TWI595006B - 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法 - Google Patents

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Description

抗PD-1抗體類和使用彼等之方法
本發明關於抗體類，例如結合PD-1之全長抗體類。本發明進一步關於包含抗PD-1抗體類之組成物及使用抗PD-1抗體類作為藥劑之方法。某些具體態樣關於使用抗PD-1抗體類於各式疾病之治療、預防及/或診斷之方法，該疾病包括過度增生疾病，諸如癌症。
PD-1係50至55kDa之第I型跨膜受體，其起初係在經歷活化誘導之細胞凋亡的T細胞系中被識別。PD-1係表現於T細胞、B細胞及巨噬細胞上。PD-1之配體係B7家族成員PD-L1(B7-H1)及PD-L2(B7-DC)。
PD-1係免疫球蛋白(Ig)超家族之成員，該超家族在其胞外區含有單個Ig V-樣結構域。PD-1細胞質結構域含有二個酪胺酸，具有最接近於膜的酪胺酸(小鼠PD-1中的VAYEEL)位於ITIM(免疫受體酪胺酸基底抑制模體)內。PD-1上ITIM的存在表明此分子功能為藉由召集細胞質磷酸酶而削弱抗原受體的傳信(signaling)。人類和鼠類PD-1 蛋白共享大約60%的胺基酸一致性，具有保守之四個潛在的N-糖基化位點，及定義Ig-V結構域的殘基。細胞質區中的ITIM及羧基末端酪胺酸周圍的ITIM-樣模體在人類和鼠類進化同源物(orthologue)之間亦是保守的。
癌症免疫療法已傳統上涉及使用細胞與經個體化且費時之製劑的複雜方法。最近，基於遞送至適應免疫系統之壓抑信號的中斷的單克隆抗體基底癌症免疫療法，已顯示於臨床中現有全身性免疫療法之設定內有希望。然而，本領域對於獲得癌症之更安全且更有效之治療有持續需求。
本發明提供選擇性地與PD-1交互作用之抗體類。已證明某些抗PD-1抗體係有效於活體內預防及/或治療癌症。有利地，本文中所提供之抗PD-1抗體類結合人類、馬來猴及小鼠之PD-1。亦有利地，本文中所提供之抗PD-1抗體類有效於活體內刺激T細胞增生。
本文中提供專一性結合PD-1且預防或減少PD-1之生物效應之經分離之拮抗劑抗體類。於一些實施態樣中，該拮抗劑抗體可為，舉例來說，人類、人源化或嵌合抗體。本文中所揭示之發明係針對結合PD-1之抗體類。
於一種面向中，本發明提供一種經分離之拮抗劑抗體，其專一性結合PD-1，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含該VH的VH互補決定區1(CDR1)、VH CDR2及VH CDR3，該VH具有選自SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6所組成群組之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含該VL的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，該VL具有選自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9所組成群組之胺基酸序列。
於一些實施態樣中，該VH區包含示於SEQ ID NO：3、4、5或6之胺基酸序列、或彼在非CDR內之殘基具有一或數個保守性胺基酸取代之變體及/或該VL包含示於SEQ ID NO：2、7、8或9之胺基酸序列、或彼在非CDR內之胺基酸具有一或數個胺基酸取代之變體。於一些實施態樣中，該抗體包含：包含示於SEQ ID NO：39之胺基酸序列之輕鏈及/或包含示於SEQ ID NO：29或38之胺基酸序列之重鏈。於一些實施態樣中，該抗體包含具有ATCC登錄號PTA-121183之表現載體所產製之VH區。於一些實施態樣中，該抗體包含具有ATCC登錄號PTA-121182之表現載體所產製之VL區。
於另一種面向中，本發明提供一種經分離之抗體，其專一性結合PD-1，其中該抗體包含：包含示於SEQ ID NO：13、14或15之胺基酸序列之VH CDR1、包含示於SEQ ID NO：16、17、24、25、27、28、35或36之胺基酸序列之VH CDR2、包含示於SEQ ID NO：18、23、26或37之胺基酸序列之VH CDR3、包含示於SEQ ID NO：10、22、30或32之胺基酸序列之VL CDR1、包含示於SEQ ID NO：11、20或33之胺基酸序列之VL CDR2及包 含示於SEQ ID NO：12、21、31或34之胺基酸序列之VL CDR3。
於一些實施態樣中，該抗體可為人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。於一些實施態樣中，該抗體係單克隆抗體。
於一些實施態樣中，該抗體包含恆定區。於一些實施態樣中，該抗體具有人類IgG1、IgG2、IgG2△a、IgG3、IgG4、IgG4△b、IgG4△c、IgG4 S228P、IgG4△b S228P及IgG4△c S228P亞型。於一些實施態樣中，該抗體具有IgG4同型且包含經安定絞鏈，例如S228P。
於另一種面向中，本發明提供一種經分離之抗體，其專一性結合PD-1且與如本文中所述之該抗體類競爭及/或結合相同PD-1表位。
於一些實施態樣中，本文中所提供之抗PD-1抗體促進T細胞分泌IFNγ及/或TNF。
於一些實施態樣中，本文中所提供之抗PD-1抗體促進T細胞增生。
於一些實施態樣中，本文中所提供之抗PD-1抗體抑制腫瘤生長。
於一些實施態樣中，本文中所提供之抗PD-1抗體結合人類PD-1與小鼠PD-1。
於另一種面向中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含治療有效量之PD-1抗體及醫藥上可接受之載劑。
於另一種面向中，本發明提供一種經分離之多核苷 酸，其包含編碼如本文中所述之PD-1抗體之核苷酸序列。於另一種面向中，本發明提供一種載體，其包含該多核苷酸。
於另一種面向中，本發明提供一種經分離之宿主細胞，其重組產製如本文中所述之PD-1抗體。
於另一種面向中，本發明提供一種產製抗PD-1拮抗劑抗體之方法，該方法包括：將重組產製如本文中所述之抗體之細胞系培養於其中該抗體被產製之條件下；及回收該抗體。
於另一種面向中，本發明提供一種產製抗PD-1拮抗劑抗體之方法，該方法包括：將包含編碼抗體之核酸之細胞系培養於其中該抗體被產製之條件下，其中該抗體包含：包含示於SEQ ID NO：29或38之胺基酸序列之重鏈及包含示於SEQ ID NO：39之胺基酸序列之輕鏈；及回收該抗體。
於一些實施態樣中，該重鏈與輕鏈係編碼在個別載體上。於其他實施態樣中，重鏈與輕鏈係編碼在相同載體上。
於另一種面向中，本發明提供一種用於治療個體之狀況(condition)之方法，其包含對需要彼之個體投予有效量之如本文中所述之醫藥組成物。於一些實施態樣中，該症狀係癌症。於一些實施態樣中，該癌症係選自胃癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、頭部和頸部癌症、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲狀腺癌、肺癌、卵巢癌、 乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、膠質瘤、白血病、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、膀胱癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、口腔癌、皮膚癌及黑色素瘤所組成群組。於一些實施態樣中，該個體係具有局部晚期或轉移黑色素瘤、鱗狀細胞頭的頸癌(SCHNC)、卵巢惡性腫瘤、肉瘤、或復發或難治的經典霍奇金氏淋巴瘤(cHL)之先前經治療的成人病患。於一些實施態樣中，該癌症可為鉑抗性及/或鉑難治癌症，諸如，例如鉑抗性及/或難治卵巢癌、鉑抗性及/或難治乳腺癌、或鉑抗性及/或難治肺癌。於一些實施態樣中，抗PD-1抗體以劑量約0.5mg/kg、約1.0mg/kg、約3.0mg/kg或約10mg/kg投予。於一些實施態樣中，該抗PD-1抗體以每7、14、21或28天投予一次。於一些實施態樣中，該抗PD-1抗體係經靜脈內或皮下投予。
於另一種面向中，本發明提供一種抑制具有腫瘤之個體之腫瘤生長或惡化之方法，其包含對該個體投予有效量之如本文中所述之醫藥組成物。
於另一種面向中，本發明提供一種抑制或預防個體之癌細胞轉移之方法，其包含對需要彼之該個體投予有效量之如本文中所述之醫藥組成物。
於另一種面向中，本發明提供一種誘導具有PD-1表現腫瘤之個體之腫瘤緩解之方法，其包含對該個體投予有效量之如本文中所述之醫藥組成物。
於一些實施態樣中，本文中之該抗體可非經腸地投予 至個體。於一些實施態樣中，該個體係人類。
於一些實施態樣中，該方法可進一步包含投予有效量之第二治療劑。於一些實施態樣中，該第二治療劑係，舉例來說，克里唑替尼(crizotinib)、帕博西尼(palbociclib)、抗CTLA4抗體、抗4-1BB抗體、或第二PD-1抗體。
也提供者係一種如本文中所述之該抗PD-1拮抗劑抗體之任一者於製造在需要彼之個體內用於癌症治療或用於抑制癌症生長或惡化之藥劑之用途。於一些實施態樣中，該抗PD-1拮抗劑抗體減少該個體之重量增加。
亦提供者係一種在需要彼之個體內用於癌症治療或用於抑制癌症生長或惡化之抗PD-1拮抗劑抗體。於一些實施態樣中，該癌症係，舉例來說但不限於，胃癌、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、白血病、頭部和頸部癌症、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲狀腺癌、肺癌(包括，例如非小細胞肺癌)、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、膠質瘤、白血病、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、膀胱癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、口腔癌、皮膚癌及黑色素瘤。
於另一種面向中，本揭露提供一種用於增進用在哺乳動物癌症治療之疫苗的免疫原性效應或治療效應之方法，該哺乳動物特別是人類，該方法包含對接受該疫苗之該哺乳動物投予有效量之本揭露所提供之抗PD-1拮抗劑抗體。
於另一種面向中，本揭露提供一種用於治療哺乳動物癌症之方法，該哺乳動物特別是人類，該方法包含對該哺乳動物投予(1)有效量之能引發抗該癌細胞的免疫反應的疫苗及(2)有效量之本揭露所提供之抗PD-1拮抗劑抗體。
第1A圖繪示總結經抗PD-1拮抗劑抗體處理之小鼠體重的圖。
第1B圖繪示總結經抗PD-1拮抗劑抗體處理之小鼠體重的圖。
第1C圖繪示總結經抗PD-1拮抗劑抗體處理之小鼠體重的圖。
第1D圖繪示總結經抗PD-1拮抗劑抗體處理之小鼠體重的圖。
第1E圖繪示總結經抗PD-1拮抗劑抗體處理之小鼠體重的圖。
第2A圖繪示總結抗PD-1抗體結合初級人類經活化T細胞之EC50的圖。
第2B圖繪示總結抗PD-1抗體結合初級馬來猴經活化T細胞之EC50的圖。
第3圖繪示總結所培養之經活化CD4 T細胞增生的柱狀圖，該T細胞係經如下處理者：(a)無抗體；(b)同型對照；(c)EH12.1；(d)C1；(e)C2；(f)C3；(g)mAb1；(h)mAbX；(i)mAb4；(j)mAb5；(k)mAb6；(l)mAb7； (m)mAb9；(n)mAb10；(o)mAb11；(p)mAb14；(q)mAb15；(r)mAb16。
第4圖繪示總結所培養之經活化CD8 T細胞增生的柱狀圖，該T細胞係經如下處理者：(a)無抗體；(b)同型對照；(c)EH12.1；(d)C1；(e)C2；(f)C3；(g)mAb1；(h)mAbX；(i)mAb4；(j)mAb5；(k)mAb6；(l)mAb7；(m)mAb9；(n)mAb10；(o)mAb11；(p)mAb14；(q)mAb15；(r)mAb16。
本文中所揭示者為專一性結合PD-1之抗體類。係提供作出抗PD-1抗體類之方法、包含這些抗體之組成物及使用這些抗體作為藥劑之方法。抗PD-1抗體類可用於抑制腫瘤惡化，及可用於癌症及/或其他疾病之預防及/或治療中。
一般技術
除非另行表明，否則實施本發明將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習用技術，其係於本領域之通常知識內。此等技術係於文獻中充分解釋，諸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian細胞(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)。
定義
除非另行表明，下述用語將理解成具有下述意義：用語「經分離之分子」係指稱憑藉其衍生起源或來源係如下之分子(其中該分子為，例如多肽、多核苷酸或抗體)：(1)係不與在其天然狀態下伴隨其之天然相關成分結合；(2)係實質上不含來自相同來源，例如物種、其係從之表現的細胞、庫、等之其他分子；(3)係被來自不同物種之細胞表現；或(4)係不在天然中發生。因此，經化學合成之分子、或在不同於從之其係天然起源之系統的細胞系統中表現之分子，將與其天然相關成分「分離」。也可藉由使用該領域廣為週知之純化技術的分離，使分子實質上不含天然相關成分。分子純度或同質性(homogeneity)可藉由該領域廣為週知之多種手段檢測。舉例來說，多肽樣品之純度可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳與使用該領域廣為週知之技術染色該凝膠，以視覺化該多肽而檢測。為了某些目的，可藉由使用HPLC或該領域廣為週知之其他純化手段提供更高解析。
「抗體」係免疫球蛋白分子，其係能透過位在該免疫球蛋白分子之可變區中的至少一個抗原辨認位點專一性結合目標，諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽、等。除非另行具體指明，本文中所使用之該用語不僅涵蓋完整多克隆或單克隆抗體類，也包含與該完整抗體競爭專一性結合之任何彼之抗原結合部份、包含抗原結合部份之融合蛋白及包含抗原辨認位點之免疫球蛋白分子的任何其他經 修飾構形。抗原結合部份包括，舉例來說Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、結構域抗體(dAb，例如鯊魚及駱駝抗體)、包括互補決定區(CDR)之片段、單鏈可變片段抗體(scFv)、大型抗體(maxibodies)、迷你抗體(minibodies)、細胞內抗體(intrabodies)、雙價抗體(diabodies)、三價抗體、四價抗體、v-NAR及雙-scFv，及含有足以授予該多肽專一性抗原結合之免疫球蛋白的至少一部分之多肽。抗體包括任何類型之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或彼等之亞型)，且該抗體不需要是任何特定類型。取決於其之重鏈恆定區之抗體胺基酸序列，免疫球蛋白可被分派到不同類型中。有五種主要的免疫球蛋白類型：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且這些中的數種可進一步分成亞型(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應不同類型免疫球蛋白之該等重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型免疫球蛋白的次單元結構及三維構形係熟知。
抗體之「可變區」係指稱不論是單獨或組合之抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。如該領域已知，重鏈及輕鏈之可變區各由下列所組成，並有助於形成該抗體之抗原結合位點：藉由三個互補決定區(CDR)連接之四個架構區(FR)，CDR亦稱為超變異區。若所欲者為個體可變區之變體，特別是在CDR區外(亦即，在架構區中)之胺基酸殘基具有取代者，適當之胺基酸取代，較佳地保守性胺基酸取代，可藉由比較該個體可變區與其含有和該個體可變區 相同之典範類型(canonincal class)中的CDR1及CDR2序列之其他抗體的可變區而識別出(Chothia and Lesk,J Mol Biol 196(4)：901-917,1987)。
在某些實施態樣中，明確劃定CDR及識別包含抗體結合位點的殘基係藉由拆解該抗體之結構及/或拆解該抗體-配體複合物之結構完成。在某些實施態樣中，其可藉由該領域具有通常知識者所知之各式技術中的任一者完成，諸如X光結晶學。在某些實施態樣中，各式分析方法可被用於識別或估計該CDR區。在某些實施態樣中，各式分析方法可被用於識別或估計該CDR區。此等方法之實施例包括但不限於卡巴(Kabat)定義、柯西亞(Chothia)定義、AbM定義、接觸定義及構形定義。
卡巴定義係用於編號抗體中殘基之標準，且係典型用於識別CDR區。見例如Johnson & Wu,2000,Nucleic Acids Res.,28：214-8。柯西亞定義與卡巴定義相似，但柯西亞定義考慮某些結構圈環區之位置。見例如Chothia et al.,1986,J.Mol.Biol.,196：901-17；Chothia et al.,1989,Nature,342：877-83。AbM定義使用Oxford Molecular Group產製之整合套裝電腦程式，其模型化抗體結構。見例如Martin et al.,1989,Proc Natl Acad Sci(USA),86：9268-9272；“AbMTM,A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies,”Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd。AbM定義係使用知識資料庫與全始演算方法之組合，諸如那些由Samudrala et al.,1999,“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach,”in PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3：194-198描述者，而自一級序列模型化抗體之三級結構。接觸定義係基於可得複合物結晶結構之分析。見例如MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,5：732-45。於另一種在本文中指稱為CDR之「構形定義」的途徑中，CDR之位置可經識別為對抗原結合作出焓貢獻之殘基。見例如Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166。還有其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述途徑中之一者，但還是將與卡巴CDR之至少一部份重疊，雖然它們可能根據特定殘基或殘基群不顯著影響抗原結合之預測或實驗結果而被縮短或延長。本文中所使用之CDR可指稱，藉由該領域已知之任何途徑，包括多種途徑之組合所定義之CDR。本文中所使用之方法可利用根據這些途徑中任一者所定義之CDR。對於含有超過一種CDR之任何給定實施態樣而言，該CDR可根據卡巴、柯西亞、延長、AbM、接觸及/或構形定義中任一者加以定義。
如該領域已知者，抗體之「恆定區」係指稱單獨或經組合之抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。
本文中所使用之「單克隆抗體」係指稱自實質上同質之抗體族群獲得之抗體，亦即，除了可能少量出現之可能天然發生之突變以外，組成該族群之個別抗體係完全相同的。單克隆抗體係高度專一性，其係針對單個抗原位點。 再者，與其係典型包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體的多克隆抗體製劑相反的是，各單克隆抗體係針對抗原上之單一決定簇。修飾語「單克隆」表明抗體係自實質上同質之抗體族群獲得之特徵，不應被視為需要藉由任何特定之方法產製該抗體。舉例來說，待根據本發明使用之單克隆抗體可藉由最早由Kohler and Milstein,1975,Nature 256：495所描述之融合瘤方法作成，或可藉由重組DNA方法諸如美國專利第4,816,567號所述者作成。該單克隆抗體亦可自使用，舉例來說，McCafferty et al.,1990,Nature 348：552-554描述技術所產生之噬菌體庫分離。本文中所使用之「人源化」抗體係指稱為下述者之非人類(例如鼠類)抗體之形式：含有衍生自非人類免疫球蛋白之最少序列之嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或彼等之片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體之其他抗原結合子序列)。較佳地，人源化抗體係人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之CDR的殘基被來自非人類物種(捐贈者抗體)諸如具有所欲專一性、親和性及能力之小鼠、大鼠或兔等之CDR的殘基置換。該人源化抗體可包含既不在接受者抗體也不在經導入之CDR或架構序列中找到，但卻被包括以進一步改進及最佳化抗體表現之殘基。
「人類抗體」係一種其具有對應由人類產製之抗體的胺基酸序列及/或已使用如本文中所揭示之用於作成人類抗體之技術的任一者所作成者。這個人類抗體的定義具體排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。
用語「嵌合抗體」係意欲指稱其中可變區序列係衍生自一個物種且恆定區序列係衍生自另一個物種之抗體，諸如其中可變區序列係衍生自小鼠抗體且恆定區序列係衍生自人類抗體之抗體。
用語「表位」係指稱分子中能被抗體在該抗體之一或多個抗原結合區所辨認且被結合的部份。表位經常由分子諸如胺基酸或糖側鏈之表面集合所組成，且具有特定三維結構特徵及特定帶電特徵。於一些實施態樣中，表位可為蛋白表位。蛋白表位可為線性或構形。在線性表位中，在蛋白與交互作用分子(諸如抗體)之間的所有交互作用點係沿著該蛋白之一級胺基酸序列線性發生。「非線性表位」或「構形表位」包含對該表位具專一性之抗體所結合之抗原性蛋白內之不連續多肽(或胺基酸)。本文中所使用之用語「抗原性表位」係定義為可被抗體專一性結合之抗原的部份，該結合藉由該領域熟知之任何方法，例如藉由習用之免疫檢測法決定。一旦決定在抗原上之所欲表位，可產生針對該表位之抗體，例如使用本說明書中所述之技術。替代地，在發現期間，抗體之產生及特徵化可闡釋有關所欲表位之資訊。由此資訊即有可能競爭性地篩選結合相同表位之抗體。一種達成此之途徑係進行競爭及交叉競爭研究，以找到彼此競爭或交叉競爭結合PD-1之抗體，例如競爭結合抗原之抗體。
本文中所使用之用語「PD-1」係指稱任何形式之PD-1及彼等之變體，該變體係保留至少部份PD-1活性。除 非不同地表明，諸如藉由具體提及人類PD-1，否則PD-1包括所有哺乳動物物種之天然序列PD-1，例如人類、犬、貓、馬及牛。一種例示性人類PD-1係發現為Uniprot登錄號Q15116(SEQ ID NO：1)。
用語「促效劑」係指稱其係促進(亦即，誘導、造成、增進或增加)另一種分子之生物活性或效應之物質。該用語促效劑涵蓋其係結合受體諸如抗體之物質，及其係促進受體功能但不結合受體(例如藉由活化經相關蛋白)之物質。
用語「拮抗劑」或「抑制劑」係指稱預防、阻斷、抑制、中和或減少另一種分子，諸如受體之生物活性或效應之物質。
用語「拮抗抗體」係指稱結合目標且預防或減少該目標之生物效應之抗體。於一些實施態樣中，該用語可表示抗體預防止其所結合之目標，例如PD-1施行生物功能
本文中所使用之「抗PD-1拮抗劑抗體」係指稱能抑制PD-1生物活性及/或PD-1媒介之一或多個下游事件之抗體。抗PD-1拮抗劑抗體涵蓋阻斷、拮抗、壓抑或減少(至任何程度，包括顯著地)PD-1生物活性之抗體，該生物活性包括PD-1媒介之下游事件、此PD-L1結合及下游傳信、PD-L2結合及下游傳信、T細胞增生之抑制、T細胞活化之抑制、IFN分泌之抑制、IL-2分泌之抑制、TNF分泌之抑制、IL-10之誘導及抗腫瘤免疫反應之抑制。就本發明之目的而言，將明確理解用語「抗PD-1拮抗劑抗 體」(可交換使用之用語「拮抗劑PD-1抗體」、「拮抗劑抗PD-1抗體」、或「PD-1拮抗劑抗體」)涵蓋藉以實質上廢止、降低或中和任何有意義程度之PD-1本身、PD-1生物活性或該生物活性之後果之所有先前識別之用語、名稱、功能狀態及功能特徵。於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體結合PD-1且上調抗腫瘤免疫反應。抗PD-1拮抗劑抗體之實施例係提供於本文中。
在本文中可交換使用之用語「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白」，係指稱任何長度之胺基酸鏈。該鏈可為線性或分支，其可包含經修飾之胺基酸及/或可能被非胺基酸中斷。該等用語亦涵蓋經天然或干預修飾之胺基酸鏈；舉例來說，雙硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標籤成份共軛。也包括在該定義內者為，舉例來說，含有一或多個胺基酸類似物(包括舉例來說非天然胺基酸等)之多肽，及含有該領域習知之其他修飾之多肽。應理解的是該多肽可以單個鏈或經相關鏈存在。
如該領域已知，本文中可交換使用之「多核苷酸」或「核酸」，係指稱任何長度之核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。該核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或他們的類似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶納入鏈中之基質。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及他們的類似物。若出現的話，對核苷酸結構之修飾可在該鏈組裝之前或之後授 予。核苷酸之序列可被非核苷酸成份中斷。多核苷酸在聚合之後可進一步被修飾，諸如藉由與標籤成份共軛而被修飾。其它種類之修飾包括，例如「加蓋(cap)」、以類似物取代一或多個天然發生之核苷酸、核苷酸間修飾諸如，舉例來說那些具有不帶電鏈結(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸醯胺化物、胺基甲酸酯等)及帶電鏈結(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、那些含有側基團(moieties)者，諸如例如蛋白(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)、那些具有嵌入劑(intercalator)者(例如吖啶、補骨脂素等)、那些含有螯合劑者(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、那些含有烷化劑者、那些具有經修飾之鏈結者(例如α異位性核酸等)及該(等)多核苷酸之未經修飾形式。另外，原本出現於糖類中之羥基的任一者可能被，舉例來說膦酸基、磷酸基置換；被標準保護基保護或被活化以製備與其他核苷酸之額外鏈結；或可能共軛至固體支持物。該5’及3’端OH可被磷酸化或被胺類或自1至20個碳原子之有機加蓋基團取代。其他羥基亦可被衍生成為標準保護基。多核苷酸亦可包含該領域一般已知之核糖或去氧核糖糖類之類似形式，包括舉例來說2’-O-甲基-核糖、2’-O-烯丙基核糖、2’-氟代-核糖、2’-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α或β異位性糖類、差向異構體糖類諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖糖類、呋喃糖糖類、景天酮庚糖、非環類似物及無鹼基核苷類似物諸如甲基核糖苷。一或多個磷酸二酯鏈結可被替代性鏈結基 置換。這些替代性鏈結基包括但不限於其中磷酸鹽被P(O)S(「硫代鹽」)、P(S)S(「二硫代鹽」)、(O)NR2(「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(「甲縮醛」)置換之實施態樣，其中各R或R’係獨立地H或經取代或未經取代之烷基(1至20個碳)，該烷基可視需要地含有醚(-O-)鏈結、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。多核苷酸中之所有鏈結不需要完全相同。前面的敘述適用於本文中所提及之所有多核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文中所使用，當藉由本文中之實施例7所揭示之方法測量之平衡解離常數係等於或小於20nM、較佳地小於約6nM、更佳地小於約1nM、最佳地小於約0.2nM時，抗體係與PD-1「交互作用」。
「優先結合」或「專一性結合」(在本文中可互換使用)至表位之抗體，係該領域理解清楚之用語，且決定此種專一性或優先結合之方法也為該領域熟知。若分子與特定細胞或物質反應或結合係與其與替代性細胞或物質反應或結合相比更頻繁、更快速、有更長持續時間及/或有更高親和性，則該分子被稱為展現「專一性結合」或「優先結合」。若抗體與目標之結合係與其結合其他物質相比有更高親和性、親合力(avidity)、更快速及/或有更長持續時間，則該抗體係「專一性結合」或「優先結合」至目標。舉例來說，專一性或優先地結合PD-1表位之抗體，係以與其結合其他PD-1表位或非PD-1表位相比更高之親和性、親合力、更快速及/或有更長持續時間結合此表位之 抗體。藉由閱讀此定義也可理解，舉例來說，專一性或優先結合第一目標之抗體(或基團或表位)可能會或可能不會專一性或優先結合第二目標。因此，「專一性結合」或「優先結合」不一定需要(雖然其可包括)排他性結合。一般來說，但不必然，提及結合係意指優先結合。
本文中所使用之「實質上純的」係指稱其為至少50%純的(亦即不含汙染物)，更佳地至少90%純的，更佳地至少95%純的，甚至更佳地至少98%純的，且最佳地至少99%純的物質。
「宿主細胞」包括可以是或已經是一或多種用以納入多核苷酸插入物之載體的接受者之個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之後代，且該後代可能由於天然、意外或蓄意突變而不一定與原始親代細胞(在形態學或基因學DNA互補上)完全相同。宿主細胞包括以一或多個本發明之多核苷酸在活體內轉染之細胞。
如該領域已知，用語「Fc區」係用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區。該「Fc區」可能為天然序列Fc區或變體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可有變化，人類IgG重鏈Fc區通常被定義為從Cys226或Pro230位置之胺基酸殘基伸出至彼之羧基端。Fc區中之殘基編號係如卡巴所述之EU指數(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。免疫球蛋白之Fc區一般包含二個恆定結構域， CH2及CH3。如該領域已知，Fc區可呈二聚體或單體形式出現。
該領域所使用之「Fc受體」或「FcR」描述結合抗體之Fc區之受體。較佳之FcR係天然序列人類FcR。另外，較佳之FcR係一種其係結合IgG抗體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞型，包括這些受體之等位基因變體及替代性地經剪切形式之受體。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其等具有相似之胺基酸序列但主要差異在彼等之細胞質結構域。FcR係於Ravetch and Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9：457-92；Capel et al.,1994,Immunomethods,4：25-34；及de Haas et al.,1995,J.Lab.Clin.Med.,126：330-41中回顧。「FcR」也包括新生兒受體FcRn，其負責轉運母體IgG至胎兒(Guyer et al.,1976,J.Immunol.,117：587；及Kim et al.,1994,J.Immunol.,24：249)。
本文中關於抗體所使用之用語「競爭」，意指第一抗體或彼之抗原結合部份係以充份相似於第二抗體或彼之抗原結合部分之結合的方式結合表位，而使得第一抗體與其之同源表位在第二抗體存在下之結合結果與該第一抗體在第二抗體不存在下之結合相比可偵測地降低。替代情況可以是但不一定是，其中該第二抗體與其之表位之結合也因第一抗體之存在而可偵測地降低。也就是說，第一抗體可抑制第二抗體與第二抗體之表位之結合，而不會有第二抗體抑制該第一抗體與第一抗體之表位之結合。然而，當各 抗體不論以相同、較高或較低程度可偵測地抑制另一個抗體與其之同源表位或配體結合時，該等抗體被稱為彼此「交叉競爭」結合他們分別之一或多個表位。本發明涵蓋競爭抗體及交叉競爭抗體二者。不論此種競爭或交叉競爭所藉以發生之機轉為何(例如空間位阻、構形改變或結合共同表位或彼之部分)，本領域具有通常知識者將了解，基於本文中所提供之教示，本教示係涵蓋此種競爭及/或交叉競爭抗體且其等可有用於本文所揭示之方法。
「功能性Fc區」具有天然序列Fc區之至少一種效應子功能。例示性「效應子功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調等。此等效應子功能一般需要該Fc區與結合結構域(例如抗體可變結構域)組合，且可使用該領域已知之各式用於評價此等抗體效應子功能之檢測法評估。
「天然序列Fc區」包含與在天然中發現之Fc區的胺基酸序列完全相同之胺基酸序列。「變體Fc區」包含其憑藉至少一個胺基酸修飾而與天然序列Fc區有差異，但仍保留該天然序列Fc區之至少一種效應子功能的胺基酸序列。較佳地，該變體Fc區與天然序列Fc區或親代多肽之Fc區相比具有至少一個胺基酸取代，例如在天然序列Fc區或親代多肽之Fc區中自約1至約10個胺基酸取代，且較佳地自約1至約5個胺基酸取代。本文中之變體Fc區將較佳地具有與天然序列Fc區及/或與親代多肽之 Fc區至少約80%之序列一致性，最佳地與彼具有至少約90%之序列一致性，更佳地與彼具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%之序列一致性。
本文中所使用之「治療」係用於獲得有益或所欲臨床結果之途徑。就本發明之目的而言，有益或所欲之臨床結果包括但不限於下列之一或多者：減少腫瘤細胞或癌細胞增生(或摧毀腫瘤細胞或癌細胞)、抑制腫瘤細胞轉移、縮小或降低腫瘤體積、緩解癌症、降低癌症所導致之症狀(symptom)、增加患有癌症者的生活品質、降低治療癌症所需之其他藥劑之劑量、延緩癌症之惡化、治癒癌症及/或延長具有癌症之病患的存活。
「改善」意指與未投予抗PD-1拮抗劑抗體相比有減輕或改進一或多種症狀。「改善」也包括縮短或減少症狀之持續時間。
本文中所使用之藥物、化合物或醫藥組成物之「有效劑量」或「有效量」係足以致效任何一或多種有益或所欲結果之量。於更特定之面向中，有效量預防、緩和或改善疾病之症狀，及/或延長經治療個體的存活。就預防性用途而言，有益或所欲結果包括消除或減少風險、減輕嚴重性或延遲疾病之開始，包括疾病之生化學、組織學及/或行為學之症狀、其之併發症及在疾病發展期間所出現之中間病理學表現型。就治療性用途而言，有益或所欲結果包括臨床結果諸如減少疾病之一或多種症狀，該疾病諸如舉 例來說癌症，該癌症包括舉例來說但不限於胃癌、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、白血病、頭部和頸部癌症、鱗狀細胞頭的頸癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲狀腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、膠質瘤、白血病、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、膀胱癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、口腔癌、皮膚癌及黑色素瘤；降低治療該疾病所需之其他藥劑之劑量；增進另一種藥劑之效應；及/或延緩病患之該癌症之惡化。有效劑量可採一或多次投予。就本發明之目的而言，藥物、化合物或醫藥組成物之有效劑量係足以直接或間接完成預防性或治療性治療之量。如在臨床上所理解的，藥物、化合物或醫藥組成物之有效劑量可與或不可與另一藥物、化合物或醫藥組成物組合達成。因此，「有效劑量」可在投予一或多種治療劑之情況中被考慮，且可考慮給予有效量之單一劑，若與一或多種其他劑組合時可能或會達成所欲之結果。
「個體(individual)」或「個體(subject)」係哺乳動物，更佳者係人類。哺乳動物也包括但不限於農場動物(例如，牛、豬、馬、雞等)、競賽動物、寵物、靈長動物、馬、狗、貓、小鼠及大鼠。
本文中所使用之「載體」係指建構體，其能在宿主細胞中遞送及較佳地表現一或多種感興趣之基因或序列。載體之實施例包括但不限於病毒性載體、裸DNA或RNA表現載體、質體載體、黏質體載體、噬菌體載體、與陽離子 性縮合劑有關之DNA或RNA表現載體、包封於脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞諸如產製者細胞。
本文中使用之「表現控制序列」意指引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子或增強子。表現控制序列係可操作地鏈結待轉錄之核酸序列。
本文中所使用之「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」包括任何當其與活性組分組合時允許該組分保留生物活性且不與個體之免疫系統反應之任何物質。實施例包括但不限於任何標準醫藥載劑諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液諸如油/水乳液及各式種類之潤濕劑。較佳之用於氣霧劑或非經腸投予之稀釋劑係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理(0.9%)鹽水。包含此等載劑之組成物係由眾所週知之習知方法調製(見例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing,2000)。
本文中所使用之用語「kon」係指稱抗體與抗原結合之速率常數。具體地，該等速率常數(kon及koff)及平衡解離常數係利用全長抗體及/或Fab抗體片段(即單價)與PD-1測量。
本文中所使用之用語「koff」係指稱抗體自抗體/抗原 複合物解離之速率常數。
本文中所使用之用語「KD」係指稱抗體-抗原交互作用之平衡解離常數。
在本文中提及「約」某數值或參數時，包括(且描述)針對該數值或參數本身之實施態樣。舉例來說，提及「約X」之敘述包括對「X」之敘述。數值範圍包含定義該範圍之上下限數字。
用語「免疫效應子細胞之增進子」或「IEC增進子」，係指稱能增加或增進哺乳動物中一或多個種類的免疫效應子細胞之數目、品質或功能之物質。免疫效應子細胞之實施例包括細胞溶解性CD8 T細胞、CD4 T細胞、NK細胞及B細胞。
用語「免疫調節劑」係指稱能改變(例如，抑制、降低、增加、增進或刺激)宿主哺乳動物之天生、體液或細胞性免疫系統的任何成分的免疫反應(如本文中所定義)或工作之物質。因此，用語「免疫調節劑」涵蓋如本文中所定義之「免疫效應子細胞之增進子」及如本文中所定義之「免疫壓抑細胞之抑制劑」，及影響哺乳動物免疫系統的其他成分之物質。
用語「免疫反應」係指稱宿主哺乳動物之免疫系統抗特定物質(諸如抗原或免疫源)之任何可偵測反應，諸如天生免疫反應(例如，鐸(Toll)受體傳信級聯)、細胞媒介之免疫反應(例如T細胞媒介之反應，諸如免疫系統之抗原專一性T細胞及非專一性細胞)及體液免疫反應(例如，B 細胞媒介之反應，諸如產生及分泌抗體至細胞質、淋巴及/或組織液中)。
用語「免疫源性」，係指稱在佐劑存在下或沒有佐劑，不論是單獨或當鏈結載劑之物質對特定抗原造成、引發、刺激或誘導免疫反應；或改進、增進、增加或延長預先存在之免疫反應的能力。
用語「免疫壓抑細胞之抑制劑」或「ISC抑制劑」，係指稱能減少或壓抑哺乳動物免疫壓抑細胞之數目或功能之物質。免疫壓抑細胞之實施例包括調控型T細胞(「T reg」)、骨髓衍生壓抑細胞及腫瘤相關巨噬細胞。
於投予物質至包括人類之哺乳動物之內文中，用語「皮內投予」或「皮內地投予」，係指稱遞送該物質至該哺乳動物皮膚之真皮層中。哺乳動物皮膚係由表皮層、真皮層及皮下層所組成。表皮層是皮膚的外層。真皮，係皮膚的中間層，含有神經末梢、汗腺與油脂(皮脂)腺、毛囊及血管。皮下層是由脂肪及容置較大血管及神經之結締組織所作成。與皮內投予對比，「皮下投予」係指稱投予物質至皮下層中，而「外用投予」係指稱投予物質至皮膚表面上。
用語「腫瘤病症」，係指稱其中細胞以不正常地高且不受控之速率增生之狀況，該速率超出且不同步於周圍正常組織所具者。其通常導致實體病變或稱為「腫瘤」之塊。此用語涵蓋良性及惡性腫瘤病症。用語「惡性腫瘤病症」，於本揭露中其係與用語「癌症」可交換使用，係指 稱以腫瘤細胞擴散至身體中其他位置之能力(稱為「轉移」)為特徵之腫瘤病症。用語「良性腫瘤病症」，係指稱其中腫瘤細胞缺乏發生轉移之能力之腫瘤病症。
用語「預防(preventing)」或「預防(prevent)」，係指稱(a)使病症免於發生或(b)延緩病症開始或延緩病症之症狀開始。
用語「腫瘤相關抗原」或「TAA」，係指稱其係被腫瘤細胞專一性表現或被腫瘤細胞以與相同組織種類之非腫瘤細胞相比較高頻率或密度表現之抗原。腫瘤相關抗原可為正常不被宿主表現之抗原；他們可經突變、截短、錯誤折疊、或正常被宿主表現之分子的其他方式不正常表現；他們可與正常表現之分子完全相同但以不正常水平表現；或他們可以在不正常之情況或環境中表現。腫瘤相關抗原可為，舉例而言，蛋白或蛋白片段、複合碳水化合物、神經節苷脂、半抗原、核酸、或這些或其他生物分子之組合。
用語「疫苗」係指稱用於投予至哺乳動物之免疫源性組成物，其係用於於哺乳動物中引發抗特定抗原之免疫反應。疫苗典型含有相似於或衍生自該免疫反應之目標之劑，該目標諸如造成疾病微生物或腫瘤細胞。意圖用於腫瘤諸如癌症之治療之疫苗，係典型含有衍生自目標腫瘤上所發現之TAA且能引發對目標腫瘤上的TAA之免疫原性的抗原。
用語「疫苗基底免疫療法方案」係指稱其中疫苗係與 一或多種免疫調節劑組合投予之治療方案。疫苗與免疫調節劑可在單一調製劑中一起投予或個別投予。
可理解本文中只要以文字「包含(comprising)」描述實施態樣，亦提供用語「由…所組成」及/或「基本上由…所組成」所描述之其他方式類似實施態樣。
於本發明之面向或實施態樣以馬庫西群組或其他替代物群組描述處，本發明不僅涵蓋作為整體之整個所列示群組，亦包含個別之該群組之各成員及該主要群組中的所有可能亞群，且亦涵蓋沒有該群組成員中之一或多者的該主要群組。本發明亦設想明確排除所請求發明中任何該群組成員之一或多者。
除非另行定義，本文中所使用之所有技術及科學用語具有相同於技術領域具有通常知識者通常理解之意義。若發生衝突，以本說明書，包括定義為主。遍及本說明書及申請專利範圍中，用語「包含(comprise)」或變化用語諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」將被理解為意指包括所指整數或整數之群，但不排除任何其他整數或整數之群。除非上下文以其他方式要求，單數用語應包括複數意義且複數用語應包括單數意義。任何在用語「例如」或「舉例而言」之後的實施例並不具窮舉或限制之意。
雖然與本文中所述的那些方法及材料相似或相等者亦可被用於實施或測試本發明，係於本文中描述例示性方法及材料。該等材料、方法及實施例僅為例示而非意圖限 制。
抗PD-1拮抗劑抗體
本文中所提供者為抗PD-1拮抗劑抗體，其阻斷、壓抑或減少(包括顯著地減少)PD-1生物活性，包括PD-1媒介之下游事件。抗PD-1拮抗劑抗體應展現下述特徵之任一者或多者：(a)結合PD-1且阻斷下游傳信事件；(b)阻斷PD-L1結合PD-1；(c)上調T細胞媒介之免疫反應；(d)刺激IFNγ分泌；(e)刺激TNF分泌；(f)增加T細胞增生；及(g)減少透過PD-1之抑制信號轉導(signal transduction)。
為了本發明之目的，抗體較佳地以抑制PD-1傳信功能之方式與PD-1反應。於一些實施態樣中，該抗PD-1拮抗劑抗體專一性結合靈長動物PD-1。
有用於本發明之抗體可涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc、等)、嵌合抗體、雙專一性抗體、異源共軛抗體、單鏈(ScFv)、彼等之突變物、包含抗體部份之融合蛋白(例如結構域抗體)、人源化抗體及包含該所需專一性之抗原辨認區的免疫球蛋白分子之任何其他經修飾之構形，包括抗體之糖基化變體、抗體之胺基酸序列變體及經共價修飾之抗體。該抗體可為小鼠、大鼠、人類或任何其他起源(包括嵌合或人源化抗體)。於一些實施態樣中，該抗PD-1拮抗劑抗體係單克隆抗體。於一些實施態樣中，該抗體係人類或人源 化抗體。
抗PD-1拮抗劑抗體可藉由領域已知之任何方法作出。用於產製人類及小鼠抗體之一般技術係為領域已知及/或描述於本文中。
抗PD-1拮抗劑抗體可使用領域已知之方法識別或特徵化，藉此偵測及/或測量到PD-1生物活性之減少、改善、或中和。於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體係藉由培養候選物與PD-1並監測結合及/或隨之而來的PD-1生物活性之減少或中和而識別。該結合檢測法可使用，例如經純化之PD-1多肽進行，或使用天然表現(例如，各式株)或經轉染以表現PD-1多肽之細胞進行。在一種實施態樣中，該結合檢測法係競爭性結合檢測法，其中候選抗體與已知之抗PD-1拮抗劑抗體競爭與PD-1結合之能力係經評價。該檢測法可以各式格式進行，包括ELISA格式。於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體係藉由以PD-1培養候選抗體並監測結合而識別。
在初步識別之後，候選抗PD-1拮抗劑抗體之活性可藉由生物檢測法進一步確認及精細化，生物檢測法係已知用於測試經靶向生物活性。於一些實施態樣中，活體外細胞檢測法係用於進一步特徵化候選抗PD-1拮抗劑抗體。舉例來說，候選抗體以初級人類T細胞培養，且添加PD-L1，並監測IFNγ分泌。替代地，生物檢測法可被用來直接篩選候選物。
本發明之抗PD-1拮抗劑抗體展現下述特徵之一者或 多者：結合PD-1且阻斷下游傳信事件；(b)阻斷PD-L1結合PD-1；(c)上調T細胞媒介之免疫反應；(d)刺激IFNγ分泌；(e)刺激TNF分泌；(f)增加T細胞增生；(g)減少透過PD-1之抑制信號轉導；及(h)阻斷PD-L2結合PD-1。較佳地，抗PD-1抗體具這些特徵之二者或更多者。更佳地，該抗體具這些特徵之三者或更多者。更佳地，該抗體具這些特徵之四者或更多者。更佳地，該抗體具這些特徵之五者或更多者。更佳地，該抗體具這些特徵之六者或更多者。更佳地，該抗體具這些特徵之七者或更多者。最佳地，該抗體具所有八個特徵。
抗PD-1拮抗劑抗體可使用該領域已知之方法特徵化。舉例來說，一種方法係識別其所結合之表位，或稱「表位定位(epitope mapping)」。該領域有許多已知之用於定位及特徵化蛋白上表位位置之方法，包括拆解抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭檢測法、基因片段表現檢測法及合成性肽基底檢測法，如描述於，舉例來說Harlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999第11章。在一種額外實施例中，表位定位可被用於決定抗PD-1拮抗劑抗體所結合之序列。表位定位可自各式商業來源獲得，舉例來說Pepscan系統(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,The Netherlands)。該表位可為線性表位(亦即於單一伸展胺基酸含有)，或藉由不一定於單一伸展含有之胺基酸的三維交互作用所形成之構 形表位。具變化長度之肽(例如至少4至6個胺基酸長)可經分離或合成(例如重組地)，且用於抗PD-1拮抗劑抗體之結合檢測法。在另一種實施例中，抗PD-1拮抗劑抗體所結合之表位可於系統化篩選決定，該篩選藉由使用衍生自PD-1序列之重疊肽並決定抗PD-1拮抗劑抗體之結合。根據基因片段表現檢測法，編碼PD-1之開放閱讀框係經隨機分段或按特定基因建構體分段，且PD-1之該表現片段與待測試抗體之反應性被決定。該基因片段可能，舉例來說藉由PCR產製，且接著於活體外在放射性胺基酸存在下被轉錄及轉譯成蛋白。該抗體與該經放射性標籤之PD-1片段之結合接著藉由免疫沉澱及凝膠電泳決定。某些表位亦可藉由使用噬菌體粒子或酵母菌表面所展示之隨機肽序列的大型庫(噬菌體庫或酵母展示)加以識別。替代地，可於簡單結合檢測法中測試經定義之重疊肽片段庫對經測試抗體之結合。在一個額外實施例中，可施行抗原之突變形成、結構域交換實驗及丙胺酸掃描突變形成以識別表位結合所需、足夠及/或必要之殘基。舉例來說，丙胺酸掃描突變形成實驗可使用突變物PD-1施行，其中PD-1多肽之各式殘基已被丙胺酸置換。藉由評估該抗體對該突變物PD-1之結合力，可評估特定PD-1殘基對抗體結合之重要性。
又另一種方法，其可用於特徵化抗PD-1拮抗劑抗體，係使用與已知結合相同抗原(亦即PD-1之各式片段)之其他抗體的競爭檢測法，以決定該抗PD-1拮抗劑抗體 否和其他抗體一樣與相同之表位結合。競爭檢測法為該領域具有通常知識者熟知，包括ELISA格式。
抗PD-1拮抗劑抗體對PD-1之結合親和性(KD)可為約0.001至約200nM。於一些實施態樣中，該結合親和性係下列之任一者：約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、約60pM、約50pM、約20pM、約15pM、約10pM、約5pM、約2pM或約1pM。於一些實施態樣中，該結合親和性係小於下列之任一者：約250nM、約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、約50pM、約20pM、約10pM、約5pM或約2pM。
據此，本發明提供下列之任一者、或包含抗體或彼之變體之組成物(包括醫藥組成物)，該抗體具有如表1中所找到的一部份輕鏈序列及一部份重鏈序列。於表1中，有畫底線序列係CDR序列。除非另行表明，於表1中，KD表明對人類PD-1之親合性，係使用表面電漿共振於25℃下測量者。
本發明也提供抗PD-1抗體之CDR部份。CDR區的決定係屬於該領域所熟知之技藝。應理解，於一些實施態樣中，CDR可以是卡巴及柯西亞CDR之組合(也稱為「組合CDR」或「延伸CDR」)。在另一種途徑中，本文中指稱為CDR之「構形定義」，CDR之位置可經識別為對抗原結合作出焓貢獻之殘基。見例如Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166。一般， 「構形CDR」包括卡巴CDR中之殘基位置及游標區，該游標區係經受限以維持該抗體之適當圈環結構以與特定抗原結合。構形CDR之決定係屬於該領域所熟知之通常知識。於一些實施態樣中，該CDR係卡巴CDR。在其他實施態樣中，該CDR係柯西亞CDR。在其他實施態樣中，該CDR係延伸CDR、AbM CDR、構形CDR、或接觸CDR。換句話說，在具有超過一個CDR之實施態樣中，該CDR可為卡巴CDR、柯西亞CDR、延伸CDR、AbM CDR、構形CDR、接觸CDR或彼等之組合。
於一些實施態樣中，該抗體包含表1中所示之重鏈可變區之任一者的三個CDR。於一些實施態樣中，該抗體包含表1中所示之輕鏈可變區之任一者的三個CDR。於一些實施態樣中，該抗體包含表1中所示之重鏈可變區之任一者的三個CDR，及表1中所示之輕鏈可變區之任一者的三個CDR。
表2提供本文中所提供之抗PD-1拮抗劑抗體之CDR序列的實施例。
於一些實施態樣中，該抗體包含來自表2的三個輕鏈CDR及三個重鏈CDR。
於表3中提供來自抗PD-1抗體類之輕鏈CDR之排比。可變殘基顯示成粗體。在表3之最後一列顯示一致輕鏈CDR序列。
於表4中提供來自抗PD-1抗體類之重鏈CDR之排比。可變殘基顯示成粗體。在表4之最後一列顯示一致重鏈CDR序列。
於一些實施態樣中，該抗體包含來自表3的三個輕鏈CDR及來自表4的三個重鏈CDR。
於一些實施態樣中，該抗體包含全長重鏈，具有或不具有C-端離胺酸，及/或抗PD-1拮抗劑抗體mAb7或mAb15的全長輕鏈。mAb7全長重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：29)係顯示如下： (SEQ ID NO：29)
不具有C-端離胺酸之mAb7全長重鏈(SEQ ID NO：38)之胺基酸序列係顯示如下： (SEQ ID NO：38)
mAb7全長輕鏈(SEQ ID NO：39)之胺基酸序列係顯示如下： (SEQ ID NO：39)
本發明也提供產生、選擇及作成抗PD-1拮抗劑抗體之方法。本發明之抗體可藉由該領域已知之程序作成。於一些實施態樣中，抗體可重組作成且使用任何該領域已知之方法表現。
於一些實施態樣中，抗體可藉由噬菌體展示技術製備及選擇。見舉例來說，美國專利第5,565,332、5,580,717、5,733,743及6,265,150號；及Winter et al.,Annu.Rev.Immunol.12：433-455,1994。替代地，噬菌體展示技術(McCafferty et al.,Nature 348：552-553,1990)可被用於自未經免疫接種之捐贈者的免疫球蛋白可變(V)結構域基因譜系(repertoire)活體外產製人類抗體及抗體片段。根據此項技術，抗體V結構域基因被符合讀框地(in-frame)克隆至絲狀噬菌體(諸如M13或fd)之主要或次要外 套蛋白基因中，且呈功能性抗體片段被展示於該噬菌體粒子之表面。由於該絲狀粒子含有該噬菌體基因組之單股DNA副本，因此基於該抗體功能性質之選擇也導致對編碼展現該等性質抗體之基因的選擇。因此，該噬菌體模擬B細胞之一些性質。噬菌體展示可呈各式格式施行；回顧文獻見例如Johnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3：564-571,1993。有數個V基因區段來源可用於噬菌體展示。Clackson et al.,Nature 352：624-628,1991，從衍生自經免疫接種小鼠脾臟之V基因的小且隨機組合庫分離出抗多樣噁唑啉酮抗體陣列。基本上可遵循Mark et al.,J.Mol.Biol.222：581-597,1991或Griffith et al.,EMBO J.12：725-734,1993所述之技術，而建構來自人類捐贈者的V基因譜系，及分離抗多樣抗原陣列(包括自體抗原)之抗體。在天然免疫反應中，抗體基因以高的速率累積突變(體細胞超突變)。一些所導入改變將授予更高之親和性，且展示高親和性表面免疫球蛋白之B細胞在後續抗原挑戰期間會優先複製及分化。此天然程序可藉由採用被稱為「鏈替換(chain shuffling)」之技術模擬(Marks et al.,Bio/Technol.10：779-783,1992)。在此方法中，藉由噬菌體展示獲得之「初級」人類抗體的親和性，可藉由以自未經免疫接種之捐贈者獲得的V結構域基因天然發生變體(譜系)之譜系順序置換重鏈及輕鏈V區基因而改進。此技術允許產製具有親和性係於pM至nM之抗體及抗體片段。用於作出非常大的噬菌體抗體譜 系(亦稱為「萬眾之母庫(the mother-of-all libraries)」)之策略已由Waterhouse et al.,Nucl.Acids Res.21：2265-2266,1993描述。基因替換亦可被用於自鼠類抗體衍生人類抗體，其中該人類抗體具有與該起始鼠類抗體相似之親和性及專一性。根據此方法(其又指稱為「表位印記」)，藉由噬菌體展示技術獲得之鼠類抗體的重鏈或輕鏈V區基因被人類V結構域基因譜系置換，而產生鼠類-人類嵌合體。對於抗原之選擇係導致分離出能恢復功能性抗原結合位點之人類可變區，亦即表位主宰(印記)夥伴之選擇。當重複該程序以置換剩餘之鼠類V結構域時，會獲得到人類抗體(見PCT公開號WO 93/06213)。與傳統藉由CDR接枝將鼠抗體人源化不同的是，此技術提供完全人類抗體，其不具鼠類起源之架構殘基或CDR殘基。
於一些實施態樣中，抗體可使用融合瘤技術作成。可考慮任何哺乳動物個體包括人類或來自彼之產製抗體細胞可經操縱以作為產製製哺乳動物，包括人類之融合瘤細胞系之基礎。免疫接種宿主動物之路徑及時程一般與已建立及習用之抗體刺激與產製技術一致。典型地，宿主動物係經腹膜內、肌肉內、經口、皮下、腳掌內及/或皮內接種一定量免疫原，包括如本文中所述。
融合瘤可自淋巴細胞及永生化之骨髓瘤細胞製備，其使用Kohler,B.and Milstein,C.,1975,Nature 256：495-497之一般體細胞雜交技術或由Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18：377-381,1982所修飾技術。可得骨髓瘤細胞 系，包括但不限於X63-Ag8.653及那些來自美國加州聖地牙哥沙克研究所細胞分布中心(Salk Institute,Cell Distribution Center)之細胞可被用於雜交。一般，該技術涉及使用促融劑諸如聚乙二醇或藉由該領域具有通常知識者所週知之電性手段將骨髓瘤細胞與淋巴樣細胞融合。在融合後，使細胞與融合培養基分離並生長在選擇性生長培養基諸如次黃嘌呤-胺喋呤-胸苷(HAT)培養基中以消除未雜交之親代細胞。任何本文中所描述之補充有或未補充血清的培養基皆可被用於培養分泌單克隆抗體之融合瘤。作為另一種替代細胞融合技術之技術，EBV永生化B細胞可用於產製本標的發明之PD-1單克隆抗體。若為所欲，該等融合瘤或其他永生化B細胞係經擴增及次克隆，且藉由習用免疫檢測程序(例如放射性免疫檢測法、酵素免疫檢測法或螢光免疫檢測法)來檢測上清液之抗免疫原活性。
可被用來作為抗體來源之融合瘤涵蓋所有產製抗PD-1之專一性單克隆抗體之親代融合瘤的衍生物、繼代細胞、或彼等之部份。
產製製此種抗體之融合瘤可使用已知程序在活體外或活體內生長。若為所欲，單克隆抗體可藉由習用免疫球蛋白純化程序諸如硫酸銨沉澱、凝膠電泳、透析、色層分析及超過濾自培養基或體液中分離出。可移除非所欲活性(若出現的話)，例如藉由使該製劑運行通過由附接至固相之免疫原所製吸附物，及自該免疫原洗脫或釋放該所欲抗 體。以PD-1多肽、或共軛至蛋白之含有目標胺基酸序列之片段來免疫接種宿主動物可產出抗體族群(例如單克隆抗體)，該蛋白在待免疫接種之物種中為免疫源性，例如鑰孔狀帽貝血藍素、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，該共軛係利用雙功能劑或衍生劑進行，例如順丁烯二亞胺基苯甲醯基磺酸基琥珀醯亞胺基酯(經由半胱胺酸殘基共軛)、N-羥琥珀二醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N=C=NR，其中R和R1係不同的烷基)。
若為所欲，可對該感興趣PD-1拮抗劑抗體(單克隆或多克隆)定序，及接著該具核苷酸序列可克隆至載體以供表現或增殖。於宿主細胞，編碼該感興趣抗體的序列可維持於載體中，接著該宿主細胞可被擴增及冷凍以供將來使用。在細胞培養中產製重組單克隆抗體可透過該領域已知手段自B細胞克隆抗體基因進行。見例如Tiller et al.,2008,J.Immunol.Methods 329,112；及美國專利第7,314,622號。
於一些實施態樣中，該多核苷酸序列可用於基因操縱以「人源化」該抗體或改進該抗體之親和性或其他特徵。該等抗體也可經客製用於，舉例來說狗、貓、靈長動物、馬或牛。
於一些實施態樣中，全人類抗體可藉由使用市售小鼠獲得，該市售小鼠經工程化以表現特定人免疫球蛋白蛋白。經設計以產生更為所欲(例如全人類抗體)或更強烈之 免疫反應的基因轉殖動物亦可被用於產生人源化抗體或人類抗體。此種技術之實施例係購自加州費利蒙市(Fremont,CA)艾比基因公司(Abgenix,Inc.)之異種小鼠TM(XenomouseTM)及購自紐澤西州普林斯頓美德列斯公司(Medarex,Inc.)之HuMAb-Mouse®及TC MouseTM。
可重組作成抗體，此係藉由先自宿主動物分離抗體及產製抗體細胞、獲得該基因序列，及使用該基因序列於宿主細胞(例如CHO細胞)中重組表現該抗體。另一種可採用的方法係在植物(例如菸草)或基因轉殖乳中表現該抗體序列。在植物或乳中重組表現抗體之方法已被揭示。見舉例來說，Peeters,et al.Vaccine 19：2756,2001；Lonberg,N.and D.Huszar Int.Rev.Immunol 13：65,1995及Pollock,et al.,J Immunol Methods 231：147,1999。用於作成抗體衍生物，例如結構域、單鏈等之方法係為該領域已知。
免疫檢測法及流式細胞分選技術諸如螢光激活細胞分選(FACS)亦可採用來分離對PD-1具專一性之抗體。
編碼單克隆抗體之DNA係使用習用程序輕易地分離及定序(例如藉由使用能專一性結合編碼該等單克隆抗體重鏈及輕鏈基因之寡核苷酸探針)之。融合瘤細胞係作為此等DNA之較佳來源。一旦分離，該DNA可被置入表現載體中(諸如PCT公開號WO 87/04462所揭示之表現載體)，及其接著被轉染至不另行產製免疫球蛋白蛋白之宿主細胞諸如大腸桿菌細胞、類人猿COS細胞、中國倉鼠 卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在該等重組宿主細胞中獲得單克隆抗體合成。見例如PCT公開號WO 87/04462。該等DNA亦可經修飾，舉例來說藉由以人類重鏈及輕鏈恆定結構域之編碼序列置換同源小鼠序列(Morrison et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851,1984)，或藉由共價連結所有或部分之非免疫球蛋白多肽之編碼序列至該免疫球蛋白編碼序列。以此方式，製備具有本文中所述之PD-1單克隆抗體結合專一性之「嵌合」或「雜交」抗體。
可藉由抗體之蛋白水解或其他降解方式、藉由如上所述之重組方法(亦即單一或融合多肽)或藉由化學合成而產製抗體片段。該等抗體之多肽，尤其是最高約50個胺基酸之較短多肽，係方便地藉由化學合成作成。化學合成方法係該領域已知且係市售者。舉例來說，抗體可藉由採用固相方法之自動多肽合成儀產製。亦見美國專利第5,807,715、4,816,567及6,331,415號。
於一些實施態樣中，多核苷酸包含編碼下列抗體之重鏈及/或輕鏈可變區之序列：mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb7、mAb8、mAb9、mAb10、mAb11、mAb12、mAb13、mAb14、mAb15或mAb16。於宿主細胞，編碼該感興趣抗體的序列可維持於載體中，及接著該宿主細胞可被擴增及冷凍以供將來使用。於本文中進一步描述載體(包括表現載體)及宿主細胞。
本發明包括親和性成熟之實施態樣。舉例來說，親和性成熟抗體可藉由該領域已知之程序產製(Marks et al., 1992,Bio/Technology,10：779-783；Barbas et al.,1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813；Schier et al.,1995,Gene,169：147-155；Yelton et al.,1995,J.Immunol.,155：1994-2004；Jackson et al.,1995,J.Immunol.,154(7)：3310-9；Hawkins et al.,1992,J.Mol.Biol.,226：889-896；及PCT公開號WO2004/058184)。
下列方法可被用於調整抗體之親和性及用於特徵化CDR。一種特徵化抗體之CDR及/或改變(諸如改進)多肽諸如抗體之結合親和性之方式被稱為「庫掃描突變形成」。一般，庫掃描突變形成係如下工作。使用該領域已認知方法將CDR中之一或多個胺基酸位置以二或多個(諸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸置換。這會產生小的克隆庫(在一些實施態樣中，每個經分析之胺基酸位置有一個克隆)，各具有二或多個成員之複雜性(若每個位置以二或多種胺基酸取代)。一般，該庫亦包括包含天然(未經取代之)胺基酸之克隆。來自各庫之少量克隆，例如約20至80個克隆(取決於該庫之複雜性而定)係篩選其對目標多肽(或其他結合目標)之結合親和性，且識別出具有增加之結合、相同之結合、降低之結合或不具結合之候選物。決定結合親和性之方法係該領域廣為週知。結合親和性可使用，舉例來說BiacoreTM表面電漿共振分析，其偵測約2倍或更高之結合親和性差異、Kinexa®生物感測器、鄰近閃爍檢測法、ELISA、ORIGEN®免疫檢測法、螢光淬熄、 螢光轉移及/或酵母菌展示決定。結合親和性亦可利用適當之生物檢測法篩選。當起始抗體已以相當高之親和性，例如約10nM或更低之KD結合時，BiacoreTM係特別有用。
於一些實施態樣中，使用該領域認知之突變形成方法(該等突變形成方法的一些係於本文中描述)，將CDR中之每個胺基酸位置(於一些實施態樣中一次一個位置)以所有20種天然胺基酸置換。這會產生小的克隆庫(在一些實施態樣中，每個經分析之胺基酸位置有一個克隆)，各具有20個成員之複雜性(若每個位置以所有20種胺基酸取代)。
於一些實施態樣中，該待篩選之庫包含在二或多個位置之取代，該二或多個位置可能在相同CDR中或在二或多個CDR中。因此，該庫可能包含在一個CDR中的二或多個位置之取代。該庫可能包含在二或多個CDR中的二或多個位置之取代。該庫可能包含在3、4、5或多個位置之取代，該等位置見於二、三、四、五或六個CDR中。該取代可使用低多餘性密碼子製備。見例如Balint et al.,1993,Gene 137(1)：109-18之表2。
該CDR可為重鏈可變區(VH)CDRH3及/或輕鏈可變區(VL)CDRL3。該CDR可為VH CDRL1、VH CDRL2、VH CDRL3、VL CDRH1、VL CDRH2及/或VL CDRH3之一或多者。該CDR可為卡巴CDR、柯西亞CDR、延伸CDR、AbM CDR、接觸CDR或構形CDR。
可定序具有改進之結合的候選物，從而識別導致改進之親和性的CDR取代突變物(亦稱為「改進之」取代)。亦定序會結合之候選物，從而識別其保留結合之CDR取代。
可進行多次篩選。舉例來說，具有改進之結合的候選物(各包含在一或多個CDR之一或多個位置的胺基酸取代)亦有用於設計第二庫，該第二庫在各經改進之CDR位置(亦即在該位置取代突變物顯示改進之結合的該CDR中之胺基酸位置)含有至少該原始及經取代之胺基酸。此庫之製備、篩選及選擇係於下進一步討論。
庫掃描突變形成亦提供用於特徵化CDR之手段，就具有改進之結合、相同之結合、降低之結合或不具結合之克隆的頻率亦提供有關各胺基酸位置對抗體-抗原複合物安定性之重要性的資訊來說。舉例來說，若CDR的一個位置當被改變成所有20種胺基酸時仍保留結合，該位置經識別為不可能是抗原結合所需之位置。相反地，若CDR的一個位置只有在小百分比之該等取代會保留結合，該位置經識別為是對CDR功能重要之位置。因此，庫掃描突變形成方法產生有關下列位置的資訊：CDR中可被改變成許多不同胺基酸(包括所有20種胺基酸)之位置及CDR中其不可被改變或其僅能被改變成少數幾種胺基酸之位置。
具有改進之親和性的候選物可組合於第二庫中，該第二庫在該位置包括改進之胺基酸及原始胺基酸，且可能進一步包括在該位置之額外取代，此係取決於所欲之該庫複 雜性或使用所欲篩選或選擇方法所允許之該庫複雜性。此外，若為所欲，相鄰胺基酸位置可被隨機化成至少二或多種胺基酸。相鄰胺基酸之隨機化可能允許該突變物CDR之額外構形可塑性，其可能進而允許或促進導入更大數量之改善突變。該庫亦可包含在第一次篩選時不顯示改善之親和性的位置取代。
該第二庫係使用該領域已知之任何方法篩選或選擇具有改進及/或改變之結合親和性之庫成員，包括使用KinexaTM生物感測器分析篩選，及使用該領域已知之任何用於選擇之方法選擇，包括噬菌體展示、酵母菌展示及核糖體展示。
為了表現本發明之抗PD-1抗體類，編碼VH及VL區之DNA片段可先使用上述之任何方法獲得。各式修飾例如突變、刪除及/或添加亦可使用該領域具有通常知識者已知之標準方法導入該DNA序列中。舉例來說，可使用標準方法進行突變形成，諸如PCR媒介之突變形成，其中經突變核苷酸被納入PCR引子中而使得該PCR產物含有所欲突變或位點定向(site-directed)突變形成。
本發明涵蓋對表1所示之可變區及表2、3或4所示之CDR的修飾。舉例來說，本發明包括包含功能相等性可變區及不會顯著影響它們性質之CDR的抗體及具有增進之或降低之活性及/或親和性之變體。舉例來說，該基酸序列可能經突變以獲得對PD-1具有所欲結合親和性之抗體。多肽之修飾係該領域例行操作，不須於本文中詳細 描述。經修飾多肽之實施例包括具有下列之多肽：保守性取代之胺基酸殘基、一或多個不顯著有害地改變該功能活性之胺基酸刪除或添加、一或多個使該多肽對其配體之親和性成熟(增進)之胺基酸刪除或添加、或使用化學類似物。
胺基酸序列插入包括長度從一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽的胺基端及/或羧基端融合，也包括在序列內插入單一或多個胺基酸殘基。末端插入之實施例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或融合至表位標誌之抗體。抗體分子之其它插入變體包括在抗體之N端或C端融合有酵素或多肽以增加該抗體於血液循環中之半衰期。
取代變體係具有該抗體分子中之至少一個胺基酸殘基被移除且在其之位置插入不同之殘基。最感興趣之取代性突變形成之位點包括超變異區，但亦可考慮架構之改變。保守性取代係顯示於表5中標題「保守性取代」下。若此等取代導致生物活性改變，則更實質改變(表5中稱為「例示性取代」)或如下參照胺基酸分類進一步描述者可被導入，然後篩選產品。
抗體生物性質的實質修飾係藉由選擇其等在維持下列者之效果上有顯著差異之取代完成：(a)取代區之多肽骨架結構，舉例來說，呈β-板或螺旋構型、(b)分子在目標位點的帶電或疏水性、或(c)側鏈之主體。基於常見側鏈性質將天然發生胺基酸殘基分成下列群組：(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)極性不帶電：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(帶負電)：Asp、Glu；(4)鹼性(帶正電)：Lys、Arg；(5)影響鏈方向性之殘基：Gly、Pro；及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。
非保守性取代係藉由將這些分類中的一個分類的成員交換成另一分類作成。
舉例來說，一種可作出之取代係改變抗體中一或多個半胱胺酸，其可能係化學反應性，成另一個殘基諸如但不限於丙胺酸或絲胺酸。舉例來說，可能有非典型半胱胺酸之取代。該取代可在抗體之可變結構域之CDR或架構區中或在抗體之恆定區中作出。於一些實施態樣中，該半胱胺酸係典型半胱胺酸。任何不涉及維持適當抗體構形之半胱胺酸也可經取代，一般以絲胺酸取代，以改進該分子之氧化安定性及防止異常交聯。相反地，半胱氨酸鍵可被添加到抗體，以提高其安定性，特別是在抗體是抗體片段諸如Fv片段時。
亦可在，例如重鏈及/或輕鏈之可變結構域修飾抗體，以例如改變該抗體之結合性質。於可變區之改變可改變結合親和性及/或專一性。於一些實施態樣中，不超過一至五個保守性胺基酸取代係在CDR結構域內作出。於其他實施態樣中，不超過一至三個保守性胺基酸取代係在CDR結構域內作出。舉例來說，可在一或多個CDR區中作出突變，以增加或降低該抗體對PD-1之KD、增加或降 低koff、或改變該抗體之結合專一性。位點定向突變形成之技術係該領域熟知。見例如Sambrook et al.及Ausubel et al.(同上)。
修飾或突變亦可於架構區或恆定區作出以增加抗PD-1抗體之半衰期。見例如PCT公開號WO 00/09560。亦可在架構區或恆定區做出突變，以改變該抗體之免疫原性、以提供用於共價或非共價結合另一分子之位點、或以改變像是補體固定、FcR結合及抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性等之性質。於一些實施態樣中，不超過一至五個保守性胺基酸取代係在架構區或恆定區內作出。於其他實施態樣中，不超過一至三個保守性胺基酸取代係在架構區或恆定區內作出。根據本發明，單一抗體可在可變區之CDR或架構區之任一或多個中或在恆定區中具有突變。
修飾亦包括糖基化及非糖基化多肽，也包括具有其他轉譯後修飾之多肽，諸如舉例來說以不同之糖糖基化、乙醯化及磷酸化。抗體係於它們恆定區中的保守位置經糖基化(Jefferis and Lund,1997,Chem.Immunol.65：111-128；Wright and Morrison,1997,TibTECH 15：26-32)。免疫球蛋白之寡糖側鏈會影響該蛋白之功能(Boyd et al.,1996,Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe and Howard,1990,Biochem.29：4175-4180)及該糖蛋白之部份之間的分子內交互作用，其可影響該糖蛋白之構形及所呈現之三維表面(Jefferis and Lund，同上；Wyss and Wagner,1996,Current Opin.Biotech.7：409-416)。基於特定辨認結構， 寡糖亦可用來將給定糖蛋白靶向至某些分子。也有報告指出抗體之糖基化會影響抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)。尤其，經四環素調節表現β(1,4)-N-乙醯葡萄胺基轉移酶III(GnTIII，一種催化平分型GlcNAc形成之糖基轉移酶)之CHO細胞被報告具有改進之ADCC活性(Umana et al.,1999,Nature Biotech.17：176-180)。
抗體之糖基化典型為N-鏈結或O-鏈結。N-鏈結係指碳水化合物基團附接至天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸、天冬醯胺酸-X-蘇胺酸及天冬醯胺酸-X-半胱胺酸係供碳水化合物基團酵素性附接至天冬醯胺酸側鏈之辨識序列，其中X係除脯胺酸以外之任何胺基酸。因此，該等三肽序列之任一者存在於多肽中會產生潛在糖基化位點。O-鏈結糖基化係指附接糖類N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一者至羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，不過5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸亦可被使用。
在抗體中加入糖基化位點可藉由改變胺基酸序列而使得其包含上述之三肽序列之一或多者(供N-鏈結糖基化位點)而方便地完成。該改變亦可藉由在原始抗體之序列加入或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基作出(供O-鏈結糖基化位點)。
抗體之糖基化模式亦可在不改變基礎核苷酸序列下經改變。糖基化大多取決於用來表現該抗體之宿主細胞。由於用來表現重組糖蛋白，例如抗體作為潛在治療劑之細胞 種類鮮少為天然細胞，因此抗體之糖基化模式的變化可被預期(見例如Hse et al.,1997,J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除了宿主細胞之選擇以外，在重組產製抗體期間影響糖基化之因素包括生長模式、培養基配方、培養密度、氧化、pH、純化方案及類似因素。有各式方法被提出，以改變在特定宿主生物體中達成之糖基化模式，包括導入或過度表現某些涉及寡糖產製之酵素(美國專利第5,047,335、5,510,261及5,278,299號)。糖基化、或某些種類之糖基化可藉由自糖蛋白酵素移除，舉例來說利用內切糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、內切糖苷酶F1、內切糖苷酶F2、內切糖苷酶F3。此外，該重組宿主細胞可經基因工程化成在加工某些種類多醣有缺陷者。這些及類似之技術係該領域熟知。
其他修飾方法包括使用該領域已知之偶合技術，包括但不限於酵素手段、氧化性取代及螯合。修飾可用於，舉例來說用來附接用於免疫檢測法之標籤。經修飾多肽係使用該領域已建立之程序作成，且可使用該領域已知之標準檢測法篩選，它們中的一些係於下面及實施例中描述。
於一些實施態樣中，該Fc可係人類IgG2或人類IgG4。於一些實施態樣中，該抗體包含IgG4恆定區，其包含下列修飾：E233F234L235至P233V234A235(Armour et al.,2003,Molecular Immunology 40 585-593)(IgG4△c)，其中編號係參照野生型IgG4。於又另一種實施態樣中，該 Fc係人類IgG4 E233F234L235至P233V234A235具有刪除G236(IgG4△b)。於一些實施態樣中，該Fc係含有安定絞鏈之突變S228至P228之任何人類IgG4 Fc(IgG4、IgG4△b或IgG4△c)(Aalberse et al.,2002,Immunology 105,9-19)。
在其他實施態樣中，該Fc可為含有突變A330P331至S330S331之人類IgG2(IgG2△a)，其中胺基酸殘基係參照野生型IgG2序列編號(Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624)。
於一些實施態樣中，該抗體包含經修飾恆定區，該經修飾恆定區係對人類Fcγ受體具有增加之或降低之親和性；係免疫惰性或部分惰性，例如不引發補體媒介之溶解、係不刺激抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性(ADCC)、或係不活化小神經膠質細胞；或在下列任一或多者中具有減少之活性(與未經修飾之抗體相比)：引發補體媒介之溶解、刺激ADCC、或活化小神經膠質細胞。可使用恆定區之不同修飾達到效應子功能之最佳水平及/或組合。見舉例來說，Morgan et al.,Immunology 86：319-324,1995；Lund et al.,J.Immunology 157：4963-9 157：4963-4969,1996；Idusogie et al.,J.Immunology 164：4178-4184,2000；Tao et al.,J.Immunology 143：2595-2601,1989；及Jefferis et al.,Immunological Reviews 163：59-76,1998。於一些實施態樣中，該恆定區係如Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624；PCT公開案WO99/058572所述般經修飾。
於一些實施態樣中，抗體恆定區可經修飾以避免與Fcγ受體與補體及免疫系統交互作用。用於此類抗體之製劑的技術係描述於WO 99/58572。舉例來說，若抗體用於人類臨床試驗及治療時，該恆定區可經工程化以更類似於人類恆定區，而避免免疫反應。見例如美國專利第5,997,867及5,866,692號。
於又其他實施態樣中，該恆定區係無N-鏈結糖基化。在一些實施態樣中，該恆定區係藉由使該恆定區中為N-糖基化辨認序列之部份的附接殘基及/或側翼殘基突變而無N-鏈結糖基化。舉例來說，N糖基化位點N297可經突變成，例如A、Q、K或H。見Tao et al.,J.Immunology 143：2595-2601,1989；及Jefferis et al.,Immunological Reviews 163：59-76,1998。於一些實施態樣中，該恆定區係無N-鏈結糖基化。該恆定區可經酵素(諸如藉由酵素PNGase移除碳水化合物)無N-鏈結糖基化，或藉由在糖基化缺陷宿主細胞中表現而無N-鏈結糖基化。
其他抗體修飾包括如PCT公開號WO 99/58572所述經修飾之抗體。這些抗體除了包含針對目標分子之結合結構域，還包含具有實質上與人類免疫球蛋白重鏈之所有或部分恆定區同源之胺基酸序列的效應子結構域。這些抗體能與目標分子結合但不引發顯著之補體依賴性溶解或細胞媒介之目標破壞。於一些實施態樣中，該效應子結構域能與FcRn及/或FcγRIIb專一性結合。這些典型是基於衍生 自二或多種人類免疫球蛋白重鏈CH2結構域之嵌合性結構域。以此方式修飾之抗體特別適用於慢性抗體療法，以避免習用抗體療法所致發炎及其他不良反應。
於一些實施態樣中，該抗體包含經修飾恆定區，該經修飾恆定區具有與未經修飾抗體相比之對FcRn增加之結合親和性及/或增加之血清半衰期。
在稱為「種系化(germlining)」之程序中，在VH及VL序列中之某些胺基酸可經突變以匹配在種系VH及VL序列中天然發現之胺基酸。尤其是在VH及VL序列中之架構區的胺基酸序列可經突變成匹配種系序列，以降低該抗體在投予時之免疫原性風險。人類VH及VL基因之種系DNA序列係該領域已知(見例如「Vbase」人類種系序列資料庫；亦見Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson et al.,1992,J.Mol.Biol.227：776-798；及Cox et al.,1994,Eur.J.Immunol.24：827-836)。
另一種可作出之胺基酸取代係移除抗體中潛在之蛋白水解位點。此類位點置可能發生在抗體可變區之CDR或架構區中或在抗體恆定區中。取代半胱胺酸殘基及移除蛋白水解位點可能降低抗體產品之異質性之風險，因此增加其之同質性。另一種胺基酸取代係消除天冬醯胺酸-甘胺酸對，其藉由改變該等殘基之一或兩者以形成潛在之脫醯 胺位點。在另一種實施例中，本發明抗PD-1抗體之重鏈的C端離胺酸可被切掉。在本發明之各式實施態樣中，抗PD-1抗體類之重鏈及輕鏈可視需要包括信號序列。
一旦獲得編碼本發明之VH及VL區段之DNA片段後，可進一步藉由標準重組DNA技術操縱這些DNA片段，舉例來說，轉換該可變區基因成為全長抗體鏈基因、成為Fab片段基因或成為scFv基因。在這些操縱中，編碼VL或VH之DNA片段係可操作地鏈結至編碼另一種蛋白之另一種DNA片段，該另一種蛋白諸如抗體恆定區或可彎折之鏈結子。在此內文所使用之用語「可操作地鏈結」係意圖指兩個DNA片段係經連接而使得由該兩個DNA片段所編碼之胺基酸序列維持符合讀框。
編碼VH區之經分離之DNA可藉由可操作地鏈結該編碼VH之DNA至另一種編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之DNA分子，而轉換成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列係該領域已知(見例如Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)且涵蓋這些區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。該重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳的是IgG1或IgG2恆定區。IgG恆定區序列可為已知發生在不同個體之各式等位基因或同種異型之任一者，諸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。這些同種異 型代表在IgG1恆定區中天然發生之胺基酸取代。就Fab片段重鏈基因而言，該編碼VH之DNA可操作地鏈結至另一種僅編碼重鏈CH1恆定區之DNA分子。該CH1重鏈恆定區可衍生自該等重鏈基因之任一者。
編碼VL區之經分離之DNA可藉由可操作地鏈結該編碼VL之DNA至另一種編碼輕鏈恆定區(CL)之DNA分子，而轉換成全長輕鏈基因(及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列係該領域已知(見例如Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)且涵蓋這些區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。該輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。κ恆定區序列可為已知發生在不同個體之各式等位基因之任一者，諸如Inv(1)、Inv(2)及Inv(3)。該λ恆定區可衍生自三個λ基因中之任一者。
為了產製製scFv基因，編碼VH之DNA片段及VL之DNA片段係可操作性鏈結至另一種編碼可彎折鏈結子之片段，而使得該VH及VL序列可被表現為連續單鏈蛋白，且該VL及VH區藉由可彎折之鏈結子連接(見例如Bird et al.,1988,Science 242：423-426；Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.,1990,Nature 348：552-554)。鏈結肽的一個實施例是(GGGGS)3(SEQ ID NO：19)，其在一可變區之羧基端與另一個可變區之胺基酸端之間橋接約3.5nm。已 設計並使用其他序列之鏈結子(Bird et al.,1988，同上)。進而鏈結子可為了額外功能，諸如藥物附接或附接至固體支持物而經修飾。若僅使用單一VH及VL，該單鏈抗體可為單價；若使用二個VH及VL，該單鏈抗體可為雙價；若使用超過二個VH及VL，或該單鏈抗體可為多價。可產生雙專一性或多價抗體以與PD-1及另一個分子專一性結合。該單鏈變體可經重組或合成產製。就scFv之合成產製而言，可使用自動化合成儀。就scFv之重組產製而言，含有編碼該scFv之多核苷酸之適當質體可被導入適當之宿主細胞中，宿主細胞係真核細胞諸如酵母菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞，或是原核細胞諸如大腸桿菌。編碼感興趣之scFv之多核苷酸可藉由例行操縱作出，諸如黏合(ligation)多核苷酸。所得scFv可使用該領域已知之標準蛋白純化技術分離。
其他形式之單鏈抗體諸如雙價抗體亦涵蓋於本發明中。雙價抗體係雙價且雙專一性之抗體，其中VH及VL係表現於單一多肽鏈上，但使用過短而允許在同一鏈上的兩個結構域之間無法配對之鏈結子，藉此強迫該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點(見例如Holliger,P.,et al.,1993,Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.,et al.,1994,Structure 2：1121-1123)。
包含兩個共價連接抗體之異源共軛抗體亦屬於本發明之範疇內。此等抗體已用於將免疫系統細胞靶向至非所欲 之細胞(美國專利第4,676,980號)及用於治療HIV感染(PCT公開號WO 91/00360及WO 92/200373；EP 03089)。異源共軛抗體可使用任何方便之交聯方法作成。適當之交聯劑及技術係該領域熟知且描述於美國專利第4,676,980號。
嵌合或雜交抗體亦可使用已知之合成蛋白化學方法於活體外製備，包括那些涉及交聯劑者。舉例來說，免疫毒素可使用雙硫交換反應或藉由形成硫醚鍵而建構。為達此目的之適合試劑實施例包括亞胺基硫醇鹽及甲基-4-巰基丁亞胺酸酯。
本發明也涵蓋包含來自本文所述抗體之一或多個片段或區的融合蛋白。於一些實施態樣中，可作出融合抗體，其包含鏈結至另一個多肽之所有或部份之本發明之抗PD-1抗體。於另一種實施態樣中，僅抗PD-1抗體之可變結構域係鏈結至該多肽。於另一種實施態樣中，抗PD-1抗體之VH結構域係鏈結至第一多肽，同時抗PD-1抗體之VL結構域係鏈結至第二多肽，該第二多肽與第一多肽係以使得該VH及VL結構域可彼此交互作用而形成抗原結合位點之方式結合。於另一種較佳之實施態樣中，該VH結構域與VL結構域被鏈結子分開，而使得該VH及VL結構域可彼此交互作用。該VH-鏈結子-VL抗體接著鏈結至感興趣之多肽。此外，可產生融合抗體，其中兩個(或多個)單鏈抗體係彼此鏈結。若吾人想在單一多鏈上產生雙或多價抗體、或若吾人想產生雙專一性抗體，此係有 用。
於一些實施態樣中，提供一種融合多肽，該融合多肽包含如SEQ ID NO：2、7、8或9所示之可變輕鏈區之至少10個連續胺基酸，及/或如SEQ ID NO：3、4、5或6所示之可變重鏈區之至少10個連續胺基酸。在其他實施態樣中，提供一種融合多肽，其包含該可變輕鏈區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個連續胺基酸及/或該可變重鏈區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個連續胺基酸。在另一實施態樣中，該融合多肽包含輕鏈可變區及/或重鏈可變區，如選自SEQ ID NO：2及3、7及3、8及3、8 9及3、2及4、7及4、8及4、9及4、2及5、7及5、8及5、9及5、2及6、7及6、8及6及9及6中序列對之任一者所示。於另一種實施態樣中，該融合多肽包含一或多個CDR。在又其他實施態樣中，該融合多肽包含VH CDR3及/或VL CDR3。就本發明之目的而言，融合蛋白含有一或多種抗體及在天然分子中未附接至其上之另一種胺基酸序列，例如異源序列或來自另一區之同源序列。例示性異源序列包括但不限於「標誌」諸如FLAG標誌或6His標誌。標誌係該領域熟知。
融合多肽可藉由該領域已知之方法產生，舉例來說合成或重組產生。典型，本發明之融合蛋白係藉由，使用本文中所描述之重組方法製備及表現編碼它們的多核苷酸所作成，不過它們亦可藉由該領域已知之其他方法製備，包 括舉例來說化學合成。
在其他實施態樣中，其他經修飾之抗體可使用編碼抗PD-1抗體之核酸分子製備。舉例來說，「κ抗體」(Ill et al.,1997,Protein Eng.10：949-57)、「迷你抗體」(Martin et al.,1994,EMBO J.13：5303-9)、「雙價抗體」(Holliger et al.，同上)或「傑魯斯抗體(Janusins)」(Traunecker et al.,1991,EMBO J.10：3655-3659及Traunecker et al.,1992,Int.J.Cancer(增刊)7：51-52)可遵循本說明書教示使用標準分子生物技術製備。
舉例來說，雙專一性抗體(對至少兩種不同之抗原具有結合專一性之單克隆抗體)可使用本文中所述之抗體製備。作出雙專一性抗體之方法係該領域已知(見例如Suresh et al.,1986,Methods in Enzymology 121：210)。舉例來說，雙專一性抗體或抗原結合片段可藉由融合融合瘤或鏈結Fab’片段產製。見例如Songsivilai & Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79：315-321，Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148：1547-1553。傳統上，重組產製雙專一性抗體係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中該兩個重鏈具有不同之專一性(Millstein and Cuello,1983,Nature 305,537-539)。此外，雙專一性抗體可形成為「雙價抗體」或「傑魯斯抗體」。於一些實施態樣中，該雙專一性抗體結合PD-1的兩種不同的表位。於一些實施態樣中，該上述經修飾之抗體係使用來自本文中所提供之抗PD-1抗體的一或多個可變結構域或CDR區製備。
根據一種作成雙專一性抗體之途徑，具有所欲結合專一性之抗體可變區(抗體-抗原結合位點)係融合至免疫球蛋白恆定區序列。該融合較佳地係與免疫球蛋白重鏈恆定區，包含至少部分之絞鏈區、CH2區及CH3區。較佳地是使第一重鏈恆定區(CH1)(其含有輕鏈結合所需之位點)出現於該等融合之至少一者中。編碼免疫球蛋白重鏈融合及免疫球蛋白輕鏈(若為所欲)之DNA被插入個別表現載體中，並被共轉染至適當之宿主生物體中。這會在當建構體中所使用的三個多肽鏈的不等比例提供最佳產量之實施態樣中，提供調整三個多肽片段之相互比例的高度靈活性。然而，當以相等比例表現至少兩個多肽鏈導致高產量時，或當該比例不具特別顯著性時，有可能在一個表現載體中插入兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列。
在一種途徑中，該雙專一性抗體係由一臂具有第一結合專一性之雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂為雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合專一性)所組成。此種免疫球蛋白輕鏈僅位於該雙專一性分子之一半的不對稱結構，促進所欲之雙專一性化合物與非所欲之免疫球蛋白鏈組合分離。此途徑係描述於PCT公開號WO 94/04690。
本發明亦提供組成物，其包含共軛(例如鏈結)至促進與固相支持物(諸如生物素或抗生物素蛋白)偶合之劑之抗體。為了簡單起見，大致將以抗體為例，但應理解這些方法施用至本文中所述之任何PD-1結合及/或拮抗劑實施態樣之任一者。共軛一般係指如本文中所述鏈結該等成分。 該鏈結(其一般以近距離結合固定該等成分以至少供投予)可以任何數目方式達成。舉例來說，當劑與抗體各具有能與彼此反應之取代基時，兩者間之直接反應係可能的。舉例來說，於一者上之親核基團，諸如胺基或氫硫基可能能與另一者上之含羰基基，諸如酐或酸鹵化物反應，或與含好的離去基(例如鹵化物)之烷基反應。
該抗體可與許多不同載劑結合。載劑可為活性及/或惰性。廣為週知之載劑實施例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、澱粉酶、玻璃、天然纖維素、經改質纖維素、聚丙醯胺、洋菜糖及磁鐵礦。就本發明之目的而言，該載劑之本性可為可溶性或不可溶性。該領域中具有通常知識者知道其他用於結合抗體之適當載劑，或將能使用例行實驗加以確認。於一些實施態樣中，該載劑包含靶向肺臟、心臟或心臟瓣膜之基團。
本發明之抗體或多肽可鏈結至標籤劑，諸如螢光分子、放射性分子或任何其他該領域已知標籤。標籤係該領域已知，其一般提供(直接或間接)信號。
多核苷酸、載體及宿主細胞
本發明也提供編碼本文中所述之該等抗體，包括抗體片段及經修飾抗體之任一者之多核苷酸，諸如例如具有不健全效應子功能之抗體。於另一種面向中，本發明提供一種作成本文中所述之該等多核苷酸的任一者之方法。可藉由該領域已知程序作出及表現多核苷酸。據此，本發明提 供多核苷酸或包括多核苷酸之組成物，包括醫藥組成物，該多核苷酸編碼下列之任一者：抗體mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb7、mAb8、mAb9、mAb10、mAb11、mAb12、mAb13、mAb14、mAb15、mAb16及mAb17或彼之任何具有拮抗PD-1能力的片段或部分。
與任何此等序列互補之多核苷酸也涵蓋於本發明。多核苷酸可以是單股(編碼或反義)或雙股，且可為DNA(基因組、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子及mRNA分子，該HnRNA分子含有內含子且以一對一之方式對應DNA分子，該mRNA分子不包含內含子。額外之編碼或非編碼序列可但不一定出現於本發明之多核苷酸內，且多核苷酸可但不一定鏈結至其他分子及/或支持物材料。
多核苷酸可包含天然序列(亦即編碼抗體或彼之片段之內源性序列)或可包含此一序列之變體。多核苷酸變體含有一或多個取代、添加、刪除及/或插入，而使得該經編碼多肽之免疫反應性相對於天然免疫反應性分子不被減少。此對該經編碼多肽免疫反應性之影響一般係如本文中所述評估。變體較佳地展現與編碼天然抗體或彼之片段之多核苷酸序列至少約70%之一致性，更佳地至少約80%之一致性，甚至更佳地至少約90%之一致性及最佳地至少約95%之一致性。
若在二個多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或胺基酸序 列當於如下所述用以得到最高對應性排比時係相同，則該二個序列被稱為「完全相同」。兩序列之間的比較典型藉由在比較窗上比較序列，以識別及比較具有序列相似性之局部區域而施行。本文中所使用之「比較窗」係指至少約20個、通常30個至約75個或40個至約50個連續位置之區段，其中序列可與具有相同連續位置數目之參考序列係在該二個序列經最佳排比後比較。
供比較之序列的最佳排比可使用雷斯基(Lasergene®)生物資訊套裝軟體中之邁佳來(MegAlign®)程式(威斯康辛州麥迪遜市，DNASTAR®,Inc.)以內建參數進行。此程式具體化下列文獻中描述之數種排比法方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5：151-153；Myers,E.W.and Muller W.,1988,CABIOS 4：11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11：105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
較佳地，「序列一致性之百分比」係藉由在至少20個位置之比較窗上比較二個經最佳排比之序列而決定，其中在比較窗中多核苷酸或多肽序列之部份當與供二個序列最佳排比之參考序列(其不包含添加或刪除)相比可能包含20%或更低、通常5%至15%或10%至12%之添加或刪除(即缺口)。百分比之計算係藉由決定在該位置二個序列中出現完全相同之核酸鹼基或胺基酸殘基之位置的數目，以產出匹配位置數目，將該匹配位置數目除以參考序列之位置總數(亦即窗之大小)，並將該結果乘以100以得到序列一致性百分比。
變體亦可能或替代性地與天然基因或彼之部份或互補物實質上同源。此等多核苷酸變體能在中度嚴謹度條件下與編碼天然抗體之天然發生之DNA序列(或互補序列)雜交。
適當之「中度嚴謹度條件」包括在5倍SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)之溶液中預先清洗；於50℃至60℃之5倍SSC中雜交隔夜；接著於65℃中以含有0.1% SDS之2倍、0.5倍及0.2倍SSC之各者清洗20分鐘兩次。
本文中所使用之「高度嚴謹度條件」或「高嚴謹條件」係那些：(1)採用低離子強度及高溫清洗，舉例來說 於50℃之0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二基硫酸鈉；(2)在42℃之雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，舉例來說具有0.1%牛血清白蛋白/0.1%聚蔗糖(Ficoll)/0.1%聚乙烯基吡咯烷酮/含有750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉之pH 6.5之50mM磷酸鈉緩衝液之50%(體積/體積)甲醯胺；或(3)於42℃採用50%甲醯胺、5倍SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5倍丹哈德(Denhardt’s)溶液、經超音波化之鮭魚精子DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，並於42℃以0.2倍SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)清洗及於55℃以50%甲醯胺清洗，之後於55℃以含有EDTA之0.1倍SSC進行高嚴謹度清洗。該領域中具有通常知識者將認知當有需要時如何調整溫度、離子強度等條件以配合諸如探針長度及類似因子。
該領域具有通常知識者將了解的是，由於基因密碼簡併之結果，有許多核苷酸序列編碼本文中所描述之多肽。這些多核苷酸中的一些帶有對任何天然基因之核苷酸序列之最小同源。然而，本發明特別考慮由於使用不同的密碼子而有所變化之多核苷酸。再者，包含本文中所提供之多核苷酸序列之基因的等位基因係屬於本發明之範疇內。等位基因係作為一或多個突變，諸如核苷酸之刪除、添加及/或取代之結果而被改變之內源性基因。所得mRNA及蛋白可能但不一定具有經改變之結構或功能。等位基因可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或數據庫序列比較)加以識 別。
本發明之多核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學多核苷酸合成之方法係該領域熟知，不須於本文中詳細說明。該領域中具有通常知識者可使用本文中所提供之序列及商用DNA合成儀產製所欲之DNA序列。
在使用重組方法製備多核苷酸時，包含所欲序列之多核苷酸可被插入適合之載體中，該載體進而可被導入適合之宿主細胞以供複製及擴增，如在下面進一步討論。多核苷酸可藉由該領域已知之任何方法被插入宿主細胞中。細胞係藉由直接攝取、胞飲作用、轉染、F交配(F-mating)或電穿孔導入外源性多核苷酸而轉形。一旦導入後，該外源性多核苷酸可呈非整合性載體(諸如質體)維持於該細胞內或被整合至該宿主細胞之基因組中。如是擴增之多核苷酸可使用該領域所熟知之方法自該宿主細胞分離出。見例如Sambrook et al.,1989。
替代地，PCR允許複製DNA序列。PCR技術係該領域熟知者，且係於美國專利第4,683,195、4,800,159、4,754,065及4,683,202號及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis et al.eds.,Birkauswer Press,Boston,1994中描述。
RNA可藉由使用在適當載體中之該經分離之DNA且將其插入適合之宿主細胞中獲得。當細胞複製且該DNA被轉錄成為RNA時，接著該RNA可使用該領域中具有通常知識者熟知之方法分離，舉例來說如於Sambrook et al.,1989(同上)中所述者。
適合之克隆載體可根據標準技術建構，或可選自該領域之大量可用克隆載體。雖然該經選擇之克隆載體可能因意圖使用之宿主細胞有變化，有用之克隆載體將一般具有自我複製之能力、可具有用於特定限制內切酶之單一目標及/或可能帶有可用於選擇含有該載體之克隆的標記之基因。適合實施例包括質體及細菌性病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體諸如pSA3及pAT28。這些及許多其他克隆載體可得自商業販售商諸如伯樂(BioRad)公司、斯壯特基(Stratagene)公司及英維特基(Invitrogen)公司。
進一步提供表現載體。表現載體一般是可複製之多核苷酸建構物，其含有根據本發明之多核苷酸。這暗示表現載體必需在宿主細胞中呈附加體或呈染色體DNA之一體部分而可複製。適合之表現載體包括但不限於質體；病毒載體，包括腺病毒、腺病毒相關病毒、反轉錄病毒；黏質體及PCT公開號WO 87/04462中所揭示之表現載體。載體成份一般可包括但不限於下列一或多者：信號序列、複製起點、一或多種標記基因、適合之轉錄控制元件(諸如啟動子、增強子及終止子)。就表現(即轉譯)而言，通常也需要一或多種轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯起始位點及終止密碼子。
含有感興趣之多核苷酸之載體可藉由大量適合手段之 任一者導入宿主細胞，包括電穿孔；採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質之轉染；微彈撞擊；脂質體轉染；及感染(例如其中該載體為感染性劑諸如牛痘病毒者)。導入載體或多核苷酸之選擇經常將取決於該宿主細胞之特徵而定。
本發明亦提供包含本文中所述之多核苷酸之任一者的宿主細胞。任何能過度表現異源性DNA之宿主細胞可用於分離編碼該感興趣之抗體、多肽或蛋白之基因的目的。哺乳動物宿主細胞之非限制性實施例包括但不限於COS、HeLa及CHO細胞。亦見PCT公開號WO 87/04462。適合之非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌或枯草桿菌)及酵母菌(諸如釀酒酵母菌；分裂酵母(S.pombe)；或乳酸克魯維酵母菌(K.lactis))。較佳地，該宿主細胞以與感興趣之對應內源性抗體或蛋白(若存在)相比於宿主細胞中高出約5倍、更佳為高出10倍、甚至更佳為高出20倍之水平表現cDNA。篩選專一性結合PD-1或PD-1結構域之宿主細胞係藉由免疫檢定法或FACS致效。過度表現感興趣之抗體或蛋白之細胞可被識別。
表現載體可被用於直接表現抗PD-1拮抗劑抗體。該領域中具有通常知識者熟習投予表現載體以於活體內獲得外源性蛋白之表現。見例如美國專利第6,436,908、6,413,942及6,376,471號。表現載體之投予包括局部或全身性投予，包括注射、經口投予、粒子槍或經導管投予及外用投予。在另一種實施態樣中，該表現載體係直接投予 至交感神經幹或神經節，或投予至冠狀動脈、心房、心室或心包膜中。
亦可被使用靶向遞送含有表現載體或次基因組多核苷酸之治療性組成物。受體媒介之DNA遞送技術係描述於，舉例來說Findeis et al.,Trends Biotechnol.,1993,11：202；Chiou et al.,Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff,ed.,1994；Wu et al.,J.Biol.Chem.,1988,263：621；Wu et al.,J.Biol.Chem.,1994,269：542；Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87：3655；Wu et al.,J.Biol.Chem.,1991,266：338。基因療法計畫中，對於局部投予，含有多核苷酸之治療性組成物係以約100ng至約200mg之DNA範圍投予。約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg及約20μg至約100μg之DNA濃度範圍亦可於基因療法計畫期間使用。治療性多核苷酸及多肽可使用基因遞送載具遞送。該基因遞送載具可為病毒性或非病毒性起源(一般參考Jolly,Cancer Gene Therapy,1994,1：51；Kimura,Human Gene Therapy,1994,5：845；Connelly,Human Gene Therapy,1995,1：185；及Kaplitt,Nature Genetics,1994,6：148)。該等編碼序列之表現可使用內源性哺乳動物或異源啟動子誘導。編碼序列之表現可為組成性或經調節的。
用於遞送所欲之多核苷酸且在所欲細胞中表現之病毒基底載體係該領域所熟知。例示性病毒基底載具包括但不 限於重組反轉錄病毒(見例如PCT公開號WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美國專利第5,219,740及4,777,127號；GB專利第2,200,651號及EP專利第0 345 242號)、阿爾法病毒基底載體(例如辛德比(Sindbis)病毒載體、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、羅斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)及委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))及腺病毒相關病毒(AAV)載體(見例如PCT公開號WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984及WO 95/00655)。投予如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3：147所述之鏈結至死腺病毒之DNA亦可被採用。
亦可採用非病毒性遞送載具及方法，包括但不限於單獨之鏈結至或未鏈結至死腺病毒之經聚陽離子性縮合之DNA(見例如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3：147)；鏈結配體DNA(見例如Wu,J.Biol.Chem.,1989,264：16985)；真核細胞遞送載具細胞(見例如美國專利第5,814,482號；PCT公開號WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763及WO 97/42338)及核電荷中和或與細胞膜融合。亦可採用裸DNA。例示性裸DNA導入方法係於PCT公開號WO 90/11092及美國專利第5,580,859號中描述。可作用如基 因遞送載具之脂質體係描述於美國專利第5,422,120號；PCT公開號WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445及EP 0524968。其他途徑係描述於Philip,Mol.Cell Biol.,1994,14：2411及Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.,1994.91：1581中。
組成物
本發明也提供醫藥組成物，其包含有效量之本文中所述之抗PD-1抗體。此等組成物之實施例及如何調製也被描述本文中。於一些實施態樣中，該組成物包含一或多種PD-1抗體。於其他實施態樣中，抗PD-1抗體辨認PD-1。於其他實施態樣中，該抗PD-1抗體係人類抗體。於其他實施態樣中，該抗PD-1抗體係人源化抗體。於一些實施態樣中，該抗PD-1抗體包含能觸發所欲之免疫反應(諸如抗體媒介之溶解或ADCC)之恆定區。在其他實施態樣中，該抗PD-1抗體包含不觸發非所需或非所欲之免疫反應(諸如抗體媒介之溶解或ADCC)之恆定區。在其他實施態樣中，該抗PD-1抗體包含該抗體之一或多個CDR(諸如一、二、三、四、五個或在一些實施態樣中，所有六個CDR)。
應理解該等組成物可包含超過一種抗PD-1抗體(例如辨認PD-1之不同表位之PD-1抗體之混合物)。其他例示性組成物包含超過一種辨識相同的一或多個表位之抗PD-1抗體，或結合不同PD-1表位之不同物種的抗PD-1抗體 類。於一些實施態樣中，該組成物包含辨認PD-1之不同變體之抗PD-1抗體類之混合物。
本發明所使用之組成物可進一步包含醫藥上可接受之載劑、賦形劑或安定劑(Remington：The Science and practice of Pharmacy 20th Ed.,2000,Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)，呈冷凍乾燥調製劑或水性溶液之形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所施用該劑量及濃度下對接受者不具毒性，且可包括緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑(諸如十八基二甲基苄基氯化銨、氯化六甲雙銨；氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨；酚、丁基或苄基醇；烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑諸如EDTA；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽相對離子諸如鈉；金屬複合物(例如鋅蛋白複合物)；及/或非離子性界面活性劑諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。醫藥上可接受之賦形劑進一步於本文中說明。
該抗PD-1抗體及彼之組成物也可用於與其他劑一起使用、或個別、同時、或順序投予，該其他劑用以增進及 /或補充該等劑之有效性。
本發明也提供包含本發明之該多核苷酸之組成物，包含醫藥組成物。於一些實施態樣中，該組成物包含表現載體，該表現載體包含編碼如本文所述之抗體的多核苷酸。於其他實施態樣中，該組成物包含表現載體，該表現載體包含編碼如本文所述之抗體之任一者的多核苷酸。
預防治療或PD-1媒介之狀況之方法
本發明之抗體及抗體共軛物係有用於各式應用，包括但不限於治療性治療方法及診斷性治療方法。
於一種面向中，本發明提供一種治療癌症之方法。於一些實施態樣中，該治療個體之癌症之方法包含對需要彼之該個體投予有效量之包含如本文中所述之該PD-1抗體之任一者的組成物(例如，醫藥組成物)。如本文中所使用，癌症包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、食道癌、胃癌、神經膠母細胞瘤、膠質瘤、腦腫瘤、頭部和頸部癌症、腎癌(kidney cancer)、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、子宮癌、骨癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、血癌、甲狀腺癌、胸腺癌、眼癌及皮膚癌。於一些實施態樣中，所提供者係一種抑制個體之腫瘤生長或惡化之方法，其包含對需要彼之該個體投予有效量之包含如本文中所述之該PD-1抗體或該PD-1抗體共軛物的組成物。於一些實施態樣中，該癌症係表現PD-L1腫瘤。於其他實施態樣中，該腫瘤不表現 PD-L1。於其他實施態樣中，所提供者係一種抑制個體之癌細胞轉移之方法，其包含對需要彼之該個體投予有效量之包含如本文中所述之該PD-1抗體之任一者的組成物。於其他實施態樣中，所提供者係一種誘導個體之腫瘤緩解之方法，其包含對需要彼之該個體投予有效量之包含如本文中所述之該PD-1抗體之任一者的組成物。
於另一種面向中，所提供者係一種偵測、診斷及/或監測癌症之方法。舉例來說，本文中所述之PD-1抗體可經可偵測之基團標籤，諸如成像劑及酵素-受質標籤。本文中所述之抗體亦可被用於活體內診斷性檢測法，諸如活體內成像(例如PET或SPECT))或染色試劑。
於一些實施態樣中，本文中描述之方法進一步包含以額外形式之療法治療個體之步驟。於一些實施態樣中，該額外形式之療法係額外抗癌療法，包括但不限於化學療法、放射、手術、荷爾蒙療法及/或額外免疫療法。
對於所有本文中所述之方法，當提及抗PD-1拮抗劑抗體，也包括包含一或多種額外劑之組成物。這些組成物可進一步包含適合賦形劑，諸如醫藥上可接受之賦形劑包括緩衝劑，其係該領域所熟知。本發明可單獨或與其他治療方法組合使用。
該抗PD-1拮抗劑抗體可經由任何適合途徑投予至個體。對該領域中具有通常知識者顯而易見的是，本文中所描述之實施例不意圖限制而是可用技術之說明。據此，於一些實施態樣中，該抗PD-1拮抗劑抗體係根據已知方法 投予至個體，諸如靜脈內投予例如呈快速濃注或藉由在一段時間連續輸注、藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、經皮、皮下、關節內、舌下、滑膜內、經噴入、脊椎鞘內、經口、吸入或外用途徑。投予可為全身性例如靜脈內投予、或局部投予。市售液體調製劑用噴霧器包括噴射噴霧器及超音波噴霧器可有用於投予。液體調製劑可直接噴霧化，且冷凍乾燥之粉末可在重構後噴霧化。替代地，抗PD-1拮抗劑抗體可使用氟碳調製劑及定量吸入器氣霧化或呈經冷凍乾燥及磨細粉末之形式吸入。
於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體係經由位點專一性或靶向性局部遞送技術投予。位點專一性或靶向性局部遞送技術之實施例包括各式抗PD-1拮抗劑抗體之植入式貯劑來源或局部遞送導管，諸如輸注導管、留置導管、或針頭導管、合成性移植物、外膜層包覆、分流器及支架或其他植入式裝置、位點專一性載劑、直接注射或直接施用。見例如PCT公開號WO00/53211及美國專利第5,981,568號。
抗PD-1拮抗劑抗體之各式調製劑可用於投予。於一些實施態樣中，該抗PD-1拮抗劑抗體可淨投予。於一些實施態樣中，該抗PD-1拮抗劑抗體及醫藥上可接受之賦形劑可於各式調製劑中。醫藥上可接受之賦形劑係為該領域已知，且係有助於投予藥理有效物質之相對惰性物質。舉例來說，賦形劑可給予外形或稠度，或作用為稀釋劑。適合之賦形劑包括但不限於安定劑、潤濕及乳化劑、用於 改變滲透性之鹽類、包封劑、緩衝劑及皮膚穿透增進劑。用於非經腸及經腸藥物遞送之賦形劑及調製劑係闡述於Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing,2000。
於一些實施態樣中，這些劑係經調製為供注射投予(例如腹膜內、靜脈內、皮下、肌肉內等)。據此，這些劑可與醫藥上可接受之載具(諸如鹽水、林格(Ringer)氏液、葡萄糖溶液及類似物)組合。特定給藥方案(即劑量、時間及重複性)將依特定個體及該個體之醫學病史而定。
抗PD-1拮抗劑抗體可使用任何適合之方法投予，包括藉由注射(例如腹膜內注射、靜脈內注射、皮下內注射、肌肉內注射等)。本文中所述，抗PD-1抗體類亦可外用投予或經吸入投予。一般，對於投予抗PD-1抗體類，初始候選劑量可為約2mg/kg。就本發明之目的而言，取決於上述因子，典型之每日劑量可於自約3μg/kg至30μg/kg、至300μg/kg、至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或至100mg/kg或更多之任一範圍內。舉例來說，可使用約1mg/kg、約2.5mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg及約25mg/kg之劑量。對於在數天或更久期間內重複投予，取決於狀況，該治療係持續進行直到發生所欲之症狀壓抑或達成足夠之治療水平，舉例來說減少癌症相關症狀。此療法之進展可輕易藉由習用技術與檢測法監測。給藥方案(包括所此用之抗PD-1拮抗劑抗體)可隨時間變化。
就本發明之目的而言，抗PD-1拮抗劑抗體之適合劑量將取決於所採用之抗PD-1拮抗劑抗體(或彼之組成物)、所欲治療之症狀的種類及嚴重性、該劑是否以預防性或治療性目的投予、先前療法、該病患之臨床病史及對該劑之反應、該病患清除該經投予之劑之速率及主治醫師之考量。典型臨床醫師將投予抗PD-1拮抗劑抗體直到到達達成所欲結果之劑量。劑量及/或頻率可隨治療療程變化。經驗性考量諸如半衰期，一般將促成該劑量之決定。舉例來說，可相容於人類免疫系統之抗體，諸如人源化抗體或全人類抗體可用於延長該抗體之半衰期及防止該抗體被宿主之免疫系統攻擊。投予頻率可隨療法之療程決定及調整，且一般但不必然基於症狀之治療及/或壓抑及/或改善及/或延緩。替代地，抗PD-1拮抗劑抗體之持續性連續釋放調製劑可為適當。各式用於達成持續性釋放之調製劑及裝置係該領域已知。
於一種實施態樣中，在已給予一或多次拮抗劑抗體投予之個體中，該拮抗劑抗體之劑量可能憑經驗決定。個體係經給予漸增劑量之抗PD-1拮抗劑抗體。為了評估療效，可追蹤疾病之指標。
根據本發明之方法投予抗PD-1拮抗劑抗體可為連續性或間歇性，取決於，舉例來說接受者之生理狀況、投予之目的是否係治療性或預防性及該領域中具有通常知識者所知之其他因素而定。抗PD-1拮抗劑抗體之投予可為基本上連續一段預先選定之時間，或可為一系列間隔劑量。
於一些實施態樣中，可能出現超過一種抗PD-1拮抗劑抗體。可能出現至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同或更多種拮抗劑抗體。一般，這些抗PD-1拮抗劑抗體可能具有彼此不會有不良影響之互補活性。抗PD-1拮抗劑抗體也可用於與其他抗體及/或其他療法一起使用。抗PD-1拮抗劑抗體也可用於與其他劑一起使用，該其他劑用以增進及/或互補該等劑之有效性。
於一些實施態樣中，該抗PD-1拮抗劑抗體也可與投予一或多種額外治療劑組合投予。這些包括但不限於，投予化學治療劑；疫苗；CAR-T細胞基底療法；放射療法；細胞介素療法；疫苗；抗PD-1雙專一性抗體；其他免疫壓抑路徑之抑制劑；血管生成抑制劑；T細胞活化劑；代謝路徑抑制劑；mTOR抑制劑；腺苷路徑抑制劑；酪胺酸激酶抑制劑，包括但不限於英立達(inlyta)、ALK抑制劑及書尼替尼(sunitinib)；BRAF抑制劑；外顯遺傳修飾劑；調控型T(Treg)細胞及/或骨髓衍生壓抑細胞之抑制劑或耗盡劑；JAK抑制劑；STAT抑制劑；週期素依賴性激酶抑制劑；生物治療劑(包括但不限於抗VEGF、VEGFR、EGFR、Her2/neu、其他生長因子受體、CD20、CD40、CD-40L、CTLA-4、OX-40、4-1BB及ICOS之抗體)；免疫源性劑(舉例來說，削弱癌細胞、腫瘤抗原、抗原呈現細胞諸如以腫瘤衍生抗原或核酸致敏之樹突細胞、免疫刺激性細胞介素(舉例來說，IL-2、IFNα2、GM-CSF)及經編碼免疫刺激細胞介素諸如但不限於GM-CSF之基因轉染之 細胞)。化學治療劑之實施例包括烷化劑諸如塞替派(thiotepa)和環磷醯胺；磺酸烷基酯諸如硫酸布他卡因(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和呱泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類諸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；乙烯亞胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺和三羥甲基蜜胺；番荔枝內酯(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(包括合成的類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚蟲素；海綿多聚乙醯(callystatin)；CC-1065(包括其之合成類似物阿多來新(adozelesin)、卡澤來新(carzelesin)和比澤來新(bizelesin))；念珠藻素(尤其是念珠藻素1和念珠藻素8)；朵拉司他汀(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿素(spongistatin)；氮芥類諸如氮芥苯丁酸、萘氮芥、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥、依弗醯胺(ifosfamide)、甲基二(氯乙基)胺、鹽酸甲基二(氯乙基)胺氧化物、美法侖(melphalan)、新氮芥、膽固醇苯乙酸氮芥、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲類諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀 (ranimustine)；抗生素類諸如烯二炔抗生素(例如刺孢黴素，尤其是刺孢黴素γI1和刺孢黴素phiI1，見例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994)；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽類，諸如氯膦酸鹽；埃斯培拉黴素(esperamicin)；及新抑癌素發色團和有關的色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素、氨茴黴素(authramycin)、偶氮絲氨酸、博來黴素(bleomycin)、放線菌素、卡拉星(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素、色黴素、更生黴素(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)(包括N-嗎啉基-多柔比星、氰基N-嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和去氧多柔比星)、PEG化脂質體多柔比星、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素類諸如絲裂黴素C、麥考酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌羅黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素、鏈脲佐菌素(streptozocin)、殺結核菌素、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物諸如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物諸如氟達 拉濱(fludarabine)、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷；雄激素類諸如卡魯睾酮、丙酸屈他雄酮、環硫雄醇、美雄烷、睾內酪；抗腎上腺類諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑諸如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醒內酯(aceglatone)；醒磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戍酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯特拉比瑟爾(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；艾弗咪辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明(lonidamine)；美登木素類(maytansinoids)諸如美坦辛(maytansine)和安絲菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫呱達醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofuran)； 鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌；2,2’,2"-三氯三乙胺；新月毒素類(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、桿孢菌素A和镰刀菌烯醇(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴衛矛醇(mitolactol)；呱泊溴燒(pipobroman)；加西托新(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara_C”)；環磷醯胺；塞替派；紫杉烷類，例如紫杉醇和多西紫杉醇；氮芥苯丁酸；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物諸如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱(vinorelbine)；諾消靈(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；氨基蝶呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃醇諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；和上述任一者的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。也包括者抗荷爾蒙劑，其作用來調控或抑制荷爾蒙對腫瘤的作用，諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括舉例來說，他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、鹽酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(Fareston)；抑制酵素芳香酶之芳 香酶抑制劑，酵素芳香酶係在腎上腺中調控雌激素產製，芳香酶抑制劑諸如舉例來說，4(5)-咪唑、胺基魯米特(aminoglutethimide)、醋酸美皆斯妥、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)、來曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素類諸如氟他胺、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任一者的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。
於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體係用於與靶向免疫檢查點調節劑之一或多種其他治療劑一起使用，諸如，舉例來說但不限於靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、B7-H3、B7-H4、B7-DC(PD-L2)、B7-H5、B7-H6、B7-H8、B7-H2、B7-1、B7-2、ICOS、ICOS-L、TIGIT、CD2、CD47、CD80、CD86、CD48、CD58、CD226、CD155、CD112、LAIR1、2B4、BTLA、CD160、TIM1、TIM-3、TIM4、VISTA(PD-H1)、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、4-1BB、4-BBL、DR3、TL1A、CD40、CD40L、CD30、CD30L、LIGHT、HVEM、SLAM(SLAMF1、CD150)、SLAMF2(CD48)、SLAMF3(CD229)、SLAMF4(2B4、CD244)、SLAMF5(CD84)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMCF7(CS1)、SLAMF8(BLAME)、SLAMF9(CD2F)、CD28、CEACAM1(CD66a)、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、 CEACAM7、CEACAM8、CEACAM1-3ASCEACAM3C2、CEACAM1-15、PSG1-11、CEACAM1-4C1、CEACAM1-4S、CEACAM1-4L、IDO、TDO、CCR2、CD39-CD73-腺苷路徑(A2AR)、BTK、TIK、CXCR2、CCR4、CCR8、CCR5、VEGF路徑、CSF-1之劑、或天生免疫反應調節劑。於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體係用於與下列者一起使用：舉例來說，抗PD-L1拮抗劑抗體諸如舉例來說，BMS-936559(MDX-1105)及MPDL3280A；抗PD-1拮抗劑抗體諸如舉例來說，納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)及皮迪地蘇單抗(pidilizumab)；抗CTLA-4拮抗劑抗體諸如舉例來說，易普利單抗(ipilimumab)；抗LAG-3拮抗劑抗體諸如BMS-986016及IMP701；抗TIM-3拮抗劑抗體；抗B7-H3拮抗劑抗體諸如舉例來說，MGA271；抗VISTA拮抗劑抗體；抗TIGIT拮抗劑抗體；抗CD28拮抗劑抗體；抗CD80抗體；抗CD86抗體；抗B7-H4拮抗劑抗體；抗ICOS促效劑抗體；抗CD28促效劑抗體；天生免疫反應調節劑(例如TLR、KIR、NKG2A)；及IDO抑制劑。於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體係用於與4-1BB(CD137)促效劑一起使用，諸如舉例來說PF-05082566或BMS-663513。於一些實施態樣中，PD-1拮抗劑抗體係用於與OX40促效劑一起使用，諸如舉例來說抗OX-40促效劑抗體。於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體係用於與GITR促效劑一起使用，諸如舉例來說抗GITR促效劑抗體，諸如舉例 來說但不限於TRX518。於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體係用於與IDO抑制劑一起使用。於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體係用於與細胞介素療法一起使用，諸如舉例來說但不限於IL-15、CSF-1、MCSF-1等。
於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體係用於與一或多種其他治療抗體一起使用，諸如舉例來說但不限於靶向CD19、CD22、CD40、CD52或CCR4之抗體。
於一些實施態樣中，該抗PD-1抗體療法可早於或晚於其它劑治療自數分鐘至數週範圍之間隔。於其中該其他劑及/或蛋白或多核苷酸係個別投予之實施態樣中，吾人將一般確保在各遞送之間不會經過一段顯著時間，而使得該劑與本發明之組成物將仍可以在個體上發揮有利組合效果。於此種情況中，考慮吾人可在彼此約12至24小時(h)內更佳地在彼此的約6至12小時內，投予二模式。然而，於一些情況中，可能所欲者為顯著地延長投予之時間週期，其中分別之投予之間推延數天(2、3、4、5、6或7)至數週(1、2、3、4、5、6、7或8)。
於一些實施態樣中，抗PD-1拮抗劑抗體組成物包含第二劑，其係選自克里唑替尼，帕博西尼、吉西他濱、環磷醯胺、氟尿嘧啶、FOLFOX、醛葉酸、奧沙利鉑(oxaliplatin)、阿西替尼、舒尼替尼蘋果酸鹽、托法替尼(tofacitinib)、貝伐單抗(bevacizumab)、利妥昔單抗(rituximab)及曲妥珠單抗(traztuzumab)。
於一些實施態樣中，抗PD-1抗體組成物係與治療方 案組合，該治療方案進一步包含選自手術、放射療法、化學療法、靶向性療法、免疫療法、荷爾蒙療法、血管生成抑制及姑息療法所組成群組之傳統療法。
PD-1抗體於用於癌症之疫苗基底免疫療法方案的用途
於一些特定實施態樣中，本揭露提供一種用於增進用在哺乳動物癌症治療之疫苗的免疫原性效應或治療效應之方法，該哺乳動物特別是人類，該方法包含對接受該疫苗之該哺乳動物投予有效量之本揭露所提供之抗PD-1拮抗劑抗體。於一些其他特定實施態樣中，本揭露提供一種用於治療哺乳動物癌症之方法，該哺乳動物特別是人類，該方法包含對該哺乳動物投予(1)有效量之能引發抗該癌細胞的免疫反應的疫苗及(2)有效量之本揭露所提供之抗PD-1拮抗劑抗體。於上面本文中所述該用於治療哺乳動物腫瘤病症之方法及該用於增進哺乳動物腫瘤病症治療之疫苗的免疫原性效應或治療效應之方法係統稱「用於癌症之疫苗基底免疫療法方案」(或「用於癌症之VBIR」)。
於該用於癌症之VBIR中，疫苗可呈任何形式或調製劑，諸如(i)細胞基底疫苗、(ii)次單元疫苗、(iii)蛋白基底疫苗、(iv)肽基底疫苗、或(v)核酸基底疫苗(諸如DNA基底疫苗、RNA基底疫苗、質體基底疫苗、或病毒載體基底疫苗)。
本揭露所提供之該用於癌症之VBIR可應用於任何種類的癌症。特定癌症之實施例包括：小細胞肺癌、非小細 胞肺癌、膠質瘤、胃癌、胃腸道癌、腎癌(renal cancer)、卵巢癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌症、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰腺癌、多型性神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、膀胱癌、乳腺癌及頭部和頸部癌症。
意圖用於治療癌症之疫苗典型含有能引發抗特定TAA的免疫反應之抗原(呈肽、蛋白、細胞成分、整個細胞或編碼肽基底抵抗原之核酸分子之形式)，該TAA係在目標腫瘤細胞上表現或被目標腫瘤細胞所表現。許多TAA為該領域已知。已知TAA之實施例包括：前列腺癌之PSA、PSCA及PSMA；結腸直腸癌之CEA、MUC-1、Ep-CAM、5T4、hCG-b、K-ras及TERT；卵巢癌之CEA、Muc-1、p53、間皮素、生存素及NY-ESO-1；非小細胞肺癌之Muc-1、5T4、WT-1、TERT、CEA、EGF-R及MAGE-A3；腎細胞癌之5T4；及胰腺癌之Muc-1、間皮素、K-Ras、膜聯蛋白A2(Annexin A2)、TERT及CEA。於一些特定實施態樣中，本揭露所提供之用在該用於癌症之VBIR的疫苗係選自下列所組成群組：(1)能引發抗TAA之免疫反應的疫苗，其中該TAA係選自PSA、PSCA、PSMA、CEA、MUC-1、TERT、間皮素、EGF-R、或MAGE-A3；(2)含有肽抗原的疫苗，該肽抗原係衍生自選自PSA、PSCA、PSMA、CEA、MUC-1、TERT、間皮素、EGF-R、或MAGE-A3之TAA；及 (3)含有編碼肽抗原之核酸分子之疫苗，其中該肽抗原係衍生自選自PSA、PSCA、PSMA、CEA、MUC-1、TERT、間皮素、EGF-R、或MAGE-A3之TAA。
於又其他特定實施態樣中，該疫苗含有編碼一或多種衍生自PSA之免疫源性多肽、一或多種衍生自PSCA之免疫源性多肽、或一或多種衍生自PSMA之免疫源性多肽的核酸分子。
於特定實施態樣中，該核酸分子係選自下列所組成群組：(1)編碼衍生自示於SEQ ID NO：42人類PSMA之免疫源性多肽的核酸分子；(2)編碼包含示於SEQ ID NO：42之胺基酸15至750之免疫源性多肽的核酸分子；(3)包含示於SEQ ID NO：43之核苷酸序列的核酸分子、或彼之降解性變體；(4)包含示於SEQ ID NO：44之核苷酸序列的核酸分子、或彼之降解性變體；(5)包含示於SEQ ID NO：45之核苷酸序列的核酸分子、或彼之降解性變體；(6)包含示於SEQ ID NO：46之核苷酸序列的核酸分子、或彼之降解性變體；(7)編碼衍生自示於SEQ ID NO：47人類PSA之免疫源性多肽的核酸分子；(8)編碼包含示於SEQ ID NO：47之胺基酸25至261 之免疫源性多肽的核酸分子；(9)編碼衍生自示於SEQ ID NO：48人類PSCA之免疫源性多肽的核酸分子；(10)編碼(i)衍生自示於SEQ ID NO：42人類PSMA之免疫源性多肽，(ii)衍生自示於SEQ ID NQ：47人類PSA之免疫源性多肽，及(iii)衍生自示於SEQ ID NO：48人類PSCA之免疫源性多肽的核酸分子；及(11)編碼(i)包含示於SEQ ID NO：42之胺基酸15至750之免疫源性多肽，(ii)包含示於SEQ ID NO：47之胺基酸25至261之免疫源性多肽，及(iii)示於SEQ ID NO：48之免疫源性多肽的核酸分子。
該編碼一或多種衍生自前列腺相關抗原之免疫源性多肽之核酸分子可呈質體或載體形式。此種質體的一種實施例為示於SEQ ID NO：46所建構之核酸(也指稱為質體458)。表現衍生自人類PSMA之免疫源性多肽的載體的核苷酸序列係列於SEQ ID NO：44(也指稱為載體AdC68W)。表現衍生自人類PSMA之免疫源性多肽，衍生自人類PSA之免疫源性多肽，及衍生自人類PSCA之免疫源性多肽的載體的核苷酸序列係列於SEQ ID NO：45及載體人類PSMA(載體AdC68W-734)。各式衍生自人類PSMA、PSA及PSCA之免疫源性多肽；編碼此等免疫源性多肽之核酸建構體(包括質體與載體)；及用於製備該等免疫源性多肽及該等核酸建構體，包括質體458，及載體AdC68W及AdC68W-734之方法，係揭示於國際申請公開 案號WO2013/164754及WO 2015/063647中，其之各者藉由參考其整體內容而納入本文中。
於一種面向中，本發明提供一種經分離之拮抗劑抗體，其專一性結合PD-1，其中該抗體包含：重鏈可變區(VH)，其包含該VH的VH互補決定區1(CDR1)、VH CDR2及VH CDR3，該VH具有選自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6所組成群組之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含該VL的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，該VL具有選自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9所組成群組之胺基酸序列。
任何本揭露所揭示之抗PD-1拮抗劑抗體可用在該用於癌症之VBIR中。於一些實施態樣中，該抗PD-1拮抗劑抗體包含VH區及/或VL區，其中該VH區包含示於SEQ ID NO：3、4、5或6之胺基酸序列、或彼在非CDR內之殘基具有一或數個保守性胺基酸取代之變體，及其中該VL包含示於SEQ ID NO：2、7、8或9之胺基酸序列、或彼在非CDR內之胺基酸具有一或數個胺基酸取代之變體。於一些實施態樣中，該抗體包含：包含示於SEQ ID NO：39之胺基酸序列之輕鏈及/或包含示於SEQ ID NO：29或38之胺基酸序列之重鏈。於一些特定實施態樣中，該抗體包含具有ATCC登錄號PTA-121183之表現載體所產製之VH區。於一些實施態樣中，該抗體包含具有ATCC登錄號PTA-121182之表現載體所產製之VL區。
本揭露所提供之該用於癌症之VBIR可進一步包含一或多種其他免疫調節劑(除了包含本揭露所提供之該PD-1拮抗劑抗體之外還包含的)。該其他免疫調節劑可以是免疫效應子細胞之增進子(「IEC增進子」)或免疫壓抑細胞之抑制劑(「ISC抑制劑」)。該額外IEC增進子或額外ISC抑制劑可單獨或與該用於癌症之VBIR組合使用。該額外IEC增進子及額外ISC抑制劑也可一起與該用於癌症之VBIR組合使用。
ISC抑制劑類別之實施例包括蛋白激酶抑制劑、環加氧酶-2(COX-2)抑制劑、磷酸二酯酶第5型(PDE5)抑制劑及DNA交聯劑。COX-2抑制劑之實施例包括塞來昔布(celecoxib)及羅非昔布(rofecoxib)。PDE5抑制劑之實施例包括阿伐那非(avanafil)、羅地(lodenafil)、米羅那非(mirodenafil)、西地那非(sildenafil)、他達那非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、烏地那非(udenafil)及紮普司特(zaprinast)。DNA交聯劑之實施例係環磷醯胺。用語「蛋白激酶抑制劑」係指作用為蛋白激酶之選擇性或非選擇性抑制劑的任何物質。適合用於該用於癌症之VBIR中之特定蛋白激酶抑制劑的實施例包括拉帕替尼(Lapatinib)、AZD 2171、ET18OCH 3、靛玉紅-3'-肟、NSC-154020、PD 169316、槲皮素、羅斯維汀(Roscovitine)、曲西立濱(Triciribine)、ZD 1839、5-碘殺結核菌素(5-Iodotubercidin)、阿達福斯汀(Adaphostin)、阿洛伊辛(Aloisine)、阿爾斯特隆(Alsterpaullone)、胺基染料 木黃酮(Aminogenistein)、API-2、洋元荽黃素(Apigenin)、牛蒡子苷元(Arctigenin)、ARRY-334543、阿西替尼(AG-013736)、AY-22989、AZD 2171、雙吲哚基順丁烯二醯亞胺IX、CC1-779、白屈菜紅鹼(Chelerythrine)、DMPQ、DRB、依地福新(Edelfosine)、ENMD-981693、制表菌素類似物(Erbstatin analog)、埃羅替尼(Erlotinib)、法舒地爾(Fasudil)、吉非替尼(ZD1839)、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羥基法舒地爾(Hydroxyfasudil)、肯泡隆(Kenpaullone)、KN-62、KY12420、LFM-A13、葉黃酮、LY294002、LY-294002、粗糠柴毒(Mallotoxin)、ML-9、MLN608、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奧羅莫星(Olomoucine)、吲哚酮I、PD153035、PD 98059、根皮酯、白皮杉醇(Piceatannol)、苦鬼臼脂素(Picropodophyllin)、PKI、PP1、PP2、PTK787/ZK222584、PTK787/ZK-222584、珀伐拉諾A(Purvalanol A)、雷帕慕恩(Rapamune)、雷帕黴素(Rapamycin)、Ro 31-8220、呂宋揪夾粉素(Rottlerin)、SB202190、SB203580、西羅莫司(Sirolimus)、SL327、SP600125、星形孢菌素(Staurosporine)、STI-571、SU1498、SU4312、SU5416、SU5416(司馬沙尼(Semaxanib))、SU 6656、SU6668、syk抑制劑、TBB、TCN、酪胺酸磷酸化抑制劑AG 1024(Tyrphostin AG 1024)、酪胺酸磷酸化抑制劑AG 490、酪胺酸磷酸化抑制 劑AG 825、酪胺酸磷酸化抑制劑AG957、U0126、W-7、渥曼青黴素(Wortmannin)、Y-27632、紮克替瑪(Zactima)(ZD6474)、ZM 252868、吉非替尼(gefitinib)(Iressa.RTM．)、舒尼替尼蘋果酸鹽(SUTENT；SU11248)、埃羅替尼(TARCEVA；OSI-1774)、拉帕替尼(GW572016；GW2016)、卡拉替尼(canertinib)(CI 1033)、塞瑪昔布(semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006)、伊馬替尼(imatinib)(Gleevec.RTM.；STI571)、達沙替尼(dasatinib)(BMS-354825)、來氟米特(Ieflunomide)(SUlOl)、凡德他尼(vandetanib)(ZACTIMA；ZD6474；ZD6474)及尼勒替尼(nilotinib)。
於一些具體實施態樣中，該酪胺酸激酶抑制劑係舒尼替尼蘋果酸鹽、索拉非尼甲苯磺酸鹽、或阿西替尼。舒尼替尼蘋果酸鹽，其係由輝瑞公司(Pfizer Inc.)以商品名SUTENT販售，在化學上描述為(2S)-羥基-丁二酸與N-[2-(二乙基胺基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-1,2-二氫-2-側氧基-3H-吲哚-3-亞基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲醯胺化合物(1：1)化合。該化合物、其之合成及特定多晶型物描述於美國專利第6,573,293號。舒尼替尼蘋果酸鹽在美國已被批准用於治療具有不可切除局部晚期或轉移疾病病患的胃腸道基質腫瘤、晚期腎細胞癌及惡化性充分分化型胰臟神經內分泌腫瘤。用於人類胃腸道基質腫瘤(GIST)及晚期腎細胞癌(RCC)，舒尼替尼蘋果酸鹽之建議劑量為50mg每日 口服一次，按照治療4週隨後停止2週之時程(時程4/2)。用於胰臟神經內分泌腫瘤，舒尼替尼蘋果酸鹽之建議劑量為37.5mg每日口服一次。在用於癌症之VNIR中，舒尼替尼蘋果酸鹽可以單一劑量或多劑量經口投予。典型，舒尼替尼蘋果酸鹽遞送二、三、四或更多連續週劑量，隨後為約1或2週或更多週「停止」期，其中不遞送舒尼替尼蘋果酸鹽。於一種實施態樣中，遞送劑量約4週，停止2週。經口投予人類舒尼替尼蘋果酸鹽之有效量典型低於每天每人40mg，諸如每天每人37.5、31.25、25、18.75、12.5或6.25mg。於一些實施態樣中，係以每天每人1至25mg範圍經口投予舒尼替尼蘋果酸鹽。於一些其它實施態樣中，係以每天每人6.25、12.5或18.75mg範圍經口投予舒尼替尼蘋果酸鹽。其它給藥方案及變化為可預見的，且將根據醫師指導來決定。
以商品名NEXAVAR販售之索拉非尼甲苯磺酸鹽具有化學名稱為4-(4-{3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]脲基}苯氧基)-N-甲基吡啶-2-甲醯胺。其在美國中已被批准用於治療原發性腎癌(晚期腎細胞癌)及晚期原發性肝癌(肝細胞癌)。建議每日劑量為400毫克，每日口服兩次。在本揭露所提供之該用於癌症之VBIR中，經口投予索拉非尼甲苯磺酸鹽之有效量典型低於每天每人400mg。於一些實施態樣中，經口投予索拉非尼甲苯磺酸鹽之有效量在每天每人10至300mg範圍。在一些其它實施態樣中，經口投予索拉非尼甲苯磺酸鹽之有效量在每天每人10至200mg 之間，諸如每天每人10、20、60、80、100、120、140、160、180或200mg。
以商品名INLYTA販售之阿西替尼具有化學名稱為(N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫基]-苯甲醯胺。其已被批准用於治療在一次先前全身性療法失敗後之晚期腎細胞癌。起始劑量為5mg，每日口服兩次。可基於個體安全性及耐受性作出劑量調整。在本揭露所提供之該用於癌症之VBIR中，經口投予阿西替尼之有效量典型低於5mg，每日兩次。在一些其它實施態樣中，經口投予阿西替尼之有效量在1至5mg之間，每日兩次。在一些其它實施態樣中，經口投予阿西替尼之有效量在1、2、3、4或5mg之間，每日兩次。
可使用在本揭露所提供之該用於癌症之VBIR中之IEC增進子的實施例，係包括TNFR激動劑、CTLA-4拮抗劑、TLR促效劑、其他PD-1拮抗劑(諸如BMS-936558及抗PD-1抗體CT-011)、計畫性細胞死亡蛋白1配體1(PD-L1)拮抗劑(諸如BMS-936559)、淋巴細胞活化基因3(LAG3)拮抗劑及含T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域之分子3(TIM-3)拮抗劑。TNFR促效劑之實施例包括OX40、4-1BB(諸如BMS-663513)、GITR(諸如TRX518)及CD40之促效劑。下文詳細描述特定CD40促效劑之實施例。
於某些其他實施態樣中，該額外免疫調節劑係抗CD40促效劑抗體。該抗體可以是人類、人源化或部分人 類嵌合抗CD40抗體。特定抗CD40單克隆抗體的實施例包括G28-5、mAb89、EA-5或S2C6單克隆抗體及CP870893。於一種特定實施態樣中，該抗CD40促效劑抗體係CP870893或達西株單抗(dacetuzumab)(SGN-40)。
CP-870,893為全人類促效性CD40單克隆抗體，其已於臨床上作為抗腫瘤療法探討。CP-870,893之結構及製備揭示於W02003041070中，其中抗體CP870,893經識別為抗體「21.4.1」。CP-870,893之重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別列在WO2003040170之SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：48，及表7中。在臨床試驗中，CP870,893藉由靜脈內輸注投予，係於劑量一般在每輸注0.05至0.25mg/kg範圍。在本揭露所提供之該用於癌症之VBIR中，CP-870,893可皮內、皮下或外用投予。此方案中待投予之CP870893之有效量一般低於0.2mg/kg，典型在0.01mg至0.15mg/kg或0.05至0.1mg/kg範圍。
達西株單抗(也稱為SGN-40或huS2C6；CAS編號88-486-59-9)係另一種抗CD40促效劑抗體，其已於頑固性淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤及多發性骨髓瘤之臨床試驗中探討。在本揭露所提供之該用於癌症之VBIR中，達西株單抗可皮內、皮下或外用投予。待投予之達西株單抗之有效量一般低於16mg/kg，典型在0.2mg至14mg/kg、或0.5至8mg/kg或1至5mg/kg範圍。
於又其他實施態樣中，該額外免疫調節劑係抗CTLA-4拮抗劑。適合之抗CTLA-4拮抗劑的實施例包括抗 CTLA-4抗體(諸如人類抗CTLA-4抗體、小鼠抗CTLA-4抗體、哺乳動物抗CTLA-4抗體、人源化抗CTLA-4抗體、單克隆抗CTLA-4抗體、多克隆抗CTLA-4抗體、嵌合抗CTLA-4抗體、抗CTLA-4結構域抗體類)，及促效共刺激路徑之CTLA-4之抑制劑。於一些實施態樣中，該CTLA-4抑制劑係易普利單抗或曲美目(Tremelimumab)。
易普利單抗(以YERVOY販售，也稱為MEX-010、MDX-101、或以其之CAS註冊編號477202-00-9稱之)係PCT公開號WO 01/14424中作為抗體10DI揭示，其藉由參考其整體內容及用於所有目的而納入本文中。包含易普利單抗之醫藥組成物的實施例係提供於PCT公開號WO 2007/67959中。易普利單抗在美國已被批准用於治療不可切除黑色素瘤或轉移黑色素瘤。在本發明所提供之方法中，易普利單抗可皮內或皮下投予。易普利單抗局部投予之有效量典型在每人5至200mg/劑之範圍。於一些實施態樣中，易普利單抗之有效量係在每人每劑10至150mg/劑之範圍。於一些具體實施態樣中，易普利單抗之有效量係約每人10、25、50、75、100、125、150、175或200mg/劑。
曲美目單抗(亦稱為CP-675,206)為全人類IgG2單克隆抗體且CAS編號為745013-59-6。曲美目單抗在美國專利號6,682,736中揭示為抗體11.2.1，其藉由參考其整體內容及用於所有目的而納入本文中。在本發明所提供之該用於癌症之VBIR中，曲美目單抗可經靜脈內、皮內或 皮下投予。皮內或皮下投予之曲美目單抗之有效量典型在每人5至200mg/劑之範圍。於一些實施態樣中，曲美目單抗之有效量係在每人每劑10至150mg/劑之範圍。於一些具體實施態樣中，曲美目單抗之有效量係約每人10、25、50、75、100、125、150、175或200mg/劑。
於又其他實施態樣中，該額外免疫調節劑係鐸樣受體(TLR)促效劑。用語「鐸樣受體促效劑」或「TLR促效劑」係指稱作為鐸樣受體(TLR)之促效劑的化合物。此包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10及TLR11之促效劑或彼之組合。
有用於本發明之方法之TLR促效劑包括小有機分子及大生物分子二者。小有機分子TLR促效劑之實施例包括4-胺基-α,α,2-三甲基-1H-咪唑並[4,5-c]喹啉-1-乙醇、N-(2-{2-[4-胺基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑並[4,5-c]喹啉-1-基]乙氧基-}乙基)-N-甲基嗎啉-4-甲醯胺、1~(2~胺基-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基-)-1H-咪唑並[4,5-c]喹啉-4-胺、N-[4-(4-胺基-2-乙基-1H-咪唑並[4,5-c]喹啉-1-基)丁基]甲磺醯胺、N-[4-(4-胺基-2-丙基-1H-咪唑並[4,5-c]喹啉-1-基)丁基]甲磺醯胺及咪喹莫特(imiquimod)。一些尤其有用於本揭露所提供之方法或方案中之TLR促效劑係討論於回顧文件：Folkert Steinhagen,et al.：TLR-based immune adjuvants.Vaccine 29(2011)：3341-3355。於一些實施態樣中，該TLR促效劑係TLR9促效劑，尤其是CpG寡核苷酸(或CpG.ODN)。CpG寡核苷酸係含有胞嘧啶及接著藉 由磷酸酯鍵鏈結之鳥嘌呤之短核酸分子，其中該胞嘧啶的嘧啶環未經甲基化。有用於本揭露所提供之方法的特定CpG寡核苷酸之實施例包括：5'TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3'(CpG 7909；SEQ ID NO：49)；5'TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3'(CpG 24555；SEQ ID NO：50)；及5'TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3'(CpG 10103；SEQ ID NO：51)。
CpG7909，一種合成之單鏈24聚體，已作為單一療法及與化學治療劑組合用於治療癌症，及作為針對癌症及傳染病之疫苗的佐劑而廣泛探討。在本揭露所提供之方法中，CpG7909可藉由注射至肌肉中或任何其它適合方法投予。為了與核酸基底疫苗諸如DNA疫苗之一起使用，可將CpG與該疫苗於單一調製劑中共同調製並藉由肌肉內注射偶合電穿孔投予。藉由肌肉內、皮內或皮下投予之CpG7909之有效量典型係在10μg/劑至10mg/劑之範圍。於一些實施態樣中，CpG7909之有效量係在0.05mg至14mg/劑之範圍。於一些具體實施態樣中，CpG7909之有效量係約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、05、1mg/劑。其它CpG寡核苷酸，包括CpG 24555及CpG10103，可用類似方式及劑量水平投予。
在該用於癌症之VBIR中，該抗PD-1拮抗劑、該疫苗及該額外免疫調節劑可同時或順序投予。於一些實施態樣中，疫苗係相對於該抗PD-1拮抗劑抗體順序投予，但係相對於一或多種該額外免疫調節劑同時(例如，呈混合物)投予。於其中核酸疫苗係與CpG組合投予之例子中， 該疫苗與CpG可在單一調製劑中含有且藉由任何適合方法一起投予。於一些實施態樣中，該於共調製劑(混合物)中之核酸疫苗與CpG係藉由肌肉內注射組合電穿孔投予。
調製劑
根據本發明所使用之抗PD-1拮抗劑抗體之治療調製劑係藉由混合具有所欲程度純度之抗體與視需要之醫藥上可接受之載劑、賦形劑或安定劑(Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing,2000)製備以供呈冷凍乾燥調製劑或水性溶液之形式儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所施用該劑量及濃度下對接受者不具毒性，且可包括緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽類諸如氯化鈉；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑(諸如十八基二甲基苄基氯化銨、氯化六甲雙銨；氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨；酚、丁基或苄基醇；烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑諸如EDTA；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽相對離子諸如 鈉；金屬複合物(例如鋅蛋白複合物)；及/或非離子性界面活性劑諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有抗PD-1拮抗劑抗體之脂質體係藉由該領域已知之方法製備，諸如Epstein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang,et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；及美國專利第4,485,045及4,544,545號所述。具有增進之循環時間的脂質體係揭露於美國專利第5,013,556號。特別有用之脂質體可藉由逆相蒸發方法使用脂質組成物產生，該脂質組成物包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)。脂質體被擠壓通過具有經定義孔徑大小之過濾器以產生具有所欲直徑之脂質體。
該活性組分亦可被包封於藉由例如凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊中，舉例來說分別於羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中、於膠體藥物遞送系統中(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米微膠囊)或於巨乳化液中。此等技術係揭示於Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實施例包括含有該抗體之固體疏水性聚合物之半透性基體，該基體係呈經塑形物件之形式，例如膜或微膠囊。持續釋放基體之實施例包括聚酯、水凝膠(舉例來說聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919 號)、L-麩胺酸及7乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所組成之可注射微球)、蔗糖乙酸酯異丁酸酯及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
待用於活體內投予之調製劑必須為無菌。此可輕易地藉由，舉例來說過濾通過無菌過濾膜完成。治療性抗PD-1拮抗劑抗體組成物一般置放於具有無菌接口之容器中，舉例來說具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
根據本發明之組成物可呈單位劑量形式，諸如錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、溶液、懸浮液或栓劑，以供經口、非經腸或經直腸投予，或藉由吸入或噴入投予。
為了製備固體組成物諸如錠劑，主要活性組份係與醫藥載劑，例如習用之製錠組分諸如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠；及其他醫藥稀釋劑，例如水混合，以形成含有本發明之化合物或彼之非毒性醫藥上可接受之鹽的均質混合物之固體預調製劑組成物。當提及這些預調製劑組成物係均質時，意指該活性組分係遍及整個該組成物均勻分散於內，而使得該組成物可被輕易地次分成同樣有效之單位劑量形式諸如錠劑、丸劑及膠囊。此固體預調製劑組成物接著被次分成上述種類之單位劑量形式，其含有自約0.1至約500mg之本發明之活性組份。該新穎組成物之錠劑或丸劑可經塗 覆或以其他方式複合以提供具有長效優點之劑型。舉例來說，該錠劑或丸劑可包含內部劑量及外部劑量成分，後者係呈前者之包封套之形式。該兩種成分可被腸溶層分開，該腸溶層用來抵抗胃中之崩解，及允許該內部成分完整通過到達十二指腸或被延遲釋放。有各式材料可被用於此種腸溶層或塗覆層，此等材料包括大量的聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、鯨臘醇及醋酸纖維素之材料的混合物。
適合之表面活性劑包括尤其是非離子性劑，諸如聚氧乙烯去水山梨醇(例如TweenTM 20、40、60、80或85)及其他去水山梨醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。含有表面活性劑之組成物將方便地方包含在0.05至5%之間之表面活性劑，且可在0.1至2.5%之間。將了解若需要的話其他組分可被添加，舉例來說甘露醇或其他醫藥上可接受之載具。
適合之乳液可使用市售脂肪乳液製備，諸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM。該活性組分可被溶解於預先混合之乳液組成物中，替代地其可被溶解於油中(例如大豆油、紅花籽油、棉花籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)，及一旦與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合會形成乳液。將了解的是可添加其他組分，舉例來說甘油或葡萄糖，以調整該乳液之張力。適合之乳液典型將含有最高20%，舉例來說在5至20%之間的油。該脂肪乳液可包含在0.1與1.0μm之間，尤其是0.1與0.5μm之間的脂肪 液滴，且具有在5.5至8.0之間的pH。
該乳液組成物可為那些藉由混合抗PD-1拮抗劑抗體與IntralipidTM或彼之成份(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所製備者。
用於吸入或噴入之組成物包括在醫藥上可接受之水性或有機溶劑或彼等之混合物中之溶液及懸浮液，和粉末。該液體或固體組成物可能含有如前述之適合之醫藥上可接受之賦形劑。於一些實施態樣中，為了局部或全身性效應，該組成物係藉由經口或經鼻呼吸路徑投予。在較佳醫藥上可接受之無菌溶劑中之組成物可藉由使用氣體加以噴霧化。經噴霧化之溶液可從噴霧裝置直接吸入，或該霧化裝置可附接至面罩、帷幕或間歇性正壓呼吸器。溶液、懸浮液或粉末組成物可自裝置較佳地經口或經鼻投予，該裝置以適當方式遞送調製劑。
套組
本發明亦提供包含任何或所有本文中所述抗體之套組。本發明之套組包括一或多個包含本文中所述之抗PD-1拮抗劑抗體之容器，及根據本文中所述之本發明方法中之任一者所使用之說明。一般，這些說明包含投予用於上述治療性治療之抗PD-1拮抗劑抗體的說明。於一些實施態樣中，套組係經提供以供產製單一劑量投予單位。於某些實施態樣中，該套組含有具有乾燥蛋白之第一容器及具有水性調製劑之第二容器二者。於一些實施態樣中，係包 括含有單個或多個艙預先填滿之注射器(例如液體注射器及凍乾劑注射器)之套組。
於一些實施態樣中，該抗體係人類抗體。於一些實施態樣中，該抗體係人源化抗體。於一些實施態樣中，該抗體係單克隆抗體。關於使用抗PD-1抗體之儀器一般包括用於該意圖治療之劑量、給藥時程及投予路徑之資訊。該等容器可為單位劑量、大量包裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。提供於本發明之套組中之說明典型為在標籤或包裝仿單上之書面說明(例如包括在套組中之紙)，但亦可接受機器可讀取之說明(例如磁性或光學儲存磁碟上攜帶之說明)。
本發明之套組係經適合包裝。適合之包裝包括但不限於小瓶、瓶子、罐、可彎折之包裝(例如密封之美拉(Mylar)或塑膠袋)及該類似物。亦考慮的是與特定裝置組合使用之包裝，諸如吸入器、經鼻投予裝置(例如霧化器)或輸注裝置諸如小型泵。套組可能具有無菌接口(舉例來說該容器可能為具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。該容器也可能具有無菌接口(舉例來說該容器可能為具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。該組成物中之至少一種活性劑係抗PD-1抗體。該容器可能進一步包含第二醫藥活性劑。
套組可能可視需要提供額外成份，諸如緩衝劑及解說資訊。通常，該套組包含容器及在該容器上或與該容器結合之標籤或包裝仿單。
生物寄存
本發明之代表性材料係於2014年4月29寄存於美國菌種保存中心(10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209,USA)。具有ATCC登錄號PTA-121182之載體msb7-LC係編碼mAb7輕鏈可變區之多核苷酸，及具有ATCC登錄號PTA-121183之載體mab7-HC係編碼mAb7重鏈可變區之多核苷酸。寄存係根據布達佩斯條約對於國際承認用於專利程序的微生物寄存之規定和其細則(布達佩斯條約)作出。此確保自寄存日開始30年內維持該寄存物為活的培養物。該寄存物將依照布達佩斯條約之規定由ATCC提供，且將受限於輝瑞(Pfizer,Inc.)與ATCC之合約，該合約確保當簽發相關美國專利或公開任何美國或外國專利申請案時(以先到者為主)，該寄存物之培養子代可永久且不受限制地供公眾使用，且確保由美國專利商標局局長依據35 U.S.C.122及該局長所依據之法則(包括37 C.F.R.1.14，特別參照886 OG 638)判定有權獲得該子代者之可得性。
本申請案之代理人同意，若該寄存中之材料的培養物在適當條件培養下死亡或遺失或毀損，一經通知應立即以另一相同材料取代該材料。不得將該寄存材料之可得性視為可藉以實施本發明而侵犯由任何政府機關依據該國專利法所授予之權利之許可。
下列實施例僅供說明目的，而不意圖以任何方式限制本發明之範疇。事實上，除了在本文中顯示及描述者外， 本發明之各式修飾將為該領域中具有通常知識者自前述說明所顯而易見且屬於隨附之申請專利範圍之範疇內。
實施例
實施例1：抗PD-1抗體對IFNγ與TNF分泌之效應
此實施例說明，在混合之淋巴球反應(MLR)檢測法中，抗PD-1抗體對IFNγ與TNF分泌之效應。
自全血(史丹福大學血庫)分離之初級人類T細胞，係藉由表現高水平PD-L1及PD-L2之同種異型樹突細胞(DC)活化，該樹突細胞先前係使用IL-4及GM-CSF自CD14+骨髓細胞分化而得。於此研究中，使用下述抗體：同型對照(IgG4κ經安定絞鏈)、抗PD-1拮抗劑抗體C1、抗PD-1拮抗劑抗體C2、抗PD-1拮抗劑抗體C3、EH12.1(BD Biosciences小鼠抗人類抗PD-1抗體，小鼠同型IgG1κ)、mAb7-G4、mAb15-G4、mAb-AAA、mAb15-AAA(G4=IgG4經安定絞鏈；AAA=突變體IgG1，其不會結合FcγR)。在下列濃度測試抗體：0、0.1、1或10μg/ml)。
用於該MLR檢測法，培養物係以測試或對照抗體培養於96孔盤中，三重複，以1：10比之DC：T細胞，且係培養於37℃具有5% CO2之潮濕培養器中。在第5天收獲上清液，且根據製造商的步驟使用人類可溶性蛋白非力斯組系統套組(Human Soluble Protein Flex Set System kit)(BD Biosciences，目錄號：558265)，以下列人類分析 物使用細胞儀磁珠陣列法(CBA)測量細胞介素：IFNγ(BD Biosciences，目錄號：558269)，TNF(BD Biosciences，目錄號：558273)。簡言之，96孔過濾器盤(Millipore，目錄號：MSBVN1250)係以清洗緩衝液(BD Biosciences專有配方)清洗，且藉由真空歧管吸除。該套組所提供之標準品及樣品係稀釋於檢測稀釋劑(BD Biosciences專有配方)中且添加至具有捕捉珠之該盤中(捕捉珠係塗覆有抗特定可溶蛋白之抗體，該特定可溶蛋白上塗覆有區別螢光劑)。使用盤震盪器以500rpm將盤混合5分鐘，且在室溫培養1小時。將偵測試劑(藻紅素(PE)-共軛之抗體，由k所提供)添加至盤中且將盤混合5分鐘。在室溫培養盤2小時。接著以清洗緩衝液清洗5分鐘，且樣品在BD Fortessa平台上取得數據。使用FCAP陣列第3版(BD)分析數據。MLR檢測法之結果顯示於下表6A及6B中。表6A顯示IFNγ水平(單位pg/ml)，而表6B顯示TNF水平(單位pg/ml)。數據以生物三重複之平均±S.E.M表示。樣品為一個MLR實驗的代表。
與同型對照相比，以抗PD-1拮抗劑抗體處理經活化T細胞導致增加之IFNγ水平(表6A)。舉例來說，以0.1μg/ml mAb15-G4及mAb7-G4處理導致IFNγ水平分別為4728.295±2.035pg/ml及8567.203±2085.826pg/ml。以1μg/ml mAb15-G4及mAb7-G4處理導致IFNγ水平分別為8893.595±365.125pg/ml及11876.86±1259.788pg/ml。以10μg/ml mAb15-G4及mAb7-G4處理導致IFNγ水平分別為7790.95±1700.012pg/ml及11794.82±1827.243pg/ml。相反地，以0.1、1或10μg/ml同型對照處理導致IFNγ水平分別為3760±367.4262pg/ml、3693.972±1033.879pg/ml及3525.655±744.676。
與同型對照相比，以抗PD-1拮抗劑抗體處理經活化T細胞導致增加之TNF水平(表6B)。舉例來說，以0.1μg/ml mAb15-G4及mAb7-G4處理導致TNF水平分別為743.1167±56.75547pg/ml及730.47±33.35488pg/ml。以1μg/ml mAb15-G4及mAb7-G4處理導致TNF水平分別為686.32±45.63348pg/ml及793.05±21.19019pg/ml。以10μg/ml mAb15-G4及mAb7-G4處理導致TNF水平分別為798.853±9.14366pg/ml及930.623±16.0494pg/ml。相反地，以0.1、1或10μg/ml同型對照處理導致TNF水平分別為407.4133±49.58195pg/ml、486.7167±4.4241pg/ml及501.17±5.033334pg/ml。
這些結果證實，抗PD-1抗體類mAb7及mAb15刺激T細胞分泌IFNγ與TNF係至少如或好於抗PD-1抗體類 C1、C2及C3。
進行第二MLR研究以測試較低抗體濃度對T細胞活化之效應。自全血分離之初級人類T細胞，係如上所述般活化。於第二MLR研究中，測試下述抗體：mAb7(G4)、mAb15(G4)、C1(G4)、EH12.1及G4同型對照。在下列濃度測試抗體：0.0001、0.001、0.01、0.1、1及10μg/ml。如上所述般進行MLR檢測法。結果總結於下表中7A及7B中。
與同型對照相比，以抗PD-1拮抗劑抗體處理經活化T細胞導致增加之IFNγ水平(表7A)。於沒有抗體之培養物中，IFNγ水平為901.453±216.472pg/ml。於給予0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10μg/ml同型對照抗體之培養物中，IFNγ水平分別為558.9629±489.4828pg/ml、753.3767±291.6092pg/ml、1074.37±324.2031pg/ml、1667.96±144.7286pg/ml、1867.96±282.7461pg/ml、2501.293±220.1829pg/ml。相反地，於以0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10μg/ml mAb7(G4)處理之培養物中，IFNγ水平分別為2082.07±720.9931pg/ml、3062.09±370.2791pg/ml、5067.823±111.4903pg/ml、7082.667±1336.082pg/ml、11928.81±1457.723pg/ml、11862.13±800.586pg/ml。於以0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10μg/ml mAb15(G4)處理之培養物中，IFNγ水平分別為1678.27±233.82pg/ml、1410.758±439.9474pg/ml、 4734.49±322.2087pg/ml、5416±1054.075pg/ml、9140.337±1320.499pg/ml及10992.13±1008.533pg/ml。
與同型對照相比，以抗PD-1拮抗劑抗體處理經活化T細胞導致增加之TNF水平(表7B)。於沒有抗體之培養物中，TNF水平為365.523±84.6607pg/ml。於以0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10μg/ml同型對照抗體處理之培養物中，TNF水平分別為452.7133±62.85pg/ml、282.9287±56.77266pg/ml、310.9144±21.7811pg/ml、358.948±81.09122pg/ml、338.1107±46.88385pg/ml及331.008±31.35559pg/ml。相反地，於以0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10μg/ml mAb7(G4)處理之培養物中，TNF水平分別為227.6±50.63436pg/ml、394.4233±30.47005、452.65±30.64335pg/ml、1089.377±174.7824pg/ml、1583.52±267.2131pg/ml及1419.88±108.711pg/ml。於給予0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10μg/ml mAb15(G4)之培養物中，TNF水平分別為494.7967±48.1810pg/ml、489.2333±30.63302pg/ml、593.34±65.87622pg/ml、811.16±89.50238pg/ml、1143.54±136.3954pg/ml及1109.063±57.70232pg/ml。
這些結果證實抗PD-1抗體類mAb7及mAb15阻斷PD-1傳信且促進初級人類T細胞分泌IFNγ與TNF。
實施例2：抗PD-1抗體類對T細胞增生之效應
此實施例說明抗PD-1抗體類對T細胞增生之效應。
於此研究中，T細胞增生係於MLR檢測法中測量，其中T細胞在抗PD-1拮抗劑或同型對照抗體存在下培養。
用於該MLR，自全血(自史丹福大學血庫獲得)分離之初級人類T細胞，係藉由表現高水平PD-L1及PD-L2之同種異型樹突細胞(DC)活化，該樹突細胞先前係使用IL-4及GM-CSF自CD14+骨髓細胞分化而得。進行兩個實驗。
於第一實驗中，比較mAb7(IgG4κ經安定絞鏈)、mAb15(IgG4κ經安定絞鏈)、C1、EH12.1及同型對照。於第二實驗中，比較克隆mAb7、mAb15、C2、EH12.1及同型對照。於這二個實驗中，抗體都以下列濃度添加：0、0.0001；0.001；0.01；0.1；1及10μg/ml。
對於這兩個實驗，培養物都以抗體培養於96孔盤中，三重複，以1：10比之DC：T細胞，且係培養於37℃具有5% CO2之潮濕培養器中。在第5天，培養物以每孔1μCi之[3H]-胸苷在收穫前脈衝18h。接著盤係使用Harvester96(Tomtec Life Sciences)在DNA專一性過濾器紙(Perkin Elmer)上收穫。以β閃爍液體(Perkin Elmer)覆蓋經放射性標籤之過濾器且於Microbeta®計數器盤(Perkin Elmer)中讀取。將胸苷納入以每秒計數(CPM)分析。結果以三重複之平均±SEM顯示。
與同型對照相比，以濃度0.01μg/ml或更高之抗PD-1拮抗劑抗體處理經活化T細胞，導致顯著增加之T細胞增生(表8A及8B)。
舉例來說，以0.01、0.1、1或10μg/ml mAb7處理，導致胸苷納入率分別為365625.3±30171.07CPM、380054.3±9774.328CPM、392256.7±15341.19CPM及372889.7±14826.49CPM(表8B)。以0.01、0.1、1或10μg/ml之mAb15-G4及mAb7，導致胸苷納入率分別為317377±31915.29CPM、360226.3±1802.69CPM、421229±27865.13CPM及323441.3±64476.55CPM(表8B)。相反地，以0.01、0.1、1、or 10μg/ml同型對照處理，導致胸苷納入率分別為278072.3±32671.62CPM、268939.7±12332.06CPM、241164±13776.81CPM及231897.7±25865.95CPM(表8B)。
這些結果證實抗PD-1抗體類mAb7及mAb15阻斷PD-1傳信且促進自初級人類T細胞增生。
實施例3：於GvHD小鼠模型中抗PD-1抗體類之效應
此實施例說明，於移植物抗宿主疾病(GvHD)小鼠模型中，抗PD-1抗體類對T細胞增生及體重減輕之效應。
於此研究中，使用NOD-scid-IL-2受體γ鏈裸(NSG)小鼠，以測試抗PD-1拮抗劑抗體於活體內對T細胞增生之效應。因為NSG小鼠缺乏T細胞及B細胞，且具有不健全之細胞NK細胞，可輕易達成移植人類細胞。當人類PBMC移植入這些小鼠中，發生人類T細胞增生且誘導GvHD。該GvHD涉及宿主之骨髓部件及人類細胞。於早期階段人類淋巴細胞的大量增生可見於血液中，隨後這些 細胞高浸潤至小鼠器官中，諸如肝、脾、腎、膽等，導致小鼠之體重減輕及皮膚病變、駝背及死亡。該模型的嚴重度取決於捐贈者PBMC，且可於捐贈者間有不同。
於此研究中，使用下列抗PD-1拮抗劑抗體：mAb7(人類IgG4經安定絞鏈或AAA)、mAb15(人類IgG4經安定絞鏈)、C1、C2及C3。對於負對照，使用同型對照人類IgG4經安定絞鏈抗體。使用Ficoll梯度，自全血(史丹福大學血庫)分離之初級人類PBMC。將107個人類PBMC注射入NSG小鼠中(母，8週齡，賈克森實驗室(Jackson Laboratories))。在第0天，基於體重將小鼠隨機化，及靜脈內注射PBMC。對於實驗1至4，在第2與第8天，以10mg/kg腹膜內投予抗體。對於實驗5，在第2與第8天，以1mg/kg或10mg/kg腹膜內投予抗體。表9總結各實驗所用抗體。
週期地測量體重。結果總結於第1A至1E圖中。對小鼠週期地抽血以評估T細胞增生。以抗PD-1抗體處理加劇疾病過程，如藉由體重減輕速率所測量者。與對照小鼠相比，以抗PD-1拮抗劑抗體處理之小鼠具有更快速體重減輕(第1A至1E圖)。
人類T細胞增生係藉由流式細胞儀測量，該流式細胞 儀係使用CD45作為標記(克隆HI30；BD Biosciences)。流式細胞儀之結果總結於下表10中。於以抗PD-1拮抗劑抗體處理之小鼠中的T細胞增生係較高於以同型對照處理之小鼠中者。較高百分比的CD45表明較高水平之CD45細胞增生且因此更嚴重的GvHD。
於實驗1中，於對照小鼠中的CD45陽性血液細胞的百分比為63.86%(表10)。相反地，於以抗PD-1抗體mAb7、mAb15、C1、或mAb7-AA處理之小鼠中的CD45陽性血液細胞的百分比分別為80.34%、77.62%、77.26%及76.9%(表10)。
總之，與以同型對照處理之小鼠相比，以抗PD-1抗體處理之小鼠具有較快速之體重減輕及增加之T細胞增生。這些結果證實以抗PD-1抗體處理刺激活體內人類T細胞增生。
實施例4：抗PD-1抗體類之結合
此實施例說明在經活化人類T細胞及馬來猴(cyno)T細胞上之抗PD-1抗體結合。
根據製造商的步驟(Miltenyi Biotec；130-096-353)，使用人類PAN T細胞分離套組自PBMC(史丹福大學血庫)分離初級人類T細胞。Cyno PBMC係購自(BioreclamationIVT)，而PAN T細胞係使用非人類靈長動物PAN T細胞分離套組，根據製造商的步驟(Miltenyi Biotec；130-091-993)分離。人類T細胞以用於細胞擴增及活化之DYNABEADSTM人類T-活化劑CD3/CD28(Life Technologies；11131D)活化3天。所用之珠對細胞比分別係1：1的珠：T細胞。Cyno T細胞係使用T細胞活化/擴 增套組，非人類靈長動物，根據製造商的步驟(Miltenyi Biotec；130-092-919)活化3天。所用之珠對細胞比分別係1：1的珠：T細胞。3天後收穫培養物，且使用磁力將珠與經活化T細胞分離。細胞經清洗及以FACS緩衝液(包括2%FBS)及人類Fc受體結合抑制劑(Affymetrix eBioscience目錄號16-9161-73)培養。對於cyno細胞係使用Fc阻斷試劑(BD Biosciences目錄號564765)。細胞於室溫培養10分鐘，且接著以活死色料(LIVE/DEAD®可固定藍色死細胞染色套組(Fixable Blue Dead Cell Stain Kit)，用於UV激發；目錄號：A10346))染色再5分鐘以排除死細胞。添加抗PD-1抗體(在細胞上培養之抗PD-1克隆濃度係，以1：3序列稀釋比，開始於10μg/ml至0μg/ml)，各反應使用1x106個細胞，總共100μl，且細胞在冰上培養30分鐘。接著細胞以FACS緩衝液清洗，以移除接口一次抗體及以共軛有異藻藍素(APC)之抗人類(AffiniPure F(ab')2片段驢抗人類IgG(H+L)二次抗體；目錄號709-136-149)培養。於冰上，將細胞染色30分鐘。在冰上清洗及保持細胞直到使用BD LSRFortessa細胞分析儀(BD Biosciences，目錄號647465)讀取。使用FlowJoTM軟體分析數據。結果總結於第2A及2B圖中。
第2A圖顯示抗PD-1抗體結合經活化人類細胞所測到之EC50，而第2B圖顯示抗PD-1抗體結合經活化cyno細胞所測到之EC50。抗PD-1抗體類mAb7及C1係以相似EC50結合經活化T細胞(第2A及2C圖)。
實施例5：以抗PD-1抗體抑制PD-L1結合
此實施例說明以抗PD-1抗體抑制PD-1配體(PD-L1)結合。
使用人類PAN T細胞分離套組，根據製造商的步驟(Miltenyi Biotec；130-096-353)，自PBMC(史丹福大學血庫)分離初級人類T細胞。Cyno PBMC係購自(BioreclamationIVT)，而PAN T細胞係使用非人類靈長動物PAN T細胞分離套組，根據製造商的步驟(Miltenyi Biotec；130-091-993)分離。人類T細胞以DYNABEADSTM人類T-活化劑CD3/CD28(用於細胞擴增及活化，Life Technologies；11131D)活化3天。所用之珠對細胞比分別係1：1。Cyno T細胞係使用T細胞活化/擴增套組，非人類靈長動物，根據製造商的步驟(Miltenyi Biotec；130-092-919)活化3天。所用之珠對細胞比分別係1：1。3天後收穫培養物，且使用磁力將珠與經活化T細胞分離。細胞經清洗及以FACS緩衝液(包括2%FBS)及人類Fc受體結合抑制劑(Affymetrix eBioscience目錄號16-9161-73)培養。對於cyno細胞係使用Fc阻斷試劑(BD Biosciences目錄號564765)。細胞於室溫培養10分鐘，且接著以活死色料(LIVE/DEAD® Fixable Blue Dead Cell Stain Kit，用於UV激發；目錄號：A10346))染色再5分鐘以排除死細胞。以10ng/ml之人類重組PD-L1 Fc(R&D Systems，目錄號156-B7)或單獨緩衝劑培養細胞。各配體個別培養且係在冰上培養30分鐘。接著細胞經清洗並以抗PD-1抗體 (在細胞上培養之抗PD-1克隆濃度係，以1：3序列稀釋比，開始於10μg/ml至0μg/ml)培養，各反應使用1x106個細胞，總共100μl，且細胞在冰上培養30分鐘。接著細胞以FACS緩衝液清洗，以移除接口一次抗體及以共軛有異藻藍素(APC)之抗人類κ(Life Technologies；目錄號MH10515)培養。於冰上，將細胞染色30分鐘，接著在冰上清洗及保持細胞直到使用BD LSRFortessa細胞分析儀(BD Biosciences，目錄號647465)讀取。使用FlowJoTM軟體分析數據，及於FlowJoTM軟體中計算在活的細胞上APC染色的平均螢光強度(MFI)及幾何平均數(Geo.M)。在計算Geo平均數後，使用GraphPD Prism軟體計算IC50。結果總結於表11及12中。
這些結果證明抗PD-1抗體類mAb7及C1係以相似IC50抑制PD-L1結合人類及cyno T細胞。
實施例6：抗PD-1抗體對T細胞增生之效應
此實施例說明抗PD-1抗體對T細胞增生之效應。
CD4及CD8(AllCells,LLC)以DYNABEADSTM人類T-活化劑CD3/CD28(或細胞擴增及活化(Life Technologies；11131D)活化2天。所用之珠對細胞比分別係1：1以誘導PD-1。在第2天收穫培養物，且使用磁力將珠與經活化T細胞分離。接著細胞在表現PD-L1樹突細胞上活化且細胞以1μg/ml的不同抗PD-1克隆培養於96孔盤中，三重複，以1：10比之DC：T細胞，且係培養於37℃具有5% CO2之潮濕培養器中。在第3天，培養物以每孔1μCi之[3H]-胸苷在收穫前脈衝18h。接著盤係使用Harvester96(Tomtec Life Sciences)在DNA專一性過濾器紙(Perkin Elmer)上收穫。以β閃爍液體(Perkin Elmer)覆 蓋經放射性標籤之過濾器且於Microbeta®計數器盤(Perkin Elmer)中讀取。將胸苷納入以每秒計數(CPM)分析。於第3及4圖中，結果以三重複之平均±SEM顯示。
實施例7：決定人類、馬來猴及小鼠PD-1與人源化抗PD-1抗體類交互作用之動力學及親和性
此實施例說明抗PD-1抗體類與人類、馬來猴及小鼠PD-1之結合。
除非另行表明，所有交互作用分析係於25℃在無標籤生物感測器施行。使用表面電漿共振生物感測器(ProteOn-XPRTM來自BioRadTM，及Biacore 2000TM與Biacore T200TM來自GE Life Sciences)來研究人類及馬來猴PD-1，及使用生物層干涉生物感測器(Octet-Red384,Fortebio/Pall Life Sciences)來研究小鼠PD-1。ProteOn實驗在PBS，pH 7.4+0.01% Tween-20(PBST)運行緩衝液中施行。Biacore實驗在10mM Hepes，pH 7.4，150mM NaCl，0.05% Tween-20(HBST+)中施行，及Octet實驗在HBST+及1g/l BSA中施行。ProteOn數據在ProteOn經理軟體中處理，Biacore數據在Biaevaluation中處理，及Octet數據簡單地對準到對照軟體的零。SPR數據經雙重參照(Myszka,1999,J Mol Recognit12(5)：279-284)且全局擬合至簡單朗繆爾(Langmuir)模式，以從動力學速率常數之比決定平衡解離常數KD(KD=kd/ka)。
免校正濃度分析(CFCA)
在具有不動IgG之動力學實驗中用來作為分析物之人類PD-1(hPD-1)單體(Sino Biologicals，目錄號10377-H08H)的活性濃度係使用CFCA檢測法在配備有CM5感測晶片之Biacore T200TM上經驗地決定。為了製備這些實驗的表面，高能力(約12,000RU)之mAb15 hIgG4(或於一些實驗中，競爭者抗體C2-hIgG1)係胺偶合至流動細胞2上，讓流動細胞1空白(只「經活化且阻斷」，沒有任何IgG)以提供參考表面。hPD-1樣品在標稱濃度0.1、1及10μg/ml以低(5μl/分鐘)及高(100μl/分鐘)流動速率注射36秒。以2：1 v/v的皮爾斯(Pierce)IgG洗脫緩衝液(pH 2.8)：4M NaCl雞尾酒再生表面。於T200軟體中在CFCA工具分析數據，以衍生出hPD-1分析物之表觀活性值，其係用以修正其之「標稱」蛋白濃度(如藉由以適當消光係數在280nm吸光度所決定者)成「活性」蛋白濃度。一些批次實測為32%活性，而其他批次為100%活性。
人類PD-1(hPD-1)結合經胺偶合mAb7、mAb15、C1、C2、C3及C4 mAb的動力學分析
使用配備有GLC感測晶片(BioRadTM,Hercules,CA)之ProteOn-XPR36來決定在PBST運行緩衝液中，hPD-1單體結合一組經胺偶合抗hPD-1 mAb(mAb7、mAb15、C1、C2、C3及C4)的動力學及親和性。於三個步驟中製 備用於這些實驗的表面：(1)使用於水中最終0.8mM EDC及0.2mM N-羥基硫代琥珀醯亞胺(sulfo-NHS)之新鮮製備活化試劑混合物最低限度地活化配體通道2分鐘，(2)於pH 4.5之10mM乙酸鈉中，IgG以15μg/ml偶合3分鐘，及(3)以1M乙醇胺HCl，pH 8.5阻斷過量反應性酯3分鐘。經偶合IgG的最終水平在從400RU至1157RU之範圍。沿著「分析物」通道以三倍序列稀釋及頂部「活性」濃度為30、44或36nM(取決於實驗)，以一步法動力學(one-shot kinetic)模式(Bravman et al.,2006,Anal Biochem 358(2)：281-288)注射hPD-1單體。結合與解離時間分別為3分鐘與20分鐘，且所有分析物以二重複結合循環注射。以2：1 v/v的Pierce IgG洗脫緩衝液(pH 2.8)：4M NaCl雞尾酒再生表面。
hPD-1單體與mAb7及mAb15之交互作用顯示，在允許解離相內之結合反應沒有可見衰退，所以在它們kd及KD值上放置上限值，係根據「5%規則」(Katsamba et al, 2008,Anal Biochem 352(2)：208-221)在它們kd及KD值上施加放置上限值。N=2係指在兩個不同經片上的兩個獨立實驗。
mAb7與mAb15對馬來猴PD-1的交叉反應
使用配備有CM4感測晶片之Biacore 2000TM及HBST+運行緩衝液，決定經純化重組Fab片段(mAb7與mAb15)對hPD-1-hFc1(R&D systems目錄號1086PD)及cynoPD-1-hFc1(在公司內製備)的結合動力學。抗hFc多克隆抗體係胺偶合至該晶片且係用於在流動細胞2與3上捕捉約90RU之hPD-1-hFc1及125RU之cynoPD-1-hFc1，讓流動細胞1空白(裸抗hFc捕捉表面)而提供參考通道。經純化重組Fab片段作為分析物，以0、10及100nM注射2分鐘，其流過新鮮捕捉之PD-1-hFc1融合蛋白，允許15分鐘解離時間。使用75mM磷酸再生捕捉表面及以二重複結合循環注射mAb7 Fab樣品。所有Fab/PD-1複合物都非常安定，以致沒有一個交互作用顯示在允許解離時間內它們的結合反應有任何可見衰退，所以施加「5%規則」(Katsamba et al,2008)以在它們kd及KD值上放置上限值。
hPD-1對mAb15、mAb7及C3之結合親和性的溫度依賴性
使用配備有CM4感測晶片之Biacore 2000TM來決定hPD-1單體結合一組hIgG4分子(mAb15、mAb7及C3)的動力學及親和性，該等hIgG4分子係經由經胺偶合抗hFc多克隆抗體以低水平被捕捉。hIgG4 mAb係以10μg/ml捕捉在個別流動細胞上，讓流動細胞1空白以作為參考表面(裸捕捉表面)。以活性濃度0、10及100nM注射hPD-1，3分鐘，允許18分鐘解離相。在各結合循環後，以75mM磷酸再生捕捉表面。
mAb7對小鼠-PD-1的交叉反應
使用配備有鏈霉抗生物素蛋白感測尖端之Octet- Red384來決定是否小鼠PD-1結合mAb7。選擇親和性-傾向(avidity-prone)檢測格式以增加該檢測法之偵側敏感度。感測器以生物素化抗人類κ多克隆塗覆且用於以10μg/ml捕捉一組hIgG4抗hPD-1 mAb(mAb7、C1、C2及C3)，各mAb經捕捉在八個感測器上。作為正對照，八個鏈霉抗生物素蛋白感測器以生物素化J43(eBioSciences)(一種抗小鼠PD-1抗體)塗覆。將各經mAb塗覆感測器暴露在下列分析物中：緩衝劑、1μM小鼠PD-1-hFc結合位點、1μM hPD-1-hFc結合位點(正對照)、或1μM hGHR-hFc結合位點(負對照)。所有重組Fc-融合蛋白係來自R&D systems。因此在二重複感測器上測試各分析物/mAb之交互作用。
抗PD-1抗體類C1、C2及C3不會結合小鼠-PD-1-hFc1(數據未顯示)。抗PD-1抗體mAb7會弱結合小鼠-PD-1-hFc1(數據未顯示)。所有經測試抗PD-1抗體類會結合hPD-1-hFc。這些結果證實，mAb7對小鼠PD-1具弱交叉反應性而C1、C2及C3對小鼠PD-1不具交叉反應性。
實施例8：以抗PD-1抗體類治療癌症
這是一個預言實施例，其說明本發明之抗PD-1抗體類用於治療癌症之用途。
選擇具有經組織學上確認且先前未經治療之可測量轉移結腸直腸癌的病患，以用於以抗PD-1抗體治療。將病患分組到兩個治療群組中的一者中：化學療法加上安慰劑 或化學療法加上mAb7。利用動態隨機化演算法來達成整體平衡且在下列類別之各者內：研究中心、基線ECOG表現狀態(0 vs.≧1)、原發疾病位點(結腸vs.直腸)及轉移位點數目(1 vs.>1)。於各8週循環的首6週，每週投予化學療法治療。持續化學療法直到研究完成(96週)或疾病惡化。每2週投予5mg/kg之mAb7或安慰劑。在mAb7臂中具有經確認完全反應或體驗到為化學療法治療結果的不可接受毒性之病患，允許其不繼續化學療法且繼續接受單獨mAb7作為第一線治療。僅隨機化到mAb7群組中之病患可接受mAb7作為第二線治療之成分。在完成研究後，每4個月追蹤病患的任何後續治療及存活直到死亡、失去追蹤、或研究中止。
病患將在基線及在完成每8週循環經歷腫瘤狀態評估，此係使用適當放射圖像技術，典型為螺旋CT掃描。利用實體腫瘤之回應評價標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)(Therasse et al.(2000)，藉由研究員及獨立放射機構(IRF)決定腫瘤回應、或惡化。IRF評估的施行將不需要知道治療分組或研究員的評估。此外，在基線及在各治療循環之前，病患將完成第4版癌症療法功能性評估一大腸(Functional Assessment of Cancer Therapy-Colorectal(FACT-C),Version 4)，一種經過驗證用於評估結腸直腸癌病患之生活品質(QOL)的工具，直到疾病惡化。Ward et al.(1999)Qual.Life Res.8：181-195。
從不良事件、實驗室測試結果及生命跡象測量之報告 評估安全性。使用第二版國家癌症機構一般毒標準(National Cancer Institute Common Toxicity Criteria(NCI-CTC),Version 2)分類不良事件及不正上實施驗結果。預先指定之安全性測量包括四個特別感興趣之不良事件(高血壓、蛋白尿、血栓形成、出血)。
主要結果測量係在整個存活期間。次要結果測量包括：無惡化存活、客觀回應率(完全或部分)、回應持續期及在FACT-C QOL得分之改變。存活持續期經定義為從隨機化到死亡的時間。對於在分析時點活著的病患，存活持續期將以最後一次接觸日刪減。無惡化存活經定義為從隨機化到疾病惡化早期或於研究時死亡的時間，該於研究時死亡經定義為在最後一劑研究藥物或化學療法的30天內因任何原因所致死亡。對於在分析時點活著且沒有疾病惡化的病患，無惡化存活將以它們最後一次腫瘤評估、或當沒有施行基線後評估時以第1天(研究治療的第1天)刪減。於客觀回應之分析中，沒有腫瘤評估之病患被分類成不回應者。疾病惡化及回應分析係基於IRF評估。在生活品質的改變經分析為在QOL之惡化(TDQ)時間，其係經定義為從隨機化到最早有從大腸癌專用FACT-C次規格得分(CCS)基線降低≧3分、疾病惡化、或於研究時死亡的時間長度。也將決定TOI-C(CCS之和，物理上與功能上良好)及從基線改變之總FACT-C之TDQ。
實施例9：以抗PD-1抗體類治療癌症
此實施例說明本發明之抗PD-1抗體類用於治療癌症之用途。
此實施例中的研究係在具有局部晚期或轉移黑色素瘤、鱗狀細胞頭的頸癌(SCHNC)、卵巢惡性腫瘤、肉瘤、或復發或難治的經典霍奇金氏淋巴瘤(cHL)之先前經治療的成人病患中，靜脈內投予抗PD-1單克隆抗體mAb7的第1期、非盲標籤、多個中心、多個劑量、劑量遞增、安全、PK且PD研究。
納入標準：-組織學上和細胞學上診斷有局部晚期或轉移黑色素瘤、SCCHN、卵巢癌、肉瘤、或復發或難治cHL：-病患應已接受至少1次且不超過5次用於反覆發生或轉移疾病之先前療法線，包括標準照護及研究性療法。-至少一個第1.1版RECIST(RECIST version 1.1)所定義之可測量病變或(用於cHL)至少1個先前未被照射惡性淋巴瘤之回應標準所定義之氟去氧葡萄糖正子攝影(FDG PET)親和(多維勒(Deauville)4/5)可測量病變>1.5cm。-對於第1B部分擴增組及所有第2部分組：病患已同意經歷治療前及治療中活檢。-充足腎、肝、骨隨功能排除標準-活性腦或軟腦膜轉移。-眼黑色素瘤-活性且已知或懷疑自體 免疫疾病。允許編入具有下列者之病患：白斑症、第I型糖尿病、因自體免疫自體免疫狀況只需要更換賀爾蒙之殘留甲狀腺功能低下、不需要全身性治療之牛皮癬、或在沒有外部引發劑的存在下不預期會重複復發生的狀況。先前免疫不全或需要免疫壓抑療法的器官移植物之診斷，-對於第2部分：先前經PD 1或PD L1抗體治療。-等級3之免疫媒介之AE的病史(包括被視為是與藥物相關之AST/ALT伸高及細胞介釋放症候群)，其被視為是與先前免疫調節性療法(例如免疫檢查點抑制劑、共刺激性劑等)相關且需要免疫壓抑療法。
具有ORR(客觀回應率)之病患數目將在基線且每六週測量直到疾病惡化或最高24個月不可接受之毒性。
實施例9：抗PD-1抗體類在人類及馬來猴之初級T細胞的拮抗劑活性
此實施例說明抗PD-1單克隆抗體在人類及馬來猴之初級T細胞的拮抗劑活性。
於此研究中，使用混合之淋巴細胞反應(MLR)，於活體外檢驗抗PD-1單克隆抗體mAb7的拮抗劑活性。自人類末梢血液單核細胞(PBMC)及馬來猴-末梢血液單核細胞分離初級T細胞。在mAb7暴露後，使用人類及馬來猴之MLR及使用經金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)超級抗原活化之馬來猴血液細胞介素釋放檢測法，在不同活化條件下活體外評價細胞增生及細胞介素分泌。
方法 人類T淋巴細胞
人類核黃層係購自史丹福大學血液中心(Stanford,CA)，以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)稀釋之並層疊在Ficoll上以用於分離PBMC。hu-PBMC以PBS清洗4次，且使用人類專一性Pan T-細胞分離套組，如製造商的步驟所述般(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)以負選擇分離T淋巴細胞。
馬來猴T淋巴細胞
新鮮馬來猴-PBMC係購自Bioreclamation IVT(New York,NY)，且以PBS清洗兩次。使用非人類靈長動物專一性之Pan T-細胞分離套組，如製造商的步驟所述般(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)以負選擇分離T淋巴細胞。
產生表現高水平PD-L1之人類樹突細胞
人類核黃層係購自史丹福大學血液中心(Stanford,CA)，以PBS稀釋之並層疊在Ficoll上以用於分離hu-PBMC。hu-PBMC以PBS清洗4次，且人類專一性CD14細胞分離套組，如製造商的步驟所述般(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)以負選擇分離分化簇14(CD14+)單核細胞。接著將細胞以5 x 105細胞/mL接種在補充有10%胎牛血清(FBS)之完全羅斯維爾公園紀念學院(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640培養基中7天。在第0、2及5天，對培養物補充重組人類(rh-)IL-4(1000U/mL)(R&D Systems,Minneapolis,MN)及rh-顆粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)(rh-GMCSF)(500U/mL)(R&D Systems,Minneapolis,MN)。在第7天，將未成熟DC收穫、清洗並計數。使用經r-藻紅素(RPE)標籤之抗hu-PD-L1(eBioscience/Affymatrix,San Diego,CA)，藉由使用LSRFortessaTM分析儀之(BD Biosciences,San Jose,CA)流式細胞儀，來測試各製劑之樣品的PD-L1表現
產生表現高水平PD-L1之馬來猴樹突細胞
新鮮馬來猴-PBMC係購自Bioreclamation IVT(New York,NY)，且以PBS清洗兩次。使用非人類靈長動物專一性之CD14細胞分離套組，如製造商的步驟所述般(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)以正選擇分離CD14+單核細胞。接著將細胞以5 x 105細胞/mL接種在補充有10%胎牛血清(FBS)之完全RPMI 1640培養基中7天。在第0、2及5天，對培養物補充rhIL-4(1000U/mL)(R&D Systems,Minneapolis)及rh-GMCSF(500U/mL)(R&D Systems,Minneapolis,MN)。在第7天，將未成熟DC收穫、清洗並計數。使用經RPE標籤之抗hu-PD-L1(eBioscience/Affymatrix,San Diego,CA)，藉由使用LSRFortessaTM分析儀之(BD Biosciences,San Jose,CA)流式細胞儀，來測試各製劑之樣品的PD-L1表現。
產生表現高水平人類PD-L1之JeKo-1-Luc-綠色螢光蛋白細胞克隆
JeKo-1細胞系(外套細胞淋巴瘤)係購自美國菌種保存中心(ATCC,Manassas,VA)。JeKo-1-luc-2A-GFP細胞系是根據製造商的步驟藉由轉導程序在輝瑞(South San Francisco,CA)產製，該轉導程序使用透過具有殺稻瘟菌素標記之雙作用子系統獨立表達螢火蟲發光酶(luc2A)及綠色螢光蛋白(GFP)之慢病毒粒子(AMSBIO,LVP323，每200μL 1×10E7粒子)。產生JeKo-1細胞團並以具有20%FBS之RPMI培養基中稀釋成1 x 106細胞/mL。以每0.5mL細胞50μL病毒之比添加慢病毒粒子至經稀釋細胞。為了產生表達hu-PD-L1之JeKo-1細胞系，藉由Life Technologies(San Diego,CA)客製合成hu-PD-L1 cDNA並克隆到基因表現載體(pcDNA3.1)中。安定表現hu-PDL-1之JeKo-1-Luc-GFP細胞系是藉由使用Amaxa® Nucleofector系統(Lonza,Walkersville,MD)之電穿孔及根據製造商步驟(Lonza,Walkersville,MD)使用之套組V在輝瑞(South San Francisco,CA)產製。接著細胞在250μg/mL潮霉素存在下生長2週，並藉由使用BD FACSAriaTM II分選器(BD Biosciences,San Jose,CA)之細胞分選選擇。以直接經異藻藍素(APC)標籤標籤之抗hu-PD-L1抗體克隆MIH-1(Affymetrix/eBioscience,San Diego,CA)傳導經分選細胞。擴增陽性克隆並使用流式細胞儀(LSRFortessaTM分析儀，BD Biosciences,San Jose, CA)測試高PD-L1表現。係選擇自單一經分選細胞產生且含有高水平PD-L1表現之克隆。
產生抗體
使用優良實驗室操作規範(GLP)材料(批次編號STL0005717)在CHO細胞(Pharmaceutical Sciences,Pfizer Inc,Saint Louis,MO)中產生mAb7並以在20mM組胺酸、85mg/mL蔗糖、0.2mg/mL聚山梨醇酯-80、0.05mg/mL EDTA二鈉之pH 5.5緩衝液中提供之。經測量內毒素為0.01EU/mg。所有活體外檢測法中使用之對照抗體係克隆到IgG4-HG架構(與MAB7相同之架構)中之抗牛疱疹病毒。對照抗體係在輝瑞(South San Francisco,CA)產生，批次編號4945，具有0.3EU/mg內毒素。
自公開於先前專利中的序列產生兩個抗hu-PD-1抗體並於類似於MAB7所用之IgG4-HG架構中表現之。抗體係在輝瑞(South San Francisco,CA)產生，且經設計成正對照1及正對照2(批次編號分別為5053與4255)。經測量內毒素分別為0.13EU/mg與0.056EU/mg。
使用表現高水平人類PD-L1之樹突細胞的人類檢測法
摘用Kruisbeek et al,2004之步驟，有進行一些修改。在第7天收穫經分化初級hu-DC，並藉由流式細胞儀驗證高水平PD-L1表現及T-細胞活化所必要之共刺激性信號；標記包括CD80及CD86(抗體，購自BD Bioscience,San Jose,CA)。計數細胞並使用RS2000 x-光機器(Radsource,Brentwood,TN)以3000輻射單位(rad)輻射之，以防止DC分泌細胞介素而僅作為T細胞的Ag呈現支持物。因此，該檢測法之結果僅來自T細胞誘導。在第7天，從同種異型捐贈者收獲新鮮分離之hu-T細胞。在不同濃度mAb7、負與正對照抗體或單獨培養基(用以評價基線反應)之存在下，使用10：1比將T細胞與經輻射DC裝盤(最佳檢測條件經決定為2 x 105個T細胞以2 x 104個DC於200μL培養物培養)。所有條件裝排在96孔平底組織培養經處理盤(Fisher Scientific Pittsburg,PA)。使用無血清X-vivo15培養基(Lonza,Walkersville,MD)培養細胞，以避免實驗間之人類血清變化性。培養物在37℃，5% CO2培養5天。在第5天，收集上清液且根據製造商的步驟使用細胞儀磁珠陣列法(CBA)(BD Biosciences,San Jose,CA)測量細胞介素濃度。使用流式細胞儀(LSRFortessaTM分析儀(BD Biosciences,San Jose,CA)取得數據，且使用BD FCAP陣列軟體第3.0版(BD Biosceinces,San Jose,CA)施行數據分析。在平行培養物中測量增生，此係藉由添加1μCi之3H甲基-經氚化胸苷(Perkin Elmer,Waltham,MA)至各孔中且進一步培養16至18小時。接著收獲培養物在去氧核醣核酸(DNA)納入過濾器(Perkin Elmer,Waltham,MA)上，且經氚化胸苷納入係提供使用MicroBeta2機器(Perkin Elmer,Waltham,MA)以每分鐘計數(cpm)測量之細胞增生指標。
使用JeKol-PD-L1表現細胞系之人類檢測法
使用5：1比之T細胞比JeKo-1-PD-L1細胞系施行此檢測法，因為此比提供捕捉第5天細胞介素分泌的更理想途徑。因此，各孔採2 x 105個T細胞與4 x 104個JeKo-1-PD-L1培養。在第5天，收集上清液且根據製造商的步驟使用CBA(BD Biosciences,San Jose,CA)測量細胞介素濃度。此細胞系表現非常溫和量之共刺激性分子(CD80及CD86)，且因此，在抗體處理後，增進之增生係非常和緩。相反地，細胞介素分泌，包括IL-2係強烈，從而允許在mAb7處理後測量細胞介素分泌而不是T-細胞增生。
使用表現高水平PD-L1樹突細胞之馬來猴檢測法
在第7天收獲經分化DC，並藉由流式細胞儀(使用LSRFortessaTM分析儀，BD Biosceinces,San Jose,CA)驗證高水平PD-L1表現及T-細胞活化所必要之共刺激性信號；標記包括CD80及CD86(抗體，購自BD Bioscience,San Jose,CA)。計數細胞並使用RS2000 X-光機器(Radsource,Brentwood,TN)以3000rad輻射之。從同種異型捐獻者收獲新鮮分離之馬來猴T細胞。在不同濃度mAb7、負及正對照抗體或單獨培養基(用以評價基線反應)存在下，使用10：1之T細胞比DC比將T細胞與經輻射之DC裝盤(最佳檢測法係當2 x 105個T細胞以2 x 104個DC於200μL培養物中培養)。將所有條件裝盤在96孔平底組織培養經處理盤(Fisher Scientific,Pittsburg,PA)。 使用無血清X-vivo15培養基(Lonza,Walkersville,MD)培養細胞，以避免實驗間之血清變化性。培養物在37℃，5% CO2培養5天。在第5天，收集上清液及根據製造商的步驟使用CBA(BD Biosciences,San Jose,CA)測量細胞介素濃度。使用流式細胞儀(LSRFortessaTM分析儀，BD Biosceinces San Jose,CA)取得數據，且使用BD FCAP陣列軟體第3.0版(BD Biosciences,San Jose,CA)施行數據分析。同時在相似培養物中，添加1μCi之3H甲基-經氚化胸苷(Perkin Elmer,Waltham,MA)至各孔中；進一步培養細胞16至18小時以測量增生。將培養物收獲在DNA納入過濾器玻璃印製濾網A(Glass Printed filtermate A，Perkin Elmer,Waltham,MA)上，經氚化胸苷納入係提供使用MicroBeta2機器(Perkin Elmer,Waltham,MA)以cpm測量之細胞增生指標。
藉由超級抗原(金黃色葡萄球菌內毒素B)刺激所誘導之馬來猴血液的細胞介素釋放
收集馬來猴全血；將225μL血液分裝到96孔組織培養經處理盤(Fisher Scientific,Pittsburg,PA)中。於37℃，5% CO2，在濃度從0.1至100μg/mL範圍之mAb7或同型匹配負對照抗體存在下，培養樣品，二重複。添加抗體1小時後，以0.1μg/mL SEB(Toxic Technologies,Sarasota,FL)刺激樣品並將培養物培養3天。在第3天，收獲血漿、匯集之並冷凍在-80℃。根據製造商的步驟， 使用MSD免疫檢測盤(Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD)及具有MSD Discovery Workbench軟體(第4.0.12版)之MSD讀取器(Model 1200)，測量經解凍血清樣品中之IFN-γ、IL-2及TNF-α的濃度，二重複。報告二重複的平均。
結果 mAb7對人類初級T細胞之拮抗劑活性
當初級人類T細胞於MLR中以表現PD L1之同種異型hu-DC活化，mAb7會以劑量依賴性方式增加T細胞增生(藉由測量經氚化胸苷納入)及T-細胞活化(藉由測量促炎性細胞介素分泌)。以mAb7(10μg/mL)處理T細胞導致T細胞增生之增加最高2.5倍高於以負對照抗體(10μg/mL)處理者。當與負對照抗體相比，IFN-γ與TNF-α水平分別增加最高8與5倍。IFN-γ增加較TNF-α增加優異。在這些培養物中沒有偵測到IL-2表現。當初級人類T細胞於MLR中係使用腫瘤細胞系JeKo 1 PD-L1作為同種異型表現抗原細胞活化，與負對照抗體相比，mAb7會誘導劑量依賴性增加之IFN-γ(最高2.5倍)、TNF-α(最高2倍)及IL-2(最高5倍)分泌。此檢測法中mAb7之效應類似二個正對照抗體所得數據。在這些條件下未觀察到增加之T細胞增生。與初級DC媒介之MLR相比，細胞增生係最小，具有CD80與CD86所提供之弱信號。在上述所有檢測法中，IL-10、IL-4、IL-17A及IL-6係最小至沒有偵測 到。
mAb7對馬來猴初級T細胞之拮抗劑活性
於動力學排除檢測法中(KinExA)，mAb7對hu-PD-1及馬來猴PD-1之溶液中結合親和性係非常相似(人類及馬來猴PD-1之KD分別=23及28pM)。mAb7在表現人類PD-1及馬來猴PD-1之細胞上的EC50也非常相似。於使用不同馬來猴分離之T細胞及DC之MLR功能檢測法中，mAb7以劑量依賴性方式誘導T細胞增生及活化(藉由測量經氚化胸苷納入)。此效應也在使用正對照(抗體1及抗體2)中觀察到，但未在使用負對照抗體中觀察到。mAb7也增進細胞介素分泌(亦即，IFN-γ及TNF-α，與負對照抗體相比，最高5倍及3倍。在這些培養物中沒有偵測到IL-2表現。在使用經0.1μg/mL之SEB超級抗原刺激3天之馬來猴全血的不同細胞介素釋放檢測法中，與負對照抗體相比，mAb7(0.1至100μg/mL)會誘導較大之IFN-γ、IL-2及TNF-α分泌。
MLR研究係用於產生類似腫瘤微環境之活體外設定，其中在表現PD-L1之同種異型DC或腫瘤細胞的存在下，T細胞經活化並表達高水平PD-1。PD-1/PD-L1之交互作用會抑制進一步之T細胞增生及細胞介素釋放。於這些MLR中添加抗PD-1抗體類，會恢復T細胞活化且增加增生及細胞介素分泌，由其IFN-γ，此係由於阻斷PD-1/PD-L1軸。
當以表現高水平PD-L1同種異型細胞(DC或JeKo 1 PD-L1細胞系)培養時，mAb7加速人類T細胞增生及IFN-γ、TNF-α及IL-2分泌。相反地，負對照抗體，其證實與單獨培養基相似，並不會增進這些效應。相似地，在馬來猴-MLR系統中，mAb7增進T細胞增生，IFN-γ及TNF-α分泌，及增進使用超級抗原SEB之馬來猴全血釋放細胞介素。
這些結果證實，抗PD-1抗體mAb7係增進T細胞增生及促炎性細胞介素分泌，包括干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及白介素(IL)-2。這些活性係在初級人類及馬來猴T細胞中都觀察到。
實施例10：抗PD-1抗體類於移植物抗宿主疾病中之效應
此實施例說明於活體中抗PD-1抗體類對T細胞活化與擴增的效應，係使用異種-aGvHD模型之經轉入有hu-PBMC之NSG小鼠。
於此研究中，於活體中抗PD-1抗體mAb7對T細胞活化與擴增的效應，係在急性移植物抗宿主疾病(aGvHD)模型中，於使用hu-末梢血液單核細胞(PBMC)之非肥胖糖尿病型(NOD)重症聯合免疫不全型(SCID)之白介素2受體γ裸(IL2rγnull)(NSG)小鼠中研究。
免疫功能低下NSG母小鼠(每群組5隻)8至10週齡(正式名稱NOD,Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)係購自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。所有動物根據實驗 動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee；IACUC)關在輝瑞(South San Francisco,CA)的無病原設施中。
人類核黃層係購自史丹福大學血液中心(Stanford,CA)，以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)稀釋之並層疊在Ficoll上以用於分離PBMC。PBMC以PBS清洗2次。紅血球細胞(RBC)使用如製造商之步驟(Life Technologies；San Diego,CA)所表明之氯化銨鉀(ACK)溶解緩衝液溶解。在RBC溶解後，再清洗細胞一次並以PBS稀釋成每mL有5 x 107個細胞。
為了誘導異種-aGvHD，經由尾靜脈以hu-PBMC靜脈內注射NSG小鼠。各小鼠接受於200μL之PBS中之1 x 107個細胞。在所有實驗中，小鼠每週稱重，共3次並監測出現異種-aGvHD-樣症候群，包括重量減輕、駝背姿勢、皺皮、減少移動性及在某些例中之腹瀉。在減輕20%體重後或在2天中減輕1g/天後將小鼠安樂死；該時點紀錄為存活時間。mAb7、負對照抗體及正對照抗體係如上面實施例9中所述般產生。
NSG小鼠經負對照抗體、正對照抗體或mAb7處理，劑量範圍在每公斤0.1至10毫克(0.1至10mg/kg)之間。使用適當載具，在轉入hu-PBMC後的第2及8天對小鼠投予抗體。抗體投予路徑為腹膜內(ip)投予。
收獲移植有hu-PBMC之小鼠的末梢血液、脾及肝。如下製備各器官的單細胞懸浮液：收集末梢血液，及使用 ACK-溶解緩衝液溶解RBC並以PBS清洗之。使用注射器柱塞的背面將細胞吸通過70μM過濾器而機械地均質脾及肝，並用PBS清洗一次。溶解RBC且細胞再清洗2次及再次將細胞吸通過70μM過濾器。在此階段，脾細胞已就緒。為了分離中肝的白血球，使用30%至80%之泊可(Percoll)梯度(Percoll® Plus,GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh,PA)將單細胞懸浮液分層，並經歷高速離心。從中間層收獲白血球並以PBS清洗二次。所有單細胞懸浮液經計數且將1 x 106個來自各樣品之細胞用於螢光激活細胞分選(FACS)。對於人類細胞介素分泌檢測法，如製造商之步驟(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)，使用小鼠專一性CD45細胞單離套組藉由正選擇耗盡小鼠CD45+細胞，以確保細胞介素分泌係單獨來自人類免疫細胞。接著，細胞經計數且將1 x 106個來自各樣品之細胞用於該檢測法。
自異種-aGvHD小鼠獲得末梢血液、脾及肝之單細胞懸浮液。於4℃，避光下，將每個樣品總共1 x 106細胞以於FACS緩衝液中之適當經螢光標籤單克隆抗體混合物培養30分鐘，該FACS緩衝液包括含有2%胎牛血清(FBS)之1 x PBS，接著以FACS緩衝液清洗細胞。對於細胞內染色Kiel 67蛋白(Ki67，用於測量增生細胞)，在表面染色後根據製造上的步驟(Affymetrix/eBioscience,San Diego,CA)使用細胞內固定及滲透緩衝液組(Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set)固定細胞。在4℃ 黑暗中施行細胞內染色30分鐘。染色後，清洗樣品並使其經歷使用BD LSR FortessaTM細胞分析儀(BD Biosciences,San Jose,CA)之多色流式細胞儀。使用FlowJo軟體(FLOWJO LLC,Ashland,OR)進行數據分析。辨認細胞表面分子之不同組合所用之抗體係：抗hu-CD45太平洋藍(Pacific Blue；PB)或Amcyan、抗小鼠CD45-亮紫(Brilliant Violet；BV)-711、抗hu-CD3-PerCPCy5.5、抗hu-CD8藻紅素-Cy7(PE-Cy7)或BV-786、抗hu-CD4-螢光素異硫氰酸酯(FITC)或BV-650、抗hu-PD-1(克隆EH12.1)BV-786或PE、抗hu-PD-1(克隆MIH-4)PE或FITC、抗hu-Ki67異藻藍素(APC)(所有抗體來自BD Biosciences,San Jose,CA)、抗hu-PD-L1(PE-Affymatrix-eBioscience,San Diego,CA)及活/死染色用藍色螢光反應性染料(Life Technologies,Grand Island,NY)。
自異種-aGvHD小鼠(在小鼠CD45耗盡後)收獲脾及肝之富含人類CD45族群的單細胞懸浮液。於平底組織培養經處理96孔盤中(Fisher Scientific；Pittsburg,PA)將每個樣品總共1 x 106個細胞培養於200μL X-vivo 15培養基中。接著讓細胞未經刺激或以作為低刺激條件10ng/mL乙酸肉荳蔻酯(PMA)及125ng/mL離子黴素(ionomycin；iono)或作為高刺激條件50ng/mL之PMA及1μg/mL離子黴素(皆購自Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)刺激。培養物在37℃於5% CO2中培養8小時以確保最大細胞介素分泌。收集上清液並根據製造商的步驟(BD Biosciences, San Jose,CA)使用人類細胞介素專一性細胞儀磁珠陣列法(CBA)測量人類細胞介素濃度。使用流式細胞儀(LSRFortessaTM分析儀(BD Biosciences,San Jose,CA)取得數據，且使用FCAP陣列TM軟體第3.0版(BD Biosceinces, San Jose,CA)施行數據分析。Hu-IFN-γ、hu-TNF-α及hu-IL-2珠陣列套組係購自BD Biosciences(San Jose,CA)，且已確認它們不會與小鼠細胞介素交叉作用。
所有分析涉及使用獨立樣品t-測試或使用Graphpad Prism之2-因子ANOVA(Graphpad Software,San Diego,CA)之比較手段。將p0.05之值視為統計上顯著。植入數據以包括平均值標準差(sem)之平均濃度描繪。
以抗PD-1抗體mAb7處理NSG免疫低下小鼠會加速體重減輕(表17)並誘導常見於此模型中的其他疾病徵兆，諸如駝背姿勢、皺皮、降低移動性及在某些例中之腹瀉。於此模型中，體重減輕預期會在轉入後的第20天與第30天之間加速(見例如Schroeder and DiPersio,2011)。因為以mAb7及正對照1與2處理會加速異種-aGvHD症候群，小鼠必須在較早時點安樂死，而無法獲得存活取線；因此體重減輕為主要結果測量。在第一實驗中，小鼠以0.1、1及10mg/kg之mAb7或10mg/kg負對照抗體處理。於表17中，體重減輕係藉由以在第23天經處理群組相對於第0天之體重差異標準化而計算。值表明每群組5隻小鼠隻平均±sem。
在hu-PBMC轉入後的第2天及第8天，小鼠以所表明抗體處理。雖在23天於控制群組中體重減輕變得明顯，從在hu-PBMC轉入後的第10至11天，在所有抗PD-1抗體mAb7處理群組中之個別小鼠偵測到體重減輕及疾病惡化。當與經負對照處理群組相比，於經1mg/kg及10mg/kg處理群組中，在第14至23天之間，體重減輕到達顯著(p0.0001)。在23天，於1mg/kg及10mg/kg處理群組中偵測到15%體重減輕且於0.1mg/kg處理群組中偵測到7.9%體重減輕(表17)。
末梢血液、肝及脾之FACS分析證實，與對照群組相比，於經mAb7處理群組中在hu-CD45陽性細胞及hu-CD3陽性細胞T細胞之百分比有增加。脾之代表性數據也顯示，與經負對照抗體處理群組相比，於經mAb7處理群組中在hu-CD8陽性細胞T細胞計數有增加，及在hu-CD4陽性細胞T細胞計數有增加(但增加到較少程度)。亦於肝與血液之hu-T細胞計數中注意到相似增加。為了評估是否T細胞之增加係由於透過mAb7結合人類T細胞而阻斷PD-1，將細胞以會與mAb7競爭結合之市售PD-1抗體(克隆EH12.1)染色。所有器官的經mAb7處理淋巴細胞(藉由FACS分析)顯示沒有與EH12.1結合。為了 確認經mAb7處理之T細胞仍表現PD-1，將T細胞經不同抗hu-PD-1克隆(克隆MIH4)染色，克隆MIH4係部分競爭mAb7結合T細胞。結果顯示經mAb7處理之T細胞部分結合有MIH4；因此指示PD-1係表現在經處理T細胞尚且顯然PD-1被mAb7阻斷(數據未顯示，保留輝瑞內部紀錄中)。對於在脾中、在T細胞(hu-CD3陽性)上或在非hu-T細胞(hu-CD3陰性)上之hu-PD-L1表現，沒有觀察到可偵測改變。於脾中間組中，與經負對照處理群組相比，為淋巴細胞增生標記之Ki67係在經PF-0681591處理群組之hu-CD3陽性細胞中升高)。相似結果亦見於血液與肝中。
為了檢驗於異種-aGvHD期間mAb7對細胞介素釋放的效應，從小鼠CD45陽性細胞中進一步分離出之hu-CD45陽性細胞(來自肝與脾)。這些淋巴細胞接著在37℃經PMA及離子黴素之混合物(在2個濃度：低相較於高)處理或未經處理8小時。藉由CBA測量上清液中細胞介素分泌(表18)。沒有刺激下，未獲得可偵測細胞介素(表18)。與對照群組相比，在mAb7處理後，自小鼠脾及肝部件分離之人類淋巴細胞中的hu-IFN-γ、hu-IL-2及hu-TNF-α升高。在弱活體外刺激條件下，經mAb7處理T細胞會增加hu-IFN-γ分泌至顯著高於自負對照群組分離之T細胞所具者之水平(p0.05)。在強活體外刺激條件下，所有細胞介素係在所有群組中被誘導，但與自負對照分離之T細胞相比，在經mAb7處理T細胞會進一步增加。表18 顯示自個群組中5隻不同小鼠收集之數據。表18中，於比較mAb7相對於負對照群組之非成對t-測試中，*p<0.05，**p<0.01；aGvHD=急性移植物抗宿主疾病；Hu=人類；IFN-γ=干擾素-γ；IL-2=白介素-2；Ino=離子黴素；N=數目；ns=不顯著；P=P值；PMA=乙酸肉荳蔻酯；TNFα=腫瘤壞死因子α；異種=異種性。
這些結果證實，在NSG小中，以抗PD-1抗體mAb7處理異種-aGvHD會加速異種-aGvHD發展，如藉由體重減輕、T細胞增生及增加之細胞介素分泌，包括干擾素- γ(IFN-γ)及白介素-2(IL-2)所測量者。
實施例11：特徵化抗PD-1抗體類
此實施例說明抗PD-1抗體mAb7對表現表面受體PD-1之細胞的結合親和性、專一性及配體阻斷活性。
mAb7、負對照抗體及正對照抗體係如實施例9中所述般產生。經藻紅素(PE)或亮紫(BV)-786一次標籤之抗hu-PD-1抗體克隆EH12.1及經相同染料標籤同型對照抗體係購自BD Biosciences(San Jose,CA)。經PE標籤抗小鼠PD-1克隆J43及抗倉鼠IgG同型對照抗體係購自Affymetrix/eBiosciense(San Diego,CA)。生物素化hu-PD-L1及生物素化hu-PD-L2(CD273)係得自ACRO Biosystems(Newark,DE)。馬來猴PD-L1及PD-L2係購自Creative BioMart®重組蛋白(Shirley,NY)，且皆依照製造商之步驟所指導使用Alexa Fluor® 647標籤套組(LifeTechnologies,San Diego,CA)以Alexa Fluor® 647染料在公司標籤之。測試馬來猴PD-L1及PD-L2對表達馬來猴PD-1細胞系之結合。大鼠-PD-L1-Fc-標誌及小鼠-PD-L1-Fc-標誌(人類IgG1Fc區在C-端)係購自Creative BioMart®重組蛋白(Shirley,NY)。偵測生物素化PD-L1及PD-L2係使用鏈霉抗生物素蛋白PE或異藻藍素(APC)(Affymetrix/eBiosciense,San Diego,CA)達成。偵測大鼠-PD-L1或小鼠-PD-L1係使用經APC標籤Fc伽馬(Fcγ)片段專一性驢-抗人類affiniPure F(ab')2 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc,West Grove,PA)達成。
用於順時轉染之載體
Hu-PD-1表現質體(於pCMV6-Entry載體中)係購自OriGene Technologies,Inc(Rockville,MD)，目錄號RC210364/登錄號NM_005018。
小鼠-PD-1表現載體(m6 pCMV6-Entry載體中)係購自OriGene Technologies,Inc(Rockville,MD)，目錄號MR227347/登錄號NM_008798。馬來猴-PD-1經Life Technologies(San Diego,CA)密碼子最佳化且由合成，批次號1482149/登錄號EF443145。其符合讀框地克隆至具有小鼠κ分泌性信號序列之輝瑞專利(San Francisco,CA)巨細胞病毒(CMV)基底表現質體中，該信號序列係添加C-端FLAG標誌至C-端。
大鼠-PD-1去氧核醣核酸(DNA)根據來自登錄號NM_001106927之序列客製合成並克隆至來自LifeTechnologies(San Diego,CA)之表現載體pEF1V5-His之BamHI-NotI位點中，批次號1598305。
用於安定轉染之PD-1表現載體
Hu-PD-1 DNA根據來自登錄號NM_005018之序列客製合成並克隆至InVitroGen表現載體pEF1V5-His B之BamHI-NotI位點中，批次號513478。
馬來猴-PD-1 DNA根據來自登錄號EF443145之序列 客製合成並克隆至InVitroGen表現載體pEF1V5-His B之BamHI-NotI位點中，批次號1482149。
小鼠-PD-1 DNA根據來自登錄號NM_008798之序列客製合成並克隆至InVitroGen表現載體pEF1V5-His B之BamHI-NotI位點中，批次號1513476。
所有載體經Life Technologies(San Diego,CA)合成並克隆至InVitroGen表線載體pEF1V5-His B中。所有載體含有完整PD-1序列包括胞外結構域、膜結構域及細胞內結構域。所有載體編碼有V5-6His表位標誌於PD-1之C-端。於各載體內包括抵抗新黴素基因，以供使用G418硫酸鹽抗生素選擇。
使用HEK-293T細胞系之瞬時轉染
HEK-293T細胞係購自美國菌種保存中心(ATCC®,Manassas,VA)，且保持細胞於補充有10%胎牛血清(FBS)與1 x盤尼西林/鏈黴素(Pen/Strep)之經達爾伯克氏修飾之伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium；DMEM)中(Corning CellGro,Manassas,VA)，且在37℃，6%二氧化碳(CO2)中生長。轉染前一天，細胞經胰蛋白處理並以每T75燒瓶(Fisher Scientific,Pittsburg,PA)有4 x 106個細胞裝盤。轉染當天，以預先溫熱之無抗生素生長培養基置換舊的培養基，且細胞進一步在37℃，6% CO2中培養2小時。添加表現載體或空載體(10μg)至1.5mL OptiMEM培養基中(Life Technologies,San Diego, CA)。接著添加脂質體(Lipofectamine)2000試劑(20μl)(Life Technologies,San Diego,CA)至另一個1.5ml OptiMEM中。接著將質體OptiMEM及脂質體OptiMEM管混合在一起並載室溫培養25分鐘。接著以滴加方式將OptiMEM混合物添加至適當培養燒瓶中，且讓燒瓶在37℃，6% CO2中放置過夜。隔天，從燒瓶移除培養基並置換成完全生長培養基。轉染後四十八(48)小時，使用StemPro-Accutase(Life Technologies,San Diego,CA)收獲細胞，從而允許輕輕地從培養表面移除細胞而不影響PD-1表面表現。接著使細胞經歷抗體結合及螢光激活細胞分選(FACS)分析。
使用Jurkat細胞系之安定轉染
使用Jurkat細胞系(克隆E6-1-TIB-152TM,ATCC®,Manassas,VA)安定表達hu-及馬來猴-PD-1。係使用電穿孔經由Amaxa necluotransfector系統(Lonza,Walkersville,MD)產生細胞系。依照製造商之步驟所指導(Lonza,Walkersville,MD)使用套組V在輝瑞(San Francisco,CA)施行轉染。於37℃，5% CO2，以0.3至1.0×106個細胞/ml之間之密度將細胞維持在補充有10%胎牛血清(FBS)與1 x L-麩醯胺酸(LifeTechnologies,San Diego,CA)之羅斯維爾公園紀念學院(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640培養基中。對於各載體，使用2μg/mL轉染2×106個細胞。轉染後，在G418硫酸鹽(600μg/mL)存在 下生長細胞2週以供選擇及維持經安定轉染細胞。為了防止長時間汙染，添加1 x Pen/Strep至培養基中。藉由以稀釋率1：200培養細胞(1個細胞於200μL補充有硫酸鹽抗生素完全培養基)來選擇單細胞克隆。為了選擇表現高水平hu-PD-1或馬來猴-PD-1之克隆，於流式細胞儀檢測法中使用經PE標籤之抗hu-PD-1克隆EH12.1。使用BD LSRFortessaTM細胞分析儀(BD Biosciences,San Jose,CA)收集樣品。使用Flowjo軟體(FLOWJO LLC,Ashland,OR)數據分析及計算平均螢光強度(MFI)。選擇具有高MFI之細胞系用於檢測法開發。
在轉染後48小時收獲經hu-PD-1載體、馬來猴-PD-1載體、小鼠-PD-1載體或大鼠-PD-1載體或空載體轉染之HEK-293T細胞。在與mAb7結合之前，以市售抗生素或配體測試來自各特定轉染之細胞，以確保適當PD-1受體高度表現在細胞表面上。對於人類及馬來猴，使用交叉反應性市售抗PD-1抗體(克隆EH12.1)。對於小鼠，使用市售抗小鼠-PD-1抗體(克隆J43)。對於大鼠，使用市售大鼠-PD-L1配體(因為沒有可得市售大鼠交叉反應性抗PD-1抗體)。在確認有適當PD-1表現後，細胞經計數且將2 x 105個細胞以hu-Fc受體結合抑制劑功能級混合物(以1μg/1 x 106個細胞阻斷Fc-γ受體，Affymetrix/eBiosciense,San Diego,CA)培養20分鐘，且添加用於活/死染色之藍色螢光反應性染料(Life Technologies,San Diego,CA)至該混合物中。添加序列稀釋之mAb7或負對 照(1至0.00001μg/mL)抗體至細胞混合物中且接著允許冰上培養1小時。接著清洗細胞及添加經APC標籤-驢-抗人類-affiniPure F(ab')2片段IgG,Fcγ專一性(1：100稀釋率)(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc,West Grove,PA)至該混合物中，接著細胞於冰上培養另30分鐘。在BD LSRFortessaTM細胞分析儀(BD Biosciences,San Jose,CA)上取得數據並使用Flowjo軟體(FLOWJO LLC,Ashland,OR)分析數據。
產生經hu-PD-1受體、馬來猴-PD-1受體或小鼠-PD-1受體之任一者轉染之安定Jurka細胞克隆。為這些檢測法所選之PD-1細胞克隆來自表達相似PD-1受體量(~400,000個受體/細胞；受體係在先前產生細胞系期間定量過)之各物種。在確認有適當PD-1表現後，細胞經計數且將2 x 105個細胞以hu-Fc受體結合抑制劑功能級混合物(以1μg/1 x 106個細胞阻斷Fc-γ受體，Affymetrix/eBiosciense,San Diego,CA)培養20分鐘，且添加用於活/死染色之藍色螢光反應性染料(Life Technologies,San Diego,CA)至該混合物中。添加序列稀釋(1：3)之mAb7、正對照1、正對照2或負對照抗體(使用IgG4架構)至細胞混合物中且接著允許冰上培養1小時。接著清洗細胞及添加經APC標籤-驢-抗人類-affiniPure F(ab')2片段IgG,Fcγ專一性(1：100稀釋率)(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc,West Grove,PA)至該混合物中，接著細胞於冰上培養另30分鐘。在BD LSRFortessaTM細胞分析 儀(BD Biosciences,San Jose,CA)上取得數據。使用Flowjo軟體(FLOWJO LLC,Ashland,OR)進行分析且計算幾何平均。使用Graph Pad Prism(對數促效劑性相對於回應[結合])計算EC50值。
產生經活化之表現高水平PD-1受體之T細胞。在確認T細胞有適當PD-1表現後，使用市售試劑(對於人類及馬來猴，使用抗hu-PD-1克隆EH12.1，對於小鼠-PD-1，使用抗小鼠-PD-1克隆J43，而對於大鼠-PD-1，使用大鼠-PD-L1)。細胞經計數且將1 x 106個細胞以hu-Fc受體結合抑制劑功能級混合物(以1μg/1 x 106個細胞阻斷Fc-γ受體，Affymetrix/eBiosciense,San Diego,CA)培養20分鐘，且添加用於活/死染色之藍色螢光反應性染料(Life Technologies,San Diego,CA)至該混合物中。添加序列稀釋之mAb7(1：3)至細胞混合物中且接著允許冰上培養1小時。接著，在添加經APC標籤-驢-抗人類-affiniPure F(ab')2片段IgG,Fcγ專一性二次抗體(1：100稀釋率)(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc,West Grove,PA)之前清洗細胞，及允許細胞於冰上培養另30分鐘。在BD LSRFortessaTM細胞分析儀(BD Biosciences,San Jose,CA)上取得數據。使用Flowjo軟體(FLOWJO LLC,Ashland,OR)進行分析。計數幾何平均且使用Graph Pad Prism(對數促效劑性相對於回應[結合])計算EC50值。
為檢測法選擇安定之表現高水平hu-PD-1的Jurkat細胞克隆。二十(20)μg/mL之生物素化-hu-PD-L1或生物素 化-hu-PD-L2會飽和在此細胞系上之所有PD-1受體(在預知結合滴定檢測法後)。因此，此濃度於我們的檢測法中經選擇作為最佳濃度。表現Hu-PD-1之Jurkat細胞(2 x 105個)以hu-Fc受體結合抑制劑功能級(以1μg/1 x 106個細胞阻斷Fc-γ受體，Affymetrix/eBiosciense,San Diego,CA)培養20分鐘，且也添加用於活/死染色之藍色螢光反應性染料(Life Technologies,San Diego,CA)至該混合物中。以20μg/mL添加生物素化-hu-PD-L1或生物素化-hu-PD-L2至細胞，隨後立刻添加序列稀釋之mAb7、正對照1、正對照2或負對照抗體(都於IgG4架構中且於1：3序列稀釋)。允許冰上培養細胞1小時。接著清洗細胞及添加PE鏈霉抗生物素蛋白(1：100稀釋率)(Affymetrix/eBiosciense,San Diego,CA)，且允許細胞於冰上培養另30分鐘。在BD LSRFortessaTM細胞分析儀(BD Biosciences,San Jose,CA)上取得數據，且使用Flowjo軟體(FLOWJO LLC,Ashland,OR)進行分析且計算幾何平均。使用Graph Pad Prism(對數抑制劑相對於回應[結合])計算EC50值。
Jurkat細胞係經安定轉染高水平hu-PD-1受體或馬來猴-PD-1受體。為此檢測法選擇表現馬來猴-PD-1受體(~400,000個受體/細胞)之細胞。使用這些細胞測試馬來猴-PD-L1及PD-L2之結合且結果顯示20μg/mL之馬來猴-PD-L1或PD-L2足夠飽和所有PD-1受體，此係基於不同濃度(50ng/mL至50μg/mL)的這些配體當結合此細胞系 時所測試之幾何平均。表現馬來猴-PD-1之Jurkat細胞(2 x 105個)以hu-Fc受體結合抑制劑功能級(以1μg/1 x 106個細胞阻斷Fc-γ受體，Affymetrix/eBiosciense,San Diego,CA)培養20分鐘，且添加用於活/死染色之藍色螢光反應性染料(Life Technologies,San Diego,CA)至該混合物中。添加20μg/mL之Alexa-Fluor®-647-馬來猴PD-L1或Alexa--Fluor®-647-馬來猴PD-L2至細胞，隨後立即添加不同濃度mAb7、正對照1、正對照2或負對照抗體(使用IgG4架構，於1：3序列稀釋)。接著允許冰上培養細胞1小時。清洗後，細胞在BD LSRFortessaTM細胞分析儀(BD Biosciences,San Jose,CA)上取得數據。使用Flowjo軟體(FLOWJO LLC,Ashland,OR)進行分析且計算幾何平均。使用Graph Pad Prism(對數抑制劑相對於回應[結合])計算EC50值。
人類核黃層係購自史丹福大學血液中心(Stanford,CA)，以PBS稀釋之並層疊在Ficoll上以用於分離PBMC。PBMC以PBS清洗4次。RBC使用如製造商之步驟(Life Technologies；San Diego,CA)所表明之ACK溶解緩衝液溶解。在RBC溶解後，再清洗細胞一次並以PBS稀釋成每mL有5 x 107個細胞。一半的PBMC經計數並冷凍於冷凍培養基(90%FBS與10%二甲基亞碸[DMSO])中而剩餘細胞經歷T-細胞純化。
使用hu-專一性PAN T細胞分離套組，如製造商的步驟所述般(Miltenyi Biotec；130-096-353)以負選擇自剩餘 PBMC分離T淋巴細胞。
對於ADCC檢測法，新鮮分離之T細胞(目標細胞)經計數，且以每mL有1 x 106個T細胞培養於無血清X-vivo 15培養基(Lonza,Walkersville,MD)中並使用經抗CD3及抗CD28(用於細胞擴增及活化之Dynabeads®人類T-活化劑CD3/CD28(Life Technologies,San Diego,CA)塗覆之珠及100U/mL之重組人類(rh)-IL-2(R&D Systems,Minneapolis,MN)刺激。培養物在37℃，5% CO2培養72小時。當T細胞活化到達48小時時點，解凍PBMC(衍生自相同捐獻者之效應子細胞)、計數之且接著於具有10% FBS之完全RPMI-1640培養基中以rh-IL-2(50U/mL用於5 x 106細胞/mL培養物)刺激總共18至24小時。在檢測當天，二種細胞種類都經計數且藉由流式細胞儀測試以確保有適當活化。對於T細胞，檢驗PD-1之高表現，而對於PBMC，檢驗媒介ADCC之受體CD16、CD32及CD64(分別為Fc-伽馬受體-[FcγR]III[a及b]、FcγRIIa、FcγRI)的表現水平。接著以5：1效應子對目標比(因為此為最佳比)將細胞裝盤在平底96孔組織培養經處理盤(Fisher Scientific,Pittsburg,PA)中，隨後添加抗體：mAb7(IgG4及IgG1架構)及正對照抗體。所有抗體測試於濃度0.01至100μg/mL(以1：10序列稀釋)。添加檢測對照，包括評價最大溶解之單獨目標細胞、單獨效應子細胞及於5：1比之效應子對目標但沒有添加抗體。檢測盤在37℃，5% CO2中培養4小時。如製造上之步驟所指導地 使用CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢測法(Promega US,Madison,WI)分析數據。該檢測法定量地測量乳酸去氫酶(LDH)，一種細胞溶解時釋出之安定細胞內酵素。細胞毒性百分比(%)經測量為=100 x(實驗LDH釋放[OD490]/最大LDH釋放[OD490])。當單獨目標細胞(T細胞)時細胞經化學溶解以獲得最大殺害時，計算最大LDH釋放。
使用流式細胞儀(FACS)細胞基底結合檢測法來評價mAb7結合hu-PD-1、馬來猴-PD-1、小鼠-PD-1及大鼠-PD-1的能力，該檢測法包括有經瞬時轉染之HEK-293T細胞系、初級人類經活化T細胞及經安定轉染hu-PD-1或馬來猴-PD-1及小鼠-PD-1之Jurkat細胞。mAb7以高親和性結合hu-PD-1及馬來猴-PD-1並對這2個物種(這些同型的胺基酸序列是所分析之物種中最相似者)顯示相似EC50值。數據係總結於表19、20及21中。結合小鼠-PD-1僅在生物學上不相關之高濃度mAb7達成且可能是由於親和性成熟程序所致。對於大鼠-PD-1，當使用經轉染細胞或經活化T細胞時，沒有偵測到mAb7結合(表19)。
於表21中，各數目表示於單一個實驗中mAb7結合之EC50值。*表明平均±sem。mAb(IgG4)=具有IgG4骨架之單克隆抗體；PD-1=計畫性死亡-1；sem=平均值之標準差。
使用不同細胞基底檢測系統來檢驗mAb7結合hu-PD-1及馬來猴-PD-1。在所有系統中，發現在二個物種中結合都具有高親和性與專一性。使用表現hu-PD-1或馬來猴-PD-1之經瞬時轉染HEK-293T細胞系，mAb7顯示與如MFI所表明者相似之結合模式。在經空載體(載具)轉染之親代細胞系中觀察到最小至沒有結合。
在活化後72小時，當PD-1表現在細胞表面上且細胞生命力為最佳時，決定mAb7結合經活化hu-初級T細胞及馬來猴-初級T細胞之EC50值(表19)。計算各物種的2 個不同捐獻者的EC50值(表20)。於hu-經活化T細胞及馬來猴-經活化T細胞中，都獲得低EC50值且發現在這2個物種之間EC50值接近，分別為51.04±5.07pM及85.34±11.73pM(平均±平均值之標準差[sem])。沒有結合觀察到有負對照抗體高於基線值。
最小地表現hu-PD-1受體之Jurkat T細胞系係用於產生經安定轉染hu-PD-1、馬來猴-PD-1及小鼠-PD-1細胞系。細胞系經次克隆且選擇表現高水平hu-PD-1及馬來猴-PD-1受體之克隆(每個細胞~400,000個PD-1受體為所獲得的最高表現)。於此系統中，mAb7顯示對hu-PD-1及馬來猴-PD-1受體之高親和性。這兩個物種之EC50值係相似於初級經活化T細胞之數據(表21)；對於hu-PD-1，EC50=64.725±1.89，而對於馬來猴-PD-1，EC50=222.55±41.3。在2個實驗運行之間，表現馬來猴-PD-1細胞之EC50值較人類EC50值有變化。這兩個物種之數據係相似於使用任何給定重複之正對照抗體所獲得者(表21)。在實驗重複之任一者中，負對照抗體不展現高於基線值之結合。在經PD-1轉染之Jurkat細胞系(表現hu-PD-1或馬來猴-PD-1)中，檢驗mAb7阻斷PD-L1及PD-L2配體與PD-1受體交互作用之能力。於此檢測法中，細胞係以飽和濃度之經標籤配體培養，隨後以不同濃度之未經標籤mAb7培養。如表22所顯示，mAb7以劑量依賴方式抑制PD-L1及PD-L2配體與PD-1受體交互作用。PD-1之正對照抗體顯示可相比擬之抑制。mAb7之IC50在hu-PD-1 及馬來猴-PD-1之間係可相比擬(對於hu-PD-L1及hu-PD-L2分別為1880.15±289.85及1058±355.4；及對於馬來猴-PD-L1及馬來猴-PD-L2分別為942.9±110.1及839±89.5)。IC50值的總結係提供於表22中。於表22中，各數目表示於單一個實驗中mAb7之IC50值；*表明平均±sem；‡表明括號中重複數目；mAb IgG4=具有IgG4骨架之單克隆抗體；PD-1=計畫性死亡-1；PD-L1=計畫性死亡-配體1；PD-L2=計畫性死亡-配體2；sem=平均值之標準差。
mAb7顯示弱結合補體成分1，q次成分(C1q)及CD64。C1q及CD64(用於IgG4架構)分別被視為補體依賴細胞毒性(CDC)及ADCC之潛在代用品。為了進一步於活體外調查mAb7缺乏誘導T細胞殺害之能力，係以表現高水平PD-1受體之經活化T細胞(目標細胞)及表現高水平Fcγ受體之PBMC(效應子細胞)施行ADCC檢測法。細胞係 選自2個健康捐獻者。在二個捐獻者中，mAb7(於其之原始IgG4架構中)都顯示最小ADCC活性。缺乏ADCC活性係與於IgG4架構之抗PD-1正對照抗體所展現之活性一致，且這二個都相似於負對照IgG4抗體。當抗PD-1(mAb7或正對照抗PD-1抗體)係於人類IgG1架構中評估，該架構已知會誘導較強的ADCC，則抗PD-1係誘導ADCC最高4-倍高於當抗體係於IgG4架構中者。當單獨目標細胞(T細胞)時細胞經化學溶解以獲得最大殺害(根據檢測法計算各捐獻者之殺害係預估為100%溶解)時，計算最大LDH釋放。使用IgG1架構之T細胞溶解係對應經活化T細胞上之PD-1水平(捐獻者1之PD-1表現及溶解係高於捐獻者2所具者)，確認了該檢測法的正確性。
這些結果證實抗PD-1抗體mAb7以高親和性結合細胞上所表現之hu-PD-1受體及馬來猴-PD-1受體，具有EC50值在範圍46至270pM之間，此係取決於測試系統。mAb7不會以生理濃度結合表現小鼠-PD-1之細胞或表現大鼠-PD-1之細胞。mAb7阻斷PD-L1及PD-L2配體與細胞表面PD-1受體交互作用；IC50值範圍從500至1000pM顯示其之高拮抗劑功能，係阻斷經由配體結合所誘導之PD-1功能。mAb7，於其IgG4架構，會觸發最小至沒有抗體所誘導之細胞毒性，其與IgG4抗體性質一致。
實施例12：使用無標籤生物感測器及ELISA特徵化抗 PD-1抗體mAb7與PD-1、FcRn、FcγRs及C1Q之結合。
此實施例說明使用SPR生物感測器，mAb7對於自先關於毒性研究之各式物種純化而來之PD-1的活體外結合親和性。也藉由SPR測試mAb7之Fc區接合FCGR及FcRn之能力，以確認其展現與同型匹配之對照所具者一致之性質。藉由ELISA，檢測mAb7與同型匹配之對照與人類C1q之結合。也藉由使用無標籤生物感測器，來測試mAb7阻斷PD-1與其配體PD-L1及PD-L2之結合交互作用的能力，以支持其之作動機制。
除非另行指明，所有動力學及親和性實驗係在25℃之離酸鹽緩衝鹽水(PBS)+0.01% Tween 20運行緩衝液中進行。在配備有NLC(經中性軟白素塗覆(neutravidin-coated))晶片之SPR ProteOn XPR36生物感測器(BioRad,Hercules,CA)上施行動力學研究。ProteOn也經由以mAb7滴定作為參考標準，而用於決定hu-PD-1及馬來猴-PD-1分析物之活性濃度品。本文中所用之蛋白分析物之濃度係指「活性」或「標稱」值。人類Fc伽馬受體(hu-FCGR)I、人類新生兒Fc受體(hu-FcRn)(批次號R3091)及馬來猴-新生兒Fc受體(馬來猴-FcRn)(批次號JCR)之活性濃度係使用免校正濃度分析(CFCA)實驗在配備有CM5感應器晶片之Biacore T200(GE Life Sciences,Marlborough,MA)上決定。所有其他分析物係以它們標稱濃度使用，如藉由以適當消光係數在A280nm吸光度所決定者。使用配備有自動取樣機之KinExA設備3000或 3200(Sapidyne)，在室溫(約23℃)決定溶液親和性。根據製造商之步驟以DyLight 650(Pierce Biotechnology,Grand Island,NY.)標籤二次偵測抗體。在等莫耳濃度比之鏈結子：IgG下，根據製造商之指導使用EZ-LinkTM N-羥基硫代琥珀醯亞胺-LC-LC-生物素(Pierce Biotechnology Grand Island,NY)施行免疫球蛋白G(IgG)之生物素化。除非另行指明，使用包含Pierce IgG洗脫緩衝液(pH 2.8)/4M氯化鈉(NaCl)之2：1 v/v混合物之「皮爾斯/鹽」雞尾酒再生不動IgG。
使用KinExA方法於PBS+0.01% Tween 20之運行緩衝液及PBS+0.01% Tween 20+1g/l胎牛血清白蛋白(BSA)樣品緩衝液中，決定hu-PD-1及馬來猴-PD-1(二者都是經His標誌之單體)與mAb7之溶液中結合交互作用。採用兩種不同檢測格式。於第一檢測格式，將mAb7滴定到固定濃度之hu-PD-1(標稱200、400或4000pM)且允許樣品達到平衡。游離hu-PD-1被捕將捉到經抗hu-PD-1單克隆抗體mAb7(於非優良實驗室操作規範(GLP)條件下於公司內製備[批次號R5432])塗覆(藉由吸附)之聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠上。接著以0.5μg/mL經Dylight標籤之抗His mAb(R&D Systems,Minneapolis,MN)偵測珠所捕捉之hu-PD-1。於第二檢測格式中，將hu-PD-1或馬來猴-PD-1滴定到固定濃度之mAb7(20、50、100或500pM)，且允許這些混合物達到平衡。游離mAb7被捕將捉到已吸附有專一性結合游離mAb7但不結合經PD-1-飽和之 mAb7的阻斷劑抗遺傳型小鼠抗mAb7 mAb 1699.1 H6之PMMA珠上。接著以0.5μg/mL經Dylight標籤之山羊抗hu-IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Inc,West Grove,PA)偵測珠所捕捉之mAb7。所有滴定經製備為12-成員2-倍稀釋系列變化頂部標稱結合位點濃度為落在1nM至10nM之範圍內，取決於實驗。允許樣品最高48小時達成平衡且根據實驗調整注射體積，以給出落在0.7V至1.9V範圍內之總信號。所有樣品以二重複循環注射。使用分析軟體中之N-曲線工具全局地分析來自每個交互作用有最高4個獨立實驗之數據且擬合至簡單生物分子模型，其中mAb7的濃度係用於作為參考濃度。全局分析報告KD及PD-1之表觀活性結合位點濃度的最佳擬合值(及95%信賴區間)。
當使用KinExA檢測法研究時，溶液中hu-PD-及馬來猴-PD-1針對mAb7之結合親和性彼此不可區分；在23℃決定之表觀平衡常數(KD)值對於hu-PD-1為17pM或23pM(當於相反檢測方向性研究)及對於馬來猴-PD-1為28pM；這三個值於統計學上係彼此不可區分。這些值藉由表面電漿共振於(SPR)生物檢測器測量扼要重述，SPR產出下列KD值：在25℃對於hu-PD-1為42pM及對於馬來猴-PD-1為69pM，及在37℃對於hu-PD-1為109pM及對於馬來猴-PD-1為115pM。當於0.5μM以SPR動力學分析測試時，mAb7以KD值0.9μM結合小鼠-PD-1且沒有偵測到對大鼠-PD-1之結合。無標籤生物感測器係用 於證明mAb7阻斷hu-PD-1結合其天然配體，人類計畫性死亡-配體1(hu-PD-L1)及人類計畫性死亡-配體2(hu-PD-L2)。SPR進一步用於確認mAb7以與同型匹配之對照相同之動力學及專一性結合一範圍來自人類及馬來猴物種二者之可結晶片段(Fc)伽馬受體(FCGR)及新生兒Fc受體(FcRn)。藉由ELISA，mAb7顯示與補體成分1，q次成分(C1q)之可忽略結合，與同型匹配之對照之行為一致。整體來說，mAb7以高結合親和性及專一性結合hu-PD-1及馬來猴-PD-1二者，但具有對小鼠-PD-1之低親和性及對大鼠-PD-1之可忽略結合。
表23總結mAb7與來自各式物種之PD-1之交互作用分析所獲得之動力學及親和性數據。mAb7以統計上不可區分之表觀親和性結合hu-PD-1及馬來猴-PD-1，當使用KinExA方法在23℃測量這些交互作用於溶液中；明顯KD值對於hu-PD-1為17pM及23pM(當於兩個相反檢測方向性中研究)及對於馬來猴-PD-1為28pM。KinExA值藉由以SPR施行之動力學測量而印證，SPR給出在25℃之表觀KD值對於hu-PD-1為42±11pM(n=10)及對於馬來猴-PD-1為69±24pM(n=10)。在37℃ SPR測量顯示2倍較弱於在25℃所具者之親和性；在37℃決定之KD值對於hu-PD-1為109±8pM(n=15)及對於馬來猴-PD-1為115±15pM(n=8)。當以SPR在25℃測量時，mAb7以表觀KD為0.9±0.1μM(n=5)結合小鼠PD-1，對應於20,000-倍較弱於對hu-PD-1所具者之親和性。雖然大鼠- PD-1蛋白已經經由它們明確結合正對照、小鼠-PD-L1及小鼠-PD-L2而確認為活性，當以0.5μM藉由SPR在25℃測量時，沒有偵測到對於大鼠PD-1之結合。KinExA測量之KD值表示N個獨立實驗之全局分析的最佳擬合及95%信賴區間，而SPR測量之KD值表示在ProteOn NLC感應晶片上n個獨立實驗之平均±標準差。於表23中，h或hu=人類；ka=結合速率常數；kd=解離速率常數；KD=平衡解離常數；KinExA=動力學排除檢測法；mAb=單克隆抗體；Ms=每秒莫耳濃度；n=數目；ND=未決定；PD-1=計畫性死亡-1；s=秒；SPR=表面電漿共振；Temp=溫度；*mAb之與hu-PD-17的交互作用係在如Bee et al,2012所述之兩個相反檢測方向性中進行。
表24顯示mAb7在一範圍的Fc受體，包括來自人類及馬來猴之FCGR及FcRn的結合動力學及專一性係扼要 重述預期於同型匹配之同型對照hu-IgG4的那些值。舉例來說，與同型對照之177±71pM(n=4)相比，mAb7以在25℃為146±42pM(n=14)之表觀KD值(平均±標準差)結合hu-FCGRI。所有其他交互作用係以弱親和性(KD值~1μM或更高)為特徵。對於FCGR以pH 7.4及對於FcRn以pH 5.9在ProteOn NLC晶片上施行動力學分析。於表24中，CD=分化簇；cy=馬來猴；FCGR=Fc伽馬受體；FcRn=新生兒Fc受體；hu=人類；ka=結合速率常數；kd=解離速率常數；KD=平衡解離常數；=每秒莫耳濃度；n=數目；s=秒。
此外，藉由ELISAmAb7幾乎沒有結合C1q，此與同型匹配之對照hu-IgG4之行為一致(數據未顯示)。其之結合甚至低於人類免疫球蛋白G2(hu-IgG2)之低結合。相反地，正對照hu-IgG1及人類免疫球蛋白G3(hu-IgG3)給出高結和信號。使用SPR及Octet生物感測器二者及不同檢測格式(預先混合及經典三明治檢測格式)，證實mAb7會 阻斷hu-PD-1結合其天然配體hu-PD-L1與hu-PD-L2。
這些數據證實mAb7以高親和性與高專一性結合hu-PD-1。當使用KinExA方法在23℃於溶液中測量時，mAb7以統計上不可區分之表觀KD值結合hu-PD-1及馬來猴-PD-1，對於hu-PD-1，表觀KD值為17pM及23pM(當於交替檢測方向性研究時)而對於馬來猴-PD-1，表觀KD值為28pM。mAb7顯示對小鼠-PD-1有20,000-倍較弱之親和性(以SPR在25℃測量之表觀KD為0.9μM)，且當以0.5μM測試時，對於大鼠PD-1沒有可偵測之結合。當以SPR在25℃測量時，mAb7及同型匹配之對照hu-IgG4當針對一組hu-Fc受體及馬來猴-Fc受體測試結合時，具有相似動力學及專一性。當以ELISA測試時，mAb7以可忽略信號結合hu-C1q，這與hu-IgG4同型對照一致，且其之結合甚至更低於hu-IgG2所具者。已證明mAb7阻斷hu-PD-1結合其天然配體hu-PD-L1與hu-PD-L2。
實施例13：以抗PD-1抗體與抗OX40抗體組合治療
此實施例說明於結腸癌小鼠模型中以抗PD-1抗體組合上抗OX40抗體治療之效應。
對於此研究，以5x105個細胞/小鼠之MC-38小鼠結腸腫瘤(等級III腺瘤)皮下接種C57B6/J母小鼠(6至8週齡)。在第10天，隨機化小鼠並開始以10mg/kg抗小鼠-PD-1及1mg/kg抗小鼠-OX-40處理。處理係在第10、12及14天i.p.投予抗OX40抗體(1mg/kg)；及在第10、 12、14、17、23及25天i.p.投予抗PD-1抗體(10mg/kg)。腫瘤體積每週測量2次。在第34天結束此研究。使用2因子Anova施行統計分析以在單一個時點比較各兩群組之間的均線。結果總結於表25中。於表25中，值表明每組8隻小鼠的日平均腫瘤體積±(平均值之標準差)sem；N=每群組數目，mm2=毫米立方。同型對照包括各抗體之適當同型，對於抗OX40係1mg/kg而對於抗PD-1係10mg/kg。
在第24天開始，當與對照群組相比，所有以抗PD-1抗體及/或抗OX-40抗體處理之群組顯示顯著較小腫瘤體積(表25)。在第24天，當與對照群組相比，以組合(抗PD-1抗體加上抗OX40抗體)處理之群組顯示顯著性為p0.0001，而當與對照群組相比，各單一抗體處理顯示顯著性係p0.01。第34天，當與對照群組相比，所有經處理群組顯示顯著性係p0.0001。第34天，當與以單獨抗PD-1抗體處理之群組或以單獨OX-40抗體處理之群組相比，以組合處理之群組顯示差異。這些結果證實，當與以單獨抗PD-1抗體或以單獨抗OX40抗體治療相比，以抗 PD-1抗體及抗OX40抗體二者治療，抗體減緩腫瘤生長。
實施例14：疫苗對經活化T細胞上PD-1表現的效應
此實施例說明，在抗CTLA4單克隆抗體曲美目單抗(檢查點抑制劑)的存在下，表現人類前列腺專一性膜抗原(PSMA)之DNA基底疫苗對CD3+CD4細胞上PD-1表現之效應(表26)及對CD3+CD8T細胞上PD-1表現之效應(表27)。
活體內研究程序。此研究中使用三個中國石蟹獼猴(Chinese cynomolgus macaques)群組(n=8/群組)。群組1與群組2中之動物係肌肉內注射含有編碼人類PSMA胺基酸15至750之AdC68腺病毒載體(SEQ ID NO：44)的疫苗(以總劑量為2e11 VP)，而群組3中動物係沒有接受疫苗接種。AdC68腺病毒載體的完整序列提供在SEQ ID NO：44。此外，疫苗接種後立即藉由皮下注射以50mg抗CTLA4單克隆抗體曲美目單抗處理群組2中之動物。收集來自疫苗接種之前(Pre)與之後在第9、15及29天各動物的全血樣品並藉由流式細胞儀分析表現PD-1之CD3+CD4及CD3+CD8T細胞的頻率。
CD3+ CD4及CD8 T細胞表現型。在新鮮收集之全血上，藉由施行多色流式細胞儀分析找出白血球族群表現型。簡言之，在室溫以含有CD3-V500(克隆SP34-2)、CD4-BV605(克隆L200)、CD8-APC.H7(克隆SK1)、PD1-AF488(克隆EH12.2H7,Biolegend)、PDL1-BV421(克隆 MIH1)、Lag3-PE.Cy7(克隆11E3,Novus)、CD69-PE.德州紅(克隆TP1.553,Beckman Coulter)、TIM3-APC(克隆344823,R&D Systems)、CD20-PE.Cy5.5(克隆2H7,eBioscience)、CD14-AF700(克隆M5E2)、CD16-PE.Cy5(克隆3G8)、CD56-PerCP.Cy5.5(克隆B159)及CD11c-PE(克隆SHCL3)之抗體雞尾酒將全血染色20分鐘。除非另行表明，所有抗體係購自BD。樣品係以RBC溶解緩衝液(BD)處理、清洗並混合50ml液體計數珠(BD)且在LSR Fortessa(BD)上取得數據。使用FlowJo(Tree Star Inc,USA)分析數據。
於表26中呈現CD3+CD4 T細胞上PD-1表現的結果且於表27中呈現CD3+CD8 T細胞上PD-1表現的結果。在疫苗接種後第9天觀察到誘導PD-1且其在疫苗接種後第29天分解至未經活化動物中所見之水平(群組3)。這些結果表明，於非人類靈長動物中，該與抗CTLA4抗體一起給予之疫苗載體可引發CD3+ CD4及CD8 T細胞上之PD-1表現。
實施例15.抗PD-1抗體在表現人類PSMA之疫苗所誘導抗原專一性T細胞回應上的效應
此實施例說明，於石蟹獼猴中之抗PD1抗體在含有表達人類PSMA之AdC68腺病毒載體之疫苗所誘導IFNγ CD4及CD8 T細胞回應上的效應。
細胞內細胞介素染色(ICS)檢測法。簡言之，來自個別動物之PBMC係與來自跨越分別之抗原的整個序列重疊11個胺基酸的15聚體(15mer)肽庫之肽池共培養，各肽係在2μg/ml。在37℃，5% CO2培養該等盤~16小時。接著細胞經染色用以偵測CD8+T細胞之細胞內IFNγ表現，並固定之。在流式細胞儀上取得細胞。回應頻率經標準化成每百萬個CD8+T細胞之IFNγ CD8+T細胞數目，且減掉不含有肽之二甲基亞碸對照孔中之回應。表中的抗原專一性回應表示對於對應抗原專一性肽池之回應的和。
活體內研究程序。簡言之，五個中國石蟹獼猴群組(n=8/群組)係以總劑量2e11 VP肌肉內注射含有編碼人類 PSMA(hPSMA)胺基酸15至750之AdC68腺病毒載體(SEQ ID NO：44)的疫苗。於群組2、4及5中，疫苗接種後立即藉由皮下注射50mg抗CTLA4單克隆抗體曲美目單抗及/或皮下(群組3及4)或靜脈內(群組5)給予10mg/kg抗PD-1單克隆抗體mAb7。自各動物分離PBMC並使其經歷ICCS檢測法以測量人類PSMA專一性IFN CD4 T細胞回應(第9天或第29天)或CD8 T細胞回應(第29天)。全長人類PSAM之胺基酸序列係提供在SEQ ID NO：42。表現人類PSMA胺基酸15至750之AdC68腺病毒載體的序列提供在SEQ ID NO：44。
結果。於表29、30及37中呈現結果。數據證實抗CTLA4及抗PD-1二者個別地都可增加該疫苗所誘導IFNγ CD4及CD8 T細胞回應之頻率。
實施例16.抗PD-1抗體在共表現人類前列腺專一性膜抗原(PSMA)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)及前列腺專一性抗原(PSA)之疫苗所誘導IFNγ T細胞回應上的效應
活體內研究程序。簡言之，此研究中使用三個中國石蟹獼猴群組(n=4/群組)。群組1中之動物係肌肉內注射載 具。群組2中之動物係皮下投予20mg/kg抗PD-1單克隆抗體mAb7。群組3中動物係以總劑量為6e11 VP之含有共表現三種人類前列腺相關抗原(PSMA、PSCA及PSA)之AdC68腺病毒載體(載體AdC68W-734)的疫苗處理，隨後立即藉由皮下注射150mg抗CTLA4單克隆抗體曲美目單抗及20mg/kg抗PD-1單克隆抗體mAb7。注射後28天，動物係以載具(群組1)、抗PD-1單克隆抗體mAb7皮下20mg/kg(群組2)或藉由電穿孔遞送表現三種人類前列腺癌抗原(PSMA、PSCA及PSA)之DNA質體(質體458)隨後立即藉由皮下注射150mg抗CTLA4及20mg/kg抗PD-1單克隆抗體(群組3)補強免疫。先發首次注射的四十三天後，自各動物分離PBMC並使其經歷ELISPOT檢測法，以測量PSMA、PSCA及PSA專一性之IFNγ T細胞回應。
用於此研究之載體AdC68W-734的完整序列係提供於本揭露之SEQ ID NO：45及國際申請公開號WO2015/063647之SEQ ID NO：63。載體AdC68W-734之建構體也描述於WO2015/063647，其之揭露係藉由參考而納入本文中。AdC68W-734載體及質體458各包含(1)編碼具有示於SEQ ID NO：42之人類PSMA之胺基酸15至750的核酸序列，(2)編碼具有示於SEQ ID NO：47之人類PSA之胺基酸25至261的核酸序列，及(3)編碼示於SEQ ID NO：48之全長人類PSCA的核酸序列。
IFNγ ELISPOT檢測法。簡言之，來自個別動物之末梢血液單核細胞(PBMC)係與來自跨越分別之抗原的整個 序列重疊11個胺基酸的15mer肽庫之肽池共培養，二重複，各肽係在2μg/ml。在37℃，5% CO2培養該等盤~16小時，接著根據製造商之指導清洗並顯影。以CTL讀取器計數形成IFNγ斑點之細胞(SFC)的數目。計算二重複的平均並減掉不含有肽之負對照孔之回應。接著將SFC計數標準化以描述每1e6個PBMC之回應。表中的抗原專一性回應表示對於對應抗原專一性肽池之回應的和。
結果。於表33中呈現之ELISpot結果證實，接受該疫苗與皮下抗PD-1抗體及抗CTLA4抗體之動物展現對於至少一種前列腺癌抗原之IFNγ T細胞回應之強烈增加，而在載具群組(群組1)中或單獨投予抗PD-1抗體之群組(群組2)中，對這些抗原沒有IFNγ T細胞回應。
雖然所揭示之教示已藉由參考各式應用、方法、套組及組成物描述，應了解可進行各式改變及修飾而不背離本文之教示及以下所請發明。前述之實施例係為了更佳地說明本發明之教示而提供，並非意圖限制本發明之範疇。雖然本教示已就這些例示性實施態樣描述，該領域具有通常知識者將輕易了解可能針對這些例示性實施態樣進行許多變化及修飾而無須過度實驗。所有此等變化及修飾皆包含在目前教示之範疇內
所有於本文中引述之文獻，包括專利、專利申請案、論文、教科書及類似物，及於彼等中所引述之文獻除非不是業已納入本發明，係藉由參考其整體內容而納入本文中。若一或多篇該等納入文獻及相似材料與本申請案有不同或衝突之處，包括但不限於經定義之用語、用語之使 用、所描述之技術或類似物，以本申請案為主。
前面的描述及實施例係詳細描述本發明之某些特定實施態樣，並描述發明人所考慮之最佳模式。然而應了解的是，不論前面說明得多詳細，本發明可以許多方式實施，且應根據該隨附之申請專利範圍及彼等之任何均等物被解讀。
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<213> 智人
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<213> 人工序列
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<223> 人源化抗體序列
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<213> 人工序列
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<223> 人源化抗體序列
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<221> 變體
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<223> Xaa為Thr或Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 人源化抗體序列
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<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為Phe或Ser
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<221> 變體
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Leu或His
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<213> 人工序列
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<221> 變體
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<223> Xaa is Tyr or Trp
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<221> 變體
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<223> Xaa is Leu,Ile,or Ser
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<213> 人工序列
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<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Leu或Ser
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<213> 人工序列
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<223> 人源化抗體序列
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<213> 人工序列
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<223> mAb7重鏈可變區之DNA序列
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<212> DNA
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<223> mAb7輕鏈可變區之DNA序列
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<223> 合成建構體
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<213> 智人
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<223> 合成建構體
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Claims (42)

  1. 一種經分離之拮抗劑抗體，其專一性結合PD-1且包含：重鏈可變區(VH)，其包含該VH的VH互補決定區1(CDR1)、VH CDR2及VH CDR3，該VH具有選自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6所組成群組之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含該VL的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，該VL具有選自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9所組成群組之胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含：包含示於SEQ ID NO：13、14或15之胺基酸序列之VH CDR1、包含示於SEQ ID NO：16、17、24、25、27、28或35之胺基酸序列之VH CDR2、包含示於SEQ ID NO：18、23或26之胺基酸序列之VH CDR3、包含示於SEQ ID NO：10、22或30之胺基酸序列之VL CDR1、包含示於SEQ ID NO：11或20之胺基酸序列之VL CDR2及包含示於SEQ ID NO：12、21或31之胺基酸序列之VL CDR3。
  3. 如申請專利範圍第1項之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含：包含示於SEQ ID NO：3、4、5或6之胺基酸序列之VH、或彼在非CDR內之殘基具有一或數個保守性胺基酸取代之變體。
  4. 如申請專利範圍第3項之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含：包含示於SEQ ID NO：2、7、8或9之胺基酸序列之VL、或彼在非CDR內之胺基酸具有一或數個胺基酸取代之變體。
  5. 如申請專利範圍第1項之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含：包含示於SEQ ID NO：4之胺基酸序列之VH及包含示於SEQ ID NO：8之胺基酸序列之VL。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含：包含示於SEQ ID NO：29或38之胺基酸序列之重鏈及包含示於SEQ ID NO：39之胺基酸序列之輕鏈。
  7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含恆定區。
  8. 如申請專利範圍第7項之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體具有選自IgG2、IgG2△a、IgG4、IgG4△b、IgG4△c、IgG4 S228P、IgG4△b S228P及IgG4△c S228P所組成群組之同型。
  9. 如申請專利範圍第7項之經分離之拮抗劑抗體，其中該恆定區係IgG4 S228P。
  10. 如申請專利範圍第1項之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體之各CDR係根據卡巴(Kabat)定義、柯西亞(Chothia)定義、卡巴定義及柯西亞定義之組合、AbM定義或CDR之接觸定義而定義。
  11. 一種經分離之抗PD-1抗體，其中該抗體包含： 包含示於SEQ ID NO：13之胺基酸序列之VH CDR1、包含示於SEQ ID NO：17之胺基酸序列之VH CDR2、包含示於SEQ ID NO：23之胺基酸序列之VH CDR3、包含示於SEQ ID NO：10之胺基酸序列之VL CDR1、包含示於SEQ ID NO：20之胺基酸序列之VL CDR2及包含示於SEQ ID NO：21之胺基酸序列之VL CDR3。
  12. 如申請專利範圍第1至5及11項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體促進T細胞分泌IFNγ及/或TNF。
  13. 如申請專利範圍第1至5及11項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體促進T細胞增生。
  14. 如申請專利範圍第1至5及11項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體抑制腫瘤生長。
  15. 如申請專利範圍第1至5及11項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體結合人類PD-1與鼠類PD-1。
  16. 如申請專利範圍第15項之經分離之抗體，其中該抗體以藉由表面電漿共振於25℃下測量之約0.73nM之親和性結合人類PD-1。
  17. 一種經分離之細胞系，其產製如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體。
  18. 一種經分離之核酸，其編碼如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體。
  19. 一種重組表現載體，其包含如申請專利範圍第18項之核酸。
  20. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第19項之表現載體。
  21. 一種融合瘤，其能產製如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體。
  22. 一種產製抗PD-1拮抗劑抗體之方法，該方法包含：將重組產製如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體之細胞系培養於其中該抗體被產製之條件下；及回收該抗體。
  23. 一種產製抗PD-1拮抗劑抗體之方法，該方法包含：將包含編碼抗體之核酸之細胞系培養於其中該抗體被產製之條件下，其中該抗體包含：包含示於SEQ ID NO：29或38之胺基酸序列之重鏈及包含示於SEQ ID NO：39之胺基酸序列之輕鏈；及回收該抗體。
  24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該抗體之重鏈與輕鏈係編碼在個別載體上。
  25. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該抗體之重鏈與輕鏈係編碼在相同載體上。
  26. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體及醫藥上可接受之載體。
  27. 一種用於癌症治療之套組，其包含如申請專利範圍第26項之醫藥組成物。
  28. 一種如申請專利範圍第1至16項中任一項之經分離之抗體或如申請專利範圍第26項之醫藥組成物於製備用於治療個體之癌症的藥劑或套組之用途，使得個體中 一或多種與該癌症相關之症狀被改善。
  29. 如申請專利範圍第28項之用途，其中該癌症係選自胃癌(gastric cancer)、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、白血病、頭部和頸部癌症、鱗狀細胞頭頸癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、甲狀腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、膠質瘤、白血病、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、膀胱癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、口腔癌、皮膚癌及黑色素瘤所組成群組。
  30. 如申請專利範圍第28項之用途，其中該個體係具有局部晚期或轉移黑色素瘤、鱗狀細胞頭頸癌(SCHNC)、卵巢惡性腫瘤(ovarian carcinoma)、肉瘤或復發或難治的經典霍奇金氏淋巴瘤(cHL)之先前經治療的成人病患。
  31. 如申請專利範圍第28至30項中任一項之用途，其中該抗體以劑量約0.5mg/kg、約1.0mg/kg、約3.0mg/kg或約10mg/kg投予。
  32. 如申請專利範圍第28至30項中任一項之用途，其中該抗體以每7、14、21或28天投予一次。
  33. 如申請專利範圍第28至30項中任一項之用途，其中該抗體係經靜脈內或皮下投予。
  34. 如申請專利範圍第28至30項中任一項之用途，其中該藥劑或套組進一步包含第二治療劑。
  35. 如申請專利範圍第34項之用途，其中該第二治 療劑係選自抗CTLA4抗體、抗4-1BB抗體、第二PD-1拮抗劑、抗PD-L1抗體、抗TIM3抗體、抗LAG3抗體、抗TIGIT抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體、酪胺酸激酶抑制劑及ALK抑制劑所組成群組。
  36. 如申請專利範圍第35項之用途，其中該酪胺酸激酶抑制劑係阿西替尼(axitinib)或帕博西尼(palbociclib)。
  37. 如申請專利範圍第35項之用途，其中該ALK抑制劑係舒尼替尼(sunitinib)或克里唑替尼(crizotinib)。
  38. 一種(1)如申請專利範圍第1至16項中任一項之經分離之抗體或如申請專利範圍第26項之醫藥組成物與(2)能引發抗癌細胞的免疫反應的疫苗之組合於製備用於治療個體的癌症之單一劑量單位藥劑或多劑量單位套組之用途，其中於該多劑量單位中，一劑量單位含有該經分離之抗體或該醫藥組成物，且另一劑量單位含有該疫苗。
  39. 一種如申請專利範圍第1至16項中任一項之經分離之抗體或如申請專利範圍第26項之醫藥組成物於製備藥劑或套組之用途，該藥劑或套組係用於在接受用於癌症治療之疫苗之個體內增進該疫苗之免疫原性或治療效應。
  40. 如申請專利範圍第38或39項之用途，其中該癌症係選自乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及結腸直腸癌所組成群組。
  41. 如申請專利範圍第38或39項之用途，其中該藥 劑或套組進一步包含一或多種其他免疫調節劑。
  42. 如申請專利範圍第41項之用途，其中該其他免疫調節劑係選自蛋白激酶受體抑制劑、CTLA-4拮抗劑、CD40促效劑及TLR9促效劑所組成群組。
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