TW202325741A

TW202325741A - Dll3靶向之多特異性抗原結合分子及其用途

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Publication number: TW202325741A
Application number: TW112110624A
Authority: TW
Inventors: 直井壯太朗; 馮舒; 井川智之; 菽文何
Original assignee: 日商中外製藥股份有限公司
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2023-07-01
Also published as: KR102505383B1; MX2022012091A; TWI799824B; TW202204409A; KR20220100520A; US20240010725A1; AU2021250186A1; CN115397866A; CL2022002624A1; IL296803A; SG11202105302PA; US20220251201A1; BR112022019498A2; US11718672B2; JP7085666B2; AR121695A1; JP2021159081A; US20210301016A1; EP4126969A4; US11274151B2

Abstract

本揭露提供多特異性抗原結合分子，其包括第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，其中每一個皆可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137；以及可結合至DLL3的第三抗原結合部分，較佳為人類DLL3，其更有效率地誘導T細胞依賴性細胞毒性，同時避免其他多特異性抗原結合分子可能具有的不良毒性問題或副作用。本發明提供藉由包括抗原結合分子作為活性成分的能夠治療不同癌症的多特異性抗原結合分子及醫藥組成物，特別是DLL3相關。

Description

DLL3靶向之多特異性抗原結合分子及其用途

本發明是有關於一種多特異性抗原結合分子，其包括第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，其中每一個皆可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137；及可結合至DLL3之第三抗原結合部分。本發明亦有關於編碼抗原結合分子之核酸；製備抗原結合分子之方法；表現或能夠表現此種抗原結合分子之宿主細胞；包含此種抗原結合分子之組成物；此種抗原結合分子或組成物之用途，特別是癌症疾病領域的治療目的。

癌症是世界上導致死亡的主要原因之一。除某些惡性瘤(carcinoma)外，腫瘤在發現時通常無法手術。傳統的癌症治療方法包括放射療法、化學療法和免疫療法。這些治療往往不夠有效，最終會在治療後發生癌症復發或轉移。缺乏腫瘤特異性是限制最大療效的因素之一；因此，更多的腫瘤特異性分子靶向治療已成為癌症治療中另一個可行的選擇。

抗體因為在血漿中具有高度穩定性且具有很少副作用而作為藥物受到矚目。在許多治療抗體中，一些型態的抗體需要效應細胞而發揮抗腫瘤反應。抗體依賴性細胞介導細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)是效應細胞針對與抗體結合的細胞所展現的細胞毒性，藉由抗體Fc區結合至存在於自然殺手細胞(natural killer cells, NK cells)與巨噬細胞上的Fc受體。直至今日，已發展出多種可誘導ADCC而發揮抗腫瘤效用的治療抗體作為治療癌性的藥品(非專利文獻 1)。使用常規治療性抗體靶向腫瘤特異性表現抗原的療法顯示出優異的抗腫瘤活性，而施用此類抗體並不總是能達到令人滿意的結果。

除了採納NK細胞或巨噬細胞作為效應細胞而誘導ADCC的抗體外，自1980年代起已知有募集T細胞作為效應細胞而採取細胞毒性的T細胞募集抗體(T cell-recruiting antibodies, TR antibodies)(非專利文獻 2至4)。TR抗體是雙特異性抗體，其辨識且結合至形成於T細胞上的T細胞受體複合體的任一次單元，特別是CD3ε鏈，以及癌細胞上抗原。現今正發展著許多TR抗體。針對EpCAM的TR抗體-卡妥索單抗(Catumaxomab)已於歐盟批准用於治療惡性腹水。再者，近來已發現稱為「雙特異性T細胞銜接蛋白(bispecific T-cell engager, BiTE)」的一種TR抗體展現出強烈的抗腫瘤活性(非專利文獻5與6)。百利妥單抗(Blinatumomab)為一種針對CD19的BiTE分子，首度於2014年受到FDA批准。與誘導抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)與補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity, CDC)的利妥昔單抗(Rituximab)相比，已證實百利妥單抗對體外的CD19/CD20陽性癌細胞展現出更強的細胞毒性活性(非專利文獻7)。

然而，已知三功能性抗體以癌抗原非依賴性的方式同時結合至T細胞及如NK細胞或巨噬細胞的細胞兩者，且因此表現於細胞上的受體交聯，並以抗原非依賴性的方式誘導各種細胞激素的表現。系統性投予三功能性抗體由於誘導了此種細胞激素的表現而被認為會導致類細胞激素風暴的副作用。事實上，已有報導指出在一期臨床試驗中，每個個體5微克的超低劑量是對患有非小細胞肺癌的患者系統性投予卡妥索單抗的最大耐受劑量，且投予較高的劑量導致了各種嚴重的副作用(非專利文獻8)。當以此低劑量投予時，卡妥索單抗可能會從未達到有效血液水準。亦即，以此低劑量投予卡妥索單抗可能無法達到預期的抗腫瘤效果。

同時，與卡妥索單抗不同，BiTE不具有Fcγ受體結合位，因此不會以癌抗原非依賴性的方式與T細胞及如NK細胞與巨噬細胞的細胞上表現的受體交聯。因此，已經證明BiTE不會引起癌症抗原非依賴性細胞因子的誘導，其為在給予卡妥昔單抗(catumaxomab)時觀察的結果。然而，因為BiTE是經修飾且不具有Fc區的低分子量抗體分子，故問題在於，在投予至患者後其血液半衰期明顯比常規作為治療抗體的IgG型抗體更短。事實上，已有報導指出體內投予的BiTE的血液半衰期約為數個小時(非專利文獻9與10)。在百利妥單抗的臨床試驗中，使用微幫浦連續靜脈輸注投予百利妥單抗。此投予方法不僅對患者極為不便，還因為設備故障等因素而存在引發醫療事故的潛在風險。因此，這樣的投予方法不能說是合乎需求的。

Delta-like 3 (DLL3)是屬於Notch配體家族成員的I型膜蛋白。DLL3是正常體節形成和塑形化(patterning)所必需的。DLL3中的突變在染色體隱性脊椎肋骨發育不良(autosomal recessive spondylocostal dysostosis) 的患者會導致肋骨缺損或椎關節病變(spondylolysis) (非專利文獻11與12)。已有先前研究報導，染色體上DLL3基因的擴增以及該基因在癌細胞株中的表現增加(非專利文獻 13)，以及在一些神經膠質瘤案例中DLL3的表現量增加(非專利文獻14)。此外，除了SCLC，DLL3先前已被報導用於治療及診斷神經膠質瘤的方法中，其使用增強ADCC的抗體，抗體-藥物複合體(ADC)，及使用BiTE-Fc 型式的T細胞銜接(engaging)雙特異性分子(專利文獻1、2與3)。 [文獻列表] [專利文獻]

[專利文獻 1] WO 2011/093097 [專利文獻 2] WO 2013/126746 [專利文獻 3] WO 2017/021349 [非專利文獻]

[非專利文獻1] Clin Cancer Res. 2010 Jan 1;16(1):11-20 [非專利文獻2] Nature. 1985 Apr 18-24;314(6012):628-31. [非專利文獻3] Int J Cancer. 1988 Apr 15;41(4):609-15. [非專利文獻4] Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Mar;83(5):1453-7. [非專利文獻5] Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Jul 18;92(15):7021-5. [非專利文獻6] Drug Discov Today. 2005 Sep 15;10(18):1237-44. [非專利文獻7] Int J Cancer. 2002 Aug 20;100(6):690-7. [非專利文獻8] Cancer Immunol Immunother (2007) 56 (10), 1637-44 [非專利文獻9] Cancer Immunol Immunother. (2006) 55 (5), 503-14 [非專利文獻10] Cancer Immunol Immunother. (2009) 58 (1), 95-109 [非專利文獻11] Bulman, M. P. et al. (2000) Nat Genet 24, 438-441 [非專利文獻12] Turnpenny, P. D. et al. (2003) J Med Genet 40, 333-339 [非專利文獻13] Phillips, H. S. (2006) Cancer Cell 9, 157-173 [非專利文獻14] Mulledndore, M. E. (2009) Clin Cancer Res 15, 2291-2301

[技術問題]

本發明的一個目標是提供一種多特異性抗原結合分子，其能夠將T細胞募集至DLL-3表現細胞，並利用T細胞之細胞毒性而對抗表現DLL-3癌細胞藉此治療癌症，多特異性抗原結合分子的製造方法，及包括此多特異性抗原結合分子作為活性成分(active ingredient)而誘導細胞毒性之治療劑。本發明的另一個目標是提供用於治療或預防多種癌症之醫藥組成物，其包括至少一種上述之抗原結合分子作為活性成分，以及使用此醫藥組成物之治療方法。 [解決問題的手段]

本發明是關於一種多特異性抗原結合分子，其包括第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，其中每一個皆可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137 (例如，可結合至CD3及CD137但並非同步地)；及可結合至DLL3之第三抗原結合部分，較佳為人類DLL3，其更有效地誘導T細胞依賴性細胞毒性，同時避免其他多特異性抗原結合分子可能具有的不良毒性問題或副作用。本發明提供多特異性抗原結合分子及醫藥組成物，藉由包括該抗原結合分子作為活性成分而可治療不同癌症，特別是與DLL3相關，例如DLL3-陽性腫瘤。

在一態樣，本發明之多特異性抗原結合分子具有非常獨特的結構型式，其改善或提高多特異性抗原結合分子的功效。此具有獨特的結構型式之新穎抗原結合分子，提供增加數量的抗原結合域以增加效價及/或特異性用以針對效應細胞和目標細胞上的相應抗原，減少不必要的副作用。

在一特定態樣，本發明是有關於多特異性抗原結合分子，其包括第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，其中每一個皆可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137 (例如，可結合至CD3及CD137但並非同步地)；及可結合至DLL3之第三抗原結合部分，較佳為人類DLL3，其有效地誘導T細胞依賴性細胞毒性同時避免其他多特異性抗原結合分子可能具有的不良毒性問題或副作用。在一此種態樣，每一個第一及第二抗原結合部分包括至少一個胺基酸突變，例如半胱胺酸插入/取代/突變，其在第一及第二抗原結合部分之間產生雙硫鍵使其彼此接近，並且，例如由於兩個Dual-Fab之間的空間阻礙或縮短距離，提供順式抗原結合(cis-antigen binding)至在相同單一效應細胞上之抗原(CD3及/或CD137)，因此藉由抑制兩個表現CD3/CD137免疫細胞之間經由兩個Dual-Fab的DLL3非依賴性方式(manner)的不期望的交聯，而改善三特異性Ab的安全性概況(safety profile)。在一具體態樣，所述每一第一抗原結合部分及第二抗原結合部分為Fab，且在CH1區包括至少一個半胱胺酸殘基(經由突變、取代或插入)，所述至少一個半胱胺酸殘基能夠在第一抗原結合部分的CH1區及第二抗原結合分子部分的CH1區之間形成至少一個雙硫鍵。在另一具體態樣，所述每一第一抗原結合部分及第二抗原結合部分在CH1區依照EU編號第191位包括一個半胱胺酸殘基(經由突變、取代或插入)，其在第一抗原結合部分的CH1區及第二抗原結合分子部分的CH1區之間之間形成一個雙硫鍵。

具有此種獨特結構型式的抗原結合分子，令人驚異的發現與其他多特異性抗體型式(例如BiTE)相比，顯示更優良的功效，同時具有降低的或是最小化的歸因於在兩個不同細胞(例如效應細胞，如T細胞)之間不期望的交聯所造成的脫靶(off-target)副作用。

更具體而言，本揭露提供下述者： [1] 一種多特異性抗原結合分子，包括：第一抗原結合部分(moiety)及第二抗原結合部分，每一者皆可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137；及第三抗原結合部分，其可結合至第三抗原，較佳為表現在癌細胞/組織之抗原。 [1A] 一種多特異性抗原結合分子，包括：第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，每一者皆可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137；及第三抗原結合部分，其可結合至DLL3，較佳為人類DLL3。 [2] 如[1]至[1A]任一者之多特異性抗原結合分子，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分每一皆包括包括下述(a1)至(a17)中之任一者之抗體可變區： (a1) SEQ ID NO: 17的重鏈互補決定區(complementarity determining region，CDR) 1，SEQ ID NO: 31的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 45的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 64的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 69的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 74的輕鏈CDR 3； (a2) SEQ ID NO: 18的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 32的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 46的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2 及SEQ ID NO: 73輕鏈CDR 3； (a3) SEQ ID NO: 19的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a4) SEQ ID NO: 19的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3； (a5) SEQ ID NO: 20的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a6) SEQ ID NO: 22的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 36的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 50的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a7) SEQ ID NO: 23的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a8) SEQ ID NO: 23的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a9)SEQ ID NO: 24的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 38的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 52的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a10)SEQ ID NO: 25的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 39的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 53的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a11) SEQ ID NO: 26的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a12) SEQ ID NO: 26的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a13) SEQ ID NO: 27的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 41的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 55的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a14) SEQ ID NO: 28的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 42的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 56的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a15) SEQ ID NO: 82的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 83的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 84的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3； (a16) 結合至與選自(a1)至(a15)中之任一抗體可變區相同的抗原決定位(epitope)之抗體可變區；及 (a17) 抗體可變片段，其與選自(a1)至(a15)中之任一的抗體可變片段的結合進行競爭。 [3] 如[1]至[2]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分每一皆包括抗體可變區，其包括下述 (a1)至(a17)之任一者： (a1) 包括SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a2) 包括SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a3) 包括SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a4) 包括SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a5) 包括SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a6) 包括SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a7) 包括SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a8) 包括SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a9) 包括SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a10) 包括SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a11) 包括SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a12) 包括SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a13) 包括SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a14) 包括SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區；以及 (a15) 包括SEQ ID NO: 81的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的輕鏈可變區， (a16) 結合至與選自(a1)至(a15)中之任一抗體可變區相同的抗原決定位(epitope)之抗體可變區；及 (a17) 抗體可變片段，其與選自(a1)至(a15)中之任一的抗體可變片段的結合進行競爭。 [4] 如[1]至[3]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中第一抗原結合分子部分及第二抗原結合分子部分每一者為Fab分子，且包括至少一個雙硫鍵形成於第一抗原結合部分的CH1區及第二抗原結合分子部分的CH1區之間。 [4A] 如[4]之多特異性抗原結合分子，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分每一者為Fab分子，且包括一雙硫鍵形成於第一抗原結合部分及第二抗原結合分子部分各自的CH1區的依照EU編號為第191位的胺基酸殘基。 [5] 如[1]至[4A]任一者之多特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分與第一抗原結合部分或第二抗原結合部分之任一者融合(fused)。 [5A] 如[5]之多特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分為Fab或scFv。 [6] 如[5]至[5A]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中第一、第二及第三抗原結合部分每一者為Fab分子，其中第三抗原結合部分的Fab重鏈(CH1)C端融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分任一者的Fab重鏈N端，可選地經由胜肽連接子。 [6A] 如[5]至[6]任一者之多特異性抗原結合分子，其中所述胜肽連接子選自由SEQ ID NO: 248、SEQ ID NO: 249或SEQ ID NO: 259之胺基酸序列所組成的群組。 [6B] 如[1]至[6A]任一者之多特異性抗原結合分子，其中第一抗原結合部分等同於第二抗原結合部分。 [7] 如[1]至[6B]任一者之多特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分為互換型(crossover)Fab分子，其Fab輕鏈與Fab重鏈的可變區交換，且其中第一及第二抗原結合部分每一者為傳統(conventional)Fab分子。 [8] 如[7]之多特異性抗原結合分子，其中在每一第一及第二抗原結合部分的輕鏈恆定域CL中，第123位及/或第124位的胺基酸獨立地以離胺酸(K) 、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且其中在每一第一及第二抗原結合部分的重鏈恆定域CH1中，第147位的胺基酸及/或第213位的胺基酸獨立地以麩胺酸(E)或天門冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 [9] 如[8]之多特異性抗原結合分子，其中在每一第一及第二抗原結合部分的輕鏈恆定域CL中，第123位與第124位的胺基酸分別為精胺酸(R)與離胺酸(K)(根據Kabat編號)，且其中在每一第一及第二抗原結合部分的重鏈恆定域CH1中，第147位與第213位的胺基酸為麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)。 [10] 如[1]至[9]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中可結合至DLL3的第三抗原結合部分包括抗體可變區，其包括下述(a1)至(a5)中之任一者： (a1) SEQ ID NO: 233的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 234的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 235的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 237的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 238的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 239的輕鏈CDR 3； (a2) SEQ ID NO: 276的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 277的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 278的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 279的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 280的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 281的輕鏈CDR 3； (a3) SEQ ID NO: 285的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 286的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 287的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 288的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 289的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 290的輕鏈CDR 3； (a4) 結合至與選擇自(a1)中(a3)之任一個抗體可變區相同的抗原決定位之抗體可變區；及 (a5) 與選擇自(a1)中(a3)之任一個之抗體可變片段的結合進行競爭之抗體可變片段。 [11] 如[1]至[10]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中可結合至DLL3的第三抗原結合部分包括抗體可變區，其包括下述(a1)至(a6)中任一者： (a1)包括SEQ ID NO: 232的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 236的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a2)包括SEQ ID NO: 264的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 265的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a3)包括SEQ ID NO: 266的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 267的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a4)包括SEQ ID NO: 268的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 269的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a5) 結合至與選擇自(a1)中(a4)之任一個抗體可變區相同的抗原決定位之抗體可變區；及 (a6) 與選擇自(a1)中(a4)之任一個之抗體可變片段的結合進行競爭之抗體可變片段。 [12] 如[1]至[11]中任一者之多特異性抗原結合分子，更包括一Fc域(Fc domain)。 [12A] 如[12]之多特異性抗原結合分子，其中Fc域由可穩定締合的第一Fc區次單元與第二Fc區次單元所形成，且其中與天然的人類IgG1的Fc域相比，上述Fc域對人類Fcγ受體展現出減弱的結合親和性。 [12B] 如[12A]之多特異性抗原結合分子，其中第一Fc區次單元選擇自包括下列所組成之群組： (a1)包括第234位為Ala及第235位為Ala之Fc區多肽； (a2)包括第234位為Ala，第235位為Ala，及第297位為Ala之Fc區多肽； (a3)包括第234位為Ala，第235位為Ala，第297位為Ala，第354位為Cys及第366位為Trp之Fc區多肽；及其中第二Fc區次單元選擇自包括下列所組成之群組： (a4)包括第234位為Ala及第235位為Ala之Fc區多肽； (a5)包括第234位為Ala，第235位為Ala，及第297位為Ala之Fc區多肽； (a6)包括第234位為Ala，第235位為Ala，第297位為Ala，第349位為Cys，第366位為Ser，第368位為Ala及第407位為Val之Fc區多肽；且其中胺基酸位置係使用EU索引編號而進行編號。 [12C] 如[12]至[12B]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中Fc域相較於天然IgG的Fc區、在酸性pH環境(例如，pH 5.8)下具有增強的FcRn結合活性。 [12D] 如[12C]之多特異性抗原結合分子，其中Fc域包括依照EU編號第434位為Ala；第438位為Glu、Arg、Ser、或Lys；及第440位為Glu、Asp、或Gln。 [12E] 如[12D]之多特異性抗原結合分子，其中Fc域包括依照EU編號第434位為Ala；第438位為Arg或Ly；及第440位為Glu或Asp。 [12F] 如[12E]之多特異性抗原結合分子，其中Fc域更包括依照EU編號第428位為Ile或Leu；及/或第436位為Ile、Leu、Val、Thr或Phe。 [12G] 如[12C]至[12F]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中Fc域包括胺基酸取代的組合，其選自由下述組成之群組：依照EU編號， (a) N434A/Q438R/S440E； (b) N434A/Q438R/S440D； (c) N434A/Q438K/S440E； (d) N434A/Q438K/S440D； (e) N434A/Y436T/Q438R/S440E； (f) N434A/Y436T/Q438R/S440D； (g) N434A/Y436T/Q438K/S440E； (h) N434A/Y436T/Q438K/S440D； (i) N434A/Y436V/Q438R/S440E； (j) N434A/Y436V/Q438R/S440D； (k) N434A/Y436V/Q438K/S440E； (l) N434A/Y436V/Q438K/S440D； (m) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E； (n) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D； (o) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E； (p) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D； (q) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E； (r) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D； (s) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E； (t) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D； (u) M428L/N434A/Q438R/S440E； (v) M428L/N434A/Q438R/S440D； (w) M428L/N434A/Q438K/S440E； (x) M428L/N434A/Q438K/S440D； (y) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E； (z) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D； (aa) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E； (ab) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D； (ac) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E； (ad) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D； (ae) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E； (af) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D； (ag) L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；及 (ah)L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E。 [12H] 如[12C]至[12G]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中Fc域包括M428L/N434A/Q438R/S440E之胺基酸取代的組合。 [12I] 如[12]至[12H]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中Fc域為IgG Fc域，較佳為人類IgG Fc域，更佳為人類IgG1 Fc域。 [12J] 如[12]至[12I]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中Fc域包括下述任一者： (a) 第一Fc次單元，包括如SEQ ID NO: 100所示之胺基酸序列，及第二Fc次單元，包括如SEQ ID NO: 111所示之胺基酸序列；及 (b) 第一Fc次單元，包括如SEQ ID NO: 99所示之胺基酸序列，及第二Fc次單元，包括如SEQ ID NO: 109所示之胺基酸序列。 [12K] 如[12]至[12J]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中第一及第二抗原結合部分每一者為Fab，其中第一抗原結合部分的Fab重鏈C端融合至Fc域的第一或第二次單元的N端，及第二抗原結合部分的Fab重鏈的C端融合至Fc域剩餘的次單元的N端。 [12L] 如[12K]之多特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分的C端融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分任一者之Fab重鏈的N端，可選地經由胜肽連接子。 [13] 如[1]至[12L]中之任一者之多特異性抗原結合分子，其包括選自下述(a1)至(a15)任一者之5個多肽鏈組合： (a1) 包括SEQ ID NO: 201的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 208的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈 (鏈4 & 鏈5)； (a2) 包括SEQ ID NO: 203的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a3) 包括SEQ ID NO: 204的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a4) 包括SEQ ID NO: 205的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a5) 包括SEQ ID NO: 216的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 229的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a6) 包括SEQ ID NO: 217的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 210的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a7) 包括SEQ ID NO: 219的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 211的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a8) 包括SEQ ID NO: 220的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 211的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a9) 包括SEQ ID NO: 221的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 211的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a10) 包括SEQ ID NO: 222的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 230的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a11) 包括SEQ ID NO: 223的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 212的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a12) 包括SEQ ID NO: 225的胺基酸序列的多肽鏈 (鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 213的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a13) 包括SEQ ID NO: 226的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 213的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a14) 包括SEQ ID NO: 227的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 213的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)；及 (a15) 包括SEQ ID NO: 228的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 231的胺基酸序列的多肽鏈 (鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)；且其中較佳為5個多肽鏈(鏈1至鏈5)較佳是根據圖1(a)所示的方向彼此連接及/或締合。 [14] 一種單離的多核苷酸或複數個多核苷酸，其編碼如[1]至[13]中任一者之多特異性抗原結合分子。 [15] 一種載體，其編碼如[14]之多核苷酸或複數個多核苷酸。 [16] 一種宿主細胞，包括如[14]之多核苷酸或複數個多核苷酸，或如[15]之載體。 [17] 一種如[1]至[13]中任一者之多特異性抗原結合分子的製造方法，包括以下步驟： (a) 在適合表現上述抗原結合分子的條件下，培養如[16]之宿主細胞；以及 (b) 回收上述抗原結合分子。 [17A] 一種多特異性抗原結合分子，係利用如[17]之方法所製造。 [18] 一種醫藥組成物，包括如[1]至[13]中任一者之多特異性抗原結合分子以及醫藥上可接受的載劑。 [19] 如[1]至[13]中任一者之多特異性抗原結合分子或如[18]之醫藥組成物，其誘導細胞毒性，較佳為T細胞依賴性細胞毒性。 [20] 如[1]至[13]中任一者之多特異性抗原結合分子或如[18]之醫藥組成物，其用作為藥物。 [21] 如[1]至[13]中任一者之多特異性抗原結合分子或如[18]之醫藥組成物，其係用於治療或預防有需要的個體中的疾病。 [22] 如[21]之多特異性抗原結合分子或醫藥組成物之用於治療或預防疾病，其中疾病為癌症。 [22A] 如[22]之多特異性抗原結合分子或醫藥組成物之用於治療或預防疾病，其中癌症為表現DLL3癌症或DLL3陽性癌症。 [22B] 如[22]或[22B]之多特異性抗原結合分子或醫藥組成物之用於治療或預防疾病，其中癌症為肺癌(包含小細胞肺癌)及黑色素瘤。 [23] 一種如[1]至[13]中任一者之多特異性抗原結合分子或如[18]之醫藥組成物之用途，用於製備用於治療或預防有需要的個體中的疾病之藥物+。 [24] 一種治療個體中疾病的方法，包括對上述個體投予治療有效量之組成物，其包括如[1]至[13]中任一者之多特異性抗原結合分子或如[18]之醫藥組成物。 [25] 如[23]之用途或如[24]之方法，其中疾病為癌症，較佳為DLL3陽性癌症或表現DLL3癌症。 [25A] 如[25]之用途或方法，其中癌症為表現DLL3癌症或DLL3陽性癌症。 [25B] 如[25]之用途或方法，其中癌症為肺癌(包含小細胞肺癌)或黑色素瘤。 [26] 一種誘導目標細胞裂解的方法，包括在T細胞存在下，使目標細胞與如[1]至[13]中任一者之多特異性抗原結合分子或如[18]之醫藥組成物接觸。 [27] 一種套組，包括如[18]之醫藥組成物以及藥品仿單(package insert)，藥品仿單包括投予至對象的說明，以治療或延遲癌症進程，較佳為DLL3陽性癌症或表現DLL3癌症。 [27A] 如[27]之套組，其中癌症為肺癌(包含小細胞肺癌)及黑色素瘤。

本發明的另一態樣是關於： [28] 一多特異性抗原結合分子，包括：可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137之抗原結合部分；及可結合至DLL3之抗原結合部分，較佳為人類DLL3。 [29] 如[28]之多特異性抗原結合分子，其中可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137之抗原結合部分，包括抗體可變區，其包括下述(a1)至(a17)中之任一項： (a1) SEQ ID NO: 17的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 31的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 45的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 64的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 69的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 74的輕鏈CDR 3； (a2) SEQ ID NO: 18的重鏈互補決定區(CDR) 1 ，SEQ ID NO: 32的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 46的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a3) SEQ ID NO: 19的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a4) SEQ ID NO: 19的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3； (a5) SEQ ID NO: 20的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a6) SEQ ID NO: 22的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 36的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 50的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a7) SEQ ID NO: 23的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a8) SEQ ID NO: 23的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a9)SEQ ID NO: 24的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 38的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 52的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a10)SEQ ID NO: 25的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 39的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 53的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a11) SEQ ID NO: 26的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a12) SEQ ID NO: 26的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a13) SEQ ID NO: 27的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 41的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 55的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a14) SEQ ID NO: 28的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 42的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 56的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a15) SEQ ID NO: 82的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 83的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 84的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3； (a16) 結合至與選自(a1)至(a15)中之任一抗體可變區相同的抗原決定位(epitope)之抗體可變區；及 (a17) 抗體可變片段，其與選自(a1)至(a15) 任一的抗體可變片段的結合進行競爭。 [30] 如[28]至[29]任一者之多特異性抗原結合分子，其中可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137之抗原結合部分，包括抗體可變區，其包括下述(a1)至(a17)中之任一者： (a1)包括SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a2)包括SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a3)包括SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a4)包括SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a5)包括SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a6)包括SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a7)包括SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a8)包括SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a9)包括SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a10)包括SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a11)包括SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a12)包括SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a13)包括SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a14)包括SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a15)包括SEQ ID NO: 81的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a16) 結合至與選擇自(a1)中(a15)之任一個抗體可變區相同的抗原決定位之抗體可變區；及 (a17) 與選擇自(a1)中(a15)之任一個之抗體可變片段的結合進行競爭之抗體可變片段。

在本發明之另一態樣是關於： [31]一種多特異性抗原結合分子，其包括選自下述(a1)至(a15)任一者之5個多肽鏈組合： (a1) 包括SEQ ID NO: 201的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 208的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a2) 包括SEQ ID NO: 203的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a3) 包括SEQ ID NO: 204的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈 (鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a4) 包括SEQ ID NO: 205的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a5) 包括SEQ ID NO: 216的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 229的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a6) 包括SEQ ID NO: 217的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 210的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a7) 包括SEQ ID NO: 219的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 211的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a8) 包括SEQ ID NO: 220的胺基酸序列的多肽鏈 (鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 211的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a9) 包括SEQ ID NO: 221的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 211的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a10) 包括SEQ ID NO: 222的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 230的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a11) 包括SEQ ID NO: 223的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 212的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a12) 包括SEQ ID NO: 225的胺基酸序列的多肽鏈 (鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 213的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a13) 包括SEQ ID NO: 226的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 213的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)； (a14) 包括SEQ ID NO: 227的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 213的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)；及 (a15) 包括SEQ ID NO: 228的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 231的胺基酸序列的多肽鏈 (鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)；且其中5個多肽鏈(鏈1至鏈5)較佳是根據圖1(a)所示的方向彼此連接及/或締合。

本發明之又一態樣是關於： [32] 一種可結合至DLL3之抗原結合分子，其包括抗體可變區包含下述(a1)至(a5)中任一者： (a1) SEQ ID NO: 233的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 234的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 235的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 237的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 238的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 239的輕鏈CDR 3； (a2) SEQ ID NO: 276的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 277的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 278的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 279的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 280的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 281的輕鏈CDR 3； (a3) SEQ ID NO: 285的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 286的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 287的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 288的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 289的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 290的輕鏈CDR 3； (a4) 結合至與選自(a1)至(a3)中之任一抗體可變區相同的抗原決定位之抗體可變區；及 (a5) 抗體可變片段，其與選自(a1)至(a3) 任一者的抗體可變片段的結合進行競爭。 [33] 一種可結合至DLL3之抗原結合分子，其包括抗體可變區，包括下述(a1)至(a6)中任一者： (a1)包括SEQ ID NO: 232的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 236的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a2)包括SEQ ID NO: 264的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 265的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a3)包括SEQ ID NO: 266的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 267的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a4)包括SEQ ID NO: 268的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 269的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a5) 結合至與選自(a1)至(a4)中之任一抗體可變區相同的抗原決定位之抗體可變區；及 (a6) 抗體可變片段，其與選自(a1)至(a4)任一者的抗體可變片段的結合競爭。本發明之又另一態樣是有關於： [2-1] 一種多特異性抗原結合分子，其包括： (a) 第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，任一者皆可結合至人類CD3且包括抗體可變區，其可相同亦可相異，獨立地選自由下述所組成之群組： (a1)抗體可變區包括SEQ ID NO: 17的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 31的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 45的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 64的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 69的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 74的輕鏈CDR 3； (a2) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 18的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 32的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 46的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a3) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 19的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a4) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 19的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3； (a5) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 20的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a6) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 22的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 36的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 50的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a7) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 23的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a8) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 23的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a9) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 24的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 38的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 52的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a10) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 25的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 39的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 53的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a11) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 26的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a12) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 26的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a13) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 27的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 41的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 55的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a14) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 28的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 42的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 56的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3；及 (a15) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 82的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 83的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 84的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3；及 (b) 第三抗原結合部分，其結合至人類Delta-like 3 (DLL3)且包括抗體可變區包含包括SEQ ID NO: 233的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 234的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 235的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 237的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 238的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 239的輕鏈CDR 3。 [2-2] 如[2-1]之多特異性抗原結合分子，其中每一個第一及第二抗原結合部分皆包括抗體可變區，其可相同亦可相異，獨立地選自由下述所組成之群組： (a1)包括SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a2)包括SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a3)包括SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a4)包括SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a5)包括SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a6)包括SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a7)包括SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a8)包括SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a9)包括SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a10)包括SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a11)包括SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a12)包括SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a13)包括SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a14)包括SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區；及 (a15)包括SEQ ID NO: 81的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [2-2A] 如[2-1]至[2-2]任一者之多特異性抗原結合分子，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分每一者皆包括抗體可變區包括SEQ ID NO: 20的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3。 [2-2B] 如[2-2A]之多特異性抗原結合分子，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分每一者皆包括抗體可變區包括包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [2-2C] 如[2-1]至[2-2B]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分包括抗體可變區，其包括包含SEQ ID NO: 232的VH及包含SEQ ID NO: 236之VL。 [2-3] 如[2-1]至[2-2C]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中每一第一及第二抗原結合部分為Fab，其在第191位(EU編號)具有半胱胺酸殘基，且其中具有雙硫鍵連結兩個半胱胺酸殘基。 [2-4] 如[2-3]之多特異性抗原結合分子，其中每一第一、第二及第三抗原結合部分皆為Fab，包含包括VH及 CH1域之重鏈以及包括VL及輕鏈恆定(CL)域之輕鏈，且其中第三抗原結合部分的重鏈C端直接或經由胜肽連接子融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分任一者的Fab重鏈N端。 [2-5] 如[2-4]之多特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分的重鏈C端經由胜肽連接子融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分任一者的Fab重鏈N端，且其中胜肽連接子具有選自由SEQ ID NO: 248、SEQ ID NO: 249、及SEQ ID NO: 259所組成之群組之胺基酸序列。 [2-6] 如[2-5]之多特異性抗原結合分子，其中在每一第一及第二抗原結合部分的CL域，第123及124位(Kabat編號)的胺基酸分別為精胺酸及離胺酸；且其中，在每一第一及第二抗原結合部分的CH1域，在每一第147及213位(EU編號)胺基酸為麩胺酸。 [2-7] 如[2-6]之多特異性抗原結合分子，更包括Fc域。 [2-8] 如[2-7]之多特異性抗原結合分子，其中Fc域包括第一及第二Fc區次單元，第一Fc區次單元選擇自包括下列之群組：在第234及235位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；及在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸，第354位為半胱胺酸，及第366位為色胺酸之Fc區多肽；及第二Fc區次單元選擇自包括下列之群組：在第234及235位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；及在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸，第349位為半胱胺酸，第366位為絲胺酸，丙胺酸第368位，及第407位為纈胺酸之Fc區多肽，其中所有位置為EU編號。又本發明之另一態樣是關於： [3-1] 一種多特異性抗原結合分子，其包括： (a) 第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，每一個結合至人類CD137且包括抗體可變區，其可相同亦可相異，獨立地選自由下述所組成之群組： (a1) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 17的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 31的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 45的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 64的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 69的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 74的輕鏈CDR 3； (a2) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 18的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 32的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 46的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a3) 抗體可變區包括 SEQ ID NO: 19的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a4) 抗體可變區包括 SEQ ID NO: 19的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3； (a5) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 20的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a6) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 22的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 36的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 50的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a7) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 23的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a8) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 23的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a9) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 24的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 38的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 52的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a10) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 25的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 39的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 53的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a11) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 26的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a12) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 26的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a13) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 27的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 41的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 55的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a14) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 28的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 42的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 56的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3；及 (a15) 抗體可變區包括SEQ ID NO: 82的重鏈互補決定區(CDR) 1 ，SEQ ID NO: 83的重鏈CDR 2 ，SEQ ID NO: 84的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3；及 (b) 第三抗原結合部分，其結合至人類Delta-like 3 (DLL3)且包括抗體可變區包含包括SEQ ID NO: 233的重鏈CDR1，包括SEQ ID NO: 234的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 235的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 237的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 238的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 239的輕鏈CDR 3。 [3-2] 如[3-1]之多特異性抗原結合分子，其中每一個第一及第二抗原結合部分皆包括抗體可變區，其可相同亦可相異，獨立地選自由下述所組成之群組： (a1)包括SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a2)包括SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a3)包括SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a4)包括SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a5)包括SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a6)包括SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a7)包括SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a8)包括SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a9)包括SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a10)包括SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a11)包括SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a12)包括SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a13)包括SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區； (a14)包括SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區；及 (a15)包括SEQ ID NO: 81的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [3-2A] 如[3-1]至[3-2]任一者之多特異性抗原結合分子，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分每一者皆包括抗體可變區，包括SEQ ID NO: 20的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3。 [3-2B] 如[3-2A]之多特異性抗原結合分子，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分每一者皆包括抗體可變區，其包含包括SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [3-2C] 如[3-1]至[3-2B]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分包括抗體可變區，其包括SEQ ID NO: 232的VH 及包括SEQ ID NO: 236的VL。 [3-3] 如[3-1]至[3-2C]中任一者之多特異性抗原結合分子，其中每一個第一及第二抗原結合部分皆為Fab，其在第191位(EU編號)具有半胱胺酸殘基，且其中具有雙硫鍵連結兩個半胱胺酸殘基。 [3-4] 如[3-3]之多特異性抗原結合分子，其中每一個第一、第二及第三抗原結合部分為Fab，其包含包括VH 及CH1域之重鏈與包括VL及輕鏈恆定(CL)域之輕鏈，且其中第三抗原結合部分的重鏈C端、直接或經由胜肽連接子融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分任一者的Fab重鏈N端。 [3-5] 如[3-4]之多特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分的重鏈C端經由胜肽連接子融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分任一者的Fab重鏈N端，且其中胜肽連接子具有選擇自由SEQ ID NO: 248、SEQ ID NO: 249、及SEQ ID NO: 259組成之群組之胺基酸序列。 [3-6] 如[3-5]之多特異性抗原結合分子，其中在每一個第一及第二抗原結合部分的CL域，第123及124位(Kabat編號)的胺基酸分別為精胺酸及離胺酸；且其中在每一個第一及第二抗原結合部分的CH1域，在每一個第147及213位 (EU編號)的胺基酸為麩胺酸。 [3-7] 如[3-6]之多特異性抗原結合分子，更包括Fc域。 [3-8] 如[3-7]之多特異性抗原結合分子，其中Fc域包括第一及第二Fc區次單元，第一Fc區次單元選擇自包括下述之群組：在第234及235位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；及在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸，第354位為半胱胺酸，與第366位為色胺酸之Fc區多肽；及第二Fc區次單元選擇自包括下述之群組：在第234及235位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；及在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸，第349位為半胱胺酸，第366位為絲胺酸，第368位丙胺酸，與第407位為纈胺酸之Fc區多肽，其中所有位置依照EU編號。本發明之又一態樣是有關於： [4-1] 一種多特異性抗原結合分子，其包括： (a) 第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，每一者結合至人類CD3且包括抗體可變區，其可相同亦可相異，獨立地選自由(a1)至(a15)所組成之群組： (a1)包含包括SEQ ID NO: 17的重鏈互補決定區(CDR) 1，包括SEQ ID NO: 31的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 45的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 64的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 69的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 74的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a2)包含包括SEQ ID NO: 18的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 32的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 46的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a3)包含包括SEQ ID NO: 19的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a4)包含包括SEQ ID NO: 19的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a5)包含包括SEQ ID NO: 20的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a6)包含包括SEQ ID NO: 22的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 36的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 50的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a7)包含包括SEQ ID NO: 23的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a8)包含包括SEQ ID NO: 23的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a9)包含包括SEQ ID NO: 24的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 38的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 52的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a10)包含包括SEQ ID NO: 25的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 39的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 53的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a11)包含包括SEQ ID NO: 26的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a12)包含包括SEQ ID NO: 26的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a13)包含包括SEQ ID NO: 27的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 41的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 55的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3之抗體可變區； (a14)包含包括SEQ ID NO: 28的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 42的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 56的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3之抗體可變區；及 (a15)包含包括SEQ ID NO: 82的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 83的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 84的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3之抗體可變區；及 (b) 第三抗原結合部分其結合至人類Delta-like 3 (DLL3)且包括抗體可變區，包含包括SEQ ID NO: 233的重鏈CDR1，包括SEQ ID NO: 234的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 235的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 237的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 238的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 239的輕鏈CDR 3。 [4-2] 一種多特異性抗原結合分子，其包括： (a) 第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，每一者皆包括抗體可變區，其可相同亦可相異，獨立地選自由下述所組成之群組： (a1)包含包括SEQ ID NO: 3的重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO: 59的輕鏈可變區(VL)之抗體可變區； (a2)包含包括SEQ ID NO: 4的VH及包括SEQ ID NO: 58的VL之抗體可變區； (a3)包含包括SEQ ID NO: 5的VH及包括SEQ ID NO:58的VL之抗體可變區； (a4)包含包括SEQ ID NO: 5的VH及包括SEQ ID NO: 60的VL之抗體可變區； (a5)包含包括SEQ ID NO: 6的VH及包括SEQ ID NO: 58的VL之抗體可變區； (a6)包含包括SEQ ID NO: 8的VH及包括SEQ ID NO: 58的VL之抗體可變區； (a7)包含包括SEQ ID NO: 9的VH及包括SEQ ID NO: 58的VL之抗體可變區； (a8)包含包括SEQ ID NO: 9的VH及包括SEQ ID NO: 61的VL之抗體可變區； (a9)包含包括SEQ ID NO: 10的VH及包括SEQ ID NO: 58的VL之抗體可變區； (a10)包含包括SEQ ID NO: 11的VH及包括SEQ ID NO: 61的VL之抗體可變區； (a11)包含包括SEQ ID NO: 12的VH及包括SEQ ID NO: 61的VL之抗體可變區； (a12)包含包括SEQ ID NO: 12的VH及包括SEQ ID NO: 58的VL之抗體可變區； (a13)包含包括SEQ ID NO: 13的VH及包括SEQ ID NO: 58的VL之抗體可變區； (a14)包含包括SEQ ID NO: 14的VH及包括SEQ ID NO: 58的VL之抗體可變區；及 (a15)包含包括SEQ ID NO: 81的VH及包括SEQ ID NO: 60的VL之抗體可變區；及 (b) 第三抗原結合部分包括抗體可變區，其包含包括SEQ ID NO: 232的VH及包括SEQ ID NO: 236的VL。 [4-3] 如[4-1]之多特異性抗原結合分子，其中第一及第二抗原結合部分的抗體可變區是相同的。 [4-4] 如[4-2]之多特異性抗原結合分子，其中第一及第二抗原結合部分的抗體可變區是相同的。 [4-5] 如[4-3]之多特異性抗原結合分子，其中第一及第二抗原結合部分每一者皆為Fab，其在第191位(EU編號)具有半胱胺酸殘基，且其中具有雙硫鍵連結兩個半胱胺酸殘基。 [4-6] 如[4-4]之多特異性抗原結合分子，其中第一及第二抗原結合部分每一者皆為Fab，其在第191位(EU編號)具有半胱胺酸殘基，且其中具有雙硫鍵連結兩個半胱胺酸殘基。 [4-7] 如[4-5]之多特異性抗原結合分子，其中第一、第二及第三抗原結合部分每一者是Fab的形式，包括VH、VL、CH1域及輕鏈恆定(CL)域，且其中第三抗原結合部分的CH1域C端直接或經由胜肽連接子融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分任一者的VH N端。 [4-8] 如[4-6]之多特異性抗原結合分子，第一、第二及第三抗原結合部分每一者是Fab的形式，包括CH1域及輕鏈恆定(CL)域，且其中第三抗原結合部分的CH1域C端直接或經由胜肽連接子融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分任一者的VH N端 [4-9] 如[4-7]之多特異性抗原結合分子，其中融合是經由胜肽連接子，其包括選自由SEQ ID NO: 248、SEQ ID NO: 249及SEQ ID NO: 259所組成之群組之胺基酸序列。 [4-10] 如[4-8]之多特異性抗原結合分子，其中融合是經由胜肽連接子，其包括選自由SEQ ID NO: 248、SEQ ID NO: 249及SEQ ID NO: 259所組成之群組之胺基酸序列。 [4-11] 如[4-9]之多特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分為互換型(crossover)Fab，其VH連結至CL域且VL連結至CH1域，且其中第一及第二抗原結合部分每一者為傳統(conventional)Fab，其VH連結至CH1域且VL連結至CL域。 [4-12] 如[4-10]之多特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分為互換型(crossover)Fab，其VH連結至CL域且VL連結至CH1域，且其中第一及第二抗原結合部分每一者為傳統Fab，其VH連結至CH1域且VL連結至CL域。 [4-13] 如[4-11]之多特異性抗原結合分子，其中，在第一及第二抗原結合部分每一個的CL域，在第123及124位(Kabat編號)的胺基酸分別為精胺酸及離胺酸；且其中，在第一及第二抗原結合部分每一個的CH1域，在第147及213位(EU編號) 每一個的胺基酸為麩胺酸。 [4-14] 如[4-12]之多特異性抗原結合分子，其中，在每一第一及第二抗原結合部分的CL域，在第123及124位(Kabat編號)的胺基酸分別為精胺酸及離胺酸；且其中，在每一第一及第二抗原結合部分的CH1域，在第147及213位(EU編號) 每一個的胺基酸為麩胺酸。 [4-15] 如[4-13]之多特異性抗原結合分子，更包含Fc域。 [4-16] 如[4-14]之多特異性抗原結合分子，更包含Fc域。 [4-17] 如[4-15]之多特異性抗原結合分子，其中Fc域包括第一及第二Fc區次單元，其中第一Fc區次單元選擇自包括下述之群組：在第234及235位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；及在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸，第354位為半胱胺酸，及第366位為色胺酸之Fc區多肽；其中第二Fc區次單元選擇自包括下述之群組：在第234及235位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；及在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸，第349位為半胱胺酸，第366位為絲胺酸，第368位為丙胺酸，及第407位為纈胺酸之Fc區多肽；且其中所有位置由EU編號。 [4-18] 如[4-16]之多特異性抗原結合分子，其中Fc域包括第一及第二Fc區次單元，其中第一Fc區次單元選擇自包括下述之群組：在第234及235位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；及在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸，第354位為半胱胺酸，及第366位為色胺酸之Fc區多肽；其中第二 Fc區次單元選擇自包括下述之群組：在第234及235位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；及在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸，第349位為半胱胺酸，第366位為絲胺酸，第368位為丙胺酸，及第407位為纈胺酸之Fc區多肽；及其中所有位置由EU編號。 [4-19] 一種多特異性抗原結合分子，其包括選自下述(A)至(O)任一者之5個多肽鏈組合： (A) 包括SEQ ID NO: 201的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 208的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (B) 包括SEQ ID NO: 203的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (C) 包括SEQ ID NO: 204的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (D) 包括SEQ ID NO: 205的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (E) 包括SEQ ID NO: 216的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 229的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (F) 包括SEQ ID NO: 217的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 210的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (G) 包括SEQ ID NO: 219的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 211的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (H) 包括SEQ ID NO: 220的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 211的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (I) 包括SEQ ID NO: 221的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 211的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (J) 包括SEQ ID NO: 222的胺基酸序列的多肽鏈 (鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 230的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (K) 包括SEQ ID NO: 223的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 212的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (L) 包括SEQ ID NO: 225的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 213的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (M) 包括SEQ ID NO: 226的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 213的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)； (N) 包括SEQ ID NO: 227的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 213的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)；及 (O) 包括SEQ ID NO: 228的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 231的胺基酸序列的多肽鏈 (鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 215的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)。 [4-20] 如[4-19]之多特異性抗原結合分子，其包含包括SEQ ID NO: 203的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈 (鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)。 [4-21] 如[4-19]之多特異性抗原結合分子，其包含包括SEQ ID NO: 204的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)。 [4-22] 如[4-19]之多特異性抗原結合分子，其包含包括SEQ ID NO: 205的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)，及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4及5)。 [4-23] 一種多特異性抗原結合分子，其包括： (a) 第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，每一皆結合至人類CD3且包括抗體可變區，包含包括SEQ ID NO: 20的重鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3；及 (b) 第三抗原結合部分，其結合至人類DLL3且包括抗體可變區，包含包括SEQ ID NO: 233的重鏈CDR1，包括SEQ ID NO: 234的重鏈CDR 2，包括SEQ ID NO: 235的重鏈CDR 3，包括SEQ ID NO: 237的輕鏈CDR 1，包括SEQ ID NO: 238的輕鏈CDR 2，及包括SEQ ID NO: 239的輕鏈CDR 3。 [4-24] 如[4-23]之多特異性抗原結合分子，其中每一個第一及第二抗原結合部分之抗體可變區包含包括SEQ ID NO: 6的VH及包括SEQ ID NO: 58的VL；及第三抗原結合部分的抗體可變區包含包括SEQ ID NO: 232的VH及包括SEQ ID NO: 236的VL。 [4-25] 如[4-24]之多特異性抗原結合分子，其中每一個第一及第二抗原結合部分為Fab，其在第191位(EU編號)具有半胱胺酸殘基，且其中雙硫鍵連結此兩個半胱胺酸殘基。 [4-26] 如[4-25]之多特異性抗原結合分子，其中每一第一、第二及第三抗原結合部分為Fab形式，包括VH、VL、CH1域及CL域，且其中第三抗原結合部分的CH1域C端直接或經由胜肽連接子融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分任一個的VH的N端。 [4-27] 如[4-26]之多特異性抗原結合分子，其中融合是經由胜肽連接子，其包括選擇自由SEQ ID NO: 248、SEQ ID NO: 249、及SEQ ID NO: 259所組成之群組之胺基酸序列。 [4-28] 如[4-27]之多特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分為互換型Fab，其VH連結至CL域且VL連結至CH1域，且其中第一及第二抗原結合部分每一者為傳統Fab，其VH連結至CH1域且VL連結至CL域。 [4-29] 如[4-28]之多特異性抗原結合分子，其中，在每一第一及第二抗原結合部分的CL域，在第123及124位(Kabat編號)的胺基酸分別為精胺酸及離胺酸；且其中，在每一第一及第二抗原結合部分的CH1域，在第147及213位 (EU編號) 每一者的胺基酸為麩胺酸。 [4-30] 如[4-29]之多特異性抗原結合分子，更包括Fc域。 [4-31] 如[4-30]之多特異性抗原結合分子，其中Fc域包括第一及第二Fc區次單元，其中第一Fc區次單元選擇自包括下述之群組：在第234及235位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；及在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸，第354位為半胱胺酸，及第366位為色胺酸之Fc區多肽；其中第二 Fc區次單元選擇自包括下述之群組：在第234及235位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸之Fc區多肽；及在第234、235、及297位每一者包括丙胺酸，第349位為半胱胺酸，第366位為絲胺酸，第368位為丙胺酸，及第407位為纈胺酸之Fc區多肽；及其中所有位置由EU編號。

本發明所屬領域中具有通常知識者使用常規方法普遍充分理解與採用本文描述或引用的技術和步驟，例如，下列所述中廣泛使用的方法：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., (1987))；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；以及 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)。

提供以下定義和詳細描述以助於對本文所示的揭露有所理解。

定義胺基酸於本文中，胺基酸是以一或三字母編碼或上述兩者進行描述。例如，Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、或Val/V。

胺基酸的改變對於抗原結合分子的胺基酸序列中的胺基酸改變(於此說明中亦描述為「胺基酸取代」或「胺基酸突變」)，可適當地採用已知方法如定點突變方法(site-directed mutagenesis)(Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))及重疊延伸聚合酶連鎖反應(overlap extension PCR)。再者，也可採用許多已知方法作為取代成非天然胺基酸的胺基酸改變方法(Annu Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; and Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357)。例如，適合使用無細胞轉譯系統(Clover Direct (Protein Express))，其包含具有與終止密碼子之一的UAG密碼子(琥珀密碼子)的互補琥珀抑制子tRNA結合的非天然胺基酸的tRNA。

在本說明書中，當描述胺基酸改變的位點時，「及/或」一詞的意思包括適當結合「及」與「或」的每種組合。具體而言，例如，「取代第33、55、及/或96位的胺基酸」包括以下胺基酸改變的變化：(a)第33位胺基酸、(b)第55位胺基酸、(c)第96位胺基酸、(d)第33及55位胺基酸、(e)第33及96位胺基酸、(f)第55及96位胺基酸、以及(g)第33、55及96位胺基酸。

再者，於本文中，作為顯示胺基酸改變的表達用法，可以適當地使用在指示特定位置的數字之前和之後的表達用法，分別在胺基酸改變之前和之後的一字母或三字母代碼。例如，當取代包含於抗體改變區中的胺基酸時使用改變N100bL或Asn100bLeu，表示第100b位(根據Kabat編號)的Asn以Leu取代。亦即，上述數字根據Kabat編號顯示胺基酸位置，在該數字之前的一字母或三字母胺基酸密碼顯示取代前的胺基酸，且在該數字之後的一字母或三字母胺基酸密碼顯示取代後的胺基酸。同樣地，當取代包含於抗體恆定區中的Fc區胺基酸時使用改變P238D或Pro238Asp，表示第238位(根據EU編號)的Pro以Asp取代。亦即，上述數字根據EU編號顯示胺基酸位置，在該數字之前的一字母或三字母胺基酸密碼顯示取代前的胺基酸，且在該數字之後的一字母或三字母胺基酸密碼顯示取代後的胺基酸。

多肽如本文所使用，「多肽」一詞指的是構成單體(胺基酸)的分子，係以醯胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接。「多肽」一詞指的是兩個或兩個以上胺基酸的任何鏈，且並不是指產物的特定長度。因此，用以指的是兩個或兩個以上胺基酸的一鏈的胜肽、雙肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或任何其他用詞包含於「多肽」的定義之中，且可使用「多肽」一詞取而代之或以任何這些用詞替換使用「多肽」一詞。「多肽」一詞也意指多肽表現後修飾的產物，包括但不限於，醣基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、已知保護/阻斷基團的衍生化、蛋白水解或非天然存在胺基酸修飾。多肽可由天然生物來源衍生或由重組技術所產生，但並非一定得由指定的核酸序列所轉譯。可由任何方式產生多肽，包括化學合成。本文所描述的多肽可以是約3或3個以上、5或5個以上、10或10個以上、20或20個以上、25或25個以上、50或50個以上、75或75個以上、100或100個以上、200或200個以上、500或500個以上、1000或1000個以上或2000或2000個以上胺基酸的尺寸。多肽可具有定義的三維結構，但不一定具有此結構。具有定義的三維結構的多肽視為折疊的，且不具有定義的三維結構的多肽視為未折疊的，但可採用大量的不同構型。

胺基酸序列相似度百分比(%) 相對於參考多肽序列的「胺基酸序列相似度百分比(%)」定義為在比對序列且若有必要的話，則將間隙導入以達到最大的序列相似度百分比，且不將任何保守取代視為序列相似度的一部分後，候選序列中與參考多肽序列的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。可用本發明所屬領域技術中的各種方式，來實現用於確定胺基酸序列相似度百分比的比對，例如，使用公開可用的電腦軟體例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可確定用於比對序列的合適參數，包含在所比較的序列的全長上實現最大比對所需的任何演算法。然而，為了此述的目的，胺基酸序列相似度百分比的數值是利用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.編寫，且來源碼已與用戶文件一起歸檔(file)於U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559中，且註冊於美國版權註冊號TXU510087中。ALIGN-2程式可從Genentech, Inc., South San Francisco, California公開獲得，或也可從來源碼中進行編譯。ALIGN-2程式應編譯為在UNIX操作系統(包含數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設置，且沒有改變。在使用ALIGN-2進行胺基酸序列比較的情況下，給定的胺基酸序列A對、和或針對給定的胺基酸序列B(可替代地表示為具有或包含對、和或針對給定的胺基酸序列B的胺基酸序列相似度百分比的給定的胺基酸序列A)胺基酸序列相似度百分比的計算如下：分式X/Y的100倍其中X是在此程式的A和B的比對中被序列比對程式ALIGN-2計為相同匹配的胺基酸殘基的數目，且其中Y是B中胺基酸殘基的總數目。應理解的是，若胺基酸序列A的長度不等於胺基酸序列B的長度，則A對B的胺基酸序列相似度百分比將不等於B對A的胺基酸序列相似度百分比。除非另有具體說明，否則如前一段落所述，使用ALIGN-2電腦程式，來獲得本文使用的所有胺基酸序列相似度%數值。

重組方法與組成物可使用重組方法和組合物來製造抗體與抗原結合分子，如美國專利號4,816,567中所述。在一實施例中，提供了編碼本文所述抗體的單離核酸。這樣的核酸可編碼包含抗體VL的胺基酸序列和/或包含抗體VH的胺基酸序列(例如，抗體的輕鏈和/或重鏈)。在又一實施例中，提供了包含此類核酸的一或多種載體(例如，表現載體)。在又一實施例中，提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一此類實施例中，宿主細胞包含(例如，已經用以下所述轉形)：(1)載體，其包含編碼包含抗體VL的胺基酸序列和包含抗體VH的胺基酸序列的核酸、或(2)第一載體，其包含編碼包含抗體VL的胺基酸序列的核酸；及第二載體，其包含編碼包含抗體VH的胺基酸序列的核酸。在一實施例中，宿主細胞是真核的，例如中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞或類淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp2/0細胞)。在一實施例中，提供了一種本發明多特異性抗原結合分子製備方法，其中此方法包含：在適合表現抗體的條件下，培養包含編碼如上所述之抗體的核酸的宿主細胞，和視需要地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收抗體。

為了重組產生本文所述的抗體，將編碼如前文所述的抗體的核酸單離，且將其插入至一或多個載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。可使用常規流程(例如藉由使用可特異性結合至編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)輕易地單離且定序此類核酸。

用於選殖或表現編碼抗體的載體的合適宿主細胞包含本文所述的原核或真核細胞。例如，可在細菌中產生抗體，特別是在不需要醣基化和Fc效應子功能時。對於在細菌中表現抗體片段和多肽，參照如美國專利號5,648,237、5,789,199和5,840,523 (亦參照Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254，其描述了在大腸桿菌中表現抗體片段)。表現之後，可從細菌細胞糊的可溶部分中單離出抗體並進行進一步純化。

除原核生物外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母菌，也是用於編碼抗體的載體的合適選殖或表現宿主，包含其醣基化路徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而產生具有部分或完全人類醣基化模式的抗體。參照Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)以及Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。

用於表現醣基化抗體的合適宿主細胞也衍生自多細胞生物(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的範例包含植物和昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株(baculoviral strain)，其可與昆蟲細胞結合使用，特別是用於節食斜紋夜蛾細胞(Spodoptera frugiperda cell)的轉染。

植物細胞培養物也可作為宿主。參照如美國專利號5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429 (描述了在轉基因植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM ^TM技術)。

脊椎動物細胞也可作為宿主。例如，可使用適應在懸浮液中生長的哺乳類細胞株。有用的哺乳類宿主細胞株的其他範例是由SV40 (COS-7)轉形的猴腎CV1細胞株；人類胚胎腎細胞株(293或293細胞，如Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)中所述)；嬰兒倉鼠腎細胞(baby hamster kidney cell，BHK)；小鼠史托利細胞(mouse sertoli cell)(TM4細胞，例如Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中描述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，例如Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)中所述；MRC 5細胞；和FS4細胞。其他有用的哺乳類宿主細胞株包含中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞，其包含DHFR ^-CHO細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；和骨髓瘤細胞株例如Y0、NS0和Sp2/0。適合產生抗體的某些哺乳類宿主細胞株的評論(review)，參照如Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)。

本文所述的抗原結合分子的重組製造可以前文所述相似的方法完成，透過使用(例如，已轉形有)包括核酸的一或複數個載體的宿主細胞，該核酸編碼包括抗原結合分子整體或部分的抗原結合分子的胺基酸序列。

抗原結合分子與多特異性抗原結合分子如本文所使用的，「抗原結合分子」一詞指的是包括抗原結合位的任何分子或對抗原具有結合活性的任何分子，且可更指的是如具有長度約為五個或更多個的胺基酸的胜肽或蛋白質的分子。胜肽或蛋白質並不限於衍生自生物體的胜肽或蛋白質，且例如，可以是由人造設計序列所產生的多肽。胜肽或蛋白質也可以是任何天然存在多肽、合成多肽及重組多肽等。包括已知如α/β桶(α/β barrel)作為支架的穩定構型結構，且其中部分的分子作為抗原結合位的支架(scaffold)分子也是本文所述抗原結合分子的一實施例。

「多特異性抗原結合分子」指的是特異性地結合至一個以上的抗原的抗原結合分子。「雙特異性」一詞指的是抗原結合分子能特異性結合至至少兩種不同的抗原決定子。「三特異性」一詞指的是抗原結合分子能特異性結合至至少三種不同的抗原決定子。在某些實施例，本申請之多特異性抗原結合分子為三特異性抗原結合分子，例如，其能夠特異性地結合至三種不同抗原，可結合至CD3或CD137之任一者，但不同步地結合至兩者，且其能夠特異性地結合至DLL3。

在第一態樣，本揭露提供一種多特異性抗原結合分子包括：第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，其中每一個皆能夠結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137；及第三抗原結合部分，其可結合至第三抗原，較佳為在癌症細胞/組織上表現的抗原。在某些實施例，由第三抗原結合部分所結合的第三抗原為DLL3，且較佳為人類DLL3。

第一抗原結合部分及第二抗原結合部分可為「雙重抗原結合部分」可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137，將在之後更詳細的說明。第三抗原結合部分可為「DLL3抗原結合部分」，也將在之後更詳細的說明。

在一些實施例，每一個第一抗原結合分子部分及第二抗原結合分子部分為Fab分子，且包括至少一個形成於第一抗原結合部分之CH1區及第二抗原結合分子部分之CH1區之間的雙硫鍵。此雙硫鍵可形成於第一抗原結合部分及第二抗原結合分子部分分別的CH1區之依照EU編號為第191位之胺基酸殘基之間。

在一些實施例，第三抗原結合部分可為Fab或scFv，其融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分之任一者。在此情形，每一個第一、第二、及第三抗原結合部分為Fab分子，第三抗原結合部分在Fab重鏈 (CH1) C端可融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分任一者之Fab重鏈N端，可選地經由胜肽連接子。代表性的胜肽連接子包含由SEQ ID NO: 248，SEQ ID NO: 249，或SEQ ID NO: 259所組成之胺基酸序列。在某些實施例，第一抗原結合部分相同於第二抗原結合部分。

在一些實施例，第三抗原結合部分為互換型(crossover)Fab分子，其Fab輕鏈與Fab重鏈的可變區交換，且其中第一及第二抗原結合部分每一者為傳統(conventional)Fab分子。

在一些實施例，在每一個第一及第二抗原結合部分的輕鏈恆定域CL，第123及/或124位的胺基酸獨立地被離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H) (根據Kabat編號)取代，其中在每一個第一及第二抗原結合部分的重鏈恆定域CH1，第147位胺基酸及/或第213位胺基酸獨立地被麩胺酸(E)或天門冬胺酸(D) (根據Kabat EU索引編號)取代。在另一實施例，每一個第一及第二抗原結合部分的輕鏈恆定域CL，第123與124位胺基酸分別為精胺酸(R)及離胺酸(K) (根據Kabat編號)，且其中每一個第一及第二抗原結合部分的重鏈恆定域CH1，第147與213位胺基酸為麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)。

此多特異性抗原結合分子更包括Fc域，將會在之後進行詳細說明。在此情形，每一個第一及第二抗原結合部分皆為Fab，第一抗原結合部分可在Fab重鏈C端融合至Fc域的第一或第二次單元N端，及第二抗原結合部分在Fab重鏈C端可融合至Fc域的剩餘的次單元N端。在一些實施例，第三抗原結合部分在C端融合至第一抗原結合部分或第二抗原結合部分任一者之Fab重鏈N端，可選地經由胜肽連接子。

在本發明之另一態樣，本揭露提供一種多特異性抗原結合分子，包括：可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137之抗原結合部分；及可結合至DLL3之抗原結合部分，較佳為人類DLL3。在某些實施例，此可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137之抗原結合部分為「雙重抗原結合部分(Dual antigen binding moiety)」可結合至CD3及CD137，但不會同時，將於之後進行說明。

本發明之多特異性抗原結合分子的組成能夠以不同配置相互融合。例示性的配置描繪於圖1(a)，同時參照表10-1至10-3。

根據任何上述實施例，多特異性抗原結合分子的成分(例如，抗原結合部分、Fc域)可直接融合或透過本文所述或本發明所屬技術領域中習知的各種連接子(linker)融合，特別是包括一或多個胺基酸的胜肽連接子，一般約為2至20個胺基酸。合適的非免疫性胜肽連接子包括如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n胜肽連接子，其中n通常為1至10之間的數字，一般為2至4之間。

焦麩醯胺化(pyroglutamylation) 已知在細胞中表現抗體時，抗體會經過轉譯後修飾。後轉譯修飾的範例包括羧肽酶(carboxypeptidase)在重鏈C端切割離胺酸；在重鏈與輕鏈N端透過焦麩醯胺化將麩醯胺酸或麩胺酸修飾為焦麩胺酸(pyroglutamic acid)；醣基化；氧化；脫醯胺化；以及醣化作用(glycation)，且已知這些轉譯後修飾發生於各種抗體中(Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447)。

在一些實施例，本發明的多特異性抗原結合分子也包括進行轉譯後修飾的多特異性抗體。轉譯後修飾的範例包括在重鏈可變區的N端進行焦麩醯胺化，及/或在重鏈的C端刪除離胺酸。在本領域中，N端的焦麩醯胺化及刪除C端離胺酸的這些轉譯後修飾已知不會對抗體活性造成任何影響(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39)。

抗原結合部分如本文所使用的，「抗原結合部分」一詞指的是特異性地結合至抗原的多肽分子。在一實施例中，抗原結合部分可將其所連結的實體引導至目標位置，例如將其引導至表現癌抗原(DLL3)的特定類型腫瘤細胞。在另一實施例中，抗原結合部分可透過其目標抗原活化訊號，例如T細胞受體複合抗原(特別是CD3)及/或共刺激受體CD137。抗原結合部分包括抗體及其於本文進一步定義的片段。特定抗原結合部分包括抗原結合域或抗體的抗體可變區，包括抗體重鏈可變區與抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包括如本文進一步定義與本發明所屬技術領域已知的抗體恆定區。有用的重鏈恆定區包括五種同型的任一者：α、δ、ε、γ或μ。有用的輕鏈恆定區包括兩種同型的任一者：κ或λ。

如本文所使用的，當具有一種以上的各類型的部分時，對於抗原結合部分的「第一」、「第二」及「第三」等用詞用以便於分辨。除非另有明確陳述，使用這些用詞並非意圖賦予多特異性抗原結合分子特定的順序或方向。

另一態樣，本發明之抗原結合部分揭示可作為新穎嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)，包括一或以上的本揭露的抗原結合部分。在某些實施例，本發明之CAR包括scFv構築體(construct)，且在一較佳實施例，將包括並包括本揭露之重及輕鏈可變區。在一較佳實施例，本揭露之嵌合抗原受體是用於治療或預防增殖性疾病及任何其復發或轉移。

可結合至CD3與CD137但不會同時結合至CD3與CD137的抗原結合部分本文所述的多特異性抗原結合分子包括可結合至CD3與CD137，但不會同時結合至CD3與CD137的至少一抗原結合部分(於本文也稱為「雙重抗原結合部分」或「第一抗原結合部分」或「Dual-Fab」或「Dual-Ig」)。在一特定實施例中，多特異性抗原結合分子包括兩個雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」及「第二抗原結合部分」，每一個可稱為「Dual-Fab」)。在一些實施例中，此兩個雙重抗原結合分子部分每一個(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)提供單價結合至CD3或CD137，但不同時結合至CD3及CD137。在一特定實施例，該多特異性抗原結合分子包括不超過2個雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)。

在某些實施例中，雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)一般為Fab分子，特別是傳統Fab分子。在某些實施例中，雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)為包括抗體輕鏈與重鏈可變區(VL與VH)的結構域(domain)。包括抗體輕鏈與重鏈可變區的這些結構域的合適範例包括「單鏈Fv(single chain Fv, scFv)」、「單鏈抗體」、「Fv」、「單鏈Fv2(scFv2)」、「Fab」與「F(ab’) ₂」等。

在某些實施例中，雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)特異性地結合至CD3部分胜肽的整體或一部分。在一特定實施例中，CD3是人類CD3或食蟹猴(cynomolgus)CD3，特別是人類CD3。在一特定實施例中，第一抗原結合部分對於人類CD3與食蟹猴CD3為交叉反應的(cross-reactive)(即，特異性結合)。在一些實施例中，第一抗原結合部分可特異性結合至CD3的ε次單元，特別是SEQ ID NO: 7(NP_000724.1)(括弧中顯示RefSeq登錄號)所示的CD3的人類CD3ε次單元。在一些實施例中，雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)可特異性結合至表現於真核細胞表面上的CD3ε鏈。在一些實施例中，雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)結合至表現於T細胞表面上的CD3ε鏈。

在某些實施例中，CD137為人類CD137。在一些實施例中，本發明的抗原結合分子較佳的範例包括結合至與由下述抗體結合的人類CD137抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位的雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)，該抗體擇自於由下列所組成之群組：辨識包括人類CD137蛋白質中序列SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC(SEQ ID NO: 21)的區域的抗體；辨識包括人類CD137蛋白質中序列DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC(SEQ ID NO: 35)的區域的抗體；辨識包括人類CD137蛋白質中序列LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC(SEQ ID NO: 49)的區域的抗體；以及辨識包括人類CD137蛋白質中序列LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC(SEQ ID NO: 105)的區域的抗體。

在一具體實施例，雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)包括下列表1所示之抗體可變區序列的任一者。在一具體實施例，雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)包括下列表1所示之重鏈可變區及輕鏈可變區之組合之任一者。 (表1) 雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)之可變區的序列辨識號(SEQ ID Nos)

名稱	SEQ ID NOs
重鏈可變區(VH)	輕鏈可變區 (VL)
DualAE08	3	59
DualAE06	4	58
DualAE17	5	58
DualAE10	5	60
DualAE05	6	58
DualAE19	8	58
DualAE20	9	58
DualAE21	9	61
DualAE22	10	58
DualAE23	11	61
DualAE09	12	61
DualAE18	12	58
DualAE14	13	58
DualAE15	14	58
DualAE16	81	60

在一實施例，雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」) 包含包括與SEQ ID NO: 6具有至少95%、96%、97%、98%、99%，或100%相似度之重鏈可變區序列，及與SEQ ID NO: 58具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相似度之輕鏈可變區序列。在一實施例，此雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)包含包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一實施例，此雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」) 包含包括與SEQ ID NO: 14具有至少95%、96%、97%、98%、99%，或100%相似度之重鏈可變區序列，及與SEQ ID NO: 58具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相似度之輕鏈可變區序列。在一實施例，此雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)包含包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列的重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一實施例，雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」) 包含包括與SEQ ID NO: 81具有至少95%、96%、97%、98%、99%，或100%相似度之重鏈可變區序列，及與SEQ ID NO: 58具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相似度之輕鏈可變區序列。在一實施例，此雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)包含包括SEQ ID NO: 81之胺基酸序列的重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一具體實施例，此雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)包括下述表2所示之HVR序列組合之任一者。 (表2) 雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)的HVR(CDR)序列的序列辨識號(SEQ ID NOs)

名稱	SEQ ID NOs
HVR-H1	HVR-H2	HVR-H3	HVR-L1	HVR-L2	HVR-L3
DualAE08	17	31	45	64	69	74
DualAE06	18	32	46	63	68	73
DualAE17	19	33	47	63	68	73
DualAE10	19	33	47	65	70	75
DualAE05	20	34	48	63	68	73
DualAE19	22	36	50	63	68	73
DualAE20	23	37	51	63	68	73
DualAE21	23	37	51	66	71	76
DualAE22	24	38	52	63	68	73
DualAE23	25	39	53	66	71	76
DualAE09	26	40	54	66	71	76
DualAE18	26	40	54	63	68	73
DualAE14	27	41	55	63	68	73
DualAE15	28	42	56	63	68	73
DualAE16	82	83	84	65	70	75

在一些實施例，雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)每一者皆包括包含下述(a1)至(a17)中任一者之抗體可變區： (a1) SEQ ID NO: 17的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 31的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 45的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 64的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 69的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 74的輕鏈CDR 3； (a2) SEQ ID NO: 18的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 32的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 46的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a3) SEQ ID NO: 19的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a4) SEQ ID NO: 19的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 33的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 47的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3； (a5) SEQ ID NO: 20的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a6) SEQ ID NO: 22的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 36的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 50的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a7) SEQ ID NO: 23的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a8) SEQ ID NO: 23的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 37的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 51的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a9)SEQ ID NO: 24的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 38的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 52的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a10)SEQ ID NO: 25的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 39的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 53的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a11) SEQ ID NO: 26的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 66的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 71的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 76的輕鏈CDR 3； (a12) SEQ ID NO: 26的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 40的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 54的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a13) SEQ ID NO: 27的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 41的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 55的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a14) SEQ ID NO: 28的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 42的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 56的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3； (a15) SEQ ID NO: 82的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 83的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 84的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 65的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 70的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 75的輕鏈CDR 3； (a16) 結合至與選自(a1)至(a15)中之任一抗體可變區相同的抗原決定位(epitope)之抗體可變區；及 (a17) 抗體可變片段，其與選自(a1)至(a15)中任一抗體可變片段的結合進行競爭。

在一些實施例，本發明的多特異性抗原結合分子或雙重抗原結合部分(「第一抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」或「Dual-Fab」)也包括進行轉譯後修飾(posttranslational modification)。轉譯後修飾的例子包括重鏈可變區N端經過焦麩胺化(pyroglutamylation)及/或重鏈C端離胺酸的缺失(deletion)。發明所屬技術領域已知此種起因於N端的焦麩胺化及C端的離胺酸缺失之轉譯後修飾對於抗體的活性不會有任何影響(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39)。

可結合至DLL3的抗原結合部分本文所述的多特異性抗原結合分子包括至少一個可結合至Delta-like 3 (DLL3)的抗原結合部分(在此亦稱為「DLL3抗原結合部分」或「第三抗原結合部分」或「抗原結合部分其結合至DLL3」)。

在某些實施例中，多特異性抗原結合分子包括一個可結合至DLL3的抗原結合部分。在某些實施例中，多特異性抗原結合分子包括兩個可結合至DLL3的抗原結合部分(「DLL3抗原結合部分」)。在一特定的此實施例中，這些抗原結合部分每一者皆特異性結合至DLL3的相同抗原決定位。在一更特定實施例中，這些「DLL3 抗原結合部分」皆相同。在一實施例中，多特異性抗原結合分子包括可特異性結合至DLL3 (「DLL3抗原結合部分」)的免疫球蛋白分子。在一實施例中，多特異性抗原結合分子包括不多於兩個之可結合至DLL3的抗原結合部分(「DLL3抗原結合部分」)。

在某些實施例中，DLL3抗原結合部分為互換型(crossover)Fab分子，亦即，Fab重鏈與輕鏈之可變區或恆定區其中一者交換的DLL3分子。在某些實施例中，DLL3抗原結合部分為互換型Fab分子，其中Fab輕鏈與Fab重鏈的可變區交換。

在一些實施例，DLL3 抗原結合部分特異性地結合至DLL3的細胞外域(extracellular domain)。在一些實施例，DLL3抗原結合部分特異性地結合至DLL3細胞外域內的抗原決定位。在一些實施例，DLL3抗原結合部分結合至表現於真核細胞表面的DLL3蛋白質。在一些實施例，DLL3抗原結合部分結合至表現於癌細胞表面的DLL3蛋白質。

在一些實施例，多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分結合至細胞外域(ECD)內的抗原決定位，例如，從N端到緊鄰TM區之前的結構域(domain)，但並非TM區或C端細胞內域(intracellular domain)。多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分可結合至ECD內的任何上述提到的結構域/區內的抗原決定位。在一較佳實施例，多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分結合至從EGF6至緊鄰TM區之前的區域中的抗原決定位。更具體而言，多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分結合至人類DLL3之由SEQ ID NO: 89所定義的區域內的抗原決定位。在一些實施例，多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分結合至人類DLL3的EGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、或EGF6區、或者從EGF6至緊鄰TM區之前的區，或在人類DLL3的EGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、或EGF6區，或者從EGF6至緊鄰TM區之前的區的抗原決定位。在一些實施例，多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分可以由先前報導抗DLL3抗體衍生，其中此DLL3抗原決定位結合已經被界定(例如WO2019131988及WO2011093097)。

在一具體實施例，多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分包括下述表3所示的任一抗體可變區序列。在一具體實施例，多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分包括表3所示的重鏈可變區及輕鏈可變區的組合之任一者。在一些實施例，多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分包括結構域，其包括與表3所示之任一抗體可變區的結合至DDL3進行結合競爭之抗體可變片段。 (表3) 例示的DLL3抗原結合部分之可變區的序列辨識號(SEQ ID NOs)

名稱	SEQ ID NOs
重鏈可變區(VH)	輕鏈可變區 (VL)
DL301	305	313
DL306	306	314
DL309	307	315
DL312	308	316
DLL3-14	309	317
DLL3-22	310	318
DLL3-4	311	319
DLL3-6	312	320
DLA0106	260	261
DLA0126	262	263
DLA0316	264	265
DLA0379	266	267
DLA0580	268	269
DLA0641	270	271
DLA0769	272	273
DLA0841	274	275
D30841AE05	297	236
D30841AE08	298	236
D30841AE11	298	302
D30841AE12	299	236
D30841AE13	232	236
D30841AE14	300	236
D30841AE15	301	236

在一實施例，DLL3抗原結合部分包含包括與SEQ ID NO: 232具有至少95%、96%、97%、98%、99%，或100%相似度之重鏈可變區序列，及與SEQ ID NO: 236具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相似度之輕鏈可變區序列。在一實施例，此DLL3抗原結合部分包含包括SEQ ID NO: 232之胺基酸序列的重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 236之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一實施例，DLL3抗原結合部分包含包括與SEQ ID NO: 300具有至少95%、96%、97%、98%、99%，或100%相似度之重鏈可變區序列，及與SEQ ID NO: 236具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相似度之輕鏈可變區序列。在一實施例，此DLL3抗原結合部分包含包括SEQ ID NO: 300之胺基酸序列的重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 236之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一實施例，DLL3抗原結合部分包含包括與SEQ ID NO: 301具有至少95%、96%、97%、98%、99%，或100%相似度之重鏈可變區序列，及與SEQ ID NO: 236具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相似度之輕鏈可變區序列。在一實施例，此DLL3抗原結合部分包含包括SEQ ID NO: 301之胺基酸序列的重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 236之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一實施例，DLL3抗原結合部分包含包括與SEQ ID NO: 274具有至少95%、96%、97%、98%、99%，或100%相似度之重鏈可變區序列，及與SEQ ID NO: 275具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相似度之輕鏈可變區序列。在一實施例，此DLL3抗原結合部分包含包括SEQ ID NO: 274之胺基酸序列的重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 275之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一實施例，DLL3抗原結合部分包含包括與SEQ ID NO: 264具有至少95%、96%、97%、98%、99%，或100%相似度之重鏈可變區序列，及與SEQ ID NO: 265具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相似度之輕鏈可變區序列。在一實施例，此DLL3抗原結合部分包含包括SEQ ID NO: 264之胺基酸序列的重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 265之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一具體實施例，DLL3抗原結合部分包括下述表4所示之HVR序列之組合之任一者。在一些實施例，多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分包括結構域(domain)，其包括與表4所示之抗體可變區中任一者的結合至DLL3進行競爭，或與包含表4所示之抗體可變區之HVR區所界定的HVR序列的抗體可變片段的結合至DLL3進行競爭。 (表4) 例示性的DLL3抗原結合部分的HVR(CDR)序列之序列辨識號(SEQ ID NOs)

名稱	SEQ ID NOs
HVR-H1	HVR-H2	HVR-H3	HVR-L1	HVR-L2	HVR-L3
DLA0316	276	277	278	279	280	281
DLA0580	285	286	287	288	289	290
DLA0769	291	292	293	294	295	296
DLA0841	282	283	284	237	238	239
D30841AE05	233	234	303	237	238	239
D30841AE08	233	234	235	237	238	239
D30841AE11	233	234	235	237	238	304
D30841AE12	233	234	235	237	238	239
D30841AE13	233	234	235	237	238	239
D30841AE14	233	234	235	237	238	239
D30841AE15	233	234	235	237	238	239

在一些實施例，本發明之多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分包括抗體可變區，包括下述(a1)至(a5)中任一者： (a1) SEQ ID NO: 233的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 234的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 235的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 237的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 238的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 239的輕鏈CDR 3； (a2) SEQ ID NO: 276的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 277的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 278的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 279的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 280的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 281的輕鏈CDR 3； (a3) SEQ ID NO: 285的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 286的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 287的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 288的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 289的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 290的輕鏈CDR 3； (a4) 與選擇自(a1)至(a3)中任一者之抗體可變區結合至相同的抗原決定位之抗體可變區；及 (a5) 與選擇自(a1)至(a3)中任一者之抗體可變片段的結合進行競爭之抗體可變片段。

在一些實施例，本發明之多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分亦包含轉譯後修飾(posttranslational modification)。轉譯後修飾的例子包括重鏈可變區N端經過焦麩胺化(pyroglutamylation)及/或重鏈C端離胺酸的缺失(deletion)。發明所屬技術領域已知此種起因於N端的焦麩胺化及C端的離胺酸缺失之轉譯後修飾對於抗體的活性不會有任何影響(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39)。

另一態樣，本發明之DLL3抗原結合部分能夠使用作為新穎嵌合抗原受體 (CAR)合併一個DLL3結合域(DLL3 CAR)。在某些實施例，本發明之DLL3結合域(及DLL3 CAR)可包括scFv構築體(construct)，且在一較佳實施例，將包括本揭露之重鏈及輕鏈可變區。在另一較佳實施例，本發明之DLL3結合域(及DLL3 CAR)可包括包含本揭露之重鏈及輕鏈可變區之scFv構築體(construct)或其片段。在一較佳實施例，本揭露之嵌合抗原受體是用於治療或預防增殖性疾病及任何其復發或轉移。

在某些實施例，DLL3蛋白質是表現在腫瘤起始細胞(tumor-initiating cell)。DLL3 CAR是表現在細胞毒性淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte)(較佳為自體細胞毒性淋巴細胞)經由基因修飾(例如，轉導(transduction))，造成DLL3敏感性淋巴球其可被使用於靶向及殺死DLL3陽性腫瘤細胞。如本文將廣泛討論的，本發明的CAR通常包括細胞外域、跨膜域和包括DLL3結合域的細胞內訊息傳遞域，其活化某些淋巴球並產生DLL3陽性腫瘤細胞的免疫應答。本發明的選擇的實施例包括免疫活性宿主細胞(immunologically active host cell)，其展示揭露的CAR及不同的編碼本發明之DLL3 CAR的多核苷酸序列及載體。另一態樣包含一個方法，藉由將表現DLL3 CAR分子的宿主細胞導入罹患癌症的個體並治療該個體，促進個體中的T淋巴球或自然殺手(NK)細胞的活性。此種態樣包含特別是(inter alia) 肺癌(例如，小細胞肺癌)及黑色素瘤。

抗原如本文所使用，「抗原」一詞指的是抗原結合部分所結合並形成抗原結合部分-抗原複合體的多肽聚分子上的位置(例如，胺基酸的連續延伸，或由非連續胺基酸的不同區域所形成的構型組態(conformational configuration))。可在如腫瘤細胞的表面上、感染病毒的細胞表面上、其他患病細胞的表面上、免疫細胞的表面上、無血液血清中及/或胞外基質(extracellular matrix, ECM)中發現有用的抗原決定子。除非另有說明，否則於本文稱為抗原的蛋白質(例如，CD3、CD137、DLL3)可以是來自任何脊椎動物來源的天然(native)蛋白質形式，脊椎動物包括哺乳類如靈長類(primates)(例如人類)與齧齒類(例如小鼠與大鼠)。在一特定實施例中，抗原為人類CD3、人類CD137或人類DLL3。在本文中提及特定蛋白質的情況下，此用詞涵蓋「全長」、未加工的蛋白質以及在細胞中加工產生的任何形式蛋白質。此用詞也涵蓋蛋白質的自然存在變異體，例如剪接變異體(splice variants)或對偶變異體(allelic variants)。

在某些實施例中，本文所述的多特異性抗原結合分子結合至CD3、CD137或DLL3的抗原決定位，其在不同物種的CD3、CD137或DLL3之中是保守的(conserved)。在某些實施例中，本應用的多特異性抗原結合分子為三特異性抗原結合分子，即可特異性結合至三種不同抗原、可結合至CD3或CD137其中一者但不會同步地結合CD3與CD137，且可特異性結合至DLL3。

在某些實施例中，多特異性抗原結合分子特異性結合至CD3部分胜肽的整體或一部分。在一特定實施例中，CD3是人類CD3或食蟹猴(cynomolgus)CD3，特別是人類CD3。在一特定實施例中，多特異性抗原結合分子對於(即，特異性結合至)人類CD3與食蟹猴CD3為交叉反應的(cross-reactive)。在一些實施例中，多特異性抗原結合分子可特異性結合至CD3的ε次單元，特別是SEQ ID NO: 7(NP_000724.1)(括弧中顯示RefSeq登錄號)所示的CD3的人類CD3ε次單元。在一些實施例中，多特異性抗原結合分子可特異性結合至表現於真核細胞表面上的CD3ε鏈。在一些實施例中，多特異性抗原結合分子結合至表現於T細胞表面上的CD3ε鏈。

在某些實施例中，CD137為人類CD137。在一些實施例中，本發明抗原結合分子較佳的範例包括結合至與由下述抗體結合的人類CD137抗原決定位(epitope)相同的抗原決定位的抗原結合分子，該抗體擇自於由下列所組成之群組：辨識包括人類CD137蛋白質中序列SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC (SEQ ID NO: 21)的區域的抗體；辨識包括人類CD137蛋白質中序列DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC (SEQ ID NO: 35)的區域的抗體；辨識包括人類CD137蛋白質中序列LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC (SEQ ID NO: 49)的區域的抗體；以及辨識包括人類CD137蛋白質中序列LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC (SEQ ID NO: 105)的區域的抗體。

此處所使用的「DLL3」用語，除非另有聲明，是指源自任何脊椎動物的任何天然的DLL3 (Delta-like 3)，包含哺乳動物，比如靈長類(例如人類)，及齧齒類(例如，小鼠及大鼠)。用語包含「全長」、未經處理的DLL3以及在細胞中經過處理產生的任何形式的DLL3。此用語亦包含自然產生的DLL3變異體(variant)，例如，剪接變異體(splice variant)或對偶變異體(allelic variant)。例示性的人類DLL3的胺基酸序列已知例如NCBI參考序列 (RefSeq) NM_016941.3，及例示食蟹猴的DLL3胺基酸序列已知例如NCBI參考序列 XP_005589253.1，以及例示小鼠DLL3的胺基酸序列已知例如NCBI參考序列 NM_007866.2。

人類DLL3蛋白質包括跨膜(TM)區及在C端側細胞內域，及在N端側的DSL (Notch)域 (請參照例如，圖6)。此外，DLL3具有包括6個區的EGF域，從N端側至C端側為EGF1至EGF6。在一些實施例，本發明之多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分結合至細胞外域(ECD)中的抗原決定位，例如，從N端至緊鄰TM區之前的結構域，但未到TM區或C端細胞內域。本發明之多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分可結合至上述ECD中任一結構域/區中的抗原決定位。在一較佳實施例，本發明之多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分結合至從EGF6至緊鄰TM之前中的區域中的抗原決定位。更具體而言，本發明之多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分可結合至人類DLL3由SEQ ID NO: 89所定義之區域中的抗原決定位。在一些實施例，本發明之分子/抗體結合至人類DLL3的EGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、或EGF6區、或者從EGF6至緊鄰TM區之前的區域，或者在人類DLL3的EGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、或EGF6區、或者從EGF6至緊鄰TM區之前的區域中的抗原決定位。

在人類DLL3，上述之域/區具有下述胺基酸殘基 (參照例如，http：//www.uniprot.org/uniprot/Q9NYJ7或WO2013/126746)：細胞外域(ECD)：第1至492位胺基酸殘基； DSL域：第176至215位胺基酸殘基； EGF域：第216至465位胺基酸殘基； EGF1區：第216至249位胺基酸殘基； EGF2區：第274至310位胺基酸殘基； EGF3區：第312至351位胺基酸殘基； EGF4區：第353至389位胺基酸殘基； EGF5區：第391至427位胺基酸殘基； EGF6區：第429至465位胺基酸殘基；從EGF6至緊鄰TM區之前的區域：第429至492位胺基酸殘基； TM區：第493至513位胺基酸殘基；及 C端細胞內域：第516至618位胺基酸殘基 (或在某些同功型(isoform) 516至587)。上述之胺基酸位置亦指稱如SEQ ID NO: 90所示之胺基酸序列的胺基酸位置。因此，本發明之多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分可以結合在人類DLL3上的在上述位置具有胺基酸殘基的上述區/域。亦即，本發明之多特異性抗原結合分子或DLL3抗原結合部分可結合至在人類DLL3的在上述位置具有胺基酸殘基的上述區/域中的抗原決定位。

本發明所使用的DLL3蛋白質可為具有上述序列的DLL3蛋白質，或者可為具有經過一種或多種胺基酸的修飾而衍生自上述序列的序列的修飾蛋白質。具有經過一種或多種胺基酸的修飾而衍生自上述序列的序列的修飾蛋白質的例子，可以包含具有與上述胺基酸序列具有70%或70%以上，較佳為80%或80%以上，更較佳為90%或90%以上，甚至更較佳為95%或95%以上的相似性的多肽。或者，能夠使用這些DLL3蛋白質的部分胜肽。

本發明所使用的DLL3蛋白質不受其來源限制，較佳為人類或食蟹猴(cynomolgus)的DLL3蛋白質。

在一些實施例，DLL3蛋白質能夠使用DLL3 ECD片段蛋白質(或ECD變異體)。根據切斷(truncation)的部分，片段/變異體可包括從N端側至C端側、DSL域至 EGF6、EGF1至EGF6、EGF2至EGF6、EGF3至EGF6、EGF4至EGF6、EGF5及EGF6、或EGF6。此片段/變異體可更包括從緊接在EGF6域之後到緊接在TM區域之前的區域。能夠經由該技術領域的週知技術將Flag標籤(Flag tag)添加至片段/變異體的C端。

抗原結合域「抗原結合域」一詞指的是抗體的一部分，其包括與抗原的部分或全部互補並特異性結合的區域。抗原結合域可由例如一或以上抗體可變域(也稱為抗體可變區)提供。較佳為，抗原結合域包括抗體輕鏈可變區(VL)與抗體重鏈可變區(VH)兩者。這些較佳的抗原結合域包括如「單鏈Fv(single chain Fv, scFv)」、「單域抗體或VHH」、「單鏈抗體」、「Fv」、「單鏈Fv2(scFv2)」、「Fab」與「F(ab’) ₂」等。

可變區「可變區」或「可變域」一詞指的是抗體重鏈或輕鏈涉及抗體與抗原結合的結構域。天然抗體的重鏈可變域與輕鏈可變域(分別為VH與VL)一般具有相似的結構，各結構域包括四個保守的框架區(framework region，FR)與三個高度可變區(hypervariable region，HVR)(參照如，Kindt et al. Kuby Immunology, 6 ^thed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007))。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。再者，可利用來自結合一特定抗原的抗體的VH域或VL域單離出結合至此抗原的抗體，以分別篩選出互補VL或VH域的基因庫(library)。參照如Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)。

高度可變區(HVR)或互補決定區(CDR) 本文使用的「高度可變區」或「HVR」一詞指的是抗體可變域中序列高度可變的各區域(「互補決定區」或「CDR」)，及/或抗體可變域形成結構性定義環(loop)(「高度可變環」) 的各區域，及/或抗體可變域含有抗原接觸殘基(「抗原接點 (antigen contact)」)的各區域。高度可變區(HVR)也稱為「互補決定區(CDR)」，且本文使用的這些用詞參照可變區形成抗原結合區的部分可互換。一般而言，抗體包含6個HVR：3個於VH (H1、H2、H3)中以及3個於VL (L1、L2、L3)中。本文的例示性高度可變區包括： (a) 發生於胺基酸殘基26至32 (L1)、50至52 (L2)、91至96 (L3)、26至32 (H1)、53至55 (H2)及96至101 (H3)的高度可變環(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))； (b) 發生於胺基酸殘基24至34 (L1)、50至56 (L2)、89至97 (L3)、31至35b (H1)、50至65(H2)及95至102(H3)的CDR(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5 ^thEd. Public Health Service, National of Health, Bethesda, MD (1991))； (c) 發生於胺基酸殘基27c至36(L1)、46至55(L2)、89至96(L3)、30至35b(H1)、47至58(H2)及93至101(H3)的抗原接點(MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；以及 (d) (a)、(b)及/或(c)的組合，包括HVR胺基酸殘基46至56 (L2)、47至56 (L2)、48至56(L2)、49至56(L2)、26至35(H1)、26至35b(H1)、49至65(H2)、93至102(H3)及94至102(H3)。

除非另有指明，本文中，可變域中的HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)，係根據Kabat et al.(同上)進行編號。

HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2與HVR-L3也分別稱為「H-CDR1」、「H-CDR2」、「H-CDR3」、「L-CDR1」、「L-CDR2」與「L-CDR3」。

可結合至CD3與CD137但不同時結合至CD3及CD137 可利用本發明所屬領域中的已知方法判斷本發明的抗體可變區是否「可結合至CD3與CD137」。

例如，可藉由電致化學發光方法(electrochemiluminescence method，ECL方法)來判斷(BMC Research Notes 2011, 4: 281)。

具體而言，例如，由可結合至CD3及CD137的區域，例如欲測試的生物素標記抗原結合分子或其單價抗體(缺乏由一般抗體所帶有的二個Fab區之一者的抗體)的Fab區所形成的低分子量抗體與以硫標籤(釕(Ru)複合體)標記的CD3或CD137混合，且將混合物添加至固定鏈黴親和素(streptavidin)的盤。在此操作步驟中，欲測試的生物素標記抗原結合分子結合至盤中的鏈黴親和素。由硫標籤發展出光，且可使用Sector Imager 600或2400(MSD K.K.)等偵測發光(luminescence)訊號，藉此確認前述欲測試的抗原結合分子的區域與CD3或CD137的結合。

或者，可藉由ELISA、FACS (fluorescence activated cell sorting，螢光活化細胞分類)、ALPHAScreen (amplified luminescent proximity homogeneous assay screen，放大發光近似均質測定篩選)、基於表面電漿共振(surface plasmon resonance, SPR)現象的BIACORE方法等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006)103 (11), 4005-4010)來進行此測定。

具體而言，可使用如基於表面電漿共振(SPR)現象的交互作用分析儀Biacore(GE Health Japan Corp.)來進行此測定。Biacore分析儀包括任何型號如Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000或C。用於Biacore的任何感測晶片，如CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA或Au晶片皆可用作為感測晶片。用於捕獲本發明抗原結合分子的蛋白質，如蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、抗人類IgG抗體、抗人類IgG-Fab、抗人類L鏈抗體、抗人類Fc抗體、抗原性蛋白質或抗原性胜肽，係藉由如胺偶合、雙硫偶合或醛偶合之偶合方法固定於感測晶片。CD3或CD137係注射於感測晶片上作為分析物，並測量交互作用以獲得感測圖。在此操作步驟中，CD3或CD137的濃度可根據測定樣品交互作用的強度(例如，KD)於數μM至數pM的範圍內選擇。

或者，CD3或CD137可取代抗原結合分子而固定於感測晶片，進一步使欲評估的抗體樣品與其進行交互作用。可基於由交互作用的感測圖所計算的解離常數(KD)或基於抗原結合分子樣品作用後相較於作用前水平之感測圖中增加的程度而證實本發明抗原結合分子的抗體可變區對CD3或CD137是否具有結合活性。

在一些實施例中，於37度C(對於CD137)或25度C(對於CD3)使用例如Biacore T200儀器(GE Healthcare)或Biacore 8K儀器(GE Healthcare)來評估本發明的抗體可變區對感興趣抗原(亦即CD3或CD137)的結合活性或親和性。抗人類Fc(例如，GE Healthcare)係使用胺偶合套組(例如，GE Healthcare)固定至CM4感測晶片的所有流通槽。抗原結合分子或抗體可變區被捕獲至抗Fc感測表面，然後注入抗原(CD3或CD137)至流通槽。抗原結合分子或抗體可變區的捕獲水平可以200共振單元(RU)為目標。重組人類CD3或CD137可以藉由兩倍序列稀釋所製備之2000至125nM注入，接著解離。所有抗原結合分子或抗體可變區及分析物係於含有20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% Tween 20、0.005% NaN ₃的ACES pH 7.4中製備。感測器表面於各循環係以3M MgCl ₂再生。使用例如Biacore Insight評估軟體，版本 2.0 (GE Healthcare)或Biacore 8K評估軟體(GE Healthcare)透過處理及擬合(fitting)數據至1:1結合模型而判斷結合親和性。計算KD值，以評估本發明抗原結合域的特異性結合活性或親和性。

藉由使用二種珠粒(供者及受者)的ALPHA技術並基於下述準則來進行ALPHAScreen方法：僅當經由與供者珠粒結合的分子以及與受者珠粒結合的分子之間產生生物交互作用而使此二珠粒接近時，偵測到發光訊號。供者珠粒中的雷射激發感光劑將環境氧轉換為具激發態的單態氧(singlet oxygen)。單態氧於供者珠粒周圍擴散且接近至受者珠粒附近，因此於珠粒中引起化學發光反應，其最終發射光線。在與供者珠粒結合的分子以及與受者珠粒結合的分子之間沒有產生交互作用時，由供者珠粒所產生的單態氧沒有接近受者珠粒。因此，沒有發生化學發光反應。

將欲觀察之間具有交互作用的物質之其中一者(配體)固定至感測晶片的金薄膜上。由背部以光照射感測晶片，使得金薄膜及玻璃之間的界面發生全反射。因此，反射強度(SPR訊號)下降的位點形成於反射光的一部分。在欲觀察之間具有交互作用的物質之另一者(分析物)注射至感測晶片的表面。一旦分析物結合至配體，固定的配體分子的質量增加，改變感測晶片表面上溶劑的折射率。此折射率的變化偏移SPR訊號的位置(相對於此，已結合的分子的解離使訊號回至原始位置)。Biacore系統於偏移量的軸作圖，亦即感測晶片表面的質量變化，且展示時間依賴性的質量變化作為測定數據(感測圖)。可由感測圖判斷分析物與捕獲於感測晶片表面的配體的結合量(於分析物的交互作用之前與之後之間感測圖的反應變化量)。然而，由於結合量亦取決於配體量，必須於所使用的配體量為實質相同的條件下進行比較。可由感測圖曲線判斷動力學，亦即締合速率常數(ka)與解離速率常數(kd)，而可由這些常數之間的比例判斷親和性(KD)。抑制測定也較佳使用於BIACORE方法中。抑制測定的範例描述於Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010。

用詞「不同時(at the same time)結合至CD3與CD137(4-1BB)」或「不同步(simultaneously)結合至CD3與CD137(4-1BB)」指的是本發明抗原結合部分或抗體可變區不會在結合至CD3的狀態下結合至CD137，而抗原結合部分或抗體可變區不會在結合至CD137的狀態下結合至CD3。在此情況下，用句「不同時結合至CD3與CD137」也可包括表現CD3的細胞沒有與表現CD137的細胞交聯，或沒有同時結合至各表現於不同細胞的CD3與CD137。此用句更包括以下情況：當CD3及CD137不表現於細胞膜上，而是作為可溶性蛋白質，或二者同時在相同細胞上時，可變區可同時結合至CD3及CD137，但不可同時結合至各自表現於不同細胞上的CD3及CD137。只要抗體可變區具有這些功能，這樣的抗體可變區就沒有特別限制。其範例可包括衍生自IgG型抗體可變區的可變區，其經過一部份胺基酸的改變以結合至所欲抗原。欲改變的胺基酸擇自如在結合至CD3或CD137的抗體可變區中、其改變沒有消除與抗原結合的胺基酸。

在此情況下，用句「表現於不同細胞」僅指的是抗原表現於個別細胞。這些細胞的組合可以是例如相同型態的細胞，例如T細胞與另一T細胞，或可以是不同型態的細胞，例如T細胞與NK細胞。

可藉由以下方式來證實本發明之抗原結合分子是否「不同時結合至CD3及CD137」：證實抗原結合分子對CD3及CD137二者具有結合活性；然後使CD3或CD137中的任一者先結合至包含具有此結合活性的可變區的抗原結合分子；以及接著藉由上述方法判斷對另一者的結合活性是否存在。或者，此亦可透過判斷抗原結合分子對固定於ELISA盤或感測晶片的CD3或CD137中的任一者的結合，是否藉由將另一者添加至溶液受到抑制而證實。在一些實施例中，本發明的抗原結合分子與CD3或CD137中的任一者的結合係藉由抗原結合分子與另一者的結合而受到至少50%的抑制、較佳為60%或60%以上的抑制、更佳為70%或70%以上的抑制、更佳為80%或80%以上的抑制、再佳為90%或90%以上的抑制、或甚至更佳為95%或95%以上的抑制。

在一態樣中，當一抗原(例如，CD3)被固定時，抗原結合分子與CD3結合的抑制可於另一抗原(例如，CD137)的存在下，利用本發明所屬技術領域習知的方法(亦即，ELISA、BIACORE等)而進行判斷。在另一態樣中，當CD137被固定時，抗原結合分子與CD137結合的抑制亦可於CD3的存在下而判斷。當進行上述二態樣之任一者時，若結合受到至少50%的抑制、較佳為60%或60%以上的抑制、更佳為70%或70%以上的抑制、更佳為80%或80%以上的抑制、更佳為90%或90%以上的抑制、或甚至更佳為95%或95%以上的抑制，則判斷本發明的抗原結合分子不同時結合至CD3及CD137。

在一些實施例中，注入作為分析物的抗原濃度比欲固定的另一抗原濃度高至少1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍或100倍。

在較佳方式中，注入作為分析物的抗原濃度比欲固定的另一抗原濃度高100倍，且結合受到至少80%的抑制。

在一實施例中，計算抗原結合分子的CD3(分析物)結合活性與抗原結合分子的CD137(固定的)結合活性的KD值比例(KD(CD3)/KD(CD137)，且比CD137(固定的)濃度高10倍、50倍、100倍或200倍KD值比例(KD(CD3)/KD(CD137)的CD3(分析物)濃度可用於上述競爭測量。(例如，當KD值比例為0.1時，可選擇高1倍、5倍、10倍或20倍的濃度。再者，當KD值比例為10時，可選擇高100倍、500倍、1000倍或2000倍的濃度。)

在一態樣中，當一抗原(例如，CD3)被固定時，抗原結合分子對CD3的結合訊號衰減可於另一抗原(例如，CD137)的存在下，利用所屬技術領域習知的方法(亦即，ELISA、ECL等)來判斷。在另一態樣中，當CD137被固定時，抗原結合分子對CD137的結合訊號衰減亦可於CD3的存在下來判斷。當進行上述二態樣之任一者時，若結合訊號衰減至少50%、較佳為60%或60%以上、更佳為70%或70%以上、更佳為80%或80%以上、更佳為90%或90%以上、或甚至更佳為95%或95%以上，則判斷本發明的抗原結合分子不同時結合至CD3及CD137。

在一實施例中，計算抗原結合分子的CD3(分析物)結合活性與抗原結合分子的CD137(固定的)結合活性的KD值比例(KD(CD3)/KD(CD137)，且比CD137(固定的)濃度高10倍、50倍、100倍或200倍KD值比例(KD(CD3)/KD(CD137)的CD3(分析物)濃度可用於上述測量。(例如，當KD值比例為0.1時，可選擇高1倍、10倍或20倍的濃度。再者，當KD值比例為10時，可選擇高100倍、500倍、1000倍或2000倍的濃度。)

具體而言，例如在使用ECL方法的情況中，製備欲測試的生物素標記抗原結合分子、以硫標籤(釕複合體)標記的CD3以及未標記的CD137。當欲測試的抗原結合分子可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137時，藉由將欲測試的抗原結合分子與標記的CD3的混合物添加至固定鏈黴親和素的盤，接著顯光而於未標記CD137不存在的情況下偵測硫標籤的發光訊號。相對地，在未標記CD137的存在下，發光訊號降低。可將發光訊號的降低定量以判斷相對結合活性。可使用標記的CD137及未標記的CD3類似地進行此分析。

在ALPHAScreen的情況下，在不存在競爭CD137的情況下，欲測試的抗原結合分子與CD3進行交互作用以產生520至620nm的訊號。未標籤的CD137及CD3競爭與欲測試的抗原結合分子的交互作用。可將競爭所引起的螢光減低進行定量以判斷相對結合活性。使用硫-NHS-生物素等的多肽生物素化於本發明所屬技術領域是習知的。可藉由合適地採用的方法以GST來標籤CD3，例如涉及：使框架中編碼CD3的多核苷酸與編碼GST的多核苷酸融合；以及使所得融合基因透過帶有能表現其載體的細胞等而進行表現，接著使用穀胱甘肽(glutathione)管柱純化。較佳使用如適用於基於非線性迴歸分析之一位點競爭模型的軟體GRAPHPAD PRISM (GraphPad Software, Inc., San Diego)來分析所得訊號。可使用標籤的CD137及未標籤的CD3類似地進行此分析。

或者，可使用螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)的方法。FRET為激發能量藉由電子共振而在彼此位處鄰近的兩個螢光分子之間直接轉移的現象。當發生FRET時，供者(具有激發態的螢光分子)的激發能量轉移至受者(靠近供者的另一螢光分子)，使得由供者發射的螢光消失(精確而言，螢光的壽命縮短)，且取而代之的是由受者發射螢光。藉由使用此現象，可分析是否同時結合至CD3及CD137。例如，當帶有螢光供者的CD3及帶有螢光受者的CD137同時結合至欲測試的抗原結合分子時，供者的螢光消失而由受者發射螢光。因此，觀察到螢光波長的變化。這種抗體被證實同時結合至CD3及CD137。另一方面，若混合CD3、CD137及欲測試的抗原結合分子不改變與CD3結合的螢光供者的螢光波長，則欲測試的此抗原結合分子可視為可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137的抗原結合域。

例如，使欲測試的生物素標記抗原結合分子允許結合至供者珠粒上的鏈黴親和素，而使具有穀胱甘肽S轉移酶(glutathione S transferas, GST)標籤的CD3允許結合至受者珠粒。於競爭的第二抗原不存在的情況下，欲測試的抗原結合分子與CD3進行交互作用以產生520至620nm的訊號。未標籤的第二抗原和CD3競爭與欲測試的抗原結合分子的交互作用。可定量競爭結果所引起的螢光減低以判斷相對結合活性。使用硫-NHS-生物素等的多肽生物素化在本發明所屬技術領域是習知的。可利用適當採用的方法來以GST標籤CD3，例如，涉及：使編碼框架中CD3的多核苷酸與編碼GST的多核苷酸融合；以及藉由帶有能將其表現的載體的細胞等表現所得融合基因，接著使用穀胱甘肽管柱純化。較佳使用如適用於基於非線性迴歸分析之一位點競爭模型的軟體GRAPHPAD PRISM (GraphPad Software, Inc., San Diego)來分析所得訊號。

標籤不限於GST標籤且可以任何標籤進行，例如但不限於組胺酸標籤、MBP、CBP、Flag標籤、HA標籤、V5標籤或c-myc標籤。欲測試的抗原結合分子對供者珠粒的結合不限於使用生物素-鏈黴親和素反應的結合。詳細而言，當欲測試的抗原結合分子包含Fc時，可能的方法涉及使欲測試的抗原結合分子經由辨識Fc的蛋白質而結合，如供者珠粒上的蛋白質A或蛋白質G。

再者，當CD3及CD137不表現於細胞膜上，而是作為可溶性蛋白質，或二者同時在相同細胞上時，可變區可同時結合至CD3及CD137，但不可同時結合至各自表現於不同細胞上的CD3及CD137的情況下，亦可利用所屬技術領域習知的方法進行測定。

具體而言，欲測試的抗原結合分子在偵測同時結合至CD3及CD137的ECL-ELISA中已被證實為陽性，且欲測試的抗原結合分子亦與表現CD3的細胞及表現CD137的細胞混合。除非抗原結合分子及這些細胞同時彼此結合，否則欲測試的抗原結合分子可顯示為不可同時結合至表現於不同細胞上的CD3及CD137。可利用如基於細胞的ECL-ELISA進行此測試。表現CD3的細胞事先固定於盤中。在欲測試的抗原結合分子與其結合之後，將表現CD137的細胞添加至盤中。利用針對此抗原的硫標籤標記抗體來偵測僅表現於表現CD137的細胞上的不同抗原。當抗原結合分子同時結合至分別表現於兩種細胞的兩種抗原時，則觀察到訊號。當抗原結合分子不同時結合至這些抗原時，則未觀察到訊號。

或者，可利用ALPHAScreen方法來進行此測試。欲測試的抗原結合分子與已結合至供者珠粒的表現CD3的細胞以及已結合至受者珠粒的表現CD137的細胞混合。當抗原結合分子同時結合至分別表現於兩種細胞的兩種抗原時，則觀察到訊號。當抗原結合分子不同時結合至這些抗原時，則未觀察到訊號。

或者，可利用八隅體交互作用(Octet interaction)分析法來進行此測試。首先，使表現具有胜肽標籤標記的CD3的細胞結合至辨識此胜肽標籤的生物感測器。表現CD137的細胞和欲測試的抗原結合分子置於孔(well)中，且分析交互作用。當抗原結合分子同時結合至分別表現於兩個細胞的兩種抗原時，則觀察到由欲測試的抗原結合分子和表現CD137的細胞與生物感應器結合所引起的大幅度波長偏移。當抗原結合分子不同時結合至這些抗原時，則觀察到僅由欲測試的抗原結合分子與生物感應器結合所引起的小幅度波長偏移。

可進行基於生物活性的測試，而非基於結合活性的這些方法。例如，表現CD3的細胞以及表現CD137的細胞與欲測試的抗原結合分子混合，並進行培養。當抗原結合分子同時結合至這兩種抗原時，分別表現於兩個細胞的兩種抗原經由欲測試的抗原結合分子互相活化。因此，可偵測到活化訊號的變化，如抗原的個別下游磷酸化水準(level)的增加。或者，因為活化而誘發產生細胞激素。因此，可測量細胞激素的產生量以證實是否同時結合至兩個細胞。或者，因為活化而誘發針對表現CD137的細胞的細胞毒性。或者，報導基因被啟動子誘導的表現量，因為活化而導致啟動子在CD137或CD3的訊息傳遞途徑的下游被活化。因此，可測量細胞毒性或報導蛋白質的產生量，以證實是否同時結合至兩個細胞。

至少一個雙硫鍵在本發明之一態樣，每一個第一抗原結合部分及第二抗原結合部分包括至少一個半胱胺酸殘基(經由突變、取代或插入)，較佳為在CH1區，且所述至少一個半胱胺酸殘基在第一抗原結合部分及第二抗原結合分子部分之間能夠形成至少一個雙硫鍵。在某些實施例，半胱胺酸殘基位在抗體重鏈恆定區CH1區內，例如，位在由下述位置組成的群組之位置，依照EU編號在CH1區第119、122、123、131、132、133、134、135、136、137、139、140、148、150、155、156、157、159、160、161、162、163、165、167、174、176、177、178、190、191、192、194、195、197、213、及214位。在一實施例，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分每一者包括一個半胱胺酸殘基(經由突變、取代或插入)在CH1區中的依照EU編號的第191位，其可形成一個雙硫鍵介於第一抗原結合部分的CH1區及第二抗原結合分子部分的CH1區之間。

在上述態樣的一實施例，如同前述形成「至少一個鍵」連結第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，能夠將這兩個抗原結合部分(亦即，如同前述的第一抗原結合部分及第二抗原結合部分)維持在空間上接近的位置。藉由在第一抗原結合部分及第二抗原結合部分之間經由雙硫鍵的連結的效能，本發明之抗原結合分子能夠將兩個抗原結合部分維持在比對照抗原結合分子更貼近的位置，對照抗原結合分子與本發明的抗原結合分子的不同之處僅在於沒有在兩個抗原結合部分之間導入額外的鍵。在一些實施例，用語「空間上接近的位置」或「貼近的位置」包含上述第一抗原結合域及第二抗原結合域維持在較短的距離及/或降低可撓性(flexibility)的涵義。

其結果，本發明的抗原結合分子的此兩個抗原結合部分(亦即，如同前述的第一抗原結合部分及第二抗原結合部分)結合至表現於相同單一細胞上的抗原。換句話說，本發明的抗原結合分子的此分別的兩個抗原結合部分(亦即，如同前述的第一抗原結合部分及第二抗原結合部分)並不會結合至表現在不同細胞上的抗原從而引起不同細胞的交聯。在本申請中，本發明之抗原結合分子的此種抗原結合模式能被稱為「順式結合(cis-binding)」，而抗原結合分子的兩個抗原結合部分分別與表現於不同細胞上的抗原結合，使不同細胞發生交聯的抗原結合分子的抗原結合方式稱為「反式結合(trans-binding)」。在一些實施例，本發明之抗原結合分子主要以「順式結合」模式結合至表現在相同單一細胞上的抗原。

在上述態樣的一實施例中，藉由如同前述的形成於第一抗原結合部分及第二抗原結合部分之間的經由雙硫鍵的雙硫鍵連結的效能，本發明之抗原結合分子能夠降低及/或預防不期望的交聯與免疫細胞的活化(例如，T細胞，NK細胞，DC細胞，或類似者)。亦即，在本發明一些實施例，本發明之抗原結合分子的第一抗原結合部分結合至任何在免疫細胞，例如T細胞上表現的訊息傳遞分子(signaling molecule)(例如，第一抗原)，且本發明之抗原結合分子的第二抗原結合域也結合至任何在免疫細胞，例如T細胞上表現的訊息傳遞分子(例如，第一抗原或與第一抗原不同的第二抗原)。因此，本發明之抗原結合分子的第一抗原結合域及第二抗原結合域可結合至表現在相同免疫細胞，例如T細胞上的第一或第二訊息傳遞分子的任一者 (亦即，順式結合模式)，或在不同免疫細胞例如T細胞上(亦即，反式結合模式)。當第一抗原結合域及第二抗原結合域以反式結合模式結合至表現在不同免疫細胞，例如T細胞上的訊息傳遞分子，那些不同的免疫細胞例如T細胞被交聯，在某些情況下，此種免疫細胞例如T細胞的交聯可能會引起免疫細胞例如T細胞的不期望的活化。

另一方面，本發明之抗原結合分子的另一個情況的實施例，亦即，抗原結合分子包括第一抗原結合部分及第二抗原結合分子部分，其經由至少一個位在CH1區(依照EU編號第191位)之雙硫鍵相互連結，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分兩者皆能夠以「順式結合」模式結合至在相同單一免疫細胞例如T細胞上表現的訊息傳遞分子，因此能夠降低不同免疫細胞例如T細胞經由抗原結合分子的交聯，以避免免疫細胞不期望的活化。

在本申請，上述特徵，經由CH1區(例如依照EU編號第191位)的至少一個雙硫鍵連結第一抗原結合部分及第二抗原結合部分能夠以縮寫「LINC」描述。使用此縮寫，在一些實施例，上述本發明之抗原結合分子具有所述至少一個雙硫鍵可以表示為例如，「LINC 型式」，「Dual/LINC」或「DLL3-Dual/LINC」或其類似物。同樣地，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分不連結/尚未經由CH1區(例如依照EU編號第191位)的至少一個雙硫鍵連結的抗原結合分子能夠以縮寫「UnLINC」描述。

Fab分子「Fab分子」指的是由免疫球蛋白的重鏈(「Fab重鏈」)VH與CH1域以及輕鏈(「Fab輕鏈」)VL與CL域所組成的蛋白質。

融合「融合」指的是成分（例如，Fab分子和Fc域次單元）經由胜肽鍵直接連接，或經由一個或多個胜肽連接子連接。

「互換型(crossover)」Fab 「互換型」Fab分子(也稱為「Crossfab」)指的是Fab重鏈與輕鏈的可變區或恆定區的任一者進行交換的Fab分子，亦即，互換型Fab分子包括由輕鏈可變區與重鏈恆定區形成的胜肽鏈，以及由重鏈可變區與輕鏈恆定區形成的胜肽鏈。為了清楚起見，在Fab輕鏈與Fab重鏈的可變區交換的互換型Fab分子中，包括重鏈恆定區的胜肽鏈於本文稱為互換型Fab分子的「重鏈」。相反地，在Fab輕鏈與Fab重鏈的恆定區交換的互換型Fab分子中，包括重鏈可變區的胜肽鏈於本文稱為互換型Fab分子的「重鏈」。

傳統Fab 與其相反，「傳統」Fab分子指的是其自然型式的Fab分子，即包括由重鏈可變區與恆定區形成的重鏈(VH-CH1)，以及由輕鏈可變區與恆定區形成的輕鏈(VL-CL)。「免疫球蛋白分子」一詞指的是具有天然存在抗體結構的蛋白質。例如，IgG型的免疫球蛋白為約150,000道耳吞的異四聚體醣蛋白，其由雙硫鍵鍵結的兩個輕鏈與兩個重鏈所形成。從N到C端來看，每個重鏈具有可變區(VH)，也稱為可變重域或重鏈可變域，之後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，也稱為重鏈恆定區。同樣地，從N到C端來看，每個輕鏈具有可變區(VL)，也稱為可變輕域或輕鏈可變域，之後為恆定輕域(CL)，也稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白的重鏈可歸為五種類型之一，五種類型為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些更分成次型，如γ1 (IgG1)、γ2 (IgG2)、 γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)、α1 (IgA1)及α2 (IgA2)。免疫球蛋白的輕鏈基於其恆定域的胺基酸序列可歸為兩種類型之一，兩種類型為κ與λ。免疫球蛋白實質上由兩個Fab分子與一個Fc域所組成，其透過免疫球蛋白鉸鏈區(hinge region)所連接。

親和性「親和性」指的是分子(如，抗原結合分子或抗體)單一結合位與其結合對象(如，抗原)間的非共價交互作用的強度總和。如非另有說明，如本文所使用，「結合親和性」指的是固有的結合親和性，其反應了結合對成員(例如，抗原結合分子及抗原，或抗體及抗原)間的1比1的交互作用。分子X對其對象Y的親和性一般可以解離常數(KD)表示，解離常數是解離與締合速率常數(分別為koff與kon)的比例。因此，只要速率常數的比例維持相同，同等親和性可包括不同的速率常數。可利用本發明所屬技術領域中習知的完善方法來測量親和性，包括本文所述的方法。測量親和性的特定方法為表面電漿共振法(surface plasmon resoncance, SPR)。

判斷親和性的方法在某些實施例中，本文提供的抗原結合分子或抗體對其抗原具有以下解離常數(KD)：1μM或1μM以下、120nM或120nM以下、100nM或100nM以下、80nM或80nM以下、70nM或70nM以下、50nM或50nM以下、40nM或40nM以下、30nM或30nM以下、20nM或20nM以下、10nM或10nM以下、2nM或2nM以下、1nM或1nM以下、0.1nM或0.1nM以下、0.01nM或0.01nM以下、或0.001nM或0.001nM以下(例如，10 ^-8M或10 ^-8M以下、10 ^-8M至10 ^-13M、10 ^-9M至10 ^-13M)。在某些實施例中，抗體/抗原結合分子對CD3、CD137或DLL3的KD值位於以下範圍之內：1-40nM、1-50nM、1-70nM、1-80nM、30-50nM、30-70nM、30-80nM、40-70nM、40-80nM、或60-80nM。

在一實施例中，利用放射標記抗原結合測定法(radiolabeled antigen-binding assay, RIA)測量KD。在一實施例中，以感興趣抗體的Fab形式及其抗原來進行放射標記抗原結合測定。例如，透過在未標記抗原的序列滴定存在下，用最小濃度的 ¹²⁵I標記抗原平衡Fab，然後用塗佈抗Fab抗體的盤捕獲結合的抗原來測量Fab對抗原的溶液結合親和性(參照如Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999))。為了建立測定條件，將5μg/ml之在50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中的捕獲抗Fab抗體(Cappel Labs)於MICROTITER(註冊商標)多孔盤(Thermo Scientific)塗佈過夜，接著在室溫(約23度C)下、以含2%(w/v)之牛血清白蛋白的PBS將其阻斷二至五小時。在非吸收盤中(Nunc#269620)，將序列稀釋的感興趣Fab與100pM或26pM的 ¹²⁵I標記抗原混合(例如，與在Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)中對於抗VEGF抗體Fab-12進行的評估一致)。接著將感興趣Fab培養過夜，然而，培養可持續更長的時間(例如，約65小時)以確保達到平衡。接著，將混合物轉移至捕獲盤而於室溫下培養(例如，一小時)。接著移除溶液，並以含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20(註冊商標))的PBS清洗盤八次。當盤已乾燥時，於每孔添加150μL的閃爍劑(scintillant，MICROSCIN-20 ^TM；Packard)，且於TOPCOUNT ^TM伽瑪計量器(Packard)上計量盤十分鐘。選擇小於或等於20%最大結合的各個Fab濃度用於競爭結合測定中。

根據另一實施例，利用BIACORE(註冊商標)表面電漿共振測定法來測量Kd。例如，使用BIACORE(註冊商標)-2000或BIACORE(註冊商標)-3000 (BIACORE, Inc., Piscataway, NJ)的測定法，是在25度C下使用固定有約10個反應單位(response unit, RU)的抗原之CM5晶片進行。在一實施例中，根據供應商的使用說明，使用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5, BIACORE, Inc.)。在以5μl/分的流速注射抗原前，使用pH4.8的10mM醋酸鈉，將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，以達到約10個反應單位(RU)的偶合蛋白質。注射抗原後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應基團。為了進行動力學測量，在25度C以約25μl/分的流速，在含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20 ^TM)界面活性劑的PBS(PBST)中注入兩倍序列稀釋的Fab(0.78nM~500nM)。使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE(註冊商標)評估軟體版本3.2)、藉由同步擬合(fitting)締合及解離感測圖而計算締合速率(k _on)及解離速率(k _off)。平衡解離常數(Kd)是以k _off/k _on比值進行計算。例如，參照Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。若以上述的表面電漿共振測定法，締合速率(on-rate)超過10 ⁶M ^-1s ^-1，可利用螢光淬滅技術來判斷締合速率，螢光淬滅技術利用分光計(例如，停流(stop-flow)式分光光度計(Aviv Instruments)或使用攪拌比色管之8000系列SLM-AMINCO ^TM分光光度計(ThermoSpectronic))而進行測量，並在漸增濃度抗原存在的情況下，測量在pH7.2的PBS中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25度C的螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，帶通16nm)的增加或減少。

根據上述抗原結合分子或抗體親和性的測量方法，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可對各種抗原進行其他抗原結合分子或抗體的親和性測量。

抗體本文「抗體」一詞是以最廣泛的方式使用且涵蓋各種抗體結構，而抗體結構只要能夠展現所欲的抗原結合活性，其包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段。

抗體片段「抗體片段」指的是完整抗體以外的分子，其包括完整抗體的一部分，結合至完整抗體所結合的抗原。抗體片段的範例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) ₂、雙鏈抗體(diabody)、線性抗體、單鏈抗體分子(例如，scFv)及單域抗體。某些抗體片段的評論請參照Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)。scFv片段的評論請參照如Plückthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；亦參照WO 93/16185、美國專利號5,571,894與5,587,458。關於包含再利用(salvage)受體結合抗原決定位殘基且具有體內(in vivo)延長半衰期的Fab與F(ab’) ₂片段所作的討論，可參照美國專利號5,869,046。雙鏈抗體是具有雙價或雙特異性的兩種抗原結合位的抗體片段。例如，參照EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)；以及Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。三鏈抗體(triabody)與四鏈抗體(tetrabody)亦描述於Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)中。單域抗體是包括抗體重鏈可變域全部或一部分，或抗體輕鏈可變域全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參照如美國專利號6,248,516 B1)。可利用各種技術製造抗體片段，包括但不限於如本文所述的完整抗體蛋白水解消化以及利用重組宿主細胞(例如，大腸桿菌或嗜菌體)產生而製造。

抗體類型抗體的「類型」指的是其重鏈擁有的恆定域或恆定區型態。有五種主要的抗體類型：IgA、IgD、IgE、IgG與IgM，且許多這些類型可更分成次類型(次型)，例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1與IgA2。對應至不同免疫球蛋白類型的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ以及μ。

除非另有說明，否則輕鏈恆定區中的胺基酸殘基在本文是根據Kabat等人進行編號，且重鏈恆定區中的胺基酸殘基編號是根據EU編號系統，也稱為EU索引，如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。

框架「框架(framework)」或「FR」指的是可變域殘基而不是高度可變區(HVR)殘基。可變域的框架一般由四個框架域所組成：FR1、FR2、FR3與FR4。因此，高度可變區與框架序列一般在VH(或CL)序列中以下述順序出現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

人類共通框架(humen consensus framework) 「人類共通框架」是代表在選擇人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常存在的胺基酸殘基之框架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH框架序列的選擇是來自可變域序列的次群組。一般而言，序列的次群組如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3中的次群組。在一實施例中，對於VL而言，次群組為如前述Kabat等人的次群組κI。在一實施例中，對於VH而言，次群組為如前述Kabat等人的次群組III。

嵌合抗體(chimeric antibody) 「嵌合」抗體一詞指的是重鏈及/或輕鏈的一部份衍生自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的剩餘部分衍生自不同來源或物種的抗體。同樣地，「嵌合抗體可變域」一詞指的是重鏈及/或輕鏈可變區衍生自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈可變區的剩餘部分衍生自不同來源或物種的抗體可變區。

人源化抗體(humanized antibody) 「人源化」抗體指的是包括來自非人類HVR的胺基酸殘基與來自人類FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將實質上包括所有至少一種可變域且一般是兩種可變域，其中所有或實質上所有HVR(例如，CDR)對應至非人類抗體的HVR，且所有或實質上所有FR對應至人類抗體的FR。人源化抗體可視需要地包括衍生自人類抗體的抗體恆定區的至少一部分。抗體，例如非人類抗體的「人源化形型式」，指的是抗體已進行人源化。「人源化抗體可變區」指的是人源化抗體的可變區。

人類抗體「人類抗體」所具有的胺基酸序列是對應至由人類或人類細胞所產生，或衍生自使用人類抗體庫(repertoire)或其他編碼人類抗體的序列的非人類來源的抗體的胺基酸序列。此人類抗體的定義特別排除包括非人類抗原結合殘基的人源化抗體。「人類抗體可變區」指的是人類抗體的可變區。

多核苷酸(核酸) 本文可交替使用的「多核苷酸」或「核酸」指的是任何長度的核苷酸聚合物，且可包括DNA與RNA。核苷酸可以是去氧核醣核苷酸、核醣核苷酸、修飾的核苷酸或鹼基及/或其類似物、或可被DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應加入至聚合物的任何受質。多核苷酸可包括修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分所阻斷。多核苷酸可包括合成之後所作的修飾，例如連接至標記。其他種類的修飾包括如「加帽(cap)」、以類似物取代一或多個天然存在核苷酸、核苷酸內修飾如非帶電鍵結(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯(phosphoramidates)、胺基甲酸酯(carbamates)等)與帶電鍵結(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核苷酸內修飾、含有懸垂部分(pendant moiety)的修飾如蛋白質(例如，核酸酶、毒素、抗體、訊息胜肽、聚-L-離胺酸等)、具有插入劑(intercalators)(例如，吖啶(acridine)、補骨脂素(psoralen)等)的修飾、含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、具有修飾鍵結(例如，α變旋異構物核酸等)的修飾以及多核苷酸的未修飾形式。再者，通常存在於糖中的任何羥基基團可使用如膦酸酯基、磷酸基取代，被標準保護基團保護，或被活化以製備額外鍵結連接至額外的核苷酸，或可被結合至固體或半固體支持物。5'和3'端OH可被磷酸化或使用胺或具有1至20個碳原子的有機帽基團部分取代。其他羥基也可被衍生化成標準的保護基團。多核苷酸也可含有本領域一般習知的核醣或去氧核醣的同工(analogous)形式，包括，例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基-、2'-氟-核醣或2'-疊氮基-核醣、碳環醣類似物、α變旋異構物醣(α-anomeric sugars)、差向異構糖(epimeric sugars)(例如，阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚糖(sedoheptuloses))，非環類似物以及鹼性核苷類似物(例如甲基核糖苷(riboside))。一種或多種磷酸二酯鍵可被替代連接基團取代。這些替代連接基團包括但不限於其中磷酸酯被P(O)S(「硫酯」)、P(S)S(「二硫酯」)、(O)NR ₂(「醯胺酯」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(「甲醛(formacetal)」)取代的實施例，其中R或R'各單獨為H或取代或非取代的烷基(1-20 C)，其視需要含有醚(-O-)鍵、芳基、鏈烯基(alkenyl)、環烷基、環鏈烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中的所有鍵結並非皆為相同。前文描述應用至本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

單離(核酸) 「單離」核酸分子是從其自然環境的成分所分離的分子。單離核酸分子更包括包含於細胞中的核酸分子，上述細胞通常包含核酸分子，但此核酸分子是存在於染色體外的，或位於與其自然染色體位置不同的染色體位置。

載體本文所使用的「載體」一詞指的是能夠傳遞其所連接的另一核酸的核酸分子。此用詞包括作為自我複製核酸結構的載體以及加入其被導入的宿主細胞基因體中的載體。某些載體可引導其有效連接的核酸表現。這些載體在本文稱為「表現載體」。載體可利用病毒或電穿孔的方式被導入至宿主細胞。然而，導入載體並不侷限於體外(in vitro)方法。例如，也可直接利用體內(in vivo)方法將載體導入至一對象中。

本發明之另一態樣，載體包含核酸分子能夠導入至個體，其編碼本揭露之可結合至CD3及CD137但不同時的抗原結合部分，可結合至DLL3的抗原結合部分，抗原結合分子或抗體，以直接在個體中表現本揭露之抗原結合部分、抗原結合分子或抗體。載體的一個例子，能夠使用腺病毒，但不限定於此。也能夠將編碼本揭露之抗原結合部分、抗原結合分子或抗體的核酸分子直接給予至個體，或經由電穿孔(electroporation)將編碼本揭露之抗原結合部分、抗原結合分子或抗體之核酸分子轉移(transfer)至個體，或給予可表現並分泌的包括編碼本揭露之抗原結合部分、抗原結合分子或抗體之核酸分子的細胞至個體，以在個體中持續地表現並分泌本揭露之抗原結合部分、抗原結合分子或抗體。

宿主細胞「宿主細胞」、「宿主細胞株」與「宿主細胞培養物」等用詞可交替使用，且指的是外源核酸導入其中的細胞，包括這些細胞的子代。宿主細胞包括「轉形體(transformant)」與「轉形細胞」，其包括初始(primary)轉形細胞以及自其衍生且不論繼代數量的子代。子代與親代細胞中的核酸成分可不完全相同，但可包括突變。具有與在一開始轉形細胞中所篩選或選擇的相同功能或生物活性的突變子代也包含於此。

特異性「特異性」指的是特異性結合至一或多個結合對象的分子沒有與對象之外的其他分子產生顯著結合。再者，「特異性」也用於抗原結合位對包含於抗原中多個抗原決定位中的一特定抗原決定位具有特異性時。若抗原結合分子特異性結合至一抗原，則亦描述為「抗原結合分子對/針對此抗原具有/展現出特異性」。當與抗原結合位(antigen-binding site)結合的抗原決定位(epitope)包含於多個不同抗原中時，包括此抗原決定位(antigen-binding site)的抗原結合分子可結合至具有此抗原決定位(epitope)的各種抗原。

抗體片段「抗體片段」指的是完整抗體以外的分子，其包括完整抗體的一部分，結合至完整抗體所結合的抗原。抗體片段的範例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) ₂；雙鏈抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；及由抗體片段所形成的多特異性抗體。

用詞「全長抗體」、「完整抗體」與「全抗體(whole antibody)」於本文可交替使用，且指的是具有與天然抗體結構實質上相似的結構的抗體，或具有包含如本文定義的Fc區的重鏈的抗體。

可變片段(Fv) 於本文中，「可變片段(Fv)」一詞指的是由一對抗體輕鏈可變區(VL)與抗體重鏈可變區(VH)形成的抗體衍生抗原結合位的最小單位。1988年，Skerra與Pluckthun發現可將抗體基因插入細菌訊號序列的下游並誘導大腸桿菌中的基因表現，而從大腸桿菌周邊細胞質(periplasm)部分製備同質及活性抗體(Science (1988) 240(4855), 1038-1041)。在從周邊細胞質製備的Fv中，VH以可結合至一抗原的方式與VL締合。

scFv、單鏈抗體及sc(Fv) ₂於本文中，用詞「scFv」、「單鏈抗體」及「sc(Fv) ₂」皆指的是單一多肽鏈的抗體片段，其包含衍生自重鏈與輕鏈的可變區，而不包含恆定區。一般而言，單鏈抗體也包含VH域與VL域間的多肽連接子，以能夠形成被認為能夠結合抗體的所欲結構。「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)」中Pluckthun詳細討論單鏈抗體。亦參照國際專利公開WO 1998/001649；美國專利號4,946,778及5,260,203。在一特定實施例中，單鏈抗體可以是雙特異性及/或人源化的。

scFv為單鏈低分子量抗體，其中形成Fv的VH與VL以胜肽連接子相互連接(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85(16), 5879-5883)。VH與VL可透過胜肽連接子保持在相當接近的位置。

sc(Fv) ₂為單鏈抗體，其中兩個VL與兩個VH的四個可變區透過連接子連接，連接子例如形成單鏈的胜肽連接子(J Immunol. Methods (1999) 231(1-2), 177-189)。兩個VL與兩個VH可衍生自不同單株抗體。如Journal of Immunology (1994) 152(11), 5368-5374中所揭示，這些sc(Fv) ₂較佳包括如雙特異性sc(Fv) ₂，其辨識單一抗原中的兩個抗原決定位。可利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者習知的方法製造sc(Fv) ₂。例如，可使用如胜肽連接子的連接子連接scFv而製造sc(Fv) ₂。

於本文中，sc(Fv) ₂包括兩個VH單位與兩個VL單位，其以從單鏈多肽N端起VH、VL、VH及VL的順序排列([VH]-連接子-[VL]-連接子-[VH]-連接子-[VL])。兩個VH單位與兩個VL單位的順序並不限於以上形式，且可以任何順序排列。範例形式如以下所列。 [VL]-連接子-[VH]-連接子-[VH]-連接子-[VL] [VH]-連接子-[VL]-連接子-[VL]-連接子-[VH] [VH]-連接子-[VH]-連接子-[VL]-連接子-[VL] [VL]-連接子-[VL]-連接子-[VH]-連接子-[VH] [VL]-連接子-[VH]-連接子-[VL]-連接子-[VH]

sc(Fv) ₂的分子形式也詳細描述於WO 2006/132352。根據這些描述，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可適當地製備所欲sc(Fv) ₂，以製造本發明所揭示的多肽複合體。

再者，本揭露的抗原結合分子或抗體可與載劑聚合物如PEG或有機化合物如抗癌劑接合(conjugate)。或者，較佳可將醣鏈加成序列插入至抗原結合分子或抗體，使醣鏈產生所欲效果。

用於連接抗體可變區的連接子包括可透過基因工程導入的任意胜肽連接子、合成連接子以及如Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996中揭示的連接子。然而，本揭露中較佳為胜肽連接子。胜肽連接子的長度沒有特別限制，且可根據目的由本發明所屬技術領域中具有通常知識者適當地選擇。長度較佳為5或更多個胺基酸(上限沒有特別限制，且一般為30或少於30個胺基酸，較佳為20或少於20個胺基酸)，特佳為15個胺基酸。當sc(Fv) ₂含有三個胜肽連接子時，其長度可以皆相同或不同。

例如，這些胜肽連接子包括 Ser、 Gly-Ser、 Gly-Gly-Ser、 Ser-Gly-Gly、 Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 91)、 Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 92)、 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 93)、 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 94)、 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 95)、 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 96)、 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 97)、 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 98)、 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 93))n、以及 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 94))n，其中，n為1或更大的整數。胜肽連接子的長度或序列可由本發明所屬技術領域中具有通常知識者根據目的而選擇。

通常使用合成連接子(化學交聯劑)來交聯胜肽，且範例包括： N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl suberate, DSS)、辛二酸雙(硫琥珀醯亞胺酯)(bis(sulfosuccinimidyl) suberate, BS3)、二硫代雙(丙酸琥珀醯亞胺酯)(dithiobis(succinimidyl propionate), DSP)、二硫代雙(丙酸硫代琥珀醯亞胺酯)(dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate), DTSSP)、乙二醇雙(琥珀酸琥珀醯亞胺酯)(ethylene glycol bis(succinimidyl succinate), EGS)、乙二醇雙(琥珀酸硫代琥珀醯亞胺酯)(ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate), sulfo-EGS)、酒石酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl tartrate, DST)、酒石酸二硫代琥珀醯亞胺酯(sulfo-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧基羰基氧基)乙基]碸(bis[2-(succinimidoxycarbonyloxy)ethyl]sulfonate, BSOCOES)、及雙[2-(硫代琥珀醯亞胺氧基羰基氧基)乙基]碸(bis[2- (sulfosuccinimidoxycarbonyloxy)ethyl]sulfonate, sulfo-BSOCOES)。這些交聯劑為市售可得。

一般而言，需要三個連接子來將四個抗體可變域連接在一起。所使用的連接子可為相同種類或不同種類。

Fab、F(ab’) ₂及Fab’ 「Fab」由單一輕鏈以及來自單一重鏈的CH1域與可變區所組成。Fab分子的重鏈無法與另一重鏈分子形成雙硫鍵。

「F(ab’) ₂」或「Fab」是將免疫球蛋白(單株抗體)以例如胃蛋白酶及木瓜酵素的蛋白酶處理所製造的，且指的是將免疫球蛋白(單株抗體)在兩各自H鏈中的絞鏈區間存在的雙硫鍵附近進行消化所產生的抗體片段。例如，木瓜酵素切割兩各自H鏈中的絞鏈區間存在的雙硫鍵的IgG上游以產生兩個同源抗體片段，其中包括VL(L鏈可變區)與CL(L鏈恆定區)的L鏈透過在C端區的雙硫鍵連接至包括VH(H鏈可變區)與CHγ1(H鏈恆定區中的γ1區)的H鏈片段。這兩個同源抗體片段各稱為Fab’。

「F(ab’) ₂」由包括CH1域恆定區與CH2域一部分的兩個輕鏈與兩個重鏈所組成，使得兩重鏈之間形成雙硫鍵。本文揭示的F(ab’) ₂較佳可如下文所述而製造。可利用如胃蛋白酶的蛋白酶來部分消化全單株抗體或包括所欲抗原結合位的全單株抗體；以及藉由吸附於蛋白質A管柱而移除Fc片段。蛋白酶沒有特別限制，只要於適當設定的酵素反應條件(例如，pH)下可以選擇性的方式切割全抗體而產生F(ab’) ₂即可。例如，這些蛋白酶包括胃蛋白酶及無花果蛋白酶(ficin)。

單域抗體在本說明書中，「單域抗體」一詞不被其結構所限制，只要其結構域本身可發揮抗原結合活性。如IgG抗體的通常抗體已知在配對VH與VL形成可變區的狀態下展現出抗原結合活性，而單域抗體自己的域結構本身在不與另一域配對的情況下可發揮抗原結合活性。單域抗體一般具有相對低的分子量並以單體形式存在。

單域抗體的範例包括但不限於，先天缺少輕鏈的抗原結合分子，例如駱駝科動物的VHH和鯊魚VNAR，以及包含抗體VH域全體或一部分或抗體VL域全體或一部分的抗體片段。範例包括但不限於，包含抗體VH域或VL域全體或一部分的抗體片段之單域抗體，如美國專利號US 6,248,516 B1等中所述，源自人類抗體VH或人類抗體VL的人造製備單域抗體。在本發明的一些實施例中，一個單域抗體具有三個CDR(CDR1、CDR2與CDR3)。

可從能製造單域抗體的動物或將能製造單域抗體的動物進行免疫化而獲得單域抗體。能製造單域抗體的動物範例包括但不限於駱駝科動物，以及帶有能產生單域抗體的基因的轉基因動物。駱駝科動物包括駱駝(camels)、駱馬(lamas)、羊駝(alpacas)、單峰駱駝(one-hump camels)與原駝(guanacos)等。帶有能產生單域抗體的基因的轉基因動物範例包括但不限於國際公開號WO 2015/143414與美國專利公開號US 2011/0123527 A1中所述的轉基因動物。從動物獲得的單域抗體的框架序列可轉換成人類生殖系列序列或其相似序列以獲得人源化單域抗體。人源化單域抗體(例如，人源化VHH)也是本發明單域抗體的一實施例。

或者，可從包含單域抗體的多肽庫利用ELISA或篩選法(panning)等獲得單域抗體。包含單域抗體的多肽庫範例包括但不限於從各種動物或人類獲得的天然抗體庫(例如，Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)；及 Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764: 8 (1307-1319))、藉由免疫各種動物而獲得的抗體庫(例如，Journal of Applied Microbiology 2014 117: 2 (528-536))、以及從各種動物或人類抗體基因製備的合成抗體庫(例如，Journal of Biomolecular Screening 2016 21: 1 (35-43)；Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657)；以及AIDS 2016 30: 11 (1691-1701))。 Fc區「Fc區」或「Fc域」一詞指的是包括由抗體分子中絞鏈或其部分及CH2域與CH3域所組成的片段的區域。IgG類型的Fc區指的是但不限於，例如從半胱胺酸226(EU編號(本文中亦稱為EU索引))至C端，或脯胺酸230(EU編號)至C端的區域。較佳地可藉由以如胃蛋白酶的蛋白水解酵素部分消化如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體，接著將吸附於蛋白質A管柱或蛋白質G管柱的分液再沖提，以獲得Fc區。這種蛋白水解酵素沒有特別限定，只要在此酵素在適當設定的反應條件下(例如，pH)，能消化全抗體以限制性地形成Fab或F(ab’) ₂即可。其範例可包括胃蛋白酶及木瓜酵素。

衍生自如天然存在IgG的Fc區可用作為本發明的「Fc區」。在此情況下，天然存在IgG指的是多肽，其含有與自然中發現的IgG相同的胺基酸序列且屬於實質上由免疫球蛋白γ基因所編碼的抗體類型。天然存在人類IgG指的是例如天然存在人類IgG1、天然存在人類IgG2、天然存在人類IgG3或天然存在人類IgG4。天然存在IgG也包括從其自發性衍生的變異體等。於Sequences of proteins of immunological interest, NIH出版號No. 91-3242中，基於基因多型性的複數個同種異型體(allotype)序列描述為人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3及人類IgG4抗體的恆定區，其任一者皆可使用於本發明。詳細而言，人類IgG1的序列可具有DEL或EEM作為EU編號第356至358位的胺基酸序列。

在一些實施例中，多特異性抗原結合分子的Fc域由一對包括免疫球蛋白分子的重鏈域的多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域為雙體，其各個次單元包括CH2與CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域的兩個次單元可彼此穩定締合。在一實施例中，本文所述的多特異性抗原結合分子包括不多於一個的Fc域。

在本文所述的一實施例中，多特異性抗原結合分子的Fc域為IgG Fc域。在一特定實施例中，Fc域為IgG1 Fc域。在又一特定實施例中，Fc域為人類IgG1 Fc區。

在某些實施例，多特異性抗原結合分子的Fc域由第一及第二Fc區次單元所構成能夠穩定結合，與天然的人類 IgG1 Fc域相比，Fc域對人類 Fcγ受體的結合親和力降低。

在某些實施例，所述的多特異性抗原結合分子的Fc域包括促進Fc域的第一及第二次單元締合(association)的修飾。在一特定實施例所述修飾被稱為「杵入臼(knob-into-hole)」修飾，包括在兩個Fc域次單元的其中一個中的「杵(knob)」修飾以及Fc域兩個次單元的另一個中的「臼(hole)」修飾，將在之後更詳細的說明。

在一特定實施例，在由能夠穩定締合且與天然人類IgG1 Fc域相比表現出降低的對人類Fc-γ受體結合親和力的第一及第二Fc區次單元所構成的Fc域，第一Fc區次單元選擇自由下述組成的群組： (a1)包括突變L234A、L235A的Fc區多肽； (a2)包括突變L234A、L235A、N297A的Fc區多肽； (a3)包括突變L234A、L235A、N297A、S354C、T366W的Fc區多肽；及第二Fc-區次單元選擇自由下述組成的群組： (a4)包括突變L234A、L235A的Fc區多肽； (a5)包括突變L234A、L235A、N297A的Fc區多肽；及 (a6)包括突變L234A、L235A、N297A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的Fc區多肽 (胺基酸位置依照EU索引編號進行編號)。

在某些實施例，所述的多特異性抗原結合分子的Fc域相較於天然IgG的Fc區，在酸性pH環境(例如，pH 5.8)具有增強的FcRn結合活性。此種Fc域包括，舉例而言，依照EU編號第434位為Ala；第438位為Glu、Arg、Ser、或Lys；及第440位為Glu、Asp、或 Gln。在一些實施例，Fc域包括依照EU編號第434位為Ala；第438位為Arg或Lys；及第440位為Glu或Asp。在一些實施例，Fc域更包括依照EU編號第428位為Ile或Leu；及/或第436位為Ile、Leu、Val、Thr或Phe。在一些實施例，Fc域包括選擇自由下述組成的群組之胺基酸取代的組合：依照EU編號， (a) N434A/Q438R/S440E； (b) N434A/Q438R/S440D； (c) N434A/Q438K/S440E； (d) N434A/Q438K/S440D； (e) N434A/Y436T/Q438R/S440E； (f) N434A/Y436T/Q438R/S440D； (g) N434A/Y436T/Q438K/S440E； (h) N434A/Y436T/Q438K/S440D； (i) N434A/Y436V/Q438R/S440E； (j) N434A/Y436V/Q438R/S440D； (k) N434A/Y436V/Q438K/S440E； (l) N434A/Y436V/Q438K/S440D； (m) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E； (n) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D； (o) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E； (p) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D； (q) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E； (r) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D； (s) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E； (t) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D； (u) M428L/N434A/Q438R/S440E； (v) M428L/N434A/Q438R/S440D； (w) M428L/N434A/Q438K/S440E； (x) M428L/N434A/Q438K/S440D； (y) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E； (z) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D； (aa) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E； (ab) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D； (ac) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E； (ad) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D； (ae) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E； (af) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D； (ag) L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；及 (ah) L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E。

在一些實施例，多特異性抗原結合分子的Fc域包括M428L/N434A/Q438R/S440E之胺基酸取代的組合。在一些實施例，Fc域為IgG Fc域，較佳為人類IgG Fc域，更佳為人類IgG1 Fc域。在某些實施例，多特異性抗原結合分子的Fc域包括下述任一者： (a) 第一Fc次單元包括如SEQ ID NO: 100所示之胺基酸序列及第二Fc次單元包括如SEQ ID NO: 111所示之胺基酸序列；及(b) 第一Fc次單元包括如SEQ ID NO: 99所示之胺基酸序列及第二Fc次單元包括如SEQ ID NO: 109所示之胺基酸序列。

具有降低的Fcγ受體結合活性的Fc區在此，「降低的Fcγ受體結合活性」是指，舉例來說，根據上述分析方法，測試抗原結合分子或抗體的競爭活性相較於對照抗原結合分子或抗體的競爭活性為50%或小於50%，較佳為45%或小於45%、40%或小於40%、35%或小於35%、30%或小於30%、20%或小於20%、或15%或小於15%，及特佳10%或小於10%、9%或小於9%、8%或小於8%、7%或小於7%、6%或小於6%、5%或小於5%、4%或小於4%、3%或小於3%、2%或小於2%、或者1%或小於1%。

抗原結合分子或抗體包括單株 IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4 抗體的Fc域可以適當地作為對照抗原結合分子或抗體。Fc域結構以SEQ ID NOs： 85 (在RefSeq登錄號AAC82527.1的N端添加A)，86 (在RefSeq登錄號AAB59393.1的N端添加A)，87 (在RefSeq登錄號CAA27268.1的N端添加A)，及 88 (在RefSeq登錄號AAB59394.1的N端添加A)表示。進而，當抗原結合分子或抗體包含特定同種型(isotype)抗體的Fc域突變體作為受試物時，使用包含相同同種型的Fc域的抗原結合分子或抗體作為對照，評估突變體的突變對Fcγ受體結合活性的影響。如同前述，適當製備抗原結合分子或抗體，其包含Fcγ受體結合活性已被判斷為降低的Fc域突變體。

此種已知突變包含，舉例而言，在胺基酸231A-238S(EU編號)具有缺失的突變體(WO 2009/011941)，以及C226S，C229S，P238S，(C220S) (J. Rheumatol (2007) 34, 11)； C226S及C229S (Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54)； C226S，C229S，E233P，L234V，及 L235A (Blood (2007) 109, 1185-1192)突變體。

具體來說，較佳的抗原結合分子或抗體，包括包含Fc域具有至少一個胺基酸選自下述胺基酸位置的突變 (例如取代)者： 220、226、229、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、264、265、266、267、269、270、295、296、297、298、299、300、325、327、328、329、330、331、或332 (EU編號)，在形成特定同種型抗體的Fc域的胺基酸中。抗體同種型的Fc域來源並無特別限定，可使用衍生自單株IgG2、IgG3或IgG4抗體的合適的Fc域。較佳可使用衍生自IgG1抗體的Fc域。

較佳的抗原結合分子或抗體包含，舉例而言，包括具有下述取代的任一者的Fc域，其位置依照EU編號指定(每一個號碼表示EU編號的胺基酸殘基位置；且在該數字前的一字母胺基酸符號顯示取代前的胺基酸殘基，及在該數字後的一字母胺基酸符號顯示取代後的胺基酸殘基)在形成IgG1抗體的Fc域的胺基酸： (a) L234F、L235E、P331S； (b) C226S、C229S、P238S； (c) C226S、C229S；或 (d) C226S、C229S、E233P、L234V、L235A；以及具有在胺基酸序列第231至238位具有缺失的Fc域者。

進而，較佳的抗原結合分子或抗體亦包含包括具有下述取代中的任一個的Fc域，其位置依照EU編號指定在形成IgG2抗體的Fc域的胺基酸： (e) H268Q、V309L、A330S、及P331S； (f) V234A； (g) G237A； (h) V234A及G237A； (i) A235E及G237A；或 (j) V234A、A235E、及G237A。每個號碼顯示依照EU編號的胺基酸殘基的位置；且在該數字前的一字母胺基酸符號顯示取代前的胺基酸殘基，及在該數字後的一字母胺基酸符號顯示取代後的胺基酸殘基。

進而，較佳的抗原結合分子或抗體亦包含包括具有下述取代中的任一個的Fc域，其位置依照EU編號指定在形成IgG3抗體的Fc域的胺基酸： (k) F241A； (l) D265A；或 (m) V264A。每個號碼顯示依照EU編號的胺基酸殘基的位置；且在該數字前的一字母胺基酸符號顯示取代前的胺基酸殘基，及在該數字後的一字母胺基酸符號顯示取代後的胺基酸殘基。

進而，較佳的抗原結合分子或抗體亦包含包括具有下述取代中的任一個的Fc域，其位置依照EU編號指定在形成IgG4抗體的Fc域的胺基酸： (n) L235A、G237A、及E318A； (o) L235E；或 (p) F234A及L235A。每個號碼顯示依照EU編號的胺基酸殘基的位置；且在該數字前的一字母胺基酸符號顯示取代前的胺基酸殘基，及在該數字後的一字母胺基酸符號顯示取代後的胺基酸殘基。

其他較佳的抗原結合分子或抗體包含，舉例而言，其包括Fc域，其中在形成IgG1抗體的Fc域的胺基酸的第233、234、235、236、237、327、330、或331 (EU編號)位胺基酸的任一個被取代為對應的IgG2或IgG4的對應的EU編號的胺基酸。

較佳抗原結合分子或抗體亦包含，舉例而言，其包括Fc域，其中在形成IgG1抗體的Fc域的胺基酸的第234、235、及297 (EU編號)位胺基酸的一或以上被取代為其他胺基酸。被取代後的胺基酸種類未特別限定；然而，較佳為抗原結合分子或抗體包括Fc域，其中在第234、235、及297位胺基酸的一或以上被取代為丙胺酸。

較佳抗原結合分子或抗體亦包含，舉例而言，其包括Fc域，其中在形成IgG1抗體的Fc域的胺基酸的第265(EU編號)位胺基酸被取代為其他胺基酸。被取代後的胺基酸種類未特別限定；然而，較佳為抗原結合分子或抗體包括Fc域，其中在第265位胺基酸被取代為丙胺酸。

Fc受體「Fc受體」或「FcR」一詞指的是結合至抗體Fc區的受體。在一些實施例中，FcR為天然人類FcR。在一些實施例中，FcR是結合IgG抗體 (γ受體)的FcR，且包括FcγRI、FcγRII、及FcγRIII次類型的受體，其包括這些受體的對偶變異體及選擇性剪接(splicing)形態。FcγRII受體包含FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有主要差異在於其細胞質域的相似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域包含免疫受體酪胺酸活化模體(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域包含免疫受體酪胺酸抑制模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITIM)(例如，參照Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。FcR的回顧例如在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；及de Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)中。包含將來鑑定的其他FcR也包含於本文的「FcR」一詞。

「Fc受體」或「FcR」一詞更包括新生兒(neonatal)受體FcRn，其負責母體IgG向胎兒的轉移(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))以及免疫球蛋白的恆定調節。與FcRn結合的測量方法為習知的(例如，參照Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；WO 2004/92219 (Hinton et al.))。

體內(in vivo)與人類FcRn的結合及人類FcRn高親和性結合多肽的血漿半衰期，可在如表現人類FcRn的轉基因小鼠或者轉染(transfect)人類細胞株中、或被投予具有變異體Fc區的多肽的靈長類中進行測定。WO 2000/42072 (Presta)描述了對FcR結合增加或減少的抗體變異體。例如，亦參照Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)。

Fcγ受體 Fcγ受體指的是可結合至單株IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體Fc域的受體，且包括屬於實質上由Fcγ受體基因編碼的蛋白質家族的所有成員。人類中，此家族包括：包括同型異構物FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc的FcγRI (CD64)；包括同型異構物FcγRIIa(包括同種異型體(allotype)H131及R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc的FcγRII (CD32)；以及包括同型異構物FcγRIIIa(包括同種異型體V158及F158)及FcγRIIIb(包括同種異型體FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)；以及所有未鑑定的人類Fcγ受體、Fcγ受體同型異構物及其同種異型體。然而，Fcγ受體不限於這些範例。並非以此為限，Fcγ受體包括衍生自人類、小鼠、大鼠、兔子和猴子的Fcγ受體。Fcγ受體可衍生自任何生物。小鼠Fcγ受體包括但不限於，FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2 (CD16-2)、以及所有未鑑定的小鼠Fcγ受體、Fcγ受體同型異構物及其同種異型體。這些較佳的Fcγ受體包括如人類FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16)及/或FcγRIIIB(CD16)。FcγRI的多核苷酸序列及胺基酸序列分別於RefSeq登錄號NM_000566.3及RefSeq登錄號NP_000557.1中所示；FcγRIIA的多核苷酸序列及胺基酸序列分別於RefSeq登錄號BC020823.1及RefSeq登錄號AAH20823.1中所示；FcγRIIB的多核苷酸序列及胺基酸序列分別於RefSeq登錄號BC146678.1及RefSeq登錄號AAI46679.1中所示；FcγRIIIA的多核苷酸序列及胺基酸序列分別於RefSeq登錄號BC033678.1及RefSeq登錄號AAH33678.1中所示；且FcγRIIIB的多核苷酸序列及胺基酸序列分別於RefSeq登錄號BC128562.1及RefSeq登錄號AAI28563.1中所示。除了上述FACS (fluorescence activated cell sorting，螢光活化細胞分類)及ELISA形式，可利用ALPHAScreen (amplified luminescent proximity homogeneous assay screen，放大發光近似均質測定篩選)、基於表面電漿共振(surface plasmon resonance, SPR)現象的BIACORE方法及其他方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006)103 (11), 4005-4010)來評估Fcγ受體對單株IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體的Fc域是否具有結合活性。

同時，「Fc配體」或「效應子配體(effector ligand)」指的是結合至抗體Fc域而形成Fc/Fc配體複合體的分子，且較佳為多肽。分子可衍生自任何生物。Fc配體與Fc的結合較佳誘導了一或多個效應子功能。此Fc配體包括但不限於Fc受體、Fcγ受體、Fcα受體、Fcβ受體、FcRn、C1q、C3、甘露聚醣結合凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌蛋白質A、葡萄球菌蛋白質G以及病毒Fcγ受體。Fc配體也包括Fc受體同源物(Rc receptor homolog, RcRH)(Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136)，為與Fcγ受體同源的Fc受體家族。Fc配體也包括結合至Fc的未鑑定分子。

Fcγ受體結合活性可利用上述FACS與ELISA形式以及ALPHAScreen (amplified luminescent proximity homogeneous assay screen，放大發光近似均質測定篩選)與基於表面電漿共振(SPR)的BIACORE方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010)評估Fc域對Fcγ受體FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA及/或FcγRIIIB中任一的減弱的結合活性。

藉由基於下述準則並使用二種珠粒(供者及受者珠粒)的ALPHA技術來進行ALPHAScreen。只有當連接至供者珠粒的分子與連接至受者珠粒的分子進行生物交互作用時，以及當兩珠粒非常接近時，偵測得到發光訊號。供者珠粒中雷射光所激發的感光劑將珠粒周圍的氧轉換成激發的單態氧(singlet oxygen)。當單態氧於供者珠粒周圍擴散且到達非常接近的受者珠粒時，於受者珠粒中引起化學發光反應。此反應最終發出光線。若連接至供者珠粒的分子沒有與連接至受者珠粒的分子進行交互作用時，供者珠粒產生的單態氧沒有到達受體珠粒且沒有發生化學發光反應。

例如，將生物素標記抗原結合分子或抗體固定於供者珠粒，且將穀胱甘肽S轉移酶(GST)標籤的Fcγ受體固定於受者珠粒。在包括競爭性突變Fc域的抗原結合分子或抗體不存在的情況下，Fcγ受體與包括野生型Fc域的抗原結合分子或抗體進行交互作用，因此引發520至620nm的訊號。具有未標籤突變Fc域的抗原結合分子或抗體與包括野生型Fc域的抗原結合分子或抗體競爭與Fcγ受體的交互作用。可透過定量因競爭而減少的螢光來判斷相對結合親和性。抗原結合分子或抗體的生物素化方法是習知的方法，例如使用硫-NHS-生物素等的抗體。將GST標籤添加至Fcγ受體的適當方法包括涉及以下所述的方法：使框架中編碼Fcγ受體與GST的多肽融合；以導入帶有基因的載體的細胞表現融合基因；接著使用穀胱甘肽管柱純化。較佳可透過如使用GRAPHPAD PRISM(GraphPad; San Diego)的軟體，並基於非線性迴歸分析將引發出的訊號擬合至一位點競爭模型而分析引發出的訊號。

將欲觀察其交互作用的其中一物質作為配體固定至感測晶片的金薄層上。當光線照射感測晶片的背面，使得在金薄層與玻璃之間的界面發生全反射時，反射光的強度在某些位點(SPR訊號)部分地減少。將欲觀察其交互作用的另一物質作為分析物注射於感測晶片的表面上。當分析物結合至配體時，固定的配體分子的質量增加。這改變了感測晶片的表面上溶劑的折射率。折射率的改變造成SPR訊號的位置偏移(相反地，解離將訊號轉移至原始位置)。在Biacore系統中，上述的偏移量(亦即，感測晶片表面上的質量改變)繪示於垂直軸，因此隨時間的質量變化繪示為測量資料(感測圖)。動力學參數(締合速率常數(ka)與解離速率常數(kd))是由感測圖的曲線而判斷，且親和性(KD)是由這兩個常數間的比值而判斷。BIACORE方法中較佳使用抑制測定法。此抑制測定的範例描述於Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010。

多特異性抗體的製造與純化本文所述的多特異性抗原結合分子包括兩個不同的抗原結合部分(例如，「第一抗原結合部分」與「第二抗原結合部分」皆可結合至CD3及CD137，且「第三抗原結合部分」可結合至不同的抗原)，其中每一個最後皆與Fc域兩個次單元的其中一者或另一者融合，因此Fc域的兩個次單元一般包含於兩個不相同的多肽鏈中。這些多肽的重組共表現與後續的二聚合(dimerization)產生兩個多肽的許多可能組合。為了改善重組製造中多特異性抗原結合分子的產率與純度，在多特異性抗原結合分子的Fc域中導入促進所欲多肽締合的修飾將是有利的。

因此，在特定實施例中，本文所述的多特異性抗原結合分子的Fc域包括促進Fc域的第一次單元與第二次單元締合的修飾。人類IgG Fc域兩個次單元之間的蛋白質-蛋白質交互作用最大量的位點位於Fc域的CH3域中。因此，在一實施例中，上述修飾位於Fc域的CH3域中。

在特定實施例中，上述修飾是所謂的「杵入臼(knob-into-hole)」修飾，包括Fc域兩個次單元的其中一個中的「杵(knob)」修飾以及Fc域兩個次單元的另一個中的「臼(hole)」修飾。

杵入臼技術描述於US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)；以及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)。一般而言，方法涉及在第一多肽的界面導入隆起(protuberance)(「杵」)並於第二多肽的界面中導入對應的空腔(cavity)(「臼」)，使隆起可被放置於空腔中以促進異二聚體的形成與絞鏈同二聚體的形成。可藉由從第一多肽的界面以較大的側鏈(例如，酪胺酸或色胺酸)取代小胺基酸側鏈而建構出隆起。藉由以較小的胺基酸側鏈(例如，丙胺酸或蘇胺酸)取代大胺基酸側鏈而於第二多肽的界面中產生與隆起尺寸相同或相似的補償空腔。

因此，在一特定實施例中，多特異性抗原結合分子Fc域的第一次單元的CH3域中，以具有較大側鏈體積的胺基酸殘基取代胺基酸殘基，以於第一次單元的CH3域之中產生隆起，隆起可置於第二次單元的CH3域之中的空腔中，且Fc域第二次單元的CH3域中，以具有較小側鏈體積的胺基酸殘基取代胺基酸殘基，以於第二次單元的CH3域之中產生空腔，第一次單元的CH3域之中的隆起可置於第二次單元CH3域之中的空腔中。

可利用如定點突變改變編碼多肽的核酸或利用胜肽合成而製造隆起與空腔。

在一特定實施例中，Fc域第一次單元的CH3域中，以色胺酸殘基取代第366位的蘇胺酸殘基(T366W)，且Fc域第二次單元的CH3域中，以纈胺酸殘基取代第407位的酪胺酸殘基(Y407V)。在一實施例中，Fc域的第二次單元中，另外以絲胺酸殘基取代第366位的蘇胺酸殘基(T366S)，並以丙胺酸殘基取代第368位的白胺酸殘基(L368A)。

在又一實施例中，Fc域的第一次單元中，另外以半胱胺酸殘基取代第354位的絲胺酸殘基(S354C)，且在Fc域的第二次單元中，另外以半胱胺酸殘基取代第349位的酪胺酸殘基(Y349C)。導入這兩個半胱胺酸殘基造成在Fc域的兩個次單元之間形成雙硫鍵，進一步穩定二聚體(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。

在其他實施例中，於H鏈之中以及具有所欲組合的L鏈與H鏈之間促進締合的其他技術可應用於本發明的多特異性抗原結合分子。

例如，在抗體H鏈第二恆定區或第三恆定區(CH2或CH3)的界面導入靜電排斥(electrostatic repulsion) 而抑制非所欲的H鏈締合的技術可應用於多特異性抗體締合(WO 2006/106905)。

在CH2或CH3的界面導入靜電排斥而抑制非刻意的H鏈締合的技術中，在H鏈其他恆定區的界面接觸的胺基酸殘基範例包括對應至CH3區中的EU編號第356、439、357、370、399與409位殘基的區域。

更具體而言，範例包括含有兩種H鏈CH3區的抗體，其中第一H鏈CH3區中一至三對胺基酸殘基帶有相同型態的電荷，上述一至三對胺基酸殘基擇自於下列(1)至(3)所示的胺基酸殘基對：(1) 包含於H鏈CH3區EU編號第356與439位中的胺基酸殘基；(2) 包含於H鏈CH3區EU編號第357與370位中的胺基酸殘基；以及(3) 包含於H鏈CH3區EU編號第399與409位中的胺基酸殘基。

再者，抗體可以是第二H鏈CH3區中的胺基酸殘基對與前述第一H鏈CH3區不同的抗體，第二H鏈CH3區中的胺基酸殘基對擇自於前述(1)至(3)的胺基酸殘基對，其中對應至在第一H鏈CH3區中帶有相同型態電荷的前述(1)至(3)的胺基酸殘基對的一至三對胺基酸殘基帶有與前述第一H鏈CH3區中對應的胺基酸殘基相反的電荷。

以上(1)至(3)所示的每個胺基酸殘基在締合時彼此靠近。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可透過同源建模等使用市售軟體，在所欲H鏈CH3區或H鏈恆定區中找出對應至前述胺基酸殘基(1)至(3)的位置，且可適當地對這些位置的胺基酸殘基進行修飾。

在前述抗體中，「帶電胺基酸殘基」較佳擇自如包含於下列群組中其中一者中的胺基酸殘基： (a) 麩胺酸(E)與天門冬胺酸(D)；以及 (b) 離胺酸(K)、精胺酸(R)與組胺酸(H)。

在前述抗體中，用句「帶有相同電荷」指的是如兩個或兩個以上的胺基酸殘基皆擇自包含於上述群組(a)與(b)的其中一者中的胺基酸殘基。用句「帶有相反電荷」指的是如當兩個或兩個以上的胺基酸殘基之中的至少一胺基酸殘基擇自包含於上述群組(a)與(b)的其中一者中的胺基酸殘基時，剩餘的胺基酸殘基是擇自包含於另一群組中的胺基酸殘基。

在一較佳實施例中，前述抗體可透過雙硫鍵使其第一H鏈CH3區與第二H鏈CH3域交聯。

在本發明中，進行修飾的胺基酸殘基並不限於抗體可變區或抗體恆定區的前述胺基酸殘基。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可透過同源建模等使用市售軟體，鑑定出在突變多肽或多異聚體中形成界面的胺基酸殘基，且可對這些位置的胺基酸殘基進行修飾以調節締合。

此外，其他習知技術也可用於形成本發明的多特異性抗體。將其中抗體H鏈CH3中的一個的一部分轉換為對應的IgA衍生序列，且將對應的IgA衍生序列導入其他H鏈CH3的互補部分中而製造股交換改造域(strand-exchange engineered domain)CH3，使用股交換改造域CH3進行CH3的互補締合來有效誘導具有不同序列的多肽進行締合(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。此習知技術也可用以有效率地形成感興趣的多特異性抗體。

此外，利用抗體CH1與CL的締合以及VH與VL的締合製造抗體的技術描述於WO 2011/028952、WO 2014/018572及Nat Biotechnol. 2014 Feb; 32(2):191-8；利用結合個別製備的單株抗體(Fab臂交換)來製造雙特異性抗體的技術描述於WO 2008/119353及WO 2011/131746；調節抗體重鏈CH3之間締合的技術描述於WO 2012/058768及WO 2013/063702；由兩種輕鏈與一種重鏈所構成的多特異性抗體的製造技術描述於WO 2012/023053；使用獨立表現包括單一輕鏈與單一重鏈的抗體的其中一鏈的兩種細菌細胞株來製造多特異性抗體的技術如Christoph等人所述(Nature Biotechnology Vol. 31, p. 753-758 (2013))；且亦可用於形成多特異性抗體。

或者，即便是無法有效形成感興趣的多特異性抗體時，可透過從所製造的抗體分離並純化感興趣的多特異性抗體而獲得本發明的多特異性抗體。例如，已有報導(WO2007114325)揭示可透過將胺基酸取代導入至兩種H鏈的可變區中而產生等電點差異，進而以離子交換層析法純化感興趣的兩種同聚體形式與異聚體抗體的方法。直至今日，作為純化異聚體抗體的方法，已有報導(WO98050431及WO95033844)揭示利用蛋白質A純化異二聚體抗體的方法，異二聚體抗體包括結合至蛋白質A的小鼠IgG2a H鏈及沒有結合至蛋白質A的大鼠IgG2b H鏈。再者，可利用包括為IgG蛋白質A結合位的EU編號第435與436位胺基酸殘基以如Tyr、His或產生不同的蛋白質A親和性的胺基酸取代的H鏈，或利用具有不同蛋白質A親和性的H鏈以改變每個H鏈與蛋白質A的交互作用，然後使用蛋白質A管柱而自行有效率地純化異二聚體抗體。

再者，Fc區C端異質性已改善的Fc區可適當地作為本發明的Fc區。更具體而言，本發明提供透過從組成衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區的兩個多肽胺基酸序列，刪除如EU編號所指定的第446位的甘胺酸與第447位的離胺酸而製造的Fc區。

可利用本發明所屬技術領域習知的技術如高效能液相層析法、離子交換層析法、凝膠電泳法、親和性層析法、粒徑篩析層析法等來純化如本文所述而製備的多特異性抗原結合分子。用以純化特定蛋白質的實際條件將部分地取決於如淨電荷、親油性、親水性等因素，且對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者是顯而易見的。對於親和性層析純化，可使用與多特性抗原結合分子結合的抗體、配體、受體或抗原。例如，對於本發明多特異性抗原結合分子的親和性層析純化而言，可使用具有蛋白質A或蛋白質G的基質(matrix)。可使用依序的蛋白質A或蛋白質G親和性層析法及粒徑篩析層析法來分離多特異性抗原結合分子。可利用任何各式各樣習知的分析方法判斷多特異性抗原結合分子的純度，包括凝膠電泳法及高壓液相層析法等。

抗體依賴性細胞介導細胞毒性(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 「抗體依賴性細胞介導細胞毒性」或「ADCC」指的是一種形式的細胞毒性，其中與存在於某些細胞毒性細胞(例如，NK細胞、嗜中性球與巨噬細胞)上的Fc受體(FcRs)結合的分泌Ig，可使這些細胞毒性效應細胞特異性結合至帶有抗原的目標細胞，並接著以細胞毒素殺死目標細胞。介導ADCC的初始細胞(primary cell)，NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII與FcγRIII。造血細胞上FcR的表現概述於Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)第464頁的表3中。為了評估感興趣分子的ADCC活性，可進行如美國專利號5,500,362或5,821,337或美國專利號6,737,056(Presta)中所述的體外ADCC測定。這些測定適用的效應細胞包括PBMC與NK細胞。或者或更甚者，可於體內評估感興趣分子的ADCC活性，例如在Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中揭示的動物模型中。

補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity, CDC) 「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」指的是在補體存在的情況下裂解目標細胞。傳統的補體途徑是透過補體系統第一成分(C1q)與結合至其同源抗原的抗體(適當次類型)結合而開始進行活化。為了評估補體的活化，可進行如Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)中所述的CDC測定。具有經改變的Fc區胺基酸序列的多肽變異體(具有變異體Fc區的多肽)及增強或減弱的C1q結合能力描述於如美國專利號6,194,551 B1及WO 1991/51642。亦參照如Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)。

T細胞依賴性細胞毒性(T cell dependent cellular cytotoxicity, TDCC) 「T細胞依賴性細胞毒性」或「TDCC」指的是一種形式的細胞毒性，其中抗原結合分子結合至表現於目標細胞的抗原以及表現於T細胞的另一抗原兩者，其再引導T細胞接近目標細胞，例如T細胞誘導對目標細胞的細胞毒性。評估T細胞依賴性細胞毒性的方法，體外TDCC測定也描述於本說明書的「T細胞依賴性細胞毒性的測量」段落中。

T細胞依賴性細胞毒性的測量在抗原結合分子結合至DLL3及CD3/CD137兩者的實施例中，下文所述的方法較佳作為T細胞依賴性細胞毒性(TDCC)的評估或判斷方法，將本揭露的抗原結合分子接觸與本揭露抗原結合分子中抗原結合位結合的表現DLL3細胞而導致T細胞依賴性細胞毒性(TDCC)。體外細胞毒性活性的評估或判斷方法包括細胞毒性T細胞活性的判斷方法等。可利用習知方法(參照如Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993))來判斷本揭露的抗原結合分子是否具有誘導T細胞介導細胞毒性的活性。在細胞毒性測定中，可結合至與DLL3不同的抗原及CD3/CD137且沒有表現於細胞中的抗原結合分子作為對照抗原結合分子。以相同方式測定對照抗原結合分子。接著，測試本揭露的抗原結合分子是否展現比對照抗原結合分子更強的細胞毒性活性來評估活性。

同時，可利用如以下步驟來評估或判斷體內抗腫瘤功效。將表現與本揭露抗原結合分子中的抗原結合位結合的抗原的細胞、皮內或皮下移植到非人類動物對象。接著從移植日或之後，每天或以數天的期間將測試抗原結合分子投予至靜脈或腹膜腔。隨著時間測量腫瘤尺寸。腫瘤尺寸的變化差異可定義為細胞毒性活性。如在體外測定中，投予對照抗原結合分子。當投予本揭露的抗原結合分子群組中的腫瘤尺寸小於投予對照抗原結合分子群組中的腫瘤尺寸時，可評斷本揭露的抗原結合分子具有細胞毒性。

較佳使用甲基噻唑四氮唑(MTT)方法並測量同位素標記胸苷被細胞攝取來評估或判斷與本揭露抗原結合分子的效應，該效應為本揭露抗原結合分子與表現與抗原結合分子中的抗原結合位結合的抗原的細胞接觸，以抑制細胞成長。同時，上述評估或判斷體內細胞毒性活性的相同方法可較佳用以評估或判斷體內抑制細胞成長的活性。

本揭露抗體或抗原結合分子的TDCC可利用任何本發明所屬技術領域中習知的合適方法來進行評估。例如，可利用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放測定法來測量TDCC。在此測定法中，在存在測試抗體或抗原結合分子的情況下，將目標細胞(例如，表現DLL3的細胞)與T細胞(例如，PBMC)進行培養，且從T細胞殺死的目標細胞所釋放的LDH活性是使用合適試劑進行測量。一般而言，細胞毒性活性是計算為來自與抗體或抗原結合分子培養而得的LDH活性相對於來自殺死100%目標細胞(例如，利用Triton-X處理而裂解)而得的LDH活性的百分比。若如前述計算的細胞毒性活性較高，則判斷測試抗體或抗原結合分子具有較高的TDCC。

或者或更甚者，例如，也可利用即時細胞成長抑制測定法來測量TDCC。在此測定中，目標細胞(例如，表現DLL3的細胞)在測試抗體或抗原結合分子存在的情況下於96孔盤與T細胞(例如，PBMC)進行培養，且利用本發明所屬技術領域中習知的方法監測目標細胞的成長，例如使用合適的分析儀器(例如，xCELLigence即時細胞分析儀)。由根據公式: CGI(%) = 100 - (CI _Ab× 100 / CI _NoAb)的細胞指標值(cell index value, CGI)判斷細胞成長抑制率(CGI: %)。「CI _Ab」表示於特定實驗時間具有抗體或抗原結合分子的孔的細胞指標值，且「CI _NoAb」表示沒有抗體或抗原結合分子的孔的平均細胞指標值。若抗體或抗原結合分子的CGI率高，亦即具有顯著正值，則可謂抗體或抗原結合分子具有TDCC活性。

在一態樣中，本揭露的抗體或抗原結合分子具有T細胞活化活性。可利用本發明所屬技術領域中習知的方法來測定T細胞的活化，例如使用對其活化反應而表現報導基因(例如，螢光素酶)的改造T細胞株(例如，Jurkat / NFAT-RE Reporter細胞株(T Cell Activation Bioassay, Promega))的方法。此方法中，目標細胞(例如，表現DLL3的細胞)在測試抗體與抗原結合分子存在的情況下與T細胞進行培養，且接著利用適合作為T細胞活化指標的方法測量報導基因表現產物的水準或活性。當報導基因為螢光素酶基因時，可測量來自於螢光素酶與其受質之間的反應發光作為T細胞活化的指標。若如前述所測量的T細胞活化程度較高，則判斷測試抗體或抗原結合分子具有較高的T細胞活化活性。

醫藥組成物在一態樣中，本揭露提供一種包括本揭露抗原結合分子或抗體的醫藥組成物。在某些實施例中，本揭露的醫藥組成物誘導T細胞依賴性細胞毒性，換言之，本揭露的醫藥組成物為誘導細胞毒性的治療劑。在某些實施例中，本揭露的醫藥組成物為用於治療及/或預防癌症的醫藥組成物。在某些實施例中，本揭露的醫藥組成物為治療及/或預防DLL3陽性的癌症或表現DLL3的癌症包含肺癌(包含小細胞肺癌)及黑色素瘤的醫藥組成物。在某些實施例，本揭露之醫藥組成物為細胞生長抑制劑。在某些實施例，本揭露之醫藥組成物是抗癌劑。

本揭露的醫藥組成物、本揭露的誘導細胞毒性的治療劑、細胞成長抑制劑或抗癌劑若有需要，可與不同種類的抗原結合分子或抗體配製。例如，可利用本揭露多重抗原結合分子或抗體的混合物(cocktail)增強針對表現抗原的細胞的細胞毒性作用。

將具有所欲純度的此抗原結合分子或抗體與一或多種可選的醫藥上可接受載體(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))以凍乾製劑或水溶液的形式混合來製備如本文所述的抗原結合分子或抗體的醫藥組成物。醫藥上可接受載體在所採用的劑量與濃度一般對於接受者是無毒性的，且其包括但不限於：緩衝液如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸與甲硫胺酸；防腐劑(如氯化十八烷基二甲基苄銨(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)；氯化六甲銨(hexamethonium chloride)；氯化苄二甲基烴銨(benzalkonium chloride)；氯化苯索寧(hexamethonium chloride)；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣和其它醣類，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽相對離子，如鈉；金屬複合體(例如鋅蛋白質複合體)；及/或非離子界面活性劑，如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性醫藥上可接受載體更包括藥物間質分散劑，如可溶中性活性玻尿酸酶醣蛋白(soluble neutral-active hyaluroidase glycoproteins, sHASEGP)，例如，人類可溶PH-20玻尿酸酶醣蛋白，如rHuPH20(HYLENEX(註冊商標)，Baxter International, Inc.)。某些示例性sHASEGP及使用方法，包含rHuPH20，描述於美國專利公開號2005/0260186及2006/0104968中。在一態樣中，sHASEGP與一或多種額外的葡糖胺聚醣酶結合，葡糖胺聚醣酶如軟骨素酶。

例示性凍乾的抗體配方描述於美國專利號6,267,958中。水溶液抗體配方包含描述於美國專利號6,171,586及WO 2006/044908中的水溶液抗體配方，後者的配方包含組胺酸-醋酸鹽緩衝液。

對於治療的特定適應症所需，本文的配方亦可包含多於一種的活性成分，較佳為具有不會對彼此造成負面影響的互補活性的活性成分。此活性成分適合以對於目的用途有效的量的組合存在。

若有需要，可將本揭露的抗原結合分子或抗體裝入微膠囊(羥甲基纖維素、明膠、聚[甲基丙烯酸甲酯]等製成的微膠囊)中，且可製成膠體藥物遞送系統(微脂體、白蛋白微球體、微乳劑、奈米粒子及奈米膠囊等)(參照如"Remington’s Pharmaceutical Science 16thedition", Oslo Ed.(1980))的成分。再者，將製劑製備成緩釋製劑的方法是習知的，且這些方法可應用於本揭露的抗原結合分子(J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 267-277；Chemtech. (1982) 12, 98-105；美國專利號3773719、歐洲專利申請號EP58481及EP133988；Biopolymers (1983) 22, 547-556)。

本揭露的醫藥組成物、細胞成長抑制劑或抗癌劑可口服或腸胃外投予至患者。較佳為腸胃外投予。具體而言，此投予方法包括注射、鼻腔投予、經肺投予及經皮投予。例如，注射包括靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等。例如，可透過注射而局部或系統性投予本揭露的醫藥組成物、本揭露的誘導細胞毒性的治療劑、細胞成長抑制劑或抗癌劑。再者，適當的投予方法可根據患者的年齡與症狀而選擇。例如，投予劑量可擇自每次投予每kg體重0.0001mg至1,000mg之間的範圍。或者，例如，劑量可擇自每位患者0.001mg/body至100,000mg/body之間的範圍。然而，本揭露醫藥組成物的劑量並不限於這些劑量。

本揭露的醫藥組成物較佳包括本文所述的抗原結合分子或抗體。在一態樣中，組成物為用於誘導細胞毒性的醫藥組成物。在另一態樣中，組成物為用於治療或預防癌症的醫藥組成物。癌症較佳為肺癌(包含小細胞肺癌)及黑色素瘤。本揭露的醫藥組成物可用於治療或預防癌症。因此，本揭露提供治療或預防癌症的方法，其中將本文所述的抗原結合分子或抗體投予至有需要的患者。

本揭露也提供透過將表現DLL3的細胞與本揭露之結合至DLL3的抗原結合分子接觸，而損害表現DLL3的細胞或或抑制細胞成長的方法。本揭露之抗原結合分子所結合的細胞只要能表現DLL3即可，並沒有特別限制。具體而言，在本揭露，較佳的DLL3表現細胞包含肺癌(包含小細胞肺癌)及黑色素瘤

在本揭露中，例如，可透過將本揭露的抗原結合分子添加至於體外培養的表現DLL3細胞的培養基來進行「接觸」。在此情況下，欲添加的抗原結合分子可以適當的形式使用，例如溶液或利用凍乾製備而得的固體等。當本揭露的抗原結合分子以水溶液添加時，溶液可以是僅含有抗原結合分子的純水溶液，或是含有如前述界面活性劑、賦形劑、著色劑、調味劑(flavoring agent)、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等滲劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑和矯味劑(corrigent)的溶液。添加的濃度並沒有特別限制，然而，培養基中的最終濃度較佳在1pg/ml至1g/ml之間的範圍，更佳為1ng/ml至1mg/ml，且更佳為1μg/ml至1mg/ml。

在本揭露的另一實施例中，也可透過體內投予至移植表現DLL3的細胞的非人類動物，或投予至具有內源性表現DLL3的癌細胞的動物來進行「接觸」。投予方法可以是口服或腸胃外的。特別偏好腸胃外投予。具體而言，腸胃外投予方法包括注射、鼻腔投予、經肺投予及經皮投予。例如，注射包括靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等。例如，可透過注射而局部或系統性投予本揭露的醫藥組成物、誘導細胞毒性的治療劑、細胞成長抑制劑或抗癌劑。再者，可根據動物對象的年齡與症狀而選擇適當的投予方法。當抗原結合分子以水溶液形式投予時，溶液可以是僅含有抗原結合分子的純水溶液，或是含有如前述界面活性劑、賦形劑、著色劑、調味劑(flavoring agent)、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等滲劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑和矯味劑(corrigent)的溶液。例如，投予劑量可擇自每次投予每kg體重0.0001mg至1,000mg之間的範圍。或者，例如劑量可擇自每位患者0.001mg/body至100,000mg/body之間的範圍。然而，本揭露之抗原結合分子的劑量並不限於這些範例。

本揭露也提供用於本揭露方法的套組，其包括本揭露的抗原結合分子或利用本揭露方法製造的抗原結合分子。套組可以與額外的醫藥上可接受載體或培養基，或敘述如何使用套組的說明書等一同包裝。

在本發明的另一態樣中，提供包括用於治療、預防及/或診斷前述病症的材料的製品。製品包括容器及容器上的標籤或與容器相關的藥品仿單。例如，合適的容器包括瓶子、小瓶(vial)、注射器、IV溶液袋等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。容器裝有組成物，組成物是單獨地或與對治療、預防及/或診斷病症有效的另一組成物組合，且可具有無菌的存取口(例如，容器可以是具有可被皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組成物中至少一活性成分為本發明的抗體。標籤或藥品仿單標明組成物是用於治療特定的病症。此外，製品可包含(a) 包含組成物於其中的第一容器，其中組成物包括本發明的抗體；及(b) 包含組成物於其中的第二容器，其中組成物包括另外的細胞毒性劑或其它治療劑。在本發明的此實施例中的製品可更包括標明組成物可用於治療特定症狀的藥品仿單。或者或更甚者，製品可更包括第二(或第三)容器，其包括醫藥上可接受的緩衝液，如注射用抑菌水(bacreiostatic water for injection, BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer溶液及右旋糖溶液。以商業角度與使用者角度而言，可更包括其他所需材料，包括其它緩衝液、稀釋劑、濾膜、針頭及注射器。

藥品仿單「藥品仿單」一詞指的是習慣包含於治療產品的商業包裝中的說明，其包含關於適應症、用法、劑量、投予、結合療法、禁忌症及/或有關這類治療產品的使用警語的資訊。

醫藥配方「醫藥配方」或「醫藥組成物」一詞指的是處於使包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，且其不包含對將要投予此配方的對象具有不可接受的毒性之額外成分。

醫藥上可接受的載劑「醫藥上可接受的載劑」指的是醫藥配方中活性成分以外的成分，對對象不具有毒性。醫藥上可接受的載劑包括但不限於緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

治療如本文所使用，「治療」(及其文法上的變化如治療(treat)或進行治療(treating))指的是意圖改變被治療個體自然病程的臨床介入，且可在臨床病理過程中進行或為了預防而進行。治療的預期效果包括但不限於防止疾病的發生或復發、減緩症狀、減少疾病任何直接或間接的病理結果、防止轉移、降低疾病進程的速率、改善或減輕疾病的狀態以及緩解或改善預後。在一些實施例中，本揭露的抗原結合分子或抗體用以延遲疾病的發展或減緩疾病的進程。

癌症用詞「癌症」與「癌變(cancerous)」指的是或描述的是哺乳類中的生理狀況，一般是以不受控制的細胞成長/增殖為特徵。

在某些實施例，癌症為表現DLL3癌症或DLL3陽性癌症，包括肺癌(包含小細胞肺癌)及黑色素瘤。

腫瘤「腫瘤」一詞指的是所有腫瘤性(neoplastic)細胞成長與增殖，無論是良性或惡性，以及所有癌前病變或癌變細胞與組織。用詞「癌症」、「癌變」、「細胞增殖失調」、「增殖失調」與「腫瘤」於本文並不相互排斥。

在一較佳實施例，癌症為表現DLL3之癌症(包含癌組織或細胞)。在一些實施例，癌症為肺癌，小細胞肺癌(SCLC)，或黑色素瘤。

其他製劑與治療本文所述的多特異性抗原結合分子可與一或多種其他治療劑一起投予。例如，本文所述的多特異性抗原結合分子可與至少一種額外的治療劑共同投予。「治療劑(therapeutic agent)」一詞涵蓋治療有需要此治療的個體中的症狀或疾病而投予的任何製劑。這些額外的治療劑可包括適用於被治療的特定適應症的任何活性成分，較佳為不會彼此帶來負面影響的互補活性的活性成分。在某些實施例中，額外的治療劑為免疫調節劑、細胞抑制劑、細胞附著抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡活化劑、或增加細胞對細胞凋亡誘導劑靈敏度的製劑。在一特定實施例中，額外的治療劑為抗癌劑，例如微管破壞劑(microtubule disruptor)、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑、DNA插入劑(intercalator)、烷化劑、荷爾蒙療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑或抗血管新生劑。

這些其他製劑適合以對預期目的有效的含量存在。這些其他製劑的有效量取決多特異性抗原結合分子的使用量、病症或治療的種類及前文所討論的其他因素。多特異性抗原結合分子一般是以本文所述的相同劑量及投予途徑使用，或約本文所述劑量的1至99%，或以經驗/臨床上判斷為合適的任何劑量及任何途徑使用。

前文提及的這些組合療法涵蓋結合投予(其中相同或個別組成物中包含兩種或兩種以上的治療劑)以及個別投予，在此情況下，可在投予額外治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後投予本文所述的多特異性抗原結合分子。本文所述的多特異性抗原結合分子也可與放射療法一同使用。

本文引用的所有文獻均通過引用併入本文。

以下為本揭露方法與組成物的範例。應能理解，在前述提供的總體描述的情況下，可實施其他各種實施例。 [實施例]

[實施例1]

篩選親代Dual-Fab H183L072的親和性成熟變異體以改善對腫瘤細胞的體外細胞毒性 1.1 親和性成熟變異體的序列提供結合至CD3與CD137但沒有同時結合至CD3與CD137的免疫球蛋白可變(Fab)區的概念(Dual-Fab)揭示於WO2019111871中(透過引用併入本文)。為了增加WO2019111871中揭示的親代Dual-Fab H183L072(重鏈：SEQ ID NO: 1；輕鏈：SEQ ID NO: 57)的結合親和性，使用H183L072作為模板，於可變區導入單一或多個突變，產生1000個以上的Dual-Fab變異體。抗體使用Expi293細胞(Invitrogen)表現，且利用蛋白質A純化法並接著利用凝膠過濾(有需要進行凝膠過濾時)來進行純化。帶有多個突變的22個代表的Dual-Fab變異體的序列列於表6與表8-1至8-6，且在實施例1.2.2(表9)，在25度C及/或37度C下使用下述的Biacore T200儀器(GE Healthcare)評估對CD3與CD137的結合親和性與動力學。

1.2. 親和性成熟變異體的結合動力學資訊 1.2.1 人類CD3與CD137的表現與純化人類CD3複合體的γ與ε次單元(人類CD3eg連接子)是透過29個單體單元的連接子連接，且Flag標籤融合至γ次單元的C端末(SEQ ID NO: 102，表5與7)。使用FreeStyle293F細胞株(Thermo Fisher)暫時表現此構築體。使用裝載有Q HP樹脂(GE healthcare)的管柱濃縮表現人類CD3eg連接子的條件培養基(conditioned media)，接著將其供給於FLAG標籤親和性層析。收集包含人類CD3eg連接子的分液且接著以經1x D-PBS平衡的Superdex 200凝膠過濾管柱(GE healthcare)進行處理。然後匯集含有人類CD3eg連接子的分液。使用FreeStyle293F細胞株(Thermo Fisher)暫時表現C端有六組胺酸(hexahistidine)(His標籤)及生物素受體胜肽(biotin acceptor peptide，BAP)的人類CD137細胞外域(extracellular domain，ECD)(SEQ ID NO: 103，表5與7)。將表現人類CD137細胞外域的條件培養基供給於HisTrap HP管柱(GE healthcare)，並以含有咪唑(Nacalai)的緩衝液沖提。收集含有人類CD137細胞外域的分液接著以經1x D-PBS平衡的Superdex 200凝膠過濾管柱(GE healthcare)進行處理。然後匯集含有人類CD137細胞外域的分液並儲存於-80度C。

1.2.2 對人類CD3與CD137的親和性測量在25度C下，使用Biacore 8K儀器(GE Healthcare)評估Dual-Fab抗體(Dual-Ig)對人類CD3的結合親和性。使用胺偶合套組(GE Healthcare)將抗人類Fc(GE Healthcare)固定於CM4感測晶片的所有流通槽(flow cell)。將抗體捕獲於抗Fc感測表面上，並接著將重組人類CD3或CD137注入於流通槽上。以pH7.4之含有 20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% Tween 20、0.005% NaN ₃的ACES來製備所有抗體與分析物。每循環以3M MgCl ₂再生感測表面。使用版本為2.0的Biacore Insight評估軟體(GE Healthcare)處理數據並將其擬合至1:1結合模型以判斷結合親和性。以相同條件進行CD137結合親和性測定，但測定溫度設定為37度C。Dual-Fab抗體對重組人類CD3與CD137的結合親和性顯示於表9-1與9-2中(表中的用於表達K _on、K _off、KD值中的E意味著「10的次方」，例如，3.54E+04 = 3.54*10 ⁴)。如表9-1與9-2所示，與H183/L072相比，Dual Fab變異體對CD3與CD137展現出不同的結合動力學。 (表5) 表7的序列辨識號(SEQ ID Nos)的註解(表9的親和性分析所使用的人類CD3及CD137抗原的SEQ ID NOs) (表6) 表8-1至8-6的序列辨識號的註解(抗體命名及包含CDR1、2及3之可變區的序列辨識號(SEQ ID NO)) (表7)抗原的全長胺基酸序列 (表8-1)抗體可變區的全長胺基酸序列接續表6註解的CDR 1、2 及3區的胺基酸序列 (表8-2) 接表8-1 (表8-3) 接表8-2 (表8-4) 接表8-3 (表8-5) 接表8-4 (表8-6) 接表8-5 (表9-1) 雙重變異體對人類CD3及人類CD137的結合動力學 (表9-2) 雙重變異體對人類CD3及人類CD137的結合動力學 [實施例2]

雙特異性及三特異性抗體序列及製備 2.1. 設計及製備雙- 或三-特異性Ab(1+1)型式為了評價實施例1所製備的Dual-Ig 變異體(DualAE05 etc.)的效果，雙特異性及三特異性抗體以一臂辨識腫瘤抗原DLL3 (來自抗DLL3 抗體 D30841AE13)及另一臂辨識效應細胞較佳為T細胞的方式製作。依照Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26； 110(13)：5145–5150所述的方法，使用Fab臂交換型(FAE)製作DLL3/CD3ɛ (1+1)及DLL3/DualAE05 (1+1)抗體。(1+1)型式如圖1(b)所示。(1+1) 型式的雙及三特異性抗體的每一Fc區的標靶抗原及每一結合域的命名規則顯示於表10-2及序列辨識號顯示於表12。

2.2. 包括一個單價DLL3結合臂和兩個Dual-Fab的三價Ab(1+2)型式的設計和製備實性瘤(solid tumor)中的標靶抗原的表現量可能具有高度異質性(heterogenous)，且腫瘤低抗原表現量的區域中可能無法提供足夠的CD3或CD137交聯。特別是，C137受體的群集(clustering)對於有效的對抗活性(agonistic activity)是重要的(Trends Biohem Sci. 2002 Jan；27(1)19-26)。為了改善由CD3結合及活化所媒介的細胞毒性，一種新的三價三特異性抗體型式(例如，DLL3-DUAL/LINC， 1+2)被設計以增加對CD137分子的結合域的數目。具體而言，此新的抗體型式為具有「1+2」型式的三價三特異性抗體，其包括兩個單價Dual-Fab每一個可結合至一個CD3或CD137，但不同步 (圖1(a)之FvB及FvC)，且一個單價DLL3-結合臂(圖1(a)之FvA)，其中經由在兩個Dual-Fab中的每一個CH1域的例如第191位(以Kabat編號S191C)導入一個半胱胺酸取代，而在兩個Dual-Fab之間導入/設計一個雙硫鍵(「LINC」) (圖1(a)及表10-1)。不期望受限於理論，我們設想如此設計的雙硫鍵(「LINC」)由於空間阻礙或兩個Dual-Fab的距離較短，會限制兩個的Dual-Fab的抗原 (CD3或CD137)結合方向 (binding orientation)為順式抗原結合(cis antigen-binding)(亦即，結合至相同細胞的兩個抗原)，因此，經由防止不期望的兩個表現CD3/CD137免疫細胞經由此兩個Dual-Fab以DLL3依賴性模式被交聯，而改善三特異性Ab的安全性狀況。具體而言，製備DLL3-Dual/Dual抗體變異體(DLL3-Dual/LINC，1+2)具有對於DLL3的單價腫瘤抗原結合能力，雙價CD3及雙價CD137結合特性促進兩個Dual-Fab(圖1(a)及表10-1)。也可利用CrossMab技術(WO2017055539)。Fc區為 Fc-γR 沉默(silent)且去醣基化。三特異性抗體的每一個Fv區的標靶抗原及每一個結合域的命名規則顯示於表10-1以及SEQ ID NO顯示於表11-1及12。作為負對照(negative control)，使用不結合至DLL3的Ctrl (VHR IC17HdK及VLR IC17L) 取代單價DLL3結合臂(表12)。所有抗體藉由Expi293細胞(Invitrogen)的短暫表現(transient expression)以三價形式表現，並依照實施例1.1進行純化。為了增加純度，抗體進而以通過專一地結合UnLINC型式(亦即，不具有設計的雙硫鍵的三價1+2抗體)但非LINC型式(亦即，具有設計的雙硫鍵的三價1+2抗體)的親和性管柱進行純化。

2.3. 產生雙特異性Ab (BiTE) 為了比較三價Ab (DLL3-DUAL/LINC，2+1) 與其他DLL3/CD3雙特異性型式抗體的效率，製備半衰期延長的BiTE型式的抗體，命名為DLL3CD3BiTE。DLL3CD3BiTE由兩個單鏈可變片段(ScFv)所構成，其中一者直接針對腫瘤相關抗原DLL3融合至直接針對CD3的另一者(圖1(c))。BiTE型式的雙特異性抗體的每一Fc區的標靶抗原顯示於表10-3，序列辨識號顯示於表11-2與表14。 (表10-2)雙及三特異性Ab(1+1)


抗體名稱	Fv A	Fv B
DLL3/CD3ɛ	DLL3	CD3ɛ
DLL3/DualAE05	DLL3	DualAE05

(表10-3)雙特異性Ab(BiTE)


抗體名稱	Fv A	Fv B
DLL3CD3BiTE	抗-DLL3	抗-CD3

(表11-1)抗體鏈編號及序列辨識號

變異體名稱	連接子	鏈1	鏈2	鏈3	鏈4或鏈5
DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091	249	201	206	208	214
Ctrl-DualAE05/DualAE05-FF091	249	202	207	208	214
DLL3-DualAE05/DualAE05-FF102	249	203	206	209	214
DLL3-DualAE05/DualAE05-FF110	248	204	206	209	214
DLL3-DualAE05/DualAE05-FF111	259	205	206	209	214
DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056	249	216	206	229	214
DLL3-DualAE15/DualAE15-FF119	249	217	206	210	214
Ctrl-DualAE15/DualAE15-FF119	249	218	207	210	214
DLL3-DualAE15/DualAE15-FF120	249	219	206	211	214
DLL3-DualAE15/DualAE15-FF121	248	220	206	211	214
DLL3-DualAE15/DualAE15-FF122	259	221	206	211	214
DLL3-DualAE15/DualAE15-FF123	249	222	206	230	214
DLL3-DualAE16/DualAE16-FF124	249	223	206	212	215
Ctrl-DualAE16/DualAE16-FF124	249	224	207	212	215
DLL3-DualAE16/DualAE16-FF125	249	225	206	213	215
DLL3-DualAE16/DualAE16-FF126	248	226	206	213	215
DLL3-DualAE16/DualAE16-FF127	259	227	206	213	215
DLL3-DualAE16/DualAE16-FF128	249	228	206	231	215

(表11-2) 抗體鏈編號及序列辨識號

抗體名稱	鏈1
DLL3CD3BiTE	250

(表12)可變區及其CDR 1-3序列辨識號

VR名稱	VHR名稱	VLR名稱	VHR	VHR_ CDR1	VHR_ CDR2	VHR_ CDR3	VLR	VLR_ CDR1	VLR_ CDR2	VLR_ CDR3
DLL3 (D30841AE13)	D08410053H0118	D084101L0000	232	233	234	235	236	237	238	239
DualAE05	dBBDu183H1643	dBBDu072L0581	6	20	34	48	58	63	68	73
DualAE15	dBBDu183H2594	dBBDu072L0581	14	28	42	56	58	63	68	73
DualAE16	dBBDu183H1644	dBBDu072L0939	81	82	83	84	60	65	70	75
CD3ɛ	CD3ɛVH	CD3ɛVL	251	252	253	254	255	256	257	258
Ctrl	IC17HdK	IC17L	240	241	242	243	244	245	246	247

(表13)表14中的Fc區的序列辨識號(SED ID NO)

Fc 名稱	SED ID NOs
SG1321kV11Fc	99
SG1372kV11Fc	100
SG1176kV11Fc	108
SG1321hV11Fc	109
SG1372hV11Fc	111
SG1176hV11Fc	112

[實施例3]

DLL3-Dual-LINC抗體對於表現DLL3細胞株的體內(in vitro)效率 3.1. 使用抗DLL3/Dual-Linc(1+2)抗體、Dual(1+1) 抗體、DLL3CD3BiTE與DLL3/CD3ɛ (1+1)抗體測量TDCC活性於PBMC存在的情況下，使用xCELLigence即時細胞分析儀(Roche Diagnostics)觀察腫瘤細胞成長抑制率以評估細胞毒性活性。圖2顯示依照表10-13所製備的抗DLL3/Dual-Linc 抗體 (DLL3-DualAE05/DualAE05，1+2)，Dual (1+1)抗體 (DLL3/DualAE05)，DLL3CD3BiTE與DLL3/CD3ɛ (1+1) 抗體的TDCC活性。使用SK-MEL30細胞株作為目標細胞。目標細胞從盤脫附，將細胞調整至5x10 ³細胞/孔並以100 µL/孔的等分將細胞接種於E-plate 96 (Roche Diagnostics)中，且使用xCELLigence即時細胞分析儀開始進行細胞成長的測量。24小時後，移除盤且將50µL以各濃度(從10nM為起始進行五倍系列稀釋，即0.25、1.25、2.5、5及10nM)製備的各抗體添加至盤中。於室溫反應15分鐘後，以效應細胞比目標細胞(E:T)為2的比例添加50µL新鮮人類PBMC溶液(亦即，1x10 ⁴細胞/孔)，且使用xCELLigence即時細胞分析儀繼續細胞成長的測量。在37度C及5%二氧化碳氣體的條件下進行反應。由於CD137訊號增強T細胞的存活且防止活化所引發的細胞死亡，TDCC測定是以低E:T比進行。可能會需要延長時間以觀察CD137活化所貢獻的較多細胞毒性。因此，添加PBMC之後約68小時，使用以下算式判斷細胞成長抑制(cell growth inhibition, CGI)率(%)。由xCELLigence 即時細胞分析儀所獲得且用於計算的細胞指標值為標準化數值，其中在添加抗體前的時間點的細胞指標值定義為1。細胞生長抑制率 (%) = (A-B) x 100/ (A-1) A表示無添加抗體的孔(僅含有目標細胞及人類PBMC)中細胞指標值的平均值，且B表示目標孔的細胞指標值的平均值。以三重複(triplicate)的方式進行檢視。

如圖2(a)所示，抗-DLL3/Dual-Linc抗體(DLL3-DualAE05 /DualAE05，1+2)顯示比Dual(1+1)抗體(DLL3/DualAE05)與DLL3/CD3ɛ (1+1)抗體更強的TDCC活性。此推測Dual-Linc分子型式有助於提升細胞毒性。此外，在該些抗體濃度，抗-DLL3/Dual-Linc抗體的TDCC活性能夠與DLL3/CD3BiTE相比。

3.2. 評估連接子長度對細胞毒性的影響為了增強對於腫瘤細胞的細胞毒性，腫瘤細胞與效應細胞之間的更接近及更牢固的結合是重要的。這意味著較短的距離可能有助於使T細胞和腫瘤細胞靠近，此可能有助於TDCC。因此，我們製造了三個抗-DLL3/Dual-Linc抗體變異體，其含有不同長度的連接子。DLL3-DualAE05/DualAE05-FF110 (中連接子)與DLL3-DualAE05/DualAE05-FF111 (短連接子)的連接子長度短於DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091 (長連接子) (以下將這些變異體分別簡稱為DLL3-AE05/AE05-FF110，DLL3-AE05/AE05-FF111，與DLL3-AE05/AE05-FF091)。評估連接子長度對細胞毒性的影響，如同實施例3.1般進行，使用0.2、1及 5 nM的抗體測量TDCC。

如圖2(b)所示，在0.2nM、DLL3-AE05/AE05-FF110(中連接子)與DLL3-AE05/AE05-FF111(短連接子)顯示比DLL3-AE05/AE05-FF091(長連接子)更強的TDCC活性。DLL3-AE05/AE05-FF110(中連接子)顯示最強的TDCC活性。這些結果顯示連接子長度對於TDCC活性是重要的，且中等長度的連接子最適合體外(in vitro)TDCC活性。 [實施例4]

評估DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091三特異性抗體相較於DLL3CD3BiTE的體內(in vivo)效率以人類小細胞肺癌NCI-H1436腫瘤模式檢測由實施例2製備的DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091抗體與DLL3CD3BiTE的抗腫瘤活性。將NCI-H1436細胞皮下移植至NOG人源化小鼠。NOG雌性小鼠是從In-Vivo Science購買而得。對於人源化而言，次致死性(sub lethally)照射小鼠1天後，注射100,000個人臍帶血細胞(ALLCELLS)。人源化後，將NCI-H1436細胞(5x10 ⁶個細胞)與Matrigel Basement Membrane Matrix (Corning)混合並移植至人源化NOG小鼠的右側腹。移植日定義為第0天。於第11天，根據腫瘤體積與體重將小鼠隨機分組。在之後的日子，小鼠被靜脈注射媒液(vehicle)(含有0.05% Tween的PBS)、6.5mg/kg的DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091、3.5mg/kg DLL3CD3BiTE。

為了T細胞浸潤分析，於抗體給予後，在指定時間點採取在小鼠之異種移植腫瘤。將腫瘤秤重，以人類腫瘤分離套組(Miltenyi)依照說明書的步驟將其切碎，且在分離後添加CountBright Absolute Counting Beads (ThermoFisher scientific)。使用LSRFortessa X-20 (BD)評估腫瘤內(intratumor) CD8+ T細胞數目。

為了T細胞耗竭分析，於抗體給予後，在第7天採取在小鼠之異種移植腫瘤。將腫瘤以人類腫瘤分離套組(Miltenyi)依照說明書的步驟將其切碎，評估腫瘤內T細胞的T細胞耗竭標誌Tim-3、PD-1與Lag-3的表現。

其結果，DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091相較於DLL3CD3BiTE顯示較強的效率及較高的T細胞浸潤(圖3及圖4)。進而，DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091處理組的T細胞具有較低的PD-1、Tim-3與LAG3表現量(圖5)，顯示DLL3-DualAE05/DualAE05-FF091誘導較少的T細胞耗竭。 [產業可利用性]

本發明提供可結合至CD3及CD137(4-1BB)但不同時結合至CD3及CD137，且可結合至DLL3的多特異性抗原結合分子。本發明的抗原結合分子透過與CD3/CD137及DLL3結合，以DLL3依賴性的方式展現出增強的T細胞依賴性細胞毒性活性。抗原結合分子及其醫藥組成物可用於靶向表現DLL3的細胞，且用於治療各種癌症的免疫療法中，特別是與DLL3相關的癌症，例如DLL3陽性的癌症。

無

[圖1] 圖1顯示 (a) DUAL/LINC (1+2) 型式的三價Ab，(b) 具有傳統Ab型式的雙特異性Ab，及(c) 具有BiTE型式的雙特異性(Bispecific) Ab的設計及命名規則。 [圖2] 圖2顯示抗體對於SK-MEL30細胞株的TDCC活性。(a) DUAL/LINC及CD3 雙特異性型式之間的TDCC的比較。(b) 連接子長度對於細胞毒性的影響。 [圖3] 圖3顯示抗體對於在huNOG小鼠模式的NCI-H1436異種移植 (xenograft)的體內(in vivo)效率。Y軸為腫瘤體積(mm ³)，及X軸為腫瘤植入(implantation)後的天數。 [圖4] 圖4顯示CD8 T細胞的浸潤分析結果。在注射抗體後的指定時間點採取腫瘤，並使用流式細胞儀分析T細胞浸潤。 [圖5] 圖5顯示在CD8 T細胞的耗竭標誌物(exhaustion marker)的分析結果。在注射抗體後第7天採取腫瘤，並使用流式細胞儀分析耗竭標誌物的表現量。 [圖6] 圖6是全長人類DLL3和人類DLL3 ECD片段蛋白質的結構的示意圖。顯示了每個抗DLL3抗體識別的抗原決定位。EGF域有六個區，從N端側到C端側為EGF1到EGF6。

Claims

一種醫藥組合物，包括一多特異性抗原結合分子，其包括： (a)第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，每一者皆為可結合至人類CD3之Fab分子，且包括包含下述(a1)至(a2)中之任一者之抗體可變區： (a1) SEQ ID NO: 20的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3，及 (a2)SEQ ID NO: 28的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 42的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 56的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3；及 (b)第三抗原結合部分，其可結合至人類Delta-like 3(DLL3)，包括一抗體可變區，其包括SEQ ID NO: 233的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 234的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 235的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 237的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 238的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 239的輕鏈CDR 3，及至少一個雙硫鍵形成於該第一抗原結合部分的CH1區及該第二抗原結合分子部分的CH1區之間。
如請求項1所述之醫藥組合物，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分每一者皆包括包含下述(a1)至(a2)之任一者之抗體可變區： (a1) 包括SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區；及 (a2) 包括SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項1或2所述之醫藥組合物，其中該至少一個雙硫鍵包括一雙硫鍵形成於該第一抗原結合部分及該第二抗原結合分子部分各自的CH1區的依照EU編號為第191位的胺基酸殘基。
如請求項1或2所述之醫藥組合物，其中該第三抗原結合部分為Fab分子，其中該第三抗原結合部分的Fab重鏈(CH1)C端融合至該第一抗原結合部分或該第二抗原結合部分任一者的Fab重鏈N端，經由胜肽連接子。
如請求項4所述之醫藥組合物，其中該胜肽連接子選自由SEQ ID NO: 248、SEQ ID NO: 249或SEQ ID NO: 259之胺基酸序列所組成的群組。
如請求項5所述之醫藥組合物，其中該第三抗原結合部分為互換型(crossover)Fab分子，其Fab輕鏈與Fab重鏈的可變區交換，且其中每一第一及第二抗原結合部分皆為傳統(conventional)Fab分子。
如請求項6所述之醫藥組合物，其中在每一第一及第二抗原結合部分的輕鏈恆定域CL中，第123位及第124位的胺基酸分別為精胺酸(R)及離胺酸(K) (根據Kabat編號)，且其中在每一第一及第二抗原結合部分的重鏈恆定域CH1中，第147位及第213位的胺基酸皆為麩胺酸(E) (根據EU編號)。
如請求項1所述之醫藥組合物，其中每一該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分包括抗體可變區，其包含SEQ ID NO: 20的重鏈CDR 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3。
如請求項8所述之醫藥組合物，其中每一該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分包括抗體可變區，其包括SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項1、2或9中任一項所述之醫藥組合物，其中該第三抗原結合部分包括抗體可變區，其包括：包括SEQ ID NO: 232的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 236的胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項1、2或9中任一項所述之醫藥組合物，更包括一Fc域(Fc domain)。
一種醫藥組合物，包括一多特異性抗原結合分子，其包括： (a)第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，每一者皆為可結合至人類CD137之Fab分子，且包括包含下述(a1)至(a2)中之任一者之抗體可變區： (a1) SEQ ID NO: 20的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3，及 (a2)SEQ ID NO: 28的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 42的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 56的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3；及 (b)第三抗原結合部分，其可結合至人類Delta-like 3(DLL3)，包括一抗體可變區，其包括SEQ ID NO: 233的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 234的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 235的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 237的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 238的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 239的輕鏈CDR 3，及至少一個雙硫鍵形成於該第一抗原結合部分的CH1區及該第二抗原結合分子部分的CH1區之間。
如請求項12所述之醫藥組合物，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分每一者皆包括包含下述(a1)至(a2)之任一者之抗體可變區： (a1) 包括SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區；及 (a2) 包括SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項12或13所述之醫藥組合物，其中該至少一個雙硫鍵包括一雙硫鍵形成於該第一抗原結合部分及該第二抗原結合分子部分各自的CH1區的依照EU編號為第191位的胺基酸殘基。
如請求項12或13所述之醫藥組合物，其中該第三抗原結合部分為Fab分子，其中該第三抗原結合部分的Fab重鏈(CH1)C端融合至該第一抗原結合部分或該第二抗原結合部分任一者的Fab重鏈N端，經由胜肽連接子。
如請求項15所述之醫藥組合物，其中該胜肽連接子選自由SEQ ID NO: 248、SEQ ID NO: 249或SEQ ID NO: 259之胺基酸序列所組成的群組。
如請求項16所述之醫藥組合物，其中該第三抗原結合部分為互換型(crossover)Fab分子，其Fab輕鏈與Fab重鏈的可變區交換，且其中每一第一及第二抗原結合部分皆為傳統(conventional)Fab分子。
如請求項17所述之醫藥組合物，其中在每一第一及第二抗原結合部分的輕鏈恆定域CL中，第123位及第124位的胺基酸分別為精胺酸(R)及離胺酸(K) (根據Kabat編號)，且其中在每一第一及第二抗原結合部分的重鏈恆定域CH1中，第147位及第213位的胺基酸皆為麩胺酸(E) (根據EU編號)。
如請求項12所述之醫藥組合物，其中每一該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分包括抗體可變區，其包含SEQ ID NO: 20的重鏈CDR 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3。
如請求項19所述之醫藥組合物，其中每一該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分包括抗體可變區，其包括SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項12、13或20中任一項所述之醫藥組合物，其中該第三抗原結合部分包括抗體可變區，其包括：包括SEQ ID NO: 232的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 236的胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項12、13或20中任一項所述之醫藥組合物，更包括一Fc域(Fc domain)。
一種醫藥組合物，包括一多特異性抗原結合分子，其包括： (a)第一抗原結合部分及第二抗原結合部分，每一者皆可結合至人類CD3及人類CD137，其中每一第一抗原結合部分及第二抗原結合部分皆為Fab分子，其可結合至人類CD3及人類CD137之任一者，且包括包含下述(a1)至(a2)中之任一者之抗體可變區： (a1) SEQ ID NO: 20的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3，及 (a2)SEQ ID NO: 28的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 42的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 56的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3；及 (b)第三抗原結合部分，其可結合至人類Delta-like 3(DLL3)，包括一抗體可變區，其包括SEQ ID NO: 233的重鏈互補決定區(CDR) 1，SEQ ID NO: 234的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 235的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 237的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 238的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 239的輕鏈CDR 3，及至少一個雙硫鍵形成於該第一抗原結合部分的CH1區及該第二抗原結合分子部分的CH1區之間。
如請求項23所述之醫藥組合物，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分每一者皆包括包含下述(a1)至(a2)之任一者之抗體可變區： (a1) 包括SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區；及 (a2) 包括SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項23或24所述之醫藥組合物，其中該至少一個雙硫鍵包括一雙硫鍵形成於該第一抗原結合部分及該第二抗原結合分子部分各自的CH1區的依照EU編號為第191位的胺基酸殘基。
如請求項23或24所述之醫藥組合物，其中該第三抗原結合部分為Fab分子，其中該第三抗原結合部分的Fab重鏈(CH1)C端融合至該第一抗原結合部分或該第二抗原結合部分任一者的Fab重鏈N端，經由胜肽連接子。
如請求項26所述之醫藥組合物，其中該胜肽連接子選自由SEQ ID NO: 248、SEQ ID NO: 249或SEQ ID NO: 259之胺基酸序列所組成的群組。
如請求項27所述之醫藥組合物，其中該第三抗原結合部分為互換型(crossover)Fab分子，其Fab輕鏈與Fab重鏈的可變區交換，且其中每一第一及第二抗原結合部分皆為傳統(conventional)Fab分子。
如請求項28所述之醫藥組合物，其中在每一第一及第二抗原結合部分的輕鏈恆定域CL中，第123位及第124位的胺基酸分別為精胺酸(R)及離胺酸(K) (根據Kabat編號)，且其中在每一第一及第二抗原結合部分的重鏈恆定域CH1中，第147位及第213位的胺基酸皆為麩胺酸(E) (根據EU編號)。
如請求項23所述之醫藥組合物，其中每一該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分包括抗體可變區，其包含SEQ ID NO: 20的重鏈CDR 1，SEQ ID NO: 34的重鏈CDR 2，SEQ ID NO: 48的重鏈CDR 3，SEQ ID NO: 63的輕鏈CDR 1，SEQ ID NO: 68的輕鏈CDR 2及SEQ ID NO: 73的輕鏈CDR 3。
如請求項30所述之醫藥組合物，其中每一該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分包括抗體可變區，其包括SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈可變區以及包括SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項23、24或31中任一項所述之醫藥組合物，其中該第三抗原結合部分包括抗體可變區，其包括：包括SEQ ID NO: 232的胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO: 236的胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項23、24或31中任一項所述之醫藥組合物，更包括一Fc域(Fc domain)。
一種醫藥組合物，包括一多特異性抗原結合分子，其包括選自下述(a1)至(a3)任一者之5個多肽鏈組合： (a1) 包括SEQ ID NO: 201的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 208的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈 (鏈4 & 鏈5)； (a2) 包括SEQ ID NO: 203的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)；及 (a3) 包括SEQ ID NO: 204的胺基酸序列的多肽鏈(鏈1)，包括SEQ ID NO: 206的胺基酸序列的多肽鏈(鏈2)，包括SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的多肽鏈(鏈3)及皆包括SEQ ID NO: 214的胺基酸序列的2個多肽鏈(鏈4 & 鏈5)。