CN112672790A - 条件性活化的结合蛋白的共表达和纯化方法 - Google Patents

条件性活化的结合蛋白的共表达和纯化方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于共表达和纯化条件性活化的结合蛋白诸如半‑COBRA的方法。

Description

条件性活化的结合蛋白的共表达和纯化方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年8月9日提交的美国临时申请号62/716,755的优先权，所述申请的全部内容以引用的方式整体明确地并入本文。
对在光盘上提交的“序列表”、表或计算机程序列表附录的引用
包含在名为“118459-5006_ST25.txt”的文件中且大小为183千字节的序列表已以电子方式通过EFS-Web提交，并且txt文件的内容在此以引用的方式整体并入。
背景技术
在各种临床设置中，常常需要选择性破坏单个细胞或特定细胞类型。例如，癌症疗法的主要目标是特异性破坏肿瘤细胞，同时留下尽可能完整且未受损的健康细胞和组织。一种此类方法是通过诱导针对肿瘤的免疫应答来使免疫效应细胞诸如自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击和破坏肿瘤细胞。
使用对肿瘤相关抗原提供优越的结合特异性和亲和力的完整单克隆抗体(MAb)已成功应用于癌症治疗和诊断领域中。然而，完整MAb的大尺寸、其不良生物分布和在血池中的长持久性限制了其临床应用。例如，完整抗体可在肿瘤区域内表现出特异性累积。在生物分布研究中，当精确探查肿瘤时，会注意到抗体分布不均匀，在外周区域中具有原始累积。由于肿瘤坏死、抗原分布不均和间质组织压力增加，使用完整抗体构建体不可能到达肿瘤的中心部分。相比之下，较小抗体片段显示快速肿瘤定位，更深入地渗透到肿瘤中，并且还相对快速地从血流中除去。
在临床应用方面，从亲本MAb的小结合结构域衍生的单链片段(scFv)提供比完整MAb更好的生物分布，并且可更有效地靶向肿瘤细胞。单链片段可有效地从细菌中进行工程化，然而，与其亲本MAb((C(c),D)相比，由于二价化合物所经历的亲合力缺乏，大多数工程化scFv具有单价结构并显示出肿瘤累积减少(例如，在肿瘤细胞上的停留时间短)且特异性降低。
尽管scFv具有有利特性，但某些特征阻碍了其在癌症化疗中的全面临床部署。特别值得注意的是，由于这些剂靶向患病和健康组织共有的细胞表面受体，因此它们在患病与健康组织之间具有交叉反应性。具有改善的治疗指数的ScFv将使这些剂的临床应用获得显著进展。本发明提供此类改善的scFv及其制造和使用方法。本发明的改善的scFv通过形成二聚体化合物而具有克服由单一单元所表现的亲合力缺乏的出人意料的益处。
发明内容
在一个方面，本文提供一种分离的细胞，其包含：
(a)编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包含：(i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第一单结构域抗体(sdAb)；(ii)第一结构域接头；(iii)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；(iv)包含第一蛋白酶裂解位点的第一可裂解接头；和(v)假可变轻链；以及
(b)编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽从N末端到C末端包含：(i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第二sdAb；(ii)第二结构域接头；(iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的可变轻链；(iv)包含第二蛋白酶裂解位点的第二可裂解接头；和(v)假可变重链；其中所述第一多肽的可变重链和所述第二多肽的可变轻链当缔合形成Fv时结合人CD3。
在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb结合相同的人TTA。在一些情况下，第一sdAb和第二sdAb包含相同的氨基酸序列。在其他情况下，所述第一sdAb和所述第二sdAb包含不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb结合不同的人TTA。
在一些实施方案中，第一sdAb和/或第二sdAb结合选自由以下组成的组的人TTA：人EGFR、人B7H3、人EpCAM和人FOLR1。
在本文所述的任何发明的一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb结合人EGFR。在某些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb结合人B7H3。在特定实施方案中，第一sdAb和第二sdAb结合人EpCAM。在其他实施方案中，第一sdAb和第二sdAb结合人FOLR1。在一些实施方案中，第一sdAb结合人EGFR，并且第二sdAb结合人B7H3。
在本文所述的任何发明的一些实施方案中，第一sdAb结合人EGFR，并且第二sdAb结合人EpCAM。在一些实施方案中，第一sdAb结合人EGFR，并且第二sdAb结合人FOLR1。在一些实施方案中，第一sdAb结合人B7H3，并且第二sdAb结合人EGFR。在一些实施方案中，第一sdAb结合人EpCAM，并且第二sdAb结合人EGFR。在一些实施方案中，第一sdAb结合人FOLR1，并且第二sdAb结合人EGFR。在一些实施方案中，第一sdAb结合人B7H3，并且第二sdAb结合人EpCAM。在一些实施方案中，第一sdAb结合人FOLR1，并且第二sdAb结合人EpCAM。在一些实施方案中，第一sdAb结合人B7H3，并且第二sdAb结合人FOLR1。在一些实施方案中，第一sdAb结合人EpCAM，并且第二sdAb结合人B7H3。在一些实施方案中，第一sdAb结合人EpCAM，并且第二sdAb结合人FOLR1。在一些实施方案中，第一sdAb结合人FOLR1，并且第二sdAb结合人B7H3。在一些实施方案中，第一sdAb结合人FOLR1，并且第二sdAb结合人EpCAM。
在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点和第二蛋白酶裂解位点由相同的蛋白酶识别。在其他实施方案中，第一蛋白酶裂解位点和第二蛋白酶裂解位点由不同的蛋白酶识别。
在一些实施方案中，第一多肽还在C末端包含半衰期延长结构域，且/或第二多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。以另一种方式，第一多肽还在C末端包含半衰期延长结构域，并且第二多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。在一些情况下，第一多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。在一些情况下，第二多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。
在一些实施方案中，第一多肽的可变重链包含图39的SEQ ID NO:102的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3序列。在一些实施方案中，第一多肽的假可变重链包含选自由图39的SEQID NO:106、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:207组成的组的任一个的假可变重链序列。在一些实施方案中，假可变重链包含分别为图39的SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109的ivhCDR1、ivhCDR2和ivhCDR3序列。在其他实施方案中，假可变重链包含分别为图39的SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:103的ivhCDR1、ivhCDR2和ivhCDR3序列。在一些实施方案中，假可变重链包含分别为图39的SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210的ivhCDR1、ivhCDR2和ivhCDR3序列。在一些实施方案中，第二多肽的可变轻链包含图38的SEQ ID NO:90的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列。在一些实施方案中，第二多肽的假可变轻链包含选自由图38的SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:203组成的组的任一个的假可变轻链序列。在一些实施方案中，假可变轻链包含分别为图38的SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:97的ivlCDR1、ivlCDR2和ivlCDR3序列。在其他实施方案中，假可变轻链包含分别为图38的SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101的ivlCDR1、ivlCDR2和ivlCDR3序列。在一些实施方案中，假可变轻链包含分别为图38的SEQ ID NO:204、SEQ IDNO:205、SEQ ID NO:206的ivlCDR1、ivlCDR2和ivlCDR3序列。
在一些实施方案中，第一多肽选自由以下组成的组：Pro16(SEQ ID NO:5)、Pro39(SEQ ID NO:9)、Pro41(SEQ ID NO:13)、Pro43(SEQ ID NO:17)、Pro45(SEQ ID NO:21)和Pro349(SEQ ID NO:25)。在一些实施方案中，第二多肽选自由以下组成的组：Pro19(SEQ IDNO:7)、Pro40(SEQ ID NO:11)、Pro42(SEQ ID NO:15)、Pro44(SEQ ID NO:19)、Pro46(SEQID NO:23)和Pro353(SEQ ID NO:27)。在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽选自由以下组成的组：Pro16+Pro19(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7)、Pro39+Pro40(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11)、Pro41+Pro42(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15)、Pro43+Pro44(SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:19)、Pro45+Pro46(SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23)和Pro349+Pro353(SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27)。
在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸以不同的表达载体引入到所述细胞中。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸以多核苷酸比率引入到本文所述的细胞中，以产生基本上等量的第一多肽和第二多肽。在一些情况下，第一多核苷酸与第二多核苷酸的比率(多核苷酸比率)为1:1。在一些情况下，第一多核苷酸与第二多核苷酸的比率大于1:1。在某些情况下，第一多核苷酸与第二多核苷酸的比例小于1:1。
此外，本发明提供了一种表达载体，其包含本文概述的第一多核苷酸中的任一种。类似地，提供了一种表达载体，其包含本文概述的第二多核苷酸中的任一种。
在另一方面，本发明公开了一种组合物，其包含本文概述的第一表达载体和第二表达载体，其中第一表达载体和第二表达载体以多核苷酸比率引入到宿主细胞中，以产生基本上等量的所述第一多肽和所述第二多肽。在一些实施方案中，第一表达载体与第二表达载体的比率为1:1。在其他实施方案中，第一表达载体与第二表达载体的比率大于1:1。在其他实施方案中，第一表达载体与第二表达载体的比率小于1:1。
在一个方面，本发明提供了一种分离包含第一多肽和第二多肽的前药组合物的方法。所述方法包括：(1)在合适的培养条件下培养宿主细胞以产生第一多肽和第二多肽并将其分泌到培养基中；以及(2)使用蛋白A色谱法从培养基中纯化第一多肽和第二多肽，从而分离出包含第一多肽和第二多肽的前药组合物；其中所述宿主细胞包含：
(a)编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包含：(i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第一sdAb；(ii)第一结构域接头；(iii)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；(iv)包含第一蛋白酶裂解位点的第一可裂解接头；以及
(b)编码第二多肽的第二多核苷酸序列，所述第二多肽从N末端到C末端包含：(i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第二sdAb；(ii)第二结构域接头；(iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的可变轻链；(iv)包含第二蛋白酶裂解位点的第二可裂解接头；和(v)假可变重链；其中第一多肽的可变重链和第二多肽的可变轻链当缔合形成Fv时结合人CD3。
在一些实施方案中，单独对第一多肽和第二多肽进行纯化。在其他实施方案中，同时对第一多肽和第二多肽进行纯化。
在一些实施方案中，纯化还包括在蛋白A色谱法之后进行亲和色谱法。
在一些实施方案中，前药组合物包含基本上等量的第一多肽和第二多肽。
在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb结合相同的人TTA。在一些情况下，第一sdAb和第二sdAb包含相同的氨基酸序列。在其他情况下，所述第一sdAb和所述第二sdAb包含不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb结合不同的人TTA。
在一些实施方案中，第一sdAb和/或第二sdAb结合选自由以下组成的组的人TTA：人EGFR、人B7H3、人EpCAM和人FOLR1。
在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点和第二蛋白酶裂解位点由相同的蛋白酶识别。在某些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点和第二蛋白酶裂解位点由不同的蛋白酶识别。
在一些实施方案中，第一多肽在C末端包含半衰期延长结构域，且/或第二多肽在C末端包含半衰期延长结构域。在一些情况下，第一多肽还在C末端包含半衰期延长结构域，并且第二多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。在一些情况下，第一多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。在其他情况下，第二多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。
在一些实施方案中，第一多肽的可变重链包含图39的SEQ ID NO:102的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3序列。在一些实施方案中，假可变重链包含选自由图39的SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:207组成的组的任一个的假可变重链序列。在一些实施方案中，假可变重链包含分别为图39的SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109的ivhCDR1、ivhCDR2和ivhCDR3序列。在其他实施方案中，假可变重链包含分别为图39的SEQID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:103的ivhCDR1、ivhCDR2和ivhCDR3序列。在一些实施方案中，假可变重链包含分别为图39的SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210的ivhCDR1、ivhCDR2和ivhCDR3序列。在一些实施方案中，第二多肽的可变轻链包含图38的SEQ ID NO:90的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列。在一些实施方案中，假可变轻链包含选自由图38的SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:203组成的组的任一个的假可变轻链序列。在一些实施方案中，假可变轻链包含分别为图38的SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQID NO:97的ivlCDR1、ivlCDR2和ivlCDR3序列。在其他实施方案中，假可变轻链包含分别为图38的SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101的ivlCDR1、ivlCDR2和ivlCDR3序列。在一些实施方案中，假可变轻链包含分别为图38的SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ IDNO:206的ivlCDR1、ivlCDR2和ivlCDR3序列。
在一些实施方案中，第一多肽选自由以下组成的组：Pro16(SEQ ID NO:5)、Pro39(SEQ ID NO:9)、Pro41(SEQ ID NO:13)、Pro43(SEQ ID NO:17)、Pro45(SEQ ID NO:21)和Pro349(SEQ ID NO:25)。在一些实施方案中，第二多肽选自由以下组成的组：Pro19(SEQ IDNO:7)、Pro40(SEQ ID NO:11)、Pro42(SEQ ID NO:15)、Pro44(SEQ ID NO:19)、Pro46(SEQID NO:23)和Pro353(SEQ ID NO:27)。在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽选自由以下组成的组：Pro16+Pro19(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7)、Pro39+Pro40(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11)、Pro41+Pro42(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15)、Pro43+Pro44(SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:19)、Pro45+Pro46(SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23)和Pro349+Pro353(SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27)。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸以不同的表达载体引入到宿主细胞中。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸已以单个表达载体引入到宿主细胞中。
分离任一种所述前药组合物的方法还可包括将第一多核苷酸和第二多核苷酸以多核苷酸比率引入到宿主细胞中，以产生基本上等量的第一多肽和第二多肽。在一些实施方案中，将第一多核苷酸和所述第二多核苷酸以不同的表达载体或以单个表达载体引入到所述宿主细胞中。
在一些实施方案中，将第一多核苷酸和第二多核苷酸以多核苷酸比率引入到宿主细胞中，以产生基本上等量的第一多肽和第二多肽。在一些实施方案中，第一多核苷酸与第二多核苷酸的多核苷酸比率为1:1。在某些实施方案中，第一多核苷酸与第二多核苷酸的多核苷酸比率大于1:1。在其他实施方案中，第一多核苷酸与第二多核苷酸的多核苷酸比率小于1:1。
本文提供了一种治疗有需要的人受试者的癌症的方法，所述方法包括施用根据本文概述的任一种方法制备的前药组合物。
：参考2018年9月6日提交的WO 2019/051122、2017年9月8日提交的美国临时申请号62/555,999、2018年9月6日提交的WO 2019/051102、2017年9月8日提交的美国临时申请号62/555,943、2017年11月15日提交的美国临时申请号62/586,627、2017年11月16日提交的美国临时申请号62/587,318、2017年3月8日提交的WO2017/156178、2017年9月8日提交的美国临时申请号62/555,999，所述专利均以引用的方式整体明确地并入，包括附图、图例和定义以及所有叙述的实施方案。
附图说明
图1A和图1B示出了示例性半COBRA构建体的示意图。Pro16构建体的结构包含(从N末端到C末端)抗EGFR1 sdAb–结构域接头–抗CD3 scFv的活性可变重结构域–可裂解接头–抗CD3 scFv的假(无活性)可变轻链-半衰期延长结构域(例如，抗HSA)。Pro19构建体的结构包含(从N末端到C末端)抗EGFR2 sdAb–结构域接头–抗CD3 scFv的活性可变轻链–可裂解接头–抗CD3 scFv的假可变重链-半衰期延长结构域(例如，抗HSA)。未裂解分子与EGFR结合，不与CD3结合，并且在T细胞细胞毒性测定中没有活性。识别可裂解接头的蛋白酶裂解位点的蛋白酶(例如，肠激酶)可裂解Pro16和Pro19半COBRA，以产生活性抗CD3 Fv分子，因为完整VH结构域和完整VL结构域都通过活性构建体的抗EGFR1/2sdAb来栓系至癌细胞。图1B示出了通用半COBRA构建体。Pro1构建体的结构包含(从N末端到C末端)抗TTA1 sdAb–结构域接头–抗CD3 scFv的活性可变重结构域–可裂解接头–抗CD3 scFv的假(无活性)可变轻链-半衰期延长结构域(例如，抗HSA)。Pro2构建体的结构包含(从N末端到C末端)抗TTA2 sdAb–结构域接头–抗CD3 scFv的活性可变轻链–可裂解接头–抗CD3 scFv的假可变重链-半衰期延长结构域(例如，抗HSA)。在一些情况下，抗TTA1和抗TTA2结合相同肿瘤抗原。在其他情况下，抗TTA1和抗TTA2结合不同的肿瘤抗原。
图2显示EK裂解与互补半COBRA Pro16和Pro19协同活化EGFR+靶细胞的T细胞杀伤。Pro51代表T细胞依赖性细胞毒性的阳性对照。
图3示出了在蛋白水解裂解之前和之后共表达的半COBRA的SDS-PAGE分析。从瞬时共转染的expi293细胞群中共表达半COBRA，并且然后使用蛋白A纯化柱从所得条件培养基中共纯化。数据显示，一些半COBRA对等效地共表达(诸如Pro45/Pro46)，而其他半COBRA对并未共表达(诸如Pro43/Pro44)。另外的实验表明，在共转染中调节每个半COBRA的表达载体比率导致半COBRA对的等效表达。
图4A和图4B显示Pro16和Pro19构建体的共表达和共纯化的主要产物等同于单体半COBRA(Pro19单体)，如通过分析性尺寸排阻色谱法(SEC)测量的。数据显示，Pro16和Pro19构建体的共表达和共纯化不会导致蛋白质聚集。
图5示出了与每种单体的等摩尔混合物相比共表达和共纯化的Pro16和Pro19的SEC分析。
图6A和图6B显示Pro16构建体导致分析SEC上的单体峰。图6B示出了Pro16构建体相对于Pro19单体的比较。
图7A和图7B显示Pro39和Pro40构建体的共表达和共纯化的主要产物等同于单体半COBRA(Pro19单体)，如通过分析SEC测量的。
图8示出了与每种单体的等摩尔混合物相比共表达和共纯化的Pro39和Pro40构建体的SEC分析。
图9A和图9B显示Pro41和Pro42构建体的共表达和共纯化的主要产物等同于单体半COBRA(Pro19单体)，如通过分析SEC测量的。
图10示出了与每种单体的等摩尔混合物相比共表达和共纯化的Pro41和Pro42构建体的SEC分析。
图11A和图11B显示Pro43和Pro44构建体的共表达和共纯化的主要产物等同于单体半COBRA(Pro19单体)，如通过分析SEC测量的。
图12A和图12B显示Pro45和Pro46构建体的共表达和共纯化的主要产物等同于单体半COBRA(Pro19单体)，如通过分析SEC测量的。
图13A、图13B、图13C、图13D、图13E和图13F示出了使用共表达的半COBRA的TDCC测定。T细胞杀伤测定表明，共表达的半COBRA对表现出与每对的表达更低的半COBRA一致的预期效力水平。图13A示出了裂解的Pro16和Pro19对的结果。图13B示出了裂解的Pro39和Pro40对的结果。图13C示出了裂解的Pro41和Pro42对的结果。图13D示出了裂解的Pro43和Pro44对的结果。图13E示出了裂解的Pro45和Pro46对的结果。图13F示出了裂解的Pro59和Pro60对的结果。Pro51代表T细胞依赖性细胞毒性的阳性对照。
图14A、图14B和图14C提供了许多合适的蛋白酶裂解位点。如本领域技术人员将理解的，这些可裂解的位点可用作可裂解接头。在一些实施方案中，例如，当需要更多柔性可裂解接头时，可存在位于这些裂解位点的N末端和C末端中的一者或二者的额外氨基酸(通常为甘氨酸和丝氨酸)。
图15示出了用于本文所述的实施方案中的示例性接头序列，诸如结构域接头序列。
图16A和图16B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图16A至图16B分别示出了Pro6的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和核酸序列(SEQ ID NO:2)。Pro6和Pro7可形成半COBRA对。
图17A和图17B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图17A至图17B分别示出了Pro7的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)和核酸序列(SEQ ID NO:4)。
图18A和图18B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图18A至图18B分别示出了Pro16的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)和核酸序列(SEQ ID NO:6)。Pro16和Pro19可形成半COBRA对。
图19A和图19B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图19A至图19B分别示出了Pro19的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)和核酸序列(SEQ ID NO:8)。
图20A和图20B示出二氯示例性抗EGFR半COBRA。图20A至图20B分别示出了Pro39的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)和核酸序列(SEQ ID NO:10)。Pro39和Pro40可形成半COBRA对。
图21A和图21B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图21A至图21B分别示出了Pro40的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)和核酸序列(SEQ ID NO:12)。
图22A和图22B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图22A至图22B分别示出了Pro41的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)和核酸序列(SEQ ID NO:14)。Pro41和Pro42可形成半COBRA对。
图23A和图23B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图23A至图23B分别示出了Pro42的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)和核酸序列(SEQ ID NO:16)。
图24A和图24B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图24A至图24B分别示出了Pro43的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)和核酸序列(SEQ ID NO:18)。Pro43和Pro44可形成半COBRA对。
图25A和图25B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图25A至图25B分别示出了Pro44的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)和核酸序列(SEQ ID NO:20)。
图26A和图26B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图26A至图26B分别示出了Pro45的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)和核酸序列(SEQ ID NO:22)。Pro45和Pro46可形成半COBRA对。
图27A和图27B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图27A至图27B分别示出了Pro46的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)和核酸序列(SEQ ID NO:24)。
图28A和图28B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图28A至图28B分别示出了Pro349的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)和核酸序列(SEQ ID NO:26)。Pro349和Pro353可形成半COBRA对。
图29A和图29B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图29A至图29B分别示出了Pro353的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)和核酸序列(SEQ ID NO:28)。
图30A和图30B示出了示例性抗B7H3半COBRA。图30A至图30B分别示出了Pro348的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)和核酸序列(SEQ ID NO:30)。Pro348和Pro352可形成半COBRA对。
图31A和图31B示出了示例性抗B7H3半COBRA。图31A至图31B分别示出了Pro352的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)和核酸序列(SEQ ID NO:32)。
图32A和图32B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图32A至图32B分别示出了Pro350的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)和核酸序列(SEQ ID NO:34)。Pro350和Pro354可形成半COBRA对。
图33A和图33B示出了示例性抗EGFR半COBRA。图33A至图33B分别示出了Pro354的氨基酸序列(SEQ ID NO:35)和核酸序列(SEQ ID NO:36)。
对于图16A至图16B、图17A至图17B、图18A至图18B、图19A至图19B、图20A至图20B、图21A至图21B、图22A至图22B、图23A至图23B、图24A至图24B、图25A至图25B、图26A至图26B、图27A至图27B、图28A至图28B、图29A至图29B、图30A至图30B、图31A至图31B、图32A至图32B和图33A至图33B中的抗原结合结构域，CDR加粗体且加单下划线。接头加双下划线。可裂解接头为斜体且加双下划线。斜杠(“/”)表示结构域分隔符。
图34提供了本发明的示例性TTA ABD的氨基酸序列，诸如SEQ ID NO:37、41、45和50的抗EGFR sdAb。CDR加粗且加单下划线，并且对应于图中所示的SEQ ID NO标识符。
图35提供了本发明的示例性TTA ABD的氨基酸序列，诸如SEQ ID NO:54、58和62的抗FOLR1 sdAb。CDR加粗且加单下划线，并且对应于图中所示的SEQ ID NO标识符。
图36提供了本发明的示例性TTA ABD的氨基酸序列，诸如SEQ ID NO:66和68的抗B7H3 sdAb以及SEQ ID NO:74和78的抗EpCAM sdAb。CDR加粗且加单下划线，并且对应于图中所示的SEQ ID NO标识符。
图37提供了本发明的示例性抗HSA结合结构域(半衰期延长结构域)的氨基酸序列，诸如SEQ ID NO:82和86的那些。CDR加粗且加单下划线，并且对应于图中所示的SEQ IDNO标识符。
图38提供了本发明的示例性活性抗CD3可变轻结构域(例如，αCD3 VL，SEQ ID NO:90)和示例性无活性抗CD3可变轻结构域(例如，αCD3 VLi，SEQ ID NO:94；αCD3 VLi2，SEQID NO:98；和αCD3 VLiGL，SEQ ID NO:203)。CDR加粗且加单下划线，并且对应于图中所示的SEQ ID NO标识符。
图39提供了本发明的示例性活性抗CD3可变重结构域(例如，αCD3 VH，SEQ ID NO:102)和示例性无活性抗CD3可变重结构域(例如，αCD3 VHi，SEQ ID NO:106；αCD3 VHi2，SEQID NO:110；和αCD3 VHiGL4，SEQ ID NO:207)。CDR加粗且加单下划线，并且对应于图中所示的SEQ ID NO标识符。
图40提供了示例性抗CD3 scFv接头的氨基酸序列。在一个实施方案中，接头为具有氨基酸序列SEQ ID NO:114的不可裂解接头。在不同实施方案中，接头具有氨基酸序列SEQ ID NO:115。
图41示出了两对半COBRA(Pro348/Pro352和Pro350/Pro354)的组分。表还提供在通过瞬时转染Expi293细胞单独产生时每个半COBRA的产率。
图42示出了使用半COBRA对Pro348/Pro352和Pro350/Pro354从质粒DNA比率优化实验获得的数据。黑色实线示出了如通过His6标签检测到的Pro348/Pro352。灰色实线示出了如通过Strep2标签检测到的Pro348/Pro352。黑色虚线示出了如通过Strep2标签检测到的Pro350/Pro354。灰色虚线示出了如通过His6标签检测到的Pro350/Pro354。
图43显示半COBRA对的每个成员的最佳质粒DNA比率导致共表达的半COBRA的相似产生率。在一些情况下，Pro348和Pro352对的最佳DNA比率为2.5:7.5(Pro348:Pro352)。在一些情况下，Pro350和Pro354对的最佳DNA比率为2:8(Pro350:Pro354)。
图44示出了表达一个半COBRA对的稳定细胞系的产生率。评估了表达Pro348/Pro352的四个稳定克隆(克隆1E9、1F4、3B9和4B12)。评估了表达Pro350/Pro354的三个稳定克隆(克隆3C8、4H3和2G2)。通过Octet分析测量由在不同培养形式(诸如96孔板、12孔板、24孔板和悬浮培养)中的克隆产生的每个Pro构建体的量。
图45A、图45B和图45C示出了来自表达半COBRA对(诸如Pro348/Pro352或Pro350/Pro354)的稳定克隆的集落筛选实验的示例性数据。图45A代表克隆ID号。图45B示出了使用Octet His1K生物传感器检测His标记的Pro352和Pro354的数据。图45C示出了使用OctetSAX生物传感器检测Strep2标记的Pro348和Pro350的数据。
图46示出了来自Pro348/Pro352(克隆1F4、3B9和4B12)和Pro350/Pro354(克隆3C8、4H3和2G2)稳定细胞系的前3种克隆的Octet数据。
具体实施方式
I.引言
本发明涉及制备可用于产生治疗性部分的组合物的方法。具体地，本发明的方法允许产生治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质减少与重要的生理靶标(诸如CD3和肿瘤抗原)结合的双特异性抗体(包括抗体样功能蛋白)的毒性和副作用。许多抗原结合蛋白(诸如抗体)可具有显著的脱靶副作用，并且因此需要仅在疾病组织附近活化治疗分子的结合能力，以避免脱靶相互作用。因此，本发明涉及制备具有许多功能蛋白结构域的多价条件有效性(“MCE”)蛋白的方法。通常，这些结构域中的一个是将结合靶肿瘤抗原(TTA)的抗原结合结构域(ABD)，并且另一个结构域是将在某些条件下结合T细胞抗原(诸如CD3)的ABD。另外，MCE蛋白还包含一个或多个蛋白酶裂解位点。也就是说，以“前药”样形式制备治疗分子，其中CD3结合结构域在暴露于肿瘤环境之前是无活性的。肿瘤环境具有升高水平的蛋白水解活性，使得在暴露于肿瘤环境中的蛋白酶时，前药被裂解并变得有活性。
这通常在本文中通过使用包含针对T细胞抗原(诸如CD3)的“假”可变重结构域和“假”可变轻结构域的蛋白质来实现，所述蛋白质将MCE的CD3 Fv限制为如本文所讨论的无活性形式。当TTA将MCE靶向到肿瘤附近时，MCE因此暴露于蛋白酶。裂解后，活性可变重结构域和活性轻结构域现在能够配对以形成针对CD3的一个或多个活性ABD，从而将T细胞募集至肿瘤，从而实现治疗。
然而，将两种蛋白质用于单一机制会导致将这些分子作为药物产生的问题。一种解决方案是形成两个表达细胞系，每个细胞系表达不同的半COBRA，然后可以单独表达并纯化这两个半COBRA，并混合以产生前药混合物。不幸的是，这是耗时且昂贵的生产大剂量药物混合物的过程。另一种解决方案是在同一细胞中共表达两个半COBRA，并且然后从同一条件培养基中分别或一起对其进行纯化。
因此，本发明涉及在某些条件下共表达并共纯化可结合CD3和肿瘤抗原的互补治疗分子对的方法。所述方法可用于以约等摩尔比产生互补对的每种蛋白质。还提供了表达互补治疗分子对的稳定细胞系。
本发明还涉及产生治疗性分子的方法，所述治疗性分子可减少与重要的生理靶标(诸如CD3和肿瘤抗原)结合的双特异性抗体(包括抗体样功能蛋白)的毒性和副作用。许多抗原结合蛋白(诸如抗体)可具有显著的脱靶副作用，并且因此需要仅在疾病组织附近活化治疗分子的结合能力，以避免肿瘤外相互作用。因此，本发明涉及具有许多功能蛋白结构域的条件有效性蛋白。通常，这些结构域中的一个是将结合靶肿瘤抗原(TTA)的抗原结合结构域(ABD)，并且另一个结构域是将在某些条件下结合T细胞抗原(诸如CD3)的ABD的一部分，所述某些条件诸如当ABD的所述部分非常接近ABD的互补部分以形成抗CD3 Fv结合结构域时。也就是说，以“前药”样形式制备治疗分子，其中CD3结合结构域在暴露于肿瘤环境之前是无活性的。当肿瘤环境过表达蛋白酶时，治疗分子的前药经历裂解以产生活性治疗分子。
在本发明中，前药(例如，未裂解的)形式的前药多肽包含“假VL结构域”或“假VH结构域”。互补前药构建体的示意图在图1中示出。假可变重结构域和假可变轻结构域含有标准框架区，但含有“无活性”(“惰性”或“虚拟”)CDR。然而，由于假结构域的“惰性”CDR，所得ABD将不会结合CD3，从而防止蛋白水解无活性组织中的脱靶毒性。然而，在肿瘤中或附近存在蛋白酶的情况下，前药构建体以允许“真”可变重结构域和可变轻结构域缔合的方式裂解，从而触发活性CD3结合并导致抗肿瘤功效。
前药活化可如图1和图2中一般所示发生。在图1中，前药构建体Pro16在活性VH结构域和假VL结构域(也称为VLi结构域)之间具有一个裂解位点(例如，FLAG位点)，并且前药构建体Pro19在假VH结构域(也称为VHi结构域)和活性VL结构域之间具有一个裂解位点(例如，FLAG位点)。通过EK进行蛋白水解裂解后，Pro16的VLi结构域和Pro19的VHi结构域从它们各自的前药构建体中释放出来，从而留下由于抗CD3可变重结构域和可变轻结构域的先天性自我组装而在表达EGFR的细胞表面上缔合的两个分子，每个分子还具有肿瘤抗原的抗原结合结构域，从而允许T细胞募集到肿瘤部位。
II.定义
为了可以更彻底地理解本申请，下文阐述几种定义。此类定义意图涵盖语法等效物。
术语“COBRATM”和“条件性双特异性重定向活化”是指具有许多功能蛋白结构域的双特异性条件有效性蛋白。在一些实施方案中，功能结构域中的一个是结合靶肿瘤抗原(TTA)的抗原结合结构域(ABD)。在某些实施方案中，另一个结构域是在某些条件下结合T细胞抗原的ABD。T细胞抗原包括但不限于CD3。术语“半COBRATM”是指当半COBRA的可变重链可与另一个半COBRATM(互补半COBRATM)的可变轻链由于集中在靶标表达细胞的表面上时先天性自我组装而缔合时可结合T细胞抗原的条件有效性蛋白。
如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指20种天然存在的氨基酸或可存在于特定的限定位置处的任何非天然类似物中的一种。在许多实施方案中，“氨基酸”意指20种天然存在的氨基酸中的一种。在本文中，“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键或合成的肽模拟物结构(即“类似物”，诸如类肽)组成(参见例如Simon等人,PNAS USA 89(20):9367(1992))，尽管通常优选仅包含天然存在的氨基酸的蛋白质。因此，如本文所用，“氨基酸”或“肽残基”意指天然存在的氨基酸和合成氨基酸。例如，高苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被认为是用于本发明的目的的氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基，诸如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可为(R)或(S)构型。在优选的实施方案中，氨基酸为(S)或L-构型。如果使用非天然存在的侧链，则可使用非氨基酸取代基，以例如防止或延迟在体内降解。
在本文中，“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或对化学连接至蛋白质的部分的改变。例如，修饰可为连接至蛋白质的改变的碳水化合物或PEG结构。为了清楚起见，除非另有说明，否则氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如DNA和RNA中具有密码子的20种氨基酸。本文中优选的氨基酸修饰为取代。
在本文中，“氨基酸取代”或“取代”意指以不同氨基酸替换亲本多肽序列的特定位置处的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代是置换成在特定位置处未天然存在的氨基酸，也是生物体内或任何生物体内未天然存在的氨基酸。为了清楚起见，被工程化来改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如，将CGG(编码精氨酸)转换成CGA(仍编码精氨酸)，以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白质的新基因，但是如果所述蛋白质在其起始的特定位置处具有相同的氨基酸，则它不是氨基酸取代。
如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列的特定位置处添加氨基酸序列。
如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列的特定位置处除去氨基酸序列。
如本文所概述，本发明的多肽特异性结合CD3和靶肿瘤抗原(TTA)(诸如靶细胞受体)。“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定抗原或表位意指与非特异性相互作用明显不同的结合。特异性结合可例如通过测定与对照分子结合相比的分子结合来测量，对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，特异性结合可通过与类似于靶标的对照分子竞争来测定。
对特定抗原或表位的特异性结合可例如由针对抗原或表位的KD为至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、可替代地至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更大的抗体来展现，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。通常，特异性结合抗原的抗体对于对照分子的KD为相对于所述抗原或表位20、50、100、500、1000、5,000、10,000倍或更大倍数。
此外，对特定抗原或表位的特异性结合可例如由对抗原或表位的KA或Ka为相对于对照至少20、50、100、500、1000、5,000、10,000倍或更大倍数的抗体展现，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。结合亲和力通常使用如本领域已知的Biacore测定法或Octet测量。
如本文所用，“亲本多肽”或“前体多肽”(包括Fc亲本或前体)意指随后修饰以产生变体的多肽。亲本多肽可为天然存在的多肽或天然存在的多肽的变体或工程化版本。亲本多肽可指多肽本身、包含亲本多肽的组合物或编码所述多肽的氨基酸序列。因此，如本文所用，“亲本Fc多肽”意指被修饰以产生变体的未修饰Fc多肽，并且如本文所用，“亲本抗体”意指被修饰以产生变体抗体的未修饰抗体。
如本文所用，“位置”意指蛋白质序列中的位置。位置可按顺序编号或根据确立的形式(例如用于抗体编号的EU索引)编号。
如本文所用，“靶抗原”意指与给定抗体的可变区特异性结合的分子。靶抗原可为蛋白质、碳水化合物、脂质或其他化学化合物。本文描述了一系列合适的示例性靶抗原。
如本文所用，“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。
如本文所用，“Fv”或“Fv结构域”或“Fv区”意指包含抗体(通常为人IgG1抗体)的VL和VH结构域的多肽。如果Fv结构域含有活性VH和VL结构域并且不具有限制性接头(constrained linker)，则它们通常形成如本文所讨论的“抗原结合结构域”或“ABD”。如下文所讨论，在本发明中，Fv结构域可以多种方式组织，并且可为“活性的”或“无活性的”，诸如呈scFv形式、限制性Fv形式、假Fv形式等。
在本文中，“可变结构域”意指包含一个或多个Ig结构域的免疫球蛋白的区域，所述Ig结构域基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因座的Vκ、Vλ和/或VH基因中的任一个编码。
每个VH和VL由按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列的三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个“框架区”或“FR”组成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。因此，VH结构域具有结构vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4，并且VL结构域具有结构vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4。如本文更充分描述的，vhFR区和vlFR区自我组装以形成Fv结构域。通常，在本发明的前药形式中，存在“假Fv结构域”，其CDR当自我缔合时不形成抗原结合结构域。
高变区赋予抗原结合特异性，并且通常涵盖来自轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中的大致约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)的氨基酸残基；Kabat等人,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)和/或形成轻链可变区中的高变环的那些残基(例如，残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3))以及形成重链可变区中的高变环的那些残基26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)以及96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。下文描述了本发明的特定CDR。
如本领域技术人员将理解的，CDR的确切编号和布置在不同的编号系统中可不同。然而，应理解，可变重和/或可变轻序列的公开内容包括相关(固有)CDR的公开内容。因此，每个可变重区的公开内容为vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个可变轻区的公开内容为vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。
CDR编号的可用比较如下，参见Lafranc等人,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003)：
表1
Figure BDA0002967132110000221
Figure BDA0002967132110000231
在整个本说明书中，总体上在提及可变结构域(大约轻链可变区的1-107个残基和重链可变区的1-113个残基)中的残基时使用Kabat编号系统并且对于Fc区使用EU编号系统(例如Kabat等人，同上(1991))。
本发明提供了大量不同的CDR组。在此情况下，“完整CDR组”包含三个可变轻CDR和三个可变重CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。如本领域技术人员将理解的，每组CDR(VH和VL CDR)可单独或作为一组结合抗原。例如，在限制性Fv结构域中，vhCDR可结合例如CD3，并且vlCDR可结合CD3，但是在限制性形式中它们不能结合CD3。
这些CDR可分别为较大可变轻结构域或可变重结构域的一部分。另外，如本文更充分概述的，可变重结构域和可变轻结构域可位于单独的多肽链上或在scFv序列的情况下位于单一多肽链上。
CDR有助于形成抗原结合，或更具体地形成表位结合位点。“表位”是指与可变区中称为互补位的特异性抗原结合位点相互作用的决定簇。表位为诸如氨基酸或糖侧链的分子的组群，并且通常具有特定结构特征以及特定电荷特征。单个抗原可具有超过一个表位。
表位可包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其他氨基酸残基，诸如被特异性抗原结合肽有效地阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基是在特异性抗原结合肽的足迹内。
表位可为构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的在空间上并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象表位和非构象表位的区别可在于，在变性溶剂存在下丧失与构象表位的结合而不与非构象表位的结合。
表位通常在独特的空间构象中包含至少3个并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可在简单的免疫测定法中得到验证，所述免疫测定法显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力，例如“聚类(binning)”。如下文所概述，本发明不仅包括本文中列举的抗原结合结构域和抗体，而且还包括与由列举的抗原结合结构域结合的表位竞争结合的那些。
本发明的可变重结构域和可变轻结构域可为“活性的”或“无活性的”。
如本文所用，“无活性VH”(“VHi”)和“无活性VL”(“VLi”)是指假Fv结构域的组分，所述组分在分别与其同源VL或VH配偶体配对时形成所得VH/VL对，所述VH/VL对如果与并非“无活性”的类似VL或VH结合，则其不会特异性结合“活性”VH或“活性”VL将结合的抗原。示例性“无活性VH”和“无活性VL”结构域通过野生型VH或VL序列的突变形成。示例性突变是在VH或VL的CDR1、CDR2或CDR3内。示例性突变包括将结构域接头置于CDR2内，从而形成“无活性VH”或“无活性VL”结构域。相反，“活性VH”或“活性VL”在分别与其“活性”同源配偶体(即VL或VH)配对时能够特异性结合其靶抗原。
相反，如本文所用，术语“活性的”是指能够特异性结合CD3的CD3结合结构域。此术语在以下两种情况下使用：(a)在提及Fv结合对的单个成员(即VH或VL)时，所述单个成员的序列能够与其同源配偶体配对并特异性结合CD3；以及(b)同源物对(即VH和VL)，其序列能够特异性结合CD3的。示例性“活性”VH、VL或VH/VL对为野生型或亲本序列。
“CD-x”是指分化簇(CD)蛋白。在示例性实施方案中，CD-x选自在已施用本发明的多肽构建体的受试者中具有募集或活化T细胞的作用的那些CD蛋白。在一个示例性实施方案中，CD-x为CD3。
结合本发明，术语“结合结构域”表征分别(特异性)结合靶分子(抗原)(例如：EGFR和CD3)上的给定靶表位或给定靶位点/与所述给定靶表位或给定靶位点相互作用/识别所述给定靶表位或给定靶位点的结构域。靶抗原结合结构域的结构和功能(识别EGFR)以及优选地还有CD3结合结构域的结构和/或功能(识别CD3)是基于抗体(例如全长或完整免疫球蛋白分子，包括sdAb)的结构和/或功能。根据本发明，靶抗原结合结构域的特征通常在于结合靶肿瘤抗原的三个CDR(在本领域中通常称为可变重结构域，尽管不存在相应的轻链CDR)的存在。或者，TTA的ABD可包含三个轻链CDR(即，VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即，VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。CD3结合结构域优选地还包含允许靶结合的抗体的至少最低结构要求。更优选地，CD3结合结构域包含至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。设想的是，在示例性实施方案中，靶抗原和/或CD3结合结构域通过噬菌体展示或文库筛选方法产生或可获得。
如本文所用，“结构域”意指如本文所概述的具有功能的蛋白质序列。本发明的结构域包括肿瘤靶抗原结合结构域(TTA结构域)、可变重结构域、可变轻结构域、接头结构域和半衰期延长结构域。
在本文中，“结构域接头”(“DL”)意指连接如本文所概述的两个结构域的氨基酸序列。结构域接头可为可裂解接头、限制性可裂解接头、不可裂解接头、限制性不可裂解接头、scFv接头等。
在本文中，“可裂解接头”(“CL”)意指如本文所概述的可被疾病组织中的蛋白酶(优选地人蛋白酶)裂解的氨基酸序列。可裂解接头的长度通常为至少3个氨基酸，其中根据所需的柔性，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸可用于本发明。
在本文中，“不可裂解接头”(“NCL”)意指在正常生理条件下不能被人蛋白酶裂解的氨基酸序列。
在本文中，“限制性可裂解接头”(“CCL”)意指含有以一种方式连接如本文所概述的两个结构域的蛋白酶裂解位点(如本文所定义)的短多肽，所述方式使得两个结构域不能彼此显著相互作用，直到它们驻留在不同的多肽链上(例如，裂解之后)。当CCL连接如本文所定义的VH和VL结构域时，VH和VL由于空间限制而不能在裂解之前以分子间方式自我组装形成功能性Fv。在被相关蛋白酶裂解后，VH和VL可以分子间方式组装以形成活性抗原结合结构域。通常，CCL的长度小于10个氨基酸，其中9、8、7、6、5和4个氨基酸可用于本发明。通常，蛋白酶裂解位点的长度通常为至少4+个氨基酸，以赋予足够的特异性，如图14A至图14C所示。
在本文中，“限制性不可裂解接头”(“CNCL”)意指短多肽，所述短多肽以两个结构域不能彼此显著相互作用的方式连接如本文所概述的两个结构域，并且在生理条件下不被人蛋白酶显著裂解。
在本文中，“限制性Fv结构域”意指如下Fv结构域，其包含活性可变重结构域和活性可变轻结构域，这些结构域以一种方式与如本文所概述的限制性接头共价连接，使得活性重可变结构域和轻可变结构域不能在分子内相互作用形成将结合抗原(诸如CD3)的活性Fv。因此，限制性Fv结构域为与scFv相似但由于存在限制性接头而不能结合抗原的结构域。
在本文中，“假Fv结构域”意指包含使用结构域接头(其可为可裂解的、限制性、不可裂解的、非限制性等)连接的假或无活性可变重结构域和假或无活性可变轻结构域。假Fv结构域的VHi和VLi结构域在彼此缔合(VHi/VLi)时或与活性VH或VL缔合时不结合人抗原；因此，VHi/VLi、VHi/VL和VLi/VH Fv结构域并未明显结合人蛋白质，使得这些结构域在人体内为惰性的。
在本文中，“单链Fv”或“scFv”意指通常使用如本文所讨论的scFv接头共价连接至可变轻(VL)结构域以形成scFv或scFv结构域的可变重(VH)结构域。scFv结构域可呈N端到C端的任何取向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)上。
在本文中，“单结构域Fv”、“sdFv”、“单结构域抗体”或“sdAb”意指通常基于骆驼科抗体技术仅具有三个CDR的抗原结合结构域。参见：Protein Engineering 9(7):1129-35(1994)；Rev Mol Biotech 74:277-302(2001)；Ann Rev Biochem 82:775-97(2013)。
“蛋白酶裂解位点”是指被蛋白酶识别和裂解的氨基酸序列。下文概述了合适的蛋白酶裂解位点。
如本文所用，“蛋白酶裂解结构域”是指包含“蛋白酶裂解位点”以及个别蛋白酶裂解位点之间和一个或多个蛋白酶裂解位点与本发明构建体的其他功能组分(例如，VH、VL、VHi、VLi、一个或多个靶抗原结合结构域、半衰期延长结构域等)之间的任何接头的肽序列。
如本文所用，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指包含抗体的恒定区，排除第一恒定区免疫球蛋白结构域并且在一些情况下排除铰链的部分的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域以及这些结构域N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及在Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的低级铰链区。虽然Fc区的边界可能变化，但通常所界定的人IgG重链Fc区包含其羧基端的残基C226或P230，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。
在量、比率、水平等的背景下，“基本上等同”是指接近相等或相等的数量。在一些实施方案中，基本上等同的量是指两个量之间10％或更小的差异，例如10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的差异。在一些实施方案中，基本上等同的量是指两个相等或相同的量、比率、水平或数量。在一些情况下，基本上等同的量的多肽是指相等量的第一多肽和第二多肽。在一些情况下，基本上等同的比率的多核苷酸是指相等量的第一多核苷酸和第二多核苷酸。
III.实施方案描述
A.多肽对和前药构建体
在一些实施方案中，多肽具有结构(N端至C端)：sdAb(TTA)-DL-hFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CL-vlFR1-vliC DR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4。在一些实施方案中，CDR和/或可变结构域(例如，活性重链结构域或假轻链)是图16A、图18A、图20A、图22A、图24A、图26A、图28A、图38和图39中描绘的那些中的任一个。在一些实施方案中，多肽的sdAb(TTA)是图34、图35和图36中描绘的那些中的任一个。在某些实施方案中，多肽具有选自由以下组成的组的任一个的结构：Pro6(SEQ ID NO:2)、Pro16(SEQ ID NO:5)、Pro39(SEQ ID NO:9)、Pro41(SEQ ID NO:13)、Pro43(SEQ ID NO:17)、Pro45(SEQ ID NO:21)和Pro349(SEQ ID NO:25)。
在一个实施方案中，多肽具有结构(N端至C端)：vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4-CL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-DL-sdAb(TTA)。在一些实施方案中，CDR和/或可变结构域(例如，假重链结构域或活性轻链)是图17A、图38和图39的那些。在一些实施方案中，多肽的sdAb(TTA)是图34、图35和图36中描绘的那些中的任一个。在某些实施方案中，多肽具有结构Pro7(SEQ ID NO:3)。
在各种实施方案中，多肽具有结构(N端至C端)：sdAb(TTA)-DL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-CL-vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4。在一些实施方案中，CDR和/或可变结构域(例如，假重链结构域或活性轻链)是图19A、图21A、图23A、图25A、图27A、图29A、图38和图39中描绘的那些中的任一个。在一些实施方案中，多肽的sdAb(TTA)是图34、图35和图36中描绘的那些中的任一个。在某些实施方案中，多肽具有选自由以下组成的组的任一个的结构：Pro19(SEQ ID NO:7)、Pro40(SEQ IDNO:11)、Pro42(SEQ ID NO:15)、Pro44(SEQ ID NO:19)、Pro46(SEQ ID NO:23)和Pro353(SEQ ID NO:27)。
在一个实施方案中，本文提供了一种前药组合物(或前药构建体)，其包含有包含结构sdAb(TTA)-DL-vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CL-vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4的第一多肽和包含结构vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4-CL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-DL-sdAb(TTA)的第二多肽。在一些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含有包含图16A所示的结构的第一多肽和包含图17A所示的结构的第二多肽。在某些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含Pro6和Pro7。在一些情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb相同的抗原。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb相同的抗原表位。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb不同的抗原。
在一些实施方案中，本文提供了一种前药组合物(或前药构建体)，其包含有包含结构sdAb(TTA)-DL-vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CL-vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4的第一多肽和包含结构sdAb(TTA)-DL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-CL-vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4的第二多肽。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb相同的抗原表位。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb不同的抗原。
在一些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含有包含图18A所示的结构的第一多肽和包含图19A所示的结构的第二多肽。在一些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含Pro16和Pro19。
在一些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含有包含图20A所示的结构的第一多肽和包含图21A所示的结构的第二多肽。在某些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含Pro39和Pro40。
在一些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含有包含图22A所示的结构的第一多肽和包含图23A所示的结构的第二多肽。在特定实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含Pro41和Pro42。
在一些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含有包含图24A所示的结构的第一多肽和包含图25A所示的结构的第二多肽。在一些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含Pro43和Pro44。
在一些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含有包含图26A所示的结构的第一多肽和包含图27A所示的结构的第二多肽。在一些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含Pro45和Pro46。
.在一些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含有包含图28A所示的结构的第一多肽和包含图29A所示的结构的第二多肽。在某些实施方案中，前药组合物(或前药构建体)包含Pro349和Pro353。
B.表达载体和宿主细胞
在一个实施方案中，本文提供了一种表达载体，其包含编码包含结构sdAb(TTA)-DL-hFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CL-vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4的第一多肽的第一多核苷酸；和/或编码包含结构vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4-CL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-DL-sdAb(TTA)的第二多肽的第二多核苷酸。在一些情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb相同的抗原(TTA)。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb相同的抗原表位。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb不同的抗原。
在另一个实施方案中，本文提供了一种宿主细胞，其包含编码包含结构sdAb(TTA)-DL-hFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CL-vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4的第一多肽的第一多核苷酸；和/或编码包含结构vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4-CL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-DL-sdAb(TTA)的第二多肽的第二多核苷酸。在一些情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb相同的抗原。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb相同的抗原表位。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb不同的抗原。在一个实施方案中，本文提供了一种细胞，其表达(产生或分泌)包含结构sdAb(TTA)-DL-hFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CL-vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4的第一多肽和包含结构vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4-CL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-DL-sdAb(TTA)的第二多肽。
在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图16A所示；和/或编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图17A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码包含图16A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸和/或编码包含图17A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，表达载体包含图16B所示的第一核酸序列和/或图17B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含与SEQID NO:2具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列和/或与SEQ ID NO:4具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码Pro6的核酸序列(SEQ ID NO:2)和/或编码Pro7的核酸序列(SEQ ID NO:4)。
在本发明的一些实施方案中，宿主细胞包含有包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一表达载体，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图16A所示；和包含编码第二多肽的第二多核苷酸的第二表达载体，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图17A所示。在一些情况下，宿主细胞包含有包含图16B所示的第一核酸序列的第一表达载体和包含图17B所示的第二核酸序列的第二表达载体。在一些情况下，宿主细胞包含有包含与SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的核酸序列的第一表达载体；和包含与SEQ ID NO:4具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的核酸序列的第二表达载体。在一些情况下，宿主细胞包含有包含编码Pro6的核酸序列(诸如SEQ ID NO:2)的第一表达载体和包含编码Pro7的核酸序列(诸如SEQ ID NO:4)的第二表达载体。
在一些实施方案中，本文提供了一种表达载体，其包含编码包含结构sdAb(TTA)-DL-hFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CL-vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4的第一多肽的第一多核苷酸；和/或编码包含结构sdAb(TTA)-DL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-CL-vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4的第二多肽的第二多核苷酸。在一些情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb相同的抗原。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb相同的抗原表位。在一些情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb不同的抗原表位。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb不同的抗原。
在一些方面，本文提供了一种宿主细胞，其包含编码包含结构sdAb(TTA)-DL-hFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CL-vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4的第一多肽的第一多核苷酸；和/或编码包含结构sdAb(TTA)-DL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-CL-vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4的第二多肽的第二多核苷酸。在一些情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb相同的抗原。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb相同的抗原表位。在一些情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb不同的抗原表位。在其他情况下，第一多肽的sdAb结合与第二多肽的sdAb不同的抗原。在一些实施方案中，本文提供了一种细胞，其表达(产生或分泌)包含结构sdAb(TTA)-DL-hFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CL-vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4的第一多肽和包含结构sdAb(TTA)-DL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-CL-vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4的第二多肽。
在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图18A所示；和/或编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图19A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码包含图18A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸和/或编码包含图19A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，表达载体包含图18B所示的第一核酸序列和/或图19B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含与SEQID NO:6具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列和/或与SEQ ID NO:8具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码Pro16的核酸序列(诸如SEQ ID NO:6)和/或编码Pro19的核酸序列(诸如SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含有包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一表达载体，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图18A所示；和包含编码第二多肽的第二多核苷酸的第二表达载体，所述第二多肽包含与SEQ IDNO:7具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图19A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码包含图18A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码包含图19A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，第一表达载体包含图18B所示的第一核酸序列，并且第一表达载体包含图19B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含与SEQ ID NO:6具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列，并且第二表达载体包含与SEQ ID NO:8具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码Pro16的核酸序列(诸如SEQ ID NO:6)，并且第二表达载体包含编码Pro19的核酸序列(诸如SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图20A所示；和/或编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图21A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码包含图20A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸和/或编码包含图21A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，表达载体包含图20B所示的第一核酸序列和/或图21B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含与SEQ ID NO:10具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列和/或与SEQ ID NO:12具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码Pro39的核酸序列(诸如SEQ ID NO:10)和/或编码Pro40的核酸序列(诸如SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含有包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一表达载体，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图20A所示；和包含编码第二多肽的第二多核苷酸的第二表达载体，所述第二多肽包含与SEQ IDNO:11具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图21A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码包含图20A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码包含图21A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，第一表达载体包含图20B所示的第一核酸序列，并且第一表达载体包含图21B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含与SEQ IDNO:10具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列，并且第二表达载体包含与SEQ ID NO:12具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码Pro39的核酸序列(诸如SEQID NO:10)，并且第二表达载体包含编码Pro40的核酸序列(诸如SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图22A所示；和/或编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:15具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图23A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码包含图22A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸和/或编码包含图23A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，表达载体包含图22B所示的第一核酸序列和/或图23B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含与SEQ ID NO:14具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列和/或与SEQ ID NO:16具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码Pro41的核酸序列(诸如SEQ ID NO:14)和/或编码Pro42的核酸序列(诸如SEQ ID NO:16)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含有包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一表达载体，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图22A所示；和包含编码第二多肽的第二多核苷酸的第二表达载体，所述第二多肽包含与SEQ IDNO:15具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图23A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码包含图22A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码包含图23A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，第一表达载体包含图22B所示的第一核酸序列，并且第一表达载体包含图23B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含与SEQ IDNO:14具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列，并且第二表达载体包含与SEQ ID NO:16具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码Pro41的核酸序列(诸如SEQID NO:14)，并且第二表达载体包含编码Pro42的核酸序列(诸如SEQ ID NO:16)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图24A所示；和/或编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:19具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图25A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码包含图24A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸和/或编码包含图25A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，表达载体包含图24B所示的第一核酸序列和/或图25B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含与SEQ ID NO:18具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列和/或与SEQ ID NO:20具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码Pro43的核酸序列(诸如SEQ ID NO:18)和/或编码Pro44的核酸序列(诸如SEQ ID NO:20)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含有包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一表达载体，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图24A所示；和包含编码第二多肽的第二多核苷酸的第二表达载体，所述第二多肽包含与SEQ IDNO:19具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图25A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码包含图24A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码包含图25A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，第一表达载体包含图24B所示的第一核酸序列，并且第一表达载体包含图25B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含与SEQ IDNO:18具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列，并且第二表达载体包含与SEQ ID NO:20具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码Pro43的核酸序列(诸如SEQID NO:18)，并且第二表达载体包含编码Pro44的核酸序列(诸如SEQ ID NO:20)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:21具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图26A所示；和/或编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图27A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码包含图26A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸和/或编码包含图27A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，表达载体包含图26B所示的第一核酸序列和/或图27B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列和/或与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码Pro45的核酸序列(诸如SEQ ID NO:22)和/或编码Pro46的核酸序列(诸如SEQ ID NO:24)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含有包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一表达载体，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:21具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图26A所示；和包含编码第二多肽的第二多核苷酸的第二表达载体，所述第二多肽包含与SEQ IDNO:23具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图27A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码包含图26A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码包含图27A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，第一表达载体包含图26B所示的第一核酸序列，并且第一表达载体包含图27B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含与SEQ IDNO:22具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列，并且第二表达载体包含与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码Pro45的核酸序列(诸如SEQID NO:22)，并且第二表达载体包含编码Pro46的核酸序列(诸如SEQ ID NO:24)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图28A所示；和/或编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:27具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图29A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码包含图28A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸和/或编码包含图29A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，表达载体包含图28B所示的第一核酸序列和/或图29B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含与SEQ ID NO:26具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列和/或与SEQ ID NO:28具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码Pro349的核酸序列(诸如SEQ ID NO:26)和/或编码Pro353的核酸序列(诸如SEQ ID NO:28)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含有包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一表达载体，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图28A所示；和包含编码第二多肽的第二多核苷酸的第二表达载体，所述第二多肽包含与SEQ IDNO:27具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图29A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码包含图28A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码包含图29A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，第一表达载体包含图28B所示的第一核酸序列，并且第一表达载体包含图29B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含与SEQ IDNO:26具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第一核酸序列，并且第二表达载体包含与SEQ ID NO:28具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码Pro349的核酸序列(诸如SEQID NO:26)，并且第二表达载体包含编码Pro353的核酸序列(诸如SEQ ID NO:28)。
在一些方面，本发明的细胞表达(产生或分泌)本文所述的多肽对或半COBRA中的任一个。在一些实施方案中，细胞表达(产生或分泌)Pro16和Pro19。在某些实施方案中，细胞表达(产生或分泌)Pro39和Pro40。在特定实施方案中，细胞表达(产生或分泌)Pro41和Pro42。在一些实施方案中，细胞表达(产生或分泌)Pro43和Pro44。在一些实施方案中，细胞表达(产生或分泌)Pro45和Pro46。在某些实施方案中，细胞表达(产生或分泌)Pro349和Pro353。
在一些实施方案中，本文所述的多肽中的任一种还包含半衰期延长结构域。在某些情况下，半衰期延长结构域(诸如抗HSA结构域)位于假重链结构域、假轻链结构域或多肽的C末端。在一些实施方案中，本文所述的多肽中的任一种还包含可用于纯化的蛋白质标签。在一些实施方案中，多肽中的任一种包含组氨酸(His6)标签、链霉亲和素(StrepII)标签、其片段或其变体。
C.表达多肽对的稳定细胞
可通过在宿主细胞中共表达编码互补对的每个多肽的多核苷酸并共纯化互补对来产生结合如本文所述的CD3和一种或多种肿瘤靶抗原(TTA)的蛋白质互补对。在一些实施方案中，细胞产生并分泌蛋白质互补对。在一些实施方案中，蛋白质互补对的第一多肽和第二多肽以约等摩尔比(例如，约1:1的比率)产生。换句话说，宿主细胞产生基本上等同(几乎相等或相等)的量的第一多肽和第二多肽。在其他实施方案中，第一多肽和第二多肽以非等摩尔的比率(例如，不是约1:1的比率)产生。
在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸以约1:1的多核苷酸比率引入宿主细胞中。在其他实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸(或第一表达载体)的量和编码第二多肽的第二多核苷酸(或表达载体)的量以不是1:1的比率(诸如大于1:1的比率或小于1:1的比率)引入宿主细胞中。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸以选自由以下比率组成的组的多核苷酸比率引入宿主细胞：8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45和1:50。在一些实施方案中，多核苷酸比率选自由以下组成的组：编码本文所述的第一多肽的第一多核苷酸和编码本文所述的第二多肽的第二多核苷酸分别为8:2、7:3、4:6、5:5、4:6和3:7。在一些实施方案中，多核苷酸比率选自由以下组成的组：编码本文所述的第一多肽的第一多核苷酸和编码本文所述的第二多肽的第二多核苷酸分别为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3。
在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的引入本文所述的宿主细胞中的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多肽包含与EQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:25具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:27具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多肽选自由以下组成的组：具有SEQ ID NO:2的Pro6、具有SEQ IDNO:5的Pro16、具有SEQ ID NO:9的Pro39、具有SEQ ID NO:13的Pro41、具有SEQ ID NO:17的Pro43、具有SEQ ID NO:21的Pro45和具有SEQ ID NO:25的Pro349，并且第二多肽选自由以下组成的组：具有SEQ ID NO:3的Pro7、具有SEQ ID NO:7的Pro19、具有SEQ ID NO:11的Pro40、具有SEQ ID NO:15的Pro42、具有SEQ ID NO:19的Pro44、具有SEQ ID NO:23的Pro46和具有SEQ ID NO:27的Pro353。
在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的引入宿主细胞中的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多肽和第二多肽对(例如，第一多肽/第二多肽)选自Pro6/Pro7、Pro16/Pro19、Pro39/Pro40、Pro41/Pro42、Pro43/Pro44、Pro45/Pro46和Pro349/Pro353。
在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的引入宿主细胞中的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的引入宿主细胞中的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多核苷酸包含与SEQ ID NO:10具有至少85％序列同一性的核酸序列，并且第二多核苷酸包含与SEQ ID NO:12具有至少85％序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的引入宿主细胞中的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO:15具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多核苷酸包含与SEQ ID NO:14具有至少85％序列同一性的核酸序列，并且第二多核苷酸包含与SEQ ID NO:16具有至少85％序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的引入宿主细胞中的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO:19具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多核苷酸包含与SEQ ID NO:18具有至少85％序列同一性的核酸序列，并且第二多核苷酸包含与SEQ ID NO:20具有至少85％序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的引入宿主细胞中的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多肽包含与SEQ ID NO:21具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多核苷酸包含与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性的核酸序列，并且第二多核苷酸包含与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的引入宿主细胞中的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO:27具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多核苷酸包含与SEQ ID NO:26具有至少85％序列同一性的核酸序列，并且第二多核苷酸包含与SEQ ID NO:28具有至少85％序列同一性的核酸序列。
IV.本发明的蛋白质
本发明的蛋白质具有以多种方式连接在一起的许多不同组分，在本文中通常称为结构域。一些结构域为各自结合靶抗原(例如，例如TTA或CD3)的结合结构域。由于它们结合超过一种抗原，因此它们在本文中称为“多特异性的”；例如，本发明的前药构建体可结合TTA和CD3，并因此是“双特异性的”。
本发明的蛋白质可包含以本文概述的多种方式排列的CD3抗原结合结构域、肿瘤靶抗原结合结构域、半衰期延长结构域、接头等。
在一些实施方案中，第一蛋白包含第一肿瘤靶抗原结构域，并且第二蛋白包含第二肿瘤靶抗原结构域，使得第一肿瘤靶抗原结构域和第二肿瘤靶抗原结构域结合相同肿瘤靶抗原。在某些情况下，第一肿瘤靶抗原结构域和第二肿瘤靶抗原结构域结合同一肿瘤靶抗原的不同表位、区域或部分。在一些情况下，第一肿瘤靶抗原结构域和第二肿瘤靶抗原结构域结合不同的肿瘤靶抗原。
本发明的蛋白质可通过在细胞中共表达并共纯化以获得可与CD3和肿瘤靶抗原结合的蛋白质互补对来产生。在一些实施方案中，单独对每个蛋白质互补对进行纯化。在一些实施方案中，同时或伴随地对每个蛋白质互补对进行纯化。
在一些实施方案中，表达载体包含编码蛋白质互补对中的一个蛋白质的核酸序列和编码蛋白质互补对中的另一个蛋白质的核酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含此种表达载体。在一些情况下，可在合适条件下在培养基中培养此种宿主细胞以产生蛋白质。在一些实施方案中，在合适条件下培养宿主细胞以将本文所述的蛋白质分泌到培养基中。在某些实施方案中，对包含本发明的分泌的蛋白质的培养基进行纯化以获得蛋白质互补对的蛋白质。可用的纯化方法包括但不限于蛋白A色谱法、蛋白G色谱法、肝素结合、反相色谱法、HIC色谱法、CHT色谱法、亲和色谱法、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法等。
D.CD3抗原结合结构域
T细胞应答的特异性由T细胞受体复合物对抗原(在主要组织相容性复合物MHC的情况下显示)的识别所介导。作为T细胞受体复合物的一部分，CD3是包含存在于细胞表面上的CD3γ(gamma)链、CD3δ(delta)链和两条CD3ε(epsilon)链的蛋白质复合物。CD3与T细胞受体(TCR)的α(alpha)和β(beta)链以及CD-ζ(zeta)一起缔合以构成T细胞受体复合物。CD3在T细胞上聚集(诸如通过与CD3结合的Fv结构域)导致T细胞活化，其类似于T细胞受体的接合，但与其典型的克隆特异性无关。
然而，如本领域中已知的，CD3活化可引起许多毒性副作用，并且因此，本发明旨在仅在肿瘤细胞存在下提供本发明的多肽的活性CD3结合，其中发现特定蛋白酶，其然后裂解本发明的前药多肽以提供活性CD3结合结构域。因此，在本发明中，抗CD3 Fv结构域与CD3的结合由蛋白酶裂解结构域调节，所述蛋白酶裂解结构域仅在具有升高水平的蛋白酶的患病细胞或组织的微环境中(例如在如本文所述的肿瘤微环境中)限制CD3 Fv结构域与CD3的结合。
因此，本发明提供了两组VH和VL结构域，即活性组(VH和VL)和无活性组(VHi和VLi)，其中所有四个结构域都存在于一个或多个前药构建体中。将构建体格式化，使得VH和VL组不能自我缔合，而是与无活性配偶体缔合，所述无活性配偶体例如如本文所示的VHi和VL以及VLi和VH。
存在许多本领域已知的可用于本发明的许多合适的活性CDR组和/或VH和VL结构域。例如，CDR和/或VH和VL结构域衍生自已知的抗CD3抗体，例如像莫罗单抗(muromonab)-CD3(OKT3)、奥昔珠单抗(otelixizumab)(TRX4)、替利珠单抗(teplizumab)(MGA031)、维西珠单抗(visilizumab)(Nuvion)、SP34或I2C、TR-66或X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1和WT-31。
在一些实施方案中，在与活性VL结构域非常接近时，形成结合人CD3的活性Fv结构域的VH序列在图16A中示出为Pro6，在图18A中示出为Pro16，在图20A中示出为Pro39，在图22A中示出为Pro41，在图24A中示出为Pro43，在图26A中示出为Pro45，或在图28A中示出为Pro349。活性VH结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:102，如图39所示。
在一些实施方案中，在与活性VH结构域非常接近时，形成结合人CD3的活性Fv结构域的VL序列在图17A中示出为Pro7，在图19A中示出为Pro19，在图21A中示出为Pro40，在图23A中示出为Pro42，在图25A中示出为Pro44，在图27A中示出为Pro46，或在图29A中示出为Pro353。活性VL结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:90，如图38所示。
无活性VHi和VLi结构域含有允许缔合的“常规”框架区(FR)，使得无活性可变结构域将与活性可变结构域缔合，从而使所述对无活性，例如无法结合CD3。在一个实施方案中，当一个或两个无活性结构域存在于互补构建体对中时，VHi和VLi形成无活性Fv结构域。在一些实施方案中，无活性VLi结构域的氨基酸序列在图16A中示出为Pro6，在图18A中示出为Pro16，在图20A中示出为Pro39，在图22A中示出为Pro41，在图24A中示出为Pro43，在图26A中示出为Pro45，并在图28A中示出为Pro349。在一些情况下，无活性VL结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:94，如图38所示。在其他情况下，无活性VL结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:98，如图38所示。在一些实施方案中，无活性VHi结构域的氨基酸序列在图17A中示出为Pro7，在图19A中示出为Pro19，在图21A中示出为Pro40，在图23A中示出为Pro42，在图25A中示出为Pro44，在图27A中示出为Pro46，并在图29A中示出为Pro353。在一些情况下，无活性VH结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:106，如图39所示。在其他情况下，无活性VL结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:110，如图39所示。
在一些实施方案中，无活性VHi结构域包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个)氨基酸修饰(例如，氨基酸插入、缺失或取代)，其在与活性VL结构域配对时，使配对的VHi-VL结构域无法结合靶抗原。在其他实施方案中，无活性VLi结构域包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个)氨基酸修饰(例如，氨基酸插入、缺失或取代)，其在与活性VH结构域配对时，使配对的VH-VLi结构域无法结合靶抗原。
如本领域技术人员将理解的，存在可用于本发明的许多“无活性”可变结构域。基本上，可使用具有人框架区的任何可变结构域，其允许与另一个可变结构域自我组装，无论可变区的CDR位置的氨基酸是什么。为了清楚起见，据说无活性结构域包含CDR，尽管在技术上无活性可变结构域并不赋予结合能力。
在一些情况下，无活性结构域可被工程化为以前药形式促进选择性结合，以促进在裂解前形成分子内VHi-VL和VH-VLi结构域(例如，分子间对形成)。参见例如Igawa等人,Protein Eng.Des.Selection 23(8):667-677(2010)，在此整体并且特别是关于界面残基氨基酸取代以引用的方式明确地并入。
在一个方面，本文所述的多肽构建体包含当被蛋白酶活化时特异性结合CD3的结构域。在一个方面，本文所述的多肽构建体包含当被蛋白酶活化时特异性结合人CD3的两个或更多个结构域。在一些实施方案中，本文所述的多肽构建体包含当被蛋白酶活化时特异性结合CD3ε的两个或更多个结构域。在一些实施方案中，本文所述的多肽构建体包含当被蛋白酶活化时特异性结合CD3ε的两个或更多个结构域。
在一些实施方案中，蛋白酶裂解位点是在第一单体上的抗CD3活性VH与无活性VL结构域之间，并且阻止它们折叠并结合T细胞上的CD3。在一些实施方案中，蛋白酶裂解位点是在第二单体上的抗CD3无活性VH与活性VL结构域之间，并且阻止它们折叠并结合T细胞上的CD3。一旦蛋白酶裂解位点被靶细胞处存在的蛋白酶裂解，第一单体的抗CD3活性VH结构域和第二单体的抗CD3活性VL结构域就能够结合T细胞上的CD3。
在某些实施方案中，本文所述的多肽构建体的CD3结合结构域不仅表现出与人CD3的有效CD3结合亲和力，还显示出与相应食蟹猴CD3蛋白的优异的交叉反应性。在一些情况下，多肽构建体的CD3结合结构域与食蟹猴的CD3交叉反应。在某些情况下，CD3的人:食蟹猴KD比为5与0.2之间。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白的CD3结合结构域可为与CD3结合的任何结构域，包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域。在一些情况下，有益的是，CD3结合结构域来源于最终将使用抗原结合蛋白的相同物种。例如，为了用于人，可能有益的是，抗原结合蛋白的CD3结合结构域包含来自抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基。
因此，在一个方面，抗原结合结构域包含人源化或人结合结构域。在一个实施方案中，人源化或人抗CD3结合结构域包含本文所述的人源化或人抗CD3结合结构域的一个或多个(例如，所有三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)和/或本文所述的人源化或人抗CD3结合结构域的一个或多个(例如，所有三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)，例如，包含一个或多个(例如，所有三个)LC CDR和一个或多个(例如，所有三个)HCCDR的人源化或人抗CD3结合结构域。
在一些实施方案中，人源化或人抗CD3结合结构域包含对CD3具有特异性的人源化或人轻链可变区，其中对CD3具有特异性的轻链可变区在人轻链框架区中包含人或非人轻链CDR。在某些情况下，轻链框架区为λ(lambda)轻链框架。在其他情况下，轻链框架区为κ(kappa)轻链框架。
在一些实施方案中，一个或多个CD3结合结构域是人源化或完全人CD3结合结构域。在一些实施方案中，一个或多个活化的CD3结合结构域与CD3表达细胞上的CD3具有1000nM或更低的KD结合。在一些实施方案中，一个或多个活化的CD3结合结构域与CD3表达细胞上的CD3具有100nM或更低的KD结合。在一些实施方案中，一个或多个活化的CD3结合结构域与CD3表达细胞上的CD3具有10nM或更低的KD结合。在一些实施方案中，一个或多个CD3结合结构域与食蟹猴CD3具有交叉反应性。在一些实施方案中，一个或多个CD3结合结构域包含本文提供的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人源化或人抗CD3结合结构域包含对CD3具有特异性的人源化或人重链可变区，其中对CD3具有特异性的重链可变区在人重链框架区中包含人或非人重链CDR。
在一个实施方案中，抗CD3结合结构域为包含本文提供的氨基酸序列的轻链和重链的Fv。在一个实施方案中，抗CD3结合结构域包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含具有至少一个、两个或三个本文提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，取代、插入和缺失)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代、插入和缺失)的氨基酸序列或与本文提供的氨基酸序列具有95％至99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含具有至少一个、两个或三个本文提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，取代、插入和缺失)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代、插入和缺失)的氨基酸序列或与本文提供的氨基酸序列具有95％至99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化或人抗CD3结合结构域为scFv，并且包含本文所述的氨基酸序列的轻链可变区通过scFv接头连接至包含本文所述的氨基酸序列的重链可变区。scFv的轻链可变区和重链可变区可例如呈以下取向中的任一种：轻链可变区-scFv接头-重链可变区或重链可变区-scFv接头-轻链可变区。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白的CD3结合结构域对CD3表达细胞上的CD3具有亲和力，其中KD为1000nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、20nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、1nM或更低或0.5nM或更低。在一些实施方案中，抗原结合蛋白的CD3结合结构域对CD3ε具有亲和力，其中KD为1000nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、20nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、1nM或更低或0.5nM或更低。在其他实施方案中，抗原结合蛋白的CD3结合结构域对CD3具有低亲和力，即约100nM或更高。
可例如通过抗原结合蛋白本身或其CD3结合结构域与包覆在测定板上；展示在微生物细胞表面上；处于溶液中；等的CD3结合的能力来确定与CD3结合的亲和力，如本领域中已知的，通常使用Biacore或Octet测定。可通过将配体(例如CD3)或其抗原结合蛋白本身或其CD3结合结构域固定到珠粒、底物、细胞等上来测定本公开的抗原结合蛋白本身或其CD3结合结构域与CD3的结合活性。可将剂添加到适当的缓冲液中，并将结合配偶体在给定温度下孵育一段时间。在洗涤以去除未结合的材料之后，可将结合的蛋白质用例如SDS、具有高pH的缓冲液等释放，并例如通过表面等离子体共振(SPR)进行分析。
E.肿瘤靶抗原的抗原结合结构域
除了所描述的CD3和半衰期延长结构域之外，本文所述的多肽构建体还包含至少一个或至少两个或更多个与一个或多个靶抗原或单个靶抗原上的一个或多个区域结合的结构域。本文中预期的是，本发明的多肽构建体例如在受试者的疾病特异性微环境中或在血液中在蛋白酶裂解结构域处裂解，并且每个靶抗原结合结构域将结合靶细胞上的靶抗原，从而活化CD3结合结构域以结合T细胞。通常，TTA结合结构域可在蛋白酶裂解之前与其靶结合，因此它们可在靶细胞上“等待”以被活化为T细胞衔接器(engager)。至少一种靶抗原涉及疾病、病症或病状和/或与疾病、病症或病状相关。示例性靶抗原包括与增殖性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病相关的那些。在一些实施方案中，靶抗原为在肿瘤细胞上表达的肿瘤抗原。或者，在一些实施方案中，靶抗原与诸如病毒或细菌的病原体相关。至少一种靶抗原也可针对健康组织。
在一些实施方案中，靶抗原为细胞表面分子，诸如蛋白质、脂质或多糖。在一些实施方案中，靶抗原位于肿瘤细胞、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、受损的红细胞、动脉斑块细胞或纤维化组织细胞上。本文中预期的是，在结合超过一个靶抗原时，两个无活性CD3结合结构域共定位并在靶细胞表面上形成活性CD3结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含超过一个靶抗原结合结构域，以活化抗原结合蛋白中的无活性CD3结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含超过一个靶抗原结合结构域，以增强与靶细胞的结合强度。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含超过一个靶抗原结合结构域，以增强与靶细胞的结合强度。在一些实施方案中，超过一个抗原结合结构域包含相同抗原结合结构域。在一些实施方案中，超过一个抗原结合结构域包含不同的抗原结合结构域。例如，已知在患病细胞或组织(例如肿瘤或癌细胞)中双重表达的两个不同的抗原结合结构域可增强抗原结合蛋白对靶的结合或选择性。
本文所预期的多肽构建体包括至少一个抗原结合结构域，其中抗原结合结构域结合少一个靶抗原。在一些情况下，靶抗原在患病细胞或组织(例如肿瘤或癌细胞)的表面上表达。靶抗原包括但不限于EpCAM、EGFR、FOLR1、B7H3、HER-2、HER-3、c-Met、LyPD3和CEA。本文所公开的多肽构建体还包括包含与已知在患病细胞或组织上表达的两个不同靶抗原结合的两个抗原结合结构域的蛋白质。示例性抗原结合结构域对包括但不限于EGFR/CEA、EpCAM/CEA、EGFR/EpCAM、EGFR/B7H3、EGFR/FOLR1、EpCAM/B7H3、EpCAM/FOLR1、B7H3/FOLR1和HER-2/HER-3。
本文所述的多肽构建体的设计允许一种或多种靶抗原的结合结构域具有柔性，因为靶抗原的结合结构域可为任何类型的结合结构域，包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域。在一些实施方案中，靶抗原的结合结构域为单链可变片段(scFv)、单结构域抗体诸如骆驼科动物来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH)。在其他实施方案中，靶抗原的结合结构域为非Ig结合结构域，即抗体模拟物，诸如anticalin、affilin、亲和体(affibody)分子、亲和性多聚体(affimer)、affitin、α体(alphabody)、高亲合性多聚体(avimer)、DARPin、菲诺体(fynomer)、库尼茨型结构域肽(kunitz domain peptide)和单体(monobody)。在其他实施方案中，一种或多种靶抗原的结合结构域为与一种或多种靶抗原结合或缔合的配体、受体结构域、凝集素或肽。
在一些实施方案中，靶细胞抗原结合结构域独立地包含scFv、VH结构域、VL结构域、非Ig结构域或特异性结合靶抗原的配体。在一些实施方案中，靶抗原结合结构域特异性结合细胞表面分子。在一些实施方案中，靶抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，靶抗原结合结构域特异性且独立地结合选自以下中的至少一者的抗原：EpCAM、EGFR、B7H3、HER-2、HER-3、cMet、LyPD3、CEA和FOLR1。在一些实施方案中，靶抗原结合结构域特异性且独立地结合两种不同的抗原，其中至少一种抗原选自以下中的一者：EpCAM、EGFR、B7H3、HER-2、HER-3、cMet、CEA、LyPD3和FOLR1。在一些实施方案中，在裂解蛋白酶裂解结构域之前蛋白质小于约100kDa。在一些实施方案中，在裂解蛋白酶裂解结构域之后蛋白质为约25kDa至约75kDa。在一些实施方案中，在蛋白酶裂解之前蛋白质的尺寸大于用于首过清除的肾脏阈值。在一些实施方案中，在蛋白酶裂解之前蛋白质具有至少约50小时的消除半衰期。在一些实施方案中，在蛋白酶裂解之前蛋白质具有至少约100小时的消除半衰期。在一些实施方案中，与针对相同靶抗原的IgG相比，所述蛋白质具有增加的组织渗透。在一些实施方案中，与针对相同靶抗原的IgG相比，所述蛋白质具有增加的组织分布。
在一些实施方案中，本发明的人TTA选自由以下组成的组：人EGFR、人B7H3、人EpCAM和人FOLR1。本文所述的多肽中的任一种可包含与选自由以下组成的组的人TTA结合的sdAb：人EGFR、人B7H3、人EpCAM和人FOLR1。
F.半衰期延长
本发明的蛋白质任选地包含半衰期延长结构域。预期此类结构域包括但不限于HSA结合结构域、Fc结构域、小分子和本领域已知的其他半衰期延长结构域。
人血清白蛋白(HSA)(分子质量为约67kDa)是血浆中最丰富的蛋白质，以约50mg/ml(600μM)的形式存在，并且在人体内的半衰期为约20天。HSA用于维持血浆pH，促进胶体血压，充当许多代谢物和脂肪酸的载剂，并用作血浆中的主要药物转运蛋白。
与白蛋白的非共价缔合延长了短寿命蛋白质的消除半衰期。例如，与单独施用Fab片段相比，白蛋白结合结构域与Fab片段的重组融合物当分别向小鼠和兔子静脉内施用时导致体内清除率降低25倍和58倍且半衰期延长26倍和37倍。在另一个实例中，当胰岛素被脂肪酸酰化以促进与白蛋白缔合时，在皮下注射到兔子或猪中时观察到持久效应。总之，这些研究证明白蛋白质结合与延长作用之间的联系。
在一个方面，本文所述的抗原结合蛋白包含半衰期延长结构域，例如与HSA特异性结合的结构域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白的HSA结合结构域可为与HSA结合的任何结构域，包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域。在一些实施方案中，HSA结合结构域为对HSA具有特异性的单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(诸如骆驼科动物来源的纳米体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH))、肽、配体或小分子。在某些实施方案中，HSA结合结构域为单结构域抗体(sdAb)。在其他实施方案中，HSA结合结构域为肽。在其他实施方案中，HSA结合结构域为小分子。预期在一些实施方案中，抗原结合蛋白的HSA结合结构域相当小并且不超过25kD、不超过20kD、不超过15kD或不超过10kD。在某些情况下，如果HSA结合结构域为肽或小分子，则其为5kD或更小。
抗原结合蛋白的半衰期延长结构域提供了抗原结合蛋白本身的改变的药效动力学和药代动力学。如上文所述，半衰期延长结构域延长消除半衰期。半衰期延长结构域还改变药效动力学特性，包括改变抗原结合蛋白的组织分布、渗透和扩散。在一些实施方案中，与没有半衰期延长结合结构域的蛋白质相比，半衰期延长结构域提供了改善的组织(包括肿瘤)靶向、组织渗透、组织分布、组织内扩散以及增强的功效。在一个实施方案中，治疗方法有效地且高效地利用减少量的抗原结合蛋白，从而导致副作用减少，诸如非肿瘤细胞的细胞毒性减少。
此外，半衰期延长结构域(例如HSA结合结构域)的特征包括HSA结合结构域对HSA的结合亲和力。可选择HSA结合结构域的亲和力，以靶向特定多肽构建物中的特定消除半衰期。因此，在一些实施方案中，HSA结合结构域具有高结合亲和力。在其他实施方案中，HSA结合结构域具有中等结合亲和力。在其他实施方案中，HSA结合结构域具有低或边缘结合亲和力。示例性结合亲和力包括10nM或更小(高)、10nM与100nM之间(中等)和大于100nM(低)的KD浓度。如上文所述，与HSA的结合亲和力通过已知方法诸如表面等离子体共振(SPR)来确定。
G.蛋白酶裂解位点
如本文概述的，本发明的多肽(例如蛋白质)组合物并且特别是前药构建体包含通常驻留在可裂解接头中的一个或多个蛋白酶裂解位点。
如本文所述，本发明的前药构建体包含至少一个蛋白酶裂解位点，其包含被至少一种蛋白酶裂解的氨基酸序列。在一些情况下，本文所述的蛋白质包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个被至少一种蛋白酶裂解的蛋白酶裂解位点。如本文中更充分讨论的，当在前药构建中使用超过一个蛋白酶裂解位点时，它们可为相同的(例如，被单个蛋白酶裂解的多个位点)或不同的(两个或更多个裂解位点被至少两种不同的蛋白酶裂解)。如本领域技术人员将理解的，含有三个或更多个蛋白酶裂解位点的构建体可利用一个、两个、三个等；例如，一些构建体可利用两种不同蛋白酶的三个位点等。
蛋白酶裂解位点的氨基酸序列将取决于所靶向的蛋白酶。如本领域中已知的，许多人蛋白酶存在于体内且可与疾病状态相关。
已知蛋白酶由一些患病细胞和组织(例如肿瘤或癌细胞)分泌，从而产生富含蛋白酶的微环境或蛋白酶丰富的微环境。在一些情况下，受试者的血液富含蛋白酶。在一些情况下，肿瘤周围的细胞将蛋白酶分泌到肿瘤微环境中。肿瘤分泌蛋白酶周围的细胞包括但不限于肿瘤基质细胞、肌纤维母细胞、血细胞、肥大细胞、B细胞、NK细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、细胞毒性T淋巴细胞、树突状细胞、间充质干细胞、多形核细胞和其他细胞。在一些情况下，蛋白酶存在于受试者的血液中，例如靶向存在于微生物肽中的氨基酸序列的蛋白酶。此特征允许诸如抗原结合蛋白的靶向治疗剂具有另外的特异性，因为除了在靶向细胞或组织的富含蛋白酶的微环境中之外，T细胞不会被抗原结合蛋白结合。
蛋白酶是在一些情况下以序列特异性方式裂解蛋白质的蛋白质。蛋白酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶、血清蛋白酶、组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S)、激肽释放酶、hK1、hK10、hK15、KLK7、颗粒酶B、纤溶酶、胶原酶、IV型胶原酶、溶血素、XA因子、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、弹性蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)、Mir1-CP、木瓜蛋白酶、HIV-1蛋白酶、HSV蛋白酶、CMV蛋白酶、凝乳酶、肾素、胃蛋白酶、蛋白裂解酶(Matriptase)、豆荚蛋白、纤溶酶、猪笼草蛋白酶、金属外肽酶、金属内肽酶、基质金属蛋白酶(MMP)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP13、MMP11、MMP14、穿膜肽酶、尿激酶纤溶酶原活化剂(uPA)、肠激酶、前列腺特异性抗原(PSA，hK3)、白介素-1β转化酶、凝血酶、FAP(FAP-α)、二肽基肽酶和二肽基肽酶IV(DPPIV/CD26)。
一些合适的蛋白酶和蛋白酶裂解序列在图14A、图14B和图14C中示出。
V.表达方法
本文提供了用于产生本发明的蛋白质的方法，其通过在细胞(例如，宿主细胞)中共表达并共纯化以获得可与CD3和一个或多个肿瘤靶抗原(TTA)结合的蛋白质互补对来进行。在一些实施方案中，蛋白质互补对(例如，第一多肽和第二多肽)以约等摩尔比(例如，约1:1的比率)产生。在其他实施方案中，蛋白质互补对(例如，第一多肽和第二多肽)以非等摩尔的比率(例如，不是约1:1的比率)产生。换句话说，本文所述的方法可用于获得第一多肽与第二多肽的比率，诸如但不限于100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。
在一些实施方案中，包含TTA结构域的第一多肽可与包含相同TTA结构域的第二多肽以接近1:1的比率(以约1:1的比率)从细胞中纯化。第一多肽和第二多肽可包含基本上相似的结构域接头、可裂解接头、半衰期延长结构域及其任何组合。
在其他实施方案中，包含TTA结构域的第一多肽可与包含不同TTA结构域的第二多肽以非等摩尔的比率从细胞中纯化。第一多肽的TTA结构域和第二多肽的TTA结构域可具有不同的结合亲和力。在一些情况下，第一多肽和第二多肽可包含不同的结构域接头、可裂解接头、半衰期延长结构域及其任何组合。
可在细胞中表达特定量的编码多肽的多核苷酸(或表达载体)，以产生所需量的多肽。在一些实施方案中，引入(例如，转染、电穿孔、转导等)到细胞中的编码第一多肽的第一多核苷酸(或第一表达载体)的量和编码第二多肽的多核苷酸(或表达载体)的量相同。例如，可将第一多核苷酸和第二多核苷酸以约1:1的多核苷酸比率引入细胞。在其他实施方案中，引入细胞中的编码第一多肽的第一多核苷酸(或第一表达载体)的量和编码第二多肽的第二多核苷酸(或表达载体)的量不同。例如，可将第一多核苷酸和第二多核苷酸以诸如但不限于以下的多核苷酸比率引入细胞中：8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50等。
多肽的表达载体可包含能够使细胞以所需比率产生多肽的一种或多种组分(例如，启动子、调节元件、增强子等)。在一些情况下，与第二多肽的第二表达载体的表达水平相比，第一多肽的第一表达载体包含增加载体的表达水平的组分。在其他情况下，与第一多肽的第一表达载体的表达水平相比，第二多肽的第二表达载体包含增加载体的表达水平的组分。在一些情况下，第一多肽的第一表达载体包含使得载体的表达水平与第二多肽的第二表达载体的表达水平相同的组分。
在一些情况下，本文所述的核酸能够例如在哺乳动物细胞中产生本公开的双特异性条件有效性蛋白。编码本公开的第一多肽和/或第二多肽的核苷酸序列能够可操作地连接至转录控制元件，例如启动子和增强子等。
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。为了在细菌细胞中表达，合适的启动子包括但不限于lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。为了在真核细胞中表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；存在于逆转录病毒长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；以及各种本领域已知的组织特异性启动子。
编码蛋白质的核酸或核苷酸序列(例如本文所述的前药构建体)可存在于表达载体和/或克隆载体中。在蛋白质(例如前药构建体)包含两个单独的多肽的情况下，可将编码这两个多肽的核苷酸序列克隆在相同或单独的载体中。表达载体可包括选择性标记、复制起点和提供载体复制和/或维持的其他特征。合适的表达载体包括例如质粒、病毒载体等。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制位点，以提供编码异源蛋白的核酸序列的插入。可存在在表达宿主中操作的选择性标记。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于以下病毒的病毒载体：牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borra等人,Gene Ther 6:515524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,H Gene Ther 5:10881097,1999；WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见例如Ali等人,Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery等人,PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人,Gene Ther 4:683 690,1997,Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641648,1999；Ali等人,Hum Mol Genet 5:591 594,1996；Srivastava的WO 93/09239；Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165；以及Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见例如Miyoshi等人,PNAS 94:10319 23,1997；Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和源自逆转录病毒诸如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒以及乳腺肿瘤病毒的载体)等。
本公开提供了一种哺乳动物细胞，其被修饰以产生蛋白质(例如本公开的前药构建体)。本文所述的多核苷酸可使用本领域技术人员已知的任何方法(诸如但不限于转染、电穿孔、病毒感染等)来引入哺乳动物细胞中。
合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类细胞系、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)号CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如，ATCC号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞、(例如，ATCC号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC号CCL10)、PC12细胞(ATCC号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC号CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC号CCLI.3)、人胚肾(HEK)细胞(ATCC号CRL1573)、HEK293细胞、expi293细胞、HLHepG2细胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK细胞系(例如，NKL、NK92和YTS)等。
在一些实施方案中，根据细胞所产生并分泌的多肽的量来选择宿主细胞或稳定的宿主细胞系。宿主细胞或稳定的宿主细胞系可产生并分泌本文所述的前药组合物。在一些情况下，合适的细胞可产生等摩尔比(例如，约1:1的比率)的本文所述的任一种第一多肽和任一种第二多肽。在其他实施方案中，合适的细胞产生非等摩尔比率(例如，不同于1:1的比率)的任一种第一多肽和任一种第二多肽。
VI.可用的发明实施方案
在一些实施方案中，根据细胞所产生并分泌的多肽的量来选择宿主细胞或稳定的宿主细胞系。宿主细胞或稳定的宿主细胞系可产生并分泌本文所述的前药组合物。在一些情况下，合适的细胞可产生等摩尔比(例如，约1:1的比率)的本文所述的任一种第一多肽和任一种第二多肽。在其他实施方案中，合适的细胞产生非等摩尔比率(例如，不同于1:1的比率)的任一种第一多肽和任一种第二多肽。
在一个方面，本文提供了一种细胞，所述细胞包含：(a)编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包含：(i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第一sdAb；(ii)第一结构域接头；(iii)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；(iv)包含第一蛋白酶裂解位点的第一可裂解接头；和(v)假可变轻链；以及(b)编码第二多肽的第二多核苷酸序列，所述第二多肽从N末端到C末端包含：(i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第二sdAb；(ii)第二结构域接头；(iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的可变轻链；(iv)包含第二蛋白酶裂解位点的第二可裂解接头；和(v)假可变重链。在一些情况下，第一多肽的可变重链和第二多肽的可变轻链能够在缔合形成Fv(例如，配对的Vh-Vl)时结合人CD3。
在一些实施方案中，可变重链包含vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4。在某些实施方案中，可变轻链包含v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4。在特定实施方案中，假可变重链包含vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4。在一些实施方案中，假可变轻链包含vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4。
在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb结合相同的人TTA。在某些情况下，第一sdAb和第二sdAb结合相同的人EGFR(例如，相同EGFR分子)。在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb包含相同序列。在某些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb包含不同序列。
在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点和第二蛋白酶裂解位点由相同的蛋白酶识别。
在各种实施方案中，第一多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。在其他实施方案中，第二多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。
在一些实施方案中，第一多肽选自由以下组成的组：Pro16(SEQ ID NO:3)、Pro39(SEQ ID NO:5)、Pro41(SEQ ID NO:7)、Pro43(SEQ ID NO:9)、Pro45(SEQ ID NO:11)和Pro349(SEQ ID NO:13)。在一些实施方案中，第二多肽选自由以下组成的组：Pro19(SEQ IDNO:4)、Pro40(SEQ ID NO:6)、Pro42(SEQ ID NO:8)、Pro44(SEQ ID NO:10)、Pro46(SEQ IDNO:12)和Pro353(SEQ ID NO:14)。
在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽选自由以下组成的组：Pro16+Pro19、Pro39+Pro40、Pro41+Pro42、Pro43+Pro44、Pro45+Pro46和Pro349+Pro353。
在一些实施方案中，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列已在相同表达载体上引入到细胞中。在一些实施方案中，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列已在不同表达载体上引入到细胞中。
在另一个方面，本文提供了一种分离包含第一多肽和第二多肽的前药组合物的方法。所述方法包括：(1)在合适的条件下培养宿主细胞，其中第一多肽和第二多肽被产生并分泌到培养基中；以及(2)使用蛋白A色谱法从培养基中纯化第一多肽和第二多肽，从而分离出包含第一多肽和第二多肽的前药组合物。所述宿主细胞包含：(a)编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包含：(i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第一sdAb；(ii)第一结构域接头；(iii)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；(iv)包含第一蛋白酶裂解位点的第一可裂解接头；和(v)假可变轻链；以及(b)编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽从N末端到C末端包含：(i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第二sdAb；(ii)第二结构域接头；(iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的可变轻链；(iv)包含第二蛋白酶裂解位点的第二可裂解接头；和(v)假可变重链；其中第一多肽的可变重链和第二多肽的可变轻链能够在缔合形成Fv(例如，配对的Vh-Vl)时结合人CD3。
在一些实施方案中，单独对第一多肽和第二多肽进行纯化。在特定实施方案中，同时对第一多肽和第二多肽进行纯化。
在一些实施方案中，前药组合物包含等摩尔比率的第一多肽和第二多肽。在其他实施方案中，前药组合物包含不是约1:1的比率的第一多肽和第二多肽。
在一些实施方案中，纯化步骤还包括在蛋白A色谱之后进行亲和色谱。
在一些实施方案中，可变重链包含vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4。在某些实施方案中，可变轻链包含v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4。在特定实施方案中，假可变重链包含vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4。在一些情况下，假可变重链包含选自由SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:207组成的组的序列。在一些实施方案中，假可变轻链包含vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4。在一些情况下，假可变轻链包含选自由SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:203组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb结合相同的人TTA。在某些情况下，第一sdAb和第二sdAb结合相同的人EGFR。
在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb包含相同的氨基酸序列(例如，蛋白质序列)。在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb包含不同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点和第二蛋白酶裂解位点由相同的蛋白酶识别。
在一些实施方案中，第一多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。在特定实施方案中，第二多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。
在一些实施方案中，第一多肽选自由以下组成的组：Pro16(SEQ ID NO:3)、Pro39(SEQ ID NO:5)、Pro41(SEQ ID NO:7)、Pro43(SEQ ID NO:9)、Pro45(SEQ ID NO:11)和Pro349(SEQ ID NO:13)。在一些实施方案中，第二多肽选自由以下组成的组：Pro19(SEQ IDNO:4)、Pro40(SEQ ID NO:6)、Pro42(SEQ ID NO:8)、Pro44(SEQ ID NO:10)、Pro46(SEQ IDNO:12)和Pro353(SEQ ID NO:14)。
在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽选自由以下组成的组：Pro16+Pro19、Pro39+Pro40、Pro41+Pro42、Pro43+Pro44、Pro45+Pro46和Pro349+Pro353。
在一些实施方案中，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列已在相同表达载体上引入到细胞中。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸已在不同表达载体上引入到细胞中。
在一个方面，本文提供了一种多肽，所述多肽包含：(a)从N末端到C末端包含以下的氨基酸序列：(i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第一sdAb；(ii)结构域接头；(iii)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；(iv)包含第一蛋白酶裂解位点的第一可裂解接头；和(v)假可变轻链；或(b)从N末端到C末端包含以下的氨基酸序列：(i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第二sdAb；(ii)第二结构域接头；(iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的可变轻链；(iv)包含第二蛋白酶裂解位点的第二可裂解接头；和(v)假可变重链。在一些实施方案中，多肽的可变重链和多肽的可变轻链能够在缔合形成Fv时结合人CD3。
在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb结合相同的人TTA。在某些情况下，第一sdAb和第二sdAb结合相同的人EGFR。
在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb包含相同的氨基酸序列(例如，蛋白质序列)。在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb包含不同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点和第二蛋白酶裂解位点由相同的蛋白酶识别。
在一些实施方案中，包含可变重链的多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。在各种实施方案中，包含可变轻链的多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。
在一些实施方案中，多肽为Pro349(SEQ ID NO:13)。在其他实施方案中，多肽选自由Pro353(SEQ ID NO:14)组成的组。在一些实施方案中，Pro349(SEQ ID NO:13)与Pro353(SEQ ID NO:14)配对。
在一些实施方案中，本文提供了一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含本文所述的可变重链(例如，可结合CD3的可变重链)的任何多肽。在某些实施方案中，本文提供了一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含本文所述的可变轻链(例如，可结合CD3的可变轻链)的任何多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种表达载体，所述表达载体包含编码包含本文所述的可变重链(例如，可结合CD3的可变重链)的任何多肽的多核苷酸序列。在其他实施方案中，本文提供了一种表达载体，所述表达载体包含编码包含本文所述的可变轻链(例如，可结合CD3的可变轻链)的任何多肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码包含本文所述的可变重链(例如，可与可变轻链缔合以结合CD3的可变重链)的任何多肽的多核苷酸序列和编码包含本文所述的可变轻链(例如，可与可变轻链缔合以结合CD3的可变轻链)的任何多肽的多核苷酸序列。在特定实施方案中，本文提供了一种宿主细胞，其包含本发明的任何表达载体。在一些情况下，宿主细胞为哺乳动物细胞。
在一些方面，本文提供了一种前药，所述前药包含有包含本文所述的可变重链的多肽和包含本文所述的可变轻链的多肽，其中可变重链和可变轻链能够在缔合形成Fv(例如，配对的Vh-Vl)时结合人CD3。
在另一个方面，本文提供了一种治疗有需要的人受试者的癌症的方法，所述方法包括施用本文所述的任何前药组合物。
另一个示例性半COBRA对包含具有以下结构(N端至C端)的第一多肽：sdAb(TTA)-DL-hFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-DL-vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4；和具有以下结构(N端至C端)的第二多肽：sdAb(TTA)-DL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-DL-vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4。在一些实施方案中，所述对包括Pro348/Pro352。在一些实施方案中，所述对包括Pro350/Pro354。在本发明的一些实施方案中，分离的细胞表达(产生或分泌)Pro348和Pro352。在某些实施方案中，分离的细胞表达(产生或分泌)Pro350和Pro354。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:29具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)的氨基酸序列，如图30A所示；和/或编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图31A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码包含图30A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸和/或编码包含图31A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，表达载体包含图30B所示的第一核酸序列和/或图31B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含与SEQ ID NO:30具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高)的第一核酸序列和/或与SEQID NO:32具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码Pro348的核酸序列(诸如SEQ ID NO:30)和/或编码Pro352的核酸序列(诸如SEQ ID NO:32)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含有包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一表达载体，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:29具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图30A所示；和包含编码第二多肽的第二多核苷酸的第二表达载体，所述第二多肽包含与SEQ IDNO:31具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图31A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码包含图30A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码包含图31A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，第一表达载体包含图30B所示的第一核酸序列，并且第一表达载体包含图31B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含与SEQ IDNO:30具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高)的第一核酸序列，并且第二表达载体包含与SEQ ID NO:32具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码Pro348的核酸序列(诸如SEQ ID NO:30)，并且第二表达载体包含编码Pro352的核酸序列(诸如SEQ ID NO:32)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:33具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图32A所示；和/或编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:35具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图33A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码包含图32A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸和/或编码包含图33A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，表达载体包含图32B所示的第一核酸序列和/或图33B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含与SEQ ID NO:34具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高)的第一核酸序列和/或与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码Pro350的核酸序列(诸如SEQ ID NO:33)和/或编码Pro354的核酸序列(诸如SEQ ID NO:36)。
在一些实施方案中，宿主细胞包含有包含编码第一多肽的第一多核苷酸的第一表达载体，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:33具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图32A所示；和包含编码第二多肽的第二多核苷酸的第二表达载体，所述第二多肽包含与SEQ IDNO:35具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，如图33A所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码包含图32A所示的结构的第一多肽的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码包含图33A所示的结构的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方案中，第一表达载体包含图32B所示的第一核酸序列，并且第一表达载体包含图33B所示的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含与SEQ IDNO:34具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高)的第一核酸序列，并且第二表达载体包含与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性)的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码Pro350的核酸序列(诸如SEQ ID NO:34)，并且第二表达载体包含编码Pro354的核酸序列(诸如SEQ ID NO:36)。
在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的转染到本文所述的宿主细胞中的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多肽包含与SEQ ID NO:29具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多核苷酸包含与SEQ ID NO:30具有至少90％序列同一性的核酸序列，并且第二多核苷酸包含与SEQ ID NO:32具有至少90％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的转染到本文所述的宿主细胞中的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多肽包含与SEQ IDNO:33具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO:35具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸相应的多核苷酸比率为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4和7:3，其中第一多核苷酸包含与SEQ ID NO:34具有至少85％序列同一性的核酸序列，并且第二多核苷酸包含与SEQID NO:36具有至少85％序列同一性的核酸序列。
VII.实施例
A.实施例1：用于产生半COBRA对的方法
半COBRA即使在蛋白酶活化后也不能作为单个分子诱导T细胞杀伤，然而，两个活化的互补半COBRA分子可诱导针对靶标表达细胞的强效T细胞介导的细胞毒性(图1和图2)。这就产生了将这些分子作为药物生产的问题，因为需要生产两个蛋白质分子。一种解决方案是形成两个表达细胞系，每个细胞系表达不同的半COBRA，然后可以单独表达并纯化这两个半COBRA，并混合以产生前药混合物。不幸的是，这是耗时且昂贵的生产大剂量药物混合物的过程。
此问题的解决方案是在同一细胞中共表达两个半COBRA，并且然后从同一条件培养基中分别或一起对其进行纯化。
图3显示半COBRA从瞬时共转染的expi293细胞群中共表达，并且然后使用蛋白A纯化柱从所得条件培养基中共纯化。
对于互补对Pro39+Pro40、Pro41+Pro42和Pro45+Pro46，共表达和共纯化方法产生了大致等摩尔的两个半COBRA的混合物。对于互补对Pro16+Pro19和Pro43+Pro44，两个半COBRA中的一个在纯化产物中更丰富。
图4A至图12B显示这些共表达/纯化批次的主要产物等同于单体半COBRA，如通过尺寸排阻色谱法测量的。结果表明，共表达和纯化不会导致蛋白质聚集。在T细胞杀伤测定(图13A至图13F)中，考虑到每个对的较低表达的半COBRA的浓度，共表达的半COBRA显示出预期的效力水平。共表达的半COBRA也显示出良好的蛋白酶活化。
互补的半COBRA对可在稳定的细胞系(例如，CHO和293细胞)中通过共转染、从单个载体共表达或两个半COBRA表达单元的逆转录病毒共转导产生。可选择表达高水平的接近等摩尔比率的两种蛋白质的稳定克隆。本文提供的数据证明，本发明的蛋白质可在细胞中共表达，并且然后使用蛋白A柱共纯化。
在一些实施方案中，互补的半COBRA对(诸如但不限于Pro16+Pro19、Pro39+Pro40、Pro41+Pro42、Pro43+Pro44、Pro45+Pro46和Pro349+Pro353)可基于每个单体上的不同羧基末端标签进一步纯化，以产生纯批次的每种半COBRA。例如，蛋白A柱的洗脱液可通过使用亲和色谱法通过其不同羧基末端标签进一步纯化。如果需要的话，可将纯化的样品合并以产生等摩尔混合物。
本文所述的实验的目标是测试共表达的半COBRA是否产生两种单独的蛋白质。完整的半COBRA具有相同的分子量，并且无法通过SDS PAGE进行区分。但是，在裂解蛋白酶敏感性接头后，具有VH-VLi构型的半COBRA和具有VL-VHi构型的半COBRA产生具有不同分子量的消化产物。因此，用共表达的半COBRA和单独的半COBRA建立蛋白水解反应，并且然后通过SDS PAGE使蛋白水解产物可视化(图3)。
使用HBS+10mM CaCl2缓冲液将样品的浓度调整为在100μl体积中的0.2mg/ml。将CaCl2添加到每个样品中，使最终浓度为10mM。
评估了以下裂解蛋白酶：肠激酶(New England Biolabs，#P8070S)；蛋白裂解酶ST14(R&D Systems，#3946-SE-010)，其以5.7μM使用；凝血酶(Enzo，BML-SE363-1000)，其稀释至100nM；MMP9(R&D Systems#911-MP-010)，其根据制造商方案活化并稀释至100nM；以及食蟹猴的穿膜肽酶1B，其以135nM使用，在内部表达和纯化，并根据穿膜肽酶1A(R&DSystems#3220-ZN-010)的R&D Systems方案活化。
蛋白水解反应如下建立：
用肠激酶裂解Pro16/19、Pro16、Pro19。
用MMP9裂解Pro39/40、Pro39、Pro40。
用穿膜肽酶1B裂解Pro41/42、Pro41、Pro42。
用蛋白裂解酶ST14裂解Pro43/44、Pro43、Pro44。
用凝血酶裂解Pro45/46、Pro45、Pro46。
将反应物在室温下孵育过夜。通过SDS PAGE(非还原条件)在Tris-甘氨酸运行缓冲液中使用NuPAGE TG 10-20％凝胶来分析样品。将凝胶在200V下运行1h。
从SDS PAGE分析(图3)观察到，半COBRA在一定程度的摩尔比可变性下共表达，其中此值在Pro39/40、Pro41/42和Pro45/46共表达的半COBRA中接近1:1。
使用分析性尺寸排阻色谱法(SEC)分析来自共表达和共纯化的产物。使用以下参数。
仪器：具有二极管阵列检测器的Agilent 1100HPLC
柱：Zenix-C SEC-300柱，7.8x 300mm，3μm粒径，
Figure BDA0002967132110000751
孔径，SepaxTechnologies，Newark，DE
流动相：0.2M L-精氨酸盐酸盐+0.1M磷酸钠，pH 7.0
流速：0.5ml/min等度
柱温：30℃
检测：280nm处的吸光度
样品制备：无(纯净注射)
样品体积：25μL至50μL
SEC分析的结果在图4A至图12中提供。
使用T细胞杀伤测定(T细胞依赖性细胞毒性测定或TDCC)评估共表达的半COBRA的活性。结果显示，共表达的半COBRA对表现出与每个对的较低表达的半COBRA一致的预期效力水平。图13A示出了裂解的Pro16和Pro19对的结果。图13B示出了裂解的Pro39和Pro40对的结果。图13C示出了裂解的Pro41和Pro42对的结果。图13D示出了裂解的Pro43和Pro44对的结果。图13E示出了裂解的Pro45和Pro46对的结果。图13F示出了裂解的Pro59和Pro60对的结果。Pro51代表T细胞依赖性细胞毒性的阳性对照。
B.实施例2：共表达半COBRA对的稳定细胞系的产生
此实施例说明了一种用于产生共表达互补半COBRA对的细胞系的示例性方法。
材料和方法
所有细胞培养基、转染均来自Life Technologies。转染试剂包括Expi293转染试剂盒。研究中使用的生长和表达培养基为Expi293表达培养基。选择培养基包括DMEM+10％FBS+0.5mg/ml G418。所有用于Octet分析的生物传感器均来自ForteBio，包括SAX(高精密度链霉亲和素)和His1K(Anti-Penta-His)。
结果
图41中示出了用于产生共表达稳定细胞系的两个半COBRA对的示意图。将半COBRA对不同地标记，以便于检测和纯化。每个测试对包括具有以下结构(N端至C端)的第一多肽：sdAb(TTA)-DL-hFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-DL-vlFR1-vliCDR1-vlFR2-vliCDR2-vlFR3-vliCDR3-vlFR4；和具有以下结构(N端至C端)的第二多肽：sdAb(TTA)-DL-v1FR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4-DL-vhFR1-vhiCDR1-vhFR2-vhiCDR2-vhFR3-vhiCDR3-vhFR4。所测试的半COBRA对为Pro348+Pro352和Pro350+Pro354。
由SEQ ID NO:29表示的Pro348包含结合B7H3的sdAb、抗HSA结构域和StrepII标签。由SEQ ID NO:31表示的Pro352包含结合B7H3的sdAb、抗HSA结构域和His6标签。
由SEQ ID NO:33表示的Pro350包含结合EGFR的sdAb、抗HSA结构域和StrepII标签。由SEQ ID NO:35表示的Pro354包含结合EGFR的sdAb、抗HSA结构域和His6标签。
图41中的表示出了每个半COBRA当通过瞬时转染从Expi293细胞产生时的产率。换句话说，将每个半COBRA(Pro348、Pro352、Pro350和Pro354)单独转染到Expi293细胞中。每个半COBRA的产生率不同表明，应优化用于共转染的质粒DNA浓度。
图42和图43示出了质粒DNA比率优化实验的数据。目标是鉴定出每个对的使共表达的半COBRA具有相似产生率的最佳DNA比率。
将2.5ml/孔的在VCD 2.9下的Expi293细胞接种到24深孔板中的Expi293培养基中。遵循制造商的方案，使用Expi293转染试剂盒进行转染。针对共转染进行测试的质粒DNA比率为2:8；3:7；4:6；5:5；6:4；和7:3。重复所有转染。转染后20小时添加增强剂。转染后5天，收集条件培养基以进行Octet分析：将SAX生物传感器用于Pro348和Pro350，并且将His1K(抗6His)用于Pro352和Pro354。
Pro348和352的最佳比率为2.5:7.5。Pro350和354的最佳比率为2:8。简言之，使用Expi293转染试剂盒将Pro348/Pro352质粒对转染到Expi293细胞中。在6孔板中转染后48小时，开始G418选择。花费两周时间完成选择。在选择完成后，将细胞分选到96孔板中以进行稳定细胞系产生。用Octet(抗His和SAX)筛选菌落。挑选出所述对的两个半COBRA具有相似表达水平的前几种克隆进行进一步测试。鉴定出每个对的三个最后克隆并储存。在每个阶段检查共转染的半COBRA的表达水平：不同规模的瞬时、稳定库和稳定细胞系(参见图44)。
根据以下方法产生稳定的细胞系。对于细胞培养，将Expi293细胞保持在湿润培养箱的振荡烧瓶中VCD为0.3–5x10E6/ml的Expi293培养基中。培养条件为37℃、8％CO2，振荡速度为225rpm。在转染后对细胞使用相同培养条件，然而振荡速度根据烧瓶/板尺寸而变化。
遵循制造商的方案使用Expi293转染试剂盒，将Pro348/Pro352(DNA比率为2.5:7.5)和Pro350/Pro354(DNA比率为2:8)的质粒DNA对共转染到Expi293细胞中。简言之，将细胞以每孔2.9x10E6/ml x 2.5ml接种在MixMate(Eppendorf)振荡器上在350rpm下的24深孔板中。DNA/Expi293fectamine/细胞比率为1μg/3μl/1ml。将质粒DNA和Expi293fectamin单独在OptiMEM中以最终转染体积的1/20稀释，然后合并，并在室温下孵育20’，之后添加到细胞中。然后在上文所述的标准培养条件下将细胞放回培养箱中。
为了产生稳定的细胞系，在转染后两天，将2x10E6个转染细胞接种到具有选择培养基的T75中。从选择中回收后，将细胞以1个细胞/孔分选到96孔板中。使剩余的细胞适应于悬浮以形成稳定池。使用2组Octet/生物传感器针对产生率筛选存活克隆：将SAX用于Pro348和Pro350，并且将His1K用于Pro352和Pro354。将细胞融合(IncuCyte)用于归一化。挑选出与共表达的半COBRA具有相似产生率的前几种克隆，并将其转移至12孔板中。
为了进行菌落筛选，将在选择中幸存的细胞以一个细胞/孔接种在96孔板上。将来自回收的菌落的条件培养基转移到2组96孔板中，以进行Octet分析。图45A至图45C示出了来自菌落筛选的示例性数据。图45A提供了克隆ID。图45B示出了使用His1K生物传感器检测His标记的Pro352和354的数据。图45B示出了使用SAX检测StrepII标记的Pro348和Pro350的数据。
为了使细胞适应于悬浮培养，当细胞达到90％融合时，将选择培养基更换为Expi293培养基加0.5mg/ml G418。更换培养基后一天，将细胞转移到具有相同培养基的24深孔板中，并将其置于在rpm 350下的MixMate上。在扩展的每个阶段都监测共表达的半COBRA的产生率。
从24深孔板中收集条件培养基，并使用Octet进行分析。图46示出了来自两种细胞系的前3种克隆的分析的数据。
在适应于悬浮培养后，以0.5x10E6/ml接种细胞。接种后3天，用5％高效饲料B饲喂细胞。饲喂后4天收集条件培养基以进行Octet分析，以获得容积产生率估算值。
总之，此实施例描述了用于产生半COBRA对，使得半COBRA以基本上等同的量表达的示例性方法。在此研究中，转染到宿主细胞中的每个半COBRA的质粒DNA比率不是1:1。相反，与编码第二半COBRA的质粒DNA相比，转染了更多编码一个半COBRA的质粒DNA。
所使用的方法、方案和测定的附加详细描述可发现于2018年9月6日提交的WO2019/051122、2017年9月8日提交的美国临时申请号62/555,999、2018年9月6日提交的WO2019/051102、2017年9月8日提交的美国临时申请号62/555,943、2017年11月15日提交的美国临时申请号62/586,627、2017年11月16日提交的美国临时申请号62/587,318、2017年3月8日提交的WO2017/156178、2017年9月8日提交的美国临时申请号62/555,999，所述专利均以引用的方式整体明确地并入，包括附图、附图的详细描述、定义、实施方案的详细描述和实施例以及所有叙述的实施方案。
所有引用的参考文献均以引用的方式整体明确地并入本文。
尽管上文已经出于说明的目的描述了本发明的特定实施方案，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求中描述的本发明的情况下，可对细节做出多种变化。
序列表
<110> 马弗里克治疗公司(Maverick Therapeutics, Inc.)
R·B·杜布里奇(DuBridge, Robert, B)
<120> 条件性活化的结合蛋白的共表达和纯化方法
<130> 118459-5006-WO
<150> US 62/716,755
<151> 2018-08-09
<160> 210
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro6 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -Flag - α-CD3Vli - His6)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr
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Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
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Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala
145 150 155 160
Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
165 170 175
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn
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Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile
195 200 205
Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu
210 215 220
Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe
225 230 235 240
Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
260 265 270
Lys Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
275 280 285
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly
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Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly
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Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
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Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala
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Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys
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Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
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Thr Val Leu His His His His His His
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<210> 2
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro6 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -Flag - α-CD3Vli - His6)
<400> 2
gaagttcaac tggttgaatc cggtggtggc cttgtccagg cgggaggctc ccttcgactg 60
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gcggattctg taaagggcag gttcactatc tcacgcgata atgcaaaaaa taccatgtat 240
cttcagatga actcactgaa gcccgaggac acggcagttt attactgtgc tgccggttac 300
cagatcaatt ccggaaatta caatttcaag gactacgagt acgattattg gggtcagggc 360
acccaggtaa ccgtcagcag cgggggaggc ggatcaggag gcggttcaga ggttcagctc 420
gttgagagtg gtggagggct ggttcagcca gggggaagtt tgaagctttc ctgtgcggcc 480
tctggtttca cctttaacaa atacgctatg aactgggtac gacaagcccc cggtaaaggg 540
cttgaatggg ttgcaagaat acgcagtaaa tacaataatt atgcgactta ttatgccgat 600
agtgtaaagg accgctttac tatcagtaga gatgacagta agaacacggc ttatttgcaa 660
atgaacaact tgaagacaga agatacggcg gtctattatt gtgtacgaca cggtaatttt 720
gggaattcat atataagcta ttgggcatac tggggtcaag gaacccttgt tacggtgagc 780
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<210> 3
<211> 390
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro7 - α-CD3Vhi - Flag - α-CD3Vl- α-EGFR-2 sdAb - His6)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn
65 70 75 80
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr
100 105 110
Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
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Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Ser Gln Thr
130 135 140
Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val
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Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr
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Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile
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Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp
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Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
260 265 270
Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr
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Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
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Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
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Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu
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Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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His His His His His His
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<211> 1173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro7 - α-CD3Vhi - Flag - α-CD3Vl- α-EGFR-2 sdAb - His6)
<400> 4
gaggttcagc ttgttgaatc agggggaggt ctggtacagc caggcggaag tttgaaactg 60
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ggtacccctg cacgattcag cggatccctt ttgggcggca aagcggctct tacactttct 660
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro16 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -Flag - α-CD3Vli - α-HSA - His6)
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro16 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -Flag - α-CD3Vli - α-HSA - His6)
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<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro19 - α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl(2B2) - Flag - α-CD3Vhi - α-HSA - His6)
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Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly
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Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Val Pro Gly
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Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln
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Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly
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<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro19 - α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl(2B2) - Flag - α-CD3Vhi - α-HSA - His6)
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cttctgggtg gaaaagccgc cttgaccttg tcaggcgttc agcccgaaga tgaggccgaa 660
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ggaactttgg taacggtcag ctcccaccac catcatcatc actga 1545
<210> 9
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro39 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -MMP9 - α-CD3VliGL - α-HSA - His6)
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35 40 45
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Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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275 280 285
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro39 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -MMP9 - α-CD3VliGL - α-HSA - His6)
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<210> 11
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro40 - α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl -MMP9 - α-CD3VhiGL4 - α-HSA - His6)
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Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro40 - α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl -MMP9 - α-CD3VhiGL4 - α-HSA - His6)
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<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro41 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -穿膜肽酶- α-CD3VliGL - α-HSA - His6)
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro41 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -穿膜肽酶- α-CD3VliGL - α-HSA - His6)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro42 - α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vi -穿膜肽酶- α-CD3VhiGL4 - α-HSA - His6)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro42 - α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vi -穿膜肽酶- α-CD3VhiGL4 - α-HSA - His6)
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ggcctgatcg ggggcacaaa atttctcgtc ccgggcactc cggccaggtt ttccggttct 600
ctgctcgggg gtaaggcggc cctgaccctt agtggtgttc aaccggagga tgaagcagag 660
tattactgca cattgtggta ctcaaatcgg tgggtttttg ggggcggtac aaagctgaca 720
gtgttgtcag gagggggcaa aaaactggcg gatgaaccag aaggggggtc cgaggtccag 780
ctcgttgaat ctgggggcgg cctggtacag ccaggaggtt ccctcaagct ttcatgcgcc 840
gcatccggat tcaccttcag tgggtacgca atgaattggg ttagacaggc accaggtaaa 900
gggttggaat gggtggcacg cattaggtcc aaggccaaca gctacgccac cgagtacgcg 960
gccagcgtaa aagaccgatt tacgataagc cgggatgatt ctaagaacac tgcttatttg 1020
cagatgaata atttgaagac cgaggatact gctgtctatt attgcgtccg ccacggtaat 1080
gctggtaact ctgccattag ctattgggcg tattgggggc agggcactct ggtcaccgtc 1140
tcatctggcg gagggggcag tggcggcggg tcagaggttc aacttgtcga gtctggaggc 1200
ggtctcgtac aaccggggaa tagtctccga ctctcttgcg ctgcgtccgg gttcacgttc 1260
tcaaagtttg ggatgtcttg ggttaggcaa gccccaggta agggactcga atgggtcagc 1320
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<210> 17
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro43 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -蛋白裂解酶- α-CD3VliGL - α-HSA - His6)
<400> 17
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35 40 45
Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
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Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala
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Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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<210> 18
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro43 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -蛋白裂解酶- α-CD3VliGL - α-HSA - His6)
<400> 18
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ggtaattctt atatctctta ttgggcctat tggggtcagg gcacgttggt taccgtttct 780
tctggaggtt cattcacccg ccaggcgcga gttgtcggtg gaggatccca gactgtggta 840
acacaggaac catctttgac agtaagtcct ggaggtacgg tcacgctcac ttgtgggtcc 900
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<210> 19
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro44 - α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl -蛋白裂解酶- α-CD3VhiGL4 - α-HSA - His6)
<400> 19
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<210> 20
<211> 1539
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro44 - α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl -蛋白裂解酶- α-CD3VhiGL4 - α-HSA - His6)
<400> 20
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ttggtaacgg tcagctccca ccaccatcat catcactga 1539
<210> 21
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro45 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -凝血酶- α-CD3VliGL - α-HSA - His6)
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro45 - α-EGFR-1 sdAb - α-CD3 Vh -凝血酶- α-CD3VliGL - α-HSA - His6)
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<210> 23
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro46 - α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl -凝血酶- α-CD3VhiGL4 - α-HSA - His6)
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450 455 460
Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu
465 470 475 480
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser
485 490 495
Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
500 505 510
<210> 24
<211> 1539
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro46 - α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl -凝血酶- α-CD3VhiGL4 - α-HSA - His6)
<400> 24
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ccgggaaaag agcgggagtt tgtatctggc ataagctgga ggggcgactc cactggttac 180
gcagattccg tcaaagggcg gtttacgatc tctcgggata acgcgaagaa taccgttgat 240
ctccaaatga actctcttaa acccgaggat acagcaatat actattgcgc cgccgctgcg 300
gggtcagcct ggtatggcac attgtacgaa tatgactatt ggggtcaagg tacccaagta 360
acggtcagtt ccggtggtgg ggggtctggt ggtggatccc aaacagttgt tactcaggag 420
ccatccttga cagtatcccc cggtggaacg gtgaccctga catgcgcttc aagtacaggt 480
gctgtaacct caggtaacta cccgaattgg gtgcagcaaa aacctggaca agcaccccgg 540
ggtcttatcg gggggacgaa gttcttggta ccgggtaccc ctgcgcgctt cagcggaagt 600
cttctgggtg gaaaagccgc cttgaccttg tcaggcgttc agcccgaaga tgaggccgaa 660
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gtgttgtcat ctggcggagg tatgccaagg agctttcgcg gtggaggctc agaagtacaa 780
cttgtagaaa gcgggggggg tctggtccag ccaggcggaa gcctcaagct ttcatgcgcc 840
gcatccggat tcaccttcag tgggtacgca atgaattggg ttagacaggc accaggtaaa 900
gggttggaat gggtggcacg cattaggtcc aaggccaaca gctacgccac cgagtacgcg 960
gccagcgtaa aagaccgatt tacgataagc cgggatgatt ctaagaacac tgcttatttg 1020
cagatgaata atttgaagac cgaggatact gctgtctatt attgcgtccg ccacggtaat 1080
gctggtaact ctgccattag ctattgggcg tattgggggc agggcactct ggtcaccgtc 1140
tcatctggcg gagggggcag tggcggcggg tcagaggttc aacttgtcga gtctggaggc 1200
ggtctcgtac aaccggggaa tagtctccga ctctcttgcg ctgcgtccgg gttcacgttc 1260
tcaaagtttg ggatgtcttg ggttaggcaa gccccaggta agggactcga atgggtcagc 1320
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<210> 25
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro349 - h-α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vh - MMP9 - α-CD3Vli2 - α-HSA - Strep2)
<400> 25
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
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Phe Asn Lys Tyr Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
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Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser Ser Gly Gly Pro Gly Pro Ala Gly Met Lys Gly Leu Pro Gly Ser
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Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr
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Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln
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Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Ala
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Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
530 535
<210> 26
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro349 - h-α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vh - MMP9 - α-CD3Vli2 - α-HSA - Strep2)
<400> 26
caagttaaac tcgtagagtc aggaggtggt gtagtccgtc cgggaggtag cttaaccctt 60
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<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro353 - h-α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl- MMP9 - α-CD3Vhi - α-HSA - His6)
<400> 27
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
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Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
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Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly
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Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys
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Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
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Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys
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His
<210> 28
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro353 - h-α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl- MMP9 - α-CD3Vhi - α-HSA - His6)
<400> 28
caagttaaac tcgtagagtc aggaggtggt gtagtccgtc cgggaggtag cttaaccctt 60
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体-示例性抗 B7H3半COBRA (Pro348 - h-α-B7H3 sdAb - α-CD3Vh- NCL15 - α-CD3Vli2 - α-HSA - Strep2)
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Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr
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Ala Asp Gln Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys
195 200 205
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Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val
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Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro
340 345 350
Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp
355 360 365
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
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<210> 30
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗 B7H3半COBRA (Pro348 - h-α-B7H3 sdAb - α-CD3Vh- NCL15 - α-CD3Vli2 - α-HSA - Strep2)
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<210> 31
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗B7H3半COBRA (Pro352 - h-α-B7H3 sdAb - α-CD3Vl -NCL15 - α-CD3Vhi - α-HSA - HIs6)
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Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
245 250 255
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
260 265 270
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala
275 280 285
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
290 295 300
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Asp
305 310 315 320
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
325 330 335
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
340 345 350
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
355 360 365
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
370 375 380
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
385 390 395 400
Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
405 410 415
Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
420 425 430
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr
435 440 445
Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
450 455 460
Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
465 470 475 480
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser
485 490 495
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
500 505 510
<210> 32
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗B7H3半COBRA (Pro352 - h-α-B7H3 sdAb - α-CD3Vl -NCL15 - α-CD3Vhi - α-HSA - HIs6)
<400> 32
caagtccaac tccaggaatc cggtggcggt cttgtccaac cagggggttc actccgattg 60
tcctgtgagg ccagtccccg gacctttagc acttactcaa tggcttggtt ccgccaagcg 120
cctgggaagg aacgctcttt cgtagctgct attaactgga gcggaggtaa cacttcttac 180
gctgactccg tgaaggggcg ctttaccata agtagagaca atagcaaaaa tacactctac 240
ctgcaaatga actctttgag agctgaagat acagctgtgt attattgcgc tgcgggaggt 300
gtactggcgc atcataacta tgagtacgat tactggggac agggcacgct cgtaactgtt 360
tcatccggtg gtggggggtc tggtggtgga tcccaaacag ttgttactca ggagccatcc 420
ttgacagtat cccccggtgg aacggtgacc ctgacatgcg cttcaagtac aggtgctgta 480
acctcaggta actacccgaa ttgggtgcag caaaaacctg gacaagcacc ccggggtctt 540
atcgggggga cgaagttctt ggtaccgggt acccctgcgc gcttcagcgg aagtcttctg 600
ggtggaaaag ccgccttgac cttgtcaggc gttcagcccg aagatgaggc cgaatattat 660
tgcacgctgt ggtattctaa ccggtgggtc ttcggaggag ggacgaaact tactgtactt 720
gggggcggtg gttctggcgg gggaggttcc gggggcggcg gatccgaggt ccagttggta 780
gaatccggag gtggattggt tcaaccggga ggaagcctta agctttcatg cgccgcatcc 840
ggattcacct tcaataagta cgcaatgaat tgggttagac aggcaccagg taaagggttg 900
gaatgggtgg cacgcattag gtctaaatac gattacaagg acgacgacga caaagctgac 960
agcgtaaaag accgatttac gataagccgg gatgattcta agaacactgc ttatttgcag 1020
atgaataatt tgaagaccga ggatactgct gtctattatt gcgtccgcca cggtaatttt 1080
ggtaactctt acattagcta ttgggcgtat tgggggcagg gcactctggt caccgtctca 1140
tctggcggag ggggcagtgg cggcgggtca gaggttcaac ttgtcgagtc tggaggcggt 1200
ctcgtacaac cggggaatag tctccgactc tcttgcgctg cgtccgggtt cacgttctca 1260
aagtttggga tgtcttgggt taggcaagcc ccaggtaagg gactcgaatg ggtcagcagc 1320
atctcaggct ccggcagaga cacgttgtat gccgaaagtg tcaaagggag gttcacaatc 1380
tctcgggaca atgcaaaaac caccttgtat ctccaaatga actcactccg gcctgaggac 1440
acagcagttt actactgtac gataggaggg tcccttagcg tatcttctca gggaactttg 1500
gtaacggtca gctcccacca ccatcatcat cac 1533
<210> 33
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro350 - h-α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vh- NCL15 - α-CD3Vli2 - α-HSA - Strep2)
<400> 33
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
130 135 140
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
145 150 155 160
Phe Asn Lys Tyr Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr
180 185 190
Tyr Tyr Ala Asp Gln Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
195 200 205
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Ala Asn Phe Gly Asn Ser Tyr
225 230 235 240
Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
275 280 285
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
290 295 300
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
305 310 315 320
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Asp Asp Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
325 330 335
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
340 345 350
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
355 360 365
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
370 375 380
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
385 390 395 400
Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
405 410 415
Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
420 425 430
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr
435 440 445
Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
450 455 460
Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
465 470 475 480
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser
485 490 495
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln
500 505 510
Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Ala
515 520 525
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
530 535
<210> 34
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro350 - h-α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vh- NCL15 - α-CD3Vli2 - α-HSA - Strep2)
<400> 34
caagttaaac tcgtagagtc aggaggtggt gtagtccgtc cgggaggtag cttaaccctt 60
agctgcgctg ctagcggacg gacaagccgc agttacggca tggggtggtt cagacaagcg 120
ccaggcaagg aacgcgagtt tgtttctggc atcagttggc gcggggattc tacgggctat 180
gcagactccg tgaaggggag attcacgatc tctagagaca acgccaagaa cagtttgtat 240
ctccaaatga actcacttag ggcagaagat actgcacttt actactgcgc ggctgcagcg 300
ggaagtgcat ggtacggtac gctttacgag tatgattact ggggacaagg gaccctcgtc 360
acagttagca gtggaggcgg atcaggaggc ggttcagagg ttcagctcgt tgagagtggt 420
ggagggctgg ttcagccagg gggaagtttg aagctttcct gtgcggcctc tggtttcacc 480
tttaacaaat acgctatcaa ctgggtacga caagcccccg gtaaagggct tgaatgggtt 540
gcaagaatac gcagtaaata caataattat gcgacttatt atgccgatca agtaaaggac 600
cgctttacta tcagtagaga tgacagtaag aacacggctt atttgcaaat gaacaacttg 660
aagacagaag atacggcggt ctattattgt gtacgacacg caaattttgg gaattcatat 720
ataagctatt gggcatactg gggtcaagga acccttgtta cggtgagcag cgggggcggt 780
ggttctggcg ggggaggttc cgggggcggc ggatcccaga ctgtggtaac acaggaacca 840
tctttgacag taagtcctgg aggtacggtc acgctcactt gtgggtcctc aaccggggct 900
gtaacgtcag gcaattaccc taactgggtc caacagaagc ctggacaagc tcccaggggt 960
ctgataggcg gaactaaaga tgatgcccct ggcactccag cgcgctttag cggatccctt 1020
ctgggtggaa aagcagccct cactctgagt ggagtacaac ccgaggatga ggcggaatat 1080
tattgcgtgc tctggtattc aaaccgctgg gtcttcggtg gcggtacgaa acttactgta 1140
ctggggggag gcggctcagg cggcggatca gaagtgcagc ttgttgaatc tggcggaggt 1200
ctggtccagc caggtaacag cttgagactg tcctgtgctg ctagcggctt taccttctct 1260
aaattcggta tgagttgggt tcggcaagcc cctggaaagg gtttggaatg ggtatcaagc 1320
attagtggtt ctgggcgaga tacactctat gccgaatcag tgaagggccg ctttaccatt 1380
agtagggata acgctaaaac tactctgtat ctgcaaatga atagtctgag accagaagat 1440
actgccgttt actactgcac aataggggga tctctgagcg tttcatctca aggtacactt 1500
gtgactgtta gcagttctgc ttggtctcat ccgcagtttg aaaagggtgg ggggtctggt 1560
ggaggaagtg gcggttcttc tgcctggtca cacccacaat tcgagaaatg a 1611
<210> 35
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro354 - h-α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl- NCL15 - α-CD3Vhi - α-HSA - His6)
<400> 35
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly
145 150 155 160
Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Val Pro Gly
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
225 230 235 240
Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
260 265 270
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys
275 280 285
Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
290 295 300
Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
305 310 315 320
Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys
325 330 335
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala
340 345 350
Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser
355 360 365
Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
405 410 415
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
420 425 430
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg
435 440 445
Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
450 455 460
Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
465 470 475 480
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val
485 490 495
Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His
500 505 510
His
<210> 36
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性抗EGFR半COBRA (Pro354 - h-α-EGFR-2 sdAb - α-CD3Vl- NCL15 - α-CD3Vhi - α-HSA - His6)
<400> 36
caagttaaac tcgtagagtc aggaggtggt gtagtccgtc cgggaggtag cttaaccctt 60
agctgcgctg ctagcggacg gacaagccgc agttacggca tggggtggtt cagacaagcg 120
ccaggcaagg aacgcgagtt tgtttctggc atcagttggc gcggggattc tacgggctat 180
gcagactccg tgaaggggag attcacgatc tctagagaca acgccaagaa cagtttgtat 240
ctccaaatga actcacttag ggcagaagat actgcacttt actactgcgc ggctgcagcg 300
ggaagtgcat ggtacggtac gctttacgag tatgattact ggggacaagg gaccctcgtc 360
acagttagca gtggtggtgg ggggtctggt ggtggatccc aaacagttgt tactcaggag 420
ccatccttga cagtatcccc cggtggaacg gtgaccctga catgcgcttc aagtacaggt 480
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ggtcttatcg gggggacgaa gttcttggta ccgggtaccc ctgcgcgctt cagcggaagt 600
cttctgggtg gaaaagccgc cttgaccttg tcaggcgttc agcccgaaga tgaggccgaa 660
tattattgca cgctgtggta ttctaaccgg tgggtcttcg gaggagggac gaaacttact 720
gtacttgggg gcggtggttc tggcggggga ggttccgggg gcggcggatc cgaggtccag 780
ttggtagaat ccggaggtgg attggttcaa ccgggaggaa gccttaagct ttcatgcgcc 840
gcatccggat tcaccttcaa taagtacgca atgaattggg ttagacaggc accaggtaaa 900
gggttggaat gggtggcacg cattaggtct aaatacgatt acaaggacga cgacgacaaa 960
gctgacagcg taaaagaccg atttacgata agccgggatg attctaagaa cactgcttat 1020
ttgcagatga ataatttgaa gaccgaggat actgctgtct attattgcgt ccgccacggt 1080
aattttggta actcttacat tagctattgg gcgtattggg ggcagggcac tctggtcacc 1140
gtctcatctg gcggaggggg cagtggcggc gggtcagagg ttcaacttgt cgagtctgga 1200
ggcggtctcg tacaaccggg gaatagtctc cgactctctt gcgctgcgtc cgggttcacg 1260
ttctcaaagt ttgggatgtc ttgggttagg caagccccag gtaagggact cgaatgggtc 1320
agcagcatct caggctccgg cagagacacg ttgtatgccg aaagtgtcaa agggaggttc 1380
acaatctctc gggacaatgc aaaaaccacc ttgtatctcc aaatgaactc actccggcct 1440
gaggacacag cagtttacta ctgtacgata ggagggtccc ttagcgtatc ttctcaggga 1500
actttggtaa cggtcagctc ccaccaccat catcatcact ga 1542
<210> 37
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EGFR1
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr
100 105 110
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EGFR1的sdCDR1
<400> 38
Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EGFR1的sdCDR2
<400> 39
Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EGFR1的sdCDR3
<400> 40
Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr Glu Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 41
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EGFR2
<400> 41
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EGFR2的sdCDR1
<400> 42
Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met Gly
1 5 10
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EGFR2的sdCDR2
<400> 43
Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EGFR2的sdCDR3
<400> 44
Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 45
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - h-α-EGFR1
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr
100 105 110
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - h-α-EGFR1的sdCDR1
<400> 46
Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 47
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - h-α-EGFR1的sdCDR2
<400> 47
Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 48
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - h-α-EGFR1的sdCDR3
<400> 48
Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr Glu Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 49
<400> 49
000
<210> 50
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - h-α-EGFR2
<400> 50
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - h-α-EGFR2的sdCDR1
<400> 51
Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met Gly
1 5 10
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - h-α-EGFR2的sdCDR2
<400> 52
Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - h-α-EGFR2的sdCDR3
<400> 53
Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 54
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1
h77-2
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asn Ser
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ile Ile Asn Ser Ile Gly Ile Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys Asn
85 90 95
Arg Asn Phe Asp Arg Ile Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1 h77-2的sdCDR1
<400> 55
Gly Phe Thr Val Ser Asn Ser Val Met Ala
1 5 10
<210> 56
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1 h77-2的sdCDR2
<400> 56
Ile Ile Asn Ser Ile Gly Ile Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1 h77-2的sdCDR3
<400> 57
Asn Phe Asp Arg Ile Tyr
1 5
<210> 58
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1
h59.3
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Pro Gly Asn Thr Phe Ser Ile Ser
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr His Ser Asp Tyr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
His Tyr Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1 h59.3的sdCDR1
<400> 59
Gly Asn Thr Phe Ser Ile Ser Ala Met Gly
1 5 10
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1 h59.3的sdCDR2
<400> 60
Val Thr His Ser Asp Tyr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1 h59.3的sdCDR3
<400> 61
Tyr Gly Ile Asp Tyr
1 5
<210> 62
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1
h22-4
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Thr Thr Phe Ser Arg Asp
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Arg Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Asn Thr Ala Thr Trp Gly Arg Val Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1 h22-4的sdCDR1
<400> 63
Gly Thr Thr Phe Ser Arg Asp Val Met Gly
1 5 10
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1 h22-4的sdCDR2
<400> 64
Ile Ile Ser Arg Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-FOLR1 h22-4的sdCDR3
<400> 65
Asn Thr Ala Thr Trp Gly Arg Val Phe
1 5
<210> 66
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-B7H3 hF7
<400> 66
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Arg Arg Thr Phe His Thr Tyr
20 25 30
His Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Val Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gln Arg Ala Thr Glu Ala Ser Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-B7H3 hF7的sdCDR1
<400> 67
Arg Arg Thr Phe His Thr Tyr His Met Gly
1 5 10
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-B7H3 hF7的sdCDR2
<400> 68
Val Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-B7H3 hF7的sdCDR3
<400> 69
Gly Gly Ala Thr Thr Gln Arg Ala Thr Glu Ala Ser Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 70
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-B7H3 hF12
<400> 70
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Pro Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ser Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Val Leu Ala His His Asn Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-B7H3 hF12的sdCDR1
<400> 71
Pro Arg Thr Phe Ser Thr Tyr Ser Met Ala
1 5 10
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-B7H3 hF12的sdCDR2
<400> 72
Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 73
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-B7H3 hF12的sdCDR3
<400> 73
Gly Gly Val Leu Ala His His Asn Tyr Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 74
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EpCAM
hF13
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Gly Ser Ile Phe Ser
20 25 30
Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Arg Ile Thr Ser Gly Asp Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Leu Leu Leu Arg Ser Ser Pro Gly Ala Thr Thr Pro Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EpCAM hF13的sdCDR1
<400> 75
Gly Thr Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Leu Met Gly
1 5 10
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EpCAM hF13的sdCDR2
<400> 76
Arg Ile Thr Ser Gly Asp Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 77
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb - α-EpCAM hF13的sdCDR3
<400> 77
Leu Leu Arg Ser Ser Pro Gly Ala Thr Thr Pro Tyr
1 5 10
<210> 78
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb α-EpCAM hF23
<400> 78
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ile Ser Gly Ser Phe Ser Ala Leu Trp
20 25 30
Ala Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ser Arg Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala
85 90 95
Ile Asp Gly His Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb α-EpCAM hF23的sdCDR1
<400> 79
Gly Ser Phe Ser Ala Leu Trp Ala Met Arg
1 5 10
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb α-EpCAM hF23的sdCDR2
<400> 80
Ser Ser Arg Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性靶向sdAb α-EpCAM hF23的sdCDR3
<400> 81
Ile Asp Gly His Leu Ala Tyr
1 5
<210> 82
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性α-HSA半衰期延长结构域
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-α-HSA半衰期延长结构域的示例性sdCDR1
<400> 83
Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-α-HSA半衰期延长结构域的示例性sdCDR2
<400> 84
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-α-HSA半衰期延长结构域的示例性sdCDR3
<400> 85
Gly Gly Ser Leu Ser Val
1 5
<210> 86
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-具有His标签的示例性α-HSA半衰期延长结构域
<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser His His His His His His
115 120
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-具有His标签的α-HSA半衰期延长结构域的示例性sdCDR1
<400> 87
Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-具有His标签的示例性α-HSA半衰期延长结构域的sdCDR2
<400> 88
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 89
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-具有His标签的α-HSA半衰期延长结构域的示例性sdCDR3
<400> 89
Gly Gly Ser Leu Ser Val
1 5
<210> 90
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)
<400> 90
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Val Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Thr Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 91
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体- 活性抗CD3
可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性aVLCDR1
<400> 91
Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体- 示例性活性抗CD3
可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的aVLsdCDR2
<400> 92
Gly Thr Lys Phe Leu Val Pro
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性活性抗CD3
可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的aVLsdCDR3
<400> 93
Thr Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 94
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)
<400> 94
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Thr Pro Ala Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly
65 70 75 80
Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser
85 90 95
Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVLCDR1
<400> 95
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVLsdCDR2
<400> 96
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVLsdCDR3
<400> 97
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 98
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)
<400> 98
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Asp Asp Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 99
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVLCDR1
<400> 99
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVLsdCDR2
<400> 100
Gly Thr Lys Asp Asp Ala Pro
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVLsdCDR3
<400> 101
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 102
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Gln Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Ala Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性aVHCDR1
<400> 103
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 104
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性aVHsdCDR2
<400> 104
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Gln
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 105
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性aVHsdCDR3
<400> 105
His Ala Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 106
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn
65 70 75 80
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr
100 105 110
Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 107
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVHsdCDR1
<400> 107
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 108
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVHsdCDR2
<400> 108
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Asp
20
<210> 109
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVHsdCDR3
<400> 109
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 110
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys His
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVHsdCDR1
<400> 111
Gly Phe Thr Phe Asn Lys His Ala Met Asn
1 5 10
<210> 112
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVHsdCDR2
<400> 112
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 113
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性iVHsdCDR3
<400> 113
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 114
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体：正常/不可裂解接头
<400> 114
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 115
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体：限制性接头
<400> 115
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP7
<400> 116
Lys Arg Ala Leu Gly Leu Pro Gly
1 5
<210> 117
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP7
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> X可为Asp或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(24)
<223> X可为Asp或Arg
<400> 117
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Leu Ala Leu Trp Arg Ser
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP9
<400> 118
Pro Arg Ser Thr Leu Ile Ser Thr
1 5
<210> 119
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP9
<400> 119
Leu Glu Ala Thr Ala
1 5
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP11
<400> 120
Gly Gly Ala Ala Asn Leu Val Arg Gly Gly
1 5 10
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP14
<400> 121
Ser Gly Arg Ile Gly Phe Leu Arg Thr Ala
1 5 10
<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP
<400> 122
Pro Leu Gly Leu Ala Gly
1 5
<210> 123
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 123
Pro Leu Gly Leu Ala Xaa
1 5
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> X可为Met或Glu
<400> 124
Pro Leu Gly Cys Xaa Ala Gly
1 5
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP
<400> 125
Glu Ser Pro Ala Tyr Tyr Thr Ala
1 5
<210> 126
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP
<400> 126
Arg Leu Gln Leu Lys Leu
1 5
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP
<400> 127
Arg Leu Gln Leu Lys Ala Cys
1 5
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP2、MMP9、MMP14
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> X可为Cys或Ile或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> X可为His或Orn或Phe
<400> 128
Glu Pro Xaa Gly Xaa Tyr Leu
1 5
<210> 129
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- 尿激酶纤溶酶原活化剂(upa)
<400> 129
Ser Gly Arg Ser Ala
1 5
<210> 130
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- 尿激酶纤溶酶原活化剂(upa)
<400> 130
Asp Ala Phe Lys
1
<210> 131
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-尿激酶纤溶酶原活化剂(upa)
<400> 131
Gly Gly Gly Arg Arg
1 5
<210> 132
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-溶酶体酶
<400> 132
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 133
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-溶酶体酶
<400> 133
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 134
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-溶酶体酶
<400> 134
Phe Lys
1
<210> 135
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-组织蛋白酶B
<400> 135
Asn Leu Leu
1
<210> 136
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-组织蛋白酶D
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> X可为Glu或Thr
<400> 136
Pro Ile Cys Xaa Phe Phe
1 5
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-组织蛋白酶K
<400> 137
Gly Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly
1 5
<210> 138
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-前列腺特异性抗原
<400> 138
His Ser Ser Lys Leu Gln
1 5
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-前列腺特异性抗原
<400> 139
His Ser Ser Lys Leu Gln Leu
1 5
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-前列腺特异性抗原
<400> 140
His Ser Ser Lys Leu Gln Glu Asp Ala
1 5
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-单纯疱疹病毒蛋白酶
<400> 141
Leu Val Leu Ala Ser Ser Ser Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- Hiv蛋白酶
<400> 142
Gly Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gly
1 5 10
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- Cmv蛋白酶
<400> 143
Gly Val Val Gln Ala Ser Cys Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 144
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-凝血酶
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> X可为Pro或Ile或Pro
<400> 144
Phe Xaa Arg Ser
1
<210> 145
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-凝血酶
<400> 145
Asp Pro Arg Ser Phe Leu
1 5
<210> 146
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-凝血酶
<400> 146
Pro Pro Arg Ser Phe Leu
1 5
<210> 147
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
<400> 147
Asp Glu Val Asp
1
<210> 148
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
<400> 148
Asp Glu Val Asp Pro
1 5
<210> 149
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
<400> 149
Lys Gly Ser Gly Asp Val Glu Gly
1 5
<210> 150
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-白介素1-β转化酶
<400> 150
Gly Trp Glu His Asp Gly
1 5
<210> 151
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-肠激酶
<400> 151
Glu Asp Asp Asp Asp Lys Ala
1 5
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- Fap
<400> 152
Lys Gln Glu Gln Asn Pro Gly Ser Thr
1 5
<210> 153
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-激肽释放酶2
<400> 153
Gly Lys Ala Phe Arg Arg
1 5
<210> 154
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-纤溶酶
<400> 154
Asp Ala Phe Lys
1
<210> 155
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-纤溶酶
<400> 155
Asp Val Leu Lys
1
<210> 156
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-纤溶酶
<400> 156
Asp Ala Phe Lys
1
<210> 157
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- Top
<400> 157
Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5
<210> 158
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP (CCL)
<400> 158
Gly Pro Ala Gly Met Lys Gly Leu
1 5
<210> 159
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP (NCCL)
<400> 159
Ser Gly Gly Pro Gly Pro Ala Gly Met Lys Gly Leu Pro Gly Ser
1 5 10 15
<210> 160
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-组织蛋白酶S/L/K (CCL)
<400> 160
Ser Gly Gly Gly Ala Arg Leu Gln Ser Ala Ala Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 161
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-组织蛋白酶S/L/K (CCL)
<400> 161
Ala Arg Leu Gln Ser Ala Ala Pro
1 5
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-穿膜肽酶/颗粒酶B (CCL)
<400> 162
Ser Gly Gly Gly Gly Val Tyr Ala Asp Ser Leu Glu Asp Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点-穿膜肽酶/颗粒酶B (CCL)
<400> 163
Gly Val Tyr Ala Asp Ser Leu Glu Asp Gly
1 5 10
<210> 164
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- 穿膜肽酶A/B (CCL)
<400> 164
Gly Gly Gly Gly Lys Lys Leu Ala Asp Glu Pro Glu Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 165
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- 穿膜肽酶A/B (CCL)
<400> 165
Lys Lys Leu Ala Asp Glu Pro Glu
1 5
<210> 166
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP9/2
<400> 166
Gly Pro Ala Gly Met Lys Gly Leu
1 5
<210> 167
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP9/2
<400> 167
Ser Gly Gly Pro Gly Pro Ala Gly Met Lys Gly Leu Pro Gly Ser
1 5 10 15
<210> 168
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- MMP9/2
<400> 168
Ser Gly Gly Gly Pro Gly Pro Ala Gly Met Lys Gly Leu Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 169
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- 蛋白裂解酶(ST14)
<400> 169
Ser Gly Gly Gly Ser Phe Thr Arg Gln Ala Arg Val Val Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成蛋白酶裂解位点- 蛋白裂解酶(ST14)
<400> 170
Ser Phe Thr Arg Gln Ala Arg Val Val
1 5
<210> 171
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带正电荷的scFv接头- Gly-Ser 15
<400> 171
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 172
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带正电荷的scFv接头- Whitlow接头
<400> 172
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 173
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带正电荷的scFv接头- 6paxA_1 (+A)
<400> 173
Ile Arg Pro Arg Ala Ile Gly Gly Ser Lys Pro Arg Val Ala
1 5 10
<210> 174
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带正电荷的scFv接头- (+B)
<400> 174
Gly Lys Gly Gly Ser Gly Lys Gly Gly Ser Gly Lys Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 175
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带正电荷的scFv接头- (+C)
<400> 175
Gly Gly Lys Gly Ser Gly Gly Lys Gly Ser Gly Gly Lys Gly Ser
1 5 10 15
<210> 176
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带正电荷的scFv接头- (+D)
<400> 176
Gly Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly Lys Ser
1 5 10 15
<210> 177
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带正电荷的scFv接头- (+E)
<400> 177
Gly Lys Gly Lys Ser Gly Lys Gly Lys Ser Gly Lys Gly Lys Ser
1 5 10 15
<210> 178
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带正电荷的scFv接头- (+F)
<400> 178
Gly Gly Gly Lys Ser Gly Gly Lys Gly Ser Gly Lys Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 179
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带正电荷的scFv接头- (+G)
<400> 179
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
<210> 180
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带正电荷的scFv接头- (+H)
<400> 180
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Ser
20
<210> 181
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带正电荷的scFv接头- (+I)
<400> 181
Gly Lys Gly Lys Ser Gly Lys Gly Lys Ser Gly Lys Gly Lys Ser Gly
1 5 10 15
Lys Gly Lys Ser
20
<210> 182
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带负电荷的scFv接头- Gly-Ser 15
<400> 182
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 183
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带负电荷的scFv接头- 3hsc_2 (-A)
<400> 183
Ser Thr Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp
1 5 10
<210> 184
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带负电荷的scFv接头- 3hsc_2 (-B)
<400> 184
Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 185
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带负电荷的scFv接头- 3hsc_2 (-C)
<400> 185
Gly Gly Glu Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ser
1 5 10 15
<210> 186
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带负电荷的scFv接头- 3hsc_2 (-D)
<400> 186
Gly Gly Gly Glu Ser Gly Gly Gly Glu Ser Gly Gly Gly Glu Ser
1 5 10 15
<210> 187
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带负电荷的scFv接头- 3hsc_2 (-E)
<400> 187
Gly Glu Gly Glu Ser Gly Glu Gly Glu Ser Gly Glu Gly Glu Ser
1 5 10 15
<210> 188
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带负电荷的scFv接头- 3hsc_2 (-F)
<400> 188
Gly Gly Gly Glu Ser Gly Gly Glu Gly Ser Gly Glu Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 189
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的带负电荷的scFv接头- 3hsc_2 (-G)
<400> 189
Gly Glu Gly Glu Ser Gly Glu Gly Glu Ser Gly Glu Gly Glu Ser Gly
1 5 10 15
Glu Gly Glu Ser
20
<210> 190
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 190
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 191
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 192
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 193
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 193
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 194
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 194
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 195
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 195
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 196
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 196
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 197
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 197
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 198
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 198
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 199
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 199
Pro Arg Gly Ala Ser Lys Ser Gly Ser Ala Ser Gln Thr Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Gly Ser
<210> 200
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 200
Gly Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 201
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 201
Gly Thr Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly
<210> 202
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的scFv接头
<400> 202
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Ser
20
<210> 203
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)
<400> 203
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
His Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Ser Asn Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Gly Ser Arg
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 204
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性aVLiGLCDR1
<400> 204
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 205
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性aVLiGLCDR2
<400> 205
Gly Thr Ser Asn Lys His Ser
1 5
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变轻结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性aVLiGLCDR3
<400> 206
Val Leu Trp Gly Ser Arg Arg Trp Val
1 5
<210> 207
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-示例性无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)
<400> 207
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Ala Gly Asn Ser Ala Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 208
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性aVHiGL4CDR1
<400> 208
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 209
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性aVHiGL4CDR2
<400> 209
Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Glu Tyr Ala Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 210
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体-无活性抗CD3可变重结构域(α-CD3 scFv结构域)的示例性aVHiGL4CDR3
<400> 210
His Gly Asn Ala Gly Asn Ser Ala Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10

Claims (53)

1.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含
a)编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包含：
i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第一单结构域抗体(sdAb)；
ii)第一结构域接头；
iii)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；
iv)包含第一蛋白酶裂解位点的第一可裂解接头；和
v)假可变轻链；以及
b)编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽从N末端到C末端包含：
i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第二sdAb；
ii)第二结构域接头；
iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的可变轻链；
iv)包含第二蛋白酶裂解位点的第二可裂解接头；和
v)假可变重链；
其中所述第一多肽的所述可变重链和所述第二多肽的所述可变轻链在缔合形成Fv时将结合人CD3。
2.根据权利要求1所述的分离的细胞，其中所述第一sdAb和所述第二sdAb结合相同的人TTA。
3.根据权利要求1或2所述的分离的细胞，其中所述第一sdAb和/或所述第二sdAb结合选自由以下组成的组的人TTA：人EGFR、人B7H3、人EpCAM和人FOLR1。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一sdAb和所述第二sdAb包含相同的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一sdAb和所述第二sdAb包含不同的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一蛋白酶裂解位点和所述第二蛋白酶裂解位点由相同的蛋白酶识别。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一蛋白酶裂解位点和所述第二蛋白酶裂解位点由不同的蛋白酶识别。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一多肽还在C末端包含半衰期延长结构域，且/或所述第二多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的细胞，其中所述可变重链包含图39的SEQID NO:102的所述vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的细胞，其中所述可变轻链包含图38的SEQID NO:90的所述vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的分离的细胞，其中所述假可变重链包含选自由图39的SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:207组成的组的任一个的假可变重链序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的分离的细胞，其中所述假可变轻链包含选自由图38的SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:203组成的组的任一个的假可变轻链序列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一多肽选自由以下组成的组：Pro16(SEQ ID NO:5)、Pro39(SEQ ID NO:9)、Pro41(SEQ ID NO:13)、Pro43(SEQ IDNO:17)、Pro45(SEQ ID NO:21)和Pro349(SEQ ID NO:25)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的分离的细胞，其中所述第二多肽选自由以下组成的组：Pro19(SEQ ID NO:7)、Pro40(SEQ ID NO:11)、Pro42(SEQ ID NO:15)、Pro44(SEQID NO:19)、Pro46(SEQ ID NO:23)和Pro353(SEQ ID NO:27)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一多肽和所述第二多肽选自由以下组成的组：Pro16+Pro19、Pro39+Pro40、Pro41+Pro42、Pro43+Pro44、Pro45+Pro46和Pro349+Pro353。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在不同的表达载体中引入到所述细胞中。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在单个表达载体中引入到所述细胞中。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸以多核苷酸比率引入到所述细胞中，以产生基本上等量的所述第一多肽和所述第二多肽。
19.根据权利要求18所述的分离的细胞，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的所述比率为1:1。
20.根据权利要求18所述的分离的细胞，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的所述比率大于1:1。
21.根据权利要求18所述的分离的细胞，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的所述比率小于1:1。
22.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求1至21中任一项所述的第一多核苷酸。
23.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求1至21中任一项所述的第二多核苷酸。
24.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求22所述的第一表达载体和根据权利要求23所述的第二表达载体，其中所述第一表达载体和所述第二表达载体以多核苷酸比率引入到宿主细胞中，以产生基本上等量的所述第一多肽和所述第二多肽。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述第一表达载体与所述第二表达载体的所述比率为1:1。
26.根据权利要求24所述的组合物，其中所述第一表达载体与所述第二表达载体的所述比率大于1:1。
27.根据权利要求24所述的组合物，其中所述第一表达载体与所述第二表达载体的所述比率小于1:1。
28.一种分离包含第一多肽和第二多肽的前药组合物的方法，所述方法包括：
1)在合适的培养条件下培养宿主细胞以产生第一多肽和第二多肽并将其分泌到培养基中；
其中所述宿主细胞包含：
a)编码所述第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包含：
i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第一sdAb；
ii)第一结构域接头；
iii)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；
iv)包含第一蛋白酶裂解位点的第一可裂解接头；和
v)假可变轻链；以及
b)编码第二多肽的第二多核苷酸序列，所述第二多肽从N末端到C末端包含：
i)与人肿瘤靶抗原(TTA)结合的第二sdAb；
ii)第二结构域接头；
iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的可变轻链；
iv)包含第二蛋白酶裂解位点的第二可裂解接头；和
v)假可变重链；
其中所述第一多肽的所述可变重链和所述第二多肽的所述可变轻链在缔合形成Fv时将结合人CD3；以及
2)使用蛋白A色谱法从所述培养基中纯化所述第一多肽和所述第二多肽，从而分离出包含所述第一多肽和所述第二多肽的前药组合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中单独对所述第一多肽和所述第二多肽进行纯化。
30.根据权利要求28所述的方法，其中同时对所述第一多肽和所述第二多肽进行纯化。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述纯化还包括在蛋白A色谱法之后进行亲和色谱法。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述前药组合物包含基本上等量的所述第一多肽和所述第二多肽。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述第一sdAb和所述第二sdAb结合相同的人TTA。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述第一sdAb和/或所述第二sdAb结合选自由以下组成的组的人TTA：人EGFR、人B7H3、人EpCAM和人FOLR1。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述第一sdAb和所述第二sdAb包含相同的氨基酸序列。
36.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述第一sdAb和所述第二sdAb包含不同的氨基酸序列。
37.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白酶裂解位点和所述第二蛋白酶裂解位点由相同的蛋白酶识别。
38.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白酶裂解位点和所述第二蛋白酶裂解位点由不同的蛋白酶识别。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中所述第一多肽还在C末端包含半衰期延长结构域，且/或所述第二多肽还在C末端包含半衰期延长结构域。
40.根据权利要求28至39中任一项所述的方法，其中所述可变重链包含图39的SEQ IDNO:102的所述vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3序列。
41.根据权利要求28至40中任一项所述的方法，其中所述可变轻链包含图38的SEQ IDNO:90的所述vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列。
42.根据权利要求28至41中任一项所述的方法，其中所述假可变重链包含选自由图39的SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:207组成的组的任一个的假可变重链序列。
43.根据权利要求28至42中任一项所述的方法，其中所述假可变轻链包含选自由图38的SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:203组成的组的任一个的假可变轻链序列。
44.根据权利要求28至43中任一项所述的方法，其中所述第一多肽选自由以下组成的组：Pro16(SEQ ID NO:5)、Pro39(SEQ ID NO:9)、Pro41(SEQ ID NO:13)、Pro43(SEQ ID NO:17)、Pro45(SEQ ID NO:21)和Pro349(SEQ ID NO:25)。
45.根据权利要求28至44中任一项所述的方法，其中所述第二多肽选自由以下组成的组：Pro19(SEQ ID NO:7)、Pro40(SEQ ID NO:11)、Pro42(SEQ ID NO:15)、Pro44(SEQ IDNO:19)、Pro46(SEQ ID NO:23)和Pro353(SEQ ID NO:27)。
46.根据权利要求28至45中任一项所述的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽选自由以下组成的组：Pro16+Pro19、Pro39+Pro40、Pro41+Pro42、Pro43+Pro44、Pro45+Pro46和Pro349+Pro353。
47.根据权利要求28至46中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸以不同的表达载体引入到所述宿主细胞中。
48.根据权利要求28至46中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸以单个表达载体引入到所述宿主细胞中。
49.根据权利要求28至48中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸以多核苷酸比率引入到所述宿主细胞中以产生基本上等量的所述第一多肽和所述第二多肽。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的所述多核苷酸比率为1:1。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的所述比率大于1:1。
52.根据权利要求49所述的方法，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的所述比率小于1:1。
53.一种治疗有需要的人受试者的癌症的方法，所述方法包括施用根据权利要求28至52中任一项所述的方法产生的前药组合物。
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