JP2020510681A - 抗レナラーゼ抗体および抗pd−1抗体を用いる、がんを処置するための組成物および方法 - Google Patents
抗レナラーゼ抗体および抗pd−1抗体を用いる、がんを処置するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、2017年3月8日に出願された米国仮出願第62/468,453号に対する優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書に援用される。
他に定めがなければ、本明細書で使用されている全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。
本発明は、PD1の阻害剤と組み合わせてレナラーゼの阻害剤を使用した、がんの処置、阻害、予防または低下のための組成物および方法に関する。一実施形態では、レナラーゼの阻害剤は、抗レナラーゼ抗体またはその結合断片であり、PD1の阻害剤は、抗PD1抗体またはその結合断片である。別の実施形態では、レナラーゼの阻害剤は、抗レナラーゼ抗体またはその結合断片であり、PD1の阻害剤は、抗PD−L1抗体またはその結合断片である。
様々な実施形態では、本発明は、レナラーゼの縮小されたレベルまたは活性が望まれる疾患または障害の処置または予防における使用のための、レナラーゼ阻害剤組成物および方法ならびにPD1阻害剤組成物および方法の組み合わせを含む。本発明の組成物および方法で処置または予防することができる、PD1の縮小されたレベルまたは活性と組み合わせたレナラーゼの縮小されたレベルまたは活性が望まれる疾患または障害の一例は、がんを含む。様々な実施形態では、本発明の処置または予防のレナラーゼ阻害剤組成物および方法は、レナラーゼポリペプチドの量、レナラーゼペプチド断片の量、レナラーゼmRNAの量、レナラーゼ酵素活性の量、レナラーゼ基質結合活性の量、レナラーゼ受容体結合活性の量、またはこれらの組み合わせを縮小する。様々な実施形態では、本発明の処置または予防のPD1阻害剤組成物および方法は、PD1ポリペプチドの量、PD1 mRNAの量、PD1酵素活性の量、PD1結合活性の量、PD1受容体結合活性の量、またはこれらの組み合わせを縮小する。当業者は、PD1活性の量を縮小するための1種の仕方が、抗PD1抗体もしくはその結合断片とPD1を結合させることによる、および/または抗PD−L1抗体もしくはその結合断片とPD−L1を結合させることによるなど、PD1へのPD−L1の結合に干渉するおよび/またはこれを予防することによることを理解すると予想される。
本発明は、レナラーゼに結合する組成物を提供する。本明細書に開示されているレナラーゼ分子は、本明細書に開示されている他のポリペプチドと高いおよび/または有意な配列同一性を有する分子を含む分子のクラスである。より具体的には、推定レナラーゼは、配列番号49または51の配列を有する核酸と少なくとも約40%の配列同一性を共有する。より好ましくは、レナラーゼをコードする核酸は、本明細書に開示されている配列番号49または51と少なくとも約45%の同一性、または少なくとも約50%の同一性、または少なくとも約55%の同一性、または少なくとも約60%の同一性、または少なくとも約65%の同一性、または少なくとも約70%の同一性、または少なくとも約75%の同一性、または少なくとも約80%の同一性、または少なくとも約85%の同一性、または少なくとも約90%の同一性、または少なくとも約95%の同一性、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有する。なおより好ましくは、核酸は、配列番号49または51または93または95である。用語「レナラーゼ」は、レナラーゼアイソフォームも含む。レナラーゼ遺伝子は、ヒトゲノムの第10染色体における310188bpに及ぶ9個のエクソンを含有する。本明細書に開示されているレナラーゼクローン(配列番号49、GenBank受託番号:BC005364)は、エクソン1、2、3、4、5、6、8を含有する遺伝子である。ヒトゲノムデータベースに示す通り、レナラーゼタンパク質の少なくとも2種の追加の選択的にスプライシングされた形態が存在する。一方の選択的にスプライシングされた形態は、その配列を明確に参照により本明細書に組み込む、GenBank受託番号AK002080およびNMJ)18363としてのヒトゲノムデータベースにおけるクローンによって同定された、エクソン1、2、3、4、5、6、9を含有する。他方の選択的にスプライシングされた形態は、その配列を明確に参照により本明細書に組み込む、GenBank受託番号BX648154としてのヒトゲノムデータベースにおけるクローンによって同定された、エクソン5、6、7、8を含有する。他に断りがなければ、「レナラーゼ」は、本明細書に開示されているレナラーゼの特徴および/または物理的特色を有する、ヒトレナラーゼおよびチンパンジーレナラーゼが挙げられるがこれらに限定されない、全ての公知のレナラーゼ(例えば、ラットレナラーゼおよびヒトレナラーゼ)、および発見されるはずのレナラーゼを包含する。
本発明はさらに、ヒトレナラーゼまたはPD1またはPD−L1と結合するヒト化免疫グロブリン(または抗体)を提供する。ヒト化形態の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリン(アクセプター免疫グロブリンと命名)に実質的に由来する可変フレームワーク領域(複数可)、およびレナラーゼと特異的に結合する非ヒトmAbに実質的に由来するCDRを有する。存在するのであれば、定常領域(複数可)も、ヒト免疫グロブリンに実質的に由来する。ヒト化抗体は、少なくとも約10−6M(1マイクロM)、約10−7M(100nM)またはそれに満たない、レナラーゼに対するKDを示す。ヒト化抗体の結合親和性は、これが由来するマウス抗体のものよりも大きいまたは小さい場合がある。レナラーゼに対するヒト化抗体の親和性の変化に影響を与え、親和性を改善するために、CDR残基またはヒト残基のいずれかにおける置換を作製することができる。
一般に、本発明の処置および予防方法は、治療または予防有効量の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片および抗PD1抗体(および/または抗PD−L1抗体)またはその結合断片の組み合わせを、それを必要とする被験体に投与するステップを含む。被験体に、抗レナラーゼおよび抗PD1抗体(および/または抗PD−L1抗体)を提供する際に、投与される薬剤の投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態、以前の病歴などのような因子に応じて変動する。
オサテロン;オキサリプラチン;オキサウノマイシン;パクリタキセル;パクリタキセルアナログ;パクリタキセル誘導体;パラウアミン;パルミトイルリゾキシン;パミドロン酸;パナキシトリオール;パノミフェン(panomifene);パラバクチン;パゼリプチン(pazelliptine);ペグアスパルガーゼ;ペルデシン;ペントサンポリ硫酸ナトリウム;ペントスタチン;ペントロゾール(pentrozole);ペルフルブロン;ペルフォスファミド;ペリリルアルコール;フェナジノマイシン;フェニル酢酸塩;ホスファターゼ阻害剤;ピシバニール;ピロカルピン塩酸塩;ピラルビシン;ピリトレキシム;プラセチン(placetin)A;プラセチンB;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;白金錯体;白金化合物;白金−トリアミン錯体;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニゾン;プロピルビス−アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテアソーム阻害剤;プロテインAに基づく免疫モジュレーター;プロテインキナーゼC阻害剤;プロテインキナーゼC阻害剤、微細藻類;プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤;プルプリン;ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート;rafアンタゴニスト;ラルチトレキセド;ラモセトロン;rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;ras阻害剤;ras−GAP阻害剤;レテリプチン(retelliptine)脱メチル化;レニウムRe 186エチドロネート;リゾキシン;リボザイム;RIIレチンアミド;ログレチミド;ロヒツキン(rohitukine);ロムルチド;ロキニメックス;ルビギノンB1;ルボキシル(ruboxyl);サフィンゴール;サイントピン(saintopin);SarCNU;サルコフィトールA;サルグラモスチム;Sdi 1模倣物;セムスチン;老化由来阻害剤1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シグナル伝達モジュレーター;単鎖抗原結合タンパク質;シゾフラン(sizofuran);ソブゾキサン;ナトリウムボロカプテート(sodium borocaptate);フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロール(solverol);ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミン(sonermin);スパルフォス酸(sparfosic acid);スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン;スポンジスタチン(spongistatin)1;スクアラミン;幹細胞阻害剤;幹細胞分裂阻害剤;スチピアミド;ストロメライシン阻害剤;スルフィノシン;超活性血管作用性腸ペプチドアンタゴニスト(superactive vasoactive intestinal peptide antagonist);スラジスタ(suradista);スラミン;スウェインソニン;合成グリコサミノグリカン;タリムスチン(tallimustine);タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム;テガフール;テルラピリリウム(tellurapyrylium);テロメラーゼ阻害剤;テモポルフィン;テモゾロミド;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン;サリブラスチン(thaliblastine);チオコラリン;トロンボポエチン;トロンボポエチン模倣物;サイマルファシン;サイモポエチン受容体アゴニスト;チモトリナン(thymotrinan);甲状腺刺激ホルモン;スズエチルエチオプルプリン;チラパザミン;チタノセンビクロライド(titanocene bichloride);トプセンチン;トレミフェン;全能性幹細胞因子;翻訳阻害剤;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキセート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド(turosteride);チロシンキナーゼ阻害剤;チルホスチン;UBC阻害剤;ウベニメクス;尿生殖洞由来成長阻害性因子(urogenital sinus-derived growth inhibitory factor);ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト;バプレオチド;バリオリンB;ベクター系、赤血球遺伝子療法;ベラレソール;ベラミン(veramine);ベルジン;ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン(vinxaltine);ビタキシン(vitaxin);ボロゾール;ザノテロン(zanoterone);ゼニプラチン;ジラスコルブ(zilascorb);イミリムマブ(imilimumab);ミルタザピン;BrUOG 278;BrUOG 292;RAD0001;CT−011;folfirinox;ティピファニブ;R115777;LDE225;カルシトリオール;AZD6244;AMG 655;AMG 479;BKM120;mFOLFOX6;NC−6004;セツキシマブ;IM−C225;LGX818;MEK162;BBI608;MEDI4736;ベムラフェニブ;イピリムマブ;イボルマブ(ivolumab);ニボルマブ;パノビノスタット;レフルノミド;CEP−32496;アレムツズマブ;ベバシズマブ;オファツムマブ;パニツムマブ;ペムブロリズマブ;リツキシマブ;トラスツズマブ;STAT3阻害剤(例えば、STA−21、LLL−3、LLL12、XZH−5、S31−201、SF−1066、SF−1087、STX−0119、クリプトタンシノン、クルクミン、ジフェルロイルメタン、FLLL11、FLLL12、FLLL32、FLLL62、C3、C30、C188、C188−9、LY5、OPB−31121、ピリメタミン、OPB−51602、AZD9150など);低酸素誘導因子1(HIF−1)阻害剤(例えば、LW6、ジゴキシン、ラウレンジテルペノール、PX−478、RX−0047、ビテキシン、KC7F2、YC−1など)およびジノスタチンスチマラマーが挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、抗がん薬は、5−フルオロウラシル、タキソールまたはロイコボリンである。
本発明はまた、本発明の抗体(すなわち、抗レナラーゼおよび抗PD1(および/または抗PD−L1抗体))またはその結合断片の組み合わせと、例えば、本明細書の他の箇所に記載されている通り、治療的または予防的処置としての個体への抗体またはその結合断片の組み合わせを投与することについて記載する指導的材料とを含むキットを含む。ある実施形態では、本キットは、例えば、個体への本発明のレナラーゼ結合分子を投与することに先立つ、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせを含む治療組成物(複数可)を溶解または懸濁するために適した(好ましくは無菌の)薬学的に許容される担体をさらに含む。必要に応じて、キットは、レナラーゼ結合分子を投与するためのアプリケーターを含む。
免疫原としてペプチドを使用した。生成されたペプチドは、9〜21アミノ酸の範囲にあり、レナラーゼ−1およびレナラーゼ−2タンパク質の領域に対応した。ペプチドは全て、NまたはC末端システイン残基を有した。ペプチドの配列は、表1に見出すことができ、レナラーゼ−1または2配列に対応するこれらのペプチドは、図4の配列アライメントに示されている。示されている通り、レナラーゼ−1特異的ペプチドは、1A−Fと標識されており、レナラーゼ−2特異的ペプチドは、3A5と標識されている。各ペプチドを、システインを介してアジュバントKLHにコンジュゲートし、6匹のウサギの免疫化に使用した。各動物から収集された抗血清を、関連ペプチド(BSA−コンジュゲート)または全長レナラーゼ−1もしくは2の両方を使用したELISAアッセイによって、抗レナラーゼ抗体力価に関してスクリーニングした。抗血清は、ウエスタンブロットによって、組織ライセートにおける内在性レナラーゼを検出するその能力に関しても検査した。これらのスクリーニング判定基準を使用して、好ましい特徴を有する抗体を産生する動物を選択した。一部の例では、また、一部のペプチドのため、数匹の動物が、要求される特異性を有する抗体を産生した。これらの場合、1匹の動物に、ポリクローナル抗体産生のために最終抗血清出血させ、他の1匹または一部の例では2匹の動物を使用して、脾臓リンパ球を回収した。他の例では、単一の動物に終末出血させ、脾摘出術を行った。プロテインGクロマトグラフィーによる終末出血からの総IgGの精製の後、ペプチド親和性クロマトグラフィーにおけるさらなる精製によって、全てのペプチドに対して作製されたポリクローナル抗体を生成した。さらに、標準手順を使用して、選択された動物の脾臓由来のリンパ球を、ハイブリドーマ生成のために骨髄腫細胞に融合させた。ハイブリドーマ上清を、これらが作製されたペプチドの両方への結合に関してスクリーニングし、レナラーゼタンパク質全体に対して二次的にスクリーニングした。抗体精製のため、選択されたハイブリドーマをサブクローニングし、増やした。馴化されたハイブリドーマ培養上清から、プロテインA親和性クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製した。
Biacore T100を使用して結合研究を行った。ランニングバッファーとして25mM Tris pH8、150mM NaCl、1mM EDTA、10%グリセロール、0.005%Tween−20および0.1mg/mL BSAを使用して、25℃で結合研究を行った。ビオチン化抗体を、下に示す通り、個々のストレプトアビジンセンサーチップフローセルに捕捉した。研究は、2個のセンサーチップを採用したため、第2のセンサーチップにおけるmAbの2種の解析を反復して、より多くのデータを集めた。レナラーゼ−1は、3倍希釈系列における最高濃度として、50nMで検査した。5種の濃度のそれぞれを2連で検査した。1/1000リン酸の短い瞬間適用(short pulse)により、結合した複合体を再生した。データセットをグローバルフィットして、表2に要約されている結合定数の推定値を抽出した。
モノクローナル抗体1D−28−4、1D−37−10、1F−26−1、1F−42−7および3A−5−2を、そのレナラーゼ結合特異性および高い親和性のために選択した。標準ポリメラーゼ連鎖反応手順および縮重プライマーセットを使用して、サブクローニングされたハイブリドーマから、これらの抗体の抗体重および軽鎖可変領域のcDNAを増幅した。1D−28−4(RP−220)の可変領域ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図5に示す。このようにして、好ましい特徴を有する抗体の組成を例証する。
レナラーゼ発現は、いくつかのがん細胞株において上方調節されるため(図6)、実験を行って、レナラーゼが、がん細胞に生存利点をもたらしたか否かを決定した。レナラーゼ発現が、正常皮膚と比較して、母斑および転移性メラノーマにおいて著しく増加したことが見出され(図7)、レナラーゼが、メラニン形成細胞に生存利点をもたらしたことを示唆する。加えて、RenMonoAb1(RP−220に対して作製されたモノクローナル)は、A375.S2(変異体B−Raf(V600E)を有するメラノーマ細胞株)の生存度を低下させることにおいて高度に有効であり、メラノーマに対して活性な2種のアルキル化剤:テモゾロミド(図8)およびダカルバジン(図9)との相乗作用を呈した。RenMonoAb1は、メラノーマ細胞株Sk−Mel−28(変異体B−Raf(V600E)および野生型N−Rasを発現)の生存度を低下させることにおいても有効であり、テモゾロミドとの相乗作用を示した(図10)。
イェール大学の発見および転移シリーズ(Yale discovery and metastatic series)(最大30年間追跡した263名の患者)から得られた原発性および転移性腫瘍試料におけるレナラーゼの発現を試験した。抗S−100および抗gp100の両方による標識化によって定義された区画内の標的抗原発現が決定される方法である、自動定量的解析(AQUA)技術(Gouldら、2009年、Journal of Clinical Oncology、27巻:5772〜5780頁)を使用して、蛍光に基づく免疫組織化学的染色を行った。メラノーマ組織におけるレナラーゼ発現上昇が、疾患特異的死亡率の大幅な増加に関連したことが見出され(図16)、レナラーゼの作用の阻害が、この疾患における有用な治療選択肢であり得ることを示唆する。
RNLSは、MAPKおよびPI3K経路に関与する生存因子として機能するため、また、その発現は、STAT3によって調節されるため(Sonawaneら、2014年、Biochemistry.53巻(44号):6878〜6892頁)、問題は、RNLS発現およびシグナル伝達が、がん細胞に生存利点をもたらすかということである。MAPK、PI3KおよびJAK/STAT経路が異常に調節され、追加の治療標的が望ましいと思われる障害であるメラノーマに焦点が置かれる。
ヒトメラノーマ細胞株A375.S2、SkMel28、SkMel5、MeWoおよびWM266−4をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から得て、推奨される通りに維持した。記載されている通りに、組換えヒトRNLSを発現させ、精製し、濃縮し、PBSに対して透析した(Desirら、Journal of the American Heart Association.2012年;1巻:e002634頁)。RNLSペプチドRP220および変異したペプチドRP220AをUnited Peptideで合成した。ウサギ抗RNLSモノクローナル抗体(AB178700)、ヤギポリクローナル抗RNLS抗体(AB31291)、ヤギIgGおよびウサギIgGは、Abcamから購入した。
RNLSペプチドRP−220をKLHにコンジュゲートし、6匹のウサギの免疫化に使用し、選択された動物の脾臓由来のリンパ球を、ハイブリドーマ生成のために骨髄腫細胞に融合させた。ハイブリドーマ上清をrRNLSに対してスクリーニングし、選択されたハイブリドーマを、抗体精製のためにクローニングし、増やした。馴化されたハイブリドーマ培養上清から、プロテインA親和性クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製した。
ヒトメラノーマcDNAアレイIおよびIIをOriGene Technologies(Rockville、MD、USA)から得た。関連病理報告は、オンラインで利用できる:http://www.origene.com/assets/documents/TissueScan。US Biomax(Rockville、MD、USA)から得たヒトメラノーマおよび正常皮膚組織試料を、免疫組織化学または免疫蛍光に使用した。
以前に記載された通りに、様々な遺伝子の相対的発現レベルをqRT−PCRによって評価した(Leeら、2013年、J Am Soc Nephrol.24巻:445〜55頁)。TaqMan遺伝子発現リアルタイムPCRアッセイ(Applied Biosystems、Carlsbad、CA、USA)を使用して、RNLS、2’−5’−オリゴアデニル酸シンテターゼ1(OAS1)、β−アクチンおよび18s rRNAのmRNAレベルを評価した。結果は、閾値サイクル(Ct)として表現した。内在性対照18s rRNAまたはβ−アクチンに対して正規化された標的転写物の相対的定量化を、比較Ct方法(ΔCt)によって決定し、製造業者のプロトコール(ユーザー会報番号2、Applied Biosystems)に従って、2−ΔΔCt方法を使用して、被験細胞株間の遺伝子発現の相対的変化を解析した。
以前に記載された通りに免疫組織化学を行った(Guoら、2012年、Cancer science.103巻:1474〜80頁)。簡潔に説明すると、腫瘍組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、スライドグラス上で5μm切片にカットした。スライドを脱パラフィンし、水分添加した後、10mMクエン酸ナトリウム、pH6バッファーを含有する圧力釜において抗原回復を行った。切片を3%過酸化水素において30分間、PBS/0.1%Tween20中2.5%正常ウマ血清において1時間ブロッキングした後、一次抗体およびアイソタイプ対照IgGと共に一晩4℃でインキュベートした。本研究において以下の抗体を使用した:m28−RNLS、500ng/ml;ヤギポリクローナル抗RNLS、250ng/ml(Abcam、ab31291);ウサギモノクローナル抗CD68(BDBioscience、1:100);ウサギモノクローナル抗CD163(AbD Serotec、1:100);ウサギモノクローナル抗CD86(Abcam、1:100);ウサギモノクローナル抗Ki67(Vector Lab、VP−RM04、1:100);ウサギモノクローナル抗p21、ホスホ−Tyr705−Stat3および総Stat3(Cell Signaling Technologies、それぞれ#2947、1:100、#9145、1:400および#4904、1:400)。ImmPRESSペルオキシダーゼ−抗ウサギIgG(Vector Laboratories、Burlingame、CA、USA)を使用して、一次抗体を検出した。Vector DAB基質キットを使用して発色させ、ヘマトキシリン(Vector Laboratories)で対比染色した。Olympus BX41顕微鏡およびカメラ(Olympus America Inc、Center Valley、PA、USA)を使用して、スライドを観察および撮影した。
メラノーマ組織マイクロアレイは、US BioMax,Inc.およびイェール大学組織病理サービスから購入した。本研究は、イェール大学医学部の人体研究倫理委員会(Human Investigation Committee of Yale University School of Medicine)(HICプロトコール番号1003006479)によって承認された。以前に記載された通りにイェール大学メラノーマ組織マイクロアレイを構築した(Bergerら、2003年、Cancer research.63巻:8103〜7頁;Rimmら、2001年、Cancer journal.7巻:24〜31頁)。542種の総メラノーマ症例を表す総計570種の組織コアおよび0.6mmの寸法の小さい一連の対照を、単一のスライドグラス上に0.8mm離れた間隔をあけて置いた。イェール大学医学部病理学科のアーカイブから得た、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織ブロックからコホートを構築した。病理学者は、各症例を試験して、組織マイクロアレイにおける組み入れのための領域を選択した。標本由来のコア生検材料を、Tissue Micorarrayer(Beecher Instruments、Sun Prairie、WI)を用いて組織マイクロアレイに置いた。次いで、組織マイクロアレイを5um切片にカットし、UV架橋による粘着テープ移行システム(Instumedics,Inc.、Hackensack、NJ)を有するスライドグラスに置いた。2ヶ月間〜38年間(メジアンの経過観察時間、60ヶ月間)の経過観察範囲により、1959年〜1994年の間に切除された腫瘍のアーカイブから標本を全て引き出した。コホート特徴は、以前に記載されている(Bergerら、2004年、Cancer research.64巻:8767〜72頁)。
総細胞数および生細胞のパーセンテージをトリパンブルー排除によって評価し、BioRad TC10自動細胞計数器を使用して細胞を計数した。追加の研究のため、製造業者の指示に従ってWST−1試薬(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN、USA)を使用して細胞生存度を決定した。マイクロプレートリーダー(Power Waves XS、BioTek Instruments、Winooski、VT、USA)を使用して吸光度を読み取った。
RNLSを標的とする4種の個々のsiRNAおよびsiRNA SMARTプールは、Dharmacon(Lafayette、CO、USA)から購入した。製造業者によって指示される通りにDharmaFECT 4試薬(Dharmacon)を使用して、細胞に、RNLS siRNAまたはユニバーサル陰性対照低分子干渉RNA(対照siRNA、Dharmacon)をトランスフェクトした。qPCRによってノックダウン効率を決定した。
18〜20gの雌胸腺欠損ヌードマウス(nu/nu)を、Charles River(Willimantic、CT)から得て、12時間の明/暗周期による、特定の病原体を含まない施設におけるオートクレーブした寝床を備えるマイクロアイソレーターケージに収容した。動物に、水および食物を自由に与え、VACHS IACUCによって承認された研究プロトコールに従って、腫瘍成長の徴候、活動性、採餌および疼痛に関して観察した。
ウィルコクソン順位和検定およびマン−ホイットニーのU検定を、それぞれ対形成したおよび対形成していないデータのために使用した。ノンパラメトリック反復処理に適切な場合、ANOVA(フリードマン検定)を使用して、統計的有意性を評価した。フリードマン検定が、統計的有意性を明らかにした場合、ダンの検定をペアワイズ比較のために使用した。カプラン−マイヤー生存解析および多変量Cox回帰解析も実行した。全データは、平均±平均の標準誤差(平均±SEM)であり、統計的有意差としてP<0.05の値が許容された。SPSS(登録商標)ソフトウェア、バージョン21.0(SPSS Inc.、Chicago、IL、USA)を使用して組織アレイデータの統計解析を行った。
RNLS発現が、正常ヒト皮膚および悪性メラノーマの間で異なるかどうかを決定するために、正常皮膚から良性母斑から原発性および転移性メラノーマの進行に及ぶ、組織マイクロアレイ(TMA;イェール大学組織マイクロアレイ施設およびUS Biomax,Inc.)を試験した。Yale TMAは、1959年〜1994年の間に収集された192種の原発性メラノーマのコホート、1997年〜2004年に収集された246種の系列原発性および転移性メラノーマのコホート、295名の良性母斑患者のコホート、ならび15名の患者に由来するマッチした正常皮膚標本から得た、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した標本を含有した。これらの組織マイクロアレイの人口統計学および臨床特徴は、以前に記載されている(Gould Rothbergら、2009年、Journal of clinical oncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology.27巻:5772〜80頁)。US Biomaxアレイは、35種の原発性メラノーマ、11種の転移性病変、14種の良性母斑および14種の正常試料を含む74種の標本を含有した。定量的自動免疫蛍光(IF)顕微鏡システム(AQUA)を使用した、RNLSタンパク質発現のためのおよそ600種のヒストスポット(histospot)の試験は、正常皮膚から良性母斑から原発性悪性メラノーマから転移性メラノーマへの進行が、RNLS発現の大幅な増加を伴うことを明らかにした(それぞれp=0.009、p=0.0003およびp<0.001、図17A〜C)。
RNLS媒介性シグナル伝達は、抗アポトーシス性であり、毒性ストレスに曝露された正常細胞をアポトーシス死から保護する(Wangら、2014年、J Am Soc Nephrol.;Leeら、2013年、J Am Soc Nephrol.24巻:445〜55頁)。RNLSシグナル伝達が、がん細胞の生存を支持したか探索するために、組換えRNLS(rRNLS)またはウシ血清アルブミン(BSA)のいずれかを、培養中の血清飢餓状態にされたメラノーマ細胞(A375.S2、MeWo、SkMel5およびSkMel28)に添加し、細胞生存度を決定した。BSAと比較して、RNLSは、血清飢餓状態にされた細胞の生存を著しく増加させ、WST−1アッセイによって測定される増殖速度の見かけの増加を引き起こした(n=6、p<0.05、図18A)。RNLSで処置された細胞の総細胞数および生細胞のパーセンテージを計数して、増殖速度の見かけの増加が、細胞増殖の増加またはアポトーシスの速度の減少によるものであったかを決定した。図18Bに示す通り、RNLSによる処置は、BSAで処置した細胞と比較して、増加した細胞計数および増加した生細胞のパーセンテージを示し、RNLSが、抗アポトーシス生存因子として機能することを示唆する。
メラノーマにおけるRNLS発現およびシグナル伝達を阻害する機能的帰結を決定するための3種のアプローチを使用した。第一に、細胞生存度に対するRNLS発現減少の効果を評価した。siRNAによるRNLSノックダウンは、メラノーマ細胞株A375.S2およびSkMel28の生存度を著しく低下させた(それぞれp=0.03およびp=0.003、図19A)。第二に、RNLSペプチドRP−220は、rRNLSの保護効果およびシグナル伝達特性を模倣するため、これが、細胞外RNLSに対する受容体の決定的な領域と相互作用する可能性が高く、これに対する抗体が、阻害特性を有し得ると判断された。したがって、RP−220に対するモノクローナル抗体のパネルを開発し、がん細胞生存に対するこれらの効果を検査した。RNLSに対して生成された2種のモノクローナル抗体[クローン#28−4(m28−RNLS)、37−10(m37−RNLS)]は、検査した全(総計5種の)メラノーマ細胞株の生存度を減少させ、代表例を図19B〜Cに示す。m28−RNLSは、処置濃度増加と相関した細胞傷害性のレベル増加を実証した(p<0.05、図19B)。第三に、RP−220の正味の電荷を減少させることにより(3個のリシン/アルギニンをアラニンに変化、図19D)、ペプチドアンタゴニスト(RP−220A)を生成した。RP220Aは、RNLS依存性シグナル伝達を媒介しないが、PMCA4bに結合し、内在性RNLSの作用をアンタゴナイズする(Wangら、2015年、PLoS ONE.10巻:e0122932頁)。RP−220Aは、培養中のメラノーマ細胞にとって、漸増用量において細胞傷害性であることが判明した(p<0.005、図19D)。
A375.S2(ヒトメラノーマ)細胞を、胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射して、腫瘍を生成した。腫瘍が、ほぼ50mm3の体積に達したら、次いで、対照ウサギIgGまたはRNLS中和モノクローナル抗体、m28−RNLSのいずれかで動物を処置した。全体的な動物の健康および活動性は、研究を通して維持されたため、抗体処置は、毒性であるとは思われなかった。腫瘍サイズを1日おきに測定し、m28−RNLSによる処置は、検査した全てのポイントにおいて腫瘍体積を減少させた(p<0.05、図20A)。一部の動物において全体的腫瘍サイズおよび潰瘍化のために11日目に動物を屠殺した。細胞増殖マーカーKi67による異種移植腫瘍由来の切片のIHC染色は、抗RNLS抗体で処置した腫瘍内の、ウサギIgGで処置した腫瘍と比べて細胞増殖の大幅な減少を明らかにした:対照群における35.1±2.3陽性細胞/高倍率視野 対 RNLS Ab処置群における13.4±3.0、n=14、p=0.0004(図20B)。
STAT3は、RNLS遺伝子のプロモーター領域に結合し、その発現を増加させることが公知であり、正のRNLS−STAT3フィードバックループが示唆されている(Sonawaneら、2014年、Biochemistry.53巻(44号):6878〜6892頁)。免疫蛍光組織染色、ならびに対照IgGおよびm28−RNLSで処置した異種移植腫瘍由来の細胞ライセートの研究により、この関係性をさらに調査した。リン酸化および総STAT3とRNLSの顕著な同時発現が、IFによって評価される通り、腫瘍試料において認められた(図21A)。m28−RNLSによる処置は、RNLSタンパク質発現の、ならびに総およびリン酸化STAT3の両方の劇的な低下を引き起こした(図21A)。図21B〜Cに示す通り、ウエスタンブロットによりタンパク質発現の変化が確認された。m28−RNLSで処置した腫瘍において、チロシン705におけるSTAT3リン酸化(p−Y705−STAT3)および総STAT3は、大幅に減少した(n=8、p<0.005、図21B〜C)。
RNLSおよびメラニン形成細胞染色の間に認められる重複は最小であるため、メラニン形成細胞は、メラノーマヒストスポットにおけるRNLSの主な供給源であるとは思われなかった(図17A)。メラノーマは、多くの場合、マクロファージを含む免疫細胞の顕著な浸潤を有する。浸潤マクロファージは、汎マクロファージマーカーCD68と大幅に重複した、各ヒストスポットに認められるRNLS染色の実質的構成成分として大部分の腫瘍RNLSに寄与すると思われた(図22A上パネル)。さらなる調査の際に、RNLSが、CD163+(M2様)TAMと主に同時発現されたことが決定された(図22A、中央パネル)。CD86+(M1様)マクロファージとのRNLSの同時発現は、最小であった(図22A、下パネル)。M2様(CD163+)マクロファージは、免疫回避と関連し、がん発症および拡散を促進することが示される一方、M1様(CD86+)マクロファージは典型的に炎症促進性であり、腫瘍成長を阻害する(Biswasら、2010年、Nat Immunol.11巻:889〜96頁;Mantovaniら、Trends in Immunology.23巻:549〜55頁)。m28−RNLS抗体による異種移植片の処置は、CD163+ TMAの数の相当な減少をもたらし、残っている細胞は、検出可能なレベルのRNLSを発現しなかった(図22B)。
RNLSは、膵がんにおいて障害されているMAPKおよびPI3K経路に関与する生存因子として機能するため、また、その発現は、シグナル伝達性転写因子STAT3によって調節されるため(Sonawaneら、2014年、Biochemistry.53巻(44号):6878〜6892頁)、RNLS発現およびシグナル伝達の異常調節が、がん細胞に生存利点をもたらし、腫瘍形成を促進し得ることが仮定された(Guoら、2014年、Curr Opin Nephrol Hypertens.23巻(5号):513〜8頁)。
ヒト管膵腺癌細胞株BxPC−3、Panc1およびMiaPaCa−2をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)(Manassas、VA、USA)から得て、推奨される通りに維持した。p38およびSTAT3遮断薬SB203580およびStatticは、Abcam(Cambridge、UK)から購入した。JNK阻害剤SP600125およびERK阻害剤U0126は、それぞれSigma Aldrich(St.Louis、MO、USA)およびCell Signaling Technologies(Beverly MA、USA)から得た。以前に記載された通りに、組換えヒトRNLS(rRNLS)を発現させ、精製し、濃縮し、PBSに対して透析した(Desirら、2012年、J Am Heart Assoc.1巻(4号):e002634頁)。ウサギ抗RNLSモノクローナル(AB178700)、ヤギポリクローナル抗RNLS(AB31291)、ヤギIgGおよびウサギIgGは、Abcamから購入した。
RNLSペプチドRP−220をKLHにコンジュゲートし、6匹のウサギの免疫化に使用し、選択された動物の脾臓由来のリンパ球を、ハイブリドーマ生成のために骨髄腫細胞に融合させた。ハイブリドーマ上清をrRNLSに対してスクリーニングし、選択されたハイブリドーマを、抗体精製のためにクローニングし、増やした。馴化されたハイブリドーマ培養上清から、プロテインA親和性クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製した。
OriGene Technologies(Rockville、MD、USA)からヒトがんcDNAアレイ(Screen cDNA Arrays IおよびII、膵がんcDNAアレイ)を得た。関連病理報告は、オンラインで利用できる:www.origene.com/assets/documents/TissueScan。US Biomax(Rockville、MD、USA)から得たヒト膵がんおよび正常組織試料を、免疫組織化学または免疫蛍光に使用した。
様々な遺伝子の相対的発現レベルをqPCRによって評価した。TaqMan遺伝子発現リアルタイムPCRアッセイ(Applied Biosystems、Carlsbad、CA、USA)を使用して、RNLS、2’−5’−オリゴアデニル酸シンテターゼ1(OAS1)、β−アクチンおよび18s rRNAのmRNAレベルを評価した。結果は、閾値サイクル(Ct)として表現した。内在性対照18s rRNAまたはβ−アクチンに対して正規化された標的転写物の相対的定量化は、比較Ct方法(ΔCt)によって決定し、製造業者のプロトコール(ユーザー会報番号2、Applied Biosystems)に従って、2−ΔΔCt方法を使用して、被験細胞株間の遺伝子発現の相対的変化を解析した。
以前に記載された通りに免疫組織化学を行った(Guoら、2012年、Cancer Science.103巻(8号):1474〜80頁)。簡潔に説明すると、腫瘍組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、スライドグラス上で5μm切片にカットした。スライドを脱パラフィンし、水分添加した後、10mMクエン酸ナトリウム、pH6バッファーを含有する圧力釜において抗原回復を行った。切片を3%過酸化水素において30分間、PBS/0.1%Tween20中2.5%正常ウマ血清において1時間ブロッキングした後、一次抗体およびアイソタイプ対照IgGと共に一晩4℃でインキュベートした。本研究において以下の抗体を使用した:m28−RNLS、500ng/ml;ヤギポリクローナル抗RNLS、250ng/ml(Abcam、AB31291);ウサギモノクローナル抗Ki67(Vector Lab、VP−RM04、1:100);ウサギモノクローナル抗p21およびホスホ−Tyr705−Stat3(Cell Signaling Technologies、それぞれ#2947、1:100および#9145、1:400)。ImmPRESSペルオキシダーゼ−抗ウサギIgG(Vector Laboratories、Burlingame、CA、USA)を使用して、一次抗体を検出した。Vector DAB基質キットを使用して発色させ、ヘマトキシリン(Vector Laboratories)で対比染色した。Olympus BX41顕微鏡およびカメラ(Olympus America Inc、Center Valley、PA、USA)を使用して、スライドを観察および撮影した。
膵臓組織マイクロアレイは、US BioMaxから購入した。以前に記載された通りに組織マイクロアレイスライドを染色した(Nicholsonら、2014年、Journal of the American College of Surgeons.219巻(5号):977〜87頁)。手短に言えば、標本は、m28−RNLSおよびマウスモノクローナル汎サイトケラチン抗体(1:100、DAKO M3515)で4℃にて一晩共染色した。二次抗体Alexa 488コンジュゲートヤギ抗マウス(1:100、Molecular Probes、Eugene、OR)およびEnvision抗ウサギ(DAKO)を1時間室温で適用した。スライドをTris緩衝食塩水で洗浄し(5分間を3回)、Cy5−チラミド(Perkin−Elmer Life Science Products、Boston、MA)と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼによって活性化した。Cy5は、その発光ピーク(赤色)が組織自家蛍光の緑色−橙色スペクトルの外側にあるため使用した。4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドールを含有するProlong Gold退色防止試薬によりカバーガラスでスライドを封着して、核の可視化を容易にした。
トリパンブルー排除によって細胞生存度を評価し、BioRad TC10自動計数器を使用して細胞を計数した。一部の研究のため、細胞生存度を、以前に記載された通りにWST−1試薬(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN、USA)を使用して決定した(Wangら、2014年、Journal of the American Society of Nephrology.、DOI:10.1681/asn.2013060665)。
細胞周期解析のため、培養細胞を、10mM EDTAを使用して解離し、氷冷70%エタノールで固定し、RNAse Aで消化し、ヨウ化プロピジウムで染色した。プロピジウム染色を、BD FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences、San Jose、CA、USA)を使用して検出し、CellQuestソフトウェアを使用して解析した。
RNLSを標的とする4種の個々のsiRNAおよびsiRNA SMARTプールは、Dharmacon(Lafayette、CO、USA)から購入した。製造業者によって示唆される通りにDharmaFECT 4試薬(Dharmacon)を使用して、細胞に、RNLS siRNAまたはユニバーサル陰性対照siRNA(対照siRNA、Dharmacon)をトランスフェクトした。
18〜20gの雌胸腺欠損ヌードマウス(nu/nu)をCharles River(Willimantic、CT)から得て、12時間の明/暗周期で、特定の病原体を含まない施設におけるオートクレーブした寝床を備えるマイクロアイソレーターケージに収容した。動物に、水および食物を自由に与え、VACHS IACUCによって承認された研究プロトコールに従って、腫瘍成長の徴候、活動性、採餌および疼痛に関して観察した。
ウィルコクソン順位検定およびマン−ホイットニー検定は、それぞれ対形成したおよび対形成していないデータのために使用した。適切であれば、ノンパラメトリック反復処理ANOVA(フリードマン検定)を使用して、統計的有意性を評価した。フリードマン検定が、統計的有意性を明らかにした場合、ダンの検定をペアワイズ比較のために使用した。全データは、平均±平均の標準誤差(平均±SEM)であり、統計的有意差としてP<0.05の値が許容された。SPSS(登録商標)ソフトウェア、バージョン21.0(SPSS Inc.、Chicago、IL、USA)を使用して、組織アレイデータの統計解析を行った。
RNLS発現が、正常およびがん組織の間で異なるかどうかを決定するために、定量的PCR(qPCR)を使用して市販のヒト組織cDNAアレイをスクリーニングすることにより、15種の異なる種類のがんを試験した。RNLS発現は、膵臓、膀胱および乳房のがんならびにメラノーマにおいて大幅に増加された(図23A)。その特に不十分な生存および限定的な治療選択肢のため、膵新生物に焦点を置いた。RNLS発現は、PDAC(ほぼ3倍)および膵神経内分泌(8倍)腫瘍の両方において上昇された(図23B)。抗RNLSモノクローナルm28−RNLSを使用した免疫細胞化学的研究は、図23Cおよび図28)に示す通り、RNLS発現が、PDACグレード1〜4に存在し、がん細胞に主に局在化されたことを示した。大部分のRNLSは、がん細胞における細胞質分布を有すると思われた;これは、全ての腫瘍グレードに存在したが、より分化したがん(グレードI〜III)において最も明らかであった。膵臓の神経内分泌腫瘍において、RNLSは、腫瘍の至るところの細胞において発現された(図29)。RNLS遺伝子発現は、KRAS変異を有する膵管腺癌細胞(PDACC)株(MiaPaCa2およびPanc1)において、BxPC3などの野生型KRASを有する株よりも高かった(図30)。
RNLS媒介性シグナル伝達は、毒性ストレスに曝露されたHK−2細胞をアポトーシスから保護する(Leeら、2013年、J Am Soc Nephrol.24巻(3号):445〜55頁;Wangら、2014年、Journal of the American Society of Nephrology.、DOI:10.1681/asn.2013060665)。RNLSシグナル伝達が、ストレスに曝露された膵管腺癌細胞(PDACC)に生存利点をもたらしたか探索するために、培養BxPC3、Panc1およびMiaPaCa2細胞から血清を48時間取り除き、組換えRNLS(rRNLS)またはウシ血清アルブミン(BSA)のいずれかを培養培地にさらに72時間添加した;総および生(トリパンブルー排除)細胞計数を決定した。BSAと比較して、rRNLSは、PDACC生存率を2〜5倍増加させた(図24A)。
膵がん細胞におけるRNLS発現およびシグナル伝達阻害の機能的帰結を決定するために、siRNAによるRNLSノックダウンによって、in vitroでの細胞生存度に対するRNLS発現減少の効果を評価した。この処置は、PDACC株Panc1およびMiaPaCa2の生存度を著しく低下させた(図25Aおよび31)。RNLSペプチドRP−220は、rRNLSの保護効果およびシグナル伝達特性を模倣するため、これが、細胞外RNLSに対する受容体の決定的な領域と相互作用する可能性が高く、これに対して生成された抗体が阻害性であり得ると判断された。RP−220に対してウサギにおいて生成されたモノクローナル抗体のパネルから、2種のクローン、m28−RNLS、m37−RNLSを、それらの高い結合親和性(それぞれ0.316および2.67nMのKD)に基づき選択した。PDACC成長に対するm28−RNLS、m37−RNLSおよび市販のポリクローナル(RP−220の部分的配列に対する)の阻害性効果は、図25Bおよび25Cにおいて描写される代表例によって示されている。培養細胞におけるこれらの研究は、RNLSが、自己分泌/パラ分泌経路を介して作用して、PDACC成長を刺激することができることを示唆する。
RNLSレベルを低下させるために、ウサギIgGまたはm28−RNLSのいずれかで処置したマウス由来のBxPC3異種移植腫瘍の切片は、抗体処置腫瘍におけるアポトーシス(TUNEL染色)のほぼ2倍増加を明らかにした(図26A):m28−RNLS 対 IgG;28.4±3.3陽性細胞/高倍率視野 対 IgG−14.8±2.3、n=14、p=0.002。培養中のPanc1細胞のFACS解析は、m28−RNLSがアポトーシスを引き起こしたことを確認した(図26Bおよび33)。m28−RNLS抗体による処置は、処置後1日目から始まるp38 MAPKの持続したリン酸化を引き起こした(図26C)。
STAT3は、RNLS遺伝子のプロモーター領域に結合し、その発現を増加させる(Sonawaneら、2014年、Biochemistry.53巻(44号):6878〜6892頁)。正のRNLS−STAT3フィードバックループは、RNLSで処置したHK−2細胞において、セリン727(p−Ser727−STAT3)およびチロシン705(p−Y705−STAT3)におけるSTAT3リン酸化が、それぞれ2および4倍増加するが、STAT1は影響を受けないことの観察によって示唆される(図34)。図27A〜Bに描写される通り、PDACC株Panc1へのRNLSの添加は、リン酸化STAT3(p−Ser727−STAT3およびp−Y705−STAT3)の急速増加を引き起こした。RNLS−STAT3フィードバックループのための追加の支持は、m28−RNLSによるPanc1におけるRNLSシグナル伝達の阻害が、p−Y705−STAT3の長続きするおよび持続した減少をもたらすという知見によって提供される(図27C〜D)。
実験を行って、抗PD1薬剤に対して抵抗性である腫瘍細胞株(すなわち、YUMM)に対する抗RNLS抗体および抗PD1抗体の間の相乗作用を評価した(図35)。抗PD1抵抗性マウスメラノーマ細胞株(YUMM)を、免疫応答性C57B6マウスに生着させた。生着されたYUMM腫瘍体積が、約100mm3に達した後(すなわち、0日目)、図23の矢印によって示される通り、0、7、9および12日目に処置を投与した。図35に示す通り、抗RNLS抗体(m28;15μg、30μgまたは60μg)および抗PD1抗体(120μg)の組み合わせによる処置は、抗RNLS抗体(60μg)単独または抗PD1抗体(120μg)単独のいずれかよりも高い程度まで腫瘍成長を低下させた。
<配列番号1−抗原seq1a;PRT;Homo sapiens>
<配列番号2−抗原seq1b;PRT;Homo sapiens>
<配列番号3−抗原seq1c;PRT;Homo sapiens>
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<配列番号8−Huレナラーゼ−1タンパク質(37位にグルタミン酸のアミノ酸をもたらす多型);PRT;Homo sapiens>
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<配列番号91−3A−5−2軽鎖CDR3核酸;DNA;Oryctolagus cuniculus>
<配列番号92−代替ヒトレナラーゼ−1タンパク質(37位にアスパラギン酸のアミノ酸をもたらす多型;PRT;Homo sapiens>
<配列番号93−代替ヒトレナラーゼ−1核酸配列(注記:ヌクレオチド111位における可能な多型;DNA;Homo sapiens>
<配列番号94−代替ヒトレナラーゼ−2アミノ酸配列(37位にアスパラギン酸のアミノ酸をもたらす多型;PRT;Homo sapiens>
<配列番号95−代替ヒトレナラーゼ−2核酸配列(注記:ヌクレオチド111位における可能な多型;DNA;Homo sapiens>
<配列番号96−Ren−7ペプチド;PRT;Homo sapiens>
<配列番号97−Rp−224;PRT;Homo sapiens>
<配列番号98−RP−220;PRT;Homo sapiens>
<配列番号99−RP−H220;PRT;Homo sapiens>
<配列番号100−Rp−Scr220;PRT;Homo sapiens>
<配列番号101−抗原seq3b;PRT;Homo sapiens>
Claims (32)
- 少なくとも1種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片、および少なくとも1種の抗PD1抗体またはその結合断片を含む組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体またはその結合断片が、少なくとも10−6Mの親和性で、レナラーゼに特異的に結合する、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗PD1抗体またはその結合断片が、少なくとも10−6Mの親和性で、PD1に特異的に結合する、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号1〜7からなる群より選択されるペプチド配列と特異的に結合する、請求項1に記載の組成物。
- 前記少なくとも1種の抗体またはその結合断片が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、イムノコンジュゲート、脱フコシル化抗体、二特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および完全ヒト抗体からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、a)配列番号11および配列番号19からなる群より選択される重鎖CDR1配列;b)配列番号12および配列番号20からなる群より選択される重鎖CDR2配列;c)配列番号13および配列番号21からなる群より選択される重鎖CDR3配列;d)配列番号14および配列番号22からなる群より選択される軽鎖CDR1配列;e)配列番号15および配列番号23からなる群より選択される軽鎖CDR2配列;f)配列番号16および配列番号24からなる群より選択される軽鎖CDR3配列からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号4のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、a)配列番号27および配列番号35からなる群より選択される重鎖CDR1配列;b)配列番号28および配列番号36からなる群より選択される重鎖CDR2配列;c)配列番号29および配列番号37からなる群より選択される重鎖CDR3配列;d)配列番号30および配列番号38からなる群より選択される軽鎖CDR1配列;e)配列番号31および配列番号39からなる群より選択される軽鎖CDR2配列;f)配列番号32および配列番号40からなる群より選択される軽鎖CDR3配列からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号6のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、a)重鎖CDR1配列、配列番号43;b)重鎖CDR2配列、配列番号44;c)重鎖CDR3配列、配列番号45;d)軽鎖CDR1配列、配列番号46;e)軽鎖CDR2配列、配列番号47;f)軽鎖CDR3配列、配列番号48からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号9、17、25、33および41からなる群より選択される重鎖配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号10、18、26、34および42からなる群より選択される軽鎖配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- がんの処置または予防を必要とする被験体においてがんを処置または予防する方法であって、少なくとも1種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物を前記被験体に投与するステップと、少なくとも1種の抗PD1抗体またはその結合断片を含む組成物を前記被験体に投与するステップとを含む、方法。
- 前記少なくとも1種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物、および前記少なくとも1種の抗PD1抗体またはその結合断片を含む組成物が、少なくとも1種の追加の治療剤と組み合わせて前記被験体に投与される、請求項14に記載の方法。
- 前記がんが、急性リンパ芽球性;急性骨髄球性白血病;副腎皮質癌;副腎皮質癌、小児期;虫垂がん;基底細胞癌;胆管がん、肝外;膀胱がん;骨がん;骨肉腫および悪性線維性組織球腫;脳幹神経膠腫、小児期;脳腫瘍、成人期;脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期;脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形様/ラブドイド腫瘍、小児期;中枢神経系胚芽腫;小脳性星状細胞腫;大脳性星状細胞腫/悪性神経膠腫;頭蓋咽頭腫;上衣芽腫;上衣腫;髄芽腫;髄上皮腫;中間分化の松果体実質腫瘍;テント上未分化神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫;視路および視床下部神経膠腫;脳および脊髄腫瘍;乳がん;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;カルチノイド腫瘍;カルチノイド腫瘍、胃腸管;中枢神経系非定型奇形様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;中枢神経系リンパ腫;小脳性星状細胞腫大脳性星状細胞腫/悪性神経膠腫、小児期;子宮頸部がん;脊索腫、小児期;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性障害;結腸がん;結腸直腸がん;頭蓋咽頭腫;皮膚t細胞リンパ腫;食道がん;ユーイングファミリー腫瘍;性腺外生殖細胞腫瘍;肝外胆管がん;眼がん、眼球内メラノーマ;眼がん、網膜芽細胞腫;胆嚢がん;胃(gastric/stomach)がん;胃腸管カルチノイド腫瘍;胃腸管間質腫瘍(gist);生殖細胞腫瘍、頭蓋外;生殖細胞腫瘍、性腺外;生殖細胞腫瘍、卵巣;妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;神経膠腫、小児期脳幹;神経膠腫、小児期大脳性星状細胞腫;神経膠腫、小児期視路および視床下部;ヘアリー細胞白血病;頭頸部がん;肝細胞(肝臓)がん;組織球増殖症、ランゲルハンス細胞;ホジキンリンパ腫;下咽頭がん;視床下部および視路神経膠腫;眼球内メラノーマ;島細胞腫瘍;腎臓(腎細胞)がん;ランゲルハンス細胞組織球増殖症;喉頭がん;白血病、急性リンパ芽球性;白血病、急性骨髄球性;白血病、慢性リンパ球性;白血病、慢性骨髄性;白血病、ヘアリー細胞;口唇および口腔がん;肝臓がん;肺がん、非小細胞;肺がん、小細胞;リンパ腫、aids関連;リンパ腫、バーキット;リンパ腫、皮膚t細胞;リンパ腫、ホジキン;リンパ腫、非ホジキン;リンパ腫、原発性中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンストレーム;骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫;髄芽腫;メラノーマ;メラノーマ、眼球内(眼);メルケル細胞癌;中皮腫;原発不明の転移性扁平上皮頸部がん;口のがん;多発性内分泌腺腫症候群、(小児期);多発性骨髄腫/形質細胞新生物;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄球性白血病、成人期急性;骨髄球性白血病、小児期急性;骨髄腫、多発性;骨髄増殖性障害、慢性;鼻腔および副鼻腔がん;鼻咽頭がん;神経芽細胞腫;非小細胞肺がん;口内がん;口腔がん;中咽頭がん;骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫;卵巣がん;卵巣上皮がん;卵巣生殖細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵がん;膵がん、島細胞腫瘍;乳頭腫症;副甲状腺がん;陰茎がん;咽頭がん;褐色細胞腫;傍神経節腫;中間分化の松果体実質腫瘍;松果体芽腫およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍;下垂体腫瘍;形質細胞新生物/多発性骨髄腫;胸膜肺芽細胞腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺がん;直腸がん;腎細胞(腎臓)がん;腎盂および尿管、移行細胞がん;第15染色体上のnut遺伝子が関与する気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;唾液腺がん;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;肉腫、カポジ;肉腫、軟部組織;肉腫、子宮;セザリー症候群;皮膚がん(非メラノーマ);皮膚がん(メラノーマ);皮膚癌、メルケル細胞;小細胞肺がん;小腸がん;軟部組織肉腫;扁平細胞癌、原発不明の扁平上皮頸部がん、転移性;胃(stomach/gastric)がん;テント上未分化神経外胚葉性腫瘍;t細胞リンパ腫、皮膚性;精巣がん;喉のがん;胸腺腫および胸腺癌;甲状腺がん;腎盂および尿管の移行細胞がん;絨毛性腫瘍、妊娠性;尿道がん;子宮がん、子宮内膜;子宮肉腫;膣がん;外陰部がん;ワルデンストレームマクログロブリン血症;ならびにウィルムス腫瘍からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項14に記載の方法。
- 少なくとも1種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片、および少なくとも1種の抗PD−L1抗体またはその結合断片を含む組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体またはその結合断片が、少なくとも10−6Mの親和性で、レナラーゼに特異的に結合する、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗PD−L1抗体またはその結合断片が、少なくとも10−6Mの親和性で、PD−L1に特異的に結合する、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号1〜7からなる群より選択されるペプチド配列と特異的に結合する、請求項17に記載の組成物。
- 前記少なくとも1種の抗体またはその結合断片が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、イムノコンジュゲート、脱フコシル化抗体、二特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および完全ヒト抗体からなる群より選択される、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、a)配列番号11および配列番号19からなる群より選択される重鎖CDR1配列;b)配列番号12および配列番号20からなる群より選択される重鎖CDR2配列;c)配列番号13および配列番号21からなる群より選択される重鎖CDR3配列;d)配列番号14および配列番号22からなる群より選択される軽鎖CDR1配列;e)配列番号15および配列番号23からなる群より選択される軽鎖CDR2配列;f)配列番号16および配列番号24からなる群より選択される軽鎖CDR3配列からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号4のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、a)配列番号27および配列番号35からなる群より選択される重鎖CDR1配列;b)配列番号28および配列番号36からなる群より選択される重鎖CDR2配列;c)配列番号29および配列番号37からなる群より選択される重鎖CDR3配列;d)配列番号30および配列番号38からなる群より選択される軽鎖CDR1配列;e)配列番号31および配列番号39からなる群より選択される軽鎖CDR2配列;f)配列番号32および配列番号40からなる群より選択される軽鎖CDR3配列からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号6のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、a)重鎖CDR1配列、配列番号43;b)重鎖CDR2配列、配列番号44;c)重鎖CDR3配列、配列番号45;d)軽鎖CDR1配列、配列番号46;e)軽鎖CDR2配列、配列番号47;f)軽鎖CDR3配列、配列番号48からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号9、17、25、33および41からなる群より選択される重鎖配列を含む、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号10、18、26、34および42からなる群より選択される軽鎖配列を含む、請求項17に記載の組成物。
- がんの処置または予防を必要とする被験体においてがんを処置または予防する方法であって、少なくとも1種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物を前記被験体に投与するステップと、少なくとも1種の抗PD−L1抗体またはその結合断片を含む組成物を前記被験体に投与するステップとを含む、方法。
- 前記少なくとも1種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物、および前記少なくとも1種の抗PD−L1抗体またはその結合断片を含む組成物が、少なくとも1種の追加の治療剤と組み合わせて前記被験体に投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記がんが、急性リンパ芽球性;急性骨髄球性白血病;副腎皮質癌;副腎皮質癌、小児期;虫垂がん;基底細胞癌;胆管がん、肝外;膀胱がん;骨がん;骨肉腫および悪性線維性組織球腫;脳幹神経膠腫、小児期;脳腫瘍、成人期;脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期;脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形様/ラブドイド腫瘍、小児期;中枢神経系胚芽腫;小脳性星状細胞腫;大脳性星状細胞腫/悪性神経膠腫;頭蓋咽頭腫;上衣芽腫;上衣腫;髄芽腫;髄上皮腫;中間分化の松果体実質腫瘍;テント上未分化神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫;視路および視床下部神経膠腫;脳および脊髄腫瘍;乳がん;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;カルチノイド腫瘍;カルチノイド腫瘍、胃腸管;中枢神経系非定型奇形様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;中枢神経系リンパ腫;小脳性星状細胞腫大脳性星状細胞腫/悪性神経膠腫、小児期;子宮頸部がん;脊索腫、小児期;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性障害;結腸がん;結腸直腸がん;頭蓋咽頭腫;皮膚t細胞リンパ腫;食道がん;ユーイングファミリー腫瘍;性腺外生殖細胞腫瘍;肝外胆管がん;眼がん、眼球内メラノーマ;眼がん、網膜芽細胞腫;胆嚢がん;胃(gastric/stomach)がん;胃腸管カルチノイド腫瘍;胃腸管間質腫瘍(gist);生殖細胞腫瘍、頭蓋外;生殖細胞腫瘍、性腺外;生殖細胞腫瘍、卵巣;妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;神経膠腫、小児期脳幹;神経膠腫、小児期大脳性星状細胞腫;神経膠腫、小児期視路および視床下部;ヘアリー細胞白血病;頭頸部がん;肝細胞(肝臓)がん;組織球増殖症、ランゲルハンス細胞;ホジキンリンパ腫;下咽頭がん;視床下部および視路神経膠腫;眼球内メラノーマ;島細胞腫瘍;腎臓(腎細胞)がん;ランゲルハンス細胞組織球増殖症;喉頭がん;白血病、急性リンパ芽球性;白血病、急性骨髄球性;白血病、慢性リンパ球性;白血病、慢性骨髄性;白血病、ヘアリー細胞;口唇および口腔がん;肝臓がん;肺がん、非小細胞;肺がん、小細胞;リンパ腫、aids関連;リンパ腫、バーキット;リンパ腫、皮膚t細胞;リンパ腫、ホジキン;リンパ腫、非ホジキン;リンパ腫、原発性中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンストレーム;骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫;髄芽腫;メラノーマ;メラノーマ、眼球内(眼);メルケル細胞癌;中皮腫;原発不明の転移性扁平上皮頸部がん;口のがん;多発性内分泌腺腫症候群、(小児期);多発性骨髄腫/形質細胞新生物;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄球性白血病、成人期急性;骨髄球性白血病、小児期急性;骨髄腫、多発性;骨髄増殖性障害、慢性;鼻腔および副鼻腔がん;鼻咽頭がん;神経芽細胞腫;非小細胞肺がん;口内がん;口腔がん;中咽頭がん;骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫;卵巣がん;卵巣上皮がん;卵巣生殖細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵がん;膵がん、島細胞腫瘍;乳頭腫症;副甲状腺がん;陰茎がん;咽頭がん;褐色細胞腫;傍神経節腫;中間分化の松果体実質腫瘍;松果体芽腫およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍;下垂体腫瘍;形質細胞新生物/多発性骨髄腫;胸膜肺芽細胞腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺がん;直腸がん;腎細胞(腎臓)がん;腎盂および尿管、移行細胞がん;第15染色体上のnut遺伝子が関与する気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;唾液腺がん;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;肉腫、カポジ;肉腫、軟部組織;肉腫、子宮;セザリー症候群;皮膚がん(非メラノーマ);皮膚がん(メラノーマ);皮膚癌、メルケル細胞;小細胞肺がん;小腸がん;軟部組織肉腫;扁平細胞癌、原発不明の扁平上皮頸部がん、転移性;胃(stomach/gastric)がん;テント上未分化神経外胚葉性腫瘍;t細胞リンパ腫、皮膚性;精巣がん;喉のがん;胸腺腫および胸腺癌;甲状腺がん;腎盂および尿管の移行細胞がん;絨毛性腫瘍、妊娠性;尿道がん;子宮がん、子宮内膜;子宮肉腫;膣がん;外陰部がん;ワルデンストレームマクログロブリン血症;ならびにウィルムス腫瘍からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項30に記載の方法。
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