BR112020013854A2

BR112020013854A2 - proteínas bifuncionais que combinam bloqueio de ponto de verificação para a terapia alvejada

Info

Publication number: BR112020013854A2
Application number: BR112020013854-1A
Authority: BR
Inventors: Jeng-Horng Her; Jhong-Jhe You; Ching-Hsuan HSU; Po-Lin Huang
Original assignee: Ap Biosciences, Inc.
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2020-12-01
Also published as: EP3758735B1; KR20200088883A; JP2021511786A; AU2019227715B2; JP7464525B2; AU2019227715A1; EP3758735A4; CA3085467A1; KR102469248B1; WO2019168947A1; SG11202005290QA; NZ765074A; TW201945023A; CN111565738B; RU2756899C1; US20230322931A1; US20200299389A1; TWI731310B; US11780922B2; CN111565738A

Abstract

São providas proteínas biespecíficas que compreendem uma proteína de superfície celular de ligação de domínio de ligação e um domínio de inibição de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Também é fornecido um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende um agente terapêutico e um anticorpo ou uma ligação de fragmento de ligação a antígeno PD-L1 e/ou um domínio de inibição de VEGF, em que o agente terapêutico é covalentemente conjugado ao anticorpo ou ao fragmento de ligação a antígeno por um ligante.

Description

“PROTEÍNAS BIFUNCIONAIS QUE COMBINAM BLOQUEIO DE PONTO DE VERIFICAÇÃO PARA A TERAPIA ALVEJADA” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade para o pedido Provisório US Número de Série 62/636,825, depositado em 28 de fevereiro de 2018, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS Campo da Invenção

[002] A presente invenção refere-se a um anticorpo. Mais particularmente, a presente invenção refere-se ao anticorpo para terapia de câncer Descrição da Técnica Relacionada

[003] Os dois tipos principais de linfócitos em seres humanos são T (derivados do timo) e B (derivados da medula óssea). Estas células são derivadas de células tronco hematopoiéticas na medula óssea e fígado fetal que foram comprometidos para a via de desenvolvimento linfóide. A progénie destas células tronco seguem caminhos divergentes para amadurecer em linfócitos B ou T. O desenvolvimento de linfócitos B humanos ocorre inteiramente dentro da medula óssea. As células T, por outro lado, se desenvolvem de precursores imaturos que deixam a medula e se deslocam através da corrente sanguínea para o timo, onde eles proliferam e diferenciam em linfócitos T maduros. Células T

[004] Células T são as mais abundantes (cerca de 75% de linfócitos sanguíneos) e potentes células exterminadoras imunes. O papel das células T efetoras na resposta imune antitumoral é fortemente suportado por estudos In vitro e a observação de que uma alta infiltração de células T CD8+ em vários tipos de tumores correlaciona- se com prognóstico clínico favorável (Fridman et al, 2012). A ativação de células T humanas efetoras requer pelo menos três sinais complementares: (I) interação TCR-CD3/Ag-MHC com a ajuda de correceptores (CD4 ou CD8); (ii) ligação de moléculas coestimuladoras tais como CD80 ou CD86 a CD28, CD40/CD40L; e (iii) moléculas acessórias tais como citocinas.

[005] Coestimulação ou a provisão de dois sinais distintos para células T é um modelo amplamente aceito de ativação de linfócitos de linfócitos T em repouso por células que apresentam antígenos (APCs) (Lafferty e Cunningham, 1975). Este modelo fornece ainda a discriminação de tolerância auto-auto-auto e imune (Bretscher e Cohn, 1970; Bretscher, 1999; Jenkins e Schwartz, 1987). O sinal primário, ou sinal específico de antígeno, é transduzido através do receptor de células T (TCR) após o reconhecimento do peptídeo de antígeno estranho apresentado no contexto do principal complexo de histocompatibilidade (MHC). O segundo sinal ou sinal co- estimulador é liberado para células T por moléculas coestimuladoras expressas em células que apresentam antígenos (APCs), e induzem células T para Promover expansão clonal, secreção de citocina e função efetora (Lenschow et al., 1996). Na ausência de coestimulação, células T podem tornar-se refratárias à estimulação de antígenos, não montam uma resposta imune eficaz, podendo também resultar em exaustão ou tolerância a antígenos estranhos.

Proteína de ponto de verificação imune: PD-L1

[006] Os pontos de verificação de imunização referem-se a um grupo de vias inibitórias e estimulantes principalmente iniciadas pela interação do ligante-receptor do sistema imunológico, especificamente imunidade mediada por células T, para manter auto-tolerância e modular a duração e a amplitude de respostas fisiológicas em tecidos periféricos a fim de minimizar os danos colaterais do tecido (Pardoll, 2012). Células tumorais co-opõem certas vias de controle como um mecanismo principal da resistência imune. Por exemplo, o ligante de proteína 1 de morte celular programada, PD-L1, é comumente regulado na superfície celular tumoral de cânceres humanos. A interação de PD-L1 com seu receptor, PD-1, expressa em linfócitos infiltrados de tumor (TILs), especificamente em células T, inibe a resposta mediada por células T local a escapar da vigilância imune (Liang et al, 2006; Sznol e Chen, 2013). Assim, a inibição de sinais imunossupressores em células cancerosas, ou estimulação agonística direta de células T, resulta em e/ou induz uma forte resposta imunológica antitumoral prolongada. Estudos clínicos recentes sugerem fortemente o bloqueio de proteínas de ponto de verificação imune através de anticorpos ou modulados por ligantes ou receptores solúveis são as abordagens mais promissoras para ativar a imunidade antitumoral terapêutica (Topalian et al., 2014). Atualmente, anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA- 4(antígeno-4 associado a linfócito T citotóxico) foram aprovados pela FDA para Tratar doenças tais como melanomas. Domínio de inibição de angiogênese e VEGF (VID)

[007] A angiogênese, a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos pré- existentes, é um processo normal e vital envolvido no desenvolvimento fetal e reparo do tecido. O processo é altamente regulado tanto por fatores angiogênicos como anti-angiogênicos, e envolve a migração e a proliferação da célula endotelial, a maturação e a remodelagem do vaso, e a degradação da matriz extracelular. Embora seja um processo importante no crescimento e desenvolvimento normais, a angiogênese também desempenha um papel chave no crescimento tumoral. Os tumores requerem um fornecimento vascular para crescer e pode conseguir isto através da expressão de fatores de crescimento pró-angiogênicos, incluindo membros da família de ligantes do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) de ligantes (Hicklin e Ellis, 2005). Quando o VEGF e outros fatores de crescimento endotelial se ligam a seus receptores em células endoteliais, são iniciados sinais dentro destas células que promovem o crescimento e a sobrevivência de novos vasos sanguíneos. Bloqueio da atividade de VEGF com anticorpo específico de VEGF (Avastin), receptores de VEGF solúveis (aflibercept), ou inibidores da atividade de VEGF tirosina cinase (sunitinib) são estratégias que foram usadas para tratar distúrbios do tipo tumor ou angiogênicos, tais como AMD. Anticorpo biespecífico/bifuncional

[008] A ideia de usar anticorpos biespecíficos para recombinar eficientemente as células imunes efetoras em direção às células tumorais emergiu nas 1980s (Karpovsky et al., 1984; Perez et al., 1985; Staerz et al., 1985). Os suportes biespecíficos são geralmente classificados em dois grupos principais com diferentes propriedades farmacocinéticas, com base na ausência ou presença de um fragmento Fc, moléculas semelhantes a IgG e pequenos formatos biespecíficos recombinantes, a maioria dos mesmos derivando de um fragmento variável de cadeia simples (scFv). Através de seu tamanho compacto, os fragmentos de anticorpos usualmente penetram tumores mais eficientemente do que as moléculas semelhantes a IgG, mas este benefício é mitigado por uma meia-vida de soro curto (poucas horas) limitando sua absorção global de tumor e tempo de residência (Goldenberg Et al, 2007). Em contraste, a presença de um fragmento Fc, que se liga aos receptores Fc neonatal, proporciona uma longa meia-vida de soro (> 10 dias) para os formatos semelhantes a IgG, favorecendo a absorção e retenção do tumor, mas limita a penetração do tumor.

[009] Estudos recentes realçam a eficácia terapêutica de imunoterapia, uma classe de tratamentos de câncer que utilizam o próprio sistema imunológico do paciente para destruir células cancerosas. Dentro de um tumor, a presença de uma família de moléculas reguladoras negativas, coletivamente conhecidas como "inibidores de ponto de verificação", pode inibir a função da célula T para suprimir a imunidade antitumoral. Inibidores de ponto de verificação, tais como CTLA-4 e PD-1, atenuam a proliferação de células T e a produção de citoquina. Bloqueio alvo de CTLA-4 ou PD-1 com anticorpos monoclonais antagonistas (mAbs) libera os "freios" em células T para aumentar a imunidade antitumoral. Também, estudos recentes relataram as associações entre vias PD-L1 ou PD-L2/PD-1 e genes pró-angiogênicos incluindo fatores induzíveis por hipoxia (HIFs) e fator de crescimento Endotelial vascular (VEGF) em várias malignidades, tais como linfoma de Hodgkin Clássico (cHL) (Koh et Al, 2017) e glioma (Xue et al, 2017). Koh et al. confirmaram as correlações positivas entre PD-L1, VEGF ou MVD. Suas descobertas proporcionaram evidências de novos métodos terapêuticos que incluem combinações de anti-PD-L1/PD-1 e terapia anti-VEGF além do regime padrão atual para cHL (Koh et al, 2017). VEGF também evidenciou sua capacidade de romper uma etapa chave no ciclo de imunidade ao câncer: infiltração de células T No tumor (Kim e Chen, 2016; Terme et al, 2012). O alvo de VEGF pode ajudar a restaurar parte do ciclo de imunidade ao câncer pelo aumento da infiltração de células T no microambiente de tumor (Hughes et Al, 2016; Terme et al, 2012; Wallin et al, 2016). A inibição da via de VEGF pode levar à expressão aumentada de moléculas de adesão celular em células endoteliais, aumentando as células T intratumorais para criar um microambiente de tumor inflamado imunológico.

SUMÁRIO

[0010] A presente descrição projetada para investigar o anticorpo biespecífico com a inibição imunomoduladora e a inibição da angiogênese para o tratamento do paciente com cânceres, tais como câncer da próstata, câncer do pulmão, NSCLC, melanoma, Linfoma, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, RCC, ou câncer ovariano foram examinadas.

[0011] A presente descrição fornece um anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma compreendendo pelo menos uma cadeia de polipeptídeo,

em que a cadeia de polipeptídeo compreendendo: uma proteína de superfície celular de ligação de domínio de ligação; e um domínio de inibição de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).

[0012] Em uma modalidade, a proteína de superfície celular compreendendo ligante de proteína de morte celular programada 1 (PD-L1), proteína de morte de célula programada 1 (PD-1), receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2), antígeno associado a linfócitos T citotóxico 4 (CTLA-4), gene de ativação de linfócito 3 (LAG3), Atenuador de linfócitos B e T (BTLA), OX40 (cluster de diferenciação 134, CD134), CD27, CD28, o membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 9 (TNFRSF9 ou CD137), coestimulação da célula T indutível (ICOS Ou CD278), CD40, ou uma combinação dos mesmos.

[0013] Em uma modalidade, o domínio de ligação liga o PD-L1, e o domínio de ligação compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs. 4 e 6; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em aminoácidos 1-111 de SEQ ID NO. 3 e 1- 110 da SEQ ID NO 5.

[0014] Em uma modalidade, o domínio de inibição de VEGF é de receptor de VEGF humano 1 (VEGFR-1)

ou receptor de VEGF Humano 2 (VEGFR-2).

[0015] Em uma modalidade, o domínio de inibição de VEGF compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N-1,2,9, 14,15,16, 17,18,19, 20,21,22, 23,24,25, 26, 27, e uma combinação das mesmas.

[0016] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma compreende ainda: um domínio Fc; e um fragmento Fab Conectado ao terminal N do domínio Fc, e o fragmento Fab Que compreende o domínio de ligação, em que o domínio de inibição de VEGF É conectado ao terminal C do domínio Fc.

[0017] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma compreende ainda um ligante entre o domínio Fc e o domínio de inibição de VEGF.

[0018] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO 12 ou 13.

[0019] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma compreende um par de cadeias de polipeptídeo.

[0020] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico é um Anticorpo IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou gama.

[0021] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico é um anticorpo IgG.

[0022] Em uma modalidade, o anticorpo IgG é um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

[0023] Em uma modalidade, o anticorpo IgG1 é uma redução da citotoxidade mediada por células dependentes de anticorpos do anticorpo IgG1.

[0024] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico é um anticorpo humano.

[0025] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende: um anticorpo biespecífico ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo como mencionado acima, e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0026] A presente descrição também proporciona um conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo: um agente terapêutico; e um anticorpo biespecífico ou um fragmento de ligação a antígeno que liga o PD-L1 e/ou um domínio de inibição de VEGF, em que o agente terapêutico é covalentemente conjugado ao anticorpo ou ao fragmento de ligação a antígeno por um ligante.

[0027] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico ou um fragmento de ligação a antígeno é selecionado a partir do anticorpo biespecífico ou um fragmento de ligação a antígeno como mencionado acima.

[0028] A presente invenção também fornece um método de tratamento de câncer, o método compreendendo a administração ao indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz do anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno como mencionado acima.

[0029] Em uma modalidade, o câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC), melanoma, linfoma, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais (RCC) e câncer ovariano.

[0030] Em uma modalidade, a quantidade eficaz é de 0,001 µg/kg a 250 mg/kg.

[0031] A presente invenção também fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno como mencionado acima.

[0032] A presente descrição também fornece um método para diagnóstico de câncer em um indivíduo, compreendendo: (a) obtenção de uma amostra de fluido corporal ou uma amostra de células de um indivíduo; (b) contactar a amostra com um ou mais anticorpos que podem detectar a expressão de um painel de marcadores de câncer selecionados do grupo consistindo em PD-L1 e VEGF; (c) ensaiar a ligação de um ou mais anticorpos à célula ou a amostra; e (d) avaliação da condição de câncer do indivíduo em um ensaio através da medição e comparação do nível de ligação de anticorpos com um controle normal para determinar a presença do câncer no indivíduo.

[0033] A presente descrição também fornece um método para avaliar o risco de um indivíduo sofrendo de câncer ou um método para triagem de câncer em um indivíduo, compreendendo: (a) obter uma amostra de fluido corporal ou uma amostra de célula de um indivíduo; (b) contactar a amostra com um ou mais anticorpos que podem detectar a expressão de um painel de marcadores de câncer selecionados Do Grupo consistindo em PD-L1 e VEGF; (c) ensaiar a ligação de um ou mais anticorpos à célula ou a amostra; e (d) avaliação da condição de câncer do indivíduo em um ensaio através da medição e comparação do nível de ligação de anticorpo com um controle normal para determinar se o indivíduo tem o risco de sofrer de câncer.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0034] A invenção pode ser mais completamente entendida através da leitura da seguinte descrição detalhada da modalidade, com referência feita aos desenhos anexos, como segue:

[0035] A figura 1 mostra pontos de verificação de imunidade Modulando a imunidade mediada por células T. Anticorpo ou agonista ou antagonista contra os pontos de verificação, tais como anti-ICOS, anti-CD28, anti-OX40 e anti-CD27, ou anti-PD-1, anti-CTLA4, anti-LAG3, anti-BTLA, poderia ser usado para construir a proteína de fusão bifuncional dependendo das aplicações.

[0036] As figuras 2A e 2B mostram a triagem de clones de fagos por ELISA direto para PD-L1 recombinante.

[0037] A figura 3 mostra condutores de anticorpos purificados específicos para PD-L1 por SDS-PAGE com reagente não redutor ou redutor para revelar a integridade e a pureza.

[0038] A figura 4 mostra exemplos da atividade de ligação direta do ligante de proteínas do ponto de verificação anti-imunes purificadas e anticorpos anti-PD-L1 contra o PD-L1. Os poços pré-revestidos de ligante foram primeiro incubados com várias concentrações de condutores de anticorpos, conforme indicado. As proteínas ligadas foram então detectadas com anticorpo monoclonal IgG anti- humano de cabra conjugado a HRP e as leituras de OD450 foram plotadas.

[0039] A figura 5 mostra a análise de fluxo usando células de expressão de PD-L1 293. As células HEK293 de expressão de PD-L1 foram primeiramente incubadas com condutores de anticorpos purificados, e os anticorpos ligados foram detectados com IgG anti-Humano de Cabra conjugado Alexa-488 (H + L) seguido por análise de separador de células ativadas por fluorescência (FACS).

[0040] Fig. 6 mostra o bloqueio da interação PD-1/PD-L1 com anticorpos anti-PD-L1 purificados. Anticorpos purificados conforme indicado foram aplicados com-PD-L1-Fc e pré-revestidos PD-1/His em placa de 96 poços para avaliar a atividade de inibição da interação PD-1/PD- L1. A PD-L1-Fc recombinante de ligação em PD-1 recombinante foi detectada por estreptavidina-Alexa-488 e análise por ELISA.

[0041] As figuras 7A e 7B mostram o anticorpo anti-PD-L1 que leva com 1 ou 10 μg/mL estimula a produção de IL-2 e/ou IFN- em um ensaio de reação de linfócito misto (MLR) após 3 dias (Fig. 7A) ou 5 dias (Fig. 7B) tratamento de anticorpos.

[0042] A figura 8 mostra a estrutura de uma cadeia pesada de anticorpo Fc fundida com o domínio de inibição de VEGF (VI D) Do receptor de VEGF.

[0043] A figura 9 mostra exemplos de análise SDS-gel de anticorpos monoclonais anti-imunes anticorpos anti-VID. Proteínas de fusão purificadas, anticorpos biespecíficos anti-PD-L1-VID Demonstraram ter um peso molecular de cerca de 220 kDa (não redutora), e a fusão de cadeia pesada tem cerca de 85 kDa e a cadeia leve é cerca de 25 kDa (reduzida) em ambas as fusões de anticorpos. M é o marcador, a Pista 1 é anti-PD-L1-VID/elgG1, A pista 2 é reduzida anti-PD-L1-VID/elgG1, A pista 3 é anti-PD-L1- VID/IgG4, e A pista 2 é reduzida anti-PD-L1-VID/IgG4. Cada uma das pistas carrega 3 μg.

[0044] As figuras 10A e 10B mostram A pureza de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1-VID/IgG4 (Fig. 10A) e anti-PD-L1-VID/elgG1 (Fig. 10B) De células HEK293 Por análise SEC-HPLC.

[0045] As figuras 11A e 11B mostram exemplos da Atividade de ligação de PD-L1 (Fig. .11A) e de VEGF165 (figura B) de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1-VID por ELISA direto. Poços pré-revestidos de ligante foram primeiro incubados com várias concentrações de amostras de teste conforme indicado. As Abs ligadas foram então detectadas com IgG anti-humano de cabra conjugado com HRP ou anticorpos específicos de F(ab')2 e leituras de OD450 foram plotadas.

[0046] Fig. 12 mostra a inibição da proliferação de HUVEC estimulada por VEGF165 com Anticorpos biespecíficos anti-PD-L1-VID purificados. O VEGF165 foi pré-incubado com amostras de teste conforme indicado por um dia e depois aplicado para Células HUVEC Para monitorar a proliferação de células HUVEC estimuladas por VEGF165. Após 3 dias de cultura, a proliferação celular foi determinada por reagente MTS (Promega). A absorbância foi plotada contra a concentração de Abs da amostra de teste, e a concentração na qual a proliferação celular foi inibida por 50% (IC50) foi determinada.

[0047] As figuras 13A e 13B mostram o anticorpo biespecífico sinérgico estimula a Ativação da célula T para a Produção de IL-2 (Fig. 13A) e IFN- (Fig.

13B) em um Ensaio de reação de linfócito misto (MLR) após 3 ou 5 dias com IgG de isótipo, anticorpo de referência (MPDL3280A) ou tratamento de anticorpos biespecíficos anti- PD-L1-VID/elgG1

[0048] As figuras 14A, 14B e 14C mostram a estabilidade de soro In vitro de anticorpo biespecífico anti-PD-L1-VID/elgG1 de diferentes espécies (figura 14A: soro Humano; figura 14B: soro de camundongo; Figura 14C: sem soro). Anticorpo purificado foi incubado em soro (15 μg/mL) de diferentes espécies como indicado a 37° C por 1,3,5, 7 e 14 dias. Após a incubação, as amostras colhidas foram aplicadas para ensaio ELISA em sanduíche para determinar a atividade de ligação relativa para PD-L1 e VEGF165. A meia-vida foi plotada com base na concentração de anticorpo biespecifico no soro.

[0049] Figura 15A é um gráfico que mostra o efeito de tratamento de anticorpos biespecíficos anti-PD- L1-VID/elgG1 e tratamento de anticorpos monoclonais sobre o crescimento de tumor PC-3 em camundongos Bege De Fox Chase SCID ®. A figura 15B mostra que o tratamento de anticorpos biespecíficos de tamanho de tumor é significativo menor do que o tratamento de isótipo ou anticorpo de referência no dia 35 após a inoculação.

[0050] As figuras 16A, 16B e 16C mostram anti- PD-L1-VID Abs para sua especificidade de ligação a antígeno em comparação com anti-PD-L1 sozinho Em A549 estimulada Por IFN- (Fig. 16A), NCI-H292 (Fig.2216B), ou células 293-L1 de Expressão de PD-L1 (Fig. 16C); MFI: intensidade média de fluorescência.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0051] Será feita agora referência em detalhes às presentes modalidades da invenção, cujos exemplos são ilustrados nos desenhos anexos. Sempre que possível, os mesmos números de referência são usados nos desenhos e na descrição para se referir a partes iguais ou similares.

[0052] A presente invenção descreve a expressão, purificação e caracterização de proteínas bifuncionais com domínio de inibição de VEGF funcional isolado para o C-terminal de domínio Fc de anticorpos anti- imunes de proteína de ponto de verificação. Estas proteínas interagem com seu correspondente ponto de verificação alvo devem transmitir o sinal inibidor para modular a imunidade envolvida em células T e neutralizar a angiogênese induzida por VEGF ao Mesmo tempo. Os componentes de proteínas de fusão Fc na presente invenção são de todas as origens humanas, e assim são esperados serem não imunogênicos e podem ser usados como terapêuticos em seres humanos.

[0053] Moléculas biespecíficas, tais como anticorpos biespecíficos (BsAbs) Proporcionam Meios para direcionar simultaneamente múltiplos epítopos no mesmo alvo molecular ou alvos diferentes com um único agente terapêutico. Como terapêuticos de câncer, têm o potencial de conferir novas ou mais atividades potentes, reduzir o custo de mercadorias e facilitar o desenvolvimento de novos regimes terapêuticos em contraste com uma mistura de dois mAbs (Chames e Baty, 2009; Hollander, 2009; Thakur e Lum, 2010). Recentemente, catumaxoab, um anticorpo biespecífico trifuncional que direciona a molécula de adesão de células epiteliais humanas (EpCAM) e CD3 Mostrou um benefício clínico claro em pacientes com carcinomatose peritoneal de cânceres epiteliais (Heiss et al, 2010), e um anticorpo biespecífico de Ligação de células T (BiTE) com especificidade dupla para CD19 e CD3 também Demonstrou estimular a atividade clínica em pacientes com CD19 que expressam malignidades hematológicas (Bargou Et al, 2008). A despeito de forte interesse no desenvolvimento de moléculas biespecíficas como terapêuticos de câncer, desafios técnicos na produção de moléculas biespecíficas estáveis e ativas têm, no passado, impedidos da avaliação clínica da maioria dos formatos biespecíficos.

Muitos formatos de anticorpos engenheirados, incluindo um anticorpo biespecifico semelhante a IgG, tem estabilidade ou solubilidade comprometida (Bargou et al., 2008; Demarest e Glaser, 2008; Lu et al, 2005). Além disso, foram tomadas várias estratégias para aumentar a qualidade do produto e estabilidade in vivo de moléculas biespecíficas, incluindo pegilação, Conjugação com albumina de soro humano e engenharia Fc (Muller et al., 2007; Ridgway et al., 1996). Anticorpos biespecíficos da forma geral acima descritas têm a vantagem de que a sequência de nucleotídeos que codifica os dois domínios V, um único ligante ou um espaçador pode ser incorporado em um organismo de expressão hospedeiro adequado sob o controle de um único promotor.

Isto aumenta a flexibilidade com a qual estas construções podem ser projetadas bem como o grau de controle de experiência durante a sua produção.

Além disso, o Fc de IgG é um andaime de atração muito outro para projetar novos terapêuticos porque contém todas as funções de anticorpos exceto a capacidade de ligação.

A engenharia Fc é importante para melhorar a eficácia dos anticorpos biespecíficos. Portanto, a conformação baseada em IgG é usada na presente invenção para dois alvos independentes em células imunes ou proteínas pró-angiogênicas em terapia de câncer.

[0054] As proteínas do ponto de verificação de imunidade imunológica são abordagens promissoras para ativar a imunidade antitumoral. As proteínas de ponto anti- verificação, tais como PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, etc., são atualmente avaliadas clinicamente (Fig. 1). Os dados preliminares com bloqueadores de proteínas de ponto de verificação imune demonstraram ser capazes de aumentar a imunidade antitumoral com o potencial de produzir respostas clínicas duráveis. Entretanto, a despeito da eficácia clínica notável destes agentes em um número de malignidades, tornou-se claro que elas não são suficientemente ativas para muitos pacientes. Numerosos caminhos imunomodulatórios adicionais bem como fatores inibidores expressos ou secretados por células mielóides e estromais no microambiente tumoral são alvos potenciais para a sinergia com bloqueio de ponto de verificação imune. Portanto, a combinação de terapias de anticorpos anticâncer ou biespecíficos tem sido essencial para se conseguir a remissão completa e curas para pacientes com câncer. Enquanto isso, o direcionamento de VEGF já sabe ser reduzido a angiogênese por tumor (Hicklin e Ellis, 2005) e pode ajudar a restaurar parte do ciclo de imunidade Ao câncer pelo aumento da infiltração de células T no microambiente tumoral (Hughes et Al, 2016; Terme et al, 2012; Wallin et al, 2016).

[0055] O domínio de ligação de ligante extracelular (SEQ ID NOs 1 e 2) de um receptor de VEGF Humano é capaz de se ligar a um ligante de VEGF, e compreende um ou mais domínios semelhantes a Ig D1-D7 (Tabela 1) de um ou mais receptores de VEGF. Preferivelmente, o domínio de ligação de ligante extracelular do receptor de VEGF compreende um domínio semelhante a Ig D2 de um primeiro receptor de VEGF e um domínio semelhante a Ig D3 de um segundo receptor de VEGF, em que os primeiro e segundo receptores de VEGF são os mesmos ou diferentes receptores de VEGF. Na presente invenção, o domínio de inibição de VEGF (VI D), o domínio de ligação de ligante extracelular do receptor de VEGF compreende Um Domínio semelhante a Ig D2 de um VEGFR1 e Um domínio semelhante a Ig D3 de Um VEGFR2 para bloquear O VEGF e reduzir a angiogênese.

Tabela 1. A sequência de aminoácidos de domínios semelhantes a Ig de receptores de VEGF humano Nome SEQ ID Sequência NO. D1 de 14 receptor 1 VEGF humano D2 de 15 receptor 1 VEGF humano D3 de 16 receptor 1 VEGF humano

D4 de 17 receptor 1 VEGF humano D5 de 18 receptor 1 VEGF humano

D6 de 19 receptor 1 VEGF humano D7 de 20 receptor 1 VEGF humano D1 de 21 receptor 2 VEGF humano

D2 de 22 receptor 2 VEGF humano D3 de 23 receptor 2 VEGF humano D4 de 24 receptor 2 VEGF humano D5 de 25 receptor 2 VEGF humano

D6 de 26 receptor 2 VEGF humano D de 27 receptor 2 VEGF humano

[0056] Em algumas modalidades, o domínio de inibição de VEGF compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N-1,2,9, 14,15,16, 17,18,19, 20,21,22, 23,24,25, 26, 27, e uma combinação das mesmas. Em alguns exemplos, o domínio de inibição de VEGF compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos como mencionado acima.

[0057] A presente invenção descreve a construção, a expressão e a caracterização de anticorpos anti-imunes de proteína de ponto de verificação Fc fundidos com o domínio de inibição de VEGF (VI D) do receptor de VEGF Humano. O anticorpo anti-Fc-L1 posicionado N- terminalmente em construções de fusão deve permitir a expansão da potência de proteínas de fusão além do agente potenciador imune se a contraparte de fusão for substituída por outros pontos de verificação de imunização, tais como anti-CTLA-4, CD3, anticorpos OX40 ou molécula de direcionamento de superfície celular tais como anti-EGFR, anti-HER2, anticorpos anti-CD40, por exemplo

[0058] A presente descrição fornece anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma proteína de superfície celular de ligação de domínio de ligação; e um domínio de inibição de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Em algumas modalidades, o domínio de ligação que liga o PD-L1 compreende: um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve. O domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs. 4 e 6. Em alguns exemplos, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos como mencionado acima. O domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em aminoácidos 1-111 da SEQ ID NO 3 e 1-110 da SEQ ID NO 5. em alguns exemplos, a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos como mencionado acima. Geração de anticorpos da biblioteca OmniMab

[0059] Para a geração de anticorpos terapêuticos contra o PD-L1, as seleções com a biblioteca de fagemídeo OmniMab foram realizadas. A biblioteca de fagemídeo é gerada por AP Biosciences Inc (APBio Inc) a partir de uma coleção de cerca de cem doadores de Saúde B. Os fagos para a primeira rodada de panos foram preparados por Hiperfagos (Μ13FK07ρIII, Progen, Heidelberg, Alemanha). Fase sólida panorâmica e a panorâmica de células contra o PD-L1 foram aplicados para a seleção de ligação específica de PD-L1 E isolamento da biblioteca OmniMab.

A varredura de fase sólida foi realizada usando PD-L1-Fc humana recombinante (APBio Inc) na primeira seleção rodada e em Seguida Células HEK293 expressas PD-L1 foram usadas para enriquecimento adicional de duas rodadas.

Após a seleção de três rodadas, os ligantes PD-L1 específicos foram selecionados e isolados por ELISA direto com proteína recombinante correspondente (Figs. 2A e 2B).Proteínas recombinantes PD-L1-Fc pré-revestidas foram lavadas com sobrenadante contendo fagos resgatados por 1 hora e lavadas com PBS Contendo Tween-20 a 0,1% Durante Três vezes.

Fagos ligados foram detectados por anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Roche) e Substrato TMB foi usado para o desenvolvimento de sinal.

As leituras de OD450 foram registradas.

Os aglutinantes positivos foram isolados e enviados para sequenciamento para confirmar a sequência e diversidade de cadeia pesada e cadeia leve.

A região variável de cadeia pesada e cadeia leve específica para PD- L1 foi descrita a partir da SEQ ID NO 3 até a SEQ ID NO 6: SEQ ID NO: 3 é a cadeia leve do clone de PD-L1 6, SEQ ID NO 4 é a região variável da cadeia pesada do clone de PD-L1 6, SEQ ID NO 5 é a cadeia leve do clone PD-L1 32, SEQ ID NO 6 é a região variável da cadeia pesada do clone PD-L1 32. Conforme mostrado nas figuras 2A e 2B, vários clones foram isolados e conhecidos por serem reconhecidos especificamente para o antígeno correspondente em comparação com o controle negativo.

Subclonagem e expressão/purificação do ligante específico de PD-L1 selecionado como formato de IgG

[0060] Para facilitar a triagem rápida do ligante específico com funcionalidade na ativação da célula T, as cadeias pesadas e cadeias leves de aglutinantes positivos contra o PD-L1 por ELISA foram então amplificadas, digeridas e subclone em vetor de expressão IgG recém-Especializado Carregando Região constante IgG4 (SEQ ID NO 7). Depois da validação da sequência, os plasmídeos foram então preparados e transfectados em células HEK293 Para a expressão de anticorpos com reagente de transfecção de 293 Fectina (Invitrogen). Após 4 dias de cultura, o anticorpo secretado no meio isento de soro é purificado por afinidade a partir do sobrenadante de cultura por cromatografia de proteína G. O anticorpo purificado é então concentrado, seguido por diálise em tampão PBS. A concentração final de proteína dialisada é determinada por espectrofotômetro NanoDrop2000 E a pureza e a integridade são determinadas por SDS-PAGE Com ou sem o reagente redutor como mostrado na figura 3. A integridade de vários condutores de anticorpos purificados é normal nas células HEK293 bem como anticorpo de Referência, MPDL3280A. Determinação da atividade de ligação para IgG específicos de PD-L1 por ELISA direto

[0061] Anticorpo purificado leva contra Células PD-L1 (anti-PD-L1 anticorpo) foram então aplicados para caracterização de ligação ELISA em PD-L1-Fc humana em configuração revestida direta. Fig. 4 mostrou o resultado de ligação ELISA para anticorpos anti-PD-L1. Para anticorpos específicos de PD-L1, a maioria dos condutores mostrou uma atividade de ligação similar ou melhor com o anticorpo de referência (Ref Ab, MPDL3280A, Roche).

[0062] Quimera Fc-L1 IgG1 Fc Humana purificada (PD-L1-Fc, APBio) foi dialisada em Solução Salina Tamponada com fosfato (PBS), ajustada a 1 mg/mL e depois diluída com PBS a uma concentração final de 1 μg/mL. Foram revestidas com 0,1 mL por Cavidade de quimera de PD-L1-Fc recombinante que deixa poços vazios para controles de ligação não específicos e incubadas a 4° C durante a noite. A solução de quimera de PD-L1-Fc Foi removida e as placas foram lavadas três vezes com 0,4 mL de tampão de lavagem (Tween- 20 a 0,1% Em PBS). 0,4 mL de tampão de bloqueio (5% de pó de leite com baixo teor de gordura em PBS) foi adicionado a todos os poços e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora com mistura. O tampão de bloqueio foi removido e as placas lavadas três vezes com 0,4 mL de tampão de lavagem. Diluições em série dos anticorpos de teste PD-L1 foram preparadas em PBS e 0,1 mL de Ab diluído foi adicionado por cavidade. As placas foram incubadas 1 hora à temperatura ambiente. A solução de anticorpo foi removida e as placas lavadas três vezes com 0,4 mL de tampão de lavagem por cavidade. Anticorpo anti-humano de cabra marcado com peroxidase de raiz forte, IgG anti-humano F(ab')2 específico F(ab')2 (Jackson Immunoresearch # 109-036-097) foi diluído 1: 2.000 com PBS e adicionado 0,1 mL por cavidade. As placas foram incubadas 1 hora à temperatura ambiente e lavadas com 0,4 mL por meio de tampão de lavagem. 0,1 mL de reagente TMB (Invitrogen) foi adicionado e incubado durante 1 a 5 minutos em temperatura ambiente. A reação foi interrompida por adição de 0,05 mL de HCl 1N e a absorbância foi lida a 450 nm em Um Espectro Bio-Tek. A EC50 calculada para anticorpos anti-PD-L1 leva a PD-L1 mostrou que a maioria dos condutores possui boa atividade de ligação bem como MPDL3280A (Ref Ab) por ELISA direto (Fig. 4). Determinação da atividade de ligação para IgG específicos de PD-L1 por FACS

[0063] Os condutores de anticorpos purificados (condutores anti-PD-L1) foram também aplicados para citometria de fluxo para determinar e comparar a atividade de ligação com células HEK293 expressas em PD-L1. A figura 5 mostra a atividade de ligação de correspondentes condutores de anticorpos como indicado por FACS com células PD-L1 HEK293 expressas estáveis.

[0064] A análise FACS da expressão estável de PD-L1 293 células marcadas com anticorpo anti-PD-L1 leva a examinar a atividade de ligação de PD-L1, células de expressão estáveis foram incubadas com 1 μg/mL de anticorpos anti-PD-L1 purificados, anticorpo de referência (Ref Ab MPDL3280A) ou com anticorpo de isótipo como controle negativo sobre gelo durante 1 hora. As células foram lavadas três vezes com 1 xPBS e em seguida incubadas com IgG Anti-Humano de cabra Alexa-488-conjugado (H + L) (Invitrogen Inc) em gelo por 1 hora adicional. Após a coloração, as células foram lavadas três vezes com 1 xPBS, ressuspensas em FBS 1 x PBS/2% antes de analisadas por FACS Calibur (BD Biosciences, Inc) e FlowJo (TreeStar, LLC). Como mostrado na Figura 5, a maioria dos anticorpos anti- PD-L1 tem uma boa atividade de ligação bem como anticorpo de referência. Isto indicou que os clones de fagos selecionados a partir da biblioteca OmniMab de fato reconhecem o PD-L1 nativo nas células. Ligação de competição de ligante (Ensaio ELISA)

[0065] Os condutores de anticorpos mostraram a seletividade de ligação e o ensaio de afinidade usados para avaliar os fios anti-PD-L1 dos anticorpos da presente invenção para a sua capacidade de bloquear a ligação de PD- L1 a PD-1.

[0066] Anticorpos foram testados quanto à sua capacidade de bloquear a ligação da quimera de PD-L1-Fc Humana (PD-L1-Fc) à PD-1 humana Recombinante/His (hPD- 1/His) por ELISA. hPD-1/His recombinante purificado (APBio) foi dialisado para 1 mg/mL Em PBS e em seguida diluído a 5 μg/mL em PBS. Nunc Maxisorp 96 poços foram revestidos com 250 ng de hPD-1/His por poço em PBS durante a noite. A solução de h PD-1/His foi removida e as placas foram lavadas três vezes com 0,4 mL de tampão de lavagem (Tween- 20 a 0,1% em PBS). 0,4 mL de tampão de bloqueio (5% de pó de leite com baixo teor de gordura em PBS) foi adicionado a todos os poços e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora com mistura. Durante a etapa de bloqueio, os estoques de anticorpos foram diluídos em uma faixa de 200 nM a 0 nM em PBS com diluição em série de 2 vezes. Quimera de PD-L1- Fc Recombinante purificada foi diluída a 4 μg/mL em PBS. As placas revestidas de PD-1/His foram lavadas três vezes com 0,2 mL de tampão de lavagem (Tween 20 a 0,1% em PBS). 60 μL de diluições de anticorpo (anticorpos anti-PD-LI) ou Ref Ab MPDL3280A) foram adicionados sozinhos com 60 μL de Quimera de PD-L1-Fc e Incubados em temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas como descrito anteriormente. IgG humana de peroxidase de raiz forte, anticorpo específico Fc foi diluído 1: 2.000 em PBS, 100 μL da solução resultante adicionada aos poços da placa lavada e incubadas à temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas conforme descrito anteriormente, 100 μL de solução de substrato TMB foram adicionados a cada poço e incubados durante 10 minutos. A reação foi interrompida com 50 μL de HCl 1N e absorbância a 450 nm lida usando leitora de Bio- Tek e mostrou na Figura 6. Condutores parciais de anticorpos mostraram inibir a interação entre PD-1-PD-L1 por ELISA de competição. A maioria dos condutores de anticorpos revelou uma atividade de bloqueio similar à comparação com o anticorpo de referência (Ref Ab MPDL3280A). Estimulação melhorada da ativação da célula T por inibição de PD-1. Interação do ligante PD-L1 para o anticorpo anti- PD-L1

[0067] A via de sinalização de PD-1 inibe os sinais coestimuladores de TCR/CD28 moderado, com a produção de citocina sendo reduzida primeiramente sem uma Diminuição na proliferação de células T. Como os sinais coestimuladores de TCR/CD28 enfraquecem, O caminho de PD-1 domina, com uma grande redução na produção de citoquinas acompanhada por uma redução na proliferação. Consequentemente, a fim de confirmar que a inibição do PD-1 através da inibição da interação com PD-L1, os anticorpos humanos da invenção aumentam a ativação da célula T, as reações de linfócito mistas (MLRs) são realizadas.

[0068] Monócitos de sangue integral humano foram enriquecidos por Coquetel de Enriquecimento de monócito humano Rosetesep™ (Cat no 15068) e cultivados em meio de diferenciação, RPMI 1640 com FBS a 10%, 100 ng/mL (1000 U/mL) GM-CSF, 100 ng/mL (500 U/mL) durante 6 dias. As células dendríticas diferenciadas (DC) de monócito foram verificadas por DC-SIGN-PE, anti-CD 14 conjugado com FITC Ab, Anti-CD83 conjugado com PE Ab, ou Anti-CD80 conjugado com FITC Ab para Validar A diferenciação e usada para ser APCs em MLRs.

[0069] Células T CD4+ alogênicas de sangue integral humano foram isoladas por Coquetel de Enriquecimento de Células CD4+ CD4+ T rosetesep ® (Cat NO 15062). A pureza das células CD4+ T foi verificada com o APC conjugado anti-CD4 Ab para assegurar que a pureza esteja acima de 95% e, então, marcada com 1 μM de CFSE (Kit de proliferação celular celitract ™ CFSE, Life technologies, Cat NO C34554) Para o ensaio De proliferação de células T. Células T CD4+ marcadas foram usadas para co- cultura com DC imaturo com diferentes condutores de anticorpos como indicado por 3 e 5 dias para ver se os condutores de anticorpos podem restaurar a ativação da célula T através do bloqueio da interação entre PD-1 e PD- L1. Após 3 e 5 dias de incubação, o sobrenadante foi coletado para citoquina, tal como a Quantificação de IL-2 e IFN- por ELISA. A adição de anticorpos anti-PD-L1 (clones 6,32,28, 51, 64, 27 e 37) a culturas de células dendríticas imaturas mais células T alogênicas é prevista como resultado em um aumento na proliferação De células T e produção de citocina, em comparação com as culturas tratadas com IgG de Isótipo (Iso # 1, # 2) e mostrou nas figuras 7A E 7B. O aumento de produção de IL-2 e IFN- resulta significativamente nas MLRs como comparando com o tratamento com anticorpo de isótipo após 3 dias (Fig. 7A) ou 5 dias (figura 7B) tratamento de anticorpos, especialmente para o clone de anticorpo anti-PD-L1 6. O incremento de citoquinas é ainda obviamente após 5 dias de tratamento com anticorpo e similar ao anticorpo de referência (ref), MPDL3280A. Isto indicou que o clone de anticorpo anti-PD-L1 6 deve ser um dos condutores potenciais para o composto de anticorpos biespecíficos. Construção, Expressão e Purificação do anticorpo Antil-PD- L1-VID

[0070] Uma vez que o biespecífico é projetado como IgG Com base em domínio de inibição de VEGF, o clone de anticorpo anti-PD-L1 6 é designado como forma IgG, por outro lado, o domínio de ligação de VEGF, dl E D2, no receptor de VEGF É fundido no terminal C Da região Fc No anticorpo anti-PD-L1 Do clone 6. Uma vez que o isótipo Fc ou Fc engenheirado é importante para melhorar a eficácia ou a produção dos anticorpos biespecíficos em células mamíferas; portanto, dois tipos Fc diferentes, IgG4 (SEQ ID NO 7) e IGg1 engenheirado (elgG1, expressão de Citotoxidade Mediada por Células dependentes de Anticorpos (ADCC), SEQ ID NO 8) foi usada para construção biespecífica. A construção de anticorpos anti-PD-L1 biespecíficos Fc fundida com VID (SEQ ID NO 9) foi representada na Figura 8. Um ligante de peptídeo flexível curto (GGGGS) 3 (SEQ ID NO 10) foi colocado entre, por exemplo, o Terminal C-terminal de cadeia pesada de anticorpo Anti-PD-L1 da região Fc (SEQ ID NO 4) e o módulo N-terminal de VID para assegurar a dobra correta e minimizar o impedimento estérico. As sequências de codificação de cadeia pesada anti-PD-L1-VID para IgG4 e elGg1 foram mostradas em SEQ ID NO 12 e NO 13. As proteínas de fusão Fc de anticorpo construído foram tratadas por um peptídeo de sinal (SEQ ID NO 11) e expressas por células mamíferas, e purificadas a partir do sobrenadante da cultura celular transfectada através de cromatografia de proteína G de 1 etapas. Como mostrado na Figura 9, maior do que 95% de pureza pode ser obtida em um processo de purificação de etapa única e mostra que proteínas de fusão purificadas têm peso molecular correto (Mw = 220 kDa). Uma vez que a taxa de baixa pureza ou recuperação é a principal questão para o anticorpo biespecífico ou a produção de proteína de fusão na produção química, de fabricação e controle (CMC); portanto, ambos os anticorpos biespecíficos purificados foram também aplicados para a coluna de eluição de tamanho (SEC) Com cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) Para avaliar a pureza dos anticorpos biespecíficos (Figs. 10A.10B). Ambos os anticorpos biespecíficos, anti-PD-L1-VID/IgG4 (Fig. 10A) ou anti-PD-L1-VID/elgG1 (figura 10B), revelou que a pureza é maior do que 99% de pureza na análise SEC-HPLC. Esta implicada no formato pode ser processada facilmente no desenvolvimento de CMC e proporcionar a taxa bem sucedida no desenvolvimento adicional.

[0071] Como mostrado na Figura 8, A estrutura do anticorpo monoclonal anti-imunização Fc-terminalmente fundida com VID. Em algumas modalidades, anticorpo pode ser anticorpos anti-imunes inibidores, tais como anti-PD-L1, anti-PD-1, anti-CTLA4, anti-LAG3, etc., ou anticorpos estimulantes, tais como anti-CD28, anti-CD 137, anti-CD27,

anti-ICOS, etc. ou receptor/antígeno de superfície celular, tal como HER2, EGFR, Etc. um ligante é colocado Entre anticorpo Fc e VID para gerar o anticorpo biespecífico. Afinidade de ligação das Proteínas de Fusão para PD-L1 e VEGF165

[0072] Um ensaio imunossorvente ligado a enzima de ligação direta (ELISA) foi usado para medir a afinidade de ligação dos anticorpos biespecíficos a PD-L1 ou VEGF165, Uma variante de junção de VEGF-A uma proteína de captura De VEGF recombinante (VEGFR-Fc) e Anticorpo anti-PD-L1 Parental foi Usada como controle positivo 1 para PD-L1 E VEGF, respectivamente. A VEGFR-Fc, aflibercept, é um receptor de VEGF solúvel que foi desenvolvido para uso terapêutico e é atualmente aprovado pela administração de alimento e fármaco dos EUA (FDA) para tratar degeneração macular relacionada à idade (AMD). VEGFR-Fc contém o segundo domínio semelhante a Ig (D2) De VEGFR1 fundido ao terceiro Domínio semelhante a Ig (D3) de VEGFR2 Fundido à região Fc de IgG1 Humano (Holash et al, 2002).

[0073] 100 μL de uma solução de revestimento (1 μg/mL de VEGF165 em solução salina Tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2) foram adicionados a cada poço de uma placa ELISA de 96 cavidades, e a placa foi incubada durante a noite a 4° C. as cavidades foram lavadas duas vezes com 400 μL De tampão PBS, e o líquido em excesso foi cuidadosamente removido com uma toalha de papel. 400 ΜL de uma solução de bloqueio (5% de leite desnatado não gorduroso em PBS) foram adicionados a cada poço, e a placa foi incubada em temperatura ambiente por 1 hora. As cavidades foram lavadas duas vezes com tampão PBS. Anticorpos biespecíficos e amostras de controle foram serialmente diluídos três vezes na solução de bloqueio, com a concentração de proteína mais elevada de 100 nM. 100 µL das amostras serialmente diluídas foram adicionados a cada poço. A placa foi coberta e incubada em um agitador de placa (cerca de 100 rpm) durante 1 hora em temperatura ambiente. Os poços foram lavados três vezes com tampão de lavagem (Tween-20 a 0,05% em PBS). 100 μL de 1: 2500 diluídos com peroxidase de raiz forte-IgG anti-humano IgG anti-humano em solução de bloqueio foram adicionados a cada poço. As placas foram seladas e incubadas em um agitador de placa por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem. 100 ΜL de substrato TMB foram adicionados a cada poço, e as placas foram incubadas durante 3 a 5 minutos para permitir que a reação ocorra. Para parar a reação, 100 μL de solução de parada (1N HCl) foram adicionados a cada poço. A densidade ótica (OD) de cada poço foi determinada usando um leitor de placas ELISA (Bio-Tek) a um comprimento de onda de absorção de 450 nm. A absorbância foi plotada contra a concentração de proteína da proteína de fusão ou do controle, e a concentração na qual o sinal foi metade da concentração efetiva máxima (EC50) foi determinada. Enquanto isso, a atividade de ligação de PD-L1 para ambos os anticorpos biespecíficos foi também realizada como um cenário similar conforme descrito acima, exceto que os anticorpos biespecíficos ligados foram detectados por IgG anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre, anticorpos F(ab')2 específicos de F(ab')2

[0074] Como os dados mostrados na Figura 11A, a afinidade de ligação, expressa como o valor de EC50, foi de 0,075 para ambos anticorpos anti-PD-L1-VID/IgG4 e anti- PD-L1-VID/elgG1 para proteína de PD-L1 recombinante. Ambos os anticorpos biespecíficos possuem uma atividade de ligação de comparação bem como controle positivo, anticorpo anti-PD-L1 Clone 6 (0,1 nM). Enquanto isso, o resultado foi também registrado para o teste de atividade de ligação de VEGF. Como os dados mostrados na Figura 11B, ambos os anticorpos biespecíficos mostraram uma atividade de ligação ao VEGF Similar em comparação com o controle positivo, VEGFR-Fc (Aflibercept). A atividade de ligação não é afetada tanto em anticorpos biespecíficos para o PD-L1 Quanto para a atividade de ligação do VEGF. Inibição da proliferação de HUVEC Pelos Anticorpos biespecíficos antil-PD-L1-VID

[0075] Um ensaio de proliferação de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) foi realizado para testar A funcionalidade do anticorpo biespecífico na invenção. VEGFR-Fc Foi usado como um controle positivo como descrito acima. 100 ΜL de uma solução de revestimento (1% de gelatina em água destilada dupla) foram adicionados a cada poço de uma placa ELISA de 96 cavidades, e a placa foi incubada durante 2 horas ou durante a noite a 37° C. as cavidades foram lavadas duas vezes com tampão PBS. 3500 células de Células HUVEC em meio de crescimento de células endoteliais foram adicionadas a cada poço, e a placa foi incubada durante a noite a 37° C. A amostra conforme indicado foi diluída em tampão de ensaio (meio-199 1 x sais de Earle, 10% de soro bovino fetal, 10 mM HEPES, 1 antibiótico/antimicótico), com uma concentração de proteína mais elevada de 30 nM. As amostras foram misturadas com

VEGF165 (8 ng/mL), e as misturas foram incubadas durante a noite em temperatura ambiente. As cavidades foram então lavadas com 200 μL de PBS. 100 µL de mistura de VEGF165/amostra foram adicionados a cada poço, e as placas foram incubadas durante 72 horas a 37° C com CO2 a 5%. Após a incubação, 10 μL de reagente de detecção de MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4- sulfofenil)-2 H-tetrazólio) + metossulfato de fenazina em PBS destilado) foram adicionados a Cada cavidade, e as placas foram incubadas a 37° C por 2,5 horas. A OD de cada poço foi determinada usando um leitor de placas ELISA (Bio- Tek) em um comprimento de onda de absorbância de 490 nm. A absorbância foi plotada contra a concentração de proteína da amostra de teste, e a concentração na qual a proliferação celular foi inibida por 50% (IC50) foi determinada. A inibição da proliferação celular (IC50) foi determinada como estando entre 0,1070 e 0,1233 nM para as proteínas de fusão testadas da invenção. Um dos anticorpos biespecíficos, anti-PD-L1-VID/elgG1, revelou uma melhor inibição do que outro anticorpo biespecífico, anti-PD-L1- VID/IgG4 (figura 12, 0,1070 nM vs 0,1233 nM). O IC50 de anti-PD-L1-VID/elgG1 é bom bem como controle positivo, VEGFR-Fc (0,1072 nM). Estimulação melhorada de ativação de células T para anticorpos Biespecíficos Anti-PD-L1-VID/elgG1 terminais em MLRs

[0076] Para determinar a funcionalidade antagonística do anticorpo biespecífico para melhorar a ativação das células T através Da inibição da interação entre PD-1 E PD-L1. Os condutores de anticorpos biespecíficos, anticorpos anti-PD-L1-VID/elgG1, foram aplicados em MLRs Como descrito acima. A produção de IL-2 e IFN- foi então registrada após 3 ou 5 dias de tratamento de anticorpos. Anticorpo mono- ou biespecifico foi aplicado como um mol igual para comparar a funcionalidade antagonística em aumento de ativação de célula T e IgG de Isótipo foi usado como um controle negativo. Como os dados mostrados nas Figuras 13A e 13B, o Anticorpo anti-PD-L1- VID/elgG1 mostrou uma indução de IL2 significativa após 3 dias de tratamento e caído após 5 dias de tratamento. O perfil de produção de citocina é altamente similar ao anticorpo de referência, MPDL3280A. Enquanto isso, a produção de IFN- também é regulada e acumulada no anticorpo biespecífico conduz o tratamento após 3 ou 5 dias de tratamento. Isto indicou que o anticorpo biespecífico anti-PD-L1-VID/elgG1 também possui funcionalidade antagonística na ativação Da célula T bem como um anticorpo de referência sem perda de quaisquer atividades da presente invenção. Estabilidade do soro In vitro do anticorpo biespecífico anti-PD-L1-VlD/elgG1

[0077] Anti-PD-L1-VID/elgG1 purificado foram incubados com soro (15 μg/mL) de espécies diferentes como indicado a 37° C em banho de água. Amostras de soro contendo os anticorpos biespecíficos purificados foram tomadas em diferentes pontos de tempo até 14 dias. As concentrações do anticorpo biespecífico nas amostras de soro serão determinadas usando-se um ensaio ELISA Prensado como abaixo. Os poços pré-revestidos de VEGF165 (1 μg/mL) foram incubados com concentrações tituladas de anticorpo biespecífico anti-PD-L1-VID/elgG1 para ser a curva padrão para calcular a concentração de Abs no soro (preparação fresca, dia 0). Amostras colhidas de diferentes pontos de tempo foram também aplicadas a poços de VEGF165 pré- revestidos para detecção. Após a lavagem com 0,1 % de Tween-20 em PBS, os Abs intactos e ligados foram detectados por PD-L1-Fc biotinilado e estreptavidina conjugada com HRP Antes do desenvolvimento da cor. A concentração de Abs no soro foi calculada por método de interpolação e então a meia-vida de Abs é plotada como mostrado nas Figuras 14A, 14B e 14C. A meia-vida de anti-PD-L1-VID/elgG1 é mais longa do que 8 dias ou em cinomólogo (8,6 dias), camundongo (9,2 dias) ou soro humano (11,9 dias). A meia vida longa poderia fornecer flexibilidade de utilização do anticorpo biespecífico com menor frequência de administração em estudo animal ou experiência clínica no futuro. Atividade Antitumoral de anticorpo biespecifico (modelo In Vivo)

[0078] A falta de reatividade cruzada de roedores da PD-L1 em anticorpos biespecíficos impediu o uso de modelos de tumor de xenoenxerto singênico ou de xenoenxerto humano padrão para a avaliação da eficácia tumoral anti-humana dos anticorpos. Consequentemente, foi gerado um novo modelo de camundongo de tumor xenogênico huPBL-SCID-Bg usando um camundongo SCID-Bg (CB.17/Icr.Cg PkrdcscidLystbg/Crl), que abriga a mutação bege (Bg) sem Linfócitos T e B de Murino e células NK funcionais. A eficácia tumoral anti-humana dos anticorpos biespecíficos foi avaliada usando este modelo conforme descrito abaixo

[0079] A próstata humana PC-3 foi obtida da

American Type Culture Collection e foi cultivada em RPMI- 1640 (Invitrogen) com L-glutamina, piruvato de sódio, penicilina/estreptomicina e 10% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS, Gibco Cat No 10437). As células foram crescidas até a confluência em frascos de T-150 Falcon. Subsequentemente, as células foram tripsinizadas (Tripsina 0,25%-EDTA; Invitrogen) e o crescimento foi aumentado até um número de células suficiente para a inoculação. Os linfócitos de sangue periférico (PBMCs) foram isolados de sangue heparinizado utilizando-se Lymphoprep™ de Acordo com o protocolo do fabricante (STEMCELL Technologies Inc.). As suspensões de células contadas foram combinadas de modo que cada camundongo 6 recebeu uma injeção de 0,75 x 10 PBMCs e 3 x 106 células tumorais em uma única injeção de bolo de 0,1 mL em PBS. A fim de facilitar o crescimento das células tumorais no camundongo, outro 0,1 mL de matrigel foi então misturado com a suspensão celular combinada e então imediatamente injetado para a preparação de camundongos.

[0080] Para cada camundongo, 0,2 mL de volume da suspensão celular combinada foi injetada subcutaneamente no flanco direito do animal. Após 14 dias de inoculação, o tumor sólido é formado e atingido em torno de 250 a 300 mm3 e o anticorpo biespecífico (10 mg kg) ou anticorpo de controle é desafiado duas vezes por semana durante três a quatro semanas com uma injeção intraperitoneal (i.p.). A medição do Tumor foi feita através do calibre Pressier duas vezes por semana assim como a administração de amostras de teste para a duração dos experimentos e pesos corporais também foram registrados. O volume de Tumor foi calculado usando o seguinte cálculo: comprimento x largura2 x 0,44 = volume (mm3) e traçado na figura 15A. Os camundongos foram removidos do estudo no caso em que o volume tumoral atingiu

2.000 mm3 ou animal perdido 20% do peso corporal antes da terminação do experimento. Resultados similares foram observados quando os tumores foram medidos no dia 7 pós- inoculação, e os animais foram randomizados de acordo com o volume tumoral. Para estudo animal, cada grupo continha 6 camundongos. Como os dados apresentados na Figura 15A, o anticorpo biespecifico mostrou uma eficiência antitumoral significativa no modelo de camundongo enxertado com PC-3. O tamanho do tumor é menor após 18 dias após a inoculação tumoral bem como o anticorpo de referência PD-L1 e continuado a reduzir abaixo de 200 mm3. Fig. 15B mostra que o tratamento de anticorpos biespecíficos de tamanho de tumor é significativo menor do que o tratamento de isótipo ou anticorpo de referência no dia 35 após a inoculação. Ela indicou que o anti-PD-L1-VID/elgG1 Abs tem o efeito sinérgico na atividade antitumoral no animal. O modelo de camundongo enxertado com PC-3 é preliminarmente demonstrado como antitumoral de anticorpo biespecífico e revelou seu potencial para ser um meio terapêutico de fármacos no futuro.

[0081] Coletivamente, estes resultados indicaram que anticorpos biespecíficos mantêm seu bloqueio de ponto de verificação imune em sinalização de PD-1/PD-L1 e neutralizaram a proteína pró-angiogênica, VEGF. Estudos estão em andamento para investigar ainda mais a atividade biológica destas proteínas, utilizando-se um modelo animal apropriado, tal como o tumor PC-3 no modelo NOD.Cg-Prkdcscid

II2rgtmwjl/SzJ (NSG) humanizado.

[0082] A região Fc na presente invenção poderia ser a partir de quaisquer isótipos, subclasses, alótipos, ou mutantes engenheirados, tais como fragmento Fc de botão e buraco (s).

EXEMPLOS

[0083] O exemplo abaixo descreve a geração de anticorpos monoclonais adequados para o propósito terapêutico alvo de PD-L1 e VEGF humano. Os domínios compósitos, Anti-humano PD-L1 e VEGF neutralizado foram gerados a partir do clone de anticorpo anti-PD-L1 e domínio de aprisionamento de VEGF dos receptores de VEGF humano, respectivamente. Segmentos de sequência de região V humana foram originados de bancos de dados de sequência de anticorpos humanos não relacionados (linhagem germinativa e não germinativa). Exemplo 1 Geração de anticorpos IgG que se ligam a PD-L1 e

VEGF

[0084] Certos anticorpos fornecidos pela presente invenção foram originalmente gerados a partir de Fabs se ligam a PD-L1 humana. As Fabs foram selecionadas a partir de uma biblioteca de exibição de fagos, a Biblioteca de fagemídeo OmniMab, seguindo-se a análise Alternada em proteínas de fusão Fc correspondentes (PD-L1-Fc) e células que expressam proteína correspondente humana (PD-L1). Após triagem de ELISA direta, os clones positivos foram então sequenciados para cadeia pesada e cadeia leve. Estes Fabs incluíram aqueles que são designados como OM-PD-L1-6 ", e" OM-PD-L1-32 ", etc. para PD-L1. Os anticorpos PD-L1 PD-L1- Clone 6 e o Clone PD-L1 32 apresentados neste pedido foram gerados a partir de" OM-PD-L1-6 "e" OM-PD-L1-32 " em Células HEK293 ou células CHO-S. Anticorpo biespecifico alvo PD-L1 E VEGF Simultaneamente foi projetado como anticorpo anti-PD-L1-VID (domínio De inibição de VEGF). A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve e região variável da cadeia pesada de um dado Fab são idênticas à sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve e região variável da cadeia pesada, respectivamente. Exemplo 2 ligação In vitro de anticorpo biespecífico anti-PD-L1-VID A seu Alvo correspondente

[0085] [0104] Anticorpo biespecífico Anti-PD- L1-VID Foi construído como mostrado na figura 8 e expresso nas células HEK293 ou células CHO-S. O anticorpo biespecifico contendo meio foi purificado por afinidade a partir do sobrenadante da cultura por cromatografia de Proteína G. O anticorpo purificado é então concentrado, seguido por diálise em tampão PBS e analisado por SDS-PAGE como mostrado na Figura 9Para testar a ligação direta de proteínas de fusão purificadas a PD-L1 ou VEGF165 em ELISA, 100 ng de PD-L1 recombinante foram revestidos em uma placa ELISA de 96 poços. Várias concentrações de anti-PD-L1-VID Abs purificadas foram então adicionadas a cada poço e incubadas durante 1 hora. Após a lavagem, diluição de 1: 5000 de anticorpo monoclonal anti-Fab ou anti-Fc (Jackson Immunochemicals) foi adicionada a cada poço e incubada durante uma outra hora. Após a lavagem final, o substrato TMB (Invitrogen Inc.) foi adicionada e a absorbância OD a 450 nm foi medida. Os dados analisados por ajuste de curva sigmoidal utilizando GraphPad Prism 5 e EC50 São calculados. Exemplo 3 Especificidade de ligação de antígeno de anti-PD-L1-VID Por análise FACS

[0086] Para testar a especificidade de ligação de anti-PD-L1-VID, células 293 de expressão de PD-L1 estáveis, A549 ou WIDr estimuladas com IFN-, foram coradas com 1 μg/mL de Anticorpo anti-PD-L1-VID Abs durante 1 hora em gelo antes de lavar três vezes com 1X PBS. As proteínas de fusão do anticorpo ligado foram detectadas com IgG anti- Humano de cabra conjugado Alexa-488 (H + L) seguido por Análise FACS. Anticorpo de isótipo foi usado como controle negativo para o teste. Os resultados mostraram anti-PD-L1- VID Abs para sua especificidade de ligação ao antígeno em comparação com anti-PD-L1 sozinho.

[0087] Para testar a especificidade de ligação anti-PD-L1-VID, a expressão estável de células 293-L1 293 (células renais embrionárias humanas), a A549 estimulada por IFN- (carcinoma de pulmão) ou NCI-H292 (carcinoma pulmonar mucoepidermóide) foram corados com 1 μg/mL de anticorpo anti-PD-L1-VID Abs por 1 hora em gelo antes de lavar três vezes com 1x PBS. As proteínas de fusão do anticorpo ligado foram detectadas com IgG de Cabra conjugado Alexa-488 (H + L) seguido por Análise FACS. Anticorpo de isótipo foi usado como controle negativo para o teste. Os resultados mostraram anti-PD-L1-VID Abs para sua especificidade de ligação ao antígeno em comparação com anti-PD-L1 sozinho (figuras 16 A, 16B e 16C).

Exemplo 4 efeito imunomodulador In vitro de anticorpo anti-PD-L1-VID biespecífico

[0088] Para medir a capacidade das células T- L1-VID Para modular A responsividade a células T, Células T purificadas Serão cultivadas com células dendríticas alogênicas, preparadas por cultivo de monócitos em GM-CSF E IL-4 por poucos dias. Placas paralelas foram estabelecidas para permitir a coleta de sobrenadantes no dia 3 e dia 5 para medir IL-2 e IFN- respectivamente utilizando um kit ELISA comercial. O anti-PD-L1 humanizado do Genentech/Roche, MPDL3280A, será produzido em casa e usado como controle positivo. Como os dados mostrados nas Figuras 13A e 13B, a produção de IL2 e IFN- é altamente regulada no tratamento de anticorpos biespecíficos bem como anticorpo de referência após 3 ou 5 dias de tratamento de anticorpos. Ela revelou que o anticorpo biespecífico ainda possui a capacidade de inibir a interação de PD-1/PD-L1 Entre células T e células dendríticas para ativar a atividade da célula T. Exemplo 5: expansão de leucócitos Humanos induzida por anticorpos biespecíficos in vivo

[0089] A falta de reatividade cruzada detectável do anticorpo PD-L1 com PD-L1 de murino e a necessidade de presença de células imunes humanas requereram o desenvolvimento de modelos para a avaliação funcional in vivo dos anticorpos biespecíficos. Os camundongos com o antecedente genético NOD portando a mutação imunodeficiente e imunodeficiente (SCID) e a deficiência na cadeia gama comum do receptor de IL-2 (comumente denominado NSG) são capazes de suportar o enxerto de grande número de leucócitos sanguíneos periféricos humanos (huPBL) e manter o enxerto por pelo menos 30 Dias (King et al, 2008). Este modelo de camundongo, também conhecido como modelo huPBL-NSG, foi usado para avaliar o efeito funcional da administração sistémica in vivo dos anticorpos em células imunes humanas.

[0090] Especificamente, 6 milhões de PBMCs Humanas recém-isoladas foram adotivamente transferidas através de injeção intravenosa em camundongos huPBL-NSG. Nove dias após injeções de PBMC, os animais foram administrados a uma única 1 mg/kg de anticorpo mono- anticorpo, anticorpo biespecífico ou anticorpo de controle de isótipo através de injeção intraperitoneal. No dia 24 a 28 dias de enxerto de PBMC, PBMC foram coradas com anticorpos para CD45 humano e murino avaliadas via citometria de fluxo. Perfis de dispersão para frente e lateral foram usados para determinar uma porta de linfócitos. Anticorpos biespecíficos foram capazes de aumentar a expansão de leucócitos humanos conforme evidenciado pela proporção aumentada de células CD45 + humanas no sangue periférico de camundongos enxertados. Para cada grupo, n ≥ 6 camundongos. Exemplo 6 Inibição do Crescimento de células tumorais PC-3 ou A498 em huPBL-NSG por anticorpo antl-PD-L1-VID/elgG1

[0091] Linhagem celular de câncer de próstata humana positiva de PD-L1, PC-3 (ATCC# CRL-1435) ou linhagem celular de câncer de rim, A498 (ATCC® HTB-44 ®) pode ser usada para estabelecer modelos de xenoenxerto em camundongos huPBL-NSG. Para a formação de tumor, 3 x IO6 Células PC-3 (ou Células A498)/camundongo serão injetadas subcutaneamente em camundongos huPBL-NSG conforme descrito acima. A fim de avaliar os efeitos inibidores do crescimento tumoral, diferentes concentrações de anticorpo anti-PD-L1-VID/elgG1, anticorpo de referência, ou anticorpo de isótipo de 0,1 - 3 mg/kg serão administrados intravenosamente duas vezes por quatro semanas nos camundongos após 14 dias de implantação de células tumorais. O crescimento de tumor será medido duas vezes por semana até 5 semanas conforme descrito no modelo de camundongos Bege de Fox Chase SCID ®. Exemplo 7 Avaliação Farmacocinética de antl-PD-L1-VID/elgG1 Em camundongos e macacos

[0092] 10 mg/kg a 40 mg/kg de proteínas bifuncionais, anti-PD-L1-VID/elgG1 serão administrados em camundongos ou macacos através de injeção subcutânea ou injeção intravenosa. Amostras de soro serão tomadas em diferentes pontos de tempo após a injeção até 15 dias. As concentrações da proteína de fusão Fc nas amostras de soro serão determinadas utilizando-se um ensaio ELISA prensado.

[0093] Embora a descrição tenha sido descrita a título de exemplo (s) e em termos da modalidade preferida (s), deve ser entendido que a descrição não é limitada à mesma. Ao contrário, pretende-se cobrir várias modificações e disposições e procedimentos similares, e o escopo das reivindicações anexas deve, portanto, receber a interpretação mais ampla de modo a abranger todas essas modificações e disposições e procedimentos similares.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno do mesmo compreendendo pelo menos uma cadeia de polipeptídeo, em que a cadeia de polipeptídeo compreendendo: uma proteína de superfície celular de ligação de domínio de ligação; e um domínio de inibição de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).

2. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de superfície celular compreendendo um ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), proteína de morte de célula programada 1 (PD-1), receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2), antígeno associado a Linfócitos T citotóxico 4 (CTLA-4), gene de ativação de linfócito 3 (LAG3), atenuador de linfócitos B- e T (BTLA), OX40 (cluster de diferenciação 134, CD134), CD27, CD28, membro da superfamília de receptor de fator de necrose tumoral 9 (TNFRSF9 ou CD137), co-estimulador da célula T indutível (ICOS Ou CD278), CD40, ou uma combinação dos mesmos.

3. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 2, em que o domínio de ligação liga o PD-L1, e o domínio de ligação compreende: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs 4 e 6; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em aminoácidos 1-111 da SEQ ID NO 3 e 1-110 da SEQ ID NO 5.

4. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 1, em que o domínio de inibição de VEGF É de receptor de VEGF humano 1 (VEGFR-1) ou receptor de VEGF Humano 2 (VEGFR-2).

5. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 1, em que o domínio de inibição de VEGF compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs 1,2,9, 14,15,16, 17,18,19, 20,21,22, 23,24,25, 26, 27, e uma combinação das mesmas.

6. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 1, em que a cadeia polipeptídica compreende ainda: um domínio Fc; e um fragmento Fab conectado ao terminal N do domínio Fc, e o fragmento Fab que compreende o domínio de ligação, em que o domínio de inibição de VEGF é conectado ao terminal C do domínio Fc.

7. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 6,

compreendendo ainda um ligante entre o domínio Fc e o domínio de inibição de VEGF.

8. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 7, em que o anticorpo biespecífico compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO 12 Ou 13.

9. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma compreende um par de cadeias de polipeptídeo.

10. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 9, em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou Gama.

11. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 10, em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo IgG.

12. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 11, em que o anticorpo IgG É um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

13. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 12, em que o anticorpo IgG1 é uma redução da citotoxidade mediada por células dependentes de anticorpos do anticorpo IgG1.

14. Anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo humano.

15. Composição farmacêutica compreendendo:

um anticorpo biespecifico ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

16. Conjugado anticorpo-fármaco compreendendo: um agente terapêutico; e um anticorpo biespecifico ou uma ligação de fragmento de ligação a antígeno PD-L1 e/ou um domínio de inibição de VEGF, em que o agente terapêutico é covalentemente conjugado ao anticorpo ou ao fragmento de ligação a antígeno por um ligante.

17. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 16, em que o anticorpo biespecífico ou o fragmento de ligação a antígeno é selecionado conforme definido na reivindicação 3.

18. Método de tratamento de câncer, o método compreendendo administrar ao indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz do anticorpo biespecífico ou porção de ligação a antígeno da mesma da reivindicação 1.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula Não Pequena (NSCLC), melanoma, linfoma, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma de Células renais (RCC) e câncer ovariano.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que a quantidade eficaz é de 0,001 μg/kg a 250 mg/kg.

21. Molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo ou A porção de ligação a antígeno da reivindicação 3.

22. Método para diagnóstico de câncer em um indivíduo, compreendendo: (a) obter uma amostra de fluido corporal ou uma amostra de células de um sujeito; (b) contactar a amostra com um ou mais anticorpos que podem detectar a expressão de um painel de marcadores de câncer selecionados do grupo consistindo em PD-L1 e VEGF; (c) ensaiar a ligação de um ou mais anticorpos à amostra de fluido ou a amostra de células; e (d) avaliar a condição de câncer do indivíduo em um ensaio através da medição e comparação do nível de ligação de anticorpos com um controle normal para determinar a presença do câncer no indivíduo.