばＶＡＳＡ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはそれより多い断片を指す。用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれる結合断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片、および単離ＣＤＲが含まれる。
[0027]用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体調製物」は、本明細書において、単一の重鎖アミノ酸配列および単一の軽鎖アミノ酸配列を有する（が、不均一なグリコシル化を有することも可能である）抗体から本質的になる抗体分子の調製物を指す。
[0028]用語「ヒト化抗体」には、本明細書において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の定常領域および可変領域フレームワーク領域（ＦＲ）を有するが、ＣＤＲを含まない抗体が含まれる。
[0029]用語「組換え抗体」には、本明細書において、組換え手段によって調製され、発現され、生成され、または単離されたすべての抗体が含まれる。特定の態様において、組換え抗体は、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から（例えばトランスフェクトーマから）単離される。他の態様において、組換え抗体は、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーから単離される。組換え抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、任意の他の手段によって、調製され、発現され、生成され、または単離されることも可能である。
[0030]用語「アイソタイプ」は、本明細書において、定常領域遺伝子によってコードされる、重鎖クラス（例えば、ヒト抗体に関してはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）または軽鎖クラス（例えばヒトにおいてカッパまたはラムダ）を指す。用語「サブタイプ」は、サブタイプ内のサブクラス（例えばヒトにおいてＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）を指す。
[0031]句、明記する抗原「に特異的な抗体」は、本明細書において、句、明記する抗原「に特異的に結合する抗体」と交換可能に用いられる。本明細書において、用語「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原複合体の会合速度を指し、そして用語「Ｋｄ」は解離速度を指す。用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａの比から得られ、そしてモル濃度（Ｍ）で表される、解離定数を指す。いくつかの態様にしたがって、「ヒトＶＡＳＡに特異的に結合する」抗体は、５×１０−８Ｍまたはそれ未満、より好ましくは１×１０−８Ｍまたはそれ未満のＫＤで、ヒトＶＡＳＡに結合する抗体を指すよう意図される。
[0032]別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する業の一般的な当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似かまたは同等の方法および材料が、本発明の実施または試験に使用可能であるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が本明細書に援用される。対立する場合、定義を含めて本明細書が統制するであろう。さらに、材料、方法、および例は例示のみであり、そして限定することを意図しない。
抗ＶＡＳＡ抗体
[0033]本発明は、ヒトＶＡＳＡタンパク質、特にＣ末端領域に対して高アフィニティを持つ多様な新規抗体を提供する。抗体は、本明細書に開示する完全ＶＨおよびＶＬ領域を含むことも可能であるし、または本明細書開示のＣＤＲ配列のみを含むことも可能である。さらに、本明細書開示のＣＤＲ配列に基づいて、ＣＤＲ配列の配列モチーフを提供し、そして抗体は、モチーフによって定義されるＣＤＲ配列を含むことも可能である。
[0034]本発明のＣＤＲ配列（図１１および１２に開示されるＣＤＲならびに本明細書開示の配列モチーフによって定義されるＣＤＲの両方を含む）を、当該技術分野に周知の方法にしたがって、他の免疫グロブリン配列と組み合わせて、本発明のＣＤＲによって定義される抗原結合特異性を持つ免疫グロブリン分子を産生することも可能である。
[0035]いくつかの態様において、本発明のＣＤＲを他の抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）および定常ドメイン（ＣＨまたはＣＬ）配列と組み合わせる。例えば、本明細書開示のＣＤＲのいくつかは、ネズミハイブリドーマ由来であり、そしてネズミＦＲおよび定常ドメイン配列を有するが、これらはヒトまたは他の哺乳動物ＦＲおよび定常ドメイン配列と組み合わされて、ヒト化または他の組換え抗体を産生することも可能である。こうした組換え抗体の産生は、当業者に周知であり、そしてルーチンの実験しか必要としない。
[0036]こうした組換え抗体に含まれる定常領域のタイプを、その意図される使用にしたがって選択することも可能である。例えば、抗体が、破壊のためにＶＡＳＡ発現細胞をターゲティングする療法使用のために意図される場合、ＩｇＧサブタイプの重鎖定常ドメイン（すなわちＦｃ領域）を用いることも可能である。抗体が細胞を標識するための試薬（例えば蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）のため）としてのみ意図される場合、完全抗体、抗原結合断片（Ｆａｂ）、一本鎖可変断片（Ｆｓｃ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはさらに非抗体免疫グロブリン分子（例えばＭＨＣ受容体細胞外ドメイン）を、本発明のＣＤＲととともに用いてもよい。
[0037]所定の可変軽（ＶＬ）鎖または可変重（ＶＨ）鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列が、異なる元来のＶＬおよびＶＨ鎖から、異なるＶＬおよびＶＨ ＣＤＲモチーフから、または開示するＣＤＲおよびモチーフの組み合わせから、本発明のＣＤＲを独立に選択することも可能である。しかし、軽鎖ＣＤＲの配列を、開示するＶＬ ＣＤＲまたはＶＬ ＣＤＲモチーフから選択すべきであり、そして重鎖ＣＤＲの配列を、開示するＶＨ ＣＤＲまたはＶＨ ＣＤＲモチーフから選択すべきである。同様に、適切であるように、ＶＬまたはＶＨ鎖に関して、ＣＤＲ１領域の配列を、開示するＣＤＲ１またはＣＤＲ１モチーフ配列から選択すべきであり、ＣＤＲ２領域の配列を、開示するＣＤＲ２またはＣＤＲ２モチーフ配列から選択すべきであり、そしてＣＤＲ３領域の配列を、開示するＣＤＲ３またはＣＤＲ３モチーフ配列から選択すべきである。
細胞を検出するか単離するために抗ＶＡＳＡ抗体を用いる方法
[0038]本発明の抗ＶＡＳＡ抗体を、免疫アフィニティ精製、免疫組織化学および免疫療法の標準法において、しかしＶＡＳＡタンパク質を発現している細胞および組織に対する特異的適用とともに、用いることも可能である。
[0039]例えば、本発明の抗ＶＡＳＡ抗体を用いて、ＶＡＳＡを発現する細胞を一部のみ含む、細胞の混合集団から、ＶＡＳＡを発現する細胞を単離することも可能である。例えば、雌性生殖系列幹細胞または卵原幹細胞またはその前駆細胞が、非常に低い比率で卵巣組織中に存在することが発見されてきている。卵巣組織（例えば卵巣表面上皮および／または皮質）を切除し、個々の細胞に解離させ、そして蛍光標識抗ＶＡＳＡ抗体を用いたＦＡＣｓまたは固定抗ＶＡＳＡ抗体を用いた免疫アフィニティ精製などの技術に供することも可能である。単離ＶＡＳＡ発現細胞は、上述のように、補助生殖技術において、多様な有用性を有する。
[0040]あるいは、本発明の抗ＶＡＳＡ抗体を用いて免疫組織化学を行って、ＶＡＳＡを発現している細胞または組織を同定し、そして／またはこうした細胞におけるＶＡＳＡ発現を定量化することも可能である。
[0041]さらに、本発明の抗ＶＡＳＡ抗体を療法的に用いて、放射または化学毒性部分にコンジュゲート化された本発明の抗ＶＡＳＡ抗体を含む抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または免疫毒素のいずれかによって、破壊のためにＶＡＳＡ発現細胞をターゲティングすることも可能である。また、本発明の抗ＶＡＳＡ抗体の抗体−薬剤コンジュゲートを用いて、ＶＡＳＡ発現細胞に療法薬剤を送達することも可能である。
抗ＶＡＳＡ抗体をコードする核酸分子
[0042]本発明はまた、本発明の抗ＶＡＳＡ抗体をコードする核酸分子も提供する。所望のアミノ酸配列をコードするであろうコドンを選択するための普遍的な遺伝暗号の標準表を用いて、こうした核酸を設計することも可能であるし、または異なる生物に特徴的なコドンバイアスを反映する、特殊化コドン表を用いることも可能である。したがって、例えば、ＣＨＯ細胞における本発明の抗ＶＡＳＡ抗体の発現を最適化するため、ＣＨＯ細胞に関して最適化されたコドン表を用いて、所望の抗体をコードする核酸を設計することも可能である。
[0043]本発明の抗ＶＡＳＡ抗体をコードする核酸は、クローニングベクター（例えば細菌または哺乳動物クローニングベクター）、形質転換ベクター（例えば相同組換え、ウイルス組込みまたは自律複製ベクター）および発現ベクター（例えば高コピー数、誘導性または恒常的哺乳動物発現ベクター）を含む、当該技術分野に知られる非常に多様なベクターが含まれることも可能である。
抗ＶＡＳＡ抗体を発現している細胞
[0044]やはり提供するのは、本発明の抗ＶＡＳＡ抗体をコードする異種配列を発現している宿主細胞である。こうした宿主細胞は、本発明の抗ＶＡＳＡ抗体の商業的産生に有用である可能性もあり、そして適切な宿主細胞を上述の発現ベクターで形質転換することによって産生可能である。
[0045]いくつかの態様において、本発明は、本発明の抗ＶＡＳＡ抗体を発現している、ＣＨＯ細胞を含む、哺乳動物細胞を提供する。しかし、当業者は、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物系を含む、多様な宿主細胞において、抗体を発現させることも可能である。例えば、本明細書にその全体が援用される、Ｖｅｒｍａら（１９９８）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１６（１−２）：１６５−８１を参照されたい。
免疫原ペプチド
[0046]以下のペプチドを免疫原として用いて、ヒトＶＡＳＡのＣ末端ドメインに対する抗体を生成し、そしてＶＡＳＡに対する高アフィニティ結合を持つ抗体に関してスクリーニングした：
ＶＡＳＡ−１（Ｖ１）免疫原：ＳＱＡＰＮＰＶＤＤＥ（配列番号１ 残基７１２〜７２１）
ＶＡＳＡ−２（Ｖ２）免疫原：ＧＫＳＴＬＮＴＡＧＦ（配列番号１ 残基７００〜７０９）
[0047]図３に示すように、これらの免疫原は、ヒトＶＡＳＡタンパク質およびマウスＶＡＳＡ相同体の間で非常に保存されるＶＡＳＡのＣ末端ドメイン由来のアミノ酸配列を含む。
ハイブリドーマ生成
[0048]ハイブリドーマは、ＶＡＳＡペプチド免疫原Ｖ１およびＶ２（上記）を用いた別個の実験において形成された。標準法によって、ペプチドをキャリアータンパク質にコンジュゲート化した。コンジュゲート化ペプチドを用いてマウスを免疫し、そしてコンジュゲート化ペプチドでのブーストを通じて、免疫反応を増加させた。血清中の抗体力価増加期間後、動物を屠殺し、そして脾臓を除去した。単離およびクローニングのため、脾臓Ｂ細胞をマウス融合パートナー細胞株（ＳＰ２−０）に融合させた。限界希釈での外植によってハイブリドーマを形成して、そしてクローニング力価決定実験によって、クローンを発展させた。ＶＡＳＡ反応性抗体の存在をＥＬＩＳＡアッセイによって調べた。限界希釈細胞クローニングでプレーティングした細胞の外植および安定化によって、ハイブリドーマを得た。
[0049]ＶＡＳＡ／ＤＤＸ４ポリペプチドのＣ末端ドメイン領域中のＶＡＳＡ反応性抗体の結合を、結合対照抗体（ＡＢ１３８４０、Ａｂｃａｍ ｐｌｃ、英国ケンブリッジ）と比較して、結合エピトープの類似性を描写した。例示的な結果を図４に示す。
ハイブリドーマの分析
[0050]ハイブリドーマをマウスに腹腔内注射し、そして増殖期間を与えた後、すべて標準法を用いて、腹水を収集し、そして精製し、そして次いで、ＥＬＩＳＡによって分析した。
[0051]ＶＡＳＡ、ＶＡＳＡ−１およびＶＡＳＡ−２ポリペプチドに対する腹水由来抗体の結合を用いて、さらなる分析のため、抗体を選択した。例えば、図７に示すように、４つの抗ＶＡＳＡハイブリドーマ抗体（２Ｍ１／１Ｋ３、２Ｍ１／１Ｋ２３、２Ｍ１／１Ｌ５および２Ｍ１／２Ｋ４）を、ＶＡＳＡ特異的ではない２つの陰性対照（２Ｍ１／１Ｆ５および２Ｍ１／１Ｈ５）に、そして／または１Ｅ９−ラムダ抗体に比較した（以下に記載する）。
組換えライブラリーパニング
[0052]ハイブリドーマ技術の代替法として、ファージディスプレイ技術を用いて、ヒトＶＡＳＡ／ＤＤＸ４のアミノ酸残基７００〜７２４に対する抗体の生成を行った。〜４０の血液ドナー由来の正常Ｂ細胞プールから、ファージディスプレイライブラリーを形成した。ファージを用いて、抗体のｓｃＦｖ鎖をディスプレイした。
[0053]ＶＡＳＡ／ＤＤＸ４ ７００〜７２４ペプチドに対して、ヒト未刺激（ｎａｉｖｅ）ｓｃＦｖライブラリーをパニングした結果は、以下の表１に示した通りであった：
表１
Figure 2017532953
[0054]選択３および４周期後に同定された単一コロニーのＥＬＩＳＡ結果を以下の表２〜４に示す。２つのクローン：「１Ａ１２」（プレート１、Ａ行、１２列）および「１Ｅ９」（プレート１、Ｅ行、９列）が注目された。
表２
Figure 2017532953
表３
Figure 2017532953
表４
Figure 2017532953
[0055]選択５周期後に同定された単一コロニーのＥＬＩＳＡ結果を以下の表５〜７に示す。注目されるクローンには、１Ａ１１、１Ｂ４、１Ｂ７、１Ｄ４、１Ｄ５、１Ｅ２、１Ｅ３、１Ｆ７、１Ｇ３、１Ｇ１２、２Ｂ８、２Ｃ７、２Ｅ１１、２Ｆ１、２Ｇ８、２Ｇ１０、２Ｈ９、３Ｂ２、３Ｂ５、３Ｂ７、３Ｄ１１、３Ｅ５、３Ｅ１２、３Ｆ６および３Ｈ１１が含まれた。
表５
Figure 2017532953
表６
Figure 2017532953
表７
Figure 2017532953
[0056]太字で示すクローンはＰＣＲ増幅された。
ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合への変換および哺乳動物細胞における発現
[0057]パニング５周期後、ＤＮＡ消化パターンは、第５周期由来の多くのクローンが同じであることを示し、選択およびＥＬＩＳＡ分析のさらなる周期が不要であることが示された。
[0058]２つのユニークなクローン（１Ａ１２、１Ｅ９）を、哺乳動物細胞において発現させるためにｓｃＦｖ−Ｆｃ融合への変換に、そしてＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析に選択した。図５Ａは、１Ｅ９が０．０２７７９ｎＭのＥＣ５０を有し、そして１Ａ１２が０．２１５６ｎＭのＥＣ５０を有することを示す、用量反応結合曲線を示す。さらに、図５Ｂは、１Ｅ９が、商業的に入手可能なウサギポリクローナル抗体（ＡＢ１３８４０、Ａｂｃａｍ ｐｌｃ、英国ケンブリッジ）と同じエピトープに結合することを示唆する、Ｖ１およびＶ２ ＶＡＳＡペプチドを用いたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
[0059]１Ｅ９抗体の２つの異なる型：ＩｇＧおよびｓｃＦｖ−Ｆｃを比較した。図６Ａに示すように、１Ｅ９ ＩｇＧは０．０８９１９ｎＭのＥＣ５０を有し、そして１Ｅ９ ｓｃＦｖ−Ｆｃは０．３０７２ｎＭのＥＣ５０を有した。さらに、図６Ｂに示すように、どちらの型もＶＡＳＡ−１エピトープに対して特異的であった。
合成抗体遺伝子産生
[0060]以下の工程を使用して、合成抗体遺伝子を産生した：
[0061]（１）ハイブリドーマ抗体のサブタイプ決定。製造者のプロトコルにしたがって、商業的に入手可能なキット（例えばマウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定キット、カタログ番号ＭＭＴ１、ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃｈ、英国キドリングトン）を用いて、ハイブリドーマ抗体のＩｇＧサブタイプを決定した。図８は、８つのハイブリドーマ由来の抗ＶＡＳＡ抗体（２Ｍ１／１Ｌ２０、２Ｍ１／１Ｊ２０、１Ｍ１／１Ｃ９、２Ｍ１／１Ｎ３、２Ｍ１／１Ｋ２３、１Ｍ１／１Ｌ５および２Ｍ１／２Ｋ４）に関するサブタイプ決定分析の結果を示す。すべての抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂであった。
[0062]（２）縮重プライマー合成。試験した８つのハイブリドーマ抗体に関するサブタイプ情報に基づいて、マウスＩｇＧデータベース（すなわち国際免疫遺伝学情報システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（登録商標）またはＩＭＧＴデータベース；Ｌｅｆｒａｎｃら（２００３）， Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７：２６０−２６６、およびＡｌａｍｙａｒら（２０１２）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０１２；８８２：５６９−６０４を参照されたい）由来の配列情報を用い、マウスＩｇＧ ＶＨおよびＶＬの縮重プライマーを設計した。ＶＨ鎖に関して１０の、そしてＶＬ鎖に関して１０（カッパ鎖に関して９、そしてラムダ鎖に関して１つ）の縮重順方向プライマーを設計し、そして合成した。さらに、ＶＨ鎖に関して２つ（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂサブタイプに関して１つ、そしてＩｇＧ２ａサブタイプに関して１つ）、そしてＶＬ鎖に関して５つ（カッパに関して４つ、そしてラムダ鎖に関して１つ）の縮重逆方向プライマーを設計し、そして合成した。
[0063]（３）ＲＮＡ抽出、増幅、クローニングおよび配列決定。標準技術によって，ハイブリドーマ細胞からＲＮＡを抽出し、遺伝子特異的およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて標準技術によって第一鎖ｃＤＮＡ合成を行い、そして遺伝子特異的プライマーを用いて、ｃＤＮＡを増幅した。次いで、増幅ＤＮＡを商業的に入手可能な細菌クローニングベクター（ｐＭＤ１８−Ｔ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， Ｉｎｃ．、中国北京）内に連結した。標準方法論を行って、大腸菌ＤＨ５ａ内に連結産物を形質転換し、そして陽性クローンを配列決定した。
抗体配列分析
[0064]潜在的に有用な抗Ｖａｓａ抗体を産生するクローンをＤＮＡ配列決定し、そして対応するアミノ酸配列を推定した。上述のハイブリドーマ由来の８つの抗体（すなわち、１Ｎ２３、１Ｋ２３、２Ｋ４、１Ｃ９、１Ｊ２０、１Ｌ２０、１Ｋ３、１Ｌ５）、契約下で産生したハイブリドーマ由来の４つのさらなる抗体（すなわち、ＣＴＡ４／５、ＣＴＢ４／１１、ＣＴＣ２／６、ＣＴＤ２／６）およびファージディスプレイ由来の２つの抗体（すなわち、１Ａ１２および１Ｅ９）に関して、配列を開示する。
可変軽鎖配列
[0065]１Ｎ２３のＶＬ。１Ｎ２３ハイブリドーマ由来の陽性ＶＬクローンを配列決定し、そして６つが機能するＶＬ鎖をコードすることが見出された。これらの６つのクローンは、１Ｎ２３ＶＬ５−５、１Ｎ２３ＶＬ５−８＿０８１６、１Ｎ２３ＶＬ１−８、１Ｎ２３ＶＬ１−２＿０８２０、１Ｎ２３ＶＬ１−４＿０８２０および１Ｎ２３ＶＬ１−２と名付けられた。
[0066]１Ｋ２３のＶＬ。１Ｋ２３ハイブリドーマ由来の陽性ＶＬクローンを配列決定し、そして４つが機能するＶＬ鎖をコードすることが見出された。これらの４つのクローンは、１Ｋ２３ＶＬ２−５、１Ｋ２３ＶＬ２−６、１Ｋ２３ＶＬ２−８＿０８２２および１Ｋ２３ＶＬ２−３＿０８２９と名付けられた。
[0067]２Ｋ４のＶＬ。２Ｋ４ハイブリドーマ由来の陽性ＶＬクローンを配列決定し、そして８つが機能するＶＬ鎖をコードすることが見出された。これらの８つのクローンは、２Ｋ４ＶＬ１−３＿０８２０、２Ｋ４ＶＬ１−４、２Ｋ４ＶＬ１−１、２Ｋ４ＶＬ１−６＿０８２０、２Ｋ４ＶＬ２−５＿０８１６、２Ｋ４ＶＬ２−４、２Ｋ４ＶＬ２−６＿０８１６および２Ｋ４ＶＬ２−５と名付けられた。
[0068]１Ｃ９のＶＬ。１Ｃ９ハイブリドーマ由来の陽性ＶＬクローンを配列決定し、そして３つが機能するＶＬ鎖をコードすることが見出された。これらの３つのクローンは、１Ｃ９ＶＬ２−４、１Ｃ９ＶＬ２−６および１Ｃ９ＶＬ２−３＿０８１６と名付けられた。
[0069]１Ｊ２０のＶＬ。１Ｊ２０ハイブリドーマ由来の陽性ＶＬクローンを配列決定し、そして３つが機能するＶＬ鎖をコードすることが見出された。これらの３つのクローンは、１Ｊ２０ＶＬ５−２＿０９０７、１Ｊ２０ＶＬ５−６＿０９０７および１Ｊ２０ＶＬ４−３＿０９０７と名付けられた。
[0070]１Ｌ２０のＶＬ。１Ｌ２０ハイブリドーマ由来の陽性ＶＬクローンを配列決定し、そして１つが機能するＶＬ鎖をコードすることが見出された。このクローンは、１Ｌ２０ＶＬ５−０９１２＿０９１と名付けられた。
[0071]１Ｋ３のＶＬ。１Ｋ３ハイブリドーマ由来の陽性ＶＬクローンを配列決定し、そして４つが機能するＶＬ鎖をコードすることが見出された。これらの４つのクローンは、１Ｋ３ＶＬ２−５、１Ｋ３ＶＬ２−５、１Ｋ３ＶＬ２−３および１Ｋ３ＶＬ２−４と名付けられた。
[0072]１Ｌ５のＶＬ。１Ｌ５ハイブリドーマ由来の陽性ＶＬクローンを配列決定し、そして２つが機能するＶＬ鎖をコードすることが見出された。これらの２つのクローンは、１Ｌ５ＶＬ２−４および１Ｌ５ＶＬ３−１と名付けられた。
[0073]さらなるＶＬ。ＣＴＡ４＿ＶＬ、ＣＴＢ４＿ＶＬ、ＣＴＣ６＿ＶＬ、ＣＴＤ６＿ＶＬと称される４つのさらなるハイブリドーマ抗体に関して、ＶＬ配列を得た。
[0074]ＶＬ配列整列。上記のＶＬ配列すべての整列を図９に示す。図は、３つのＣＤＲ領域のおよその位置（太字、下線）、および各配列に対応する配列番号を示す。
[0075]ユニークなＶＬ ＣＤＲ配列。図９のＶＬのユニークなＣＤＲ配列の整列を図１１に示す。３４のＶＬ配列のうち、図１１に示すように、５つのユニークなＣＤＲ１配列、６つのユニークなＣＤＲ２配列および８つのユニークなＣＤＲ３配列しかない。
[0076]ＶＬ ＣＤＲコンセンサス配列。図１１に開示する配列、ならびに天然存在アミノ酸の構造／機能特性に基づいて、ＶＬ ＣＤＲのコンセンサス配列を決定することも可能である。
[0077]１つのコンセンサス配列は、ＶＬ ＣＤＲ１モチーフ１である：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号１３２）
式中、Ｘ１は、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、ＳまたはＴであり；Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、Ｃ、ＮまたはＱであり；Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＡであり；Ｘ４は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ａまたは存在せず；Ｘ５は、Ｈ、Ｋ、Ｒまたは存在せず；Ｘ６は、Ｓ、Ｔ、Ｃまたは存在せず；Ｘ７は、Ｎ、Ｑまたは存在せず；Ｘ８は、Ｇ、Ａまたは存在せず；Ｘ９は、ＮまたはＱであり；Ｘ１０は、Ｔ、Ｓ、Ｃ、ＮまたはＱであり；そしてＸ１１は、Ｙ、ＦまたはＷである。いくつかの態様において、Ｘ１は、Ｑ、ＫまたはＳに限定され；そして／またはＸ２は、ＳまたはＮに限定され；そして／またはＸ３は、ＩまたはＬに限定され；そして／またはＸ４は、Ｖ、Ｌまたは存在しないに限定され；そして／またはＸ５は、Ｈまたは存在しないに限定され；そして／またはＸ６は、Ｓまたは存在しないに限定され；そして／またはＸ７は、Ｎまたは存在しないに限定され；そして／またはＸ８は、Ｇまたは存在しないに限定され；そして／またはＸ９は、Ｎに限定され；そして／またはＸ１０は、Ｔ、ＳまたはＮに限定され；そして／またはＸ１１は、ＹまたはＦに限定される。いくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＱＮＩに限定され；いくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＱＳＬに限定され；そして、いくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＫＳＬに限定される。さらに、いくつかの態様において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、ＱＳＬまたはＱＮＩである場合、Ｘ４は、Ｖであり；一方、他の態様において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、ＫＳＬである場合、Ｘ４は、Ｌである。いくつかの態様において、Ｘ９Ｘ１０が、ＮＴである場合、Ｘ１１は、Ｙである。
[0078]特に、配列番号８６〜８８のＶＬ ＣＤＲ１配列が図１１の他の配列とはまったく異なることに注目して、代替コンセンサス配列は、ＶＬ ＣＤＲ１モチーフ２である：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号１３３）
式中、Ｘ１は、Ｑ、Ｎ、ＫまたはＲであり；Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、Ｃ、ＮまたはＱであり；Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＡであり；Ｘ４は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＡであり；Ｘ５は、Ｈ、ＫまたはＲであり；Ｘ６は、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｘ７は、ＮまたはＱであり；Ｘ８は、ＧまたはＡであり；Ｘ９は、ＮまたはＱであり；Ｘ１０は、Ｔ、ＳまたはＣであり；そしてＸ１１は、Ｙ、ＦまたはＷである。いくつかの態様において、Ｘ１は、ＱまたはＫに限定され；そして／またはＸ２は、ＳまたはＮに限定され；そして／またはＸ３は、ＩまたはＬに限定され；そして／またはＸ４は、ＶまたはＬに限定され；そして／またはＸ５は、Ｈに限定され；そして／またはＸ６は、Ｓに限定され；そして／またはＸ７は、Ｎに限定され；そして／またはＸ８は、Ｇに限定され；そして／またはＸ９は、Ｎに限定され；そして／またはＸ１０は、Ｔに限定され；そして／またはＸ１１は、Ｙに限定される。いくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＱＮＩに限定され；いくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＱＳＬに限定され；そしていくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＫＳＬに限定される。さらに、いくつかの態様において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、ＱＳＬまたはＱＮＩである場合、Ｘ４は、Ｖであり；一方、他の態様において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、ＫＳＬである場合、Ｘ４は、Ｌである。いくつかの態様において、Ｘ９Ｘ１０が、ＮＴである場合、Ｘ１１は、Ｙである。
[0079]ＶＬ ＣＤＲ２に関して、１つのコンセンサス配列は、ＶＬ ＣＤＲ２モチーフ１である：
Ｙ１Ｙ２Ｙ３（配列番号１３４）
式中、Ｙ１は、Ｋ、ＲまたはＨであり；Ｙ２は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ａ、Ｔ、ＳまたはＣであり；そしてＹ３は、Ｓ、Ｔ、Ｃ、ＮまたはＱである。いくつかの態様において、Ｙ２は、Ｖ、Ｉ、ＭまたはＴに限定され；そして／またはＹ３は、ＳまたはＮに限定される。
[0080]特に、配列番号９４のＶＬ ＣＤＲ２配列が図１１の他の配列とまったく異なることに注目して、代替コンセンサス配列は、ＶＬ ＣＤＲ２モチーフ２である：
Ｙ１Ｙ２Ｙ３（配列番号１３５）
式中、Ｙ１は、ＤまたはＥであり；Ｙ２は、ＮまたはＱであり；そしてＹ３は、ＮまたはＱである。いくつかの態様において、Ｙ１は、Ｄに限定され；そして／またはＹ２は、Ｎに限定され；そして／またはＹ３は、Ｎに限定される。
[0081]同様に、配列番号９５のＶＬ ＣＤＲ２配列が図１１の他の配列とまったく異なることに注目しては、代替コンセンサス配列は、ＶＬ ＣＤＲ２モチーフ３である：
Ｙ１Ｙ２Ｙ３（配列番号１３６）
式中、Ｙ１は、ＱまたはＮであり；Ｙ２は、ＤまたはＥであり；そしてＹ３は、Ｋ、ＲまたはＨである。いくつかの態様において、Ｙ１は、Ｑに限定され；そして／またはＹ２は、Ｄに限定され；そして／またはＹ３は、Ｋに限定される。
[0082]ＶＬ ＣＤＲ３に関して、１つのコンセンサス配列は、ＶＬ ＣＤＲ３モチーフ１である：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０（配列番号１３７）
式中、Ｚ１は、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｌ、Ｖ、ＩまたはＡであり；Ｚ２は、Ｑ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｚ３は、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｙ、ＦまたはＷであり；Ｚ４は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＤまたはＥであり；Ｚ５は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｚ６は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｚ７は、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃまたは存在せず；Ｚ８は、Ｓ、Ｔ、Ｃまたは存在せず；Ｚ９は、Ｗ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆ、またはＹであり；そしてＺ１０は、Ｔ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ａである。いくつかの態様において、Ｚ１は、Ｓ、Ｆ、ＭまたはＬに限定され；そして／またはＺ２は、ＱまたはＳに限定され；そして／またはＺ３は、Ｓ、Ｇ、Ｈ、ＱまたはＹに限定され；そして／またはＺ４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、またはＤに限定され；そして／またはＺ５は、Ｈ、Ｅ、ＤまたはＳに限定され；そして／またはＺ６は、Ｖ、Ｙ、Ｆ、またはＳに限定され；そして／またはＺ７は、Ｐ、Ｓまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ８は、Ｓまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ９は、Ｗ、Ｐ、ＬまたはＦに限定され；そして／またはＺ１０は、ＴまたはＶに限定される。
[0083]特に、配列番号９６〜９８のＶＬ ＣＤＲ３配列が、Ｚ５位で陽性電荷を有する一方、図１１の他の配列はそうではないことに注目し、代替コンセンサス配列は、ＶＬ ＣＤＲ３モチーフ２である：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０（配列番号１３８）
式中、Ｚ１は、Ｓ、Ｔ、Ｃ、ＦまたはＹであり；Ｚ２は、ＱまたはＮであり；Ｚ３は、Ｓ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＡであり；Ｚ４は、Ａ、Ｇ、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｚ５は、Ｈ、ＫまたはＲであり；Ｚ６は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＡであり；Ｚ７は、Ｐまたは存在せず；Ｚ８は、存在せず；Ｚ９は、Ｗ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＦまたはＹであり；そしてＺ１０は、Ｔ、Ｓ、またはＣである。いくつかの態様において、Ｚ１は、ＳまたはＦに限定され；そして／またはＺ２は、Ｑに限定され；そして／またはＺ３は、ＳまたはＧに限定され；そして／またはＺ４は、Ａ、ＳまたはＴに限定され；そして／またはＺ５は、Ｈに限定され；そして／またはＺ６は、Ｖに限定され；そして／またはＺ７は、Ｐまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ８は、存在しないに限定され；そして／またはＺ９は、Ｗ、Ｐ、ＬまたはＦに限定され；そして／またはＺ１０は、Ｔに限定される。
[0084]特に、配列番号９９〜１０２のＶＬ ＣＤＲ３配列が、Ｚ５位で陰性電荷を有する一方、図１１の他の配列はそうではないことに注目し、代替コンセンサス配列は、ＶＬ ＣＤＲ３モチーフ３である：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０（配列番号１３９）
式中、Ｚ１は、Ｍ、Ｃ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａであり；Ｚ２は、ＱまたはＮであり；Ｚ３は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、Ａ、ＹまたはＦであり；Ｚ４は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＤまたはＥであり；Ｚ５は、ＥまたはＤであり；Ｚ６は、ＹまたはＦであり；Ｚ７は、Ｐであり；Ｚ８は、存在せず；Ｚ９は、Ｗ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＦまたはＹであり；そしてＺ１０は、Ｔ、Ｓ、またはＣである。いくつかの態様において、Ｚ１は、ＭまたはＬに限定され；そして／またはＺ２は、Ｑに限定され；そして／またはＺ３は、Ｈ、Ｑ、ＧまたはＹに限定され；そして／またはＺ４は、ＬまたはＤに限定され；そして／またはＺ５は、ＥまたはＤに限定され；そして／またはＺ６は、ＹまたはＦに限定され；そして／またはＺ７は、Ｐに限定され；そして／またはＺ８は、存在しないに限定され；そして／またはＺ９は、Ｗ、Ｐ、ＬまたはＦに限定され；そして／またはＺ１０は、Ｔに限定される。
[0085]特に、配列番号１０３のＶＬ ＣＤＲ３配列が図１１の他の配列とまったく異なることに注目して、代替コンセンサス配列は、ＶＬ ＣＤＲ３モチーフ４である：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０（配列番号１４０）
式中、Ｚ１は、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｚ２は、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｚ３は、ＹまたはＦであり；Ｚ４は、Ｔ、Ｓ、またはＣであり；Ｚ５は、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｚ６は、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｚ７は、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｚ８は、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｚ９は、Ｗ、Ｐ、ＦまたはＹであり；そしてＺ１０は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ａ、Ｔ、ＳまたはＣである。いくつかの態様において、Ｚ１は、ＳまたはＴに限定され；そして／またはＺ２は、ＳまたはＴに限定され；そして／またはＺ３は、Ｙに限定され；そして／またはＺ４は、ＴまたはＳに限定され；そして／またはＺ５は、ＳまたはＴに限定され；そして／またはＺ６は、ＳまたはＴに限定され；そして／またはＺ７は、ＳまたはＴに限定され；そして／またはＺ８は、ＳまたはＴに限定され；そして／またはＺ９は、Ｗ、ＰまたはＦに限定され；そして／またはＺ１０は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＴまたはＳに限定される。いくつかの態様において、Ｚ１は、Ｓに限定され；そして／またはＺ２は、Ｓに限定され；そして／またはＺ３は、Ｙに限定され；そして／またはＺ４は、Ｔに限定され；そして／またはＺ５は、Ｓに限定され；そして／またはＺ６は、Ｓに限定され；そして／またはＺ７は、Ｓに限定され；そして／またはＺ８は、Ｓに限定され；そして／またはＺ９は、Ｗに限定され；そして／またはＺ１０は、Ｖに限定される。
[0086]最後に、特に、配列番号１０４のＶＬ ＣＤＲ３配列が図１１の他の配列とまったく異なることに注目して、代替コンセンサス配列は、ＶＬ ＣＤＲ３モチーフ５である：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０（配列番号１４１）
式中、Ｚ１は、ＱまたはＮであり；Ｚ２は、ＡまたはＧであり；Ｚ３は、Ｗ、ＹまたはＦであり；Ｚ４は、ＤまたはＥであり；Ｚ５は、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｚ６は、Ｒ、ＫまたはＨであり；Ｚ７は、Ｔ、ＳまたはＣであり；Ｚ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＡであり；Ｚ９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＡであり；そしてＺ１０は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＡである。いくつかの態様において、Ｚ１は、Ｑに限定され；そして／またはＺ２は、Ａに限定され；そして／またはＺ３は、Ｗに限定され；そして／またはＺ４は、Ｄに限定され；Ｚ５は、Ｓに限定され；そして／またはＺ６は、Ｒに限定され；そして／またはＺ７は、Ｔに限定され；そして／またはＺ８は、Ｖに限定され；そして／またはＺ９は、Ｖに限定され；そして／またはＺ１０は、Ｉに限定される。
可変重鎖配列
[0087]１Ｎ２３のＶＨ。１Ｎ２３ハイブリドーマ由来の陽性ＶＨクローンを配列決定し、そして４つすべてが機能するＶＨ鎖をコードすることが見出された。これらの４つのクローンは、１Ｎ２３ＶＨ３−５、１Ｎ２３ＶＨ３−７、１Ｎ２３ＶＨ２−１および１Ｎ２３ＶＨ１−５と名付けられた。
[0088]１Ｋ２３のＶＨ。１Ｋ２３ハイブリドーマ由来の陽性ＶＨクローンを配列決定し、そして６つが機能するＶＨ鎖をコードすることが見出された。これらの６つのクローンは、１Ｋ２３ＶＨ２−１＿０９１０、１Ｋ２３ＶＨ１−４＿０９０７、１Ｋ２３ＶＨ１−１０＿０９０７、１Ｋ２３ＶＨ８−４＿０９０７、１Ｋ２３ＶＨ８−５＿０９０７および１Ｋ２３ＶＨ８−９＿０９０７と名付けられた。
[0089]２Ｋ４のＶＨ。２Ｋ４ハイブリドーマ由来の陽性ＶＨクローンを配列決定し、そして４つが機能するＶＨ鎖をコードすることが見出された。これらの４つのクローンは、２Ｋ４ＶＨ３−８、２Ｋ４ＶＨ２−８、２Ｋ４ＶＨ１−１および２Ｋ４ＶＨ１−４と名付けられた。
[0090]１Ｃ９のＶＨ。１Ｃ９ハイブリドーマ由来の陽性ＶＨクローンを配列決定し、そして８つが機能するＶＬ鎖をコードすることが見出された。これらの８つのクローンには４つのユニークな配列が含まれ、これらは、１Ｃ９ＶＨ２−４０４−８＿１０２４、１Ｃ９ＶＨ２−４０５−１２＿１０２４、１Ｃ９ＶＨ２−４１１−１＿１０２４および １Ｃ９ＶＨ２−４０６−４＿１０２４と名付けられた。
[0091]１Ｊ２０のＶＨ。１Ｊ２０ハイブリドーマ由来の陽性ＶＨクローンを配列決定し、そして２つが機能するＶＨ鎖をコードすることが見出された。これらの２つのクローンは、１Ｊ２０ＶＨ１−７＿０９１０および１Ｊ２０ＶＨ１−１−６＿０８２９と名付けられた。
[0092]１Ｌ２０のＶＨ。１Ｌ２０ハイブリドーマ由来の陽性ＶＨクローンを配列決定し、そして３つが機能するＶＨ鎖をコードすることが見出された。これらの３つのクローンは、１Ｌ２０ＶＨ２−３＿０９０３、１Ｌ２０ＶＨ２−１＿０９０７および１Ｌ２０ＶＨ２−３＿０９１０と名付けられた。
[0093]１Ｋ３のＶＨ。１Ｋ３ハイブリドーマ由来の陽性ＶＨクローンを配列決定し、そして５つが機能するＶＨ鎖をコードすることが見出された。これらの５つのクローンは、１Ｋ３ＶＨ６−７、１Ｋ３ＶＨ６−８＿０８１６、１Ｋ３ＶＨ３−４、１Ｋ３ＶＨ３−４および１Ｋ３ＶＨ３−３＿０８１６と名付けられた。
[0094]１Ｌ５のＶＨ。１Ｌ５ハイブリドーマ由来の陽性ＶＨクローンを配列決定し、そして９つが機能するＶＨ鎖をコードすることが見出された。これらの９つのクローンは、１Ｌ５ＶＨ００３−５−８＿０９０７、１Ｌ５ＶＨ００３−６−３＿０９０７、１Ｌ５ＶＨ００１−７−６＿０９０７、１Ｌ５ＶＨ００１−６−５＿０９０７、１Ｌ５ＶＨ００１−６−１１＿０９０７、１Ｌ５ＶＨ００３−６−２＿０９１０、１Ｌ５ＶＨ００１−６−１２＿０９０７、１Ｌ５ＶＨ００３−３−４＿０９０７および１Ｌ５ＶＨ００３−３−８＿０９０７と名付けられた。
[0095]さらなるＶＨ。ＣＴＡ５＿ＶＨ、ＣＴＢ１１＿ＶＨ、ＣＴＣ２＿ＶＨ、ＣＴＤ２＿ＶＨと名付けられた４つのさらなるハイブリドーマ抗体に関して、ＶＨ配列を得た。
[0096]ＶＨ配列整列。上述のＶＨ配列すべての整列を図１０に示す。図は、３つのＣＤＲ領域のおよその位置（太字、下線）、および各配列に対応する配列番号を示す。
[0097]ユニークなＶＨ ＣＤＲ配列。図１０のＶＨのユニークなＣＤＲ配列の整列を図１２に示す。４３のＶＨ配列のうち、図１２に示すように、８つのユニークなＣＤＲ１配列、９つのユニークなＣＤＲ２配列および１０のユニークなＣＤＲ３配列しかない。
[0098]ＶＨ ＣＤＲコンセンサス配列。図１２に開示する配列、ならびに天然存在アミノ酸の構造／機能特性に基づいて、ＶＨ ＣＤＲのコンセンサス配列を決定することも可能である。
[0099]ＶＨ ＣＤＲ１に関して、１つのコンセンサス配列は、ＶＨ ＣＤＲ１モチーフ１である：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１４２）
式中、Ｘ１は、ＧまたはＡであり；Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、ＤまたはＥであり；Ｘ３は、Ｔ、Ｓ、ＣまたはＭであり；Ｘ４は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＡであり；Ｘ５は、Ｔ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ６は、Ｓ、Ｔ、Ｃ、ＡまたはＧであり；Ｘ７は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、ＧまたはＡであり；そしてＸ８は、Ｗ、Ａ、Ｇ、ＹまたはＦである。いくつかの態様において、Ｘ１は、Ｇに限定され；そして／またはＸ２は、Ｙ、ＦまたはＤに限定され；そして／またはＸ３は、ＴまたはＳに限定され；そして／またはＸ４は、ＦまたはＶに限定され；そして／またはＸ５は、Ｔ、ＳまたはＮに限定され；そして／またはＸ６は、Ｓ、ＴまたはＡに限定され；そして／またはＸ７は、Ｙ、Ｆ、ＮまたはＧに限定され；そして／またはＸ８は、Ｗ、ＡまたはＹに限定される。いくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＧＹＴに限定され；そしていくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＧＦＴに限定される。さらに、いくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ７Ｘ８は、ＳＹＷに限定される。
[0100]特に、配列番号１０９〜１１０および１１２のＶＨ ＣＤＲ１配列が図１２の他の配列とまったく異なることに注目して、代替コンセンサス配列は、ＶＨ ＣＤＲ１モチーフ２である：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１４３）
式中、Ｘ１は、ＧまたはＡであり；Ｘ２は、Ｙ、ＦまたはＷであり；Ｘ３は、Ｔ、Ｓ、ＣまたはＭであり；Ｘ４は、Ｆ、ＹまたはＷであり；Ｘ５は、Ｔ、ＳまたはＣであり；Ｘ６は、Ｓ、ＴまたはＣであり；Ｘ７は、Ｙ、ＦまたはＷであり；そしてＸ８は、Ｗである。いくつかの態様において、Ｘ１は、Ｇに限定され；そして／またはＸ２は、ＹまたはＦに限定され；そして／またはＸ３は、ＴまたはＳに限定され；そして／またはＸ４は、Ｆに限定され；そして／またはＸ５は、ＴまたはＳに限定され；そして／またはＸ６は、ＳまたはＴに限定され；そして／またはＸ７は、ＹまたはＦに限定され；そして／またはＸ８は、Ｗに限定される。いくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＧＹＴに限定され；そしていくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＧＦＴに限定される。さらに、いくつかの態様において、下位配列Ｘ１Ｘ７Ｘ８は、ＳＹＷに限定される。
[0101]ＶＨ ＣＤＲ２に関して、１つのコンセンサス配列は、ＶＨ ＣＤＲ２モチーフ１である：
Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ５Ｙ６Ｙ７Ｙ８Ｙ９Ｙ１０（配列番号１４４）
式中、Ｙ１は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＡであり；Ｙ２は、Ｙ、Ｆ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、ＳまたはＴであり；Ｙ３は、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｒ、ＫまたはＨであり；Ｙ４は、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＤまたはＥであり；Ｙ５は、Ｔ、Ｓまたは存在せず；Ｙ６は、Ｒ、Ｋ、Ｈまたは存在せず；Ｙ７は、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ａまたは存在せず；Ｙ８は、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＹまたはＦであり；Ｙ９は、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、ＮまたはＱであり；そしてＹ１０は、Ｔ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｋ、ＲまたはＨである。いくつかの態様において、Ｙ１は、Ｉに限定され；そして／またはＹ２は、Ｙ、Ｈ、Ｒ、ＫまたはＳに限定され；そして／またはＹ３は、Ｐ、Ｓ、ＹまたはＲに限定され；そして／またはＹ４は、Ｇ、Ｓ、ＫまたはＤに限定され；そして／またはＹ５は、Ｔまたは存在しないに限定され；そして／またはＹ６は、Ｒまたは存在しないに限定され；そして／またはＹ７は、Ｎ、Ｄ、Ｇまたは存在しないに限定され；そして／またはＹ８は、Ｇ、Ａ、ＳまたはＹに限定され；そして／またはＹ９は、Ｄ、Ｅ、ＡまたはＮに限定され；そして／またはＹ１０は、Ｔ、ＩまたはＫに限定される。
[0102]特に、配列番号１２０〜１２１のＶＨ ＣＤＲ２配列が図１２の他の配列とまったく異なることに注目して、代替コンセンサス配列は、ＶＨ ＣＤＲ２モチーフ２である：
Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ５Ｙ６Ｙ７Ｙ８Ｙ９Ｙ１０（配列番号１４５）
式中、Ｙ１は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＡであり；Ｙ２は、Ｙ、Ｆ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、ＳまたはＴであり；Ｙ３は、Ｐ、Ｓ、Ｔ、ＹまたはＦであり；Ｙ４は、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、ＲまたはＨであり；Ｙ５は、Ｔ、Ｓまたは存在せず；Ｙ６は、Ｒ、Ｋ、Ｈまたは存在せず；Ｙ７は、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅまたは存在せず；Ｙ８は、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＹまたはＦであり；Ｙ９は、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、ＮまたはＱであり；そしてＹ１０は、Ｔ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＡである。いくつかの態様において、Ｙ１は、Ｉに限定され；そして／またはＹ２は、Ｙ、Ｈ、ＲまたはＳに限定され；そして／またはＹ３は、Ｐ、ＳまたはＹに限定され；そして／またはＹ４は、Ｇ、ＳまたはＫに限定され；そして／またはＹ５は、Ｔまたは存在しないに限定され；そして／またはＹ６は、Ｒまたは存在せずに限定され；そして／またはＹ７は、Ｎ、Ｄまたは存在しないに限定され；そして／またはＹ８は、Ｇ、Ａ、ＳまたはＹに限定され；そして／またはＹ９は、Ｄ、Ｅ、ＡまたはＮに限定され；そして／またはＹ１０は、ＴまたはＩに限定される。
[0103]ＶＨ ＣＤＲ３に関して、１つのコンセンサス配列は、ＶＨ ＣＤＲ３モチーフ１である：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０Ｚ１１Ｚ１２Ｚ１３Ｚ１４Ｚ１５（配列番号１４６）
式中、Ｚ１は、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＭであり；Ｚ２は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＣまたはＭであり；Ｚ３は、Ｇ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｅまたは存在せず；Ｚ４は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｈまたは存在せず；Ｚ５は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄまたは存在せず；Ｚ６は、Ｄ、Ｅまたは存在せず；Ｚ７は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｓ、Ｔまたは存在せず；Ｚ８は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａまたは存在せず；Ｚ９は、Ｇ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｈまたは存在せず；Ｚ１０は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈまたは存在せず；Ｚ１１は、Ａ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｇまたは存在せず；Ｚ１２は、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ａ、Ｇまたは存在せず；Ｚ１３は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ａ、ＭまたはＣであり；Ｚ１４は、Ａ、Ｇ、Ｍ、Ｄ、Ｅ、Ｗ、ＹまたはＦであり；そしてＺ１５は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｇ、ＡまたはＶであるいくつかの態様において、Ｚ１は、ＡまたはＶに限定され；そして／またはＺ２は、Ｒ、ＫまたはＣに限定され；そして／またはＺ３は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ｄまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ４は、Ｙ、Ｎ、Ｇ、Ｒまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ５は、Ｓ、Ｎ、Ｅまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ６は、Ｄまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ７は、Ｌ、Ｓまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ８は、Ｌまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ９は、Ｇ、Ｒまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ１０は、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｌまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ１１は、Ａ、Ｆ、Ｓ、Ｇまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ１２は、Ｗ、Ｙ、Ａまたは存在しないに限定され；そして／またはＺ１３は、Ｆ、Ｙ、ＧまたはＭに限定され；そして／またはＺ１４は、Ａ、Ｄ、ＷまたはＹに限定され；そして／またはＺ１５は、Ｙ、Ｆ、ＷまたはＧに限定される。
[0104]開示する主題は、前述の例示的態様で記載されそして例示されているが、本開示は例としてのみ作製され、そして以下の請求項によってのみ制限される、開示する主題の精神および範囲から逸脱することなく、開示する主題の実行の詳細において、多くの変化が行われうることが理解される。
[0045]いくつかの態様において、本発明は、本発明の抗ＶＡＳＡ抗体を発現している、ＣＨＯ細胞を含む、哺乳動物細胞を提供する。しかし、当業者は、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物系を含む、多様な宿主細胞において、抗体を発現させることも可能である。例えば、本明細書にその全体が援用される、Ｖｅｒｍａら（１９９８）， Ｊ． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１６（１−２）：１６５−８１を参照されたい。 本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
［態様１］
ヒトＶＡＳＡタンパク質に特異的に結合する抗体であって：
免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、
前記軽鎖の可変領域が：
（ｉ）配列番号８３〜８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）配列番号８９〜９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および／または
（ｉｉｉ）配列番号９６〜１０４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域
を含む、前記抗体。
［態様２］
ヒトＶＡＳＡタンパク質に特異的に結合する抗体であって：
免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、
前記重鎖の可変領域が：
（ｉ）配列番号１０５〜１１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）配列番号１１３〜１２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および／または
（ｉｉｉ）配列番号１２２〜１３１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域
を含む、前記抗体。
［態様３］
ヒトＶＡＳＡタンパク質に特異的に結合する抗体であって：
免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、
前記軽鎖の可変領域が：
（ｉ）ＶＬ ＣＤＲ１モチーフ１〜２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ２モチーフ１〜３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および／または
（ｉｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ３モチーフ１〜５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域
を含む、前記抗体。
［態様４］
ヒトＶＡＳＡタンパク質に特異的に結合する抗体であって：
免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、
前記重鎖の可変領域が：
（ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１モチーフ１〜２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；
（ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ２モチーフ１〜２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および／または
（ｉｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ３モチーフ１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域
を含む、前記抗体。
［態様５］
態様１〜４のいずれか一項の抗体を含む抗体調製物。
［態様６］
モノクローナル抗体調製物である、態様５の抗体調製物。
［態様７］
少なくとも２つのモノクローナル抗体調製物の混合物である、態様５の抗体調製物。
［態様８］
態様１〜４のいずれか一項の重鎖または軽鎖をコードする単離核酸分子。
［態様９］
クローニングベクター、発現ベクター、異種組換えベクターおよびウイルス組込みベクターからなる群より選択される、態様８の単離核酸。
［態様１０］
態様８〜９のいずれか一項の核酸で形質転換された細胞。
［態様１１］
哺乳動物細胞である、態様１０の細胞。
［態様１２］
齧歯類細胞である、態様１１の細胞。
［態様１３］
ＣＨＯ細胞である、態様１１の細胞。
［態様１４］
ヒト細胞である、態様１１の細胞。
［態様１５］
ＶＡＳＡタンパク質を発現している細胞を単離する方法であって：
（ａ）細胞集団を得て；
（ｂ）態様１〜４のいずれか一項の多数の抗体と、細胞集団を接触させ；そして
（ｃ）抗体と特異的に結合しない集団中の細胞から、抗体と特異的に結合する集団中の細胞を分離する
工程を含む、前記方法。
［態様１６］
細胞を蛍光活性化細胞ソーティングによって分離する、態様１５の方法。
［態様１７］
蛍光活性化細胞ソーティングによって、固定二次抗体を用いて細胞を分離する、態様１５の方法。

Claims (17)

  1. ヒトＶＡＳＡタンパク質に特異的に結合する抗体であって：
    免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、
    前記軽鎖の可変領域が：
    （ｉ）配列番号８３〜８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；
    （ｉｉ）配列番号８９〜９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および／または
    （ｉｉｉ）配列番号９６〜１０４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域
    を含む、前記抗体。
  2. ヒトＶＡＳＡタンパク質に特異的に結合する抗体であって：
    免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、
    前記重鎖の可変領域が：
    （ｉ）配列番号１０５〜１１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；
    （ｉｉ）配列番号１１３〜１２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および／または
    （ｉｉｉ）配列番号１２２〜１３１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域
    を含む、前記抗体。
  3. ヒトＶＡＳＡタンパク質に特異的に結合する抗体であって：
    免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、
    前記軽鎖の可変領域が：
    （ｉ）ＶＬ ＣＤＲ１モチーフ１〜２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；
    （ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ２モチーフ１〜３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および／または
    （ｉｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ３モチーフ１〜５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域
    を含む、前記抗体。
  4. ヒトＶＡＳＡタンパク質に特異的に結合する抗体であって：
    免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、
    前記重鎖の可変領域が：
    （ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１モチーフ１〜２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域；
    （ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ２モチーフ１〜２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域；および／または
    （ｉｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ３モチーフ１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域
    を含む、前記抗体。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項の抗体を含む抗体調製物。
  6. モノクローナル抗体調製物である、請求項５の抗体調製物。
  7. 少なくとも２つのモノクローナル抗体調製物の混合物である、請求項５の抗体調製物。
  8. 請求項１〜４のいずれか一項の重鎖または軽鎖をコードする単離核酸分子。
  9. クローニングベクター、発現ベクター、異種組換えベクターおよびウイルス組込みベクターからなる群より選択される、請求項８の単離核酸。
  10. 請求項８〜９のいずれか一項の核酸で形質転換された細胞。
  11. 哺乳動物細胞である、請求項１０の細胞。
  12. 齧歯類細胞である、請求項１１の細胞。
  13. ＣＨＯ細胞である、請求項１１の細胞。
  14. ヒト細胞である、請求項１１の細胞。
  15. ＶＡＳＡタンパク質を発現している細胞を単離する方法であって：
    （ａ）細胞集団を得て；
    （ｂ）請求項１〜４のいずれか一項の多数の抗体と、細胞集団を接触させ；そして
    （ｃ）抗体と特異的に結合しない集団中の細胞から、抗体と特異的に結合する集団中の細胞を分離する
    工程を含む、前記方法。
  16. 細胞を蛍光活性化細胞ソーティングによって分離する、請求項１５の方法。
  17. 蛍光活性化細胞ソーティングによって、固定二次抗体を用いて細胞を分離する、請求項１５の方法。
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