JP2014530244A - 血管漏出症候群および癌を治療する方法 - Google Patents

Abstract

血管漏出症候群を治療し、癌の転移を予防する方法が開示される。さらに、炎症性疾患、敗血症、癌または病原体の存在による血管漏出を治療する方法が開示される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１１年１０月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／５４６，７４８号、および２０１１年１０月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／５４６，６９７号の優先権を主張する。米国仮特許出願第６１／５４６，７４８号および米国仮特許出願第６１／５４６，６９７号の全容を参照により本明細書に組み込む。

電子提出資料の参照による組込
全容を参照により組み込まれるのは、本明細書と共に同時に提出され、次のように特定されるコンピューター可読配列表である：９２ＫＢのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件、ファイル名「233106-331560_Seq_Listing_ST25」、２０１２年１０月１５日午前１１時５２分作成。

ＨＰＴＰβ阻害剤の投与により、癌を治療し、転移と血管漏出症候群を予防する方法。

血管漏出症候群（ＶＬＳ）は、低血圧、末梢性浮腫および低アルブミン血症により特徴付けられる。ＶＬＳは、病気、特に病原体とりわけウイルスおよび細菌による病気の副作用として生じ得る。血管漏出は、治癒過程を複雑化し、それ自体がある特定の治療の直接の結果であり得る。例えば、悪性腎癌患者には、免疫系を高めるのを助けるためにインターロイキン−２（ＩＬ−２）が与えられる。しかし、この治療は、多くの患者において、重度のＶＬＳが発症するせいで治療の全過程が実施され得るずっと前に中止されねばならない。ＶＬＳは、ヒトに投与され得るＩＬ−２の用量を制限し、場合によっては、治療効果が最大になる前に治療休止を要する。

ＶＬＳは、体液とタンパク質の血管外遊出を伴う血管透過性の増加により特徴づけられ、間質浮腫と臓器不全をもたらす。ＶＬＳの症状には、体液貯留、体重増加、末梢性浮腫、胸水と心嚢液貯留、腹水、全身浮腫、および重度の場合は肺および心血管不全の徴候が含まれる。症状は患者によって大きく異なり、原因はよくわかっていない。内皮細胞の修飾または損傷は血管漏出において重要であると考えられている。内皮細胞（ＥＣ）損傷の原因は複雑であり、ＥＣおよび白血球の活性化または損傷、サイトカインと炎症メディエーターの放出、細胞−細胞間および細胞−基質間接着および細胞骨格機能の改変が関与し得る。

癌の最も恐ろしい態様の１つは、広がること、すなわち転移する能力である。癌細胞は最初、互いに集まり１以上の腫瘍を形成していることが見出される。原発腫瘍の形成後、癌細胞は原発腫瘍から分離する能力を得て体内の他の部位に移動することがある。肝臓に侵入し腫瘍を形成する肺癌細胞は、肺癌細胞のままである。したがって、１つの特定の形態の癌が転移する傾向は、癌の種類を含む多くの要因によるが、細胞がいかに転移のプロセスを開始するかの全体的なプロセスはまだ完全に解明されていない。

もし１個の局在性腫瘍が転移する機会を有する前に発見されれば、患者の予後の生存率は高い。これは、腫瘍が放射線または化学療法により有効に切除または破壊され得るからである。従って、腫瘍の増殖と腫瘍細胞の転移の間には差があり、必ずしも前者が後者をもたらすわけではない。しかし、転移した癌は、それが体中に拡がっている度合いのせいで治癒が難しい。

転移するためには、癌細胞はその腫瘍から離れて循環系またはリンパ系のいずれかに侵入しなければならない。次いで遊離細胞は自らが定着する新しい場所に運ばれる。体には、細胞がもとの位置から離れた後は生存できないようにする自然の安全対策があるが、一部の癌細胞はこれらの安全対策を打ち負かす能力をもつ。したがって、もし転移が止められるか大幅に軽減されれば、癌の程度が決定され、次いで治療され得る。このように、腫瘍が切除されているかまたは放射線／化学療法が使用されている癌治療のフォローアップ治療は、患者の抗転移剤治療になる。癌細胞の転移を予防する方法は長く必要とされている。

原発腫瘍の増殖も、治療の課題である。もし原発腫瘍の増殖が放置されれば、原発腫瘍は、原発部位および近隣組織において器官の機能に有害作用を及ぼすサイズにまで増殖し得る。原発腫瘍の転移はまた、原発腫瘍の増殖が制御されていないと余計に生じやすい。腫瘍増殖を遅延または予防する方法が必要とされている。

患者は、抗ウイルスおよび抗菌感染の過程の間に、初感染の結果として誘導される血管漏出を生じ得る。ウイルスまたは細菌感染による血管漏出を予防する方法と、１以上の病原体に感染したヒトまたは他の哺乳動物の生存率を高める方法を提供することが長く必要とされている。さらに、ある特定の抗癌剤または他の抗癌治療による血管漏出を予防して、抗癌剤の投与または抗癌治療がヒトまたは他の哺乳動物に長期の処置または治療期間与えられるようにする方法が長く必要とされている。

本開示は、血管漏出症候群の患者を治療する方法を提供し、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む。

患者に有効量のＨΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩および１以上の薬剤的に許容可能な賦形剤を含む組成物を投与することを含む、血管漏出症候群の患者を治療する方法も提供する。

本開示は、血管漏出を治療する方法を提供し、ここで治療される患者は炎症性疾患または状態、外傷、ショック、成人呼吸促迫症候群、急性肺損傷または敗血症に苦しみ、該方法は、該患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む。

本開示はまた、血管漏出を治療する方法を提供し、ここで治療される患者は炎症性疾患または状態、外傷、ショック、成人呼吸促迫症候群、急性肺損傷または敗血症に苦しみ、該方法は、該患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩および１以上の薬剤的に許容可能な賦形剤を含む組成物を投与することを含む。

本開示が提供する別の方法は、血管漏出症候群の患者の治療過程を決定する方法であって、以下を含む：
ａ）患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与すること；ｂ）治療過程の間、該患者において存在するアンジオポエチン−２のレベルをモニタリングすること；およびｃ）アンジオポエチン−２レベルが正常範囲に戻ったら治療を中止すること。

本開示が提供するさらなる１つの方法は、患者の癌を治療する方法であって、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む。

本開示が提供するさらなる１つの方法は、患者の癌を治療する方法であって、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩および薬剤的に許容可能な賦形剤を含む組成物を投与することを含む。

本開示が提供するさらに別の方法は、癌患者における転移を予防する方法であって、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することによる。

本開示が提供するさらに別の方法は、癌患者における転移を予防する方法であって、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩および薬剤的に許容可能な賦形剤を含む組成物を投与することによる。

本開示の方法では、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、限定ではなく、ＨＰＴＰβの細胞外部分に結合する抗体、タンパク質、ペプチド、アプタマー、ペプチボディー、アドネクチンまたは核酸を含む。

モノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６は内皮細胞上の内在性ＨＰＴＰβを認識する。（パネルＡ）内皮細胞溶解物は対照抗体（レーン１）、Ｒ１５Ｅ６（レーン２）、または抗Ｔｉｅ２抗体と抗ＶＥＧＦＲ２抗体の混合物（レーン３）を用いて免疫沈降される。免疫沈降物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、ＰＶＤＦ膜に転写され、Ｒ１５Ｅ６、抗Ｔｉｅ２および抗ＶＥＧＦＲ２抗体の混合物を用いてウエスタンブロットにより検出される。ＨＰＴＰβと一致する１つの主要な高分子量バンドがＲ１５Ｅ６（レーン２）では見られるが、対照抗体（レーン１）または抗Ｔｉｅ２および抗ＶＥＧＦＲ２混合物（レーン３）では見られない。（パネルＢ）内皮細胞をＲ１５Ｅ６（白色ピーク）または１次抗体なしの対照（黒色ピーク）を用いるＦＡＣＳ分析に供する。強力な蛍光シフトは、Ｒ１５Ｅ６が無傷の内皮細胞の表面でＨＰＴＰβに結合することを示す。 モノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６がＨＵＶＥＣにおけるＴｉｅ２受容体活性化を増大させる。Ｔｉｅ２活性化は、実施例４に記載するように、ヒト内皮細胞において測定される。Ｒ１５Ｅ６は、基礎のおよびＡｎｇ１に誘導される活性化の両方を用量依存的に増大させる。 眼のレーザー処置後１４日目の、１μｇまたは２μｇの抗ＶＥ−ＰＴＰ細胞外ドメイン抗体の硝子体内注射により片眼を処置され、もう一方の眼にビヒクルで同様の処置をされた、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける脈絡膜血管新生の平均面積のグラフ表示である。 マウスを７５％の酸素雰囲気中にＰ５〜Ｐ１２まで閉じ込め、大気に戻したときＰ１２に抗ＶＥ−ＰＴＰ細胞外ドメイン抗体の硝子体内注射をした後の、Ｐ１７日目のＣ５７ＢＬ／６マウスの網膜血管新生の平均面積（ｍｍ^２）を示す。 ビヒクルまたは２μｇの抗ＶＥ−ＰＴＰ細胞外ドメイン抗体の硝子体内注射後の酸素誘発網膜症モデルにおけるマウス網膜の代表的な蛍光顕微鏡写真を示す。 マウスを７５％の酸素雰囲気中にＰ５〜Ｐ１２まで閉じ込め、Ｐ１２に大気に戻し、１ｍｇ／ｋｇの抗ＶＥ−ＰＴＰ細胞外ドメイン抗体をＰ１２、１４および１６日目に皮下投与した後の、Ｐ１７日目のＣ５７ＢＬ／６マウスの網膜血管新生平均面積（ｍｍ^２）を示す。 マウスを７５％の酸素雰囲気中にＰ５〜Ｐ１２まで閉じ込め、Ｐ１２に大気に戻し、２ｍｇ／ｋｇの抗ＶＥ−ＰＴＰ細胞外ドメイン抗体をＰ１２、１４および１６日目に皮下投与した後の、Ｐ１７日目のＣ５７ＢＬ／６マウスの網膜血管新生平均面積（ｍｍ^２）を示す。

一般的な定義
この明細書およびそれに続く特許請求の範囲において、いくつかの用語が参照されるが、それらは以下の意味を有すると定義される。

「ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤」と「特異的結合剤」という用語は本明細書では交換可能に使用され、ＨＰＴＰβのＴｉｅ２デホスホリラーゼ活性を阻害する、ＨＰＴＰβの細胞外部分並びに本明細書で定義されるその変異体および誘導体に特異的に結合する分子を指す。

「剤（ａｇｅｎｔ）」は、ここでは特に断らない限り「ＨＰＴＰβ結合剤」を指す。

「ＨＰＴＰβ−ＥＣＤを特異的に結合する」は、本発明の特異的結合剤がＨＰＴＰβの細胞外ドメインのエピトープを認識し、他の関連および／または非関連分子に対するよりも高い親和性でそれに結合する能力を指す。特異的結合剤は、タンパク質および／または巨大分子の複雑な混合物において優先的にＨＰＴＰβに結合する。特異的結合剤は、好ましくはＨＰＴＰβに対し選択的である。「選択的」とは、剤が、他の分子に対し全く不活性であるということではなく、他の関連および／または非関連分子に対するよりもＨＰＴＰβに対しはるかに大きい活性を有するという意味である。例えば、選択的剤は、他の関連または非関連分子に対するよりもＨＰＴＰβに対し１０倍、１００倍または１０００倍の選択性を示しうる。

「抗ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ抗体」という用語は、ＨＰＴＰβの細胞外ドメインに結合する抗体または抗体断片を指す。抗ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ抗体は、本明細書で定義されるような種類のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤である。

「ＶＥ−ＰＴＰ」という用語は、ＨＰＴＰβのマウスオーソログを指す。

全てのパーセンテージ、比率および割合は、本明細書では、特に断らない限り、重量による。全ての温度は特に断らない限り摂氏（℃）である。

ここでは範囲は１つの特定の値から別の特定の値まで、両端の値を含んで表され得る。例えば、「１ｍｇ〜５０ｍｇ」の範囲には１ｍｇと５０ｍｇの特定の値が含まれる。「約」という先行詞は値が近似値であることを意味する。例えば、「約１ｍｇ〜約５０ｍｇ」の範囲とは、値が近似値であることを意味する。さらに、このような範囲が示される場合、「１ｍｇ〜５０ｍｇ」の範囲が含まれる。範囲の両端の値は、互いの関係において、および互いに独立して有意味であることがさらに理解されよう。例えば、「１ｍｇ〜５０ｍｇ」の範囲は「３０ｍｇ〜４０ｍｇ」の範囲を含む。

ここでは、「併用で」という用語は２つ以上の予防薬および／または治療薬の使用を指す。「併用で」という用語の使用は、予防薬および／または治療薬が患者に投与される順番を限定するものではない。第１の予防薬または治療薬は、疾病を有したか、有するか、またはそれに感染しやすい患者への第２の予防薬または治療薬の前に（例えば、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、または１２週前）、それと同時に、またはその後で（例えば、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週または１２週後）に投与され得る。予防薬または治療薬は、本開示の剤が他の剤と共に作用でき、別の方法で投与されるよりも高い利益がもたらされるような順番で、かつ間隔内に、患者に投与される。任意追加の予防薬または治療薬を他の追加の予防薬または治療薬と一緒にあらゆる順番で投与してよい。

「有効量」とは、治療される患者の症状を寛解または予防するか、または生存期間を延長する効果のある活性剤またはその併用の量を意味する。有効量は、当技術分野で既知の、治療されるヒトまたは動物の疾患状態、年齢、性別および体重などの要因により変わり得る。本明細書では実施例の中で特定の投与レジメンを記載する場合があるが、当業者であれば、投与レジメンは、最適の治療反応を得るために変更され得ることを理解しよう。例えば、用量を何回かに分けて毎日投与してもよいし、治療状況の緊急事態によっては比例的に減量してもよい。さらに、本開示の組成物は、治療量を得るため必要に応じた頻度で投与してよい。治療上有効な量は、当業者であれば、特に本明細書における詳細な開示に鑑み決定する能力が十分ある。

ここでは、「阻害する」または「阻害している」という用語は、統計的に有意かつ測定可能な活性の低下、好ましくは、対照に対し少なくとも約１０％の低下、より好ましくは約５０％以上の低下、さらに好ましくは約８０％以上の低下を指す。

ここでは、「増加させる」または「増加する」という用語は、統計的に有意かつ測定可能な活性の増加、好ましくは、対照に対し少なくとも約１０％の増加、より好ましくは約５０％以上の増加、さらに好ましくは約８０％以上の増加を指す。

「ＨＰＴＰベータ」または「ＨＰＴＰβ」はここでは交換可能に使用され、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼベータの略語である。

ここでは、「対象」とは個体を意味する。したがって、「対象」は、飼われる動物（例えばネコ、イヌなど）、家畜（例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）およびトリを含み得る。「患者」も、霊長類またはヒトなどの哺乳動物を含み得る。ここでは「対象」と「患者」は交換可能に使用される。好ましくは、対象はヒトである。

「低下させる（reduce）」または「低下する」または「低下」などの変化形は、ある事象または特徴（例えば血管漏出）を低下させることを意味する。これは、典型的には何らかの標準または期待値との関係において、言い換えれば相対的であるが、必ずしも標準または相対値に言及する必要はないことが理解される。

「治療」、「治療している」「治療する」などの用語は、宿主の疾患または疾病を緩和する、および／または疾患（例えば血管漏出）関連の特定の特徴または事象を軽減する、阻害する、または除去するなどの所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。したがって、「治療」という用語には、特に宿主がその疾患にかかる素因を有するがまだその疾患とは診断されていない場合に宿主における疾病の発症を予防すること；その疾病を阻害すること；および／またはその疾病を軽減または逆転することを含む。本発明の方法は疾病予防に関するが、「予防」という用語は、疾患状態が完全に妨害されていることは要しない。むしろ、ここでは、予防という用語は、本発明のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤の投与が疾患発症前に生じ得るように、疾病にかかりやすい集団を同定する当業者の能力を指す。この用語は疾患状態の完全回避は含意しない。

ここでは「癌治療」という用語は、限定ではなく化学療法および放射線療法を含む当技術分野で既知の任意の癌治療を意味する。

ここでは「癌治療」という用語は、限定ではなく化学療法および放射線療法を含む当技術分野で既知の任意の癌治療を意味する。

本明細書の説明と特許請求の範囲を通して、「含む」という用語および「含んでいる」「含む（三人称）」などの変化形は、限定ではなく含むことを意味し、例えば他の添加剤、成分、整数またはステップを除外する意図はない。

本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数形の指示物を包含する。したがって、例えば、「（単数形の）組成物」への言及は、そのような組成物の２以上の混合物を含む。

「所望の」または「所望により」とは、その後ろに記載された事象又は状況が発生することもしないこともでき、および、該記載は事象又は状況が発生する場合と発生しない場合を含む。

「ＨＰＴＰβを特異的に結合する」は、本発明の剤がＨＰＴＰβの細胞外ドメインのエピトープを認識し、他の関連および／または非関連分子に対するよりも高い親和性でそれに結合する能力を指す。剤は、好ましくはＨＰＴＰβに対し選択的である。「特異的」とは、剤が、他の分子に対し全く不活性であるということではなく、他の関連および／または非関連分子に対するよりもＨＰＴＰβに対しはるかに大きい活性を有するという意味である。例えば、選択的剤は、他の関連または非関連分子に対するよりもＨＰＴＰβに対し１０倍、１００倍または１０００倍の選択性を示しうる。

「エピトープ」という用語は、剤の抗原結合領域の１つ以上において剤に認識され結合される能力のある任意の分子の任意の部分を指す。エピトープは通常、アミノ酸、糖、脂質、ホスホリルまたはスルホニルなどの異なる表面基からなり、ある特定の実施形態では、特異的な３次元構造特徴および／または特異的な電荷特徴を有し得る。本明細書ではエピトープは立体構造でも直線型でもよい。

「ペプチボディー」は、少なくとも１つのペプチドに付着した抗体Ｆｃドメインを含む分子である。ペプチボディーの生産は一般に国際公開第２００２／２４７８２号に記載されている。

「断片」は剤の一部分を指す。断片は、剤の望ましい生物学的活性を保持し得、剤自体と見なされ得る。例えば、アミノ末端および／またはカルボキシ末端および／または内部アミノ酸残基が欠失している切断されたタンパク質は、そのタンパク質の断片であり、イムノグロブリン分子のＦａｂは該イムノグロブリンの断片である。そのような断片は、直接的な結合（例えばペプチドまたはジスルフィド結合）により、またはリンカーにより、別の分子に結合され得る。

「タンパク質」はここではペプチドとポリペプチドと交換可能に使用される。

本発明のペプチドは、限定ではなく、約３〜約７５のアミノ酸、または約５〜約５０のアミノ酸、または約１０〜約２５のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。ペプチドは、天然または人工的なアミノ酸配列であり得る。

本発明のタンパク質は、当技術分野では周知の、例えば標準的直接的ペプチド合成法を使用して、例えば固相合成により得てよい。遺伝子シーケンスが既知であるか推定できる場合は、そのタンパク質は標準的な組換え法により生産され得る。タンパク質は当業者に知られる様々な方法で単離または精製され得る。標準的な精製法は、塩を用いての沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー法などを含む。

「誘導体」は、挿入、欠失または置換変異体とは異なる何らかの方法で化学的に修飾されている結合剤を含む。例えば、結合剤がタンパク質である場合、カルボキシル末端はＮＨ_２などのアミノ基でキャップされ得る。

いくつかの実施形態では、１以上の分子は互いに結合して剤を形成する。例えば抗体断片はリンカーにより結合され得る。一般に、リンカーは主として空間として働くのでその化学構造は重要ではない。ある実施形態では、リンカーは、ペプチド結合により互いに結合するアミノ酸でできている。別の実施形態では、リンカーは、非立体的障害Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基などの非ペプチドリンカーである。別の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカーである。リンカーは、分子上の多くの場所に挿入され得ることをさらに理解されたい。

剤の変異体が本発明の範囲に含まれる。「変異体（単数）」または「変異体（複数）」は、本明細書では非変異体剤のタンパク質またはヌクレオチド配列と実質的に同じタンパク質またはヌクレオチド配列を有し、非変異体剤と同様の活性を有する剤を意味する。タンパク質またはヌクレオチド配列は、本発明が包含する変異体を生じる、置換、欠失、切断、挿入および他の修飾を含むあらゆる方法で改変され得る。そのような操作方法は、当技術分野では周知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (およびアップデート版) Ausubel et al., Eds (1996), John Wiley and Sons, New York: Methods in Molecular Biology, Vol. 182, In Vitro Mutagenesis Protocols, 2nd Edition, Barman Ed. (2002), Humana Press）およびそこに引用される文献を参照されたい。例えば、変異体は、アミノ酸残基が結合剤の既知のアミノ酸配列に挿入、そこから欠失および／またはそこに置換されたペプチドおよびポリペプチドを含む。ある実施形態では、アミノ酸の置換は、変異体の生化学的特性を最小限しか改変しない点において保存的である。他の実施形態では、変異体は、インビボ若しくはインビトロのタンパク質酵素処理、化学修飾、または修飾アミノ酸を用いてのタンパク質合成で達成され得る、全長タンパク質の活性断片、化学修飾タンパク質、親和性若しくはエピトープタグまたは蛍光若しくは他の標識部分を付加されて修飾されたタンパク質であり得る。

融合タンパク質も本明細書で企図される。当業者は、既知の方法を用いて、天然型とは異なるが有用であり得る、本発明のタンパク質の融合タンパク質を作製できよう。例えば、融合パートナーは、合成部位から別の部位へのタンパク質の転移を共翻訳的または翻訳後に指令するシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列であり得る（例えば酵母α因子リーダー）。あるいは、それは本発明のタンパク質の精製または同定を促進するために付加され得る（例えば、ポリＨｉｓ、Ｆｌａｇペプチドまたは蛍光タンパク質）。

標準的な技法が組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養と形質転換（例えば電気穿孔、リポフェクション）に使用され得る。酵素反応および精製技法が製造者または業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、実行される。技法と手順は、一般に、当技術分野で公知の一般的な方法に従い、本明細書全体で引用され論じられる様々な一般的およびより具体的な参照物において記載されるように、実施される。特に断らない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学および医薬化学と関連して使用される命名法およびそれらの実験手順および技法は当技術分野で既知であり一般的に使用されているものである。標準的技法は、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤および送達、および患者治療に使用され得る。

ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤
本発明において有用な剤には、限定ではなく、ＨＰＴＰβの細胞外部分に特異的に結合し、少なくとも１つのＨＰＴＰβのホスファターゼ活性を阻害する抗体、タンパク質、ダルピンズ（darpins）、ペプチド、アプタマー、アドネクチン、ペプチボディーまたは核酸が含まれる。本明細書では「ホスファターゼ活性」は、酵素活性および生物学的活性を含み、生物学的活性はＴｉｅ２リン酸化を評価して測定される。

本発明において有用な剤は、以下をさらに含む：ＨＰＴＰβの細胞外部分に結合する抗体またはそれらの抗原結合断片であって、抗体またはその抗原結合断片は少なくとも１つのＨＰＴＰβ活性を阻害する。これらの剤は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。剤は、抗体の断片であってもよく、ここで断片は重鎖および軽鎖可変領域を含み、または断片はＦ（ａｂ’）_２であり、または断片はＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖの二量体または三量体、または抗体由来のジアボディ、トリアボディまたはテトラボディである。

例えば、剤は、限定ではなく、ＨＰＴＰβの細胞外部分に結合する抗体または抗体断片；または具体的にはＨＰＴＰβのＦＮ３繰り返し体に結合する抗体、またはより具体的にはＨＰＴＰβの第１のＦＮ３繰り返し体に結合する抗体であり得る。

剤は、その全容が本明細書に組み込まれている米国特許第７，９７３，１４２号に記載されるモノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６をさらに含む。（抗体の産生に使用され得るマウスハイブリドーマ、Ｂａｌｂｃ脾臓細胞（Ｂ細胞）は郵便番号２０１０８、米国バージニア州マナサス私書箱１５４９のアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２００６年５月４日に寄託され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７５８０を割り当てられている）（本明細書ではＲ１５Ｅ６と呼ばれる））Ｒ１５Ｅ６と実質的に同じ生物学的特徴を有する抗体；Ｒ１５Ｅ６の抗体断片であって、断片は重鎖および軽鎖可変領域を含む；Ｒ１５Ｅ６のＦ（ａｂ’）_２；Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖの二量体または三量体；およびＲ１５Ｅ６由来のジアボディ、トリアボディまたはテトラボディ。

具体的には、本発明での使用に適する剤は、既知の技法により得られる、単独または他のアミノ酸配列との併用の抗体、抗体断片、その変異体または誘導体である。そのような技法には、限定ではなく、酵素的切断、化学的切断、ペプチド合成または組換えの技法が含まれる。本発明はさらに誘導体剤、例えばペプチボディーを包含する。

したがって、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤の１つの実施形態は抗体であり、別の実施形態はタンパク質であり、さらに別の実施形態はペプチドであり、別の実施形態はダルピンであり、別の実施形態はアプタマーであり、別の実施形態はペプチボディーであり、さらに別の実施形態はアドネクチンであり、別の実施形態は核酸である。いくつかの実施形態では、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤はモノクローナル抗体であるか、ポリクローナル抗体である。特定の実施形態では、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤに結合できる抗体断片である。好ましくは、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、抗体または抗体断片であり、限定ではなくＨＰＴＰβの細胞外部分に結合するＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂの二量体、Ｆｖ、Ｆｖの二量体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、Ｆａｂの二量体、Ｆｖ、Ｆｖの二量体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、Ｆａｂの三量体、Ｆｖの三量体、ｓｃＦｖの三量体、ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、タンパク質、ペプチド、アプタマー、ペプチボディー、アドネクチンまたは核酸を含む。ある特定の実施形態では、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤はモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）_２である。いくつかの実施形態では、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は複数のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合部位を含み、例えばＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は無傷の抗体、またはＦ（ａｂ’）_２、またはＦａｂの二量体、またはＦａｂの三量体である。例えば、いくつかの実施形態ではＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、同一または別のエピトープで同時に２つのＨＰＴＰβ分子に結合でき、それによって該２つのＨＰＴＰβ分子を互いに近接させる。別の実施形態ではＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、同一または別のエピトープで同時に３つのＨＰＴＰβ分子に結合でき、それによって該３つのＨＰＴＰβ分子を互いに近接させる。別の実施形態では、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７６８０により産生されたモノクローナル抗体である。さらに別の実施形態では、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７６８０により産生されたモノクローナル抗体の抗原結合断片である。さらに別の実施形態では、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７６８０により産生されたモノクローナル抗体と同じまたは実質的に同じ生物学的特徴を有する抗体またはその抗原結合断片である。

本願に開示のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤のどの実施形態も、ビヒクルに共有結合または非共有結合していてよい。「ビヒクル」という用語は、剤の生物学的特性に影響を及ぼす分子を指す。例えば、ビヒクルは、剤の劣化を回避および／または半減期、吸収を増加、毒性を低下、免疫原性を低下、または生物学的活性を増加し得る。例示的ビヒクルには、限定ではなく、イムノグロブリンのＦｃドメイン；ポリマー、例えば：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリジン、デキストラン；脂質；コレステロール群（ステロイドなど）；炭水化物、デンドリマー、オリゴ糖またはサルベージ受容体に結合するペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ビヒクルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、他の実施形態ではビヒクルはポリリジンであり、さらに別の実施形態ではビヒクルはデキストランであり、さらに他の実施形態ではビヒクルは脂質である。

それらの全容が本明細書に組み込まれる米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号および同第４，１７９，３３７号に記載されるような、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールなどの水溶性ポリマー付着物（attachments）。さらに他の当技術分野で既知の有用なポリマーには、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたは他の糖質系ポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリ酸化プロピレン／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、並びにこれらのポリマーの混合物が含まれる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットで共有結合的に修飾されたペプチボディーである。水溶性ポリマーは、特定の位置、例えばペプチボディーのアミノ末端、またはポリペプチドの１以上の側鎖にランダムに結合し得る。剤、例えばペプチボディーおよび具体的にはヒト化抗体の治療能力を向上させるためのＰＥＧの使用が米国特許第６，１３３，４２６号に記載されている。本発明はまた、ペプチドおよび／または剤のビヒクル部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）の誘導体化も企図する。そのような誘導体は、剤の溶解性、吸収、生物学的半減期などを改良し得る。部分（moieties）は代わりに剤の任意の望ましくない副作用などを排除または緩和し得る。

「抗体」（Ａｂ）という用語は、本明細書では、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二特異性抗体）、一本鎖抗体、例えば、ラマおよびラクダ由来の抗体、所望の生物学的活性、例えば抗原結合活性を示す限り抗体断片、例えば、可変領域および／または定常領域断片を含む。「イムノグロブリン」（Ｉｇ）という用語は、ここでは「抗体」と交換可能に使用される。

「抗原結合断片」は、本明細書では、ＨＰＴＰβの一部分に結合し少なくとも１つのＨＰＴＰβのホスファターゼ活性を阻害する剤の断片である。

基本の４本鎖抗体ユニットは、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、追加のＪ鎖と呼ばれるポリペプチドと共に、５つの基本ヘテロ四量体ユニットからなるので、１０個の抗原結合部位を含むが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、Ｊ鎖と共に塩基性４本鎖ユニット２〜５つを含む多価の集合を形成し得る）。ＩｇＧの場合、４本鎖ユニットは一般に約１５０キロダルトン（ｋＤａ）である。各Ｌ鎖は１つのＨ鎖に１つの共有結合的ジスルフィド結合で連結され、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖イソタイプによって、互いに１以上のジスルフィド結合で連結されている。各Ｈ鎖とＬ鎖は、規則的な間隔で鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖はＮ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と、それに続いてα鎖とγ鎖のそれぞれは３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）を、μイソタイプとεイソタイプは４つのＣ_Ｈドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）と、それに続く定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を他端に有する。Ｖ_ＬはＶ_Ｈと整列し、Ｃ_Ｌは重鎖の第１の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）と整列する。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖可変ドメインの界面を形成すると考えられている。Ｖ_ＨとＶ_Ｌの対合は共に１つの抗原結合性部位を形成する。抗体の異なるクラスの構造と特性については、例えばBasic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, 1994の71ページ第６章を参照されたい。

どの脊椎動物種由来のＬ鎖も、定常ドメインのアミノ酸配列によって、明白に区別できるカッパとラムダと呼ばれる２種類のうち１つに割り当てられる。重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）のアミノ酸配列により、イムノグロブリンは５つの別々のクラスまたはイソタイプに割り当てられ得る。イムノグロブリンには５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと命名された重鎖を有する。ガンマとアルファのクラスは、Ｃ_Ｈ配列および機能の比較的マイナーな差に基づいてさらにサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは次のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。

ラクダ科を構成する、例えばラマ、ラクダおよびヒトコブラクダは、軽鎖が欠失しているうえにＣ_Ｈ１ドメインも欠失している独特の種類の抗体を有する（Muyldermans, S., Rev. Mol. Biotechnol., 74, 277-302 (2001)）。これら重鎖抗体の可変領域は、Ｖ_ＨＨまたはＶＨＨと命名され、機能性イムノグロブリン由来の入手可能な最小（１５ｋＤａ）の無傷の抗原結合断片を構成している。

「可変」という用語は、可変ドメインのある特定のセグメントの配列が抗体間で大きく異なる事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗体の抗原に対する特異性を定める。しかし、可変性は可変ドメインの１１０個のアミノ酸全長にわたって均等に分布しているわけではない。代わりに、Ｖ領域は、各９〜１２アミノ酸長と短い高可変性の「超可変領域」と呼ばれる領域により分離された、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的可変性のない１５〜３０個のアミノ酸の伸長部からなる。天然のの重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４つのＦＲを含み、主としてβシート構造をとり、該βシート構造を接続し場合によっては一部を形成しているループを形成する３つの超可変領域により接続されている。各鎖の超可変領域はＦＲにより互いに近接近しており、他方の鎖の超可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に貢献する。定常ドメインは抗体の抗原結合に直接は関与しないが、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など様々なエフェクター機能を呈する。

「超可変領域」という用語は本明細書では抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えばＶ_Ｌのだいたい残基２４〜３４（ＬＩ）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）の周り、およびＶ_Ｈのだいたい１〜３５（ＨＩ）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）の周り；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）および／または「超可変ループ」由来の残基を含む。

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書では実質的に均質な抗体の母集団から得られた抗体を指し、すなわち、母集団を構成する個々の抗体は、ごく少量で存在し得る可能な天然の突然変異を除き同一である。異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体の調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は単一のエピトープすなわち単一の抗原決定基に対する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体に汚染されることなく合成され得るという点が利点である。「モノクローナル」という修飾語は、何らかの特定の方法で抗体を産生することを要するとみなしてはならない。例えば、本発明で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法で調製してもよいし、細菌、真核生物の動物または植物の細胞において組換えＤＮＡ法を用いて作製してもよい（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。「モノクローナル抗体」は、ファージ抗体ライブラリから利用可能な技法、例えばClackson et al., Nature, Vol. 352, pp. 624-628 (1991)を利用して単離してもよい。

モノクローナル抗体は、本明細書では、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の種由来の抗体の対応する配列と同一か類似であるか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属し、鎖（複数可）の残りの部分が別の種由来の抗体の対応する配列と同一か類似であるか、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する「キメラ」抗体、並びに所望の生物学的活性を示す限りそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号および Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851- 6855 (1984)を参照）。

「抗体断片」は、多量体抗体の一部分、好ましくは無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂの二量体および三量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ミニボディ；ジアボディ、トリアボディおよびテトラボディ；直鎖状抗体（Hudson et al., Nature Med. 9, 129-134 (2003)を参照）が含まれる。

「Ｆｖ」は最小の抗体断片であり完全な抗原結合部位を含む。この断片は、緊密に非共有結合した１つの重鎖と１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みから、アミノ酸残基を抗原結合に寄与して抗体に抗原結合特異性を与える６つの可変ループ（Ｈ鎖とＬ鎖からそれぞれ３つずつ）が出ている。しかし、１個の可変ドメイン（またはある抗原に特異的なＣＤＲを３つだけ含むＦｖの半分）であっても抗原を認識し結合する能力があるので、Ｆｖの定義に含まれる。

一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、イムノグロブリンの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）が１０〜約２５アミノ酸長の短いリンカーペプチドで連結された融合タンパク質である。リンカーは通常、溶解性のためのセリンまたはスレオニンのみならず柔軟性のためのグリシンにも富み、Ｖ_ＨのＮ末端をＶ_ＬのＣ末端と、またはその逆のいずれかを連結できる。このタンパク質は、定常領域の除去とリンカーの導入にもかかわらず、もとのイムノグロブリンの特異性を保持している。

二価（divalentまたはbivalent）の一本鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ）が２つのｓｃＦｖを結合することにより設計され得る。このことは、２つのＶ_Ｈと２つのＶ_Ｌ領域を有する単一のペプチド鎖を生産しタンデムｓｃＦｖを得ることにより実施され得る。別の可能性は、２つの可変領域を共に折り畳むには短すぎるリンカーペプチド（約５アミノ酸）を用いてｓｃＦｖを作製しｓｃＦｖを二量体化させることである。このタイプはジアボディとして知られる。ジアボディは、対応するｓｃＦｖよりも４０倍まで低い解離定数を有することが知られ、これは標的に対しはるかに高い親和性を有することを意味する。したがって、ジアボディ薬物は他の抗体医薬よりもはるかに低用量で投与でき、インビボではるかに高い特異性で腫瘍を標的化する能力がある。さらに短いリンカー（１または２つのアミノ酸）は、いわゆるトリアボディまたはトリ（トライ）ボディと呼ばれる三量体の形成をもたらす。テトラボディは、標的に対しジアボディよりもはるかに高い親和性を示すことが知られ、それが示されている。

「ヒト化抗体」または「ヒト抗体」は、非ヒト種（例えばマウス）由来の重鎖および軽鎖可変領域の配列を含むが、少なくともＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列の一部分はより「ヒト様」に、すなわちヒト生殖系の可変配列に類似して改変されている抗体を指す。ヒト化抗体の１つのタイプはＣＤＲグラフト化抗体であり、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列に導入されて、対応する非ヒトＣＤＲ配列と置き換わっている。キメラ、ＣＤＲグラフト化およびヒト化抗体を作製する方法は当業者には既知である（例えば米国特許第４，８１６，５６７号および同第５，２２５，５３９号を参照）。ヒト抗体を作製する１つの方法ではトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物を使用する。これらのトランスジェニック動物は、それら自体のゲノムに挿入されたヒト抗体産生ゲノムの相当な部分を含み、動物自体の内在性の抗体産生は抗体産生において不十分にされている。そのようなトランスジェニック動物を作製する方法は、当技術分野では既知である。そのようなトランスジェニック動物は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ．ＲＴＭ．技法を使用して、または「小遺伝子座（minilocus）」法を使用して作製してよい。ＸｅｎｏＭｉｃｅ．ＲＴＭ．を作製する方法は米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号および同第６，０７５，１８１号に記載されている。「小遺伝子座」方を使用してトランスジェニック動物を作製する方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号および国際公開第９３／１２２２７号に記載されている。

非ヒト抗体のヒト化は近年ルーチンになり、今や当業者に既知である。例えばXoma社、Aries社、Medarex社、PDL社およびCambridge Antibody Technologies社などのいくつかの企業がヒト化抗体を作製するサービスを提供している。ヒト化プロトコルは、例えば、Kipriyanov and Le Gall, Molecular Biotechnol., Vol. 26, pp. 39-60 (2004), Humana Press, Totowa, N.J.; Lo, Methods Mol. Biol., Vol. 248, pp. 135-159 (2004), Humana Press, Totowa, N.J.; Wu et al., J. Mol. Biol., 294, pp. 151-162 (1999)などの技術文献に広く記載されている。

ある特定の実施形態では、本発明において有用な抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現され得る。特定の抗体をコードする配列を、例えばポリヌクレオチドをウイルス（またはウイルスベクター）内に包み宿主細胞にウイルス（またはベクター）を形質導入する、または米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号および同第４，９５９，４５５号に例示されるような当技術分野で既知の形質移入手順を含む、ポリヌクレオチオドを宿主細胞に導入する既知の方法により、適当な哺乳動物宿主細胞の形質転換に使用してよい。使用される形質転換手順は形質転換される宿主により得る。異種性ポリヌクレオチオドを哺乳動物細胞に導入する方法は当技術分野で既知であり、限定ではなく、デキストラン媒介形質移入、カルシウムリン酸沈殿、ポリブレン媒介形質移入、原形質体融合、電気穿孔、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソーム内への封入、核酸と正に帯電した脂質の混合、およびＤＮＡの核への直接的マイクロインジェクションが含まれる。

抗体の重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域または軽鎖可変領域、またはその断片のアミノ酸配列をコードする核酸分子を、所望により適当に組み合わせて、標準的なライゲーション法を用いて適切な発現ベクターに挿入する。抗体重鎖または軽鎖定常領域は、適切な可変領域のＣ末端に付けられ結合されて発現ベクターにされ得る。ベクターは、典型的には使用する特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは宿主細胞の機構と適合するので遺伝子の増幅および／または遺伝子発現が生じ得る）。発現ベクターの概説については、Methods Enzymol. Vol. 185 (Goeddel, ed.), 1990, Academic Pressを参照されたい。

特異的結合剤の特定
適切な選択的結合剤は、当技術分野で既知の様々な技法を用いて特定され得る。例えば、候補剤は、ＨＰＴＰβへの結合についてスクリーニングされ得、および活性についてスクリーニングされ得る。一般に、候補剤は、最初に結合ついてスクリーニングされ、選択的結合を示すものは次いでＴｉｅ２のＨＰＴＰβ媒介脱リン酸化を阻害する能力を決定するスクリーニングに供される。しかし、場合によっては、候補剤は最初にインビトロで活性をスクリーニングされる。

結合活性の決定
特異的結合剤の特定に使用される適切なアッセイの選択は、スクリーニングされる候補剤の性質による。当業者であれば、特定の候補剤の適切なアッセイを選択できよう。

例えば、候補が抗体またはＦｃ部分を有するペプチボディーである場合、実施例３Ｂに記載するようなＦＡＣＳ分析により、ＨＰＴＰβを発現する細胞に結合する能力に基づき候補剤が選択できる。細胞は、内在的にＨＰＴＰβを発現してもよいし、遺伝子操作されてＨＰＴＰβを発現してもよい。

アプタマーなどの他の候補剤については、他の技法が当技術分野で知られている。例えば、ＨＰＴＰβに特異的に結合するアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）として知られる、反復回のインビトロの選択を通じて特異的なアプタマーを選択する技法を用いて選択され得る。

ウエスタンブロットによる阻害剤の活性決定
実施例４に例示されるように、１つの適切なアッセイではＨＵＶＥＣが無血清培地において様々な濃度の候補剤の存在または不存在下で培養され、細胞溶解物が調製され、Ｔｉｅ２抗体を用いて免疫沈降され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離され、ＰＶＤＦ膜に転写される。膜に結合した免疫沈降されたタンパク質は次いで連続的ウエスタンブロットに供され、抗ホスホチロシン抗体を用いてＴｉｅ２リン酸化を定量化し、次いでＴｉｅ２抗体を用いて全Ｔｉｅ２を定量化する。Ｔｉｅ２リン酸化は、抗ホスホチロシンシグナルの全Ｔｉｅ２シグナルに対する比率として表す。抗ホスホチロシンシグナルのレベルのほうが大きいことは、候補剤によりＨＰＴＰβがより阻害されていることを示す。

スクリーニングされ得る候補剤は、限定ではなく、植物または動物の抽出物などの天然物を含む既知の剤のライブラリ、タンパク質、限定ではなくランダムペプチドライブラリおよびコンビナトリアルケミストリー由来のＤ体またはＬ体アミノ酸でできた分子ライブラリのメンバーを含むペプチド、限定ではなくポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２およびＦａｂ発現ライブラリ断片およびそのエピトープ結合断片を含む抗体を含む生物学的活性分子を含む。

ここでは「抗体断片」は、限定ではなく、抗体由来のＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂの二量体または三量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはジアボディ、トリアボディまたはテトラボディを含む。

本願を通して、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、技術水準をさらに十分に記載するために、その全容がここで本願に参照により組み込まれる。

血管内皮は全血管の内側を覆い、血漿および白血球細胞の血流への出入りを制御する非血栓形成性表面を形成している。無活動性内皮は数か月〜数年の速さで代謝回転し、血管新生の活性化後にのみ増殖する。無活動性内皮の欠失は、炎症、粥状動脈硬化症、再狭窄、血管新生および様々なタイプの脈管障害などの状態の一般的な特徴である。

血管形成および血管新生は、健康な成体では下方制御されており、女性生殖系器官を除き、低酸素症または炎症などの微小環境要因により血管新生が誘発される場合の病理にほぼ排他的に関連する。これらの血管新生に関連するまたは誘発される病理プロセスは、癌、乾癬、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、血栓症および関節炎および粥状動脈硬化症を含む炎症性疾患などの多様な疾患を含む。しかし、ある特定の場合には、不十分な血管新生により、虚血性心疾患や癇前症などの疾患につながり得る。

無活動性血管内皮は、血漿および細胞が血流路から下の組織に通過するのを制御する緊密なバリアを形成する。内皮細胞は、特定の細胞内構造シグナル伝達複合体に連結される接合型膜貫通タンパク質により互いに接着している。内皮層は休止状態から活性状態に移行することができ、内皮が活性化すると、接着分子が発現する。この内皮活性化は、血管形成、炎症および炎症関連疾患が開始する要件である。

Ｔｉｅ−２は、内皮分化を制御する内皮細胞に独占的に発現する受容体様チロシンキナーゼである。Ｔｉｅ−２は、刺激性リガンドのアンジオポエチン−１（Ａｎｇ−１）に結合しこれにより活性化され、Ａｎｇ−１は、Ｔｉｅ−２受容体の自己リン酸化を促進し、内皮細胞生存率を促進し基底膜の溶解を回避して血管構造を安定化することになる一連の事象をもたらす。したがって、Ｔｉｅ−２の活性化は、無活動性の無傷の血管内皮を維持することで血管系の漏出を減弱化する方法である。Ｔｉｅ−２活性化は、Ｔｉｅ−２に競合的に結合してＴｉｅ−２のリン酸化を妨害するＡｎｇ−１拮抗作用を示すＡｎｇ−２により阻害される。Ａｎｇ−２のレベル上昇は、炎症性疾患、とりわけ敗血症、狼瘡、炎症性腸疾患および癌などの転移性疾患と関連があることがわかっている。

高Ａｎｇ−２レベルの持続中、内皮には開裂や破断が生じ、血管漏出症候群が引き起こされる。血管漏出症候群は、組織および肺の浮腫などの命にかかわる結果となる。多くの疾患状態にとって、上昇したＡｎｇ−２レベルは、疾患状態や病状が存在することの明白なマーカーである。疾患状態が解消されると、Ａｎｇ−１／Ａｎｇ−２のバランスが回復し、血管内皮は安定化する。Ａｎｇ−１とＡｎｇ−２の正常なバランスが中断されている状態において、本開示の剤は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼ−β（ＨＰＴＰ−β）の阻害を通じてリン酸化Ｔｉｅ−２の脱リン酸化を阻害することでＴｉｅ−２シグナル伝達を増幅することが見出されている。さらに、本開示の剤は、非常に制御されたやり方で量を変えて使用してＴｉｅ−２シグナル伝達量を増加させることができ、それによってＴｉｅ−２増幅レベルを決定できる。

本開示は、血管漏出症候群の患者を治療する方法を提供し、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む。本開示の組成物は、１以上の薬剤的に許容可能な賦形剤も含んでよい。

ここでは、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物が開示され、該組成物は、開示の病状、病気、傷害の治療、治療過程、細胞治療などに有用である。

１つの実施形態では、方法は、炎症性疾患または状態に苦しむ患者の血管漏出を治療することを含み、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態は、身体外傷に苦しむ患者を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。１つの特定の実施形態では、外傷は手術外傷である。１つの実施形態では、方法は、ショックに苦しむ患者を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。

特定の実施形態は、出血後のショック、外傷後のショックまたは敗血症性ショックを含む。本開示は、成人呼吸促迫症候群の患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することにより、該患者を治療する方法も提供する。別の実施形態は、急性肺傷害に苦しむ患者を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。癌の転移と細菌およびウィルス感染症は以下に記載する。

いくつかの実施形態では、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、予防的に投与され、患者を血管漏出の危険にさらす事象が起きる前に患者の血管系を安定化させる。１つの実施形態では、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、予防的に投与され、手術前に患者の血管系を安定化させる。さらに別の実施形態は、患者における血管漏出症候群を予防する方法であって、化学療法を受ける前に患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を投与する。別の実施形態は、ショックの危険がある患者を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を投与することを含む。

本開示のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、ヒトおよび動物における腫瘍の転移を予防、減衰、最小限化、制御および／または減少させるのに使用してよい。本開示のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は原発腫瘍の増殖速度の遅滞にも使用できる。したがって、ここに開示する剤は、１以上の薬物または他の薬剤との併用治療の一部として投与できる。併用治療の一部として使用される場合、本開示の剤による転移の低減と原発腫瘍増殖の減少により、患者の治療に使用されている任意の薬剤的または薬物療法がより有効かつ効率的に使用できる。さらに、本開示の剤により転移を制御することで、対象は疾患を１か所集中する大きな能力が与えられる。

したがって、本開示の１つの実施形態は、患者の癌を治療する方法であって、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態は、癌患者における転移を予防する方法であって、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、癌患者における腫瘍転移を最小限化する方法であって、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む。本明細書では、悪性腫瘍の転移を予防するかまたは腫瘍増殖速度を低下させる方法を開示する。したがって、別の実施形態は、悪性腫瘍を有すると診断された患者を治療する方法であり、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態は、悪性腫瘍を有すると診断された患者の転移を予防する方法であり、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、腫瘍を有すると診断された患者の腫瘍増殖速度を低下させる方法であり、該方法は、患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む。

以下は、本開示の方法および組成物により治療され得る癌の非限定的な例である：白血病、例えば、慢性骨髄性白血病；急性リンパ芽球性白血病、急性小児骨髄性白血病；成人急性骨髄性白血病、有毛細胞白血病；リンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、中枢神経系リンパ腫；星状細胞腫、例えば、小脳星状細胞腫、小児星状細胞腫、毛様細胞星状細胞腫、びまん性星状細胞腫、未分化星状細胞腫、グリオーム、乏突起膠腫、大脳星状細胞腫視覚路神経膠腫および視床下部神経膠腫、脳幹神経膠腫、視覚路、視床下部神経膠腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫；癌、例えば、胸腺腫、胸腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、メルケル細胞癌、副腎皮質癌、副腎皮質癌、基底細胞癌；肉腫、例えば、横紋筋肉腫肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫；虫垂癌；肝外胆管癌；膀胱癌；骨癌；唾液腺癌；脳腫瘍；小児中枢神経系非定型奇形腫様腫瘍／棒状体腫瘍；中枢神経系胚性腫瘍；頭蓋咽頭腫；上衣芽腫；上衣腫；髄芽腫；髄上皮腫；中間分化の松果体実質腫瘍；テント上原始神経外肺葉性腫瘍腫瘍および松果体芽腫；脳および脊髄の腫瘍；乳癌；気管支癌；カルチノイド腫瘍；消化器カルチノイド腫瘍；中枢神経系胚性腫瘍；子宮頸癌；小児脊索腫；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；性腺外胚細胞腫瘍；精巣胚細胞腫瘍；網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃（gastric/stomach）癌；消化器カルチノイド腫瘍；胃腸間質性腫瘍（ｇｉｓｔ）；頭蓋外胚細胞腫瘍；妊娠性絨毛腫瘍；膠芽腫；頭部および頸部の癌；肝細胞（肝臓）癌；ランゲルハンス細胞組織球症；下咽頭癌；島細胞腫瘍；腎臓（腎細胞）癌；咽頭癌；口唇および口腔の癌；肝臓癌；非小細胞肺癌；小細胞肺癌；中皮腫；原発不明の転移性扁平上皮頸癌；口腔（mouth）癌；小児多発性内分泌腫瘍症；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉症；骨髄異形成症候群；多発性骨髄腫；慢性骨髄増殖性疾患；鼻腔および副鼻腔癌；神経芽細胞腫；口腔（oral）癌；中咽頭癌；卵巣癌、例えば、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性腫瘍；膵癌；島細胞腫瘍；乳頭腫；甲状腺癌；副甲状腺癌；陰茎癌；食道癌；咽頭癌；鼻咽頭癌；褐色細胞腫；松果体実質腫瘍；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；前立腺癌；直腸癌；腎細胞（腎臓）癌；腎盂および尿管の癌；セザリー症候群；皮膚癌（非メラノーマ性）；皮膚癌（黒色腫）；眼内黒色腫；悪性黒色腫、小腸癌；転移性扁平上皮頸癌；胃（stomach/gastric）癌；睾丸癌；咽頭癌；腎盂および尿管の移行細胞癌；妊娠性絨毛腫瘍；尿道癌；子宮内膜の子宮癌；膣癌；外陰癌；ワルデンストロームマクログロブリン血症；およびウィルムス腫瘍。

ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、１以上の化学療法剤と併用で投与できる。

「化学療法剤」または「化学療法化合物」は、癌治療に有用な化学物質である。本明細書に開示のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と併用で使用され得る化学療法癌治療剤は、限定ではなく、分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）を含む。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびナベルビン（商標）（ビノレルビン−５’−ノルアナイドロブラスチン）（noranhydroblastine）が含まれる。さらに他の実施形態では、化学療法癌治療剤は、カンプトテシン化合物などのトポイソメラーゼＩ阻害剤を含む。本明細書では「カンプトテシン化合物」は、カンプトサール（商標）（イリノテカンＨＣＬ）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（商標）（トポテカンＨＣＬ）および他のカンプトテシン由来の化合物およびその類似体を含む。本開示の方法と組成物において使用され得る別の化学療法癌治療剤のカテゴリーは、エトポシド、テニポシドおよびミトポドジドなどのポドフィロトキシン誘導体である。本開示は、腫瘍細胞における遺伝子材料をアルキル化する、アルキル化剤として知られる他の化学療法癌治療剤をさらに包含する。これらは、限定ではなく、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロランブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン（chlomaphazin）およびダカルバジンを含む。本開示は、化学療法剤としての代謝拮抗剤を包含する。これらのタイプの剤の例は、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリム（azathioprime）およびプロカルバジンを含む。本開示の方法と組成物において使用され得る追加のカテゴリーの化学療法癌治療剤は、抗生物質を含む。例として、限定ではなく、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣおよびダウノマイシンが含まれる。これらの化合物の多数のリポソーム製剤が市販されている。本開示は、限定ではなく、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ−２６、イホスファミド、タキソールとその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、ミトキサントロン、ＩＦ−２、ゲムシタビン、エルロチニブ、ドキシル、イリノテカンおよびベバシズマブを含む他の化学療法癌治療剤をさらに包含する。

本開示のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤との併用で使用され得る他の抗癌剤には、限定ではなく以下が含まれる：アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール塩酸塩、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン（ambomycin）、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、アントラマイシン、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン塩酸塩、ビスナフィドジメシラート、ビセレシン、ブレオマイシン硫酸塩、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー（carbetimer）、カルボプラチン、カルビシン塩酸塩、カルゼレシン、セデフィンゴール、シロールマイシン（cirolemycin）、クラドリビン、クリスナトールメシレート、シタラビン、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシレート、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン塩酸塩、ドロキシフェン、クエン酸ドロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ズアゾマイシン、エダトレキサート、エルフォミチン（eflomithine）塩酸塩、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン塩酸塩、エルブロゾール、エソルビシン塩酸塩、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エトプリン、ファドロゾール塩酸塩、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン塩酸塩、ヒドロキシ尿素、イダルビシン塩酸塩、イルモホシン、インターロイキン２（組換えインターロイキン２すなわちｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−ｎ１、インターフェロンα−ｎ３、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンγ−１ｂ、イプロプラチン、イリノテカン塩酸塩、ランレオチド酢酸塩、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、リアロゾール塩酸塩、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロソキサントロン塩酸塩、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン塩酸塩、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メノガリル、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン（ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）、ミトスペル（ｍｉｔｏｓｐｅｒ）、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ぺリオマイシン、ペンタムスチン、ペプロマイシン硫酸塩、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロキサントロン塩酸塩、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン塩酸塩、ピューロマイシン、ピューロマイシン塩酸塩、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、サフィンゴール塩酸塩、セムスチン、シムトラゼン、スパルホサートナトリウム、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、テロキサントロン塩酸塩、テモポルフィン、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トレミフェンクエン酸塩、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール塩酸塩、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン硫酸塩、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシン塩酸塩。他の抗癌剤は、限定ではなく、以下を含む：２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、５−エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドックス、アミホスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管新生阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリックス、抗背側化形態形成タンパク質−１、抗アンドロゲン薬、前立腺癌、抗エストロゲン剤、抗新生物薬、アフィジコリングリシナート、アポトーシス遺伝子調節物質、アポトーシス調節物質、アプリン酸、ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、βラクタム誘導体、βアレチン、ベタクラマイシンＢ、ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビサジリジニルスペルミン（bisaziridinylspermine）、ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビセレシン、ブレフラート、ブロピリミン、ブドチタン（budotitane）、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カナリアポックスＩＬ−２、カペシタビン、カルボキサミド−アミノ−トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔＭ３、ＣＡＲＮ７００、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリックス、クロリン（chlorlns）、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、ｃｉｓ−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クランベシジン８１６、クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、クラシンＡ、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム（cycloplatam）、シペマイシン、シタラビンオクホスファート、細胞溶解因子、シトスタチン、ダクリキシマブ（dacliximab）、デシタビン、デヒドロジデムニンＢ、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシホスファミド（dexifosfamide）、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジクオン、ジデムニンＢ、ＤＩＤＯＸ、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジヒドロタキソール、９−，ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、フルオロダウノルニシン（fluorodaunorunicin）塩酸塩、ホルフェニメックス、ホルメスタン、ホストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリクス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモホシン、イロマスタット、イミダゾアクリドン（imidazoacridones）、イミキモド、免疫賦活ペプチド、インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、ヨーベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール、４−，イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール（isobengazole）、イソホモハリコンドリン（isohomohalicondrin）Ｂ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリン−Ｎ三酢酸、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、リュープロレリン、レバミソール、リアロゾール、直鎖ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リッソクリナミド７、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン（lysofylline）、溶解ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリシン阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、ミトナフィド、ミトトキシン（mitotoxin）線維芽細胞増殖因子−サポリン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム（myobacterium）細胞壁ｓｋ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多種腫瘍抑制１ベースの治療，マスタード抗癌剤、ミカペルオキシドＢ、マイコバクテリア細胞壁抽出物、ミリアポロン、Ｎ−アセチルジナリン、Ｎ−置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスティップ（nagrestip）、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン（napavin）、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチターゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素調節物質、窒素酸化物抗酸化剤、ニトルリン（nitrullyn）、０６−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導剤、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、
オキサウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニル酢酸、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、ピロカルピン塩酸塩、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチン（placetin）Ａ、プラセチンＢ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、白金錯体、白金化合物、白金−トリアミン錯体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルｂｉｓ−アクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアゾーム阻害剤、プロテインＡ系免疫調節物質、タンパク質キナーゼＣ阻害剤、タンパク質キナーゼＣ阻害剤、微細藻類、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン複合体、ｒａｆアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ阻害剤、ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムＲｅ１８６エチドロネート、リゾキシン、リボザイム、ＲＩＩレチナミド、ログレチミド、ロヒツキン（rohitukine）、ロムルチド、ロキニメクス、ルビギノンＢ１、ルボキシル、サフィンゴール、サイントピン、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Ｓｄｉ１模倣体、セムスチン、老化由来の阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達調節物質、一本鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン，ナトリウムボロカプテート、フェニルアセテートナトリウム、ソルベロール（solverol）、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン（sonermin）、スパルホス酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンギスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害剤、肝細胞分割阻害剤、スチピアミド、ストロメライシン阻害剤、スルフィノシン、超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ（suradista）、スラミン、スウェインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルルアピリリウム（tellurapyrylium）、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロミド、テトラクロロデカオキサイド、テトラゾミン、タリブラスチン、チオコラリン、トロンボポエチン、トロンボポエチン模倣体、チマルファシン（thymalfasin）、サイモポエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、すずエチルエチオプルプリン、チラパザミン、チタノセン２塩化物、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チロホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンＢ、ベクター系、赤血球遺伝子治療、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビンキサルチン（vinxaltine）、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブおよびジノスタチンスチマラマー。１つの実施形態では、抗癌剤は５−フルオロウラシルまたはロイコボリンである。

抗血管新生剤も、癌治療において有用である。抗血管新生剤は当業者には周知である。本開示の方法と組成物において適切な抗血管新生剤は、ヒト化およびキメラ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む抗ＢＥＧＦ抗体を含む。他の既知の血管新生阻害剤は、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（αとβを含む）インターロイキン１２、レチノイン酸およびメタロプロテイナーゼ−１およびメタロプロテイナーゼ−２組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１および−２）を含む。抗血管新生活性を有するラゾキサン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤などのトポイソメラーゼを含む低分子も使用できる。

本開示の１つの実施形態は、癌と診断された患者を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、癌と診断された患者を治療する方法であって、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を有効量の化学療法剤と併用で含む組成物を該患者に投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と化学療法剤は一緒に投与されるか、または任意の順序で投与される。

本開示の１つの実施形態は、癌と診断された患者における転移を予防または軽減する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、癌と診断された患者における転移を予防または軽減する方法であって、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を有効量の化学療法剤と併用で含む組成物を該患者に投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と化学療法剤は一緒に投与されるか、または任意の順序で投与される。

本開示のさらに別の実施形態は、肉腫と診断された患者を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、肉腫と診断された患者を治療する方法であって、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を有効量の化学療法剤と併用で含む組成物を該患者に投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と化学療法剤は一緒に投与されるか、または任意の順序で投与される。

本開示のさらに別の実施形態は、肉腫と診断された患者における転移を予防または軽減する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、肉腫と診断された患者における転移を予防または軽減する方法であって、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を有効量の１以上の化学療法剤と併用で含む組成物を該患者に投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と１以上の化学療法剤は一緒に投与されるか、または任意の順序で投与される。

本開示のさらに別の実施形態は、膵癌と診断された患者を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、膵癌と診断された患者を治療する方法であって、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を有効量の１以上の化学療法剤と併用で含む組成物を該患者に投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と１以上の化学療法剤は一緒に投与されるか、または任意の順序で投与される。

本開示のさらに別の実施形態は、膵癌と診断された患者における転移を予防または軽減する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、膵癌と診断された患者における転移を予防または軽減する方法であって、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を有効量の１以上の化学療法剤と併用で含む組成物を該患者に投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と１以上の化学療法剤は一緒に投与されるか、または任意の順序で投与される。

いくつかの実施形態では、膵癌治療に使用される化学療法剤は、ゲムシタビンまたは５−フルオロウラシル（flourouracil）またはシスプラチンまたはカペシタビンまたはオキサリプラチンまたはマイトマイシンまたはそれらの任意の組合せである。

本開示のさらに別の実施形態は、悪性黒色腫と診断された患者を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、転移性黒色腫と診断された患者を治療する方法であって、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を有効量の１以上の化学療法剤と併用で含む組成物を該患者に投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と１以上の化学療法剤は一緒に投与されるか、または任意の順序で投与される。

本開示のさらに別の実施形態は、悪性黒色腫と診断された患者における転移を予防または軽減する治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、転移性黒色腫と診断された患者における転移を予防または軽減する方法であって、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を有効量の１以上の化学療法剤と併用で含む組成物を該患者に投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と１以上の化学療法剤は一緒に投与されるか、または任意の順序で投与される。

いくつかの実施形態では、黒色腫の治療に使用される化学療法剤は、シスプラチンまたはビンブラスチンまたはダカルバジンまたはそれらの任意の組合せである。

さらに別の実施形態は、乳癌と診断された患者を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、乳癌と診断された患者を治療する方法であって、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を有効量の１以上の化学療法剤と併用で含む組成物を該患者に投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と１以上の化学療法剤は一緒に投与されるか、または任意の順序で投与される。さらに別の実施形態は、乳癌と診断された患者における転移を予防または軽減する治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態は、乳癌と診断された患者における転移を予防または軽減する方法であって、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を有効量の１以上の化学療法剤と併用で含む組成物を該患者に投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と１以上の化学療法剤は一緒に投与されるか、または任意の順序で投与される。いくつかの実施形態では、乳癌治療に使用される化学治療剤は、タキソールまたはタキソールの類似体である。

特定の実施形態では、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤はＩＬ−２と併用で投与される。

ＩＬ−２誘発性血管漏出：転移性癌の治療
免疫療法は、癌治療の１つの方法である。身体そのものの免疫系の上方制御は免疫療法の１つの態様である。多くの免疫系シグナル伝達分子の１つにインターロイキン−２（ＩＬ−２）があり、細菌感染に対する身体の自然な反応と、異物（非自己）と自己を区別するのに役立つ。高用量のインターロイキン−２は、転移性腎細胞癌および転移性黒色腫の患者に関するＦＤＡの承認済み治療である。この治療を受けた対象の２３％だけが腫瘍応答を示すことが報告されているが、この応答の持続期間は１０年を超え得る（Elias L. et al., "A literature analysis of prognostic factors for response and quality of response of patients with renal cell carcinoma to interleukin-2-based therapy." Oncology, (2001), Vol. 61, pp. 91-101）。したがって、ＩＬ−２治療は治癒の可能性を提供する唯一の利用可能な治療である。

Gallagher（Gallagher, D.C. et al., "Angiopoietin 2 Is a Potential Mediator of High- Dose Interleukin 2-Induced Vascular Leak" Clin. Cancer Res., (2007), Vol. 13, No. 7, pp. 2115- 2120）は、上昇したアンジオポエチン−２のレベルが高用量のＩＬ−２で治療された患者に見出されることを報告し、Ｔｉｅ−２シグナル伝達のＡｎｇ−２遮断を克服すれば、この治療法の副作用である血管漏出症候群の治療になり得ることを示唆している。

ＩＬ−２は内皮細胞活性化をもたらすが適切なバリア機能が欠失することが知られている。高用量のＩＬ−２免疫療法の間のＴｉｅ−２シグナル伝達の増幅は、Ｔｉｅ−２の刺激が内皮細胞の安定性を促進するので、血管漏出の減弱につながる。したがって、Ｔｉｅ−２シグナル伝達を増幅し得る剤を投与することで、血管安定性が増加し得、高ＩＬ−２用量の副作用は緩和される。本開示のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、低アンジオポエチン−１濃度の条件下で、またはＩＬ−２治療の患者におけるように高濃度のアンジオポエチン−２が存在する場合にＴｉｅ−２シグナル伝達を増幅し得る。

Ａｎｇ−２レベルに影響を及ぼすことなくＴｉｅ−２シグナル伝達を増幅することにより、上昇したレベルのＡｎｇ−２の潜在的な病理マーカーとしての使用が保持される。例えば、敗血症などの炎症性疾患患者は通常はＴｉｅ−２のＡｎｇ−１刺激を抑制する作用のある上昇したＡｎｇ−２レベルを有する。この上昇したＡｎｇ−２は、血管漏出の症状である浮腫をもたらす。本発明の方法は、Ａｎｇ−２レベルに影響を及ぼすことなくＴｉｅ−２シグナル伝達を増幅することにより、疾患進行と消散の尺度としてＡｎｇ−２レベルを使用する能力を保持しながら、血管漏出に付随する症状を緩和する方法を提供する。

このＩＬ−２治療を受ける患者の６５％もが、ＶＬＳにより治療を中断または中止せざるを得ない。インターロイキン−２（ＩＬ−２）および免疫毒素（ＩＴ）治療の主な用量規制毒性は、血管漏出症候群（ＶＬＳ）である。ＶＬＳは、体液とタンパク質の血管外遊出を伴う血管透過性の増加により特徴づけられ、間質浮腫と臓器不全をもたらす。ＶＬＳの症状には、体液貯留、低血圧、体重増加、末梢性浮腫、肺浮腫、胸水と心嚢液貯留、腹水、全身浮腫、および重度の場合は肺および心血管不全の徴候が含まれる。

本開示のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、ＩＬ−２での治療が原因の血管漏出を軽減する有効治療法として使用できる。したがって、本発明の実施形態は、ＩＬ−２を投与されている患者における血管漏出を治療、軽減または予防する方法であって、該方法は、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、ＩＬ−２と共投与または別々に投与できる。ＩＬ−２とＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、例えば静脈内、経口、貼薬、皮下注射などにより、あらゆる順序またはあらゆる方法で投与してよい。

本開示の１つの実施形態は、（ａ）免疫応答が得られるような有効量のインターロイキン−２と（ｂ）有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を患者に投与することを含む、腎細胞癌を治療する方法であり、インターロイキン−２とＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は一緒に投与することも、任意の順序で投与することもできる。本明細書で開示される別の実施形態は、（ａ）高用量のインターロイキン−２と（ｂ）有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を患者に投与することを含む、腎細胞癌を治療する方法である。

患者に一連の組成物を投与することを含む、転移性黒色腫を治療する方法であって、該組成物を任意の順序で任意の有効量で投与でき、第１組成物は高用量のインターロイキン−２を含み、第２組成物は有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む、方法がさらに開示される。

患者に一連の組成物を投与することを含む、腎細胞癌を治療する方法であって、該組成物を任意の順序で任意の有効量で投与でき、第１組成物は高用量のインターロイキン−２を含み、第２組成物は有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む、方法がさらに開示される。

本明細書では、治療を要する患者に、（ａ）免疫応答が得られるような有効量のインターロイキン−２と（ｂ）有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を患者に投与することを含む治療を実施することにより転移性黒色腫を治療する方法であり、インターロイキン−２とＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は一緒に投与することも、任意の順序で投与することもできる、方法が開示される。

本明細書では、治療を要する患者に、（ａ）免疫応答が得られるような有効量のインターロイキン−２と（ｂ）有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を患者に投与することを含む治療を実施することにより転移性黒色腫を治療する方法であり、インターロイキン−２とＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は一緒に投与することも、任意の順序で投与することもできる、方法も開示される。

本明細書では、癌患者の治療に使用できる組成物が開示され、ここで該癌患者は、患者において血管漏出症候群を誘発する１以上の癌薬物で治療されている。したがって、本明細書では、癌治療によりもたらされる血管漏出の軽減に有効な組成物が開示され、該組成物は有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む。

本明細書で開示される別の態様は、医学的状態または疾患状態を有するヒトまたは他の哺乳動物の治療に有効な組成物であり、医学的状態または疾患状態の治療は血管漏出症候群を誘発し、該組成物は（ａ）有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と（ｂ）１以上の医薬を含み、医薬のうちの少なくとも１つは血管漏出症候群を誘発する。

さらなる態様において、本明細書では（ａ）有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と（ｂ）１以上の化学療法剤を含む組成物が開示される。

本明細書では血管漏出を制御するのに使用できる組成物も開示され、該組成物は本明細書に開示される有効量の１以上の剤を含む。本明細書では、炎症性疾患の患者を治療するのに使用できる組成物がさらに開示され、炎症性疾患の非限定的な例には敗血症、狼瘡および炎症性腸疾患が含まれ、該組成物は本明細書に開示される有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む。ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、Ｔｉｅ−２シグナル伝達増幅因子として作用するＨＰＴＰβのＴｉｅ２デホスホリラーゼ活性を阻害する。

腫瘍増殖は、しばしば、細胞増殖の制御消失と共に開始する複数ステップの過程である。癌細胞は次いで急速に分割し始め、顕微鏡的に小さい球体の腫瘍：上皮内癌になる。腫瘍塊が増殖すると、細胞は直近の毛細血管からだんだん遠くに離れていく。最後に腫瘍は増殖を止め、安定状態に達し、ここで増殖細胞数は死にゆく細胞数と均衡する。サイズの制限は、栄養分と酸素の欠乏によりもたらされる。組織においては、酸素の拡散の限界は毛細血管と細胞間の距離１００μｍに匹敵し、これは１本の血管の周りの３〜５系統の細胞の範囲である。上皮内癌は、何年も検出されないまま休止状態にあり得、これらの小さい（２〜３ｍｍ^２）無血管性腫瘍関連の転移はほとんどない。

栄養分および／または酸素の欠乏により腫瘍の増殖が止まると、この腫瘍血管系の減少により、悪性細胞への抗腫瘍剤の送達能も制限される。さらに、腫瘍血管系にわずかな増加があれば、抗腫瘍剤の悪性細胞への送達が転移を開始することなく可能になる。したがって、本開示の剤がＴｉｅ−２シグナル伝達をわずかに増幅するのに使用されれば、転移または制御不能な腫瘍細胞増殖を開始させることなく腫瘍細胞への血流を増加するのに使用でき、抗癌剤を悪性細胞に送達する方法が提供される。

本明細書では、必要とする患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を１以上の化学療法化合物または免疫療法化合物と共に投与することを含む、癌を治療する方法が開示される。「Ｔｉｅ−２シグナル伝達をわずかに増幅する」とは、十分な量の本開示の化合物が患者に投与されて腫瘍細胞血管系の量が増加し、循環が増加することで抗腫瘍化合物または治療薬の送達が腫瘍増殖を引き起こすことなく可能になることを意味し、ここで腫瘍細胞の増殖速度は腫瘍細胞死の速度よりも遅い。Ｔｉｅ−２シグナル伝達の増幅により、腫瘍血管系が安定し、血管新生シグナルに対し耐性ができて腫瘍血管新生と腫瘍増殖が減少し、一方で腫瘍血流と化学療法剤の送達が向上する。

アンジオポエチン−２は、グリーソンスコア、転移および癌特定の生存率と有意に相関する（Lind A.J. et al., "Angiopoietin-2 expression is related to histological grade, vascular density, metastasis and outcome in prostate cancer" Prostate, (2005), Vol. 62, pp. 394- 299）。アンジオポエチン−２は、前立腺癌の骨、肝臓およびリンパ節転移において発現することが見出されたが、骨、肝臓およびリンパ節における前立腺癌の腫瘍細胞においてアンジオポエチン−１の発現はほとんどないか皆無である（Morrissey C. et al., "Differential expression of angionenesis associated genes in prostate cancer bone, live and lymph node metastasis" Clin. Exp. Metastasis, (2008), Vol. 25, pp. 377-388）。したがって、Ａｎｇ−２のレベルを監視することは、前立腺癌の存在と、血管漏出による前立腺癌細胞の全身への拡散を評価する方法を提供する。

したがって、本開示の別の実施形態は、患者が治療を受けている間、患者のＡｎｇ−２レベルを監視することを含む、治療の有効性を評価する方法である。

病原体が原因の疾患における血管系の安定化
本明細書では、１以上の病原体が原因の血管漏出症候群を予防または治療する方法が開示され、該方法は、治療を要するヒトまたは動物に有効量の１以上のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を投与することを含む。

１つの実施形態は、１以上の病原体が原因の血管漏出症候群を治療する方法であって、該方法は、治療を要するヒトまたは他の哺乳動物に（ａ）そのヒトまたは哺乳動物に存在する病原体に対し有効である有効量の１以上の化合物と、（ｂ）有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含み、病原体に対し有効である１以上の化合物とＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、一緒に投与することも、任意の順序で投与することもできる。

ヒトまたは哺乳動物において血管漏出症候群を生じさせ得る病原体感染と診断されたヒトまたは他の哺乳動物において血管漏出症候群を予防する方法がさらに開示され、該方法は、ヒトまたは哺乳動物に（ａ）そのヒトまたは哺乳動物に存在する病原体に対し有効である有効量の１以上の化合物と、（ｂ）有効量の１以上のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含み、病原体に対し有効である１以上の化合物と１以上のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、一緒に投与することも、任意の順序で投与することもできる。

以下は、ウイルス、細菌および他の病原体の非限定的な例であり、病原性は、その生物により誘発された血管漏出の程度を軽減することで抑制され得る。黄色ブドウ球菌、炭疽菌、緑膿菌、化膿性連鎖球菌およびデングウイルス。

１つの実施形態は、細菌感染に苦しむ患者における血管漏出症候群を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することによる。細菌感染と診断されたヒトまたは他の哺乳動物における血管漏出症候群を予防する方法がさらに開示される。

したがって、本開示の１つの実施形態は、細菌感染に苦しむ患者を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することによる。特定の実施形態では、細菌感染は炭疽菌感染である。特定の実施形態では、細菌感染は緑膿菌感染である。さらに他の実施形態では、細菌感染は化膿性連鎖球菌感染である。

１つの実施形態は、ウイルス感染に苦しむ患者における血管漏出症候群を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することを含む。ウイルス感染と診断されたヒトまたは他の哺乳動物における血管漏出症候群を予防する方法がさらに開示される。

別の実施形態は、ウイルス感染に苦しむ患者を治療する方法であって、該方法は、該患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与することによる。特定の実施形態では、ウイルス感染はデングウイルス感染である。

ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、１以上の抗菌または抗ウイルス剤と併用で投与してよく、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と抗ウイルスまたは抗菌剤は、一緒に投与することも、任意の順序で投与することもできる。したがって、本開示の実施形態は、細菌感染に苦しむ患者を治療する方法であり、該方法は、（ａ）ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と（ｂ）１以上の抗菌剤を投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と抗菌剤は一緒に投与することも、任意の順序で投与することもできる。本開示の別の実施形態は、ウイルス感染に苦しむ患者を治療する方法であり、該方法は、（ａ）ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と（ｂ）１以上の抗ウイルス剤を投与することを含み、ここでＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と抗ウイルス剤は一緒に投与することも、任意の順序で投与することもできる。

本開示が提供する別の方法は、血管漏出症候群の患者の治療過程を決定する方法であって、以下を含む：
（ａ）患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与すること；（ｂ）治療過程の間、該患者において存在するアンジオポエチン−２のレベルをモニタリングすること；および（ｃ）アンジオポエチン−２レベルが正常範囲に戻ったら治療を中止すること。

さらなる態様は、炭疽菌に感染した患者における血管漏出を治療する方法に関し、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を炭疽症に対し有効性のある有効量の１以上の抗菌剤と併用で含む組成物を投与することを含み、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と炭疽症に対し有効性のある抗菌剤は一緒に投与することも、任意の順序で投与することもできる。

さらに別の態様は、ウイルスに感染した患者における血管漏出を治療する方法に関し、該方法は、有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を有効量の１以上の抗ウイルス剤と併用で含む組成物を投与することを含み、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と抗ウイルス剤は一緒に投与することも、任意の順序で投与することもできる。

本開示の剤を用いるＴｉｅ−２シグナル伝達の増幅の増加は、Ａｎｇ−１および／またはＡｎｇ−２レベルに影響を及ぼす必要なしに血管系を安定させる方法を提供する。本明細書では、血管系を安定化させる方法が開示され、該方法は、患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を投与することを含む。

本開示の剤はＡｎｇ−２の量を増加させることなくＴｉｅ−２シグナル伝達を増幅できるので、患者にＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を投与しながら患者の血清中のＡｎｇ−２の量をモニタリングすることは、炎症の結果としての例えば敗血症などの血管漏出症候群に関連の様々な病気または疾患状態の経過を判断する方法として機能する。したがって、炎症性疾患患者において血管系を安定化させる方法が開示され、ここでアンジオポエチン−２のレベルが上昇しており、該方法は以下を含む：（ａ）患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤組成物を投与すること；（ｂ）該患者において存在するアンジオポエチン−２のレベルをモニタリングすること；および（ｃ）アンジオポエチン−２レベルが正常範囲に戻ったら治療を中止すること。

本明細書で「正常なアンジオポエチン−２レベル」が意味するのは、血清中約１ｎｇ／ｍＬ〜約２ｎｇ／ｍＬのＡｎｇ−２の量である。あるいは、Ａｎｇ−２レベルは、疾患状態、例えば重症の敗血症に苦しむ個体について決定でき、Ａｎｇ−２レベルは患者血清中のＡｎｇ−２の量が正常範囲に最も近いレベルに低下するまでモニタリングできる。この場合、薬物の共投与は継続することもでき、中止することもできる。

したがって、本明細書では治療過程の間患者の血管系を安定化させる方法が開示され、該方法は、以下を含む：（ａ）治療として患者に有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と１以上の薬物を共投与すること；（ｂ）患者において存在するアンジオポエチン−２のレベルをモニタリングすること；および（ｃ）血清中のアンジオポエチン−２のレベルが低下しなければ、１以上の薬物の投与を中止し、１以上の他の薬物を選択すること。

ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、病原体に対する治療過程が維持できるように患者の血管系を安定化させるが、病原体に対する有効な治療を決定する間患者を安定化させるのにも使用され得る。すなわち、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤自体が、血管漏出と合併症の減少により、病原体が原因の疾患の予後に有益な効果を及ぼし得る。

上述のどのＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物も、上述の全ての疾患または疾病を治療する医薬の製造への使用に適している。さらに、上述のどのＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物も、上述の全ての疾患または疾病の治療への使用に適している。

インビボの血管漏出
マイルズ（Miles）アッセイ（Miles, A. A. and E. M. Miles (1952) Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leukotaxine in the skin of guinea-pig. J. Physiol., Vol. 118, pp. 228-257 その全容を参照として本明細書に組み込む）が、マウスモデルにおける致死性毒素並びに浮腫毒素（ＥＴ［ＰＡプラスＥＦ］）が媒介する血管漏出を直接調査し定量化するのに使用され得る。以下は、Gozes Y. et al., Anthrax Lethal Toxin Induces Ketotifen-Sensitive Intradermal Vascular Leakage in Certain Inbred Mice Infect. Immun., 2006 February, Vol. 74, No. 2, pp. 1266-1272（その全容を参照として本明細書に組み込む）に記載される、本開示のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が炭疽菌に曝露されたヒトおよび動物における血管漏出を予防する能力を評価するのに使用され得る改変型マイルズアッセイである。

高純度のＰＡ、ＬＦおよび変異ＬＦ Ｅ６８７Ｃを前述のように精製する（Varughese M. et al., (1998) Internalization of a Bacillus protective antigen-c-Myc fusion protein mediated by cell surface anti-c-Myc antibodies. Mol. Med. 4:87-95 その全容を参照として本明細書に組み込む）。ＥＴまたはＬＴの用量は、各成分の量を指す（すなわち、１００μｇのＬＴは１００μｇのＰＡプラス１００μｇのＬＦ）。アゼラスチン以外の全ての薬物はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミズーリ州セントルイス）から購入でき、アゼラスチンはＬＫＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ミネソタ州セントポール）から購入できる。ＬＴは致死性毒素の略であり、ＰＡは感染防御抗原の略であり、ＬＦは致死性因子の略であり、ＥＰは浮腫因子の略である。

動物
ＢＡＬＢ／ｃＪ、ＤＢＡ／２Ｊ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ、ＷＢＢ６Ｆ１／Ｊ−Ｋｉｔ^ｗ／Ｋｉｔ^ｗ−^ｖおよび同一コロニーの野生型ホモ接合対照マウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（メイン州バーハーバー）から購入できる。ＢＡＬＢ／ｃヌード、Ｃ５７ＢＬ／６ＪヌードおよびＣ３Ｈヘアレス（Ｃ３．ｃｇ／ＴｉｆＢｏｍＴａｃ−ｈｒ）マウスはＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ社（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から購入できる。Ｃ３Ｈヌードマウスは、国立がん研究所のＡｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ａｒｅａ（メリーランド州フレデリック）から購入できる。マウスは８〜１２週齢になると使用される。Ｃ３Ｈヘアレスとヌード動物以外、全てのマウスは皮内（ｉ．ｄ．）注射の２４時間前に剃毛される。全身性ＬＴに対する感受性を評価するため、マウスに１００μｇのＬＴを腹腔内注射（ｉ．ｐ．）し、５日かけて倦怠の徴候または死亡を観察する。Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４ラットは、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ社（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から購入でき、体重１５０〜１８０ｇで使用される。ラットの尾の静脈に１２μｇのＬＴを２５０μｇのマスト細胞安定剤のケトチフェンありまたはなしで静脈内注射（ｉ．ｖ．）し、死亡までの正確な時間を監視する。

マイルズアッセイ
マイルズアッセイは、エバンスブルー色素（内在性血清アルブミンに結合する）の静脈注射をトレーサーとして使用し、試験物質の皮内注射後末梢血管からの巨大分子漏出をアッセイする。ヌードマウスと正常な剃毛マウスに２００μｌの０．１％エバンスブルー色素（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、ミズーリ州セントルイス）を静脈注射する。１０分後、３０μｌの試験毒素または対照試料（ＰＡのみ、ＬＦのみ、ＥＦのみ、またはリン酸緩衝食塩水）を左右の側腹部並びに１つまたは２つの背側部位に皮内注射する。漏出の程度を定量化するため、皮内注射部位の周りの同サイズ（直径１．０〜１．５ｃｍ）の皮膚領域を注射から６０分後に取り除き、ホルムアミド（１ｍｌ）中４１℃で４８時間保存し、色素を抽出させる。試料のΑ_６２０を読み取り、リン酸緩衝食塩水、ＰＡまたはＬＦで処置した対照と比較して漏出の程度を計算する。

ＬＴ媒介型漏出に対するＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤の有効性を試験する実験では、上述のようにマウスにエバンスブルーを静脈注射し、色素注射の１０分後に試験剤を腹腔内注射により全身的に導入する。ＬＴは、エバンスブルーの注射の３０分後に皮内注射により導入される。別の実施形態では、試験される剤は皮内注射により局所に導入され得、ＬＴは１０分後に同じ部位に注射される。

細胞毒性実験
ＭＣ／９マスト細胞は、ＡＴＣＣ社（バージニア州マナサス）から入手でき、１−グルタミン（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（０．０５ｍＭ）、ラットＴ−ＳＴＩＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ社、マサチューセッツ州ベッドフォード）（１０％）およびウシ胎児血清（ＦＢＳ、最終濃度１０％；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社、メリーランド州ゲイザースバーグ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地で成長させる。次に、様々なＬＴの濃度またはＰＡのみの対照で処置する前に、細胞を９６ウェルのプレートに１０^４／ウェルの密度で蒔く。６、１２および２４時間後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＡＱ_{ｕｅｏｕｓ} Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を使用して製造者のプロトコルに従い生存率を評価する。あるいは、毒性アッセイはＦＢＳ（無血清培地）を除く全てのサプリメントを備える培地で実行され得る。他の実施形態では、プールされた３〜５継代のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）がＣａｍｂｒｅｘ Ｃｏｒｐ社（Ｃａｍｂｒｅｘ社、メリーランド州ウォーカーズヴィル）から購入でき、内皮細胞接着因子（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）で前処理されたフラスコ内でＥＧＭ−ＭＶ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（Ｃａｍｂｒｅｘ社、メリーランド州ウォーカーズヴィル）中成長させる。細胞毒性実験については、細胞は、典型的にはＥＧＭ−ＭＶ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ中９６ウェルのプレートに蒔かれる。アッセイ当日、この培地を１０％のＦＢＳまたはヒト血清（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）を補充されたＭ１９９培地（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）と交換し、細胞を９６ウェルのプレートに２×１０^３／０．１ｍｌ／ウェルの密度で再度蒔き、様々な濃度のＬＴで３連で処置する。細胞の生存率は、典型的にはＭＣ／９細胞に関し２４、４８および７２時間の時点で評価する。

ＨＵＶＥＣ透過性アッセイ
ＨＵＶＥＣ単層は、２４ウェルのプレートでＴｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｃｌｅａｒ細胞培養インサート（直径６．５ｍｍ、孔径０．４μｍ；Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ社、マサチューセッツ州アクトン）上で、管腔コンパートメント（インサート内部）と管腔下コンパートメント（組織培養プレートウェル）からなる２チャンバの培養システムを作り、効果的に培養できる。細胞を蒔く前に、インサートを内皮細胞接着因子（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）でコートする。１０％の鉄補充仔ウシ血清と１％の内皮細胞増殖因子（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）を含む、事前に加熱したＣＳ−Ｃ培地（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）をインサートの配置前にウェルに加える。次に、ＨＵＶＥＣ細胞懸濁液（２００μＬの５×１０^５細胞／ｍｌ）を各インサートに加える。細胞は、単層の適切な形成を確保するため５％ＣＯ_２中３７℃で最長２１日培養される。バリア機能を試験するため、培地を１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩに替えるか、または血清なしのＲＰＭＩに替えてよい。バリア機能を評価するため、西洋わさびペルオキシダーゼ酵素（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）をインサートに加える（１０μｇ／ウェル）。ＬＴ（１μｇ／ｍＬ）またはＰＡのみ（１μｇ／ｍＬ）若しくはＬＦのみ（１μｇ／ｍＬ）の対照処置を二重ウェルに加え、毎時間（１２時間の間）、管腔下コンパートメントから１０μＬの試料を取り、１００μＬの基質［２’，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチゾリン（ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉｚｏｌｉｎ）６−スルホン酸）］（Ａ−３２１９；Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）を加えて、４０５ｎｍの読み取りで、西洋わさびペルオキシダーゼの酵素活性を試験した。

炭疽症併用治療
血管組織がより安定化すると、炭疽菌感染に対する既知の抗菌剤の有効性が高まる。したがって、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、炭疽症治療の併用治療として評価され得る。以下、炭疽菌感染の治療に有用な併用治療の一部としてのＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤の有効性を決定するのに使用され得る一連のアッセイを記載する。

ＬＦは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）を切断し、シグナル伝達を妨害し、マクロファージの溶解をもたらすことが見出されている。したがって、マイルズアッセイに加えて、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤がＬＴ活性効果を阻害する能力を確認するのに以下の細胞ベースのペプチド切断アッセイが使用され得る。以下のアッセイに関し、ＭＡＰＫＫｉｄｅは、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カリフォルニア州キャンベル）から購入できる。フッ化ペプチド基質はＡｎａｓｐｅｃ社（カリフォルニア州サンノゼ）から入手可能である。

インビボアッセイ
併用炭疽症治療過程の評価を開始する１週間前に、試験剤（各２００ｍｇ）を８００μＬのＤＭＳＯに溶解させて−２０℃で保存する。注射の直前に各試験剤をＰＢＳに溶解させて２％ＤＭＳＯ中最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとする。試験動物を、ＰＢＳ中マウス当たり２×１０^７の胞子の腹腔内注射により０日目に攻撃する。治療は攻撃２４時間後に開始した。適切な治療レジメンの一例は、シプロフロキサシン（５０ｍｇ／ｋｇ）とＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤（５ｍｇ／ｋｇ）の併用である。無治療動物の対照試料、シプロフロキサシンのみ、本開示の剤のみ、およびシプロフロキサシンと本開示の剤の併用を動物に与え、注射１４日後まで１日２回モニタリングした。

シプロフロキサシンと試験される剤は、便利にも、それぞれ２００μＬの量を１０日間１日１回ずつ注射して非経口投与され得る。生存した動物は全て１４日目に屠殺する。瀕死とみられる病気の動物（すなわち、活動性または歩行運動レベルの重篤な低下または欠如、外部刺激に対する無反応、または簡単に得られる食餌や水を摂取できない、などを以下の付随のいずれかの徴候と共に提示するもの：被毛の荒れ、うずくまる、正常な体温を維持できない、低体温の徴候、呼吸器系困難、または他のひどく衰弱した状態）は、これらの症状が現れた日に屠殺すべきである。

細菌誘発性血管漏出の調節
病原菌は血管漏出の原因となることが知られている。この誘発性血管漏出は、抗菌剤および他の医薬が侵入する微生物を標的化する能力を阻害する。したがって、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、細菌感染の結果として生じる過剰な血管漏出を予防することにより宿主免疫系を高めるために、単独または他の医薬成分と併用で使用され得る。

単独または併用治療でのＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤の有効性を決定するのに使用され得る試験およびアッセイを以下に記載する。

黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、グラム陽性敗血症性ショックの主要な病原体であり、血漿キニノーゲンの消費と関連付けられている。黄色ブドウ球菌誘発性血管漏出活性に対するＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤の効果は、黄色ブドウ球菌が分泌する２種類のシステインプロテイナーゼに対するこれらの剤の活性を測定することで決定され得る。細胞溶解活性のあるスタホパインＡ（ＳｃｐＡ）は、ブラジキニン（ＢＫ）Ｂ_２受容体依存性の態様でモルモットスキンにおいて血管漏出を誘発する。この効果はそれ自体は血管漏出活性をもたないスタホパインＢ（ＳｓｐＢ）により増大される。ＳｃｐＡは、ヒト血漿からの血管漏出活性も産生する。

敗血症性ショックの重要な病態生理学的機構は、血漿が血管外空間に漏れることで生じる血液量不足の低血圧である。ＳｃｐＡが、２０ｎＭという低い濃度で、モルモット皮膚内に注射して５分以内に血管漏出を誘発したことが見出されており、この反応は共存するＳｓｐＢにより増大され、このことは、これらのプロテイナーゼによる血管漏出が効率的にインビボで生じることを示す（Imamura T. et al., Induction of vascular leakage through release of bradykinin and a novel kinin by systeine proteinases from Staphylococcus aureus (2005) J. Experimental Medicine, Vol. 201, No. 10, pp. 1669-1676）。

血管漏出アッセイ
動物は、以下の手順を用いて血管漏出を評価され得る。１００μＬの食塩水中エバンスブルー色素（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）１％の溶液を尾静脈に注射する。３０分後マウスを屠殺し、右心室を通して食塩水で潅流し血管内エバンスブルーを除去する。肺を切除し、１ｍＬのホルムアミド中５５℃で一晩かけて抽出する。エバンスブルー量は、ホルムアミド抽出物のＯＤ_６２０マイナスＯＤ_５００として決定する。

本明細書に開示の剤は、ウイルスが原因の血管漏出の影響を媒介し、したがって身体そのものの免疫系が病原体により高い耐性を及ぼすことが可能になることでインフルエンザの重症性を低下させる単一の薬剤治療として使用され得る。以下のアッセイは、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が、改善された血管完全性によりウイルス性重症度を阻害する効果を決定するのに使用され得る。

本開示のアッセイは、ウイルスプラーク、ウイルス細胞傷害効果（ＣＰＥ）およびウイルス赤血球凝集素（hemagglutitin）の阻害を用い得る。

タンパク質分解感受性アッセイ
ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、赤血球凝集素に結合することでタンパク質集合を不安定化させることが決定され得る。以下の手順は、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤による不安定さの増加と、それゆえの赤血球凝集素のタンパク質分解性攻撃に対する増加した感受性を決定するのに使用され得る。融合立体構造において、赤血球凝集素はプロテアーゼ消化に対しより感受性が高くなる。この特性は、融合阻害剤が赤血球凝集素と相互作用するかどうか確認するのに使用され得る（Luo G. et al., "Molecular mechanism underlying the action of a novel fusion inhibitor of influenza A virus." J. Virol., (1997), Vol. 71, No. 5, pp. 4062-4070）。したがって、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、血管漏出の制御により、体内免疫応答を増強することで赤血球凝集素消化に間接的に影響を及ぼす能力を評価され得る。

赤血球凝集素外部ドメインの精製した三量体を５μＭの濃度で試験される剤と共に培養した。三量体は、無処理赤血球凝集素の対照と、試験剤の溶解に用いる溶媒であるＤＭＳＯで処理した赤血球凝集素をｐＨ７．０とｐＨ５．０でトリプシン消化に供する。ｐＨ５．０の試料については、赤血球凝集素三量体はｐＨ５．０のバッファーで１５分かけて処理され、ｐＨ７．０に中和される。トリプシン（２０ｎｇ）を１０μＬで試料に加え、消化は３７℃で１時間進行する。存在する赤血球凝集素の量は、抗赤血球凝集素（Ｈ３）抗血清を用いてウエスタンブロットゲル電気泳動法により評価する。有効な阻害剤を含んでいる試料は、トリプシンによる赤血球凝集素消化を増加させる。

さらに、併用治療は、抗ウイルス薬をインフルエンザウイルスによる血管漏出の重症性を予防する剤と共に提供することによりインフルエンザを治療する方法を提供できる。

抗ウイルス化合物、例えばオセルタミビルが本開示の併用治療のインビボの評価とＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤の有効性の評価に使用され得る。併用薬物は、インフルエンザＡ／ＮＷＳ／（Ｈ１Ｎ１）ウイルスに感染させたマウスに単回用量で投与する。場合によっては、動物の感染は、その肺を通して複数のウイルス経路を含む。１つの便利なプロトコルは、ウイルス曝露の４時間前に開始して２０ｍｇ／ｋｇ／日を１日２回５日間投与することを含む。次に動物を１０^−２から１０倍の範囲で異なるウイルス濃度で攻撃する（１０^５．７５細胞培養５０％感染用量（ＣＣＩＤ_５０）／ｍＬ）。各群のマウス４匹を６日目に屠殺し、肺を除去し、０（正常）〜４（最高濃紫着色）の圧密スコアを割り当て、計量し、均質化し、ホモジネートを２０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清の様々な１０倍希釈物を、９６時間３７℃で培養したＣＰＥをエンドポイントとして用いてＭＤＣＫ細胞におけるウイルス滴定アッセイを行う。

一元放射免疫拡散カイトを用いて、６日目にマウスから採取した血清のａ_１−ＡＧアッセイを行う。各群のさらに８匹のマウスを死亡について引き続き２１日間観察し、動脈血酸素飽和度（ＳａＯ_２）の値を、通常ＳａＯ_２の低下が始まる３日目から、値がさもなくば死亡するほど動物の最大限まで低下したことが示される１１日目まで、パルスオキシメトリにより決定する（Sidwell R. et al., (1992) Utilization of pulse oximetry for the study of the inhibitory effects of antiviral agents on influenza virus in mice. Antimicrob. Agents Chemother. 36, 473- 476）。

細胞におけるタンパク質チロシンホスファターゼベータの阻害
本明細書では、細胞におけるタンパク質チロシンホスファターゼベータ（ＨＰＴＰ−β）活性を阻害する方法が開示され、該方法は、細胞を有効量のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と接触させることを含む。細胞は、インビボ、エクスビボまたはインビトロで接触され得る。

投与
特定の剤の性質により、本開示の剤は、ヒトおよび他の動物に、非経口（例えば静脈内または腹腔内注射）、皮下、経口、局所的、直腸的、頬内、口腔若しくは鼻腔スプレーとして、投与され得る。

本開示のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤は、好ましくは、投与がしやすく用量の均一性がとれるように用量単位で製剤される。本明細書では「用量」または「用量単位」という表現は、治療を受ける患者に適した剤の物理的な個々の単位を指す。しかし、本発明のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤と組成物の１日当たりの総量は、適切な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることを理解されたい。

用量
ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤投与の有効な用量とスケジュールは経験的に決定してよく、このような決定をすることは当該分野の範囲内である。当業者であれば、投与されなければならない剤の用量は、例えば、剤を受ける対象、投与経路、使用される剤の特定の種類、および対象に投与されている他の薬物により異なることを理解しよう。例えば、抗体の適切な用量を選択する案内が、抗体医薬の文献、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389に見られる。単独で使用する場合の剤の典型的な用量は、上述の要因により、１日当たり体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ以上、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまで、または約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜およそ の範囲であり得る。

ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤の投与スケジュールは、限定ではなく、１日１回、毎週３回、毎週２回、毎週１回、毎月３回、２回、毎月１回、および隔月に１回、を含む。

製剤
本発明の１つの態様では、薬剤的に許容可能な組成物が準備され、これらの組成物は、本明細書に記載される剤のいずれかと、薬剤的に許容可能な担体を含み、さらに他の薬剤、アジュバントまたは希釈物を含み得る。例えば、医薬組成物は、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤などの１以上の追加の活性成分も含み得る。

製剤は、投与形態により変わり得る。医薬組成物は、例えば、錠剤、座薬、丸薬、カプセル剤、粉末、液剤、懸濁液、ローション、クリーム、ゲルなどの固形、半固形または液体の剤形であり得、好ましくは、正確な用量を単回投与するのに適した単位剤形である。

本開示の目的に関し、「賦形剤」と「担体」という用語は本開示の記載全体で交換可能に使用され、本明細書では「安全で有効な医薬組成物の製剤の実施で使用される成分」と定義される。製剤業者は、賦形剤は、主として安全で安定した機能的な医薬を送達する働きをし、送達用の全ビヒクルの一部としてだけではなく、活性成分がレシピエントにおいて有効に吸収される手段としても作用するのに使用されることを理解しよう。賦形剤は、不活性フィラーとして単純で直接的な役割を果たし得るか、または賦形剤は本明細書では成分を確実に送達するためのｐＨ安定化システムまたはコーティングの一部であり得る。

「薬剤的に許容可能な」とは、生物学的にまたはその他の望ましくないものではない物質を意味し、すなわち、物質は、何らの所望でない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される医薬製剤の他のすべての成分と有害な態様で相互作用することなく、患者に投与され得る。担体は、当然ながら、あらゆる活性成分の分解を最小限化し、当業者には周知であるような対象におけるあらゆる有害な副作用を最小限化するように、選択される。本明細書に記載される剤の製剤の調製と関連して使用され得る典型的な担体と医薬組成物を調製する従来の方法を開示しているRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Gennaro, AR. Ed., Mack Publishing, Easton Pa.（1990）を参照されたい。当業者であれば、例えば投与経路および投与される組成物の濃度により、ある特定の担体がより好ましい場合があることを理解されよう。

固形組成物の従来の非毒性固形担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、ブドウ糖、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む。液体の薬剤的に投与可能な組成物は、例えば、本明細書に記載される活性因子および所望により薬剤的アジュバントを、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの賦形剤中に溶解、分散させるなどして調整され得、それによって溶液または懸濁液が生成する。所望であれば、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンナトリウムアセテート、オレイン酸トリエタノールアミンなどのごく少量の非毒性補助物質も含み得る。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者には既知であるまたは明らかになろう。

本開示の剤は、活性治療薬を送達する液体、乳剤または懸濁液中にも存在し得る。液体の薬剤的に投与可能な組成物は、例えば、本明細書に記載される活性因子および所望により薬剤的アジュバントを、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの賦形剤中に溶解、分散させるなどして調整され得、それによって溶液または懸濁液が生成する。所望であれば、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンナトリウムアセテート、オレイン酸トリエタノールアミンなどのごく少量の非毒性補助物質も含み得る。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者には既知であるまたは明らかになろう；例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Gennaro, AR. Ed., Mack Publishing, Easton Pa. (1990)を参照されたい。

注射剤、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液を、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて従来技術に従い製剤してよい。無菌の注射可能な調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性非経口の許容可能な希釈物または溶媒中の無菌注射溶液、懸濁液または乳液であってもよい。使用してよい許容可能なビヒクルと溶媒のなかには、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油が溶媒または懸濁培地として従来的に使用される。この目的のためには、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含むあらゆる無刺激の固定油が利用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射液の調製に使用される。

注射液製剤は、使用前に、例えば細菌を保持するフィルターによる濾過、または無菌水または他の無菌注射液培地に溶解または分散し得る滅菌固形組成物として滅菌剤を含むことで滅菌され得る。

本開示の剤は、活性治療薬を鼻、喉または気管支の管などの身体の腔にエアロゾルとして送達する液体、乳剤または懸濁液中にも存在し得る。これらの調製物中、剤と他の構成剤との比率は剤形の要件により異なる。

意図される投与形態により、医薬組成物は、例えば、錠剤、座薬、丸薬、カプセル剤、粉末、液剤、懸濁液、ローション、クリーム、ゲルなどの固形、半固形または液体の剤形であり得、好ましくは、正確な用量を単回投与するのに適した単位剤形である。組成物は、上述のように、有効量の剤を薬剤的に許容可能な担体と併用で含み、さらに、他の医薬品、薬剤、担体、アジュバント、希釈物などを含み得る。

剤をヒト以外の哺乳動物体内に送達する場合は、哺乳動物は、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモットまたはげっ歯類であり得る。ヒトおよび哺乳動物という用語は特定の年齢や性別は意味しない。したがって、雌雄の別なく成人および新生児対象、並びに胎児を含むことが意図される。患者、対象、ヒトまたは哺乳動物とは、疾患または疾病に罹患している対象を指す。「患者」という用語は、ヒトと獣医学的対象を含む。

キット
ヒト、哺乳動物または細胞に送達される剤を含むキットも開示される。キットは、ヒト、哺乳動物または細胞内に送達されるＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物の１以上の包装された単位用量を含み得る。キットは、所望により、キットの構成要素を使用するための説明書を含む。剤は、無菌製剤として包装され得、使用時まで製剤の無菌性を保つ気密密封容器が設計される。
実施例

ＨＰＴＰβ細胞外ドメインタンパク質の産生
全長ＨＰＴＰβｃＤＮＡ（配列番号１）を、製造者（Ｏｒｉｇｅｎｅ社）の指示に従いヒト胎盤ライブラリーからクローン化する。全ての可溶性のＨＰＴＰβの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするｃＤＮＡを、Ｃ末端にＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（６Ｈｉｓ−Ｇｌｙ）（配列番号３）を付加されたアミノ酸１〜１６２１をコードする全長ｃＤＮＡからＰＣＲによりクローン化する。得られたｃＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞における一過性（ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ）または安定した（ｐｃＤＮＡ３．１（−））発現のため、哺乳動物発現ベクターにクローン化する。精製ＨＰＴＰβＥＣＤ（βＥＤ）を得るため、βＥＣＤ発現ベクターで形質移入したＨＥＫ２９３細胞をＯｐｔｉＭＥＭ無血清（Ｇｉｂｃｏ社）中通常の成長条件下で２４時間培養する。次いで培養上清を回収し、遠心分離してデブリを除去し、１ｍＬの洗浄済みＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）（５００μＬのパック入り）を各清澄培地１０μＬに加えて、４℃で一晩振とうする。翌日、混合物をカラムに充填し、２０ベッド体積のｐＨ８の５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾールで洗浄する。次いで、精製したＨＰＴＰβ細胞外ドメインタンパク質（配列番号４）をｐＨ８の５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール中２００μＬ／溶出で溶出する。画分のタンパク質含有量を還元−変性ＳＤＳ−ポリアクリルイミドゲル電気泳動法を用い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により検出し、質量分析により確認して分析する。

精製されたＨＰＴＰβ細胞外ドメインタンパク質を、例えば実施例１に記載の手順により産生する。ＨＰＴＰβ細胞外ドメイン免疫原を産生するため、精製されたＨＰＴＰβ細胞外ドメイン−６−Ｈｉｓタンパク質をＥＤＣ結合化学を用いてブタのサイログロブリン（Ｓｉｇｍａ社）に結合させる（Hockfield, S. et al., (1993) Cold Spring Habor Laboratory Press., Vol. 1 pp. 111-201, Immunocytochemistry）。得られたＨＰＴＰβ細胞外ドメイン−サイログロブリン複合体をｐＨ７．４のＰＢＳに対し透析する。次に、成体Ｂａｌｂ／ｃマウスを複合体（１００〜２００μｇ）と完全フロイントアジュバントの１：１の混合物で皮下免疫感作する。２〜３週後、マウスに不完全フロイントアジュバントと複合体の１：１の混合物を腹腔内または皮下注射する。注射を４〜６週に繰り返す。３回目の注射から７日後にマウスから血清を採取し、ＨＰＴＰβ細胞外ドメイン抗原に対する免疫反応性をＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット法でアッセイする。抗原に対し良好な応答を示すマウスは、３１ゲージの超長針を用いて５０μｌの精製されたＨＰＴＰβ細胞外ドメインタンパク質を１：１で水酸化ミョウバンと混合した単回脾臓内注射でブーストする（Coding, J. W., (1996) Monoclonal Antibodies: Principles and Practices. Third Edition, Academic Press Limited, p.145）。マウスは２．５％アベルチンで短時間麻酔し、皮膚と左斜体壁を１センチ切開する。抗原混合物を、針を脾臓の後方部分から前方部分に挿入し、長手方向に注入して投与する。体壁を縫合し、皮膚を２つの小型金属クリップで封着する。マウスの無事な回復をモニタリングする。術後４日目にマウスの脾臓を除去し、単一細胞の懸濁液を作製してマウス骨髄腫細胞と融合させハイブリドーマ細胞株を作製する（Spitz, M., (1986) Methods In Enzymology, Vol. 121. Eds. John J, Lagone and Helen Van Vunakis. pp. 33-41 (Academic Press, New York, NY)）。得られたハイブリドーマを１５％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）とヒポキサンチン、アミノプテリンとチミジンを補充したダルベッコ変法培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で培養する。

陽性ハイブリドーマのスクリーニングは融合の８日後から開始し、１５日間継続する。ハイブリドーマ産生抗ＨＰＴＰβ細胞外ドメイン抗体は、２組の９６ウェルのプレート上でＥＬＩＳＡにより同定され、１組はヒスチジンタグをつけたＨＰＴＰβ細胞外ドメインでコートされ、もう一方は陰性対照としてヒスチジンタグをつけた細菌性ＭｕｒＡタンパク質でコートされる。二次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）で標識されたロバ抗マウスＩｇＧである。免疫応答性は、ＡＢＴＳ錠剤をｐＨ７．５のＴＢＳバッファーに溶解させて開始される発色を用いてウェル内でモニタリングされる。個々のＨＲＰ反応混合物は、１００マイクロリットルの１％ＳＤＳを添加されて停止され、分光光度計で４０５ｎｍで吸光度を読み取られる。ＨＰＴＰβ細胞外ドメイン−６Ｈｉｓと相互作用するがｍｕｒＡ−６Ｈｉｓタンパク質とは相互作用しないハイブリドーマ産生抗体は、さらなる分析に使用される。限界希釈（０．８細胞／ウェル）を９６ウェルプレートの陽性クローンに２回行い、クローン性は、ウェルの９９％超が陽性反応を有することと定義される。抗体イソタイプを、イソストリップ手法（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて決定する。さらなる評価用に精製抗体を得るために、組織培地上清をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いて親和性精製する。

ＨＰＴＰβ−ＥＣＤタンパク質に対し免疫応答性のある５つのモノクローナル抗体が単離され、以下のとおり命名された：Ｒ１５Ｅ６、Ｒ１２Ａ７、Ｒ３Ａ２、Ｒ１１Ｃ３、Ｒ１５Ｇ２およびＲ５Ａ８。ＥＬＩＳＡとウエスタンブロット法におけるＨＰＴＰβ−ΕＣＤタンパク質との反応に基づき、Ｒ１５Ｅ６がさらなる研究用に選ばれた。

モノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６
モノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６を本願の実施例２と米国特許第７，９７３，１４２号に記載されるように同定し特徴づけた；手順と結果を以下に要約する。

Ａ．免疫沈降により示されるようにＲ１５Ｅ６は内在性のＨＰＴＰβと結合する。
材料：Ｃａｍｂｒｅｘ社のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ＥＧＭ培地、およびトリプシン中和液；ＯＰＴＩＭＥＭ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ社）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ社）、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む増殖因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔｉｅ２モノクローナル抗体（Ｄｕｋｅ大学／Ｐ＆ＧＰ社）、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリクローナル抗体（Whitaker et.al）、プロテインＡ／Ｇアガロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）、トリス−グリシンプレキャストゲル電気泳動／転写システム（６〜８％）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、溶解バッファー（２０ｍｍのトリス−ＨＣｌ、１３７ｍｍのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１％のトリトン−Ｘ−１００、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプスタチン）

方法：ＨＵＶＥＣを抗体（ＯＰＴＩＭＥＭ中）またはＯＰＴＩＭＥＭ Ｉのみで３０分間前処理する。前処理除去後、細胞をＡｎｇ１（１００ｎｇ／ｍｌ）で６分間ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡ中で処理し、溶解バッファー中で溶解させる。溶解物をトリス−グリシンゲルに直接通すか、または２〜５μｇ／ｍｌのＴｉｅ−２抗体または１０μｇ／ｍｌのＲ１５Ｅ６抗体とプロテインＡ／Ｇアガロースを用いて免疫沈降させる。免疫沈降した試料を溶解バッファーで１回すすぎ、１倍濃度の試料バッファー中、５分間沸騰させる。試料をトリス−グリシンゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、表示された抗体（ｐＴＹＲ Ａｂ （ＰＹ９９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）、Ｔｉｅ−２、ＶＥＧＦＲ２および／またはＲ１５Ｅ６）を用いてウエスタンブロット法で検出する。

結果：ＩＰ／ウエスタンブロット法により、Ｒ１５Ｅ６はＨＰＴＰβのサイズと一致する主要な高分子量のバンドを認識する（図１、パネルＡ、レーン２）。強度がより低い、低分子量のバンドは、ＨＰＴＰβの低グリコシル化前駆体をおそらく表している。対照の非免疫ＩｇＧを用いての免疫沈降（ＩＰ）は、ＨＰＴＰβの分子量範囲内にバンドを示さず（図１、パネルＡ、レーン１）、併用Ｔｉｅ２／ＶＥＧＦＲ２のＩＰは、予測された分子量のバンドを示す（図１、パネルＡ、レーン３）。この結果は、Ｒ１５Ｅ６がＨＰＴＰβを認識し、ＨＰＴＰβに対し特異的であることを示す。

Ｂ．ＦＡＣＳ分析で示されるように、Ｒ１５Ｅ６は内在性のＨＰＴＰβに結合する。
材料：Ｃａｍｂｒｅｘ社のＨＵＶＥＣ、ＥＧＭ培地およびトリプシン中和液；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社の二次Ａｌｅｘｆｌｕｏｒ ４８８−タグ付き抗体；ハンクス平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ社）；ＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーターおよびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社のＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア。

方法：ＨＵＶＥＣをトリプシン化し、トリプシン中和液で処理し、ＨＢＳＳですすぐ。Ｒ１５Ｅ６抗体（０．６μｇ）を５０μｌのＨＢＳＳ中２５０，０００個の細胞に加え、氷中２０分インキュベートする。細胞を１ｍｌのＨＢＳＳですすいだ後、２μｇの蛍光結合二次抗体を氷中２０分かけて加える。細胞をすすいで１ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁させてから、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーターで分析する。対照細胞は蛍光結合二次抗体のみで処理する。

結果：ＦＡＣＳ分析により、蛍光シグナルにおいて、無傷のＨＵＶＥＣ、Ｒ１５Ｅ６は、二次抗体のみと比較して強力なシフト（細胞の９０超）をもたらす（図１、パネルＢ）。この結果は、Ｒ１５Ｅ６が無傷の内皮細胞表面に提示される内在性のＨＰＴＰβに結合することを示す。

Ｒ１５Ｅ６は、Ｔｉｅ２活性化を増大させる
Ｒ１５Ｅ６は、Ｔｉｅ２リガンドであるアンジオポエチン１（Ａｎｇ１）の存在下および非存在下でＴｉｅ２リン酸化を増大させる。

方法：様々な濃度のＲ１５Ｅ６の存在または非存在下で、Ａｎｇ１の添加ありまたはなしで、ＨＵＶＥＣを上述したように無血清培地で培養する。溶解物が調製され、Ｔｉｅ２抗体を用いて免疫沈降され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離され、ＰＶＤＦ膜に転写される。膜に結合した免疫沈降されたタンパク質は次いで連続的ウエスタンブロットに供され、抗ホスホチロシン抗体を用いてＴｉｅ２リン酸化を定量化してからＴｉｅ２抗体を用いて全Ｔｉｅ２を定量化する。Ｔｉｅ２リン酸化は、抗ホスホチロシンシグナルの全Ｔｉｅ２シグナルに対する比率として表す。

結果：Ｒ１５Ｅ６は、Ａｎｇ１の存在下および非存在下の両方でＴｉｅ２リン酸化を増大させる（図２）。この結果は、内皮細胞表面のＨＰＴＰβにＲ１５Ｅ６が結合することで、その生物学的機能が調節され、その結果としてリガンドの有無にかかわらずＴｉｅ２の活性化が増大することを示す。

抗ＶＥ−ＰＴＰ細胞外ドメイン抗体の生成
Ａ．マウスＶＥ−ＰＴＰ細胞外ドメインタンパク質（ＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤ）の産生
ＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤは任意適当な方法により産生され得る。そのような方法は当技術分野では周知である。例えば、ＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤは、ＨＰＴＰβ−ＥＣＤをコードするｃＤＮＡの代わりにＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤｃＤＮＡが使用される、本開示の実施例１に類似の方法を用いて産生され得る。配列番号７は、ＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤをコードするヌクレオチド配列を提供する。配列番号８は、ＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤのアミノ酸配列を提供する。

Ｂ．ＶＥ−ＰＴＰ ＥＣＤに対する抗体の生成
抗ＶＥ−ＰＴＰ抗体は、当技術分野では周知の方法により、容易に生成される。例えば、抗ＶＥ−ＰＴＰ抗体は、ＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤをＨＰＴＰβ細胞外ドメインの代わりにし、得られたタンパク質でラットを免疫感作することにより、本開示の実施例２の方法を用いて生成され得る。この研究で使用されたラット抗マウスＶＥ−ＰＴＰ抗体は、Ｄ．Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ博士のご厚意により提供された（ｍＡｂ １０９）。抗体は、Baumer S. et al., Blood, 2006, Vol. 107, pp. 4754-4762に記載のように生成した。簡単に説明すると、抗体は、ラットをVE-PTP-Fc融合タンパク質で免疫感作することで生成された。免疫感作、ハイブリドーマ融合、およびスクリーニングは、Gotsch U., et al., J Cell Sci., 1997, Vol. 110, pp. 583-588およびBosse R. and Vestweber D., Eur J Immunol., 1994, Vol. 24, pp. 3019-3024に記載のように実施した。

融合タンパク質を構築し、ＶＥ−ＰＴＰの７３２位のアミノ酸で終わる最初の８個のフィブロネクチンＩＩＩ型様リピートがヒトＩｇＧ１のＦｃ部分とフレームを合わせて融合されるようにした（２３９位のアミノ酸プロリンから始まる）。このｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローン化した構築物をＣＨＯ細胞細胞に安定的に形質移入し、融合タンパク質をプロテインＡセファロース親和性精製により精製した。

抗ＶＥ−ＰＴＰＥＣＤ抗体の硝子体内注射
レーザー誘発脈絡膜血管新生モデル：脈絡膜血管新生モデルは、血管新生加齢黄斑変性モデルを代表すると考えられている。脈絡膜血管新生を前述のように生成した。Tobe T, et al., Am. J. Pathol., 1998, Vol. 153, pp. 1641-1646を参照されたい。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、各眼のブルッフ膜の３か所にレーザー誘発性裂創を有し、１または２μｇのラット抗マウスＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤ抗体（ＩｇＧ２ａ）の硝子体内注射を片眼に１回受け、もう一方の眼にはビヒクル（５％のデキストロース）を受けた。これらの処置を７日目に反復した。レーザーの１４日後、マウスをフルオレセイン標識デキストラン（平均分子量２×ｌ０^６、Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）で潅流し、血管新生の程度を蛍光顕微鏡により脈絡膜フラットマウントにおいて評価した。各ブルッフ膜裂創部位における脈絡膜血管新生の面積を、治療群については観察者に隠して画像分析により測定した。脈絡膜血管新生の面積は、片眼の３つの裂創の平均である。図３に示すように、ＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤ抗体での処置は、１および２μｇの両用量で、ビヒクル対照での処置に対し、脈絡膜血管新生を有意に減少させた。

酸素誘発虚血性網膜症
酸素誘発虚血性網膜症モデルは、増殖性糖尿病性網膜症モデルを代表すると考えられている。虚血性網膜症は、Smith, L.E.H., et al. Oxygen- induced retinopathy in the mouse. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 101-111 (1994)に記載された方法により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて作製された。

出生後７日目（Ｐ７）のＣ５７ＢＬ／６マウスとそれらの母マウスを気密チャンバに入れ、高酸素状態（７５±３％の酸素）に５日間曝した。酸素はＰＲＯＯＸモデル １１０ 酸素コントローラ（Ｒｅｍｉｎｇ Ｂｉｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．社、ニューヨーク州レッドフィールド）により継続的にモニタリングした。Ｐ１２にマウスは大気に戻され、手術用顕微鏡下で、ハーバードポンプマイクロインジェクションシステムおよび引いた（pulled）ガラスピペットを使用して、１または２μｇのＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤ抗体の１μｌの硝子体内注射を片眼に送達し、もう一方の眼にビヒクルを注射した。Ｐ１７に、前述したように、網膜表面の血管新生の面積をＰ１７に測定した。Shen J, et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2007, Vol. 48, pp. 4335- 4341を参照されたい。簡単に説明すると、マウスに０．５μｇのラット抗マウスＰＥＣＡＭ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州サンノゼ）を含む１μｌの眼内注射をした。１２時間後、マウスを安楽死させ、眼を１０％ホルマリン中に固定した。網膜を切除し、１：５００で、Ａｌｅｘａ４８８を結合させたヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）中、４０分かけてインキュベートし、洗浄し、全載した。治療群について隠された観察者が、ニコン蛍光顕微鏡を用いてスライドを検査し、ＩｍａｇｅＰｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、メリーランド州シルバースプリング）を用いてコンピュータ化画像分析により網膜当たりの血管新生面積を測定した。図４は、ＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤ抗体での処置が、１および２μｇの両用量で、ビヒクル対照での処置に対し、網膜の脈絡膜血管新生を有意に減少させたことを示す。図５は、ビヒクル処置のマウス対２μｇのＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤ抗体で処置したマウスの代表的なホールマウントを示す。

ＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤ抗体の皮下注射
硝子体内投与の酸素誘発虚血性網膜症モデルを実施例７に記載のように実施したが（Ｐ５〜Ｐ１２まで７５％の酸素雰囲気中に閉じ込める）、ＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤ抗体（１ｍｇ／ｋｇ）は、マウスが大気に戻されたＰ１２と、Ｐ１４とＰ１６に再度（全部で３回投与）皮下投与した。血管新生は上述のようにＰ１７日目に評価した。図６は、ＶＥ−ＰＴＰ−ＥＣＤ抗体の皮下投与により、網膜血管新生の面積が減少することを示す。

実施例８に記載した実験を２ｍｇ／ｋｇの皮下投与量で反復した（図７）。

本開示の多くの実施形態が記載されるが、基本例が変更されて、本発明のＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤、方法および過程を利用または包含する他の実施形態を提供し得ることは、明らかである。実施形態と例は例示目的であり、本開示を限定するものと解釈してはならず、むしろ、添付の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定する。

Claims (40)

1. 血管漏出症候群の患者を治療する方法であって、前記患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む、方法。
2. 前記組成物が１以上の薬剤的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記患者が炎症性疾患または状態、外傷、ショック、成人呼吸促迫症候群、急性肺損傷または敗血症に苦しんでいる、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記患者が炎症性疾患または状態に苦しんでいる、請求項１または請求項２に記載の方法。
5. 前記患者が癌治療を受けている、請求項１または請求項２に記載の方法。
6. 前記癌が、腎細胞癌、悪性黒色腫、髄芽腫、上衣腫、乏突起膠腫（ogliodendroglioma）、毛様細胞星状細胞腫、びまん性星状細胞腫、未分化星状細胞腫または膠芽腫である、請求項５に記載の方法。
7. 血管系を安定化させることを必要とする患者の血管系を安定化させる方法であって、前記患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む、方法。
8. 前記組成物が１以上の薬剤的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が、前記患者にＩＬ−２での治療の開始前またはその間に投与される、請求項７または請求項８に記載の方法。
10. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が、前記患者に癌治療の開始前またはその間に投与される、請求項７または請求項８に記載の方法。
11. 前記癌が、腎細胞癌または悪性黒色腫、髄芽腫、上衣腫、乏突起膠腫（ogliodendroglioma）、毛様細胞星状細胞腫、びまん性星状細胞腫、未分化星状細胞腫または膠芽腫である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記癌治療が前記患者に有効量のＩＬ−２を投与することを含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
13. 前記患者が病原体に感染している、請求項７または請求項８に記載の方法。
14. 前記病原体が細菌、ウイルス、酵母、真菌または原生生物である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記患者に有効量の抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤またはそれらの組合せを投与することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 血管漏出症候群患者を治療する過程を決定する方法であって、
    ａ）患者に有効量のΗΡΤΡβ−ＥＣＤ結合剤を含む組成物を投与すること；
    ｂ）治療過程の間、前記患者において存在するアンジオポエチン−２のレベルをモニタリングすること；および
    ｃ）前記アンジオポエチン−２レベルが正常範囲内に戻ったら治療を中止すること、を含む方法。
17. 患者における癌を治療する方法であって、患者に有効量の特異的結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩を含む組成物を投与することを含む、方法。
18. 前記組成物が１以上の薬剤的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 患者に有効量の特異的結合剤またはその許容可能な塩を含む組成物を含む組成物を投与することにより、癌患者における転移を予防する方法。
20. 前記組成物が１以上の薬剤的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. １以上の化学療法剤の投与をさらに含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記化学療法剤が、タキソール、ＩＬ−２、ゲムシタビン、エルロチニブ、ドキシル、イリノテカンおよびベバシズマブから選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 癌が、腎細胞癌または悪性黒色腫、髄芽腫、上衣腫、乏突起膠腫（ogliodendroglioma）、毛様細胞星状細胞腫、びまん性星状細胞腫、未分化星状細胞腫または膠芽腫である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が、ＨＰＴＰβの細胞外部分に結合する抗体、タンパク質、ペプチド、アプタマー、ペプチボディー、アドネクチンまたは核酸である、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
25. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
26. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７６８０により産生されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７６８０により産生された前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片と同じまたは実質的に同じ生物学的特徴を有する抗体である、請求項２４に記載の方法。
29. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が抗原結合断片であり、前記抗原結合断片はＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂの二量体、Ｆｖ、Ｆｖの二量体、またはｓｃＦｖの二量体である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が抗原結合断片であり、前記抗原結合断片はＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂの二量体、Ｆｖの二量体、またはｓｃＦｖの二量体である、請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記抗原結合断片がＦａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖである、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が、タンパク質、ペプチド、アプタマー、ペプチボディー、アドネクチンまたは核酸である、請求項２４に記載の方法。
33. 前記患者に投与される前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩の用量が、前記患者の体重により約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇである、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
34. 前記患者に投与される前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤またはその薬剤的に許容可能な塩の用量が、前記患者の体重により約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
35. 前記用量が、１日１回、毎週３回、毎週２回、毎週１回、毎月３回、毎月２回、毎月１回、または隔月に１回投与される、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
36. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤がビヒクルに結合されている、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記ビヒクルがＰＥＧである、請求項３６に記載の方法。
38. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が眼内注射により投与される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が皮下注射により投与される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記ＨＰＴＰβ−ＥＣＤ結合剤が静脈内注射により投与される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。