CN110603447A - 用抗肾酶抗体和抗pd1抗体治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于结合并抑制肾酶的组合物和方法。在一个实施方式中，肾酶结合分子抑制肾酶活性。因此，在其中肾酶活性的降低是有益的疾病和病症中，这种抑制性肾酶结合分子充当治疗剂。

Description

用抗肾酶抗体和抗PD1抗体治疗癌症的组合物和方法
相关申请的引用
本申请要求2017年3月8日提交的美国临时申请No.62/468,453的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
背景技术
肾酶(Renalase，RNLS)是一种主要在肾脏、心脏、骨骼肌、睾丸中产生的蛋白质而以较小程度上在其他组织中产生(Xu et al.,2005J Clin Invest.115(5):1275-80和Wanget al.,2008Mol Biol Rep.35(4):613-20)。已经描述了肾酶的两种同种型变体，肾酶-1和肾酶-2。这两种形式的肾酶因最终外显子的差异剪接而不同。肾酶被描述为一种新的含黄素腺嘌呤二核苷酸的单胺氧化酶，具有选择性地使儿茶酚胺肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺脱氨的活性。已经描述了与健康个体相比，晚期肾病患者的血浆中的肾酶缺乏。儿茶酚胺通过对心输出量和血管阻力的影响，在维持和调节血压方面(包括在疾病中)发挥重要作用。向大鼠输注重组形式的肾酶导致心肌收缩力、心率和血压降低。肾衰竭患者的特征是循环儿茶酚胺水平升高，其与高血压相关，并且通过心血管并发症导致更高的死亡率。因此，蛋白质肾酶可能在控制和维持儿茶酚胺引起的血压变化中发挥作用，并且在肾病患者中观察到的肾酶缺乏可能对结果有害。
已经描述了与健康个体相比，晚期肾病患者的血浆中的肾酶缺乏。肾衰竭患者的特征是循环儿茶酚胺水平升高，其与高血压相关，并且通过心血管并发症导致更高的死亡率。因此，蛋白质肾酶可能在控制和维持儿茶酚胺引起的血压变化中发挥作用，并且在肾病患者中观察到的肾酶缺乏可能对结果有害。然而，对于肾酶在癌症中的作用知之甚少。
癌症的一个基本特征是细胞衰老和死亡的失调。肾酶(RNLS)是一种分泌的黄素蛋白，其通过质膜钙ATP酶PMCA4b发信号以激活PI3K/AKT和MAPK途径来防止缺血性和毒性细胞损伤。
皮肤癌是一种常见的人类恶性肿瘤，其发病率在发达国家一直在增加(Gray-Schopfer et al.,2007Nature.445:851-7；Lowe et al.,2014Mayo ClinicProceedings.89:52-9；Lesinski et al.,2013Future oncology.9:925-7)。黑色素瘤是最致命形式的皮肤癌，一旦无法切除，存活率很低(Lowe et al.,2014Mayo ClinicProceedings.89:52-9)。它是一种分子异质性疾病，并且已经识别了参与疾病发展和进展的信号转导途径中的一些关键改变。Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信号途径在黑色素瘤的发病机制中起关键作用(Gray-Schopfer et al.,2007Nature.445:851-7；Lesinski etal.,2013Future oncology.9:925-7；Yajima et al.,2012Dermatology research andpractice.2012:354191)。Ras、Raf、PI3K或PTEN(PI3K抑制剂)的突变可导致ERK和AKT的持续激活，这反过来促进细胞的存活和增殖。Dankort et al.在小鼠中有条件黑素细胞特异性表达BRafV600E证明了这一点，然后，当与Pten肿瘤抑制基因沉默相结合时，发展有黑色素瘤的所有小鼠均未显示出100％的黑色素瘤发展外显率(Dankort et al.,2009Naturegenetics.41:544-52)。这些致病途径的阐明促进了靶向超活化激酶的特异性抑制剂的开发。虽然这些药物已被证明可有效治疗转移性黑色素瘤患者的选择性群体，但其有益作用通常很短暂，因此迫切需要确定其他治疗靶。
RNLS表达在黑色素瘤肿瘤中，特别是在CD163+肿瘤相关巨噬细胞中(TAM)显著增加。在一组原发性黑色素瘤患者中，疾病特异性存活与肿瘤块中的RNLS表达呈负相关，表明了RNLS的致病作用。使用siRNA、抗RNLS抗体或RNLS衍生的抑制肽抑制RNLS信号转导显著降低了体外黑色素瘤细胞的存活率。使用单克隆抗体的抗RNLS疗法显著抑制了异种移植小鼠模型中的黑色素瘤肿瘤生长。用m28-RNLS(也称为1D-28-4)的治疗导致内源性RNLS表达显著降低，并且CD163+ TAM中的总STAT3和磷酸化STAT3均显著降低。肿瘤细胞凋亡增加与p38MAPK介导的B细胞淋巴瘤2相关蛋白Bax的激活暂时相关。文献记载了细胞周期抑制剂p21的表达增加及细胞周期停滞。这些结果表明，CD163+ TAM产生的RNLS增加通过激活STAT3促进黑色素瘤生长，并且RNLS信号转导的抑制在黑色素瘤的治疗中具有潜在的治疗应用。
胰腺癌是最致命的肿瘤之一，在全球造成大约330,000人死亡，在美国造成40,000人死亡(World Cancer Report 2014.WHO Press；2014)。胰腺癌很难被发现，并且大多数病例是在晚期诊断出来的(Nolen et al.,2014PLoS ONE.9(4):e94928)。尽管在使用这种癌症的化学疗法方面取得了一些进展，但这种疾病对所有药物疗法都具有极强的抵抗力(Hidalgo et al.,2010New England Journal of Medicine.362(17):1605-17)。胰腺癌患者的总体5年生存率<5％(Hidalgo et al.,2010New England Journal of Medicine.362(17):1605-17)，需要其他的治疗靶。
胰腺癌的发展依赖于基因突变的逐步积累(Jones et al.,2008Science.321(5897):1801-6)，其中一些导致MAPK、PI3K和JAK-STAT信号异常。从最小发育不良的上皮细胞到发育不良到侵袭性癌的进展反映了基因突变的逐步积累，所述基因突变激活癌基因(例如KRAS2)，或灭活肿瘤抑制基因，例如CDKN2a/INK4a、TP53和DPC4/SMaD4)(Hidalgo etal.,2012Annals of Oncology.23(suppl 10):xl35-x8)。95％、90％和75％的胰腺肿瘤分别携带KRAS2、CDKN2a和TP53突变。这些突变导致持续和失调的增殖，这是癌症生长的特征。通过对24个晚期PDAC的综合遗传分析，确定了胰腺导管腺癌(PDAC)中的突变景观和核心信号途径(Jones et al.,2008Science.321(5897):1801-6)。这些数据表明，大多数PDAC含有大量的遗传变化，主要是点突变，并且影响大约12种细胞信号途径。
该研究还发现，514个基因在90％的肿瘤中在PDAC中过表达至少10倍。这包括最近表征的蛋白质肾酶(RNLS)在肿瘤或肿瘤衍生细胞系中增加2至4倍。RNLS是一种新的分泌型黄素蛋白(Xu et al.,2005J Clin Invest.115(5):1275-80；Desir et al.,2012J AmHeart Assoc.1(e002634；Desir et al.,2012J Am Soc Hypertens.6(6):417-26；Li etal.,2008Circulation.117(10):1277-82)，具有NADH氧化酶活性(Farzaneh-Far et al.,2010PLoS One.5(10):el3496；Beaupre et al.,2015Biochemistry.54(3):795-806)，通过受体介导的过程促进细胞和器官的存活(Lee et al.,2013J Am Soc Nephrol.24(3):445-55)，该受体介导的过程不依赖于其固有的酶活性(Wang et al.,2014Journal of theAmerican Society of Nephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。RNLS快速激活蛋白激酶B(AKT)，细胞外信号调节激酶(ERK)和丝裂原活化蛋白激酶(p38)。ERK或AKT的化学抑制消除了RNLS的保护作用(Wang et al.,2014Journal of the American Society ofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。
PD-1(a.k.a.CD279)是一种细胞表面受体，其通过抑制T细胞活性促进自身耐受，并作为免疫检查点防止自身免疫，从而在下调免疫系统中发挥作用。
因此，需要用于预防和治疗癌症的改进方法和组合物，其结合肾酶和PD-1(例如抗体)。本发明满足了这一需求。
发明内容
在一个实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段以及至少一种抗PD1抗体或其结合片段。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体或其结合片段以至少10-6M的亲和力特异性地结合肾酶。
在一个实施方式中，抗PD1抗体或其结合片段以至少10-6M的亲和力特异性地结合PD1。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体特异性地结合肽序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或它们的组合。
在一个实施方式中，至少一种抗体或其结合片段是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、免疫缀合物、去岩藻糖化抗体、双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体或完全人类抗体。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体包含以下中的至少一种：a)SEQ ID NO:11或SEQID NO:19的重链CDR1序列；b)SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:20的重链CDR2序列；c)SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:21的重链CDR3序列；d)SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22的轻链CDR1序列；e)SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23的轻链CDR2序列；和f)SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:24的轻链CDR3序列。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体包含以下中的至少一种：a)SEQ ID NO:27或SEQID NO:35的重链CDR1序列；b)SE Q ID NO:28或SEQ ID NO:36的重链CDR2序列；c)SEQ IDNO:29或SEQ ID NO:37的重链CDR3序列；d)SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:38的轻链CDR1序列；e)SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:39的轻链CDR2序列；和f)SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:40的轻链CDR3序列。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的多肽。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体包含以下中的至少一种：a)重链CDR1序列SEQ IDNO:43；b)重链CDR2序列SEQ ID NO:44；c)重链CDR3序列SEQ ID NO:45；d)轻链CDR1序列SEQID NO:46；e)轻链CDR2序列SEQ ID NO:47；和f)轻链CDR3序列SEQ ID NO:48。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的多肽。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:41的重链序列。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体包含选自于由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQID NO:26、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:42组成的组中的轻链序列。
在一个实施方式中，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗或预防癌症的方法，该方法包括步骤：向受试者施用包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段的组合物，和向受试者施用包含至少一种抗PD1抗体或其结合片段的组合物。
在一个实施方式中，包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段的组合物以及包含至少一种抗PD1抗体或其结合片段的组合物与至少一种另外的治疗剂组合向受试者施用。
在一个实施方式中，癌症是急性淋巴细胞癌症；急性髓系白血病；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，童年期；阑尾癌；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤，童年期；脑肿瘤，成人期；脑肿瘤，脑干胶质瘤，童年期；脑肿瘤，中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤，童年期；中枢神经系统胚胎性肿瘤；小脑星形细胞瘤；脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；颅咽管瘤；室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；中间分化的松果体实质瘤；幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体细胞瘤；视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；脑和脊髓肿瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；类癌瘤，胃肠道的；中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，童年期；宫颈癌；脊索瘤，童年期；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；食道癌；尤因肿瘤家族；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑色素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质瘤(gist)；生殖细胞肿瘤，颅外；生殖细胞肿瘤，性腺外；生殖细胞肿瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；神经胶质瘤，童年脑干；神经胶质瘤，童年脑星形细胞瘤；神经胶质瘤，童年视觉通路和下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌；组织细胞增生症，朗格汉斯细胞；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视觉通路神经胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；肾(肾细胞)癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；白血病，急性淋巴细胞癌症；白血病，急性髓细胞性的；白血病，慢性淋巴细胞的；白血病，慢性骨髓性的；白血病，毛细胞；唇和口腔癌；肝癌；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴瘤，艾滋病相关；淋巴瘤，伯基特；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，霍奇金；淋巴瘤，非霍奇金；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦尔登斯特伦；骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；髓母细胞瘤；黑色素瘤；黑色素瘤，眼内(眼)；梅克尔细胞癌；间皮瘤；伴隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征，(童年期)；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；霉菌病；蕈样肉芽肿；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；髓性白血病，慢性；髓性白血病，成人急性；髓性白血病，童年急性；骨髓瘤，多发；骨髓增生性疾病，慢性；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤和骨的恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，胰岛细胞瘤；乳头状瘤病；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；副神经节瘤；中间分化的松果体实质瘤；松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾盂和输尿管，移行细胞癌；涉及15号染色体上坚果基因的呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；肉瘤，尤因肿瘤家族；肉瘤，卡波西；肉瘤，软组织；肉瘤，子宫的；塞泽里综合征；皮肤癌(非黑色素瘤)；皮肤癌(黑色素瘤)；皮肤癌，梅克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌，鳞状颈癌，隐匿性原发性的，转移性的；胃(胃)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤，妊娠期；尿道癌；子宫癌，子宫内膜癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；或威尔姆斯肿瘤。
在一个实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段以及至少一种抗PD-L1抗体或其结合片段。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体或其结合片段以至少10-6M的亲和力特异性结合肾酶。
在一个实施方式中，抗PD-L1抗体或其结合片段以至少10-6M的亲和力特异性结合PD-L1。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体特异性结合肽序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或它们的组合。
在一个实施方式中，至少一种抗体或其结合片段是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、免疫缀合物、去岩藻糖化抗体、双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体或完全人类抗体。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体包含以下中的至少一种：a)SEQ ID NO:11或SEQID NO:19的重链CDR1序列；b)SEQ ID NO:12或SEQID NO:20的重链CDR2序列；c)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:21的重链CDR3序列；d)SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22的轻链CDR1序列；e)SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23的轻链CDR2序列；和f)SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:24的轻链CDR3序列。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体包含以下中的至少一种：a)SEQ ID NO:27或SEQID NO:35的重链CDR1序列；b)SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:36的重链CDR2序列；c)SEQ IDNO:29或SEQ ID NO:37的重链CDR3序列；d)SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:38的轻链CDR1序列；e)SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:39的轻链CDR2序列；和f)SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:40的轻链CDR3序列。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的多肽。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体包含以下中的至少一种：a)重链CDR1序列SEQ IDNO:43；b)重链CDR2序列SEQ ID NO:44；c)重链CDR3序列SEQ ID NO:45；d)轻链CDR1序列SEQID NO:46；e)轻链CDR2序列SEQ ID NO:47；和f)轻链CDR3序列SEQ ID NO:48。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的多肽。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:41的重链序列。
在一个实施方式中，抗肾酶抗体包含选自于由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQID NO:26、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:42组成的组中的轻链序列。
在一个实施方式中，本发明涉及一种在有需要的受试者治病或预防癌症的方法，该方法包括步骤：向受试者施用包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段的组合物，和向受试者施用包含至少一种抗PD-L1抗体或其结合片段的组合物。
在一个实施方式中，包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段的组合物以及所述包含至少一种抗PD-L1抗体或其结合片段的组合物与至少一种另外的治疗剂组合向受试者施用。
在一个实施方式中，癌症是急性淋巴细胞癌症；急性髓系白血病；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，童年期；阑尾癌；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤，童年期；脑肿瘤，成人期；脑肿瘤，脑干胶质瘤，童年期；脑肿瘤，中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤，童年期；中枢神经系统胚胎性肿瘤；小脑星形细胞瘤；脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；颅咽管瘤；室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；中间分化的松果体实质瘤；幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体细胞瘤；视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；脑和脊髓肿瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；类癌瘤，胃肠道的；中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，童年期；宫颈癌；脊索瘤，童年期；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；食道癌；尤因肿瘤家族；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑色素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质瘤(gist)；生殖细胞肿瘤，颅外；生殖细胞肿瘤，性腺外；生殖细胞肿瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；神经胶质瘤,童年脑干；神经胶质瘤,童年脑星形细胞瘤；神经胶质瘤,童年视觉通路和下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌；组织细胞增生症，朗格汉斯细胞；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视觉通路神经胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；肾(肾细胞)癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；白血病，急性淋巴细胞癌症；白血病，急性髓细胞性的；白血病，慢性淋巴细胞的；白血病，慢性骨髓性的；白血病，毛细胞；唇和口腔癌；肝癌；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴瘤，艾滋病相关；淋巴瘤，伯基特；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，霍奇金；淋巴瘤，非霍奇金；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦尔登斯特伦；骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；髓母细胞瘤；黑色素瘤；黑色素瘤，眼内(眼)；梅克尔细胞癌；间皮瘤；伴隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征，(童年期)；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；霉菌病；蕈样肉芽肿；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；髓性白血病，慢性；髓性白血病，成人急性；髓性白血病，童年急性；骨髓瘤，多发；骨髓增生性疾病，慢性；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤和骨的恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；胰腺癌,胰岛细胞瘤；乳头状瘤病；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；副神经节瘤；中间分化的松果体实质瘤；松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾盂和输尿管，移行细胞癌；涉及15号染色体上坚果基因的呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；肉瘤，尤因肿瘤家族；肉瘤，卡波西；肉瘤，软组织；肉瘤，子宫的；塞泽里综合征；皮肤癌(非黑色素瘤)；皮肤癌(黑色素瘤)；皮肤癌，梅克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌，鳞状颈癌，隐匿性原发性的，转移性的；胃(胃)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤，妊娠期；尿道癌；子宫癌，子宫内膜癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；或威尔姆斯肿瘤。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本发明的优选实施方式的以下详细描述。然而，应该理解的是，本发明不限于附图中所示实施方式的精确布置和手段。
图1包括图1A和图1B，是显示肾酶依赖性细胞信号转导的时间过程的一系列图像。图1A显示了用肾酶孵育的人核胎肾细胞(HK-2)以及通过蛋白质印迹分析确定的蛋白激酶B(AKT)和细胞外信号调节激酶(ERK)的活化；显示了代表性印迹(n＝3)；信号归一化为甘油醛3-磷酸脱氢酶负载对照(n＝3)；对于ERK和AKT(T308)，从1至60分钟相对于基线的变化在统计学上是显著的，并且对于AKT(S473)，仅在30分钟时是统计学显著的。图1B显示，肾酶上调HK-2细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的抗凋亡分子Bcl-2。
图2是显示肾酶同种型Ren1-7的图像：外显子编号从1到10；RP-224，Ren1或Ren2的肾酶氨基酸224 233；RP-220，氨基酸220-239；RP-H220，组氨酸标记的RP-220；RP-Scr220，加扰的RP-220。
图3是显示ERK或AKT抑制消除了肾酶肽的保护作用的图表：WT小鼠进行假手术或30分钟的肾缺血和再灌注；在肾缺血前10分钟注射RP-H220或载体(盐水)。ERK抑制剂PD98059或PI3K/AKT抑制剂渥曼青霉素消除了RP-H220的保护作用。
图4是显示表1中肽的序列比对的图像，其中这些肽对应于肾酶-1或2序列。
图5，包括图5A至图5J，是显示与肾酶结合的抗体序列的一系列图像；互补决定区(CDR)以下划线表示。图5A和图5B分别显示了1D-28-4重链和轻链编码序列的序列。图5C和图5D分别显示了1D-37-10重链和轻链编码序列的序列。图5E和图5F分别显示了1F-26-1重链和轻链编码序列的序列。图5G和图5H分别显示了1F-42-7重链和轻链编码序列的序列。图5I和图5J分别显示了3A-5-2重链和轻链编码序列的序列。
图6是显示癌细胞系中的肾酶表达的图表：通过定量PCR确定表达并归一化为肌动蛋白表达。
图7是显示黑素细胞中的肾酶表达的图像：与正常皮肤相比，痣和黑色素瘤中的肾酶表达显著增加。
图8是显示抗肾酶单克隆抑制培养物中的A375.S2黑色素瘤细胞并显示与替莫唑胺的协同作用的图表：在处理72小时后通过WST-1方法测量细胞活力；RenAb-10：肾酶单克隆，10μ/ml；TMZ：替莫唑胺，100或150μg/ml。
图9是显示抗肾酶单克隆抑制培养物中的A375.S2黑色素瘤细胞并显示与达卡巴嗪的协同作用的图表：在处理72小时后通过WST-1方法测量细胞活力；RNLSMono：肾酶单克隆。
图10是显示抗肾酶单克隆抑制培养物中的Sk-Mel-28黑色素瘤细胞并显示与替莫唑胺的协同作用的图表：在处理72小时后通过WST-1方法测量细胞活力；RenAb-10：肾酶单克隆，10μ/ml；TMZ 100：替莫唑胺，100μg/ml。
图11是显示抗肾酶单克隆抑制培养物中的白血病细胞系的图表：用抗肾酶单克隆抗体将培养物中的CCL-119细胞处理24小时；通过WST-1方法测量细胞存活(n＝3,*P,0.05)。
图12是显示抗肾酶多克隆抑制胰腺癌细胞系MiaPac的图表。
图13是显示抗肾酶单克隆抑制胰腺癌细胞系Panc1的图表。
图14是在有和没有肾酶单克隆的条件下比较培养物中黑色素瘤细胞的显微照片。肾酶抗体显著降低了活细胞的数量。
图15是展示肾酶单克隆抗体1C-22-1和1D-37-10抑制培养物中的黑色素瘤细胞的图表。
图16是显示患有表达高肾酶水平的黑色素瘤的患者死亡率增加的一系列图像：通过AQUA在来自263名黑色素瘤患者的活检标本中测量肾酶表达；使用针对S-100和gp100的抗体获得的肿瘤遮罩；x轴上的跟踪周期单位为月；Y轴上显示累积存活％。
图17包括图17A至图17D，是显示黑色素瘤中RNLS过表达以及与患者预后不良关联的一系列图像和图表。图17A是显示使用抗RNLS-m28检测正常人皮肤(n＝15)、良性痣(n＝295)和恶性黑色素瘤(n＝264)的组织微阵列的免疫荧光染色的RNLS表达的图像；为每种显示了代表性结果，蓝色：细胞核，绿色：黑色素细胞和红色：RNLS。图17B是描绘使用AQUAnalysisTM软件Yale TMA定量的荧光强度的图表：正常人皮肤(n＝15)，良性痣(n＝295)和恶性黑色素瘤(n＝264)。图17C是显示使用AQUAnalysisTM软件US Biomax TMA定量的荧光强度的图表：正常人皮肤(n＝14)，良性痣(n＝14)，原发性黑色素瘤(n＝35)和转移性黑色素瘤(n＝11)，*指示p＝0.009且**指示p<0.001。图17D描绘了黑色素瘤特异性死亡的Kaplan-Meier存活曲线；1997年至2004年收集了119份系列原发性黑色素瘤，按中位AQUA评分＝75,764.45将肿瘤分为低和高RNLS表达，*指示p＝0.008。
图18包括图18A和图18B，是显示RNLS过表达有利于癌细胞存活的两个图表。图18A是描绘经血清饥饿并且随后作用使用BSA(30ug/ml)或rRNLS(30ug/ml)处理的A375.S2、MeWo、Skmel5和Skmel28细胞以及72小时后使用WST-1检测测量的细胞活力；n＝6，*指示p<0.05且**指示p<0.005。图18B是描绘经血清饥饿24小时，然后未处理或使用30μg/ml牛血清白蛋白(BSA)或rRNLS孵育3天的A375.S2细胞的图表；使用台盼蓝和自动细胞计数器测定总细胞数和活细胞数；n＝6，**指示p<0.001。
图19包括图19A至图19D，是显示RNLS信号转导的抑制对体外黑色素瘤细胞具有细胞毒性的一系列图像和图表。图19A是描绘使用RNLS特异性siRNA或非特异性对照siRNA瞬时转染黑色素瘤细胞A375.S2和SK-Mel-28后的相对细胞活力的图表，其中在72小时后使用WST-1测定法评估细胞活力；n＝6，*指示p＝0.03且**指示p＝0.003。图19B包括描绘相对细胞活力的两个图表：左图：用指定的抗体处理细胞72小时，并使用WST-1测定细胞活力；m28-RNLS(也被称为1D-28-4)，m37-RNLS(也被称为1D-37-10)：针对RNLS肽RP20产生单克隆抗体；右图：用增加剂量的m28-RNLS处理A375.S2细胞72小时并用WST-1测定法测定细胞活力；n＝6，*指示p<0.05且**指示p<0.005。图19C包含用对照兔IgG或m28-RNLS孵育72小时后的A375.S2、SkMel28和SkMel5的代表性照片。图19D是描绘相对细胞活力的图表，其包含RNLS肽拮抗剂(RP220A)的氨基酸(AA)序列。用指定浓度的BSA或RP220A处理A375.S2细胞，72小时后使用WST-1测定法测量细胞活力；n＝6，**指示p<0.005。
图20包括图20A和图20B，包括显示RNLS信号的抑制阻断了体内黑色素瘤生长的图表和两个图像。图20A是显示用A375.S2细胞异种移植的裸无胸腺小鼠中肿瘤体积增加的图表，在每3天用2mg/kg兔IgG作为阴性对照或用RNLS单克隆抗Ab，m28-RNLS进行治疗前，测量肿瘤大小；n＝14/组；每日肿瘤生长速率计算为肿瘤大小相对于先前测量值的变化；*指示p<0.05。图20B包括用m28-RNLS或对照锅兔IgG处理的A375.S2异种移植肿瘤(每组n＝14)切片的细胞增殖标记物Ki67的IHC染色的代表性图像；棕色：Ki67阳性细胞。
图21包括图21A至图21F，是显示RNLS信号的抑制阻断RNLS表达和STAT3激活并诱导细胞凋亡和细胞周期停滞的一系列图像和图表。图21A包括一系列图像，显示了用兔IgG作为阴性对照或用RNLS单克隆Ab处理并且通过免疫荧光探测RNLS、磷酸化STAT3和总STAT3的异种移植肿瘤；磷酸STAT3＝p-Y705-STAT3；显示了每个的代表性结果，蓝色：核，绿色：RNLS，和红色：磷酸STAT3(左图)或总STAT3(右图)。图21B是显示用兔IgG作为阴性对照或用RNLS单克隆Ab处理的异种移植肿瘤、以及通过蛋白质印迹探测RNLS、磷酸化STAT3、总STAT3和p21的肿瘤细胞裂解物的图像；p-Y705-STAT3：磷酸化酪氨酸705；代表性研究。图21C是描绘图21B中所示样品中STAT3蛋白表达的定量的图表；p-Y705-STAT3信号归一化为总STAT3，总STAT3信号归一化为蛋白质负荷测量值；n＝3，*指示p<0.05且**指示p<0.005。图21D是显示用兔IgG作为阴性对照或用RNLS单克隆Ab处理并通过qPCR探测人和小鼠RNLS表达的异种移植肿瘤(每组n＝14)的图表，*指示p<0.05。图21E包括来自经m28-RNLS或对照兔IgG处理的A375.S2异种移植肿瘤(每组n＝14)的切片的IHC染色的代表性图像，用于TUNEL测定以标记凋亡细胞或细胞周期抑制剂p21；棕色：分别为TUNEL或p21阳性细胞。图21F是显示用抗RNLS抗体或对照山羊IgG处理的A375.S2细胞的图像；通过蛋白质印迹评估p38磷酸化和Bax表达的时间过程；p-p38＝磷酸化p38；Bax＝bcl-2样蛋白4。
图22包括图22A至图22C，是显示RNLS在黑色素瘤中的CD163+TAM中表达的一系列图像和图表。图22A包括图像，显示：上图：通过IF检测组织微阵列人黑色素瘤样品共表达RNLS和泛巨噬细胞标记物CD68；蓝色：细胞核，绿色：RNLS，和红色：所有巨噬细胞；DAPI：核染色，RNLS-CD68：合并的RNLS和CD68染色；中图：IF检查黑色素瘤样品共表达RNLS和交替激活的巨噬细胞(M2)标记物CD163；蓝色：细胞核，绿色：RNLS，和红色：M2巨噬细胞；DAPI：核染色，RNLS-CD163：合并的RNLS和CD163染色。注意到RNLS和CD163的显著共表达；下图：IF检测黑色素瘤样品共表达RNLS和经典活化的巨噬细胞(M1)标记物CD86；蓝色：细胞核，绿色：RNLS，和红色：M1巨噬细胞；DAPI：核染色，RNLS-CD163：合并的RNLS和CD86染色。没有注意到RNLS和CD 186的显著共表达。图22B包括两个图像，显示了用兔IgG作为阴性对照或用m28-RNLS处理并通过免疫荧光探测RNLS和M2 TAM(CD163+细胞)的异种移植肿瘤；显示了每个的代表性结果，绿色：M2巨噬细胞，红色：RNLS。m28-RNLS处理降低CD163+TAM和RNLS表达。图22C描绘了以下各项的提议作用机制：m28-RNLS-TAM：肿瘤相关巨噬细胞，CD163：交替激活的巨噬细胞(M2)标志物，CD86：经典激活的巨噬细胞(Ml)标志物，RNLS：肾酶，m28-RNLS：抗肾酶单克隆抗体，t-STAT3：总STAT3，p-STAT3：磷酸化STAT3。
图23包括图23A至图23E，是显示一些癌症中的RNLS表达以及与PDAC中患者预后不良的关联的一系列图像和图表。图23A是显示通过qPCR在含有来自15种不同肿瘤类型的182个人肿瘤样品(OriGene Technologies)的cDNA阵列中测量的RNLS mRNA水平的图表；*指示p<0.05，**指示p＝0.0001。图23B是显示通过qPCR在正常胰腺(n＝6)、胰腺导管腺癌(n＝11)和胰腺神经内分泌肿瘤(n＝23)中测量RNLS mRNA水平的图表；*指示p＝0.05；**指示p＝0.00017。图23C是显示在正常人胰腺组织(左图，n＝90)、导管腺癌(1-4级，每组n＝20)中使用m28-RNLS通过免疫组织化学检测的RNLS蛋白表达的图像；显示了每个的代表性结果；RNLS蛋白质染成棕色。图23D显示了使用抗RNLS-m28检测的RNLS表达，正常人胰腺组织(左图，n＝90)、导管癌(中图，n＝90)的组织微阵列的免疫荧光染色；显示了每个的代表性结果，并且蓝色：细胞核，绿色：细胞角蛋白，和红色：RNLS；右图：使用AQUAnalysisTM软件定量的荧光强度，正常人胰腺组织(n＝90)、导管癌(n＝90)，***指示p＝0.00013。图23E显示了存活率的Kaplan-Meier存活曲线；69个PDAC的Biomax群组分为低(n＝35，RNLS AQUA评分<中位数)和高(n＝34，RNLS AQUA评分>中位数)RNLS表达，*指示p＝0.0001。
图24包括图24A至图24D，是显示RNLS过表达有利于癌细胞存活的一系列图表。图24A显示了经血清饥饿48小时、然后用30μg/ml牛血清白蛋白(BSA)或rRNLS孵育3天的PDACC系BxPC3、Panc1和MiaPaCa2；使用台盼蓝和自动细胞计数器测定的总细胞数和活细胞数；n＝4，**指示p<0.0001。图24B是描绘相对于对照的细胞活力的图表：经血清饥饿，然后在使用和不使用MEK1抑制剂U0126进行预处理的条件下用BSA(30μg/ml)或rRNLS(30μg/ml)处理的MiaPaCa2细胞，72小时后使用WST-1测定法测量细胞活力；n＝6，*指示p<0.005。图24C包括显示siRNA介导的PMCA4b表达抑制阻断了RNLS介导的MAPK信号转导的图像和图表；左图和中图：用非靶向或PMCA4b siRNA转染的MiaPaCa2细胞，其在无血清培养基中维持3天，并用25μg BSA或25μg RNLS肽RP-220处理指定时间；显示了通过蛋白质印迹评估的RP-220介导的ERK和STAT3活化以及代表性免疫印迹；p-ERK＝磷酸化ERK，p-Y705-STAT3＝磷酸化STAT3，p-S727-STAT3＝磷酸化STAT3，BSA＝牛血清白蛋白，RP-220＝RNLS肽激动剂；右图：磷酸化ERK(p-ERK)的定量，信号归一化为甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)负载对照；n＝3，*＝P<0.05。图24D是显示使用BAS(30μg/ml)或rRNLS(30μg/ml)处理的MiaPaCa2细胞荧光激活细胞分选(FACS)分析的图表，n＝3。
图25包括图25A至图25E，是显示RNLS信号转导的抑制在体外和体内对癌细胞具有细胞毒性的一系列图表和图像。图25A是显示使用RNLS特异性siRNA或非特异性对照siRNA瞬时转染Panc1细胞后的相对细胞活力的图表，并且在96h后使用WST-1试剂测定细胞活力；n＝6，**指示p<0.001。图25B是显示当用指定的抗体处理细胞72小时并且使用WST-1测定细胞活力时的相对细胞活力的图表；m28-RNLS和m37-RNLS：针对RNLS肽RP220产生的单克隆抗体，ab31291：针对RP-220的部分序列产生的Abeam多克隆抗体；n＝6，*指示p<0.005。图25C显示了用m28-RNLS孵育3天后的MiaPaCa2细胞的代表性照片，n＝10。图25D是显示无胸腺裸鼠皮下注射用RNLS shRNA(sh-RNLS)或对照(sh-对照)转导的Panc1细胞后肿瘤体积增加的图表；每23天测量肿瘤体积，长达30天，每组n＝6；*指示p<0.05。图25E是显示裸鼠用BxPC3异种移植后肿瘤体积增加的图表；在每3-4天使用2mg/kg兔IgG作为阴性对照或使用m28-RNLS治疗前测量肿瘤体积，n＝10，*指示p<0.05。
图26包括图26A至图26E，是显示RNLS信号转导的抑制诱导细胞凋亡和细胞周期停滞的一系列图像和图表。图26A显示了来自用抗m28-RNLS或对照兔IgG处理的BxPC3异种移植肿瘤(每组n＝14)的切片的TUNEL染色的代表性图像；箭头：TUNEL阳性细胞。图26B是描绘用m28-RNLS(30μg/ml)或100μM依托泊苷(阳性对照)处理4天的培养物中Panc1细胞的FACS分析的图表；n＝3，*指示p<0.05。图26C是显示用多克隆ab31291或用山羊IgG作为阴性对照处理的Panc1细胞的图像，通过蛋白质印迹探测细胞裂解物的p38和Bax活化。图26D显示了来自用抗m28-RNLS或对照兔IgG处理的BxPC3异种移植肿瘤(每组n＝14)切片的IHC染色的代表性图像，用于细胞增殖的标志物ki67和细胞周期抑制剂p21。图26E是显示通过FACS分析测定的m28-RNLS对Panc1细胞的细胞周期的影响的图表；绿色曲线：无处理，紫色曲线：兔IgG，红色曲线：m28-RNLS 30μg/ml。
图27包括图27A至图27E，是显示RNLS和STAT3之间相互作用以及m28-RNLS抑制的机理模型的一系列图像和图表。图27A是显示Panc1细胞中RNLS激活STAT3的图像；培养物的Panc1细胞用BSA或RNLS处理，并通过蛋白质印迹评估STAT3磷酸化；p-Ser727-STAT3：在丝氨酸727磷酸化，p-Y705-STAT3：在酪氨酸705磷酸化；代表性研究。图27B是描绘用RNLS定量STAT3磷酸化的图表；信号归一化为总STAT3；n＝3，*＝P<0.05。图27C是显示m28-RNLS抑制STAT3磷酸化的图像；培养物的Panc1细胞用兔IgG或抗RNLS单克隆m28-RNLS处理长达4天，并通过蛋白质印迹评估STAT3磷酸化；p-Ser727-STAT3：在丝氨酸727磷酸化，p-Y705-STAT3：在酪氨酸705磷酸化；GAPDH负载对照；代表性研究。图27D是显示用m28-RNLS定量STAT3磷酸化的图表；信号归一化为GAPDH负载对照；n＝3，*＝P<0.05。图27E描绘了所提出的m28-RNLS的抗肿瘤活性的机制模型。
图28包括描绘RNLS表达存在于1-4级PDAC中并且主要定位于癌细胞的图像。
图29包括显示胰腺神经内分泌肿瘤中RNLS表达以及显示RNLS在整个肿瘤的细胞中表达的图像。
图30是描绘归一化为β-肌动蛋白的相对RNLS mRNA水平的图表，显示具有KRAS突变的胰腺导管腺癌细胞(PDACC)系(MiaPaCa2和Panc1)中的RNLS基因表达比具有野生型KRAS的那些(诸如BxPC3)中的更高。
图31是描绘用β-肌动蛋白归一化的相对RNLS mRNA水平的图表，显示了降低RNLS表达对体外细胞活力的影响，通过siRNA的RNLS敲低来评估；这种处理显著降低了PDACC系Panc1和MiaPaCa2的活力。
图32是显示通过RNLS靶向shRNA抑制RNLS表达导致其受体PMCA4b表达显著降低的图表，表明RNLS和PMCA4b表达是共同调节的。
图33是描绘培养物中Panc1细胞的FACS分析的一系列图表，其证实m28-RNLS引起细胞凋亡。
图34包括图像和图表，显示在用RNLS处理的HK-2细胞中，丝氨酸727的STAT3磷酸化(p-Ser727-STAT3)和酪氨酸705的STAT3磷酸化(p-Y705-STAT3)分别增加2倍和4倍。而STAT1未受影响，表明存在正的RNLS-STAT3反馈回路。
图35描绘了示例性实验的结果，证明抗RNLS抗体和抗PD1抗体在针对耐抗PD1药剂的肿瘤细胞系(即YUMM)方面存在协同作用。将抗PD1耐受性小鼠黑色素瘤细胞系(YUMM)植入免疫活性的C57B6小鼠中。在移植的YUMM肿瘤体积达到约100mm3(即第0天)后，在第0、7、9和12天施用治疗，如图23中的箭头所示。如图23所示，与单独的抗RNLS抗体(60μg)或单独的抗PD1抗体(120μg)相比，抗RNLS抗体(m28；15μg，30μg或60μg)和抗PD1抗体(120μg)联合治疗可更大程度地降低肿瘤生长。
图36描绘了在使用单独的抗RNLS抗体(m28)、单独的抗PD1抗体、以及抗RNLS抗体(m28)和抗PD1抗体的组合处理后的未分割的肿瘤块在通过qPCR测量PD1和PD-L1 mRNA表达的示例性实验的结果。
图37描绘了在使用单独的抗RNLS抗体(m28)、单独的抗PD1抗体、以及抗RNLS抗体(m28)和抗PD1抗体的组合处理后的未分割的肿瘤块中通过qPCR测量CD8a mRNA表达的示例性实验的结果。结果表明m28激活细胞毒性T细胞。
具体实施方式
本发明涉及使用肾酶的抑制剂与PD1的抑制剂组合治疗、抑制、预防或减少癌症。在一个实施方式中，肾酶的抑制剂是抗肾酶抗体或其结合片段，并且PD1的抑制剂是抗PD1抗体或其结合片段。在另一个实施方式中，肾酶的抑制剂是抗肾酶抗体或其结合片段，并且PD1的抑制剂是抗PD-L1抗体或其结合片段。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
通常，本文使用的命名法以及细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域公知和常用的那些。
将标准技术用于核酸和肽合成。通常根据本领域中的常规方法和各种一般参考文献(例如Sambrook and Russell,2012,Molecular Cloning,A Laboratory Approach,ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,和Ausubel et al.,2012,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY)执行技术和程序，本文件中提供了这些内容。
本文使用的命名法和以下描述的分析化学和有机合成中使用的实验室程序是本领域公知和常用的那些。将标准技术或其修改用于化学合成和化学分析。
本文使用的冠词“一个(a)”和“一种(an)”指的是冠词语法对象的一个或多于一个(即至少一个)。举例来说，“一个元素”表示一个元素或多于一个元素。
当提及诸如量、时间持续时间等的可测量值时，本文中使用的“约”意指包括指定值±20％、或±10％、或±5％、或者±0.1％的变化，因为这些变化适合于执行所公开的方法。
当在生物体、组织、细胞或其组分的背景下使用时，术语“异常”是指相比于展示出“正常”(预期/稳态)可观察或可检测的特征(例如年龄、治疗、时间天等)的那些生物体、组织、细胞或其组分，存在至少一种不同的相应特征的那些生物体、组织、细胞或其组分。对于一种细胞、组织类型或受试者而言正常或预期的特征，对于不同的细胞或组织类型可能是异常的。
本文所用的术语“类似物”通常是指通常在结构上类似于它们的类似化合物或“母体”化合物的化合物。通常，类似物会保留母体化合物的某些特征，例如生物学或药理学活性。类似物可以缺少其他不太需要的特征，例如抗原性、蛋白水解不稳定性、毒性等。类似物包括其中母体的特定生物活性降低，而母体的一种或多种不同的生物活性在“类似物”中不受影响的化合物。在应用于多肽时，术语“类似物”相对于母体化合物可具有不同范围的氨基酸序列同一性，例如具有给定氨基酸序列母体或者母体的选择部分或结构域中氨基酸的至少约70％、更优选至少约80％-85％或约86％-89％，并且还更优选至少约90％、约92％、约94％、约96％、约98％或约99％。在应用于多肽时，术语“类似物”通常是指由约至少3个氨基酸的片段组成的多肽，其与结合结构域融合蛋白的至少一部分具有实质同一性。类似物通常为至少5个氨基酸长度，至少20个氨基酸长度或更长，至少50个氨基酸长度或更长，至少100个氨基酸长度或更长，至少150个氨基酸长度或更长，至少200个氨基酸长度或更长，并且更通常至少250个氨基酸长度或更长。一些类似物可能缺乏实质性的生物活性，但仍可用于各种用途，诸如用于产生针对预定表位的抗体、作为通过亲和层析检测和/或纯化反应性抗体的免疫试剂、或作为结合结构域融合蛋白功能的竞争性或非竞争性激动剂、拮抗剂或部分激动剂。
如本文所使用的，术语“抗体”是指能够特异性结合于结合伴侣分子的特定表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是来自天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(“胞内抗体”)、Fv、Fab、Fab’、F(ab)2和F(ab’)2以及单链抗体(scFv)、重链抗体例如骆驼抗体和人源化抗体(Harlow et al.,1999,UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlowet al.,1989,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”或“结合片段”是指抗体的至少一种部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’，F(ab’)2和Fv片段，线性抗体，sdAb(VL或VH)，骆驼科动物VHH结构域，scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scFv”是指包含含有轻链的可变区的至少一种抗体片段和含有重链的可变区的至少一种抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接并且能够被表达为单链多肽，并且其中scFv保留了衍生它的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所使用的，scFv可以以任一顺序具有VL和VH可变区，例如相对于多肽的N-末端和C-末端，所述scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
本文所用的“抗体重链”是指天然存在构象的抗体分子中存在的两种类型的多肽链中较大的一个，并且其通常决定抗体所属的类别。
本文所用的“抗体轻链”是指天然存在构象的抗体分子中存在的两种类型的多肽链中较小的一个。卡帕(κ)和拉姆达(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
本文所用的术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如如本文所描述的噬菌体表达的抗体。该术语还应理解为通过合成编码抗体的DNA分子并且该DNA分子表达抗体蛋白而产生的抗体，或指定抗体的氨基酸序列，其中所述DNA或氨基酸序列是使用合成DNA或氨基酸序列技术获得的，该技术是本领域可获得并且是众所周知的。
“嵌合抗体”是指一种工程化抗体，其含有与衍生自受体抗体的轻链和重链恒定区关联的衍生自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)。
“人源化抗体”是指一种工程化抗体，其CDR衍生自非人供体免疫球蛋白，该分子的其余免疫球蛋白衍生部分衍生自一种(或多种)人免疫球蛋白。另外，可以改变框架支持残基以保持结合亲和力(参见例如1989,Queen et al.,Proc.Natl.Acad Sci USA,86:10029-10032；1991,Hodgson et al.,Bio/Technology,9:421)。合适的人受体抗体可以是选自常规数据库中的一种，例如KABAT数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库，与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列同源。以与供体抗体的框架区具有同源性(基于氨基酸)的人类抗体可能适合于提供用于插入供体CDR的重链恒定区和/或重链可变框架区。可以以类似的方式选择能够提供轻链恒定区或可变框架区的合适的受体抗体。应注意，受体抗体重链和轻链不需要源自相同的受体抗体。现有技术描述了多种产生这种人源化抗体的方式(参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951)。
术语“供体抗体”是指一种抗体(单克隆和/或重组体)，其将其可变区、CDR或其他功能片段或其类似物的氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白伴侣，从而提供改变的免疫球蛋白编码区以及产生表达的具有供体抗体的结合特异性和中和活性特征的改变的抗体。
术语“受体抗体”是指与供体抗体异源的抗体(单克隆和/或重组体)，其将编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列的全部(或任何部分，但在一些实施方式中为全部)贡献给第一免疫球蛋白伴侣。在某些实施方式中，人类抗体是受体抗体。
“CDR”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，它们是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4thEd.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987).在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，如本文所使用的，“CDR”是指所有三个重链CDR，或所有三个轻链CDR(或者如果合适的话，所有重链和所有轻链CDR两者)。抗体的结构和蛋白质折叠可意味着其他残基被认为是结合区域的一部分并且本领域技术人员会理解为这样。参见例如Chothia et al.,(1989)Conformationsof immunoglobulin hypervariable regions；Nature 342,p 877-883.
术语“框架”或“框架序列”是指可变区减去CDR的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可以由不同的系统确定，所以框架序列的含义受到相应不同的解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)还将轻链和重链上的框架区划分为每个链上的四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，CDR3位于FR3和FR4之间。在没有将特定子区域指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，其他人所指的框架区域代表单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区域内的组合FR。一个FR表示四个子区域中的一个，并且FR表示构成框架区域的四个子区域中的两个或更多个。
如本文所使用的，“免疫测定”是指使用能够与靶分子特异性结合以检测和定量靶分子的抗体的任何结合测定。
本文关于抗体使用的术语“特异性结合”是指识别特定结合伴侣分子但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，与一个物种的结合伴侣分子特异性结合的抗体也可以与来自一个或多个物种的结合伴侣分子结合。但是，这种跨物种反应性本身并不会改变抗体特异性的分类。在另一个实例中，特异性结合到结合伴侣分子的抗体也可以与该结合伴侣分子的不同等位基因形式结合。然而，这种交叉反应性本身并不会改变抗体特异性的分类。
在某些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二结合伴侣分子的相互作用，意味着该相互作用取决于结合伴侣分子上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别并结合特定的蛋白质结构而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和所述抗体的反应中，存在的含有表位A(或游离的，未标记的A)的分子将减少与该抗体结合的标记的A的量。在一些情况下，术语“特异性结合”和“特异性地结合”是指选择性结合，其中抗体识别对于与结合伴侣分子结合的增强亲和力较重要的序列或构象表位。
如本文所使用的，术语“中和”是指当结合蛋白特异性结合肾酶时，肾酶生物活性的中和。优选地，中和结合蛋白是一种中和抗体，其与肾酶的结合导致抑制肾酶的生物活性。优选地，中和结合蛋白结合肾酶并将肾酶的生物活性降低至少约20％，40％，60％，80％，85％或更多。在一些实施方式中，肾酶是人类肾酶。
术语“表位”具有其结构伴侣分子上的位点的普通含义，其由抗体或其结合部分或其他结合分子(例如scFv)识别。表位可以是氨基酸的分子或区段，包括代表完整蛋白质或多肽的一小部分的区段。表位可能是构象的(即不连续的)。也就是说，它们可以由通过蛋白质折叠而并置的主要序列的非连续部分编码的氨基酸形成。
本文所用的短语“生物样品”旨在包括任何包含细胞、组织或体液的样品，其中可检测核酸或多肽的表达。此类生物样品的实例包括但不限于血液、淋巴、骨髓、活组织检查和涂片。性质上为液体的样品在本文中称为“体液”。可以通过多种技术从患者获得生物样品，包括例如通过刮擦或擦拭区域或通过使用针来获得体液。用于收集各种身体样品的方法在本领域中是公知的。
本文使用的术语“癌症”定义为以异常细胞的异常生长为特征的疾病。癌细胞可以通过局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌(例如黑色素瘤)、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、肉瘤等。
如本文所使用的，“缀合的”是指一个分子与第二分子的共价连接。
基因的“编码区”由基因编码链的核苷酸残基和基因非编码链的核苷酸组成，它们分别与通过基因转录产生的mRNA分子的编码区同源或互补。
mRNA分子的“编码区”也由mRNA分子的核苷酸残基组成，其在mRNA分子的翻译期间与转移RNA分子的抗密码子区匹配或编码终止密码子。因此，编码区可以包括核苷酸残基，核苷酸残基包含在由mRNA分子编码的成熟蛋白中不存在的氨基酸残基(例如蛋白质输出信号序列中的氨基酸残基)的密码子。
如本文所使用的，“互补的”是指核酸，是指两条核酸链的区域之间或相同核酸链的两个区域之间的序列互补性的广义概念。已知第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与第二核酸区域的残基形成特定的氢键(“碱基配对”)，如果残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则第二核酸区域的残基与第一区域反平行。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与第二核酸链的残基碱基配对，如果残基是鸟嘌呤，则第二核酸链与第一链反平行。当两个区域以反平行方式排列时，核酸的第一区域与相同或不同核酸的第二区域互补，第一区域的至少一个核苷酸残基能够与第二区域的残基碱基配对。优选地，第一区域包括第一部分且第二区域包括第二部分，由此，当第一和第二部分以反平行方式排列时，第一部分的核苷酸残基的至少约50％，优选至少约75％，至少约90％，或至少约95％能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，第一部分的所有核苷酸残基都能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
如本文所使用的，术语“衍生物”包括多肽、多核苷酸或其他分子的化学修饰。在本发明的上下文中，“衍生多肽”是例如通过糖基化、聚乙二醇化或任何类似方法修饰的多肽，其保留了结合活性。例如，结合结构域的术语“衍生物”包括经化学修饰的结合结构域融合蛋白、变体或片段，例如通过添加一种或多种聚乙二醇分子、糖、磷酸酯和/或其他此类分子进行化学修饰，其中所述分子或多个分子未天然地附着于野生型结合结构域融合蛋白。多肽的“衍生物”还包括通过相对于参考多肽具有例如氨基酸取代、缺失或插入而由参考多肽“衍生”的那些多肽。因此，多肽可以“衍生”自野生型多肽或自任何其他多肽。如本文所使用的，化合物(包括多肽)也可以“衍生”自特定来源，例如衍生自特定生物体、组织类型，或衍生自特定多肽、核酸或存在于特定生物体或特定的组织类型中的其他化合物。
本文所用的术语“DNA”定义为脱氧核糖核酸。
“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，所述特定核苷酸序列用作生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，所述其他聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码了该蛋白质。用作基因或cDNA转录的模板的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，并且通常在序列表中提供)和非编码链可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语‘核苷酸序列’也可以包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可以包含内含子。
“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持体内稳态，并且其中如果疾病没有改善则动物的健康继续恶化。
相比之下，动物的“病症”是一种健康状态，其中动物能够维持体内稳态，但动物的健康状况不如没有病症时的健康状态。如果不治疗，病症不一定会导致动物的健康状况进一步下降。
如果疾病或病症的体征或症状的严重程度、患者体验到这种体征或症状的频率、或两者都减少，则疾病或病症被“缓解”。
化合物的“有效量”或“治疗有效量”是足以对施用该化合物的受试者提供有益效果的化合物的量。
本文所描述的结合结构域多肽的术语“高亲和力”是指解离常数(Kd)为至少约10- 6M，优选至少约10-7M，更优选至少约10-8M或更强，更优选至少约10-9M或更强，更优选至少约10-10M或更强，例如高达10-12M或更强。然而，对于其他结合结构域多肽，“高亲和力”结合可以不同。
如本文所使用的，术语“抑制”意指抑制或阻断活性或功能，例如相对于对照值抑制约百分之十。优选地，与对照值相比，活性被抑制或阻断50％，更优选75％，甚至更优选95％。如本文所使用的，“抑制”还意指将分子、反应、相互作用、基因、mRNA和/或蛋白质的表达、稳定性、功能或活性的水平降低可测量的量或者完全防止。抑制剂是化合物例如拮抗剂，其例如结合、部分或完全阻断活性，减少、防止、延迟活化、失活、脱敏或下调蛋白质、基因和mRNA的稳定性、表达、功能和活性。
本文以其各种形式使用的目的分子的术语“调节剂”和“调节”，旨在涵盖与目的蛋白酶相关的活性的拮抗作用、激动作用、部分拮抗作用和/或部分激动作用。在各个实施方式中，“调节剂”可以抑制或刺激蛋白酶表达或活性。此类调节剂包括蛋白酶分子、反义分子、核酶、三链分子和RNAi多核苷酸等的小分子激动剂和拮抗剂。
如本文所使用的，“说明材料”包括出版物、记录、图表或任何其他表达介质，可用于传达试剂盒中本发明的化合物、组合物、载体或递送系统用于减轻本文所描述的各种疾病或病症的有用性。可选地或者替代地，说明材料可以描述一种或多种缓解哺乳动物细胞或组织中的疾病或病症的方法。本发明的试剂盒的说明材料可以例如固定在容器上，该容器含有本发明的识别化合物、组合物、载体或递送系统，或者可以与含有所述识别化合物、组合物、载体或递送系统的容器一起运输。或者，说明材料可以与容器分开运输，目的是说明材料和化合物由接受者合作使用。
“分离的”意指从自然状态改变或移除。例如，在活体动物中天然存在于其正常环境中的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然环境的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如宿主细胞)中。
“分离的核酸”是指与使其以天然存在的状态位于侧翼的序列分开的核酸片段或片段，即DNA片段，其已从通常与该片段相邻的序列(即，在天然存在的基因组中，与该片段相邻的序列)中取出。该术语也适用于从天然伴随核酸的其他组分(即RNA或DNA或蛋白质)中基本上纯化的核酸，所述其他组分在细胞中天然与其伴随。因此，该术语包括例如重组DNA，其被整合到载体中、到自主复制的质粒或病毒中、或到原核生物或真核生物的基因组DNA中，或者其作为独立于其他序列的独立分子而存在(即作为cDNA或通过PCR或限制酶消化产生的基因组或cDNA片段)。它还包括作为编码另外的多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。
在本发明的上下文中，使用了用于常见核酸碱基的以下缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，“U”是指尿苷。如本文所使用的，术语“多核苷酸”定义为核苷酸的链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员的一般知识是，核酸是多核苷酸，其可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所使用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何方法获得的所有核酸序列，所述方法包括但不限于重组方式(即使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列)和通过合成方式。
如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的肽或蛋白质。如本文所使用的，该术语同时指代短链(例如，在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体)和长链(在本领域中通常称为蛋白质，其中有许多类型)。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。
当描述多肽时，术语“保守取代”是指多肽的氨基酸组成的变化，其基本上不改变多肽的活性，即用具有相似性质的其他氨基酸取代氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。以下六组各自含有氨基酸，其通常被理解为代表彼此的保守取代：(1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；(2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；和(6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)(还参见Creighton,1984,Proteins,W.H.Freeman and Company)。除了上面定义的保守取代之外，氨基酸残基的其他修饰也可以产生“保守修饰的变体”。例如，可以将所有带电的氨基酸视为彼此的取代，无论它们是正还是负的。此外，保守修饰的变体也可以由单个取代、缺失或添加产生，在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸，例如通常小于5％。另外，可以由重组多肽，通过将天然或野生型基因所用的氨基酸的密码子替换为相同氨基酸的不同密码子来制备保守修饰的变体。
如本文所使用的，术语“RNA”定义为核糖核酸。
如本文所使用的，术语“重组DNA”定义为通过连接来自不同来源的DNA片段产生的DNA。
如本文所使用的，术语“重组多肽”定义为通过使用重组DNA方法产生的多肽。
“药学上可接受的”是指例如载体、稀释剂或赋形剂，其与配方的其他成分相容并且通常对其接受者的施用是安全的。如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何材料，当与缀合物组合时保留缀合物的活性并且与受试者的免疫系统无反应性。实例包括但不限于任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、和各种类型的润湿剂。其他载体还可包括无菌溶液，片剂(包括包衣片剂)和胶囊。通常此类载体含有赋形剂，例如淀粉、奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石粉、植物脂肪或油、树胶、乙二醇或其他已知的赋形剂。此类载体还可包括调味剂和颜色添加剂或其他成分。通过众所周知的常规方法配制包含此类载体的组合物。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且指具有补体系统的任何动物，优选哺乳动物，最优选人，包括需要对病症或其后遗症进行治疗或易患病症的人。因此，个体可包括例如狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠、猴子、小鼠和人类。
短语“百分比(％)同一性”是指在两个或更多个氨基酸序列的比较中发现的序列相似性的百分比。可以使用任何合适的软件以电子方式确定百分比同一性。同样地，通过比较一个多肽的氨基酸序列与第二多肽的氨基酸序列来确定两个多肽(或它们中任一个或两者的一个或多个部分)之间的“相似性”。用于这种比较的任何合适算法均可以适用于本发明的上下文。
“治疗性”治疗是对表现出病理体征的受试者施用的治疗，目的是减少或消除这些体征。
“治疗有效量”是指当向患者施用时改善疾病的症状的本发明化合物的量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将根据化合物、疾病状态及其严重程度、待治疗患者的年龄等而不同。治疗有效量可以由本领域普通技术人员根据他自己的知识和本公开内容常规确定。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指本文所描述的治疗或预防措施。“治疗”方法采用向需要这种治疗的受试者施用本发明的组合物，例如患有疾病或病症(包括癌症)的受试者，或最终可能患有这种疾病或病症(包括癌症)的受试者，从而预防、治愈、延缓、减轻病症或复发病症的严重程度，或改善病症或复发病症的一种或多种症状，或者延长受试者的生存期，使其超出在没有这些治疗时的预期。
本文使用的术语“变体”是核酸序列或肽序列，其序列分别与参考核酸序列或肽序列不同，但保留了参考分子的基本生物学特性。核酸变体的序列的变化可能不改变由参考核酸编码的肽的氨基酸序列，或者可能导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。肽变体序列的变化通常是有限的或保守的，因此参考肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域中是同一的。变体和参考肽的氨基酸序列可以由于任意组合的一个或多个取代、添加、缺失而不同。核酸或肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或者可以是不是已知天然存在的变体。核酸和肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术或通过直接合成来制备。
范围：在整个本公开中，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解的是，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被解释为对本发明范围的硬性限制。因此，应该认为范围的描述已经具体公开了该范围内所有可能的子范围以及该范围内的个体数值。例如，范围诸如1至6的描述应当被认为具体地公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的个体数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。
描述
本发明涉及用于治疗、抑制、预防或减少癌症的组合物和方法，其使用肾酶的抑制剂与抑制剂或PD1的组合。在一个实施方式中，肾酶的抑制剂是抗肾酶抗体或其结合片段，并且PD1的抑制剂是抗PD1抗体或其结合片段。在另一个实施方式中，肾酶的抑制剂是抗肾酶抗体或其结合片段，并且PD1的抑制剂是抗PD-L1抗体或其结合片段。
在各种实施方式中，本发明涉及用于在个体中治疗、抑制、预防或减少癌症的组合物和方法，其通过向有此需要的受试者组合施用肾酶的抑制剂(如抗体或其结合片段)与PD1的抑制剂(如抗体或其结合片段)。
在各种实施方式中，本发明提供用于降低肾酶的水平、生产或活性中的一个或多个以及PD1的水平、生产、活性或结合活性中的一个或多个的组合物和方法。在其他各种实施方式中，本发明提供用于降低肾酶的水平、生产或活性中的一个或多个以及PD-L1的水平、生产、活性或结合活性中的一个或多个的组合物和方法。
治疗抑制剂组合物和使用方法
在各种实施方式中，本发明了肾酶抑制剂组合物和方法与PD1抑制剂组合物和方法的组合，其用于治疗或预防其中需要降低肾酶水平或活性的疾病或病症。可以使用本发明的组合物和方法治疗或预防的疾病或病症(其中需要降低肾酶水平或活性，以及需要降低PD1水平或活性)的一个实例包括癌症。在各种实施方式中，本发明的肾酶抑制剂组合物以及治疗或预防方法降低肾酶多肽的量、肾酶肽片段的量、肾酶mRNA的量、肾酶酶活性的量、肾酶底物结合活性的量、肾酶受体结合活性的量、或它们的组合。在各种实施方式中，本发明的PD1抑制剂组合物以及治疗或预防方法降低PD1多肽的量、PD1 mRNA的量、PD1酶活性的量、PD1结合活性的量、PD1受体结合活性的量、或它们的组合。技术人员会理解，降低PD1活性的量的一种方式是通过干扰和/或防止PD-L1与PD1的结合，例如通过使PD1与抗PD1抗体或其结合片段结合，和/或通过使PD-L1与抗PD-L1抗体或其结合片段结合。
基于本文提供的公开内容，本领域技术人员会理解，肾酶水平的降低涵盖减少肾酶表达，包括转录、翻译或两者，并且还涵盖促进肾酶的降解，包括在RNA水平上(例如RNAi、shRNA等)和在蛋白质水平上(例如泛素化等)。一旦掌握了本发明的教导，本领域技术人员还会理解，肾酶水平的降低包括肾酶活性的降低(例如酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)。基于本文提供的公开内容，本领域技术人员还会理解，PD1水平的降低涵盖PD1表达的降低，包括转录、翻译或两者，并且还涵盖促进PD1的降解，包括在RNA水平上(例如RNAi、shRNA等)和在蛋白质水平上(例如泛素化等)。一旦掌握了本发明的教导，本领域技术人员还会理解，PD1水平的降低包括PD1活性的降低(例如酶活性、底物结合活性、受体结合活性、配体结合活性等)。因此，降低肾酶或PD1的水平或活性包括但不限于降低编码肾酶或PD1的核酸的转录、翻译或两者；并且其还包括降低肾酶或PD1多肽或其肽片段的任何活性。
可以使用多种方法评估抑制，多种方法包括本文公开的方法以及本领域已知的或将来开发的方法。也就是说，基于本文提供的公开内容，常规者会理解，使用评估生物样品中存在的编码肾酶或PD1的核酸水平(例如mRNA)、肾酶或PD1多肽或其肽片段的水平、肾酶活性水平(例如酶活性、底物结合活性、受体结合活性、配体结合活性等)或它们的组合的方法，可以容易地评估降低肾酶或PD1的水平或活性。
基于本文提供的公开，本领域技术人员能够理解，本发明可用于在有此需要的受试者中治疗或预防癌症，无论该受试者是否还正在接受其他药物治疗或疗法。另外，基于本文提供的教导，本领域技术人员还可以理解，可通过本文描述的组合物和方法治疗的疾病或病症涵盖其中肾酶和PD1起作用并且其中肾酶水平或活性降低以及PD1水平或活性降低可促进积极治疗效果的任何疾病或病症。在一个实施方式中，使用本发明的化合物和方法可治疗或可预防的疾病或病症是癌症。
降低肾酶水平或活性并且降低PD1的水平或活性的本发明的组合物和方法包括抗体及其结合片段。本发明的抗体包括多种形式的抗体，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(“胞内抗体”)、Fv、Fab和F(ab)2、单链抗体(scFv)、重链抗体(如骆驼抗体)、合成抗体、嵌合抗体和人源化抗体。在一个实施方式中，本发明的抗体是特异性结合肾酶的抗体。在另一个实施方式中，本发明的抗体是特异性结合PD1的抗体。
在一些实施方式中，为了治疗癌症而向受试者施用本发明的抗体用于引发和/或补充受试者免疫系统对抗癌症的免疫应答。受试者对抗癌症的免疫应答可以是任何宿主防御或应答，包括先天免疫应答，体液免疫应答，细胞介导的免疫应答、或它们的组合。
本领域技术人员会理解，抗肾酶抗体和抗PD1抗体和/或抗PD-L1抗体的组合可以急性施用(例如在短时间内，例如一天、一周或一个月)或长期施用(例如在很长一段时间内，例如数个月或一年或更长时间)。本领域技术人员还会理解，可以施用抗肾酶抗体和抗PD1抗体的组合，使得两种抗体被同时施用，或者使得每种抗体在时间意义上单独施用于受试者，因为每一种都可以在另一种之前和/或之后单独施用。本领域技术人员会理解，当单独施用两种抗体中的每一种时，其中一种在另一种之前施用，只要每种施用的抗体的活性仍在受试者中发生，所述两种抗体仍然是组合递送的。因此，组合的第一抗体可以在组合的第二抗体之前或之后，时间间隔从数秒到数分钟，到数小时，到数天，到数周。
在各种实施方式中，本文所描述的本发明的肾酶或肾酶片段的抑制剂可单独施用，或者可以与其他癌症相关性分子的其他抑制剂联合施用。
当掌握包括本文详述方法的本公开时，本领域技术人员会理解，本发明不限于已经建立的疾病或病症(例如癌症)的治疗。特别地，疾病或病症不一定表现为对受试者有害的程度；实际上，在施用治疗之前不需要在受试者中检测到疾病或病症。也就是说，在本发明可以提供益处之前不必发生重大疾病或病症。因此，本发明包括一种用于在受试者中预防疾病或病症的方法，因为如本文先前其他地方所讨论的抗肾酶抗体和抗PD1抗体或其结合片段的组合可以在疾病发作或病症之前向受试者施用，从而防止疾病或病症的发展。本文描述的预防方法还包括治疗处于缓解期的受试者，以用于预防疾病或病症复发。
在某些实施方式中，本发明的抗体(包括其结合片段)包括由任何适合的多核苷酸编码的本文公开的抗体氨基酸序列，或任何分离的或配制的抗体。另外，本公开的抗体包含具有本文所描述的抗肾酶或抗PD1抗体的结构和/或功能特征的抗体。
在一个实施方式中，本发明的抗体免疫特异性地结合至少一种特异于肾酶或PD1或PD-L1蛋白、肽、亚基、片段、部分或其任何组合的特定表位，并且不特异性地结合其他多肽。所述至少一种表位可包含至少一种抗体结合区，其包含靶蛋白(即肾酶、PD1、PD-L1)的至少一部分。如本文所使用的，术语“表位”是指能够结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特性。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。在一些实施方式中，本发明的抗肾酶抗体特异性地结合SEQ ID NO:1-7、8、50、92、94及其片段中的至少一种。
抗体的结合部分包含该抗体的一个或多个片段，其保留了特异性结合结构伴侣分子(例如肾酶)的能力。已经表明，抗体的结合功能可以通过全长抗体的片段执行。涵盖在抗体的术语“结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，一种包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature341:544-546)，其由VH域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接，使它们成为单一蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.(1988)Science 242:423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此种单链抗体也旨在包括在抗体的术语“结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。结合部分可以通过重组DNA技术产生，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。
在一些实施方式中，抗肾酶抗体特异性地结合肾酶-1。在其他实施方式中，抗肾酶抗体特异性地结合肾酶-2。在又另一个实施方式中，抗肾酶抗体特异性地结合肾酶-1和肾酶-2。此外，已经产生了表位特异性抗体。本发明的优选抗体包括单克隆抗体1C-22-1、1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7和3A-5-2。双特异性抗体(例如识别肾酶-1和肾酶-2的抗体)的实例包括抗体1C-22-1、1D-28-4、1D-37-10以及表1中描述的多克隆抗体。肾酶型特异性抗体的实例包括1F-26-1、1F42-7，其特异于肾酶-1。3A-5-2特异于肾酶-2。图5中阐述了编码抗肾酶单克隆抗体的序列。
单克隆抗体1D-28-4的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:52)和氨基酸序列(SEQID NO:9)如图5A所示。单克隆抗体1D-28-4的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:53)和氨基酸序列(SEQ ID NO:10)如图5B所示。
单克隆抗体1D-37-10的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:60)和氨基酸序列(SEQID NO:17)如图5C所示。单克隆抗体1D-37-10的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:61)和氨基酸序列(SEQ ID NO:18)如图5D所示。
单克隆抗体1F-26-1的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:68)和氨基酸序列(SEQID NO:25)如图5E所示。单克隆抗体1F-26-1的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:69)和氨基酸序列(SEQ ID NO:26)如图5F所示。
单克隆抗体1F-42-7的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:76)和氨基酸序列(SEQID NO:33)如图5G所示。单克隆抗体1F-42-7的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:77)和氨基酸序列(SEQ ID NO:34)如图5H所示。
单克隆抗体3A-5-2的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:84)和氨基酸序列(SEQ IDNO:41)如图5I所示。单克隆抗体3A-5-2的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:85)和氨基酸序列(SEQ ID NO:42)如图5J所示。
每个序列中带下划线的序列并入了每个重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列。
鉴于某些单克隆抗体可以与肾酶蛋白结合，所以VH和VL序列可以“混合并匹配”以产生本公开的其他抗肾酶结合分子。使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如免疫印迹，Bia-Core等)，可以测试这种“混合和匹配的”抗体的肾酶结合。优选地，当VH和VL链混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列被替换为结构相似的VH序列。同样优选地，来自特定VH/VL配对的VL序列被替换为结构相似的VL序列。
因此，在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其结合部分，包含：(a)重链可变区，其包含选自于由SEQ ID NO:9、17、25、33和41组成的组中的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含选自于由SEQ ID NO:10、18、26、34和42组成的组中的氨基酸序列，其中所述抗体特异性地结合肾酶蛋白。
优选的重链和轻链组合包括：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的轻链可变区；或(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的轻链可变区；或(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的轻链可变区；或(d)包含氨基酸序列SEQID NO:33的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的轻链可变区；或(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的轻链可变区。
在另一方面，本发明提供了包含1D-28-4、lD-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或它们的组合的抗体。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7和3A-5-2的VH CDR1的氨基酸序列分别并入了SEQ ID NO:11、19、27、35和43所示的序列。1D-28-4、1D37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VH CDR2的氨基酸序列分别并入了SEQ ID NO:12、20、28、36和44所示的序列。1D-28-4、1D-3710、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VH CDR3的氨基酸序列分别并入了SEQ ID NO:13、21、29、37和45所示的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VK CDR1的氨基酸序列分别并入了SEQ ID NO:14、22、30、38和46所示的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F26-1、1F42-7或3A-5-2的VK CDR2的氨基酸序列并入了SEQID NO:15、23、31、39和47所示的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VκCDR3的氨基酸序列分别并入了SEQ ID NO:16、24、32、40和48所示的序列。使用Kabat系统描绘CDR区(Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242).
鉴于这些抗体中的每一种都可以与肾酶家族成员结合，并且结合特异性主要由CDR1、CDR2和CDR3区提供，因此VH CDR1、CDR2和CDR3序列和VL CDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合并匹配”(即来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，但是每个抗体必须含有VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3)以产生本公开的其他抗肾酶结合分子。可以使用上文和实施例中描述的结合测定法来测试这种“混合并匹配的”抗体的肾酶结合(例如免疫印迹，分析等)。优选地，当VH CDR序列混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替换为结构相似的CDR序列。同样地，当VL CDR序列混合并匹配时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地被替换为结构相似的CDR序列。对于普通技术人员来说显而易见的是，对于单克隆抗体1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2，通过用来自本文公开的CDR序列的结构相似的序列取代一个或多个VH和/或VL CDR区序列，可以产生新的VH和VL序列。
因此，在另一方面，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其结合部分，包含选自由以下各项组成的组中的至少一种：(a)重链可变区CDR1，其包含选自于由SEQ ID NO:11、19、27、35和43组成的组中的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含选自于由SEQ ID NO:12、20、28、36和44组成的组中的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含选自于由SEQ IDNO:13、21、29、37和45组成的组中的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包含选自于由SEQID NO:14、22、30、38和46组成的组中的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含选自于由SEQ ID NO:15、23、31、39和47组成的组中的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含选自于由SEQ ID NO:16、24、32、40和48组成的组中的氨基酸序列；其中所述抗体特异性结合肾酶。
在另一个实施方式中，抗体包含选自以下各项中的至少一种CDR：(a)包含SEQ IDNO:11的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:12的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:13的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:14的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:15的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:16的轻链可变区CDR3。
在另一个实施方式中，抗体包含选自以下各项中的至少一种CDR：(a)包含SEQ IDNO:19的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:20的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:21的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:22的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:23的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:24的轻链可变区CDR3。
在另一个实施方式中，抗体包含选自以下各项中的至少一种CDR：(a)包含SEQ IDNO:27的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:28的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:29的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:30的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:31的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:32的轻链可变区CDR3。
在另一其他实施方式中，抗体包含选自以下各项中的至少一种CDR：(a)包含SEQID NO:35的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:36的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ IDNO:37的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:38的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:39的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:40的轻链可变区CDR3。
在另一个实施方式中，抗体包含选自以下各项中的至少一种CDR：(a)包含SEQ IDNO:43的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:44的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:45的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:46的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:47的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:48的轻链可变区CDR3。
在各种实施方式中，本发明抗体可以以1x 10-6M或更小、更优选1x10-7M或更小、更优选1x 10-8M或更小、更优选5x 10-9M或更小、更优选1x 10-9M或更小或甚至更优选3x 10- 10M或更小的KD结合它们的靶蛋白(即肾酶或PD1或PD-L1)。如本文所使用的，术语“基本上不结合”蛋白质或细胞意指不结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即以大于1x106M或更大、更优选1x 105M或更大、更优选1x 104M或更大、更优选1x 103M或更大、甚至更优选1x102M或更大的KD结合蛋白质或细胞。如本文所使用的，术语“KD”意指解离常数，其由Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得并表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域公认的方法测定肾酶结合分子(例如抗体等)的KD值。确定结合分子的KD(例如抗体等)的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统，如系统。
如本文所使用的，用于IgG抗体的术语“高亲和力”是指抗体对靶结合伴侣分子具有的KD为1x 10-7M或更小，更优选5x 10-8M或更小，甚至更优选1x10-8 M或更小，甚至更优选5x 10-9M或更小且甚至更优选1x10-9M或更小。然而，对于其他抗体同种型，“高亲和力”结合可以不同。例如，用于IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体具有的KD为10-6M或更小，更优选10-7M或更小，甚至更优选10-8M或更小。
在某些实施方式中，抗体包含重链恒定区，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可以包含轻链恒定区，卡帕轻链恒定区或拉姆达轻链恒定区。优选地，抗体包含卡帕轻链恒定区。或者，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。
生成抗肾酶抗体
本发明提供了与肾酶结合的组合物。本文公开的肾酶分子是一类分子，包括与本文公开的其他多肽具有高和/或显著序列同一性的那些分子。更具体地，推定的肾酶与具有序列SEQ ID NO:49或51的核酸共享至少约40％的序列同一性。更优选地，编码肾酶的核酸与本文公开的SEQ ID NO:49或51具有至少约45％的同一性，或至少约50％的同一性，或至少约55％的同一性，或至少约60％的同一性，或至少约65％的同一性，或至少约70％的同一性，或至少约75％的同一性，或至少约80％的同一性，或至少约85％的同一性，或至少约90％的同一性，或至少约95％的同一性，或至少约98％或至少约99％的序列同一性。甚至更优选地，核酸是SEQ ID NO:49或51或93或95。术语“肾酶”还包括肾酶同种型。肾酶基因在人类基因组的染色体10中含有9个外显子，跨越310188bp。本文公开的肾酶克隆(SEQ ID NO:49，GenBank登录号：BC005364)是含有外显子1、2、3、4、5、6、8的基因。如人类基因组数据库中所示，存在至少两种另外的可选剪接形式的肾酶蛋白。一种可变剪接形式含有外显子1、2、3、4、5、6、9，其由人类基因组数据库中的克隆识别为GenBank登录号AK002080和NMJ)18363，其序列通过引用明确地并入本文。另一种可变剪接形式含有外显子5、6、7、8，其由人类基因组数据库中的克隆识别为GenBank登录号BX648154，其序列通过引用明确地并入本文。除非另有说明，否则“肾酶”包括所有已知的肾酶(例如大鼠肾酶和人肾酶)以及将要发现的具有本文公开的肾酶的特性和/或物理特征的肾酶，包括但不限于人肾酶和黑猩猩肾酶。
此外，推定的肾酶与具有序列SEQ ID NO:8或50的多肽共享至少约60％的序列同一性。更优选地，肾酶与本文公开的SEQ ID NO:8或50具有至少约45％的同一性，或至少约50％的同一性，或至少约55％的同一性，或至少约60％的同一性，或至少约65％的同一性，或至少约70％的同一性，或至少约75％的同一性，或至少约80％的同一性，或至少约85％的同一性，或至少约90％的同一性，或至少约95％的同一性，或至少约98％或至少约99％的序列同一性。甚至更优选地，肾酶多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:8或50或92或94。
在一个实施方式中，本发明的抗体可以通过使用衍生自肾酶序列的肽来产生，从而使动物免疫，由此动物产生针对免疫原的抗体。示例性免疫原包括衍生自肾酶的肽。也就是说，具有肾酶序列片段的肽可用于本发明。肽可以多种方式产生，包括表达为重组肽、表达为较大的多肽和酶促或化学切割。或者，它们可以如本领域已知的那样合成生产。用于产生本发明亲和试剂的优选肽见表1(SEQ ID NO:1-7)。
本发明的抗肾酶抗体可可选地通过多种技术产生，包括Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495的标准体细胞杂交技术(杂交瘤方法)。在杂交瘤方法中，如本文所描述的免疫小鼠或其他合适的宿主动物，例如仓鼠或猕猴，从而引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，该抗体将特异性地结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(AcademicPress,1986)).
使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的并且是本领域熟知的。在一个实施方式中，本发明提供了产生单克隆抗体的方法以及通过该方法产生的抗体，包含：培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选地，通过从用本发明的多肽或肽免疫的小鼠或兔或其他物种分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤；以及，然后筛选杂交瘤克隆融合获得的、分泌能够结合本发明多肽的抗体的杂交瘤。简而言之，可以用肾酶多肽或其肽免疫小鼠。在优选的实施方式中，将肾酶多肽或其肽与佐剂一起施用以刺激免疫应答。这些佐剂包括完全或不完全Freund佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。这些佐剂可以通过将多肽螯合在局部沉积物中来保护多肽免于快速扩散，或者它们可以含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统其他组分具有趋化性的因子的物质。优选地，如果正在施用多肽，则免疫程序将包括分布在数周内两次或更多次多肽施用。
或者，可以用肾酶多肽或其肽免疫兔。在本实施方式中，可以将全长的肾酶蛋白或衍生自肾酶的肽用作免疫原。
本发明中使用的肾酶可以采用多种形式。例如，它们可包括纯化的肾酶蛋白或其片段、重组产生的肾酶或其片段。在一些实施方式中，肾酶是人肾酶。当使用重组肾酶时，它可以在本领域已知的真核或原核细胞中产生。另外的免疫原包括衍生自肾酶的肽。也就是说，具有肾酶序列片段的肽可用于本发明。肽可以多种方式产生，包括表达为重组肽、表达为较大的多肽和酶促或化学切割。或者，它们可以如本领域已知的那样合成生产。用于产生本发明亲和试剂的肽见表1(SEQ ID NO:l-7)。SEQ ID NO:8中描绘了人类肾酶的全长氨基酸序列，其中已知多态性是可能的，如所示(相比于SEQ ID NO.92)。肾酶-2的氨基酸序列见SEQ ID NO:50，再次如所指示的那样，已知的多态性是可能的(相比于SEQ ID NO.94)。应理解存在其他多态性。这些也包括在肾酶的定义中。在一些实施方式中，本发明的肾酶结合分子特异性地结合SEQ ID NO:1-7、8、50、92、94及其片段中的至少一个。
如本文所描述的和/或如本领域已知的，抗肾酶抗体也可以可选地通过免疫能够产生一系列人抗体的转基因动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类动物等)而产生。可以从这些动物中分离产生人类抗肾酶抗体的细胞，并使用合适的方法永生化，例如本文所描述的方法。或者，通过本文教导的方法和本领域已知的方法，可以克隆抗体编码序列，将其引入合适的载体中，并用于转染宿主细胞以表达和分离抗体。
使用在其种系配置中携带人类免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因小鼠，提供了针对多种靶的高亲和力全人类单克隆抗体的分离，靶包括正常人类免疫系统耐受的人类自身抗原(Lonberg,N.et al.,美国专利No.5,569,825,美国专利No.6,300,129以及1994,Nature368:856-9；Green,L.et al.,1994,Nature Genet.7:13-21；Green,L.&Jakobovits,1998,Exp.Med.188:483-95；Lonberg,N.and Huszar,D.,1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93；Kucherlapati,et al.美国专利No.6,713,610；Bruggemann,M.et al.,1991,Eur.J.Immunol.21:1323-1326；Fishwild,D.et al.,1996,Nat.Biotechnol.14:845-851；Mendez,M.et al.,1997,Nat.Genet.15:146-156；Green,L.,1999,J.Immunol.Methods231:11-23；Yang,X.et al.,1999,Cancer Res.59:1236-1243；Bruggemann,M.and Taussig,MJ.,Curr.Opin.Biotechnol.8:455-458,1997；Tomizuka et al.WO02043478)。这些小鼠中的内源性免疫球蛋白基因座可被破坏或删除，以消除动物产生内源基因编码的抗体的能力。此外，诸如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(San Jose,Calif.)等公司可以从事使用如本文其他地方描述的技术来提供针对所选靶结合伴侣分子(例如抗原等)的人类抗体。
在另一个实施方式中，人类抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体包含人类免疫球蛋白基因，并且该文库将人类抗体结合结构域表达为例如单链抗体(scFv)、Fab或表现出成对或未成对的抗体可变区的一些其他构建体(Vaughan et lo al.Nature Biotechnology14:309-314(1996)；Sheets et al.PITAS(USA)95:6157-6162(1998))；Hoogenboom andWinter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.J.Mol.Biol.,222:581(1991))。本发明的人类单克隆抗体也可以使用用于筛选人类免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备。在本领域中已建立用于分离人类抗体的此种噬菌体展示方法。参见例如：Ladner etal.的美国专利No.5,223,409、No.5,403,484和No.5,571,698；Dower et al.的美国专利No.5,427,908和No.5,580,717；McCafferty et al.的美国专利No.5,969,108和No.6,172,197；以及Griffiths et al.的美国专利No.5,885,793、No.6,521,404、No.6,544,731、No.6,555,313、No.6,582,915和No.6,593,081。
可以使用任何合适的技术例如重组蛋白质生产来进行免疫原性抗原的制备和单克隆抗体的产生。免疫原性抗原可以以纯化蛋白质的形式或以包括全细胞或者细胞或组织提取物的蛋白质混合物的形式施用于动物，或者抗原可以在动物体内从编码所述抗原或其部分的核酸从头(de novo)形成。
如本领域所熟知的，本发明的分离的核酸可以使用(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术、或它们的组合来制备。编码单克隆抗体的DNA易于使用本领域已知的方法分离和测序(例如通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。在产生杂交瘤的情况下，这种细胞可以作为这种DNA的来源。或者，使用其中编码序列和翻译产物相关联的展示技术，例如噬菌体或核糖体展示文库，可以简化结合剂和核酸的选择。在噬菌体选择后，可以分离噬菌体的抗体编码区并用于产生完整抗体，包括人类抗体或任何其他所需的结合片段，并且在任何所需的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中进行表达。
人源化抗体
本发明还提供结合人类肾酶或PD1或PD-L1的人源化免疫球蛋白(或抗体)。人源化形式的免疫球蛋白具有基本上来自人类免疫球蛋白的可变框架区(称为受体免疫球蛋白)和基本上来自特异性结合肾酶的非人类mAb的CDR。恒定区(如果存在的话)也基本上来自人类免疫球蛋白。人源化抗体展示出对肾酶的KD为至少约10-6M(1μM)、约10-7M(100nM)或更小。人源化抗体的结合亲和力可以大于或小于衍生它们的小鼠抗体的结合亲和力。为了影响人源化抗体对肾酶的亲和力的改变，提高亲和力，可以在CDR残基或人类残基中进行取代。
与肾酶结合的人源化抗体的生产来源优选为1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2小鼠抗体，在本文提供的实施例中描述其产生、分离和表征，但是也可以使用与1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2小鼠抗体竞争结合肾酶的其他小鼠抗体。序列表中列出的识别的CDR可以是人源化过程的起始点。例如，以下氨基酸序列(及其相应的核酸序列)中的任何一个或多个均可以作为人源化过程的起点：(a)重链可变区CDR1，其包含选自于由SEQ ID NO:11、19、27、35和43组成的组中的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含选自于由SEQ ID NO:12、20、28、36和44组成的组中的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含选自于由SEQ ID NO:13、21、29、37和45组成的组中的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包含选自于由SEQ ID NO:14、22、30、38和46组成的组中的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含选自于由SEQ ID NO:15、23、31、39和47组成的组中的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含选自于由SEQ ID NO:16、24、32、40和48组成的组中的氨基酸序列。
如果人类可变结构域框架采用与CDR起源的小鼠可变框架相同或相似的构象，则将小鼠CDR取代入人类可变结构域框架最有可能导致保持其正确的空间取向。这是通过从如下的人类抗体获得人类可变结构域来实现的，即所述人类抗体的框架序列与衍生CDR的鼠可变框架结构域表现出高度的序列同一性。重链和轻链可变框架区可以衍生自相同或不同的人类抗体序列。人类抗体序列可以是天然存在的人类抗体的序列，可以源自人类种系免疫球蛋白序列，或者可以是数种人类抗体和/或种系序列的共有序列。
通过计算机比较小鼠可变区的氨基酸序列与已知人类抗体的序列来识别合适的人类抗体序列。所述比较分别针对重链和轻链进行，但各自的原理相似。
在一个实例中，将抗肾酶mAb的氨基酸序列用于查询从公共抗体序列数据库编译的人类抗体数据库。可以将重链可变区用于找到具有最高序列同一性的人类可变区。类似地，轻链的可变区可用于找到具有最高序列同一性的人类可变区。为每个鼠可变区制备了一种DNA构建体，其中编码来自鼠mAb供体的重链可变区之一的CDR的区域被转移到选定的人类重链可变序列中，替换人类可变区的CDR。
鼠CDR区与人类可变框架区的非天然并置可产生非天然的构象限制，除非通过替换某些氨基酸残基进行校正，否则会导致结合亲和力丧失。如上所述，本发明的人源化抗体包含基本上来自人类免疫球蛋白的可变框架区和基本上来自小鼠免疫球蛋白的CDR。识别了小鼠抗体的CDR和适当人类受体免疫球蛋白序列后，下一步是确定这些组分中的那些残基(如果有的话)应当被替换以优化所得到的人源化抗体的性质。一般而言，应尽量减少用鼠来代替人类氨基酸残基，因为鼠残基的引入会增加抗体在人类中引发HAMA应答的风险。基于对CDR构象和/或与靶结合伴侣分子结合的可能影响，选择氨基酸进行取代。可以通过建模、检查特定位置氨基酸的特征或对特定氨基酸的取代或诱变效果的经验观察来研究这种可能的影响。关于经验方法，已经发现可特别方便来创建变体序列文库，可以用于筛选所需活性、结合亲和力或特异性。用于创建这种变体文库的一种形式是噬菌体展示载体。或者，可以使用其他方法产生变体，用于改变编码可变结构域内的靶残基的核酸序列。
可以使用计算机建模来完成确定是否需要进一步取代的另一种方法，以及用于取代的氨基酸残基的选择。用于产生免疫球蛋白分子的三维图像的计算机硬件和软件是广泛可用的。通常，从免疫球蛋白链或其结构域的解析结构开始产生分子模型。将待建模的链与解析的三维结构的链或结构域进行比较来获得氨基酸序列相似性，并且将显示最大序列相似性的链或结构域选择作为构建分子模型的起点。修饰解析的起始结构以允许被建模的免疫球蛋白链或结构域中的实际氨基酸与起始结构中的那些之间存在差异。然后将修饰的结构组装成复合免疫球蛋白。最后，通过能量最小化并且通过验证所有原子彼此处于适当距离且键长和角度在化学上可接受的限度内来修正模型。
通常人源化抗体中的CDR区基本上相同，并且更通常地，与衍生它们的小鼠抗体中的相应CDR区相同。尽管通常不是所希望的，但有时可以对CDR残基进行一个或多个保守氨基酸取代而不明显影响所得人源化免疫球蛋白的结合亲和力。偶尔，CDR区的取代可以增强结合亲和力。
除了上面讨论的特定氨基酸取代之外，人源化免疫球蛋白的框架区通常基本上相同，并且更通常地，与衍生它们的人类抗体的框架区相同。当然，框架区中的许多氨基酸对抗体的特异性或亲和力几乎没有或没有直接贡献。因此，可以容忍框架残基的许多个体保守取代，而不会明显改变所得人源化免疫球蛋白的特异性或亲和力。
由于代码的简并性，各种核酸序列将编码每种免疫球蛋白氨基酸序列。所需的核酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过早期制备的所需多核苷酸的变体的PCR诱变来产生。编码本申请中描述的抗体的所有核酸明确地包括在本发明中。
如上所述产生的人源化抗体的可变区段通常与人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分连接。抗体将含有轻链和重链恒定区。重链恒定区通常包括CH1、铰链、CH2、CH3和(有时)CH4结构域。
人源化抗体可包含来自任何类别抗体的任何类型的恒定结构域(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和和任何亚类(同种型)(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。当需要人源化抗体表现出细胞毒活性时，恒定结构域通常是补体-固定恒定结构域，并且类别通常是IgG1。当不希望这种细胞毒活性时，恒定结构域可以是IgG2类。人源化抗体可包含来自多于一个类别或同种型的序列。
将编码可选地连接到恒定区的人源化轻链和重链可变区的核酸插入表达载体中。可以将轻链和重链克隆到相同或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的DNA区段与表达载体中的控制序列可操作地连接，确保免疫球蛋白多肽的表达。此类控制序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列(参见Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029(1989)；WO 90/07861；Co et al.,J.Immunol.148,1149(1992)，出于所有目的，这些文献的全部内容通过引用并入本文)。
治疗和预防的方法
一般而言，本发明的治疗和预防方法包括向有需要的受试者施用治疗或预防有效量的抗肾酶抗体或其结合片段与抗PD1抗体(和/或抗PD-L1抗体)或其结合片段的组合。在向受试者提供抗肾酶和抗PD1抗体(和/或抗PD-Ll抗体)时，施用剂的剂量将根据患者的年龄、体重、身高、性别、一般病情、既往病史等因素而变化。
一般来说，如果施用全身剂量，期望的是为接受者提供处于如下范围内的剂量：约1ng/kg-100ng/kg，100ng/kg-500ng/kg，500ng/kg-1μg/kg，1μg/kg-100μg/kg，100μg/kg-500μg/kg，500μg/kg-1mg/kg，1mg/kg-50mg/kg，50mg/kg-100mg/kg，100mg/kg-500mg/kg(接受者体重)，但是可以施用更低或更高的剂量。低至约1.0mg/kg的剂量可预期显示出一些功效。优选地，约5mg/kg是可接受的剂量，但是高达约50mg/kg的剂量水平也是优选的，特别是对于治疗用途。或者，可给予不基于患者体重的特定量的施用，例如1μg-100μg，1mg-100mg或1gm-100gm的量。例如，可以位点特异性施用到体腔或腔，诸如关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、子宫内、鞘内、脑室内、颅内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、肾盂内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、宫内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内、眼科或透皮方式。
抗体或其结合片段可以制备用于肠外施用(皮下、肌肉内或静脉内)或任何其他施用，特别是液体溶液或悬浮液的形式；用于阴道或直肠施用，特别是半固体形式，例如但不限于乳膏和栓剂；用于口腔或舌下施用，例如但不限于片剂或胶囊剂形式；或鼻内，例如但不限于粉末、滴鼻剂或气溶胶或某些药剂的形式；或眼科，例如但不限于滴眼液；或用于治疗牙病；或透皮，例如不限于凝胶、软膏、乳液、悬浮液或贴剂递送系统，其使用化学增强剂(如二甲基亚砜)以改变皮肤结构或增加透皮贴剂中的药物浓度，或使用使得能够将含有蛋白质和多肽的配方应用于皮肤上的氧化剂(WO 98/53847)，或者应用电场来创建瞬时传输途径，如电穿孔，或者增加带电药物通过皮肤的移动性，例如离子电渗疗法，或应用超声波如超声波导入术(美国专利No.4,309,989和No.4,767,402)。
可以根据已知方法配制本发明的抗体或其结合片段以制备药学上有用的组合物，其中将这些物质或其功能衍生物与药学上可接受的载体混合。例如，Remington’sPharmaceutical Sciences(16th ed.,Osol,A.ed.,Mack Easton Pa.(1980))描述了适合的载体及其配方(包括其他人类蛋白质，例如人血清白蛋白)。为了形成适于有效施用的药学上可接受的组合物，这种组合物将含有有效量的上述化合物和适量的载体。可以采用其他制药方法来控制作用的持续时间。可以通过使用聚合物来复合或吸收化合物来实现控制释放制剂。通过控制释放制剂来控制作用持续时间的另一种可能方法是将本发明化合物掺入聚合物材料的颗粒中，诸如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物。或者，代替将这些试剂掺入聚合物颗粒中，可以将这些材料包埋在微胶囊中，所述微胶囊通过例如分别界面聚合例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)-微胶囊来制备，或者包埋在胶体药物递送系统中，例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊或在粗乳液中。
可以以单剂量方案给予治疗，或优选地以多剂量方案给予治疗，其中主要疗程可以具有1-100个单独剂量，然后是在为维持和/或加强应答所需的后续时间间隔内给予其他剂量，例如在1-4个月时进行第二次施用，并且如果需要，数个月后给予后续剂量。合适的治疗方案的实例包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或足以引起预期减少疾病症状或降低疾病严重程度的所需应答的其他方案。
本发明还提供了可用于实施本发明的试剂盒。本发明的试剂盒包含第一容器，其含有上述抗体或与上述抗体一起包装。所述试剂盒还可以包含另外的容器，所述容器含有实施本发明必要或便利的溶液或与实施本发明必要或便利的溶液一起包装。容器可以由玻璃、塑料或箔制成，并且可以是小瓶、瓶子、小袋、管子、袋子等。该试剂盒还可以包含书面信息，例如实施本发明的程序或分析信息，例如第一容器装置中包含的试剂量。所述容器可以与所述书面信息一起处于另一容器装置中，例如盒子或袋子。
本发明的又另一方面是一种用于检测生物样品中的肾酶的试剂盒。该试剂盒包括容纳有一个或多个肾酶结合分子的容器和说明书，肾酶结合分子结合肾酶的表位，所述说明书用于说明使用肾酶结合分子以结合肾酶形成复合物以及检测该复合物的形成，使得复合物的存在或不存在与样品中肾酶的存在或不存在相关。容器的实例包括多孔板，其允许同时检测多个样品中的肾酶。
本发明的抗体或其结合片段的组合可以与另一种治疗性治疗或药剂组合使用以治疗癌症。例如，本发明的抗体或其结合片段的组合可以单独施用，或者与一种或多种治疗有效的药剂或治疗组合施用。所述其他治疗有效的药剂可以与本发明的抗体或其结合片段缀合、与本发明的抗体或其结合片段并入到同一组合物中、或者可以作为单独的组合物施用。可以在施药本发明的抗体或其结合片段的组合或相关化合物之前、期间和/或之后，施用所述其他治疗剂或治疗。
在某些实施方式中，本发明的抗体或其结合片段的组合与与一种或多种其他治疗剂或治疗共同施用。在其他实施方式中，本发明的抗体或其结合片段的组合的施用独立于一种或多种其他治疗剂或治疗的施用。例如，首先施用本发明的抗体或其结合片段的组合，随后施用一种或多种其他治疗剂或治疗。或者，首先施用一种或多种其他治疗剂，随后施用本发明的抗体或其结合片段的组合。作为另一实例，首先进行治疗(例如手术，放射等)，然后施用本发明的抗体或其结合片段的组合。
其他治疗有效的药剂/治疗包括手术、抗肿瘤药(包括化学治疗剂和放射线)、抗血管生成剂、针对其他靶的抗体、小分子、光动力疗法、免疫疗法、免疫增强疗法、细胞毒性剂、细胞因子、趋化因子、生长抑制剂、抗荷尔蒙剂、激酶抑制剂、心脏保护剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂和促进血液细胞增殖的药剂。
在一个实施方式中，如本文所使用的，“另一种治疗剂”是第二不同的治疗剂或抗癌剂，即“除”本发明的肾酶结合分子之外的治疗剂或抗癌剂。任何第二治疗剂均可用于本发明的组合疗法中。此外，根据以下指导，可以选择二治疗剂或“第二抗癌剂”以实现添加、大于添加和潜在的协同效应。
为了实施组合抗肿瘤治疗，可以有效于在动物或患者体内产生组合抗肿瘤作用的方式，向动物或患者施用本发明的抗体或其结合片段的组合以及另一种(即第二)不同的抗癌剂。因此，所述药剂可以以有效量和有效时间提供，以产生它们在肿瘤或肿瘤脉管系统中的组合或同时存在以及它们在肿瘤环境中的联合作用。为了实现该目标，本发明的抗体或其结合片段的组合以及第二不同的抗癌剂可以以单一组合物或者使用不同的施用途径作为两种不同的组合物基本上同时向动物施用。
或者，本发明的抗体或其结合片段的组合可以以从数秒到数分钟、到数小时、到数天、到数周的间隔在第二不同抗癌剂之前或之后施用。
基于某些标准，包括本文其他地方讨论的标准，可以选择用于单独定时组合疗法的第二治疗剂。然而，优选选择一种或多种第二不同的抗癌剂用于先前或后续施用并不排除它们在需要时基本上同时施用。选择第二不同的抗癌剂用于在本发明的主要治疗剂“之前”施用，并且旨在实现增加的和潜在的协同效应。
选择第二不同的抗癌剂用于在本发明的主要治疗剂“之后”施用并且旨在实现增加和潜在的协同效应，其包括受益于主要治疗剂效果的药剂。因此，用于后续施用的有效第二不同的抗癌剂包括抑制转移的抗血管生成剂；靶向坏死肿瘤细胞的药剂，如对细胞内结合伴侣分子特异的抗体，所述细胞内结合伴侣分子可从体内恶性细胞访问(美国专利No.5,019,368、No.4,861,581和No.5,882,626，每个通过引用明确地并入本文)；化学治疗剂；抗肿瘤细胞免疫缀合物，可攻击任何肿瘤细胞。
本发明的抗体或其结合片段的组合也可以与癌症免疫疗法组合施用。癌症免疫疗法可以设计用于引发针对受试者癌细胞的体液免疫应答，或引发针对受试者癌细胞的细胞介导的免疫应答，或者引发针对受试者癌细胞的体液应答和细胞介导的应答的组合。可与本发明的肾酶结合分子组合使用的癌症免疫疗法的非限制性实例包括癌症疫苗、DNA癌症疫苗、过继性细胞疗法、过继性免疫疗法、CAR T细胞疗法、抗体、免疫增强化合物、细胞因子、白细胞介素(例如IL-2等)、干扰素(IFN-α等)和检查点抑制剂(例如PD-1抑制剂、PDL-1抑制剂、CTLA-4抑制剂等)。
在一些情况下，可以需要显著的延长治疗时间，其中各施用之间时隔数天(2、3、4、5、6或7)、数周(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至数月(1、2、3、4、5、6、7或8)。这在以下情况下是有利的，即其中一种治疗旨在基本上破坏肿瘤，例如本发明的主要治疗剂，并且另一种治疗旨在预防微转移或肿瘤再生长，例如施用抗血管生成剂。然而，抗血管生成剂应该在手术后的仔细时间施用，以允许有效的伤口愈合。然后可以在患者的一生中施用抗血管生成剂。
还设想的是，本发明的抗体或其结合片段的组合或第二不同的抗癌剂可以施用不止一次。本发明的抗体或其结合片段的组合以及第二不同的抗癌剂可以在隔数天或隔数周的基础上交替换施用；或者给予一系统一种药剂治疗，随后给予一系列另一治疗。在任何情况下，为了使用联合治疗实现肿瘤消退，所需要的只是以有效发挥抗肿瘤作用的组合量递送两种药剂，而不管施用时间如何。
化学治疗药物可以与本发明的抗体或其结合片段的组合来组合使用。化学治疗药物可以杀死增殖的肿瘤细胞，增强整体治疗产生的坏死区域。
本发明的一个方面提供了一种使用本发明的抗体或其结合片段的组合治疗或预防癌症的方法。本领域技术人员可以理解的是，作为非限制性实例，在患者中治疗或预防癌症包括杀死和破坏癌细胞以及减少癌细胞的增殖或细胞分裂速率。本领域技术人员还可以理解的是，作为非限制性实例，癌细胞可以是原发性癌细胞、癌症干细胞、转移性癌细胞。以下是可以通过所公开的方法和组合物治疗的癌症的非限制性实例：急性淋巴细胞癌症；急性髓系白血病；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，童年期；阑尾癌；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤，童年期；脑肿瘤，成人期；脑肿瘤，脑干胶质瘤，童年期；脑肿瘤，中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤，童年期；中枢神经系统胚胎性肿瘤；小脑星形细胞瘤；脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；颅咽管瘤；室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；中间分化的松果体实质瘤；幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体细胞瘤；视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；脑和脊髓肿瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；类癌瘤，胃肠道的；中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，童年期；宫颈癌；脊索瘤，童年期；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；食道癌；尤因肿瘤家族；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑色素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质瘤(gist)；生殖细胞肿瘤，颅外；生殖细胞肿瘤，性腺外；生殖细胞肿瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；神经胶质瘤,童年脑干；神经胶质瘤,童年脑星形细胞瘤；神经胶质瘤,童年视觉通路和下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌；组织细胞增生症，朗格汉斯细胞；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视觉通路神经胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；肾(肾细胞)癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；白血病，急性淋巴细胞癌症；白血病，急性髓细胞性的；白血病，慢性淋巴细胞的；白血病，慢性骨髓性的；白血病，毛细胞；唇和口腔癌；肝癌；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴瘤，艾滋病相关；淋巴瘤，伯基特；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，霍奇金；淋巴瘤，非霍奇金；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦尔登斯特伦；骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；髓母细胞瘤；黑色素瘤；黑色素瘤，眼内(眼)；梅克尔细胞癌；间皮瘤；伴隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征，(童年期)；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；霉菌病；蕈样肉芽肿；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；髓性白血病，慢性；髓性白血病，成人急性；髓性白血病，童年急性；骨髓瘤，多发；骨髓增生性疾病，慢性；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤和骨的恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；胰腺癌,胰岛细胞瘤；乳头状瘤病；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；副神经节瘤；中间分化的松果体实质瘤；松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾盂和输尿管，移行细胞癌；涉及15号染色体上坚果基因的呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；肉瘤，尤因肿瘤家族；肉瘤，卡波西；肉瘤，软组织；肉瘤，子宫的；塞泽里综合征；皮肤癌(非黑色素瘤)；皮肤癌(黑色素瘤)；皮肤癌，梅克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌，鳞状颈癌，隐匿性原发性的，转移性的；胃(胃)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤，妊娠期；尿道癌；子宫癌，子宫内膜癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；和威尔姆斯肿瘤。
在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，包含：在施用本发明的抗体或其结合片段的组合之前、同时或之后，使用用于癌症的补充疗法治疗受试者，诸如手术、化学疗法、化学治疗剂、放射疗法或激素疗法或它们的组合。
化学治疗剂包括细胞毒剂(例如5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、oxorubicin、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、阿糖胞苷USP、环磷酰胺、雌二醇磷酸钠、六甲蜜胺、羟基脲、异环磷酰胺、甲基苄肼、丝裂霉素、白消安、环磷酰胺、米托蒽醌、卡铂、顺铂、干扰素α-2a重组、紫杉醇、替尼泊苷和链脲佐菌素)，细胞毒性烷化剂(例如白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑或乙基磺酸)，烷化剂(例如亮氨酸溶肉瘤素(asaley)、AZQ、BCNU、白消安、bisulphan、羧基邻苯二甲酸铂、CBDCA、CCNU、CHIP、苯丁酸氮芥、氯膦酸、顺铂、克罗米松(clomesone)、氰基吗啉代多柔比星、甲基二磺酸乙二醇脂(cyclodisone)、环磷酰胺、二脱水半乳糖醇、氟多潘、hepsulfam、海蒽酮、异环磷酰胺、米尔法兰、甲基CCNU、丝裂霉素C、mitozolamide、氮芥、PCNU、哌嗪、哌嗪二酮、哌泊溴烷、甲基丝裂霉素、螺乙内酰芥、链脲佐菌素、替罗昔隆、四铂、塞替派、三亚乙基蜜胺、尿嘧啶氮芥和Yoshi-864)，抗有丝分裂剂(例如同分异构秋水仙碱、软海绵素M、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、多拉司他汀10、美登素、根霉素、紫杉醇衍生物、紫杉醇、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、硫酸长春碱和硫酸长春新碱)，植物生物碱(例如放线菌素D、博来霉素、L-天冬酰胺酶、伊达比星、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、光辉霉素(mitramycin)、丝裂霉素、柔红霉素、VP-16-213、VM-26、诺维本和泰索帝)，生物制品(例如α干扰素、BCG、G-CSF、GM-CSF和白细胞介素-2)，拓扑异构酶I抑制剂(例如喜树碱、喜树碱衍生物和吗啉代多柔比星)，拓扑异构酶II抑制剂(例如米托蒽醌、氨萘非特、m-AMSA、蒽吡唑衍生物、吡唑并吖啶、双蒽HCL、柔红霉素、脱氧多柔比星、美诺立尔、N,N-二苄基道诺霉素、oxanthrazole、柔红霉素苯腙(rubidazone)、VM-26和VP-16)，和合成物(例如羟基脲、丙卡巴肼、o,p’-DDD、达卡巴嗪、CCNU、BCNU、顺二胺二氯铂、米托蒽醌、CBDCA、左旋咪唑、六甲基三聚氰胺、全反式维甲酸、格立得(gliadel)和卟菲尔钠)。
抗增殖剂是降低细胞增殖的化合物。抗增殖剂包括烷化剂、抗代谢物、酶、生物应答调节剂、杂项药剂(miscellaneous agent)、激素和拮抗剂、雄激素抑制剂(例如氟他胺和醋酸亮丙瑞林)、抗雌激素剂(例如他莫昔芬柠檬酸盐及其类似物，托瑞米芬，屈洛昔芬和雷洛昔芬)。特定抗增殖剂的其他实例包括但不限于左旋咪唑、硝酸镓、格拉司琼、沙格司亭锶-89氯化物、非格司亭、毛果芸香碱、右雷佐生和恩丹西酮。
本发明的肾酶结合分子可以单独施用或与其他抗肿瘤剂联合施用，所述其他抗肿瘤剂包括细胞毒性剂/抗肿瘤剂和抗血管生成剂。细胞毒性/抗肿瘤剂被定义为攻击和杀死癌细胞的药剂。一些细胞毒性/抗肿瘤剂是烷化剂，其使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化，例如顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、belustine、尿嘧啶氮芥、chlomaphazin和达卡巴嗪。其他细胞毒性/抗肿瘤剂是用于肿瘤细胞的抗代谢物，例如胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和甲基苄肼。其他细胞毒性/抗肿瘤剂是抗生素，例如多柔比星、博莱霉素、放线菌素D、柔红霉素、光辉霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。对于这些化合物，市面上存在许多脂质体配方。还有其他的细胞毒性/抗肿瘤剂是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱、长春碱和依托泊苷。杂的细胞毒性/抗肿瘤剂包括紫杉醇及其衍生物、L-门冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、阿扎胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。
抗血管生成剂是本领域技术人员熟知的。适用于本公开的方法和组合物的抗血管生成剂包括抗VEGF抗体(包括人源化抗体和嵌合抗体)、抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其他已知的血管生成抑制剂包括血管抑素、内皮抑素、干扰素、白细胞介素1(包括α和β)、白细胞介素12、维甲酸、和金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂(TIMP-1和-2)。也可以使用小分子，包括拓扑异构酶，如雷佐生，其为一种具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。
可与所公开的化合物组合使用的其他抗癌剂包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿托唑；山油柑碱；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿米替林；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；门冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新；硫酸博莱霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡鲁睾酮；卡拉酰胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗里霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克里斯蒂娜醇；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；柔红霉素盐酸盐；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；地扎胍宁甲磺酸盐；地吖醌；多西他赛；多柔比星；多柔比星盐酸盐；屈洛昔芬；屈洛昔芬柠檬酸盐；屈他雄酮丙酸盐；达佐霉素；依达曲沙；依氟鸟氨酸盐酸盐；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；表柔比星盐酸盐；厄布洛唑；依索比星盐酸盐；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；依托泊苷磷酸盐；艾托卜宁；法倔唑盐酸盐；法扎拉滨；维甲酰酚胺；氟尿苷；氟达拉滨磷酸盐；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；磷霉素钠；吉西他滨；吉西他滨盐酸盐；羟基脲；伊达比星盐酸盐；异环磷酰胺；伊莫福新；白细胞介素II(包括重组白细胞介素II、或rIL2)，干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-nl；干扰素α-n3；干扰素β-I a；干扰素γ-I b；异丙铂；伊立替康盐酸盐；兰瑞肽醋酸盐；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；利阿罗唑盐酸盐；洛美沙星钠；洛莫司汀；洛索蒽醌盐酸盐；马索罗酚；美登素；氮芥盐酸盐；醋酸甲地孕酮；醋酸美伦孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；氨甲喋呤；氨甲喋呤我，人；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托洁林；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；米托蒽醌盐酸盐；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；白蛋白结合型紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；奈莫司汀；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；必散特隆盐酸盐；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；紫菜霉素；泼尼莫司汀；甲基苄肼盐酸盐；嘌呤霉素；嘌呤霉素盐酸盐；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；洛太米特；沙芬戈；沙芬戈盐酸盐；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；螺旋锗盐酸盐；螺莫司汀；螺铂；链黑霉素；链脲霉素；磺氯苯脲；滑石霉素；替可加兰钠；替加氟；替洛蒽醌盐酸盐；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾酮内酯；噻咪啉；硫鸟嘌呤；噻替派；噻唑羧胺核苷；地拉帕扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；曲西瑞宾磷酸盐；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；妥布氯唑盐酸盐；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸维哌啶；硫酸长春甘酯；硫酸环氧长春碱；长春瑞滨；酒石酸长春瑞滨；硫酸异长春碱；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；佐柔比星盐酸盐。其他抗癌药物包括但不限于：20-表-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；2,4二氯苯氧乙酸(amidox)；氨磷汀；氨基酮戊酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；雄茸交酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背转形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸蚜虫素；凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；脱嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；阿舒拉林；阿他美坦；阿莫司汀；阿昔那他汀1；阿昔那他汀2；阿昔那他汀3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚；苯甲酰葡萄孢素；β-内酰胺衍生物；β-alethine；β-克拉霉素B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙啶基精胺；双萘法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；丁硫氨酸硫酸亚胺；钙泊三醇；钙磷酸蛋白C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧酰氨基三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗籽豆素；天蚕素B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺卟啉；克拉屈滨；克罗米芬类似物；克霉唑；柯利霉素A；柯利霉素B；考布他汀A4；考布他汀类似物；conagenin；克拉姆西丁816；克立那托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；curacin A；环戊蒽醌；cycloplatam；赛培霉素；阿糖胞苷烷磷酯；细胞溶解因子；磷酸己烷雌酚；达昔单抗；地西他滨；脱氢吡啶胺B；洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素；didox；二乙基去精胺；二氢-5-阿扎胞苷；二氢紫杉醇，9-；二氧霉素；二苯基螺莫司汀；多西他赛；二十二烷醇；多拉司琼；脱氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；杜卡霉素SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；依托泊苷磷酸盐；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；氟道诺红菌素盐酸盐；福酚美克；福美斯坦；福司曲星；福莫司汀；钆特沙弗林；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；庚磺胺；调蛋白；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘多柔比星；伊波梅诺，4-；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；片螺素-N三乙酸酯；兰瑞肽；雷那霉素；来格司亭；香菇多糖硫酸盐；立托斯坦汀；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙立德+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿罗唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；蚯蚓氨酸；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；镥泰克萨菲瑞(lutetium texaphyrin)；利索茶碱；裂解肽；美坦辛；制甘糖酶素A；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白；基质溶素抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；merbarone；美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；丝裂霉素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重耐药基因抑制剂；多种肿瘤抑制因子1-基疗法；芥末抗癌剂；mycaperoxide B；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；纳帕维(naphterpin)；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；；尼鲁米特；尼沙霉素(nisamycin)；一氧化氮调节剂；氮氧化物抗氧化剂；nitrullyn；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕劳胺(palauamine)；棕榈酰根瘤菌；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；副球菌素；帕折普汀；培门冬酶；培得星；戊聚糖多硫酸钠；喷司他丁；戊曲唑；全氟溴烷；培磷酰胺；芥子醇；苯连氮霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；溶血链球菌；毛果芸香碱盐酸盐；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；紫菜霉素；强的松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡啶氧基化血红蛋白聚氧乙烯共轭物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基化瑞替普汀；铼Re 186依替膦酸；根瘤菌素；核糖酶；RII视黄酰胺；洛太米特；罗希吐碱；罗莫泰德；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；沙因托品(saintopin)；SarCNU；肌肉叶绿醇A(sarcophytol A)；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐呋喃(sizofuran)；索布佐生；硼胆酸钠；苯乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；穗霉素D；螺莫司汀；斯耐潘定；海绵抑制素1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；溶基质素抑制剂；sulfinosine；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆素；合成糖胺聚糖；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；喃氟啶；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物；四唑明；菌体胚素；噻可拉林；血小板生成素；；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；锡本紫红素乙酯；替拉扎明；二茂钛氯化物；topsentin；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；载体系统，红细胞基因疗法；维拉雷琐；藜芦胺；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine；维他欣(vitaxin)；伏罗唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；伊米利木单抗(imilimumab)；米氮平；BrUOG 278；BrUOG 292；RAD0001；CT-011；folfirinox；替比法尼；Rl15777；LDE225；钙三醇；AZD6244；AMG 655；AMG 479；BKM120；mFOLFOX6；NC-6004；西妥昔单抗；IM-C225；LGX818；MEK162；BBI608；MEDI4736；威罗菲尼；伊匹单抗；伊沃卢单抗(ivolumab)；纳武单抗；帕比司他；来氟米特；CEP-32496；阿仑单抗；贝伐单抗；奥法木单抗；帕尼单抗；帕博利珠单抗(pembrolizumab)；利妥昔单抗；曲妥珠单抗；STAT3抑制剂(例如STA-21、LLL-3、LLL12,XZH-5、S31-201、SF-1066、SF-1087、STX-0119、隐丹参酮、姜黄素、阿魏酰甲烷、FLLL11、FLLL12、FLLL32、FLLL62、C3、C30、C188、C188-9、LY5、OPB-31121、乙胺嘧啶、OPB-51602、AZD9150等)；缺氧诱导因子1(HIF-1)抑制剂(例如LW6、地高辛、劳伦二萜醇、PX-478、RX-0047、牡荆素、KC7F2、YC-1等)和净司他丁苯马聚合物。在一个实施方式中，抗癌药物是5-氟尿嘧啶，紫杉醇或甲酰四氢叶酸。
试剂盒
本发明还包括一种试剂盒，其包含本发明的抗体(即抗肾酶和抗PDl(和/或抗PD-Ll抗体)或其结合片段的组合以及说明材料，所述说明材料描述例如将抗体或其结合片段的组合作为治疗或预防性治疗向个体施用，如本文其他部分所述。在一个实施方式中，这一试剂盒还包含(优选无菌的)药学上可接受的载体，其适于例如在向个体施用本发明的肾酶结合分子之前溶解或悬浮包含本发明的抗体或其结合片段的组合的治疗性组合物。可选地，试剂盒包含用于施用肾酶结合分子的施用器。
实验例
现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且本发明决不应被解释为限于这些实施例，而应解释为包括由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。
无需进一步描述，可以相信的是，使用前述说明和以下说明性实施例，本领域普通技术人员可以制备和利用本发明化合物并实施所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的优选实施方式，并且不应解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：肾酶抗体的研制
将肽用作免疫原。产生的肽的范围为9至21个氨基酸，并且对应于肾酶-1和肾酶-2蛋白的区域。所有肽都具有N或C末端半胱氨酸残基。肽的序列可以在表1中看到，并且图4的序列比对中展示了这些肽何处对应于肾酶-1或-2序列。可以看到，肾酶-1特异性肽标记为1A-F，并且肾酶-2特异性肽标记为3A5。每种肽通过半胱氨酸与佐剂KLH缀合，并用于免疫6只兔子。使用相关肽(BSA-缀合物)或全长肾酶-1或2，通过ELISA测定法筛选从每只动物收集的抗血清的抗肾酶抗体滴度。还通过蛋白质印迹测试了所述抗血清检测组织裂解物中内源性肾酶的能力。使用这些筛选标准，选择产生具有优选特征的抗体的动物。在一些实施例中并且对于一些肽，多只动物产生了具有所需特异性的抗体。在这些情况下，一只动物的最终抗血清血用于多克隆抗体生产，一只(或者在一些实例中另外两只)动物用于收获脾淋巴细胞。在其他实例中，一只动物有一次末端出血和脾脏切除术。通过蛋白质G层析从末端出血中纯化总IgG，然后在肽亲和层析上进一步纯化，生成针对所有肽产生的多克隆抗体。进一步并使用标准方法，将来自所选动物脾脏的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。对于杂交瘤上清液，筛选它们与产生它们的两种肽的结合，然后再针对整个肾酶蛋白进行筛选。将选择的杂交瘤亚克隆并扩增用于抗体纯化。通过蛋白A亲和层析从条件化杂交瘤培养上清液中纯化单克隆抗体。
表1-用于产生抗肾酶抗体的肾酶肽的序列
由Biocore确定的抗体亲和力
使用Biacore T100进行结合研究。在25℃下使用25mM Tris pH 8、150mM NaCl、1mM EDTA、10％甘油、0.005％Tween-20和0.1mg/mL BSA作为运行缓冲液进行结合研究。如下所示，将生物素化的抗体捕获在个体链霉亲和素传感器芯片流动池上。因为该研究采用了两个传感器芯片，所以重复在第二传感器芯片上的两个mAb的分析以收集更多数据。以50nM作为三倍稀释系列中的最高浓度来测试肾酶-1。5个浓度中的每一个均测试一式两份。用1/1000磷酸的短脉冲再生结合的复合物。数据集是全局拟合的，用于提取表2中汇总的结合常数的估计值。
表2-通过Biocore确定的肾酶单克隆抗体的亲和力
1D28-4具有最高亲和力并且用于抑制研究。
抗肾酶抗体的核苷酸和氨基酸序列
选择单克隆抗体1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7和3A-5-2的肾酶结合特异性和高亲和力。使用标准聚合酶链反应程序和简并引物集，从亚克隆杂交瘤扩增这些抗体的抗体重链和轻链可变区的cDNA。1D-28-4(RP-220)的可变区核苷酸和氨基酸序列如图5所示。以这种方式，举例说明了具有优选特征的抗体组合物。
抗体对肾酶信号转导的抑制降低了癌细胞的存活
由于肾酶表达在多种癌细胞系中被上调(图6)，因此进行实验以确定肾酶是否为癌细胞提供了生存优势。发现，与正常皮肤相比，肾酶在痣和转移性黑色素瘤中的表达明显增加(图7)，表明肾酶为黑色素细胞提供了生存优势。此外，RenMonoAbl(针对RP-220产生的单克隆)非常有效于降低A375.S2(具有突变体B-Raf(V600E)的黑色素瘤细胞系)的活力，并显示出与对黑色素瘤具有活性的两种烷化剂的协同作用：替莫唑胺(图8)和达卡巴嗪(图9)。RenMonoAb1还有效于降低黑色素瘤细胞系Sk-Mel-28(表达突变体B-Raf(V600E)和野生型N-Ras)的活力并且显示出与替莫唑胺的协同作用(图10)。
随后，进行实验以确定RenMonoAbl的抑制作用是否对黑色素瘤具有特异性，或者它是否影响更广泛的肿瘤细胞。CCL-119细胞(CCF-MEC，急性淋巴细胞的白血病细胞系；美国典型培养物保藏中心)快速分裂并表达高水平的肾酶，是构成NCI-60组(panel)细胞的平均值(来自BioGPS.org的微阵列数据)的约3.8倍。RenMonoAb1显着降低了培养物中CCL-119细胞的活力(图11)。类似地，RenMonoAb1还抑制了两种胰腺癌细胞系MiaPac和Panc1的生长(图12-13)。图14是描绘肾酶单克隆抗体对黑色素瘤细胞数和形态的影响的光学图。观察到肾酶单克隆(例如1D-28-4)抑制了培养物中的黑色素瘤细胞。图15显示另外两种1C-22-1和D-37-10肾酶单克隆抗体也抑制了黑色素瘤细胞生长。这些数据表明，在多种癌症中，肾酶抑制可能是一种有用的治疗性选择。
肾酶过度表达与黑色素瘤患者预后不良有关
对从耶鲁发现和转移系列(随访长达30年的263例患者)获得的原发性和转移性肿瘤样本中肾酶的表达进行了检测。使用自动定量分析(AQUA)技术进行了基于荧光的免疫组织化学染色(Gould et al.,2009Journal of Clinical Oncology,27:5772-5780)，通过该方法，在由用抗S-100和抗gp100标记定义的区室内测定靶抗原表达。发现黑色素瘤组织中升高的肾酶表达与疾病特异性死亡率的显著增加相关(图16)，表明肾酶作用的抑制可能是这种疾病的一种有用治疗选择。
实施例2：通过交替激活的肿瘤相关巨噬细胞表达肾酶经由STAT3介导的机制促进 了黑色素瘤的生长
由于RNLS作为参与MAPK和PI3K途径的存活因子起作用，并且因为其表达受STAT3调节(Sonawane et al.,2014Biochemistry.53(44):6878-6892)，所以问题是RNLS表达和信号转导是否为癌细胞提供了生存优势。焦点在于黑色素瘤，其是一种其中MAPK、PI3K和JAK/STAT途径被异常调节的病症，并且其需要另外的治疗靶。
在黑色素瘤细胞系和肿瘤样品中，RNLS表达显著增加。在转移性黑色素瘤患者中，RNLS表达与疾病特异性存活呈负相关。检查黑色素瘤中RNLS的表达模式表明，上调主要发生在肿瘤相关基质的细胞组分中，特别是在CD163+巨噬细胞中。实验数据表明，募集到肿瘤中的交替活化的巨噬细胞(M2样，CD163+)可抑制针对肿瘤的免疫应答，增加血管生成，并且促进肿瘤细胞迁移、侵袭和传播(Ruhrberg et al.,2010Nat Med.16:861-2；Pollard etal.,2004Nat Rev Cancer.4:71-8；Hao et al.,2012Clinical and DevelopmentalImmunology.2012:11)。TAM占人类黑色素瘤中肿瘤块的很大百分比，并且在该著作中描述的异种移植物模型中也是如此。
RNLS偏好在CD162+TAM中表达，表明M2样TAM可通过分泌RNLS促进肿瘤进展。图22C示出了一种工作模型，其结合了在抑制RNLS信号转导观察到的抗肿瘤效应下潜藏的关键机制。RNLS单克隆m28-RNLS对RNLS信号转导的抑制增加了CD86+与CD163+TAM的比例，并且降低了CD163+ TAM的RNLS分泌。另外，m28-RNLS抑制黑色素瘤细胞中的RNLS信号转导。最终结果是总的和磷酸化的STAT3显著下降，导致细胞凋亡。
最近研究了调节RNLS基因表达的调节启动子元件和转录因子(Sonawane et al.,2014Biochemistry.53(44):6878-6892)，并且这些数据指向了STAT3的关键作用。结果表明在RNLS和STAT3之间存在前馈环，其中上调STAT3的信号增加RNLS基因表达，这反过来增加STAT3活性。RNLS和STAT3之间存在的这种相互作用对于RNLS信号转导在癌症发病机理中的作用具有重要意义。事实上，有大量数据指向STAT家族蛋白(特别是STAT3)在诱导和维持促进恶性转化和癌症进展的炎症微环境中的关键作用(Yu et al.,2009Nat Rev Cancer.9:798-809)。STAT3信号转导通常在恶性细胞中持续激活，并且这种激活不仅驱动肿瘤细胞增殖，而且还增加了维持肿瘤微环境中炎症的大量基因的生产。已有文献记录了在癌症中癌细胞与未转化细胞和基质细胞之间的STAT3前馈环(Catlett-Falcone et al.,1999Immunity.10:105-15；Yu et al.,2007Nat Rev Immunol.7:41-51；Ara et al.,2009Cancer Res.69:329-37)。例如，STAT3在多发性骨髓瘤患者中被组成型激活。在IL-6依赖性人骨髓瘤细胞系U266中，IL-6通过Janus激酶发出信号以激活STAT3，这反过来上调抗凋亡因子并且促进肿瘤细胞的存活(Catlett-Falcone et al.,1999Immunity.10:105-15)。通过各种机制，还发现STAT3在大多数黑色素瘤中被组成型激活，导致增加肿瘤细胞的存活、增殖、转移、血管生成并且降低肿瘤免疫应答(Lesinski et al.,2013Futureoncology.9:925-7；Kortylewski et al.,2005Cancer metastasisreviews.24:315-27；Emeagi et al.,2013Gene therapy.20:1085-92；Yang et al.,2010International journal of interferon,cytokine and mediator research:IJEVI.2010:1-7)。
RNLS通过增加抗凋亡因子Bcl2来介导细胞保护作用，并阻止效应子胱天蛋白酶的激活(Wang et al.,2014Journal of the American Society of Nephrology DOI:10.1681/asn.2013060665)。A375.S2细胞中RNLS信号转导的抑制与p38 MAPK的持续激活有关，随后是凋亡因子Bax的激活和细胞凋亡。MAPK p38是一种应激激活的蛋白激酶，与炎症、细胞分化、细胞周期调控和细胞凋亡有关(Ono et al.,2000 Cellular Signalling.12:1-13)。例如，神经生长因子戒断被证明在JNK和p38持续活化后引起细胞凋亡，并且下调ERK(Xia et al.,1995Science.270:1326-31)。然而，由于在某些条件下抑制p38可以阻断细胞凋亡(Ono et al.,2000 Cellular Signalling.12:1-130)，因此p38在细胞凋亡中的作用显然依赖于环境。数据表明，在A375.S2细胞中，p38的RNLS依赖性激活导致细胞凋亡。
RNLS信号转导的抑制显著降低了黑色素瘤异种移植中Ki-67的表达。由于Ki-67是一种明确定义的细胞增殖标志物，已被广泛用于评估肿瘤的增殖能力，因此该数据被解释为表明RNLS信号转导是肿瘤增殖的关键驱动因素，并且RNLS抑制降低肿瘤的增殖速率。已经确定了许多决定细胞周期进展的关键因素，包括一组细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和两类CDK抑制剂，即细胞周期蛋白依赖性激酶4(INK4)的抑制剂和CDK相互作用蛋白/激酶抑制剂蛋白(CIP/KIP)家族(Jung et al.,2010 Cellular Signalling.22:1003-12)。p21(属于CIP/KIP家族的CDK抑制剂)的表达受RNLS信号转导的调节。RNLS信号转导的抑制与p21表达的显著增加相关。p21是细胞周期的负调节因子，可以将细胞维持在G0、阻断G1/S过渡并导致G1期或间-S期停滞(Jung et al.,2010 Cellular Signalling.22:1003-12)。因此，p21表达的增加可以解释在用抗RNLS抗体治疗的肿瘤中观察到的细胞增殖的减少。此外，还显示p38影响细胞周期进展(Ono etal.,2000 Cellular Signalling.12:1-13)，并且通过抗RNLS处理激活p38也可能有助于细胞周期停滞。
这些发现将RNLS识别为一种可促进癌细胞存活和生长的分泌蛋白，并且提供了用以进一步研究抗RNLS疗法单独或与其他TAM-或黑色素瘤-抑制药物(如CSF-1R抑制剂或MAPK途径抑制剂)配合用于治疗恶性黑色素瘤的用途的框架。因为存在多种调节MAPK和PI3K和JAK/STAT3的机制，并且由于途径之间存在串扰，所以细胞命运取决于多个信号的动态平衡和整合，并且数据表明RNLS抑制将使平衡倾向癌症细胞死亡。
现在描述在该实施例中使用的材料和方法。
试剂
人类黑色素瘤细胞系A375.S2、SkMel28、SkMel5、MeWo和WM266-4从美国典型培养物保藏中心获得，并按照建议进行维护。按照描述相对于PBS来表达、纯化、浓缩和透析重组人类RNLS(Desir et al.,Journal of the American Heart Association.2012；l:e002634)。在United Peptide合成RNLS肽RP220和突变肽RP220A。兔抗RNLS单克隆抗体(AB178700)、山羊多克隆抗RNLS抗体(AB31291)、山羊IgG和兔IgG购自Abeam。
抗RNLS单克隆抗体m28-RNLS(也称为1D-28-4)、m37-RNLS(也称为1D-37-10)的合 成
将RNLS肽RP-220与KLH缀合并用于免疫6只兔子，并且将来自所选动物脾脏的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。针对rRNLS筛选杂交瘤上清液，克隆选择的杂交瘤并扩增用于抗体纯化。通过蛋白A亲和层析从条件杂交瘤培养上清液中纯化单克隆抗体。
基于使用Biacore T100系统确定的高结合亲和力(KD分别为0.316和2.67nM)选择两个克隆，m28-RNLS(也称为1D-28-4)、m37-RNLS(也称为1D-37-10)。通过PCR测定m28-RNLS的核苷酸序列，合成并将其克隆到哺乳动物表达载体中。通过蛋白A层析纯化通过瞬时表达到293-F细胞中来合成的m28-RNLS。
组织样本
从OriGene Technologies(Rockville,MD,USA)获得人类黑色素瘤cDNA阵列I和II。相关病理报告可在线获取：http://www.origene.com/assets/documents/TissueScan。将获自US Biomax(Rockville,MD,USA)的人类黑色素瘤和正常皮肤组织样本用于免疫组化或免疫荧光分析。
定量RT-PCR
如先前描述的，通过qRT-PCR评估各种基因的相对表达水平(Lee et al.,2013JAm Soc Nephrol.24:445-55)。使用TaqMan基因表达实时PCR分析(Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA)评估RNLS、2’-5’-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)、β-肌动蛋白和18s rRNA的mRNA水平。将结果表示为阈值周期(Ct)。通过比较Ct方法(ΔCt)确定归一化至内源性对照18s rRNA或β-肌动蛋白的靶转录物的相对定量，并且根据制造商的协议(User BulletinNo.2,Applied Biosystems)，使用2-ΔΔCt方法分析测试细胞系之间基因表达的相对变化。
免疫组织化学染色和蛋白质印迹分析
如前所述进行免疫组织化学(Guo et al.,2012Cancer science.103:1474-80)。简而言之，将肿瘤组织用福尔马林固定，石蜡包埋并在载玻片上切成5-μm切片。将载玻片脱石蜡并水合，然后在含有10mM柠檬酸钠，pH6缓冲液的高压锅中进行抗原修复。将切片在3％过氧化氢中封闭30分钟并且在处于PBS/0.1％Tween20中的2.5％正常马血清中封闭1小时，然后在4℃下与初级抗体和同种型对照IgG一起孵育过夜。在本研究中使用以下抗体：m28-RNLS，500ng/ml；山羊多克隆抗RNLS，250ng/ml(Abeam,ab31291)；兔单克隆抗CD68(BDBioscience,1:100)；兔单克隆抗CD 163(AbD Serotec,1:100)；兔单克隆抗CD86(Abeam,1:100)；兔单克隆抗Ki67(Vector Lab,VP-RM04,1:100)；兔单克隆抗p21、磷酸-Tyr705-Stat3和总Stat3(Cell Signaling Technologies,分别为#2947，1:100，#9145，1:400和#4904，1:400)。将ImmPRESS过氧化物酶-抗兔IgG(Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)用于检测初级抗体。使用Vector DAB底物试剂盒显色，并用苏木精复染(Vector Laboratories)。使用Olympus BX41显微镜和照相机(Olympus America Inc,Center Valley,PA,USA)观察载玻片并拍照。
如先前所述进行蛋白质印迹分析(Wang et al.,2014Journal of the AmericanSociety of Nephrology DOI:10.1681/asn.2013060665)。
组织微阵列
黑色素瘤组织微阵列购自US BioMax,Inc.和耶鲁组织病理学服务。本研究得到了耶鲁大学医学院人类调查委员会的批准(HIC protocol No.1003006479)。如先前所述构建耶鲁黑色素瘤组织微阵列(Berger et al.,2003Cancer research.63:8103-7；Rimm etal.,2001Cancer journal.7:24-31)。总共570个组织核代表542个总黑色素瘤病例和一小部分0.6mm的对照在单个载玻片上间隔0.8mm。该群组是从耶鲁大学医学院病理学系档案馆获得的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织块构建的。病理学家检查每个病例以选择包含在组织微阵列中的区域。用Tissue Micorarrayer(Beecher Instruments,Sun Prairie,WI)将来自样本的核心活组织检查置于组织微阵列上。然后将组织微阵列切成5μm切片，并使用胶带转移系统(Instumedics,Inc.,Hackensack,NJ)放置在载玻片上，进行UV交联。所有样本均取自1959年至1994年间切下的肿瘤档案，随访范围为2个月至38年(中位随访时间，60个月)。先前描述了该群组特征(Berger et al.,2004Cancer research.64:8767-72)。
如先前所述对组织微阵列载玻片进行染色(Berger et al.,2004Cancerresearch.64:8767-72；Nicholson et al.,2014Journal of the American College ofSurgeons.219:977-87)。将载玻片脱石蜡，再水合，去掩盖，并且以与上述免疫组织化学处理相同的方式进行封闭。在4℃下，使用稀释于BSA/TBS中的m28-RNLS加抗S100小鼠单克隆(1:100,Millipore,Temecula,CA,USA)和抗HMB45小鼠单克隆(1:100,Thermo Scientific,Fremont,CA,USA)的混合物将黑色素瘤组织阵列染色过夜。在室温下将稀释于BSA/TBS中的第二抗体Alexa 488-缀合的山羊抗小鼠(1:100,Molecular Probes,Eugene,OR)加Envision抗兔(DAKO)施用1小时。用TBST洗涤载玻片(三次，每次5分钟)，然后与Cy5-酪酰胺(Perkin-Elmer Life Science Products,Boston,MA)一起温育并且通过辣根过氧化物酶激活，导致与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体紧邻的许多共价缔合的Cy5染料沉积。使用Cy5是因为其发射峰(红色)远远在组织自发荧光的绿橙色光谱之外。用盖玻片密封载玻片，用含有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚的Prolong Gold抗褪色试剂来显现细胞核。
细胞活力检测
通过台盼蓝排除法评估总细胞数和活细胞百分比，并使用BioRad TC10自动细胞计数器计数细胞。对于另外的研究，根据制造商的指示，使用WST-1试剂测定细胞活力(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN,USA)。使用酶标仪读取吸光度(Power Waves XS,BioTek Instruments,Winooski,VT,USA)。
RNA干扰
靶向RNLS的四个单独的siRNA和siRNA SMART池购自Dharmacon(Lafayette,CO,USA)。使用DharmaFECT 4试剂(Dharmacon)按照制造商的指示，用RNLS siRNA或通用阴性对照小干扰RNA(对照siRNA,Dharmacon)转染细胞。通过qPCR确定敲低效率。
小鼠肿瘤模型
从Charles River(Willimantic，CT)获得雌性无胸腺的18-20g裸鼠(nu/nu)，并将其置于微隔离笼中，在无特定病原体的设施中具有高压灭菌的床上用品，具有12小时光/暗循环。动物随意接受水和食物，并根据VACHS IACUC批准的研究协议观察肿瘤生长、活动、进食和疼痛的迹象。
通过皮下注射A375.S2细胞(2x 106在100μl PBS中，pH 7.6)建立异种移植肿瘤。当肿瘤达到50-100mm3的体积时，将小鼠分成对照组(n＝14，通过每周一次腹腔注射(IP)兔IgG 40μg，和每3天在肿瘤部位周围皮下(SQ)注射40μg进行治疗)和实验组(n＝14)，其接收m28-RNLS(40μg IP，每周一次，和40μg SQ，每3天一次)。用数字卡尺测量肿瘤大小并且根据公式(长x宽2)xπ/2来计算体积。
在研究结束时，处死小鼠，切下肿瘤并立即在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。使用TUNEL测定(Roche in situ Apoptosis Detection System)根据制造商的说明检查细胞凋亡。通过光学显微镜检查切片，并通过在10个随机选择的高倍视野(x 200放大倍数)中计数≥1000个细胞来确定凋亡指数。
统计分析
将Wilcoxon秩和检验和Mann-Whitney U检验分别用于配对和非配对数据。当适用于非参数重复测量时，使用ANOVA(Friedman检验)来评估统计学显著性。当Friedman检验显示统计学显著性时，将Dunn检验用于成对比较。还进行了Kaplan-Meier存活分析和多变量Cox回归分析。所有数据均为平均值±平均值的标准误差(平均值±SEM)，并且将P<0.05的值接受为统计学上显著的差异。使用软件版本21.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行组织阵列数据的统计分析。
现在描述该实施例的结果。
黑色素瘤中的RNLS过表达
为了确定正常人皮肤和恶性黑色素瘤之间RNLS表达是否不同，研究了跨越正常皮肤向良性痣进展至原发性和转移性黑色素瘤的组织微阵列(TMA；Yale Tissue MicroarrayFacility and US Biomax,Inc.)。耶鲁大学TMA含有从1959年至1994年收集的192个原发性黑色素瘤的群组、从1997年到2004年收集的246个系列原发性和转移性黑色素瘤的群组、295例良性痣患者的群组中获得的福尔马林固定的石蜡包埋的样本和来自15例患者的匹配的正常皮肤样本。先前已经描述了这些组织微阵列的人口统计学和临床特征(GouldRothberg et al.,2009Journal of clinical oncology:official journal of theAmerican Society of Clinical Oncology.27:5772-80)。美国Biomax阵列含有74个样本，包括35个原发黑色素瘤、11个转移性病变、14个良性痣和14个正常样本。使用定量自动免疫荧光(IF)显微镜系统(AQUA)检查大约600个组织斑点的RNLS蛋白表达，显示从正常皮肤到良性痣到原发性恶性黑色素瘤到转移性黑色素瘤的进展伴随着RNLS表达的显著增加(分别为p＝0.009，p＝0.0003，和p<0.001，图17A-C)。
问题是失调的RNLS表达和信号转导是否可以促进黑色素瘤的生长，并因此作为预后标志物。检查了1997年至2004年收集的246个系列原发性和转移性样品群组的每个原发黑色素瘤。119名患者的组织斑点适合通过AQUA技术进行评估。在该组中，将肿瘤表达高RNLS水平(RNLS AQUA评分>中位AQUA评分75,764.45)的患者的结果与具有低RNLS表达的患者的结果进行比较。高RNLS表达与黑色素瘤特异性死亡增加有关：5年和10年疾病特异性存活率分别为55％对69％以及39.7％对58.5％，p＝0.008(图17D)。在对该群组进行多变量分析后，发现RNLS水平可独立预测黑色素瘤的存活率(p＝0.004，HR＝3.130)。诊断时的疾病阶段(p＝0.05，HR＝3.940)，克拉克水平(p＝0.015，HR＝1.687)和原发肿瘤的溃疡(p＝0.001，HR＝2.54)也被发现可独立预测黑色素瘤。这些发现表明，RNLS表达可以作为黑色素瘤中有用的预后标志物，并且可以有助于识别具有更具攻击性表型的患者亚组。
RNLS过度表达有利于癌细胞的存活
RNLS介导的信号转导是抗凋亡的，并且保护暴露于毒性应激的正常细胞免于凋亡性死亡(Wang et al.,2014J Am Soc Nephrol.；Lee et al.,2013J Am Soc Nephrol.24:445-55)。为了探索RNLS信号转导是否有利于癌细胞的存活，将重组RNLS(rRNLS)或牛血清白蛋白(BSA)添加到培养物中血清饥饿的黑色素瘤细胞(A375.S2，MeWo，SkMel5和SkMel28)中，并且测定细胞活力。与BSA相比，RNLS显著增加了血清饥饿细胞的存活率，并且通过WST-1测定法测量的增殖率明显增加(n＝6，p<0.05，图18A)。计数用RNLS处理的细胞的总细胞数和活细胞百分比，以确定增殖率的明显增加是否是由于细胞增殖的增加或凋亡速率的降低引起的。如图18B所示，RNLS的处理显示细胞计数增加，并且与用BSA处理的细胞相比，活细胞百分比增加，表明RNLS作为抗细胞凋亡、存活因子起作用。
RNLS信号转导的抑制在体外对黑色素瘤细胞具有细胞毒性
使用三种方法来确定抑制黑色素瘤中RNLS表达和信号转导的功能性后果。首先，评估了降低RNLS表达对细胞活力的影响。通过siRNA的RNLS敲低显著降低了黑色素瘤细胞系A375.S2和SkMel28的活力(分别为p＝0.03和p＝0.003，图19A)。其次，由于RNLS肽RP-220模仿rRNLS的保护作用和信号转导特性，有理由认为它可能与细胞外RNLS受体的关键区域相互作用，并且针对它的抗体可能具有抑制特性。因此，开发了一组针对RP-220的单克隆抗体，并测试了它们对癌细胞存活的影响。针对RNLS产生的两个单克隆抗体[克隆#28-4(m28-RNLS)、37-10(m37-RNLS)]降低了测试的所有(总共5个)黑色素瘤细胞系的存活率，代表性实例显示在图19B-C中。m28-RNLS表现出与增加的处理浓度相关的增加的细胞毒性水平(p<0.05，图19B)。第三，通过降低RP-220的净电荷(3赖氨酸/精氨酸改为丙氨酸，图19D)产生肽拮抗剂(RP-220A)。RP220A不介导RNLS依赖性信号转导，但与PMCA4b结合并拮抗内源性RNLS的作用(Wang etal.,2015PLoS ONE.10:e0122932)。RP-220A被证明在增加剂量时对培养物中的黑色素瘤细胞具有细胞毒性(p<0.005，图19D)。
RNLS信号转导的抑制阻断体内肿瘤生长
将A375.S2(人类黑色素瘤)细胞皮下注射到无胸腺裸鼠中以产生肿瘤。一旦肿瘤达到～50mm3的体积，然后用对照兔IgG或RNLS中和单克隆抗体m28-RNLS治疗动物。由于整个研究期间整体动物健康和活动得以维持，抗体治疗似乎没有毒性。每隔一天测量肿瘤大小，并且用m28-RNLS的治疗在所有测试点减小了肿瘤体积(p<0.05，图20A)。由于整体肿瘤大小和一些动物的溃疡，在第11天处死动物。来自异种移植肿瘤的切片的IHC染色与细胞增殖标志物Ki67显示，用抗RNLS抗体治疗的肿瘤与用兔IgG治疗的肿瘤相比，细胞增殖显著降低：对照组为35.1±2.3个阳性细胞/高倍视野，而RNLS Ab治疗组为13.4±3.0，n＝14，p＝0.0004(图20B)。
RNLS信号转导的抑制阻断内源性RNLS表达和STAT3活化并诱导细胞凋亡和细胞周 期停滞
已知STAT3与RNLS基因的启动子区域结合并增加其表达，并且已表明存在积极的RNLS-STAT3反馈环(Sonawane et al.,2014Biochemistry.53(44):6878-6892)。通过用对照IgG和m28-RNLS处理的异种移植肿瘤的细胞裂解物的免疫荧光组织染色和研究进一步研究了这种关系。通过IF评估，在肿瘤样品中注意到RNLS与磷酸化的STAT3和总STAT3的显著共表达(图21A)。用m28-RNLS处理导致RNLS蛋白表达的显著降低，以及总STAT3和磷酸化STAT3的显著降低(图21A)。如图21B-图21C所示，通过蛋白质印迹证实了蛋白质表达的变化。在用m28-RNLS处理的肿瘤中，酪氨酸705的STAT3磷酸化(p-Y705-STAT3)和总STAT3显著下降(n＝8，p<0.005，图21B-图21C)。
为了测试RNLS表达的显著降低是否主要发生在黑色素瘤细胞中，将人类和小鼠特异性引物用于在肿瘤块中扩增肿瘤(人类)和内源性(小鼠)RNLS。如图21D所示，m28-RNLS的处理导致小鼠RNLS表达显著降低，而不影响人类(肿瘤)表达，表明肿瘤浸润细胞在RNLS产生和分泌中起关键作用。
此外，注意到细胞周期抑制剂p21的表达增加。抗体治疗显著增加了肿瘤样品中细胞周期调节因子p21的表达：抗体治疗组中为24.2±2.4个阳性细胞，对照组中为12.2±1.0个阳性细胞，n＝14，p＝0.009(图21E)。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色显示，与对照组相比，抗体治疗肿瘤中经历细胞凋亡的平均细胞数显著增加，阳性细胞平均为13.3±0.6，对照组为4.3±0.2，n＝14，p<0.001(图21E)。细胞凋亡的增加与p38MAPK的磷酸化暂时相关，并且随后与B细胞淋巴瘤2相关蛋白Bax的激活相关(图21F)。这些数据表明，用抗RNLS抗体治疗导致总STAT3和磷酸化STAT3显著减少，减少细胞增殖并且增加肿瘤细胞凋亡。
RNLS信号转导的抑制增加CD86+与CD163+TAM的比
黑素细胞似乎不是黑色素瘤组织斑点中RNLS的主要来源，因为RNLS和黑素细胞染色之间存在最小重叠(图17A)。黑色素瘤经常有明显的免疫细胞浸润，包括巨噬细胞。浸润性巨噬细胞似乎贡献了大部分肿瘤RNLS，因为在每个组织斑点中注意到的RNLS染色的重要组分与泛巨噬细胞标记物CD68显著重叠(图22A上图)。经过进一步研究，确定RNLS主要与CD163+(M2样)TAM共表达(图22A，中图)。RNLS与CD86+(M1样)巨噬细胞的共表达是最小的(图22A，下图)。M2样(CD163+)巨噬细胞与免疫逃逸相关并且显示促进癌症发展和扩散，而M1样(CD86+)巨噬细胞通常是促炎性的并且抑制肿瘤生长(Biswas et al.,2010NatImmunol.11:889-96；Mantovani et al.,Trends in Immunology.23:549-55)。用m28-RNLS抗体处理异种移植物导致CD163+ TMA数量显著减少，并且其余细胞未表达可检测水平的RNLS(图22B)。
实施例3：通过质膜钙ATP酶PMCA4b的持续肾酶信号转导促进胰腺癌生长
由于RNLS作为参与胰腺癌中病症的MAPK和PI3K途径的存活因子起作用，并且因为其表达受转录STAT3的信号转导子和激活因子的调节(Sonawane et al.,2014Biochemistry.53(44):6878-6892)，因此推测，RNLS表达和信号转导的异常调节可为癌细胞提供生存优势，并促进肿瘤形成(Guo et al.,2014Curr Opin NephrolHypertens.23(5):513-8)。
本文证明，RNLS表达在多种类型的癌症中增加，并且在一组患有胰腺导管腺癌(PDAC)的患者中，总体存活与肿瘤中的RNLS表达呈负相关，表明了RNLS的致病作用。使用siRNA或抑制性抗RNLS抗体抑制RNLS表达降低了培养的PDAC细胞的活力。在异种移植小鼠模型中，RNLS单克隆抗体m28-RNLS抑制了PDAC生长，并通过下调STAT3并上调p21和p38，引起了细胞凋亡和细胞周期停滞。肿瘤细胞中RNLS表达的下调导致PMCA4b(RNLS受体)表达的等效下降，并导致肿瘤大小的减小，与用抑制性抗RNLS抗体所观察到的相似。这些结果揭示了先前未被认识的RNLS途径在癌症中的促存活功能，表明RNLS表达可作为预后标志物，并确定治疗胰腺癌的新的治疗靶点。
此处提供了PDAC中增加的RNLS表达的致病作用和抑制RNLS信号转导的治疗效用的证据。此外，正在探索介导所观察到的RNLS信号转导抑制剂的抗肿瘤活性的分子机制。
总之，这些发现表明，上调的RNLS介导的信号转导在PDAC中起致病作用。此处已经证明，高RNLS肿瘤表达与3年总死亡率增加2倍有关，支持使用RNLS作为诊断或预后标志物。此外，由于RNLS是一种分泌蛋白，因此可以作为肿瘤初级检测的生物标志物，或作为治疗应答或复发的代用标志物。
RNLS介导的细胞保护的主要机制似乎是其具有以下能力：激活AKT，ERK和STAT；增加抗凋亡因子Bcl2；和防止效应物胱天蛋白酶的激活(Wang et al.,2014Journal of theAmerican Society of Nephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。Panc1细胞中RNLS信号转导的抑制与p38MAPK的持续激活和细胞凋亡有关。p38是一种应激激酶，与炎症、细胞分化、细胞周期调控和细胞凋亡有关(Ono et al.,2000 Cellular Signalling.12(1):1-13)。例如，神经生长因子戒断导致细胞凋亡以及JNK和p38的持续激活和ERK的下调(Xia etal.,1995Science.270(5240):1326-31)。然而，由于在某些条件下抑制p38可以阻断细胞凋亡(Ono et al.,2000 Cellular Signalling.12(1):1-13)，p38在细胞凋亡过程中的作用显然与环境有关。本文描述的数据跟Panc1细胞中p38的m28-RNLS依赖性激活与细胞凋亡相关的解释一致。
RNLS信号转导的抑制显著降低胰腺癌异种移植物中Ki-67的表达。由于Ki-67用于评估细胞分裂水平，因此数据与RNLS抑制降低肿瘤增殖速率的解释一致。已经确定了许多决定细胞周期进展的关键因素，包括细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和两类内源性CKD抑制剂，即细胞周期蛋白依赖性激酶4(INK4)的抑制剂和CDK相互作用蛋白/激酶抑制剂(CIP/KIP)蛋白质家族(Jung et al.,2010 Cellular Signalling.22(7):1003-12)。数据显示属于CIP/KIP家族的CKD抑制剂p21的表达受RNLS信号转导的调节。RNLS信号转导的抑制与p21表达的显著增加相关。由于p21是细胞周期的负调节因子，可以将细胞保持在G0、阻断G1/S过渡并引起G1期或间-s期停滞(Jung et al.,2010 Cellular Signalling.22(7):1003-12)，因此其上调可以解释在用m28-RNLS处理的肿瘤中观察到的细胞增殖的减少。此外，还显示p38影响细胞周期进展(Ono et al.,2000 Cellular Signalling.12(1):1-13)，并且通过抗RNLS处理激活它也可导致细胞周期停滞。
最近研究了调节RNLS基因表达的调节启动子元件和转录因子(Sonawane et al.,2014Biochemistry.53(44):6878-6892)，并且这些数据指向STAT3的关键作用。结果表明了RNLS和STAT3之间的前馈环：上调STAT3的信号增加RNLS基因表达，而RNLS反过来增加STAT3活性。RNLS和STAT3之间的这种相互作用对于RNLS信号转导在癌症发病机理中的作用具有重要意义。STAT家族蛋白(特别是STAT3)与促进恶性转化和癌症进展的炎症微环境的诱导和维持密切相关(Yu et al.,2009Nat Rev Cancer.9(11):798-809)。STAT3信号转导通常在癌细胞中持续激活，这种激活不仅驱动肿瘤细胞增殖，而且还增加了维持肿瘤微环境炎症的大量基因的生产。癌症中癌细胞与未转化细胞和基质细胞之间的STAT3前馈环已有文献记载(Catlett-Falcone et al.,1999Immunity.10(1):105-15；Yu et al.,2007Nat RevImmunol.7(1):41-51；Ara et al.,2009Cancer Res.69(l):329-37)。例如，STAT3在多发性骨髓瘤患者中被组成型激活。在IL-6依赖性人类骨髓瘤细胞系U266中，IL-6通过Janus激酶发出信号以激活STAT3，其反过来上调抗凋亡因子并且促进肿瘤细胞的存活(Catlett-Falcone et al.,1999Immunity.10(1):105-15)。同样地，STAT3在大多数胰腺导管腺癌中被组成型激活，并且这似乎是KRAS诱导的胰腺肿瘤发生的起始和进展所必需的(Corcoranet al.,2011Cancer Res.71(14):5020-9)。
STAT3途径和RNLS也可能在促进PDAC发展中最常见且最重要的环境因素(吸烟)中发挥作用(Muscat et al.,1997Cancer epidemiology,biomarkers&prevention:apublication of the American Association for Cancer Research,cosponsored bythe American Society of Preventive Oncology.6(1):15-9；Boyle et al.,1996International journal of cancer Journal international du cancer.67(1):63-71；Fuchs et al.,1996Archives of internal medicine.156(19):2255-60)。尼古丁是香烟烟雾的关键成分，已被证明可以提高癌症的增殖和血管生成速度(Heeschen et al.,2002J Clin Invest.110(4):527-36；Heeschen et al.,2001Nat Med.7(7):833-9)。尼古丁对肿瘤生长和转移的作用被认为是由其与乙酰胆碱受体α-7nACHR的相互作用介导的，导致JAK-STAT3和MEK-ERK1-2下游信号级联反应(Momi et al.,2013Oncogene.32(11):1384-95)。在这种情况下，尼古丁通过Sp1和STAT3的协同作用增加RNLS启动子活性(Sonawane etal.,2014Biochemistry.53(44):6878-6892)。
先前已将PMCA4b表征为参与细胞信号转导、心脏肥大和癌症的质膜ATP酶(Cartwright et al.,2007Annals of the New York Academy of Sciences.1099(l):247-53；Pinton et al.,2001EMBO J.20(11):2690-2701；Oceandy et al.,2011Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Cell Research.1813(5):974-8)。它将Ca2+从细胞质转运到外部环境，并且似乎调节局部钙浓度。除了它在调节细胞质Ca2 +中的作用外，PMCA4b是大分子复合物的核心，也可通过Ras和MAPK发出信号(Ara et al.,2009Cancer Res.69(l):329-37；Corcoran et al.,2011Cancer Res.71(14):5020-9；Muscat et al.,1997Cancer epidemiology,biomarkers&prevention:a publication ofthe American Association for Cancer Research,cosponsored by the AmericanSociety of Preventive Oncology.6(1):15-9)。例如，它通过与肿瘤抑制因子RASSF1的相互作用调节Ras信号转导和ERK活化(Armesilla et al.,2004Journal of BiologicalChemistry.279(30):31318-28)。数据表明，RNLS通过PMCA4b发信号，PMCA4b表达的下调或其酶功能的抑制对胰腺癌细胞具有细胞毒性。这些发现表明PMCA4b代表了PDAC治疗的治疗性靶点。
总之，这些发现表明RNLS是一种分泌蛋白，可以促进PDAC的存活和生长。这为进一步研究抑制RNLS的疗法用于治疗癌症的用途提供了框架。在这种情况下，RNLS调节介导MAPK、PI3K和JAK-STAT3的多种相互关联信号，在癌症中具有活性，该分子可能是一种特别有吸引力的治疗靶点(图27E)。
现在描述在该实施例中使用的材料和方法。
试剂
人类导管胰腺腺癌细胞系BxPC-3、Panc1和MiaPaCa-2获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,VA,USA)并按照建议维护。p38和STAT3阻断剂SB203580和Stattic购自Abeam(Cambridge,UK)。INK抑制剂SP600125和ERK抑制剂U0126分别获自Sigma Aldrich(St.Louis,MO,USA)和Cell Signaling Technologies(Beverly MA,USA)。如先前所述，表达、纯化、浓缩重组人类RNLS(rRNLS)并相对于PBS进行透析(Desir et al.,2012J AmHeart Assoc.I(4):e002634)。兔抗RNLS单克隆(AB178700)、山羊多克隆抗RNLS(AB31291)、山羊IgG和兔IgG购自Abeam。
抗RNLS单克隆抗体m28-RNLS(也称为1D-28-4)、m37-RNLS(也被称为1D-37-10)的 合成
将RNLS肽RP-220与KLH缀合并用于免疫6只兔子，并且将来自所选动物脾脏的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。针对rRNLS筛选杂交瘤上清液，克隆所选择的杂交瘤并扩增以用于抗体纯化。通过蛋白A亲和层析从条件化杂交瘤培养上清液中纯化单克隆抗体。
基于使用Biacore T100系统研究的其高结合亲和力(KD分别为0.316和2.67nM)来选择两个克隆m28-RNLS、m37-RNLS。通过PCR测定m28-RNLS的核苷酸序列，合成并将其克隆到哺乳动物表达载体中。通过蛋白A层析纯化通过瞬时表达到293-F细胞中而合成的m28-RNLS。
组织样本
人类癌症cDNA阵列(筛选cDNA阵列I和II，胰腺癌cDNA阵列)获自OriGeneTechnologies(Rockville,MD,USA)。相关的病理报告可在线获取：www.origene.com/assets/documents/TissueScan。将获自US Biomax(Rockville,MD,USA)的人类胰腺癌和正常组织样品用于免疫组化或免疫荧光。
定量PCR
通过qPCR评估各种基因的相对表达水平。使用TaqMan基因表达实时PCR测定(Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA)评估RNLS、2’-5’-寡腺苷酸合成酶1(OASl)、β-肌动蛋白和18s rRNA的mRNA水平。将结果表示为阈值周期(Ct)。通过比较Ct方法(ΔCt)确定归一化至内源性对照18srRNA或β-肌动蛋白的靶转录物的相对定量，并且根据制造商的协议(User Bulletin No.2,Applied Biosystems)，使用2-ΔΔCt方法分析测试细胞系之间基因表达的相对变化。
免疫组织化学和蛋白质印迹分析
如先前所述进行免疫组织化学(Guo et al.,2012Cancer science.103(8):1474-80)。简而言之，将肿瘤组织用福尔马林固定，石蜡包埋并在载玻片上切成5-μm切片。将载玻片脱石蜡并水合，然后在含有10mM柠檬酸钠，pH6缓冲液的高压锅中进行抗原修复。将切片在3％过氧化氢中封闭30分钟并且在处于PBS/0.1％Tween20中的2.5％正常马血清中封闭1小时，然后在4℃下与初级抗体和同种型对照IgG一起孵育过夜。在本研究中使用以下抗体：m28-RNLS，500ng/ml；山羊多克隆抗RNLS，250ng/ml(Abeam,AB31291)；兔单克隆抗Ki67(Vector Lab,VP-RM04,1:100)；兔单克隆抗p21和磷酸-Tyr705-Stat3(Cell SignalingTechnologies,分别为#2947，1:100和#9145，1:400)。将ImmPRESS过氧化物酶-抗兔IgG(Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)用于检测初级抗体。使用Vector DAB底物试剂盒显色，并用苏木精复染(Vector Laboratories)。使用Olympus BX41显微镜和照相机(Olympus America Inc,Center Valley,PA,USA)观察载玻片并拍照。
如先前所述进行蛋白质印迹分析(Wang et al.,2014Journal of the AmericanSociety of Nephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。
组织微阵列
胰腺组织微阵列购自US BioMax。如先前所述对组织微阵列载玻片进行染色(Nicholson et al.,2014Journal of the American College of Surgeons.219(5):977-87)。简言之，将样本用m28-RNLS和小鼠单克隆泛细胞角蛋白抗体(1:100,DAKO M3515)在4℃下共染色过夜。在室温下将第二抗体Alexa 488-缀合的山羊抗小鼠(1:100,MolecularProbes,Eugene,OR)和Envision抗兔(DAKO)应用1小时。用Tris缓冲盐水洗涤载玻片(三次，每次5分钟)，与Cy5-酪酰胺(Perkin-Elmer Life Science Products,Boston,MA)一起温育并且通过辣根过氧化物酶激活。使用Cy5是因为其发射峰(红色)在组织自发荧光的绿橙色光谱之外。用盖玻片密封载玻片，用含有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚的Prolong Gold抗褪色试剂来促进显现细胞核。
细胞活力检测
通过台盼蓝排除法评估细胞活力，并使用BioRad TC10自动计数器计数细胞。对于一些研究，如先前描述(Wang et al.,2014Journal of the American Society ofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)使用WST-1试剂测定细胞活力。
细胞凋亡和细胞周期分析
对于细胞周期分析，使用10mM EDTA解离培养的细胞，用冰冷的70％乙醇固定，用RNAse A消化，并用碘化丙锭染色。使用BD FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences,SanJose,CA,USA)检测丙锭染色，并且使用CellQuest软件进行分析。
如先前所述检测细胞凋亡并定量(Guo et al.,2012Cancer Science.103(8):1474-80)。简而言之，根据制造商的说明，用FITC标记的膜联蛋白-V和碘化丙啶染色细胞(Bender MedSystems,Burlingame,CA,USA)。在BD FACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciences,San Jose,CA,USA)上收集至少20,000个事件并且使用CellQuest软件进行分析。
RNA干扰
针对RNLS的四个单独的siRNA和siRNA SMART池购自Dharmacon(Lafayette,CO,USA)。使用DharmaFECT 4试剂(Dharmacon)如制造商所建议的，用RNLS siRNA或通用阴性对照siRNA(对照siRNA，Dharmacon)转染细胞。
为了产生稳定转染的Panc1细胞系，根据制造商的协议用携带RNLS shRNA(sh-RNLS)或对照shRNA(sh-对照)的慢病毒(Santa Cruz)转导细胞。将细胞转导两次以增加shRNA拷贝数，并在80μg/ml嘌呤霉素中选择10天后建立了稳定的克隆。通过qPCR测定敲低效率。
小鼠异种移植肿瘤模型
从Charles River(Willimantic，CT)获得雌性无胸腺的18-20g裸鼠(nu/nu)，并将其置于微隔离笼中，在无特定病原体的设施中具有高压灭菌的床上用品，具有12小时光/暗循环。动物随意接受水和食物，并根据VACHS IACUC批准的研究协议观察肿瘤生长、活动、进食和疼痛的迹象。
通过皮下注射BxPC3细胞(2x 106在100μl PBS中，pH 7.6)建立异种移植肿瘤。当肿瘤达到50-100mm3的体积时，将小鼠分成对照组(n＝14，通过每周一次腹腔注射(IP)兔IgG 40μg进行治疗)和实验组(n＝14)，其接收m28-RNLS(40μg IP，每3天一次)。用数字卡尺测量肿瘤大小并且根据公式(长x宽2)xπ/2来计算体积。在另一组动物中(每组n＝6)，皮下注射sh-RNLS或sh-对照Panc1细胞(2x 106在100μl PBS中，pH 7.6)。这些动物未接受进一步治疗，并且测量肿瘤大小和体积长达30天。
在研究结束时，处死小鼠，切下肿瘤并立即在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。使用TUNEL测定(Roche in situ Apoptosis Detection System)根据制造商的说明检查细胞凋亡。通过光学显微镜检查切片，并通过在5个随机选择的高倍视野(x 200放大倍数)中计数≥1000个细胞来确定凋亡指数。
统计分析
将Wilcoxon秩和检验和Mann-Whitney检验分别用于配对和非配对数据。当适用时，使用非参数重复测量ANOVA(Friedman检验)来评估统计学显著性。当Friedman检验显示统计学显著性时，将Dunn检验用于成对比较。所有数据均为平均值±平均值的标准误差(平均值±SEM)，并且将P<0.05的值接受为统计学上显著的差异。使用软件版本21.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行组织阵列数据的统计分析。
现在描述本实施例的结果。
RNAC中的RNLS过表达以与生存率降低有关
为了确定正常组织和癌组织之间RNLS表达是否不同，通过使用定量PCR(qPCR)筛选市售人类组织cDNA阵列来检查了15种不同类型的癌症。RNLS表达在胰腺癌、膀胱癌和乳腺癌以及黑色素瘤中显著增加(图23A)。由于其特别差的存活率和有限的治疗选择，因此焦点在于胰腺肿瘤。RNLS表达在PDAC(～3倍)和胰腺神经内分泌肿瘤(8倍)中均升高(图23B)。使用抗RNLS单克隆m28-RNLS的免疫细胞化学研究表明，RNLS表达存在于PDAC 1-4级中，主要定位于癌细胞，如图23C和图28所示。大多数RNLS似乎在癌细胞中具有细胞质分布；它存在于所有肿瘤等级中，但在更分化的癌症(I-III级)中最为明显。在胰腺的神经内分泌肿瘤中，RNLS在整个肿瘤的细胞中表达(图29)。具有KRAS突变的胰腺导管腺癌细胞(PDACC)系(MiaPaCa2和Panc1)中的RNLS基因表达比具有野生型KRAS的那些(如BxPC3)中的更高(图30)。
采用组织芯片(TMA)表征了69例PDAC患者中的RNLS表达，该组织芯片由福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤核心与匹配的相邻正常组织组成。获得样品的个体的人口统计学和临床特征显示在表3中。使用无偏、定量、自动化免疫荧光显微镜系统(AQUA)检查来自成对PDAC肿瘤及其非肿瘤邻近组织的138个组织斑点的RNLS蛋白表达(Gould Rothberg etal.,2009Journal of Clinical Oncology.27(34):5772-80)，显示PDAC肿瘤中的总体RNLS水平比其相邻的非肿瘤胰腺组织高2倍以上(p<0.001，图23D)。
表3：PDAC患者群组的特征
为了确定增强的RNLS表达是否可能影响PDAC的临床行为，询问了表达水平是否影响预后。肿瘤表达高RNLS水平的个体(n＝34且RNLS AQUA评分>中位数)的3年生存率显著降低(24％比49％，p＝0.024，图23E)。这些发现表明，RNLS表达的肿瘤水平可能是PDAC中有用的预后标志物，有助于识别患有更具攻击性表型的患者亚组。
RNLS通过PMCA4b发出信号并作为胰腺癌细胞的存活因子
RNLS介导的信号转导保护暴露于毒性应激的HK-2细胞免于凋亡(Lee et al.,2013J Am Soc Nephrol.24(3):445-55；Wang et al.,2014Journal of the AmericanSociety of Nephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。为了探究RNLS信号转导是否为暴露于应激的胰腺导管腺癌细胞(PDACC)提供了生存优势，将血清从培养的BxPC3、Panc1和MiaPaCa2细胞中取出48小时，并且将重组RNLS(rRNLS)或牛血清白蛋白(BSA)加入培养基中另外的72小时；测定总的和活(台盼蓝排除法)细胞计数。与BSA相比，rRNLS使PDACC存活率提高2至5倍(图24A)。
已经证明，通过向暴露于过氧化氢或顺铂损伤的HK-2细胞中添加rRNLS而提供的细胞保护作用依赖于ERK活化(Lee et al.,2013J Am Soc Nephrol.24(3):445-55；Wanget al.,2014Journal of the American Society of Nephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。图24B中显示的结果表明，rRNLS还以ERK依赖性方式改善PDACC存活，因为用U0126(MAPK激酶MEK1的抑制剂)的预处理消除了rRNLS的保护作用。
通过使用siRNA特异性下调PMCA4b表达获得了关于PMCA4b在胰腺癌中RNLS依赖性信号转导中的作用的证据。在对照研究中，非靶向siRNA既不影响PMCA4b基因表达，也不影响RNLS介导的ERK磷酸化(图24C)。相比之下，靶向PMCA4b的siRNA使基因表达降低超过90％，并使RNLS依赖性ERK磷酸化降低～70％(图24C)。PMCA4b抑制对RNLS介导的STAT3磷酸化无明显影响，表明存在另外的RNLS受体。
在rRNLS存在下观察到的PDAC细胞数量增加与预防细胞死亡和/或增加细胞增殖的RNLS信号转导一致。通过荧光激活细胞分选(FACS)分析检查RNLS对细胞周期的影响，以确定PDACC活力的明显增加是否是由于细胞增殖增加还是由于细胞死亡率降低所致。如图24D所示，与用BSA治疗相比，rRNLS对细胞周期进展没有影响，表明RNLS不影响增殖程序，而是防止细胞死亡，并作为生存因子起作用。
RNLS信号转导的抑制剂阻断胰腺癌生长
为了确定在胰腺癌细胞中抑制RNLS表达和信号转导的功能性后果，通过siRNA的RNLS敲低来评估降低RNLS表达对体外细胞活力的影响。该处理显著降低了PDACC系Panc1和MiaPaCa2的活力(图25A和31)。由于RNLS肽RP-220模仿rRNLS的保护作用和信号转导特性，因此有理由认为它可能与细胞外RNLS受体的关键区域相互作用，并且针对其产生的抗体可能是抑制性的。从在兔子中针对RP-220产生的一组单克隆抗体中，基于高结合亲和力(KD分别为0.316和2.67nM)选择了两个克隆m28-RNLS、m37-RNLS。图25B和25C中描绘的代表性实施例显示了m28-RNLS、m37-RNLS和市售多克隆(针对RP-220的部分序列)对PDACC生长的抑制性作用。培养细胞中的这些研究表明，RNLS可通过自分泌/旁分泌途径起作用以刺激PDACC生长。
为了确定RNLS信号转导的抑制是否影响体内肿瘤生长，使用shRNA产生两个稳定转染的Panc1细胞系：一个含有非靶向shRNA(sh-对照)，并且另一个含有RNLS靶向shRNA(sh-RNLS)。通过qPCR评估，sh-RNLS细胞中的RNLS表达降低超过90％(图31)。令人惊讶的是，RNLS靶向shRNA对RNLS表达的抑制导致其受体PMCA4b的表达显著降低，表明RNLS和PMCA4b表达是共调节的(图32)。将转染的细胞皮下注射到无胸腺裸鼠中，并在30天内评估肿瘤大小。从第8天至处死动物的第30天，sh-RNLS细胞产生的肿瘤体积明显小于sh-对照细胞产生的肿瘤体积(图25D)。由于宿主小鼠的RNLS产生和分泌未受影响，因此这些结果表明，因为同时抑制RNLS受体PMCA4b，sh-RNLS肿瘤细胞对循环RNLS无应答。
为了评估抑制性抗体的治疗潜力，将BxPC3细胞皮下注射到用对照兔IgG或m28-RNLS处理的无胸腺裸鼠中，并且测量肿瘤体积长达3周。如图25E所示，与兔IgG相比，m28-RNLS处理导致肿瘤体积显著降低。将在培养的PDACC细胞中以及在PDACC的体内模型中进行的这些研究结合在一起，提供了令人信服的证据表明，RNLS途径调节胰腺癌的生长并且可能用作治疗靶点。
通过m28-RNLS在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡和细胞周期停滞
来自用兔IgG或m28-RNLS处理以降低RNLS水平的小鼠的BxPC3异种移植肿瘤切片显示，抗体治疗的肿瘤中细胞凋亡增加了～2倍(TUNEL染色)(图26A)：m28-RNLS比IgG；28.4±3.3个阳性细胞/高倍视野，相比IgG-14.8±2.3，n＝14，p＝0.002。培养物中Panc1细胞的FACS分析证实m28-RNLS引起细胞凋亡(图26B和33)。用m28-RNLS抗体治疗在治疗后第1天开始引起p38 MAPK的持续磷酸化(图26C)。
BxPC3肿瘤的m28-RNLS治疗还导致细胞增殖标志物Ki67的表达降低了2.5倍(m28-RNLS比IgG：IgG，137.1±14.9相比340.2±11.9个阳性细胞/高倍视野，n＝14，p＝1.4x10-8)(图26D，上图)，并且导致细胞周期调节因子p21的表达增加～4倍(m28-RNLS比IgG：IgG，178.1±11.4相比42.2±4.7.6个阳性细胞/高倍视野，n＝14，p＝1.6x10-10)(图26D，下图)。进行Panc1细胞的FACS分析以检查RNLS信号转导抑制对细胞周期的影响。图26E中显示的数据证实RNLS抑制引起细胞凋亡，如通过出现大的前-G1峰所证明的。它们还显示了G2的显著降低，表明m28-RNLS对RNLS信号转导的抑制导致前-G2细胞周期停滞。
正RNLS-STAT3反馈环的存在以及通过m28-RNLS对其的中断
STAT3结合RNLS基因的启动子区并增加其表达(Sonawane et al.,2014Biochemistry.53(44):6878-6892)。通过以下观察建议了正RNLS-STAT3反馈环：在RNLS处理的HK-2细胞中，在丝氨酸727处的STAT3磷酸化(p-Ser727-STAT3)and在酪氨酸705处的STAT3磷酸化(p-Y705-STAT3)分别增加了2和4倍，但STAT1未受影响(图34)。如图27A-B所示，向PDACC系Panc1添加RNLS导致了磷酸化STAT3(p-Ser727-STAT3和p-Y705-STAT3)的快速增加。通过m28-RNLS抑制Panc1中的RNLS信号转导导致p-Y705-STAT3长期持续减少，这一发现提供了对RNLS-STAT3反馈环的另外支持(图27C-图27D)。
实施例4：抗肾酶抗体与抗PD1抗体对抗癌症的协同作用
进行实验以评估抗RNLS抗体和抗PD1抗体之间针对耐抗PD1药剂的肿瘤细胞系(即YUMM)的协同作用(图35)。将耐抗PD1的小鼠黑色素瘤细胞系(YUMM)移植到免疫活性的C57B6小鼠中。在移植的YUMM肿瘤体积达到约100mm3(即第0天)后，在第0天、第7天、第9天和第12天施用治疗，如图23中的箭头所示。如图35所示，与单独的抗RNLS抗体(60μg)或单独的抗PD1抗体(120μg)相比，用抗RNLS抗体(m28；15μg、30μg或60μg)和抗PD1抗体(120μg)的组合的治疗更大程度地降低了肿瘤生长。
进行实验，通过qPCR测量使用单独的抗RNLS抗体(m28)、单独的抗PD1抗体以及抗RNLS抗体(m28)与抗PD1抗体的组合处理后未分割肿瘤块中PD1和PD-L1 mRNA的表达(图36)。
进行实验，以通过qPCR测量使用单独的抗RNLS抗体(m28)、单独的抗PD1抗体以及抗RNLS抗体(m28)与抗PD1抗体的组合处理后未分割肿瘤块中CD8a mRNA的表达。结果表明m28激活细胞毒性T细胞(图37)。
序列
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本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用整体并入本文。
虽然已经参考具体实施方式公开了本发明，但显而易见的是，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计出本发明的其他实施方式和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。
序列表
<110> 耶鲁大学(Yale University)
加里·德西尔(Desir, Gary)
<120> 用抗肾酶抗体和抗PD1抗体治疗癌症的组合物和方法
<130> 047162-5234-00-WO.607260
<150> US 62/468,453
<151> 2017-03-08
<160> 101
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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Cys
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<213> 智人（Homo sapiens）
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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<213> 智人（Homo sapiens）
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<213> 智人（Homo sapiens）
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 9
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<220>
<223> 1D-28-4全长轻链氨基酸
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100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 13
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<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-28-4轻链CDR1氨基酸
<400> 14
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 18
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10全长轻链氨基酸
<400> 18
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Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
195 200 205
Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln
210 215 220
Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10重链CDR1氨基酸
<400> 19
Leu Ser Asp Tyr Ala Ile Ile
1 5
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10重链CDR2氨基酸
<400> 20
Ile Ile Gly Ser Ser Gly Asp Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10重链CDR3氨基酸
<400> 21
Arg Tyr Ala Gly Thr Thr Asp Tyr His Asp Ala Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10轻链CDR1氨基酸
<400> 22
Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Tyr Leu Ser
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10轻链CDR2氨基酸
<400> 23
Lys Ala Ser Thr Leu Thr Ser
1 5
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10轻链CDR3氨基酸
<400> 24
Gln Ile Asn Tyr Ser Ile Tyr Asn His Tyr Asn Ile Ile
1 5 10
<210> 25
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1全长重链氨基酸
<400> 25
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro
20 25 30
Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45
Ser Tyr Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Leu Ile Gly Asp Arg Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val
85 90 95
Thr Leu Lys Met Thr Arg Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
100 105 110
Cys Ala Arg Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Arg Ile Trp Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser Trp Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser
195 200 205
Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys
210 215 220
Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro
225 230 235 240
Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr
275 280 285
Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys
325 330 335
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
340 345 350
Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu
355 360 365
Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val
420 425 430
Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 26
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1全长轻链氨基酸
<400> 26
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Val Tyr Lys Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Thr Ser Lys Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Val Asp Phe Met Ala Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Ala Asp Leu Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys
145 150 155 160
Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp
165 170 175
Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn
180 185 190
Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser
195 200 205
Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly
210 215 220
Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1重链CDR1氨基酸
<400> 27
Leu Ser Ser Tyr Gly Val Thr
1 5
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1重链CDR2氨基酸
<400> 28
Leu Ile Gly Asp Arg Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
1 5 10 15
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1重链CDR3氨基酸
<400> 29
Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Arg Ile
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1轻链CDR1氨基酸
<400> 30
Ser Gln Ser Val Tyr Lys Asn Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1轻链CDR2氨基酸
<400> 31
Glu Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1轻链CDR3氨基酸
<400> 32
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Val Asp Phe Met Ala
1 5 10
<210> 33
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7 全长重链氨基酸
<400> 33
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro
20 25 30
Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
35 40 45
Thr Tyr Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Leu Ile Gly Asp Arg Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Val Asn Gly Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val
85 90 95
Thr Leu Lys Met Thr Arg Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
100 105 110
Cys Ala Arg Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Arg Ile Trp Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ala Ser Trp Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser
195 200 205
Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys
210 215 220
Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro
225 230 235 240
Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr
275 280 285
Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys
325 330 335
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
340 345 350
Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu
355 360 365
Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val
420 425 430
Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 34
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7全长轻链氨基酸
<400> 34
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro
20 25 30
Met Ser Ala Ala Leu Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser
35 40 45
Gln Thr Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Thr Ser Lys Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Val Asp Phe Met Ala Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Ala Asp Leu Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys
145 150 155 160
Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp
165 170 175
Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn
180 185 190
Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser
195 200 205
Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly
210 215 220
Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7重链CDR1氨基酸
<400> 35
Leu Thr Thr Tyr Gly Val Thr
1 5
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7重链CDR2氨基酸
<400> 36
Leu Ile Gly Asp Arg Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly
1 5 10 15
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7重链CDR3氨基酸
<400> 37
Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Arg Ile
1 5
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7轻链CDR1氨基酸
<400> 38
Ser Gln Thr Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7轻链CDR2氨基酸
<400> 39
Glu Thr Ser Lys Leu Ser Ser
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7轻链CDR3氨基酸
<400> 40
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Val Asp Phe Met
1 5 10
<210> 41
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2 全长重链氨基酸
<400> 41
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn
35 40 45
Asn Tyr His Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Tyr Ile Gly Ile Ile Phe Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Arg Trp Thr
65 70 75 80
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys
85 90 95
Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
100 105 110
Gly Asp Gly Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Leu Gly
115 120 125
Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp
130 135 140
Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly
165 170 175
Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn
195 200 205
Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro
210 215 220
Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg
275 280 285
Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg
290 295 300
Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys
305 310 315 320
Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr
340 345 350
Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp
370 375 380
Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro
405 410 415
Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 42
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2全长轻链氨基酸
<400> 42
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Val Phe Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Met Ser Gly Val Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Gly Ser Phe Asp Cys Asn Ser Gly Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile
145 150 155 160
Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu
165 170 175
Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro
180 185 190
Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr
210 215 220
Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2重链CDR1氨基酸
<400> 43
Leu Asn Asn Tyr His Ile Tyr
1 5
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2重链CDR2氨基酸
<400> 44
Ile Ile Phe Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Arg Trp Thr Lys Gly
1 5 10 15
<210> 45
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2重链CDR3氨基酸
<400> 45
Gly Asp Gly Ile
1
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2轻链CDR1氨基酸
<400> 46
Ser Gln Ser Val Phe Asn Asn Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2轻链CDR2氨基酸
<400> 47
Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 48
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2轻链CDR3氨基酸
<400> 48
Ala Gly Ser Phe Asp Cys Asn Ser Gly Asp Cys Val Ala
1 5 10
<210> 49
<211> 1029
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 49
atggcgcagg tgctgatcgt gggcgccggg atgacaggaa gcttgtgcgc tgcgctgctg 60
aggaggcaga cgtccggtcc cttgtacctt gctgtgtggg acaaggctga ggactcaggg 120
ggaagaatga ctacagcctg cagtcctcat aatcctcagt gcacagctga cttgggtgct 180
cagtacatca cctgcactcc tcattatgcc aaaaaacacc aacgttttta tgatgaactg 240
ttagcctatg gcgttttgag gcctctaagc tcgcctattg aaggaatggt gatgaaagaa 300
ggagactgta actttgtggc acctcaagga atttcttcaa ttattaagca ttacttgaaa 360
gaatcaggtg cagaagtcta cttcagacat cgtgtgacac agatcaacct aagagatgac 420
aaatgggaag tatccaaaca aacaggctcc cctgagcagt ttgatcttat tgttctcaca 480
atgccagttc ctgagattct gcagcttcaa ggtgacatca ccaccttaat tagtgaatgc 540
caaaggcagc aactggaggc tgtgagctac tcctctcgat atgctctggg cctcttttat 600
gaagctggta cgaagattga tgtcccttgg gctgggcagt acatcaccag taatccctgc 660
atacgcttcg tctccattga taataagaag cgcaatatag agtcatcaga aattgggcct 720
tccctcgtga ttcacaccac tgtcccattt ggagttacat acttggaaca cagcattgag 780
gatgtgcaag agttagtctt ccagcagctg gaaaacattt tgccgggttt gcctcagcca 840
attgctacca aatgccaaaa atggagacat tcacaggtta caaatgctgc tgccaactgt 900
cctggccaaa tgactctgca tcacaaacct ttccttgcat gtggagggga tggatttact 960
cagtccaact ttgatggctg catcacttct gccctatgtg ttctggaagc tttaaagaat 1020
tatatttaa 1029
<210> 50
<211> 315
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 50
Met Ala Gln Val Leu Ile Val Gly Ala Gly Met Thr Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Ala Leu Leu Arg Arg Gln Thr Ser Gly Pro Leu Tyr Leu Ala Val
20 25 30
Trp Asp Lys Ala Glu Asp Ser Gly Gly Arg Met Thr Thr Ala Cys Ser
35 40 45
Pro His Asn Pro Gln Cys Thr Ala Asp Leu Gly Ala Gln Tyr Ile Thr
50 55 60
Cys Thr Pro His Tyr Ala Lys Lys His Gln Arg Phe Tyr Asp Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Tyr Gly Val Leu Arg Pro Leu Ser Ser Pro Ile Glu Gly Met
85 90 95
Val Met Lys Glu Gly Asp Cys Asn Phe Val Ala Pro Gln Gly Ile Ser
100 105 110
Ser Ile Ile Lys His Tyr Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Val Tyr Phe
115 120 125
Arg His Arg Val Thr Gln Ile Asn Leu Arg Asp Asp Lys Trp Glu Val
130 135 140
Ser Lys Gln Thr Gly Ser Pro Glu Gln Phe Asp Leu Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
Met Pro Val Pro Glu Ile Leu Gln Leu Gln Gly Asp Ile Thr Thr Leu
165 170 175
Ile Ser Glu Cys Gln Arg Gln Gln Leu Glu Ala Val Ser Tyr Ser Ser
180 185 190
Arg Tyr Ala Leu Gly Leu Phe Tyr Glu Ala Gly Thr Lys Ile Asp Val
195 200 205
Pro Trp Ala Gly Gln Tyr Ile Thr Ser Asn Pro Cys Ile Arg Phe Val
210 215 220
Ser Ile Asp Asn Lys Lys Arg Asn Ile Glu Ser Ser Glu Ile Gly Pro
225 230 235 240
Ser Leu Val Ile His Thr Thr Val Pro Phe Gly Val Thr Tyr Leu Glu
245 250 255
His Ser Ile Glu Asp Val Gln Glu Leu Val Phe Gln Gln Leu Glu Asn
260 265 270
Ile Leu Pro Gly Leu Pro Gln Pro Ile Ala Thr Lys Cys Gln Lys Trp
275 280 285
Arg His Ser Gln Val Pro Ser Ala Gly Val Ile Leu Gly Cys Ala Lys
290 295 300
Ser Pro Trp Met Met Ala Ile Gly Phe Pro Ile
305 310 315
<210> 51
<211> 945
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 51
atggcgcagg tgctgatcgt gggcgccggg atgacaggaa gcttgtgcgc tgcgctgctg 60
aggaggcaga cgtccggtcc cttgtacctt gctgtgtggg acaaggctga ggactcaggg 120
ggaagaatga ctacagcctg cagtcctcat aatcctcagt gcacagctga cttgggtgct 180
cagtacatca cctgcactcc tcattatgcc aaaaaacacc aacgttttta tgatgaactg 240
ttagcctatg gcgttttgag gcctctaagc tcgcctattg aaggaatggt gatgaaagaa 300
ggagactgta actttgtggc acctcaagga atttcttcaa ttattaagca ttacttgaaa 360
gaatcaggtg cagaagtcta cttcagacat cgtgtgacac agatcaacct aagagatgac 420
aaatgggaag tatccaaaca aacaggctcc cctgagcagt ttgatcttat tgttctcaca 480
atgccagttc ctgagattct gcagcttcaa ggtgacatca ccaccttaat tagtgaatgc 540
caaaggcagc aactggaggc tgtgagctac tcctctcgat atgctctggg cctcttttat 600
gaagctggta cgaagattga tgtcccttgg gctgggcagt acatcaccag taatccctgc 660
atacgcttcg tctccattga taataagaag cgcaatatag agtcatcaga aattgggcct 720
tccctcgtga ttcacaccac tgtcccattt ggagttacat acttggaaca cagcattgag 780
gatgtgcaag agttagtctt ccagcagctg gaaaacattt tgccgggttt gcctcagcca 840
attgctacca aatgccaaaa atggagacat tcacaggtac caagtgctgg tgtgattcta 900
ggatgtgcga agagcccctg gatgatggcg attggatttc ccatc 945
<210> 52
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-28-4全长重链核酸
<400> 52
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gattctccct cagtagtttt gcagtgggct gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatacatcgg aatcattagt agtgttggta ttacacgcta cgcgagctgg 240
gcggccggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa aatcaccagt 300
ccgacaaccg aggacacggc cacctatttt tgtgccagat atggttatag tggtgatgtt 360
aatcggttgg atctctgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcctcagg gcaacctaag 420
gctccatcag tcttcccact ggccccctgc tgcggggaca cacccagctc cacggtgacc 480
ctgggctgcc tggtcaaagg gtacctcccg gagccagtga ccgtgacctg gaactcgggc 540
accctcacca atggggtacg caccttcccg tccgtccggc agtcctcagg cctctactcg 600
ctgagcagcg tggtgagcgt gacctcaagc agccagcccg tcacctgcaa cgtggcccac 660
ccagccacca acaccaaagt ggacaagacc gttgcgccct cgacatgcag caagcccacg 720
tgcccacccc ctgaactcct ggggggaccg tctgtcttca tcttcccccc aaaacccaag 780
gacaccctca tgatctcacg cacccccgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccag 840
gatgaccccg aggtgcagtt cacatggtac ataaacaacg agcaggtgcg caccgcccgg 900
ccgccgctac gggagcagca gttcaacagc acgatccgcg tggtcagcac cctccccatc 960
gcgcaccagg actggctgag gggcaaggag ttcaagtgca aagtccacaa caaggcactc 1020
ccggccccca tcgagaaaac catctccaaa gccagagggc agcccctgga gccgaaggtc 1080
tacaccatgg gccctccccg ggaggagctg agcagcaggt cggtcagcct gacctgcatg 1140
atcaacggct tctacccttc cgacatctcg gtggagtggg agaagaacgg gaaggcagag 1200
gacaactaca agaccacgcc ggccgtgctg gacagcgacg gctcctactt cctctacagc 1260
aagctctcag tgcccacgag tgagtggcag cggggcgacg tcttcacctg ctccgtgatg 1320
cacgaggcct tgcacaacca ctacacgcag aagtccatct cccgctctcc gggtaaatga 1380
<210> 53
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-28-4全长轻链核酸
<400> 53
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactgca tcgcccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtcagagt gtttatgata acaacaactt agcctggtat 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaagcaa ctgatctatg gtgcatccac tctggcatct 240
ggggtctcat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
ggcgtgcagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtctag gcgaatttag ttgtagtagt 360
gctgattgtt ttgctttcgg cggagggacc gaggtggtcg tcaaaggtga tccagttgca 420
cctactgtcc tcatcttccc accatctgct gatcttgtgg caactggaac agtcaccatc 480
gtgtgtgtgg cgaataaata ctttcccgat gtcaccgtca cctgggaggt ggatggcacc 540
acccaaacaa ctggcatcga gaacagtaaa acaccgcaga attctgcaga ttgtacctac 600
aacctcagca gcactctgac actgaccagc acacagtaca acagccacaa agagtacacc 660
tgcaaggtga cccagggcac gacctcagtc gtccagagct tcaatagggg tgactgttag 720
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-28-4重链CDR1 核酸
<400> 54
ctcagtagtt ttgcagtggg c 21
<210> 55
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-28-4重链CDR2 核酸
<400> 55
atcattagta gtgttggtat tacacgctac gcgagctggg cggccggc 48
<210> 56
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-28-4重链CDR3 核酸
<400> 56
tatggttata gtggtgatgt taatcggttg gatctc 36
<210> 57
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-28-4轻链CDR1 核酸
<400> 57
agtcagagtg tttatgataa caacaactta gcc 33
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-28-4轻链CDR2 核酸
<400> 58
ggtgcatcca ctctggcatc t 21
<210> 59
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-28-4轻链CDR3 核酸
<400> 59
ctaggcgaat ttagttgtag tagtgctgat tgttttgct 39
<210> 60
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10全长重链核酸
<400> 60
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggag gatccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gattctccct cagtgactat gcaataatct gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatacatcgc aattattggt agtagtggtg acacattcta cgcgacctgg 240
gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa aatgaccagt 300
ctgacagccg cggacacggc cacctatttc tgtgccccac gttatgctgg tactactgat 360
tatcatgatg cttttgatcc ctggggccca ggcactttgg tcaccgtctc ctcagggcaa 420
cctaaggctc catcagtctt cccactggcc ccctgctgcg gggacacacc cagctccacg 480
gtgaccctgg gctgcctggt caaagggtac ctcccggagc cagtgaccgt gacctggaac 540
tcgggcaccc tcaccaatgg ggtacgcacc ttcccgtccg tccggcagtc ctcaggcctc 600
tactcgctga gcagcgtggt gagcgtgacc tcaagcagcc agcccgtcac ctgcaacgtg 660
gcccacccag ccaccaacac caaagtggac aagaccgttg cgccctcgac atgcagcaag 720
cccacgtgcc caccccctga actcctgggg ggaccgtctg tcttcatctt ccccccaaaa 780
cccaaggaca ccctcatgat ctcacgcacc cccgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840
agccaggatg accccgaggt gcagttcaca tggtacataa acaacgagca ggtgcgcacc 900
gcccggccgc cgctacggga gcagcagttc aacagcacga tccgcgtggt cagcaccctc 960
cccatcgcgc accaggactg gctgaggggc aaggagttca agtgcaaagt ccacaacaag 1020
gcactcccgg cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca gagggcagcc cctggagccg 1080
aaggtctaca ccatgggccc tccccgggag gagctgagca gcaggtcggt cagcctgacc 1140
tgcatgatca acggcttcta cccttccgac atctcggtgg agtgggagaa gaacgggaag 1200
gcagaggaca actacaagac cacgccggcc gtgctggaca gcgacggctc ctacttcctc 1260
tacagcaagc tctcagtgcc cacgagtgag tggcagcggg gcgacgtctt cacctgctcc 1320
gtgatgcacg aggccttgca caaccactac acgcagaagt ccatctcccg ctctccgggt 1380
aaatga 1386
<210> 61
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10全长轻链核酸
<400> 61
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgccg aagtagtgat gacccagact ccagcctcca tggaggcacc tatgggaggc 120
acagtcacca tcaagtgcca ggccagtcag aacatttaca actacttatc ctggtatcag 180
cagaaaccag ggcagcctcc caagctccta gtctacaagg cctccactct gacttctggg 240
gtcccgtcgc gcttcaaagg cagtggatct gggacacagt tcactctcac catcagcgac 300
ctggagtgtg ccgatgctgc cacttactac tgtcaaatca attactctat ttataatcat 360
tataatatta tttttggcgg agggaccgag gtggtcgtca agggtgatcc agttgcacct 420
actgtcctca tcttcccacc atctgctgat cttgtggcaa ctggaacagt caccatcgtg 480
tgtgtggcga ataaatactt tcccgatgtc accgtcacct gggaggtgga tggcaccacc 540
caaacaactg gcatcgagaa cagtaaaaca ccgcagaatt ctgcagattg tacctacaac 600
ctcagcagca ctctgacact gaccagcaca cagtacaaca gccacaaaga gtacacctgc 660
aaggtgaccc agggcacgac ctcagtcgtc cagagcttca ataggggtga ctgttag 717
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10重链CDR1 核酸
<400> 62
ctcagtgact atgcaataat c 21
<210> 63
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10重链CDR2 核酸
<400> 63
attattggta gtagtggtga cacattctac gcgacctggg cgaaaggc 48
<210> 64
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10重链CDR3核酸
<400> 64
cgttatgctg gtactactga ttatcatgat gcttttgatc cc 42
<210> 65
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10轻链CDR1核酸
<400> 65
agtcagaaca tttacaacta cttatcc 27
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10轻链CDR2核酸
<400> 66
aaggcctcca ctctgacttc t 21
<210> 67
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1D-37-10轻链CDR3核酸
<400> 67
caaatcaatt actctattta taatcattat aatattatt 39
<210> 68
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1全长重链核酸
<400> 68
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtgaagg agtccgaggg aggtctcttc aagccaacgg ataccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gattctccct cagtagctat ggagtgacct gggtccgcca ggctccaggg 180
aacgggctgg agtggatcgg attgattggt gatcgtggta ctacgttcta cgcgagctgg 240
gcgaaaagcc gatccaccat caccagaaac accaacctga acacggtgac tctgaaaatg 300
accaggctga cagccgcgga cacggccacc tatttctgtg cgagggggag tgggtatggt 360
gctcgcatct ggggcccagg caccctggtc accgtctcct catggcaacc taaggctcca 420
tcagtcttcc cactggcccc ctgctgcggg gacacaccca gctccacggt gaccctgggc 480
tgcctggtca aagggtacct cccggagcca gtgaccgtga cctggaactc gggcaccctc 540
accaatgggg tacgcacctt cccgtccgtc cggcagtcct caggcctcta ctcgctgagc 600
agcgtggtga gcgtgacctc aagcagccag cccgtcacct gcaacgtggc ccacccagcc 660
accaacacca aagtggacaa gaccgttgcg ccctcgacat gcagcaagcc cacgtgccca 720
ccccctgaac tcctgggggg accgtctgtc ttcatcttcc ccccaaaacc caaggacacc 780
ctcatgatct cacgcacccc cgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggatgac 840
cccgaggtgc agttcacatg gtacataaac aacgagcagg tgcgcaccgc ccggccgccg 900
ctacgggagc agcagttcaa cagcacgatc cgcgtggtca gcaccctccc catcgcgcac 960
caggactggc tgaggggcaa ggagttcaag tgcaaagtcc acaacaaggc actcccggcc 1020
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaga gggcagcccc tggagccgaa ggtctacacc 1080
atgggccctc cccgggagga gctgagcagc aggtcggtca gcctgacctg catgatcaac 1140
ggcttctacc cttccgacat ctcggtggag tgggagaaga acgggaaggc agaggacaac 1200
tacaagacca cgccggccgt gctggacagc gacggctcct acttcctcta cagcaagctc 1260
tcagtgccca cgagtgagtg gcagcggggc gacgtcttca cctgctccgt gatgcacgag 1320
gccttgcaca accactacac gcagaagtcc atctcccgct ctccgggtaa atga 1374
<210> 69
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1全长轻链核酸
<400> 69
atggacacga gggcccccac tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactcca tcgcctgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca attgccagtc cagtcagagt gtttataaga acaactactt agcctggtat 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc cttatctacg aaacatccaa actggcatct 240
ggggtcccac cgcggttcag cggcagtggg tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
agcgtgcagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtcaag gcggttatag tggtgttgat 360
tttatggctt tcggcggagg gaccgaggtg gtcgtcaaag gtgatccagt tgcacctact 420
gtcctcatct tcccaccatc tgctgatctt gtggcaactg gaacagtcac catcgtgtgt 480
gtggcgaata aatactttcc cgatgtcacc gtcacctggg aggtggatgg caccacccaa 540
acaactggca tcgagaacag taaaacaccg cagaattctg cagattgtac ctacaacctc 600
agcagcactc tgacactgac cagcacacag tacaacagcc acaaagagta cacctgcaag 660
gtgacccagg gcacgacctc agtcgtccag agcttcaata ggggtgactg ttag 714
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1重链CDR1 核酸
<400> 70
ctcagtagct atggagtgac c 21
<210> 71
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1重链CDR2 核酸
<400> 71
ttgattggtg atcgtggtac tacgttctac gcgagctggg cgaaaagc 48
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1重链CDR3 核酸
<400> 72
gggagtgggt atggtgctcg catc 24
<210> 73
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1轻链CDR1 核酸
<400> 73
agtcagagtg tttataagaa caactactta gcc 33
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1轻链CDR2 核酸
<400> 74
gaaacatcca aactggcatc t 21
<210> 75
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-26-1轻链CDR3 核酸
<400> 75
caaggcggtt atagtggtgt tgattttatg gct 33
<210> 76
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7全长重链核酸
<400> 76
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtgaagg agtccgaggg aggtctcttc aagccaacgg ataccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gattctccct cactacctat ggagtgacct gggtccgcca ggctccaggg 180
aatgggctgg agtggatcgg attgattggt gatcgcggta ccacttacta cgcgagctgg 240
gtgaatggcc gatccaccat caccagaaac accaacctga acacggtgac tctgaaaatg 300
accaggctga cagccgcgga cacggccacc tatttctgtg cgagggggag tggatatggt 360
gctcgcatct ggggcccagg caccctggtc accgtcgcct catggcaacc taaggctcca 420
tcagtcttcc cactggcccc ctgctgcggg gacacaccca gctccacggt gaccctgggc 480
tgcctggtca aagggtacct cccggagcca gtgaccgtga cctggaactc gggcaccctc 540
accaatgggg tacgcacctt cccgtccgtc cggcagtcct caggcctcta ctcgctgagc 600
agcgtggtga gcgtgacctc aagcagccag cccgtcacct gcaacgtggc ccacccagcc 660
accaacacca aagtggacaa gaccgttgcg ccctcgacat gcagcaagcc cacgtgccca 720
ccccctgaac tcctgggggg accgtctgtc ttcatcttcc ccccaaaacc caaggacacc 780
ctcatgatct cacgcacccc cgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggatgac 840
cccgaggtgc agttcacatg gtacataaac aacgagcagg tgcgcaccgc ccggccgccg 900
ctacgggagc agcagttcaa cagcacgatc cgcgtggtca gcaccctccc catcgcgcac 960
caggactggc tgaggggcaa ggagttcaag tgcaaagtcc acaacaaggc actcccggcc 1020
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaga gggcagcccc tggagccgaa ggtctacacc 1080
atgggccctc cccgggagga gctgagcagc aggtcggtca gcctgacctg catgatcaac 1140
ggcttctacc cttccgacat ctcggtggag tgggagaaga acgggaaggc agaggacaac 1200
tacaagacca cgccggccgt gctggacagc gacggctcct acttcctcta cagcaagctc 1260
tcagtgccca cgagtgagtg gcagcggggc gacgtcttca cctgctccgt gatgcacgag 1320
gccttgcaca accactacac gcagaagtcc atctcccgct ctccgggtaa atga 1374
<210> 77
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7全长轻链核酸
<400> 77
atggacacga gggcccccac tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactcca tcccccatgt ctgcagctct gggaggcaca 120
gtcaccatca attgccagtc cagtcagact gtttataaca ataactactt atcctggtat 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc cttatctacg aaacatccaa actgtcatct 240
ggggtcccac cgcggttcag cggcagtggg tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
agcgtgcagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtcaag gcggttatag tggtgttgat 360
tttatggctt tcggcggagg gaccgaggtg gtcgtcaaag gtgatccagt tgcacctact 420
gtcctcatct tcccaccatc tgctgatctt gtggcaactg gaacagtcac catcgtgtgt 480
gtggcgaata aatactttcc cgatgtcacc gtcacctggg aggtggatgg caccacccaa 540
acaactggca tcgagaacag taaaacaccg cagaattctg cagattgtac ctacaacctc 600
agcagcactc tgacactgac cagcacacag tacaacagcc acaaagagta cacctgcaag 660
gtgacccagg gcacgacctc agtcgtccag agcttcaata ggggtgactg ttag 714
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7重链CDR1 核酸
<400> 78
ctcactacct atggagtgac c 21
<210> 79
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7重链CDR2 核酸
<400> 79
ttgattggtg atcgcggtac cacttactac gcgagctggg tgaatggc 48
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7重链CDR3 核酸
<400> 80
gggagtggat atggtgctcg catc 24
<210> 81
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7轻链CDR1 核酸
<400> 81
agtcagactg tttataacaa taactactta tcc 33
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7轻链CDR2 核酸
<400> 82
gaaacatcca aactgtcatc t 21
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F-42-7轻链CDR3 核酸
<400> 83
ggcggttata gtggtgttga ttttatggct 30
<210> 84
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2全长重链核酸
<400> 84
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcgctggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gattctccct caataactac cacatatact gggtccgcca ggctccagga 180
aaggggctgg aatacatcgg aatcattttc aatggtggca catattacgc gagatggaca 240
aaaggccgat tcaccatctc caaaacctcg accacggtgg atctgaaaat gaccagtctg 300
acaaccgagg acacggccac ctatttctgt gccagagggg acggcatctg gggcccaggc 360
accctggtca ccgtctcctt agggcaacct aaggctccat cagtcttccc actggccccc 420
tgctgcgggg acacacccag ctccacggtg accctgggct gcctggtcaa agggtacctc 480
ccggagccag tgaccgtgac ctggaactcg ggcaccctca ccaatggggt acgcaccttc 540
ccgtccgtcc ggcagtcctc aggcctctac tcgctgagca gcgtggtgag cgtgacctca 600
agcagccagc ccgtcacctg caacgtggcc cacccagcca ccaacaccaa agtggacaag 660
accgttgcgc cctcgacatg cagcaagccc acgtgcccac cccctgaact cctgggggga 720
ccgtctgtct tcatcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc acgcaccccc 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc caggatgacc ccgaggtgca gttcacatgg 840
tacataaaca acgagcaggt gcgcaccgcc cggccgccgc tacgggagca gcagttcaac 900
agcacgatcc gcgtggtcag caccctcccc atcgcgcacc aggactggct gaggggcaag 960
gagttcaagt gcaaagtcca caacaaggca ctcccggccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccagag ggcagcccct ggagccgaag gtctacacca tgggccctcc ccgggaggag 1080
ctgagcagca ggtcggtcag cctgacctgc atgatcaacg gcttctaccc ttccgacatc 1140
tcggtggagt gggagaagaa cgggaaggca gaggacaact acaagaccac gccggccgtg 1200
ctggacagcg acggctccta cttcctctac agcaagctct cagtgcccac gagtgagtgg 1260
cagcggggcg acgtcttcac ctgctccgtg atgcacgagg ccttgcacaa ccactacacg 1320
cagaagtcca tctcccgctc tccgggtaaa tga 1353
<210> 85
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2全长轻链核酸
<400> 85
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactcca gcctccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtcagagt gtttttaata acaactattt agcctggtat 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaagcgc ctgatctatt ctgcatccac tctggcgtct 240
ggggtctcat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacag aattcactct gaccatgagt 300
ggcgtggagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gcagttttga ttgtaatagt 360
ggtgattgtg ttgctttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaagggtga tccagttgca 420
cctactgtcc tcatcttccc accagctgct gatcaggtgg caactggaac agtcaccatc 480
gtgtgtgtgg cgaataaata ctttcccgat gtcaccgtca cctgggaggt ggatggcacc 540
acccaaacaa ctggcatcga gaacagtaaa acaccgcaga attctgcaga ttgtacctac 600
aacctcagca gcactctgac actgaccagc acacagtaca acagccacaa agagtacacc 660
tgcaaggtga cccagggcac gacctcagtc gtccagagct tcaatagggg tgactgttag 720
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2重链CDR1 核酸
<400> 86
ctcaataact accacatata c 21
<210> 87
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2重链CDR2 核酸
<400> 87
atcattttca atggtggcac atattacgcg agatggacaa aaggc 45
<210> 88
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2重链CDR3 核酸
<400> 88
ggggacggca tc 12
<210> 89
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2轻链CDR1 核酸
<400> 89
agtcagagtg tttttaataa caactattta gcc 33
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2轻链CDR2核酸
<400> 90
tctgcatcca ctctggcgtc t 21
<210> 91
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A-5-2轻链CDR3核酸
<400> 91
gcaggcagtt ttgattgtaa tagtggtgat tgtgttgct 39
<210> 92
<211> 342
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 92
Met Ala Gln Val Leu Ile Val Gly Ala Gly Met Thr Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Ala Leu Leu Arg Arg Gln Thr Ser Gly Pro Leu Tyr Leu Ala Val
20 25 30
Trp Asp Lys Ala Asp Asp Ser Gly Gly Arg Met Thr Thr Ala Cys Ser
35 40 45
Pro His Asn Pro Gln Cys Thr Ala Asp Leu Gly Ala Gln Tyr Ile Thr
50 55 60
Cys Thr Pro His Tyr Ala Lys Lys His Gln Arg Phe Tyr Asp Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Tyr Gly Val Leu Arg Pro Leu Ser Ser Pro Ile Glu Gly Met
85 90 95
Val Met Lys Glu Gly Asp Cys Asn Phe Val Ala Pro Gln Gly Ile Ser
100 105 110
Ser Ile Ile Lys His Tyr Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Val Tyr Phe
115 120 125
Arg His Arg Val Thr Gln Ile Asn Leu Arg Asp Asp Lys Trp Glu Val
130 135 140
Ser Lys Gln Thr Gly Ser Pro Glu Gln Phe Asp Leu Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
Met Pro Val Pro Glu Ile Leu Gln Leu Gln Gly Asp Ile Thr Thr Leu
165 170 175
Ile Ser Glu Cys Gln Arg Gln Gln Leu Glu Ala Val Ser Tyr Ser Ser
180 185 190
Arg Tyr Ala Leu Gly Leu Phe Tyr Glu Ala Gly Thr Lys Ile Asp Val
195 200 205
Pro Trp Ala Gly Gln Tyr Ile Thr Ser Asn Pro Cys Ile Arg Phe Val
210 215 220
Ser Ile Asp Asn Lys Lys Arg Asn Ile Glu Ser Ser Glu Ile Gly Pro
225 230 235 240
Ser Leu Val Ile His Thr Thr Val Pro Phe Gly Val Thr Tyr Leu Glu
245 250 255
His Ser Ile Glu Asp Val Gln Glu Leu Val Phe Gln Gln Leu Glu Asn
260 265 270
Ile Leu Pro Gly Leu Pro Gln Pro Ile Ala Thr Lys Cys Gln Lys Trp
275 280 285
Arg His Ser Gln Val Thr Asn Ala Ala Ala Asn Cys Pro Gly Gln Met
290 295 300
Thr Leu His His Lys Pro Phe Leu Ala Cys Gly Gly Asp Gly Phe Thr
305 310 315 320
Gln Ser Asn Phe Asp Gly Cys Ile Thr Ser Ala Leu Cys Val Leu Glu
325 330 335
Ala Leu Lys Asn Tyr Ile
340
<210> 93
<211> 1029
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 93
atggcgcagg tgctgatcgt gggcgccggg atgacaggaa gcttgtgcgc tgcgctgctg 60
acgaggcaga cgtccggtcc cttgtacctt gctgtgtggg acaaggctga ggactcaggg 120
ggaagaatga ctacagcctg cagtcctcat aatcctcagt gcacagctga cttgggtgct 180
cagtacatca cctgcactcc tcattatgcc aaaaaacacc aacgttttta tgatgaactg 240
ttagcctatg gcgttttgag gcctctaagc tcgcctattg aaggaatggt gatgaaagaa 300
ggagactgta actttgtggc acctcaagga atttcttcaa ttattaagca ttacttgaaa 360
gaatcaggtg cagaagtcta cttcagacat cgtgtgacac agatcaacct aagagatgac 420
aaatgggaag tatccaaaca aacaggctcc cctgagcagt ttgatcttat tgttctcaca 480
atgccagttc ctgagattct gcagcttcaa ggtgacatca ccaccttaat tagtgaatgc 540
caaaggcagc aactggaggc tgtgagctac tcctctcgat atgctctggg cctcttttat 600
gaagctggta cgaagattga tgtcccttgg gctgggcagt acatcaccag taatccctgc 660
atacgcttcg tctccattga taataagaag cgcaatatag agtcatcaga aattgggcct 720
tccctcgtga ttcacaccac tgtcccattt ggagttacat acttggaaca cagcattgag 780
gatgtgcaag agttagtctt ccagcagctg gaaaacattt tgccgggttt gcctcagcca 840
attgctacca aatgccaaaa atggagacat tcacaggtta caaatgctgc tgccaactgt 900
cctggccaaa tgactctgca tcacaaacct ttccttgcat gtggagggga tggatttact 960
cagtccaact ttgatggctg catcacttct gccctatgtg ttctggaagc tttaaagaat 1020
tatatttaa 1029
<210> 94
<211> 315
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 94
Met Ala Gln Val Leu Ile Val Gly Ala Gly Met Thr Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Ala Leu Leu Arg Arg Gln Thr Ser Gly Pro Leu Tyr Leu Ala Val
20 25 30
Trp Asp Lys Ala Asp Asp Ser Gly Gly Arg Met Thr Thr Ala Cys Ser
35 40 45
Pro His Asn Pro Gln Cys Thr Ala Asp Leu Gly Ala Gln Tyr Ile Thr
50 55 60
Cys Thr Pro His Tyr Ala Lys Lys His Gln Arg Phe Tyr Asp Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Tyr Gly Val Leu Arg Pro Leu Ser Ser Pro Ile Glu Gly Met
85 90 95
Val Met Lys Glu Gly Asp Cys Asn Phe Val Ala Pro Gln Gly Ile Ser
100 105 110
Ser Ile Ile Lys His Tyr Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Val Tyr Phe
115 120 125
Arg His Arg Val Thr Gln Ile Asn Leu Arg Asp Asp Lys Trp Glu Val
130 135 140
Ser Lys Gln Thr Gly Ser Pro Glu Gln Phe Asp Leu Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
Met Pro Val Pro Glu Ile Leu Gln Leu Gln Gly Asp Ile Thr Thr Leu
165 170 175
Ile Ser Glu Cys Gln Arg Gln Gln Leu Glu Ala Val Ser Tyr Ser Ser
180 185 190
Arg Tyr Ala Leu Gly Leu Phe Tyr Glu Ala Gly Thr Lys Ile Asp Val
195 200 205
Pro Trp Ala Gly Gln Tyr Ile Thr Ser Asn Pro Cys Ile Arg Phe Val
210 215 220
Ser Ile Asp Asn Lys Lys Arg Asn Ile Glu Ser Ser Glu Ile Gly Pro
225 230 235 240
Ser Leu Val Ile His Thr Thr Val Pro Phe Gly Val Thr Tyr Leu Glu
245 250 255
His Ser Ile Glu Asp Val Gln Glu Leu Val Phe Gln Gln Leu Glu Asn
260 265 270
Ile Leu Pro Gly Leu Pro Gln Pro Ile Ala Thr Lys Cys Gln Lys Trp
275 280 285
Arg His Ser Gln Val Pro Ser Ala Gly Val Ile Leu Gly Cys Ala Lys
290 295 300
Ser Pro Trp Met Met Ala Ile Gly Phe Pro Ile
305 310 315
<210> 95
<211> 945
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 95
atggcgcagg tgctgatcgt gggcgccggg atgacaggaa gcttgtgcgc tgcgctgctg 60
acgaggcaga cgtccggtcc cttgtacctt gctgtgtggg acaaggctga ggactcaggg 120
ggaagaatga ctacagcctg cagtcctcat aatcctcagt gcacagctga cttgggtgct 180
cagtacatca cctgcactcc tcattatgcc aaaaaacacc aacgttttta tgatgaactg 240
ttagcctatg gcgttttgag gcctctaagc tcgcctattg aaggaatggt gatgaaagaa 300
ggagactgta actttgtggc acctcaagga atttcttcaa ttattaagca ttacttgaaa 360
gaatcaggtg cagaagtcta cttcagacat cgtgtgacac agatcaacct aagagatgac 420
aaatgggaag tatccaaaca aacaggctcc cctgagcagt ttgatcttat tgttctcaca 480
atgccagttc ctgagattct gcagcttcaa ggtgacatca ccaccttaat tagtgaatgc 540
caaaggcagc aactggaggc tgtgagctac tcctctcgat atgctctggg cctcttttat 600
gaagctggta cgaagattga tgtcccttgg gctgggcagt acatcaccag taatccctgc 660
atacgcttcg tctccattga taataagaag cgcaatatag agtcatcaga aattgggcct 720
tccctcgtga ttcacaccac tgtcccattt ggagttacat acttggaaca cagcattgag 780
gatgtgcaag agttagtctt ccagcagctg gaaaacattt tgccgggttt gcctcagcca 840
attgctacca aatgccaaaa atggagacat tcacaggtac caagtgctgg tgtgattcta 900
ggatgtgcga agagcccctg gatgatggcg attggatttc ccatc 945
<210> 96
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 96
Met Lys Ile Asp Val Pro Trp Ala Gly Gln Tyr Ile Thr Ser Asn Pro
1 5 10 15
Cys Ile Arg Phe Val Ser Ile Asp Asn Lys Lys Arg Asn Ile
20 25 30
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肾酶肽RP-224, Ren1或Ren2的氨基酸 224-233
<400> 97
Cys Val Ser Ile Asp Asn Lys Lys Arg Asn Ile
1 5 10
<210> 98
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 98
Cys Ile Arg Phe Val Ser Ile Asp Asn Lys Lys Arg Asn Ile Glu Ser
1 5 10 15
Ser Glu Ile Gly
20
<210> 99
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 组氨酸标记的RP-220肽
<400> 99
His His His His His His Cys Ile Arg Phe Val Ser Ile Asp Asn Lys
1 5 10 15
Lys Arg Asn Ile Glu Ser Ser Glu Ile Gly
20 25
<210> 100
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 加扰的RP-220肽
<400> 100
Cys Ser Lys Arg Ile Phe Lys Val Ile Ser Ser Ile Glu Asp Asn Asn
1 5 10 15
Glu Arg Gly
<210> 101
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 101
Ala Lys Ser Pro Trp Met Met Ala Ile Gly Phe Pro Ile
1 5 10

Claims (32)

1.一种组合物，包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段和至少一种抗PD1抗体或其结合片段。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体或其结合片段以至少10-6M的亲和力特异性结合肾酶。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗PD1抗体或其结合片段以至少10-6M的亲和力特异性结合PD1。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体特异性结合从由SEQ ID NO:1-7组成的组中选择的肽序列。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述至少一种抗体或其结合片段选自由以下各项组成的组：单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、免疫缀合物、去岩藻糖化抗体、双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体和完全人类抗体。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体包含选自由以下各项组成的组中的至少一种：a)选自于由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:19组成的组中的重链CDR1序列；b)选自于由SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:20组成的组中的重链CDR2序列；c)选自于由SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:21组成的组中的重链CDR3序列；d)选自于由SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:22组成的组中的轻链CDR1序列；e)选自于由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:23组成的组中的轻链CDR2序列；f)选自于由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:24组成的组中的轻链CDR3序列。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体包含选自由以下各项组成的组中的至少一种：a)选自于由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:35组成的组中的重链CDR1序列；b)选自于由SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:36组成的组中的重链CDR2序列；c)选自于由SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:37组成的组中的重链CDR3序列；d)选自于由SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:38组成的组中的轻链CDR1序列；e)选自于由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39组成的组中的轻链CDR2序列；f)选自于由SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:40组成的组中的轻链CDR3序列。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的多肽。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体包含选自由以下各项组成的组中的至少一种：a)重链CDR1序列SEQ ID NO:43；b)重链CDR2序列SEQ ID NO:44；c)重链CDR3序列SEQ ID NO:45；d)轻链CDR1序列SEQ ID NO:46；e)轻链CDR2序列SEQ ID NO:47；f)轻链CDR3序列SEQ ID NO:48。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的多肽。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体包含选自于由SEQ ID NO:9、17、25、33和41组成的组中的重链序列。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体包含选自于由SEQ ID NO:10、18、26、34和42组成的组中的轻链序列。
14.一种有需要的受试者中治疗或预防癌症的方法，其中，该方法包括以下步骤：向所述受试者施用包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段的组合物，和向所述受试者施用包含至少一种抗PD1抗体或其结合片段的组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段的组合物以及所述包含至少一种抗PD1抗体或其结合片段的组合物与至少一种另外的治疗剂组合向所述受试者施用。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述癌症是选自由以下各项组成的组中的至少一种：急性淋巴细胞癌症；急性髓系白血病；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，童年期；阑尾癌；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤，童年期；脑肿瘤，成人期；脑肿瘤，脑干胶质瘤，童年期；脑肿瘤，中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤，童年期；中枢神经系统胚胎性肿瘤；小脑星形细胞瘤；脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；颅咽管瘤；室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；中间分化的松果体实质瘤；幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体细胞瘤；视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；脑和脊髓肿瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；类癌瘤，胃肠道的；中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，童年期；宫颈癌；脊索瘤，童年期；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；食道癌；尤因肿瘤家族；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑色素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质瘤(gist)；生殖细胞肿瘤，颅外；生殖细胞肿瘤，性腺外；生殖细胞肿瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；神经胶质瘤，童年脑干；神经胶质瘤，童年脑星形细胞瘤；神经胶质瘤，童年视觉通路和下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌；组织细胞增生症，朗格汉斯细胞；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视觉通路神经胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；肾(肾细胞)癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；白血病，急性淋巴细胞癌症；白血病，急性髓细胞性的；白血病，慢性淋巴细胞的；白血病，慢性骨髓性的；白血病，毛细胞；唇和口腔癌；肝癌；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴瘤，艾滋病相关；淋巴瘤，伯基特；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，霍奇金；淋巴瘤，非霍奇金；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦尔登斯特伦；骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；髓母细胞瘤；黑色素瘤；黑色素瘤，眼内(眼)；梅克尔细胞癌；间皮瘤；伴隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征，(童年期)；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；霉菌病；蕈样肉芽肿；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；髓性白血病，慢性；髓性白血病，成人急性；髓性白血病，童年急性；骨髓瘤，多发；骨髓增生性疾病，慢性；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤和骨的恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，胰岛细胞瘤；乳头状瘤病；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；副神经节瘤；中间分化的松果体实质瘤；松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾盂和输尿管，移行细胞癌；涉及15号染色体上坚果基因的呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；肉瘤，尤因肿瘤家族；肉瘤，卡波西；肉瘤，软组织；肉瘤，子宫的；塞泽里综合征；皮肤癌(非黑色素瘤)；皮肤癌(黑色素瘤)；皮肤癌，梅克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌，鳞状颈癌，隐匿性原发性的，转移性的；胃(胃)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤，妊娠期；尿道癌；子宫癌，子宫内膜癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；和威尔姆斯肿瘤。
17.一种组合物，包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段和至少一种抗PD-L1抗体或其结合片段。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体或其结合片段以至少10-6M的亲和力特异性结合肾酶。
19.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述抗PD-L1抗体或其结合片段以至少10-6M的亲和力特异性结合PD-L1。
20.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体特异性结合选自SEQ ID NO:1-7的肽序列。
21.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述至少一种抗体或其结合片段选自由以下各项组成的组：单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、免疫缀合物、去岩藻糖化抗体、双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体和完全人类抗体。
22.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体包含选自由以下各项组成的组中的至少一种：a)选自于由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:19组成的组中的重链CDR1序列；b)选自于由SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:20组成的组中的重链CDR2序列；c)选自于由SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:21组成的组中的重链CDR3序列；d)选自于由SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:22组成的组中的轻链CDR1序列；e)选自于由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:23组成的组中的轻链CDR2序列；f)选自于由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:24组成的组中的轻链CDR3序列。
23.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽。
24.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体包含选自由以下各项组成的组中的至少一种：a)选自于由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:35组成的组中的重链CDR1序列；b)选自于由SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:36组成的组中的重链CDR2序列；c)选自于由SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:37组成的组中的重链CDR3序列；d)选自于由SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:38组成的组中的轻链CDR1序列；e)选自于由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39组成的组中的轻链CDR2序列；f)选自于由SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:40组成的组中的轻链CDR3序列。
25.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的多肽。
26.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体包含选自由以下各项组成的组中的至少一种：a)重链CDR1序列SEQ ID NO:43；b)重链CDR2序列SEQ ID NO:44；c)重链CDR3序列SEQ ID NO:45；d)轻链CDR1序列SEQ ID NO:46；e)轻链CDR2序列SEQ ID NO:47；f)轻链CDR3序列SEQ ID NO:48。
27.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的多肽。
28.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体包含选自于由SEQ ID NO:9、17、25、33和41组成的组中的重链序列。
29.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述抗肾酶抗体包含选自于由SEQ ID NO:10、18、26、34和42组成的组中的轻链序列。
30.一种在有需要的受试者中治疗或预防癌症的方法，其中，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段的组合物，和向所述受试者施用包含至少一种抗PD-L1抗体或其结合片段的组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述包含至少一种抗肾酶抗体或其结合片段的组合物和所述包含至少一种抗PD-L1抗体或其结合片段的组合物与至少一种另外的治疗剂组合向所述受试者施用。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述癌症是选自由以下各项组成的组中的至少一种：急性淋巴细胞癌症；急性髓系白血病；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，童年期；阑尾癌；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤，童年期；脑肿瘤，成人期；脑肿瘤，脑干胶质瘤，童年期；脑肿瘤，中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤，童年期；中枢神经系统胚胎性肿瘤；小脑星形细胞瘤；脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；颅咽管瘤；室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；中间分化的松果体实质瘤；幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体细胞瘤；视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；脑和脊髓肿瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；类癌瘤，胃肠道的；中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，童年期；宫颈癌；脊索瘤，童年期；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；食道癌；尤因肿瘤家族；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑色素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质瘤(gist)；生殖细胞肿瘤，颅外；生殖细胞肿瘤，性腺外；生殖细胞肿瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；神经胶质瘤，童年脑干；神经胶质瘤，童年脑星形细胞瘤；神经胶质瘤，童年视觉通路和下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌；组织细胞增生症，朗格汉斯细胞；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视觉通路神经胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；肾(肾细胞)癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；白血病，急性淋巴细胞癌症；白血病，急性髓细胞性的；白血病，慢性淋巴细胞的；白血病，慢性骨髓性的；白血病，毛细胞；唇和口腔癌；肝癌；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴瘤，艾滋病相关；淋巴瘤，伯基特；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，霍奇金；淋巴瘤，非霍奇金；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦尔登斯特伦；骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；髓母细胞瘤；黑色素瘤；黑色素瘤，眼内(眼)；梅克尔细胞癌；间皮瘤；伴隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征，(童年期)；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；霉菌病；蕈样肉芽肿；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；髓性白血病，慢性；髓性白血病，成人急性；髓性白血病，童年急性；骨髓瘤，多发；骨髓增生性疾病，慢性；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤和骨的恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；胰腺癌,胰岛细胞瘤；乳头状瘤病；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；副神经节瘤；中间分化的松果体实质瘤；松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾盂和输尿管，移行细胞癌；涉及15号染色体上坚果基因的呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；肉瘤，尤因肿瘤家族；肉瘤，卡波西；肉瘤，软组织；肉瘤，子宫的；塞泽里综合征；皮肤癌(非黑色素瘤)；皮肤癌(黑色素瘤)；皮肤癌，梅克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌，鳞状颈癌，隐匿性原发性的，转移性的；胃(胃)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤，妊娠期；尿道癌；子宫癌，子宫内膜癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；和威尔姆斯肿瘤。
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