KR102505383B1 - Dll3 표적 다중 특이성 항원 결합 분자 및 그의 사용 - Google Patents
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Abstract
본 개시는, 각각이, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분과, DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공하고, 해당 다중 특이성 항원 결합 분자는, 다른 다중 특이성 항원 결합 분자가 가질 수 있는 유해한 독성의 염려 또는 부작용을 회피하면서, 보다 효율적으로 T 세포 의존성 세포 상해 활성을 유도한다. 본 발명은, 유효 성분으로서 해당 항원 결합 분자를 포함하는 것에 의해, 여러 가지 암, 특히 DLL3에 관련된 암을 치료할 수 있는 다중 특이성 항원 결합 분자 및 의약 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은, 각각이 CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및 DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 그와 같은 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산; 그와 같은 항원 결합 분자를 조제하기 위한 방법; 그와 같은 항원 결합 분자를 발현하는 또는 발현할 수 있는 숙주 세포; 그와 같은 항원 결합 분자를 포함하는 조성물; 특히 암 질환의 분야에 있어서의 치료 목적으로의, 그와 같은 항원 결합 분자 또는 그와 같은 조성물의 사용에도 관한 것이다.
암은, 세계에서 사망의 주된 원인의 하나이다. 어느 특정의 암종을 제외하고, 종양은 많은 경우, 그들이 발견되었을 때에는 수술 불가능하다. 종래의 암 치료에는, 방사선 요법, 화학 요법, 및 면역 요법이 포함된다. 이들 치료는 많은 경우, 효과가 충분하지 않고, 최종적으로, 암의 재발 또는 전이가 치료 후에 생긴다. 최대 효과를 제한하는 요인의 하나가, 종양 특이성의 결여이며, 따라서, 보다 종양 특이성이 높은 분자 표적 요법이, 암 치료에 있어서의 추가적인 실행 가능한 선택 사항이 되고 있다.
항체는, 혈장 중에서 극히 안정하고 부작용이 거의 없으므로, 의약으로서 주목을 받고 있다. 복수의 치료용 항체 중, 일부 종류의 항체는, 항종양 반응을 발휘하기 위해 이펙터 세포를 필요로 한다. 항체 의존성 세포 상해(ADCC)는 NK 세포 및 매크로파지 상에 존재하는 Fc 수용체에 대한 항체 Fc 영역의 결합을 개재시켜, 항체 결합 세포에 대한 이펙터 세포에 의해 나타나는, 세포 상해이다. 지금까지, ADCC를 유도하여 항종양 효과를 발휘할 수 있는 복수의 치료용 항체가, 암을 치료하기 위한 의약으로서 개발되고 있다(비특허문헌 1). 종래형의 치료용 항체를 이용한, 종양 특이적으로 발현하고 있는 항원을 표적으로 하는 요법은, 우수한 항종양 활성을 나타내지만, 그와 같은 항체의 투여가, 만족스러운 결과를 항상 가져온다고는 할 수 없다.
이펙터 세포로서 NK 세포 또는 매크로파지를 채용하는 것에 의해 ADCC를 유도하는 항체에 더하여, 이펙터 세포로서 T 세포를 동원하는 것에 의해 세포 상해성을 받아들이는 T 세포 동원 항체(TR 항체)가, 1980년대부터 알려져 있다(비특허문헌 2 내지 4). TR 항체는, T 세포 상의 T 세포 수용체 복합체를 형성하는 서브유닛 중 어느 하나, 특히 CD3ε쇄와 암 세포 상의 항원을 인식하고, 또한 그들에 결합하는 이중 특이성 항체이다. 몇몇 TR 항체가 현재 개발되어 있다. 카투막소마브(Catumaxomab)는, EpCAM에 대한 TR 항체이며, 악성 복수증의 치료에 관해서 EU에서 승인되어 있다. 더욱이, "이중 특이성 T 세포 유도(BiTE)"라고 불리는 종류의 TR 항체가, 강력한 항종양 활성을 나타냄이 근년 발견되어 있다(비특허문헌 5 및 6). 블리나투모마브(Blinatumomab)는, CD19에 대한 BiTE 분자이며, 2014년에 최초로 FDA의 승인을 받았다. 블리나투모마브는, 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 및 보체 의존성 세포 상해(CDC)를 유도하는 리툭시마브(Rituximab)와 비교하여, CD19/CD20 양성 암 세포에 대해서 훨씬 강한 세포 상해 활성을 인비트로(in vitro)로 나타냄이 증명되어 있다(비특허문헌 7).
그렇지만, 3기능성 항체는, 암 항원 비의존적으로, T 세포와 NK 세포 또는 매크로파지 등의 세포의 양쪽에 동시에 결합하여, 그 결과로, 이들 세포 상에 발현하고 있는 수용체가 가교되어, 여러 가지 사이토카인의 발현이 암 항원 비의존적으로 유도되는 것이 공지되어 있다. 3기능성 항체의 전신 투여는, 그와 같은 사이토카인 발현의 유도의 결과로서, 사이토카인 스톰양(樣)의 부작용을 야기한다고 생각된다. 실제, 제I상 임상 시험에 있어서, 비소세포 폐암을 갖는 환자에 대한 카투막소마브의 전신 투여에서의 최대 내용량이 5μg/body와 같은 초저용량인 것, 및 보다 고용량의 투여가, 다양한 중독(重篤)한 부작용을 야기함이 보고되어 있다(비특허문헌 8). 그와 같은 저용량으로 투여했을 경우, 카투막소마브는, 유효 혈중 레벨에 도달할 수 없다. 즉, 그와 같은 저용량으로 카투막소마브를 투여하는 것에 의해서는, 기대되는 항종양 작용을 달성할 수 없다.
한편으로, 카투막소마브와는 달리, BiTE는, Fcγ 수용체 결합 부위를 갖지 않으므로, T 세포 상 및 NK 세포 및 매크로파지 등의 세포 상에 발현하고 있는 수용체를 암 항원 비의존적으로 가교하지 않는다. 따라서, BiTE는, 카투막소마브를 투여했을 때에 나타나는 암 항원 비의존적 사이토카인 유도를 야기하지 않음이 실증되어 있다. 그렇지만, BiTE는, Fc 영역을 갖지 않는 개변된 저분자량 항체 분자이므로, 환자로의 투여 후의 그의 혈중 반감기가, 치료용 항체로서 통상 이용되는 IgG형의 항체보다 현저히 짧다고 하는 문제가 있다. 실제, in vivo로 투여된 BiTE의 혈중 반감기는, 대략 수시간이라고 보고되어 있다(비특허문헌 9 및 10). 블리나투모마브의 임상 시험에서는, 블리나투모마브는, 미니펌프를 이용하는 지속 점적 정주에 의해 투여된다. 이 투여 방법은, 환자에게 있어 극히 불편할 뿐만 아니라, 디바이스의 오작동 등에 의한 의료 사고의 위험성의 가능성도 또한 갖는다. 따라서, 그와 같은 투여 방법은 바람직한 것이라고는 말할 수 없다.
델타양 3(Delta-like 3, DLL3)은, Notch 리간드 패밀리 멤버에 속하는 I형 막단백질이다. DLL3은, 정상적인 체절 형성 및 패턴 형성에 필요하다. DLL3에 있어서의 변이는, 상염색체 열성 척추 늑골 이골증의 환자에 있어서 늑골 결손 또는 척추 분리를 야기한다(비특허문헌 11 및 12). 염색체 상의 DLL3 유전자의 증폭 및 암 세포주에 있어서의 이 유전자의 발현의 증가(비특허문헌 13) 및 일부의 신경교종의 경우에 있어서의 DLL3 발현의 증가(비특허문헌 14)를 보고하는 이전의 연구가 존재하고 있다. 더하여, DLL3은, ADCC 증강 항체, 항체-약물 컨주게이트(ADC), 및 BiTE-Fc 포맷을 이용하는 T 세포 유도 이중 특이성 분자를 이용한, SCLC에 더하여 신경교종을 진단 및 치료하는 방법에 있어서, 지금까지 제안되고 있다(특허문헌 1, 2, 및 3).
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본 발명의 목적은, T 세포를 DLL3 발현 세포의 가까이에 동원하여, DLL3 발현 암 세포에 대한 T 세포의 세포 상해성을 이용하는 것에 의해, 암 치료가 가능한, 다중 특이성 항원 결합 분자; 다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하기 위한 방법; 및 세포 상해 활성을 유도하기 위한 유효 성분으로서 그와 같은 다중 특이성 항원 결합 분자를 포함하는 치료제를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은, 유효 성분으로서 전술한 항원 결합 분자 중 하나를 포함하는, 여러 가지 암 치료 또는 예방에 사용하기 위한 의약 조성물, 및 해당 의약 조성물을 이용하는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 각각이, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는(즉, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, 동시는 아니다), 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분과; DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 관한 것이고, 해당 다중 특이성 항원 결합 분자는, 다른 다중 특이성 항원 결합 분자가 가질 수 있는 유해한 독성의 염려 또는 부작용을 회피하면서, 보다 효율적으로 T 세포 의존성 세포 상해 활성을 유도한다. 본 발명은, 유효 성분으로서 항원 결합 분자를 포함하는 것에 의해, 여러 가지 암, 특히, DLL3 양성 종양 등의 DLL3에 관련된 암을 치료할 수 있는 다중 특이성 항원 결합 분자 및 의약 조성물을 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자는, 다중 특이성 항원 결합 분자의 유효성을 개선 또는 증강하는, 매우 독특한 구조 포맷을 갖는다. 독특한 구조 포맷을 갖는 신규한 항원 결합 분자는, 바람직하지 않은 유해 작용의 저감과 함께, 이펙터 세포 및 표적 세포 상의 각각의 항원에 대한 증가한 결합가 및/또는 특이성을 발생시키기 위해 증가한 항원 결합 도메인의 수를 제공한다.
하나의 특정의 국면에 있어서, 본 발명은, 각각이, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는(즉, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, 동시는 아니다), 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분과; DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 관한 것이고, 해당 다중 특이성 항원 결합 분자는, 다른 다중 특이성 항원 결합 분자가 가질 수 있는 유해한 독성의 염려 또는 부작용을 회피하면서, 효율적으로 T 세포 의존성 세포 상해 활성을 유도한다. 하나의 그와 같은 국면에 있어서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, 적어도 1개의 아미노산 변이, 예를 들어, 시스테인의 삽입/치환/변이를 포함하고, 이것은, 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이에 다이설파이드 결합을 만들어 내어, 그들을 서로 가깝게 유지하고, 또한, 예를 들어, 2개의 Dual-Fab 사이의 입체 장애 또는 보다 짧은 거리의 결과로서 동일한 단일의 이펙터 세포 상의 항원(CD3 및/또는 CD137)으로의 시스 항원 결합을 촉진하고, 그에 의해, 2개의 Dual-Fab에 의해 DLL3 비의존적으로 매개되는 2개의 CD3/CD137 발현 면역 세포의 바람직하지 않은 가교 형성을 방해하는 것에 의해 삼중 특이성 항체의 안전성 프로파일을 개선한다. 하나의 특정의 국면에 있어서, 해당 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, Fab이며, 또한 CH1 영역 중에(변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 적어도 1개의 시스테인 잔기를 포함하고, 해당 적어도 1개의 시스테인 잔기는, 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있다. 다른 특정의 국면에 있어서, 해당 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는, CH1 영역 중의 EU 넘버링에 의한 191위에 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 1개의 시스테인 잔기를 포함한다.
그와 같은 독특한 구조 포맷을 갖는 항원 결합 분자는 놀랄 만하게도, 다양한 세포(예를 들어, T 세포 등의 이펙터 세포) 사이의 바람직하지 않은 가교 형성에 기인하는 오프타겟(off-target) 부작용의 저감 또는 최소화를 나타내면서, 다른 다중 특이성 항체 포맷(예를 들어, BiTE)과 비교하여 우수한 유효성을 나타냄이 발견되었다.
보다 구체적으로는, 본 개시는 이하를 제공한다:
[1] 각각이, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및
제 3 항원, 바람직하게는 암 세포/조직 상에 발현하고 있는 항원에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[1A] 각각이, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및
DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [1] 내지 [1A] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편의 어느 하나의 결합과 경합하는 항체 가변 단편.
[3] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [1] 내지 [2] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a15) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편의 어느 하나의 결합과 경합하는 항체 가변 단편.
[3A] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3B] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [3A]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, Fab 분자이고, 또한 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 포함하는, [1] 내지 [3B] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4A] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, Fab 분자이고, 또한 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 191위에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 1개의 다이설파이드 결합을 포함하는, [4]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[5] 제 3 항원 결합 부분이, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽에 융합되어 있는, [1] 내지 [4A] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[5A] 제 3 항원 결합 부분이 Fab 또는 scFv인, [5]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[6] 제 1, 제 2, 및 제 3 항원 결합 부분의 각각이 Fab 분자이며, 제 3 항원 결합 부분이, Fab 중쇄의 C말단(CH1)에서, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 임의로 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어 있는, [5] 내지 [5A] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[6A] 상기 펩티드 링커가, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 또는 서열 번호: 259의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 [5] 내지 [6] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[6B] 제 1 항원 결합 부분이 제 2 항원 결합 부분과 동일한, [1] 내지 [6A] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[7] 제 3 항원 결합 부분이, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이 종래형의 Fab 분자인, [1] 내지 [6B] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[8] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및/또는 124위에 있는 아미노산이 독립적으로, 리신(K), 아르기닌(R), 및 히스티딘(H)으로 치환되고(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위 및/또는 213위에 있는 아미노산이 독립적으로, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되어 있는(Kabat EU 인덱스에 의한 넘버링), [7]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[9] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및 124위에 있는 아미노산이 각각, 아르기닌(R) 및 리신(K)이며(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위 및 213위에 있는 아미노산이, 글루탐산(E)인(Kabat EU 인덱스에 의한 넘버링) [8]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[10] DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 이하의 (a1) 내지 (a5) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 276의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 277의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 278의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 279의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 280의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 281의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 285의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 286의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 287의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 288의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 289의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 290의 경쇄 CDR 3;
(a4) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a5) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 단편의 어느 하나의 결합과 경합하는 항체 가변 단편.
[11] DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 이하의 (a1) 내지 (a6) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [1] 내지 [10] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 264의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 265의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 266의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 268의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 269의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) (a1) 내지 (a4)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a6) (a1) 내지 (a4)로부터 선택되는 항체 가변 단편의 어느 하나의 결합과 경합하는 항체 가변 단편.
[11A] DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [10] 또는 [11]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[11B] DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [11A]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12] Fc 도메인을 추가로 포함하는, [1] 내지 [11B] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12A] Fc 도메인이, 안정된 회합이 가능한 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛으로 구성되고, 또한 Fc 도메인이, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 친화성(affinity)을 나타내는, [12] 의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12B] 제 1 Fc 영역 서브유닛이, 이하로 이루어지는 군으로부터 선택되고:
(a1) 234위에 Ala 및 235위에 Ala를 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드;
(a2) 234위에 Ala, 235위에 Ala, 및 297위에 Ala를 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드;
(a3) 234위에 Ala, 235위에 Ala, 297위에 Ala, 354위에 Cys, 및 366위에 Trp를 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드,
제 2 Fc 영역 폴리펩티드가, 이하로 이루어지는 군으로부터 선택되고:
(a4) 234위에 Ala 및 235위에 Ala를 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드;
(a5) 234위에 Ala, 235위에 Ala, 및 297위에 Ala를 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드;
(a6) 234위에 Ala, 235위에 Ala, 297위에 Ala, 349위에 Cys, 366위에 Ser, 368위에 Ala, 및 407위에 Val을 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드,
아미노산 위치가 EU 인덱스 넘버링을 이용하여 넘버링되는, [12A]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12C] Fc 도메인이, 천연형 IgG의 Fc 영역의 것과 비교하여 산성 pH 조건(예를 들어, pH 5.8) 하에서 증강된 FcRn 결합 활성을 나타내는, [12] 내지 [12B] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12D] Fc 도메인이, EU 넘버링에 의한, 434위에 Ala; 438위에 Glu, Arg, Ser, 또는 Lys; 및 440위에 Glu, Asp, 또는 Gln를 포함하는, [12C]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12E] Fc 도메인이, EU 넘버링에 의한, 434위에 Ala; 438위에 Arg 또는 Lys; 및 440위에 Glu 또는 Asp를 포함하는, [12D]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12F] Fc 도메인이, EU 넘버링에 의한, 428위에 Ile 혹은 Leu; 및/또는 436위에 Ile, Leu, Val, Thr, 혹은 Phe를 추가로 포함하는, [12E]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12G] Fc 도메인이, EU 넘버링에 의한, 이하로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함하는, [12C] 내지 [12F] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a) N434A/Q438R/S440E;
(b) N434A/Q438R/S440D;
(c) N434A/Q438K/S440E;
(d) N434A/Q438K/S440D;
(e) N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(f) N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(g) N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(h) N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(i) N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(j) N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(k) N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(l) N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(m) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E;
(n) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D;
(o) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E;
(p) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D;
(q) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E;
(r) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D;
(s) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E;
(t) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D;
(u) M428L/N434A/Q438R/S440E;
(v) M428L/N434A/Q438R/S440D;
(w) M428L/N434A/Q438K/S440E;
(x) M428L/N434A/Q438K/S440D;
(y) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(z) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(aa) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(ab) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(ac) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(ad) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(ae) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(af) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(ag) L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E; 및
(ah) L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E.
[12H] Fc 도메인이, M428L/N434A/Q438R/S440E의 아미노산 치환의 조합을 포함하는, [12C] 내지 [12G] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12I] Fc 도메인이, IgG Fc 도메인, 바람직하게는 인간 IgG Fc 도메인, 보다 바람직하게는 인간 IgG1 Fc 도메인인, [12] 내지 [12H] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12J] Fc 도메인이, 이하 중 어느 하나를 포함하는, [12] 내지 [12I] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a) 서열 번호: 100에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 Fc 서브유닛 및 서열 번호: 111에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 2 Fc 서브유닛; 및
(b) 서열 번호: 99에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 Fc 서브유닛 및 서열 번호: 109에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 2 Fc 서브유닛.
[12K] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이 Fab이며, 제 1 항원 결합 부분이, Fab 중쇄의 C말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N말단에 융합되고, 또한 제 2 항원 결합 부분이, Fab 중쇄의 C말단에서 Fc 도메인의 나머지의 서브유닛의 N말단에 융합되어 있는, [12] 내지 [12J] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12L] 제 3 항원 결합 부분이, C말단에서 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 임의로 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어 있는, [12K]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[13] 이하의 (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 조합 중 어느 하나에 있어서의 5개의 폴리펩티드쇄를 포함하고:
(a1) 서열 번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 208의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a2) 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a3) 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a4) 서열 번호: 205의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a5) 서열 번호: 216의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a6) 서열 번호: 217의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 210의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a7) 서열 번호: 219의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a8) 서열 번호: 220의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a9) 서열 번호: 221의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a10) 서열 번호: 222의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 230의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a11) 서열 번호: 223의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a12) 서열 번호: 225의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a13) 서열 번호: 226의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a14) 서열 번호: 227의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5); 및
(a15) 서열 번호: 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5),
바람직하게는, 5개의 폴리펩티드쇄(쇄 1 내지 쇄 5)가, 도 1(a)에 나타내는 배향성을 따라 서로 접속 및/또는 관련하고 있는,
[1] 내지 [12L] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[14] [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 폴리뉴클레오티드.
[15] [14]의 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 벡터.
[16] [14]의 폴리뉴클레오티드 혹은 복수의 폴리뉴클레오티드, 또는 [15]의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
[17] a) 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에서 [16]의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 b) 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하는 방법.
[17A] [17]의 방법에 의해 제조된, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[18] [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 의약 조성물.
[19] 세포 상해 활성, 바람직하게는 T 세포 의존성 세포 상해 활성을 유도하는, [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 [18]의 의약 조성물.
[20] 의약으로서 사용하기 위한 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 [18]의 의약 조성물.
[21] 그것을 필요로 하는 대상에 있어서의 질환의 치료 또는 예방에 있어서 사용하기 위한, [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 [18]의 의약 조성물.
[22] 질환이 암인, [21]의 질환의 치료/예방에 사용하기 위한 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 의약 조성물.
[22A] 암이 DLL3 발현 암 또는 DLL3 양성 암인, [22]의 질환의 치료/예방에 사용하기 위한 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 의약 조성물.
[22B] 암이 폐암(소세포 폐암을 포함한다) 및 흑색종인, [22] 또는 [22A]의 질환의 치료/예방에 사용하기 위한 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 의약 조성물.
[23] 그 필요가 있는 개체에 있어서의 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 [18]의 의약 조성물의 사용.
[24] [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 [18]의 의약 조성물의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에 있어서 질환을 치료하는 방법.
[25] 상기 질환이, 암, 바람직하게는 DLL3 양성 암 또는 DLL3 발현 암인, [23]의 사용 또는 [24]의 방법.
[25A] 암이 DLL3 발현 암 또는 DLL3 양성 암인, [25]의 사용 또는 방법.
[25B] 암이 폐암(소세포 폐암을 포함한다) 또는 흑색종인, [25A] 의 사용 또는 방법.
[26] T 세포의 존재하에서, 표적 세포를, [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 [18]의 의약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 방법.
[27] [18]의 의약 조성물과; 암, 바람직하게는 DLL3 양성 암 또는 DLL3 발현 암을 치료하는 또는 그 진행을 늦추기 위해서 대상에게 투여하기 위한 지시서를 포함하는 첨부 문서를 포함하는, 키트.
[27A] 암이 폐암(소세포 폐암을 포함한다) 및 흑색종인, [27]의 키트.
본 발명의 다른 국면은, 이하에 관한 것이다:
[28] 이하를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 항원 결합 부분; 및
DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 부분.
[29] CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 항원 결합 부분이, 이하의 (a1) 내지 (a17) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [28]의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편의 어느 하나의 결합과 경합하는 항체 가변 단편.
[30] CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 항원 결합 부분이, 이하의 (a1) 내지 (a17) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [28] 내지 [29] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a15) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편의 어느 하나의 결합과 경합하는 항체 가변 단편.
본 발명의 또 다른 국면에 있어서, 이하에 관한 것이다:
[31] 이하의 (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 조합 중 어느 하나에 있어서의 5개의 폴리펩티드쇄를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자로서, 바람직하게는, 5개의 폴리펩티드쇄(쇄 1 내지 쇄 5)가, 도 1(a)에 나타나는 배향성을 따라 서로 연결 및/또는 회합되는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 208의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a2) 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a3) 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a4) 서열 번호: 205의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a5) 서열 번호: 216의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a6) 서열 번호: 217의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 210의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a7) 서열 번호: 219의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a8) 서열 번호: 220의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a9) 서열 번호: 221의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a10) 서열 번호: 222의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 230의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a11) 서열 번호: 223의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a12) 서열 번호: 225의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a13) 서열 번호: 226의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a14) 서열 번호: 227의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5); 및
(a15) 서열 번호: 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5).
본 발명의 또 다른 국면은 이하에 관한 것이다:
[32] 이하의 (a1) 내지 (a5) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 276의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 277의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 278의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 279의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 280의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 281의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 285의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 286의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 287의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 288의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 289의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 290의 경쇄 CDR 3;
(a4) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a5) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 단편의 어느 하나의 결합과 경합하는 항체 가변 단편.
[33] 하기의 (a1) 내지 (a6) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 264의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 265의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 266의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 268의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 269의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) (a1) 내지 (a4)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a6) (a1) 내지 (a4)로부터 선택되는 항체 가변 단편의 어느 하나의 결합과 경합하는 항체 가변 단편.
본 발명의 또 다른 국면은 이하에 관한 것이다:
[2-1] (a) 각각이 인간 CD3에 결합하고, 또한 동일하거나 또는 상이할 수 있는 항체 가변 영역을 포함하고, 해당 항체 가변 영역이, 이하로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분:
(a1) 서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역; 및
(b) 인간 Delta-like 3(DLL3)에 결합하고, 또한, 서열 번호: 233을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 234를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235를 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239를 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2-2] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, 동일하거나 또는 상이할 수 있는 항체 가변 영역을 포함하고, 해당 항체 가변 영역이, 이하로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는, [2-1]의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
[2-2A] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각,
서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역
을 포함하는, [2-1] 내지 [2-2] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2-2B] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각,
서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 가변 영역
을 포함하는, [2-2A]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2-2C] 제 3 항원 결합 부분이,
서열 번호: 232를 포함하는 VH와 서열 번호: 236을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역
을 포함하는, [2-1] 내지 [2-2B] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2-3] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, 191위(EU 넘버링)에 시스테인 잔기를 갖는 Fab이며, 또한 2개의 시스테인 잔기를 연결하는 다이설파이드 결합이 존재하는, [2-1] 내지 [2-2C] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2-4] 제 1, 제 2, 및 제 3 항원 결합 부분의 각각이, VH 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄와 VL 및 경쇄 정상(CL) 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab이며, 제 3 항원 결합 부분의 중쇄의 C말단이, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 직접 또는 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어 있는, [2-3]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2-5] 제 3 항원 결합 부분의 중쇄의 C말단이, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 펩티드 링커를 개재시켜 융합되어 있고, 펩티드 링커가, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 및 서열 번호: 259로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, [2-4]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2-6] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분 각각의 CL 도메인에 있어서, 123위 및 124위(Kabat 넘버링)에 있는 아미노산이 각각, 아르기닌 및 리신이며, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분 각각의 CH1 도메인에 있어서, 147위 및 213위(EU 넘버링) 각각의 아미노산이 글루탐산인, [2-5]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2-7] Fc 도메인을 추가로 포함하는, [2-6]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2-8] Fc 도메인이 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛을 포함하고,
제 1 Fc 영역 서브유닛이, 이하로 이루어지는 군으로부터 선택되고:
234위 및 235위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드;
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드; 및
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌, 354위에 시스테인, 및 366위에 트립토판을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드,
제 2 Fc 영역 서브유닛이, 이하를 포함하는 군으로부터 선택되고:
234위 및 235위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드;
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드; 및
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌, 349위에 시스테인, 및 366위에 세린, 368위에 알라닌, 및 407위에 발린을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드,
모든 위치가 EU 넘버링에 의하는 것인,
[2-7]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
본 발명의 또 다른 국면은 이하에 관한 것이다:
[3-1] (a) 각각이 인간 CD137에 결합하고, 또한 동일하거나 또는 상이할 수 있는 항체 가변 영역을 포함하고, 해당 항체 가변 영역이, 이하로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분:
(a1) 서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역; 및
(b) 인간 Delta-like 3(DLL3)에 결합하고, 또한, 서열 번호: 233을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 234를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235를 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239를 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-2] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, 동일하거나 또는 상이할 수 있는 항체 가변 영역을 포함하고, 해당 항체 가변 영역이, 이하로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는, [3-1]의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
[3-2A] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각,
서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역
을 포함하는, [3-1] 내지 [3-2] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-2B] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각,
서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 영역
을 포함하는, [3-2A]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-2C] 제 3 항원 결합 부분이,
서열 번호: 232를 포함하는 VH 및 서열 번호: 236을 포함하는 VL을 포함하는 항체 가변 영역
을 포함하는, [3-1] 내지 [3-2B] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-3] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, 191위(EU 넘버링)에 시스테인 잔기를 갖는 Fab이며, 또한 2개의 시스테인 잔기를 연결하는 다이설파이드 결합이 존재하는, [3-1] 내지 [3-2C] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-4] 제 1, 제 2, 및 제 3 항원 결합 부분의 각각이, VH 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄와 VL 및 경쇄 정상(CL) 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab이며, 제 3 항원 결합 부분의 중쇄의 C말단이, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 직접 또는 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어 있는, [3-3]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-5] 제 3 항원 결합 부분의 중쇄의 C말단이, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 펩티드 링커를 개재시켜 융합되어 있고, 펩티드 링커가, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 및 서열 번호: 259로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, [3-4]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-6] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분 각각의 CL 도메인에 있어서, 123위 및 124위(Kabat 넘버링)의 아미노산이 각각, 아르기닌 및 리신이며, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분 각각의 CH1 도메인에 있어서, 147위 및 213위(EU 넘버링) 각각의 아미노산이 글루탐산인, [3-5]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-7] Fc 도메인을 추가로 포함하는, [3-6]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-8] Fc 도메인이 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛을 포함하고,
제 1 Fc 영역 서브유닛이, 이하를 포함하는 군으로부터 선택되고:
234위 및 235위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드;
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드; 및
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌, 354위에 시스테인, 및 366위에 트립토판을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드,
제 2 Fc 영역 서브유닛이, 이하를 포함하는 군으로부터 선택되고:
234위 및 235위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드;
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드; 및
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌, 349위에 시스테인, 및 366위에 세린, 368위에 알라닌, 및 407위에 발린을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드,
모든 위치가 EU 넘버링에 의하는 것인,
[3-7]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
본 발명의 또 다른 국면은 이하에 관한 것이다:
[4-1] (a) 각각이 인간 CD3에 결합하고, 또한 동일하거나 또는 상이할 수 있는 항체 가변 영역을 포함하고, 해당 항체 가변 영역이, 이하의 (a1) 내지 (a15)로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분:
(a1) 서열 번호: 17을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31을 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45를 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64를 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69를 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74를 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 18을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 32를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 19를 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 33을 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 19를 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 33을 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65를 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75를 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 20을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 34를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 22를 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 36을 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 23을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 37을 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 23을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 37을 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 24를 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 38을 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52를 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 25를 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 39를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 26을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 40을 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54를 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 26을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 40을 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54를 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 27을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 41을 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55를 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 28을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 42를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 82를 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 83을 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84를 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65를 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75를 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역; 및
(b) 인간 Delta-like 3(DLL3)에 결합하고, 또한, 서열 번호: 233을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 234를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235를 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239를 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-2] (a) 동일하거나 또는 상이할 수 있는 항체 가변 영역을 각각이 포함하고, 해당 항체 가변 영역이, 이하로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분:
(a1) 서열 번호: 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)과 서열 번호: 59를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 4를 포함하는 VH와 서열 번호: 58을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 5를 포함하는 VH와 서열 번호: 58을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 5를 포함하는 VH와 서열 번호: 60을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 6을 포함하는 VH와 서열 번호: 58을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 8을 포함하는 VH와 서열 번호: 58을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 9를 포함하는 VH와 서열 번호: 58을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 9를 포함하는 VH와 서열 번호: 61을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 10을 포함하는 VH와 서열 번호: 58을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 11을 포함하는 VH와 서열 번호: 61을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 12를 포함하는 VH와 서열 번호: 61을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 12를 포함하는 VH와 서열 번호: 58을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 13을 포함하는 VH와 서열 번호: 58을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 14를 포함하는 VH와 서열 번호: 58을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 81을 포함하는 VH와 서열 번호: 60을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 가변 영역; 및
(b) 서열 번호: 232를 포함하는 VH와 서열 번호: 236을 포함하는 VL을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-3] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 항체 가변 영역이 동일한, [4-1]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-4] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 항체 가변 영역이 동일한, [4-2]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-5] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, 191위(EU 넘버링)에 시스테인 잔기를 갖는 Fab이며, 이들 2개의 시스테인 잔기를 다이설파이드 결합이 연결하고 있는, [4-3]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-6] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, 191위(EU 넘버링)에 시스테인 잔기를 갖는 Fab이며, 이들 2개의 시스테인 잔기를 다이설파이드 결합이 연결하고 있는, [4-4]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-7] 제 1, 제 2, 및 제 3 항원 결합 부분의 각각이, VH, VL, CH1 도메인, 및 경쇄 정상(CL) 도메인을 포함하는 Fab의 포맷이며, 제 3 항원 결합 부분의 CH1 도메인의 C말단이, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 VH의 N말단에, 직접 또는 펩티드 링커를 개재시켜 융합되어 있는, [4-5]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-8] 제 1, 제 2, 및 제 3 항원 결합 부분의 각각이, CH1 도메인 및 경쇄 정상(CL) 도메인을 포함하는 Fab의 포맷이며, 제 3 항원 결합 부분의 CH1 도메인의 C말단이, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 VH의 N말단에, 직접 또는 펩티드 링커를 개재시켜 융합되어 있는, [4-6]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-9] 융합이, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 및 서열 번호: 259로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 개재시키는 것인, [4-7]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-10] 융합이, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 및 서열 번호: 259로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 개재시키는 것인, [4-8]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-11] 제 3 항원 결합 부분이, VH가 CL 도메인에 연결되고 VL이 CH1 도메인에 연결된 크로스오버 Fab이며, 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, VH가 CH1 도메인에 연결되고 VL이 CL 도메인에 연결된 종래형의 Fab인, [4-9]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-12] 제 3 항원 결합 부분이, VH가 CL 도메인에 연결되고 VL이 CH1 도메인에 연결된 크로스오버 Fab이며, 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, VH가 CH1 도메인에 연결되고 VL이 CL 도메인에 연결된 종래형의 Fab인, [4-10]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-13] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분 각각의 CL 도메인에 있어서, 123위 및 124위(Kabat 넘버링)의 아미노산이 각각, 아르기닌 및 리신이며, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분 각각의 CH1 도메인에 있어서, 147위 및 213위(EU 넘버링) 각각의 아미노산이 글루탐산인, [4-11]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-14] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분 각각의 CL 도메인에 있어서, 123위 및 124위(Kabat 넘버링)의 아미노산이 각각, 아르기닌 및 리신이며, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분 각각의 CH1 도메인에 있어서, 147위 및 213위(EU 넘버링) 각각의 아미노산이 글루탐산인, [4-12]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-15] Fc 도메인을 추가로 포함하는, [4-13]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-16] Fc 도메인을 추가로 포함하는, [4-14]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-17] Fc 도메인이 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛을 포함하고,
제 1 Fc 영역 서브유닛이, 이하를 포함하는 군으로부터 선택되고:
234위 및 235위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드;
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드; 및
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌, 354위에 시스테인, 및 366위에 트립토판을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드,
제 2 Fc 영역 서브유닛이, 이하를 포함하는 군으로부터 선택되고:
234위 및 235위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드;
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드; 및
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌, 349위에 시스테인, 및 366위에 세린, 368위에 알라닌, 및 407위에 발린을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드,
모든 위치가 EU 넘버링에 의하는 것인,
[4-15]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-18] Fc 도메인이 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛을 포함하고,
제 1 Fc 영역 서브유닛이, 이하를 포함하는 군으로부터 선택되고:
234위 및 235위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드;
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드; 및
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌, 354위에 시스테인, 및 366위에 트립토판을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드,
제 2 Fc 영역 서브유닛이, 이하를 포함하는 군으로부터 선택되고:
234위 및 235위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드;
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드; 및
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌, 349위에 시스테인, 및 366위에 세린, 368위에 알라닌, 및 407위에 발린을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드,
모든 위치가 EU 넘버링에 의하는 것인,
[4-16]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-19] 이하의 (A) 내지 (O)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조합으로의 5개의 폴리펩티드쇄를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
(A) 서열 번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 208의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(B) 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(C) 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(D) 서열 번호: 205의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(E) 서열 번호: 216의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(F) 서열 번호: 217의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 210의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(G) 서열 번호: 219의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(H) 서열 번호: 220의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(I) 서열 번호: 221의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(J) 서열 번호: 222의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 230의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(K) 서열 번호: 223의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(L) 서열 번호: 225의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(M) 서열 번호: 226의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5);
(N) 서열 번호: 227의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5); 및
(O) 서열 번호: 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5).
[4-20] 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5)를 포함하는, [4-19]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-21] 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5)를 포함하는, [4-19]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-22] 서열 번호: 205의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 5)를 포함하는, [4-19]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-23] (a) 각각이 인간 CD3에 결합하고, 또한 서열 번호: 20을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 34를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및
(b) 인간 DLL3에 결합하고, 또한 서열 번호: 233을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 234를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235를 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239를 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-24] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 항체 가변 영역이, 서열 번호: 6을 포함하는 VH와 서열 번호: 58을 포함하는 VL을 포함하고, 제 3 항원 결합 부분의 항체 가변 영역이, 서열 번호: 232를 포함하는 VH와 서열 번호: 236을 포함하는 VL을 포함하는, [4-23]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-25] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, 191위(EU 넘버링)에 시스테인 잔기를 갖는 Fab이며, 이들 2개의 시스테인 잔기를 다이설파이드 결합이 연결하고 있는, [4-24]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-26] 제 1, 제 2, 및 제 3 항원 결합 부분의 각각이, VH, VL, CH1 도메인, 및 CL 도메인을 포함하는 Fab의 포맷이며, 제 3 항원 결합 부분의 CH1 도메인의 C말단이, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 VH의 N말단에, 직접 또는 펩티드 링커를 개재시켜 융합되어 있는, [4-25]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-27] 융합이, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 및 서열 번호: 259로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 개재시키는 것인, [4-26]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-28] 제 3 항원 결합 부분이, VH가 CL 도메인에 연결되고 VL이 CH1 도메인에 연결된 크로스오버 Fab이며, 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, VH가 CH1 도메인에 연결되고 VL이 CL 도메인에 연결된 종래형의 Fab인, [4-27]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-29] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분 각각의 CL 도메인에 있어서, 123위 및 124위(Kabat 넘버링)의 아미노산이 각각, 아르기닌 및 리신이며, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분 각각의 CH1 도메인에 있어서, 147위 및 213위(EU 넘버링) 각각의 아미노산이 글루탐산인, [4-28]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-30] Fc 도메인을 추가로 포함하는, [4-29]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-31] Fc 도메인이 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛을 포함하고,
제 1 Fc 영역 서브유닛이, 이하를 포함하는 군으로부터 선택되고:
234위 및 235위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드;
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드; 및
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌, 354위에 시스테인, 및 366위에 트립토판을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드,
제 2 Fc 영역 서브유닛이, 이하를 포함하는 군으로부터 선택되고:
234위 및 235위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드;
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드; 및
234위, 235위, 및 297위의 각각에 알라닌, 349위에 시스테인, 및 366위에 세린, 368위에 알라닌, 및 407위에 발린을 포함하는, Fc 영역 폴리펩티드,
모든 위치가 EU 넘버링에 의하는 것인,
[4-30]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[도 1] a) DUAL/LINC(1+2) 포맷으로의 3가 항체, b) 종래형의 항체 포맷을 갖는 이중 특이성 항체, 및 c) BiTE 포맷을 갖는 이중 특이성 항체의 설계 및 명명 규칙을 나타낸다.
[도 2] SK-MEL30 세포주에 대한 항체의 TDCC 활성을 나타낸다. a) DUAL/LINC 및 CD3 이중 특이성 포맷 사이에서의 TDCC의 비교. b) 세포 상해 활성에 대한 링커 길이의 효과.
[도 3] huNOG 마우스 모델에 있어서의 NCI-H1436 이종 이식편에 대한 항체의 in vivo 유효성을 나타낸다. Y축은 종양 체적(mm3)을 의미하고, X축은 종양 이식 후의 일수를 의미한다.
[도 4] CD8 T 세포 침윤을 분석한 결과를 나타낸다. 항체 주사 후의 표시한 시점에서 종양을 수집하고, 플로 사이토미터를 이용하여 T 세포 침윤을 분석했다.
[도 5] CD8 T 세포 상의 피폐 마커(exhaustion marker)를 분석한 결과를 나타낸다. 종양을 항체 주사 후 7일째에 수집하고, 플로 사이토미터를 이용하여 피폐 마커의 발현을 분석했다.
[도 6] 전장 인간 DLL3 및 인간 DLL3 ECD 단편 단백질의 구조를 나타내는 모식도이다. 항DLL3 항체의 각각에 의해 인식되는 에피토프도 나타낸다. EGF 도메인은, N말단측으로부터 C말단측으로, 6개의 영역 EGF1 내지 EGF6을 갖는다.
[도 2] SK-MEL30 세포주에 대한 항체의 TDCC 활성을 나타낸다. a) DUAL/LINC 및 CD3 이중 특이성 포맷 사이에서의 TDCC의 비교. b) 세포 상해 활성에 대한 링커 길이의 효과.
[도 3] huNOG 마우스 모델에 있어서의 NCI-H1436 이종 이식편에 대한 항체의 in vivo 유효성을 나타낸다. Y축은 종양 체적(mm3)을 의미하고, X축은 종양 이식 후의 일수를 의미한다.
[도 4] CD8 T 세포 침윤을 분석한 결과를 나타낸다. 항체 주사 후의 표시한 시점에서 종양을 수집하고, 플로 사이토미터를 이용하여 T 세포 침윤을 분석했다.
[도 5] CD8 T 세포 상의 피폐 마커(exhaustion marker)를 분석한 결과를 나타낸다. 종양을 항체 주사 후 7일째에 수집하고, 플로 사이토미터를 이용하여 피폐 마커의 발현을 분석했다.
[도 6] 전장 인간 DLL3 및 인간 DLL3 ECD 단편 단백질의 구조를 나타내는 모식도이다. 항DLL3 항체의 각각에 의해 인식되는 에피토프도 나타낸다. EGF 도메인은, N말단측으로부터 C말단측으로, 6개의 영역 EGF1 내지 EGF6을 갖는다.
본 명세서에 있어서 기재 또는 참조되는 기법 및 순서는, 대체로 잘 이해되어 있고, 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, 및 Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)에 기재되는 널리 이용되고 있는 방법론 등의 종래의 방법론을 사용하여 당업자에 의해 일반적으로 이용되는 것이다.
이하의 정의 및 상세한 설명은, 본 명세서에 있어서 설명하는 본 개시의 이해를 용이하게 하기 위해서 제공된다.
정의
아미노산
본 명세서에 있어서, 아미노산은, 1문자 코드 혹은 3문자 코드 또는 그 양쪽, 예를 들어, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, 또는 Val/V에 의해 기재된다.
아미노산의 개변
항원 결합 분자의 아미노산 서열 중의 아미노산 개변(본 명세서에서 "아미노산 치환" 또는 "아미노산 변이"로도 기재)을 위해, 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) 및 중복 신장 PCR과 같은 공지된 방법을 적절히 채용할 수 있다. 더욱이, 비천연 아미노산의 치환을 위한 아미노산 개변 방법으로서 몇몇 공지된 방법도 채용할 수 있다(Annu Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; and Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들어, 종지 코돈 중 하나인, UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합된 tRNA를 포함하는 무세포 번역계(Clover Direct(Protein Express))를 이용하는 것이 적절하다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 변이 부위를 기재할 때의 용어 "및/또는"의 의미는, "및"과 "또는"이 적절하게 조합되는 모든 조합을 포함한다. 구체적으로, 예를 들어, "33위, 55위, 및/또는 96위의 아미노산이 치환된"은 이하의 아미노산 개변 배리에이션을 포함한다: (a) 33위, (b) 55위, (c) 96위, (d) 33위 및 55위, (e) 33위 및 96위, (f) 55위 및 96위, 및 (g) 33위, 55위, 및 96위의 아미노산.
더욱이, 본 명세서에 있어서, 아미노산의 개변을 나타내는 표현으로서 특정의 위치를 나타내는 숫자의 앞 및 뒤에, 각각 개변 전 및 개변 후의 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드를 나타내는 표현이, 적절히 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 가변 영역 중에 포함되는 아미노산을 치환할 때에 이용되는 N100bL 또는 Asn100bLeu라고 하는 개변은, 100b위(Kabat 넘버링에 의한다)에 있어서의 Asn의, Leu에 의한 치환을 나타낸다. 즉, 숫자는 Kabat 넘버링에 의한 아미노산의 위치를 나타내고, 숫자 앞에 기재되는 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는 치환 전의 아미노산을 나타내고, 숫자 뒤에 기재되는 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는 치환 후의 아미노산을 나타낸다. 마찬가지로, 항체 정상 영역 중에 포함되는 Fc 영역의 아미노산을 치환할 때에 이용되는 P238D 또는 Pro238Asp라고 하는 개변은, 238위(EU 넘버링에 의한다)에 있어서의 Pro의, Asp에 의한 치환을 나타낸다. 즉, 숫자는 EU 넘버링에 의한 아미노산의 위치를 나타내고, 숫자 앞에 기재되는 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는 치환 전의 아미노산을 나타내고, 숫자 뒤에 기재되는 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는 치환 후의 아미노산을 나타낸다.
폴리펩티드
본 명세서에서 이용되는 용어 "폴리펩티드"는, 아마이드 결합(일명 펩티드 결합)에 의해 직쇄상으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성되는 분자를 가리킨다. 용어 "폴리펩티드"는, 2아미노산 이상의 임의의 쇄를 가리키고, 특정 길이의 산물을 가리키는 것은 아니다. 따라서, 펩티드, 다이펩티드, 트라이펩티드, 올리고펩티드, "프로틴", "아미노산쇄" 또는 2아미노산 이상의 임의의 쇄를 가리키기 위해 이용되는 임의의 다른 용어는, "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어들 대신에, 또는 상호 교환 가능하게 사용되어도 된다. 용어 "폴리펩티드"는 또한, 한정되지 않지만, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아마이드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 절단, 또는 비천연 아미노산에 의한 수식을 포함하는, 폴리펩티드의 발현후 수식의 산물을 가리키는 것을 의도한다. 폴리펩티드는 천연의 생물학적 공급원에서 유래해도 되고, 또는 재조합 기술에 의해 산생되어도 되지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역될 필요는 없다. 폴리펩티드는 화학 합성을 포함하는 임의의 방법으로 산생되어도 된다. 본 명세서에 있어서 기재되는 폴리펩티드는, 약 3아미노산 이상, 5아미노산 이상, 10아미노산 이상, 20아미노산 이상, 25아미노산 이상, 25아미노산 이상, 50아미노산 이상, 75아미노산 이상, 100아미노산 이상, 200아미노산 이상, 500아미노산 이상, 1,000아미노산 이상, 또는 2,000아미노산 이상의 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 규정된 3차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 그와 같은 구조를 가질 필요는 없다. 규정된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 폴드(fold)되었다고 말하고, 규정된 3차원 구조를 가지지 않지만 다수의 상이한 입체구조(conformation)를 취할 수 있는 폴리펩티드는 언폴드(unfold)되었다고 말한다.
퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 최대의 퍼센트 서열 동일성을 얻기 위해서 서열을 정렬시키고 또한 필요하면 갭을 도입한 후의, 또한 여하한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부라고 생각하지 않을 때의, 참조 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율비로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적의 얼라인먼트는, 당해 기술분야에 있어서의 기술의 범위 내에 있는 여러 가지의 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 당업자는, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐서 최대의 얼라인먼트를 달성하기 위해서 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열의 얼라인먼트를 취하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 있어서의 목적을 위해서는, %아미노산 서열 동일성값은, 서열 비교 컴퓨터 프로그램인 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은, 제넨텍크사의 저작이고, 그 소스 코드는 미국 저작권청, 워싱턴 D.C., 20559에 사용자용 서류와 함께 제출되어, 미국 저작권 등록번호 TXU510087로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은, 제넨텍크사, 사우스 샌프란시스코, 캘리포니아로부터 공적으로 입수 가능하거나, 당해 소스 코드로부터 컴파일되어도 된다. ALIGN-2 프로그램은, 디지털 UNIX(등록상표) V4.0D를 포함하는 UNIX(등록상표) 오퍼레이팅 시스템 상에서의 사용을 위해서 컴파일된다. 모든 서열 비교 파라미터는, ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변동되지 않는다. 아미노산 서열 비교에 ALIGN-2가 이용되는 상황에서는, 주어진 아미노산 서열 A의, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 %아미노산 서열 동일성(혹은, 주어진 아미노산 서열 B에 대해서 특정의 %아미노산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라고 할 수도 있다)은 다음과 같이 계산된다:
분율 X/Y의 100배.
여기에서, X는 서열 얼라인먼트 프로그램 ALIGN-2에 의해, 당해 프로그램의 A 및 B의 얼라인먼트에 있어서 동일한 일치로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우, A의 B에 대한 %아미노산 서열 동일성은, B의 A에 대한 % 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않음이 이해될 것이다. 특별히 별도로 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 모든 %아미노산 서열 동일성값은, 바로 앞 단락에서 기술한 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻은 것이다.
재조합의 방법 및 구성
예컨대 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같이, 항체 및 항원 결합 분자는 재조합의 방법이나 구성을 이용하여 제조할 수 있다. 하나의 태양에 있어서, 본 명세서에 기재된 항체를 코딩하는, 단리된 핵산이 제공된다. 이와 같은 핵산은, 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예컨대, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩해도 된다. 추가적인 태양에 있어서, 이와 같은 핵산을 포함하는 1개 이상의 벡터(예를 들어 발현 벡터)가 제공된다. 추가적인 실시태양에서는, 이와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이와 같은 태양의 하나에서는, 숙주 세포는, 이하를 포함한다(예컨대, 이하로 형질전환되어 있다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터. 하나의 태양에 있어서, 숙주 세포는, 진핵성이고, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp2/0 세포)이다. 하나의 태양에 있어서, 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 상기한 바와 같이 당해 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것, 및 임의로, 당해 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자를 제작하는 방법이 제공된다.
본 명세서에 있어서 기재되는 항체의 재조합 제조를 위해, 예를 들어, 전술한 것 등의 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포 중에서의 발현을 위해, 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이와 같은 핵산은, 종래의 절차를 이용하여 용이하게 단리 및 서열 결정할 수 있을 것이다(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써).
항체를 코딩하는 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는, 본 명세서에 기재된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우는, 세균에서 제조할 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 관해서는, 예를 들어, 미국 특허 제 5,648,237 호, 미국 특허 제 5,789,199 호 및 미국 특허 제 5,840,523 호를 참조한다(또한 대장균에서의 항체 단편의 발현을 기술하고 있는 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 참조). 발현 후에, 항체는 세균 세포 페이스트로부터 가용성 획분 중으로 단리되어도 되고, 또한 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물에 더하여, 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 산생을 가져오는, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있는 균류 및 효모주를 포함하는, 사상균 또는 효모 등의 진핵성의 미생물은, 항체 코딩 벡터의 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004); 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)을 참조한다.
다세포 생물(무척추동물 및 척추동물)에서 유래하는 것도 또한, 글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포이다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와의 접합, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질전환에 이용되는, 다수의 바큘로바이러스주가 동정되어 있다.
식물 세포 배양물도, 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 미국 특허 제6,040,498호, 미국 특허 제6,420,548호, 미국 특허 제7,125,978호 및 미국 특허 제6,417,429호(트랜스제닉 식물에서 항체를 산생하기 위한, 플랜티보디스(PLANTIBODIES)TM 기술을 기재)를 참조한다.
척추동물 세포도 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 부유 상태에서 증식하도록 적응시킨 포유동물 세포주는, 유용하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 그 외의 예는, SV40으로 형질 전환된 원숭이 신장 CV1주(COS-7); 인간 태아성 신주(293 또는 293세포, 예컨대 Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)에 기재); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 서톨리 세포(TM4 세포, 예컨대 Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에 기재); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 사바나 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁 경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); TRI 세포(예컨대 Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 기재); MRC5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물의 숙주 세포주로는, DHFR-CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 Y0, NS0 및 Sp2/0 등의 골수종 세포주가 있다. 항체 산생에 적절한 그 외의 포유동물의 숙주 세포주의 리뷰에 대해서는, 예컨대 Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다.
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자의 재조합 산생은, 항원 결합 분자의 전체 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는(예컨대 벡터로 형질전환되어 있는) 숙주 세포를 이용하는 것에 의해, 전술한 것과 마찬가지의 방법으로 행할 수 있다.
항원 결합 분자 및 다중 특이성 항원 결합 분자
본 명세서에서 이용되는 용어 "항원 결합 분자"는, 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 분자, 또는 항원에 대한 결합 활성을 갖는 임의의 분자를 가리키고, 약 5아미노산 이상의 길이를 갖는 펩티드 또는 단백질 등의 분자를 추가로 가리킬 수 있다. 펩티드 또는 단백질은 생물에서 유래하는 것으로 한정되지 않고, 예를 들어, 인공적으로 설계된 서열로부터 산생된 폴리펩티드여도 된다. 이들은, 천연 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 등의 어느 것이어도 된다. 스캐폴드로서 α/β 배럴 등의 공지된 안정된 입체 구조를 포함하고, 분자의 일부가 항원 결합 부위가 되는, 스캐폴드 분자도 또한, 본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자의 일 태양이다.
"다중 특이성 항원 결합 분자"는, 1보다 많은 항체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 가리킨다. 용어 "이중 특이성"은, 항원 결합 분자가, 적어도 2종류의 상이한 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 용어 "삼중 특이성"은, 항원 결합 분자가 적어도 3종류의 상이한 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 특정의 태양에 있어서, 본 출원의 다중 특이성 항원 결합 분자는, 삼중 특이성 항원 결합 분자, 즉, 3종류의 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 즉, CD3 또는 CD137의 어느 한쪽에 결합할 수 있지만, 양쪽의 항원에 동시에는 결합하지 않고, 또한 DLL3에 특이적으로 결합할 수 있는, 삼중 특이성 항원 결합 분자이다.
제 1 국면에 있어서, 본 개시는, 각각이, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분과; 제 3 항원, 바람직하게는 암 세포/조직 상에 발현하고 있는 항원에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 어느 특정의 태양에 있어서, 제 3 항원 결합 부분에 의해 결합되는 제 3 항원은 DLL3이며, 바람직하게는, 인간 DLL3이다.
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분은, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, 동시에는 결합하지 않는, "이중(Dual) 항원 결합 부분"이어도 되고, 이것들은 이하에 있어서 보다 상세히 설명된다. 제 3 항원 결합 부분은, "DLL3 항원 결합 부분"이어도 되고, 이것도 이하에 있어서 보다 상세히 설명된다.
몇몇 태양에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은 Fab 분자이며, 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 포함한다. 다이설파이드 결합은, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 CH1 영역 중의 EU 넘버링에 의한 191위에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성될 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 제 3 항원 결합 부분은, Fab 또는 scFv여도 되고, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽에 융합된다. 제 1, 제 2, 및 제 3 항원 결합 부분의 각각이 Fab 분자인 경우, 제 3 항원 결합 부분은, Fab 중쇄의 C말단(CH1)에서, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 임의로 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어도 된다. 대표적인 펩티드 링커에는, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 또는 서열 번호: 259의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 포함된다. 어느 특정의 태양에 있어서, 제 1 항원 결합 부분은 제 2 항원 결합 부분과 동일하다.
몇몇 태양에 있어서, 제 3 항원 결합 부분은, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있고, 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이 종래형의 Fab 분자인, 크로스오버 Fab 분자이다.
몇몇 태양에 있어서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및/또는 124위에 있는 아미노산이, 리신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위에 있는 아미노산 및/또는 213위에 있는 아미노산이, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환되고 있다(Kabat EU 인덱스에 의한 넘버링). 다른 태양에 있어서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및 124위에 있는 아미노산이 각각 아르기닌(R) 및 리신(K)이며(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위에 있는 아미노산 및 213위에 있는 아미노산이 글루탐산(E)이다(Kabat EU 인덱스에 의한 넘버링).
다중 특이성 항원 결합 분자는, 이하에 상술하는 Fc 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이 Fab인 경우에 있어서, 제 1 항원 결합 부분은, Fab 중쇄의 C말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N말단에 융합되어도 되고, 또한 제 2 항원 결합 부분은, Fab 중쇄의 C말단에서 Fc 도메인의 나머지의 서브유닛의 N말단에 융합되어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 제 3 항원 결합 부분은, C말단에서 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 임의로 펩티드 링커를 개재시켜, 융합된다.
본 발명의 다른 국면에 있어서, 본 개시는, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 항원 결합 부분과; DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 부분을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 어느 특정의 태양에 있어서, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 항원 결합 부분은, 이하에 있어서 상세히 설명되는, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, 동시에는 결합하지 않는 "이중 항원 결합 부분"이다.
본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자의 구성성분은, 다양한 배치로 서로 융합할 수 있다. 예시적인 배치는, 표 10-1 내지 10-3과 함께 읽는 도 1a)에 도시된다.
상기 태양의 어느 하나에 따르면, 다중 특이성 항원 결합 분자의 구성성분(예를 들어, 항원 결합 부분, Fc 도메인)은, 직접적으로, 또는 여러 가지 링커, 특히, 본 명세서에 있어서 기재되어 있거나 또는 당해 기술 분야에 있어서 공지되어 있는 1개 혹은 복수의 아미노산, 전형적으로는 약 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해서, 융합시켜도 된다. 적절한 비면역원성 펩티드 링커에는, 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n, 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커가 포함되고, 여기에서, n은 대체로 1 내지 10, 전형적으로는 2 내지 4의 수이다.
파이로글루타밀화
항체가 세포에 있어서 발현되었을 경우, 항체는 번역 후에 수식됨이 알려져 있다. 번역후 수식의 예로서는, 중쇄의 C말단에서의 리신의, 카복시펩티다제에 의한 절단; 파이로글루타밀화에 의한 중쇄 및 경쇄의 N말단에서의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루탐산으로의 수식; 글리코실화; 산화; 탈아마이드화; 및 당화가 있고, 이와 같은 번역후 수식은 여러 가지 항체에서 발생함이 공지되어 있다(Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447).
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자는, 또한 번역후 수식을 포함한다. 번역후의 예로서는, 중쇄 가변 영역의 N말단에서의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄의 C말단에서의 리신의 결실을 받고 있는 것을 들 수 있다. 당 분야에 있어서, N말단에서의 파이로글루타밀화 및 C말단에서의 리신의 결실에 의한 이와 같은 번역후 수식이, 항체의 활성에 전혀 영향을 주지 않음은 공지되어 있다(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).
항원 결합 부분
본 명세서에서 이용되는 용어 "항원 결합 부분"은, 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 가리킨다. 하나의 태양에 있어서, 항원 결합 부분은, 그것이 결합하고 있는 실체를, 표적 부위, 예를 들어 암 항원(DLL3)을 발현하는 특정 종류의 종양 세포로 재방향설정시킬 수 있다. 다른 태양에 있어서, 항원 결합 부분은, 그의 표적 항원, 예를 들어 T 세포 수용체 복합체 항원(특히, CD3) 및/또는 공자극 수용체(CD137)를 통해 시그널 전달을 활성화시킬 수 있다. 항원 결합 부분에는, 본 명세서에 있어서 추가로 정의되는 항체 및 그의 단편이 포함된다. 구체적인 항원 결합 부분으로서는, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체의 항원 결합 도메인 또는 항체 가변 영역을 들 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 항원 결합 부분은, 본 명세서에 있어서 추가로 정의되고 또한 당해 기술 분야에 있어서 공지된 항체 정상 영역을 포함해도 된다. 유용한 중쇄 정상 영역에는, 5개의 아이소타입: α,δ,ε,γ, 또는 μ의 어느 하나가 포함된다. 유용한 경쇄 정상 영역에는, 2개의 아이소타입: κ 및 λ의 어느 하나가 포함된다.
항원 결합 부분 등에 관해서, 본 명세서에서 이용되는 용어 "제 1", "제 2", 및 "제 3"은, 1종류보다 많은 각 종류의 부분이 존재하는 경우에 구별한다고 하는 편리성을 위해서 이용된다. 이들 용어의 사용은, 특별히 명시하지 않는 한, 다중 특이성 항원 결합 분자의 특정의 순서 또는 배향을 부여하는 것을 의도하지 않는다.
다른 국면에 있어서, 본 명세서에 있어서 개시되는 본 발명의 항원 결합 부분은, 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 부분의 하나 또는 복수를 포함하는 신규한 키메라 항원 수용체(CAR)에 있어서 이용할 수 있다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 발명의 CAR은 scFv 구축물을 포함하고, 바람직한 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서 개시되는 바와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직한 태양에 있어서, 개시되는 키메라 항원 수용체는, 증식성 질환 및 그의 임의의 재발 또는 전이를 치료 또는 예방하는 데 유용하다.
CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, 동시에는 결합하지 않는, 항원 결합 부분
본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 적어도 하나의 항원 결합 부분(본 명세서에 있어서 "이중 항원 결합 부분" 또는 "제 1 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab" 또는 "Dual-Ig"라고도 불린다)을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 2개의 이중 항원 결합 부분(각각이 "Dual-Fab"라고 불릴 수 있는, "제 1 항원 결합 부분" 및 "제 2 항원 결합 부분")을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 2개의 이중 항원 결합 부분의 각각("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, CD3 또는 CD137에 대한 1가의 결합을 가져오지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는다. 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 2개 이하의 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")을 포함한다.
특정의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은 일반적으로, Fab 분자, 특히 종래형의 Fab 분자이다. 특정의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역(VL 및 VH)을 포함하는 도메인이다. 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는, 이와 같은 도메인의 적절한 예로서는, "단쇄 Fv(scFv)", "단쇄 항체", "Fv", "단쇄 Fv2(scFv2)", "Fab", "F(ab')2" 등을 들 수 있다.
특정의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, CD3의 전체 혹은 그의 부분 펩티드의 일부분에 특이적으로 결합한다. 특정의 태양에 있어서, CD3은 인간 CD3 또는 필리핀원숭이 CD3, 특히 인간 CD3이다. 특정의 태양에 있어서, 제 1 항원 결합 부분은, 인간 및 필리핀원숭이 CD3에 대해 교차 반응성을 갖는다(즉, 그들에 특이적으로 결합한다). 몇몇 태양에 있어서, 제 1 항원 결합 부분은, CD3의 ε 서브유닛, 특히, 서열 번호: 7(NP_000724.1)(괄호 안에 RefSeq 등록 번호를 나타낸다)에 나타나는 CD3의 인간 CD3ε서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 진핵 세포의 표면 상에 발현하고 있는 CD3ε쇄에 특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, T 세포의 표면 상에 발현하고 있는 CD3ε쇄에 결합한다.
특정의 태양에 있어서, CD137은 인간 CD137이다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자의 적합한 예에는, 이하:
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC 서열(서열 번호: 21)을 포함하는 영역을 인식하는 항체,
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC 서열(서열 번호: 35)을 포함하는 영역을 인식하는 항체,
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC 서열(서열 번호: 49)을 포함하는 영역을 인식하는 항체, 및
인간 CD137 단백질 중의 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC 서열(서열 번호: 105)을 포함하는 영역을 인식하는 항체
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체에 의해 결합되는 인간 CD137 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")을 들 수 있다.
특정의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 이하의 표 1에 나타나는 항체 가변 영역 서열의 어느 하나를 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 표 1에 나타나는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합의 어느 하나를 포함한다.
하나의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 6에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 58에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 14에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 58에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 81에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 58에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정의 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 이하의 표 2에 나타나는 HVR 서열의 조합의 어느 하나를 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함한다:
(a1) 서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편의 어느 하나의 결합과 경합하는 항체 가변 단편.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 이중 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")에는, 번역후 수식도 포함된다. 번역후의 예로서는, 중쇄 가변 영역의 N말단에서의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄의 C말단에서의 리신의 결실을 받고 있는 것을 들 수 있다. 이 분야에 있어서, N말단에서의 파이로글루타밀화 및 C말단에서의 리신의 결실에 의한 이와 같은 번역후 수식은, 항체의 활성에 전혀 영향을 주지 않음이 공지되어 있다(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).
DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 부분
본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, 델타양 3(DLL3)에 결합할 수 있는 항원 결합 부분(본 명세서에 있어서 "DLL3 항원 결합 부분" 또는 "제 3 항원 결합 부분" 또는 "DLL3에 결합하는 항원 결합 부분"이라고도 불린다)을 적어도 하나 포함한다.
어느 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 부분을 하나 포함한다. 어느 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 부분("DLL3 항원 결합 부분")을 2개 포함한다. 특정의 그와 같은 태양에 있어서, 이들 항원 결합 부분의 각각은, DLL3과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 보다 더 구체적인 태양에 있어서, 이들 "DLL3 항원 결합 부분"은 모두 동일하다. 하나의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, DLL3에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자("DLL3 항원 결합 부분")를 포함한다. 하나의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 부분("DLL3 항원 결합 부분")을 2개 이하 포함한다.
어느 특정의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 크로스오버 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 정상 영역의 어느 하나가 교환되어 있는 DLL3 분자이다. 어느 특정의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이다.
몇몇 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, DLL3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 몇몇 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, DLL3의 세포외 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 진핵 세포의 표면 상에 발현하고 있는 DLL3 단백질에 결합한다. 몇몇 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 암 세포의 표면 상에 발현하고 있는 DLL3 단백질에 결합한다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 세포외 도메인(ECD) 내, 즉, N말단으로부터 TM 영역의 직전까지이지만, TM 영역 또는 C말단 세포내 도메인까지는 아닌, 도메인 내의 에피토프에 결합한다. 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, ECD 내의 전술한 도메인/영역의 어느 것 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직한 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, EGF6로부터 TM 영역의 직전까지의 영역 내의 에피토프에 결합한다. 보다 구체적으로는, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 인간 DLL3 중의 서열 번호: 89로 정의되는 영역 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 인간 DLL3의 EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5, 혹은 EGF6 영역, 또는 EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역, 또는 인간 DLL3의 EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5, 혹은 EGF6 영역, 또는 EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역 내의 에피토프에 결합한다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 결합되는 DLL3 에피토프가 특성 해석되어 있는 지금까지 보고된 항DLL3 항체(예를 들어, WO2019131988 및 WO2011093097)에서 유래할 수 있다.
특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 이하의 표 1C에 나타내는 항체 가변 영역 서열의 어느 하나를 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 표 3에 나타내는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합의 어느 하나를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 표 3에 나타내는 항체 가변 영역의 어느 하나와 DLL3으로의 결합에 대해 경합하는 항체 가변 단편을 포함하는 도메인을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 232에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 236에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 300에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 236에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 300의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 301에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 236에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 301의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 274에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 275에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 274의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 275의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 264에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 265에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 264의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 265의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 이하의 표 4에 나타내는 HVR 서열의 조합의 어느 하나를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 표 4에 나타내는 항체 가변 영역의 어느 하나와 DLL3으로의 결합에 대해 경합하거나, 또는 표 4에 나타내는 항체 가변 영역의 HVR 영역과 동일한 HVR 서열을 포함하는 임의의 항체 가변 단편과 DLL3으로의 결합에 대해 경합하는, 항체 가변 단편을 포함하는 도메인을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 이하의 (a1) 내지 (a5) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함한다:
(a1) 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 276의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 277의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 278의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 279의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 280의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 281의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 285의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 286의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 287의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 288의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 289의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 290의 경쇄 CDR 3;
(a4) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a5) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 단편의 어느 하나의 결합과 경합하는 항체 가변 단편.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분에는, 번역후 수식도 포함된다. 번역후의 예로서는, 중쇄 가변 영역의 N말단에서의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄의 C말단에서의 리신의 결실을 받고 있는 것을 들 수 있다. 이 분야에 있어서, N말단에서의 파이로글루타밀화 및 C말단에서의 리신의 결실에 의한 그와 같은 번역후 수식은, 항체의 활성에 전혀 영향을 주지 않음이 공지되어 있다(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).
다른 국면에 있어서, 본 발명의 DLL3 항원 결합 부분은, DLL3 결합 도메인을 짜넣고 있는 새로운 키메라 항원 수용체(CAR)(DLL3 CAR)에 있어서 이용할 수 있다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 발명의 DLL3 결합 도메인(및 DLL3 CAR)은, scFv 구축물을 포함하고, 바람직한 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서 개시되는 바와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 DLL3 결합 도메인(및 DLL3 CAR)은, 본 명세서에 있어서 개시되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv 구축물 또는 그의 단편을 포함한다. 바람직한 태양에 있어서, 개시되는 키메라 항원 수용체는, 증식성 질환 및 그 임의의 재발 또는 전이를 치료 또는 예방하는 데 유용하다.
어느 특정의 태양에 있어서, DLL3 단백질은 종양 시원 세포 상에 발현하고 있다. DLL3 CAR은, 유전자 개변(예를 들어, 형질 도입)을 개재시켜 세포 상해성 림프구(바람직하게는 자기 세포 상해성 림프구) 상에 발현하여, DLL3 양성 종양 세포를 표적으로 하고 또한 그것을 살상하기 위해서 이용할 수 있는 DLL3 감수성 림프구를 가져온다. 본 명세서에 있어서 널리 논해지는 바와 같이, 본 발명의 CAR은 전형적으로는, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하고, 어느 특정의 림프구를 활성화하여, DLL3 양성 종양 세포의 면역 응답을 일으키게 하는 DLL3 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 선택되는 태양은, 개시된 CAR을 나타내는 면역학적으로 활성인 숙주 세포, 및 본 발명의 DLL3 CAR을 코딩하는 여러 가지 폴리뉴클레오티드 서열 및 벡터를 포함한다. 다른 국면에는, DLL3 CAR 분자를 발현하는 숙주 세포를 암으로 이환하고 있는 개체에게 도입하여, 개체를 치료하는 것에 의해, 개체에 있어서의 T 림프구 또는 NK 세포(NK) 세포의 활성을 증강하는 방법이 포함된다. 그와 같은 국면에는, 특히, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암) 및 흑색종이 포함된다.
항원
본 명세서에서 이용되는 용어 "항원"은, 항원 결합 부분이 결합하는 폴리펩티드 거대 분자 상의 부위(예를 들어, 연속한 일련의 아미노산, 또는 비연속 아미노산의 다른 영역으로 구성되는 입체 구조)를 가리키고, 항원 결합 부분-항원 복합체를 형성한다. 유용한 항원 결정기는, 예를 들어, 종양 세포의 표면 상에, 바이러스 감염 세포의 표면 상에, 다른 질환 세포의 표면 상에, 면역 세포의 표면 상에, 혈청 중에 유리된 상태로, 및/또는 세포외 기질(ECM) 중에서 발견할 수 있다. 특별히 나타내지 않는 한, 본 명세서에 있어서 항원으로 지칭되는 단백질(예를 들어, CD3, CD137, DLL3)은, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트) 등의 포유동물을 포함하는, 임의의 척추동물 공급원 유래의 단백질의 임의의 천연 형태일 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 항원은 인간 CD3, 인간 CD137, 또는 인간 DLL3이다. 본 명세서에 있어서 특정의 단백질이 언급될 경우, 해당 용어는, "전장"의, 프로세싱을 받고 있지 않은 단백질, 및 세포 중에서의 프로세싱에 의해 생기는 단백질의 임의의 형태를 포함한다. 해당 용어는 또한, 단백질의 천연에 존재하는 배리언트, 예를 들어, 스플라이스 배리언트 또는 알렐 배리언트도 포함한다.
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, 상이한 종의 CD3, CD137, 또는 DLL3의 사이에서 보존되어 있는 CD3, CD137, 또는 DLL3의 에피토프에 결합한다. 특정의 태양에 있어서, 본 출원의 다중 특이성 항원 결합 분자는, 삼중 특이성 항원 결합 분자, 즉, 3종류의 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 즉, CD3 또는 CD137의 어느 한쪽에 결합할 수 있지만, 양쪽의 항원에 동시에는 결합하지 않고, 또한 DLL3에 특이적으로 결합할 수 있는, 삼중 특이성 항원 결합 분자이다.
특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, CD3의 부분 펩티드의 전체 또는 일부에 특이적으로 결합한다. 특정의 태양에 있어서, CD3는 인간 CD3 또는 필리핀원숭이 CD3, 가장 전형적으로는 인간 CD3이다. 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 인간 CD3 및 필리핀원숭이 CD3에 대해서 교차 반응성이다(즉, 그들에 특이적으로 결합한다). 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, CD3의 ε 서브유닛, 특히, 서열 번호: 7(NP_000724.1)(괄호 내에 RefSeq 등록 번호를 나타낸다)에 나타나는 CD3의 인간 CD3ε 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 진핵 세포의 표면 상에 발현하고 있는 CD3ε쇄에 특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, T 세포의 표면 상에 발현하고 있는 CD3ε쇄에 결합한다.
특정의 태양에 있어서, CD137은 인간 CD137이다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자의 적합한 예에는, 이하로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체에 의해 결합되는 인간 CD137 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자가 포함된다:
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC 서열(서열 번호: 21)을 포함하는 영역을 인식하는 항체,
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC 서열(서열 번호: 35)을 포함하는 영역을 인식하는 항체,
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC 서열(서열 번호: 49)을 포함하는 영역을 인식하는 항체, 및
인간 CD137 단백질 중의 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC 서열(서열 번호: 105)을 포함하는 영역을 인식하는 항체.
용어 "DLL3"은, 본 명세서에 있어서 이용되는 경우, 특별한 지시가 없는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트) 등의 포유동물을 포함하는, 임의의 척추동물 공급원 유래의 임의의 천연형 DLL3(델타양 3)을 가리킨다. 해당 용어는, 프로세싱을 받고 있지 않은 "전장" DLL3, 및 세포에서의 프로세싱에 의해 생기는 임의의 형태의 DLL3을 포함한다. 해당 용어는 또한, DLL3의 천연에 생기는 배리언트, 예를 들어, 스플라이스 배리언트 또는 알렐 배리언트도 포함한다. 예시적인 인간 DLL3의 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열(RefSeq) NM_016941.3으로서 공지이며, 예시적인 필리핀원숭이 DLL3의 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열 XP_005589253.1로서 공지이며, 예시적인 마우스 DLL3의 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열 NM_007866.2로서 공지이다.
인간 DLL3 단백질은, C말단측에 막관통(TM) 영역 및 세포내 도메인, 및 N말단측에 DSL(Notch) 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 6을 참조). 더하여, DLL3은, N말단측으로부터 C말단측으로, 6개의 영역 EGF1 내지 EGF6을 포함하는, EGF 도메인을 갖는다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 세포외 도메인(ECD) 내, 즉, N말단으로부터 TM 영역의 직전까지이지만, TM 영역 또는 C말단 세포내 도메인까지는 아닌, 도메인 내의 에피토프에 결합한다. 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, ECD 내의 전술한 도메인/영역의 어느 것 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역 내의 에피토프에 결합한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 인간 DLL3 중의 서열 번호: 89로 정의되는 영역 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 분자/항체는, 인간 DLL3의 EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5, 혹은 EGF6 영역, 또는 EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역, 또는 인간 DLL3의 EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5, 혹은 EGF6 영역, 또는 EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역 내의 에피토프에 결합한다.
인간 DLL3에서는, 전술한 도메인/영역은, 이하의 아미노산 잔기를 갖는다(예를 들어, http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NYJ7 또는 WO2013/126746을 참조):
세포외 도메인(ECD): 1위 내지 492위에 있는 아미노산 잔기;
DSL 도메인: 176위 내지 215위에 있는 아미노산 잔기;
EGF 도메인: 216위 내지 465위에 있는 아미노산 잔기;
EGF1 영역: 216위 내지 249위에 있는 아미노산 잔기;
EGF2 영역: 274위 내지 310위에 있는 아미노산 잔기;
EGF3 영역: 312위 내지 351위에 있는 아미노산 잔기;
EGF4 영역: 353위 내지 389위에 있는 아미노산 잔기;
EGF5 영역: 391위 내지 427위에 있는 아미노산 잔기;
EGF6 영역: 429위 내지 465위에 있는 아미노산 잔기;
EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역: 429위 내지 492위에 있는 아미노산 잔기;
TM 영역: 493위 내지 513위에 있는 아미노산 잔기; 및
C말단 세포내 도메인: 516위 내지 618위에 있는 아미노산 잔기(또는 일부의 아이소폼에서는 516위 내지 587위).
상기에 기술되는 아미노산 위치는 또한, 서열 번호: 90에 나타나는 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 위치도 가리킨다. 따라서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 인간 DLL3 중의 전술한 위치에 있는 아미노산 잔기를 갖는 전술한 영역/도메인에 결합할 수 있다. 즉, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 인간 DLL3 중의 전술한 위치에 있는 아미노산 잔기를 갖는 전술한 영역/도메인 내의 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 DLL3 단백질은, 상기에 기재되는 서열을 갖는 DLL3 단백질이어도 되고, 또는 1개 또는 복수의 아미노산의 개변에 의해 상기에 기재되는 서열로부터 도출된 서열을 갖는 개변 단백질이어도 된다. 1개 또는 복수의 아미노산의 개변에 의해 상기에 기재되는 서열로부터 도출된 서열을 갖는 개변 단백질의 예는, 상기에 기재되는 아미노산 서열에 대해서, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 혹은, 이들 DLL3 단백질의 부분 펩티드가 이용되어도 된다.
본 발명에 있어서 이용되는 DLL3 단백질은 그 기원에 의해 한정되지 않고, 바람직하게는 인간 또는 필리핀원숭이 DLL3 단백질이다.
몇몇 태양에 있어서, DLL3 단백질로서, DLL3 ECD 단편 단백질(또는 ECD 배리언트)이 이용될 수 있다. 절단의 부위에 따라서, 단편/배리언트는, N말단측으로부터 C말단측으로, DSL 도메인으로부터 EGF6, EGF1로부터 EGF6, EGF2로부터 EGF6, EGF3으로부터 EGF6, EGF4로부터 EGF6, EGF5 및 EGF6, 또는 EGF6을 포함해도 된다. 단편/배리언트는, EGF6 영역의 직후로부터 TM 영역 직전에 이르는 영역을 추가로 포함해도 된다. Flag 태그를, 당해 기술 분야에 주지된 기술을 이용하여 단편/배리언트의 C말단에 부착시켜도 된다.
항원 결합 도메인
용어 "항원 결합 도메인"은, 항원의 일부 또는 모두에게 특이적으로 결합하고 또한 그것에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부를 가리킨다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 1개 또는 복수의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역이라고도 불린다)에 의해 초래되어도 된다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은, 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 양쪽을 포함한다. 그와 같은 바람직한 항원 결합 도메인에는, 예를 들어, "단쇄 Fv(scFv)", "싱글 도메인 항체 또는 VHH", "단쇄 항체", "Fv", "단쇄 Fv2(scFv2)", "Fab", 및 "F(ab')2"가 포함된다.
가변 영역
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은, 항체를 항원으로 결합시키는 것에 관여하는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 가리킨다. 천연형 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은, 통상, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하는, 유사한 구조를 갖는다. (예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참조.) 1개의 VH 또는 VL 도메인으로, 항원 결합 특이성을 주기에 충분할 것이다. 더욱이, 어느 특정의 항원에 결합하는 항체는, 당해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 각각 VL 또는 VH 도메인의 상보적 라이브러리를 스크리닝하여, 단리되어도 된다. 예를 들어 Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 참조.
HVR 또는 CDR
본 명세서에서 이용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 서열에 있어서 초가변이며("상보성 결정 영역" 또는 "CDR"), 및/또는 구조적으로 정해진 루프("초가변 루프")를 형성하고, 및/또는 항원 접촉 잔기("항원 접촉")를 포함하는, 항체의 가변 도메인의 각 영역을 가리킨다. 초가변 영역(HVR)은, "상보성 결정 영역"(CDR)이라고도 칭해지고, 이들 용어는, 본 명세서에서는, 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분에 관해서 서로 교환 가능하게 이용된다. 통상, 항체는 6개의 HVR를 포함한다: VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3)이다.
본 명세서에서의 예시적인 HVR은, 이하의 것을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)의 장소에 생기는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)의 장소에 생기는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)의 장소에 생기는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및,
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)를 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
특별히 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 중의 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는, 본 명세서에서는 상기의 Kabat 등에 의해 넘버링된다.
HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3은, 각각, "H-CDR1", "H-CDR2", "H-CDR3", "L-CDR1", "L-CDR2", 및 "L-CDR3"이라고도 기재된다.
CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는
본 발명의 항체 가변 영역이 "CD3 및 CD137에 결합할 수 있는"지 여부는, 당해 기술 분야에 있어서 공지된 방법에 의해 판정할 수 있다.
이것은, 예를 들어, 전기화학발광법(ECL법)에 의해 판정할 수 있다(BMC Research Notes 2011, 4:281).
구체적으로는, 예를 들어, 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자의, CD3 및 CD137에 결합할 수 있는 영역, 예를 들어, Fab 영역으로 구성되는 저분자 항체, 또는 그의 1가 항체(통상의 항체가 갖는 2개의 Fab 영역 중 1개가 결여되어 있는 항체)를, sulfo-tag(Ru 착체)로 표지된 CD3 또는 CD137과 혼합하고, 혼합물을 스트렙트아비딘 고정화 플레이트 상에 첨가한다. 이 조작에 있어서, 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자는, 플레이트 상의 스트렙트아비딘에 결합한다. sulfo-tag로부터 광을 발생시키고, 그 발광 시그널을, Sector Imager 600 또는 2400(MSD K.K.) 등을 이용하여 검출하고, 그에 의해, CD3 또는 CD137에 대한 피험 항원 결합 분자의 전술한 영역의 결합을 확인할 수 있다.
혹은, 이 어세이는, ELISA, FACS(형광 활성화 세포 선별), ALPHAScreen(증폭 발광 근접 호모지니어스 어세이 스크린), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상에 기초하는 BIACORE법 등에 의해 실시되어도 된다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
구체적으로는, 어세이는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상에 기초하는 상호작용 해석 기기인 Biacore(GE Healthcare Japan Corp.)를 이용하여 실시할 수 있다. Biacore 해석 기기에는, Biacore T100, T200, X100, A100, 4000, 3000, 2000, 1000, 또는 C 등의 임의의 기종이 포함된다. CM7, CM5, CM4, CM3, C1, SA, NTA, L1, HPA, 또는 Au 칩 등의 임의의 Biacore용 센서 칩을, 센서 칩으로서 이용할 수 있다. 프로틴 A, 프로틴 G, 프로틴 L, 항인간 IgG 항체, 항인간 IgG-Fab, 항인간 L쇄 항체, 항인간 Fc 항체, 항원 단백질, 또는 항원 펩티드 등의, 본 발명의 항원 결합 분자를 포착하기 위한 단백질을, 아민 커플링, 다이설파이드 커플링, 또는 알데하이드 커플링 등의 커플링법에 의해, 센서 칩 상에 고정화한다. 그 위에 CD3 또는 CD137을 애널라이트로서 인젝트하고, 상호작용을 측정하여 센서그램을 취득한다. 이 조작에 있어서, CD3 또는 CD137의 농도는, 어세이 샘플의 상호작용의 강도(예를 들어, KD)에 따라 수μM로부터 수pM의 범위 내에서 선택할 수 있다.
혹은, CD3 또는 CD137을, 항원 결합 분자 대신에 센서 칩 상에 고정화하고, 다음에, 평가하고 싶은 항체 샘플을 상호작용시켜도 된다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항체 가변 영역이 CD3 또는 CD137에 대한 결합 활성을 갖는지 여부를, 상호작용의 센서그램으로부터 산출된 해리 상수(KD)치에 기초하여, 또는 항원 결합 분자 샘플의 작용 전의 레벨을 상회하는, 작용 후의 센서그램의 증가의 정도에 기초하여, 확인할 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 목적하는 항원(즉, CD3 또는 CD137)에 대한 본 발명의 항체 가변 영역의 결합 활성 또는 친화성을, 예를 들어, Biacore T200 기기(GE Healthcare) 또는 Biacore 8K 기기(GE Healthcare)를 이용하여, 37℃(CD137에 대해) 또는 25℃(CD3에 대해)에서 평가한다. 항인간 Fc(예를 들어, GE Healthcare)를, 아민 커플링 키트(예를 들어, GE Healthcare)를 이용하여 CM4 센서 칩의 모든 플로 셀 상에 고정화한다. 항원 결합 분자 또는 항체 가변 영역을, 항Fc 센서 표면 상에 포착하고, 그 다음에, 항원(CD3 또는 CD137)을 플로 셀 상에 인젝트한다. 항원 결합 분자 또는 항체 가변 영역의 포착 레벨은, 200레조넌스 유닛(RU)을 목표로 해도 된다. 재조합 인간 CD3 또는 CD137을, 2배 단계 희석에 의해 조제한 2000 내지 125nM로 인젝트하고, 그 후 해리시켜도 된다. 모든 항원 결합 분자 또는 항체 가변 영역 및 애널라이트는, 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3을 함유하는 ACES pH 7.4에 있어서 조제한다. 센서 표면은, 사이클마다 3M MgCl2로 재생시킨다. 결합 친화성은, 예를 들어, Biacore Insight Evaluation software, version 2.0(GE Healthcare) 또는 Biacore 8K Evaluation software(GE Healthcare)를 이용하여, 데이터를 프로세싱하여, 1:1 결합 모델에 피팅시키는 것에 의해 결정한다. 본 발명의 항원 결합 도메인의 특이적 결합 활성 또는 친화성을 평가하기 위해서, KD치를 산출한다.
ALPHAScreen은, 2종류의 비즈(도너 및 억셉터)를 이용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해, 이하의 원리에 기초하여 실시된다: 도너 비즈에 결합한 분자와 억셉터 비즈에 결합한 분자 사이의 생물학적 상호작용에 의해 이들 2개의 비즈가 근접하여 위치할 때에만, 발광 시그널이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비즈 중의 포토센서타이저는, 주변의 산소를 여기 상태의 일중항 산소로 변환한다. 일중항 산소는, 도너 비즈 주변으로 확산하고, 그것에 근접하여 위치하는 억셉터 비즈에 도달하면, 그에 의해 비즈에 있어서의 화학 발광 반응을 야기하여, 최종적으로 광이 방출된다. 도너 비즈에 결합한 분자와 억셉터 비즈에 결합한 분자 사이의 상호작용이 없는 경우에는, 도너 비즈에 의해 산생되는 일중항 산소가 억셉터 비즈에 도달하지 않는다. 따라서, 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
그 사이의 상호작용을 관찰하는 물질 중 한쪽(리간드)을, 센서 칩의 금 박막 상에 고정한다. 금 박막과 유리의 경계면에서 전반사하도록, 센서 칩의 이측(裏側)으로부터 광을 쪼인다. 결과로서, 반사광의 일부에, 반사 강도가 저하된 부위(SPR 시그널)가 형성된다. 그 사이의 상호작용을 관찰하는 물질 중 다른 쪽(애널라이트)을, 센서 칩의 표면 상에 인젝트한다. 애널라이트가 리간드에 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하여, 센서 칩 표면 상의 용매의 굴절률이 변화한다. 이 굴절률의 변화에 의해, SPR 시그널의 위치가 시프트한다(반대로, 결합한 분자가 해리되면, 시그널은 원래의 위치로 돌아간다). Biacore 시스템은, 시프트의 양, 즉, 센서 칩 표면 상의 질량 변화를 세로 좌표에 플롯하여, 질량의 시간 의존적 변화를 어세이 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서 칩 표면 상에 포착된 리간드에 결합한 애널라이트의 양(애널라이트를 상호작용시키기 전후에서의 센서그램 상에서의 리스폰스의 변화의 양)을, 센서그램으로부터 결정할 수 있다. 그러나, 결합량은 리간드의 양에도 의존하기 때문에, 비교는, 실질적으로 동일한 양의 리간드의 양을 이용하는 조건하에서 행하지 않으면 안 된다. 키네틱스, 즉, 회합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd)는, 센서그램의 곡선으로부터 결정할 수 있고, 한편, 친화성(KD)은, 이들 상수의 비로부터 결정할 수 있다. 저해 어세이도 또한, BIACORE법에 있어서 호적하게 이용된다. 저해 어세이의 예는, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 기재되어 있다.
용어 "CD3과 CD137(4-1BB)에 동시(at the same time)에는 결합하지 않는" 또는 "CD3과 CD137(4-1BB)에 동시(simultaneously) 결합하지 않는"은, 본 발명의 항원 결합 부분 또는 항체 가변 영역이, CD3과 결합하고 있는 상태에서는 CD137에 결합할 수 없고, 반대로, 항원 결합 부분 또는 항체 가변 영역이, CD137과 결합하고 있는 상태에서는 CD3에 결합할 수 없음을 의미한다. 여기에서, "CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는"이라는 구에는, CD3을 발현하는 세포와 CD137을 발현하는 세포를 가교하지 않는 것, 또는 각각이 상이한 세포 상에서 발현하고 있는 CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는 것도 포함된다. 이 구에는 더욱이, CD3 및 CD137이 가용성 단백질과 같이 세포막 상에 발현하고 있지 않거나, 또는 양쪽이 동일한 세포 상에 존재할 때에는, 가변 영역이, CD3과 CD137의 양쪽에 동시에 결합할 수 있지만, 각각이 상이한 세포 상에서 발현하고 있는 CD3과 CD137에는 동시에는 결합할 수 없는 경우도 포함된다. 그와 같은 항체 가변 영역은, 이들 기능을 갖고 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 그 예에는, 소망의 항원에 결합하도록 그 아미노산의 일부를 개변한, IgG형의 항체 가변 영역에서 유래하는 가변 영역이 포함될 수 있다. 개변되는 아미노산은, 예를 들어, CD3 또는 CD137에 결합하는 항체 가변 영역에 있어서의, 그 개변이 항원에 대한 결합을 상실시키지 않는 아미노산으로부터 선택된다.
여기에서, "상이한 세포 상에서 발현하고 있는"이라는 구는, 단순히, 항원이 상이한 세포 상에서 발현하고 있음을 의미한다. 그와 같은 세포의 조합은, 예를 들어, T 세포와 다른 T 세포와 같이 동일한 종류의 세포여도 되고, 또는 T 세포와 NK 세포와 같이 상이한 종류의 세포여도 된다.
본 발명의 항원 결합 분자가 "CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는"지 여부는, 항원 결합 분자가 CD3 및 CD137의 양쪽에 대한 결합 활성을 가짐을 확인하는 것; 그 다음에, 이 결합 활성을 가지는 가변 영역을 포함하는 항원 결합 분자에, CD3 또는 CD137의 어느 하나를 미리 결합시키는 것; 및 그 다음에, 전술한 방법에 의해 다른 하나의 것에 대한 그 결합 활성의 유무를 판정하는 것에 의해 확인할 수 있다. 혹은, 이것은 또한, ELISA 플레이트 상 또는 센서 칩 상에 고정화된 CD3 또는 CD137의 어느 하나에 대한 항원 결합 분자의 결합이, 용액 중으로의 다른 하나의 것의 첨가에 의해 저해되는지 여부를 판정하는 것에 의해, 확인할 수도 있다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자의 CD3 또는 CD137의 어느 하나에 대한 결합은, 다른 하나에 대한 항원 결합 분자의 결합에 의해, 적어도 50%, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 이상 저해된다.
하나의 국면에 있어서, 1개의 항원(예를 들어, CD3)을 고정화하고 있는 동안에, CD3에 대한 항원 결합 분자의 결합의 저해를, 선행 기술에 있어서 공지된 방법(즉, ELISA, BIACORE 등)에 의해, 다른 항원(예를 들어, CD137)의 존재하에서 결정할 수 있다. 다른 국면에 있어서, CD137을 고정화하고 있는 동안에, CD137에 대한 항원 결합 분자의 결합의 저해도 또한, CD3의 존재하에서 결정할 수 있다. 전술한 2개의 국면 중 어느 하나가 실시될 때에, 결합이, 적어도 50%, 바람직하게는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 이상 저해된다면, 본 발명의 항원 결합 분자는, CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는다고 판정된다.
몇몇 태양에 있어서, 애널라이트로서 인젝트되는 항원의 농도는, 고정화되는 다른 항원의 농도보다도 적어도 1배, 2배, 5배, 10배, 30배, 50배, 또는 100배 높다.
바람직한 양식에 있어서, 애널라이트로서 인젝트되는 항원의 농도는, 고정화되는 다른 항원의 농도보다도 100배 높고, 결합은, 적어도 80% 저해된다.
하나의 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 CD137(고정화) 결합 활성에 대한 KD치에 대한 항원 결합 분자의 CD3(애널라이트) 결합 활성에 대한 KD치의 비(KD(CD3)/KD(CD137))를 산출하고, CD137(고정화) 농도보다도 KD치의 비(KD(CD3)/KD(CD137))의 10배, 50배, 100배, 또는 200배 높은, CD3(애널라이트) 농도를, 상기의 경합 측정을 위해서 이용할 수 있다. (예를 들어, KD치의 비가 0.1인 경우는, 1배, 5배, 10배, 또는 20배 높은 농도를 선택할 수 있다. 더욱이, KD치의 비가 10인 경우는, 100배, 500배, 1000배, 또는 2000배 높은 농도를 선택할 수 있다.)
하나의 국면에 있어서, 1개의 항원(예를 들어, CD3)을 고정화하고 있는 동안에, CD3에 대한 항원 결합 분자의 결합 시그널의 감약을, 선행 기술에 있어서 공지된 방법(즉, ELISA, ECL 등)에 의해, 다른 항원(예를 들어, CD137)의 존재하에서 결정할 수 있다. 다른 국면에 있어서, CD137을 고정화하고 있는 동안에, CD137에 대한 항원 결합 분자의 결합 시그널의 감약도 또한, CD3의 존재하에서 결정할 수 있다. 전술한 2개의 국면 중 어느 하나가 실시될 때에, 결합 시그널이, 적어도 50%, 바람직하게는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 이상 감약되면, 본 발명의 항원 결합 분자는, CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는다고 판정된다.
몇몇 태양에 있어서, 애널라이트로서 인젝트되는 항원의 농도는, 고정화되는 다른 항원의 농도보다도 적어도 1배, 2배, 5배, 10배, 30배, 50배, 또는 100배 높다.
바람직한 양식에 있어서, 애널라이트로서 인젝트되는 항원의 농도는, 고정화되는 다른 항원의 농도보다도 100배 높고, 결합은, 적어도 80% 저해된다.
하나의 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 CD137(고정화) 결합 활성에 대한 KD치에 대한 항원 결합 분자의 CD3(애널라이트) 결합 활성에 대한 KD치의 비(KD(CD3)/KD(CD137))를 산출하여, CD137(고정화) 농도보다도 KD치의 비(KD(CD3)/KD(CD137))가 10배, 50배, 100배, 또는 200배 높은, CD3(애널라이트) 농도를, 상기의 측정을 위해서 이용할 수 있다. (예를 들어, KD치의 비가 0.1인 경우는, 1배, 5배, 10배, 또는 20배 높은 농도를 선택할 수 있다. 더욱이, KD치의 비가 10인 경우는, 100배, 500배, 1000배, 또는 2000배 높은 농도를 선택할 수 있다.)
구체적으로는, 예를 들어, ECL법을 이용하는 경우, 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자, sulfo-tag(Ru 착체)로 표지된 CD3, 및 표지되어 있지 않은 CD137을 준비한다. 피험 항원 결합 분자가, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는 경우, 피험 항원 결합 분자와 표지된 CD3의 혼합물을 스트렙트아비딘 고정화 플레이트 상에 첨가하는 것, 및 그 후의 발광에 의해, sulfo-tag의 발광 시그널이, 표지되어 있지 않은 CD137의 비존재하에서 검출된다. 대조적으로, 발광 시그널은, 표지되어 있지 않은 CD137의 존재하에서 감소한다. 이 발광 시그널의 감소를 정량하여, 상대적인 결합 활성을 결정할 수 있다. 이 해석은, 표지된 CD137 및 표지되어 있지 않은 CD3을 이용하여, 마찬가지로 실시될 수 있다.
ALPHAScreen의 경우, 피험 항원 결합 분자는, 경합하는 CD137의 비존재하에서 CD3과 상호작용하여, 520 내지 620nm의 시그널을 생성한다. 태그 붙여져 있지 않은 CD137은, 피험 항원 결합 분자와의 상호작용에 대해 CD3과 경합한다. 경합의 결과로서 야기되는 형광의 감소를 정량하고, 그에 의해 상대적인 결합 활성을 결정할 수 있다. 설포-NHS-비오틴 등을 이용한 폴리펩티드의 비오틴화는, 당해 기술 분야에 있어서 공지이다. 예를 들어, CD3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합하는 것; 및 결과로서 생긴 융합 유전자를, 그 발현이 가능한 벡터를 보유하는 세포 등에 의해 발현시키고, 그 후 글루타티온 컬럼을 이용하여 정제하는 것을 포함하는, 적절히 채용되는 방법에 의해, CD3을 GST로 태그 붙이기할 수 있다. 얻어진 시그널은, 바람직하게는, 예를 들어, 비선형 회귀 해석에 기초하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합한 소프트웨어 GRAPHPAD PRISM(GraphPad Software, Inc., San Diego)을 이용하여 해석된다. 이 해석은, 태그 붙여진 CD137 및 태그 붙여져 있지 않은 CD3을 이용하여, 마찬가지로 해석될 수 있다.
혹은, 형광 공명 에너지 이동(FRET)을 이용한 방법이 이용되어도 된다. FRET란, 여기 에너지가, 근접하여 위치하는 2개의 형광 분자 사이에서 서로, 전자 공명에 의해 직접 이동하는 현상이다. FRET가 일어나면, 도너(여기 상태를 갖는 형광 분자)의 여기 에너지가 억셉터(도너의 근처에 위치하는 다른 하나의 형광 분자)로 이동하기 때문에, 도너로부터 방사되는 형광이 소실되고(정확하게는, 형광의 수명이 단축되고), 대신에 억셉터로부터 형광이 방사된다. 이 현상의 사용에 의해, CD3과 CD137에 동시에 결합하는지 여부를 해석할 수 있다. 예를 들어, 형광 도너를 갖는 CD3 및 형광 억셉터를 갖는 CD137이, 피험 항원 결합 분자에 동시에 결합하면, 도너의 형광은 소실되고, 한편, 억셉터로부터 형광이 방사된다. 그 때문에, 형광 파장의 변화가 관찰된다. 그와 같은 항체는, CD3과 CD137에 동시에 결합하는 것이라고 확인된다. 다른 한편으로, CD3, CD137, 및 피험 항원 결합 분자의 혼합이, CD3과 결합한 형광 도너의 형광 파장을 변화시키지 않는다면, 이 피험 항원 결합 분자는, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는 항원 결합 도메인으로 간주할 수 있다.
예를 들어, 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자를, 도너 비즈 상의 스트렙트아비딘에 결합시키고, 한편, 글루타티온 S 트랜스페라제(GST)로 태그 붙여진 CD3을, 억셉터 비즈에 결합시킨다. 피험 항원 결합 분자는, 경합하는 제 2 항원의 비존재하에서 CD3과 상호작용하여, 520 내지 620nm의 시그널을 생성한다. 태그 붙여져 있지 않은 제 2 항원은, 피험 항원 결합 분자와의 상호작용에 대해 CD3과 경합한다. 경합의 결과로서 야기되는 형광의 감소를 정량하고, 그에 의해 상대적인 결합 활성을 결정할 수 있다. 설포-NHS-비오틴 등을 이용한 폴리펩티드의 비오틴화는, 당해 기술 분야에 있어서 공지이다. 예를 들어, CD3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합하는 것; 및, 결과로서 생긴 융합 유전자를, 그 발현이 가능한 벡터를 보유하는 세포 등에 의해 발현시키고, 그 후 글루타티온 컬럼을 이용하여 정제하는 것을 포함하는, 적절히 채용되는 방법에 따라, CD3을 GST로 태그 붙이기할 수 있다. 얻어진 시그널은, 바람직하게는, 예를 들어, 비선형 회귀 해석에 기초하는 일부위 경합 모델에 적합한 소프트웨어 GRAPHPAD PRISM(GraphPad Software, Inc., San Diego)을 이용하여 해석된다.
태그 붙이기는, GST 태그 붙이기로 한정되지 않고, 히스티딘 태그, MBP, CBP, Flag 태그, HA 태그, V5 태그, c-myc 태그 등이지만 그들로 한정되지 않는, 임의의 태그로 실시되어도 된다. 피험 항원 결합 분자의 도너 비즈로의 결합은, 비오틴-스트렙트아비딘 반응을 이용한 결합으로 한정되지 않는다. 특히, 피험 항원 결합 분자가 Fc를 포함하는 경우, 가능한 방법에는, 도너 비즈 상의 프로틴 A 또는 프로틴 G 등의 Fc 인식 단백질을 개재시켜 피험 항원 결합 분자를 결합시키는 것이 포함된다.
또한, CD3 및 CD137이, 가용성 단백질과 같이 세포막 상에 발현하고 있지 않을 때, 또는 양쪽이 동일한 세포 상에 존재할 때에는, 가변 영역이, CD3과 CD137에 동시에 결합할 수 있지만, 각각이 상이한 세포 상에서 발현하고 있는 CD3과 CD137에 동시에는 결합할 수 없는 경우도 또한, 당해 기술 분야에 있어서 공지된 방법에 따라 어세이할 수 있다.
구체적으로는, CD3 및 CD137에 대한 동시의 결합을 검출하기 위한 ECL-ELISA에 있어서 양성임이 확인되고 있는 피험 항원 결합 분자를 또한, CD3을 발현하는 세포 및 CD137을 발현하는 세포와 혼합한다. 피험 항원 결합 분자는, 항원 결합 분자 및 이들 세포가 서로 동시에 결합하지 않는 한, 상이한 세포 상에서 발현하고 있는 CD3과 CD137에 동시에는 결합할 수 없음이 나타날 수 있다. 이 어세이는, 예를 들어, 세포 베이스의 ECL-ELISA에 의해 실시할 수 있다. CD3을 발현하는 세포를, 미리 플레이트 상에 고정화한다. 피험 항원 결합 분자를 거기에 결합시킨 후에, CD137을 발현하는 세포를 플레이트에 첨가한다. CD137을 발현하는 세포 상에서만 발현하고 있는 상이한 항원은, 이 항원에 대한 sulfo-tag로 표지된 항체를 이용하여 검출된다. 항원 결합 분자가, 각각 2개의 세포 상에서 발현하고 있는 2개의 항원에 동시에 결합하는 경우는, 시그널이 관찰된다. 항원 결합 분자가 이들 항원에 동시에는 결합하지 않는 경우는, 어떠한 시그널도 관찰되지 않는다.
혹은, 이 어세이는, ALPHAScreen법에 따라 실시되어도 된다. 피험 항원 결합 분자를, 도너 비즈에 결합한 CD3을 발현하는 세포 및 억셉터 비즈에 결합한 CD137을 발현하는 세포와 혼합한다. 항원 결합 분자가, 각각 2개의 세포 상에서 발현하고 있는 2개의 항원에 동시에 결합하는 경우는, 시그널이 관찰된다. 항원 결합 분자가 이들의 항원에 동시에는 결합하지 않는 경우는, 시그널은 관찰되지 않는다.
혹은, 이 어세이는, Octet 상호작용 해석법에 따라 실시되어도 된다. 최초에, 펩티드 태그를 부가한 CD3을 발현하는 세포를, 펩티드 태그를 인식하는 바이오센서에 결합시킨다. CD137을 발현하는 세포 및 피험 항원 결합 분자를, 웰에 넣고, 상호작용에 대해 해석한다. 항원 결합 분자가, 각각 2개의 세포 상에서 발현하고 있는 2개의 항원에 동시에 결합하는 경우는, 피험 항원 결합 분자 및 CD137을 발현하는 세포의 바이오센서로의 결합에 의해 야기되는 큰 파장 시프트가 관찰된다. 항원 결합 분자가 이들 항원에 동시에는 결합하지 않는 경우는, 피험 항원 결합 분자만의 바이오센서로의 결합에 의해 야기되는 작은 파장 시프트가 관찰된다.
결합 활성에 기초하는 이들 방법 대신에, 생물 활성에 기초하는 어세이가 실시되어도 된다. 예를 들어, CD3을 발현하는 세포 및 CD137을 발현하는 세포를, 피험 항원 결합 분자와 혼합하고, 배양한다. 각각 2개의 세포 상에서 발현하고 있는 2개의 항원은, 항원 결합 분자가 이들 2개의 항원에 동시에 결합하는 경우는, 피험 항원 결합 분자를 개재시켜 서로 활성화된다. 그 때문에, 항원의 각각의 하류의 인산화 레벨의 증가 등의 활성화 시그널의 변화를, 검출할 수 있다. 혹은, 사이토카인의 산생이, 활성화의 결과로서 유도된다. 그 때문에, 산생되는 사이토카인의 양을 측정하고, 그에 의해, 2개의 세포에 동시에 결합하는지 여부를 확인할 수 있다. 혹은, CD137을 발현하는 세포에 대한 세포 상해 활성이, 활성화의 결과로서 유도된다. 혹은, 리포터 유전자의 발현이, 활성화의 결과로서, CD137 또는 CD3의 시그널 전달 경로의 하류에서 활성화되는 프로모터에 의해 유도된다. 그 때문에, 세포 상해 활성 또는 산생되는 리포터 단백질의 양을 측정하고, 그에 의해, 2개의 세포에 동시에 결합하는지 여부를 확인할 수 있다.
적어도 1개의 다이설파이드 결합
본 발명의 하나의 국면에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, 바람직하게는 CH1 영역에 있어서, (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 적어도 1개의 시스테인 잔기를 포함하고, 해당 적어도 1개의 시스테인 잔기는, 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이에 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있다. 어느 특정의 태양에 있어서, 시스테인 잔기는, 항체 중쇄 정상 영역의 CH1 영역 내에 존재하고, 예를 들어, CH1 영역 중의 EU 넘버링에 의한 119위, 122위, 123위, 131위, 132위, 133위, 134위, 135위, 136위, 137위, 139위, 140위, 148위, 150위, 155위, 156위, 157위, 159위, 160위, 161위, 162위, 163위, 165위, 167위, 174위, 176위, 177위, 178위, 190위, 191위, 192위, 194위, 195위, 197위, 213위, 및 214위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에 존재한다. 하나의 태양에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는, CH1 영역 중의 EU 넘버링에 의한 191위에 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 1개의 시스테인 잔기를 포함한다.
상기 국면의 어느 태양에 있어서, 형성되는 "적어도 1개의 결합"은, 상기에 기재되는 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 연결하여, 2개의 항원 결합 부분(즉, 상기에 기재되는 바와 같은 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분)을 공간적으로 가까운 위치로 유지할 수 있다. 다이설파이드 결합을 개재시키는 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이의 연결 때문에, 본 발명의 항원 결합 분자는, 2개의 항원 결합 부분 사이에 도입된 추가의 결합을 갖지 않는다는 점에서만 본 발명의 항원 결합 분자와 상이한 대조 항원 결합 분자보다도 가까운 위치에서, 2개의 항원 결합 부분을 유지할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 용어 "공간적으로 가까운 위치" 또는 "보다 가까운 위치"는, 상기에 기재되는 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인이 단축된 거리 및/또는 감소된 가요성으로 유지된다고 하는 의미를 포함한다.
결과로서, 본 발명의 항원 결합 분자의 2개의 항원 결합 부분(즉, 상기에 기재되는 바와 같은 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분)은, 동일한 단일의 세포 상에 발현하고 있는 항원에 결합한다. 환언하면, 본 발명의 항원 결합 분자의 2개의 항원 결합 부분(즉, 상기에 기재되는 바와 같은 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분)의 각각은, 상이한 세포의 가교를 가져오는, 상이한 세포 상에 발현하고 있는 항원에는 결합하지 않는다. 본 출원에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자의 그와 같은 항원 결합 양식은 "시스 결합"이라고 부를 수 있는 데 반해, 항원 결합 분자의 2개의 항원 결합 부분의 각각이, 상이한 세포의 가교를 가져오도록 상이한 세포 상에 발현하고 있는 항원에 결합하는, 항원 결합 분자의 항원 결합 양식은, "트랜스 결합"이라고 부를 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는 주로, "시스 결합" 양식으로 동일한 단일의 세포 상에 발현하고 있는 항원에 결합한다.
상기 국면의 어느 태양에 있어서, 상기에 기재되어 있는 바와 같은 다이설파이드 결합을 개재시키는 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이의 다이설파이드 결합 때문에, 본 발명의 항원 결합 분자는, 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, 또는 DC 세포 등)의 바람직하지 않은 가교 형성 및 활성화를 저하시키고 및/또는 방해할 수 있다. 즉, 본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자의 제 1 항원 결합 부분은, T 세포 등의 면역 세포 상에 발현하고 있는 임의의 시그널 전달 분자(예를 들어, 제 1 항원)에 결합하고, 본 발명의 항원 결합 분자의 제 2 항원 결합 도메인도 또한, T 세포 등의 면역 세포 상에 발현하고 있는 임의의 시그널 전달 분자(예를 들어, 제 1 항원, 또는 제 1 항원과는 상이한 제 2 항원)에 결합한다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 분자의 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은, 동일한 단일의 면역 세포, 예를 들어 T 세포 등 상(즉, 시스 결합 양식)에, 또는 상이한 면역 세포, 예를 들어 T 세포 등 상(즉, 트랜스 결합 양식)에 발현하고 있는 제 1 또는 제 2 시그널 전달 분자의 어느 것에 결합할 수 있다. 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인이, 트랜스 결합 양식으로 상이한 면역 세포, 예를 들어 T 세포 상에 발현하고 있는 시그널 전달 분자에 결합하는 경우, 그들 상이한 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 가교되고, 어느 특정의 상황에 있어서, T 세포 등의 면역 세포의 그와 같은 가교 형성은, T 세포 등의 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 야기할 수 있다.
한편, 본 발명의 항원 결합 분자, 즉, CH1 영역 중(EU 넘버링에 의한 191위)의 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 개재시켜 서로 연결되는 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 항원 결합 분자의 다른 태양의 경우, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분은 어느 것도, 항원 결합 분자를 개재시키는 상이한 면역 세포, 예를 들어 T 세포의 가교 형성이 저감되어, 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 회피할 수 있도록, 동일한 단일의 면역 세포, 예를 들어 T 세포 상에 발현하고 있는 시그널 전달 분자에 "시스 결합" 양식으로 결합할 수 있다.
본 출원에 있어서, 상기의 특징, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 연결하는 CH1 영역 중(예를 들어, EU 넘버링에 의한 191위)의 적어도 1개의 다이설파이드 결합은, 약어 "LINC"로 기재될 수 있다. 이 약어를 이용하면, 몇몇 태양에 있어서, 해당 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 본 발명의 상기의 항원 결합 분자는, 예를 들어, "LINC 포맷", "Dual/LINC" 또는 "DLL3-Dual/LINC" 등으로서 표시될 수 있다. 마찬가지로, CH1 영역 중(예를 들어, EU 넘버링에 의한 191위)의 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 개재시켜 서로 연결되지 않는/아직 연결되어 있지 않은 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 항원 결합 분자는, 약어 "UnLINC"로 기재될 수 있다.
Fab 분자
"Fab 분자"는, 면역글로불린의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인("Fab 중쇄") 및 경쇄의 VL 및 CL 도메인("Fab 경쇄")으로 이루어지는 단백질을 가리킨다.
융합된
"융합된"은, 구성성분(예컨대 Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)이, 직접적으로, 또는 1개 이상의 펩티드 링커를 개재시켜, 펩티드 결합에 의해 연결되는 것을 의미한다.
"크로스오버" Fab
"크로스오버" Fab 분자("Crossfab"라고도 칭함)는, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 정상 영역이 교환되어 있는, Fab 분자를 의미한다. 즉, 크로스오버 Fab 분자는, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 정상 영역으로 구성된 펩티드쇄와, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역으로 구성된 펩티드쇄를 포함한다. 명확하게 하기 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자에서는, 중쇄 정상 영역을 포함하는 펩티드쇄가, 본 명세서에 있어서, 크로스오버 Fab 분자의 "중쇄"로 칭해진다. 반대로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 정상 영역이 교환된 크로스오버 Fab 분자에서는, 중쇄 가변 영역을 포함하는 펩티드쇄가, 본 명세서에 있어서, 크로스오버 Fab 분자의 "중쇄"로 칭해진다.
"종래형의" Fab
그와 대조적으로, "종래형의" Fab 분자는, 그의 천연의 포맷에서의 Fab 분자, 즉 중쇄 가변 및 정상 영역으로 구성된 중쇄(VH-CH1), 및 경쇄 가변 및 정상 영역으로 구성된 경쇄(VL-CL)를 포함하는 Fab 분자를 의미한다. 용어 "면역글로불린 분자"는, 천연에 존재하는 항체의 구조를 갖는 단백질을 가리킨다. 예를 들어, IgG 클래스의 면역글로불린은, 다이설파이드 결합으로 결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된, 약 150,000돌턴의 헤테로4량체 당단백질이다. 각 중쇄는, N말단으로부터 C말단으로, 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH)과, 그 후에 계속되는 중쇄 정상 영역이라고도 불리는 3종류의 정상 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 마찬가지로, 각 경쇄는, N말단으로부터 C말단으로, 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL)과, 그 후에 계속되는 경쇄 정상 영역이라고도 불리는 정상 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는, α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)로 불리는 5개의 타입 중 하나에 할당되어도 되고, 이들 중 일부는, 예컨대 γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)의 서브타입으로 추가로 분류되어도 된다. 면역글로불린의 경쇄는, 그의 정상 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, κ 및 λ로 불리는 2개의 타입 중 하나에 할당되어도 된다. 면역글로불린은, 면역글로불린 힌지 영역을 개재시켜 연결된, 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 본질적으로 이루어진다.
친화성
"친화성"은, 분자(예컨대 항원 결합 분자 또는 항체)의 결합 부위 1개와, 그 분자의 결합 파트너(예컨대 항원) 사이의, 비공유 결합적 상호작용의 합계의 강도를 가리킨다. 특별히 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 "결합 친화성"은, 어떤 결합쌍의 멤버(예컨대 항원 결합 분자와 항원, 또는 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는, 고유의 결합 친화성을 가리킨다. 분자 X의, 그의 파트너 Y에 대한 친화성은, 일반적으로 해리 속도 상수와 회합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(KD)에 의해 표시될 수 있다. 따라서, 속도 상수의 비가 동일한 채로 유지되는 한, 등가의 친화성은 상이한 속도 상수를 포함해도 된다. 친화성은, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는, 당해 기술 분야에 있어서 공지된 확립된 방법에 의해 측정할 수 있다. 친화성을 측정하기 위한 구체적인 방법은, 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다.
친화성을 결정하는 방법
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 분자 또는 항체는 그의 항원에 대한 해리 상수(KD)가 1μM 이하, 120nM 이하, 100nM 이하, 80nM 이하, 70nM 이하, 50nM 이하, 40nM 이하, 30nM 이하, 20nM 이하, 10nM 이하, 2nM 이하, 1nM 이하, 0.1nM 이하, 0.01nM 이하, 또는 0.001nM 이하(예컨대 10-8M 이하, 10-8M 내지 10-13M, 10-9M 내지 10-13M)이다. 특정의 태양에 있어서, 항체/항원 결합 분자의 CD3, CD137 또는 DLL3에 대한 KD치는, 1-40, 1-50, 1-70, 1-80, 30-50, 30-70, 30-80, 40-70, 40-80, 또는 60-80nM의 범위 내에 있다.
하나의 태양에 있어서, KD는, 방사성 표지 항원 결합 측정법(RIA)에 의해 측정된다. 하나의 태양에 있어서, RIA는, 목적하는 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 이용하여 실시된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액중 결합 친화성은, 비표지 항원의 점증량 계열의 존재하에서 최소 농도의 (125I) 표지 항원에 의해 Fab를 평형화시키고, 그 다음에 결합한 항원을 Fab 항체로 코팅된 플레이트에 의해 포착하는 것에 의해 측정된다. (예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)을 참조). 측정 조건을 구축하기 위해, 마이크로타이터(등록 상표) 멀티웰 플레이트(서모 사이언티픽)를 50mM 탄산 나트륨(pH 9.6) 중의 5μg/ml의 포착용 항Fab 항체(Cappel Labs)로 하룻밤 코팅하고, 그 후에 실온(대략 23℃)에서 2 내지 5시간 동안, PBS 중 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 블로킹한다. 비흡착 플레이트(Nunc #269620)에 있어서, 100pM 또는 26pM [125I]-항원을, (예를 들어, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에 있어서의 항VEGF 항체, Fab-12의 평가와 동일하게) 목적하는 Fab의 계열 희석물과 혼합한다. 그 다음에, 목적하는 Fab를 하룻밤 인큐베이트하지만, 이 인큐베이션은, 평형이 확실히 달성되도록, 보다 장시간(예를 들어, 약 65시간) 계속될 수 있다. 그 후, 혼합물을, 실온에서의 인큐베이션(예를 들어, 1시간)을 위해서 포착 플레이트로 옮긴다. 그 다음에 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1%의 폴리소르베이트 20(TWEEN-20(등록상표))으로 8회 세정한다. 플레이트가 건조하면, 150μl/웰의 신틸런트(MICROSCINT-20TM, Packard)를 첨가하고, TOPCOUNTTM 감마 카운터(Packard)에 있어서 플레이트를 10분간 카운트한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를, 경합 결합 어세이에 있어서 사용하기 위해서 선택한다.
다른 태양에 의하면, Kd는, BIACORE(등록 상표) 표면 플라즈몬 공명 어세이를 이용하여 측정된다. 예를 들어, BIACORE(등록 상표)-2000 또는 BIACORE(등록 상표)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하는 측정법이, 대략 10반응 단위(response unit: RU)의 항원이 고정된 CM5 칩을 이용하여 25℃에서 행해진다. 하나의 태양에 있어서, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은, 공급원의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 이용하여 활성화된다. 항원은, 대략 10반응 단위(RU)의 단백질의 결합을 달성하도록, 5μL/분의 유속으로 주입하기 전에, 10mM 아세트산 나트륨, pH 4.8을 이용하여 5μg/ml(~0.2μM)로 희석된다. 항원의 주입 후, 미반응 기를 블로킹하기 위해 1M 에탄올아민이 주입된다. 키네틱스의 측정을 위해서, 25℃, 대략 25μL/분의 유속으로, 0.05% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20TM) 계면활성제 함유 PBS(PBST) 중의 Fab의 2배 계열 희석물(0.78nM∼500nM)이 주입된다. 회합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는, 단순한 1대1 랑뮤어 결합 모델(BIACORE(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여, 회합 및 해리의 센서그램을 동시에 피팅하는 것에 의해 계산된다. 평형 해리 상수(Kd)는, koff/kon비로서 계산된다. 예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)을 참조. 상기의 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 온 속도(on-rate)가 106M-1s-1를 초과하는 경우, 온 속도는, 분광계(예를 들어 스톱 플로식 분광 광도계(Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 이용하는 8000 시리즈의 SLM-AMINCOTM 분광 광도계(ThermoSpectronic))에 있어서 측정되는, 점증 농도의 항원의 존재하에서의 PBS, pH 7.2 중 20nM의 항원 결합 도메인의 25℃에서의 형광 발광 강도(여기=295nm; 발광=340nm, 밴드 패스 16nm)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 이용하는 것에 의해 결정될 수 있다.
전술한 항원 결합 분자 또는 항체의 친화성을 측정하는 상기 방법에 따라, 당업자는, 다양한 종류의 항원에 대한 다른 항원 결합 분자 또는 항체의 친화성 측정을 행할 수 있다.
항체
본 명세서에서 용어 "항체"는, 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체) 및 항체 단편을 포함하는, 여러 가지 항체 구조를 포함한다.
항체 단편
"항체 단편"은, 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 당해 완전 항체의 일부분을 포함하는, 당해 완전 항체 이외의 분자를 가리킨다. 항체 단편의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아보디; 선상 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 싱글 도메인 항체를 포함한다. 특정의 항체 단편에 대한 총설로서, Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)을 참조할 것. scFv 단편의 총설로서, 예를 들어, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 더하여, WO93/16185; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조할 것. 솔베이지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 인비보에 있어서의 반감기가 길어진 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논설로서, 미국 특허 제5,869,046호를 참조할 것. 다이아보디는, 2가 또는 이중 특이적이어도 되는, 항원 결합 부위를 2개 수반하는 항체 단편이다. 예를 들어, EP404,097호; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 참조. 트라이아보디(triabody)나 테트라보디(tetrabody)도, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 기재되어 있다. 싱글 도메인 항체는, 항체의 중쇄 가변 도메인의 모두 혹은 일부분, 또는 경쇄 가변 도메인의 모두 혹은 일부분을 포함하는, 항체 단편이다. 특정의 태양에 있어서, 싱글 도메인 항체는, 인간 싱글 도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516호 B1 참조). 항체 단편은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된, 완전 항체의 단백질 분해적 소화, 재조합 숙주 세포(예를 들어, 대장균(E. coli) 또는 파지)에 의한 산생을 포함하는, 여러 가지 수법에 의해 만들 수 있다.
항체의 클래스
항체의 "클래스"는, 항체의 중쇄에 구비되는 정상 도메인 또는 정상 영역의 타입을 가리킨다. 항체에는 5개의 주요한 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이다. 그리고, 이 중 어느 것은 추가로 서브클래스(아이소타입)로 나눠져도 된다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2이다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 정상 도메인을, 각각, α, δ, ε, γ, 및 μ라고 부른다.
특별히 나타내지 않는 한, 경쇄 정상 영역 중의 아미노산 잔기는, 본 명세서에서는 Kabat 등에 따라 넘버링되고, 중쇄 정상 영역 중의 아미노산 잔기의 넘버링은, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991에 기재되어 있는 바와 같은, EU 인덱스라고도 불리는, EU 넘버링 시스템에 따른다.
프레임워크
"프레임워크" 또는 "FR"은, 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의, 가변 도메인 잔기를 가리킨다. 가변 도메인의 FR은, 통상 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 그에 따라서, HVR 및 FR의 서열은, 통상 다음의 순서로 VH(또는 VL)에 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
인간 컨센서스 프레임워크
"인간 컨센서스 프레임워크"는, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택군에 있어서 가장 공통되게 생기는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 통상, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은, 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터이다. 통상, 서열의 서브그룹은, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에 있어서의 서브그룹이다. 하나의 태양에 있어서, VL에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 κI이다. 하나의 태양에 있어서, VH에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 III이다.
키메라 항체
용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정의 공급원 또는 종에서 유래하는 한편으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종에서 유래하는 항체를 가리킨다. 마찬가지로, 용어 "키메라 항체 가변 도메인"은, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 일부분이 특정의 공급원 또는 종에서 유래하는 한편으로, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종에서 유래하는 항체 가변 영역을 가리킨다.
인간화 항체
"인간화" 항체는, 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는, 키메라 항체를 가리킨다. 어느 태양에서는, 인간화 항체는, 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함하고, 당해 가변 영역에 있어서는, 모든 혹은 실질적으로 모든 HVR(예를 들어 CDR)은 비인간 항체의 것에 대응하고, 또한, 모든 혹은 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는, 임의로, 인간 항체에서 유래하는 항체 정상 영역의 적어도 일부분을 포함해도 된다. 항체(예를 들어, 비인간 항체)의 "인간화된 형태"는, 인간화를 거친 항체를 가리킨다. "인간화된 항체 가변 영역"은 인간화 항체의 가변 영역을 가리킨다.
인간 항체
"인간 항체"는, 인간 혹은 인간 세포에 의해 산생된 항체 또는 인간 항체 레퍼터리 혹은 다른 인간 항체 코드 서열을 이용하는 비인간 공급원에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 구비하는 항체이다. 이 인간 항체의 정의는, 비인간의 항원 결합 부분을 포함하는 인간화 항체를, 명확히 제외하는 것이다. "인간 항체 가변 영역"은, 인간 항체의 가변 영역을 가리킨다.
폴리뉴클레오티드(핵산)
본 명세서에서 서로 교환 가능하게 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 가리키고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 수식된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 아날로그, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체로 짜넣어질 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 아날로그 등의 수식 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에, 비뉴클레오티드 성분이 끼어들어가 있어도 된다. 폴리뉴클레오티드는, 표지로의 컨주게이션과 같은, 합성 후에 이루어지는 수식을 포함할 수 있다. 다른 타입의 수식은, 예를 들어, "캡(cap)", 하나 이상의 천연에 존재하는 뉴클레오티드의 아날로그로의 치환, 인터뉴클레오티드 수식, 예를 들어, 비하전 연결(예컨대 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포르아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전 연결(예컨대 포스포로싸이오에이트, 포스포로다이싸이오에이트 등)을 갖는 것, 예를 들어 단백질(예컨대 뉴클레아제, 톡신, 항체, 시그널 펩티드, 폴리-L-리신 등) 등의 펜던트 부분을 포함하는 것, 인터캘레이트제(예컨대 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것, 킬레이트제(예컨대 금속, 방사능 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 포함하는 것, 알킬화제를 포함하는 것, 수식 연결(예컨대 α 아노머 핵산 등)이나 비수식 형태의 폴리뉴클레오티드를 갖는 것을 포함한다. 더욱이, 통상 당에 존재하는 임의의 하이드록실기를, 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 치환할 수 있고, 표준적인 보호기에 의해 보호할 수 있고, 혹은 추가의 뉴클레오티드로의 추가적인 연결을 생성하도록 활성화시킬 수 있고, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 컨주게이트시킬 수 있다. 5' 및 3' 말단의 OH는, 포스포릴화 또는 아민 혹은 탄소수 1 내지 20의 유기 캐핑기 부분으로 치환시킬 수 있다. 다른 하이드록실도 또한, 표준적인 보호기로 유도체화될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 이하의 것을 포함하는, 당해 기술 분야에 일반적으로 공지되어 있는 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사 형태를 함유할 수 있다: 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴-, 2'-플루오로- 또는 2'-아자이도-리보스, 탄소환식 당 아날로그, α-아노머 당, 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스 등의 에피머 당, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 아날로그, 및 메틸 리보사이드 등의 염기성 뉴클레오사이드. 하나 이상의 포스포다이에스터 결합은, 대안적인 연결기에 의해 치환될 수 있다. 이들 대안적인 연결기는, 이들로 한정되지는 않지만, 포스페이트가 이하의 것에 의해 치환되어 있는 형태를 포함한다: P(O)S("싸이오에이트"), P(S)S("다이싸이오에이트"), (O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO, 또는 CH2("폼아세탈"), 여기에서, R 또는 R'는 각각 독립적으로 H, 또는 임의로 에터(-O-) 연결, 아릴, 알켄일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 아르알딜을 포함하는 치환 또는 비치환된 알킬(1-20C)이다. 폴리뉴클레오티드 중의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 설명은, RNA 및 DNA를 포함하는 본 명세서에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
단리된 (핵산)
"단리된" 핵산 분자는, 그 원래의 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 단리된 핵산 분자는 더욱이, 그 핵산 분자를 통상 포함하는 세포 중에 포함된 핵산 분자를 포함하지만, 그 핵산 분자는 염색체 외에 존재하고 있거나 또는 본래의 염색체 상의 위치와는 상이한 염색체 상의 위치에 존재하고 있다.
벡터
본 명세서에서 이용되는 용어 "벡터"는, 그것이 연결된 또 하나의 핵산을 증가시킬 수 있는, 핵산 분자를 가리킨다. 이 용어는, 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터, 및 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 중에 짜넣어지는 벡터를 포함한다. 어느 벡터는, 자신이 동작적으로 연결된 핵산의, 발현을 가져올 수 있다. 그와 같은 벡터는, 본 명세서에서는 "발현 벡터"라고도 칭해진다. 벡터는 바이러스 또는 전기영동을 이용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 그러나, 벡터의 도입은 인비트로로의 방법으로 한정되지 않는다. 예를 들어, 벡터는 인비보로의 방법을 이용하여 대상에게 직접 도입할 수 있다.
본 발명의 다른 국면에 있어서, 본 개시의, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만 동시에는 결합하지 않는 항원 결합 부분, DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 부분, 항원 결합 분자, 또는 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는, 본 개시의 항원 결합 부분, 항원 결합 분자, 또는 항체를 대상 내에서 직접적으로 발현하도록, 대상에게 도입될 수 있다. 이용될 가능성이 있는 벡터의 예는, 이들로 한정되지 않지만, 아데노바이러스이다. 본 개시의 항원 결합 부분, 항원 결합 분자, 또는 항체를 코딩하는 핵산 분자를 대상에게 직접적으로 투여하는 것, 또는 본 개시의 항원 결합 부분, 항원 결합 분자, 또는 항체를 코딩하는 핵산 분자를 일렉트로포레이션을 개재시켜 대상에게 이입(移入)하는 것, 또는 발현 및 분비시켜야 할 본 개시의 항원 결합 부분, 항원 결합 분자, 또는 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포를 대상에게 투여하여, 대상에 있어서 본 개시의 항원 결합 부분, 항원 결합 분자, 또는 항체를 연속적으로 발현 및 분비시키는 것도 또한 가능하다.
숙주 세포
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"은, 상호 교환 가능하게 이용되고, 외래 핵산이 도입된 세포(그와 같은 세포의 자손을 포함한다)를 가리킨다. 숙주 세포는 "형질 전환체" 및 "형질 전환 세포"를 포함하고, 이것에는 초대의 형질 전환 세포 및 계대수에 상관 없이 그 세포에서 유래하는 자손을 포함한다. 자손은, 친세포와 핵산의 내용에 있어서 완전히 동일하지 않아도 되고, 변이를 포함하고 있어도 된다. 오리지널의 형질 전환 세포가 스크리닝되었을 때 또는 선택되었을 때에 이용된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손도, 본 명세서에서는 포함된다.
특이성
"특이적"이란, 하나 이상의 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 분자가, 해당 파트너 이외의 분자에 대해서는 전혀 유의한 결합을 나타내지 않음을 의미한다. 더욱이, "특이적"은 또한, 항원 결합 부위가, 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중의 특정한 에피토프에 특이적인 경우에도 이용된다. 항원 결합 분자가 항원에 특이적으로 결합할 경우, 이를 "항원 결합 분자가, 항원에/항원에 대해 특이성을 갖는다/나타낸다"라고도 기재된다. 항원 결합 부위가 결합하는 에피토프가 복수의 상이한 항원 중에 포함될 경우, 해당 항원 결합 부위를 포함하는 항원 결합 분자는, 해당 에피토프를 갖는 다양한 항원에 결합할 수 있다.
항체 단편
"항체 단편"은, 완전(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는, 완전 항체의 일부를 포함하는, 완전 항체 이외의 분자를 가리킨다. 항체 단편의 예로서는, 이들로 한정되지는 않지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아보디; 선상 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및, 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 들 수 있다.
용어 "전장 항체", "완전 항체", 및 "전부(whole) 항체"는, 천연형의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나, 또는 본 명세서에 있어서 정의하는 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 가리키기 위해, 본 명세서에 있어서 호환적으로 이용된다.
가변 단편(Fv)
본 명세서에 있어서, 용어 "가변 단편(Fv)"은, 항체의 경쇄 가변 영역(VL)과 항체의 중쇄 가변 영역(VH)의 페어로 구성되는 항체 유래의 항원 결합 부위의 최소 단위를 가리킨다. 1988년에 스케라(Skerra) 및 플뤽툰(Pluckthun)은 세균의 시그널 서열의 하류에 항체 유전자를 삽입하고 대장균 중에서 당해 유전자의 발현을 유도하는 것에 의해, 균일하고 또한 활성인 항체가 대장균의 페리플라즘 획분으로부터 조제될 수 있음을 발견했다(Science (1988) 240(4855), 1038-1041). 페리플라즘 획분으로부터 조제된 Fv에 있어서는, 항원에 결합하도록 하는 양식으로 VH와 VL이 회합하고 있다.
scFv, 단쇄 항체, 및 sc(Fv)
2
본 명세서에 있어서, 용어 "scFv", "단쇄 항체", 및 "sc(Fv)2"는 모두, 중쇄 및 경쇄에서 유래하는 가변 영역을 포함하지만, 정상 영역은 포함하지 않는, 단일 폴리펩티드쇄의 항체 단편을 가리킨다. 일반적으로, 단쇄 항체는, 항원 결합을 가능하게 한다고 생각되는 소망의 구조의 형성을 가능하게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. 단쇄 항체는, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)"에 있어서 플뤽툰에 의해 상세히 고찰되어 있다. 마찬가지로, 국제 특허공보 WO 1988/001649; 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호를 참조할 것. 특정의 태양에 있어서, 단쇄 항체는, 이중 특이성 및/또는 인간화될 수 있다.
scFv는 Fv를 형성하는 VH 및 VL이 펩티드 링커에 의해 함께 연결된 단쇄 저분자량 항체이다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85(16), 5879-5883). 당해 펩티드 링커에 의해 VH 및 VL은 근접한 상태로 유지될 수 있다.
sc(Fv)2는, 2개의 VL 및 2개의 VH의 4개의 가변 도메인이 펩티드 링커 등의 링커에 의해 연결되어 1개의 쇄를 형성한 단쇄 항체이다(J Immunol. Methods (1999) 231(1-2), 177-189). 이 2개의 VH와 2개의 VL은 상이한 모노클로날 항체에서 유래해도 된다. 이와 같은 sc(Fv)2로서는, 바람직하게는 Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374에서 개시되는 바와 같은, 단일 항원 중에 존재하는 2개의 에피토프를 인식하는 이중 특이성 sc(Fv)2를 적합하게 들 수 있다. sc(Fv)2는, 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, sc(Fv)2는, scFv를 펩티드 링커 등의 링커로 연결하는 것에 의해 제조할 수 있다.
본 명세서에 있어서, sc(Fv)2는 단쇄 폴리펩티드의 N말단을 기점으로 하여 VH, VL, VH, 및 VL([VH]-링커-[VL]-링커-[VH]-링커-[VL])의 순서로 정렬되어 있는 2개의 VH 단위 및 2개의 VL 단위를 포함한다. 2개의 VH와 2개의 VL의 순서는, 상기의 구성에 특별히 한정되지 않고, 어떤 순서로 정렬되어도 된다. 구성의 예를 이하에 열거한다.
[VL]-링커-[VH]-링커-[VH]-링커-[VL]
[VH]-링커-[VL]-링커-[VL]-링커-[VH]
[VH]-링커-[VH]-링커-[VL]-링커-[VL]
[VL]-링커-[VL]-링커-[VH]-링커-[VH]
[VL]-링커-[VH]-링커-[VL]-링커-[VH]
sc(Fv)2의 분자 형태에 대해서는 WO2006/132352에 있어서도 상세히 기재되어 있다. 당업자라면 이들 기재에 따라, 본 명세서에서 개시되는 폴리펩티드 복합체를 제조하기 위해서 소망의 sc(Fv)2를 적절히 조제하는 것이 가능하다.
더욱이, 본 개시의 항원 결합 분자 또는 항체는, PEG 등의 담체 고분자나 항암제 등의 유기 화합물을 컨주게이트해도 된다. 혹은, 당쇄가 소망의 효과를 가져오도록, 당쇄 부가 서열이 항원 결합 분자 또는 항체에 적합하게 삽입된다.
항체의 가변 영역의 연결에 사용하는 링커는, 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커, 합성 화합물 링커, 및 예를 들어 Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996에서 개시되는 링커를 포함한다. 그러나, 본 개시에 있어서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 그 길이는, 바람직하게는 5아미노산 이상이며(특별히 한정되지 않지만, 상한은 통상 30아미노산 이하, 바람직하게는 20아미노산 이하), 특히 바람직하게는 15아미노산이다. sc(Fv)2가 3개의 펩티드 링커를 포함하는 경우에는, 이들의 길이는 모두 동일해도 되고 상이해도 된다.
예를 들어, 이와 같은 펩티드 링커에는 이하의 것이 포함된다:
Ser,
Gly-Ser,
Gly-Gly-Ser,
Ser-Gly-Gly,
Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호: 91),
Ser-Gly-Gly-Gly(서열 번호: 92),
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호: 93),
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호: 94),
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호: 95),
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호: 96),
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호: 97),
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호: 98),
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호: 93))n, 및
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호: 94))n,
(여기에서, n은 1 이상의 정수이다). 펩티드 링커의 길이 또는 서열은 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
합성 링커(화학 가교제)는, 펩티드의 가교에 통상 이용되고 있고, 예로서는 이하를 들 수 있다:
N-하이드록시석신이미드(NHS),
다이석신이미딜 수베레이트(DSS),
비스(설포석신이미딜)수베레이트(BS3),
다이싸이오비스(석신이미딜 프로피오네이트)(DSP),
다이싸이오비스(설포석신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP),
에틸렌 글라이콜 비스(석신이미딜 석시네이트)(EGS),
에틸렌 글라이콜 비스(설포석신이미딜 석시네이트)(설포-EGS),
다이석신이미딜 타르트레이트(DST),
다이설포석신이미딜 타르트레이트(설포-DST),
비스[2-(석신이미드옥시카보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 및
비스[2-(설포석신이미드옥시카보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES). 이들 가교제는 시판되고 있다.
4개의 항체 가변 도메인을 연결하려면, 통상, 3개의 링커가 필요하다. 이용되는 링커는, 동일한 종류의 것이어도 상이한 종류의 것이어도 된다.
Fab, F(ab')
2
, 및 Fab'
"Fab"는, 1개의 경쇄, 및 1개의 중쇄의 CH1 도메인 및 가변 영역으로 이루어진다. Fab 분자의 중쇄는, 다른 중쇄 분자와 다이설파이드 결합을 형성할 수 없다.
"F(ab')2" 또는 "Fab"는, 펩신 및 파파인 등의 프로테아제로 면역글로불린(모노클로날 항체)을 처리하는 것에 의해 제조되고, 면역글로불린(모노클로날 항체)을 2개의 각 H쇄의 힌지 영역 사이에 존재하는 다이설파이드 결합의 근방에서 소화하는 것에 의해 생성되는 항체 단편을 가리킨다. 예를 들어 파파인은, 2개의 각 H쇄의 힌지 영역 사이에 존재하는 다이설파이드 결합의 IgG 상류에서 절단하여, VL(L쇄 가변 영역) 및 CL(L쇄 정상 영역)을 포함하는 L쇄가 VH(H쇄 가변 영역) 및 CHγ1(H쇄 정상 영역 중의 γ1 영역)을 포함하는 H쇄 단편에 그의 C말단 영역에서 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는, 상동인 2개의 항체 단편을 생성한다. 이들 2개의 상동인 항체 단편은 각각 Fab'라고 부른다.
"F(ab')2"는, 2개의 경쇄, 및 다이설파이드 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성되도록 CH1 도메인 및 CH2 도메인의 일부분의 정상 영역을 포함하는 2개의 중쇄로 이루어진다. 본 명세서에 있어서 개시되는 F(ab')2는, 다음과 같이 적합하게 제조할 수 있다. 소망의 항원 결합 부위를 포함하는 모노클로날 전부 항체 등을, 펩신 등의 프로테아제로 부분 소화하고, Fc 단편을 프로틴 A 컬럼에 흡착시키는 것에 의해 제거한다. 프로테아제는, pH 등의 적절한 설정 효소의 반응 조건하에서 선택적으로 F(ab')2를 가져오도록 전부 항체를 절단할 수 있는 것인 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 이와 같은 프로테아제에는 펩신 및 피신이 포함된다.
싱글 도메인 항체
본 명세서에 있어서, 용어 "싱글 도메인 항체"는, 해당 도메인이 그 단독으로 항원 결합 활성을 발휘할 수 있는 한, 그 구조에 의해 한정되지 않는다. 일반적인 항체, 예를 들어 IgG 항체가, 가변 영역이 VH과 VL의 페어링에 의해 형성되고 있는 상태에서 항원 결합 활성을 나타내는 데 반해, 싱글 도메인 항체의 그 자체의 도메인 구조는, 다른 도메인과의 페어링 없이 그 단독으로 항원 결합 활성을 발휘할 수 있음이 공지되어 있다. 통상, 싱글 도메인 항체는, 비교적 낮은 분자량을 갖고, 단량체의 형태로 존재한다.
싱글 도메인 항체의 예로서는, 이들로 한정되지 않지만, 경쇄를 천연에서 결여하고 있는 낙타과의 동물의 VHH 및 상어의 VNAR 등의 항원 결합 분자, 및 항체 VH 도메인의 전체 혹은 일부 또는 항체 VL 도메인의 전체 혹은 일부를 함유하는 항체 단편을 들 수 있다. 항체 VH 도메인 또는 항체 VL 도메인의 전체 또는 일부를 함유하는 항체 단편인 싱글 도메인 항체의 예로서는, 이들로 한정되지 않지만, 미국 특허 제6,248,516 B1호 등에 기재되어 있는 바와 같은 인간 항체 VH 또는 인간 항체 VL을 기원으로 하는, 인공적으로 조제한 싱글 도메인 항체를 들 수 있다. 본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 1개의 싱글 도메인 항체는, 3종류의 CDR(CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 갖는다.
싱글 도메인 항체는, 싱글 도메인 항체를 산생할 수 있는 동물로부터, 또는 싱글 도메인 항체를 산생할 수 있는 동물의 면역화에 의해, 얻을 수 있다. 싱글 도메인 항체를 산생할 수 있는 동물의 예로서는, 이들로 한정되지 않지만, 낙타과의 동물, 및 싱글 도메인 항체를 산생시킬 수 있는 유전자를 보유하는 트랜스제닉 동물을 들 수 있다. 낙타과의 동물에는, 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타, 및 과나코 등이 포함된다. 싱글 도메인 항체를 산생시킬 수 있는 유전자가 도입되어 있는 트랜스제닉 동물의 예로서는, 이들로 한정되지 않지만, 국제 공보 제WO2015/143414호, 또는 미국 특허 공보 제US2011/0123527 A1호에 기재된 트랜스제닉 동물을 들 수 있다. 해당 동물로부터 얻어진 싱글 도메인 항체의 프레임워크 서열은, 인간화 싱글 도메인 항체를 얻기 위해, 인간 생식 계열 서열 또는 그와 유사한 서열로 변환시켜도 된다. 인간화 싱글 도메인 항체(예를 들어, 인간화 VHH)도 또한, 본 발명의 싱글 도메인 항체의 일 태양이다.
혹은, 싱글 도메인 항체는, 싱글 도메인 항체를 함유하는 폴리펩티드 라이브러리로부터 ELISA 및 패닝 등에 의해 얻을 수 있다. 싱글 도메인 항체를 함유하는 폴리펩티드 라이브러리의 예로서는, 이들로 한정되지 않지만, 여러 가지 동물 또는 인간으로부터 얻어진 나이브 항체 라이브러리(예를 들어, Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78) 및 Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764:8 (1307-1319)), 여러 가지 동물의 면역화에 의해 얻어진 항체 라이브러리(예를 들어, Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536)), 및 여러 가지 동물 또는 인간의 항체 유전자로부터 조제한 합성 항체 라이브러리(예를 들어, Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1 (35-43), Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657), 및 AIDS 2016 30:11 (1691-1701))를 들 수 있다.
Fc 영역
본 발명에 있어서, 용어 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은, 항체 분자 중의, 힌지 또는 그 일부, 및 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어지는 단편을 포함하는 영역을 가리킨다. IgG 클래스의 Fc 영역은, 예를 들어, 시스테인 226(EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU 인덱스라고도 한다))으로부터 C말단까지, 또는 프롤린 230(EU 넘버링)으로부터 C말단까지의 영역을 의미하지만, 그에 한정되지 않는다. Fc 영역은, 바람직하게는, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 모노클로날 항체를, 펩신 등의 단백질 분해 효소로 부분 소화한 후에, 프로틴 A 컬럼 또는 프로틴 G 컬럼에 흡착된 획분을 재용출하는 것에 의해 취득할 수 있다. 그와 같은 단백질 분해 효소는, 적절히 설정되는 효소의 반응 조건(예를 들어, pH)하에서 제한적으로 Fab 또는 F(ab')2를 형성하도록 전장 항체를 소화할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 그 예에는, 펩신 및 파파인이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 예를 들어, 천연형 IgG에서 유래하는 Fc 영역을, 본 발명의 "Fc 영역"으로서 이용할 수 있다. 여기에서, 천연형 IgG란, 천연에 발견되는 IgG와 동일한 아미노산 서열을 함유하고, 면역글로불린 γ 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩티드를 의미한다. 천연형 인간 IgG란, 예를 들어, 천연형 인간 IgG1, 천연형 인간 IgG2, 천연형 인간 IgG3, 또는 천연형 인간 IgG4를 의미한다. 천연형 IgG에는 또한, 자연 발생적으로 그것에서 유래하는 배리언트 등도 포함된다. 유전자다형에 기초하는 복수의 알로타입 서열이, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 및 인간 IgG4 항체의 정상 영역으로서 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242에 기재되어 있고, 그들은 모두, 본 발명에 있어서 이용할 수 있다. 특히, 인간 IgG1의 서열은, EU 넘버링 356 내지 358위의 아미노산 서열로서 DEL 또는 EEM을 가져도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드쇄로 이루어진다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은, 그의 각 서브유닛이 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 정상 도메인을 포함하는, 이량체이다. Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 상호 안정적으로 회합할 수 있다. 하나의 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, 1개 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
본 명세서에 있어서 기재되는 하나의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 다른 태양에 있어서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 더한 특정의 태양에 있어서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 영역이다.
어느 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, 안정된 회합이 가능한 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛으로 구성되고, 또한 Fc 도메인은, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 친화성을 나타낸다.
어느 특정의 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 회합을 촉진하는 개변을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 해당 개변은, Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 한쪽에 "노브(knob)"개변 및 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 다른 쪽에 "홀(hole)" 개변을 포함하는, 이른바 "노브-인투-홀(knob-into-hole)" 개변이며, 이하에 있어서 보다 상세히 기재된다.
특정의 태양에 있어서, 안정된 회합이 가능한 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛으로 구성되고, 또한 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 친화성을 나타내는, Fc 도메인에 있어서, 제 1 Fc 영역 서브유닛은, 이하로 이루어지는 군으로부터 선택되고:
(a1) 변이 L234A, L235A를 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드;
(a2) 변이 L234A, L235A, N297A를 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드;
(a3) 변이 L234A, L235A, N297A, S354C, T366W를 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드,
제 2 Fc 영역 폴리펩티드는, 이하로 이루어지는 군으로부터 선택된다(아미노산 위치는 EU 인덱스 넘버링을 이용하여 넘버링된다):
(a4) 변이 L234A, L235A를 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드;
(a5) 변이 L234A, L235A, N297A를 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드; 및
(a6) 변이 L234A, L235A, N297A, Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하는 Fc 영역 폴리펩티드.
어느 특정의 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, 천연형 IgG의 Fc 영역의 것과 비교하여 산성 pH 조건(예를 들어, pH 5.8) 하에서 증강된 FcRn 결합 활성을 나타낸다. 그와 같은 Fc 도메인은, 예를 들어, EU 넘버링에 의한, 434위에 Ala; 438위에 Glu, Arg, Ser, 또는 Lys; 및 440위에 Glu, Asp, 또는 Gln를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, Fc 도메인은, EU 넘버링에 의한, 434위에 Ala; 438위에 Arg 또는 Lys; 및 440위에 Glu 또는 Asp를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, Fc 도메인은, EU 넘버링에 의한, 428위에 Ile 혹은 Leu; 및/또는 436위에 Ile, Leu, Val, Thr, 혹은 Phe를 추가로 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, Fc 도메인은, EU 넘버링에 의한, 이하로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다:
(a) N434A/Q438R/S440E;
(b) N434A/Q438R/S440D;
(c) N434A/Q438K/S440E;
(d) N434A/Q438K/S440D;
(e) N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(f) N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(g) N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(h) N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(i) N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(j) N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(k) N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(l) N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(m) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E;
(n) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D;
(o) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E;
(p) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D;
(q) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E;
(r) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D;
(s) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E;
(t) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D;
(u) M428L/N434A/Q438R/S440E;
(v) M428L/N434A/Q438R/S440D;
(w) M428L/N434A/Q438K/S440E;
(x) M428L/N434A/Q438K/S440D;
(y) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(z) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(aa) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(ab) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(ac) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(ad) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(ae) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(af) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(ag) L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E; 및
(ah) L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, M428L/N434A/Q438R/S440E의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, Fc 도메인은, IgG Fc 도메인, 바람직하게는 인간 IgG Fc 도메인, 보다 바람직하게는 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 어느 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, 이하: (a) 서열 번호: 100에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 Fc 서브유닛 및 서열 번호: 111에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 2 Fc 서브유닛; 및 (b) 서열 번호: 99에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 Fc 서브유닛 및 서열 번호: 109에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 2 Fc 서브유닛의 어느 하나를 포함한다.
저하된 Fcγ 수용체 결합 활성을 갖는 Fc 영역
본 명세서에 있어서, "저하된 Fcγ 수용체 결합 활성"은, 예를 들어, 상기의 분석 방법에 기초하여, 시험 항원 결합 분자 또는 항체의 경합 활성이, 대조 항원 결합 분자 또는 항체의 경합 활성과 비교하여 50% 이하, 바람직하게는 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 또는 15% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하인 것을 의미한다.
모노클로날 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체는, 대조 항원 결합 분자 또는 항체로서 적절히 이용할 수 있다. Fc 도메인 구조는, 서열 번호: 85(A가 RefSeq 억세션 번호 AAC82527.1의 N말단에 부가된다), 서열 번호: 86(A가 RefSeq 억세션 번호 AAB59393.1의 N말단에 부가된다), 서열 번호: 87(A가 RefSeq 억세션 번호 CAA27268.1의 N말단에 부가된다), 및 서열 번호: 88(A가 RefSeq 억세션 번호 AAB59394.1의 N말단에 부가된다)에 나타난다. 더욱이, 특정의 아이소타입의 항체의 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체가 시험 물질로서 이용되는 경우, Fcγ 수용체 결합 활성에 대한 변이체의 변이의 작용은, 동일한 아이소타입의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체를 대조로서 이용하여 평가된다. 상기에 기재되는 바와 같이, 그 Fcγ 수용체 결합 활성이 저하하고 있다고 판단되고 있는 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체가 적절히 조제된다.
그와 같은 공지된 변이체에는, 예를 들어, 아미노산 231A 내지 238S(EU 넘버링)의 결실을 갖는 변이체(WO 2009/011941), 및 변이체 C226S, C229S, P238S, (C220S)(J. Rheumatol (2007) 34, 11); C226S 및 C229S(Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54); C226S, C229S, E233P, L234V, 및 L235A(Blood (2007) 109, 1185-1192)가 포함된다.
구체적으로는, 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 특정의 아이소타입의 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서, 이하의 아미노산 위치: 220위, 226위, 229위, 231위, 232위, 233위, 234위, 235위, 236위, 237위, 238위, 239위, 240위, 264위, 265위, 266위, 267위, 269위, 270위, 295위, 296위, 297위, 298위, 299위, 300위, 325위, 327위, 328위, 329위, 330위, 331위, 또는 332위(EU 넘버링)로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산의 변이(예를 들어, 치환)를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 것이 포함된다. Fc 도메인의 기원인 항체의 아이소타입은, 특별히 한정되지 않고, 모노클로날 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체에서 유래하는 적절한 Fc 도메인을 이용하는 것이 가능하다. IgG1 항체에서 유래하는 Fc 도메인을 이용하는 것이 바람직하다.
바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 예를 들어, 그 위치가, IgG1 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 EU 넘버링에 의해 지정되어 있는(각 숫자가 EU 넘버링에서의 아미노산 잔기의 위치를 나타내고; 또한 숫자 앞에 있는 1문자 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 나타내고, 숫자 뒤에 있는 1문자 아미노산 기호가 치환 후의 아미노산 잔기를 나타낸다), 이하에 나타내는 치환 중 어느 하나:
(a) L234F, L235E, P331S;
(b) C226S, C229S, P238S;
(c) C226S, C229S; 또는
(d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A
를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 것, 및 231위 내지 238위에 있는 아미노산 서열의 결실을 갖는 Fc 도메인을 갖는 것이 포함된다.
더욱이, 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 그 위치가, IgG2 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 EU 넘버링에 의해 지정되어 있는, 이하에 나타내는 치환 중 어느 하나:
(e) H268Q, V309L, A330S, 및 P331S;
(f) V234A;
(g) G237A;
(h) V234A 및 G237A;
(i) A235E 및 G237A; 또는
(j) V234A, A235E, 및 G237A
를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 것도 포함된다. 각 숫자는, EU 넘버링에서의 아미노산 잔기의 위치를 나타내고; 또한 숫자 앞에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 전의 아미노산 잔기를 나타내고, 숫자 뒤에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 후의 아미노산 잔기를 나타낸다.
더욱이, 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 그 위치가, IgG3 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 EU 넘버링에 의해 지정되어 있는, 이하에 나타내는 치환 중 어느 하나:
(k) F241A;
(l) D265A; 또는
(m) V264A
를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 것도 포함된다. 각 숫자는, EU 넘버링에서의 아미노산 잔기의 위치를 나타내고; 또한 숫자 앞에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 전의 아미노산 잔기를 나타내고, 숫자 뒤에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 후의 아미노산 잔기를 나타낸다.
더욱이, 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 그 위치가, IgG4 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 EU 넘버링에 의해 지정되어 있는, 이하에 나타내는 치환 중 어느 하나:
(n) L235A, G237A, 및 E318A;
(o) L235E; 또는
(p) F234A 및 L235A
를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 것도 포함된다. 각 숫자는, EU 넘버링에서의 아미노산 잔기의 위치를 나타내고; 또한 숫자 앞에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 전의 아미노산 잔기를 나타내고, 숫자 뒤에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 후의 아미노산 잔기를 나타낸다.
다른 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 예를 들어, IgG1 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 233위, 234위, 235위, 236위, 237위, 327위, 330위, 또는 331위(EU 넘버링)에 있는 임의의 아미노산이, 대응하는 IgG2 또는 IgG4에 있어서의 대응하는 EU 넘버링에서의 위치의 아미노산으로 치환되어 있는 Fc 도메인을 포함하는 것이 포함된다.
바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 예를 들어, IgG1 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 234위, 235위, 및 297위(EU 넘버링)에 있는 아미노산의 어느 1개 또는 복수가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 Fc 도메인을 포함하는 것도 포함된다. 치환 후의 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않는다; 그렇지만, 234위, 235위, 및 297위에 있는 아미노산의 어느 1개 또는 복수가 알라닌으로 치환되어 있는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체가 특히 바람직하다.
바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 예를 들어, IgG1 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 265위(EU 넘버링)에 있는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있는 Fc 도메인을 포함하는 것도 포함된다. 치환 후의 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않는다; 그렇지만, 265위에 있는 아미노산이 알라닌으로 치환되어 있는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체가 특히 바람직하다.
Fc 수용체
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은, 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 가리킨다. 몇몇 태양에 있어서, FcR은, 천연형 인간 FcR이다. 몇몇 태양에 있어서, FcR은, IgG 항체(γ 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를, 이들 수용체의 알렐 배리언트 및 선택적 스플라이싱에 의한 형태를 포함하여, 포함한다. FcγRII 수용체는, FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 그 세포질 도메인에 있어서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는, 그 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB는, 그 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 저해 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM)를 포함한다. (예를 들어, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) 참조). FcR은, 예를 들어 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)에 총설되어 있다. 장래 동정될 것을 포함하는 다른 FcR도, 본 명세서의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한, 모체의 IgG의 태아로의 이동(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 면역글로불린의 항상성을 조절하는 역할을 담담하는, 신생아형 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn으로의 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다(예를 들어, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.)을 참조할 것).
인비보로의 인간 FcRn으로의 결합 및 인간 FcRn 고친화성 결합 폴리펩티드의 혈장 반감기는, 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 트랜스펙트된 인간 세포주에 있어서 또는 배리언트 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드가 투여된 영장류에 있어서 측정될 수 있다. WO 2000/42072(Presta)는, FcR에 대한 결합이 증가 또는 감소된 항체 배리언트를 기재하고 있다. 예를 들어 Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)도 참조할 것.
Fcγ 수용체
Fcγ 수용체는, 모노클로날 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있는 수용체를 가리키고, 이것에는 Fcγ 수용체 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 단백질 패밀리에 속하는 모든 멤버가 포함된다. 인간에 있어서, 이 패밀리에는, 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함한다), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함한다), 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함한다)를 포함하는 FcγRIII (CD16); 및 미동정된 인간 Fcγ 수용체, Fcγ 수용체 아이소폼, 및 그의 알로타입의 모두가 포함된다. 그러나, Fcγ 수용체는 이들 예로 한정되지 않는다. Fcγ 수용체에는, 이들로 한정되지 않지만, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이에서 유래하는 것이 포함된다. Fcγ 수용체는 임의의 생물에서 유래해도 된다. 마우스 Fcγ 수용체에는, 이들로 한정되지 않지만, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16), 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및 미동정된 마우스 Fcγ 수용체, Fcγ 수용체 아이소폼, 및 그의 알로타입의 모두가 포함된다. 그와 같은 바람직한 Fcγ 수용체에는, 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16), 및/또는 FcγRIIIB(CD16)가 포함된다. FcγRI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 RefSeq 등록 번호 NM_000566.3 및 RefSeq 등록 번호 NP_000557.1에 나타나고; FcγRIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 RefSeq 등록 번호 BC020823.1 및 RefSeq 등록 번호 AAH20823.1에 나타나고; FcγRIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 RefSeq 등록 번호 BC146678.1 및 RefSeq 등록 번호 AAI46679.1에 나타나고; FcγRIIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 RefSeq 등록 번호 BC033678.1 및 RefSeq 등록 번호 AAH33678.1에 나타나고; FcγRIIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 RefSeq 등록 번호 BC128562.1 및 RefSeq 등록 번호 AAI28563.1에 나타난다. Fcγ 수용체가 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 모노클로날 항체의 Fc 도메인에 대한 결합 활성을 갖는지 여부는, 상기의 FACS 및 ELISA 포맷에 더하여, ALPHA 스크린(증폭 발광 근접 호모지니어스 어세이), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 베이스의 BIACORE법, 및 그 외에 의해 평가할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010).
그 한편으로, "Fc 리간드" 또는 "이펙터 리간드"는, 항체 Fc 도메인에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 가리킨다. 해당 분자는 임의의 생물에서 유래해도 된다. Fc 리간드의 Fc로의 결합은, 바람직하게는 하나 이상의 이펙터 기능을 유도한다. 이와 같은 Fc 리간드에는, Fc 수용체, Fcγ 수용체, Fcα 수용체, Fcβ 수용체, FcRn, C1q, 및 C3, 만난 결합 렉틴, 만노스 수용체, 포도상구균(Staphylococcus) 프로틴 A, 포도상구균 프로틴 G, 및 바이러스성 Fcγ 수용체가 포함되지만 그들로 한정되지 않는다. 또한, Fc 리간드에는, Fcγ 수용체와 상동인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 상동체(FcRH)(Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136)도 포함된다. 또한, Fc 리간드에는, Fc에 결합하는 미동정된 분자도 포함된다.
Fcγ 수용체 결합 활성
FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, 및/또는 FcγRIIIB의 어느 Fcγ 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 활성이 손상되어 있음은, 상기의 FACS 및 ELISA 포맷, 및 ALPHA 스크린(증폭 발광 근접 호모지니어스 어세이) 및 표면 플라즈몬 공명(SPR) 베이스의 BIACORE법을 이용하는 것에 의해 평가할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은, 2종류의 비즈, 즉 도너 비즈 및 억셉터 비즈를 이용하는, 하기의 원리에 기초한 ALPHA 기술에 의해 실시된다. 도너 비즈에 연결된 분자가 억셉터 비즈에 연결된 분자와 생물학적으로 상호작용하고, 또한 2개의 비즈가 근접하여 위치하는 경우에만, 발광 시그널이 검출된다. 도너 비즈 내의 광증감제는, 레이저광에 의해 여기되어, 비즈 주변의 산소를 여기 상태의 일중항 산소로 변환한다. 일중항 산소가 도너 비즈 주변으로 확산하고, 근접하여 위치하는 억셉터 비즈에 도달하면, 억셉터 비즈 내의 화학 발광 반응이 유도된다. 이 반응에 의해 최종적으로 광이 방출된다. 도너 비즈에 연결된 분자가 억셉터 비즈에 연결된 분자와 상호작용하지 않으면, 도너 비즈에 의해 생성되는 일중항 산소는 억셉터 비즈에 도달하지 않아, 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들어, 비오틴 표지된 항원 결합 분자 또는 항체를 도너 비즈에 고정화하고, 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST)로 태그 붙여진 Fcγ 수용체를 억셉터 비즈에 고정화한다. 경합적 변이 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체의 비존재하에서는, Fcγ 수용체는, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체와 상호작용하여, 그 결과 520 내지 620nm의 시그널을 유도한다. 태그 붙여져 있지 않은 변이 Fc 도메인을 갖는 항원 결합 분자 또는 항체는, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체와, Fcγ 수용체와의 상호작용에 관하여 경합한다. 경합의 결과로서의 형광의 감소를 정량화하는 것에 의해, 상대적 결합 친화성을 결정할 수 있다. 설포-NHS-비오틴 등을 이용하여 항체 등의 항원 결합 분자 또는 항체를 비오틴화하는 방법은 공지되어 있다. GST 태그를 Fcγ 수용체에 부가하는 적절한 방법에는, Fcγ 수용체를 코딩하는 폴리펩티드와 GST를 코딩하는 폴리펩티드를 인프레임으로 융합하고, 해당 융합된 유전자를 보유하는 벡터가 도입된 세포를 이용하여 해당 융합된 유전자를 발현시키고, 그 후 글루타티온 컬럼을 이용하여 정제하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 유도된 시그널은 바람직하게는, 예를 들어, GRAPHPAD PRISM(GraphPad; San Diego) 등의 소프트웨어를 이용하여 비선형 회귀 해석에 기초하는 일부위 경합 모델에 적합시키는 것에 의해, 해석할 수 있다.
상호작용을 관찰하기 위한 물질 중 한쪽을, 리간드로서 센서 칩의 금 박막 상에 고정화한다. 금 박막과 유리의 경계면에서 전반사가 일어나도록 센서 칩의 이면(裏面)으로부터 광을 쪼이면, 어느 특정의 부위에 있어서 반사광의 강도가 부분적으로 저하된다(SPR 시그널). 상호작용을 관찰하기 위한 다른 쪽의 물질을, 분석물로서 센서 칩의 표면 상에 주입한다. 분석물이 리간드에 결합하면, 고정화 리간드 분자의 질량이 증가한다. 이것에 의해, 센서 칩 표면 상의 용매의 굴절률이 변화된다. 굴절률의 변화는, SPR 시그널의 위치의 시프트를 야기한다(반대로, 해리되면 시그널은 원래의 위치로 시프트하여 되돌아간다). Biacore 시스템에서는, 상기 시프트의 양(즉, 센서 칩 표면 상의 질량 변화)를 세로축에 플롯하고, 이와 같이 하여 경시적인 질량의 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램의 곡선으로부터 동태 파라미터(회합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd))가 결정되고, 이들 2개의 상수의 비율로부터 친화성(KD)이 결정된다. BIACORE법에서는, 저해 어세이가 바람직하게 이용된다. 이와 같은 저해 어세이의 예는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010에 기재되어 있다.
다중 특이성 항체의 산생 및 정제
본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, 양쪽이 CD3 및 CD137에 결합할 수 있는, 상이한 결합 특이성을 갖는 2종류의 항원 결합 부분(예를 들어, "제 1 항원 결합 부분" 및 "제 2 항원 결합 부분")과, 다른 항원에 결합할 수 있는 "제 3 항원 결합 부분"을 포함하고, 그 각각이 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 한쪽 또는 다른 쪽에 최종적으로 융합되고, 따라서, Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 전형적으로는, 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드쇄에 포함된다. 이들 폴리펩티드의 재조합 동시 발현 및 계속된 이량체화는, 2개의 폴리펩티드의 복수의 조합의 가능성을 가져온다. 따라서, 재조합 산생에 있어서의 다중 특이성 항원 결합 분자의 수량 및 순도를 개선하기 위해서, 원하는 폴리펩티드의 회합을 촉진하는 개변을 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인 중에 도입하는 것은 유리해진다.
따라서, 특정의 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, Fc 도메인의 제 1 서브유닛과 제 2 서브유닛의 회합을 촉진하는 개변을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 서브유닛 사이에서의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는, Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다. 따라서, 하나의 태양에 있어서, 해당 개변은 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다.
특정의 태양에 있어서, 해당 개변은, Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 한쪽에 있어서의 "노브" 개변과, Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 다른 쪽에 있어서의 "홀" 개변을 포함하는, 이른바 "노브-인투-홀" 개변이다.
노브-인투-홀 기술은, 예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호; 미국 특허 제7,695,936호; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996); 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은, 돌기("노브")가 공극("홀") 중에 위치하여, 헤테로이량체 형성을 촉진하고 호모이량체 형성을 방해할 수 있도록, 돌기를 제 1 폴리펩티드의 계면에, 및 대응하는 공극을 제 2 폴리펩티드의 계면에 도입하는 단계를 갖는다. 돌기는 제 1 폴리펩티드의 계면의 작은 아미노산 측쇄를, 보다 큰 측쇄(예컨대 티로신 또는 트립토판)로 치환하는 것에 의해 구축된다. 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상적인 공극은, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예컨대 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환하는 것에 의해 제 2 폴리펩티드의 계면에 만들어진다.
따라서, 특정의 태양에 있어서는, 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에 있어서, 아미노산 잔기는, 보다 큰 측쇄 체적을 갖는 아미노산 잔기로 치환되고, 이것에 의해, 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 공극 중에 위치할 수 있는 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌기가 생성되고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에 있어서, 아미노산 잔기는, 보다 작은 측쇄 체적을 갖는 아미노산 잔기로 치환되고, 이것에 의해 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌기가 위치할 수 있는 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 공극이 생성된다.
돌기 및 공극은, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 예를 들어 부위 특이적 변이유발에 의해 변경하는 것에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해, 만들 수 있다.
특정의 태양에 있어서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에 있어서, 366위의 트레오닌 잔기는 트립토판 잔기로 치환되고(T366W), Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에 있어서 407위의 티로신 잔기는 발린 잔기로 치환된다(Y407V). 하나의 태양에 있어서, Fc 도메인의 제 2 서브유닛에 있어서 366위의 트레오닌 잔기는 세린 잔기로 치환되고(T366S) 368위의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다(L368A).
또 다른 태양에 있어서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛에 있어서, 추가로, 354위의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 치환되고(S354C), Fc 도메인의 제 2 서브유닛에 있어서 추가로, 349위의 티로신 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다(Y349C). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은, Fc 도메인의 2개의 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 가져와, 이량체를 더욱 안정화한다(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
다른 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자에는, 소망의 조합을 갖는 H쇄 사이 및 L쇄와 H쇄 사이의 회합을 촉진하는 다른 기술을 적용할 수 있다.
예를 들어, 다중 특이성 항체 회합에는, 항체 H쇄의 제 2 정상 영역 또는 제 3 정상 영역(CH2 또는 CH3)의 계면에 정전기적 반발을 도입하는 것에 의해 의도되지 않은 H쇄 회합을 억제하는 기술을 적용할 수 있다(WO2006/106905).
CH2 또는 CH3의 계면에 정전기적 반발을 도입하는 것에 의해 의도되지 않은 H쇄 회합을 억제하는 기술에 있어서, H쇄의 다른 쪽의 정상 영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기의 예에는, CH3 영역에 있어서의 EU 넘버링 356위, 439위, 357위, 370위, 399위, 및 409위의 잔기에 대응하는 영역이 포함된다.
보다 구체적으로는, 2종의 H쇄 CH3 영역을 포함하는 항체로서, 제 1의 H쇄 CH3 영역에 있어서의, 이하의 (1) 내지 (3)에 나타내는 아미노산 잔기의 쌍으로부터 선택되는 1 내지 3쌍의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 항체를, 예로서 들 수 있다: (1) H쇄 CH3 영역에 함유되는, EU 넘버링 356위 및 439위의 아미노산 잔기; (2) H쇄 CH3 영역에 함유되는, EU 넘버링 357위 및 370위의 아미노산 잔기; 및 (3) H쇄 CH3 영역에 함유되는, EU 넘버링 399위 및 409위의 아미노산 잔기.
더욱이, 해당 항체는, 상기 제 1의 H쇄 CH3 영역과는 상이한 제 2의 H쇄 CH3 영역에 있어서의 아미노산 잔기의 쌍이, 상기 (1) 내지 (3)의 아미노산 잔기의 쌍으로부터 선택되고, 상기 제 1의 H쇄 CH3 영역에 있어서 동종의 전하를 갖는 상기 (1) 내지 (3)의 아미노산 잔기의 쌍에 대응하는 1 내지 3쌍의 아미노산 잔기가, 상기 제 1의 H쇄 CH3 영역에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 항체여도 된다.
상기 (1) 내지 (3)에 나타나는 각각의 아미노산 잔기는, 회합할 때에 서로 근접하고 있다. 당업자라면, 소망의 H쇄 CH3 영역 또는 H쇄 정상 영역에 있어서, 시판되는 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 상기 (1) 내지 (3)의 아미노산 잔기에 대응하는 위치를 발견할 수 있고, 적절히, 그 위치의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
상기 항체에 있어서, "전하를 갖는 아미노산 잔기"는, 예를 들어, 이하의 군(a) 및 (b)의 어느 하나에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다:
(a) 글루탐산(E) 및 아스파르트산(D); 및
(b) 리신(K), 아르기닌(R), 및 히스티딘(H).
상기 항체에 있어서, 어구 "동일한 전하를 갖는"이란, 예를 들어, 2개 이상의 아미노산 잔기의 모두가, 상기의 군(a) 및 (b) 중 어느 하나에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것을 의미한다. 어구 "반대의 전하를 갖는"이란, 예를 들어, 2개 이상의 아미노산 잔기 중의 적어도 1개의 아미노산 잔기가, 상기의 군(a) 및 (b) 중 어느 하나에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 경우에, 나머지의 아미노산 잔기가, 다른 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것을 의미한다.
바람직한 태양에 있어서 상기 항체는, 그 제 1의 H쇄 CH3 영역과 제 2의 H쇄 CH3 영역이 다이설파이드 결합에 의해 가교되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서, 개변에 제공되는 아미노산 잔기는, 전술한 항체 가변 영역 또는 항체 정상 영역의 아미노산 잔기로 한정되지 않는다. 당업자라면, 변이 폴리펩티드 또는 헤테로다량체에 있어서, 시판되는 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 동정할 수 있고; 그 다음에 이들 위치의 아미노산 잔기를, 회합을 제어하도록 개변에 제공하는 것이 가능하다.
추가로, 본 발명의 다중 특이성 항체의 형성에는 다른 공지된 기술이 이용되어도 된다. 항체의 한쪽의 H쇄 CH3의 일부를 대응하는 IgA 유래의 서열로 변환하고, 대응하는 IgA 유래의 서열을 다른 쪽의 H쇄 CH3의 상보적인 부분에 도입하는 것에 의해 생성된 쇄 교환 조작 도메인 CH3(strand-exchange engineered domain CH3)을 이용하여, 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드의 회합을 CH3의 상보적인 회합에 의해 효율적으로 유도할 수 있다(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). 이 공지 기술을 이용하여 효율적으로 목적하는 다중 특이성 항체를 형성시킬 수도 있다.
더욱이, 다중 특이성 항체의 형성에는, WO2011/028952, WO2014/018572, 및 Nat Biotechnol. 2014 Feb; 32(2):191-8에 기재되어 있는 바와 같은 항체의 CH1과 CL 회합 및 VH와 VL 회합을 이용한 항체 제조 기술; WO2008/119353 및 WO2011/131746에 기재되어 있는 바와 같은 따로따로 조제된 모노클로날 항체를 조합하여 사용하여 이중 특이성 항체를 제조하는 기술(Fab Arm Exchange); WO2012/058768 및 WO2013/063702에 기재되어 있는 바와 같은 항체 중쇄 CH3 사이의 회합을 제어하는 기술; WO2012/023053에 기재되어 있는 바와 같은 2종류의 경쇄와 1종류의 중쇄로 구성되는 다중 특이성 항체를 제조하는 기술; 또는 Christoph et al. (Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013))에 기재되어 있는 바와 같은 1개의 H쇄와 1개의 L쇄를 포함하는 항체의 한쪽 쇄를 각각 발현하는 2개의 세균 세포주를 이용한 다중 특이성 항체를 제조하는 기술 등을 이용해도 된다.
혹은, 목적하는 다중 특이성 항원 결합 분자를 효율적으로 형성시킬 수 없는 경우에도, 산생된 항체로부터 목적하는 다중 특이성 항원 결합 분자를 분리하고 정제하는 것에 의해, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자를 얻는 것이 가능하다. 예를 들어, 2종류의 H쇄의 가변 영역에 아미노산 치환을 도입하는 것에 의해 등전점의 차를 부여함으로써, 2종류의 호모체와 목적하는 헤테로 항체를 이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 것을 가능하게 하는 방법이 보고되어 있다(WO2007114325). 헤테로 항체를 정제하는 방법으로서, 이제까지, 프로틴 A에 결합하는 마우스 IgG2a의 H쇄와 프로틴 A에 결합하지 않는 래트 IgG2b의 H쇄를 포함하는 헤테로이량체화 항체를, 프로틴 A를 이용하여 정제하는 방법이 보고되어 있다(WO98050431 및 WO95033844). 더욱이, IgG와 프로틴 A의 결합 부위인 EU 넘버링 435위 및 436위의 아미노산 잔기를, 상이한 프로틴 A 친화성을 가져오는 아미노산인 Tyr 및 His 등으로 치환한 H쇄를 이용하여, 혹은 상이한 프로틴 A 친화성을 갖는 H쇄를 이용하여, 각 H쇄와 프로틴 A의 상호작용을 변화시키고, 그 다음에 프로틴 A 컬럼을 이용하는 것에 의해, 헤테로이량체화 항체만을 효율적으로 정제할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 Fc 영역으로서, Fc 영역의 C말단의 불균질성(heterogeneity)이 개선된 Fc 영역이 적절히 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 유래의 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 의해 특정되는 446위의 글리신 및 447위의 리신을 결실시키는 것에 의해 산생된 Fc 영역을 제공한다.
본 명세서에 있어서 기재되는 바와 같이 조제된 다중 특이성 항원 결합 분자는, 예를 들어 고속 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 및 사이즈 배제 크로마토그래피 등의 당해 기술 분야에 있어서 공지된 기술에 의해 정제되어도 된다. 특정의 단백질을 정제하기 위해 이용되는 실제 조건은, 알짜 전하, 소수성, 친수성 등의 인자에 일부 의존하고, 당업자에게 명백하다. 친화성 크로마토그래피 정제에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자가 결합하는, 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자의 친화성 크로마토그래피 정제에서는, 프로틴 A 또는 프로틴 G를 갖는 매트릭스를 이용해도 된다. 다중 특이성 항원 결합 분자를 단리하기 위해, 연속된 프로틴 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 다중 특이성 항원 결합 분자의 순도는, 겔 전기영동 및 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하는, 다양한 공지된 분석 방법의 어느 것인가에 의해 결정할 수 있다.
항체 의존성 세포 매개성 세포 상해
"항체 의존성 세포 매개성 세포 상해" 또는 "ADCC"는, 분비된 Ig가 특정의 세포 상해성 세포(예를 들어 NK 세포, 호중구, 및 매크로파지) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcRs)에 결합하고 그것에 의해 이들 세포 상해성 이펙터 세포가 항원을 갖는 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있고 그리고 그 후에 그 표적 세포를 세포독소에 의해 살상할 수 있게 되는, 세포 상해의 일 형태를 가리킨다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는, FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR의 발현은, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)의 제464면의 표 3에 정리되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 인비트로 ADCC 측정법, 예를 들어 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호 또는 미국 특허 제6,737,056호(Presta)에 기재된 것을 실시할 수 있다. 이와 같은 측정법에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 혹은, 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어 Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)에 개시되는 동물 모델과 같은 동물 모델에 있어서, 인비보로 평가할 수 있다.
보체 의존성 세포 상해
"보체 의존성 세포 상해" 또는 "CDC"는, 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 가리킨다. 고전적 보체 경로의 활성화는, (적절한 서브클래스의) 항체(대응하는 항원에 결합하고 있는)로의 보체계의 제 1 요소(C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)에 기재된 CDC 측정법이 실시될 수 있다. 개변된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 배리언트(배리언트 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가 또는 감소된 C1q 결합능은, 예를 들어 미국 특허 제6,194,551 B1호 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 예를 들어 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)도 참조할 것.
T 세포 의존성 세포 상해
"T 세포 의존성 세포 상해" 또는 "TDCC"는, 표적 세포에 대한 세포 상해가 T 세포에 의해 유도되도록, 항원 결합 분자가, 표적 세포 상에 발현하고 있는 항원과, T 세포 상에 발현하고 있는 다른 항원의 양쪽에 결합하여, T 세포를 표적 세포 가까이로 재방향설정하는, 세포 상해의 형태를 가리킨다. T 세포 의존성 세포 상해를 평가하는 방법인, 인비트로 TDCC 어세이는, 본 명세서의 "T 세포 의존성 세포 상해의 측정" 난에도 설명된다.
T 세포 의존성 세포 상해의 측정
항원 결합 분자가 DLL3 및 CD3/CD137의 양쪽에 결합하는 태양에 있어서, 본 개시의 항원 결합 분자를, 본 개시의 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 부위가 결합하는 DLL3 발현 세포와 접촉시키는 것에 의해 야기되는 T 세포 의존성 세포 상해(TDCC)를 평가 또는 결정하기 위한 방법으로서, 바람직하게는 이하에 기재하는 방법이 이용된다. 세포 상해 활성을 인비트로로 평가 또는 결정하기 위한 방법에는, 세포 상해성 T 세포 등의 활성을 결정하기 위한 방법이 포함된다. T 세포 매개성 세포 상해를 유도하는 활성을 본 개시의 항원 결합 분자가 갖는지 여부는 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다(예를 들어, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993) 참조). 세포 상해 어세이에 있어서, DLL3과 상이하고 세포에 있어서 발현하고 있지 않는 항원과, CD3/CD137에 결합할 수 있는 항원 결합 분자가, 대조 항원 결합 분자로서 이용된다. 대조 항원 결합 분자를 동일한 방식으로 어세이한다. 그 다음에, 활성을, 본 개시의 항원 결합 분자가, 대조 항원 결합 분자의 것보다 강한 세포 상해 활성을 나타내는지 여부를 시험하는 것에 의해 평가한다.
한편, 인비보 항종양 유효성은, 예를 들어 이하의 절차에 의해, 평가 또는 결정된다. 본 개시의 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 부위가 결합하는 항원을 발현하는 세포는, 비인간 동물 대상에게 피내(皮內) 또는 피하 이식된다. 그 다음에, 이식일 또는 그 이후부터, 피험 항원 결합 분자가, 정맥내 또는 복막강내에 매일 또는 수일 간격으로 투여된다. 종양 크기는 경시적으로 측정된다. 종양 크기 변화의 차이를 세포 상해 활성으로서 정의할 수 있다. 인비트로 어세이와 마찬가지로, 대조 항원 결합 분자가 투여된다. 종양 크기가, 대조 항원 결합 분자를 투여한 군보다, 본 개시의 항원 결합 분자를 투여한 군에서 작을 경우, 본 개시의 항원 결합 분자는 세포 상해 활성을 갖는 것으로 판단할 수 있다.
항원 결합 분자의 항원 결합 부위가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 억제하는 본 개시의 항원 결합 분자와의 접촉의 작용을 평가 또는 결정하기 위해, 바람직하게는, MTT법 및 세포 내로의 아이소토프 표지 티미딘 흡수의 측정이 이용된다. 한편, 인비보로 세포 증식을 억제하는 활성을 평가 또는 결정하기 위해, 바람직하게는, 인비보 세포 상해 활성을 평가 또는 결정하기 위한 상기에 기재한 동일한 방법을 이용할 수 있다.
본 개시의 항체 또는 항원 결합 분자의 TDCC는, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, TDCC는, 락테이트 데하이드로제나제(LDH) 방출 어세이에 의해 측정할 수 있다. 이 어세이에서는, 표적 세포(예컨대 DLL3 발현 세포)를 피험 항체 또는 항원 결합 분자의 존재하에서 T 세포(예컨대 PBMC)와 함께 인큐베이트하고, T 세포에 의해 살상된 표적 세포로부터 방출된 LDH의 활성을, 적절한 시약을 이용하여 측정한다. 전형적으로는, 세포 상해 활성은, 예컨대 Triton-X로 처리하는 것에 의해 용해된 표적 세포의 100% 사멸에 의해 생긴 LDH 활성에 대한, 항체 또는 항원 결합 분자와의 인큐베이션에 의해 생긴 LDH 활성의 비율로서 산출된다. 상기와 같이 산출된 세포 상해 활성이 보다 높은 경우, 피험 항체 또는 항원 결합 분자는 보다 높은 TDCC를 갖는 것으로 판정된다.
추가로 또는 그 대신에, 예를 들어, TDCC는, 리얼타임 세포 증식 저해 어세이에 의해 측정할 수도 있다. 이 어세이에서는, 96-웰 플레이트에 있어서 표적 세포(예컨대 DLL3-발현 세포)를 피험 항체 또는 항원 결합 분자의 존재하에서 T 세포(예컨대 PBMC)와 함께 인큐베이트하고, 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 적합한 분석 기기(예컨대 xCELLigence Real-Time Cell Analyzer)를 이용하는 것에 의해, 표적 세포의 증식을 모니터링한다. 세포 증식 저해율(CGI: %)은, CGI(%)=100-(CIAb×100/CINoAb)로서 주어지는 식에 따라, 셀 인덱스치로부터 결정한다. "CIAb"는, 특정의 실험 시간에 있어서의, 항체 또는 항원 결합 분자를 갖는 웰의 셀 인덱스치를 나타내고, "CINoAb"는, 항체 또는 항원 결합 분자를 갖지 않는 웰의 평균 셀 인덱스치를 나타낸다. 항체 또는 항원 결합 분자의 CGI율이 높으면, 즉, 유의한 양의 값을 갖는 경우, 그 항체 또는 항원 결합 분자는 TDCC 활성을 갖는다고 할 수 있다.
하나의 국면에 있어서, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 분자는 T 세포 활성화 활성을 갖는다. T 세포 활성화는, 그 활성화에 응답하여 리포터 유전자(예를 들어, 루시페라제)를 발현하는 개변된 T 세포주(예를 들어, Jurkat/NFAT-RE Reporter Cell Line(T Cell Activation Bioassay, Promega))를 이용하는 방법 등의, 당해 기술 분야에 있어서 공지된 방법에 의해 어세이할 수 있다. 이 방법에서는, 표적 세포(예컨대 DLL3-발현 세포)를 피험 항체 또는 항원 결합 분자의 존재하에서 T 세포와 함께 배양하고, 그 다음에 리포터 유전자의 발현 산물의 레벨 또는 활성을, T 세포 활성화의 지표로서 적절한 방법에 의해 측정한다. 리포터 유전자가 루시페라제 유전자인 경우, 루시페라제와 그 기질 사이의 반응에 의해 발생한 발광을, T 세포 활성화의 지표로서 측정할 수 있다. 상기와 같이 측정된 T 세포 활성화가 보다 높은 경우, 피험 항체 또는 항원 결합 분자는, 보다 높은 T 세포 활성화 활성을 갖는다고 판정된다.
의약 조성물
하나의 국면에 있어서, 본 개시는, 본 개시의 항원 결합 분자 또는 항체를 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, T 세포 의존성 세포 상해를 유도하고, 달리 말하면, 본 개시의 의약 조성물은, 세포 상해를 유도하기 위한 치료제이다. 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, 암 치료 및/또는 예방에 이용되는 의약 조성물이다. 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, 폐암(소세포 폐암을 포함한다) 및 흑색종을 포함하는 DLL3 양성 암 또는 DLL3 발현 암 치료 및/또는 예방에 이용되는 의약 조성물이다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은 세포 증식 억제제이다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은 항암제이다.
본 개시의 의약 조성물, 본 개시의 세포 상해를 유도하기 위한 치료제, 세포 증식 억제제, 또는 항암제는, 필요에 따라서, 다양한 종류의 항원 결합 분자 또는 항체와 함께 제제화할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 복수의 항원 결합 분자 또는 항체의 칵테일에 의해, 항원을 발현하는 세포에 대한 세포 상해 작용을 증강시킬 수 있다.
본 명세서에 기재되는 항원 결합 분자 또는 항체의 의약 조성물은, 소망의 순도를 갖는 항원 결합 분자 또는 항체를, 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용되는 담체(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하는 것에 의해, 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로, 조제된다. 약학적으로 허용되는 담체는, 대체로, 이용될 때의 투여량 및 농도에서는 레시피언트(recipient)에 대해 비독성이며, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이하의 것을 포함한다: 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산염 등의 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화 방지제; 보존료(옥타데실다이메틸벤질 염화 암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르신올; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸 등); 저분자량(약 10잔기 미만)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린 등의 단백질; 폴리바이닐피롤리돈 등의 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 소르비톨 등의 당류; 나트륨 등의 염 형성 짝이온류; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 비이온성 계면활성제. 본 명세서의 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는, 더욱이, 가용성 중성 활성형 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP)(예를 들어, rHuPH20(HYLENEXTM, Baxter International, Inc.) 등의 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질) 등의 간질성 약제 분산제를 포함한다. 특정한 예시적 sHASEGP(rHuPH20을 포함) 및 그 사용 방법은, 미국 특허출원공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 하나의 국면에 있어서, sHASEGP는, 콘드로이티나제 등의 1개 이상의 추가적인 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 제제는, 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수용액 항체 제제는, 미국 특허 제6,171,586호 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, WO2006/044908의 제제는 히스티딘-아세트산 완충액을 포함하고 있다.
본 명세서의 제제는, 치료되는 특정의 적응증을 위해서 필요하면 하나 이상의 유효 성분을 포함해도 되고, 서로 악영향을 주지 않고 상보적인 활성을 갖는 것이 바람직하다. 이와 같은 유효 성분은, 의도된 목적을 위해서 유효한 양으로, 적합하게 조합하여 존재한다.
필요에 따라서, 본 개시의 항원 결합 분자 또는 항체는, 마이크로캡슐(하이드록시메틸셀룰로스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴레이트] 등으로 제조된 마이크로캡슐) 중에 봉입되어도 되고, 콜로이드 약물 송달계(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐)의 구성성분으로 해도 된다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)을 참조). 더욱이, 약제를 서방성 약제로서 조제하기 위한 방법도 공지되어 있으며, 이들은 본 개시의 항원 결합 분자에 적용할 수 있다(J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 267-277; Chemtech. (1982) 12, 98-105; 미국 특허 제3773719호; 유럽 특허출원(EP) 번호 EP58481 및 EP133988; Biopolymers (1983) 22, 547-556).
본 개시의 의약 조성물, 세포 증식 억제제, 또는 항암제는, 경구 또는 비경구로 환자에게 투여될 수 있다. 비경구 투여가 바람직하다. 구체적으로, 이와 같은 투여 방법에는, 주사, 경비 투여, 경폐 투여, 및 경피 투여가 포함된다. 주사에는, 예를 들어, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 및 피하 주사가 포함된다. 예를 들어, 본 개시의 의약 조성물, 세포 상해를 유도하기 위한 치료제, 세포 증식 억제제, 또는 항암제는, 주사에 의해 국소적으로 또는 전신적으로 투여할 수 있다. 더욱이, 환자의 연령 및 증상에 따라서 적절한 투여 방법을 선택할 수 있다. 투여 용량은, 예를 들어, 각 투여에 대해 체중 1kg당 0.0001mg 내지 1,000mg의 범위에서 선택할 수 있다. 혹은, 용량은, 예를 들어, 1환자당 0.001mg/body 내지 100,000mg/body의 범위에서 선택할 수 있다. 그러나, 본 개시의 의약 조성물의 용량은 이들 용량으로 한정되지 않는다.
바람직하게는, 본 개시의 의약 조성물은, 본 명세서에 있어서 기재되는 바와 같은 항원 결합 분자 또는 항체를 포함한다. 하나의 국면에 있어서, 조성물은, 세포 상해를 유도함에 있어서 사용하기 위한 의약 조성물이다. 다른 국면에 있어서, 조성물은, 암을 치료 또는 예방함에 있어서 사용하기 위한 의약 조성물이다. 바람직하게는, 암은 폐암(소세포 폐암을 포함한다) 및 흑색종이다. 본 개시의 의약 조성물은 암을 치료 또는 예방하기 위해서 이용할 수 있다. 따라서, 본 개시는, 그 필요가 있는 환자에게 본 명세서에 기재되는 항원 결합 분자 또는 항체가 투여되는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.
본 개시는 또한, DLL3을 발현하는 세포를, DLL3에 결합하는 본 개시의 항원 결합 분자와 접촉시키는 것에 의해, DLL3을 발현하는 세포를 손상하기 위한, 또는 세포 증식을 억제하기 위한 방법도 제공한다. 본 개시의 항원 결합 분자가 결합하는 세포는, 그것이 DLL3을 발현하는 한, 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 본 개시에 있어서, 바람직한 DLL3 발현 세포는 폐암(소세포 폐암을 포함한다) 및 흑색종을 포함한다.
본 개시에 있어서, "접촉"은, 예를 들어, 인비트로로 배양된 DLL3을 발현하는 세포의 배지에 본 개시의 항원 결합 분자를 첨가하는 것에 의해 행할 수 있다. 이 경우, 첨가될 항원 결합 분자는, 용액, 또는 동결건조 등에 의해 조제된 고체 등의 적절한 형태로 이용할 수 있다. 본 개시의 항원 결합 분자를 수용액으로서 첨가하는 경우, 해당 용액은, 항원 결합 분자를 단독으로 함유하는 순수한 수용액, 또는 예를 들어 상기의 계면활성제, 부형제, 착색제, 착향제, 보존제, 안정화제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 및 교미제를 함유하는 용액이어도 된다. 첨가 농도는 특별히 한정되지 않지만, 배지 중의 최종 농도는, 바람직하게는 1pg/ml 내지 1g/ml의 범위 내, 보다 바람직하게는 1ng/ml 내지 1mg/ml의 범위 내, 및 더욱 바람직하게는 1μg/ml 내지 1mg/ml의 범위 내에 있다.
본 개시의 다른 태양에 있어서, "접촉"은 또한, 인비보로 DLL3 발현 세포가 이식된 비인간 동물, 또는 DLL3을 내인적으로 발현하는 암 세포를 갖는 동물에게 투여하는 것에 의해 행할 수 있다. 투여 방법은, 경구 또는 비경구여도 된다. 비경구 투여가 특히 바람직하다. 구체적으로는, 비경구 투여 방법에는, 주사, 경비 투여, 경폐 투여, 및 경피 투여가 포함된다. 주사에는, 예를 들어 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 및 피하 주사가 포함된다. 예를 들어, 본 개시의 의약 조성물, 세포 상해를 유도하기 위한 치료제, 세포 증식 억제제, 또는 항암제는, 주사에 의해 국소 투여 또는 전신 투여할 수 있다. 더욱이, 적절한 투여 방법은, 동물 대상의 연령 및 증상에 따라서 선택할 수 있다. 항원 결합 분자를 수용액으로서 투여하는 경우, 해당 용액은, 항원 결합 분자를 단독으로 함유하는 순수한 수용액, 또는 예를 들어 상기의 계면활성제, 부형제, 착색제, 착향제, 보존제, 안정화제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 및 교미제를 함유하는 용액이어도 된다. 투여 용량은, 예를 들어, 각 투여에 대해 체중 1kg당 0.0001mg 내지 1,000mg의 범위에서 선택할 수 있다. 혹은, 용량은, 예를 들어, 각 환자에 대해 0.001 내지 100,000mg/body의 범위에서 선택할 수 있다. 그러나, 본 개시의 항원 결합 분자의 용량은 이들 예로 한정되지 않는다.
또한, 본 개시는, 본 개시의 항원 결합 분자 또는 본 개시의 방법에 의해 산생된 항원 결합 분자를 함유하는, 본 개시의 방법에 있어서 사용하기 위한 키트를 제공한다. 해당 키트는, 추가의 약학적으로 허용되는 담체 또는 매체, 또는 키트의 사용 방법을 기재한 취급 설명서 등과 함께 포장될 수 있다.
본 발명의 다른 국면에 있어서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 기재를 포함하는 제품이 제공된다. 제품은, 용기, 및 당해 용기 상의 라벨 또는 당해 용기에 부속되는 첨부 문서를 포함한다. 바람직한 용기로서는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기류는, 유리나 플라스틱 등, 다양한 재료로부터 형성되어 있어도 된다. 용기는, 조성물을 그 자체로, 또는 증상의 치료, 예방, 및/또는 진단을 위해서 유효한 다른 조성물과 조합하여 보유해도 되고, 무균적인 억세스 포트를 갖고 있어도 된다(예를 들어, 용기는, 피하 주사바늘에 의해 뚫릴 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 투여용 용액 백 또는 바이알이어도 된다). 조성물 중의 적어도 하나의 유효 성분은, 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 첨부 문서는, 조성물이, 선택된 증상을 치료하기 위해 사용되는 것임을 나타낸다. 더욱이, 제품은, (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 제 1 용기, 및 (b) 추가의 세포 상해제 또는 그 외의 치료제를 포함하는 조성물을 포함하는 제 2 용기를 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 이 태양에 있어서의 제품은, 조성물이 특정의 증상을 치료하기 위해서 사용될 수 있음을 나타내는 첨부 문서를 추가로 포함하고 있어도 된다. 혹은, 또는 추가로, 제품은, 예를 들어, 주사용 제균수(BWFI), 인산 완충 생리 식염수, 링거 용액, 및 덱스트로스 용액 등의 약학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제 2(또는 제 3) 용기를 추가로 포함하고 있어도 된다. 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 및 시린지 등의, 상업적 관점 또는 사용자의 입장에서 소망되는 기재를 추가로 포함해도 된다.
첨부 문서
용어 "첨부 문서"는, 치료용 제품의 시판 패키지에 통상 포함되는 설명서를 가리키기 위해서 이용되며, 그와 같은 치료용 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여 방법, 병용 요법, 금기, 및/또는 경고에 대한 정보를 포함한다.
의약 제제
용어 "의약 제제" 또는 "의약 조성물"은, 그 중에 포함된 유효 성분의 생물학적 활성이 효과를 발휘할 수 있는 형태로 있는 조제물로서, 또한 제제가 투여되는 대상에게 허용할 수 없는 정도로 독성이 있는 추가의 요소를 포함하지 않는, 조제물을 가리킨다.
약학적으로 허용되는 담체
"약학적으로 허용되는 담체"는, 대상에 대해서 무독인, 의약 제제 중의 유효 성분 이외의 성분을 가리킨다. 약학적으로 허용되는 담체는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함한다.
치료
본 명세서에서 이용되는 "치료"(및, 그 문법상의 파생어, 예를 들어 "치료한다", "치료하는 것" 등)는, 치료되는 개체의 자연 경과를 개변하는 것을 기도한 임상적 개입을 의미하고, 예방을 위해서도, 임상적 병태의 경과 동안에도 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는, 그것으로 한정되는 것은 아니지만, 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환에 의한 임의의 직접적 또는 간접적인 병리적 영향의 감약, 전이의 방지, 질환의 진행 속도의 저감, 질환 상태의 회복 또는 완화, 및 관해(寬解) 또는 개선된 예후를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 항원 결합 분자 또는 항체는, 질환의 발증을 늦추거나, 또는 질환의 진행을 느리게 하기 위해서 이용된다.
암
용어 "암" 및 "암성"은, 조절되지 않은 세포 성장/증식에 의해 전형적으로 특징지어지는 포유동물에 있어서의 생리학적 상태를 가리키거나 또는 설명하는 것이다.
특정의 태양에 있어서, 암은, 폐암(소세포 폐암을 포함한다) 및 흑색종을 포함하는 DLL3 발현 암 또는 DLL3 양성 암이다.
종양
용어 "종양"은, 악성인지 양성인지에 상관 없이, 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전(前)암성 및 암성 세포 및 조직을 가리킨다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은, 본 명세서에서 말하는 경우, 서로 배타적이지 않다.
바람직한 태양에 있어서, 암은, DLL3을 발현하는 암(암 조직 또는 암 세포를 포함한다)이다. 몇몇 태양에 있어서, 암은, 폐암, 소세포 폐암(SCLC), 또는 흑색종이다.
다른 제제 및 치료
본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, 치료에 있어서 하나 이상의 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, 적어도 하나의 추가적인 치료제와 동시 투여되어도 된다. 용어 "치료제"는, 이와 같은 치료의 필요가 있는 개체에 있어서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 제제를 포함한다. 이와 같은 추가 치료제는, 치료되는 특정의 적응증에 적합한 임의의 유효 성분, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 추가 치료제는, 면역조절제, 세포 분열 저해제, 세포 접착의 저해제, 세포 상해제, 세포 사멸(apoptosis)의 활성화제, 또는 사멸 유도인자에 대한 세포의 감수성을 증가시키는 제제이다. 특정의 태양에 있어서, 추가 치료제는, 항암제, 예를 들어 미세관 파괴제, 항대사제, 토포아이소메라제 저해제, DNA 인터캘레이트제, 알킬화제, 호르몬 요법, 키나제 저해제, 수용체 안타고니스트, 종양 세포 사멸의 활성화제, 또는 항혈관신생제이다.
이와 같은 다른 제제는, 의도된 목적을 위해 유효한 양으로, 적합하게 조합되어 존재한다. 이와 같은 다른 제제의 유효량은, 이용되는 다중 특이성 항원 결합 분자의 양, 장애 또는 치료의 종류, 및 전술한 다른 요인에 의존한다. 다중 특이성 항원 결합 분자는 대체로, 본 명세서에 기재된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본 명세서에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적/임상적으로 적절하다고 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 이용된다.
상기의 이와 같은 병용 요법은, 병용 투여(2종류 이상의 치료제가 동일 또는 개별 조성물 중에 포함되어 있음), 및 개별 투여를 포괄하고, 개별 투여의 경우, 본 명세서에 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자의 투여가 추가적인 치료제 및/또는 아주반트의 투여에 앞서, 동시에, 및/또는 계속해서, 행해질 수 있다. 본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는 또한, 방사선 요법과 조합하여 이용할 수 있다.
본 명세서에 인용되는 모든 문헌은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
이하는, 본 개시의 방법 및 조성물의 실시예이다. 전술한 일반적인 기재에 비추어, 여러 가지 다른 태양이 실시될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예
[실시예 1]
종양 세포에 대한 인비트로 세포 상해 활성의 개선에 관한, 친Dual-Fab H183L072의 친화성 성숙 배리언트의 스크리닝
1.1 친화성 성숙 배리언트의 서열
CD3 및 CD137에 결합하지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 면역글로불린 가변(Fab) 영역(Dual-Fab)을 제공한다고 하는 개념은, WO2019111871(참조에 의해 본 명세서에 원용된다)에 개시되어 있다. WO2019111871에 개시된 친Dual-Fab H183L072(중쇄: 서열 번호: 1; 경쇄: 서열 번호: 57)의 결합 친화성을 증가시키기 위해서, H183L072를 주형으로서 이용하여, 가변 영역에 단일의 또는 복수의 변이를 도입하는 것에 의해, 1,000개를 상회하는 Dual-Fab 배리언트를 제작했다. 항체를, Expi293(Invitrogen)을 이용하여 발현시키고, 프로틴 A 정제, 계속해서, 겔 여과가 필요한 경우에는 겔 여과에 의해 정제했다. 복수의 변이를 갖는 22개의 대표적인 Dual-Fab 배리언트의 서열을, 표 6 및 표 8-1 내지 8-6에 열기하고, CD3 및 CD137에 대한 결합 친화성 및 동태를, 실시예 1.2.2(표 9)에 있어서 하기에 기재되는 바와 같이, Biacore T200 기기(GE Healthcare)를 이용하여 25℃ 및/또는 37℃에서 평가했다.
1.2 친화성 성숙 배리언트의 결합 동태 정보
1.2.1 인간 CD3 및 CD137의 발현 및 정제
인간 CD3 복합체(인간 CD3eg 링커)의 γ 서브유닛 및 ε 서브유닛을 29-mer 링커에 의해 연결하고, Flag-태그를 γ 서브유닛의 C말단에 융합시켰다(서열 번호: 102, 표 5 및 7). 이 구축물을, FreeStyle293F 세포주(Thermo Fisher)를 이용하여 일과성으로 발현시켰다. 인간 CD3eg 링커를 발현하는 배양 상청을, Q HP 수지(GE healthcare)를 충전한 컬럼을 이용하여 농축하고, 그 다음에, FLAG-태그 친화성 크로마토그래피에 적용했다. 인간 CD3eg 링커를 함유하는 획분을 수집하고, 계속해서, 1×D-PBS로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 컬럼(GE healthcare)에 제공했다. 그 다음에, 인간 CD3eg 링커를 함유하는 획분을 풀링했다. 그 C말단에 헥사히스티딘(His-태그) 및 비오틴 억셉터 펩티드(BAP)를 갖는 인간 CD137 세포외 도메인(ECD)(서열 번호: 103, 표 5 및 7)을, FreeStyle293F 세포주(Thermo Fisher)를 이용하여 일과성으로 발현시켰다. 인간 CD137 ECD를 발현하는 배양 상청을 HisTrap HP 컬럼(GE healthcare)에 적용하고, 이미다졸(Nacalai)을 함유하는 완충액으로 용출했다. 인간 CD137 ECD를 함유하는 획분을 수집하고, 계속해서, 1×D-PBS로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 컬럼(GE healthcare)에 제공했다. 그 다음에, 인간 CD137 ECD를 함유하는 획분을 풀링하고, -80℃에서 보관했다.
1.2.2 인간 CD3 및 CD137에 대한 친화성 측정
인간 CD3에 대한 Dual-Fab 항체(Dual-Ig)의 결합 친화성을, Biacore 8K 기기(GE Healthcare)를 이용하여 25℃에서 평가했다. 항인간 Fc(GE Healthcare)를, 아민 커플링 키트(GE Healthcare)를 이용하여 CM4 센서 칩의 모든 플로 셀 상에 고정화했다. 항체를 항Fc 센서 표면 상에 포착하고, 그 다음에, 재조합 인간 CD3 또는 CD137을 플로 셀 상에 인젝트했다. 모든 항체 및 애널라이트를, 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3을 함유하는 ACES pH 7.4에 있어서 조제했다. 센서 표면은, 3M MgCl2로 사이클마다 재생시켰다. 결합 친화성은, Biacore Insight Evaluation software, version 2.0(GE Healthcare)을 이용하여, 데이터를 프로세싱하여, 1:1 결합 모델에 피팅시키는 것에 의해 결정했다. CD137 결합 친화성 어세이를, 어세이 온도를 37℃로 설정한 것을 제외하고, 동일한 조건에서 행했다. 재조합 인간 CD3 및 CD137에 대한 Dual-Fab 항체의 결합 친화성을 표 9-1 및 9-2에 나타낸다(표 중에서 Kon치, Koff치, 및 KD치를 나타내는데 이용되는 어구 E는, "10의 _승"을 의미하고, 예를 들어, 3.54E+04=3.54*104이다). 표 9-1 및 9-2에 나타내는 바와 같이, Dual Fab 배리언트는, CD3 및 CD137에 대해, H183/L072와 비교하여 상이한 결합 동태를 나타냈다.
(표 8-1)
(표 8-2)
(표 8-3)
(표 8-4)
(표 8-5)
(표 8-6)
(표 9-1)
(표 9-2)
［실시예 2］
이중 특이성 및 삼중 특이성 항체의 서열 및 조제
2.1. 이중 특이성 또는 삼중 특이성 항체(1+1) 포맷의 설계 및 조제
실시예 1에서 조제한 Dual-Ig 배리언트(DualAE05 등)의 효과를 평가하기 위해서, 종양 항원 DLL3을 인식하는 1개의 암(arm)(항DLL3 항체 D30841AE13 유래)과, 이펙터 세포, 주로 T 세포를 인식하는 다른 암을 갖는 이중 특이성 및 삼중 특이성 항체를 제작했다. DLL3/CD3ε(1+1) 항체 및 DLL3/DualAE05(1+1) 항체를, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26; 110(13):5145-5150에 기재되어 있는 방법에 따르는 Fab-암 교환(FAE)을 이용하는 것에 의해 제작했다. (1+1) 포맷을 도 1(b)에 나타낸다. (1+1) 포맷에서의 이중 특이성 및 삼중 특이성 항체에 있어서의 각 Fv 영역의 표적 항원 및 각 결합 도메인의 명명 규칙을 표 10-2에 나타내고, 서열 번호를 표 12에 나타낸다.
2.2. 1개의 1가 DLL3 결합 암과 2개의 Dual-Fab를 포함하는 3가 항체(1+2) 포맷의 설계 및 조제
고형 종양에 있어서의 표적 항원의 발현은 극히 불균일할 가능성이 높고, 항원 발현이 낮은 종양의 영역은, CD3 또는 CD137의 충분한 가교 형성을 가져오지 않는 경우가 있다. 특히, CD137 수용체 클러스터 형성은, 효과적인 아고니스트 활성에 있어 중대한 의미를 가진다(Trends Biohem Sci. 2002 Jan; 27(1) 19-26). CD3 결합 및 활성화에 의해 매개되는 세포 상해 활성을 개선하기 위해서, 새로운 3가 삼중 특이성 항체 포맷, 즉, DLL3-DUAL/LINC, 1+2)를, CD137 분자에 대한 결합 도메인의 수를 증가시키도록 설계했다. 구체적으로는, 새로운 항체 포맷은, 각각이 1개의 CD3 또는 CD137에 결합할 수 있지만 동시적이 아닌 1가 Dual-Fab를 2개(도 1a의 FvB 및 FvC), 및 1가 DLL3 결합 암을 1개(도 1(a)의 FvA) 포함하는, "1+2" 포맷을 갖는 3가 삼중 특이성 항체로서, 1개의 다이설파이드 결합("LINC")이, 예를 들어, 2개의 Dual-Fab의 각각의 CH1 도메인의 191위에, 시스테인 치환(Kabat 넘버링으로 S191C)을 도입하는 것에 의해, 2개의 Dual-Fab 사이에 도입/설계되어 있다(도 1(a) 및 표 10-1). 이론에 속박되는 것은 아니지만, 본 발명자들은, 그와 같이 설계된 다이설파이드 결합("LINC")은, 2개의 Dual-Fab 사이의 입체 장애 또는 짧은 거리의 결과로서, 2개의 Dual-Fab의 항원(CD3 또는 CD137) 결합 배향성을 시스 항원 결합(즉, 동일한 세포 상의 2개의 항원으로의 결합)으로 제한하고, 그에 따라, DLL3 비의존적으로 2개의 Dual-Fab에 의해 매개되는 2개의 CD3/CD137 발현 면역 세포의 바람직하지 않은 가교 형성을 방해하는 것에 의해 삼중 특이성 항체의 안전성 프로파일을 개선하는 것을 기도했다. 구체적으로는, DLL3에 대한 1가 종양 항원 결합능, 2개의 Dual-Fab에 기인하는 2가 CD3 및 2가 CD137 결합 특성을 갖는 DLL3-Dual/Dual 항체 배리언트(DLL3-Dual/LINC, 1+2)를 조제했다(도 1(a) 및 표 10-1). CrossMab 테크놀로지(WO2017055539)도 이용했다. Fc 영역은, FcγR 사일런트이며, 또한 탈글리코실화되었다. 삼중 특이성 항체에 있어서의 각 Fv 영역의 표적 항원 및 각 결합 도메인의 명명 규칙을 표 10-1에 나타내고, 서열 번호를 표 11-1 및 12에 나타낸다. 음성 대조에 대해서는, DLL3에 결합하지 않는 Ctrl(VHR IC17HdK 및 VLR IC17L)을, 1가 DLL3 결합 암 대신에 이용했다(표 12). 모든 항체를 Expi293 세포(Invitrogen)에서의 일과성 발현에 의해 3가 형태로서 발현시키고, 실시예 1.1에 따라 정제했다. 순도를 향상시키기 위해서, 항체를, UnLINC 포맷(즉, 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는 3가 1+2 항체)에 특이적으로 결합하지만, LINC 포맷(즉, 조작된 다이설파이드 결합을 갖는 3가 1+2 항체)에는 결합하지 않는 친화성 컬럼을 통과시키는 것에 의해 추가로 정제했다.
2.3. 이중 특이성 항체(BiTE)의 제작
3가 항체(DLL3-DUAL/LINC, 2+1)의 효과를 다른 DLL3/CD3 이중 특이성 포맷 항체와 비교하기 위해서, 반감기 연장형 BiTE 포맷을 갖는 항체를 제작하여, DLL3CD3BiTE라고 명명했다. DLL3CD3BiTE는, 종양 관련 항원 DLL3으로 지향된 1본쇄 가변 단편이, CD3으로 지향된 것에 융합되어 있는, 2개의 1본쇄 가변 단편(ScFv)으로 구성되어 있다(도 1(c)). BiTE 포맷 이중 특이성 항체 중의 각 Fv 영역의 표적 항원을 표 10-3에 나타내고, 서열 번호를 표 11-2 및 표 14에 나타낸다.
(표 10-1)
(표 10-2)
(표 10-3)
(표 11-1)
(표 11-2)
(표 14-1)
(표 14-2)
(표 14-3)
(표 14-4)
(표 14-5)
(표 14-6)
(표 14-7)
(표 14-8)
(표 14-9)
(표 14-10)
(표 14-11)
［실시예 3］
DLL3 발현 세포주에 대한 DLL3-Dual-LINC 항체의 인비트로 유효성
3.1. 항DLL3/Dual-Linc(1+2) 항체, Dual(1+1) 항체, DLL3CD3BiTE, 및 DLL3/CD3ε(1+1) 항체를 이용한, TDCC 활성의 측정
PBMC의 존재하에서 xCELLigence Real-Time Cell Analyzer(Roche Diagnostics)를 이용하여 종양 세포 증식 억제율을 관찰하는 것에 의해, 세포 상해 활성을 평가했다. 도 2는, 표 10-13에 따라 조제한 항DLL3/Dual-Linc 항체(DLL3-DualAE05/DualAE05, 1+2), Dual(1+1) 항체(DLL3/DualAE05), DLL3CD3BiTE, 및 DLL3/CD3ε(1+1) 항체의 TDCC 활성을 나타낸다. SK-MEL30 세포주를 표적 세포로서 이용했다. 표적 세포를 디시로부터 박리하고, 세포를 5×103세포/웰로 조정하는 것에 의해 100μL/웰의 분할량으로, 세포를 E-plate 96(Roche Diagnostics)에 플레이 팅하고, xCELLigence Real-Time Cell Analyzer를 이용하여, 세포 증식의 측정을 개시했다. 24시간 후에, 플레이트를 꺼내고, 각 농도(10nM로부터 개시한 5배 계열 희석, 즉, 0.25, 1.25, 2.5, 5, 및 10nM)로 조제한 각각의 항체 50μL를, 플레이트에 가했다. 실온에서 15분간의 반응 후에, 50μL의 신선한 인간 PBMC 용액을, 이펙터:표적비 2(즉, 1×104세포/웰)로 가하고, 세포 증식의 측정을, xCELLigence Real-Time Cell Analyzer를 이용하여 재개했다. 반응은, 5% 이산화탄소 가스의 조건하, 37℃에서 실시했다. CD137 시그널 전달은, T 세포 생존을 증강하고, 또한 활성화 유도 세포사를 저지하기 때문에, TDCC 어세이를 낮은 E:T비로 실시했다. CD137 활성화가 기여하는 우수한 세포 상해 활성을 관찰하기 위해서, 기간의 연장이 필요해지는 경우가 있다. 따라서, PBMC의 첨가의 대략 68시간 후에, 하기의 식을 이용하여, 세포 증식 억제(CGI)율(%)을 결정했다. 계산에 있어서 이용한 xCELLigence Real-Time Cell Analyzer로부터 얻어진 Cell Index치는, 항체 첨가의 직전의 시점의 Cell Index치를 1로서 정의한 정규화치였다.
세포 증식 억제율(%)=(A-B)×100/(A-1)
A는, 항체를 첨가하고 있지 않은 웰(표적 세포 및 인간 PBMC만을 함유한다)에 있어서의 Cell Index치의 평균치를 나타내고, B는, 표적 웰의 Cell Index치의 평균치를 나타낸다. 시험은 2회 연속으로 실시했다.
도 2a)에 나타내는 바와 같이, 항DLL3/Dual-Linc 항체(DLL3-DualAE05/DualAE05, 1+2)는, Dual(1+1) 항체(DLL3/DualAE05) 및 DLL3/CD3ε(1+1) 항체의 것보다 강한 TDCC 활성을 나타냈다. 이것은, Dual-Linc 분자 포맷은 개선된 세포 상해 활성에 기여함을 시사한다. 더하여, 이들 항체의 농도에서, 항DLL3/Dual-Linc 항체의 TDCC 활성은, DLL3/CD3BiTE와 동등하다.
3.2. 세포 상해 활성에 대한 링커 길이의 효과의 평가
종양 세포에 대한 세포 상해 활성을 개선하기 위해서는, 종양 세포와 이펙터 세포 사이의 보다 근접한 보다 강고한 결합이 중대한 의미를 가지게 된다. 이것은, 보다 짧은 거리가, T 세포와 종양 세포를 보다 근접시키는 데 도움이 될 가능성이 있어, TDCC에 도움이 될 가능성이 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명자들은, 상이한 길이의 링커를 갖는, 3종류의 항DLL3/Dual-Linc 항체 배리언트를 제작했다. DLL3-DualAE05/DualAE05-FF110(중간 정도의 링커) 및 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF111(짧은 링커)의 링커 길이는, DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091(긴 링커)의 것보다 짧다(본 명세서의 이하에 있어서, 이들 배리언트는 각각, DLL3-AE05/AE05-FF110, DLL3-AE05/AE05-FF111, 및 DLL3-AE05/AE05-FF091이라고 생략되는 경우가 있다). 세포 상해 활성에 대한 링커 길이의 효과를 평가하기 위해서, TDCC 측정을, 0.2, 1, 및 5nM의 항체를 이용하여 실시예 3.1에 기재되는 바와 같이 행했다.
도 2b)에 나타내는 바와 같이, DLL3-AE05/AE05-FF110(중간 정도의 링커) 및 DLL3-AE05/AE05-FF111(짧은 링커)은, 0.2nM에서 DLL3-AE05/AE05-FF091(긴 링커)의 것보다 강한 TDCC 활성을 나타냈다. DLL3-AE05/AE05-FF110(중간 정도의 링커)은 가장 강한 TDCC 활성을 나타냈다. 이들 결과는, 링커 길이가 TDCC 활성에 있어 중요하고, 또한 중간 정도의 길이의 링커가, 인비트로에서의 TDCC 활성에 있어 가장 적절함을 시사한다.
［실시예 4］
DLL3CD3BiTE와 비교한 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091 삼중 특이성 항체의 인비보 유효성의 평가
실시예 2에서 조제한 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091 항체 및 DLL3CD3BiTE의 항종양 활성을, 인간 소세포 폐암 NCI-H1436 암 모델에서 시험했다. NCI-H1436 세포를 NOG 인간화 마우스에게 피하 이식했다. NOG 암컷 마우스를 In-Vivo Science로부터 구입했다. 인간화를 위해서, 마우스를 치사량 이하로 조사하고, 계속해서 1일 후에 100,000개의 인간 제대혈 세포(ALLCELLS)를 주사했다. 인간화 후, NCI-H1436(5×106세포)을 Matrigel Basement Membrane Matrix(Corning)와 혼합하고, 인간화 NOG 마우스의 우측 복부에 이식했다. 이식한 날을 0일째라고 정의했다. 11일째에, 마우스를, 종양 체적 및 체중에 기초하여 랜덤화했다. 다음날, 비히클(0.05% Tween을 함유하는 PBS), 6.5mg/kg DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091, 및 3.5mg/kg DLL3CD3BiTE의 어느 하나를, 마우스에게 정맥내 주사했다.
T 세포 침윤(infiltration)의 분석을 위해서, 마우스가 갖는 이종 이식한 종양을, 항체 투여 후의 표시되고 있는 시점에서 수집했다. 종양을 계량하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 인간용 Tumor Dissociation Kit(Miltenyi)를 이용하는 것에 의해 세분화하고, 분리 후에 CountBright Absolute Counting Beads(ThermoFisher scientific)를 가했다. 종양 내의 CD8+T 세포의 수를, LSRFortessa X-20(BD)을 이용하여 평가했다.
T 세포 피폐(exhaustion)의 분석을 위해서, 마우스가 갖는 이종 이식한 종양을, 항체 투여 후 7일째에 수집했다. 종양을, 제조업자의 프로토콜에 따라 인간용 Tumor Dissociation Kit(Miltenyi)에 의해 세분화하고, T 세포 피폐 마커, Tim-3, PD-1, 및 Lag-3의 발현에 대해, 종양내 T 세포를 평가했다.
결과로서, DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091은, DLL3CD3BiTE보다 강한 효과와 높은 T 세포 침윤을 나타냈다(도 3 및 도 4). 더욱이, DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091 처치군의 T 세포는, PD-1, Tim-3, 및 LAG3보다 낮은 발현을 갖고(도 5), 이것은, DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091이 보다 낮은 T 세포 피폐를 유도함을 시사했다.
본 발명은, CD3 및 CD137(4-1BB)에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합할 수 없고, 또한 DLL3에 결합할 수 있는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 본 발명의 항원 결합 분자는, CD3/CD37 및 DLL3으로의 결합을 통해서, 증강된 T 세포 의존성 세포 상해 활성을 DLL3 의존적으로 나타낸다. 항원 결합 분자 및 그 의약 조성물은, 여러 가지 암, 특히, DLL3 양성 암 등의 DLL3에 관련된 암을 치료하기 위한 면역 요법에서의 사용을 위해서, DLL3을 발현하는 세포를 표적으로 하는 데에 이용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120> DLL3-TARGETING MULTISPECIFIC ANTIGEN-BINDING MOLECULES AND USES
THEREOF
<130> C1-A2006P
<150> JP 2020-062326
<151> 2020-03-31
<160> 320
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 1
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<223> an artificially synthesized sequence
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Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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<400> 62
Gln Ala Ser Gln Glu Leu Val His Met Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asp Ser Lys Asn Ser
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Pro Leu Val His Ser
20 25 30
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50 55 60
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Asn Val
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50 55 60
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Ala
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
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Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
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Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
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Met Val Ser Pro Arg Met Ser Gly Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu
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Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu
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Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala
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Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala
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Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg
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Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala
165 170 175
Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg
180 185 190
Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala
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Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu
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245 250 255
Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val
260 265 270
Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser
275 280 285
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290 295 300
Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro
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Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala
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Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys
340 345 350
Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
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Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
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Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser
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Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys
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Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala
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Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu
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Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu
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Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu
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Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser
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Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Gln Gly Ile Tyr Val
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Pro Pro Leu His Thr Gly Arg Ala Gly Gln Arg Gln His Leu Leu Phe
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Pro Tyr Pro Ser Ser Ile Leu Ser Val Lys
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Gly Gly Gly Gly Gly Ser
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<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 205
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Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Tyr Tyr Asn Ala
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Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ala Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
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Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
260 265 270
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
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Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn
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Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser
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Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys
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Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly
340 345 350
Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
370 375 380
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420 425 430
Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro
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Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu
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Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp
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Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
485 490 495
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530 535 540
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Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<220>
<223> an artificially synthesized sequence
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Asn Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gly Leu
1 5
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<211> 5
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<223> an artificially synthesized sequence
<400> 285
Ser Asn Ala Met Cys
1 5
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<211> 17
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<223> an artificially synthesized sequence
<400> 286
Cys Ile Tyr Asn Asp Asp Gly Ser Ala Tyr Ser Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
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<223> an artificially synthesized sequence
<400> 287
Ser Pro Tyr Tyr Thr Tyr Gly Gly Ala Pro Ser Ala Tyr Ala Ser Gly
1 5 10 15
Tyr Phe Asn Leu
20
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<211> 11
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Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Ser Leu Ala
1 5 10
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Asp Ala Ser Val Leu Thr Ser
1 5
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Gln Ser Asp Tyr Tyr Ser Thr Gly Gly Ser Tyr Gly Phe Ala
1 5 10
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Ser Ser Gly Tyr Met Cys
1 5
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Cys Ile Ser Gly Gly Ser Ser Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asn Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
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Asp Val Tyr Ile Asp Ser Thr Ile Phe Asn Phe Asn Leu
1 5 10
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<211> 13
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Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Asn Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
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Ala Ala Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
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Gln Gly Thr Tyr Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Ser Thr
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Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Thr Ile Tyr Thr Gly Asp Tyr Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asn Thr Gly Tyr Gly Tyr Phe Gly Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
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Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Thr Ile Tyr Thr Gly Asp Tyr Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg His Thr Gly Tyr Gly Tyr Phe Gly Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 119
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Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
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Met Gly Thr Ile Tyr Thr Gly Asp Tyr Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ser Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<400> 301
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Thr Ile Tyr Thr Gly Asp Tyr Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg His Thr Gly Tyr Gly Tyr Phe Gly Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<400> 302
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Thr Glu Ser Val Tyr Gly Ser
20 25 30
Asp Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Glu Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu
65 70 75 80
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Ser Gly
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Tyr Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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Asn Thr Gly Tyr Gly Tyr Phe Gly Leu
1 5
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<400> 304
Gln Gly Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ser Tyr Ala
1 5 10
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<211> 121
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 305
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr His Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Tyr Asp Tyr Val Thr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 306
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<223> an artificially synthesized sequence
<400> 307
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Asp Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ser Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Trp Gly Ala Arg Glu Pro Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 308
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asp Gly Tyr Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 309
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 309
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Leu Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asn Ser Ala Phe Tyr Ser Tyr Tyr Asp Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 310
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Ile Ala Val Arg Gly Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 311
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 311
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Ile Ala Val Thr Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 312
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 312
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Ser Phe
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Ala Val Ala Gly Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 313
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 313
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ile Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Thr Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Gly Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 314
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 314
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
His Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 315
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 315
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 316
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 316
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Phe Ser Leu Ser Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 317
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 317
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Arg
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Trp Gln Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 318
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 318
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 319
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 319
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Asn Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Arg Ser Pro
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Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 320
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 320
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Lys Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Arg Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
Claims (37)
- (a) 각각이,
인간 CD3에 결합하고, 또한
이하의 (a1)∼(a2) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는 Fab 분자인,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분:
(a1) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3; 및
(a2) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3
(b) 인간 Delta-like 3(DLL3)에 결합하고, 또한 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역을 포함하는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하고, 또한 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 1 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a2) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역:
(a1) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(a2) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 적어도 1개의 다이설파이드 결합이, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 191위에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 1개의 다이설파이드 결합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
제 3 항원 결합 부분이 Fab 분자이며, 제 3 항원 결합 부분이, Fab 중쇄의 C말단(CH1)에서, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어 있는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 4 항에 있어서,
상기 펩티드 링커가, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 또는 서열 번호: 259의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 5 항에 있어서,
제 3 항원 결합 부분이, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이 종래형의 Fab 분자인, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 6 항에 있어서,
제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및 124위에 있는 아미노산이 각각, 아르기닌(R) 및 리신(K)이며(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위 및 213위에 있는 아미노산이, 글루탐산(E)인(EU 넘버링에 의한 넘버링), 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 1 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 서열 번호: 20을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 34를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 8 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 1 항, 제 2 항 또는 제 9 항에 있어서,
제 3 항원 결합 부분이,
서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 가변 영역
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 1 항, 제 2 항 또는 제 9 항에 있어서,
Fc 도메인을 추가로 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - (a) 각각이,
인간 CD137에 결합하고, 또한
이하의 (a1)∼(a2) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는 Fab 분자인,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분:
(a1) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3; 및
(a2) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3
(b) 인간 Delta-like 3(DLL3)에 결합하고, 또한 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역을 포함하는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하고, 또한 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 12 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a2) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역:
(a1) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(a2) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
상기 적어도 1개의 다이설파이드 결합이, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 191위에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 1개의 다이설파이드 결합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
제 3 항원 결합 부분이 Fab 분자이며, 제 3 항원 결합 부분이, Fab 중쇄의 C말단(CH1)에서, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어 있는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 15 항에 있어서,
상기 펩티드 링커가, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 또는 서열 번호: 259의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 16 항에 있어서,
제 3 항원 결합 부분이, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이 종래형의 Fab 분자인, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 17 항에 있어서,
제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및 124위에 있는 아미노산이 각각, 아르기닌(R) 및 리신(K)이며(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위 및 213위에 있는 아미노산이, 글루탐산(E)인(EU 넘버링에 의한 넘버링), 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 12 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 서열 번호: 20을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 34를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 19 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 12 항, 제 13 항 또는 제 20 항에 있어서,
제 3 항원 결합 부분이,
서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 가변 영역
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 12 항, 제 13 항 또는 제 20 항에 있어서,
Fc 도메인을 추가로 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - (a) 각각이, 인간 CD3 및 인간 CD137에 결합할 수 있는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분으로서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이 인간 CD3 및 인간 CD137 중 어느 한쪽에 결합하고 또한 이하의 (a1)∼(a2) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는 Fab 분자인, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분:
(a1) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3; 및
(a2) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3
(b) 인간 Delta-like 3(DLL3)에 결합하고, 또한 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 항체 가변 영역을 포함하는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하고, 또한 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 23 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a2) 중 어느 하나를 포함하는 항체 가변 영역:
(a1) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(a2) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
상기 적어도 1개의 다이설파이드 결합이, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 191위에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 1개의 다이설파이드 결합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
제 3 항원 결합 부분이 Fab 분자이며, 제 3 항원 결합 부분이, Fab 중쇄의 C말단(CH1)에서, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어 있는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 26 항에 있어서,
상기 펩티드 링커가, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 또는 서열 번호: 259의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 27 항에 있어서,
제 3 항원 결합 부분이, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이고, 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이 종래형의 Fab 분자인, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 28 항에 있어서,
제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및 124위에 있는 아미노산이 각각, 아르기닌(R) 및 리신(K)이며(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위 및 213위에 있는 아미노산이, 글루탐산(E)인(EU 넘버링에 의한 넘버링), 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 23 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 서열 번호: 20을 포함하는 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 34를 포함하는 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48을 포함하는 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63을 포함하는 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73을 포함하는 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 30 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 23 항, 제 24 항 또는 제 31 항에 있어서,
제 3 항원 결합 부분이,
서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 가변 영역
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 23 항, 제 24 항 또는 제 31 항에 있어서,
Fc 도메인을 추가로 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 이하의 (a1) 내지 (a3):
(a1) 서열 번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 208의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5);
(a2) 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5); 및
(a3) 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 및 쇄 5)
으로부터 선택되는 조합 중 어느 하나에 있어서의 5개의 폴리펩티드쇄를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자. - 제 1 항, 제 2 항, 제 9 항, 제 12 항, 제 13 항, 제 20 항, 제 23 항, 제 24 항, 제 31 항 또는 제 34 항의 다중 특이성 항원 결합 분자를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 폴리뉴클레오티드.
- 제 35 항의 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 숙주 세포주.
- a) 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에서 제 36 항의 숙주 세포주를 배양하는 단계, 및
b) 항원 결합 분자를 회수하는 단계
를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하는 방법.
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