ES2249761T3 - Vectores de adenovirus para terapia genica. - Google Patents
Vectores de adenovirus para terapia genica.Info
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Abstract
LA INVENCION COMPRENDE UNA SERIE DE VECTORES BASADOS DE ADENOVIRUS QUE TIENEN OMISIONES EN LAS REGIONES E1 Y/O E3, Y OPCIONALMENTE INSERCIONES DE LAS SECUENCIAS PBR322 QUE PUEDEN UTILIZARSE PARA ENVIAR INSERTOS DE ACIDO NUCLEICO EN LAS CELULAS ANFITRIONAS, TEJIDOS Y ORGANISMOS ANFITRIONES QUE PUEDEN ENTONCES EXPRESAR EL INSERTO. LA INVENCION TAMBIEN COMPRENDE EL USO DE ESTOS VECTORES EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS, PARA HACER VACUNAS Y EN LA TERAPIA GENETICA.
Description
Vectores de adenovirus para terapia génica.
Esta invención se refiere a vectores de
adenovirus (Ad) que son útiles para la expresión potenciada de
ácidos nucleicos seleccionados en células infectadas, transfectadas
o transformadas, especialmente células eucariotas mamíferas. Esta
invención generalmente también se refiere a vectores genéticamente
manipulados que codifican sustancias terapéuticas útiles como
vacunas y para terapia génica.
Los adenovirus (Ads) son un grupo de virus
homogéneo relativamente bien caracterizado. Hasta ahora se han
identificado aproximadamente 100 adenovirus diferentes, incluyendo
casi 50 serotipos aislados de humanos.
Los serotipos de Ads más comunes no son
patogénicos, físicamente y genéticamente estables, pueden crecer en
grandes cantidades (son fáciles de obtener reservas concentradas con
10^{11}-10^{12} PFU/ml de virus infeccioso) y
pueden ser fácilmente purificados por centrifugación en gradiente
isopícnico de CsCl. El genoma de Ad se manipula fácilmente por
técnicas de recombinación de DNA, y las proteínas codificadas por
los insertos de DNA foráneo que se expresan en células mamíferas
normalmente se glicosilarán o se fosforilarán apropiadamente a
diferencia de las proteínas recombinantes expresadas en bacterias,
levaduras y algunas células de insecto. Aunque los Ads humanos se
replican más eficientemente en células humanas de origen epitelial,
estos virus infectan al menos algunos genes virales. A diferencia de
los retrovirus, los Ads infectarán, y se expresarán en, células no
replicadas. Así, los vectores basados en Ad pueden ser útiles para
la liberación, expresión de genes y terapia génica.
Los vectores de Ad han sido construidos por la
ligación o la recombinación del DNA viral con secuencias
subgenómicas que contenidas en plásmidos de bacterias. Berkner, K.L.
y Sharp, P.A., 1983, Nucleic Acids Res. 11:
6003-6020; Haj-Ahmad, Y. y Graham,
F.L., 1986, J. Virol. 57: 267274; Stow, N.D., 1981, J.
Virol. 37: 171-180. Este acercamiento tiene
varias desventajas, que incluyen el tiempo y la dificultad técnica
requerida para producir DNA viral, los antecedentes del virus
infeccioso parental que hacen del cribado una labor pesada y, en el
caso de la ligación directa, la disponibilidad limitada de los
sitios de restricción útiles debida al tamaño relativamente grande
del genoma de adenovirus.
Otra estrategia ha sido recombinar dos plásmidos
que juntos contengan secuencias que comprenden el genoma de Ad
entero. Se han desarrollado varios sistemas de plásmidos
condicionalmente defectivos haciendo la construcción de vectores más
simple y la reducción del número de análisis subsiguientes
requeridos para identificar virus recombinantes. McGrory, W.J.,
Bautista, D.S. and Graham f.L., 1988, Virol. 163:
614-617; Ghosh-Choudhury, G.,
HajAhmad, Y., Brinkley, P., Rudy, J. y Graham, F. L., 1986,
Gene 50: 161-171; Mittal, S.K., McDermott, M.R.
Johnson, D.C., Prevec, L. y Graham, F.L., 1993, Virus Res.
28: 67-90.
El genoma representativo de adenovirus 5
("Ad5") utilizado en realizaciones de la presente invención es
un dúplex lineal de 36Kb. Su secuencia ha sido
publicada.(Chroboczek, J., Bieber, F., y Jacrot, B., 1992, The
Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with
the Genome of Adenovirus Type 2, Virol. 186:
280-285; incorporados por referencia por la
presente). El genoma Ad5 contiene una repetición terminal invertida
("ITR") de 100-150 pares de bases (pb) en cada
extremo del genoma linearizado. Una proteína terminal ("PT") de
55.000 daltons se une covalentemente al extremo 5' de cada cadena.
Se piensa que ambas la TP y las ITRs juegan un papel en la
replicación de DNA viral. McGrory, W. J. et al., 1988,
Virol. 163: 614-617 y
Ghosh-Choudhury, G. et al., 1986, Gene 50:
161-171.) Ad5 ha infectado cada línea celular humana
probada, aunque algunas células, tales como linfocitos, son
relativamente no permisivos.
Cuatro regiones no contiguas del genoma de Ad5 se
transcriben pronto en la infección, antes de la replicación de DNA.
Estas regiones son la región temprana 1 (E1) (alrededor de
1,3-11,2 mu o alrededor de la posición
198-4025 pb de un genoma estanadardizado, incluida
la región potenciadora de E1A; Sussenbach, J. S., 1984, in Ginsburg
(Ed.), THE ADENOVIRUSES, Plenum Press, pp. 35-124)
que está más dividida en las subregiones E1A y E1B; la región
temprana 2 (E2), que codifica las funciones replicativas del DNA del
virus; la región temprana 3 (E3) (alrededor de
75,9-86,0 mU, o 27,275-30,904 pb;
Cladaras, C. y Wold, W.S.M., 1985, Virol. 140:
28-43; y región temprana 4 (E4). ElA está implicado
en las otras regiones tempranas y en regular varias funciones de la
célula huésped. E1B y E4 están implicadas primariamente en concluir
la síntesis proteica de la célula huésped. E3 regula la respuesta
inmune de la célula huésped a la infección del virus. Algunas de
estas funciones de los genes tempranos para "activar" los genes
expresados más tarde que se necesitan para replicar el genoma y
formar partículas virales.
Se han descrito varios vectores Ad. Por ejemplo,
un vector Ad5 se ha construido a partir de un fragmento de DNA de
adenovirus y un plásmido linearizado. Quantin et al., 1992,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584. Se ha
descrito un vector de adenovirus recombinante construido a partir de
un casete de expresión de CTFR y un fragmento de DNA de adenovirus.
Rosenfeld et al., 1992, Cell. 68:143-155.
El virión del Ad tiene la capacidad de empaquetar
hasta el 105-106% de la longitud del genoma tipo
salvaje. Bett, A.J., Prevec, L., and Graham, F.L., 1993, Packaging
Capacity y Stability Human Adenovirus Type 5 Vectors, J. Virol.
67:5911-5921. Genomas más grandes (pej., 108% del
tipo salvaje en tamaño), resultan en la inestabilidad del virus y
tasas pobres de crecimiento. Id. Esta capacidad de empaquetamiento
permite la inserción de sólo aproximadamente 1,8-2,0
Kb de DNA en exceso en el genoma del Ad.
Para empaquetar insertos más grandes, primero es
necesario suprimir porciones del genoma viral. Partes de la región
E1 se pueden suprimir, y los virus que resultan pueden ser
propagados en células 293 humanas. (células 293 contienen y expresan
el E1, complementando mutantes virales que son defectuosos en E1.)
Se pueden insertar ácidos nucleicos foráneos en lugar del E1, en
genomas de Ad5 que contienen deleciones de E1 de hasta 2,9 KB, para
producir vectores independientes de ayudantes condicionales con una
capacidad para insertar de 4,7-4,9 Kb.
Los virus con una deleción en la región E3
también pueden replicarse en células humanas cultivadas tales como
HeLa o KB e infectar y ser expresados en animales incluyendo
humanos. Se ha descrito una deleción de una secuencia E3 de 3,0 Kb,
sin una inserción concomitante. Ranheim, T.S., Shesler, J., Horton,
T.M., Wold, L.J. Gooding, L.R., y Wold, W.S.M., 1993, J. Virol.
67:21592167.
Entre los métodos desarrollados hasta ahora no
hay un procedimiento simple para generar vectores que utilicen ambas
deleciones de E1 y E3. Además, los vectores que utilicen deleciones
de E1 o E3 solamente pueden colocar insertos relativamente pequeños.
Para simplificar la producción y el uso de los vectores de Ad que
pueden tolerar fragmentos más grandes, hemos desarrollado una nueva
metodología basada en una serie de plásmidos bacterianos que
contienen la mayor parte de un genoma viral de Ad.
Un objetivo de esta invención es proporcionar
vectores de Ad5 de clonación y expresión simples, flexibles,
eficientes, con alta capacidad. Por consiguiente, se ha desarrollado
un sistema de vectores nuevo que comprende deleciones expandidas en
ambas E1 y E3 y además las combina en un sistema de vectores simple
que pueden tolerar insertos de más de 8000pb de insertos,
suficientes para colocar la mayoría de los genes que codifican
proteínas a lo largo de los elementos de control para regular la
expresión. La invención proporciona la opción de clonar ácidos
nucleicos foráneos en alguna o en ambas regiones E1 ó E3 y promete
ser la más versátil y fácil para usar tecnología ya desarrollada.
Además, una modificación del sistema permite la construcción de
virus que llevan una región E3 de tipo salvaje, e inserciones,
sustituciones, o mutaciones en la región e1.
Una realización de la presente invención
proporciona un plásmido bacteriano que comprende un genoma de
Adenovirus tipo 5 (Ad5) humano modificado circularizado. La
secuencia nucleotídica del plásmido tiene una deleción en la región
temprana 3' de dicho genoma Ad5, y un segmento de plásmido pBR322
replicable bacterianamente que codifica la resistencia a la
ampicilina sustituida por una secuencia de la región temprana 1A
(E1A) que corresponde, en parte o completamente, a la señal de
empaquetamiento.
Otra realización proporciona un plásmido
bacteriano que comprende aproximadamente 340 pares de base desde el
extremo izquierdo del genoma de Adenovirus tipo 5 las secuencias de
la repetición terminal invertida del extremo izquierdo de dichas
secuencias y las secuencias señal de empaquetamiento de las mismas,
dicho plásmido comprenden también una secuencia de genes eucariótica
de más de alrededor de 8 kilobases foráneas a dicho plásmido y a
dicho genoma viral. La secuencia de adenovirus a partir de
aproximadamente la posición nucleotídica 3540 de la misma hasta
aproximadamente la posición 5790 de la misma está presente en el
lado derecho de dicha secuencia foránea.
Otras realizaciones de la presente invención
incluyen construcciones del genoma de adenovirus que contienen
deleciones en E1 e insertos foráneos de origen eucariótico, usando
alguna combinación de tamaño de la deleción E1 y/o del tamaño del
inserto foráneo que puede ser colocado en el plásmido quedando
todavía operativo. Debido a la gran capacidad de los vectores
proporcionados aquí, múltiples insertos de genes foráneos pueden ser
reemplazados en el sitio de clonación E1. Por ejemplo, dos o más
genes que codifican diferentes antígenos, o genes que codifican
proteínas útiles, se pueden combinar con genes que codifican
marcadores seleccionables químicamente.
Una realización específica de la invención, el
plásmido pBHG10, se puede utilizar para insertar genes foráneos en
cualquiera de las regiones E1 ó E3 del genoma de Ad5. Los genes
insertados en E3 se pueden combinar con una variedad de mutaciones,
deleciones ,o inserciones en E1 por elección apropiada del plásmido
cotransfectado que contiene secuencias del extremo izquierdo
(E1).
Fig. 1 es una representación diagramática de la
estructura y de la construcción del vector pBHG10.
Fig. 2 es una representación diagramática de la
estructura y de la construcción del vector pBHG3.
Fig. 3 es una representación diagramática de
recuperación usando los vectores pBHG.
Fig. 4 es una representación diagramática de la
estructura y de la construcción de la deleción en E1 de 3,2 Kb, y
dos ejemplos (p\DeltaE1sp1A y p\DeltaE1sp1B) de plásmidos que
contienen la dicha deleción.
Fig. 5 ilustra diversos niveles de la proteína IX
sintetizada usando los plásmidos que tienen diferentes deleciones en
E1 con o sin un sitio Ssp1 reintroducido.
Fig. 6 ilustra la estabilidad del calor de los
virus con la deleción en E1 de 3,2 Kb con o sin un sitio Sspl
reintroducido.
Fig. 7 ilustra la construcción y la recuperación
de un inserto de 7,8 Kb usando pBGH10.
Fig. 8 representa la estrategia para la
construcción de un doble recombinante que contiene lacZ en la
deleción de E3 y luciferasa de luciérnaga en la deleción de E1.
Fig. 9 es una representación diagramática de los
plásmidos pABS.6, pABS.7, y pABS.9.
Fig. 10 es una representación diagramática de los
plásmidos lanzaderas pHCMVsplA, pHCMVsplB, pHCMVsp1C, y
pHCMVsplD.
Los vectores Ad recombinantes proporcionados aquí
son significativamente diferentes de las construcciones previamente
descritas en parte porque contienen la deleción más grande posible
de las secuencias de E1 (en 30-40 pb) que se puede
hacer mientras todavía se permite la generación de recombinantes
virales viables. Sorprendentemente, los diferentes elementos
genéticos descritos aquí, cuando se combinan, produjeron una
construcción estable útil para introducir y expresar ácidos
nucleicos foráneos en las células huésped.
Al inicio de estos experimentos, se desconocía
cuán grande podía ser una deleción, o donde podía tener lugar, sin
afectar el crecimiento, la producción y la inefectividad de los
viriones empaquetados. Para la viabilidad viral y la capacidad de
empaquetamiento máxima, las deleciones en la región E1
preferiblemente no deberían afectar la repetición terminal invertida
a la izquierda (ITR; 1-103 pb) o señales de
empaquetamiento (194-358 pb). Hearing, P. y Shenk,
T., 1983, Cell, 33: 695-703; Grable, M. y Hearing,
P., 1992, J. Virol. 64: 2047-2056. Además,
porque la única E1 actualmente disponible que complementa la línea
celular (células 293) no expresa la proteína IX, las deleciones
pueden no extenderse en las secuencias codificantes para este
polipéptido. (Aunque los mutantes de la deleción viral que carecían
el gen de la proteína IX han sido aislados, parece ser que la
proteína es esencial para el empaquetamiento de los genomas
completos en virus funcionales).
En las realizaciones del plásmido pBHG de la
invención, las secuencias de pBR322 se sustituyen por secuencias Ad5
a partir de la posición 188 a 1339, que incluyen la señal de
empaquetamiento, potenciador de E1A, promotor y la mayoría de
secuencias codificantes de las proteínas de ElA. El inserto pBR322
no solamente tiene una resistencia a la ampicilina, sino que también
permite que la familia pBHG de vectores se replique en células en
donde pBR322 puede ser replicado.
Algunas realizaciones de la invención aquí
contienen una deleción de la región E1 entre un sitio Ssp I en 339pb
y un sitio Afl en 3533pb. Puesto que el sitio Sspl puede ser
esencial para la expresión de la proteína IX, fue reintroducido como
oligonucleótido sintético que colocó el sitio Sspl más cerca de la
proteína IX TATA box que en el caso del gen de tipo salvaje (wt) de
la proteína IX.
Todos los términos técnicos y científicos usados
aquí, a menos que se defina lo contrario, generalmente pretenden
tener el mismo significado como lo entiende comúnmente un entendido
de la materia. Varios de los términos usados aquí no pretenden ser
limitantes, aunque el uso común pueda sugerir lo contrario. Por
ejemplo, el término "expresión de" ó "expresar" un ácido
nucleico foráneo, gen cDNA se usan aquí para abarcar la replicación
de un ácido nucleico, la transcripción de DNA y/o la traducción de
RNA en la proteína, en células o en sistemas libres de proteínas
tales como gérmenes de trigo o reticulocitos de conejo; y "ácido
nucleico" intercambiablemente con gen, cDNAs, RNA, u otros
oligonucleótidos que codifican productos génicos. El término
"foráneo" indica que el ácido nucleico no se encuentra en la
naturaleza idénticamente asociados con el mismo vector o célula
huésped, pero más que la asociación precisa entre dicho ácido
nucleico y el vector o célula huésped que se crea por ingeniería
genética. Los términos "recombinante" y "recombinación"
generalmente se refieren a las reorganizaciones del material
genético que se contemplan por los inventores, y que son el
resultado de la manipulación experimental.
"Vector" denota una construcción de ácido
nucleico manipulado genéticamente capaz de ser modificado por
técnicas de recombinación genética para incorporar alguna secuencia
de ácidos nucleicos foráneos deseada, que puede ser usada de una
manera para introducir dicha secuencia en una célula huésped,
replicarla, clonarla, y/o expresar dicha secuencia de ácidos
nucleicos, en donde dicho vector comprende toda la información
necesaria de la secuencia para capacitar al vector a ser replicado
en células huésped, y/o para capacitar la secuencia de ácidos
nucleicos a ser expresadas, y/o para capacitar la recombinación que
se produce, y/o para capacitar que el vector se empaquete en
partículas virales. Esta recitación de las propiedades de un vector
no significa que sea exhaustivo.
Los vectores, que opcionalmente contienen un
ácido nucleico foráneo, pueden ser "introducidos" en una célula
huésped, tejido u organismo de acuerdo con técnicas conocidas, tales
como transformación, transfección usando DNA precipitado con fosfato
cálcico, electroporación, pistolas génicas, transfección con un
virus recombinante o fagómido, infección con una partícula viral
inefectiva, inyección en tejidos o microinyección del DNA en células
o similares. Los dos huéspedes procarióticos y eucarióticos pueden
ser empleados, los cuales pueden incluir bacterias, levaduras,
plantas y animales, incluyendo células humanas.
Un vector "soporta la expresión de las
secuencias codificantes contenidas por el vector" cuando sirve
como vehículo para la introducción de un gen en una célula huésped,
cuando las secuencias presentes en el vector permiten al vector y
las regiones codificantes que contiene replicarse y ser mantenidas
en una célula sin ser degradados, y cuando las secuencias presentes
en el vector permiten a las secuencias codificantes a ser
transcritas, recombinadas, o integradas en el genoma de la célula
huésped.
Una vez un gen estructural cDNA o marco de
lectura abierto dado, se ha introducido en el huésped apropiado, el
huésped puede crecer para expresar dicho gen estructural, cDNA o
marco de lectura abierto. Donde el ácido nucleico exógeno se expresa
en un huésped que no reconoce las regiones regulatorias donde tienen
lugar naturalmente la transcripción y la traducción de los ácidos
nucleicos, una variedad de regiones regulatorias transcripcionales
pueden ser insertadas corriente arriba y corriente debajo de la
región codificante, algunas de las cuales son externadamente
inducibles. Las regiones regulatorias trasncripcionales ilustrativas
o promotores para el uso en bacterias incluyen el promotor
\beta-gal, promotores lambda derecha e izquierda,
promotores trp y lac, promotor de la función
trp-lac, y también el promotor del bacteriófago
lambda P_{L} junto con el operador del bacteriófago lambda O_{L}
y el represor sensible a temperatura CI857, por ejemplo, para
proporcionar la expresión sensible a temperatura de un gen
estructural. La regulación del promotor se consigue a través de la
interacción entre el represor y el operador. Para el uso en la
levadura, las regiones o promotores regulatorios transcripcionales
ilustrativos incluyen promotores de enzimas glicolíticos, tales como
promotores ADH-I y -II, el promotor GPK, y el
promotor PGI, el promotor TRP, etc.; para el uso en células de
mamíferos, elementos de control transcripcional incluyen promotores
SV40 tempranos y tardíos , promotores tardíos mayores de adenovirus,
etc.; Otras secuencias regulatorias útiles en células eucariotas
pueden incluir, por ejemplo, la secuencia potenciadora de
citomegalovirus, que se puede fusionar a una secuencia promotora tal
como el promotor SV40 para formar un promotor quimérico, o puede ser
insertada en otro lugar en el vehículo de expresión, preferiblemente
cerca de las proximidades de secuencia promotora. Donde el promotor
es inducible, se pueden emplear condiciones permisivas (por ejemplo,
cambio de temperatura, consumición, o exceso de un producto
metabólico o nutriente, o similares).
Cuando se desee, la expresión de los genes
estructurales puede ser amplificada por ejemplo, ligando en tándem
un ácido nucleico para un marcador genético amplificable dominante
5' ó 3' al gen estructural y el crecimiento de las células huésped
bajo condiciones selectivas. Un ejemplo de un ácido nucleico
amplificable es el gen para la dihidrofolato reductasa, la expresión
del cual puede ser incrementada en células que presentan resistencia
al metotrexato, un antagonista del folato.
Los vehículos de expresión usados o
proporcionados aquí puede ser incluidos en un sistema de replicación
para el mantenimiento episomal en un huésped celular apropiado,
pueden ser proporcionados sin un sistema de replicación, o pueden
pasar a integrarse en el genoma huésped.
Mientras se contempla una amplia variedad de
células huésped, ciertas realizaciones requieren que la célula
huésped exprese las secuencias E1 que no están o están inactivados
en el vector. Mientras la línea celular humana 293 es la célula
huésped preferida, la invención también contempla otras líneas
celulares capaces de complementar el vector que tiene una deleción
en E1. "Complementar" o "complementado por" denota que la
línea de células huésped codifica y /o expresa funciones que son
necesarias para generar partículas viables que desaparecen del
vector o han sido inactivadas en el vector.
Es importante reconocer que la presente invención
no se limita al uso de tales células como se usan aquí. Pueden
usarse células de diferentes especies (humanos, ratones, etc.) o
diferentes tejidos (epitelio de mama, colon, tejido neuronal,
linfocitos, etc.).
"Modificación" de un ácido nucleico incluye
todas las alteraciones moleculares de una secuencia de ácidos
nucleicos que cambian su capacidad de realizar una función indicada,
incluyendo específicamente deleciones, inserciones, modificaciones
químicas, y similares. Las inserciones y deleciones se pueden hacer
de varias maneras conocidas por aquellos entendidos en la materia,
incluyendo el corte enzimático de la secuencia completa seguido de
la modificación y ligación de fragmentos concretos, o mutagénesis de
sitio dirigida, especialmente por mutagénesis
"loop-out" del tipo descrito por Kramer et
al., 1984, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456.
"Fragmento" se refiere a un ácido nucleico
aislado derivado de una secuencia de referencia por escisión o
deleción de uno o más nucléotidos a cualquier posición de la
secuencia de referencia usando técnicas recombinantes conocidas, o
insertando un nucleótido predeterminado o secuencia de nucleótidos
en cualquier posición predeterminada en la secuencia de referencia
usando técnicas recombinantes conocidas, o sustituyendo un
nucleótido predeterminado o secuencia de nucleótidos para un
nucleótido determinado o secuencia de nucleótidos en la secuencia de
referencia usando técnicas recombinantes conocidas. No se pretende
que la invención se limite al uso de las secuencias de ácidos
nucleicos de cualquier especie o género particular, sino que esta
invención se puede llevar a cabo usando ácidos nucleicos de una
variedad de fuentes. Se contempla que cualquier ácido nucleico de
alguna fuente pueda ser insertado en el vector, con o sin elementos
de control.
"Terapia génica" comprende la corrección de
defectos genéticos así como la distribución y expresión de ácidos
nucleicos en un tratamiento de término corto de una enfermedad o
condición patológica.
Referente a tampones particulares, el medio,
reactivos, células, condiciones de cultivo y similares, o a algunas
subclases de los mismos, no pretenden ser limitantes, sino que
deberían mostrarse para incluir todos los materiales relacionados
que un entendido en la materia reconocería como de interés o valor
en el contexto particular en que se presenta la discusión. Por
ejemplo, con frecuencia es posible sustituir un sistema tampón o
medio de cultivo por otro, etc., tal que una manera diferente pero
conocida se usa para conseguir los mismos objetivos que aquéllos a
los que se dirige el uso de un método sugerido, material o
composición.
La presente invención no se limita al uso de
todos los descubrimientos descritos o realizaciones explícitamente
descritas aquí. Aunque de hecho se puede preferir la combinación de
ellos, no es necesario para la invención que todos los aspectos se
usen simultáneamente.
Los ácidos nucleicos aislados de esta invención
se pueden usar para generar polipéptidos modificados, cada uno
teniendo al menos una característica del polipéptido nativo. Estos
incluyen subfragmentos, mutantes por eliminación, mutantes
procesados, o mutantes por sustitución, polipéptidos que tienen la
misma estructura secundaria como la región de unión del polipéptido
nativo, y combinaciones de los mismos. Tales péptidos modificados
pueden llevar la funcionalidad del péptido de "tipo salvaje", o
pueden tener una funcionalidad modificada o externamente regulable.
Tales polipéptidos modificados pueden tener utilidad considerable en
la presente invención, como serían apreciados por aquellos
entendidos en la materia.
"Tipo salvaje", mutantes, y polipéptidos
análogos y composiciones de los mismos se pueden usar para hacer
anticuerpos, que puede encontrar uso en resultados de análisis de
los ensayos descritos como parte de esta invención. Los anticuerpos
pueden ser preparados de maneras convencionales, usando el
polipéptido sujeto como un inmunógeno e inyectando el polipéptido en
un huésped mamífero, p.ej., ratón, vaca, cabra, oveja, conejo, etc.,
particularmente con un adyuvante, p.ej., adyuvante de Freund
completo, gel de hidróxido de aluminio, o similares. El huésped
entonces puede sangrarse y la sangre puede emplearse para el
aislamiento de anticuerpos policlonales, o los linfocitos de sangre
periférica (células B) se pueden fusionar con una célula apropiada
de mieloma para producir anticuerpos específicos para los compuestos
sujetos.
Todas las publicaciones mencionadas aquí se
incorporan por referencia.
Los enzimas usados para las manipulaciones de DNA
recombinante fueron comprados a Boehringer-Mannheim,
Inc. (Laval, Quebec, Canada), New England Biolabs (Beverly, MA) o
Bethesda Research Laboratories (Burlington, Ontario, Canada) y se
usaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Los
plásmidos se construyeron usando protocolos estándares. Sambrook,
J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, MOLECULAR CLONING: A
LABORATORY MANUAL, 2^{nd} Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y. Se usó electroporación para transformar la cepa
DH5 de E. coli (supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96
thi-1 relAl) con plásmidos nuevamente construidos.
Dower, W. J., J. F. Miller, y C. W. Ragsdale, 1988, High efficiency
transformation of E. coli by high voltage electroporation,
Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145. El DNA
plasmídico se preparó por el método de la lisis alcalina y se
purificó por centrifugación de gradiente de densidad de bromuro de
etidio-CsCl. Birnboim, H.C., y J. Doly, 1978, A
rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant
plasmid DNA, Nucleic Acids Res. 7:
1513-1523.
Los medios de cultivo celulares y los reactivos
se obtuvieron de los laboratorios GIBCO (Gran Island, NY). Se
titularon los vectores de adenovirus (Ad) y se introdujeron en
células 293 que constitutivamente expresan el 11% izquierdo del
genoma de Ad5, comprendiendo la región E1. Graham, F.L., J. Smiley,
W.C. Russell, y R. Nairn, 1977, Characteristics of a human cell line
transformed by DNA from human adenovirus type 5, J. Gen.
Virol. 36:59-72. Las células 293 fueron
cultivadas en monocapa en medio esencial mínimo F-11
complementado con 100 unidades de penicilina/ml, 100 \mug de
estreptomicina/ml, 2,5 \mug de amfotericina/ml y con suero bovino
de recién nacido 10% para el mantenimiento celular o suero de
caballo al 5% para la infección viral. Las células KB que crecieron
en cultivo Spinner se mantuvieron en medio modificado de Joklik
complementado con antibióticos como anteriormente y con suero de
caballo al 10%.
Las curvas de crecimiento de un paso de células
KB crecieron hasta una densidad de 2x10^{5} células/ml, se
centrifugaron y se resuspendieron en 1/10 parte del volumen del
medio original y se añadió virus (20 PFU/célula) y se dejó adsorber
durante 1h a 37ºC con agitación. Las células volvieron al volumen
original usando medio 50% fresco y 50% original. A varios tiempos de
post-infección se tomaron alícuotas de 4 ml, se
añadieron 0,5 ml de glicerol y las muestras se guardaron a -70ºC
para ensayos de virus infecciosos por titulación de placa.
Los virus recombinantes se aislaron por
cotransfección con células 293 con los plásmidos adecuados. Graham,
F.L., y A.J. Van der Eb, 1973, A new technique for the assay of
infectivity of human adenovirus 5 DNA, Virol., 52:
456-467. Tras 8-10 días las placas
fueron aisladas, se expandieron y el DNA viral se analizó por
digestión de enzimas de restricción como se ha descrito
anteriormente. Graham, F.L. y L. Prevec, 1991, Manipulation of
Adenovirus Vectors, en E.J. Murry (ed.) METHODS IN MOLECULAR
BIOLOGY, Vol. 7: GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS, The Humana
Press Inc., Clifton, N.J., p. 109-128. Los virus
candidatos fueron purificados una vez por placa, y para los estudios
de estabilidad, los vectores fueron pasados empezando con medios de
células infectadas para análisis de DNA viral tras la primera
purificación de placas. Las monocapas semiconfluentes de células 293
en discos de 60mm se infectaron con 0,5 ml de medio de cada pasaje
previo (aproximadamente 40 PFU/célula), se dejó que el virus
adsorbiera durante media hora y luego se reemplazó el medio. Las
células y el medio se cultivaron cuando el efecto citopático se
completó, normalmente a los 2-3 días posteriores a
la infección.
Las monocapas semiconfluentes de células 293 en
discos de 60 mm se infectaron con virus de pasajes para analizarlas
y a las 24 h de la infección se eliminó el medio y se reemplazó con
1 ml de medio 199 libre de fosfato que contenía suero de caballo al
5% y 25 nCi/ml de ácido ^{32}P-ortofosfórico
(adquirido de DuPont de Nemours & Co. Inc., Wilmington, DE).
Tras incubar las células infectadas durante 6 h más, se cultivaron
las células y se extrajo el DNA. El DNA viral se digirió entonces
con enzimas de restricción adecuados. Luego se hizo una
electroforesis a través de geles de agarosa al 1% y se secó los
geles. Las bandas de DNA se visualizaron por autoradiografía.
Los adenovirus portan una secuencia que actúa en
cis en la región E1 que es esencial para la encapsidación de las
moléculas de DNA viral. Cuando esta señal que actúa en cis,
localizada entre 194 y 358pb en Ad5, es borrada, los genomas virales
no pueden empaquetarse, pero todavía se esperaría que replicaran su
DNA en las células transfectadas. Esto, el hecho de que el DNA Ad
pueda circularizarse en las células infectadas y que la
cotransfección a células mamíferas de dos plásmidos con secuencias
que se solapen pueda generar un virus infeccioso con una buena
eficacia, nos llevó a pensar la estrategia que se define a
continuación.
El primer paso relacionado con la construcción de
Ad5PaCI, un virus que contiene el genoma Ad5 entero con la
eliminación de las secuencias E3 desde 28133 a 30818pb. Ad5PaCI fue
fabricado por cotransfección de células 293 con dos plásmidos:
pFG173; y pAB14PaCI, un pAB14 modificado (Bett, A..J., L. Prevec, y
Gram., F.L., 1993, J. Virol. 67: 5911-5921),
donde el sitio de unión PaCI está sustituido en el lugar de 2,69 kb
de E3. (Fig. 1A). Luego, el DNA viral purificado de Ad5PaCI se
digirió con CLAI y XbaI y se cotransfectó en células 293 con otro
plásmido, pWH3 (Bautista, D.S., y Gram., F.L., 1989, Gene 82:
201-208), para proporcionar el virus AdBHG (Fig.
1B). pWH3 es un plásmido que contiene secuencias Ad5 del extremo
izquierdo, con una inserción del plásmido pBR322 modificado en pb
1339, diseñada de forma que las señales de empaquetamiento puedan
eliminarse en una fase posterior.
El siguiente paso comprendía la generación de un
plásmido bacteriano que contenga el genoma de AdBHG entero y la
subsiguiente identificación de clones infecciosos. Se infectó
células de riñón de cría de ratón (BRK) con AdBHG bajo condiciones
antes indicadas para tener como resultado la generación de genomas
Ad5 circulares. Graham. F.L., 1984, EMBO J. 3:
2917-2922; Ruben, M. Bacchetti, S. y Gram., F.L.,
1983, Nature 301: 172-174. A las 48 horas
después de la infección, se extrajo el DNA a partir de células de
RCR infectadas y se usó para transformar la cepa de E. coli
HMS 174 para dotarlas de resistencia a la ampicilina (Ap^{r}) y a
la tetraciclina (Tet^{r}). A partir de dos experimentos se obtuvo
un total de 104 colonias. Las preparaciones de plásmido a pequeña
escala se cribaron por digestión con HindII y BamHI/SmaI y
electroforesis de gel. Los resultados del análisis de restricción
revelaron que los plásmidos diferían en la cantidad de genoma viral
que contenían. Se cree que esto era debido, por lo menos en parte, a
la formación de un palíndromo de 206 pb cuando las repeticiones
terminales invertidas (ITR) del genoma Ad5 se unen cabeza con cola
(la unión).
A partir de los análisis de restricción se
seleccionó cuatro candidatos de plásmido que parecieron tener un
genoma AdBHG completo con las regiones de unión intactas. Los cuatro
plásmidos resultaron infecciosos en ensayos de infecciosidad en los
que se transfectó células 293 con 5 ó 10 \mug de DNA plásmido (los
datos no se muestran).
Las uniones ITR en cada clon infeccioso se
secuenciaron y analizaron. El número de nucleótidos que faltan del
punto medio del palíndromo en cada clon varió desde tan poco como
4pb (1 pb de la RTI derecha y 3 pb de la izquierda) hasta tanto como
19 pb (1 pb de la RTI derecha y 18 pb de la izquierda). Para el
trabajo posterior escogimos los clones que carecían de 19pb de la
unión y les llamamos pBHG9.
El pBHG10 se generó eliminando las señales de
empaquetamiento en pBHG9. Esto se consiguió por digestión parcial y
religación de BamHI (Fig. 1B). El cribado para pBHG10 se facilitó
por el hecho de que la eliminación de las señales de empaquetamiento
también daba como resultado la eliminación del gen Tet^{r}.
El pBHG10 contiene secuencias de DNA Ad5 de pb 19
(final genómico izquierdo) a pb 188; pb 1339 a 28133; y pb 3818 a
35934 (final genómico derecho). Las terminaciones izquierda y
derecha de los genomas Ad5 están unidas covalentemente. Un segmeno
del plásmido pBR322, que representa los nucleótidos
375-1/4361-2064 del genoma pBR322,
que incluye el origen pBR322 de replicación y el gen de resistencia
a la ampicilina pBR322, está presente entre pb 188 y 1339 de Ad5
para permitir la propagación de pBHG10 en células huésped como E.
coli. Un sitio del enzima de restricción PacI, único en este
plásmido, está presente entre pb 28133 y 30818 de Ad5 para permitir
la inserción de genes externos. Puesto que la señal de
empaquetamiento se borra, el pBHG10 por sí mismo no proporciona
partículas virales infecciosas. Las
co-transfecciones de pBHG10 con plásmidos
"ayudantes" que contienen las secuencias de la terminación
izquierda de Ad5, incluyendo la señal de empaquetamiento,
proporciona mediante la recombinación en la célula huésped, vectores
virales infecciosos con una eficacia comparable a la obtenida usando
pJM17^{1}.
Puesto que para algunas aplicaciones puede
resultar deseable generar vectores Ad con secuencias E3 de Ad5
salvajes, se reintrodujo secuencias E3 salvajes en pBHG10 (Fig. 2).
El primer paso incluía la construcción de un plásmido que portara
secuencias E3 flanqueando un gen para la resistencia a kanamicina
(Kn^{r}) para simplificar la inserción en un pBHG10. El plásmido
Ap^{r} pFG23 (McKinnon, R.D., Bacchetti, S. y Gram., F.L., 1982,
Gene 19:33-42) fue digerido con XbaI, que
corta en la posición 28592 en las secuencias Ad5 (no existe rotura
en 30470 pb debida a una metilación Dam en la cepa de E. coli
utilizada) y se ligó a pKN30 digerido por XbaI (Lee, F., 1982, PH.D.
Thesis, McMaster University, Hamilton, Notario, Canada), generando
pFG23AK (Ap^{r} y Kn^{r}) (Fig. 2ª). Para eliminar las
secuencias y el gen Ap^{r}, se digirió con AflII y se ligó,
generando pFG23K.
El siguiente paso comprendía la inserción de las
secuencias E3 de nuevo en pBHG10 en la correcta orientación (Fig.
2B). El pBHG10 fue digerido con SpeI, que corta sólo en 75,4 mu en
las secuencias Ad5, y se ligó con pFG23K que había sido linealizado
con SpeI, generando pBHG10A, que ahora contiene la secuencia E3
salvaje deseada en tándem con la región E3 previa que contiene la
eliminación de 2,69kb. Para eliminar secuencias repetidas, se
digirió parcialmente el pBHG10A con NdeI y se religó, generando
pBHG10B. En el paso final, el segmento Kn^{r} fue eliminado de
pBHG10B por una digestión parcial con XbaI y se religó, generando
pBHGE3. Excepto por la presencia de una región E3 salvaje, el pBHGE3
es idéntico a pBHG10, y es igualmente eficiente para la generación
de vectores Ad con sustitución de E1 por cotransfección.
Nuestro análisis de las secuencias en la región
E3 de Ad5 nos llevó a creer que podía ser posible expandir la
eliminación de 2,69 kb presente en pBHG10 a 3,13kb. Utilizando la
técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y siguiendo
una estrategia muy parecida a la descrita anteriormente para la
construcción de pBHGE3 (Fig. 2), creamos una extracción de E3 3,13
kb y la introdujimos en pBHG10. El plásmido resultante pBHG11 es
idéntico a pBHG10 excepto por el trozo eliminado E3 expandido que
suprime las secuencias de 27865 a 30995 pb. Igual que el pBHG10, el
pBHG11 contiene un sitio de la enzima de restricción PacI en lugar
de las secuencias E3 eliminadas para permitir la inserción de genes
externos.
Se diseñaron los plásmidos pBHG10, pBHG11 y
pBHGE3 de forma que comprendieran todas las secuencias Ad5
esenciales necesarias para producir virus infecciosos tras la
transfección de células 293 excepto por la señal de empaquetamiento
(194-358 pb) necesaria para encapsidar el DNA viral
en partículas virales. Para generar vectores virales infecciosos
pBHG10, pBHG11, pBHGE3 o derivados que porten una inserción en E3
deben cotransfectarse en células 293 con un segundo plásmido que
contenga secuencias virales de terminación izquierda (E1) incluyendo
la señal de empaquetamiento, como se ilustra en la Figura 3. Para
maximizar la capacidad del sistema de vector BHG necesitábamos un
plásmido con la mayor eliminación de E1 posible para
cotransfecciones con los plásmidos
BHG.
BHG.
Nuestro análisis de las secuencias E1 reveló que
la eliminación de aproximadamente 3,2kb podía crearse suprimiendo
las secuencias entre un sitio Ssp I en 339pb y un sitio Afl II en
3533 pb (Fig. 4). Esta eliminación no interfiere con la ITR
(1-103 pb), la señal de empaquetamiento del núcleo
esencial (194-358 pb) o las secuencias codificadoras
para proteína Ix, pero sí elimina el sitio de unión sp1
(3525-3530 pb) del promotor de la proteína IX.
Mientras que esta eliminación E1 de 3,2kb no interfiere con la
región potenciadota de E1, no elimina el elemento de empaquetamiento
más cercano al 3' terminal. La eliminación de este elemento tiene
poco efecto o nulo sobre el empaquetamiento.
\newpage
Puesto que el sitio de unión sp1 se cree que es
esencial para la expresión de la proteína IX, (Babiss, L.E. y Vales,
L.D., 1991, J. Virol. 65:598-605) se
reintrodujo como un oligonucleótido sintético que posicionó el sitio
sp1 1pb más cerca del TATA box de la proteína IX (Fig. 4).
Para evaluar el efecto de la eliminación de 3,2kb
y la reintroducción del sitio de unión sp1, se examinó la expresión
de la proteína IX por inmunoprecipitación. Se infectaron células 293
a 10PFU/célula con virus que contenían o bien ninguna eliminación en
E1 (Ad5 salvaje), o una eliminación de 2,3kb extendiéndose dentro
del gen de la proteína IX (d1313), o la eliminación de 3,2kb
descrita anteriormente (d170-3), o la eliminación de
3,2kb que contiene el HCMV (AdHCMV2), o los promotores de
\beta-actina (Ad\betaAct2) en la orientación
antiparalela de E1, o la eliminación de 3,2kb que contiene el HCMV
(AdHCMVsp1), o los promotores de \beta-Actina
(Ad\betaActsp1) con el sitio de unión sp1 reintroducido. Tras ser
etiquetados todos los extractos celulares con
[^{35}S]-metionina, se cultivaron, se
inmunoprecipitaron las muestras con anticuerpos de proteína IX Ad2 y
se hizo pasar por un gel PAGE SDS 12%. Los resultados (Fig. 5)
indican que los niveles variables de proteína IX se expresaron en
función de las secuencias corriente arriba del gen de la proteína IX
pero con el sitio sp1 presente se produjo una reducción de a lo sumo
25% en comparación con Ad5 salvaje.
Como se sabe que la proteína IX afecta la
estabilidad al calor de las partículas virales, examinamos la
estabilidad al calor de Ad5 salvaje en comparación con d1313,
dl70-3, AdHCMV2, Ad\betaAct2, AdHCMVsp1 y
Ad\betaActsp1. Se titularon ciertas cantidades de estos virus
antes y después de una incubación a 45ºC durante 1 y 2 horas. De los
seis mutantes virales estudiados, sólo d1313 difería
significativamente en estabilidad al calor respecto al salvaje (Fig.
6). Incluso Ad\betaAct2, que produce sólo el 16% de los niveles
salvajes de proteína IX (Fig. 5) fue tan resistente a la
inactivación por calor como el virus salvaje. Esto indica que la
proteína IX es posiblemente fabricada en exceso durante la infección
vírica. También se observó que los virus que contenían la
eliminación de E1 3,2kb se replicaron en células 293 hasta las
mismas titulaciones finales que los Ad5 salvajes (datos no
mostrados).
Con la verificación de que las características de
crecimiento y estabilidad de los virus no se vieron afectadas con la
eliminación de E1 3,2kb, se decidió incorporar esta eliminación en
los plásmidos p\DeltaE1sp1A y p\DeltaE1sp1B para usarlos en
cotransfecciones con los plásmidos BHG (Fig. 4). Estos plásmidos
contienen varios sitios de restricción para facilitar la inserción
de genes externos.
La invención también incluye un vector que
comprende un fragmento o fragmentos de plásmido pBR322 que cuenta
tanto con resistencia a la ampicilina y el origen de replicación
pBR322 (que permite que dicho vector sea replicado en células donde
el pBR322 es capaz de ser replicado), y una inserción entre la
región 4 (E4) temprana y la repetición de la terminación invertida
derecha, y una eliminación de secuencias E1 de la posición 188 a o
cerca de la secuencia AflII en la posición 3533, y sitios de
clonación para la inserción de un ácido nucleico externo.
Para evaluar la capacidad de los plásmidos BHG
para generar vectores virales infecciosos, se realizó
cotransfecciones con varios plásmidos de terminación izquierda y se
encontró que la eficiencia del rescate era comparable a la obtenida
con pJM17 (no se muestran los datos).
El uso de pBHGE3, pBHG10 ó pBHG11 combinados con
la eliminación de 3,2 kb en E1 debería permitir rescatar los
insertos de aproximadamente 5,2, 7,9 y 8,3 kb respectivamente en
vectores virales. Para estudiar la capacidad del sistema BHG
construimos un inserto de 7,8 kb que consiste en el gen lacZ
dirigido por el promotor temprano-inmediato del
citomegalovirus humano y el gen gB de virus herpes simplex de tipo 1
(HSV-1) dirigido por el promotor SV40 en la
eliminación E1 de 3,2 kb (Fig. 7). Después de la cotransfección de
discos de 20-60 mm de células 293, 10 con 5 \mug
de pBHG10 y de pHlacZgBR y la otra mitad con 10 \mug de cada uno,
se obtuvo una placa. Ésta se aisló, expandió y analizó por
restricción con HindIII y se encontró que seguía el patrón de
restricción esperado. Se vio que el AdHlacZgBR designado aislado
expresaba tanto lacZ como HSV-1 gB a niveles
comparables a los obtenidos con vectores que contenían insertos
individuales de estos genes (no se muestran los datos).
Un vector lanzadera, pABS.4, se usó en la
construcción de un doble recombinante que contenía lacZ en la
eliminación de E3 y luciferasa de luciérnaga en la eliminación E1.
La construcción de este vector además ilustra el uso de los vectores
lanzadera así como los dobles recombinantes.
La estrategia para la construcción de este vector
se presenta en la Fig. 8. Primero se insertó el gen lacZ con la
señal poli A SV40 entre los sitios SalI y XvaI en la región de
clonación de pABS.4, generando pABSLacZ. Fig. 8A. En el siguiente
paso se digirió pABSLacZ con PacI y BstBI generando un fragmento que
contenía el gen LacZ y el gen de resistencia a la kanamicina
(Kan^{r}). Este fragmento se insertó luego entre los sitios PacI y
BstBI de pAdBHG.28, en la orientación paralela E3, generando
pAdBHGLacZK. Puesto que se usó doble selección antibiótica, el
cribado para el plásmido deseado que contiene el inserto LacZ era
trivial. Finalmente se digirió el pAdBHGLacZK en SwaI para eliminar
el gen Kan^{1} generando pAdBHGLacZ. Los pAdBHGLacZ se cultivan y
se usan para cotransfecciones con pCA15, un plásmido que contiene
secuencias de terminación izquierda Ad5 con luciferasa de luciérnaga
bajo el control del promotor del gen
inmediato-temprano de citomegalovirus humano (HCMV)
en lugar de la mayoría de E1. Fig. 8B. Los pAdBHGLacZ pueden usarse
en cotransfecciones con virtualmente cualquier construcción derivada
de E1 para fabricar vectores con una variedad de combinaciones de
lacZ en E3 e insertos de genes exteriores o mutaciones en E1.
Desarrollamos vectores lanzadera pABS.6, pABS.7 y
pABS.9 para simplificar la introducción de insertos en la supresión
de E3 en plásmidos pAdBHG. Fig. 9. Se usan para facilitar la
transferencia de genes exteriores en el conjunto pAdBHG de plásmidos
de la siguiente manera: las secuencias de genes se insertan en o
bien pABS.7 ó pABS.9 usando los sitios de clonación SphI, PstI,
SalI, BamHI, CPU, SacI, o EcoRI. El plásmido lanzadera es entonces
cortado con una o dos combinaciones de XvaI, PacI o BstBI y el
fragmento que contiene Kan se inserta en el plásmido pAdBHG
Amp^{r} usando la doble resistencia Amp+Kan para seleccionar los
transformantes bacterianos que llevan el plásmido deseado.
Posteriormente, el gen Kan^{r} se elimina por digestión con ClaI o
SwaI y ligación. Finamente el plásmido es "rescatado" en
vectores virales Ad infecciosos por cotransfección de células 293
con un plásmido adecuado que contenga secuencias E1.
Se han fabricado varios plásmidos lanzadera que
pueden usarse para cotransfecciones con vectores del conjunto pGBH.
Un plásmido lanzadera E1 que tenga una señal de empaquetamiento
insertada entre la región 4 temprana (E4) y la repetición terminal
invertida (RTI) derecha es específicamente parte de la materia
objeto de la presente
invención.
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Plásmido | Secuencia | Eliminación | Sitios de clonación |
| reguladora | neta | ||
| PXCJL1 | - - - - - | 2,88 kb | X-B-Xh-S-C |
| PXCJL2 | - - - - - | 2,88 kb | C-S-Xh-B-X |
| P\DeltaE1sp1A | - - - - - | 3,19 kb | C-B-Xh-X-EV-E-H-S-Bg |
| p\DeltaE1sp1B | - - - - - | 3,19 kb | C-S-H-E-EV-X-Xh-B-Bg |
| pHCMVsp1A | HCMV (L) | 2,81 kb | C-B-Xh-X-EV-E-H-S |
| pHCMVsp1B | HCMV (L) | 2,81 kb | C-S-H-E-EV-X-Xh-B |
| pHCMVsp1C | HCMV(L)/SV40pA | 2,66 kb | C-B-Xh-X-EV-E-H-S |
| pHCMVsp1D | HCMV(L)/SV40pA | 2,66 kb | C-S-H-E-EV-X-Xh-B |
| pCA3 | HCMV(L)/SV40pA | 2,66 kb | B-Xh-X-EV-E-H-S |
| pCA4 | HCMV(L)/SV40pA | 2,66 kb | S-H-E-EV-X-Xh-B |
| pCA13 | HCMV(L)/SV40pA | 2,66 kb | S-H-E-EV-X-Xh-B |
| pCA14 | HCMV(L)/SV40pA | 2.66 kb | B-Xh-X-EV-E-H-S |
| pBActsp1A | \betaActina(L) | 1,74 kb | C-B-X-EV-E-H-S |
| pBActsp1B | \betaActina(L) | 1,74 kb | C-S-H-E-EV-X-B |
| pCA1 | \betaActina(L)/SV40pA | 1,58 kb | S-H-E-EV-X-B |
| pCA2 | \betaActina(L)/SV40pA | 1,58 kb | B-X-EV-E-H-S |
| pMLPsp1A | MLP(R) | 2,23 kb | B-X-EV-E-H-S-Bg |
| X: XbaI, B: BamHI, Xh: XhOI, S: SalI, C: ClaI, EV: EcoRV, E: EcoRI, H: HindIII, Bg: Bg1II |
\newpage
Los métodos experimentales descritos hasta ahora
no tienen carácter limitante. Aquéllos expertos en la materia
apreciarán que puede usarse una gran variedad de métodos para
introducir vectores en las células de tejidos diana (por ejemplo,
los tumores de hígado pueden tratarse inoculando el hígado afectado
por la vena porta con vectores del tipo descrito y/o reivindicados
aquí y con las solicitudes progenitoras). Además, la invención
contempla el uso de vectores que contienen ácidos nucleicos externos
que codifican para moléculas que pueden ser útiles para tratar
enfermedades como RNA antisentido, factores de crecimiento tisular
como GM-CSF, moléculas que inician la
diferenciación, moléculas que inducen la apoptosis, etc. Finalmente,
una persona experta en la materia apreciará que los métodos de esta
invención pueden usarse para tratar otros animales diferentes a
ratones y humanos.
Claims (32)
1. Un sistema de vectores que comprende:
- (a)
- un primer plásmido con genoma de adenovirus modificado que contiene
- (i)
- una modificación dentro de la región temprana 1 (E1) de dicho genoma que elimina la señal de empaquetamiento en dicho genoma;
- y
- (ii)
- un fragmento o fragmentos de plásmido bacteriano que codifica para una resistencia antibiótica e incluye el origen de replicación del plásmido y otras secuencias necesarias para permitir que el vector sea replicado en células donde el plásmido bacteriano es capaz de ser replicado;
- y
- (b)
- un segundo plásmido que sirve como plásmido lanzadera E1, que comprende:
- (i)
- un fragmento o fragmentos de plásmido bacteriano que codifica para la resistencia antibiótica e incluye el origen de replicación del plásmido y otras secuencias necesarias para permitir que el vector sea replicado en células donde el plásmido bacteriano es capaz de ser replicado
- y
- (ii)
- una secuencia derivada de una región E1 Ad
- (c)
- donde dicho primer y segundo plásmido son capaces de recombinar para producir un genoma de adenovirus modificado recombinante capaz de ser empaquetado en partículas virales.
2. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde el segundo plásmido además comprende un ácido nucleico
exterior empalmado dentro de dicha secuencia derivada de una región
E1 Ad y donde dicho genoma de adenovirus modificado recombinante
producido por recombinación de dichos primer y segundo plásmido
contiene dicho ácido nucleico exterior.
3. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde el genoma de adenovirus modificado del primer plásmido
derivado del genoma de adenovirus 5 (Ad5).
4. El sistema de vectores de la reivindicación 1,
donde dicha modificación en E1 es una eliminación que comprende la
región E1A.
5. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde la modificación en E1 es una eliminación que incluye los
nucleótidos 188 a 1339.
6. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde la modificación en E1 es una eliminación que incluye los
nucleótidos 188 y el sitio Af1II en la posición 3533.
7. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde un sitio sp1 en la posición 3525 que se eliminó dicho primer
plásmido se reintroduce en el segundo plásmido insertando un
oligonucleótido sintético que incluye un sitio sp1.
8. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde dicho primer plásmido además comprende la eliminación dentro
de la región temprana 3 (E3), donde dicha eliminación E3 no inhibe
la expresión de secuencias necesaria para la replicación viral, el
empaquetamiento, la viabilidad o la infecciosidad.
9. El sistema de vectores de la reivindicación 8
donde la eliminación E3 incluye las posiciones
27865-30995 del genoma Ad5.
10. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde dicho primer plásmido adicionalmente comprende un fragmento o
fragmentos de plásmido bacteriano pBR322 que codifica para una
resistencia a ampicilina, y también un origen de replicación pBR322
que capacita al primer plásmido para ser replicado en células donde
el pBR322 es capaz de ser replicado.
11. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde dicho fragmento o fragmentos de plásmido de acuerdo con la
reivindicación 1(a)(ii) se inserta en la localización
señalada del grupo de localizaciones compuesto por: una
localización entre la región temprana 4 (E4) y la repetición
terminal invertida (RTI) derecha; una localización dentro de la
región temprana 4; y una localización donde las secuencias
incluidas en E4 son eliminadas y sustituidas con dicho fragmento o
fragmentos de plásmido.
12. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde dicho primer plásmido comprende además sitios de clonación
para la inserción de una secuencia de ácido nucleico.
13. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde dicho primer plásmido comprende un fragmento o fragmentos de
plásmido bacteriano pBR322 que codifica para una resistencia a la
ampicilina y también un origen de replicación pBR322 que capacita
al vector para ser replicado en células donde pBR322 es capaz de
ser replicado, donde dicho vector es además modificado para contener
un inserto entre la región temprana 4 (E4) y la repetición terminal
invertida derecha, vector que además tiene la eliminación de
secuencias E1 de la posición 188 hasta la secuencia AfII en la
posición 3533 o cerca, donde dicho vector no tiene un sitio de
clonación par ala inserción de un ácido nucleico exterior.
14. Un plásmido que contiene secuencias de DNA
Ad5 de adenovirus de pb 19 (terminación genómica izquierda) a pb
188; pb 1339 a 28133 y pb 30818 a pb 35934 (terminación genómica
derecha) donde las terminaciones genómicas izquierda y derecha de
las secuencias Ad5 están unidas covalentemente. También contiene un
fragmento de plásmido pBR322 que compuesto por los nucleótidos
375-1/4361-2064 insertados entre pb
188 y pb 1339 de Ad5 y un sitio de restricción PacI
localizado entre pb 28133 y pb 30818 de Ad5.
15. Un plásmido que contiene secuencias de DNA
Ad5 de adenovirus de pb 19 (terminación genómica izquierda) a pb
188; pb 1339 a 28133 y pb 30818 a pb 35934 (terminación genómica
derecha) donde las terminaciones genómicas izquierda y derecha de
las secuencias Ad5 están unidas covalentemente. También contiene un
fragmento de plásmido pBR322 compuesto por los nucleótidos
375-1/4361-2064 insertados entre pb
188 y pb 1339 de Ad5.
16. Un plásmido que contiene secuencias de DNA
Ad5 de adenovirus desde pb 19 (terminación genómica izquierda) a pb
188; pb 1339 a 27865; y de pb 30995 a pb 35934 (terminación
genómica derecha) donde las terminaciones genómicas izquierda y
derecha de las secuencias Ad5 están unidas covalentemente. También
contiene un fragmento de plásmido pBR322 compuesto por los
nucleótidos 375-1/4361-2064
insertados entre pb 188 y pb 1339 de Ad5 y un sitio de restricción
PacI localizado entre pb 27865 y pb 30995 deAd5.
17. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde el segundo plásmido es un plásmido lanzadera E1 que contiene
dicha secuencia derivada de la región E1 de Ad5, incluyendo una
señal de empaquetamiento.
18. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde un ácido nucleico externo que comprende un marco de
lectura abierto se inserta en dicho plásmido lanzadera E1.
19. El sistema de vectores de la reivindicación
18, donde las secuencias que regulan la expresión de dicho marco de
lectura abierto son además insertadas en dicho plásmido lanzadera
E1.
20. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde dicho plásmido lanzadera E1 comprende la eliminación de la
secuencia derivada de la región E1 para el fragmento de
aproximadamente 3,19kb entre el sitio SspI y 339 pb y un sitio
AflII a 3533pb. Dicho plásmido comprende además un sitio de unión
sp1 específico y sitios de clonación para la inserción de un ácido
nucleico externo dentro de la supresión de E1.
21. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde dicho plásmido lanzadera E1 comprende la eliminación de la
secuencia derivada de la región E1 y también comprende un promotor
HCMV localizado dentro de la supresión de E1 y los sitios de
clonación para la inserción de un ácido nucleico externo localizado
de forma adyacente a dicho promotor HCMV dentro de la eliminación
de E1.
22. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde dicho plásmido lanzadera E1 comprende la eliminación de la
secuencia derivada de la región E1 y también comprende un promotor
HCMV y una señal de poliadenilación SV40, ambos localizados dentro
de la eliminación de E1 y sitios de clonación para la inserción de
un ácido nucleico externo localizado entre el promotor HCMV y la
señal de poliadenilación Sv40.
23. El sistema de vectores de la reivindicación
17, donde dicho plásmido lanzadera E1 comprende una eliminación de
aproximadamente 2,88 kb en la secuencia derivada de la región E1 Ad5
y que además comprende sitios de clonación para la inserción de un
ácido nucleico externo localizado dentro de la eliminación de
E1.
24. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde dicho plásmido lanzadera de E1 comprende la eliminación en
la secuencia derivada de la región E1 de Ad5 y que además comprende
un promotor de \beta actina y una señal de poliadenilación SV40,
ambos localizados dentro de la eliminación de E1 y sitios de
clonación para la inserción de un ácido nucleico exterior localizado
entre el promotor de \beta actina y la señal de poliadenilación
SV40.
25. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde dicho plásmido lanzadera comprende una señal de
empaquetamiento insertada entre la región temprana 4 (E4) y la
repetición terminal invertida (ITR) derecha.
26. Un método in vitro para la
introducción y la expresión de un ácido nucleico externo en una
célula huésped, comprendiendo:
\newpage
- (a)
- introducción de:
- (i)
- un primer plásmido que incluye genoma de adenovirus modificado que comprende una modificación dentro de la región 1 temprana (E1) de dicho genoma que elimina la señal de empaquetamiento en dicho genoma;
- y
- (ii)
- un plásmido lanzadera que contiene una secuencia derivada de una región E1 Ad, incluyendo una señal de encapsidación y una secuencia de ácido nucleico insertada, en una célula huésped que expresa funciones codificadas por la secuencia E1 que han sido suprimidas del primer plásmido;
- (b)
- aislamiento de un genoma viral recombinante donde el primer plásmido ha sido recombinado con el plásmido lanzadera E1 para proporcionar un genoma viral modificado recombinante que contiene la señal de encapsidación y la secuencia de ácidos nucleicos insertada del plásmido lanzadera E1 y elementos del primer plásmido excluyendo las modificaciones dentro de E1,
- (c)
- introducción de dicho genoma viral modificado recombinante dentro de una célula huésped, y
- (d)
- expresión de las secuencias codificantes contenidas en dicho genoma viral recombinante modificado.
27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26
donde dicho primer plásmido comprende además un fragmento o
fragmentos de un plásmido bacteriano que codifica para una
resistencia antibiótica e incluye el origen de replicación del
plásmido y otras secuencias necesarias para permitir que el vector
sea replicado en las células donde le plásmido es capaz de ser
replicado.
28. Un método de acuerdo con la reivindicación 26
ó la reivindicación 27 donde en dicho plásmido lanzadera E1 se
inserta también una secuencia de ácidos nucleicos que contiene un
marco de lectura abierto.
29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28
donde dentro de dicho plásmido lanzadera se inserta además
secuencias que regulan la expresión de dicho marco de lectura
abierto.
30. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 26 a la 29, donde dicho genoma viral
recombinante se empaqueta en una partícula viral recombinante que es
capaz de infectar células que pueden ser infectadas por el
adenovirus del que deriva originariamente el genoma de adenovirus
modificado.
31. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 26 a la 30 donde dicho genoma de adenovirus
modificado deriva originariamente del adenovirus 5.
32. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 26 a la 31 donde dicho vector que contiene la
eliminación de E1 es introducida en las células huésped mencionadas
junto con una partícula adenoviral que tienen la región E1 intacta,
donde dicha partícula adenoviral que tiene la región E1 intacta es
capaz de complementar la replicación de dicho vector que contiene la
eliminación de E1.
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