JP5889533B2 - 改変された抗体定常ドメイン分子 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国仮特許出願第６１／０６３，２４５号（２００８年１月３１日出願）の恩典を主張する。
本発明は、抗体、特に、特定の位置で突然変異させられているおよび／または対象となる抗原に特異的に結合する異種抗体由来の１つ以上の可変鎖ループが移入されている抗体定常ドメインに関する。
従来の抗体は、２つの軽鎖と２つの重鎖を含む、少なくとも４つのポリペプチド鎖を含む大きな多サブユニットタンパク質複合体である。抗体の重鎖と軽鎖は、抗原に結合する可変（Ｖ）領域と、構造的支持およびエフェクター機能を提供する定常（Ｃ）領域とを含む。抗原結合領域は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）という、２つの別々のドメインを含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）という、抗体の可変ドメイン中の短いアミノ酸配列は、抗原特異性を提供する。抗体分子の重鎖と軽鎖は各々、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を提供するので、各々の抗体について、抗原に接触することができ、結果として抗原特異性をもたらす、６つのＣＤＲが存在する。
典型的な抗体（例えば、ＩｇＧ分子）は、約１５０ｋＤの分子量を有する。抗体のサイズが比較的大きい（これによって、組織浸透またはエピトープ接近が制限され得る）ために、治療的使用が限定される可能性がある。
天然に存在する抗体のいくつかのより小さい抗原結合断片がプロテアーゼ消化の後に同定されている（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２）。これらの抗体断片は、約５０〜１００ｋＤの範囲の分子量を有する。組換え法を用いて、合成ペプチドリンカーによって接続されたＶＬとＶＨからなる、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と呼ばれる、また別の抗原結合断片が作製されている。ｓｃＦｖ分子は、約２５〜３０ｋＤの分子量を有する。
ヒトおよび大部分の他の哺乳類における天然に存在する抗体の抗原結合単位は、通常、一対の可変領域から構成されることが知られているが、ラクダ科動物種は、軽鎖配列を欠いている完全に機能的で、極めて特異的な抗体の大部分を発現する。ラクダ科動物の重鎖抗体は、その定常領域を介して二量体化した、単一の重鎖のホモ二量体として存在する(特許文献１および特許文献２;ならびに米国特許出願公開第２００３−００８８０７４号)。ＶＨＨドメインと呼ばれるこれらのラクダ科動物の重鎖抗体の可変ドメインは、ＶＨ鎖の断片として単離されたときに、高い特異性で抗原に結合する能力を保持する（非特許文献１；非特許文献２)。
ドメイン抗体（ｄＡｂ）と呼ばれる抗原結合単ＶＨドメインも、免疫化マウスのゲノムＤＮＡから増幅されたマウスＶＨ遺伝子のライブラリーから同定されている（非特許文献３）。高親和性で抗原に結合することができるヒト単免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドも記載されている（例えば、特許文献３および特許文献４参照)。
しかしながら、抗原に特異的に結合することができる非常に小さい抗体が依然として必要とされている。そのような小分子ならば、増大したエピトープ接近、より良好な組織浸透を提供することができ、抗体またはそれらの断片を利用する任意の診断用途または治療用途に使用することができるであろう。
米国特許第５，８４０，５２６号明細書 米国特許第６，８３８，２５４号明細書 国際公開第２００５／０３５５７２号 国際公開第２００３／００２６０９号
Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８，１９９３ Ｇａｈｒｏｕｄｉら ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４：５２１−５２６，１９９７ Ｗａｒｄ ら Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９
本開示は、改変抗体定常ドメイン分子に関する。一実施形態では、抗体定常ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤのＣＨ２ドメインである。別の実施形態では、抗体定常ドメインは、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ３ドメインである。本明細書に記載される場合、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、小さく、安定で、可溶性で、毒性が最小から無であり、かつ効果的に抗原に結合する。したがって、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであって、このＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのループの少なくとも１つが突然変異させられているか、またはこのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのループ領域の少なくとも一部が、異種免疫グロブリン可変ドメインに由来する、相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはその機能性断片（例えば、特異性決定残基（ＳＤＲ）を含む断片）に置換されているか、またはその両方である免疫グロブリンのＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを本明細書に提供する。本明細書に記載されるＣＨ２ドメイン分子およびＣＨ３ドメイン分子は、約１５ｋＤ未満の分子量を有する。ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を含む組成物、ライブラリー、およびキット、ならびに使用方法も、本明細書に提供する。安定性の増大を示す組換え定常ドメインであって、抗原結合性のＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを構築するためのスキャフォールドとして使用することができる定常ドメインをさらに提供する。また、抗原に特異的に結合する組換えＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを同定する方法と、組換えＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含むライブラリーを作製する方法とを提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、またはＩｇＥもしくはＩｇＭの免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであって、前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが約１〜約７アミノ酸のＮ末端切断を含み、（ｉ）前記ＣＨ２ドメインもしくは前記ＣＨ３ドメインのループの少なくとも１つが突然変異させられているか、（ｉｉ）前記ＣＨ２ドメインもしくは前記ＣＨ３ドメインのループ領域の少なくとも一部が異種免疫グロブリン可変ドメイン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはその機能性断片に置換されているか、または（ｉｉｉ）その両方であり、前記ポリペプチドが約１５ｋＤ未満の分子量を有し、かつ前記ポリペプチドが抗原に特異的に結合する、ポリペプチド。
（項目２）
前記ポリペプチドがＩｇＧ由来のＣＨ２ドメインを含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループ１が突然変異させられている、項目１または項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループ２が突然変異させられている、項目１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループ３が突然変異させられている、項目１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループＡ-Ｂが突然変異させられている、項目１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループＣ-Ｄが突然変異させられている、項目１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループＥ-Ｆが突然変異させられている、項目１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目９）
ループＡ-ＢがＣＤＲに置換されている、項目１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１０）
ループＥ-ＦがＣＤＲに置換されている、項目１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記ＣＤＲがＣＤＲ３である、項目９または項目１０に記載のポリペプチド。
（項目１２）
約１２ｋＤ〜約１４ｋＤの分子量を有する、項目１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが約７アミノ酸のＮ末端切断を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが約１〜約４アミノ酸のＣ末端切断をさらに含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがグリコシル化されていない、項目１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがグリコシル化されている、項目１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがＦｃ受容体に結合することができる、項目１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが補体タンパク質に結合することができる、項目１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記補体タンパク質がＣ１ｑである、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが新生児型Ｆｃ受容体に結合することができる、項目１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記抗原が病原体由来のものである、項目１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記病原体がウイルスまたは細菌である、項目２１に記載のポリペプチド。
（項目２３）
前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、項目２に記載のポリペプチド。
（項目２４）
前記抗原が癌特異的抗原または癌関連タンパク質である、項目１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２５）
前記癌が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、悪性メラノーマ、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、または腎細胞癌である、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２６）
前記抗原が自己免疫障害または炎症性障害と関連する、項目１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２７）
項目１〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
（項目２８）
項目２７に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目２９）
項目２８に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
（項目３０）
項目１〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
（項目３１）
エフェクター分子または検出可能標識にコンジュゲートされた項目１〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
（項目３２）
対象のＨＩＶを治療する方法であって、前記対象に治療的有効量の項目２３に記載のポリペプチドを投与する工程を含む方法。
（項目３３）
対象の癌を治療する方法であって、前記対象に治療的有効量の項目２４または項目２５に記載のポリペプチドを投与する工程を含む方法。
（項目３４）
対象の自己免疫障害または炎症性障害を治療する方法であって、前記対象に治療的有効量の項目２６に記載のポリペプチドを投与する工程を含む方法。
（項目３５）
ＨＩＶ感染症の治療用、癌の治療用、または自己免疫障害もしくは炎症性障害の治療用の医薬品を調製するための項目２３〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
（項目３６）
ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、またはＩｇＥもしくはＩｇＭのＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであって、前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが第１のアミノ酸置換と第２のアミノ酸置換とを含み、前記第１のアミノ酸置換と前記第２のアミノ酸置換が各々、もとの残基をシステイン残基と置換し、前記システイン残基がジスルフィド結合を形成し、前記ポリペプチドが約１５ｋＤ未満の分子量を有する、ポリペプチド。
（項目３７）
前記第１のアミノ酸置換がＮ末端のＡ鎖中にあり、前記第２のアミノ酸置換がＣ末端のＧ鎖中にある、項目３６に記載のポリペプチド。
（項目３８）
ＩｇＧのＣＨ２ドメインを含む、項目３６または項目３７に記載のポリペプチド。
（項目３９）
前記第１のアミノ酸置換がＬ１２からＣ１２へのものであり、前記第２のアミノ酸置換がＫ１０４からＣ１０４へのものである（付番は配列番号５に対するものである）、項目３８に記載のポリペプチド。
（項目４０）
前記第１のアミノ酸置換がＶ１０からＣ１０へのものであり、前記第２のアミノ酸置換がＫ１０４からＣ１０４へのものである（付番は配列番号５に対するものである）、項目３８に記載のポリペプチド。
（項目４１）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが約１〜約７アミノ酸のＮ末端切断を含む、項目３６〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目４２）
（ｉ）前記ＣＨ２ドメインもしくは前記ＣＨ３ドメインのループの少なくとも１つが突然変異させられているか、（ｉｉ）前記ＣＨ２ドメインもしくは前記ＣＨ３ドメインのループ領域の少なくとも一部が異種免疫グロブリン可変ドメイン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）、もしくはその機能性断片に置換されているか、または（ｉｉｉ）その両方であり、かつ前記ポリペプチドが抗原に特異的に結合する、項目３６〜４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目４３）
ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、またはＩｇＥもしくはＩｇＭのＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであって、前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが約１〜約７アミノ酸のＮ末端切断を含み、前記ポリペプチドが約１５ｋＤ未満の分子量を有する、ポリペプチド。
（項目４４）
約７アミノ酸のＮ末端切断を含む、項目４３に記載のポリペプチド。
（項目４５）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが第１のアミノ酸置換と第２のアミノ酸置換とをさらに含み、前記第１のアミノ酸置換と前記第２のアミノ酸置換が各々、もとの残基をシステイン残基と置換し、前記システイン残基がジスルフィド結合を形成する、項目４３または項目４４に記載のポリペプチド。
（項目４６）
（ｉ）前記ＣＨ２ドメインもしくは前記ＣＨ３ドメインのループの少なくとも１つが突然変異させられているか、（ｉｉ）前記ＣＨ２ドメインもしくは前記ＣＨ３ドメインのループ領域の少なくとも一部が異種免疫グロブリン可変ドメイン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）、もしくはその機能性断片に置換されているか、または（ｉｉｉ）その両方であり、かつ前記ポリペプチドが抗原に特異的に結合する、項目４３〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目４７）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがグリコシル化されていない、項目３６〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目４８）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがグリコシル化されている、項目３６〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目４９）
標的抗原に特異的に結合する組換えのＣＨ２ドメインまたは組換えのＣＨ３ドメインを同定する方法であって、
（ａ）組換えのＣＨ２ドメインまたは組換えのＣＨ３ドメインをその表面上にディスプレイする粒子のライブラリーであって、前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが約１〜約８アミノ酸のＮ末端欠失を含み、前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが約１５ｋＤ未満の分子量を有し、前記ライブラリーが、
（ｉ）ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの遺伝的に多様な集団をコードする核酸分子のライブラリーであって、前記遺伝的に多様な集団が、前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインの１つ以上のループ領域に突然変異を導入することによって提供される、ライブラリーを提供することと、
（ｉｉ）前記核酸分子のライブラリーを組換え宿主細胞で発現させ、それによって、前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが前記粒子の表面上に発現し、かつ前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインの核酸分子が前記粒子の遺伝物質によってコードされること、
とによって作製される、ライブラリーを提供する工程と、
（ｂ）前記粒子のライブラリーを前記標的抗原と接触させて、前記標的抗原に特異的に結合する粒子を選択する工程と、
（ｃ）前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインの核酸分子を、前記標的抗原に特異的に結合する前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインを発現する前記粒子からクローニングし、それによって、前記標的抗原に特異的に結合するＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを同定する工程と、を含む方法。
（項目５０）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがループ１に少なくとも１つの突然変異を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがループ２に少なくとも１つの突然変異を含む、項目４９または項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがループ３に少なくとも１つの突然変異を含む、項目４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがループＡ−Ｂに少なくとも１つの突然変異を含む、項目４９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがループＣ−Ｄに少なくとも１つの突然変異を含む、項目４９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがループＥ−Ｆに少なくとも１つの突然変異を含む、項目４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記ライブラリーが組換えＣＨ２ドメインを含む、項目４９〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記ＣＨ２ドメインがＩｇＧ ＣＨ２ドメインである、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
標的抗原に特異的に結合する組換えＣＨ２ドメインを同定する方法であって、
（ａ）組換えのＩｇＧ ＣＨ２ドメインをその表面上にディスプレイする粒子のライブラリーであって、前記ＣＨ２ドメインが約１〜約８アミノ酸のＮ末端欠失を含み、前記ＣＨ２ドメインが約１５ｋＤ未満の分子量を有し、前記ライブラリーが、
（ｉ）ＣＨ２ドメインの遺伝的に多様な集団をコードする核酸分子のライブラリーであって、前記遺伝的に多様な集団が、前記ＣＨ２ドメインの１つ以上のループ領域に突然変異を導入することによって提供され、前記ループ領域が、ループ１、ループ２、およびループ３から選択される、ライブラリーを提供する工程と、
（ｉｉ）前記核酸分子のライブラリーを組換え宿主細胞で発現させ、それによって、前記ＣＨ２ドメインが前記粒子の表面上に発現し、かつ前記ＣＨ２ドメインの核酸分子が前記粒子の遺伝物質によってコードされる工程、
とによって作製される、ライブラリーを提供する工程と、
（ｂ）前記粒子のライブラリーを前記標的抗原と接触させて、前記標的抗原に特異的に結合する粒子を選択する工程と、
（ｃ）前記ＣＨ２ドメインの核酸分子を、前記標的抗原に特異的に結合する前記ＣＨ２ドメインを発現する前記粒子からクローニングし、それによって、前記標的抗原に特異的に結合するＣＨ２ドメインを同定する工程と、を含む方法。
（項目５９）
前記粒子がファージ粒子である、項目４９〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
組換えのＣＨ２ドメインまたは組換えのＣＨ３ドメインのライブラリーを作製する方法であって、（ｉ）ＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのスキャフォールドの１つ以上のループ領域に突然変異を導入する工程、または（ｉｉ）前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのスキャフォールドのループ領域の一部を異種免疫グロブリン可変ドメイン由来のＣＤＲもしくはその機能性断片と置換する工程、または（ｉｉｉ）その両方の工程であって、前記スキャフォールドがＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤの単離された免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、またはＩｇＥもしくはＩｇＭの単離された免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む工程、を含む方法。
（項目６１）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのスキャフォールドが約１〜約７アミノ酸のＮ末端切断をさらに含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのスキャフォールドが約１〜約４アミノ酸のＣ末端切断をさらに含む、項目６０または項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのスキャフォールドが第１のアミノ酸置換と第２のアミノ酸置換とをさらに含み、前記第１のアミノ酸置換と第２のアミノ酸置換が各々、もとの残基をシステイン残基と置換し、前記システイン残基がジスルフィド結合を形成する、項目６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
標的抗原に特異的に結合する組換えのＣＨ２ドメインまたは組換えのＣＨ３ドメインを同定する方法であって、項目６０〜６３のいずれか一項に記載の方法によって産生されたライブラリーを前記標的抗原と接触させ、前記標的抗原に特異的に結合する組換えのＣＨ２ドメインまたは組換えのＣＨ３ドメインを選択する工程を含む方法。


前述の特色と利点および他の特色と利点は、添付の図面を参照して進められる以下のいくつかの実施形態の詳細な説明からより明らかになる。
免疫グロブリン分子の概略図である。従来の抗体は、２つの軽（Ｌ）鎖と２つの重（Ｈ）鎖を含む、少なくとも４つのポリペプチド鎖を含む大きな多サブユニットタンパク質複合体である。抗体の重鎖と軽鎖は、抗原に結合する可変（Ｖ）領域と、構造的支持およびエフェクター機能を提供する定常（Ｃ）領域（例えば、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）とを含む。抗原結合領域は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）という、２つの別々のドメインを含む。 ヒト重鎖可変ドメインのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３（Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と表記されている）の位置を示す。３つの異なる抗原特異的ヒト抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２〜配列番号４）も示す。示された番号は、Ｋａｂａｔの付番体系に基づいている（ＷｕおよびＫａｂａｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１−２５０，１９７０）。 ヒトγ１ ＣＨ２ドメイン（配列番号５）のアミノ酸配列を示す。β-シート（...）とα-ヘリックス（***）の領域内の残基を示す。ループＢ-Ｃ（ここではループ１と表記されている）、ループＤ-Ｅ（ここではループ２と表記されている）、ループＦ-Ｇ（ここではループ３と表記されている）、ループＡ-Ｂ、ループＣ-Ｄ、およびループＥ-Ｆの位置も示す。各ループ内の残基を太字で示す。 ＣＨ２ドメイン上にＣＤＲ（または超可変ループ）を移入するための潜在的戦略を説明する概略図である。 ＣＨ２ドメイン上にＣＤＲ（または超可変ループ）を移入するための潜在的戦略を説明する概略図である。 ＣＨ２ドメイン上にＣＤＲ（または超可変ループ）を移入するための潜在的戦略を説明する概略図である。 改変ＣＨ２ドメインのタンパク質発現（矢印で示す）を示すゲルの画像を示す。 ヒトＣＨ２（ＮＣＢ受託番号Ｊ００２２８；配列番号５）とマウスＣＨ２（ＮＣＢ受託番号Ｊ００４５３；配列番号９２）のアミノ酸配列アラインメントを示す。同一残基と類似残基は、それぞれ、６７％と９２％であった。図５Ｂは、ヒトＣＨ２のサイズ排除クロマトグラフィーを示すグラフである。挿入図は、標準曲線を示す。図５Ｃは、ＣＨ２ドメイン分子（レーン当たり１〜１０μｇまたは２〜５μｇの濃度）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体断片（Ｆａｂ）、およびインタクトの抗体分子（ＩｇＧ）の分子量を示すＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルの画像である。 ヒトＣＨ２（ＮＣＢ受託番号Ｊ００２２８；配列番号５）とマウスＣＨ２（ＮＣＢ受託番号Ｊ００４５３；配列番号９２）のアミノ酸配列アラインメントを示す。同一残基と類似残基は、それぞれ、６７％と９２％であった。図５Ｂは、ヒトＣＨ２のサイズ排除クロマトグラフィーを示すグラフである。挿入図は、標準曲線を示す。図５Ｃは、ＣＨ２ドメイン分子（レーン当たり１〜１０μｇまたは２〜５μｇの濃度）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体断片（Ｆａｂ）、およびインタクトの抗体分子（ＩｇＧ）の分子量を示すＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルの画像である。 ヒトＣＨ２（ＮＣＢ受託番号Ｊ００２２８；配列番号５）とマウスＣＨ２（ＮＣＢ受託番号Ｊ００４５３；配列番号９２）のアミノ酸配列アラインメントを示す。同一残基と類似残基は、それぞれ、６７％と９２％であった。図５Ｂは、ヒトＣＨ２のサイズ排除クロマトグラフィーを示すグラフである。挿入図は、標準曲線を示す。図５Ｃは、ＣＨ２ドメイン分子（レーン当たり１〜１０μｇまたは２〜５μｇの濃度）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体断片（Ｆａｂ）、およびインタクトの抗体分子（ＩｇＧ）の分子量を示すＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルの画像である。 円二色性（ＣＤ）および示差走査熱分析法（ＤＳＣ）によって測定されるヒトＣＨ２の安定性を示すグラフである。（Ａ）ＣＤによって測定される、２５℃でのフォールディング曲線（-）、９０℃でのアンフォールディング曲線（□□□）、および２５℃でのリフォールディング曲線（---）。タンパク質のフォールディングされた割合（ｆｆ）は、ｆｆ＝（［θ］-［θＭ］）／（［θＴ］-［θＭ］）として算出された。［θＴ］と［θＭ］は、２５℃でのフォールディング状態と９０℃のアンフォールディング状態の２１６における平均残基楕円率である。ＣＤから得られる正確なＴｍ値（５４．１±１．２℃）は、温度（Ｔ）に対する一次導関数［ｄ（フォールディングした割合）／ｄＴ］から決定した。（Ｂ）ＤＳＣから得られる熱誘導性アンフォールディング曲線。Ｔｍ＝５５．４℃であり、これはＣＤから得られるＴｍと同様である。 円二色性（ＣＤ）および示差走査熱分析法（ＤＳＣ）によって測定されるヒトＣＨ２の安定性を示すグラフである。（Ａ）ＣＤによって測定される、２５℃でのフォールディング曲線（-）、９０℃でのアンフォールディング曲線（□□□）、および２５℃でのリフォールディング曲線（---）。タンパク質のフォールディングされた割合（ｆｆ）は、ｆｆ＝（［θ］-［θＭ］）／（［θＴ］-［θＭ］）として算出された。［θＴ］と［θＭ］は、２５℃でのフォールディング状態と９０℃のアンフォールディング状態の２１６における平均残基楕円率である。ＣＤから得られる正確なＴｍ値（５４．１±１．２℃）は、温度（Ｔ）に対する一次導関数［ｄ（フォールディングした割合）／ｄＴ］から決定した。（Ｂ）ＤＳＣから得られる熱誘導性アンフォールディング曲線。Ｔｍ＝５５．４℃であり、これはＣＤから得られるＴｍと同様である。 ＣＨ２構造に基づいたたｍ０１とｍ０２のデザインを示す概略図である。２つの天然Ｃｙｓ中の２つのＣα間の距離は、６．５３Åである。これら２つのＣｙｓ残基は、天然のジスルフィド結合（黒い矢印で示す）を形成した。改変されたジスルフィド結合は、システインに置換されたＶ１０とＫ１０４（ｍ０１）の間またはＬ１２とＫ１０４（ｍ０２）の間に導入された。 ｍ０１とｍ０２の高レベルの発現を示すＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルの画像である。ｍ０１とｍ０２の可溶性発現をＣＨ２の可溶性発現と比較した。発現を矢印で示す。 ＣＤ（Ａ〜Ｃ）、ＤＳＣ（Ｄ）、および蛍光分光法（Ｅ）によって測定された２つの突然変異体の増大した安定性を示すグラフである。ｍ０１（Ａ）とｍ０２（Ｂ）の２５℃でのフォールディング曲線（−）、９０℃でのアンフォールディング曲線（□□□）、および２５℃でのリフォールディング曲線（---）を示す。（Ｃ）ｍ０１とｍ０２のフォールディングされた割合については、ＣＨ２の場合と同じ方法で算出した。ｍ０１のＴｍ＝７７．４±１．７℃、ｍ０２のＴｍ＝６８．６±０．６℃であった。（Ｄ）ｍ０１とｍ０２の熱誘導性アンフォールディング曲線もＤＳＣにより記録した。ｍ０１のＴｍとｍ０２のＴｍは、ＣＨ２と比較して、それぞれ約２０℃と約１０℃増大した。（Ｅ）蛍光分光法によるＣＨ２とｍ０１とｍ０２の間の尿素誘導性アンフォールディングの比較。ＣＨ２とｍ０１とｍ０２のアンフォールディングの中点は、それぞれ、４．２Ｍと６．８Ｍと５．８Ｍである。 ＣＤ（Ａ〜Ｃ）、ＤＳＣ（Ｄ）、および蛍光分光法（Ｅ）によって測定された２つの突然変異体の増大した安定性を示すグラフである。ｍ０１（Ａ）とｍ０２（Ｂ）の２５℃でのフォールディング曲線（−）、９０℃でのアンフォールディング曲線（□□□）、および２５℃でのリフォールディング曲線（---）を示す。（Ｃ）ｍ０１とｍ０２のフォールディングされた割合については、ＣＨ２の場合と同じ方法で算出した。ｍ０１のＴｍ＝７７．４±１．７℃、ｍ０２のＴｍ＝６８．６±０．６℃であった。（Ｄ）ｍ０１とｍ０２の熱誘導性アンフォールディング曲線もＤＳＣにより記録した。ｍ０１のＴｍとｍ０２のＴｍは、ＣＨ２と比較して、それぞれ約２０℃と約１０℃増大した。（Ｅ）蛍光分光法によるＣＨ２とｍ０１とｍ０２の間の尿素誘導性アンフォールディングの比較。ＣＨ２とｍ０１とｍ０２のアンフォールディングの中点は、それぞれ、４．２Ｍと６．８Ｍと５．８Ｍである。 ＣＤ（Ａ〜Ｃ）、ＤＳＣ（Ｄ）、および蛍光分光法（Ｅ）によって測定された２つの突然変異体の増大した安定性を示すグラフである。ｍ０１（Ａ）とｍ０２（Ｂ）の２５℃でのフォールディング曲線（−）、９０℃でのアンフォールディング曲線（□□□）、および２５℃でのリフォールディング曲線（---）を示す。（Ｃ）ｍ０１とｍ０２のフォールディングされた割合については、ＣＨ２の場合と同じ方法で算出した。ｍ０１のＴｍ＝７７．４±１．７℃、ｍ０２のＴｍ＝６８．６±０．６℃であった。（Ｄ）ｍ０１とｍ０２の熱誘導性アンフォールディング曲線もＤＳＣにより記録した。ｍ０１のＴｍとｍ０２のＴｍは、ＣＨ２と比較して、それぞれ約２０℃と約１０℃増大した。（Ｅ）蛍光分光法によるＣＨ２とｍ０１とｍ０２の間の尿素誘導性アンフォールディングの比較。ＣＨ２とｍ０１とｍ０２のアンフォールディングの中点は、それぞれ、４．２Ｍと６．８Ｍと５．８Ｍである。 ＣＤ（Ａ〜Ｃ）、ＤＳＣ（Ｄ）、および蛍光分光法（Ｅ）によって測定された２つの突然変異体の増大した安定性を示すグラフである。ｍ０１（Ａ）とｍ０２（Ｂ）の２５℃でのフォールディング曲線（−）、９０℃でのアンフォールディング曲線（□□□）、および２５℃でのリフォールディング曲線（---）を示す。（Ｃ）ｍ０１とｍ０２のフォールディングされた割合については、ＣＨ２の場合と同じ方法で算出した。ｍ０１のＴｍ＝７７．４±１．７℃、ｍ０２のＴｍ＝６８．６±０．６℃であった。（Ｄ）ｍ０１とｍ０２の熱誘導性アンフォールディング曲線もＤＳＣにより記録した。ｍ０１のＴｍとｍ０２のＴｍは、ＣＨ２と比較して、それぞれ約２０℃と約１０℃増大した。（Ｅ）蛍光分光法によるＣＨ２とｍ０１とｍ０２の間の尿素誘導性アンフォールディングの比較。ＣＨ２とｍ０１とｍ０２のアンフォールディングの中点は、それぞれ、４．２Ｍと６．８Ｍと５．８Ｍである。 ＣＤ（Ａ〜Ｃ）、ＤＳＣ（Ｄ）、および蛍光分光法（Ｅ）によって測定された２つの突然変異体の増大した安定性を示すグラフである。ｍ０１（Ａ）とｍ０２（Ｂ）の２５℃でのフォールディング曲線（−）、９０℃でのアンフォールディング曲線（□□□）、および２５℃でのリフォールディング曲線（---）を示す。（Ｃ）ｍ０１とｍ０２のフォールディングされた割合については、ＣＨ２の場合と同じ方法で算出した。ｍ０１のＴｍ＝７７．４±１．７℃、ｍ０２のＴｍ＝６８．６±０．６℃であった。（Ｄ）ｍ０１とｍ０２の熱誘導性アンフォールディング曲線もＤＳＣにより記録した。ｍ０１のＴｍとｍ０２のＴｍは、ＣＨ２と比較して、それぞれ約２０℃と約１０℃増大した。（Ｅ）蛍光分光法によるＣＨ２とｍ０１とｍ０２の間の尿素誘導性アンフォールディングの比較。ＣＨ２とｍ０１とｍ０２のアンフォールディングの中点は、それぞれ、４．２Ｍと６．８Ｍと５．８Ｍである。 ｍ０１とｍ０２のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。ＣＨ２と同様、ｍ０１は単量体しか形成しなかったが、ｍ０２は主に単量体を形成し、それには及ばない程度に二量体を形成した。図１０Ｂは、Ｎ末端切断型のＣＨ２（ＣＨ２ｓ）と切断型のｍ０１（ｍ０１ｓ）の高い安定性を示すグラフである。最初の７個のＮ末端残基を欠失させた（配列番号５の残基１〜７）。ＣＤによって測定される５０％アンフォールディング温度（Ｔｍ）（それぞれ、６２℃と７９℃）は、対応するＣＨ２とｍ０１の５０％アンフォールディング温度（それぞれ、５４℃と７４℃）よりも著しく（それぞれ、８℃と５℃）高かった。 ｍ０１とｍ０２のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。ＣＨ２と同様、ｍ０１は単量体しか形成しなかったが、ｍ０２は主に単量体を形成し、それには及ばない程度に二量体を形成した。図１０Ｂは、Ｎ末端切断型のＣＨ２（ＣＨ２ｓ）と切断型のｍ０１（ｍ０１ｓ）の高い安定性を示すグラフである。最初の７個のＮ末端残基を欠失させた（配列番号５の残基１〜７）。ＣＤによって測定される５０％アンフォールディング温度（Ｔｍ）（それぞれ、６２℃と７９℃）は、対応するＣＨ２とｍ０１の５０％アンフォールディング温度（それぞれ、５４℃と７４℃）よりも著しく（それぞれ、８℃と５℃）高かった。 ＣＨ２ライブラリーの設計を示す模式図である。ＣＨ２断片の略図を示し、黒い長方形はループ（Ｌ１〜Ｌ３）を示す。網掛けのある長方形は、ループ（Ｌ）と、ループ１からループ３に対して反対の方向を向いているヘリックス（Ｈ１、Ｈ２）とを表す。Ａ〜Ｇの文字でラベルされた白い長方形は、βサンドイッチ構造を形成する７つのβ鎖を表す。番号２３１と番号３４１は、ＩｇＧ１に関してＣＨ２断片の最初の残基と最後の残基を表す。ＣＨ２のループ１（配列番号９３）とループ３（配列番号９５）の配列を下に示し、下線を付している。導入された突然変異を括弧で示している（配列番号９４と配列９６）。 ＣＨ２バインダーの特性解析を示す。（Ａ）４つのＢａｌ ｇｐ１２０−ＣＤ４特異的ＣＨ２クローンを、下記の実施例に記載の通りに発現させ、精製した。精製産物をウェスタンブロットで解析した。試料１〜試料４は、可溶性画分由来のクローンｍ１ａ１〜ｍ１ａ３’を表し、試料５〜試料８は、封入体から再生したものを表す。（Ｂ）Ｂａｌ ｇｐ１２０−ＣＤ４に対するＣＨ２クローンの結合のＥＬＩＳＡ解析。 ＣＨ２バインダーの特性解析を示す。（Ａ）４つのＢａｌ ｇｐ１２０−ＣＤ４特異的ＣＨ２クローンを、下記の実施例に記載の通りに発現させ、精製した。精製産物をウェスタンブロットで解析した。試料１〜試料４は、可溶性画分由来のクローンｍ１ａ１〜ｍ１ａ３’を表し、試料５〜試料８は、封入体から再生したものを表す。（Ｂ）Ｂａｌ ｇｐ１２０−ＣＤ４に対するＣＨ２クローンの結合のＥＬＩＳＡ解析。 ＣＨ２特異的結合の決定基を示すグラフと電気泳動ゲルの画像である。（Ａ）ループ１が結合能を決定する。２つの主要なクローンであるｍ１ａ１とｍ１ａ２、およびｍ１ａ１とｍ１ａ３由来のループ１配列は含むが、もとのＣＨ２ループ３配列は含まない２つのハイブリッドを発現させ、封入体から精製し、リフォールディングさせた（左のパネル）。その後、これらのタンパク質をＥＬＩＳＡ解析で用いた（右のパネル）。（Ｂ）ＣＨ２はループ１に極めて重要な構造的支持を与えた。主要なクローンｍ１ａ１と、追加のジスルフィド結合を有するその突然変異体とを発現させ、精製し、リフォールディングさせた（左のパネル）。その後、それらをＥＬＩＳＡ解析で用いた（右のパネル）。 ＣＨ２特異的結合の決定基を示すグラフと電気泳動ゲルの画像である。（Ａ）ループ１が結合能を決定する。２つの主要なクローンであるｍ１ａ１とｍ１ａ２、およびｍ１ａ１とｍ１ａ３由来のループ１配列は含むが、もとのＣＨ２ループ３配列は含まない２つのハイブリッドを発現させ、封入体から精製し、リフォールディングさせた（左のパネル）。その後、これらのタンパク質をＥＬＩＳＡ解析で用いた（右のパネル）。（Ｂ）ＣＨ２はループ１に極めて重要な構造的支持を与えた。主要なクローンｍ１ａ１と、追加のジスルフィド結合を有するその突然変異体とを発現させ、精製し、リフォールディングさせた（左のパネル）。その後、それらをＥＬＩＳＡ解析で用いた（右のパネル）。 ＨＩＶ Ｅｎｖでシュードタイピングしたウイルスの感染のＣＨ２バインダーによる広範な中和を示すグラフである。１００μｇ／ｍｌという一定濃度の２つのＣＨ２クローンｍ１ａ１とｍ１ａ２を用いて、９つのＨＩＶシュードウイルスのパネルに対する中和能を検討した。４μｇ／ｍｌまたは６μｇ／ｍｌという濃度のＣ３４ペプチドを陽性対照として用いた。 ｍ１ａ１に基づいた第２のＣＨ２ライブラリーの設計を示す。ＣＨ２クローンｍ１ａ１由来のループ２配列（配列番号９７）とループ３配列（配列番号９９）（下線）を括弧内に示す配列（配列番号９８と配列番号１００）に置換した。 第２のＣＨ２ライブラリーから選択されたＣＨ２クローンの特性を示す。（Ａ）第２のライブラリーから選択されたＣＨ２クローンの発現と精製。（Ｂ）ｍ１ｂ３のゲル濾過解析。（Ｃ）ＣＨ２クローンのＥＬＳＩＡ解析。（Ｄ）もとのＣＨ２配列（配列番号９７〜配列番号１００）と比較して、大部分が単量体形態であったクローンｍ１ｂ３のループ２配列とループ３配列。 第２のＣＨ２ライブラリーから選択されたＣＨ２クローンの特性を示す。（Ａ）第２のライブラリーから選択されたＣＨ２クローンの発現と精製。（Ｂ）ｍ１ｂ３のゲル濾過解析。（Ｃ）ＣＨ２クローンのＥＬＳＩＡ解析。（Ｄ）もとのＣＨ２配列（配列番号９７〜配列番号１００）と比較して、大部分が単量体形態であったクローンｍ１ｂ３のループ２配列とループ３配列。 第２のＣＨ２ライブラリー由来のクローンによるシュードウイルスの中和を示すグラフである。第２のライブラリーから単離された３つのクローンを、１００μｇ／ｍｌの濃度でＨＩＶシュードウイルスの同じパネルに対する中和能について解析した。精製されたＳｃＦｖ Ｘ５を、並行して２０μｇ／ｍｌの濃度で対照として用いた。 ＣＨ２バインダーが保存されたエピトープを認識したことを示すグラフである。大部分が単量体のＣＨ２クローンｍ１ｂ３をビオチンで標識し、競合ＥＬＩＳＡアッセイで用いた。ＥＬＩＳＡ抗原Ｂａｌ ｇｐ１２０−ＣＤ４をＥＬＩＳＡプレートの底にコーティングした。一定量のビオチン化ｍ１ｂ３（１．７μＭ）を示された量の未標識のｍ１ｂ３、ｓｃＦｖ Ｘ５、またはｍ３６−Ｆｃと混合し、各ウェルに添加した。結合したｍ１ｂ３をストレプトアビジン−ＨＲＰで検出した。
配列表
添付の配列表に記載された核酸配列とアミノ酸配列は、米国特許法第１条８２２項に定義されている、ヌクレオチド塩基についての標準的な文字の略号と、アミノ酸についての３文字暗号とを用いて示されている。各々の核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、提示された鎖を参照することにより相補鎖が含まれるものと理解される。添付の配列表は以下のとおりである。
配列番号１は、ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２〜配列番号４は、３つのヒト抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号５は、ヒトγ１ ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号６〜配列番号１０は、突然変異体ＣＨ２ドメインのライブラリーを作製するためのＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１１〜配列番号３０は、ランダム化されたループ１を有する突然変異体ＣＨ２ドメインの断片のアミノ酸配列である。
配列番号３１〜配列番号５０は、ランダム化されたループ３を有する突然変異体ＣＨ２ドメインの断片のアミノ酸配列である。
配列番号５１〜配列番号６８は、ヒト抗体由来のＣＤＲ３をＣＨ２スキャフォールドに移入するためのＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号６９〜配列番号８７は、移入されたＨ３を有する改変ＣＨ２ドメインの断片のアミノ酸配列である。
配列番号８８と配列番号８９は、ＣＨ２ドメイン突然変異体ｍ０１の断片のアミノ酸配列である。
配列番号９０と配列番号９１は、ＣＨ２ドメイン突然変異体ｍ０２の断片のアミノ酸配列である。
配列番号９２は、マウスＣＨ２のアミノ酸配列である。
配列番号９３は、ＣＨ２ループ１のアミノ酸配列である。
配列番号９４は、突然変異体ＣＨ２ループ１のコンセンサスアミノ酸配列である。
配列番号９５は、ＣＨ２ループ３のアミノ酸配列である。
配列番号９６は、突然変異体ＣＨ２ループ３のコンセンサスアミノ酸配列である。
配列番号９７は、クローンｍ１ａ１由来のＣＨ２ループ２のアミノ酸配列である。
配列番号９８は、クローンｍ１ａ１に由来する突然変異体ＣＨ２ループ２のコンセンサスアミノ酸配列である。
配列番号９９は、クローンｍ１ａ１由来のＣＨ２ループ３のアミノ酸配列である。
配列番号１００は、クローンｍ１ａ１に由来する突然変異体ＣＨ２ループ３のコンセンサスアミノ酸配列である。
配列番号１０１〜配列番号１０５は、第１のＣＨ２ライブラリーを増幅するためのＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１０６は、ｍ１ａ１合成ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１０７は、ｍ１ａ１ループ１のアミノ酸配列である。
配列番号１０８は、ｍ１ａ２ループ１のアミノ酸配列である。
Ｉ．略語
ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
ＣＤＣ：補体依存性細胞傷害
ＣＤＲ：相補性決定領域
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＨＩＶ：ヒト免疫不全ウイルス
Ｉｇ：免疫グロブリン
ＮＫ：ナチュラルキラー
ＲＮＡ：リボ核酸
ＳＤＲ：特異性決定残基
ＩＩ．用語
別途明記しない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ ０-１９-８５４２８７-９）によって刊行されているＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０-６３２-０２１８２-９）によって刊行されているＫｅｎｄｒｅｗら（編），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；およびＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ １-５６０８１-５６９-８）によって刊行されているＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅに見出すことができる。
本発明のさまざまな実施形態を概説しやすくするために、特定の用語に関する以下の説明を提供する。
投与：選択した経路で組成物を対象に導入すること。例えば、選択した経路が静脈内である場合、組成物を対象の静脈に導入することによって組成物を投与する。
動物：生きた多細胞脊椎生物、すなわち、例えば、哺乳類と鳥類を含むカテゴリー。哺乳類という用語には、ヒトとヒト以外の哺乳類の両方が含まれる。同様に、「対象」という用語には、ヒト対象と獣医学的対象の両方が含まれる。
抗体：免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質（またはタンパク質複合体）。広く認められている免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、これらは順次、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥという免疫グロブリンクラスを規定する。
基本的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、通常、四量体である。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各々の対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する。各々の鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０またはそれより多くのアミノ酸の可変領域を規定する。「可変軽鎖」（ＶＬ）および「可変重鎖」（ＶＨ）という用語は、それぞれ、このような軽鎖および重鎖を指す。各々の軽鎖が単一の定常ドメイン（ＣＬ）を含むのに対し、各々の重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３という３つの定常ドメイン（またはＩｇＥとＩｇＭについては、４つの定常ドメイン）を含む。従来の免疫グロブリン分子の概略図については、図１Ａを参照されたい。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語には、インタクトの免疫グロブリン、および分子量約２５〜１００ｋＤのよく特徴付けられたいくつかの断片が含まれる。例えば、標的タンパク質（またはタンパク質もしくは融合タンパク質内のエピトープ）に結合するＦａｂ、Ｆｖ、および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、そのタンパク質（またはエピトープ）の特異的結合剤でもある。これらの抗体断片は、以下のように定義される。（１）Ｆａｂ、インタクトの軽鎖と１つの重鎖の一部とを生じるように、全抗体を酵素パパインで消化することによって産生される抗体分子の一価抗原結合断片を含む断片。（２）Ｆａｂ’、インタクトの軽鎖と重鎖の一部とを生じるように、全抗体をペプシンで処理し、次いで還元することによって得られる抗体分子の断片。抗体１分子につき２つのＦａｂ’断片が得られる。（３）（Ｆａｂ’）２、全抗体を酵素ペプシンで処理し、その後に還元しないで得られる抗体の断片。（４）Ｆ（ａｂ’）２、２つのジスルフィド結合によって１つになった２つのＦａｂ’断片の二量体。（５）Ｆｖ、２つの鎖として発現した軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子改変断片。（６）ｓｃＦｖ、単鎖抗体、好適なポリペプチドリンカーによって遺伝子融合単鎖分子として連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子改変分子。これらの断片を作製する方法はありふれたものである（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９参照）。
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。ほんの一例として、モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７，１９７５）の古典的な方法またはその派生法に従って、マウスハイブリドーマから調製することができる。モノクローナル抗体産生の詳細な方法については、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）に記載されている。
「ヒト化」免疫グロブリン（例えば、ヒト化抗体）とは、ヒトフレームワーク領域と非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリン由来の１つ以上のＣＤＲとを含む免疫グロブリンのことである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、ＣＤＲが全て、ヒト化免疫グロブリンにおいてドナー免疫グロブリンに由来する。「ヒト化抗体」とは、ヒト化軽鎖免疫グロブリンとヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）のことである。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同一または同様の抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンのアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから取り込まれたアミノ酸による限定された数の置換を有する場合がある。ヒト化分子は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさない追加の保存的アミノ酸置換を有することができる。これらの分子は、遺伝子改変によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号参照）。
抗原：動物内での抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質。動物に注射または吸収される組成物を含む。抗原は、特異的な液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。
自己免疫疾患:免疫系が、正常な宿主の一部である抗原（すなわち、自己抗原）に対する免疫応答（例えば、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答）を産生し、結果として組織損傷を伴う疾患。自己抗原は、宿主細胞に由来する場合もあるし、または通常は粘膜表面に定着している共生生物、例えば、（共生生物として知られている）微生物に由来する場合もある。
哺乳類を侵す例示的な自己免疫疾患としては、関節リウマチ、若年性少関節炎、コラーゲン誘導性関節炎、アジュバント誘導性関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、自己免疫性胃萎縮症、尋常性天疱瘡、乾癬、白斑、１型糖尿病、非肥満糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血などが挙げられる。
結合親和性：結合部位とリガンドの間の（例えば、抗体、ＣＨ２ドメイン、またはＣＨ３ドメインと抗原またはエピトープの間の）結合の強さ。結合部位ＸのリガンドＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって表されるが、これは、溶液中に存在するＸの結合部位の半分を占めるのに必要とされるＹの濃度のことである。より低い（Ｋｄ）は、ＸとＹの間のより強いまたはより親和性の高い相互作用と、これらの部位を占めるのにより低い濃度のリガンドが必要とされることを示す。一般に、結合親和性は、パラトープ（エピトープを認識する分子の部分）によって認識されるエピトープ中の１つ以上のアミノ酸の改変、修飾、および／または置換によって影響を受け得る。結合親和性は、抗原に結合する抗体の親和性であり得る。
一例では、結合親和性は、Ａｇ−ＥＬＩＳＡアッセイで終点滴定によって測定される。修飾／置換エピトープに対する特異的抗体の終点力価が、未改変エピトープと比較して、少なくとも４倍、例えば、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、またはそれを上回って異なる場合、結合親和性は、抗体パラトープによって認識されるエピトープ中の１つ以上のアミノ酸の修飾および／または置換によって大きく低減（または測定可能な程度に低下）する。
ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子：免疫グロブリンのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインに由来するポリペプチド（またはポリペプチドをコードする核酸）。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭであり得る。本明細書に記載される一実施形態では、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、少なくとも１つのＣＤＲまたはその機能性断片を含む。ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子はさらに、追加のアミノ酸配列（例えば、完全な超可変ループ）を含むことができる。別の実施形態では、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、ＣＤＲまたはその機能性断片と置換された１つ以上のループ領域の少なくとも一部を有する。本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインは、分子のループ領域に１つ以上の突然変異を含む。ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの「ループ領域」とは、β−シート領域とβ−シート領域の間にあるタンパク質部分を指す（例えば、各々のＣＨ２ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ａ〜Ｇという７つのβ-シートを含む）。図３Ａ〜図３Ｃに示すように、ＣＨ２ドメインは、６つのループ領域：ループ１、ループ２、ループ３、ループＡ−Ｂ、ループＣ−Ｄ、およびループＥ−Ｆを含む。ループＡ−Ｂ、ループＣ−Ｄ、およびループＥ−Ｆは、それぞれ、β−シートＡとβ−シートＢの間、β−シートＣとβ−シートＤの間、およびβ−シートＥとβ−シートＦの間にある。ループ１、ループ２、およびループ３は、それぞれ、β−シートＢとβ−シートＣの間、β−シートＤとβ−シートＥの間、およびβ−シートＦとβ−シートＧの間にある。ＣＨ２ドメイン内のループのアミノ酸範囲については、表１を参照されたい。本明細書に開示されるＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子は、Ｎ末端欠失（例えば、約１〜約７アミノ酸の欠失）を含むこともできる。特定の例では、Ｎ末端欠失の長さは、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸である。本明細書に開示されるＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子は、Ｃ末端欠失（例えば、約１〜約４アミノ酸の欠失）を含むこともできる。特定の例では、Ｃ末端欠失の長さは、１、２、３、または４アミノ酸である。
ＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子のサイズは小さく、通常、１５ｋＤ未満である。ＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子のサイズは、ループ領域内に挿入されたＣＤＲ／超可変アミノ酸配列の長さと、ＣＤＲがいくつ挿入されているかということと、別の分子（例えば、エフェクター分子または標識）がＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインにコンジュゲートされているかどうかということとによって変わり得る。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、追加の定常ドメイン（すなわち、ＣＨ１またはもう１つのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメイン）あるいは可変ドメインを含まない。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ由来である。別の実施形態では、定常ドメインは、ＩｇＥまたはＩｇＭ由来のＣＨ３ドメインであり、これは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤのＣＨ２ドメインに相同である。
本明細書に提供されるＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子は、グリコシル化されることもあるし、グリコシル化されないこともある。例えば、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子をグリコシル化するために、組換えＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを適当な哺乳類細胞で発現させることができる。
相補性決定領域（ＣＤＲ）：抗原受容体（例えば、免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメインに見られる短いアミノ酸配列であって、この受容体に抗原接触部位と特定の抗原に対する特異性とを与えるアミノ酸配列。抗原受容体の各々のポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含む。抗原受容体は、通常、２つのポリペプチド鎖（重鎖と軽鎖）から構成されるため、各々の抗原受容体について、抗原に接触することができる６つのＣＤＲが存在する。抗原受容体と関連する大部分の配列変異はＣＤＲに見出されるので、これらの領域は超可変ドメインと呼ばれることもある。
ＣＤＲは、抗原受容体のループ領域内（通常、β-シート構造領域とβ-シート構造領域の間；図３Ａ〜図３Ｃ参照）に見出される。これらのループ領域は、通常、超可変ループと呼ばれる。各々の抗原受容体は、６つの超可変ループ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を含む。例えば、Ｈ１ループは、重鎖のＣＤＲ１を含み、Ｌ３ループは、軽鎖のＣＤＲ３を含む。本明細書に記載されるＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子は、抗体の可変ドメイン由来の移入アミノ酸を含む。移入アミノ酸は、ＣＤＲの少なくとも一部を含む。移入アミノ酸は、追加のアミノ酸配列（例えば、完全な超可変ループ）を含むこともできる。本明細書で使用される場合、ＣＤＲの「機能性断片」とは、特異的抗原に結合する能力を保持するＣＤＲの少なくとも一部のことである。
ＣＤＲの位置に関する付番の慣例は、Ｋａｂａｔら（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（ＮＩＨ刊行物第９１-３２４２号）に記載されている。
接触：直接物理的に会合するように置くことで、この会合は、固体と液体の両方の形態での会合を含む。
縮重変異体：本明細書で使用される場合、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子の「縮重変異体」とは、遺伝暗号の結果として縮重した配列を含むＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子をコードするポリヌクレオチドのことである。２０個の天然アミノ酸が存在し、その大半は、２つ以上のコドンによって特定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子のアミノ酸配列が変化しない限り、全ての縮重ヌクレオチドが含まれる。
ドメイン：タンパク質の残りの部分とは無関係に３次構造を保持するタンパク質構造。場合によっては、ドメインは、個別的な機能特性を有し、機能を失わせることなく、別のタンパク質に付加、移動、または転移させることができる。
エフェクター分子：分子またはキメラ分子がターゲッティングされる細胞に対する所望の効果を有することが意図される分子、またはキメラ分子の部分。エフェクター分子は、エフェクター部分（ＥＭ）、治療剤、もしくは診断剤、または同様の用語としても知られる。
治療剤としては、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸もしくは誘導体、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、糖質、または組換えウイルスのような化合物が挙げられる。核酸性の治療的部分および診断的部分としては、アンチセンス核酸、単鎖ＤＮＡまたは二重鎖ＤＮＡと共有結合的に架橋するための誘導体化オリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。あるいは、ターゲッティング部分（例えば、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子）に連結される分子は、封入系、例えば、薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）などの治療的組成物、または循環系への直接的な曝露から保護され得る別の治療的部分を含むリポソームもしくはミセルであってもよい。抗体に結合したリポソームを調製する手段は、当業者に周知である。例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；およびＣｏｎｎｏｒら，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２８：３４１−３６５，１９８５を参照されたい。診断剤または診断的部分としては、放射性同位体および他の検出可能標識が挙げられる。このような目的に有用な検出可能標識も当技術分野で周知であり、これらの標識としては、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、１２５Ｉ、および１３１Ｉ）、フルオロフォア、化学発光剤、ならびに酵素が挙げられる。
エピトープ：抗原決定基。これらは、分子上の特定の化学基または連続的もしくは非連続的なペプチド配列であって、抗原性がある、すなわち、特異的な免疫応答を誘発するペプチド配列である。抗体は、抗体とその対応（またはコグネート）エピトープの３次元構造に基づいて、特定の抗原エピトープに結合する。
発現：核酸がタンパク質に翻訳されること。タンパク質は、発現して、細胞内に残ってもよいし、細胞表面膜の構成成分になってもよいし、または細胞外マトリックスもしくは培地中に分泌されてもよい。
発現制御配列：機能的に連結される異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列が、核酸配列の転写と翻訳とを適切に制御および調節する場合、発現制御配列は、核酸配列に機能的に連結されている。したがって、発現制御配列は、適当なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前にある開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロン用のスプライシングシグナル（ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするために、その遺伝子の正確なリーディングフレームを維持するもの）、および終止コドンを含むことができる。「制御配列」という用語は、最低でも、その存在によって発現に影響を及ぼすことができる構成要素を含むことが意図されるが、その存在が好都合な追加の構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含むこともできる。発現制御配列はプロモーターを含むことができる。
プロモーターとは、核酸の転写を導く一連の核酸制御配列のことである。プロモーターは、転写の開始部位付近の必要な核酸配列（例えば、ポリメラーゼＩＩ型のプロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメント）を含む。プロモーターは、任意で、転写の開始部位から数千塩基対ほども離れて位置し得る遠位エンハンサーエレメントまたは遠位リプレッサーエレメントも含む。構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４，１９８７参照）。
プロモーター依存的遺伝子発現を、細胞型特異的、組織特異的であるように制御可能とするように、または外部からのシグナルもしくは薬剤で誘導されるように十分なプロモーターエレメントも含まれる。このようなエレメントは、遺伝子の５’領域または３’領域に位置し得る。構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４，１９８７参照）。例えば、細菌系でクローニングする場合、バクテリオファージラムダのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などのような誘導性プロモーターを使用し得る。一実施形態では、哺乳類細胞系でクローニングする場合、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルスの長い末端反復；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を使用することができる。また、核酸配列を転写するために、組換えＤＮＡ法または合成法によって産生されたプロモーターを使用し得る。
ポリヌクレオチドを、挿入した宿主の遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターに挿入することができる。発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、および形質転換細胞の表現型による選択を可能にする特異的な核酸配列を含む。
フレームワーク領域：ＣＤＲとＣＤＲ（または超可変領域と超可変領域）の間に介在するアミノ酸配列。フレームワーク領域としては、可変軽フレームワーク領域と可変重フレームワーク領域が挙げられる。各々の可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と呼ばれることが多い）を含む。フレームワーク領域は、抗原結合のためにＣＤＲを適切な向きに保つ役割を果たす。フレームワーク領域は、通常、β-シート構造を形成する。
真菌関連抗原（ＦＡＡ）：Ｔ細胞によって規定される真菌特異的な免疫応答を刺激することができる真菌抗原。例示的なＦＡＡとしては、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）由来の抗原、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来の抗原（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）由来のｄ２５、もしくはＭＰ９８マンノタンパク質もしくはＭＰ８８マンノタンパク質、またはそれらの免疫学的断片）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）（例えば、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ））由来の抗原（例えば、ＷＩ−１またはその免疫学的断片）、ならびにヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）（例えば、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ））由来の抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
異種：異種ポリペプチドまたは異種ポリヌクレオチドとは、異なる源または種に由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドのことを指す。
超可変領域：抗体可変ドメイン内の特に高い配列可変性がある領域。超可変領域は、フレームワーク領域のβ-シート間にループ構造を形成する。したがって、超可変領域は、「超可変ループ」とも呼ばれる。各々の可変ドメインは、３つの超可変領域（重鎖のＨ１、Ｈ２、およびＨ３、ならびに軽鎖のＬ１、Ｌ２、およびＬ３と呼ばれることが多い）を含む。超可変ループのループ構造を図３Ａ〜図５Ｃに図示する。
免疫応答：刺激物質（例えば、抗原）に対する免疫系の細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、多形核細胞）の応答。免疫応答は、宿主防御応答に関与する任意の体細胞、例えば、インターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含み得る。免疫応答には、先天免疫応答または炎症が含まれるが、これらに限定されない。
免疫コンジュゲート：エフェクター分子が抗体またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子に共有結合したもの。エフェクター分子は、検出可能標識または免疫毒素であり得る。特異的で、非限定的な毒素の例としては、アブリン、リシン、シュードモナス外毒素（ＰＥ、例えば、ＰＥ３５、ＰＥ３７、ＰＥ３８、およびＰＥ４０）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、もしくはそれらの修飾毒素、または直接的もしくは間接的に細胞増殖を阻害するかもしくは細胞を死滅させる他の毒物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＰＥとＤＴは、通常は肝毒性によって死をもたらす極めて毒性の高い化合物である。しかしながら、ＰＥとＤＴは、毒素の天然のターゲッティング成分（例えば、ＰＥのドメインＩａおよびＤＴのＢ鎖）を除去し、それを異なるターゲッティング部分（例えば、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子）と置換することによって、免疫毒素として使用される形態に改変することができる。一実施形態では、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子をエフェクター分子（ＥＭ）に接続する。別の実施形態では、エフェクター分子に接続したＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子を脂質に、または他の分子をタンパク質もしくはペプチドにさらに接続して、体内での半減期を増大させる。結合は、化学的手段または組換え手段のいずれか一方によるものであり得る。「化学的手段」とは、１つの分子を形成するように２つの分子間で形成される共有結合が存在するようなＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子とエフェクター分子の間の反応を指す。ペプチドリンカー（短いペプチド配列）を任意でＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子とエフェクター分子の間に含めることができる。免疫コンジュゲートは、本来は、別々の機能を有する２つの分子（例えば、抗体とエフェクター分子）から調製されたので、「キメラ分子」と呼ばれることもある。したがって、本明細書で使用される「キメラ分子」という用語は、エフェクター分子にコンジュゲート（結合）したターゲッティング部分（例えば、リガンド、抗体、またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子）を指す。
「コンジュゲートする」、「接続する」、「結合する」、または「連結する」という用語は、２つのポリペプチドを１つの連続するポリペプチド分子に作ること、または放射性ヌクレオチドもしくは他の分子をポリペプチド（例えば、ＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子）に共有結合させることを指す。特定の文脈では、これらの用語は、リガンド（例えば、抗体部分）のエフェクター分子（「ＥＭ」）への接続に対する言及を含む。
免疫原：適当な条件の下で、免疫応答（例えば、動物内での抗体の産生またはＴ細胞応答）を刺激することができる化合物、組成物、または物質。これには、動物に注射または吸収される組成物が含まれる。
単離された：「単離された」生体成分（例えば、核酸分子またはタンパク質）は、この成分が天然に存在する他の生体成分（例えば、細胞の他の生体成分）、例えば、他の染色体ＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡと、ＲＮＡと、タンパク質（他の抗体を含む）とから実質的に分離または精製分離されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。「単離された」抗体とは、その抗原特異性が維持されるように他のタンパク質または生物学的成分から実質的に分離または精製分離された抗体のことである。この用語はまた、宿主細胞での組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質（ＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子を含む）と、化学合成された核酸もしくはタンパク質、またはそれらの断片とを含む。
標識：別の分子（例えば、抗体またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子）を検出しやすくするために、その分子に直接的または間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物または組成物。特異的で、非限定的な標識の例としては、蛍光タグ、酵素的結合、および放射性同位体が挙げられる。
リガンド接触残基または特異性決定残基（ＳＤＲ）：リガンドまたは抗原との接触に関与するＣＤＲ内の残基。リガンド接触残基は、特異性決定残基（ＳＤＲ）としても知られる。非リガンド接触残基とは、リガンドと接触しないＣＤＲ内の残基のことである。非リガンド接触残基とは、フレームワーク残基のことでもあり得る。
ナノ抗体（ｎＡｂ）：抗原に特異的に結合するように改変されたＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子。抗原に結合するように改変されたＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子は、既知の抗原特異的結合抗体ドメインに基づいた分子の中で最小のものである。
新生物形成および腫瘍：新生物形成の産物が新生物（腫瘍）であるが、これは過剰な細胞分裂が原因で生じる異常な組織増殖である。新生物形成は、「癌」とも呼ばれる。転移しない腫瘍は「良性」と呼ばれる、周囲組織に侵入する、および／または転移可能である腫瘍は「悪性」と呼ばれる。
固形腫瘍（例えば、肉腫および癌腫）の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、ならびにＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、メラノーマ、神経芽細胞腫、および網膜芽腫）が挙げられる。
血液学的腫瘍の例としては、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性型および高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、ならびに骨髄形成異常が挙げられる。
核酸：ホスホジエステル結合、関連する天然の構造変異体、およびそれらの非天然の合成類似体を介して連結されたヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然の構造変異体、およびそれらの非天然の合成類似体）から構成されたポリマー。したがって、この用語は、これらのヌクレオチドおよびそれらの間の連結が非天然の合成類似体を含む、ヌクレオチドポリマーを含み、そのような類似体の例として、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、２’-Ｏ-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。このようなポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機を用いて、合成することができる。「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、短いポリヌクレオチド、通常、多くても約５０ヌクレオチド程度のものを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表される場合、これは、「Ｕ」が「Ｔ」の代わりに用いられるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むことが理解される。
ヌクレオチド配列を説明するために、本明細書では従来の表記法を用いる。すなわち、一本鎖ヌクレオチド配列の左側の末端が５’末端であり、二本鎖ヌクレオチド配列の左側の方向を５’方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写物に５’から３’へとヌクレオチドを付加する方向を転写方向と呼ぶ。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖を「コード鎖」と呼び、ＤＮＡから転写されるｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列であって、ＲＮＡ転写物の５’から５’末端に位置する配列を「上流配列」と呼び、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列であって、コードＲＮＡ転写物の３’から３’末端に位置する配列を「下流配列」と呼ぶ。
「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに相補的またはｍＲＮＡと同一な、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、ＤＮＡを指す。
「コードする」とは、規定のヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）配列かまたは規定のアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子を合成するための鋳型として働くポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性と、それに起因する生物学的特性とを指す。したがって、ある遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの転写と翻訳によって、細胞または他の生体系でタンパク質が産生される場合、その遺伝子はタンパク質をコードしている。遺伝子またはｃＤＮＡの、コード鎖（そのヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列と同一であり、通常、配列表に示される）と非コード鎖（転写用の鋳型として用いられる）は両方とも、その遺伝子もしくはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードしているということができる。別途規定のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重バージョンである全てのヌクレオチド配列と、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列とが含まれる。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列には、イントロンが含まれる場合がある。
「組換え核酸」とは、天然では１つに接続されていないヌクレオチド配列であって、１つに接続されなければ別々であった２つの配列セグメントを人為的に組み合わせることにより作製することができるヌクレオチド配列を有する核酸を指す。この人為的な組合せは、多くの場合、化学合成によるか、またはより一般的には、単離された核酸セグメントの人為的操作によって（例えば、遺伝子改変技術によって）達成される。組換え核酸には、好適な宿主細胞を形質転換するために使用することができる増幅された核酸またはアセンブルされた核酸を含む核酸ベクターが含まれる。組換え核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。その後、遺伝子を組換え宿主細胞内で発現させ、「組換えポリペプチド」を産生させる。組換え核酸は、非コード機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）を果たすこともできる。
機能的に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列に機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたＤＮＡ配列は連続的であり、２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合には、同一のリーディングフレーム中にある。
病原体：その宿主に疾患または病気を引き起こす生物学的因子。病原体としては、例えば、細菌、ウイルス、真菌、原虫、および寄生虫が挙げられる。病原体は、感染性因子とも呼ばれる。
病原性ウイルスの例としては、以下のウイルスファミリー：レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ））；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス；口蹄疫ウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス；黄熱病ウイルス；ウエストナイルウイルス；セントルイス脳炎ウイルス；日本脳炎ウイルス；および他の脳炎ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンターンウイルス；シンノンブレウイルス、リフトバレー熱ウイルス；ブニヤウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス；マチュポウイルス；フニンウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス；ＢＫ-ウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）-１およびＨＳＶ-２；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）；およびＨＳＶ-６を含む他のヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；ならびにイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚熱ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス；マールブルグウイルス）；カリシウイルス（例えば、ノーウォークウイルス）；ならびに未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損付随体と考えられている）；およびアストロウイルス）に属するウイルスが挙げられる。
真菌性病原体の例としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティディス、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、およびカンジダ・アルビカンスが挙げられるが、これらに限定されない。
細菌性病原体の例としては、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）、ライム病ボレリア菌（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリウム種（例えば、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリダンス（ｖｉｒｉｄａｎｓ）群）、大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、クロストリジウム・ペルフリンゲルス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネマ・パリジウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネマ・パルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、およびアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
他の病原体（例えば、原生生物）の例としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびトキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられる。
薬学的に許容されるビヒクル：本開示で有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は従来のものである。Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，第１５版（１９７５）には、１つ以上の治療的化合物または治療的分子（例えば、１つ以上の抗体）と追加の薬剤の薬学的送達に好適な組成物と製剤が記載されている。
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与様式によって決まる。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理学的に許容される液体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）をビヒクルとして含む注射液を含む。固体組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセル形態）については、従来の無毒性固体担体として、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性の担体に加えて、少量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝化剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含むことができる。
ポリペプチド：単量体が、アミド結合を介して１つに接続されたアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がアルファ-アミノ酸である場合、Ｌ-光学異性体またはＤ-光学異性体のいずれかが使用され得る。本明細書で使用される「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、任意のアミノ酸配列を包含し、かつ糖タンパク質などの修飾配列を含むことが意図される。「ポリペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質、および組換えまたは合成によって産生されたタンパク質を含むことが特に意図される。
「残基」または「アミノ酸残基」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに組み込まれたアミノ酸に対する言及を含む。
「保存的」アミノ酸置換とは、ポリペプチドの活性もしくは抗原性に実質的に影響を及ぼさないかまたはポリペプチドの活性もしくは抗原性を実質的に減少させない置換のことである。例えば、ポリペプチドは、高々約１個、高々約２個、高々約５個、高々約１０個、または高々約１５個の保存的置換を含み、もとのポリペプチドに結合する抗体に特異的に結合することができる。置換ポリペプチドに対して作製した抗体が未置換のポリペプチドとも免疫反応するならば、保存的変異という用語は、未置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することを含む。保存的置換の例を以下に示す。
保存的置換は、通常、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シート構造もしくはヘリックス構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、および／または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持する。
一般にタンパク質の特性を最も変化させると考えられる置換は非保存的なものであり、例えば、（ａ）親水性残基（例えば、セリルもしくはトレオニル）を疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニル）の代わりに用いる（もしくはこれらによって代えられる）変化、（ｂ）システインもしくはプロリンを任意の他の残基の代わりに用いる（もしくはこれらによって代えられる）変化、（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基（例えば、リジル、アルギニル、もしくはヒスチジル（ｈｉｓｔａｄｙｌ））を電気陰性残基（例えば、グルタミルもしくはアスパルチル）の代わりに用いる（もしくはこれらによって代えられる）変化、または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）を側鎖のない残基（例えば、グリシン）の代わりに用いる（もしくはこれによって代えられる）変化である。
疾患の予防、治療、または改善：疾患の「予防」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「治療」とは、疾患または病理学的状態が発症し始めた後に、これらの徴候または症状を改善する治療的介入を指す。「改善」とは、疾患の徴候または症状の数または重症度が低下することを指す。
プローブおよびプライマー：プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子に結合した単離された核酸を含む。プライマーは短い核酸であり、長さ１５ヌクレオチド以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドであることができる。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成し、その後、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長し得る。プライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当技術分野で公知の他の核酸増幅法による、核酸配列の増幅に用いることができる。当業者は、特定のプローブまたはプライマーの特異性がその長さとともに増大することを理解するであろう。したがって、例えば、２０個の連続するヌクレオチドを含むプライマーは、わずか１５ヌクレオチドの対応するプライマーよりも高い特異性で標的にアニールする。したがって、より大きい特異性を得るために、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、またはそれより多くの連続するヌクレオチドを含むプロープおよびプライマーを選択し得る。
精製された：精製されたという用語は、完全な純度を要求するものではなく、どちらかと言えば、相対的な用語として意図されるものである。したがって、例えば、精製されたＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子とは、天然に会合するタンパク質および他の混入物質から全体的にまたは部分的に単離された分子であって、この分子が、天然に存在する状態と比べて、例えば、細胞抽出物または生体液中での純度と比べて、測定可能な程度まで精製される分子のことである。
「精製された」という用語は、類似体または模倣体または他の生物活性化合物のような所望の産物であって、他の化合物を結合させるためにおよび／または治療的処置もしくは診断手順で有用な製剤を提供するために、追加の化合物または部分がＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子に結合している産物を含む。
通常、実質的に精製されたＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子には、治療的に投与される完全な薬学的製剤中でそれぞれの化合物を追加の成分とともに混合または処方する前に調製物中に存在する全ての高分子種の８０％よりも多くが含まれる。追加の成分としては、薬学的担体、賦形剤、緩衝剤、吸収促進剤、安定化剤、防腐剤、補助物質、または他の同様の共成分を挙げることができる。より典型的には、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を、他の製剤成分と混合する前に精製調製物中に存在する全ての高分子種の９０％超、多くの場合、９５％超を示すよう精製する。他の例では、精製調製物が本質的に均質であってもよく、その場合、他の高分子種は１％未満である。
組換え：組換え核酸または組換えポリペプチドとは、天然に存在しない配列を有するかまたは組み合わせなければ別々であった２つの配列セグメントを人為的に組み合わせることによって作製された配列を有する核酸またはポリペプチドのことである。この人為的な組合せは、多くの場合、化学合成によるか、またはより一般的には、単離された核酸セグメントの人為的操作によって（例えば、遺伝子改変技術によって）達成される。
試料：全体を代表する部分、断片、またはセグメント。この用語は、例えば、対象から得られた試料を含む、任意の材料を包含する。
「生体試料」とは、細胞、組織、および体液を含むが、これらに限定されない、対象から得られる試料のことである。体液としては、例えば、唾液、痰、脊髄液、尿、血液、および血液の派生物と画分（血清とリンパ球（例えば、Ｂ細胞と、Ｔ細胞と、それらの亜画分）とを含む）が挙げられる。組織としては、生検、剖検、および病理標本に由来する組織、ならびに例えば、固定されていない、凍結された、ホルマリン固定された、および／またはパラフィン包埋された組織を含む、生検組織または手術で摘出された組織が挙げられる。
特定の実施形態では、生体試料（例えば、血液または血清）は、対象から得られる。生体試料は、通常、哺乳類、例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、ウサギ、または霊長類から得られる。一実施形態では、霊長類は、マカク、チンパンジー、またはヒトである。
スキャフォールド：本明細書で使用される場合、ＣＨ２ドメインスキャフォールドまたはＣＨ３ドメインスキャフォールドとは、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインへの抗原結合性を付与するために、突然変異を（例えば、ループ領域に；図２および図３Ａ〜図３Ｃ参照）導入するためのプラットフォームとして使用し得る組換えのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのことである。いくつかの実施形態では、スキャフォールドを、天然のＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインと比較して増大した安定性を示すように改変する。特定の例では、スキャフォールドを、１つ以上の非天然のジスルフィド結合の形成が可能になるようにシステイン残基の対を導入するように突然変異させる。いくつかの例では、スキャフォールドは、Ｎ末端欠失（例えば、約１〜約７アミノ酸の欠失）を有するＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインである。
配列同一性：ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の類似性は、配列間の類似性（配列同一性とも呼ばれる）に関して表現される。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性または相同性）に関して測定されることが多く、このパーセンテージが高ければ高いほど、２つの配列はより類似している。標準的な方法を用いて整列させた場合、相同体または変異体は、比較的高度の配列同一性を有する。
比較のために配列を整列させる方法は、当技術分野で周知である。さまざまなプログラムとアラインメントアルゴリズムが、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７-２４４，１９８８；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１-１５３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１-１０８９０，１９８８；ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８．Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：１１９-１２９，１９９４に記載されている。
ＮＣＢＩ基本局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ（商標））（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３-４１０，１９９０．）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘという配列解析プログラムとともに使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびインターネットを含む、いくつかの源から入手可能である。
特異的結合剤：実質的に規定の標的のみに結合する薬剤。したがって、抗原特異的結合剤とは、実質的に抗原性ポリペプチドまたはその抗原性断片に結合する薬剤のことである。一実施形態では、特異的結合剤は、抗原性ポリペプチドまたはその抗原性断片に特異的に結合する、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子である。
「特異的に結合する」という用語は、抗原に関して、抗体または他のリガンドが、全体的にまたは部分的に、その抗原を有する細胞または組織と優先的に会合し、検出可能な量のその抗原を欠く細胞または組織とは優先的に会合しないことを指す。当然、ある程度の非特異的相互作用が分子と標的でない細胞または組織との間で生じ得ることが理解されよう。それでも、特異的結合は、特異的な抗原認識を通じて仲介されるものとして区別し得る。特異的結合によって、結合抗体（またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子）とその抗原を欠く細胞との間よりも遥かに強い会合が、抗体（またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子）とその抗原を有する細胞との間に生じる。特異的結合によって、通常、抗原性ポリペプチドを有する細胞または組織に対する結合抗体またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子（単位時間当たり）の量が、それぞれ抗原性ポリペプチドを欠く細胞または組織と比較して２倍よりも多く、例えば、５倍よりも多く、１０倍よりも多く、または１００倍よりも多く増大する。このような条件下でのタンパク質に対する特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性について選択された抗体またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子が必要とされる。種々の免疫アッセイフォーマットは、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子を選択するのに適している。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが日常的に使用される。
対象：脊椎動物を含む、生きた多細胞生物、すなわち、ヒトとヒト以外の哺乳類の両方を含むカテゴリー。
治療的有効量：特定の作用物質を用いて治療されている対象で所望の効果を達成するのに十分なその作用物質の量。このような作用物質には、本明細書に記載されるＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子が含まれる。例えば、これは、ＨＩＶ感染を予防、治療、または改善する際に有用なＨＩＶ特異的ＣＨ２ドメイン分子の量であり得る。理想的には、抗体の治療的有効量は、対象における実質的な細胞毒性効果を引き起こさずに、対象におけるＨＩＶ感染によって生じるような、感染または疾患を予防、治療、または改善するのに十分な量である。対象を予防、改善、および／または治療するのに有用な作用物質の治療的有効量は、治療されている対象、苦痛の種類および重症度、ならびに治療的組成物の投与様式によって決まる。
毒素：細胞に対して細胞毒性のある分子。毒素としては、アブリン、リシン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、サポリン、レストリクトシン、もしくはゲロニン、またはそれらの修飾毒素が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＰＥとＤＴは、通常は肝毒性によって死をもたらす極めて毒性の高い化合物である。しかしながら、ＰＥとＤＴは、毒素の天然のターゲッティング成分（例えば、ＰＥのドメインＩａおよびＤＴのＢ鎖）を除去し、それを異なるターゲッティング部分（例えば、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子）と置換することによって、免疫毒素として使用される形態に改変することができる。
形質導入された：形質導入された細胞とは、分子生物学の技術によって核酸分子が導入された細胞のことである。本明細書で使用される場合、「形質導入」という用語は、核酸分子をこのような細胞に導入し得る全ての技術を包含し、これには、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、およびパーティクルガン加速による裸のＤＮＡの導入が含まれる。
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）：Ｔ細胞によって規定される腫瘍特異的な免疫応答を刺激することができる腫瘍抗原。例示的なＴＡＡとしては、ＲＡＧＥ-１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ-１、ＭＡＧＥ-２、ＮＹ-ＥＳＯ-１、Ｍｅｌａｎ-Ａ／ＭＡＲＴ-１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００、β-カテニン、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ-１、ＷＴ-１、ＣＥＡ、およびＰＲ-１が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるＴＡＡが当技術分野で公知であり（例えば、Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４（３）：１８７-２０７，２００５参照）、これには未同定のＴＡＡも含まれる。
ベクター：宿主細胞に導入されることによって、形質転換された宿主細胞を産生する核酸分子。ベクターは、それが宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝子エレメントも含み得る。
ウイルス関連抗原（ＶＡＡ）：Ｔ細胞によって規定されるウイルス特異的な免疫応答を刺激することができるウイルス抗原。例示的なＶＡＡとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス６（ＨＳＶ-６）、パラインフルエンザ３型、またはＢ型インフルエンザに由来する抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
別途説明しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の専門家によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。文脈により別途明示しない限り、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数形の指示対象を含む。同様に、文脈により別途明示しない限り、「または（ｏｒ）」という語は、「および（ａｎｄ）」を含むことが意図される。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ｏｒ Ｂ）」は、「Ａを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ａ）」、「Ｂを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｂ）」、または「ＡとＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ａ ａｎｄ Ｂ）」を意味する。核酸またはポリペプチドに与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズと全ての分子量値または分子質量値は、おおよそのものであり、説明のために提供されるということがさらに理解されるべきである。本明細書に記載される方法および材料と同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試行で使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合には、用語の説明を含む、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、実例であるに過ぎず、限定的であることが意図されない。
ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概説
従来の抗体は、２つの軽鎖と２つの重鎖を含む、少なくとも４つのポリペプチド鎖を含む巨大な多サブユニットタンパク質複合体である（従来の免疫グロブリン分子の概略図については図１Ａを参照）。抗体の重鎖と軽鎖は、抗原に結合する可変領域と、構造的支持およびエフェクター機能を提供する定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含む。抗原結合領域は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）という、２つの別々のドメインを含む。典型的な抗体（例えば、ＩｇＧ分子）は、約１５０ｋＤの分子量を有する。天然に存在する抗体のいくつかのより小さい抗原結合断片がプロテアーゼ消化の後に同定されている（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２）。これらの抗体断片は、約５０〜１００ｋＤの範囲の分子量を有する。組換え法を用いて、合成ペプチドリンカーによって接続されたＶＬとＶＨからなる、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と呼ばれる、また別の抗原結合断片が作製されている。ｓｃＦｖ分子は、約２５〜３０ｋＤの分子量を有する。
しかしながら、場合によっては、抗体のサイズが原因で、抗体または抗体断片の治療的使用が限定される可能性がある。例えば、抗体または抗体断片が大き過ぎる場合、組織浸透とエピトープ接近が制限され得る。さらに、多くの治療抗体は、ヒト以外の起源のものであり、これは、ヒト対象で毒性を生じさせる可能性がある。これらの限界を考慮すると、抗原に特異的に結合することができる小さいヒト抗体が、抗体またはその断片を利用する診断用途または治療用途に望ましい。
改変抗体定常ドメイン分子を本明細書に記載する。分子に抗原結合性を付与する突然変異を導入するためのスキャフォールドとしての役割を果たす組換えのＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子を本明細書に開示する。抗原に特異的に結合する修飾ＣＨ２ドメイン分子と修飾ＣＨ３ドメイン分子も提供する。いくつかの実施形態では、抗体定常ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤに由来するＣＨ２ドメインである。他の実施形態では、抗体定常ドメインは、ＩｇＥまたはＩｇＭに由来するＣＨ３ドメインである。開示されるＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子は、小さく、安定で、可溶性で、毒性が最小から無であり、かつ場合によって、抗原に結合することができる。本明細書に記載されるＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子は、２つ以上の定常ドメインを含まず、また、免疫グロブリン可変ドメインを含まない。
免疫グロブリンのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであって、このＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインが、異種免疫グロブリン可変ドメインに由来する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはその機能性断片（例えば、ＳＤＲ）を含むポリペプチドを本明細書に提供する。ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの１つ以上のループ内に、少なくとも１つの突然変異（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くの突然変異）を含むＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子も提供する。本明細書に記載されるＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分は、約１５ｋＤ未満の分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、約１２〜約１４ｋＤの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインは、約１〜約７アミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸）のＮ末端切断を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、約１〜約４アミノ酸（例えば、１、２、３、または４アミノ酸）のＣ末端切断を含む。
ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインへの特定の突然変異の導入および／または異種ＣＤＲの移入によって、ポリペプチドを抗原に結合させることができる。いくつかの実施形態では、異種免疫グロブリン由来の移入される部分は、ＣＤＲ、またはその機能性断片のみを含む。他の実施形態では、移入される部分は、追加の配列、例えば、超可変ループの全部または一部を含む。移入される部分の長さはさまざまであり得るが、通常、５〜２１アミノ酸（５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１アミノ酸を含む）である。一実施形態では、移入される部分は、８〜１５アミノ酸である。移入される部分の長さはさまざまであるが、得られるＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、約１０-６、約１０-７、または約１０-８ＭのＫｄで抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、２つ以上のＣＤＲ、またはその機能性断片（例えば、２つまたは３つのＣＤＲ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのループ領域の少なくとも一部を、ＣＤＲまたはその機能性断片に置換する。ループ領域から除去されるアミノ酸の数はさまざまであり得る。いくつかの実施形態では、ループ領域から除去されるアミノ酸の数は、１〜１０アミノ酸（１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸を含む）である。他の実施形態では、ループ領域からアミノ酸を除去することなく、ＣＤＲを移入する。ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの１つまたは複数のループから除去されるアミノ酸の数はさまざまであり得る。当業者は、例えば、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を、安定性、溶解性、および対象となる抗原に結合する能力について試験することによって、除去するのに適当な配列を実験的に決定することができる。
移入される特定のＣＤＲは、任意の免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインまたはＶＬドメイン）由来の任意のＣＤＲであり得る。一実施形態では、ＣＤＲはＣＤＲ１である。別の実施形態では、ＣＤＲはＣＤＲ２である。別の実施形態では、ＣＤＲはＣＤＲ３である。他の実施形態では、２つまたは３つまたはそれより多くのＣＤＲを、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子のループ内に移入する。
ＣＤＲに置換されるＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのループ（またはループ配列が除去されることなく、ＣＤＲが移入されるＣＨ２ドメイン）は、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの任意のループであり得る。一実施形態では、ループ領域は、ループ１、ループ２、ループ３、ループＡ-Ｂ、ループＣ-Ｄ、またはループＥ-Ｆから選択される。ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの任意のループを、任意のＣＤＲに置換することができる。さらに、複数のループを、任意の組合せで、ＣＤＲに置換することができる。一実施形態では、ループ１をＣＤＲ１またはＣＤＲ３に置換する。別の実施形態では、ループ３をＣＤＲ１またはＣＤＲ３に置換する。別の実施形態では、ループ１とループ３を、それぞれ、ＣＤＲ１とＣＤＲ３に置換する。別の実施形態では、ループ１とループ３を、それぞれ、ＣＤＲ３とＣＤＲ１に置換する。他の実施形態では、ループＡ-ＢをＣＤＲ１に置換するか、ループＣ-ＤをＣＤＲ２に置換するか、またはループＥ-ＦをＣＤＲ３に置換する。
好ましい実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインまたはＶＬドメイン）を含まない。
抗体定常ドメインは、任意のタイプの免疫グロブリンに由来し得る。一実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧである。他の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥである。特定の例では、定常ドメインは、ＩｇＧ由来のＣＨ２ドメインである。
いくつかの実施形態では、抗原に結合するＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインは、分子の安定性を増大させる追加の突然変異を有する。例えば、分子は、例えば、もとの残基をシステイン残基と置換するために１対のアミノ酸置換を導入することによって、非天然のジスルフィド結合の形成を可能にする突然変異を含むことができる。いくつかの例では、第１のアミノ酸置換をＮ末端のＡ鎖に導入し、第２のアミノ酸置換を定常ドメインのＣ末端のＧ鎖に導入する。さらに、抗原結合性のＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子は、グリコシル化されているか、またはグリコシル化されていないかのどちらかであり得る。
ＩｇＧ、Ｉｇ、もしくはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、またはＩｇＥおよびＩｇＭのＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであって、このＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインが第１のアミノ酸置換と第２のアミノ酸置換を含み、この第１のアミノ酸置換と第２のアミノ酸置換が各々、もとの残基をシステイン残基と置換し、このシステイン残基がジスルフィド結合を形成し、かつポリペプチドが約１５ｋＤ未満の分子量を有する、ポリペプチドも本明細書で提供する。このようなＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、未修飾のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインと比べて、増大した安定性を示し、したがって、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインに抗原結合性を付与する突然変異を導入するためのスキャフォールドとして有用である。
いくつかの実施形態では、第１のアミノ酸置換がＮ末端のＡ鎖にあって、かつ第２のアミノ酸置換がＣ末端のＧ鎖にあるが、これによって、Ａ鎖とＧ鎖の間のジスルフィド結合の形成が可能になる（ループ領域の模式図については図３Ａ〜図３Ｃ参照）。いくつかの例では、定常ドメインは、ＩｇＧのＣＨ２ドメインである。
本明細書に記載される特定の例では、第１のアミノ酸置換は、Ｌ１２からＣ１２へのものであり、第２のアミノ酸置換は、Ｋ１０４からＣ１０４へのものである（付番は配列番号５を参照して行った）。他の例では、第１のアミノ酸置換は、Ｖ１０からＣ１０へのものであり、第２のアミノ酸置換は、Ｋ１０４からＣ１０４へのものである（付番は配列番号５を参照して行った）。
ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインのスキャフォールドは、例えば、安定性を増大させるかまたは溶解性および発現を増強するための追加の突然変異を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインは、約１〜約７アミノ酸のＮ末端切断を含む。特定の例では、Ｎ末端切断の長さは、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのスキャフォールドは、約１〜約４アミノ酸のＣ末端切断を含む。特定の例では、Ｃ末端切断は、１、２、３、または４アミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのスキャフォールドを、抗原結合性を付与するためにさらに突然変異させる。特定の実施形態では、（ｉ）ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのループの少なくとも１つを突然変異させるか、（ｉｉ）ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのループ領域の少なくとも一部を異種免疫グロブリン可変ドメイン由来のＣＤＲもしくはその断片に置換するか、あるいは（ｉｉｉ）その両方である。
さらに、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインは、グリコシル化されていないか、またはグリコシル化されているかのどちらかであり得る。例えば、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を可能にするために、組換えＣＨ２ドメインまたは組換えＣＨ３ドメインを哺乳類細胞で発現させることができる。
いくつかの実施形態では、抗原は、病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）由来である。一実施形態では、病原体はＨＩＶである。他の実施形態では、抗原は、癌特異的抗原または癌関連タンパク質である。他の実施形態では、抗原は、自己免疫疾患に関連する（例えば、ＴＮＦ−α）。
いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、腫瘍抗原に結合する。腫瘍抗原は、当技術分野で周知の任意の腫瘍関連抗原であり得る。
本明細書に記載されるＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を含む組成物も本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインと薬学的に許容される担体とを含む。
開示されるＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子をコードする核酸分子、この核酸配列を含むベクター、およびこのベクターを含む細胞も本明細書に提供する。
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、Ｆｃ受容体結合部位を含み、少なくとも１つのＦｃ受容体に結合することができる。特定の例では、Ｆｃ受容体は、新生児型Ｆｃ受容体である。Ｆｃ受容体に結合する能力は、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子に、例えば、ＡＤＣＣのような、エフェクター機能を付与する。他の実施形態では、改変ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインは、補体系を活性化することができる補体関連分子（例えば、Ｃ１ｑ）に結合する。さらに他の実施形態では、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を、治療的部分、診断的部分、または検出部分を含むが、これらに限定されない、エフェクター分子にコンジュゲートする。
医薬品を調製するためにＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を使用する方法をさらに提供する。一実施形態では、医薬品は、ＨＩＶ感染を治療するためのものである。別の実施形態では、医薬品は、癌を治療するためのものである。別の実施形態では、医薬品は、自己免疫障害または炎症性障害を治療するためのものである。
本明細書に記載されるＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子を、任意の所望の抗原に特異的に結合するように改変することができる。抗原特異的なＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を同定および選択する方法は、当技術分野で公知の任意の好適な技術を用いて（例えば、ファージディスプレイライブラリーを用いて）達成することができる。
標的抗原に特異的に結合する組換えのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを同定する方法を本明細書に提供する。この方法は、（ａ）組換えのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを粒子の表面にディスプレイする粒子のライブラリーであって、このＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインが約１５ｋＤ未満の分子量を有するライブラリーを提供する工程と、（ｂ）この粒子のライブラリーを標的抗原と接触させて、この標的抗原に特異的に結合する粒子を選択する工程と、（ｃ）この標的抗原に特異的に結合するＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを発現する粒子からＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの核酸分子をクローニングし、それによって、この標的抗原に特異的に結合するＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを同定する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、（ｉ）ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの遺伝的に多様な集団をコードする核酸分子のライブラリーであって、この遺伝的に多様な集団がＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの１つもしくは複数のループ領域に突然変異を導入することによって提供されるライブラリーを提供し、かつ（ｉｉ）この核酸分子のライブラリーを組換え宿主細胞内で発現させることによって作製され、それによって、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインは粒子の表面に発現され、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの核酸分子は、これらの粒子の遺伝物質によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインは、約１〜約７アミノ酸のＮ末端欠失を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、ファージ粒子である。
いくつかの実施形態では、ファージライブラリーは、組換えＣＨ２ドメイン（例えば、ＩｇＧ ＣＨ２ドメイン）を発現する。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインは、ループ１内の少なくとも１つの突然変異、またはループ２内の少なくとも１つの突然変異、またはループ３内の少なくとも１つの突然変異、またはループＡ−Ｂ内の少なくとも１つの突然変異、またはループＣ−Ｄ内の少なくとも１つの突然変異、またはループＥ−Ｆ内の少なくとも１つの突然変異、またはそれらの任意の組合せを含む。
任意の好適な組換え宿主細胞を用いて、ファージ粒子を作製することができる。このような宿主細胞は当技術分野で周知である。いくつかの例では、組換え宿主細胞は、ＴＧ１細胞である。
組換えのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのライブラリーを作製する方法であって、（ｉ）ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのスキャフォールドの１つ以上のループ領域に突然変異を導入する工程、または（ｉｉ）ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのスキャフォールドのループ領域の一部を異種免疫グロブリン可変ドメイン由来のＣＤＲもしくはその断片と置換する工程、または（ｉｉｉ）その両方の工程を含み、このスキャフォールドが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤの単離された免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、またはＩｇＥもしくはＩｇＭのＣＨ３ドメインを含む方法を本明細書でさらに提供する。
いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのスキャフォールドは、約１〜約７アミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸）のＮ末端切断をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのスキャフォールドは、約１〜約４アミノ酸（例えば、約１、２、３、または４アミノ酸）のＣ末端切断をさらに含む。
いくつかの例では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのスキャフォールドは、分子を安定化させるために追加の突然変異をさらに含む。本方法のいくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのスキャフォールドは、第１のアミノ酸置換と第２のアミノ酸置換をさらに含み、この第１のアミノ酸置換と第２のアミノ酸置換は各々、もとの残基をシステイン残基と置換し、このシステイン残基はジスルフィド結合を形成する。
標的抗原に特異的に結合する組換えのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを同定する方法であって、本明細書に開示される方法によって産生されるライブラリーをこの標的抗原と接触させて、この標的抗原に特異的に結合する組換えのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを選択する工程を含む方法をさらに提供する。
ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子のライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）も提供する。これらのライブラリーは、１つ以上の突然変異、移入されたＣＤＲ、超可変ループ、またはそれらの機能性断片を有するＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を含む。所望の抗原結合親和性を有するＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を同定するために、および／または低下した免疫原性を有するＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を同定するために、突然変異した残基を含むライブラリーを用いることができる。
本明細書に開示されるＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を含むキットをさらに提供する。一実施形態では、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を（例えば、蛍光標識、放射性標識、または酵素標識で）標識する。別の実施形態では、キットは、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子の使用方法を開示する教材を含む。教材は、書面によるもの、電子形態（例えば、コンピュータディスケットもしくはコンパクトディスク）によるものであってもよく、または目で見るもの（例えば、ビデオファイル）であってもよい。これらのキットは、キットが考案された特定の適用を容易にする追加の構成要素を含むこともできる。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識に対する酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、２次抗体などの適当な２次標識、など）をさらに含むことができる。これらのキットは、特定の方法を実施するために日常的に使用される緩衝剤または他の試薬をさらに含むことができる。このようなキットおよび適当な内容物は当業者に周知である。
ＩＶ．改変抗体定常ドメイン
本明細書に記載される改変抗体定常ドメイン分子はサイズが小さく（典型的には、１５ｋＤ未満）、このことは、検出、診断、および治療にとって大きな利点を提供する。例えば、これらの分子のサイズが小さいことによって、より大きなエピトープ接近とより良好な組織浸透が可能になる。図５Ｃに示すように、本明細書に提供されるＣＨ２ドメイン抗体は、他のタイプの抗体および抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、およびＩｇＧ分子）よりも低い分子量を有する。また、本明細書に提供されるＣＨ２ドメイン抗体は、ＶＨドメイン抗体よりも小さい。
本明細書に記載される場合、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、可変ドメインまたは他の定常ドメインを含む他の免疫グロブリンドメインの非存在下で効果的に抗原に結合することができる。例えば、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、約１０-６、約１０-７、約１０-８、もしくは約１０-９、またはそれ未満のｋＤで抗原に特異的に結合することができる。
抗原に特異的に結合する、本明細書に記載されるＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインは、免疫グロブリン可変ドメイン由来の少なくとも１つの異種アミノ酸配列を含み、かつ／または少なくとも１つの突然変異を含む。ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインに移入される異種アミノ酸配列は、少なくとも１つのＣＤＲ、またはその機能性断片（例えば、対象となる抗原に特異的に結合する抗体由来のＳＤＲ）を含む。移入されるアミノ酸配列は、ＣＤＲからＮ末端の方向におよび／またはＣ末端の方向に伸長する追加のアミノ酸配列（例えば、超可変ループを含む他のアミノ酸）も含むことができる。したがって、いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、異種免疫グロブリン可変ドメイン由来の完全な超可変ループを含む。改変ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインは、第２または第３のＣＤＲまたは超可変ループをさらに含むことができる。移入されるＣＤＲまたは超可変ループの長さはさまざまであり得る。適切な長さは、例えば、改変ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを発現させ、タンパク質の安定性と溶解性を評価することによって、および結合親和性を決定することによって、実験的に決定することができる。タンパク質を発現する方法、タンパク質の溶解性を決定する方法、および抗原結合親和性を評価する方法は当技術分野で周知である。本明細書に記載されるように、最大２１アミノ酸までの長さの配列をＣＨ２ドメインに首尾よく移入し得ることが明らかにされている。
ヒトＣＨ２ドメインは、６つのループ領域：ループ１、ループ２、ループ３、ループＡ-Ｂ、ループＣ-Ｄ、およびループＥ-Ｆを含む。異種免疫グロブリン可変ドメイン由来のＣＤＲおよび／または超可変ループを、１つ以上のこれらのループのいずれかに、任意の組合せで移入することができる（例えば、図５Ａ〜図５Ｃ参照）。
ヒトγ１ ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列を配列番号５として示す。各々のループ領域を含むアミノ酸残基を下記の表１に示す。アミノ酸位置は、ＣＨ２の最初の残基に対する番号１から付番する。
ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列を図１Ｂに示し、配列番号１として示す。各々のＣＤＲと超可変ループを含むアミノ酸残基を下記の表２に示す。
例示的な一実施形態では、ＣＨ２ドメインのループ１に由来する９個のアミノ酸を、ヒト抗体のＶＨドメイン由来の超可変ループＨ１／ＣＤＲ１に由来する１０個のアミノ酸と置換する。他の例示的な実施形態では、ＣＨ２ドメインのループ３に由来する６個のアミノ酸を、ヒト抗体のＶＨドメインの超可変ループＨ３／ＣＤＲ３に由来する１２個または１３個のアミノ酸と置換する。別の例示的な実施形態では、ＣＨ２ドメインのループ３に由来する６個のアミノ酸を、ヒト抗体のＶＨドメイン由来の超可変ループＨ１／ＣＤＲ１に由来する１０個のアミノ酸と置換する。他の例示的な実施形態では、ＣＨ２ドメインのループ１に由来する９個のアミノ酸を、ヒト抗体のＶＨドメインの超可変ループＨ３／ＣＤＲ３に由来する１２個または１３個のアミノ酸と置換する。
他の実施形態では、ループ１、ループ２、ループ３、ループＡ-Ｂ、ループＣ-Ｄ、またはループＥ-Ｆの１つ以上の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸を、異種抗体由来の１つ以上のＣＤＲまたは超可変ループの５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２１個のアミノ酸と、任意の組合せで置換する。ＣＤＲまたは超可変ループは、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン由来であり得る（図３Ａ〜３Ｃ参照）。
移入される超可変ループまたはＣＤＲは、対象となる任意の抗体由来であり得る。このような抗体としては、病原体特異的抗体および癌特異的抗体が挙げられるが、これらに限定されない。病原体特異的抗体としては、例えば、病原体（例えば、ウイルス、細菌または真菌、原虫または寄生虫）由来の抗原に特異的に結合する抗体が挙げられる。例示的な一実施形態では、抗体は、ＨＩＶ−１に特異的に結合する。癌特異的抗体としては、癌細胞によって（例えば、細胞表面上に）発現されるが、他の非癌細胞によって発現されない抗原を特異的に認識する抗体が挙げられる。癌特異的抗体の例としては、肺癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、甲状腺癌、腎癌、膵癌、結腸直腸癌、皮膚癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、白血病、またはリンパ腫の細胞または組織を認識する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、既知の特異性を有するＣＤＲ／超可変配列を含む。あるいは、改変ＣＨ２ドメイン分子は、ランダム化された１つまたは複数のＣＤＲペプチド配列を含むことができる。ＣＤＲの突然変異解析を行なって、増大した結合親和性および／または減少した免疫原性を有するＣＨ２ドメイン分子を同定することができる。さらに、ランダム化されたまたは突然変異させられたＣＤＲペプチド配列を含むＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子のライブラリーを作製して、以下に記載されるような、対象となる特定の抗原に高い親和性で結合するＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を同定することができる。
本明細書に提供されるＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子は、例えば、治療的目的、診断的目的、または検出目的のための、エフェクター分子をさらに含むことができる。例えば、エフェクター分子としては、毒素および検出可能標識（例えば、放射性標識、酵素、または蛍光マーカー）を挙げることができる。ＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子とともに使用し得るエフェクター分子の種類に関するさらなる詳細は、以下に記載されている（「抗体定常ドメイン分子のエフェクター機能」参照）。
Ｖ．抗体定常ドメイン分子ライブラリー
ランダムに挿入されたまたは突然変異させられたＣＤＲアミノ酸配列を含む改変ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子のライブラリーを本明細書でさらに提供する。これらのライブラリーを用いて、対象となる特定の抗原に対する高い親和性を有するＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子をスクリーニングすることができる。一実施形態では、これらのライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。抗体ファージディスプレイライブラリー、およびこのようなライブラリーを作製する方法は、当技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，８２８，４２２号および同第７，１９５，８６６号参照）。
ポリペプチド（抗体を含む）のライブラリーの開発が記載されている（米国特許第６，８２８，４２２号）。ポリペプチドのライブラリー（例えば、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子のライブラリー）を作製するために、ライブラリーの生成に好適な核酸配列をまず作製しなければならない。このようなランダム化された核酸配列を作製するために、通常、エラープローンＰＣＲを用いる。突然変異は、少なくとも１つのループにランダムに導入される。例えば、一群（例えば、２つまたは３つまたはそれより多く）の相同なタンパク質を同定し、タンパク質配列のデータベースを構築し、タンパク質配列を互いに整列させる。ＣＨ２ドメイン分子の場合、一群のヒトＣＨ２ドメイン配列を同定し、データベースを創造するために用いる。このデータベースを用いて、配列および／または構造的配置において高度の類似性を示すタンパク質配列のサブグループを規定する。各々のサブグループについて、少なくとも１つのコンセンサス配列を含むポリペプチド配列であって、このサブグループ（例えば、ＣＨ２ドメインのサブグループ）のメンバーを代表するものを推定する。完全なポリペプチド配列群は、相同なタンパク質（ＣＨ２ドメイン）群の完全な構造レパートリーに相当する。これらの人工ポリペプチド配列をその構造特性に従って解析し、ポリペプチド配列内のアミノ酸とアミノ酸の間のまたはポリペプチド配列と他のポリペプチド配列の間の好ましくない相互作用を同定することができる。このような相互作用は、コンセンサス配列を適当に変化させることによって取り除くことができる。
次に、これらのポリペプチド配列を解析し、ドメイン、ループ、β-シート、α-ヘリックス、および／またはＣＤＲを含む、サブエレメントを同定する。アミノ酸配列の翻訳をもとに戻して、記載された核酸配列の発現が予定される宿主細胞のコドン使用に適した対応するコード核酸配列にする。上記のように同定されたサブエレメントをコードする各々のサブ配列が、核酸配列中で２度は生じない２つの部位に隣接するように、１組の切断部位を配置する。これは、既にサブ配列に隣接している切断部位を同定するか、または１つ以上のヌクレオチドを変化させて切断部位を生成し、かつその部位を遺伝子の残りの部分から除去するかのいずれかによって達成することができる。これらの切断部位は、対応するサブエレメントまたはサブ配列の全てに共通するものであるべきであり、それによって、核酸配列中のサブ配列の完全モジュール式の配置と、対応するポリペプチド中のサブエレメントの完全モジュール式の配置とを作り出すことが可能となる。
上記の核酸配列は、当技術分野で周知のいくつかの方法のいずれか１つを用いて、例えば、全遺伝子合成によって、またはＰＣＲベースの手法によって、合成される。
一実施形態では、核酸配列は、ベクターにクローニングされる。ベクターは、当技術分野で周知の、配列解析ベクター、発現ベクター、またはディスプレイベクター（例えば、ファージディスプレイ）であり得る。ベクターは、異なるオペロンもしくは同じオペロンのいずれか一方の中に、１つの核酸配列、または２つ以上の核酸配列を含むことができる。同じオペロンの中にある場合、核酸配列は、別々にまたは連続する配列としてクローニングすることができる。
一実施形態では、核酸配列の１つ以上のサブ配列（例えば、ループ）を異なる配列に置換する。これは、サブ配列の末端近傍またはサブ配列の末端にある切断部位を用いて、例えば、適当な制限酵素によって、サブ配列を切り出し、かつこのサブ配列を、切断される核酸配列と適合する異なる配列に置換することによって達成することができる。さらなる実施形態では、最初のサブ配列を置換する異なる配列（「移入される配列」とも呼ばれる）は、ゲノム配列または再配列されたゲノム配列（例えば、異種抗体由来のＣＤＲ、ＳＤＲ、または超可変ループ）である。いくつかの実施形態では、異種配列は、ランダムな配列である。ランダムな配列の導入は、ポリペプチド（またはＣＨ２ドメイン分子）に可変性を導入し、ライブラリーを生成する。ランダムな配列は、当技術分野で周知のいくつかの方法のいずれかを用いて（例えば、自動オリゴヌクレオチド合成中にモノヌクレオチドもしくはトリヌクレオチドの混合物を用いることによって、またはエラープローンＰＣＲによって）作製することができる。これらのランダムな配列は、完全にランダム化されていてもよく、または既知のタンパク質配列中の特定の位置におけるアミノ酸分布に従って特定のコドンに有利にもしくは不利に偏らせていてもよい。さらに、ランダムなサブ配列群は、異なる数のコドンを含み、異なる長さの一群のサブエレメントを生じさせることができる。
これらの核酸配列は、当技術分野で周知の適当な条件下で好適なベクターから発現させることができる。一実施形態では、これらの核酸配列から発現されるポリペプチドをスクリーニングする。これらのポリペプチドはさらに、最適化することができる。スクリーニングは、当技術分野で周知の任意の方法（例えば、ファージディスプレイ、選択的に感染するファージ、結合をスクリーニングするためのポリソーム技術、酵素活性またはタンパク質安定性のためのアッセイ系）を用いて実施することができる。所望の特性を有するポリペプチド（例えば、ＣＨ２ドメイン分子）は、核酸配列もしくはアミノ酸配列を配列決定することによって、または質量分析によって同定することができる。ポリペプチドをスクリーニングする所望の特性は、例えば、標的分子に対する最適化された親和性または特異性であり得る。
いくつかの実施形態では、ファージミドベクターを用いて、多数の核酸配列（例えば、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子のライブラリーをコードする核酸配列）を同時に発現させることができる（例えば、米国特許出願公開第２００８／０３１２１０１号参照）。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを発現するファージ粒子のライブラリーは、ファージで適用可能であることが知られている任意のスクリーニングアッセイを用いてスクリーニングすることができる。例えば、複合構造体の中に、および特に、生理学的にまたは治療上意義のある場所に存在する標的に接着する（例えば、癌細胞にまたはウイルス粒子上の抗原に結合する）ファージを同定するために、ファージを、溶けているかまたは（例えば、プレート上もしくはビーズ上に）固定されている精製抗原に曝露させるか、あるいは細胞全体、組織全体、または動物全体に曝露させることができる。
異種配列がクローニングされ、発現され、かつ特異的リガンドに対するその結合性に基づいて特異的に単離された、選ばれたファージミドベクターを、細菌細胞から抽出し、配列決定し、ＰＣＲ増幅することができ、かつ／または例えば、細菌、植物、酵母、もしくは哺乳類の細胞での大規模な組換え産生のために、別の適当なベクターに再クローニングすることができる。
特異的な標的抗原との相互作用の検出は、標準的なパニング法を適用することによって、あるいはディスプレイされたＣＨ２結合分子またはＣＨ３結合分子とその標的抗原との間の相互作用を評価するためのより洗練された生物物理学的技術（例えば、蛍光ベースの分光法もしくは顕微鏡法、ホスファターゼ反応、または他のハイスループット技術）を適用することによって、実施することができる。
ひとたび、標的抗原に特異的に結合するＣＨ２ドメイン発現ファージ粒子またはＣＨ３ドメイン発現ファージ粒子が選択されれば、この組換えファージおよび関連ＤＮＡ配列を、当技術分野で公知の方法に従って単離し、かつ特性解析する（例えば、制限酵素を用いてファージミドベクターから分離し、直接配列決定し、かつ／またはＰＣＲで増幅する）ことができる。その後、これらの配列を、さらに修飾するためにおよび／または原核生物もしくは真核生物の宿主細胞内に発現させるために、より適当なベクターに移すことができる。ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインをコードするＤＮＡ配列は、ひとたび好適なベクターに挿入すれば、任意の好適な手段（形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接的なマイクロインジェクションなど）によって適当な宿主細胞に導入し、細胞を形質転換することができる。
その後、このＤＮＡ分子群を用いて、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子のライブラリーを生成することができる。ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子の親和性は、上記の方法を用いて最適化することができる。これらのライブラリーを用いて、標的に結合する１つ以上のＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を同定することができる。所望のＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子の同定は、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を発現させ、その後、これらをスクリーニングして、所与の標的分子に所望の親和性で結合する１つ以上の分子を単離することを含む。必要ならば、ＤＮＡ分子をモジュール式に設計することによって、１つ以上の遺伝子サブ配列を切り出し、かつ構造的サブエレメントをコードする１つ以上の第２のサブ配列と置換することが可能になる。その後、所望の親和性を有するＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子が作製されるまで、発現とスクリーニングの工程を繰り返すことができる。
一実施形態では、１つ以上の遺伝子サブユニット（例えば、１つ以上のＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのループ領域）が、切断部位を用いて、ランダムな一群の配列（ライブラリー）に置換される方法がある。得られるライブラリーは、その後、任意の選択された抗原に対してスクリーニングされる。所望の特性を有する（例えば、所望の結合親和性を有する）ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を選択し、回収し、次のライブラリーのための出発材料として使用することができる。
別の実施形態では、ポリペプチド（上記）と追加の部分の両方をコードするＤＮＡ配列を提供することによって、融合タンパク質を作製することができる。このような部分としては、免疫毒素、酵素、エフェクター分子、治療的分子、（例えば、検出および／または精製用の）標識あるいはタグが挙げられる。
上記の方法に従って作製される、核酸配列、これらの核酸配列を含むベクター、これらのベクターを含む宿主細胞、およびポリペプチドも本明細書に提供する。
上記の方法によるこれらの核酸配列、組換えベクター、ポリペプチド、および／またはベクター、ならびに該ポリペプチドを産生するための好適な宿主細胞のうちの１つもしくは複数を含むキットをさらに提供する。
ＶＩ．抗体定常ドメイン分子をコードする核酸
ＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子および／または免疫毒素をコードする核酸配列は、例えば、適当な配列のクローニングを含む、任意の好適な方法によって、またはＮａｒａｎｇら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０-９９，１９７９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９-１５１，１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９-１８６２，１９８１のジエチルホスホロアミダイト法；例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ-ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９-６１６８，１９８４に記載されているような自動合成機を用いた、Ｂｅａｕｃａｇｅ ＆ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９-１８６２，１９８１によって記載されている固相ホスホロアミダイトトリエステル法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法などの方法による直接的な化学合成によって調製することができる。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これを、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、またはこの一本鎖を鋳型として用いてＤＮＡポリメラーゼで重合させることによって、二本鎖に変換することができる。ＤＮＡの化学合成は、通常、約１００塩基の配列に制限されるが、より短い配列のライゲーションによって、より長い配列を入手し得るということを当業者であれば理解するであろう。
ＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子、またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子を含む免疫毒素をコードする配列をコードする例示的な核酸は、クローニング技術によって調製することができる。適当なクローニング技術と配列決定技術、および多くのクローニング実施を通じて当業者を教え導くのに十分な指示の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲書）、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（編）（前掲書）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ（前掲書）に見出される。生物学的試薬と実験機器の製造業者からの製品情報も有用な情報を提供する。このような製造業者としては、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ-Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ならびに当業者に公知の多くの他の商業的供給源が挙げられる。
核酸は、増幅法によって調製することもできる。増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、自己持続性配列複製系（３ＳＲ）が挙げられる。多種多様なクローニング法、宿主細胞、およびインビトロ増幅法が当業者に周知である。
一例では、有用なＣＨ２ドメイン分子は、このＣＨ２ドメイン分子コードするｃＤＮＡを、エフェクター分子（ＥＭ）をコードするｃＤＮＡを含むベクターに挿入することによって調製される。可変領域とＥＭがインフレームで読み取られ、１つの連続するポリペプチドが産生されるように挿入がなされる。したがって、コードされるポリペプチドは、機能的なＣＨ２ドメイン領域と機能的なＥＭ領域とを含む。一実施形態では、ＥＭがＣＨ２ドメイン分子のカルボキシル末端に位置するように、例えば、細胞毒素などの、しかしこれに限定されない、エフェクター分子をコードするｃＤＮＡをＣＨ２ドメイン分子にライゲートする。一例では、ＥＭがＣＨ２ドメイン分子のアミノ末端に位置するように、非特異的結合を排除するかまたは低下させるように突然変異させられた、シュードモナス外毒素（「ＰＥ」）をコードするｃＤＮＡをＣＨ２ドメイン分子にライゲートする。
ひとたび、ＣＨ２ドメイン分子（または免疫毒素）をコードする核酸を単離およびクローニングすれば、タンパク質を、組換え技術によって改変した細胞（例えば、細菌、植物、酵母、昆虫、または哺乳類の細胞）で発現させることができる。例えば、ＣＨ２ドメイン分子をコードする１つ以上のＤＮＡ配列を、好適な宿主細胞内にＤＮＡを移入することによってインビボで発現させることができる。細胞は、原核生物であっても、または真核生物であってもよい。この用語は、対象宿主細胞の任意の子孫も含む。複製中に生じる突然変異があり得るので、全ての子孫が親細胞と同一であるとは限らない可能性があることが理解されよう。外来ＤＮＡを宿主内で継続的に維持することを意味する、安定移入の方法は、当技術分野で公知である。あるいは、免疫毒素、抗体、またはそれらの断片をコードするＤＮＡ配列をインビトロで発現させることができる。
ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子をコードするポリヌクレオチド配列は、発現制御配列に機能的に連結させることができる。コード配列に機能的に連結される発現制御配列は、このコード配列の発現が、この発現制御配列と適合する条件下で達成されるようにライゲートされる。発現制御配列としては、適当なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前にある開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、イントロン用のスプライシングシグナル（ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするために、その遺伝子の正確なリーディングフレームを維持するもの）、および終止コドンが挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子をコードするポリヌクレオチド配列は、配列の挿入または組込みを可能にするよう操作することができ、かつ原核生物または真核生物のいずれかで発現させることができるプラスミド、ウイルス、または他のビヒクルを含むが、これらに限定されない、発現ベクターに挿入することができる。宿主としては、微生物、酵母、昆虫、および哺乳類生物を挙げることができる。真核生物またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物で発現させる方法は当技術分野で周知である。宿主内での発現および複製が可能な、生物学的機能を持つウイルスおよびプラスミドのＤＮＡベクターは当技術分野で公知である。
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に公知の従来技術によって実行し得る。宿主が原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））の場合、指数関数的増殖期の後に収穫し、次に、当技術分野で周知の手順を用いてＣａＣｌ２法により処理した細胞から、ＤＮＡの取込みが可能なコンピテント細胞を調製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを用いることができる。所望の場合には宿主細胞のプロトプラストを形成した後に、またはエレクトロポレーションによって、形質転換を行なうこともできる。
宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム共沈殿、従来の機械的な方法（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに包み込まれたプラスミドの挿入）、またはウイルスベクターのようなＤＮＡのトランスフェクション方法を使用してもよい。真核細胞は、免疫毒素、抗体、またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチド配列と、選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）とで共形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスなどの、真核生物のウイルスベクターを用いて、真核細胞に一過性に感染させるかまたは真核細胞を一過性に形質転換し、タンパク質を発現させることである（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｌｕｚｍａｎ編，１９８２参照）。当業者は、高等真核細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびメラノーマ細胞株）を含む細胞内でタンパク質を産生する際に有用なプラスミドおよびベクターなどの発現系を容易に使用することができる。
調製的クロマトグラフィーと免疫学的分離を含む従来の方法によって、組換え発現ポリペプチド（例えば、ＣＨ２ドメイン分子）の単離と精製を実行することができる。ひとたび発現させれば、組換え発現ポリペプチドは、硫安沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む、当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（一般に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２を参照されたい）。少なくとも約９０〜９５％均質な実質的に純粋な組成物が本明細書に開示されており、９８〜９９％またはそれを上回る均質性のものを薬学的目的に使用することができる。治療的に使用されることになっている場合、ひとたび望み通りに部分的にまたは均質になるまで精製されれば、ポリペプチドは、内毒素を実質的に含まないはずである。
大腸菌などの細菌から、タンパク質を発現させるおよび／または適当な活性形態にリフォールディングさせるための方法が記載され、それらは周知であり、本明細書に開示される抗体に適用可能である。Ｂｕｃｈｎｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３-２７０，１９９２；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５，１９９１；Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５，１９８９、およびＷａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４，１９８９を参照されたく、これらは全て参照により本明細書に組み入れられる。
多くの場合、大腸菌または他の細菌由来の機能的異種タンパク質は封入体から単離されるので、強力な変性剤を用いて可溶化し、その後にリフォールディングする必要がある。当技術分野ではよく知られていることであるが、可溶化工程の間、ジスルフィド結合を分離するために還元剤が存在しなければならない。還元剤を含む例示的な緩衝液は、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、６Ｍ グアニジン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ ＤＴＥ（ジチオエリスリトール）である。変性および還元されたタンパク質をリフォールディング緩衝液中に（例えば、１００倍に）希釈することによって、再生を達成することができる。例示的な緩衝液は、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ｌ-アルギニン、８ｍＭ 酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、および２ｍＭ ＥＤＴＡである。
組換え法に加えて、本明細書に開示されるＣＨ２ドメイン分子およびＣＨ３ドメイン分子を、標準的なペプチド合成を用いて、全体的にまたは部分的に構築することもできる。約５０アミノ酸未満の長さのポリペプチドの固相合成は、配列のＣ末端アミノ酸を不溶性の支持体に結合させ、次いで、配列中に残りのアミノ酸を順次付加することによって達成することができる。固相合成のための技術は、Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．ｐｐ．３-２８４；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９-２１５６，１９６３、およびＳｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，１９８４によって記載されている。より大きい長さのタンパク質は、より短い断片のアミノ末端とカルボキシル末端を縮合することによって合成し得る。カルボキシル末端の活性化によって（例えば、カップリング試薬であるＮ，Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミドを使用することによって）ペプチド結合を形成する方法は、当技術分野で周知である。
ＶＩＩ．診断または治療のための抗体定常ドメイン分子の使用
ＣＨ２ドメイン分子およびＣＨ３ドメイン分子は、抗体が有用となる多くの疾患もしくは状態のいずれかの診断および／または治療に非常に大きな可能性を有する。例えば、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、癌、感染性疾患（例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫による感染症）、自己免疫疾患、炎症性障害、あるいは抗体もしくはその断片を治療剤として使用することができる任意の他の疾患または状態の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、感染性疾患は、ウイルス、例えば、以下のファミリーのうちの１つに由来するウイルスによって引き起こされる：レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ））；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス；口蹄疫ウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス；黄熱病ウイルス；ウエストナイルウイルス；セントルイス脳炎ウイルス；日本脳炎ウイルス；および他の脳炎ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンターンウイルス；シンノンブレウイルス、リフトバレー熱ウイルス；ブニヤウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス；マチュポウイルス；フニンウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス；ＢＫ-ウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）-１およびＨＳＶ-２；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）；およびＨＳＶ-６を含む他のヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；ならびにイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚熱ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス；マールブルグウイルス）；カリシウイルス（例えば、ノーウォークウイルス）；ならびに未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損付随体と考えられている）；およびアストロウイルス）。
他の実施形態では、感染性疾患は、ある種の細菌、例えば、ヘリコバクターピロリ、ライム病ボレリア菌、レジオネラ・ニューモフィリア、マイコバクテリウム種（例えば、Ｍ．ツベルクローシス、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．カンサイ、Ｍ．ゴルドナエ）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリダンス群）、大便連鎖球菌、ストレプトコッカス・ボビス、連鎖球菌（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター種、腸球菌種、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌、クロストリジウム・ペルフリンゲルス、破傷風菌、エンテロバクター・エロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ・ムルトシダ、バクテロイデス種、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバシラス・モニリフォルミス、トレポネマ・パリジウム、トレポネマ・パルテヌエ、レプトスピラ、またはアクチノミセス・イスラエリによって引き起こされる。
他の実施形態では、感染性疾患は、真菌、例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミティス、ブラストミセス・デルマティディス、クラミジア・トラコマチス、またはカンジダ・アルビカンスによって引き起こされる。他の実施形態では、感染性疾患は、寄生虫、例えば、熱帯熱マラリア原虫またはトキソプラズマ原虫によって引き起こされる。
いくつかの実施形態では、癌は、固形腫瘍または造血系癌である。特定の例では、固形腫瘍は、肉腫または癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、もしくは別の肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、またはＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、もしくは網膜芽腫）である。
いくつかの例では、造血系癌は、白血病、例えば、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性型および高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、または骨髄形成異常である。
いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、腫瘍抗原に特異的に結合する。腫瘍抗原は当技術分野で周知であり、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β−ＨＣＧ）、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ（ＡＦＰ−Ｌ３）、チログロブリン、ＲＡＧＥ-１、ＭＮ-ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０-２、Ｍ-ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＬＡＧＥ-１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-１（ＰＣＴＡ-１）、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２ならびにＣＤ２２を含む。ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、任意の癌関連タンパク質、例えば、ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩ、ＩＧＲ-ＩＲ、またはメソテリンに結合することもできる。さらなる腫瘍関連抗原を下記の表３に示す。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性少関節炎、コラーゲン誘導性関節炎、アジュバント誘導性関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、自己免疫性胃萎縮症、尋常性天疱瘡、乾癬、白斑、１型糖尿病、非肥満糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性溶血性貧血、または悪性貧血である。
ＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子の幅広い有用性は、少なくとも一部はそのサイズが小さいことに起因し、それによって、ＨＩＶが複製する固形腫瘍とリンパ系組織とを含む組織への効率的な浸透が可能になり、宿主免疫系によって産生される免疫グロブリンによる中和を回避するように速やかに進化するウイルス（例えば、ＨＩＶ）の効率的な中和も可能になる。改変ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、対象となる任意の抗原に対する高親和性の結合抗体を生成しやすいので治療に有用でもある。さらに、本明細書に記載されるように、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、治療特性を有するエフェクター分子（例えば、薬物、酵素、または毒素など）をさらに含むことができる。
本明細書に記載されるように、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、病原体（例えば、ＨＩＶ）に特異的な抗体由来の１つ以上のＣＤＲを含むように改変することができる。Ｘ５は、ＨＩＶ-１に特異的な中和抗体である（Ｍｏｕｌａｒｄら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：６９１３-６９１８，２００２）。Ｘ５の中和活性は、完全な免疫グロブリン（ＩｇＧ１）またはＦａｂから重鎖と軽鎖の可変ドメインのみを含むｓｃＦｖ抗体に変換されたときに著しく増大することが示されている（Ｌａｂｒｉｊｎら Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０５５７-１０５６５，２００３）。この効果は、Ｘ５エピトープへの接近がサイズによって制限されることが原因であると考えられている。ＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子はｓｃＦｖ抗体よりも小さく、これによって、改変ＣＨ２ドメイン分子（１つ以上のＸ５ ＣＤＲを含む）は、エピトープに接近する能力があるので、増強した中和活性を有するであろうという仮説が導かれる。
ＣＨ２ドメイン分子とＣＨ３ドメイン分子は、通常、１つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物として対象に投与される。このような担体は、部分的には、投与される特定の組成物によって、および組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって決定される。したがって、本開示の薬学的組成物の好適な製剤は多種多様に存在する。
非経口投与用の調製物としては、滅菌水性溶液または滅菌非水性溶液、滅菌水性懸濁液または滅菌非水性懸濁液、および滅菌水性乳濁液または滅菌非水性乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性担体としては、食塩水および緩衝化媒質を含む、水、アルコール性溶液／水性溶液、アルコール性乳濁液／水性乳濁液、またはアルコール性懸濁液／水性懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、水分補給剤および栄養補給剤、電解質補給剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づいたもの）などが挙げられる。例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなどの、防腐剤および他の添加剤も存在し得る。
局所投与用の製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、および粉末剤を挙げることができる。従来の薬学的担体、水性基剤、粉末基剤、または油状基剤、増粘剤などが、必要であるかまたは望ましいこともある。
経口投与用の組成物としては、粉末剤または顆粒剤、水もしくは非水性媒質中の懸濁液または溶液、カプセル剤、サシェー剤、あるいは錠剤が挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が望ましいこともある。
これらの組成物のうちのいくつかは、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸）、ならびに有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸）との反応によって形成されるか、または無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）、ならびに有機塩基（例えば、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、およびアリールアミン、ならびに置換エタノールアミン）との反応によって形成される薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与される可能性がある。
投与は、単回用量または複数回用量で達成することができる。必要とされる用量は、対象の種、年齢、体重、全般的な状態、治療される特定の出血性障害または出血性発作、使用される特定のＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子、およびその投与様式によって対象ごとに異なる。適切な用量は、日常的な試験のみを用いて当業者により決定され得る。
単独でまたは薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的有効量の改変ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を含む薬学的組成物を本明細書に提供する。薬学的に許容される担体としては、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。担体および組成物は滅菌されていてもよく、製剤は、投与様式に適するものである。組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。組成物は、液性溶液、液性懸濁液、液性乳濁液、錠剤、ピル、カプセル剤、持続放出製剤、または粉末剤であり得る。組成物は、従来の結合剤および担体（例えば、トリグリセリド）とともに、坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムを含むことができる。任意の一般的な薬学的担体（例えば、滅菌食塩水溶液またはゴマ油）を使用することができる。媒質は、例えば、浸透圧を調整するための薬学的に許容される塩、緩衝剤、防腐剤などのような、従来の薬学的な補助物質を含むこともできる。本明細書に提供される組成物および方法とともに使用することができる他の媒質は、生理食塩水およびゴマ油である。
ＶＩＩＩ．検出のための抗体定常ドメイン分子の使用
ポリペプチドの有無を決定する方法は当技術分野で周知である。例えば、特異的な結合剤（例えば、ＣＨ２ドメイン分子）を、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、または薬物を含むが、これらに限定されない、他の化合物にコンジュゲートすることができる。ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット、または免疫沈降アッセイなどの、しかし、これらに限定されない、免疫アッセイで利用することもできる。これらのアッセイは当技術分野で周知である（免疫アッセイフォーマットの説明については、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照されたい）。
一実施形態では、免疫アッセイを含む診断キットを提供する。免疫アッセイの詳細は、利用される特定のフォーマットとともに変わり得るが、生体試料中の抗原を検出するための方法は、通常、生体試料を、免疫学的に反応性の条件下で、対象となる抗原に特異的に反応するＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子と接触させる工程を含む。ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を、免疫学的に反応性の条件下で特異的に結合させて免疫複合体を形成させ、この免疫複合体（結合抗原）の存在を直接的にまたは間接的に検出する。
本明細書に開示されるＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に使用することもできる。ＦＡＣＳアッセイは、より高度なレベルの検出の中でも特に、複数のカラーチャネル、小角／鈍角光散乱検出チャネル、およびインピーダンスチャネルを利用して、細胞を分離または選別する（米国特許第５，０６１，６２０号参照）。細胞を適切に標識されたＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子と接触させることにより、ＦＡＣＳを用いて抗原陽性の細胞を選別することができる。しかしながら、異なる効果を持つ他の技術を利用して、所望の細胞集団を精製および単離してもよい。利用される分離技術は、回収される細胞の画分の生存能の保持を最大にすべきである。利用される特定の技術は、当然、分離の効率、方法の細胞毒性、分離の容易さと速さ、ならびに必要とされる機器および／または技能によって決まる。
さらなる分離方法としては、ＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、親和性クロマトグラフィー、ＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子に接続されているかまたは補体と併用されるかのいずれかの細胞毒性剤、および固体マトリックスに結合した抗体またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子を利用する「パニング」、あるいは別の好都合な技術を挙げることができる。特異的結合剤を磁気ビーズならびに他の固体マトリックス（例えば、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空繊維膜、およびプラスチック製ペトリ皿）に結合させることによって、直接的な分離が可能になる。特異的結合剤（例えば、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子）によって結合される細胞は、固体支持体を細胞懸濁液から単に物理的に分離することによって、細胞懸濁液から除去することができる。固相に結合した抗体またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子と細胞とのインキュベーションの正確な条件および期間は、利用される系に特異的ないくつかの要因によって決まる。しかしながら、適切な条件の選択は当業者に周知である。
次に、対象となる抗原を発現する細胞を、固相に結合した結合剤に十分な時間結合させた後、未結合の細胞を生理緩衝液で溶出するかまたは洗い流すことができる。次に、結合細胞を、主に、利用される固相および抗体またはＣＨ２ドメイン分子もしくはＣＨ３ドメイン分子の性質に応じて、任意の適切な方法で固相から分離し、かつ当技術分野で周知の方法を用いて定量する。特異的で、非限定的な一例では、固相から分離された結合細胞をＦＡＣＳで定量する。
ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を、ビオチン（これは、その後、支持体に結合したアビジンもしくはストレプトアビジンで除去することができる）、または蛍光色素（これは、当技術分野で知られているように、ＦＡＣＳとともに用いて、細胞の分離と定量を可能にすることができる）にコンジュゲートしてもよい。
ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子を、酵素、常磁性ビーズ、コロイド状常磁性ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、または薬物を含むが、これらに限定されない、他の化合物にコンジュゲートすることができる。ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子にコンジュゲートすることができる酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＨ２ドメイン分子にコンジュゲートすることができる蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート、テトタメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリスリン、アロフィコシアニン、およびテキサスレッドが挙げられるが、これらに限定されない。抗体にコンジュゲートすることができるさらなる蛍光色素については、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９２-１９９４）を参照されたい。ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子にコンジュゲートすることができる金属化合物としては、フェリチン、コロイド状金、および特に、コロイド状超常磁性ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子にコンジュゲートすることができるハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサザロン、およびニトロフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる試薬が、当技術分野で周知である。
ＩＸ．抗体定常ドメイン分子のエフェクター機能
改変ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインは、Ｆｃ受容体および／または補体関連分子（例えば、Ｃ１ｑ）に結合することができ、これによって、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、貪食作用、オプソニン化、およびオプソニン化貪食作用を含む、種々のエフェクター機能が可能になる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子は、１つ以上のＦｃ受容体に対する結合部位を含んでおり、したがって、これらの分子がさまざまなエフェクター機能を仲介することが可能になっている（下記の表４参照）。エフェクター機能が望ましくない場合、Ｆｃ結合部位を突然変異させて、こうした機能を妨げることができる。
抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、種々のエフェクター機能と免疫調節性シグナルを含む、多種多様な応答を引き起こす。こうした相互作用は、抗体または免疫複合体のＦｃドメインが、特殊な細胞表面受容体であるＦｃ受容体に結合することによって開始される。Ｆｃ受容体ファミリーの各々のメンバーは、Ｆｃドメイン上の認識ドメインを介して１つ以上のアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンサブタイプに対するその特異性によって規定される（例えば、ＩｇＧに対するＦｃ受容体は、ＦｃγＲと呼ばれる）（米国成立前特許公開第２００６-０１３４７０９号）。
Ｆｃ受容体は、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、および樹状細胞を含む、免疫系のいくつかの細胞の表面に見られる糖タンパク質である。Ｆｃ受容体は、種々の細胞発現パターンとエフェクター機能を示す（表４参照）。Ｆｃ受容体は、免疫細胞が微生物の表面に結合した抗体または微生物に感染した細胞に結合した抗体に結合することを可能にし、これらの細胞が微生物病原体を同定しかつ排除するのを手助けする。Ｆｃ受容体は、そのＦｃ領域で抗体に結合するが、これは、Ｆｃ受容体を有する細胞を活性化する相互作用である。
貪食細胞の活性化は、Ｆｃ受容体による最も一般的な機能である。例えば、マクロファージは、Ｆｃγ受容体のエンゲージメント後の貪食作用によって、ＩｇＧでコーティングされた病原体を摂取し、殺し始める。Ｆｃ受容体が関わる別のプロセスは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる。ＡＤＣＣの間、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面上のＦｃγＲＩＩＩ受容体は、ＮＫ細胞を刺激し、ＮＫ細胞の顆粒から細胞傷害性分子を放出させて、抗体で覆われた標的細胞を殺す。しかしながら、ＦｃεＲＩは異なる機能を有する。ＦｃεＲＩは、アレルギー反応と寄生虫感染に対する防御とに関与する顆粒球上のＦｃ受容体である。適当なアレルギー抗原または寄生虫が存在するとき、顆粒球の表面での少なくとも２つのＩｇＥ分子とそのＦｃ受容体の架橋は、細胞が予め形成されたメディエーターを細胞の顆粒から速やかに放出するきっかけとなる。
さらに、ＩｇＧ抗体とＩｇＭ抗体のＦｃドメインは、補体活性化の古典経路の構成成分であるＣ１ｑに結合することができる。ＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体が病原体の表面に結合すると、Ｃ１ｑは、これらの抗体のＦｃ領域に結合することができ、これによって補体カスケードが開始され、最終的には、炎症細胞の動員および病原体のオプソニン化と死滅がもたらされる。
ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子に機能性をさらに提供するために、エフェクター分子（例えば、治療的部分、診断的部分、または検出部分）を、当業者に公知の任意の数の手段を用いて、ＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子に連結させることができる。例示的なエフェクター分子としては、放射性標識、蛍光マーカー、または毒素が挙げられるが、これらに限定されない。共有結合手段と非共有結合手段の両方を使用することができる。エフェクター分子を抗体に結合させるための方法は、エフェクターの化学構造によってさまざまである。ポリペプチドは、通常、種々の官能基、例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）基、遊離アミン（−ＮＨ２）基、またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基を含み、これらの基は、エフェクター分子の結合をもたらす抗体上の好適な官能基との反応に利用可能である。あるいは、抗体を誘導体化して、さらなる反応性官能基を露出させるかまたはこのような官能基を結合させる。誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能なリンカー分子のような、いくつかのリンカー分子のいずれかを結合させることを含み得る。リンカーは、抗体をエフェクター分子に接続するために用いられる任意の分子であり得る。リンカーは、抗体とエフェクター分子の両方に共有結合を形成することができる。好適なリンカーは当業者に周知であり、これには、直鎖もしくは分岐鎖の炭素リンカー、複素環炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定されない。抗体とエフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーは、アミノ酸の側鎖を介して（例えば、システインに対するジスルフィド結合を介して）構成アミノ酸に接続されてもよいし、または末端アミノ酸のアルファ炭素のアミノ基およびカルボキシル基に接続されてもよい。
状況によっては、免疫コンジュゲートがその標的部位に達したときに、エフェクター分子を抗体から遊離させることが望ましい。それゆえに、こうした状況では、免疫コンジュゲートは、標的部位の付近で切断可能な連結を含むことになる。抗体からエフェクター分子を放出するためのリンカーの切断は、免疫コンジュゲートが標的細胞内部かまたは標的部位付近のいずれかで曝される酵素活性または酵素状態によって促進し得る。
種々の放射性診断化合物、放射性治療化合物、標識（例えば、酵素または蛍光分子）薬物、毒素、および他の薬剤を抗体に結合させることに関する報告されている多数の方法を考慮して、当業者は、所与の薬剤をＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子に結合させるための好適な方法を決定することができるであろう。
治療剤には、さまざまな薬物（例えば、ビンブラスチン、ダウノマイシンなど）、およびエフェクター分子（例えば、天然のもしくは修飾されたシュードモナス外毒素またはジフテリア毒素などの細胞毒素、それ自体が薬理学的組成物を含む封入剤（例えば、リポソーム）、標的部分、およびリガンド）が含まれる。特定の治療剤の選択は、特定の標的分子または標的細胞と、惹起されることが望ましい生物学的効果とによって決まる。したがって、例えば、治療剤は、特定の標的細胞の死をもたらすために使用される細胞傷害性のエフェクター分子であってもよい。逆に、単に、致死的でない生体応答を惹起することが望ましい場合には、治療剤を、致死的でない薬理的薬剤、または致死的でない薬理的薬剤を含むリポソームにコンジュゲートすることができる。
毒素は、免疫毒素として有用なＣＨ２ドメイン分子またはＣＨ３ドメイン分子とともに利用することができる。例示的な毒素としては、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、リシン、アブリン、ジフテリア毒素とそのサブユニット、リボトキシン、リボヌクレアーゼ、サポリン、およびカリケアマイシン、ならびにボツリヌス毒素ＡからＦが挙げられる。これらの毒素は当技術分野で周知であり、多くのものは、商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から容易に入手可能である。
ジフテリア毒素はジフテリア菌から単離される。通常、免疫毒素として使用されるジフテリア毒素は、非特異的毒性を低下させるかまたは排除するように突然変異させられている。完全な酵素活性を有するが、非特異的毒性が著しく低下している、ＣＲＭ１０７として知られる突然変異体が１９７０年代以降知られており（ＬａｉｒｄおよびＧｒｏｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９：２２０，１９７６）、ヒトの臨床試験で使用されている。米国特許第５，７９２，４５８号および米国特許第５，２０８，０２１号を参照されたい。本明細書で使用される場合、「ジフテリア毒素」という用語は、適宜、天然のジフテリア毒素を指すか、または酵素活性を保持するが、非特異的毒性を低下させるように修飾されているジフテリア毒素を指す。
リシンとは、ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）由来のＲＣＡ６０というレクチンのことである。「リシン」という用語は、その毒性変異体に言及するものでもある。例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照されたい。ヒマアグルチニン（ＲＣＡ）は、それぞれ、約６５ｋＤおよび約１２０ｋＤの分子量によって、ＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０と命名された２つの形態で生じる（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ＆ Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２６６：５４３，１９７２）。Ａ鎖は、タンパク質合成を不活性化することと、細胞を殺すことに関与する。Ｂ鎖は、リシンを細胞表面ラクトース残基に結合させ、Ａ鎖の細胞質への輸送を促進する（Ｏｌｓｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ２４９：６２７-６３１，１９７４および米国特許第３，０６０，１６５号）。
リボヌクレアーゼも、免疫毒素として使用される標的分子にコンジュゲートされている（Ｓｕｚｕｋｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２６５-７０，１９９９参照）。例示的なリボトキシン（例えば、α−サルシンおよびレストリクトシン）は、例えば、Ｒａｔｈｏｒｅら，Ｇｅｎｅ １９０：３１-５，１９９７；ならびにＧｏｙａｌおよびＢａｔｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４５ Ｐｔ ２：２４７-５４，２０００で考察されている。カリケアマイシンは、最初、ミクロモノスポラ・エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）から単離されたものであり、アポトーシスをもたらすＤＮＡの二本鎖切断を引き起こすエンジイン抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである（例えば、Ｌｅｅら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ ４２：１０７０-８７．１９８９参照）。この薬物は、臨床試験における免疫毒素の毒性部分である（例えば、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １１：７３５-４１，２０００参照）。
アブリンには、トウアズキ（Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ）由来の毒性レクチンが含まれる。毒性の素である、アブリンａ、ｂ、ｃ、およびｄは、約６３〜６７ｋＤの分子量を有し、２つのジスルフィド結合ポリペプチド鎖であるＡとＢから構成されている。Ａ鎖は、タンパク質合成を阻害し、Ｂ鎖（アブリン−ｂ）はＤ−ガラクトース残基に結合する（Ｆｕｎａｔｓｕら，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２：１０９５，１９８８；およびＯｌｓｎｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０：３３０-３３５，１９７８参照）。
以下の実施例は、ある特定の特色および／または実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、本発明を、記載される特定の特色または実施形態に限定するものと見なされるべきではない。
実施例１：４つの残基（Ｙ、Ｓ、Ａ、またはＤ）のいずれかにランダムに突然変異させられたアミノ酸残基を含むループを有する抗体ＣＨ２ドメインのライブラリーの作製
この実施例では、ループ１が１０個のランダムに配置されたＹ残基、Ｓ残基、Ａ残基、またはＤ残基で置換され、ループ１のＣ末端に追加のＧが付加されている突然変異ＣＨ２ドメインを構築した。同様に、ループ３を、６個のランダムに配置されたＹ残基、Ｓ残基、Ａ残基、またはＤ残基で置換し、ループ３のＣ末端に追加のＧを付加した。ＤＮＡライブラリーは３段階で作製される。
まず、ＣＨ２ ＤＮＡを、それぞれ、突然変異ループ１および突然変異ループ２を含む、断片１および断片２という２つの断片を作製するために用いる。断片１は、Ｎ末端プライマー（５' ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＴＣ ＧＣＴ ＡＣＣ ＧＴ ＧＧＣＣ ＣＡＧＧＣ ＧＧＣＣ ＧＣＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ３'；配列番号６）とループ１リバースプライマー（５' ＣＡＣ ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＴＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＣＡ ＴＧＴ ＧＡＣ ３'；配列番号７）（ここで、Ｋ＝ＧまたはＴ、かつＭ＝ＡまたはＣ）を用いてＰＣＲ増幅で作製する。断片２は、ループ１フォワードプライマー（５' ＡＡＧ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＧＴＧ ３'；配列番号８）とループ３リバースプライマー（５' ＧＡＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＴＣ ＧＡＴ ＧＧＧ ＧＣＣ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＧＴＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＴＴ ＧＣＡ ＣＴＴ Ｇ ３'；配列番号９）を用いて作製する。
次に、この２つの断片を、重複伸張（ＳＯＥ）ＰＣＲによるスプライシングを用いることによって接続する。ＳＯＥ ＰＣＲの第２ステップの間に、Ｎ末端プライマーに加えて、Ｃ末端プライマー（５' ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＣＣ ＧＧＣＣＴ ＧＧＣＣ ＴＴＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＧＧＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＴＣ ＧＡＴ Ｇ ３’；配列番号１０）を用いて、クローニングの次の段階に必要な制限部位Ｓｆｉ１をＤＮＡの両末端に導入する。
３番目に、増幅した突然変異ＣＨ２断片をＳｆｉ１で消化し、同じ酵素で消化したファージミドベクター中にライゲートする。エレクトロポレーションによってＴＧ１細胞を形質転換する前に、ライゲーションの産物を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ-４セントリコンを用いて再蒸留水で３回洗浄することにより脱塩する。
形質転換されたＴＧ１細胞に由来する２０個のランダムに選択されたクローンの配列を以下に示す（表５）。これは、４つの残基（Ｙ、Ｓ、Ａ、またはＤ）によってランダム化されたループ１とループ３を有するＣＨ２突然変異体の作製が成功したことを示している。
実施例２：ヒト抗体由来のＣＤＲ３のＣＨ２スキャフォールドへの移入
本実施例では、ループＡ-ＢおよびＥ-Ｆを置換することによって、抗体ライブラリー由来のヒトＶＨ ＣＤＲ３（Ｈ３）をＣＨ２に移入する。まず、ループＡ-Ｂを５回のＰＣＲを用いてＨ３に置換する。最初の２回のＰＣＲでは、以下のプライマー、すなわち、断片１については、フォワード１プライマー（５' ＴＡＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＧＣＴ ＡＣＣ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＡＧ ＧＣＧ ＧＣＣ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＣＣ ３'；配列番号５１）とリバース１プライマー（５’ ＴＣＣ ＣＣＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＴＣ ＡＧＧ ＴＧＣ ３'；配列番号５２）、断片２については、フォワード２プライマー（５’ ＴＧＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＡＣ ＧＴＧ ＡＧＣ ３’；配列番号５３）とリバース２プライマー（５' ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＧＣ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＣＣ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＣＣ ＴＴＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＧＧＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＴＣ ＧＡＴ ＧＧ ３'；配列番号５４）を用いて、ループＡ-Ｂのない２つのＣＨ２断片を作製する。フォワード１プライマーとリバース２プライマーは、最終産物中のＮ末端とＣ末端で必要とされるＳｆｉＩ用の制限部位を含む。リバース１プライマーとフォワード２プライマーは、後のＳＯ ＰＣＲに必要な末端配列を含む。３回目のＰＣＲでは、鋳型として抗体ＶＨライブラリーと、多様なＨ３を増幅するように設計された各々３つのプライマーからなる２つの混合物とを用いる。フォワードプライマーの混合物は、Ｈ３フォワードプライマー１：５’ ＧＡＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＣＣＧ ＧＣＹ ＡＹＲ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＹＧ ３’（配列番号５５）、Ｈ３フォワードプライマー２：５’ ＧＡＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＣＣＧ ＧＣＹ ＴＴＲ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＹＧ ３’（配列番号５６）、およびＨ３フォワードプライマー３：５’ ＧＡＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＣＣＧ ＧＣＹ ＧＴＲ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＹＧ ３’（配列番号５７）を含む。リバースプライマーの混合物は、Ｈ３リバースプライマー１：５’ ＧＣＴ ＣＡＣ ＧＴＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＣＡ ＧＧＴ ＧＣＣ ＣＴＧ ＧＣＣ ＣＣＡ ３’ （配列番号５８）、Ｈ３リバースプライマー２：５’ ＧＣＴ ＣＡＣ ＧＴＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＣＡ ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＣＧ ＧＣＣ ＣＣＡ ３’（配列番号５９）、およびＨ３リバースプライマー３：５’ ＧＣＴ ＣＡＣ ＧＴＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＣＡ ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＹＧ ＧＣＣ ＣＣＡ ３’（配列番号６０）を含む。このＰＣＲによって、リバース１プライマーとフォワード２プライマーのそれぞれの末端配列と重複するように設計された末端配列を有するＨ３を含む断片の混合物が作製される。２つのＣＨ２断片とＨ３含有断片とを、ＳＯＥ ＰＣＲでのプライマーおよび鋳型として用いて、ループＡＢがＨ３に置換された断片を作製する。この断片混合物を、フォワード１プライマーとリバース２プライマーを用いて増幅する。増幅した断片をＳｆｉＩで消化し、同じ酵素で消化したファージミドベクター（ｐＣｏｍｂ３ＸまたはｐＺＵＤ）中にライゲートする。エレクトロポレーションによってＴＧ１細胞を形質転換する前に、ライゲーションの産物を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ-４セントリコンを用いて再蒸留水で３回洗浄することにより脱塩する。
断片１の増幅に関して、リバースプライマー１の代わりに、リバースプライマー１２（５’ ＧＴＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ＣＴＧ ＣＴＣ ３’；配列番号６１）という別のプライマーを使用し、断片２の増幅に関して、フォワードプライマー２の代わりに、フォワードプライマー２２（５’ ＡＡＧ ＧＴＣ ＴＣＣ ＡＡＣ ＡＡＡ ＧＣＣ ＣＴＣ ３’；配列番号６２）という別のプライマーを使用し、かつＨ３の増幅に関しては、Ｈ３プライマーが異なることを除いて、同様の手順を、ループＥ-Ｆの置換に用いることができる。この場合、フォワードプライマーの混合物は、Ｈ３フォワードプライマー１２：５’ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＧＣ ＡＣＧ ＴＡＣ ＧＣＡ ＧＣＹ ＡＹＲ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＹＧ ３’（配列番号６３）、Ｈ３フォワードプライマー２２：５’ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＧＣ ＡＣＧ ＴＡＣ ＧＣＡ ＧＣＹ ＴＴＲ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＹＧ ３’（配列番号６４）、およびＨ３フォワードプライマー３２：５’ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＧＣ ＡＣＧ ＴＡＣ ＧＣＡ ＧＣＹ ＧＴＲ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＹＧ ３’（配列番号６５）を含む。この場合のリバースプライマーの混合物は、Ｈ３リバースプライマー１２： ５’ ＧＡＧ ＧＧＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＴＴ ＧＧＴ ＴＣＣ ＣＴＧ ＧＣＣ ＣＣＡ ３’（配列番号６６）、Ｈ３リバースプライマー２２：ＧＡＧ ＧＧＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＴＴ ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＣＧ ＧＣＣ ＣＣＡ ３’（配列番号６７）、およびＨ３リバースプライマー３２：５’ ＧＡＧ ＧＧＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＴＴ ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＹＧ ＧＣＣ ＣＣＡ ３’（配列番号６８）を含む。最後に、Ａ-ＢおよびＥ-Ｆという両方のループをＶＨ Ｈ３と置換することができる。この場合、ループＡ-ＢをＨ３に置換した後、得られた断片中で、ループＥ-Ｆをランダムに組み換えられたＨ３に置換する。
形質転換されたＴＧ１細胞に由来する、両方のループがＨ３に置換された１９個のランダムに選択されたクローンの配列を以下に示す（表６）。これは、Ｈ３の移入が成功したことを示唆している。図４は、これらのクローンのうちのいくつかのタンパク質発現を示す。突然変異体分子のバンドの位置を矢印で示す。
実施例３：安定化されたＣＨ２突然変異体の改変および特性解析
この実施例では、もとの野生型ＣＨ２と比較して安定性の増大を示す２つのＣＨ２突然変異体が同定される。ＣＨ２フレームワークは、鎖Ｂと鎖Ｆの間の内部ジスルフィド結合によって既に安定化されているので、他の鎖間のさらなるジスルフィド結合によって全体的なＣＨ２安定性の増大をもたらすことができるという仮説を立てた。鎖Ａと鎖Ｇの中のいくつかの位置を突然変異させたが、そのうちの１つは、
と
がＣに突然変異した、非常に安定な突然変異体ＣＨ２（ｍ０１と命名）を生じさせた。
がＣに突然変異した、もう１つの突然変異体（ｍ０２と命名）は、もとのＣＨ２と比較して安定性の増大を示したが、ｍ０１の安定性よりも低かった。
材料および方法
ＣＨ２ドメインのクローニング、発現、および精製。ヒトγ１ ＣＨ２を細菌発現ベクターにクローニングし、大腸菌株ＨＢ２１５１細胞の形質転換に用いた。この細胞を、光学密度ＯＤ６００が約０．６〜０．８になるまでＳＢ培地中、３７℃で増殖させた。１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３７℃で１２〜１６時間、発現を誘導した。細菌細胞を収穫し、緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、４５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中で１：１０（緩衝液Ａの容量：培養物の容量）に再懸濁した。硫酸ポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）（０．５ｍｕ／ｍｌ）を懸濁液に添加した（硫酸ポリミキシンＢの容量：培養物の容量＝１：１０００）。その後、細胞ライセートを、４℃、４５分間、１５，０００ｒｐｍでの遠心分離によって清澄化し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって発現を検討した。清澄化した上清を、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ Ｎｉ-ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＪ）を用いて精製した。緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、４５０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）で溶出した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，ＭＡ）でイミダゾールを除去し、精製タンパク質を緩衝液ＡまたはＰＢＳ（９．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１４４ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、７９５ｍｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）中で保存した。これらのタンパク質の純度はＳＤＳ-ＰＡＧＥでチェックし、タンパク質の濃度は、ＵＶ吸光度を測定することによって決定した。
ＣＨ２突然変異体の設計とプラスミドの構築。ＣＨ２突然変異体を設計するために、Ｆｃ結晶構造を用いた。コンピュータプログラムＶＭＤ １８．６（Ｈｕｍｐｈｒｅｙら，Ｊ Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．１４：３３-３８，１９９６）を用いて構造を解析することによって、Ｖ１０／Ｅ１０３からＣ１０／Ｃ１０３への、Ｆ１１／Ｋ１０４からＣ１１／Ｃ１０４への、Ｌ１２／Ｔ１０５からＣ１１／Ｃ１０５への、Ｌ１２／Ｋ１０４からＣ１２／Ｃ１０４への、およびＶ１０／Ｋ１０４からＣ１０／Ｃ１０４への５つの突然変異体を特性解析用に選択した。これらをＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発によって作製し、細菌発現ベクターにクローニングした。これらのクローンを直接的な配列決定で確認し、大腸菌株ＨＢ２１５１の形質転換に用いた。野生型ＣＨ２と同様に、該突然変異体を発現させ、精製した。
サイズ排除クロマトグラフィー。オリゴマー形成を評価するために、精製したＣＨ２、ＣＨ２ ｍ０１、およびＣＨ２ ｍ０２を、ＡＫＴＡ ＢＡＳＩＣ ｐＨ／Ｃクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＪ）で作動するＨｉｌｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＪ）に充填した。緩衝液Ａを移動相として選択した。アルドラーゼ（１５８ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４４ｋＤａ）、キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤ）、およびリボヌクレアーゼＡ（１７ｋＤａ）からなるゲル濾過標準を用いて、ＣＨ２、ＣＨ２ ｍ０１、およびＣＨ２ ｍ０２の分子量を規定した。
質量分析によるジスルフィド結合の決定。精製したＣＨ２、ＣＨ２ ｍ０１、およびＣＨ２ ｍ０２の中のジスルフィド結合の総数は、Ｖｏｙａｇｅｒ ４７００ ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）を介して、（Ａ）全てのＳＨ基の還元化およびアルキル化と（Ｂ）ジスルフィド結合の還元を伴わないもとの遊離ＳＨ基のアルキル化の後の分子質量を比較することによって決定した。還元はＴＣＥＰを用いて行ない、アルキル化はヨードアセトアミドを用いて行なった。
円二色性（ＣＤ）。ＣＨ２、ＣＨ２ ｍ０１、およびＣＨ２ ｍ０２の二次構造を、円二色性（ＣＤ）分光法によって決定した。精製タンパク質を、最終濃度０．４９ｍｇ／ｍｌでＰＢＳに溶かし、ＣＤスペクトルをＡＶＩＶ Ｍｏｄｅｌ ２０２ ＣＤ分光計（Ａｖｉｖ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＮＪ）で記録した。天然の構造を測定するために、波長スペクトルを、０．１ｃｍの路長のキュベットを用いて２５℃で記録した。加熱速度を１℃／分とし、２５〜９０℃の温度範囲でＣＤシグナルを記録することにより、熱力学的安定性を２１６ｎｍで測定した。加熱後、波長スペクトルを９０℃で記録した。リフォールディングの評価のために、全ての試料を４℃で一晩保存し、２５℃で再度測定した。外部プローブセンサーで温度を記録し、マイクロキュベット内の温度を較正によって算出した。マイクロキュベット内の温度は、外部センサーによって測定された温度よりも約２〜３℃（２０℃〜８０℃の温度に対して１．９℃〜３．８℃の範囲）低かった。
示差走査熱分析（ＤＳＣ）。ＣＨ２、ＣＨ２ ｍ０１、およびＣＨ２ ｍ０２の熱安定性を、ＶＰ-ＤＳＣ ＭｉｃｒｏＣａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ（ＭｉｃｒｏＣａｌ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いてさらにモニターした。３つのタンパク質の濃度は、ＰＢＳ （ｐＨ７．４）中、１．５ｍｇ／ｍｌであった。利用した加熱速度は１℃／分であり、２５℃から１００℃まで走査を行なった。
蛍光分光法。ＣＨ２、ｍ０１、およびｍ０２の固有の蛍光を、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ-３（ＨＯＲＩＢＡ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ，ＮＪ）で記録した。固有の蛍光の測定は、励起波長２８０ｎｍで、タンパク質濃度１０μｇ／ｍｌを用いて行ない、放出スペクトルは、２５℃で３２０ｎｍから３７０ｎｍまで記録した。０〜８ｍＭの尿素が存在する緩衝液Ａを用いた。全ての試料について、蛍光スペクトルを、溶液のバックグラウンド蛍光（緩衝液＋変性剤）に対して補正した。３４０ｎｍでの蛍光強度をアンフォールディングの評価に用いた。
核磁気共鳴（ＮＭＲ）。ＮＭＲ実験のために、大腸菌をまず２×ＹＴで増殖させた。単一コロニーを３ｍＬの２×ＹＴに約３時間植菌した後、濁度をチェックし、ＯＤ６００が約０．８〜０．９に達するまで３７℃でさらに増殖させるために、細菌を１リットルの２×ＹＴ培地に移した。その後、この細胞培養物を遠心分離して、２×ＹＴ培地を除去し、１５Ｎ ＮＨ４Ｃｌと１３Ｃグルコースを、それぞれ、唯一の１５Ｎと１３Ｃの供給源として含むＭ９最小培地と交換した（１７）。これらの細胞を３０℃で一晩インキュベートし、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。収穫した細胞をＴＥＳ緩衝液（１Ｌの培養物に対して１０ｍＬの緩衝液）に氷上で１時間懸濁した。１．５容量のＴＥＳ／５を氷上で４時間添加することによって、ペリプラズムタンパク質を放出させるための浸透圧ショックを誘導した。その後、上清を透析緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）中、４℃で一晩透析した。タンパク質を初期精製のために上記の方法で精製した。その後、さらなる精製のために、多量のタンパク質を含む画分をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ-２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＪ）に充填した。分離した画分試料を緩衝液Ａ中に回収した。
ＮＭＲ実験は、９５％Ｈ２Ｏ／５％Ｄ２Ｏ中に６４ｍＭ ＮａＣｌを含有する４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．８）中で行ない、試料容量は、５-ｍｍ Ｓｈｉｇｅｍｉチューブ（Ｓｈｉｇｅｍｉ Ｉｎｃ，ＰＡ）中に約３００μｌ、タンパク質濃度は、２５℃で０．５〜０．８ｍＭとした。ＮＭＲ実験は、低温プローブ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＭＡ）を備えたＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ６００ ＭＨｚ機器を用いて実施した。アミドのプロトンと水のプロトンの間の交換を最小限に抑えるために、ウォーター・フリップバック法（Ｗａｔｅｒ-ｆｌｉｐ ｂａｃｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を１Ｈ-１５Ｎ ＨＳＱＣ実験と｛１Ｈ｝-１５Ｎ ＮＯＥ実験に用いた（ＧｒｚｅｓｉｅｋおよびＢａｘ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：１２５９３，１９９４）。１Ｈ-１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルは、スペクトル幅８０１２Ｈｚの取得次元については１０２４複合ポイントで、間接（ｔ１）次元については２５６複合ポイントで記録した。｛１Ｈ｝-１５Ｎ ＮＯＥ実験は、それぞれ３秒と４秒の繰り返し遅延時間のプロトン飽和の存在下と非存在下で、２組のスペクトルを記録することにより、同様の数のポイントで実施した（ＧｏｎｇおよびＩｓｈｉｍａ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ ３７：１４７-１５７，２００７）。ＮＯＥ値の不確定要素は、２つのスペクトルの平均二乗偏差（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）ノイズとピーク高さから推定した。
シグナル帰属は、ＣＨ２ドメインについては、ＨＮＣＡ実験、ＣＢＣＡＣＯＮＨ実験、ＣＣＯＮＨ実験に基づいて、ＣＨ２ ｍ０１ドメインについては、ＨＮＣＡＣＢ実験とＣＢＣＡＣＯＮＨ実験と１３Ｃ、１５Ｎ同時進化ＮＯＥＳＹ実験に基づいて行なった（Ｋａｙら，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．８９：４９６-５１４，１９９０；ＭｕｈａｎｄｉｒａｍおよびＫａｙ，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓ．Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ．１０３：２０３-２１６，１９９４）。ＮＭＲデータは、ｎｍｒＰｉｐｅ（Ｄｅｌａｇｌｉｏら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ ６：２７７-２９３，１９９５；ＭａｓｓｅおよびＫｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．１７４：１３３-１５１，２００５）を用いて処理および解析した。ＣＨ２骨格構造上の化学シフト変化の重要度を着色するために、正規化された化学シフト変化である
と、その平均値と、標準偏差（ｓ．ｄ．）とを計算した。これは４つのクラスに分類される：δｎｏｒｍ＞３．０（赤）、３．０＞δｎｏｒｍ＞２．０（オレンジ）、２．０＞δｎｏｒｍ＞１．０（黄）、および（４）δｎｏｒｍ＜１（青）。
結果
単離された、グリコシル化されていないヒトγ１ ＣＨ２ドメインは比較的安定である。ヒトγ１重鎖ＣＨ２（図５Ａ）を、上記のように細菌発現ベクターにクローニングし、発現させ、精製した。ヒトγ１ ＣＨ２は可溶性タンパク質として高レベルで発現し（細菌培養物１リットル当たり１０ｍｇを上回る）、高度に可溶性である（１０ｍｇ／ｍｌを上回る）。サイズ排除クロマトグラフィーで決定されるように、これは、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で単量体である（図５Ｂ）（Ｐｒａｂａｋａｒａｎら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｂ．６４：１０６２-１０６７，２００８）。ヒトγ１ ＣＨ２のＳＤＳ-ＰＡＧＥによって、約１４〜１５ｋＤａという見かけの分子量（ＭＷ）が明らかになったが、これは、計算したＭＷ（ＨｉｓタグとＦＬＡＧタグを含めて、１４．７ｋＤａ）に近似している。予想通り、これは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、およびＩｇＧ１のＭＷよりも遥かに小さい（図５Ｃ）。
これまでに、単離された、グリコシル化されていないマウスＣＨ２ドメインは、生理学的に意義のある温度（円二色性（ＣＤ）で測定した場合、Ｔｍ＝４１℃）で比較的不安定であることが分かっている（Ｆｅｉｇｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４４：１０７-１１８，２００４）。ヒトＣＨ２の配列はマウスＣＨ２の配列と異なっており、そのために異なる安定性を生じる可能性がある（図５Ａ）。ヒトγ１ ＣＨ２の熱力学的安定性を検討するために、ＣＤと示差走査熱分析（ＤＳＣ）の両方を用いた。ＣＤによって測定した場合、ＣＨ２の二次構造は、２５℃ではβ鎖からなっていた。ＣＨ２のアンフォールディングは、約４２℃から始まって約６２℃で終わり（図６Ａ）、算出されたＴｍは５４．１±１．２℃であった（図６Ａ）。アンフォールディングは可逆的であった（図６Ａ）。同様の結果がＤＳＣで得られた（Ｔｍ＝５５．４℃、図６Ｂ）。したがって、ヒトγ１ ＣＨ２は、そのマウス対応物よりも顕著に安定である。
追加のジスルフィド結合を有する改変ヒトγ１ ＣＨ２ドメインの設計と作製。ヒトＣＨ２の安定性をさらに改善するために、追加のジスルフィド結合をＮ末端の鎖ＡとＣ末端の鎖Ｇの間に作製した。これら２つの鎖の自由度を制約すれば、アンフォールディングの程度を減少させることができるであろうと推論された。これらの突然変異体は、当初、インタクトなＦｃのＣＨ２の結晶構造をベースにして設計された。このインタクトなＦｃのＣＨ２の結晶構造は、いくつかのループ中および末端に特定の相違が存在するものの、最近報告された単離されたＣＨ２の結晶構造と非常によく似ている（Ｐｒａｂａｋａｒａｎら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｂ．６４：１０６２-１０６７，２００８）。既知の構造を有するタンパク質中の２つのＣα炭素間の距離（Ｄａｎｉら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：１８７-１９３，２００３；ＰｅｌｌｅｑｕｅｒおよびＣｈｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ６５：１９２-２０２，２００６）とこれらの結合の配向に基づいて、Ｃｙｓに置換された５つのアミノ酸対：Ｖ１０／Ｅ１０３、Ｆ１１／Ｋ１０４、Ｌ１２／Ｔ１０５、Ｌ１２／Ｋ１０４、およびＶ１０／Ｋ１０４（付番は、γ１重鎖の番号２３１に対応する、１：Ａｌａから始まる）（図５Ａ；配列番号５）が選択された。それぞれ、ｍ０１およびｍ０２と命名された、２つの突然変異体（Ｌ１２／Ｋ１０４からＣ１２／Ｃ１０４への突然変異体、Ｌ１２のＣαとＫ１０４のＣαとの間の距離＝６．５３Å、およびＶ１０／Ｋ１０４からＣ１０／Ｃ１０４への突然変異体、Ｖ１０のＣαとＫ１０４のＣαとの間の距離＝７．２５Å）（図７）は、高度に可溶性であり、ＣＨ２と同等かまたはＣＨ２よりも高いレベルで発現した（図８）。
追加のジスルフィド結合の存在を質量分析で確認した。予期通り、ＣＨ２のジスルフィド結合の数は１つ、突然変異体ｍ０１とｍ０２のＣＨ２のジスルフィド結合の数は２つであった（表７）。これらの突然変異体をさらなる特性解析用に選択した。
ｍ０１とｍ０２はＣＨ２よりも著しく安定である。ｍ０１とｍ０２とＣＨ２の熱力学的安定性をＣＤとＤＳＣで測定し、化学作用物質に対するそれらの安定性を、尿素と蛍光分光法を用いて測定した。全ての場合において、２つの突然変異体は、ＣＨ２よりも遥かに安定であった（図９）。ＣＨ２、ｍ０１、およびｍ０２のＣＤスペクトルから、これらが２５℃で高いβ−シート含有量を有することが示された（図９Ａおよび図９Ｂ）。温度が上昇するにつれて、β−シート構造は徐々に破壊された（図９Ｃ）。９０℃で、この構造はアンフォールディングした状態となった（図９Ａおよび図９Ｂ）。以前にも報告された通りに、シグモイド曲線を２状態モデルでフィッティングした（Ｆｅｉｇｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４４：１０７-１１８，２００４）。注目すべきことに、ｍ０１とｍ０２の５０％アンフォールディングは、天然のＣＨ２の５０％アンフォールディング（５４．１±１．２℃）よりも著しく高い温度（それぞれ、Ｔｍ＝７３．８±１．７℃と６５．３±０．６℃）で起こった（図９Ｃ）。ＣＨ２とｍ０１は可逆的にリフォールディングしたが、ｍ０２は一部しかリフォールディングしなかった（図９Ａおよび図６Ａを図９Ｂと比較されたい）。
同様の結果がＤＳＣで得られた。ｍ０１とｍ０２の融解温度は、天然のＣＨ２の融解温度よりも遥かに高く、それぞれ、約２０℃と約１０℃高かった（図９Ｄ）。興味深いことに、ｍ０２のアンフォールディングは、ＣＨ２とｍ０１のアンフォールディングよりも広範でかつピークが低かった。この現象は、ｍ０２中に二量体が存在することによって生じた可能性がある。
化学的に誘導されたｍ０１とｍ０２のアンフォールディングに対する安定性も、化学的に誘導されたＣＨ２のアンフォールディングに対する安定性より高かった（図９Ｅ）。尿素を化学作用物質として用いて、固有の蛍光スペクトルを測定した。尿素濃度に対するアンフォールディング依存度を２状態モデルでフィッティングすることもできる。ｍ０１とｍ０２の５０％アンフォールディングは、ＣＨ２の５０％アンフォールディング（４．２Ｍ）よりも高い尿素濃度（それぞれ、６．８Ｍと５．８Ｍ）で起こった。
ｍ０１については単量体画分のみが観察されたが、一方ｍ０２は、ＳＥＣで測定した場合、大部分は二量体の、少量の高分子種を含んでいた（図１０）。その優れた特性が理由で、ｍ０１をさらなる特性解析に選択した。最初の７つのＮ末端残基（配列番号５の残基１〜残基７）が欠失している切断されたＣＨ２（ＣＨ２ｓ）と切断されたｍ０１（ｍ０１ｓ）の安定性も検討した。これらの切断されたタンパク質は高い安定性を示した。ＣＤによって測定された５０％アンフォールディング温度（Ｔｍ）（それぞれ、６２℃と７９℃）は、対応するＣＨ２とｍ０１の５０％アンフォールディング温度（それぞれ、５４℃と７４℃）よりも著しく高い（それぞれ、８℃と５℃高い）（図１０Ｂ）。
ｍ０１の構造保存。システインの突然変異によって引き起こされる構造摂動を調べるために、ＣＨ２ドメインとｍ０１突然変異体について溶液ＮＭＲ実験を行なった。１Ｈ-１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルは、一般に、窒素原子と窒素原子が直接結合しているプロトンの相関を示し、タンパク質骨格の「指紋」を提供する。ＣＨ２とｍ０１の各々の１Ｈ-１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（同一の実験条件で記録される）は１組のピークのみを示し、タンパク質が溶液中で十分にフォールディングしていることを示した。タンパク質の構造領域の中で、骨格の１５ＮとＣ’とＣaの化学シフトを、両方のタンパク質において約７５％帰属させた。ｍ０１において、残基Ｃｙｓ１２のＣaとＣbについて測定された化学シフトは、それぞれ、５７．６ｐｐｍと３７．７ｐｐｍであったのに対し、Ｃｙｓ１０４のＣaとＣbの化学シフトは、それぞれ、３４．２ｐｐｍと５４．５ｐｐｍであった。これらの値は、酸化されたシステイン残基について予想される範囲内に収まっており（ＳｈａｒｍａおよびＲａｊａｒａｔｈｎａｍ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ １８：１６５-１７１，２０００）、追加のジスルフィド架橋がｍ０１突然変異体で形成されることを示している。
ＮとＣaの全体的な骨格の化学シフトの比較は、ＣＨ２とｍ０１の間のタンパク質構造の全体的な類似性も示した。しかしながら、化学シフトの変化は、残基Ｃｙｓ３１と残基Ｃｙｓ９１の周辺、および新たに導入されたＣｙｓ残基１２とＣｙｓ残基１０４の周辺で観察された。これは、新たに導入されたジスルフィド架橋が、同じβ-シート中の隣接するβ鎖を天然のＣｙｓ３１-Ｃｙｓ９１架橋と連結することによって、このＣｙｓ３１-Ｃｙｓ９１の近位に位置するので、予想外というわけではなかった。ＣＨ２ ｍ０１の新たに導入されたジスルフィド結合は、Ｃｙｓ３１とＣｙｓ９１の間の天然のジスルフィド結合の微視的環境に影響を及ぼす可能性が最も高い。
ＣＨ２とｍ０１の比較的高いループ柔軟性と柔軟性のないフレームワーク。ループがＣＨ２とｍ０１の両方で柔軟性があるかどうかを明らかにするために、１５Ｎ-｛１Ｈ｝ＮＯＥを記録した。（０．７を上回る）高いＮＯＥ値で示されるように、フレームワークには柔軟性がないことが明らかにされた。対照的に、ループには、平均的により柔軟性があった。ＣＨ２とｍ０１の局所力学は同程度であり、天然の状態のｍ０１の立体構造エントロピーは、ＣＨ２の立体構造エントロピーと非常によく似ているということを示した。システイン突然変異の導入によって、ＣＨ２ドメインの必須の構造と力学は維持されるが、熱安定性は増大する可能性が最も高い。ループの柔軟性の増大は、ＣＨ２とｍ０１の両方を、ループ中の残基に移入するかまたはループ中の残基を突然変異させるためのスキャフォールドとして使用することができるということも示している。
実施例４：ＨＩＶに特異的なＣＨ２ドメイン分子
この実施例では、ＨＩＶエンベロープに特異的に結合するＣＨ２分子を同定するための、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインのループに基づいた、合成ファージライブラリーの構築を記載する。
材料および方法
プライマー、ペプチド、およびタンパク質。本研究で使用されるプライマーは全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。ビオチン標識ペプチドは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製であった。Ｂａｌ ｇｐ１２０-ＣＤ４は、Ｔｉｍ Ｆｏｕｔｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から快く提供されたものであり、他のｇｐ１２０／１４０は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｂｒｏｄｅｒ（ＵＳＵＨＳ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から提供されたものである。ＳＣＤ４は、ＡＩＤＳ研究および試薬プログラムを通じて入手した。
ライブラリーの構築。重複ＰＣＲを用いて、ループ１とループ３に突然変異を導入し、最初のＣＨ２ベースのライブラリーを作製した。
とループ１プライマーＣＡＣ ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＴＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＣＡ ＴＧＴ ＧＡＣ（配列番号７）を用いて、ループ１に突然変異を含むＣＨ２のＮ末端半分を作製した。ループ１連結プライマーＡＡＧ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＧＴＧ（配列番号８）とループ３プライマーＧＡＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＴＣ ＧＡＴ ＧＧＧ ＧＣＣ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＡＫＭ ＧＴＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＴＴ ＧＣＡ ＣＴＴ Ｇ（配列番号９）を用いて、ループ３に突然変異を有するＣＨ２の残り部分を作製した。その後、２つの断片を重複ＰＣＲ工程によって組み合わせ、Ｎ末端プライマーと、ＣＨ２断片の両末端に導入されることになるＳｆｉＩ部位（下線）を有する
を用いて増幅した。第１のライブラリーから単離されたバインダーに基づいて第２のライブラリーを作製するために、ループ２プライマーＧＣＴ ＧＡＣ ＣＡＣ ＡＣＧ ＧＴＡ ＡＤＨ ＡＤＨ ＡＤＨ ＧＴＡ ＣＴＧ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＣＧ（配列番号１０３）と上記のＮ末端プライマーを用いて、ループ２に対する突然変異を第１のバインダーに導入した。ループ２連結プライマーＴＡＣ ＣＧＴ ＧＴＧ ＧＴＣ ＡＧＣ（配列番号１０４）とループ３プライマー（２） ＧＧＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＴＣ ＧＡＴ ＧＧＧ ＡＤＨ ＴＧＧ ＡＤＨ ＡＤＨ ＡＤＨ ＧＴＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＴＴ ＧＣＡ（配列番号１０５）を用いて、第１のバインダーに突然変異を導入した。２つの断片を重複ＰＣＲ工程によって接続し、増幅用の上記の同じＮ末端プライマーとＣ末端プライマーの対を用いて増幅した。ＰＣＲ断片をＳｆｉＩで消化し、ベクターにライゲートした。そのライゲート産物を脱塩し、エレクトロポレーター（Ｂｉｏ-Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてエレクトロコンピテントＴＧ１細胞に形質転換した。得られた形質転換体からファージライブラリーを調製した。
パニング。プレートフォーマットによるパニングのために、Ｂａｌ ｇｐ１２０-ＣＤ４と、Ｂａｌ ｇｐ１２０と、ＢＳＡとを、ＰＢＳ緩衝液中、４℃で一晩、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にコーティングした。それぞれのＣＨ２ライブラリーの約１０１３個のファージ粒子を、２％の粉ミルクを含むＰＢＳに懸濁し、これらのタンパク質でコーティングしたウェルに加えた。室温で２時間後、各々のウェルを、第１のラウンドについては５回、次のラウンドについては１０回洗浄した後に、指数関数的増殖期のＴＧ１細胞を用いてファージをレスキューした。第１のライブラリーのために、各々の抗原について合計５回のパニングを行なった。第１のバインダーに基づいた第２のライブラリーについては、３回のパニングを行なった。その後、モノクローナルＥＬＩＳＡを用いて、陽性クローンを選択した。各々の抗原について２００個のクローンをスクリーニングした。モノクローナルＥＬＩＳＡで２．０より高いＯＤ４０５を示すクローンのみを、プラスミドの調製と配列決定用に選択した。
ＣＨ２の発現とリフォールディング。上記のように選択されたクローンを、発現用の大腸菌株ＨＢ２１５１に形質転換した。簡潔に述べると、単一クローンを、１００ユニットのａｍｐを補充した２×ＹＴに植菌し、振盪しながら３７℃でインキュベートした。ＯＤ６００が０．５に達したとき、ＩＰＴＧを添加して１ｍＭの最終濃度を達成し、振盪しながらさらに３〜５時間、培養を続けた。次いで、細胞を回収し、ＰＢＳ中でポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）を用いて溶解させ、ＣＨ２クローンの可溶性部分を得るために、上清をＮｉ-ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。次いで、ペレットを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６Ｍ 尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液に再懸濁し、短時間超音波処理した。上清を遠心分離で回収し、Ｎｉ-ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ペレットから得られたＣＨ２を、ＰＢＳを２回交換する透析に一晩かけ、その後、０．２μｍの低タンパク質結合フィルター（Ｐａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）に通して濾過した。
ＥＬＩＳＡ。異なるタンパク質抗原を、１〜４μｇ／ｍｌの濃度範囲でＰＢＳ緩衝液に希釈し、９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングした。その後、プレートをＰＢＳ＋５％粉ミルク緩衝液でブロッキングした。異なる濃度のＣＨ２クローンを同じブロッキング緩衝液に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。別途指示されない限り、ほとんどのＥＬＩＳＡで、マウス抗Ｈｉｓ-ＨＲＰを用いて、各々のＣＨ２クローンのＣ末端のＨｉｓタグを検出した。その後、ＡＢＴＳを各ウェルに添加し、５〜１０分後にＯＤ４０５を取得した。
ゲル濾過解析。精製濾過されたＣＨ２タンパク質の試料を、ＰＢＳで事前に平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で解析した。カラムは分子量標準を用いて較正した。０．５ｍｌ／分の流速でＣＨ２試料をカラムから溶出させた。
シュードウイルス中和アッセイ。ＨＩＶ Ｅｎｖでシュードタイピングしたウイルスの調製と中和は、本質的に以前に記載された通りに行なった（Ｃｈｏｕｄｈｒｙら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３６３：７９-９０，２００７）。
結果
ヒトＣＨ２ベースのライブラリーの設計と構築。ＣＨ２ループの限定された突然変異誘発は、多くの突然変異体のフォールディングと安定性にそれほど影響を与えることはなく、潜在的なバインダーの大きなライブラリーを作製するために使用し得るという仮説を立てた。ループ１（Ｌ１）とループ３（Ｌ３）は、分子の同じ側にある最も長い（それぞれ、９残基と５残基）２つのループであるので、まず、これらの突然変異誘発に着手した（本明細書では、ループＢＣ、ループＤＥ、およびループＦＧを、それぞれ、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と呼び、２つのヘリックスＡＢおよびＥＦを、それぞれ、Ｈ１およびＨ２と呼び、ループＣＤをＬ０と呼ぶ）（図１１）（Ｒａｄａｅｖら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１６４６９-１６４７７，２００１）。Ｌ１残基とＬ３残基の全てをランダムに置換するために、および１つの追加の残基を付加するために、ＣＤＲ中に頻繁に現れる４つの残基（Ａ、Ｙ、Ｄ、およびＳ）を選択した。柔軟性を増大させるために、さらなる残基（Ｇ）を各々のループのＣ末端にも付加した（図１１）。これら４つの残基（２つだけのこともある）は、異なるフレームワーク中で特異的結合表面を構築するのに十分であることがこれまでに観察されている（Ｆｅｌｌｏｕｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１２４６７-１２４７２，２００４；Ｋｏｉｄｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４：６６３２-６６３７，２００７）。このライブラリーの計算上の理論的多様性は、４１６＝４．３×１０９である。しかしながら、ＰＣＲによって生成される潜在的な突然変異（下記参照）のために、多様性は、ライブラリーのサイズ（５×１０１０）にまで著しくより高いものとなる可能性が高い。１００個のランダムに選択されたクローンの解析によって示されるように、大半の突然変異体（おそらく８０％超）は、正確なリーディングフレームを有する。
バインダーの同定と配列解析。ライブラリーを検討して、有用な可能性のあるバインダーを選択するために、２ドメインのＣＤ４と融合した、Ｂａｌ分離株由来のＨＩＶ-１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０（ｇｐ１２０Ｂａｌ-ＣＤ４と表記する）を抗原として用いた。５回のパニングの後、２００個のクローンをファージＥＬＩＳＡでスクリーニングし、最も高いシグナルを有する１５個のクローンをさらなる特性解析のために単離した。３個のクローン、ｍ１ａ１、ｍ１ａ２、およびｍ１ａ３は、それぞれ、（１５個のうち）７個、５個、および２個の配列によって独占、代表され、特異的な濃縮を示唆した。これらのクローンは、よく似たＬ１配列を有しており、大部分がＤとＹから構成されているが、これらのＬ３は非常に異なっている。最も多いクローンであるｍ１ａ１とｍ１ａ２は、明らかにＰＣＲエラーが原因で、Ｌ１にいくつかの改変を有している（それぞれ、Ｌ１における２つのＦと、Ｇの前の欠失）。Ｂａｌ ｇｐ１２０-ＣＤ４に対して選択されたこれらのクローンのループ１配列とループ３配列を下記の表８に示す。これらの結果は、ＣＨ２ベースのスキャフォールドが、さまざまに異なるＬ１とＬ３を有するファージディスプレイされたバインダーを支持することができることを示唆する。新たに同定されたＨＩＶ−１特異的バインダーは、下記のようにさらに特性解析した。
可溶性ｎＡｂの発現とｎＡｂの結合性の特性解析。発現したＣＨ２ドメイン分子（「ｎＡｂ」と呼ぶ）の大部分は、封入体中に見出され（図１２Ａ）、上記のようにリフォールディングされて、１Ｌの細菌培養物当たり、平均して１０〜３０ｍｇ得られた。ＥＬＩＳＡで測定した場合、精製ｎＡｂは、パニング抗原（ｇｐ１２０-ＣＤ４）に特異的に結合し、ＥＣ５０は、５００ｎＭ（ｍ１ａ１とｍ１ａ２）から低いμＭ（ｍ１ａ３）の範囲であった（図１２Ｂ）。同様の結果が、上清から精製されたｎＡｂについて得られた。これらの結果から、ｍ１ａ１、ｍ１ａ２、およびｍ１ａ３が、可溶性（ファージディスプレイされない）形態でその結合活性を保持すること、および封入体からのリフォールディングがこれらの分子に影響を及ぼさないことが示唆される。最も高い親和性を有する２つのクローンであるｍ１ａ１とｍ１ａ２を、さらなる特性解析用に選択した。
交差反応性を検討するために、４つ（Ｂａｌ、ＪＲＦＬ、Ｒ２、および８９．６）の組換えＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質を、単独でおよび可溶性ＣＤ４と複合させて用いた。図１４に示すように、ｍ１ａ１は全てのタンパク質にさまざまな程度で結合する。ＣＤ４誘導性（ＣＤ４ｉ）抗体について予想されるように、ｍ１ａ１は、ＣＤ４と複合したＢａｌ ｇｐ１２０に結合するが、ｇｐ１２０のみには非常に弱く結合し、他のタンパク質に対するその結合はＣＤ４の存在によってそれほど影響を受けなかった。Ｅｎｖのみに対するシグナルの減少は大きくなく、これは、ｓＣＤ４と混合したときにｇｐ１２０によるコーティングがわずかに低下することによる可能性がある。同様の結果がｍ１ａ２について得られた。これらのデータから、これらの抗体によって認識されるエピトープが、１つの分離株（Ｂａｌ）についてはＣＤ４ｉであるが、他の分離株についてはそうでないということが示唆される。
これらのエピトープをさらに特性解析するために、既知のＣＤ４ｉ抗体（ｓｃＦｖ Ｘ５とドメイン抗体ｍ３６）によるｍ１ａ１競合を検討した。両方のＣＤ４ｉ抗体は、ｍ１ａ１と著しく競合した。それゆえに、ｍ１ａ１は、他の極めて強力な交差反応性ＣＤ４ｉ抗体によって共有される新規の保存されたエピトープを認識するが、それらの抗体とは対照的に、ｇｐ１２０のＣＤ４との相互作用によるエピトープの露出は分離株に著しく依存する。
ループ１は結合特異性を決定する。特異的結合に対するＣＨ２クローン由来のループの異なる寄与を明らかにするために、２つのハイブリッドクローン：ｍ１ａ１ＣＨ２とｍ１ａ２ＣＨ２を作製した。ｍ１ａ１とｍ１ａ２に由来するＬ１をＣＨ２に移入し、もとのＬ１を置換した。ＥＬＩＳＡで測定した場合、これらのハイブリッド抗体は、ｍ１ａ１と比較してほとんど同じであるが、わずかに低い親和性でｇｐ１２０-ＣＤ４に結合し（図１３Ａ）、Ｌ３が結合に必須ではないことを示した。スキャフォールドが全体として結合に必要であるかどうかを解明するために、ｍ１ａ１ Ｌ１を、合成ペプチド（ＤＹＤＹＤＳＹＦＤＦＧ；配列番号１０９）として、単独で検討した。ビオチン標識ペプチドは結合しなかった。鎖Ａと鎖Ｇの間にさらなるジスルフィド結合を作り出すことによって、結合に対するスキャフォールドの比較的小さい立体構造変化の効果も検討した。実施例３に記載されているように、ＮＭＲで測定した場合、このようなＳ-Ｓ結合は、ＣＨ２安定性を著しく増大させるが、任意のＣＨ２残基の可動性と微小環境にはそれほど影響を与えない。得られた抗体ｍ１ａ１ｓｓはどちらにも結合しなかった（図１３Ｂ）。これらのデータから、スキャフォールドがｍ１ａ１の結合活性に必要であることと、Ｌ３の変化は活性に影響を与えない可能性があるが、スキャフォールド立体構造の比較的小さい変化は活性を消失させ得ることが示唆される。
ｍ１ａ１とｍ１ａ２によるＨＩＶ-１シュードウイルスの中和。ｍ１ａ１とｍ１ａ２の中和活性を評価するために、細胞株／シュードウイルスアッセイと９つのＨＩＶ-１分離株のパネルを用いた。これらの分離株のうちの７つは、一方または両方の抗体によってある程度まで阻害された（図１４Ａ）。この２つの抗体は、２つの分離株（８９．６とＩＩＩＢ）を示差的に阻害し、また、５つの他の分離株をほぼ同じ程度まで阻害した（図１４Ａ）。それらの比較的低い結合親和性から予想される通り、これらの抗体の効力は、陽性対照としてここで用いた極めて強力な阻害因子Ｃ３４と比較して比較的低かった。これらの結果は、ＣＨ２スキャフォールドに基づいたライブラリーから機能的バインダーを選択することができるという概念の証拠を提供している。
これらの抗体を第２ループと第３ループの突然変異誘発によってさらに改善した（図１５）。これらは、主に単量体となってＳＤＳゲル上を移動した（図１６Ａ）。これらの突然変異体のうちの１つであるｍ１ｂ３は、ゲル濾過で主に単量体であった（図１６Ｂ）。これらは、ＨＩＶ−１に特異的に結合し（図１６Ｃ）、ＨＩＶ−１をさまざまな程度に中和した（図１７）。また、これらはｓｃＦｖ Ｘ５およびｍ３６と競合し、ＨＩＶ-１ ｇｐ１２０の高度に保存された領域を標的とすることを示唆している（図１８）。
本開示は、少なくとも１つの突然変異、または少なくとも１つのＣＤＲ、もしくはその機能性断片を含む抗体定常ドメイン分子を提供する。本開示はさらに、これらの抗体定常ドメイン分子を含む組成物およびその使用法を提供する。記載される方法の正確な詳細は、記載される本発明の精神から逸脱することなく、変更または修正され得ることは明白であろう。本発明者らは、以下の特許請求の範囲の範囲内および精神の範囲内に収まるそのような修正および変更の全てを特許請求する。

Claims (42)

  1. ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、またはＩｇＥもしくはＩｇＭの免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであって、前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがＮ末端のＡ鎖中にある第１のアミノ酸置換と、Ｃ末端のＧ鎖中にある第２のアミノ酸置換とを含み、前記第１のアミノ酸置換および前記第２のアミノ酸置換が各々、もとの残基をシステイン残基で置換し、前記システイン残基がジスルフィド結合を形成し、前記ポリペプチドが１５ｋＤ未満の分子量を有する、ポリペプチド。
  2. （ｉ）前記ＣＨ２ドメインのループの少なくとも１つが突然変異させられているか、（ｉｉ）前記ＣＨ２ドメインのループ領域の少なくとも一部が異種免疫グロブリン可変ドメイン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）、もしくはその機能性断片に置換されているか、または（ｉｉｉ）その両方であり、かつ前記突然変異、および／または、ＣＤＲもしくはその機能性断片が、前記ポリペプチドが抗原に特異的に結合することを可能にする、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記ポリペプチドがＩｇＧ由来のＣＨ２ドメインを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
  4. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループ１が突然変異させられている、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
  5. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループ２が突然変異させられている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループ３が突然変異させられている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループＡ-Ｂが突然変異させられてい
    る、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループＣ-Ｄが突然変異させられてい
    る、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのループＥ-Ｆが突然変異させられてい
    る、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. ループＡ-ＢがＣＤＲに置換されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペ
    プチド。
  11. ループＥ-ＦがＣＤＲに置換されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリ
    ペプチド。
  12. 前記ＣＤＲがＣＤＲ３である、請求項１０または請求項１１に記載のポリペプチド。
  13. １２ｋＤ〜１４ｋＤの分子量を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが７アミノ酸のＮ末端切断を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが１〜４アミノ酸のＣ末端切断をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがグリコシル化されていない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがグリコシル化されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  18. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがＦｃ受容体に結合することができる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  19. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが補体タンパク質に結合することができる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. 前記補体タンパク質がＣ１ｑである、請求項１９に記載のポリペプチド。
  21. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが新生児型Ｆｃ受容体に結合することができる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  22. 前記抗原が病原体由来のものである、請求項２〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 前記病原体がウイルスまたは細菌である、請求項２２に記載のポリペプチド。
  24. 前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項２３に記載のポリペプチド。
  25. 前記抗原が癌特異的抗原または癌関連タンパク質である、請求項２〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  26. 前記癌が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、悪性メラノーマ、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、または腎細胞癌である、請求項２５に記載のポリペプチド。
  27. 前記抗原が自己免疫障害または炎症性障害と関連する、請求項２〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  28. 請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
  29. 請求項２８に記載の核酸分子を含むベクター。
  30. 請求項２９に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
  31. 請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
  32. エフェクター分子または検出可能標識にコンジュゲートされた請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
  33. 前記第１のアミノ酸置換がＬ１２からＣ１２へのものであり、前記第２のアミノ酸置換がＫ１０４からＣ１０４へのものである（付番は配列番号５に対するものである）、請求項１に記載のポリペプチド。
  34. 前記第１のアミノ酸置換がＶ１０からＣ１０へのものであり、前記第２のアミノ酸置換がＫ１０４からＣ１０４へのものである（付番は配列番号５に対するものである）、請求項１に記載のポリペプチド。
  35. ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、またはＩｇＥもしくはＩｇＭのＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであって、前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインが７アミノ酸のＮ末端切断を含み、前記ポリペプチドが１５ｋＤ未満の分子量を有する、ポリペプチド。
  36. （ｉ）前記ＣＨ２ドメインもしくは前記ＣＨ３ドメインのループの少なくとも１つが突然変異させられているか、（ｉｉ）前記ＣＨ２ドメインもしくは前記ＣＨ３ドメインのループ領域の少なくとも一部が異種免疫グロブリン可変ドメイン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）、もしくはその機能性断片に置換されているか、または（ｉｉｉ）その両方であり、かつ前記ポリペプチドが抗原に特異的に結合する、請求項３５に記載のポリペプチド。
  37. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがグリコシル化されていない、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  38. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインがグリコシル化されている、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  39. 組換えのＣＨ２ドメインまたは組換えのＣＨ３ドメインのライブラリーを作製する方法であって、（ｉ）ＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのスキャフォールドの１つ以上のループ領域に突然変異を導入する工程、あるいは（ｉｉ）前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのスキャフォールドのループ領域の一部を異種免疫グロブリン可変ドメイン由来のＣＤＲもしくはその機能性断片と置換する工程、あるいは（ｉｉｉ）その両方の工程を含み、前記スキャフォールドがＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤの単離された免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、またはＩｇＥもしくはＩｇＭの単離された免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含み、前記ＣＨ２ドメインもしくは前記ＣＨ３ドメインのスキャフォールドがＮ末端のＡ鎖中にある第１のアミノ酸置換とＣ末端のＧ鎖中にある第２のアミノ酸置換とを含み、前記第１のアミノ酸置換と前記第２のアミノ酸置換が各々、もとの残基をシステイン残基で置換し、前記システイン残基がジスルフィド結合を形成する、方法。
  40. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのスキャフォールドが１〜７アミノ酸のＮ末端切断をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ＣＨ２ドメインまたは前記ＣＨ３ドメインのスキャフォールドが１〜４アミノ酸のＣ末端切断をさらに含む、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
  42. 標的抗原に特異的に結合する組換えのＣＨ２ドメインまたは組換えのＣＨ３ドメインを同定する方法であって、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法によって産生されたライブラリーを前記標的抗原と接触させ、前記標的抗原に特異的に結合する組換えのＣＨ２ドメインまたは組換えのＣＨ３ドメインを選択する工程を含む方法。
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