JP3532566B2 - 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター - Google Patents
遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターInfo
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Description
(1)米国特許出願第08/080,727号、出願日:1993年6
月24日、発明の名称:遺伝子治療のためのアデノウイル
スベクター;および(2)その一部継続出願の米国特許
出願第08/250,885号、出願日:1994年5月31日、発明の
名称:遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター。こ
れらの出願をここに引用によって加える。
たは形質転換された細胞、殊に真核哺乳動物細胞におけ
る選択された核酸の発現を増強するために有用であるア
デノウイルス(Ad)ベクターに関する。本発明は、ま
た、ワクチンとしておよび遺伝子治療のために有用な治
療物質をコードする、遺伝子操作されたベクターを使用
することによって、病気の状態を処置することに関す
る。
た、ウイルスの均質なグループである。ヒトからのほぼ
50のセロタイプを包含する、おおよそ100の異なるアデ
ノウイルスが今日まで同定されている。
的にそして遺伝的に安定であり、非常に高いタイターに
増殖させるすることができ(1011〜1012PFU/mlの感染性
ウイルスの濃縮された系統が容易に得られる)そしてCs
Cl勾配の等密度の遠心により容易に精製することができ
る。Adゲノムは組換えDNA技術により容易に操作され、
そして哺乳動物細胞の中で発現される外来DNAインサー
トによりコードされるタンパク質は、通常、細菌、酵
母、およびいくつかの昆虫の細胞において発現される組
換え蛋白質と異なり、適当にグリコシル化またはリン酸
化されるであろう。ヒトAdsは上皮起源のヒト細胞にお
いて最も効率よく複製するが、これらのウイルスはほと
んど任意の哺乳動物細胞に感染し、そして少なくともい
くつかのウイルス遺伝子を発現する。レトロウイルスと
異なり、Adsは非複製性細胞に感染し、そしてこれらの
細胞の中で発現される。こうして、Adに基づくベクター
は遺伝子の供給、発現、および遺伝子治療のために有用
であることがある。
含有されるサブゲノムウイルス配列との結合または組換
えにより構成されてきている。Berkner,K.L.およびShar
p,P.A.,1983,Nucleic Acids Res.11:6003−6020;Haj−A
hmad,Y.およびGraham,F.L.,1986,J.Virol.57:267−274;
Stow,N.D.,1981,J.Virol.37:171−180。このアプローチ
はいくつかの欠点を有し、これらの欠点はウイルスDNA
の生産に要求される時間および技術的困難、スクリーニ
ングをより多い労力を要するものとする感染性の親ウイ
ルスのバックグラウンドおよび、直接結合の場合におい
て、アデノウイルスのゲノムが比較的大きいことにより
有用な制限部位の利用可能性を限定することを包含す
る。
含有する2つのプラスミドを再結合させることであっ
た。ベクターの構成をより簡単にしそして組換えウイル
スの同定に要求される引き続く分析の数を減少させる、
ある数の条件的に欠陥のあるプラスミド系が開発されて
きている。McGroy,W.J.,Bautista,D.S.およびGraham,F.
L.,1988,Virol.163:614−617;Ghosh−Choudhury,G.,Haj
−Ahmad,Y.,Brinkley,P.,Rudy,J.およびGraham,F.L.,19
86,Gene 50:161−171;Mittal,S.K.,McDermott,M.R.John
son,D.C.,Prevec,L.およびGraham,F.L.,1993,Virus Re
c.28:67−90。
ルス5(「Ad5」)ゲノムは、36kbの線状二本鎖であ
る。その配列は発表されている。(Chroboczek,J.,Bieb
er,F.,およびJaerot,B.,1992、アデノウイルス5型のゲ
ノムの配列およびアデノウイルス2型のゲノムとのその
比較[The Sequence of the Genome of Adenovirus Typ
e 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovir
us Type 2],Virol.186:280−285:ここに引用によって
加える)。Ad5ゲノムは線状化ゲノムの各末端に、100〜
150塩基対(bp)の逆方向末端反復(「ITR」)を含有す
る。55,000ダルトンの末端タンパク質「TP」)が各鎖の
5′末端に共有結合している。TPおよびITR(複数)の
両方は、ウイルスDNAの複製においてある役割を演ずる
と考えられる。McGrory,W.J.ら、1988,Virol.163:614−
617およびGhosh−Choudhury,G.ら、1986,Gene 50:161−
171。)Ad5は試験した各ヒト細胞系を感染したが、いく
つかの細胞、例えば、リンパ球は比較的非許容性であ
る。
において初期に転写される。これらの領域は、次の通り
である:初期領域1(E1)(標準化されたゲノムの位置
198−4025bpまたはその付近の約1.3−11.2mu、E1Aエン
ハンサー領域を含む;Sussenbach,J.S.,1984,Ginsburg
(編)、THE ADENOVIRUSES,Plenum Press,pp.35−124)
これはサブ領域E1AおよびE1Bにさらに分割される;初期
領域2(E2)、これはウイルスのDNA複製機能をコード
する;初期領域3(E3)(約75.9−86.0mU、または約2
7,275−30,904bp;Caldaras,C.およびWold,W.S.M.,1985,
Virol.140:28−43;および初期領域4(E4)。E1Aは他の
初期領域のターニング・オン(Turning on)および宿主
細胞の機能の数の調節に関係する。E1BおよびE4は宿主
細胞のタンパク質合成の停止に関係する。E3はウイルス
の感染に対する宿主細胞の免疫応答を調節する。これら
の初期の遺伝子のいくつかは、ゲノムを複製しそして生
活可能なウイルス粒子を形成するために必要な後期の発
現された遺伝子を「ターン・オン(turn on)」する機
能をする。
クターはアデノウイルスDNA断片および線状化プラスミ
ドから構成されてきている。Qunatinら、1992,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 89:2581−2584。CTFR発現カッセトおよ
びアデノウイルスDNA断片から構成された組換えアデノ
ウイルスベクターは記載された。Rosenfeldら、1992,Ce
ll 68:143−155。
をパッケージする能力を有する。Bett,A.J.,Prevec,L.,
およびGraham,F.L.,1993、ヒトアデノウイルス5型ベク
ターのパッケージング容量および安定性(Packaging Ca
pacity and Stability of Human Adenovirus Type 5 Ve
ctors),J.Virol.67:5911−5921。より大きいゲノム
(例えば、野性型の大きさの108%)は、ウイルスの不
安定性および劣った増幅速度を生ずる。同上。このパッ
ケーングジ能力は、ほぼ1.8〜2.0kbのみの過剰のDNAのA
dゲノムの中への挿入を可能とする。
ウイルスゲノムの部分を欠失することが必要である。領
域E1の部分を欠失することができ、そして生ずるウイル
スをヒト293細胞の中で増殖させることができる。(293
細胞はE1を含有しそしてそれを発現し、E1を欠如するウ
イルスの突然変異を補完する。)外来核酸を、E1の代わ
りに、2.9kbまでのE1欠失を含有するAd5ゲノムの中に挿
入して、4.7〜4.9kgのインサートのための容量を有す
る、条件的ヘルパー独立性ベクターを生成することがで
きる。
ト細胞、例えば、HeLaまたはKBの中で複製し、そしてヒ
トを包含する動物を感染しそしてその中で発現させるこ
とができる。汚染の挿入を含まない、3.0kbのE3配列の
欠失が報告されている。Ranheim,T.S.,Shisler,J.,Hort
on,T.M.,Wold,L.J.,Gooding,L.R.,およびWold,W.S.M.,1
993,J.Virol.67:2159−2167。
の欠失を利用するベクターを発生する簡単な手法は存在
しない。さらに、E1またはE3のいずれかの欠失を利用す
るベクターは比較的小さいインサートのみを収容するこ
とができる。より大きい断片を許容することができるAd
ベクターの生産および使用を簡素化するために、われわ
れはAdウイルスのゲノムの大部分を含有する、1系列の
細菌のプラスミドに基づく新しい方法を開発した。
量のAd5クローニングベクターおよび発現ベクターを提
供することである。したがって、E1およびE3の両方の中
に拡張した欠失を含み、そしてさらに単一のベクター系
においてそれらを再結合する新しいベクター系が開発さ
れ、前期ベクター系は、発現を調節するための制御要素
と一緒にタンパク質のコード遺伝子の大部分を収容する
ために充分な、8000bpまでのインサートの挿入を許容す
ることができる。本発明は、E1またはE3の領域のいずれ
か、あるいは両方の中に外来核酸をクローニングするオ
プションを提供し、そしてなお開発された技術の使用に
最も融通性がありかつ容易であることを約束する。さら
に、この系の修飾は野性型E3、およびE1領域の中の挿
入、置換、または突然変異を有するウイルスの構成を可
能とする。
イルス5型(Ad5)ゲノムを含む細菌のプラスミドを提
供する。このプラスミドのヌクレオチド配列は、前記Ad
5ゲノムの初期領域3(E3)内の欠失と、パッケージン
グシグナルに、全体または一部分が、相当する初期領域
1A(E1A)の配列と置換したアンピシリン耐性をコード
する、細菌的に複製可能なpBR322プラスミドのセグメン
トとを有する。
ほぼ340塩基対、前記ゲノムの左末端の逆方向末端反復
配列、およびそのパッケージングシグナルを含む細菌の
プラスミドを提供し、前記プラスミドは、また、前記プ
ラスミドおよび前記ウイルスゲノムに対して外来の約8
キロ塩基までの真核性遺伝子配列を含む。そのほぼヌク
レオチド3540からそのほぼ位置5790までのアデノウイル
ス配列が、前記外来配列の右側に存在する。
プラスミドの中に収容されそしてなお操作可能に止まる
ことができる外来インサートの大きさの任意の組み合わ
せを使用する、E1欠失および外来インサートを含有すす
るアデノウイルスゲノムの構成体を包含する。ここにお
いて提供されるベクターの容量が大きいために、外来遺
伝子の多数のインサートをE1クローニング部位に配置す
ることができる。例えば、異なる抗原をコードする2ま
たはそれ以上の遺伝子、あるいは有用なタンパク質をコ
ードする遺伝子を、化学的に選択可能なマーカーをコー
ドする遺伝子と組み合わせることができる。
HG10を使用して、Ad5ゲノムのE3またはE1の領域の中に
外来遺伝子を挿入することができる。E3の中に挿入され
た遺伝子は、左末端の(E1)配列を含有する共トランス
フェクションされたプラスミドの適当な選択により、E1
の中の種々の突然変異、欠失、または挿入と組み合わせ
ることができる。
表示である。
表示である。
表示である。
るプラスミドの2つの例(pΔE1sp1AおよびpΔE1sp1
B)の線図的表示である。
は含まない、異なるE1欠失を有するプラスミドを使用し
て合成した、異なるレベルのタンパク質IXを図解する。
は含まない、3.2kbのE1欠失を有するウイルスの熱安定
性を図解する。
キューの図解する。
ルのルシフェラーゼを含有する二重組換え体の構成のた
めの戦略を描写する。
の線図的表示である。
pHCMVsp1C、およびpHCMVsp1Dの線図的表示である。
には、作ることができるE1配列(30〜40bp内)の最大の
可能な欠失を含有すると同時に、生活可能なウイルスの
組換え体の発生をなす可能とするので、従来報告された
構成体とかなり異なる。驚くべきことには、ここに記載
する異なる遺伝要素は、組み合わせたとき、宿主細胞の
中に外来核酸を導入しそしてその中でそれを発現すると
き有用である安定な構成体を生産した。
オンの増殖、生産および感染性に影響を与えないので、
どれだけ大きい欠失を配置することができるか、あるい
はそれをどこに配置することができるかどうかは未知で
あった。ウイルスの生活可能性および最大のパッケージ
ング容量のために、E1領域における欠失は好ましくは左
の逆方向末端反復(ITR;1−103bp)またはパッケージン
グシグナル(194−358bp)に影響を与えてはならない。
Hearing,P.およびShenk,T.,1983,Cell,33:695−703;Gra
ble,M.およびHearing,P.,1992,J.Virol.64:2047−205
6。さらに、唯一の現在入手可能なE1相補的細胞系(293
細胞)はタンパク質IXを発現しないので、欠失はこのポ
リペプチドのためのコード配列の中に伸長すべきではな
い。(タンパク質IX遺伝子を欠如するウイルスの欠失突
然変異が単離されたが、そのタンパク質は機能的ウイル
スの中への全長のゲノムのパッケージングのために必須
であるように思われる。) 本発明のpBHGプラスミドの態様において、pBR322はパ
ッケージングシグナル、E1Aエンハンサー、プロモータ
ーおよびE1Aタンパク質コーディング配列の大部分を含
む、位置188−1339からのAd5配列と置換する。pBR322イ
ンサートはアンピシリン耐性を含有するばかりでなく、
かつまたpBR322がその中で複製されることができる細胞
の中でベクターのpBHGファミリーが複製できるようにす
る。
けるSsp I部位と3533bpにおけるAfl部位との間にE1領域
の欠失を含有する。Ssp I部位はタンパク質IXの発現の
ために必須であることがあるので、野性型(wt)タンパ
ク質IX遺伝子における場合よりタンパク質IXのTATAボッ
クスに近くにSsp I部位を配置する合成オリゴヌクレオ
チドとして、それは再導入された。
語は、特記しない限り、一般に当業者により普通に理解
されるのと同一の意味を有することを意図する。ここに
おいて使用するある数の用語は限定的であることを意図
せず、普通の使用は他の意味を示唆することさえある。
例えば、外来核酸、遺伝子またはcDNAの用語「発現」ま
たはそれらを「発現する」は、以後、細胞、あるいは細
胞を含有しない系、コムギ胚芽またはウサギ網状赤血球
における、核酸の複製、タンパク質へのDNAの転写およ
び/またはRNAの翻訳を包含するために使用する;そし
て、「核酸」は遺伝子、cDNA、RNA、または遺伝子産物
をエンコードする他のオリゴヌクレオチドと互換的に使
用する。用語「外来」は、核酸が同一のベクターまたは
宿主細胞と全く同じに関連して天然に見出されないが、
むしろ前記核酸とベクターまたは宿主細胞との間の正確
な関連が遺伝子工学によりつくられることを示す。用語
「組換え体」および「組換え」は、一般に、本発明者ら
が考える遺伝物質の再配列、および実験的操作の結果で
ある遺伝物質の再配列を呼ぶ。
むように遺伝的組換え技術により修飾することができ
る、遺伝的に操作した核酸構成体を意味し、これは前記
配列を宿主細胞の中に導入し、それらを複製させ、それ
をクローニングし、および/または前記核酸配列を発現
させる手段として使用することができ、ここで前記ベク
ターはベクターを宿主細胞の中で複製させることがで
き、および/または核酸配列を発現させることができ、
および/または組換えを起こすことができ、および/ま
たはベクターをウイルス粒子の中にパッケージすること
ができる、すべての必要な配列の情報を含む。ベクター
の性質のこの叙述は網羅的であることを意味しない。
技術、例えば、形質転換、リン酸カルシウム沈澱したDN
Aを使用するトランスフェクション、エレクトロポレー
ション、遺伝子ガン、組換えウイルスまたはファージミ
ドを使用するトランスフェクション、感染性ウイルス粒
子を使用する注入、組織の中への注入または細胞の中へ
のDNAマイクロインジェクションなどに従い、宿主細
胞、組織または生物の中に「導入」することができる。
原核宿主および真核宿主の両方を使用するすることがで
き、これらは細菌、酵母、植物および動物を包含するこ
とができ、ヒト細胞を包含する。
ためのベヒクルとして働くとき、ベクターの中に存在す
る配列がベクターおよびそれを含有するコーディング領
域を細胞の中で分解せずに複製させかつ維持させると
き、そしてベクターの中に存在する配列がコーディング
配列を宿主細胞のゲノムの中に転写し、組換え、または
組込むようにさせるとき、「ベクターが含有するコード
配列の発現を支持する。」 所定の構造遺伝子、cDNAまたはオープンリーディング
フレームが適当な宿主の中にいったん導入されると、宿
主を成長させて前記構造遺伝子、cDNAまたはオープンリ
ーディングフレームを発現させることができる。核酸の
天然に見出される転写および翻訳の調節領域を認識しな
い宿主の中で外因性核酸を発現させる場合、種々の転写
調節領域をコーディング領域から上流または下流に挿入
することができ、それらのいくつかは外部から誘導可能
である。細菌の中で使用するための典型的な転写調節領
域またはプロモーターは、β−galプロモーター、ラム
ダ左および右プロモーター、trpおよびlacプロモータ
ー、trp−lac融合プロモーター、およびまたバクテリオ
ファージのラムダPLプロモーターならびにバクテリオフ
ァージのラムダOLオペレーターおよび、例えば、構造遺
伝子の温度感受性発現を与えるための、CI857温度感受
性リプレッサーを包含する。プロモーターの調節はリプ
レッサーとオペレーターとの間の相互作用により達成さ
れる。酵母の中で使用するために、典型的な転写調節領
域またはプロモーターは、解糖酵素のプロモーター、例
えば、ADH−Iおよび−IIプロモーター、GPKプロモータ
ー、およびPGIプロモーター、TRPプロモーターなどを包
含する;哺乳動物細胞の中で使用するために、転写制御
要素は、SV40の初期および後期のプロモーター、アデノ
ウイルスの主要な後期のプロモーターなどを包含する。
真核細胞において有用な他の調節配列は、例えば、サイ
トメガロウイルスのエンハンサー配列を包含することが
でき、これはプロモーター配列、例えば、SV40プロモー
ターに融合してキメラのプロモーターを形成することが
できるか、あるいは発現ベヒクルの中のどこかに、好ま
しくはプロモーター配列に対して密接させて挿入するこ
とができる。プロモーターが誘発可能である場合、許容
性条件を使用することができる(例えば、温度変化、代
謝生産物または栄養の消耗または過剰など)。
子に対して5′または3′に優性の増幅可能な遺伝マー
カーのための核酸を直列に結合し、そして宿主細胞を選
択的条件下に増幅させることによって、増幅することが
できる。増幅可能な核酸の例はジヒドロ葉酸レダクター
ゼのための遺伝子であり、その発現はメトトレキセー
ト、すなわち、葉酸塩拮抗物質に対して耐性とされた細
胞の中で増加することができる。
ヒクルは適当な細胞宿主におけるエピソームの維持のた
めの複製系内に含めることができ、それらは複製系なし
に提供することができるか、あるいは宿主ゲノムの中に
組込まれるようになることができる。
はベクターから欠けているか、あるいはその中で不活性
化されたE1配列を宿主細胞が発現することを必要とす
る。ヒト293細胞系は好ましい宿主細胞であるが、本発
明は、また、E1欠失を有するベクターを補足することが
できる他の細胞系を考える。「補足する」または「によ
り補足された」は、ベクターから欠けているか、あるい
はその中で不活性化されている生活可能なウイルス粒子
を発生させるために必要である機能を宿主細胞系がコー
ドするおよび/または発現することを意味する。
定されないことを認識することは重要である。異なる種
(ヒト、マウスなど)または異なる組織(乳房上皮、結
腸、神経組織、リンパ球など)からの細胞を使用するこ
ともできる。
能力を変化させる核酸配列のすべての分子の変更を包含
し、詳しくは欠失、挿入、化学的修飾などを包含する。
挿入および欠失は当業者に知られているある数の方法で
なすことができ、このような方法は全長の配列を酵素的
に切断し、引き続いて規定した断片の修飾および結合、
あるいは部位特異的突然変異誘発、殊にKramerら、198
4,Nucl.Acids Res.12:9441−9456に記載されている種類
のループ・アウト突然変異誘発を包含する。
任意の位置における1または2以上のヌクレオチドを切
除するか、あるいは欠失させるか、あるいは既知の組換
え技術を使用して参照配列内の任意の前以て決定した位
置に前以て決定したヌクレオチドまたはヌクレオチドの
配列を挿入するか、あるいは既知の組換え技術を使用し
て参照配列内の前以て決定したヌクレオチドまたはヌク
レオチドの配列を前以て決定したヌクレオチドまたはヌ
クレオチドの配列と置換することによって、参照配列か
ら誘導された単離核酸を意味する。本発明はいずれかの
特定の種または属からの核酸配列の使用に制限すること
を意図せず、本発明は種々の源からの核酸を使用して実
施することができる。任意の源からの任意の核酸を、制
御要素をもつか、あるいはもたない、ベクターの中に挿
入できることが考えられる。
たは病理学的状態の短期間の処置における選択した核酸
の送り出しおよび発現を含む。
いて、あるいはそれらのいくつかのサブクラスについて
の言及は限定を意図せず、当業者が論じられている特定
の文脈において興味があるか、あるいは価値があると認
識する、すべてのこのような関係する物質を包含するよ
うに読むべきである。例えば、1つの緩衝液系または培
地を他のものと置換するなどし、こうして異なるが、既
知の方法を使用して、示唆する方法、物質または組成物
の使用を向ける目標と同一の目標を達成することがしば
しば可能である。
態様のすべての使用に限定されない。それらの組み合わ
せは事実好ましいが、すべての面を同時に使用すること
は本発明に対して不必要である。
発生するために使用することができ、このようなポリペ
プチドの各々は天然のポリペプチドの少なくとも1つの
特性を有する。これらは下位断片、欠失突然変異、プロ
セシング突然変異、または置換突然変異、天然のポリペ
プチドの結合領域と同一の二次構造を有するポリペプチ
ド、およびそれらの組み合わせを包含する。このような
修飾されたポリペプチドは「野性型」ペプチドの機能を
有するか、あるいは修飾されたまたは外部的に調節可能
な機能を有することができる。このような修飾されたポ
リペプチドは、当業者は理解するように、本発明におい
てかなりの実用性を有することができる。
びそれらの組成物は、本発明の一部分として記載する検
定の結果の分析において使用できる抗体の製造に使用す
ることができる。抗体は、普通の方法で、免疫原として
主題のポリペプチドを使用しそしてポリペプチドを哺乳
動物の宿主、例えば、マウス、雌牛、ヤギ、ヒツジ、ウ
サギなどの中に注入し、特にアジュバント、例えば、完
全フロインドアジュバント、水酸化アルミニウムゲルな
どを使用して、製造することができる。次いで、宿主か
ら採血し、そして血液をポリクローナル抗体の単離のた
めに使用するか、あるいは適当な骨髄腫細胞と融合し
て、主題の化合物に対して特異的なモノクローナル抗体
を分泌する永久分裂能化された細胞系を生産する。
って加える。
ガー・マンヘイム・インコーポレーテッド(Boehringer
−Bannheim,Inc.)(カナダ国クエベック州ラバル)、
ニュー・イングランド・バイオラブス(New England Bi
olabs)(マサチュセッツ州ベベリイ)またはベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda Research Labo
ratoies)(カナダ国オンタリオ州バーリントン)から
購入し、そして供給者の推奨に従い使用した。プラスミ
ドは標準のプロトコールを使用して構成した。Sambroo
k,J.,E.F.Fritsch,およびT.Maniatis,1989,MOLECULAR C
LONING:A LABORATORY MANUAL,第2版,Cold Spring Harb
or Laboratory,コールド・スプリング・ハーバー、ニュ
ーヨーク。エレクトロポレーションを使用して、大腸菌
(E.coli)DH5株(supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96
thi−1 relA1)を新しく構成したプラスミドで形質転換
した。Dower,W.J.,J.F.Miller,およびC.W.Ragsdale,198
8、高い電圧のエレクトロポレーションによる大腸菌の
高い効率の形質転換(High efficiency transformation
of E,coli by high voltage electroporation),Nucle
ic Acids Res.16:6127−6145。プラスミドDNAはアルカ
リ性溶解法により製造し、そしてCsCl−臭化エチジウム
密度勾配の遠心により精製した。Birnboim,H.C.,oyJ.Do
ly,1987、組換えプラスミドDNAをスクリーニングする急
速なアルカリ性抽出手順(A rapid alkaline extractio
n procedure for screning recmbinant plasmid DNA),
Nucleic Acids Res.7:1513−1523。
ヨーク州グランドアイランド)から入手した。アデノウ
イルス(Ad)ベクターを力価決定し、そしてE1領域を含
むAd5ゲノムの左11%を構成的に発現する293細胞上で継
代した。Graham,F.L.,J.Smiley,W.C.Russel,およびR.Na
irn,1977、ヒトアデノウイルス5型からのDNAにより形
質転換されたヒト細胞系の特性(Characteristics of h
uman cell line transformed by DNA from human adeno
virus type 5),J.Gen.Virol.36:59−72。100単位のペ
ニシリン/ml、100μgのストレプトマイシン/ml、2.5μ
gのアンフォテリシン/mlおよび細胞の維持のために10
%の新生仔ウシ血清またはウイルスの感染のために5%
のウマ血清を補充したF−11最小必須培地の中で、293
細胞を単層に増殖させた。回転培養(spinner cultur
e)において増殖させたKB細胞は、前述の抗生物質およ
び10%のウマ血清を補充したジョクリック(Joklik)の
変性培地の中で維持した。
胞/mlの密度に増殖させ、遠心し、そしてもとの体積の1
/10に再懸濁させ、そしてウイルスを添加し(20PFU/細
胞)そして震盪しながら37℃において1時間吸収させ
た。次いで、細胞を50%の新鮮な培地および50%のもと
の培地を使用してもとの体積に戻した。感染後種々の時
間において、4mlのアリコートを取り、0.5mlのグリセロ
ールを添加し、そして試料をプラーク滴定による感染性
ウイルスの検定のために−70℃において貯蔵した。
ョンにより、組換えウイルスを単離した。Graham,F.
L.、およびA.J.Van der Eb,1973、ヒトアデノウイルス
5のDNAの感染性の検定のための新しい技術(A new tec
hnique for the assay of infectivity of human adeno
virus 5 DNA),Virol.52:456−467。8〜10日後、プラ
ークを単離し、拡張し、そしてウイルスDNAを前述した
ように制限酵素の消化により分析した。Graham,F.L.お
よびL.Prevec,1991,アデノウイルスのベクターの操作
(Manipulation Adenovirus Vectors),E.J.Murry
(編)METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,vol.7:GENE TRAN
SFER AND EXPRESSION PROTOCOLS,The Humana Press In
c.,Clifton,N.J.,p.109−128。次いで、候補のウイルス
をプラーク精製しそして、安定性の研究のために、最初
のプラーク精製後ウイルスDNAの分析のために感染した
細胞の培地を使用して出発して、ベクターを継代した。
60mmの皿の中の293細胞のセミコンフルエントの単層を
各前の継代(ほぼ40PFU/細胞)からの0.5mlの培地で感
染させ、ウイルスを0.5時間吸収させ、次いで培地を置
換した。細胞変性効果が完結したとき、通常感染後2〜
3日以内に、細胞および培地を収穫した。32 P標識化およびウイルスDNAの発現 60mmの皿の中の293細胞のセミコンフルエント単層を
分析すべき継代からのウイルスで感染させそして感染後
24時間に、培地を除去しそして5%のウマ血清および25
uCi/mlの32Pオルトリン酸(デュポン社(DuPont de Nem
ours & Co.,Inc.)、デラウェア州ウィルミントンから
購入した)を含有する1mlのリン酸塩不含199培地と置換
した。感染した細胞をさらに6時間インキュベートした
後、細胞を収穫しそしてDNAを抽出した。次いで、ウイ
ルスDNAを適当な制限酵素で消化し、1%のアガロース
ゲルを通して電気泳動し、そしてゲルを乾燥しそしてDN
Aバンドをオートラジオグラフィーにより可視化した。
に必須であるE1領域の中にシス作用性の配列を有する。
このシス作用性シグナルは、Ad5の中の194〜358dpに位
置し、欠失されると、ウイルスのゲノムはパッケージさ
れることができないが、またトランスフェクションされ
た細胞の中でそれらのDNAを複製することが期待される
であろう。このAdのDNAが感染した細胞において環化す
ることができ、そしてオーバーラップする配列をもつ2
つのプラスミドの哺乳動物細胞の中への共トランスフェ
クションはすぐれた効率で感染性ウイルスを発生できる
という事実は、後述する戦略を考えることに導く。
のE3配列の欠失をもつ全体のAd5ゲノムを含有するウイ
ルスの構成を含んだ。Ad5Pac Iは、293細胞を次の2つ
のプラスミドと共トランスフェクションすることによっ
て作った:pBHG173;およびpAB14Pac I、修飾されたpAB14
(Bett,A.J.,L.Prevec、およびGraham,F.L.,1993,J.Vir
ol.67:5911 5921)、ここでPac Iクローニング部位はE3
の2.69kbの代わりに置換されている(第1A図)。次に、
Ad5Pac Iから精製したウイルスDNAをCla IおよびXba I
で消化し、そして293細胞の中に他のプラスミド、pWH3
(Bautistia,D.S.、およびGraham,H.L.,1989,Gene 82:2
01−208)と共トランスフェクションして、ウイルスAdB
HGを生成した(第1B図)。pWH3は、パッケージングシグ
ナルを後期の段階で欠失できるように設計された、pb13
39に修飾pBR322プラスミドが挿入された、左末端のAd5
配列を含有するプラスミドである。
のプラスミドの発生および引き続く感染性クローンの同
定を含んだ。子供のラットの腎(BRK)細胞を、環状Ad5
ゲノムを発生することが前に示された条件下にAdBHGで
感染させた。Graham,F.L.,1984,EMBO J.3:2917−2922;R
uben,M.,Bacchetti,S.およびGraham,F.L.,1983,Nature
301:172−174。感染後48時間に、DNAを感染したBRK細胞
から抽出し、そして大腸菌(E.coli)HMS174をアンピシ
リン耐性(Apr)およびテトラサイクリン耐性(TetR)
に形質転換させるために使用した。2つの実験から、合
計104のコロニーが得られた。小規模のプラスミドの調
製物を、Hind IIおよびBamH I−Sma I消化およびゲル電
気泳動によりスクリーニングした。制限分析の結果によ
り、プラスミドはそれらが含有するウイルスゲノムの量
を変化させることが明らかにされた。これは、少なくと
も一部分、Ad5ゲノムの逆方向末端反復(ITR(複数))
が頭尾で接合される(接合部)とき206bpのパリンドロ
ームが形成するためであると信じられる。
ノムを有するように思われる、4つの候補のプラスミド
が選択された。すべての4つのプラスミドは、293細胞
を5または10μgのプラスミドDNAでトランスフェクシ
ョンした感染性の検定において、感染性であることが発
見された(データは示されていない)。
し、そして分析した。各クローンにおけるパリンドロー
ムの中点から欠如したヌクレオチドの数は4bp程度に小
(右のITRから1bpおよび左から3bp)から19bp程度に多
く(右のITRから1bpおよび左から18bp)まで変化した。
それ以上の研究のために、われわれは接合部から19bpを
欠如するクローンを選択し、そしてこれをpBHF9と呼ん
だ。
することによって発生させた。これは部分的BamH I消化
および再結合により達成された(第1B図)。pBHG10につ
いてのスクリーニングは、パッケージングシグナルの除
去が、また、TetR遺伝子を排除するという事実により促
進された。
28133;およびbp30818−35934(右のゲノム末端)からの
Ad5DNA配列を含有する。Ad5ゲノムの左および右の末端
は共有結合で接合されている。プラスミドpBR322のセグ
メントは、pBR322ゲノムのヌクレオチド375−1/4361−2
064を表し、pBR322の複製起点およびpBR322のアンピシ
リン耐性を含み、Ad5のbp188と1339との間に存在して、
宿主細胞、例えば、大腸菌(E.coli)の中のpBHG10の増
殖を可能とする。Pac I制限酵素部位は、このプラスミ
ドにおいて独特であり、Ad5のbp28133と30818との間で
存在して、外来遺伝子の挿入を可能とする。パッケージ
ングシグナルが欠失されるので、pBHG10それ自体は感染
性ウイルス粒子を生じない。パッケージングシグナルを
含む、Ad5配列の左末端を含有するヘルパープラスミド
とのpBHG10の共トランスフェクションは、宿主細胞にお
ける組換えにより、pJM171を使用して得られたものに匹
敵する効率で感染性ウイルスのベクターを生ずる(1pJM
17はE1突然変異のレスキューまたは感染性ウイルスの中
への置換のために有用であることが発見されたが、それ
は野性型E3領域をもたず、あるいは有用なE3欠失をもた
ない。Mcgroyr,W.J.,Bautista,D.S.およびGraham,F.L.
(1988)Virology 163,614−617(未発表そして下を参
照)。こうして、pJM17は大部分のAd5ベクターの構成に
ついてpBHG系列のプラスミドにより抑制されるであろ
う。)。
び拡張した欠失をもつE3領域の置換 いくつかの応用のために、無傷の野性型Ad5のE3配列
をもつAdベクターを発生させることが望ましいことがあ
るので、われわれは野性型E3配列をpBHG10の中に再導入
した(第2図)。pBHG10の中への挿入を簡素化するため
に、第1ステップはカナマイシン耐性(Knr)遺伝子を
フランキングするE3配列を有するプラスミドの構成を含
んだ。AprプラスミドpFG23(McKinnon,R.D.,Bacchetti,
S.およびGraham,F.L.,1982,Gene 19:33−42)を、Ad5配
列の中の位置2589で切断するXba Iで消化し(使用した
大腸菌(E.coli)におけるDamメチル化のために30470bp
における切断は存在しなかった)そしてXba I消化pKN30
(Lee,F.,1982,PH.D.Thesis,McMaster University、カ
ナダ国オンタリオ州ハミルトン)と結合し、pFG23AK(A
prおよびKnr)を発生させた(第2A図)。外因性Ad5配列
およびApr遺伝子を除去するために、pFG23AKをAfl IIで
消化しそして結合して、pFG23Kを発生させた。
入し戻すことを含んだ(第2B図)。pBHG10をAd5配列の
中の75.4muにおいてのみ切断するSsp Iで消化し、そし
てSsp Iで綿状化したpFG23Kと結合して、pBHG10Aを発生
させ、これはここで2.69kbの欠失を含有する前のE3領域
と直列に所望の野性型E3配列を含有する。反復した配列
を除去するために、pBHG10AをNde Iで部分的に消化しそ
して結合して、pBHG10Bを発生させた。最終ステップに
おいて、Knrセグメントを部分的Xba I消化および再結合
によりpBHG10Bから除去して、pBHGE3を発生させた。野
性型E3領域の存在を除外して、pBHGE3はpBHG10と同一で
あり、そして共トランスフェクションによるE1置換をも
つAdベクターの発生のために等しく効率的である。
BHG10の中の2.69kbの欠失を3.13kbに拡張することが可
能であると信じられるようになった。ポリメラーゼ連鎖
反応(PCR)の技術を利用しそしてpBHGE3の構成につい
て前述したものに非常に類似する戦略(第2図)に従う
ことによって、われわれは3.13kbの欠失をつくりそして
それをpBHG10の中に導入した。生ずるプラスミドpBHG11
は、27865から30995bpの配列を除去する拡張したE3欠失
を除外して、pBHG10と同一である。pBHG10に似て、pBHG
11は欠失されたE3配列の代わりに独特Pac I制限酵素部
位を含有して、外来遺伝子の挿入を可能とする。
いて使用するためのE1シャトルプラスミドの構成 プラスミドpBHG10,pBHG11およびpBHGE3を、それらが
ウイルス粒子の中へウイルスDNAを包膜するために必要
なパッケージングシグナル(194−358bp)を除外して、
293細胞のトランスフェクションのとき感染性ベクター
を生成するために要求されるすべての必須Ad5配列を含
有するように設計した。感染性ウイルスのベクターpBHG
10を発生させるために、E3の中にインサートを有するpB
HGE3または誘導体を、第3図に図解するに、パッケージ
ングシグナルを含む左末端(E1)ウイルス配列を含有す
る第2プラスミドと293細胞の中に共トランスフェクシ
ョンしなくてはならない。BHGベクター系の容量を最大
するために、われわれはBHGプラスミドとの共トランス
フェクションのために最大の可能なE1欠失をもつプラス
ミドを必要とした。
9bpにおけるSsp I部位と3533bpにおけるAfl II部位との
間の配列を除去することによって、ほぼ3.2kbの欠失を
つくることができることが明らかとなった(第4図)。
この欠失はITR(1−103bp)、必須コアパッケージング
シグナル(194−358bp)またはタンパク質IXのためのコ
ーディング配列を妨害しないが、それはタンパク質IXプ
ロモーターからsp1結合部位(3525−3530bp)を事実除
去する。この3.2kbのE1欠失はE1エンハンサー領域を妨
害しないが、それは3′−大部分のパッケージング要素
を事実除去する。この要素の除去はパッケージングに対
する作用ほとんどあるいはまったくもたない。
ると考えられるので、(Babiss,L.E.およびVales,L.D.,
1991,J.Virol.65:598−605)それをタンパク質IXのTATA
ボックスに1bpいっそう近くにsp1部位を位置決めする合
成オリゴヌクレオチドとして再導入した(第4図)。
めに、われわれは免疫沈澱によるタンパク質IXの発現を
検査した。293細胞を10PFU/細胞においてウイルスで感
染させ、これらのウイルスはE1の中に欠失をもたない
か、あるいはタンパク質IX遺伝子の中に伸長する2.3kb
の欠失(d1313)、前述の3.2kbの欠失(d170−3)、E1
逆平行の向きでHCMV(AdHCMV2)またはβ−アクチン(A
dβAct 2)プロモーターを含有する3.2kbの欠失、ある
いは再導入された結合部位をもつHCMV(AdHCMVsp1)ま
たはβ−アクチン(AdβActsp 1)プロモーターを含有
する3.2kbの欠失を含有した。〔35S〕−メチオニンで標
識化した後、細胞抽出物を収穫し、試料を抗Ad2タンパ
ク質IX抗体で免疫沈澱させ、そして12%のSDS PAGEゲル
上で展開した。結果(第5図)は、変動するレベルのタ
ンパク質IXがタンパク質IX遺伝子から上流の配列に依存
して発現されるが、sp1部位が存在すると、野性型Ad5に
比較して最大25%の減少が存在することが示す。
ることが知られているので、われわれはd1313,d170−3,
AdHCMV2,AdβAct2,AdHCMVsp1およびAdβActsp1と比較し
て野性型Ad5の熱安定性を検査した。これらのウイルス
の系統を45℃において1および2時間のインキュベーシ
ョンの前後に力価決定した。試験した6つのウイルスの
突然変異のうちで、d1313のみが熱不安定性において有
意に異なっていた(第6図)。タンパク質IXの野性型レ
ベルの16%のみを生産するAdβAct2(第5図)でさえ、
野性型ウイルスと同様に熱不活性化に対して耐性であっ
た。これが示すように、タンパク質IXはウイルスの感染
の間に過剰に作られるようである。また、3.2kbのE1欠
失を含有するウイルスは293細胞の中で野性型Ad5と同一
の最終力価に複製することを、われわれは発見した(デ
ータは示されていない)。
性が影響を受けないという評価が得られたので、BHGプ
ラスミドとの共トランスフェクションにおいて使用する
プラスミドpΔE1sp1AおよびpΔE1sp1Bの中にこの欠失
を組み込むことを決定した(第4図)。これらのプラス
ミドは、外来遺伝子の挿入を促進するために、種々の制
限部位を含有する。
の断片を含み、これらの断片は両方のアンピシリン耐性
およびpBR322の複製起点(これはpBR322がその中で複製
できる細胞の中でベクターを複製できるようにする)、
および初期領域4(E4)と右の逆方向末端反復との間の
インサート、および位置188から位置3533におけるAfl I
Iまでまたはその付近までのE1配列の欠失、および外来
核酸の挿入のための切断部位を含む。
能力を評価するために、種々の左末端のプラスミドとの
共トランスフェクションを実施し、そしてレスキューの
効率はpJM17を使用して得られたものに匹敵することが
発見された(データは示されていない)。
またはpBHG11の使用は、ウイルスベクターの中への、そ
れぞれ、ほぼ5.2,7.9および7.3kbのインサートのレスキ
ューを可能とするであろう。BHG系の容量を試験するた
めに、ヒトサイトメガロウイスルの直ちの初期のプロモ
ーターにより推進されたlacZ遺伝子および3.2kbのE1欠
失におけるSV40プロモーターにより推進された単純ヘル
ペスウイルス1型(HSV−1)gB遺伝子から成る7.8kbの
インサートをわれわれは構成した(第7図)。293細胞
の20〜60mmの皿、10と5μgの各pBHG10およびpH1lacZg
BRとの、および他の半分と10μgの各々との共トランス
フェクション後、1つのプラークが得られた。これを単
離し、拡張し、そしてHind IIIを使用する制限消化によ
り分析し、そして期待した制限パターンを有することが
発見された。AdlacZgBRと表示する単離物は、これらの
遺伝子の単一のインサートを含有するベクターを使用し
て得られたものに匹敵するレベルでlacZおよびHSV−1
の両方のgBを発現することが発見された(データは示さ
れていない)。
ェラーゼを含有する二重組換え体の構成において、シャ
トルベクター、pABS,4、を使用した。このベクターの構
成は、シャトルベクターならびに二重組換え体の使用を
さらに例示する。
る。まず、SV40ポリAシグナルをもつlacZ遺伝子をpAB
S.4のクローニング領域の中のSal I部位とXba I部位と
の間に挿入して、pABSLacZを発生させた。第8A図。次の
ステップにおいて、pABSLacZをPac IおよびBstB Iで消
化して、LacZ遺伝子およびカナマイシン耐性(Kanr)を
含有する断片を発生させた。次いで、この断片をpAdBH
G.28のPac I部位とBstB I部位との間にE3の平行の向き
で挿入して、pAdBGHLacZを発生させた。二重の抗生物質
の選択を使用したので、lacZインサートを含有する所望
のプラスミドについてのスクリーニングはトリバイアル
(trivial)であった。最後に、pAdBHGLacZKをSwa Iに
おいて消化して、Kan1遺伝子を除去して、pAdBHGLacZを
発生させた。pAdBHGLacZを増殖させそしてpCA15との共
トランスフェクションにおいて使用し、ここでpCA15はE
1の大部分の代わりにヒトサイトメガロウイルスの直ち
の初期の遺伝子(HCMV)プロモーターの制御下にホタル
のルシフェラーザをもつAd5の左末端の配列を含有する
プラスミドであった。第8B図。pAdBHGLacZは事実上任意
のE1誘導構成体との共トランスフェクションにおいて使
用して、E3の中のlacZおよびE1の中の外来遺伝子のイン
サートまたは突然変異との種々の組み合わせをもつベク
ターを作ることができる。
させて、pAdBHGプラスミドの中のE3欠失の中へのインサ
ートの導入を簡素化した。第9図。それらを次のように
して使用して、プラスミドのpAdBHG系列の中への外来遺
伝子の転移を促進する:クローニング部位Sph I,Pst I,
Sal I,BamH I,Kpn I,Sac I、またはEcoR Iを使用して、
遺伝子配列をpABS.7またはpABS,9の中に挿入する。次い
で、シャトルプラスミドをXba I,Pac IまたはBstB Iの
1つまたは2つの組み合わせで切断し、そしてKanを含
有する断片をAmprpAdBHGプラスミドの中に挿入して、Am
p+Kan二重耐性を使用して、所望のプラスミドを有する
細菌の形質転換体について選択する。引き続いて、Kanr
遺伝子をCla IまたはSwa Iを使用する消化および結合に
より除去する。最後に、E1配列を含有する適当なプラス
ミドと293細胞を共トランスフェクションすることによ
って、プラスミドを感染性Adウイルスベクターの中に
「レスキュー」する。
めに使用できる。ある数のシャトルプラスミドを構成し
た。これらを表Iに列挙する;また、第10図を参照のこ
と。初期領域4(E4)と右の逆方向末端反復(ITR)と
の間に挿入されたパッケージングシグナルを有するE1シ
ャトルプラスミドは、詳しくは本発明の主題の一部分で
ある。
るように、種々の方法を使用してベクターを標的組織の
細胞の中に導入することができる(例えば、影響を受け
た肝臓を門静脈を経てここにおいておよびこの出願に記
載および/または特許請求した種類のベクターを注入す
ることによって、肝臓の腫瘍を処置することができ
る)。さらに、病気の処置有用であることがある分子、
例えば、アンチセンスRNA、組織成長因子、例えば、GM
−CSF、分化をトリガーする分子、アポプトーシスを誘
発する分子などをコードする外来核酸を含有するベクタ
ーの使用を本発明は考える。最後に、当業者は理解する
ように、本発明の方法はマウスおよびヒト以外の動物を
処置するために使用することができる。
Claims (38)
- 【請求項1】ベクター系であって、 (a)修飾されたアデノウイルスゲノムを有する第1プ
ラスミド、この第1プラスミドは、 (i)前記ゲノムの初期領域1(E1)内の修飾であっ
て、前記ゲノム中のパッケージシグナルを除去するも
の、及び (ii)細菌プラスミドの1または2以上の断片であっ
て、抗生物質耐性をコードし、そしてプラスミドの複製
起点と細菌のプラスミドがその中で複製されることがで
きる細胞の中でベクターが複製できるようにするために
必要な他の配列とを含むもの、 を有する;並びに (b)E1シャトルプラスミドとして働く第2プラスミ
ド、この第2プラスミドは、 (i)細菌プラスミドの1または2以上の断片であっ
て、抗生物質耐性をコードし、そしてプラスミドの複製
起点と細菌のプラスミドがその中で複製されることがで
きる細胞の中でベクターが複製できるようにするために
必要な他の配列とを含むもの、及び (ii)AdE1領域に由来する配列、 を含んで成る; を含んで成り、そして (c)前記第1プラスミドおよび第2プラスミドは組換
えにより、ウイルス粒子中にパッケージされ得る組換え
修飾されたアデノウイルスゲノムを生成することができ
る; ことを特徴とするベクター系。 - 【請求項2】前記第2プラスミドが更に、前記AdE1領域
に由来する配列にスプライスされる外来核酸を含んで成
り、そして前記第1プラスミド及び第2プラスミドの組
換えにより生成する前記組換え修飾アデノウイルスゲノ
ムが前記外来核酸を含有する、請求項1に記載のベクタ
ー系。 - 【請求項3】前記修飾されたアデノウイルスゲノムが、
アデノウイルス5(Ad5)のゲノムに由来する、請求項
1に記載の第1プラスミド。 - 【請求項4】E1における前記修飾が、はE1A領域を含ん
で成る欠失である、請求項1に記載の第1プラスミド。 - 【請求項5】前記欠失したE1領域が、ヌクレオチド188
−1339にわたる、請求項1に記載の第1プラスミド。 - 【請求項6】前記欠失したE1領域が、ヌクレオチド188
および位置3533におけるAfl II部位にわたる、請求項1
に記載の第1プラスミド。 - 【請求項7】前記第1プラスミドから欠失した位置3525
におけるSsp Iが、Sap I部位を含む合成オリゴヌクレオ
チドの挿入により、第2プラスミド中に導入される、請
求項1に記載の第1プラスミド。 - 【請求項8】第1プラスミドが生活可能なウイルス粒子
を形成できないようにする前記E1の修飾が、293細胞に
より発現されるウイルスのE1配列により補完される、請
求項1に記載の第1プラスミド。 - 【請求項9】初期領域3(E3)内の欠失をさらに含み、
前記E3の欠失がウイルスの複製、パッケージング、生活
能力、または感染性に必要な配列の発現を阻害しない、
請求項1に記載の第1プラスミド。 - 【請求項10】前記E3の欠失が、Ad5ゲノムの位置27865
−30995を含む、請求項9に記載の第1プラスミド。 - 【請求項11】前記第1プラスミドがさらにアンピシリ
ン耐性をコードする細菌プラスミドpBR322の1または2
以上の断片、およびまたpBR322がその中で複製されるこ
とができる細胞中で前記プラスミドが複製できるように
するpBR322の複製起点を含む、請求項1に記載の第1プ
ラスミド。 - 【請求項12】請求の範囲1の(a)(ii)の前記プラ
スミドの1または2以上の断片が、初期領域4(E4)と
右の逆方向末端反復(ITR)との間の位置;初期領域4
内の位置;およびE4を含む配列が欠失されそして前記プ
ラスミドの1または2以上の断片と置換された位置、か
ら成る位置の群から選択される位置に挿入される請求項
1に記載の第1プラスミド。 - 【請求項13】核酸配列の挿入のためのクローニング部
位をさらに含む、請求項1に記載の第1プラスミド。 - 【請求項14】アンピシリン耐性をコードする細菌のプ
ラスミドpBR322の1または2以上の断片およびまたpBR3
22がその中で複製できる細胞の中で前記ベクターが複製
できるようにするpBR322の複製起点を含み、前記ベクタ
ーが初期領域4(E4)と右の逆方向末端反復との間のイ
ンサートを含有するようにさらに修飾されており、前記
ベクターがさらに位置188から位置3533におけるAfl II
配列までまたはその付近までのE1配列の欠失を有し、前
記ベクターが外来核酸の挿入のためのクローニング部位
を含有する、請求1に記載の第1プラスミド。 - 【請求項15】アデノウイルスAd5のDNA配列の、bp19
(左ゲノム末端)−bp188、bp1339−bp28133、及びbp30
818−bp35934(右ゲノム末端)を含んで成り、前記Ad5
配列の左ゲノム末端と右ゲノム末端とが共有結合してお
り、そして更にAd4のDNA配列のbp188とbp1339との間に
挿入されたヌクレオチド371−1/4361−2064から成るプ
ラスミドpBR322の断片、及びAd5のDNA配列のbp28133とb
p30818との間に位置するPac I制限部位を含んで成る、
プラスミド。 - 【請求項16】Ad5パッケージシグナル及びpBR322由来
の完全なTetr遺伝子を更に含んで成る、請求項15に記載
のプラスミド。 - 【請求項17】アデノウイルスAd5のDNA配列の、bp19
(左ゲノム末端)−bp188、bp1339−bp35934(右ゲノム
末端)を含んで成り、前記Ad5配列の左ゲノム末端と右
ゲノム末端とが共有結合しており、そして更にAd5のDNA
配列のbp188とbp1339との間に挿入されたヌクレオチド3
71−1/4361−2064から成るプラスミドpBR322の断片を含
んで成る、プラスミド。 - 【請求項18】アデノウイルスAd5のDNA配列の、bp19
(左ゲノム末端)−bp188、bp1339−bp27865、及びbp30
995−bp35934(右ゲノム末端)を含んで成り、前記Ad5
配列の左ゲノム末端と右ゲノム末端とが共有結合してお
り、そして更にAd5のDNA配列のbp188とbp1339との間に
挿入されたヌクレオチド371−1/4361−2064から成るプ
ラスミドpBR322の断片、及びAd5のDNA配列のbp27865とb
p30995との間に位置するPac I制限部位を含んで成る、
プラスミド。 - 【請求項19】請求項1に記載の第2プラスミドとして
使用するための、(1)Ad5E1領域から誘導された配列
及び(2)細菌プラスミドの1または2以上の断片であ
って、抗生物質耐性をコードし、そしてプラスミドの複
製起点と細菌のプラスミドがその中で複製されることが
できる細胞の中でベクターが複製できるようにするため
に必要な他の配列を含んでなるE1シャトルプラスミドで
あって、包膜シグナルを含み、宿主細胞の中に請求の範
囲1のベクターと一緒に共トランスフェクションされる
ことができ、前記プラスミドの中に必要に応じて外来核
酸を挿入することができ、前記外来核酸はオープンリー
ディングフレームおよび、必要に応じて、前記オープン
リーディングフレームの発現を調節する配列を含み、前
記外来核酸を必要に応じて含有するAd5E1領域から誘導
された前記配列は請求の範囲1のベクターと組換えを生
ずることができる、E1シャトルプラスミド。 - 【請求項20】オープンリーディングフレームを含んで
成る外来核酸が挿入されている、請求項19に記載のE1シ
ャトルプラスミド。 - 【請求項21】前記オープンリーディングフレームの発
現を制御する配列が更に挿入されている、請求項19に記
載のシャトルプラスミド。 - 【請求項22】Ad5領域に由来する配列が、339bp位のSs
p I部位と3533bp位のAfl II部位との間の約3.2kbの断片
について欠失しており、そして更に合成sp1結合部位及
びE1の欠失内に外来核酸を挿入するためのクローニング
部位を含んで成る、請求項19に記載のE1シャトルプラス
ミド。 - 【請求項23】Ad5領域に由来する配列中に欠失を含
み、そして更にE1欠失内に位置するHCMVプロモーター及
びE1除欠失の前記HCMVプロモーターに隣接して位置する
外来核酸を挿入するためのクローニング部位を含んで成
る、請求項19に記載のE1シャトルプラスミド。 - 【請求項24】Ad5領域に由来する配列中に欠失を含
み、そして更にE1欠失内に位置するHCMVプロモーター及
びSV40ポリアデニレーションシグナル並びに前記HCMVプ
ロモーターとSV40ポリアデニレーションシグナルとの間
に位置する外来核酸を挿入するためのクローニング部位
を含んで成る、請求項19に記載のE1シャトルプラスミ
ド。 - 【請求項25】Ad5領域に由来する配列内に約2.88kbの
欠失を含み、そして更にE1の欠失内に位置する外来核酸
を挿入するためのクローニング部位を含んで成る、請求
項19に記載のE1シャトルプラスミド。 - 【請求項26】Ad5領域に由来する配列中に欠失を含
み、そして更にE1欠失内に位置するβアクチンプロモー
ター及びSV40ポリアデニレーションシグナル並びに前記
βアクチンVプロモーターとSV40ポリアデニレーション
シグナルとの間に位置する外来核酸を挿入するためのク
ローニング部位を含んで成る、請求項19に記載のE1シャ
トルプラスミド。 - 【請求項27】初期領域4(E4)と右の逆方向末端反復
(ITR)との間に挿入されたパッケージングシグナルを
有する請求項19に記載のE1シャトルプラスミド。 - 【請求項28】請求項1に記載の第1プラスミドのE3領
域に配列(DNA)を移送するためのシャトルプラスミド
であって、カナマイシン耐性遺伝子を含んで成り、この
カナマイシン耐性遺伝子が、Pac I、BstB I、Swa I及び
Cla I部位をこの順序で含んで成る第1セットのクロー
ニング部位と、Cla I、Swa I、EcoR I、Sac I、Kpn I、
BamH I、Xba1、Sal I、Pst I、Sph I及びPac I部位をこ
の順序で含んで成る第2セットのクローニング部位とに
挟まれている、シャトルベクター。 - 【請求項29】請求項1に記載の第1プラスミドのE3領
域に配列(DNA)を移送するためのシャトルプラスミド
であって、カナマイシン耐性遺伝子を含んで成り、この
カナマイシン耐性遺伝子が、Pac I、BstB I、Swa I及び
Cla I部位をこの順序で含んで成る第1セットのクロー
ニング部位と、Cla I、Swa I、EcoR I、Sac I、Kpn I、
BamH I、Sal I、Pst I、Sph I及びPac I部位をこの順序
で含んで成る第2セットのクローニング部位とに挟まれ
ている、シャトルベクター。 - 【請求項30】請求項1に記載の第1プラスミドのE3領
域に配列を移送するためのシャトルプラスミドであっ
て、カナマイシン耐性遺伝子を含んで成り、このカナマ
イシン耐性遺伝子が、Xba I、Pac I、BstB I、Swa I及
びCla I部位をこの順序で含んで成る第1セットのクロ
ーニング部位と、Cla I、Swa I、EcoR I、Sac I、Kpn
I、BamH I、Sal I、Pst I、Sph I及びPac I部位をこの
順序で含んで成る第2セットのクローニング部位とに挟
まれている、シャトルベクター。 - 【請求項31】請求項1に記載の第1プラスミドのE3領
域に配列を移送するためのシャトルプラスミドであっ
て、カナマイシン耐性遺伝子を含んで成り、このカナマ
イシン耐性遺伝子が、Xba I、Pac イ、BstB I、Swa I及
びCla I部位をこの順序で含んで成る第1セットのクロ
ーニング部位と、Cla I、Swa I、EcoR I、Sac I、Kpn
I、BamH I、Sal I、Pst I、Sph I及びXba I部位をこの
順序で含んで成る第2セットのクローニング部位とに挟
まれている、シャトルベクター。 - 【請求項32】宿主細胞中に外来核酸を導入し、そして
発現せしめるための生体外法であって、 (a)(i)アデノウイルスゲノムの初期領域1(E1)
内に当該ゲノム中のパッケージングシグナルを除去する
修飾を含む修飾されたアデノウイルスのゲノムを含んで
成り、更に細菌プラスミドの1または2以上の断片であ
って、抗生物質耐性をコードし、そしてプラスミドの複
製起点と細菌のプラスミドがその中で複製されることが
できる細胞の中でベクターが複製できるようにするため
に必要な他の配列を含む第1プラスミド、及び (ii)包膜シグナルを含む、AdE1領域由来の配列を含有
し、更に細菌プラスミドの1または2以上の断片であっ
て、抗生物質耐性をコードし、そしてプラスミドの複製
起点と細菌のプラスミドがその中で複製されることがで
きる細胞の中でベクターが複製できるようにするために
必要な他の配列を含むE1シャトルプラスミド、 を、上記(a)(i)における第1プラスミドから除去
された前記E1配列によりコードされる機能を発現する宿
主細胞に導入し; (b)前記第1プラスミドと前記E1シャトルプラスミド
との組換えにより得られる、第1プラスミドのすべての
要素並びに包膜シグナル及びE1シャトルプラスミドの挿
入された核酸配列を含有する組換え修飾されたウイルス
ゲノム単離し; (c)前記組換え修飾されたウイルスゲノムを宿主細胞
の中に導入し;そして (d)前記修飾された組換えウイルスゲノムの中に含有
されるコード配列を発現させる; ことを含んで成る方法。 - 【請求項33】単離された宿主細胞中に外来核酸を導入
し、そして発現せしめるための方法であって、 (a)(i)アデノウイルスゲノムの初期領域1(E1)
内に当該ゲノム中のパッケジングシグナルを除去する修
飾を含む修飾されたアデノウイルスのゲノムを含んで成
り、更に細胞プラスミドの1または2以上の断片であっ
て、抗生物質耐性をコードし、そしてプラスミドの複製
起点と細菌のプラスミドがその中で複製されることがで
きる細胞の中でベクターが複製できるようにするために
必要な他の配列を含む第1プラスミド、及び (ii)包膜シグナルを含む、AdE1領域由来の配合を含有
し、更に細菌プラスミドの1または2以上の断片であっ
て、抗生物質耐性をコードし、そしてプラスミドの複製
起点と細菌のプラスミドがその中で複製されることがで
きる細胞の中でベクターが複製できるようにするために
必要な他の配列を含むE1シャトルプラスミド、 を、上記(a)(i)における第1プラスミドから除去
された前記E1配列によりコードされる機能を発現する宿
主細胞に導入し; (b)前記第1プラスミドと前記E1シャトルプラスミド
との組換えにより得られる、第1プラスミドのすべての
要素並びに包膜シグナル及びE1シャトルプラスミドの挿
入された核酸配列を含有する組換え修飾されたウイルス
ゲノム単離し; (c)前記組換え修飾されたウイルスゲノムを宿主細胞
の中に導入し;そして (d)前記修飾された組換えウイルスゲノムの中に含有
されるコード配列を発現させる; ことを含んで成る方法。 - 【請求項34】前記E1シャトルベクターに、オープンリ
ーディングフレームを含んで成る核酸配列が更に挿入さ
れている、請求項32又は33に記載の方法。 - 【請求項35】前記E1シャトルベクターに、前記オープ
ンリーディングフレームの発現を制御する配列が更に挿
入されている、請求項34に記載の方法。 - 【請求項36】前記組換えウイルスゲノムが組換えウイ
ルス粒子の中にパッケージされており、前記ウイルス粒
子は修飾されたアデノウイルスゲノムが本来誘導された
アデノウイルスにより感染されることができる細胞を感
染することができる、請求項32〜35のいずれか1項に記
載の方法。 - 【請求項37】前記修飾されたアデノウイルスゲノムが
本来アデノウイルス5から誘導されている、請求項32〜
36のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項38】E1欠失を有する前記ベクターを、前記宿
主細胞の中に、無傷のE1領域を有するアデノウイルスウ
イルス粒子と一緒に導入し、無傷のE1領域を有する前記
アデノウイルス粒子はE1欠失を有する前記ベクターの複
製を補足することができる、請求項32〜37のいずれか1
項に記載の方法。
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