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Description

従来の抗体は、少なくとも4のポリペプチドを含む大きな複数のサブユニットタンパク質分子である。例えば、ヒトIgGは、機能的な抗体を形成するためにジシルフィド結合により結合されている2の重鎖及び2の軽鎖を有している。従来のIgGのサイズは、約150kDである。完全な抗体(例えば、IgG、IgA、IgM等)は、サイズが相対的に大きいことから、例えば、組織浸透性等の観点から、疾病治療における用途が限られていた。したがって抗原結合機能及び溶解性を保持したより小さい抗体フラグメントの同定及び生産に焦点を絞った試みがなされてきた。
抗体の重鎖及び軽鎖ポリペプチド鎖は、直接的に抗原相互作用に関与する可変領域(V)と、構造支持及び免疫エフェクターによる非抗原特異相互作用における機能を提供する定常領域(C)を含む。従来の抗体のこの抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL：これはVK又はVλのいずれであってもよい)の、2の分離したドメインからなる。抗体結合部位は3のVHドメイン(H1、H2及びH3)及び3のVLドメイン(L1、L2及びL3)により構成される6のポリペプチドループを有する。VH及びVLドメインをコードするV遺伝子の多様な一次レパートリーは遺伝子断片を組み合わせる再編成により作製される。C領域は、軽鎖C領域(CL領域という)及び重鎖C領域(CH1、CH2及びCH3という)を含む。
自然発生する抗体が有する多くの小さい抗原結合フラグメントは、プロテアーゼ消化により生成できることが確認されている。これらは、例えば、「Fabフラグメント」(VL-CL-CH1-VH)、「Fab’フラグメント」(重鎖のヒンジ領域を有するFabフラグメント)及び「F(ab')2フラグメント(重鎖ヒンジ領域で結合するFab’の二量体)を含む。十分に小さな抗原結合フラグメントを生成するために用いられる組換え技術は、「一本鎖Fv(可変フラグメント)」又は合成ペプチドリンカーで結合されたVL及びVHを含む「scFv」と言われる。
自然発生抗体(例えばヒト及び他の動物における)の抗原結合単位は、一組のV領域(VL/VH)を含むことが知られているが、ラクダ科の動物は、軽鎖配列を有さず、高い特性を示し、かつ十分に機能する抗体を多く発現する。このラクダ科の動物において発現される重鎖抗体は、それらの定常領域を介して二量体化した単一重鎖のホモ二量体である。このようなラクダ科動物の重鎖抗体の各種ドメインは、VHHドメインといわれ、VH鎖フラグメントとして単離されたとき、高い特異性で抗原に結合する活性を有する (Hamers-Casterman et al., 1993, Nature 363:446-448及びGahroudi et al., 1997, FEBS Lett. 414: 521-526)。抗体結合部位のVHドメインは、例えば、免疫付与されたマウスの脾臓由来のゲノムDNAを増幅することにより作成されたげっ歯類のVH遺伝子ライブラリーにより同定することができ、大腸菌で発現することができる(Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546)。ワード(Ward)等は、単離された単一VHドメインを「ドメイン抗体」として、「dAb」と称した。「dAb」の語は、本明細書では、特異的に抗原に結合する単一可変ドメイン(VH又はVL)ポリペプチドの抗体を意味する。「dAb」は、他のVドメインとは独立して抗原に結合する。本明細書で用いる「dAb」は、他のVH又はVLドメインと共にこれらのホモ-あるいはヘテロ複合体中に存在するが、「dAb」以外の他のドメインは、dAbの抗原結合には必要ではない、すなわち、dAbは、付加的なVH又はVLドメインとは独立して抗原に結合する。
抗体単一可変ドメイン、例えば、VHHは最小の抗原結合抗体単位として知られている。これを治療に用いることに関しては、患者に投与したときに免疫反応を引き起こすことがないことから、ヒト抗体であることが好ましい。上で記載したように、単離された非ラクダ科VHドメインは、溶けにくく、発現が乏しくなる傾向がある。ラクダ科のVHHとヒト抗体のVHを比較すると、ヒトVHドメインのVH/VLインターフェイスに対応するラクダ科のVHHドメインのフレームワーク領域の中に重要な違いがあることが明らかになった。「ラクダ科された」ヒトVHドメインを生成する目的で、VHH配列に似た配列をつくるために、ヒトVH3残基の変異誘発(特に、Gly44→Glu、Leu45→Arg及びTrp47→Gly)を行った。この抗体は抗原結合活性は保持していたが(Davies & Riechmann, 1994, FEBS Lett. 339: 285-290)、発現及び溶解性については改善されていなかった (本明細書で用いる可変ドメインのアミノ酸番号は、Kabatナンバリングコンベンション(Kabat et al.,1991, Sequences of Immunological Interest,5h ed. U. S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)に一致させた) 。 WO 03/035694(Muyldermans)は、Trp103→Argの変異が、非ラクダ科抗体のVHドメインの溶解性を改善することを報告した。Davies ＆ Riechmann (1995, Biotechnology N.Y. 13: 475-479)は、のファージディスプレイ法によりラクダ科したヒトVHドメインのレパートリーの生産及100-400nMの幅の親和性でハプテンに結合するクローンの選択について報告したが、選択されたクローンのタンパク質抗原への結合力は弱かった。
WO 00/29004(Plaskin et al.) 及びReiter et al. (1999, J. Mol. Biol. 290: 685-698)は、非常に安定で、ナノモルの範囲で抗原タンパク質に対する親和性を示し、大腸菌内で発現することができるマウス抗体の単離VHドメインを開示した。WO 90/05144 (Winter et al.)は、19 nMの解離定数で試験用の抗原リゾザイムに結合するマウスVHドメイン抗体フラグメントを開示した。
WO 02/051870 (Entwistle et al.)は、117 nMの親和性を有し、ブルセラ(Brucella)抗原に特有のscFvに結合するVHドメイン及び抗-FLAG IgGに結合するVHドメインを含む試験用抗原に結合するヒトVH単一ドメイン抗体フラグメントを開示した。
Tanha et al. (2001, J. Biol. Chem. 276: 24774-24780)は、試験用抗原として用いた2のモノクローナル抗体に結合し、ミクロモルの幅の解離定数を有するラクダ化したヒトVHドメインの選択方法を開示した。
U.S. 6,090,382 (Salfeld et al.)は、10-8 M以下の親和性でヒトTNF-αに結合し、10-3sec-1以下のヒトTNFαの解離に対するオフレイト(off-rate)(Koff)を有し、標準的なL929細胞アッセイで、ヒトTNFα活性を中和する、ヒト抗体について述べている。
多くの抗体及びその誘導体は、診断及び治療に有効である一方で、理想的な抗体の薬理動態は、特定の用途において達成されないことがある。抗体分子の薬理動態を改善するために、本発明は、ポリマーに結合していて、安定性及び半減期が高い単一可変ドメインポリペプチドを提供する。ポリマー分子(例えば、ポリエチレングリコール；PEG)をタンパク質へ結合する技術は、確立されており、修飾されたタンパク質において薬理動態特性を調節できることが示されている。例えば、PEG修飾したタンパク質は、in vivoにおいて、循環器系での半減期、抗原性、溶解性及びタンパク質分解作用に対する耐性が変わることが示唆されている (Abuchowski et al., J.Biol. Chem. 1977, 252:3578、Nucci et al., Adv. Drug Delivery Reviews 1991, 6:133、Francis et al., Pharmaceutical Biotechnology Vol.3(Borchardt, R. T. ed.)及びStability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathway of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 pp235-263, Pleum, NY)。
タンパク質を部位特異的に、及び、ランダムにPEG修飾することは、本技術分野で知られている(例えば、Zalipsky及びLee、Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications 1992, pp 347-370, Plenum, NY; Goodson and Katre, 1990, Bio/Technology, 8:343; Hershfield et al., 1991, PNAS 88:7185)。より具体的には、抗体分子のランダムなPEG化(PEGylation)について、リジン残基とチオール誘導体によるPEG化が開示されている(Ling and Mattiasson, 1983, Immunol. Methods 59:327、Wilkinson et al., 1987,Immunol. Letters, 15: 17、Kitamura et al., 1991, Cancer Res. 51: 4310、Delgado et al., 1996 Br. J. Cancer, 73: 175及びPedley et al., 1994, Br.J Cancer, 70: 1126)。
発明の概要
本発明は、PEG等のポリマー部を結合させた、抗体単一可変ドメインポリペプチド(ドメイン抗体；dAb)は、in vivoにおいて長い半減期を有し、dAb活性又は結合活性を失うことなくタンパク質分耐性が増加するという発見に基づいてなされたものである。本発明は、PEG等の1以上のポリマー分子が結合している二量体、三量体、及び四量体を含むdAb分子の各種フォーマットを提供する。
一の態様において、本発明は、1以上の抗体単一可変ドメインポリペプチドを含むPEGに結合しているポリペプチドを含む。このポリペプチドは、少なくとも24kDの流体力学的サイズ、少なくとも1.3時間の半減期を有する。個々の可変ドメインは、抗原結合部位を有し、ポリペプチドの中の単一抗体可変ドメインとして、抗原に結合する。
更なる態様において、本発明は、1以上の抗体単一可変ドメインポリペプチドを含むPEGに結合しているポリペプチドを含む。このポリペプチドは、少なくとも200kDの流体学的サイズを有し、20から60kDaのトータルPEGサイズを有する。個々の可変ドメインは、抗原結合サイトを有し、ポリペプチドの中の単一抗体可変ドメインとして、抗原に結合する。
本発明は、少なくとも24kDの流体力学的サイズを有する抗体単一可変ドメインを含むPEGに結合している多量体を含む。この多量体において、総PEGサイズは、20から60kDaであり、各可変ドメインは、抗原結合部位を有し、ポリペプチドの中の単一抗体可変ドメインとして、抗原に結合する。
一の態様において、このPEGに結合したポリペプチドは、PEGに結合していない同じポリペプチドに対して少なくとも90％の活性を保持している。この活性は、PEGが結合しているポリペプチドとPEGが結合していないポリペプチドの標的リガンドに対する親和性を比較することにより測定する。
一の態様において、各可変ドメインは、ユニバーサルフレームワークを有する。
更なる態様において、このユニバーサルフレームワークは、DP47、DP45及びDP38からなる群より選択されるVHフレームワーク及び/又はDPK9であるVLフレームワークを含む。
本発明は、TNFαに対して特異的な抗原結合サイトを含むPEGに結合しているポリペプチドを含む。このポリペプチドは、1又は2の抗体可変ドメインを有し、個々の可変ドメインは、TNFα結合部位を有する。このポリペプチドは、少なくとも200 kDaの流体力学的サイズを有し、総PEGサイズは、20から60 kDaである。
一の態様において、このポリペプチドは、TNFαに特異性を有している。
一の態様において、このポリペプチドは、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。
一の態様において、このポリペプチドは、基準となる細胞アッセイによると500nMから50pMのND50でヒトTNFαを中和する。
一の態様において、このPEGが結合しているポリペプチドはユニバーサルフレームワークを含む。このユニバーサルフレームワークは、DP47、DP45及びDP38から成る群より選択されるVHフレームワーク及び/又はDPK9であるVLフレームワークを含む。
本発明は、少なくとも1.3時間の半減期を有するポリマーが結合した抗体単一可変ドメインを包含する。該ポリマーは、直接あるいは非直接的に抗体単一可変ドメインのシステイン又はリジン残基の位置で、抗体単一可変ドメインに結合している。
一の態様において、抗体単一可変ドメインに結合しているポリマーは、少なくとも24KDaの流体力学的サイズを有する。
一の態様において、システイン又はリジン残基は、抗体単一可変ドメインの所定の位置にある。
一の態様において、システイン又はリジン残基は、抗体単一可変ドメインのC末端にある。
一の態様において、このポリマーは、抗体単一可変ドメインのC末端及びN末端以外の位置にあるシステイン又はリジン残基に位置で、抗体単一可変ドメインと結合している。
一の態様において、このポリマーは、C-及び/又はN末端から少なくとも2の残基離れた位置にある、システイン又はリジン残基により抗体単一可変ドメインと結合している。
一の態様において、該ポリマーは、Gln13、Pro41、又はLeu115から成る群より選択される位置を置換するシステイン又はリジン残基を含む重鎖可変ドメインに結合している。
一の態様において、この抗体単一可変ドメインは、C末端ヒンジ領域を含み、ポリマーはヒンジ領域に結合している。
一の態様において、このポリマーは、直鎖又は分岐鎖のポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(ビニルアルコール)、メトキシ(ポリエチレングリコール)、ラクトース、アミロース、デキルトラン及びグリコゲンから成る群より選択される。
一の態様において、このポリマーはPEGである。
一の態様において、前記抗体単一可変ドメインの1以上の所定の残基は、システイン又はリジン残基で変異する。前記PEGは、この変異残基に結合する。
一の態様において、この抗体単一可変ドメインは重鎖可変ドメインである。
一の態様において、この抗体単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン(VL)である。
一の態様において、この半減期は、1.3から170時間の間である。
一の態様において、このポリマーに結合した抗体単一可変ドメインは、0.25から6時間の間のt1/2αを有する。
一の態様において、このポリマーに結合した抗体単一可変ドメインは、2から40時間の間のt1/2βを有する。
本発明は、少なくとも1.3時間の半減期を有し、前記PEGが前記多量体のシステイン又はリジン残基の位置で該多量体に結合しており、各可変ドメインが、抗原結合サイトを有し、各可変ドメインは、このポリペプチドの中の単一の抗体可変ドメインとして結合することを特徴とするPEGに結合した抗体単一可変ドメインの多量体を含む。
一の態様において、この多量体は、抗体単一可変ドメインの二量体である。
一の態様において、この多量体は、抗体単一可変ドメインの三量体である。
一の態様において、この多量体は、抗体単一可変ドメインの四量体である。
一の態様において、このシステイン又はリジン残基は、前記多量体に含まれる抗体単一可変ドメインのC末端又はN末端に存在する。
一の態様において、前記抗体単一可変ドメインの少なくとも1の所定の残基は、システイン又はリジン残基で変異されている。前記PEGはこの変異残基に結合している。
一の態様において、この抗体単一可変ドメインポリペプチドは、重鎖可変ドメインであり、変異される残基は、Gln13、Pro41又はLeu115から成る群より選択される。
一の態様において、PEGは、C-及び/又はN-末端から少なくとも2の残基離れた位置にあるシステイン又はリジンのところで抗体単一可変ドメインに結合している。
一の態様において、この半減期は1.3から170時間の間である。
一の態様において、このPEGに結合した抗体単一可変ドメインは、0.25から5.8時間の間のt1/2αを有する。
一の態様において、このPEG結合した抗体単一可変ドメインは2から40時間の間のt1/2βを有する。
本発明は、3以上の抗体単一可変ドメインを含むPEGに結合した抗体単一可変ドメインの多量体を含む。この可変ドメインは、抗原結合部位を有し、各可変ドメインは抗体単一可変ドメインとして抗原に結合する。
一の態様において、この多量体は、少なくとも24kDaの流体力学的サイズを有する。
一の態様において、この多量体は、少なくとも200kDaの流体力学的サイズを有する。
一の態様において、この多量体は、3、4、5、6、7又は8の抗体単一可変ドメインを有する。
一の態様において、請求項40に記載のPEGが結合した多量体は、少なくとも1.3時間の半減期を有する。
一の態様において、この半減期は、1.3時間から170時間の間である。
一の態様において、このPEGに結合した抗体単一可変ドメインは0.55から6時間の間のt1/2αを有する。
一の態様において、このPEG結合した抗体単一可変ドメインは2から40時間の間のt1/2βを有する。
一の態様において、PEGはこの多量体の可変ドメインにある所定のシステイン又はリジン残基の位置で、抗体単一可変ドメインの三量体又は四量体に結合している。
一の態様において、このシステイン又はリジン残基は、前記多量体の抗体単一可変ドメインのC末端又はN末端に存在している。
一の態様において、前記抗体単一可変ドメインの1以上の所定の残基は、システイン又はリジン残基に変異される。PEGは前記変異残基に結合する。
一の態様において、この変異された残基は、前記抗体単一可変ドメインのC末端あるいはN末端には存在しない。
一の態様において、この抗体単一可変ドメインは、重鎖可変ドメインであり、前記変異残基は、Cln13、Pro41又はLeu115から成る群より選択される。
一の態様において、このPEGは、C-及び/又はN-末端から少なくとも2残基はなれたシステイン又はリジン残基の位置で前記抗体単一可変ドメインに結合する。
本発明は、さらに、抗体結合サイト及び1又は2の抗体の可変ドメインを含むポリペプチド、を含む。このポリペプチドは、少なくとも24kDaの流体力学的サイズ、少なくとも1.3時間の半減期を有し、各可変ドメインは、抗原結合サイトを有し、各可変ドメインは、このポリペプチドの中の抗体単一可変ドメインとして抗原に結合する。
本発明は、TNFαに対して特異的に結合することを含むポリペプチドを含む。このポリペプチドは、1又は2の抗原可変ドメインを有し、このポリペプチドは、少なくとも24kDaの流体力学的サイズ、少なくとも1.3時間の半減期を有する。
一の態様において、各可変ドメインは、抗原結合サイトを有し、各可変ドメインはこのポリペプチド中の抗体単一可変ドメインとして抗原に結合する。
一の態様において、このポリペプチドは、20から60kDaのサイズを有するPEGポリマーに結合する。
一の態様において、このポリペプチドは、少なくとも200kDaの流体力学的サイズを有する。
一の態様において、この半減期は1.3から170時間の間である。
一の態様において、このPEGに結合した抗体単一可変ドメインは0.25から6時間の間のt1/2αを有する。
一の態様において、このPEGに結合した抗体単一可変ドメインは2から40時間のt1/2βを有する。
一の態様において、このポリペプチドは、可変ドメインのシステイン又はリジン残基の位置でPEG部分と結合している可変ドメインを含む。
一の態様において、このシステイン又はリジン残基は前記抗体単一可変ドメインのC末端又はN末端に存在する。
一の態様において、前記可変ドメインの1以上の所定の残基は、システイン又はリジンに変異する。そして、前記PEGはこの変異残基に結合する。
一の態様において、この変異残基は、前記抗体単一可変ドメインのC末端又はN末端には存在しない。
一の態様において、この可変ドメインは、重鎖可変ドメインであり、前記変異される残基は、Gln13、Pro41又はLeu115から成る群より選択される。
本発明は、抗体単一可変ドメインのホモ多量体を含む。このホモ多量体は、少なくとも24kDaの流体力学的サイズ及び少なくとも1.3時間の半減期を有する。
一の態様において、各可変ドメインは抗原結合サイトを有し、各可変ドメインは、この多量体中の抗体単一可変ドメインとして抗原に結合する。
一の態様において、このホモ多量体は少なくとも1のPEGポリマーに結合している。
一の態様において、この半減期は1.3から170時間の間である。
一の態様において、このホモ多量体は0.25から6時間の間のt1/2αを有する。
一の態様において、このホモ多量体は2から40時間の間のt1/2βを有する。
一の態様において、前記ホモ多量体の各抗体単一可変ドメインは重鎖可変ドメイン又はVLのいずれかを有する。
一の態様において、前記ホモ多量体の各抗体単一可変ドメインは、前記抗体単一可変ドメインのC末端に付加的なシステイン残基を含むように配列されている。
一の態様において、前記ホモ多量体の抗体単一可変ドメインは、ペプチドリンカーによりお互いに結合されいてる。
一の態様において、このホモ多量体は、第一及び第二抗体単一可変ドメインのみを含む。ホモ多量体の前記第一の抗体単一可変ドメインは抗体単一可変ドメイン及び重鎖定常領域(CH1)を含み、第二の抗体単一可変ドメインは抗体単一可変ドメイン及び軽鎖定常領域(CL)を含む。
一の態様において、このホモ多量体はTNFα特異性を有する。
一の態様において、このホモ多量体は、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。
一の態様において、このホモ多量体は、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFαを中和する。
一の態様において、前記ホモ多量体の各抗体単一可変ドメインは、TNFαに結合する。
一の態様において、このホモ多量体の各抗体単一可変ドメインは、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。一の態様において、このホモ多量体は、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。
一の態様において、前記ホモ多量体の抗体単一可変ドメインは、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFαを中和する。
本発明はさらに、抗体単一可変ドメインのヘテロ多量体を含む。このヘテロ多量体は、少なくとも24kDaの流体力学的サイズ及び少なくとも1.3時間の半減期を有し、各可変ドメインは、抗原結合部位を含み、各抗体単一可変ドメインは、このヘテロ多量体中の抗体単一可変ドメインとして抗原に結合する。
一の態様において、このへテロ多量体は少なくとも1のPEGポリマーに結合している。
一の態様において、この半減期は1.3から170時間の間である。
一の態様において、このへテロ多量体は0.25から6時間の間のt1/2αを有する。
一の態様において、このへテロ多量体は2から40時間の間のt1/2βを有する。
一の態様において、前記へテロ多量体の各抗体単一可変ドメインは重鎖可変ドメイン又はVLのいずれかを有する。
一の態様において、前記へテロ多量体の各抗体単一可変ドメインは、前記抗体単一可変ドメインのC末端又はN末端に付加的なシステイン残基を含むように配列されている。
一の態様において、前記へテロ多量体の抗体単一可変ドメインは、ペプチドリンカーによりお互いに結合されいてる。
一の態様において、このへテロ多量体は、第一及び第二の抗体単一可変ドメインのみを含む。ホモ多量体の前記第一の抗体単一可変ドメインは抗体単一可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み(CH1)、第二の抗体単一可変ドメインは抗体単一可変ドメイン及び軽鎖定常領域(CL)を含む。
一の態様において、このへテロ多量体はTNFα特異性を有する。
一の態様において、このへテロ多量体は、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。
一の態様において、このへテロ多量体は、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFαを中和する。
一の態様において、前記へテロ多量体の抗体単一可変ドメインは、TNFαに結合する。
一の態様において、このへテロ多量体の個々の抗体単一可変ドメインは、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。
一の態様において、前記へテロ多量体のこの抗体単一可変ドメインは、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFαを中和する。
本発明は、同じ抗体単一可変ドメインを有するPEGに結合していない抗体単一可変ドメインに匹敵する活性を保持し、標的リガンドに対して同様の特異性を有するPEGに結合している抗体単一可変ドメインを含む。この活性は、PEGに結合している抗体単一可変ドメイン又はPEGに結合していない抗体単一可変ドメインの標的リガンドに対する親和性により測定される。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインは、PEGに結合していない同じ抗体単一可変ドメインに対して少なくとも90％の活性を保持している。
一の態様において、この活性は、前記PEGに結合している抗体単一可変ドメインのTNFαに対する結合として、表面プラスモン共鳴法を用いて測定する。
一の態様において、PEGに結合している抗体単一可変ドメインは、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。
一の態様において、この活性は、基準となる細胞アッセイにおけるヒトTNFα又はTNFレセプター1を中和する前記PEGに結合する抗体単一可変ドメインの能力として測定される。
一の態様において、PEGに結合している抗体単一可変ドメインは、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFαを中和する。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインのIC50又はND50は、前記PEGに結合している抗体単一可変ドメインと同じ抗体単一可変ドメインを有するPEGに結合していない抗体単一可変ドメインのIC50又はND50に対してわずかに10％高い。
本発明は、80nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合するPEGに結合している抗体単一可変ドメインも含む。
本発明は、3nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合するPEGに結合している抗体単一可変ドメインも含む。
本発明は、100pMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合するPEGに結合している抗体単一可変ドメインも含む。
一の態様において、請求項105のPEGに結合している抗体単一可変ドメインは表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαと結合する。
一の態様において、この結合は、基準となる細胞アッセイにおいてヒトTNFα又はTNFレセプター1を中和するPEGに結合している抗体単一可変ドメインの能力として測定される。
一の態様において、PEGに結合している抗体単一可変ドメインは、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFα又はTNFレセプター1を中和する。
本発明はさらに、同じ抗体単一可変ドメインを有するPEGに結合していない抗体単一可変ドメインホモ多量体に匹敵する活性を保持し、標的リガンドに対して同様の特異性を有するPEGに結合した抗体単一可変ドメインホモ多量体を含む。この活性は、PEGに結合している抗体単一可変ドメインホモ多量体又はPEGに結合していない抗体単一可変ドメインホモ多量体の標的リガンドに対する親和性により測定される。
一の態様において、PEGに結合している抗体単一可変ドメインはPEGに結合していない同じ抗体単一可変ドメインに対して90％の活性を保持している。
一の態様において、この活性は、TNFαに対するPEGに結合している抗体単一可変ドメインホモ多量体の能力として測定される。
一の態様において、この活性は、TNFαに反応する細胞毒性を抑制する能力として測定される。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインのIC50は、PEGに結合していない抗体単一可変ドメインホモ多量体のIC50よりもわずかに10％高い。
一の態様において、前記ホモ多量体の各メンバーは、重鎖可変ドメイン又はVLのいずれか一方を含んでいる。
一の態様において、このホモ多量体は、抗体単一可変ドメインのC末端又はN末端に付加的なシステイン残基を含むように配列されいてる抗体単一可変ドメインを含む。
一の態様において、前記ホモ多量体のメンバーは、ペプチドリンカーによりお互いに結合されている。
一の態様において、前記多量体は、第一及び第二メンバーのみを含み、前記ホモ二量体の前記第一メンバーは抗体単一可変ドメイン及び重鎖定常領域(CH1)を含み、前記ホモ二量体の第二メンバーは抗体単一可変ドメイン及び軽鎖定常領域(CL)を含む。
本発明はさらに、同じ抗体単一可変ドメインを有するPEGに結合していない抗体単一可変ドメインへテロ多量体に匹敵する活性を保持し、標的リガンドに対して特異性を有するPEGに結合した抗体単一可変ドメインへテロ多量体を含む。この活性は、PEGに結合している抗体単一可変ドメインへテロ多量体又はPEGに結合していない抗体単一可変ドメインへテロ多量体の標的リガンドに対する親和性により測定される。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインはPEGに結合していない同じ抗体単一可変ドメインへテロ多量体に対して90％の活性を保持している。
一の態様において、この活性は、PEGに結合している抗体単一可変ドメインへテロ多量体のTNFαへの結合として測定される。
一の態様において、この活性は、TNFαに対する細胞毒性を抑制する能力として測定される。
一の態様において、PEGに結合している抗体単一可変ドメインへテロ多量体のIC50は、PEGに結合していない抗体単一可変ドメインへテロ多量体のIC50よりもわずかに10％高い。
一の態様において、前記へテロ多量体の個々のメンバーは、重鎖可変ドメイン又はVLのいずれかを含んでいる。
一の態様において、このへテロ多量体は、抗体単一可変ドメインのC末端又はN末端に付加的なシステイン残基を含むように配列されいてる抗体単一可変ドメインを含む。
一の態様において、前記へテロ多量体のメンバーは、ペプチドリンカーによりお互いに結合されている。
一の態様において、前記多量体は、第一及び第二メンバーのみを含む。前記へテロ二量体の前記第一メンバーは抗体単一可変ドメイン及び重鎖定常領域(CH1)を含み、第二メンバーは抗体単一可変ドメイン及び軽鎖定常領域(CL)を含む。
一の態様において、前記ホモ-又はへテロ多量体は、二量体、三量体及び四量体からなる群より選択される。
一の態様において、前記ホモ-又はへテロ-多量体のPEG部分は、分岐鎖PEGである。
本発明は、80nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合する、PEGに結合しているホモ多量体の抗体単一可変ドメインも含む。
一の態様において、PEGに結合しているホモ多量体は表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でTNFαと結合する。
一の態様において、この結合は、基準となる細胞アッセイにおけるヒトTNFα又はTNFレセプター1を中和するPEGに結合するホモ多量体の能力として測定される。
一の態様において、PEGに結合しているホモ多量体は、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFα又はTNFレセプター1を中和する。
本発明は、3nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合するPEGに結合しているホモ多量体の抗体単一可変ドメインを含む。
本発明は、100pMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合するPEGに結合しているホモ多量体の抗体単一可変ドメインを含む。
本発明は、80nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合するPEGに結合しているホモ多量体の抗体単一可変ドメインを含む。
本発明は、3nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合するPEGに結合しているホモ多量体の抗体単一可変ドメインを含む。
本発明は、100pMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合するPEGに結合しているホモ多量体の抗体単一可変ドメインを含む。
本発明は、PEG分子に結合している抗体単一可変ドメインの所定の位置にある少なくとも1の溶媒可接性リジン残基を含む抗体単一可変ドメインを含む。
一の態様において、このPEGは、N-ヒドロキシスクシニミド活性エステル(N-hydroxylsuccinimide active ester)に結合するPEGの形態で前記溶媒可接性リジンに結合している。
一の態様において、N-ヒドロキシスクシニミド活性エステル(N-hydroxylsuccinimide active ester)は、PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS、PEG-O-CH2-NHS、PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS、PEG-S-CH2CH2-CO-NHS、 PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS、PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS、及びPEG-O-CH2-CO2-NHSからなる群より選択される。これらの式において、R は(CH2)4NHCO2(mPEG)である。
一の態様において、このPEGは分岐鎖PEGである。
本発明は、抗体単一可変ドメイン多量体を含む。個々の多量体は、PEG分子に結合している少なくとも1の前記溶媒可接性リジンを含む。
一の態様において、この前記溶媒可接性リジン残基はGln13、Pro41又はLeu115からなる群より選択される1以上の残基のを変異することにより得られる。
一の態様において、この多量体はホモ多量体である。
一の態様において、この多量体はヘテロ多量体である。
一の態様において、この多量体はホモ又はへテロ三量体である。
一の態様において、この多量体はホモ又はへテロ四量体である。
本発明は、PEG分子に結合している少なくとも1の溶媒可接性システインを含む抗体単一可変ドメインのホモ-又はへテロ-の三量体又は四量体も含む。
一の態様において、このPEGは、マレイミド、ビニルフスホン及びチオールから成る群より選択されるスルフヒドリル基選択試薬により溶媒可接性システインに結合される。
一の態様において、この抗体単一可変ドメインは重鎖可変ドメイン及びGln13、Pro41又はLeu115からなる群より選択される1以上の残基の変異により得られた溶媒可接性システインを有する。
本発明は、PEGに結合していない同じ抗体単一可変ドメインポリペプチドの半減期よりも少なくとも7倍高い半減期を有するPEGに結合している抗体の一重鎖可変領域ポリペプチドも含む。
一の態様において、このPEGに結合している抗体の可変領域は、少なくとも24kDaの流体力学的サイズを有する。
一の態様において、このPEGに結合している抗体可変領域は、24kDaから500kDaの流体力学的サイズを有する。
本発明は、少なくとも1.3時間の半減期を有するPEGに結合している抗体単一可変ドメイン及び担体を含む医薬品製剤を含む。
本発明は、少なくとも1.3時間の半減期及び少なくとも24kDaの流体力学的サイズを有するPEGに結合している抗体単一可変ドメイン並びに担体を含む医薬品製剤を含む。
本発明は、さらにPEGに結合している抗体単一可変ドメインへテロ三量体、ホモ三量体、へテロ四量体又はホモ四量体を含む。これら多量体の各可変ドメインは抗原結合部位を有し、各可変ドメインは1の可変ドメインとして抗原に結合する。
本発明は、PEGに結合している抗体単一可変ドメインを含む医薬品製剤を含む。この前記PEGに結合している抗体単一可変ドメインは前記医薬品製剤を動物に投与した後に該動物の胃において10％未満しか分解されないことを特徴とする。
本発明は、PEGに結合している抗体単一可変ドメインを含む医薬品製剤を含む。PEGに結合している抗体単一可変ドメインは、in vitroにおいて、ペプシン、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン及びカルボキシペプチダーゼから成る群より選択されるプロテアーゼに曝したときに10％までしか分解されないことを特徴とし、前記プロテアーゼがペプシンの場合、前記PEGに結合している抗体単一可変ドメインをpＨ2.0で30分間ペプシンに曝したときには、10％未満しか分解されず、前記プロテアーゼがトリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン又はカルボキシペプチダーゼである場合、前記PEGに結合している抗体単一可変ドメインは、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン又はカルボキシペプチダーゼにpＨ8.0で30分間曝したときには、10％未満しか分解されないことを特徴とする。
一の態様において、この医薬品製剤は、経口投与、並びに、静脈内の、筋肉内の、腹腔内注射、体内移植、直腸投与、及び経皮投与から成る群より選択される非経口経路を介しての投与に適している。
一の態様において、この医薬品製剤は、放出遅延機構を有する非経口又は経口投与製剤である。
本発明は、少なくとも1のポリマーに対して結合している単一可変ドメインを含み、ペプシン、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン及びカルボキシペプチダーゼから成る群より選択されるプロテアーゼによる抗体単一可変ドメイン単量体又は多量体の分解を減らすための方法を含む。
一の態様において、この分解は、動物の胃における減少を意味する。
一の態様において、この分解は、in vitroにおいて、pH2.0で30分間ペプシンに曝した場合の抗体単一可変ドメインの減少が10％未満であり、in vitroにおいてpH8.0で30分間トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン及びカルボキシペプチダーゼに曝した場合の抗体単一可変ドメインの減少が10％未満であることを意味する。
一の態様において、ポリマーは、直鎖又は分岐鎖のポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(ビニルアルコール)、メトキシ(ポリエチレングリコール)、ラクトース、アミロース、デキルトラン及びグリコゲンから成る群より選択される。
一の態様において、このポリマーはPEGである。
一の態様において、前記抗体単一可変ドメインの1以上の所定の残基は、システイン又はリジン残基に変異される。前記PEGは、この変異残基に結合する。
一の態様において、この抗体単一可変ドメインは重鎖可変ドメイン(VH)である。
一の態様において、この抗体単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン(VL)である。
一の態様において、この半減期は、0.25から170時間の間である。
一の態様において、このポリマーに結合した抗体単一可変ドメインは、0.25から6時間の間のt1/2αを有する。
一の態様において、このポリマーに結合した抗体単一可変ドメインは、2から40時間の間のt1/2βを有する。
本発明は、少なくとも0.25時間の半減期を有し、前記PEGが前記多量体のシステイン又はリジン残基の位置で多量体に結合しており、個々の可変ドメインは、抗原結合部位を有し、個々の可変ドメインは、このポリペプチドの中の1の抗体の可変ドメインとして結合することを特徴とする抗体単一可変ドメインのPEGに結合した多量体を含む。
一の態様において、この多量体は、抗体単一可変ドメインの二量体である。
一の態様において、この多量体は、抗体単一可変ドメインの三量体である。
一の態様において、この多量体は、抗体単一可変ドメインの四量体である。
一の態様において、システイン又はリジン残基は、前記多量体に含まれる抗体単一可変ドメインのC末端に存在する。
一の態様において、少なくとも1の前記抗体単一可変ドメインの1以上の所定の残基は、システイン又はリジン残基で変異されている。前記PEGはこの変異残基に結合している。
一の態様において、この半減期は、0.25から170時間の間である。
一の態様において、このポリマーに結合した抗体単一可変ドメインは、0.25から5.8時間のt1/2αを有する。
一の態様において、このポリマーに結合した抗体単一可変ドメインは、2から40時間のt1/2βを有する。
本発明は、3以上の抗体単一可変ドメインを含む、PEGに結合した抗体単一可変ドメインの多量体を含む。この可変ドメインは、抗原結合部位を有し、各可変ドメインは抗体単一可変ドメインとして抗原に結合する。
一の態様において、この多量体は、少なくとも24kDaの流体力学的サイズを有する。
一の態様において、この多量体は、少なくとも200kDaの流体力学的サイズを有する。
一の態様において、この多量体は、3、4、5、6、7又は8の抗体単一可変ドメインを有する。
一の態様において、このPEGに結合した多量体は、少なくとも0.25時間の半減期を有する。
一の態様において、この半減期は、0.25時間から170時間の間である。
一の態様において、このPEG結合した抗体単一可変ドメインは0.55から6時間の間のt1/2αを有する。
一の態様において、このPEG結合した抗体単一可変ドメインは2から40時間のt1/2βを有する。
一の態様において、PEGはこの多量体の可変領域の所定のシステイン又はリジン残基の位置で、抗体単一可変ドメインの三量体又は四量体に結合している。
一の態様において、このシステイン又はリジン残基は、前記多量体の抗体単一可変ドメインのC末端に存在している。
一の態様において、前記抗体単一可変ドメインの1以上の所定の残基は、システイン又はリジン残基に変異される。PEGは前記変異残基に結合する。
本発明は、さらに、抗体結合部位、及び1又は2の抗体の可変ドメインを有するポリペプチドを含む。このポリペプチドは、少なくとも24kDaの流体力学的サイズ、少なくとも1.3時間の半減期を有し、各可変ドメインは、抗原結合部位を有し、各可変ドメインは、ポリペプチドの中の抗体単一可変ドメインとして抗原に結合する。
本発明は、TNFαに対して特異的に結合することを含むポリペプチドを含む。このポリペプチドは、1又は2の抗原可変ドメインを有し、このポリペプチドは、少なくとも24kDaの流体力学的サイズ及び少なくとも0.25時間の半減期を有する。
一の態様において、各可変ドメインは、抗原結合部位を有し、各可変ドメインはこのポリペプチド中の抗体単一可変ドメインとして抗原に結合する。
一の態様において、このポリペプチドは、20から60kDaの間のサイズを有するPEGポリマーに結合する。
一の態様において、このポリペプチドは、少なくとも200kDaの流体力学的サイズを有する。
一の態様において、この半減期は0.25から170時間の間である。
一の態様において、このポリペプチドは0.25から6時間の間のt1/2αを有する。
一の態様において、このポリペプチドは2から40時間のt1/2βを有する。
一の態様において、このポリペプチドは、可変ドメインのシステイン又はリジン残基の位置でPEG部分と結合する可変ドメインを含む。
一の態様において、このシステイン又はリジン残基は前記抗体単一可変ドメインのC末端に存在する。
一の態様において、前記可変ドメインの1以上の所定の残基は、システイン又はリジンに変異される。前記PEGは、この変異残基に結合する。
本発明は、抗体単一可変ドメインのホモ多量体を含む。このホモ多量体は、少なくとも24kDaの流体力学的サイズ及び少なくとも0.25時間の半減期を有する。
一の態様において、各可変ドメインは抗原結合サイトを有し、各可変ドメインは、この多量体中の抗体単一可変ドメインとして抗原に結合する。
一の態様において、このホモ多量体は少なくとも1のPEGポリマーに結合している。
一の態様において、このホモ多量体の半減期は0.25から170時間の間である。
一の態様において、このホモ多量体は0.25から6時間の間のt1/2αを有する。
一の態様において、このホモ多量体は2から40時間の間のt1/2βを有する。
一の態様において、前記ホモ多量体の各抗体単一可変ドメインはVH又はVLのいずれか一方を有する。
一の態様において、前記ホモ多量体の各抗体単一可変ドメインは、前記抗体単一可変ドメインのC末端に付加的なシステイン残基を含むように配列されている。
一の態様において、前記ホモ多量体の抗体単一可変ドメインは、ペプチドリンカーによりお互いに結合されいてる。
一の態様において、このホモ多量体は、第一及び第二の抗体単一可変ドメインのみを含む。該ホモ多量体の前記第一の抗体単一可変ドメインは抗体単一可変ドメイン及び重鎖定常領域(CH1)を含み、第二の抗体単一可変ドメインは抗体単一可変ドメイン及び軽鎖定常領域(CL)を含む。
一の態様において、このホモ多量体はTNFα特異性を有する。
一の態様において、このホモ多量体は、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。
一の態様において、このホモ多量体は、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFαを中和する。
一の態様において、前記ホモ多量体のこの抗体単一可変ドメインは、TNFαに結合する。
一の態様において、このホモ多量体の各抗体単一可変ドメインは、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。一の態様において、このホモ多量体は、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。
一の態様において、前記ホモ多量体の抗体単一可変ドメインは、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFαを中和する。
本発明はさらに、抗体単一可変ドメインのヘテロ多量体を含む。このヘテロ多量体は、少なくとも24kDaの流体力学的サイズ及び、少なくとも0.25時間の半減期を有し、各可変ドメインは、抗原結合部位を含み、各抗体単一可変ドメインは、ヘテロ多量体中の抗体単一可変ドメインとして抗原に結合する。
一の態様において、このへテロ多量体は少なくとも1のPEGポリマーに結合している。
一の態様において、このへテロ多量体の半減期は0.25から170時間の間である。
一の態様において、このへテロ多量体は0.25から6時間の間のt1/2αを有する。
一の態様において、このへテロ多量体は2から40時間の間のt1/2βを有する。
一の態様において、前記へテロ多量体の個々の抗体単一可変ドメインはVH又はVLのいずれかを有する。
一の態様において、前記へテロ多量体の各抗体単一可変ドメインは、前記抗体単一可変ドメインのC末端又はN末端に付加的なシステイン残基を含むように配列されている。
一の態様において、前記へテロ多量体の抗体単一可変ドメインは、ペプチドリンカーによりお互いに結合されいてる。
一の態様において、このへテロ多量体は、第一及び第二抗体単一可変ドメインのみを含む。該ホモ多量体の前記第一の抗体単一可変ドメインは抗体単一可変ドメイン及び重鎖定常領域(CH1)を含み、第二の抗体単一可変ドメインは抗体単一可変ドメイン及び軽鎖定常領域(CL)を含む。
一の態様において、このへテロ多量体はTNFα特異性を有する。
一の態様において、このへテロ多量体は、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。
一の態様において、このへテロ多量体は、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でTNFαを中和する。
一の態様において、前記へテロ多量体の抗体単一可変ドメインは、TNFαに対して特異性を有する。
一の態様において、このへテロ多量体の各抗体単一可変ドメインは、表面プラスモン共鳴により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。
一の態様において、前記へテロ多量体の抗体単一可変ドメインは、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFαを中和する。
本発明は、同じ抗体単一可変ドメインを有するPEGに結合していない抗体単一可変ドメインに匹敵する活性を保持し、標的リガンドに対して特異性を有するPEGに結合した抗体単一可変ドメインを含む。この活性は、PEGに結合している抗体単一可変ドメイン又はPEGに結合していない抗体単一可変ドメインの標的リガンドに対する親和性により測定される。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインは、PEGに結合していない抗体単一可変ドメインに対して少なくとも90％の活性を保持している。
一の態様において、この活性は、前記PEGに結合している抗体単一可変ドメインのTNFαに対する結合として、表面プラスモン共鳴法により測定される。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインは、表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する。
一の態様において、この活性は、基準となる細胞アッセイにおけるヒトTNFα又はTNFレセプター1を中和するPEGに結合している抗体単一可変ドメインの能力として測定される。
一の態様において、基準となる細胞アッセイにおけるPEGに結合している抗体単一可変ドメインは、500nMから50pMのND50でTNFαを中和する。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインは、同じ抗体単一可変ドメインを有するPEGに結合していない抗体単一可変ドメインのIC50又はND50に対してわずか10％多いIC50又はND50を有する。
本発明は、80nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合する、PEGに結合している抗体単一可変ドメインも含む。
本発明は、3nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合する、PEGに結合している抗体単一可変ドメインも含む。
本発明は、100pMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合する、PEGに結合している抗体単一可変ドメインも含む。
一の態様において、PEGに結合している抗体単一可変ドメインは表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でヒトTNFαに結合する。
一の態様において、この結合は、基準となる細胞アッセイにおけるヒトTNFα又はTNFレセプター1を中和するPEGに結合している抗体単一可変ドメインの能力として測定される。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインは、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFα又はTNFレセプター1を中和する。
本発明はさらに、同じ抗体単一可変ドメインを有するPEGに結合していない抗体単一可変ドメインホモ多量体に匹敵する活性を保持し、標的リガンドに対して特異性を有するPEGに結合している抗体単一可変ドメインホモ多量体を含む。前記活性は、PEGに結合している抗体単一可変ドメインホモ多量体又はPEGに結合していない抗体単一可変ドメインホモ多量体の親標的リガンドに対する和性により測定される。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインはPEGに結合していない同じ抗体単一可変ドメインに対して90％の活性を保持している。
一の態様において、この活性は、TNFαに対するPEGに結合している抗体単一可変ドメインホモ多量体の結合として測定される。
一の態様において、この活性は、TNFαに反応する細胞毒性を抑制する能力として測定される。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインのIC50は、PEGに結合していない抗体単一可変ドメインホモ多量体のIC50よりもわずかに10％高い。
一の態様において、前記ホモ多量体の個々のメンバーは、VH又はVLのいずれか一方を含んでいる。
一の態様において、このホモ多量体は、抗体単一可変ドメインのC末端に付加的なシステイン残基を含むように配列されいてる抗体単一可変ドメインを含む。
一の態様において、前記ホモ多量体のメンバーは、ペプチドリンカーによりお互いに結合されている。
一の態様において、前記ホモ多量体は、第一及び第二メンバーのみを含む。前記ホモ二量体の前記第一メンバーは抗体単一可変ドメイン及び重鎖定常領域(CH1)を含み、第二メンバーは抗体単一可変ドメイン及び軽鎖定常領域(CL)を含む。
本発明はさらに、同じ抗体単一可変ドメインを有するPEGに結合していない抗体単一可変ドメインへテロ多量体に匹敵する活性を保持し、標的リガンドに対して特異性を有する、PEGに結合した抗体単一可変ドメインへテロ多量体を含む。前記活性は、PEGに結合している抗体単一可変ドメインへテロ多量体又はPEGに結合していない抗体単一可変ドメインへテロ多量体の標的リガンドに対する親和性により測定される。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインはPEGに結合していない同じ抗体単一可変ドメインへテロ多量体に対して90％の活性を保持している。
一の態様において、この活性は、PEGに結合している抗体単一可変ドメインへテロ多量体のTNFαに対する結合として測定される。
一の態様において、この活性は、TNFαに反応する細胞毒性を抑制する能力として測定される。
一の態様において、このPEGに結合している抗体単一可変ドメインのIC50は、PEGに結合していない抗体単一可変ドメインへテロ多量体のIC50よりもわずかに10％高い。
一の態様において、前記へテロ多量体の個々のメンバーは、VH又はVLのいずれか一方を含んでいる。
一の態様において、このへテロ多量体は、抗体単一可変ドメインのC末端に付加的なシステイン残基を含むように配列されいてる抗体単一可変ドメインを含む。
一の態様において、前記へテロ多量体のメンバーは、ペプチドリンカーによりお互いに結合されている。
一の態様において、前記へテロ多量体は、第一及び第二メンバーのみを含む。前記へテロ多二量体の前記第一メンバーは抗体単一可変ドメイン及び重鎖定常領域(CH1)を含み、第二メンバーは抗体単一可変ドメイン及び軽鎖定常領域(CL)を含む。
本発明は、80nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合するPEGに結合しているホモ多量体の抗体単一可変ドメインも含む。
一の態様において、PEGに結合しているホモ多量体は表面プラスモン共鳴法により測定した場合、50nMから20pMの解離定数(Kd)及び5ｘ10-7から1ｘ10-7ｓ-1のKoff速度定数でTNFαに結合する。
一の態様において、この結合は、基準となる細胞アッセイにおいてヒトTNFα又はTNFレセプター1を中和するPEGに結合するホモ多量体の能力として測定される。
一の態様において、このPEGに結合するホモ多量体は、基準となる細胞アッセイにおいて500nMから50pMのND50でヒトTNFα又はTNFレセプター1を中和する。
本発明は、3nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合する抗体単一可変ドメインのPEGに結合しているホモ多量体を含む。
本発明は、100pMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合する抗体単一可変ドメインのPEGに結合しているホモ多量体を含む。
本発明は、80nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合する抗体単一可変ドメインのPEGに結合しているホモ多量体を含む。
本発明は、3nMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合する抗体単一可変ドメインのPEGに結合しているへテロ多量体を含む。
本発明は、100pMから30pMのKdで標的抗原に特異的に結合する抗体単一可変ドメインのPEGに結合しているへテロ多量体を含む。
本発明は、PEG分子に結合している抗体単一可変ドメインの所定の位置にある少なくとも1の溶媒可接性リジン残基を含む抗体単一可変ドメインを含む。
一の態様において、このPEGは、N-ヒドロキシスクシニミド活性エステル(N-hydroxylsuccinimide active ester)に結合するPEGの形態で、前記溶媒可接性リジンに結合する。
一の態様において、このN-ヒドロキシスクシニミド活性エステル(N-hydroxylsuccinimide active ester)は、PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS、PEG-0-CH2-NHS、PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS、PEG-S-CH2CH2-CO-NHS、PEG-02CNH-CH(R)-CO2-NHS、PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NH、及びPEG-O-CH2-CO2-NHSからなる群より選択される。これらの式において、R は(CH2)4NHCO2(mPEG)である。
一の態様において、このPEGは分岐鎖PEGである。
本発明は、抗体単一可変ドメイン多量体を含む。個々の多量体は、PEG分子に結合している少なくとも1の溶媒可接性リジンを含む。
一の態様において、この多量体はホモ多量体である。
一の態様において、この多量体はヘテロ多量体である。
一の態様において、この多量体はホモ又はへテロ三量体である。
一の態様において、この多量体はホモ又はへテロ四量体である。
本発明は、PEG分子に結合している少なくとも1の溶媒可接性システインを含む抗体単一可変ドメインのホモ-又はへテロ-の三量体又は四量体も含む。
一の態様において、このPEGは、マレイミド、ビニルフスホン及びチオールから成る群より選択されるスルフヒドリル基選択試薬により溶媒可接性システインに結合される。
本発明は、同じ抗体単一可変ドメインを有するPEGに結合していないポリペプチドの半減期よりも少なくとも7倍高い半減期を有するPEGに結合している抗体の単一可変領域ポリペプチドも含む。
一の態様において、このPEGに結合している抗体の可変領域は、少なくとも24kDaの流体力学的サイズを有する。
一の態様において、このPEGに結合している抗体可変領域は、24kDaから500kDaの流体力学的サイズを有する。
本発明は、少なくとも0.25時間の半減期を有するPEGに結合している抗体単一可変ドメイン及び担体を含む医薬品製剤を含む。
本発明は、少なくとも0.25時間の半減期、少なくとも24kDaの流体力学的サイズを有するPEGに結合している抗体単一可変ドメイン及び担体を含む医薬品製剤を含む。
本発明は、さらにPEGに結合している抗体単一可変ドメインへテロ三量体、ホモ三量体、へテロ四量体又はホモ四量体を含む。これらの各可変ドメインは抗原結合部位を有し、各可変ドメインは1の可変ドメインとして抗原に結合する。
本発明は、PEGに結合している抗体単一可変ドメインを含む医薬品製剤を含む。この前記PEGに結合している抗体単一可変ドメインは前記医薬品製剤を動物に投与した後に動物の胃において10％未満しか分解されないことを特徴とする。
本発明は、さらにPEGに結合している抗体単一可変ドメインを有する医薬品製剤を含む、該PEGに結合している抗体単一可変ドメインはin vitroにおいて、pH2.0で30分間ペプシンに曝したときにわずか10％までしか分解されないことを特徴とする。
一の態様において、この医薬品製剤は、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射又は腹腔内注射の非経口投与、並びに、経口、舌下、及び、吸入、移植、直腸、ヴァギナ、皮下、及び経皮投与等の局所投与に適している。
本発明の更なる側面において、本発明は、血液脳関門、肺血液の障壁などの生体バリアを通過する治療効果を有するポリペプチドおよび／または医薬品を適用するための方法と分子を提供する。
本発明は、少なくとも1のPEGポリマーに結合する単一可変ドメインを含み、ペプシンにより抗体単一可変ドメインの単量体又は多量体の分解を減らす方法を含む。
一の態様において、この分解は、動物の胃において起こる。
一の態様において、この分解は、in vitroにおいて、pH2.0で30分間ペプシンにさらしたときの抗体単一可変ドメインの減少は10％未満である。
発明を実施するための最良の手段
定義
本明細書で用いる 「ドメイン」はフォールドしたタンパク質構造であって、タンパク質のレスト(rest)の３次構造を独立して有する。一般的に、ドメインはタンパク質の個別の機能特性に関わり、多くの場合、タンパク質および／または他の部分のドメインの機能を失うことなく、加え、除去しあるいは他のタンパク質に移動させることができる。
「抗体単一可変ドメイン」は、免疫グロブリン可変ドメインの特徴をもつ配列を含み、抗原に特異的に結合し、(すなわち、解離定数が1μM以下)及び、単一可変ドメインとして抗原に結合する抗体可変ドメイン、つまり完全な抗体可変ドメインを有さない、フォールドしたポリペプチドドメインを意味する。
「抗体単一可変ドメイン」は、完全な抗体の可変ドメインのほかに修飾された可変ドメインも含む。例えば１以上のループが抗体可変ドメイン以外の配列に置換されている修飾可変ドメイン、並びに、末端切断されているか又はＮもしくはＣ末端伸張部を含む抗体可変ドメインであって、500 nM 以下 (例えば、 450 nM 以下、400 nM 以下、350 nM以下、 300 nM以下、250 nM以下、200 nM以下、150 nM以下、又は100 nM以下) の解離定数及び完全長ドメインと同様の解離定数を有する可変ドメインのフォールドフラグメントを含む。本発明の単一可変ドメインは、Vkappa 及び Vlambdaを含むVH 及び VLから成る群より選択されることが好ましい。本発明のVH領域を利用するここに説明された方法と組成物はラクダ科動物のVHH領域を利用することもできる。抗体単一可変ドメインは本技術分野で公知であり、Ward et al., Nature. 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6に開示されている。この文献を参照により本明細書に援用する。
「抗体単一可変ドメイン」の語は、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドだけでなく、1以上の抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の1以上のモノマーを含む大きなポリペプチドも意味する。「ドメイン抗体」又は「dAb」は本明細書では「抗体単一可変ドメイン」の語と等しく用いる。本明細書で用いる、抗体単一可変ドメインは、哺乳類の抗体単一可変ドメインポリペプチド、好ましくはヒトであるが、げっ歯類(例えば、参照により本明細書に援用されるWOOO/29004に開示されている)又はラクダ科のVHH dAbs も含む。ラクダ科のdAbs は、ラクダ、ラマ、アルパカ、 ヒトコブラクダ及びグアナコを含むラクダ種由来の抗体単一可変ドメインポリペプチドであり、軽鎖を有さないVHHを含む。VHH 分子 はIgG分子より約 lO倍小さく、単一のポリペプチドである。それらはとても安定であり、極端なpH及び温度にも耐性を有する。さらに、ラクダ科の抗体単一可変ドメインポリペプチドはプロテアーゼの作用にも耐性を有する。ラクダ科の抗体は、U. S. Pat. Nos. 5,759,808、5,800,988、5,840,526、5,874,541、6,005,079及び 6,015,695の6つの文献に記載されている。これらの文献の内容を参照により本明細書に援用する。本発明に有用なラクダ科のVHH抗体単一可変ドメインは、ヒトと似た配列を有するラクダの抗体単一可変ドメインのクラスを含む。このクラスは、VHHドメインがKabat番号で定義されるところの45の位置のグリシン、アラニン、バリン、ロシシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、又はグルタミン、例えばL４５、さらに103の位置のトリプトファンを含むアミノ酸を運ぶ点において特徴的である。ラクダのVHHポリペプチドをヒト化することは、例えば、W0 04/041862において詳述されている。この文献の内容は、参照により本明細書に援用する。ヒト化されたVHHポリペプチドを生産するために、天然のラクダ科の抗体単一可変ドメインをW0 04/041862の示唆に従って修飾する (例えば、45及び103の位置のアミノ酸を置換する)ことが可能であることは本発明の技術分野で知られている。
本明細書において、「抗体単一可変ドメインポリペプチド」、「抗体単一可変ドメイン」、「単一抗体可変ドメイン」及び「イムノグロブリン単一可変ドメイン」の語は等しく用いられる。
本明細書で用いる、「免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列」は、免疫グロブリン可変ドメイン配列に対して、20以上、25以上、30以上、35以上、40以上、45以上、又は50以上の連続するアミノ酸が同じであるアミノ酸配列を意味する。
本明細書で用いる、「結合する」の語は、本発明の抗体単一可変ドメイン又はポリペプチドのアミノ酸残基に対するPEG等のポリマー部分の結合を意味する。PEGがdAbのアミノ酸残基又はポリペプチドに結合することは、「PEG化(PEGylation)」という。そしてこの結合は、いくつかのN-ヒドロキシスクシニミド (NHS) 活性エステル、スクシニミジルプロピオネート (SPA)、マレイミド(MAL)、ビニルスルホン (VS)又はチオールであるが、これらの限定されないいくつかのPEG結合部分を用いることにより実施することができる。PEGポリマー又は他のポリマーは、所定の位置で、dAbポリペプチドと結合することができ、また、ランダムにdAbポリペプチドと結合することもできる。しかしながら、PEGポリマーは所定の位置でdAb又はポリペプチドと結合することが望ましい。PEGポリマーは、dAb又はポリペプチドの中の任意の残基に結合している。しかしながら、PEGポリマーは、野生型dAbポリマー又はポリペプチドの中のリジン又はシステイン残基のいずれかに、又は、例えば、野生型dAbの中の残基をシステイン又はリジンに変えた変異体のリジン又はシステインのいずれかに、結合されていることが好ましい。本明細書で用いる「結合する」の語は、抗体単一可変ドメインポリペプチド単量体の二量体、三量体、四量体又は他の多量体を形成するために2以上の抗体単一可変ドメインを会合させることも意味する。dAb単量体は、本技術分野で知られているいくつかの方法により結合することができる。この方法は、dAb単量体を溶融タンパク質として発現させること、2以上の単量体を単量体の間のペプチドリンカーを介して結合させること、あるいは、互いの単量体を直接的に、又は、ジスルフィド結合か、もしくは、ジ−、トリ-、あるいは多重の結合部分により(例えば、マルチ-アームPEGにより)化学的に結合させることを含むがこれらに限定されない。
本明細書で用いる、ポリマーを抗体単一可変ドメインポリマーに「直接的に結合」した、のように用いる「直接的に結合」は、ポリマーが、(例えば、定常領域、ヒンジ領域又はリンカーペプチドを含まない)可変ドメインに(自然発生的又は変異させることにより)結合されていることを意味する。反対に、本明細書で用いる、抗体単一可変ドメインへ「非直接的に結合する」は、可変領域の部分のアミノ酸残基に、ポリマーを結合しないように抗体単一可変ドメインにポリマーを結合すること(例えば、ヒンジ領域への付加)を意味する。もし、ポリマーがリンカーペプチドを介して単一可変ドメインに結合されいるならば、ポリマーは「非直接的」に結合している。この場合、ポリマーは抗体単一可変ドメインのアミノ酸残基に接触していない。代替的に、ポリマーが単一可変ドメインのC末端ヒンジ領域に結合しているか、あるいは、抗体単一可変ドメインポリペプチドの一部にある、定常領域の任意の残基に結合している場合にも、ポリマーは「非直接的」に結合していると言う。
本明細書で用いる、「相同性」、「類似性」又は「同一性」の語は、2の核酸又はアミノ酸配列がお互いに構造的に似ていることを意味する。本発明の相同配列は、アミノ酸の付加、欠失、又は置換により修飾されたポリペプチドであり、非修飾ポリペプチドと比較した場合、前記修飾は、機能的な特徴の変更を伴わない。抗体単一可変ドメインポリペプチドがラクダ科のポリペプチドである場合、本発明の相同配列は、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、及びグアナコ等の他のラクダ科の動物の中に存在する配列でもある。本明細書で用いる、配列類似性は、配列アラインメントにおいて、対応する位置における同じアミノ酸残基の割合を測定したものである。アミノ酸は側鎖が同じである場合に互いに似ている。特に「類似」は、お互いを保存的に置換するアミノ酸を含む。「同類置換」は、ブロサム62置換マトリックス(blosun62 substitution matrix)において、ポジティブスコアを有する任意の置換である(Hentikoff and Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)。「配列Aは、n％配列Bに類似している」とは、配列AとBの間の最適広域アラインメント(optimal global alignment )のn％の位置が同一であることを意味する。最適広域アラインメント(optimal global alignment )は、Needleman-Wunsch alignment algorithの中の以下のパラメータを用いて行うことができる：
ポリペプチドに対して:
置換マトリックス : blosum62.
ギャップスコアリング機能(Gap scoring function):-A-B*LG, A=11 (ギャップペナルティー), B=1 (ギャップ長ペナルティー) 及び LGはギャップの長さである
配列に対して：
置換マトリックス: 一致に対して10、不一致に対して0
ギャップスコアリング機能(Gap scoring function):-A-B*LG、 A=50 (ギャップペナルティー), B=3 (ギャップ長ペナルティー) 及び LGはギャップの長さである。
通常の同類置換は、Met、Val、Leu、及びIleの間：SerとThrの間：Asp、Glu、Ansの間：Gln, Lys 及び Argの間：又は芳香族残基PheとTryの間で起こる。
本明細書で用いる、2の配列がお互いに「相同性」又は「類似性」を有するとは、Tatusova & Madden, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250に記載されている、ニードルマン-ブンシュアルゴリズム(Needleman-Wunsch algorithm)又は ブラスト2配列アルゴリズム(BLAST 2 sequences algorithm)のいずれかを用いて並列したときに、それらが、85％の配列類似性を有することを意味する。アミノ酸配列がブラスト2配列アルゴリズム（BLAST 2 sequences algorithm）を用いて並列するとき、ブロサム62マトリックス（Blosum 62 matrix）が既定のマトリックスである。
本明細書で用いる、「低ストリンジェンシー」「中ストリンジェンシー」又は「高ストリンジェンシー」の語は、核酸配列のハイブリダイゼーション又は洗浄の条件を意味する。ハイブリダーゼーション反応についての概要は、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。この文献を参照により本明細書に援用する。水溶性の、及び非水溶性の方法がこの文献には記載されており、いずれも本発明に使用することができる。具体的にはハイブリダイゼーション条件は以下の様である。(1)低ストリンジェンシー；約45℃で、6xの塩化ナトリウム/水酸化ナトリウム(SSC)中でハイブリダイゼーションした後、少なくとも50℃(この温度は55℃にまで高くすることができる)において、0.2xSSC、0.1%DSD中で2回洗浄する。(2)中ストリンジェンシー；約45℃で、6xの塩化ナトリウム/水酸化ナトリウム(SSC)中でハイブリダイゼーションした後、60℃において0.2xSSC、0.1%DSDの中で1回以上洗浄する。(3)高ストリンジェンシー；約45℃で、6xの塩化ナトリウム/水酸化ナトリウム(SSC)中でハイブリダイゼーションした後、65℃において0.2xSSC、0.1%DSDの中で1回以上洗浄する。そして、より好ましくは、以下の超高ストリンジェンシー条件である。(4)超高ストリンジェンシー；65℃で、0.5Mリン酸ナトリウム、7％SDSでハイブリダイズしたあと、65℃において0.2xSSC、0.1%DSDの中で1回以上洗浄する。
本明細書で用いる「特異的結合」の語は、例えばBIAcoreTM表面プラスモン共鳴システム及びBIAcoreTM動態評価ソフトウエア(例えばバージョン2.1)を用いた表面プラスモン共鳴解析による測定で、解離定数(Kd)が1μM以下である抗体単一可変ドメインの抗原への結合を意味する。特定の結合反応に対する親和性又はKdは、好ましくは、約500nM以下、好ましくは300nM、好ましくは100nM以下、より好ましくは約80nM以下及び好ましくは、10pMである。
本明細書で用いる「高親和結合」の語は、100nM以下のKdで結合することを意味する。
本明細書で用いる「〜の濃度における」の語は、所与のポリペプチドが所望の嵩又はモル量で単位容量の溶液(好ましくは水)中に溶解していることを言う。従って、容量あたりのモル濃度及び重量のパーセンテージを意味する。「Xの濃度」で存在する又は「少なくともXの濃度」で存在するポリペプチドは、それゆえ、ポリペプチドの乾燥した調製物及び結晶化した調製物を除くことを意味する。
「レパートリー」とは、多様な変異体の集団であって、例えば、ヌクレオチド配列の異なる核酸変異体またはアミノ酸配列の異なるポリペプチド変異体の集団を意味する。本発明のライブラリーは、ポリペプチド又は核酸配列のレパートリーを包含する。本発明においては、ポリペプチドのレパートリーは、一般的にリガンドに対する結合部位および標的リガンドに対する結合部位を含有するように設計することが好ましい。これらの結合部位は、重複していてもよく、または分子の同一の領域内に位置していてもよいが、特異性を異にすることが好ましい。本発明に用いるライブラリーは、少なくとも1000のメンバーを含むポリペプチドのレパートリーを含む。
本明細書で用いるライブラリーという用語は、異種のポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリーは、一本鎖ポリペプチドまたは核酸配列を含むメンバーで構成されている。この場合、「ライブラリー」は、「レパートリー」と同義である。ライブラリーメンバー間の配列の相違が、ライブラリーにおける多様性を担っている。ライブラリーは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形態をとることもあり、または核酸のライブラリーで形質転換された生物体もしくは細胞(例えば、細菌、ウイルス、動物または植物細胞など)の形態である場合もある。好ましくは、個々の有機体又は細胞は、1又は限られた数のライブラリーのメンバーを含む。核酸によってコードされるポリペプチドを発現させるために、核酸を発現ベクターに組込むことが好ましい。従って、好ましい態様では、ライブラリーは宿主生物体の集団の形態を取る場合もあり、この場合、各生物体は、発現するポリペプチドメンバーを生成し得る核酸のライブラリーの単一のメンバーを有する発現ベクターを1コピー以上含有する。即ち、宿主生物の集団は遺伝子的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードすることができる。
本明細書で用いる「ポリマー」の語は、単量体単位を繰り返して有する巨大分子を意味し、最適に置換されている、直鎖又は分岐鎖を有する、ポリアルキニル, 又は ポリオキシアルキニル分子 又は分岐、非分岐のポリサッカライド等の合成又は天然のポリマーを意味する。ここで用いるポリマーは、好ましくは、最適に置換されている又は分岐鎖の、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)、又は、ポリ(ビニルアルコール)及びそれらの誘導体を意味する。
本明細書において、「PEG」又は「PEGポリマー」の語は、ポリエチレングリコール及びより具体的には、PEGの誘導体、スクシニミジルプロピオネート、ベンゾトリアゾル活性エステル、マレイミド、ビニルスルホネート、又はチオール基のPEG誘導体等のN-ヒドロキシスクシニミド活性エステル(N-hydroxylsuccinimide active ester)を含むがこれらに限定されない。具体的なPEGの形態は、PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS、PEG-0-CH2-NHS、PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS、PEG-S-CH2CH2-CO-NHS、 PEG-02CNH-CH(R)-CO2-NHS、PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS、及びPEG-O-CH2-CO2-NHSである。これらの式においてR は(CH2)4NHCO2 (mPEG)である。本発明に有用なPEGは、単一のポリマーの中に複数のPEG部分が存在している直線、又は、分岐分子である。より具体的には、好ましいPEGコンフォメーションは、以下のものを含むがこれらに限定されない。
Figure 0005087274
 本発明明細書で用いる「スルフヒドリル基選択試薬」の語は、チオール含有アミノ酸にPEGポリマーを結合させるのに有用な試薬である。システインのアミノ酸残査上にあるチオール基は、スルフヒドリル選択試薬と相互作用するので特に有用である。本発明に有用なスルフヒドリル選択試薬は、マレイミド、ビニルスルホン及びチオールを含むがこれらに限定されない。システイン残基に結合させるためのスルフヒドリル選択試薬の使用は本発明の技術分野で知られており、必要に応じて本発明に用いることができる(例えば Zalipsky, 1995,Bioconjug. Chem. 6:150、 Greenwald et al., 2000, Crit. Rev.Ther. Di ug Carrier Syst. 17:101及びHerman et al., 1994, Macromol. Chem. Phys. 195:203参照のこと)。
本明細書で用いる「抗原」は、抗体、又は、抗体の結合領域(例えば、可変ドメイン)に結合する。通常、抗原は、in vitroにおいて、抗体の反応性を高める能力がある。抗原は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、糖質、又は、他の分子であり、マルチサブユニット分子を含む。一般的に、免疫グロブリン可変ドメインは、特定の抗原に対する標的特異性により選択される。
ここで用いる「エピトープ」の語は、抗体単一可変ドメインＶＨ／ＶＬペアが結合するための構造単位を言う。エピトープは、抗体に対する最小結合部位であると定義され、したがって、抗体に特異的な標的を示す。抗体単一可変ドメインのケースでは、エピトープは、独立して可変ドメインが結合する構造の単位をいう。
本明細書で用いる、抗体単一可変ドメインについて用いられる「中和する」の語は、ポリペプチドが、測定可能な標的抗原の活性又は機能を、阻害する(例えば、完全に又は少なくとも部分的に抑制するあるいは消失する)ことを意味する。ポリペプチドが「中和された」ポリペプチドであるとは、もし、測定可能な標的細胞の活性又は機能が、少なくとも50％まで、好ましくは、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％又はそれ以上で、100％(すなわち、標的領域の影響又は機能が検出されない)まで抑制されるように、減らされることを言う。この標的抗原の測定可能な活性又は機能の減少は、そのような活性又は機能の1以上の指標を測定する標準的方法を用いて当業者が測定することができる。例としては、標的がTNFαであるときには、中和活性は、L929細胞死滅アッセイ、又は、TNFα誘発性の細胞活性を測定するHUVECのELAM-1でTNFα誘発性発現を抑制する抗体単一可変ドメインの能力を測定して解析することができる。本明細書で用いる「中和する」の同義語として、「細胞毒性の抑制」の語があり、この語は、例えば、L929細胞死滅アッセイを用いて、測定される細胞の死滅を抑制することを意味する、ここで、抑制される細胞毒性は、少なくとも10％又はそれ以上細胞の死滅が減らされることを意味する。
本明細書で用いる、「標的抗原の測定可能な活性又は機能」とは、細胞情報伝達、酵素化成、結合活性、リガンド特異性細胞内移行、細胞殺滅、細胞活性化、細胞生存の促進、及び遺伝子発現を意味するがこれらに限定されない。当業者は、所定の標的抗原に対するそのような活性を測定することができる。好ましくは、本明細書で用いる「活性」は、(1)細胞アッセイに基づくND50；(2)標的リガンドへの親和性、(3)ELISA結合又は(4)レセプター結合アッセイにより定義される。これらの試験を行う方法は当業者に良く知られおり、以下において詳細に説明する。
本明細書で用いる「dAb活性」又は「抗体単一可変ドメインの活性」の語は、抗原に結合する抗体単一可変ドメイン又はポリペプチドの能力を意味する。本明細書で用いる「活性を保持する」の語は、PEGに結合した抗体単一可変ドメインの所定の活性レベルを意味する。このレベルは、PEGに結合している抗体単一可変ドメインと同じ可変ドメインを有するPEGに結合していない抗体単一可変ドメイン又はペプチドの活性の少なくとも10％、好ましくは、少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％及び90％まで、好ましくは、95％、98％、及び100％までである。活性は、上で説明した方法で測定される。より具体的には、PEGに結合していない抗体単一可変ドメイン又はポリペプチドに対するPEGに結合している抗体単一可変ドメイン又はポリペプチドの活性は、抗体単一可変ドメイン又はポリペプチドのモル濃度にもとづいて決められる。すなわち、同じモル数のPEGに結合している抗体単一可変ドメイン又はポリペプチド及びPEGに結合していない抗体単一可変ドメイン又はポリペプチドが、他の全ての条件を等しくした試験に用いられる。特定のPEGに結合している抗体単一可変ドメインが活性を保持しているかどうかについては、PEGに結合している抗体単一可変ドメインの活性を、PEGを有さない同じ抗体単一可変ドメインと比較することが望ましい。
本明細書で用いる「特異的に結合する」の句は、例えば、BIAcoreTM表面プラスモン共鳴システム及びBIAcoreTM動態評価装置(例えばバージョン2.1)の、表面プラスモン共鳴解析により測定される1μM以下の解離定数(Kd)を有する免疫グロブリン抗体単一可変ドメイン又はポリペプチドの抗原への結合を意味する。特定の結合の相互作用に対する親和性又はKdは、好ましくは、1μM以下、好ましくは500nM以下、より好ましくは、100nM以下、より好ましくは、80nM以下、及びより好ましくは、10pMである。
本明細書で用いる、「ヘテロ二量体」「ヘテロ三量体」「ヘテロ四量体」及び「ヘテロ多量体」の語は、2以上の異なる単一の免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド配列の単量体を2、3又はそれ以上(例えば、4、5、6、7、及び8以上)含む分子を意味する。例えば、ヘテロ二量体は、VH1とVH2 並びにVHH1とVHH2のような2のVH配列の組み合わせ、あるいは、VHとVLの組み合わせを含んでいても良い。ホモ二量体、三量体、又は四量体と同様に、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体又はへテロ多量体の単量体は、化学的に単量体を結合することができる。例えば、単量体同士が結合している融合ポリペプチドとして発現することにより、又は、翻訳の後に、個々を直接的に、又は、リンカーを用いて、ジスルフィド結合又はジ-、トリ-又は多価結合部分に結合する。一の態様において、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、又はヘテロ多量体の単量体は、複数のアームを有するPEGポリマーで結合されている。ここで、二量体、三量体、四量体又は多量体の中の個々の単量体は、このPEG複数アームのPEG部分に上で述べたように結合されている。
本明細書で用いる、「半減期」の語は、in vivoにおいて、リガンド(例えば、単一の免疫グロブリン可変ドメイン)の血清中の濃度が、例えば、リガンドの分解により及び/又は、自然の機構により、リガンドが分解又は消去されることにより、50％に減少するまでに要する時間を意味する。本発明の抗体単一可変ドメインは、PEG等の分子に結合していることから、in vivoにおいて安定であり、分解、消去及び/又は撤去に絶えることができると予想され、半減期が増加する。in vivoにおいて機能的な活性が分解等に耐えるならば、dAb又はポリペプチドの半減期は、PEGに結合していない同じdAbよりも長くなる。通常、PEG化 (PEGylate)dAb又はポリペプチドの半減期は、PEG化されていないdAb又はポリペプチドに対して、10%、20%、30%、40%、50%又はそれ以上に増えている。 半減期の幅は2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍又はそれ以上に増やすことも可能である。代替的に、又は付加的に、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、又は100倍、150倍以上に、半減期を増加させることも可能である。本発明にしたがって、PEGに結合している抗体単一可変ドメイン又はポリペプチドは、0.25から170時間の間の半減期を有する。好ましくは、1から100時間の、より好ましくは、30から100時間の、及び、より好ましくは、50時間から100時間のそして、170時間、180時間、及び200時間までの半減期を有する。
本明細書で用いる、PEGに、又は、他のポリマーに結合しているdAb単量体又は多量体に対して使用する「分解への耐性」又は「分解耐性」の語は、PEG又は他のポリマーに結合しているdAb単量体又は多量体が、pH2.0で30分間ペプシンにさらされたときに10％未満まで分解されることを、あるいは全く分解されないことを意味する。本発明のPEG又は他のポリマーに結合しているdAb多量体(例えば、ヘテロ-、又はホモ二量体、三量体、四量体等)に対しては特に、そのような多量体は、pH2.0で30分間ペプシンに曝されたときに5％未満の分解を示すか、あるいは、全く分解されないことが好ましい。
本明細書で用いる「流体力学的サイズ」の語は、水溶液中への分子の拡散に基づいて定められる分子(例えばタンパク質分子)の見かけのサイズを意味する。このサイズがタンパク質粒子の「ストークス直径」又は「流体力学的直径」により与えられている場合には、この水溶液中のタンパク質分子の拡散又は動態は、タンパク質の見かけのサイズに起因する。このタンパク質の「流体力学的サイズ」は、質量及び立体構造に依存している。同じ分子質量を有し、異なる流体力学的サイズを有する2のタンパク質は、タンパク質全体の立体構造が異なる。PEGが結合している抗体単一可変ドメイン(本明細書で開示する抗体単一可変ドメインを含む)の流体力学的サイズは、24 kDa から500 kDa、30から500 kDa、40から500 kDa、50から500 kDa、100から500 kDa 、150 から500 kDa、 200から500kDa、250から500 kDa、300 から500 kDa 、350 から500 kDa、400から500 kDa 及び450 から500 kDaの幅である。好ましくは、本発明のPEG化(PEGylate)dAbの流体力学的サイズは、30 から40 kDa、70 から80 kDa、又は、200から300 kDaである。本発明に用いるのに好ましい、抗体単一可変ドメイン多量体は、50から100kDaの流体力学的サイズを有する。代替的には、抗体単一可変ドメインの多量体は、医薬品に用いられることが望ましい。この多量体は、流体力学的サイズが200kDaより多いことが望ましい。
本明細書で用いる、「TAR１」は、標的抗原がTNFαであるdAbを意味する。
本明細書で用いる「TAR２」は、標的抗原がヒトp55-TNFαレセプターであるdAbを意味する。
発明の詳細な説明
本発明は、ポリマーに結合していないdAbに対して、高められた半減期及びタンパク分解耐性を有する、ポリマーに結合したdAb及びdAbのホモ-及びへテロ多量体を提供する。本発明は、いくつかの態様において、PEGが結合したdAb及びdAb多量体、さらには、少なくとも0.25時間の半減期及び少なくとも24kDaの流体力学的サイズを有する、PEGに結合しているdAb単量体、二量体、三量体、及び四量体に関係する。本発明は同じ抗体単一可変ドメインを含むPEGが結合していない抗体単一可変ドメインの活性と同じ活性を有する、PEGに結合している抗体単一可変ドメインにも関係する。これは、それらのより長い循環時間とその可能性、並びに効果的な活性を有するために、治療効果が増強されているdAb分子を提供する。
一の態様において、本発明は、少なくとも2の非相補的可変ドメインを含むPEGに結合しているdAb多量体を提供する。例えば、このdAbは、VHドメインのペア又はVLドメインのペアを含む。このドメインは、ラクダ科動物由来ではないことが好ましい。このドメインはヒトのドメインか、又は、ヒトフレームワーク領域(FWs)を含み、そして、1以上の異種CDRsであることが好ましい。CDRs及びフレームワーク領域は、所望の免疫タンパク質に対するキャバットの配列データベース（Kabat datebase of Sequences of Proteins of Immunological interest）中に定義されている免疫グロブリン可変ドメインの領域である。一の態様において、このdAbドメインは、ラクダ科由来である。
好ましいヒトフレームワーク領域は、生殖細胞系遺伝子セグメントのDP47及びDPK9である。VH又はVLドメインのFW1、FW2及びFW3が、DP47又はDPK9由来のFW1、FW2、又はFW3の配列を有することが好ましい。このヒトフレームワークは、任意で、本発明のdAb中に用いられるヒトフレームワーク中に5アミノ酸までの、又は、10アミノ酸までのアミノ酸変異を有する、変異体を含んでいてもよい。
単一免疫可変ドメインの調製
本発明の抗体単一可変ドメイン(又はdAb)は、免疫グロブリン可変ドメインの特徴を有する配列を含み、抗原に特異的に結合し(すなわち、500nM又はそれ以下の解離定数を有する)、そして、単一可変ドメインとして抗原に結合する。すなわち、任意の相補的な可変ドメインを有さない、折りたたみ構造を有するポリペプチドドメインである。それゆえ、本発明の抗体単一可変ドメインは完全な抗体可変ドメインの他に、修飾された可変ドメインを含む。例えば１以上のループが抗体可変ドメイン以外の配列で置換されている修飾可変ドメイン及び末端切断されているか又はＮもしくはＣ末端伸張部を含む抗体可変ドメインであって、500 nM 以下 (例えば、 450 nM 以下、400 nM 以下、350 nM以下、 300 nM以下、250 nM以下、200 nM以下、150 nM以下、又は100 nM以下) の解離定数並びに完全長ドメインと同様の解離定数を有する可変ドメインの折りたたみフラグメントを含む。好ましくは、本発明に有用な、抗体単一可変ドメインは、Vkappa及びVlambdaを含むVHH、VH及びVLから成る群より選択される。
単一免疫グロブリン可変ドメインは、幾多の方法で調整することができる。該ドメインを調製するために既知の調製(例えば、増幅、変異誘発等)方法及び核酸配列の操作方法を用いることができる。
一の手段は、所望の抗原に結合することできるクローン化された抗体の重鎖又は軽鎖のVH又はVL領域を増幅及び発現させることである。VH及びVLドメインの境界については、Kabat et al.(1991、上記)に定義されている。重鎖及び軽鎖遺伝子のVH及びVLドメインの境界に関する情報は、所与の抗原に結合する抗体をエンコードし、かつ、クローン化された重鎖及び軽鎖のコード配列からVドメインを増幅するためのPCRプライマーに用いることができる。増幅されたVドメインは、適切な発現ベクター例えば、pHEN-1(Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19;4133-4137)に挿入され、単独で、あるいは、他のポリペプチド配列と融合した形態で、発現される。発現されたVH、あるいは、VLドメインは、他の重鎖又は軽鎖ポリペプチドから単離するために、所望の抗原に対する親和性を利用してスクリーニングされる。本発明の全ての側面において、結合のスクリーニングは本発明の技術分野において、既知の方法又は以下で述べる方法により行う。
VH又はVLドメインのレパートリーは、例えばファージディスプレイ法のように、所望の抗原に対するパニング(panning)によりスクリーニングする。バクテリオファージディスプレイライブラリー及びラムダファージ発現ライブラリーの構築方法は、本発明の技術分野でよく知られており、以下の文献に記載されている：McCafferty et al., 1990, Nature348 : 552; Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:4363 ; Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832; Burton et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88:10134; Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:4133; Chang et al., 1991, J. Immunol. 147:3610; Breitling et al., 19917 Gene 104:147 ; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581 ; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 89:4457; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol., 22:867 ; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267:16007; 及びLerner et al. (1992) Science, 258 : 1313。ScFvファージライブラリーについては、例えば、Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85:5879-5883 ; Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87: 1066-1070;McCafferty et al., 1990, 上記 ; Clackson et al.,1991, 上記 ; Marks et al., 1991, 上記 ; Chiswell etal., 1992, Trends Biotech. 10:80 ; 及び Marks et al., 1992, 上記に記載されている。バクテリオファージの外殻タンパク質に展開されているscFvライブラリーの各種の態様も開示されている。ファージディスプレイ法の精錬されたアプローチも、知られている。例えば、W0 96/06213 及びW0 92/01047 (Medical Research Council et al. ) 及び W0 97/08320 (Morphosys, 上記)である。
VH又はVLドメインのレパートリーは、免疫グロブリンの天然のレパートリー、又は、合成レパートリーである。天然のレパートリーは、例えば、ヒトを含む1以上の動物から収穫した免疫グロブリンを発現している細胞から調製する。そのようなレパートリーは「野生型」、すなわち、ヒトの胎児又は新生児の免疫グロブリンを発現している細胞から調製されたもの、又は、再調整されたもの、すなわち、例えば、成人のヒトB細胞から調整されたものである。天然のレパートリーは、例えば、Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581 及びVaughan et al., 1996, Nature Biotech. 14: 309に開示されている。必要であれば、結合特性が改良されている変異体を生産及び選択するために、天然のレパートリーから同定されたクローン又は標的抗原に結合する任意のレパートリーは、その後変異誘発を受け、スクリーニングされる。
シングル免疫グロブリン可変ドメインの合成レパートリーは、クローンされたVドメインの中に人工的に多様性を導入して調製される。合成レパートリーは、例えば、Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227:381 ; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Nissim et al., 1994, EMBO J. 13: 692; Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13: 3245; DeKriuf et al., 1995, J. Mol. Biol. 248: 97及びWO 99/20749に開示されている。
従来の抗体の抗原結合ドメインは、2の配列領域を含む；重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)(Vκ又はVλでも良い)である。そのような抗体の抗原結合サイトは、6のポリペプチドループで構成されている；VHドメインの3つ(H1、H2及びH3)及びVLドメインの3つ(L1、L2及びL3)である。これらのループの境界は、例えば、Kabat et al. (1991, 上記)に記載されている。VH及びVLドメインをエンコードしているV遺伝子の多様な一次レパートリーは、遺伝子セグメントの再配列(転移)の組み合わせによりin vivoで生産される。VH遺伝子は3の遺伝子セグメント、VH、D及びJHの組換えにより生産される。ヒトでは、ハプロタイプに応じて、約51の機能的なVHセグメント(Cook and Tomlinson (1995) Immunol Today 16: 237)、25の機能的なDセグメント(Corbett et al. (1997) J. Mol. Biol. 268: 69)及び6の機能的なJHセグメント(Ravetch et al. (1981) Cell 27: 583)がある。VHセグメントは、VHドメイン(H1及びH2)の第一及び第二抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をエンコードし、VH、D及びJH断片は、VHドメインの第3の抗原結合ループ(H3)を形成するために結合する。
VL遺伝子は、2の遺伝子セグメント、VL及びJLのみの組換えにより生産される。ヒトにおいて、これらは、ハプロタイプに応じて、約40の機能的なVκセグメント(Schable andZachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374: 1001)、31の機能的なVλセグメント(Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220;Kawasaki et al. (1997) Genome Res. 7: 250)、5の機能的なJκセグメント(Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 1516)及び4の機能的なJλセグメント(Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med. 172: 609)がある。VLセグメントはVLドメインの第一及び第二抗原結合ループ(L1及びL2)を形成するポリペプチド鎖の領域をエンコードし、VL及びJL断片は、VLドメインの第3の抗原結合ループ(L3)を形成するために結合している。これらの一次レパートリーから選択された抗体は、少なくとも中程度の親和性を有し、大部分の抗原に結合するのに十分な多様性を有している。高親和性抗体は、再配列された遺伝子の「親和性成熟」によりin vivoにおいて生産される。すなわち、点(突然)変異が生成され、改善された結合性に基づく免疫システムにより選択される。
抗体の構造及び配列の解析は、6の抗原結合ループのうちの5つ(H1、H2、LI、L2、L3)が、いくつかの主鎖配位構造又は極限構造を有することを示している(Chothia and Lesk(1987) J. Mol.Biol. 196 : 901 ; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877)。主鎖構造は、(i)抗原結合ループの長さにより、及び(ii) 抗原結合ループ及び抗原フレームワーク中の所定の位置における特定の残基又は残基のタイプにより同定される。ループ長及び残基を解析することにより、ヒト抗体配列の大部分をエンコードしているHI、H2、LI、L2 及びL3の主鎖構造の使用可能性を予測することができる(Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799 ; Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628 ; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220)。H3領域は、配列、長さ及び構造の点からより多様である(D断片の使用により)けれども、長さとループ及びフレームワークの中の所定の位置にある特定の残基又は残査のタイプに依存する短ループ長に対するいくつかの主鎖構造も形成する (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters 399:1)。
本発明の一の態様において、多様性は各種抗原結合ループのCDRsの中の任意の部位に、合成レパートリーを付加することにより作り出すことができる。この試みは、大部分のVドメインにおいて、ほとんど折りたたみ構造を有さず、それゆえ、抗原に結合する能力が低い分子を作り出すことになる。抗原結合ループの主鎖構造に寄与する残基をよく知ることで、VH又はVLドメインの合成レパートリーに多様性を与える特定の残基を同定することができる。すなわち、多様性を作り出すためには、主鎖構造を維持するのに必須ではない残基を導入することが良い。例としては、L2ループの多様性を形成するための従来の試みは、Kabat et al(1991,上記)により定義されるCDR(CDR2)に対応する、７残基の全てを多様化することであった。しかしながら、L2については、50番と53番の位置が、自然発生抗体の中で多様化しており、この部分が抗原と接触することが観察されている。したがって、好ましいアプローチは、このループの中のそれらの2の残基のみを多様化させることである。このことは、抗原結合特異性について多様な幅を作り出すために必要な機能的多様性の観点から有意な改善である。
一の側面において、合成可変ドメインレパートリーは、人工的に多様化された生殖細胞のVH又はVκ配列に基づいて調製される。例えば、VHドメインレパートリーは、クローン化された生殖細胞VH遺伝子セグメントのV3-23/DP47(Tomlinson et al. , 1992, J. Mol. Biol. 227: 7768)及びJH4bに基づいている。Vκドメインレパートリーは、例えば、生殖細胞Vκ遺伝子セグメントWO O2/O12/DPK9(Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827)及びJκ1に基づいている。多様性は、これらは、例えば、PCR変異誘発を用いて、他の遺伝子セグメントの中に導入することにより作り出すことができる。多様性は、例えば、PCRのエラー(Hawkins, et al., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889)又は化学的突然変異誘発により、ランダムに作り出すことができる。しかしながら、上で議論したように、多様性を作り出すに際しては特定の残基を標的とすることが好ましい。所望の残基は、全てのアミノ酸及びTAG停止コドンをエンコードする変異プライマーを用いた(N=G、A、T又はC、及び、K＝G又はTである、IUPAC命名法を用いた)NNKコドンを導入することにより、標的とすることがさらに好ましい。NNNコドン(付加的な停止コドンであるTAG及びTAAを生成する)、DVTコドン((A/G/T)(A/G/C)T)、DVCコドン((A/G/T)(A/G/C)C)及びCVYコドン( (A/G/T) (A/G/C) (C/T))を含む同じような結果を招く他のコドンも使用できる。DVTコドンは、天然のヒト抗体の抗原結合部位のアミノ酸残基の分布に非常によく似ており、22％セリン、11％トリプシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギンン酸、トレオニン及びシステインをエンコードする。レパートリーは、多様化させる各部位における、選択され生成されたコドンを有するPCRプライマーを用いて作る。PCR変異誘発は、本発明の技術分野においてよく知られている。しかしながら、本発明に有用な、プライマーデザインの意図及びPCR変異誘発については、標題「PCR変異誘発」のセクションで説明する。
多様化されたレパートリーは、例えば、WO 99/20749が開示するように、本発明の技術分野で知られているファージ提示ベクター内でクローンされる。一般的に、本発明の実施に必要な、核酸分子及びベクター構築物は、本発明の技術分野で利用可能なものであり、Sambrooket al. (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA等の標準的な実験手順に定義されているように、構築し、操作することができる。
本発明の核酸の操作は、通常、組換えベクター内で行うことができる。本明細書で用いる、「ベクター」の語は、異種DNAを発現及び/又は複製するために、それらを細胞内導入するための別個の因子である。そのようなベクターを選択し、構築し、使用する方法は、本技術分野において、よく知られている。バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、人工染色体及びエピソームベクターを含む多くのベクターが利用可能である。そのようなベクターは、単純なクローニング及び変異誘発に用いる。また、本発明のレパートリー(又はプレ-レパートリー)に用いるベクターの典型例としては、発現ベクターが採用される。本発明に使用するベクターは、0.25キロベース(kb)から40kbの長さを有し、所望のサイズの配列をコードするポリペプチドに適用するように選択される。適切な宿主細胞は、in vitroでのクローニング操作の後に、ベクターで形質転換する。このベクターは、クローニング(又はポリリンカー)部位、複製の始点、及び少なくとも1の選択マーカーを通常含んでおり、加えて各種の機能要素も含んでいる。所与のベクターが、発現ベクターであるなら、それはさらに、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写停止(コドン)及びシグナル配列の中の1以上を有している。これらの要素は、本発明のポリペプチドレパートリーメンバーをエンコードしている遺伝子に作動可能に結合するために、クローニングサイトに近いところに位置している。
クローニングベクター及び発現ベクターの両者は、一般に、このベクターが1つ以上の選ばれた宿主細胞の中の複製に必要な核酸配列を含んでいる。通常、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主細胞の染色体DNAとは無関係に、ベクターが複製するための配列であり、複製起点又は自己複製のための配列を含んでいる。そのような配列は、各種バクテリア、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322の複製の起点は大部分のグラム陰性バクテリア、2ミクロンのプラスミドの起点は、酵母に適している。各種ウイルス由来のもの(例えばSV40、アデノウイスル)は、哺乳類の細胞中のクローニングベクターとして使用するのに適している。通常、複製の起点は、それらが、COS細胞等の高い複製レベルを有する哺乳類の細胞の中で使用される限りは、哺乳類の発現ベクターを必要としない。
クローニング又は発現ベクターは、選択マーカーとも言われる選択遺伝子を含んでいることが好ましい。この遺伝子は、形質転換された宿主細胞が選択培地の中で生存又は成長するために必要なタンパク質をエンコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換していない宿主細胞は、それゆえ、同様の培地では生存することができない。典型的な選択遺伝子は、抗体及び他の毒性(例えば、アンピリシン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリン)に対して耐性を付与し、栄養要求株欠損を補い、そして、成長培地中に使用できない臨界的な栄養素となるタンパク質をエンコードする。
本発明のベクターの複製は、ほとんどが、大腸菌の中で行うことから、大腸菌選択マーカー、例えば、アンピリシン抗生物質耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子を用いる。これらは、pBR322等の大腸菌プラスミド又はpUC18又はpUC19等のpUCプラスミドから得ることができる。
発現ベクターは、通常、宿主有機体に認識され、所望の配列に作動可能に結合するプロモーターを含んでいる。そのようなプロモーターは、誘発、構築することができる。「作動可能に結合」の語は、所与のコンポーネントが、所望の方法で機能するような位置にあることを意味する。コード配列に「作動可能に結合」している制御配列は、制御配列と互換性のある環境下で、コード配列が発現するように結合している。
原核生物の宿主に用いるのに適切なプロモーターは、例えば、β-ラクタマーゼ及びタクトースプロモーターシステム、アルカリフォフファターゼ、トリプトファンプロモーターシステム、及び、tacプロモーター等のハイブリッドプロモーターを含む。バクテリアのシステムに使用するプロモーターも、通常、コード配列に作動可能に結合しているシャイン-ダルガ−ノ(Shine-Dalgarno)配列を含んでいる。
本明細書で述べるライブラリー又はレパートリーに対する好ましいベクターは、ライブラリーメンバーのポリペプチドに対応する核酸配列を発現することができる発現ベクターである。従って、選択は、発現しているポリペプチドライブラリーメンバーのシングルクローンの、セパレートプロパゲーション(separate propagation)及び発現により、又は、任意の選択提示システムを用いて実施する。好ましいベクターは、大腸菌の複製起点(二本鎖の複製起点)を有する、ファージミドベクター及び複製起点(一本鎖DNAの生産のための)を有するファージである。そのようなベクターの操作及び発現は、当技術分野において良く知られている(Hoogenboom and Winter(1992)上記, Nissim et al. (1994)上記)。簡単に言うと、このベクターは、ファージミドに選択性を付与するβ-ラクタマーゼ又は他の選択マーカー遺伝子、及び、(発現されたポリペプチドをペリプラズム空間に導く)リーダー配列を(N又はC末端に)含み、発現カセットの上流にあるlacプロモーター、(ライブラリーメンバーの核酸バージョンのクローニングのための)多重クローニングサイト、任意で(検出のための)1以上のペプチドタグ、任意で1以上のTAG停止コドン及びファージタンパク質pIIIを含む。バクテリアの発現及び/又はファージあるいはファージミドディスプレイに用いるリーダー配列は、pelB、stII、ompA、phoA、bla、及びpelAを含む。各種サプレッサー大腸菌及び非サプレッサー系統の大腸菌を、グルコース、イソプロピルチオβ-D-ガラクトシド(IPTG)又はVCS M13等のヘルパーファージと共に使用すると、このベクターは、ポリペプチドライブラリーのメンバーのみを多量に生産し、表面に少なくとも1のポリペプチドpIIIフュージョンを含むファージを生産することができる。好ましいベクターの例は、pIIIフュージョンタンパク質の生産が、グルコースの存在下で抑制され、LacZプロモーターの下でIPTGによる誘発をおこなうことができる、pHEN1ファージミドベクターである(Hoogenboom et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19: 4133-4137; 例えばWO 03/031611に記載の配列番号7が利用可能である)。該ベクターは、例えば、TG1の大腸菌のサプレッサー系統で育成すると、IIIフュージョンタンパク質遺伝子を生産し、ファージの中に梱包される。また、例えば、HB2151等の非サプレッサー系統で育成すると、バクテリアのペリプラズム及び培地の中への可溶性融合タンパク質の分泌が起こる。III遺伝子の発現は、ヘルパーファージでの感染を阻害することから、ファージミドベクターを有するバクテリアは、VCSM13ヘルパーファージで感染させる前に、グルコースの存在下で繁殖させる。
本発明のベクター構築物は、従来の結合技術により構築することができる。所望のベクターを生成するために、単離ベクター又はDNA断片を、開列、偏性して、所望の形態に再結合する。必要ならば、構築されたベクターの中に正しい配列が存在するかどうかについて、配列解析を標準的方法を用いて行ってもよい。発現ベクターを構築するための最適な方法、in vitro転写の調整方法、DNAを宿主細胞に導入するために最適な方法及び発現と機能を評価するための解析方法は当該技術分野において知られている。サンプル中に存在する遺伝子配列は、DNA、RNA又はタンパク質に対するノザン又はサザン解析、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、in situハイブリダイゼーション、免疫細胞学的方法並びに核酸又はタンパク質の配列解析等の従来技術を用いて検出するか、あるいは、その増殖及び/又は発現量を解析する。当業者は必要においてこれらの方法を変更して用いることができる。
抗体単一可変ドメインを構成することに用いるためのスカフォード
主鎖立体配座の選択
免疫グロブリンスーパーファミリーの全メンバーは、類似したポリペプチド鎖の折りたたみ構造を有する。例えば、抗体はそれらの一次配列に関して極めて多様であるが、配列と結晶構造の比較により、抗体の６つの抗原結合ループのうち５つ(H1、H2、L1、L2、L3)は、限定された数の主鎖立体配座または正規構造をとる(Chothia Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196:901;Chothia et al.(1989) Nature,342:877)ことが明らかにされた。従って、ループ長および主要残基の分析により、大多数のヒト抗体において見出されるH1、H2、L1、L2およびL3の主鎖立体配座の予測が可能となった(Chothia et al. (1995)EMBO J.,14: 4628; Williams et al.(1996). J.Mol. Biol.,264: 220)。H3領域は配列、長さおよび構造に関してさらに一層多様である(Dセグメントの使用による)が、それはまた長さおよび特定残基の存在もしくは残基のタイプに依存する短いループ長に対する限定された数の主鎖立体配座を、ループと抗体フレームワークにおける主要位置に形成する(Martin et al.(1996)J. Mol.Biol., 263: 800; SHiRAi et al．(1996) FEBS Letters, 399:1)。
本発明のPEGに結合している抗体単一可変ドメイン単量体および多量体は、VHドメインのライブラリーおよび/またはVLドメインのライブラリー等のライブラリーから容易に構築できる。さらに、本発明のPEG結合dAbsは、それ自体がライブラリーの形態で提供されてもよい。本発明の一の態様では、抗体単一可変ドメインのライブラリーが設計されて、特定のループ長と主要残基が、メンバーの主鎖立体配座に対して最適になるように選択される。好都合なことには、これらは上記のように自然界において見出される免疫グロブリンスーパーファミリー分子の現実の立体配座であり、それらが非機能的である可能性は少ない。生殖細胞のV遺伝子セグメントは、抗体またはT細胞レセプタ・ライブラリーを構成するための１つの好適な基本フレームワークとして用いることができ、他の配列もまた有用である。少数の機能的要素が変更された主鎖立体配座を有するように、低い頻度で変形物が生じる可能性があるけれども、それらは機能に影響を及ぼさない。
また正規構造理論は、リガンドによってエンコードされる異なる主鎖立体配座の数を評価するために、リガンド配列に基づいて主鎖立体配座を予測するために、および正規構造に影響を及ぼさない多様化のための残基を選択するために有用である。ヒトV領域においては、L1ループは4つの正規構造のうちの1を採用することができ、L2ループが単一の正規構造をもつこと、およびヒトVK領域の90％がL3ループのための4つあるいは5つの正規構造の1つをとる(ToMlinson et al.(1995) 上記)ことは公知であり、従ってVκドメイン単独で、異なる正規構造が組み合わさって異なる主鎖立体配座の領域を創ることができる。VHドメインがL1、L2およびL3ループのための正規構造の異なる領域をエンコードすると仮定し、およびVKおよびVλ領域が、H1およびH2ループのためのいくつかの正規構造をエンコードするVH領域のいずれかと対になることができると仮定すると、これらの５つのループに対して観察される正規構造の組み合わせ数は極めて多数となる。このことは、幅広い結合特異性を生成のために、主鎖立体配座において多様性の生成が不可欠であり得ることを意味する。
しかしなから、全ての抗原を対象とする十分な多様性を生成するために、単一の公知の主鎖立体配座に基づく抗体ライブラリーを構成することにより、予想に反して実質的な主鎖立体配座における多様性は必要でないことが分った。さらに驚くべきことには、単一主鎖立体配座が共通構造である必要はなくて、単一の自然に生じる立体配座を、全ライブラリーのための基礎として用いることができる。従って一態様では、本発明のポリマー結合抗体単一可変ドメインは、単一の公知の主鎖立体配座を有する。
選択される単一主鎖立体配座は、当該イムノグロブリンスーパーファミリーの分子間でありふれているのが好ましい。自然に生じるかなりの数の分子が、それを採用するために観察されるときには、立体配座はありふれている。従って本発明の好ましい態様では、イムノグロブリンドメインの各結合ループの異なる主鎖立体配座の自然な生成が別途考慮されて、次に異なるループのための主鎖立体配座の所望の組み合わせをもつ自然に生じる可変ドメインが選択される。利用可能なものがない場合には、それにもっとも近い等価物が選択されてもよい。異なるループのための主鎖立体配座の所望の組み合わせは、所望の主鎖立体配座をエンコードする生殖細胞遺伝子セグメントを選択することによって創られることが好ましい。選択される生殖細胞系遺伝子セグメントは、自然界において全ての自然な生殖細胞遺伝子セグメントが頻繁に発現される(expressed)ことがより好ましく、および全ての自然な生殖細胞遺伝子セグメントがもっとも頻繁に発現されることが最も好ましい。
抗体単一可変ドメインもしくはそのライブラリーを設計することにおいて、６つの抗原結合ループのそれぞれに対する異なる主鎖立体配座の発生率を別個に考慮してもよい。H1、H2、L1、L2およびL3に対して、自然に生じる分子の抗原結合ループの20％〜100％の間で採用される所与の立体配座が選択される。 通常、それらの発生率は35％以上(すなわち35％と100％の間)であり、理想的には50％以上またはむしろ65％以上である。大半のH3ループは正規構造をもたないから、正規構造を表示するそれらのループの間にありふれている主鎖立体配座を選択することが好ましい。各々のループに対しては、その結果、自然のレパートリーでもっとも頻繁に観察される立体配座が選択される。ヒト抗体において、各ループのための最も知られた正規構造(CS)としては以下のものが挙げられる：H1-CS1(発現されるレパートリーの79％)、H2-CS3(46％)、VKのL1-CS2(39％)、L2-CS1(100％)、VKのL3-CS1(36％)(計算は、K：Sの比率を70:30と仮定した。Hood et al.(1967)ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.48:133)。正規構造をもつH3ループのために、残基94から残基101への塩橋をもつ７つの残基のCDR3長(Kabat et al.(1991) Sequences of Proteins of iH2771 unological interest, U.S.Department of Health and Human Services)は、最も一般的と思われる。少なくとも16のヒト抗体配列が、この立体配座を形成するのに必要とされるH3長と主要残基とを有するEMBLデータライブラリー中にあり、かつ少なくとも2つの結晶構造が、抗体モデリング(2cgrおよび1tet)のための素地として用い得るプロテインデータバンク中にある。正規構造のこの組み合わせで最も頻繁に発現される生殖細胞系遺伝子セグメントは、VHセグメント3-23(DP-47)、ＪHセグメントＪH4ｂ、Vκセグメント02/012(DPK9)およびJκセグメントJκ1である。また、VHセグメントDP45およびDP38も好適である。従ってこれらのセグメントは、ライブラリーを構成するために素地として所望の単一主鎖立体配座と組み合わせて用いることができる。
あるいは、隔離状態にある結合ループのそれぞれに対して、単一主鎖立体配座を、異なる主鎖立体配座の自然な生成に基づいて選択する代わりに、単一主鎖立体配座を選択するための素地として、自然発生する主鎖立体配座の組み合わせが利用される。抗体の場合には、例えば抗原結合ループの任意の2つ、3つ、4つ、5つもしくはすべての6つのための正規構造組み合わせの自然な生成を定義することができる。この場合に、選択される立体配座が自然に生じる抗体中にありふれていることが好ましく、選択される立体配座が自然のレパートリーにおいて最も頻繁に観察されることが最も好ましい。従って、ヒト抗体において、例えばH1、H2、L1、L2およびL3の5つの抗原結合ループの自然の組み合わせが考慮される場合には、正規構造の最も頻繁な組み合わせが確定されて、それから単一主鎖立体配座を選択するための素地として、H3ループのための最もよく知られる立体配座と組み合わせられる。
正規配列の多様化
いくつかの公知の主鎖立体配座もしくは好ましくは単一の公知の主鎖立体配座を選択することにより、本発明による抗体単一可変ドメインもしくは本発明で用いるためのライブラリーは、構造的および/または機能的な多様性をもつレパートリーを生成するために、分子の結合部位を変化させることによって構成することができる。このことにより、変異体が活性領域を有し、それらの構造においておよび/または機能において十分な多様性をもつように生成することができる。
所望の多様性は、通常選択される分子を変化させることによって、１つ以上の位置において生成される。変化されるべき位置はランダムに選択されてもよくて、または好ましくは意図的に選択される。それから変異体は、無作為により、その間に天然であるかまたは合成の任意のアミノ酸もしくはその類似体で既存のアミノ酸を置換し極めて多数の変異体を生成するか、もしくはアミノ酸の１つあるいはそれ以上の確定したサブセットで既存のアミノ酸を置換して、より限定された数の変異体を生成するかのいずれかによって達成することができる。
そのような多様性を導くために、種々の方法が報告されている。変異性のPCR(Hawkins et al. (1992)J.Mol.Biol.,226:889)、化学的変異誘発(Deng et al.(1994)J.Biol.Chenu.,269:9533)または細菌突然変異誘発遺伝子菌株(Low et al. (1996)JMol.Biol.,260:359)は、分子をエンコードする遺伝子へ無作為変異を導くために用いることができる。また、選択位置を変異させるための方法も当業界において公知であり、PCRを利用して、もしくは利用しないで不適当なオリゴヌクレオチドまたは退化したオリゴヌクレオチドを利用することを含んでいる。例えば、抗原結合ループに対する突然変異をターゲットとすることによって、いくつかの合成抗体ライブラリーが創出された。ヒト破傷風トキソイド結合FabのH3領域は、新しい結合特異度の領域を創出するために無作為化された(Barbas et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:4457)。突然変異したフレームワーク領域をもつ大規模なライブラリーを生成するために、無作為または半無作為のH3およびL3領域が生殖細胞Ｖ遺伝子セグメントに付加された(Hoogenboom & Winter (1992)J : Mol. Biol.,227: 381; Barbaset al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA,89:4457; Nissim et al (1994) EMBOJ.,13: 692; Griffiths et al.(1994) EMBO J,13:3245;De Kruif et al.(1995) J.Mol.Biol.,248:97)。他の抗原結合ループの一部または全てを含むよいに、そのような多様化が作り出された(Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al.(1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, W097/08320, supra)。
ループ無作為化は、H3のみ、ならびに同様にその他の5つのループのための多数の変異体のために約1015以上の構造を創出する可能性をもつから、変異技術を用いて、もしくは無細胞方式(cell freeSystem)を用いて全ての可能な組み合わせを表示するライブラリーを生成することは不可能である。例えば現在までに構成された最大規模のライブラリーの１つにおいて、この設計のライブラリーの一部分でしかない6×1010通りの異なる抗体が生成されているだけである(Griffiths et al.(1994)上記)。
好ましい実施態様では、分子の所望の機能を創造もしくは変更することに直接関与する残基のみが多様化されている。多くの場合、この機能とは標的結合性であり、従ってターゲット結合部位に多様性が集中する。一方では分子を全体的に束ねること、もしくは選択された主鎖立体配座を保持することのために不可欠な残基を変化させないように防止する点における多様性もある。
正規配列の抗体ドメインに適用する際の多様化
抗体単一可変ドメインの場合、標的に対する結合部位は多くの場合に抗原結合部位である。従って、極めて好ましい態様において、本発明は抗原結合部位のそれらの残基のみが変更される抗体単一可変ドメインの集成体のライブラリーもしくはそれのためのライブラリーを提供する。これらの残基はヒトの抗体レパートリーにおいて極めて多様であり、かつ高い特異性で抗体/抗原複合体に接触することが知られている。例えばL2において位置50と位置53は、自然に生じる抗体中にで多様であり、かつ抗原と接触することが観察されることが知られている。これとは対照的に、従来の研究法は、Kabat et al.(1991,supra)によって定義される対応する相補性決定領域(CDR1)において全ての残基、すなわち本発明によって用いるためにライブラリーにおいて多様化される2つと比較して、ほぼ７つの残基が多様化されている。このことは、抗原結合特異度の範囲を創造するために必要とされる機能的な多様性に関して著しい改良を意味する。
現実に、抗体多様性は2つのプロセス、すなわち単純なプライマーリー・レパートリー(いわゆる生殖細胞系と接合部多様性)を創造する生殖細胞系V、DならびにJ遺伝子セグメントの体細胞組換えと、再編成されたＶ遺伝子に帰着する体細胞超変異の結果である。体細胞超変異が、プライマーリー・レパートリー中に高度に維持される(Tomlinson et al. (1996) J.Mol.Biol.,256:813を参照のこと)多様性を抗原結合部位の周辺部領域に広めるのに対して、ヒト抗体配列の分析法はプライマーリー・レパートリーにおける多様性が抗原結合部位の中央部に集中されることを示した。この相補性は、配列スペースを調査するための有効なストラテジーとして発展したので、明らかに抗体特有ではあるが、それは他のポリペプチド・レパートリーに容易に適用することができる。変更される残基は、ターゲットのために結合部位を形成する残基のサブセットである。ターゲット結合部位における残基の別の(オーバーラップを含む)サブセットは、選択時に、必要に応じて異なる段階で多様化される。
抗体レパートリーの場合には、いくらかの、しかし全てではない抗原結合部位の残基が多様化される場合に初期の「単純な」レパートリーが創出される。これに関連して本明細書中で用いているように、「単純な」という用語は、所定のターゲットをもたない抗体分子をいう。これらの分子は、まだ免疫系が多種多様な抗原性刺激に曝されていない胎内の、もしくは生まれたばかりのヒトの例のように、免疫多様化を経験していないヒトのイムノグロブリン遺伝子によってエンコードされる分子に類似している。このレパートリーは、その後、抗原またはエピトープの領域に対応して選択される。必要とされる場合には、初期のレパートリーにおいて多様化される領域の外側で、更なる多様性が導かれ得る。この成長したレパートリーは、変更された機能、特異性または親和性について選択される。
本発明で用いるためのライブラリーの構造において選択される位置の多様化は、ポリペプチドの配列を特定する暗号配列を可能な限り数多くのアミノ酸(全20個もしくはそのサブセット)をその位置に組み込むことができるように変更することによって、通常は核酸レベルにおいて実現される。最も用途の広いコドンはIUPAC命名法におけるNNKである。そしてそれは、TAG終止コドンはもちろん、全てのアミノ酸をエンコードする。NNKコードンは、必要とされる多様性を導くために好ましく用いられる。TGAおよびTAAの更なる終止コードンの生成を導くNNNコードンを含めて、同じ目的を実現するための他のコードンもまた有用である。
ヒト抗体の抗原結合部位において側鎖の多様性は、特定のアミノ酸残基に有利に働くように偏り（バイアス）を有する。VH、VLおよびV領域のそれぞれにおける10個の最も多様な位置のアミノ酸組成を要約すると、側鎖多様性の76％以上が、ただ7つの異なる残基に由来するものであって、これらは、セリン(24％)、チロシン(14％)、アスパラギン(11％)、グリジン(9％)、アラニン(7％)、アスパラギン酸塩(6％)およびスレオニン(6％)である。主鎖柔軟性を提供し得る親水性残基と小規模の残基へのこの偏り（バイアス）が、広い領域にわたる抗原もしくはエピトープを結合するための表面を発生することをを反映するであろうし、プライマーリー・レパートリーの中の抗体に必ず生じる交雑を説明するのに役立ち得る。
アミノ酸のこの分配を擬態することが好ましいから、変更されるべき位置におけるアミノ酸の分配は、抗体の抗原結合部位に見られる配列を擬態することが好ましい。標的抗原の領域に対して特定のポリペプチド(抗体ポリペプチドだけでなく)を選択することを可能にするアミノ酸の置換における偏向は、任意のポリペプチド・レパートリーに容易に適用することができる。変更されるべき位置のアミノ酸分布を偏倚させるために種々の方法(トリヌクレオチド突然変異誘発の利用を含む、W097/08320を参照のこと)があり、合成の容易さから好ましい方法は、従来の縮退コードンを利用することである。縮退コードンの全ての組み合わせ(各位置に均等な比率によって1倍、2倍、3倍および4倍の縮退で)によってエンコードされるアミノ酸プロファイルを、天然アミノ酸と比較することにより、最も代表的なコードンを計算することが可能となる。コードン(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)Cおよび(AGT)(AGC)(CT)―すなわちIUPAC命名法を用いてそれぞれDVT、DVCおよびDVY― は、所望のアミノ酸プロファイルに最も近いものであり、それらは、22％のセリンおよび11％のチロシン、アスパラギン、グリジン、アラニン、アスパラギン酸塩、スレオニンおよびシステインをエンコードする。従ってライブラリーは、多様化される位置のそれぞれにおいてDVT、DVCもしくはDVYコードンのいずれかを用いて構築されるのが好ましい。
PCR突然変異誘発：
プライマーは、ポリペプチド・レパートリーのメンバーをエンコードする核酸レパートリーメンバーのセットを調製するために用いる核酸分子のプールに存在する標的分子の一部に対して相補的である。多くの場合、プライマーは化学的または酵素を用いた合成方法によって調製される。突然変異誘発性オリゴヌクレオチド・プライマーは、一般的に15〜100ヌクレオチドの長さを有し、理想的には20〜40ヌクレオチドであるが、これ以外の長さのオリゴヌクレオチドも有用である。
通常、選択的ハイブリッド形成は、2つの核酸配列が実質的に相補的(少なくとも14〜25ヌクレオチドの伸縮性に関して少なくとも約65％の相補性、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも約85％もしくは90％の相補性)であるときに生じる。参照により組み込まれるKanehisa,1984, Nucleic Acids RES.12:203を参照のこと。その結果、初回抗原刺激部位における不適当な組み合わせの一定の度合いが許容される。そのような不適当な組み合わせは小規模であって、例えばモノ-、ジ-またはトリ-ヌクレオチドであり得る。あるいは、不適当な組み合わせはヌクレオチド・ループを含んでいてもよくて、そしてそれは本願明細書において、不適当な組み合わせが4つあるいはそれ以上であるヌクレオチドのシリーズを包含する領域として定義されている。
概して、プライマーの二次的な核酸分子へのハイブリッド形成の効率と選択性については、5つの要因が影響する。これらの要因、すなわち(i)プライマー長、(ii)ヌクレオチド配列および/または組成、(iii)ハイブリッド形成温度、(iv)緩衝化学および(v)プライマーがハイブリッドを形成することを避けられない領域の構造障害の可能性は、非ランダムな初回抗原刺激配列が設計される場合に考慮すべき重要な事柄である。
プライマー長と能率および正確さの両者との間には、プライマーがアニールして標的配列になることから正の相関がある。より長い配列は、より短い方よりも高い融解温度(TM)を有し、および所与の標的配列内で繰り返されにくく、そのことによって無差別のハイブリッド形成を最小限に抑える。二分子でなくて単分子のハイブリッド形成は一般的に溶液中で行われることから、高いG-C含有量をもつプライマー配列またはパリンドローム配列を含むプライマー配列は、それらの意図された標的部位がそうであるように、ハイブリッドを形成しやすく、それと同時に、それぞれのそのような対は、AとTが対の基礎を形成するときに見られる2つではなく、3つの水素結合で結合されることから、標的配列をきつく結合するために十分な数のGCヌクレオチド組み合わせを含むプライマーを設計することは重要である。ハイブリッド形成温度は、有機溶剤、例えばハイブリッド形成混合物中に包含されていることがあり得るホルムアミドの濃度がそうであるように、プライマーをアニールする能率に反比例して変化し、その間、塩濃度が上昇して結合を助長する。厳しいハイブリッド形成条件下で、より長いプローブは、より短いものがするよりもより効率的にハイブリッドを形成する。そして、そのより短いものの効率は、より許容的な条件下で十分である。プライマーに対する厳しいハイブリッド形成条件は、通常約1M未満、より通常は約500mM未満および好ましくは約200mM未満の塩濃度を含む。ハイブリッド形成温度は0℃の低さから22℃以上、約30℃以上、および(ほとんどの場合)約37℃を超えた範囲で変動する。より長いフラグメントは、特異的なハイブリッド形成のためにより高いハイブリッド形成温度を必要としてもよい。いくつかの要因がハイブリッド形成の厳しさに影響を及ぼすので、単独のどれか１つの絶対的測度よりもパラメータの組み合わせはより重要である。
プライマーは、これらの考慮すべき事柄を意図して設計される。数多くの配列について相対的な利点の予測が当業者によって意図されていてもよく、これらいくつかのパラメータの評価およびプライマー配列の最適化を助けるために、コンピュータプログラムを利用する。そのようなプログラムの例としては、DNAStarTMソフトウェアパッケージ(DNAStar Inc. 9 Madison,WI)のPrimerSelectと、OLIGO 4.0(National Biosciences,Inc.)が挙げられる。これらを用いてプライマーを設計した後、適当な方法、例えば参照により両方とも本願明細書に引用してあるBeaucage と Carruthers,1981,Tetrahdron Lett.22:1859)によって記述されたホスホラミダイト法、またはMatteucciと Caruthers,1981, J.Am.Chem.Soc.103:3185によるトリエステル法によって、またはその他の、商業ベースの自動化されたオリゴヌクレオチド合成装置、もしくは例えばVLSIPSTM技術のどちらかを使用する化学的方法によって好適なオリゴヌクレオチドが調製される。
PCRは、鋳型DNA(少なくともlfg；さらに有効には1-1000ng)およびオリゴヌクレオチド・プライマーの少なくとも25pmolを用いて実行される。プライマー・プールがひどく不均一である場合には、各配列がプールの分子の小画分のみによって示され、その分量が後の増幅サイクルにおいて制限となることから、より多量のプライマーを用いることが有利である。典型的な反応混合物は以下を包含する：2μl のDNA、25pMolのオリゴヌクレオチド・プライマー、2.5μl の10XPCRバッファ1 (Perkin-Elmer)、0.4μlの 1.25μM dNTP、0.15μl(または2.5units) のTaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)および脱イオン水で相容量を25μlにする。鉱油を上に注ぎ、プログラム可能なヒートサイクラーを使用してPCRを行う。
PCRサイクルのサイクル数だけでなく各ステップの長さと温度も、実行状態にある厳しさ（ストリンジェンシー）の必要条件に従って調整される。アニーリングとタイミングはともに、プライマーの雛形に対する予測されるアニール化能率と、許容されるべきミスマッチングの度合いによって決定される。明らかに、核酸分子が同時に増幅されかつ突然変異を起こす場合には、少なくとも合成の第１回目においてミスマッチングは避けられない。突然変異誘発性プライマーの混合プールを用いて分子の個体群を増幅することを試みる際に、厳しい(高温)アニール条件下で、低い融解温度から帰着するだけの潜在的変異体成果の損失が、プライマーの標的部位以外の配列に対する無差別のアニーリングと比較検討される。プライマーをアニールする条件の厳しさを最適化することは、当業者の知識の範囲内である。30℃〜72℃の間の緩冷温度が用いられている。通常雛型分子の初期変性は、92℃〜99℃を4分間続け、その後、変性(15秒〜1分間94-99℃)と、アニーリング(上記のように決定される温度；1-2分)、および伸長(増幅される成果の長さに応じて1-5分間72℃)から成る20-40サイクル処理を繰り返し実施する。最終的には、通常72℃で4分間、およびその後4℃で保存する(0-24時間)ステップを追加してもよい。
抗原結合のための単一イムノグロブリン可変ドメインのスクリーニング：
ファージ表面における単一イムノグロブリン可変ドメインのレパートリーの発現に続き、ファージ・レパートリーと固定化標的抗原とを接触させ、結合していないファージを取り除くために洗浄すること、および結合されたファージの増殖によって、選択を行う。この全体プロセスはしばしば「パニング」といわれる。あるいは、ファージは、正しい折りたたみ構造を有する変異体を発現のためにさせるために固定されているジェネリックリガンド(例えばプロテインAもしくはプロテインL)に対してパニングすることにより、予め選択される。これは、非機能的要素の比率を低減する利点を有し、それによって標的抗原を結合しそうな要素の比率を増やす。ジェネリックリガンドによる予選択は、WO 99/20749で教示されている。ファージ抗体ライブラリーのスクリーニングは、一般的に開示されており、例えばHarrison et al.,1996, Meth.Enzymol.267:83-109が挙げられる。
スクリーニングは、一般に保持体、例えばプラスチック・チューブまたはウェル、もしくはクロマト・マトリックス、例えばセファロース(Pharmacia)の上に固定されている精製抗原を用いて実行される。また、スクリーニングもしくは選択は、例えば細胞の表面(Marks et al.,1993, BioTecHnology 11:1145; de Kruif et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:3938)などの複合抗原においても実行することができる。他の方法としては、ストレプトアビジンをコートしたビーズ上で捕捉することを特徴とする、ビオチン標識した抗原との水溶液中における結合による選択がある。
好ましい態様では、抗原(ジェネリックなまたは特異な)をプレート、例えばNuncMAXISORPTM immunotube 8 well stripsのチューブもしくはウェル上に固定することを特徴とするパニングが実行される。ウェルに150μlの抗原（100μg/mlPBS））をコーティングし、かつ一晩インキュベートする。それからPBSを用いてウェルを3回洗浄し、400μlのPBS-2％の脱脂乳(2％のMPBS)を用いて37℃で2時間ブロックする。ウェルをPBSで3回すすぎ、そして、ファージを2％MPBS中に添加する。混合物は室温で90分間温置され、かつ結合していないファージを含む液体を取り除く。ウェルは0.1〜20％のPBSで10回、その後界面活性剤を取り除くためにPBSで10回すすぐ。結合されたファージは、新たに調製される100mMトリエチルアミンの200μlを添加し、ウェルを混合しそして室温で10分間温置することによって溶出される。溶出されたファージは、1Mトリス-HCl、pH 7.4を100μl含むチューブに移し、かつトリエチルアミンを中和するためにボルテックスで撹拌する。指数関数的に増大する大腸菌宿主細胞(例えばTG1)は、37℃で30分間温置することにより、例えば150mlの溶出されたファージに感染させる。感染細胞を遠沈し、新しい培地中に再懸濁し、アガロース上で平板培養する。ファージプラークは、分析用または選択の更なるラウンド用として増殖するために宿主細胞の新たな培養株に抽出もしくは挿入する。ファージの純粋な個体群を確実に選択するために、必要に応じて、1回あるいはそれ以上のプラーク精製を行う。その他のスクリーニング方法は、上記Harrison et al.,1996に記述されている。
所望のターゲットを結合する単一イムノグロブリン可変ドメインを発現しているファージの識別に続いて、pHENIのようなファージミドベクターを用いる場合には、可変ドメイン融合タンパク質は、バクテリアの非抑制菌株、例えば可溶性の遺伝子III融合タンパク質の分泌を可能にするBB2151に感染させることにより容易に可溶性の形態で生成することができる。あるいはV領域配列は、従来技術において公知の方法により可溶性のタンパク質を生成するために、適当な発現ベクター中にサブクローン化することができる。
単一イムノグロブリン可変ドメインの精製と濃縮：
ペリプラズム間隙もしくはバクテリア媒体中に分泌される単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドは、公知の方法(Harrison et al.,1996,supra)によって収集され、かつ精製される。スケッラ（Skerra）とプラックタン（Pluckthun）(1988, Science 240:1038)、およびブライトリンク（Breitling）ら(1991, Gene 104: 147)は、ペリプラズムからの抗体ポリペプチドの収穫を記述し、ベター（Better）ら(1988, Science 240:1041)は培養液上澄みからの収穫を開示している。精製もまた、プロテインAまたはプロテインLのようなジェネリックリガンドに結合することによって行うことができる。あるいは可変ドメインは、アフィニティー・クロマトグラフィによって精製を助長するペプチド・タグ、例えばMyc,HAもしくは6Ｘ-ヒス・タグうぃ用いて発現することができる。
ポリペプチドは、いくつかの当業界で公知の方法によって濃縮され、例えば限外濾過、ダイアフィルトレーションおよび接線流濾過(tangential flow filtration)などがこれに含まれる。限外濾過プロセスは、サイズおよび形状に基づいて分子種を選別するために半透膜と圧力を用いる。圧力はガス圧によって、または遠心法によって提供される。多くの商業ベースの限外濾過製品が利用可能であり、その例としては、Millipore (Bedford,MA;例としてはCentriconTMとMicroconTM濃縮機を含む)およびVivascience(Hannover,Germany;例としてはVivaspinrm濃縮機を含む)が挙げられる。標的ポリペプチドより小さい分子量カットオフ(通常標的ポリペプチドの分子量の1/3〜1/6、10kDのみの差分を利用する)の選択によって、溶媒とより少量の溶質が膜を通過するときにポリペプチドは保持される。したがって、約5kDの分子量カットオフは、本願明細書において説明される単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの濃縮に対して有用である。
ポリペプチドの調製において塩あるいはバッファを取り除く、もしくは交換することが望まれる場合には、「洗浄」プロセスを伴う限外濾過膜を用いるダイアフィルトレーションが利用される。連続する限外濾過に伴い、ポリペプチドは溶媒と少量の溶質が膜を通過することによって濃縮され、そして残存塩類あるいはバッファは留め置かれたポリペプチドの新しい緩衝液もしくは塩溶液または水による希釈によって取り除かれる。連続ダイアフィルトレーションでは、新しい緩衝液が濾液の膜を通過する濾液と同速度で添加される。ダイアフィルトレーションの体積は、ダイアフィルトレーションを使用する連続ダイアフィルトレーションの始めに先立つポリペプチド水溶液の体積であり、全浸透性溶質の99.5％を超える量が、新しい緩衝液を用いた6倍のダイアフィルトレーション体積による洗浄によって取り除かれ得る。あるいは、このプロセスは不連続な方法で実行することができるものであり、つまりサンプルは繰り返し希釈され、それから塩あるいは緩衝液を除去もしくは交換するために濾過されて原体積に戻され、最後にはポリペプチドを濃縮する。ダイアフィルトレーション用の機器とその使用のための詳細な方法論は入手可能であり、例えばPall Life Sciences (Ann Arbor, MI) と、Sartorius AG/Vivascience (Hannover, Germany)が挙げられる。
「交差流濾過」としても知られるクロスフローフィルトレーション(TFF)も限外濾過膜を用いる。標的ポリペプチドを含む流体は、膜の表面に沿って接線方向に注入される。圧力は、標的ポリペプチドがフィルターの上方に留め置かれる状態にしておき、流体の一部が膜を通過する。しかし普通の限外濾過とは対照的に、留め置かれた分子は膜の表面に蓄積せずに、接線方向の流れによりそれに沿って運ばれる。フィルタを通過しない溶液(標的ポリペプチドを含む)は、所望の濃度を達成するまで繰り返し膜を通って循環されることができる。TFF用の機器とその使用のための詳細な方法論は入手可能であり、例えばMillipore (e.g.,the ProFlux M12TM Benchtop TFF system and the PelliconTM systems), Pall Life Sciences (e.g.,the Minim Tangential Flow Filtration system)が挙げられる。
プロテイン濃度は、当業界で公知の数多くの方法で測定される。その中には、例えば280nmの吸光度を用いるアミノ酸分析の、「ブラッドフォード(Bradford)」 と「ローリー(Lowry)」法およびSDS-PAGEがある。最も正確な方法は、サンプルを完全に加水分解した後に行うHPLCによるアミノ酸分析であり、その後、濃度を測定し、次に単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの既知の配列との比較を行う。この方法は最も正確ではあるものの費用がかかり、かつ時間がかかる。280nm UV吸光度の測定によるタンパク定量は、より手早くかつほとんど費用がかからず、しかも比較的正確でありアミノ酸分析の代替法として好ましい。280nmにおける吸光度は、本願明細書で説明される実施例のプロテイン濃度を測定するために用いた。
「ブラッドフォード」 と「ローリー」プロテイン検定法(Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72:248-254; Lowry et al.,1951,J.Biol.Chem.193:265-275)では、ほとんどの場合ウシ血清アルブミン(BSA)に基づく標準曲線を用いてサンプル・プロテイン濃度を比較する。これらの方法は正確性が低くて、単一イムノグロブリン可変ドメインの濃度を低く評価しがちである。しかしながらそれらの正確さは、標準物質としてVHまたはVκ抗体の単一ドメインポリペプチドを用いることによって向上させることができる。
他のプロテイン検定法方法は、U.S. Patent No. 4,839,295号(本願明細書に引用してある)で説明されているビシンコニン酸検定法であり、Pierce Biotechnology (Rockford,IL)により、BCA Protein Assay(e.g.,Pierce Catalog No.23227)として市販されている。
SDS-PAGE法はゲル電気泳動と、既知濃度標準物質、例えば単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの既知量との比較においてクーマシー・ブルー染色を用いている。定量化は、目視またはデンシトメトリによって行うことができる。
本願明細書において説明される単一のヒト・イムノグロブリン可変ドメイン抗原結合ポリペプチドは、高濃度において溶解性を維持しており、例えば水溶液(例えばPBS)中に少なくとも4.8mg(〜400μM)、および好ましくは少なくとも5mg/ml(〜417μM)、10mg/ml(〜833μM)、20mg/ml(〜1.7mM)、25mg/ml(〜2.1mM)、30mg/ml(〜2.5mM)、35mg/ml(〜2.9mM)、40mg/ml(〜3.3mM)、45mg/ml(〜3.75mM)、50mg/ml(〜4.2mM)、55mg/ml(〜4.6mM)、60mg/ml(〜5.0mM)、65mg/ml(〜5.4mM)、70mg/ml(〜5.8mM)、75mg/ml(〜6.3mM)、100mg/ml(〜8.33mM)、150mg/ml(〜12.5mM)、200mg/ml(〜16.7mM)、240mg/ml(〜20mM)以上)である。高い溶解度を助長する１つの構造的特長は、比較的小さいサイズの単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドである。従来の４鎖抗体、例えば全長IgGのサイズは約150kDである。これとは対照的に、全てが4のフレームワーク(FW)領域と3のCDRsから成る単一イムノグロブリン可変ドメインは、約12kDのサイズ、すなわち普通抗体の1/10未満のサイズを有する。同様に、単一イムノグロブリン可変ドメインは、SCFv分子(〜26kD)のサイズの約1/2であり、かつFab分子(〜60kD)のサイズの約1/5である。本願明細書において開示される単一イムノグロブリン可変ドメイン含有構造のサイズが、例えば約90kD以下、80kD以下、70kD以下、60kD以下、50kD以下、40kD以下、30kD以下、20kD以下、及び約12kDを含む100kD以下の値を有する構造であるか、または単一イムノグロブリン可変ドメインが単離されていることが好ましい。
ポリペプチドの溶解度は、主としてアミノ酸側鎖と、それを取り巻く溶媒との相互作用により測定することができる。疎水性側鎖は、ポリペプチドが溶媒相互作用表面から離れて折りたたまれていることから、内部に集中する傾向がある。これとは逆に、親水性残基はポリペプチドの溶媒相互作用表面に集中する傾向がある。概して、分子がより親水性の残基を水性環境に曝すように折りたたまれている一次配列をもったポリペプチドは、親水性残基を表面により少なく曝すように折りたたまれているポリペプチドよりも溶けやすい。したがって、疎水性残基と親水性残基の配列および数は、溶解度の重要な決定因子である。ポリペプチドの溶解度を決定するその他のパラメータには、溶媒pH、温度、およびイオン強度などがある。慣行では、ポリペプチドの溶解度は、溶液にグリセロール(例えば〜10％v/v)を添加することによって維持しあるいは高めることができる。
上記のように、概してヒトVHドメインよりも溶けやすいラクダ科のVHドメインにおいて変異しているヒトのVHドメインの保護残基の中の特定のアミノ酸残基が同定された。これらは、例えばGly44(ラクダ遺伝子中のGlu)、Leu45(Arg)およびTrp47(ラクダ遺伝子中のGly)を含んでいる。VHのアミノ酸残基103もまた、Trpから高いVH溶解度を与える傾向のあるArgへ突然変異すると溶解度に影響する。
本発明の好ましい態様では、単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドは、DP47生殖細胞系VH遺伝子セグメントまたはDPK9生殖細胞系VK遺伝子セグメントに基づいている。したがって、これらの生殖細胞系遺伝子セグメントは、とりわけ本願明細書において説明される選択された構造的な位置で多様化される場合に、特異な結合をする極めて溶けやすい単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドを生成することが可能である。特に、好ましくは４つのフレームワーク領域を多様化しないと、結果として生じるタンパク質の溶解度が高くなる。
公知の高い溶解度をもつものと、相同性の高いヒトの単一イムノグロブリン可変ドメインもまた、極めて溶けやすい傾向があると予想される。したがって、所与の単一イムノグロブリン可変ドメインが本願明細書において詳述される高い溶解度をもつであろうという予測もしくは認識を意味するように 、単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの配列を、既知の溶解度をもつ１つまたはそれ以上の単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドと比較することができる。従って、単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドが、溶解度は未知であるが高い結合能をもつと確認される場合には、そのアミノ酸配列と、高い溶解度(例えば本願明細書において開示されるdAb配列)をもつことが既知の、１つあるいはそれ以上の(好ましくはそれ以上の)ヒトの単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの配列との比較により、その溶解度の予測することができる。そのことは絶対的な予測手段ではないが、既知の極めて溶けやすい配列と高度な類似性、例えば90-95％もしくはそれ以上の類似性がある場合、およびとりわけ親水性アミノ酸残基もしくは溶媒界面において曝されそうな残基に関して高度な類似性がある場合には、新たに確認される結合ポリペプチドが既知の極めて溶けやすい配列の溶解度と同様の溶解度を有することは十分にあり得る。
また分子モデリング・ソフトウェアも、溶解度が既知のポリペプチドの配列と比較してポリペプチド配列の溶解度を予測するために用いることもできる。例えば、溶媒に曝される表面に疎水性残基を置換または付加することは、その位置に曝される疎水性がより少ない、あるいは互角の親水性残基を有する溶解度が既知の分子と比較してポリペプチドの溶解度を低下させる。同様に、上記の位置でより親水性の残基を置換または添加することは、相対的溶解度を高めることが予想される。すなわち、既知の溶解度をもつ単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチド構造に対して、分子の表面に位置決めされる親水性または疎水性残基の数(または表面に曝される残基の総合的な疎水性もしくは親水性の本質)における変化により、単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの相対的溶解度を予測することができる。
あるいは、もしくはそのような予測に関連して、単純にポリペプチドを濃縮することにより単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの溶解度の限界を判定することができる。
親和性/活性の決定：
本願明細書において説明される単離されたヒトの単一イムノグロブリン可変ドメイン含有ポリペプチドは、少なくとも300nM以下、好ましくは少なくとも300nM-50pM、200nM-50pM、およびより好ましくは少なくとも100nM-50pM、75nM-50pM、50nM-50pM、25nM-50pM、10nM-50pM、5nM-50pM、1nM-50pM、950pM-50pM、900pM-50pM、850pM-50pM、800pM-50pM、750pM-50pM、700pM-50pM、650pM-50pM、600pM-50pM、550pM-50pM、500pM-50pM、450pM-50pM、400pM-50pM、350pM-50pM、300pM-50pM、250pM-50pM、200pM-50pM、150pM-50pM、100pM-50pM、90pM-50pM、80pM-50pM、70pM-50pM、60pM-50pM、または50pMの親和性(解離定数、Kd、＝Koff/Kon)を有する。
可変ドメインポリペプチドの抗原結合能は、BIAcoreシステム(Pharmacia Biosensor, Piscataway,N.J.)を用いる表面プラスモン共鳴(SPR)によって簡便に測定することができる。この方法では、抗原は既知の濃度においてBIAcoreチップに結合されて、可変ドメインポリペプチドが導入される。可変ドメインポリペプチドと固定化された抗原が特異に結合することにより、チップマトリックス上のプロテイン濃度が高くなり、SPRシグナルが変化する。SPRシグナルの変化は、反響単位体(RU)として記録され、かつ時間に関してセンサーグラム(sensorgram)のＹ軸に沿って表示される。ベースラインシグナルは、チップを経過する溶媒だけ(例えばPBS)を用いて測定される。ベースラインシグナルと可変ドメインポリペプチドの注入完了後のシグナルとの間の正味の差分は、与えられたサンプルの結合値を示す。オフレート(off rate)(Koff))、オンレート(on rate)(Kon)および解離速度(Kd)定数を測定するには、BIAcore動態学的評価用ソフトウェア(例えばバージョン2.1)が用いられる。
親和性の高さは、抗原の表面及び抗体または抗体フラグメントのCDRsの間の相補性に依存している。相補性は標的の部分及びCDR、例えば潜在的なイオン相互作用、ファンデルヴァール(van der Waals)引力、水素結合もしくは起こり得る他の相互作用などとの間の分子相互作用のタイプと強度によって決定される。CDR3は大きいサイズを有し、表面相互作用に対して、より多くの機会を提供することができることから、CDRs1および2よりも抗原結合相互作用により多く貢献する傾向がある。(例えばPadlan et al.,1994,Mol.Immunol.31:169-217; Chothia & Lesk,1987,J.Mol. Biol.196:904-917; and Chothia et al.,1985, J.Mol.Biol.186:651-663を参照のこと。)親和性の高さは、形成されている単一イムノグロブリン可変ドメイン/抗原が可変ドメインと標的の構造に直接に関連がある高い相補性をもつことを示す。
所与の抗原に対して高いアフィニティを与える単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの構造は、抗原とポリペプチド構造との結合を可能とする分子モデリング・ソフトウェアを用いて同定してもよい。一般的に、既知の親和性を有する単一イムノグロブリン可変ドメインの構造についてのコンピューターモデルは、相互作用表面を決定するために、ポリペプチドのコンピューターモデルもしくは他の標的抗原の既知の構造と結合することができる。そのような既知の相互作用に対する相互作用表面の構造をもとに、所定の相互作用の強度における可変ドメインの保存的な又は非保存的な置換が起こるか否かについて、予測することができ、それによって結合分子を合理的に改良することができる。
抗体単一可変ドメインの多重結合形態：
一態様では、本願明細書において説明される単一イムノグロブリン可変ドメインは多量体化(multimerized)され、その例としては、ヘテロ-もしくはホモ二量体、ヘテロ-もしくはホモ三量体、ヘテロ-もしくはホモ四量体、またはより高次のヘテロ-もしくはホモ多量体(例えば、ヘテロ-もしくはホモ-五量体および八量体まで)が挙げられる。多量体化は、結合力に影響を与えることにより抗原結合力を強くすることができて、結合力は多重結合部位の結合能の総量と相関がある。
ヘテロ-およびホモ多量体は、例えばペプチドリンカーにより融合される単一イムノグロブリン可変ドメインの発現により調製されて、立体配置dAb-リンカー-dAbあるいはその配列のより高い倍数体が生成される。多量体はまた、更なる成分、例えば血清半減期を長くするポリペプチド配列または他のエフェクタ成分、例えば毒素もしくはターゲット成分、例えばPEGにも結合することがあり得る。任意のリンカーペプチド配列は、ヘテロ-もしくはホモ多量体、例えばSCFvを生成するために、従来技術において見られるリンカー配列を生成するために用いることもできる。一般的に有用なリンカー１つは、n個のペプチド配列(Gly4Ser)nの繰り返しから成り、この場合にn＝1乃至約10(例えば、n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9または10)である。例えば、このリンカーは、(Gly4Ser)3、(Gly4Ser)5、(Gly4Ser)7または(Gly4Ser)配列のその他の倍数であってもよい。
単量体をペプチド配列によって連結した多量体の発現に代るものは、翻訳の後に、例えばジスルフィド結合または他の化学的結合により単量体単一イムノグロブリン可変ドメインを結合することである。例えば、単量体ポリペプチドのC末端に遊離システインが設計され、単量体間をジスルフィド結合で結合する。遊離システインを必要としているこの態様またはその他において、dAb配列の最後のコドンに隣接しているPCRプライマー中に(それが下流のPCRプライマーに組み込まれるであろうから、カルボキシル末端のシステインに対してプライマー中の配列は実際のところ逆性補体、すなわちACAまたはGCAとなる)、及び１つあるいはそれ以上の停止コドンの直前に、システインコドン(TGＴ、TGC)を包含することによってシステインを導入する。所望により、リンカーペプチド配列、例えば(Gly4Ser)nは、dAb配列と遊離システインの間に配置される。遊離システイン残基をもつ単量体の発現は、約1:1混合状態の単量体と二量体形態の混合物中に生成する。二量体は、ゲルクロマトグラフィ、例えば塩濃度の勾配により溶出するイオン交換クロマトグラフィを用いて単量体と分離される。
付加された遊離システインは、単量体を、例えば三量体マレイミド分子(例えばトリス[2-マレイミドエチル]アミン、TMEA)もしくはバイ-マレイミドPEG(例えばネルクタール(Nelctar)(Shearwater)から入手可能)のような多価の化学的リンカーに、チオール結合によって結合させるために使用される。
一の実施態様では、本発明のホモ二量体またはヘテロ二量体は、C末端のアミノ酸においてイムノグロブリンのそれぞれCHl領域もしくはCκ領域に共有結合で繋がるVHまたはVL領域を含んでいる。従って、ヘテロ-またはホモ二量体はFabのような分子であってもよくて、抗原結合部位は、C末端においてそれぞれCHＩおよびCκドメインに共有結合で連結される付随したVHおよび/またはVL領域を含む。さらに、あるいは代わりとして、本発明のdAb多量体は、十分に機能的で極めて特異的な、軽鎖配列を有さない抗体の大きい規模を表示するラクダ科の動物の遺伝子配列にならって作成してもよい。ラクダ科動物の重鎖抗体は単一重鎖のホモ二量体として見出され、それらの不変領域を介して二量体化される。これらのラクダ遺伝基質重鎖抗体の可変ドメインは、VHH領域といわれており、VH鎖のフラグメントとして単離されると、高度の特異性をもつ抗原と結合する能力を維持する((amers-Casterman et al.,1993, Nature 363:446-448 ;Gahroudi et al.,1997,FEBS Lett.414:521-526)。従って、本発明の抗体単一可変ドメイン多量体は、当業界において公知の方法を用いて構成することができ、上記のようにラクダ科動物の重鎖抗体のVHH立体配座をもつように構成されていてもよい。
標的抗原
本願明細書において説明される抗体単一可変ドメインポリペプチドに対する標的抗原は、疾病もしくは異常に関係するヒト抗原である。すなわち、本願明細書において説明される標的抗原は、疾病治療上重要な標的である。「治療上重要な標的」とは、単一イムノグロブリン可変ドメイン、もしくは、標的抗原を結合しかつその標的の活性に対する拮抗体あるいは作動体として作用する他の抗体ポリペプチドが結合すると、結合する標的を有する動物(好ましくは哺乳類の、好ましくはヒトの)に有益効果をもたらすものを言う。「有益効果」とは、疾病もしくは異常徴候の１つあるいはそれ以上の臨床的診断の徴候において、または、単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチド調製物で治療されていない個体に観察される疾病、もしくは異常徴候が、以前より少なくとも10％の改善されていることを意味する。本願明細書において説明される単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの好適な標的である抗原の非限定的な例は、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素コファクタ、またはDNA結合タンパクなどがある。好適なサイトカインと成長因子には、ApoE、Apo-SAA、BDNF、カーディオトロフィン（Cardiotrophin-１）、EGF、EGFレセプタ、ENA-78、エオタキシン(Eotaxin)、エオタキシン(Eotaxin)-2、エクソダス(Exodus)-2、FGF-酸性、FGF-塩基性、線維芽細胞成長因子-10、ＦLＴ3リガンド、フラクタルカイン（Fractalkine）(CX３C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-P１、インスリン、IFN-g、IGF-Ｉ、IGF-II、IL-ｌa、ＩL-1(3、ＩL-2、ＩL-3、ＩL-4、ＩL-5、ＩL-6、ＩL-7、ＩL-8(72a.a.)、ＩL-8(77a.a.)、ＩL-9、ＩL-10、ＩL-11、ＩL-12、ＩL-13、ＩL-15、ＩL-16、ＩL-17、ＩL-18(IGIF)、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト成長因子-2(KGF-2)、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン(Lymphotactin)、ムレリアン(Mullerian)阻害物質、単球コロニー阻止因子、単球誘引剤プロテイン、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69 a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、MIG、MIP-ｌa、MIP-ｌss、MIP-3ａ、MIP-3ss、MIP-4、骨髄性原種抑制剤因子-1(MPIF-1)、NAP-2、ニュールツリン(Neurturin)、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFlα、SDFlβ、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TACE認識部位、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I(p55)、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGFレセプタ1、VEGFレセプタ2、VEGFレセプタ3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER3およびHER4等があるが、これらに限定するものではない。サイトカイン受容体としては、前述のサイトカインに対する各レセプター、例えばＩL-1R、IL-6R、IL-1OR、IL-18R、などがある。このリストは決して網羅的ではない。本発明による抗原単一可変ドメインポリペプチドのための好ましい標的は、W0 04/041867(その要旨は、それらの全体として本願明細書に含まれている)で開示されており以下のものがあるが、ただしこれに限定するものではない：TNFα、IgE、IFNγ、MMP-12、EGFR、CEA、H.ピロリ、TB、インフルエンザ、PDK-1、GSK1、Bad、カスパーゼ、フォークヘッド及びボンウィールブランド（Forkhead and VonWillebrand）因子 (vWF)。標的はまた、上記標的のフラグメントであってもよい。したがって標的はまた、免疫反応を導き出すことでことができる上記標的のフラグメントである。標的はまた、標的の全長に対する抗体単一可変ドメインポリペプチドに結合することができる上記標的のフラグメントである。
一の側面において、1の単一イムノグロブリンを、他の単一イムノグロブリン可変ドメインを連結してホモ二量体もしくはヘテロ二量体を形成する、各可変ドメインは同族の抗原を結合することができる。ホモ二量体として単一イムノグロブリン可変ドメインを溶解することは、例えば結合活性効果を増やすことにより、ターゲット結合効率をあげることができる。各単量体が異なる標的抗原を結合する場合において、ヘテロ二量体として単一イムノグロブリン可変ドメインを融解すると、例えばそれぞれの標的抗原に結合することのできる二重特異性を有するリガンドを生成することができる。そのような二重特異性リガンドは、生物における治療状態において相乗効果を生み出して協同するサイトカイン、および他の分子を対象とするように選択してもよい。このように、２つあるいはそれ以上のサイトカインと結合することのできる二重特異性を有する単一イムノグロブリン可変ドメインヘテロ二量体を投与することを含む、２つあるいはそれ以上のサイトカインの活性に相乗作用を与えるための方法が提供されている。この態様では、二重特異性リガンドは、補完的なおよび/または非補完的な領域を含むリガンドを含む任意の二重特異性リガンドであってもよい。例えばこの態様は、VHドメインとVLドメインの組み合わせ、VHドメイン単独およびVLドメイン単独である。
好ましくは、本発明のこの態様の二重特性を有する単一イムノグロブリン可変ドメインヘテロ二量体によって結合されるサイトカインは、以下のリストから選択される：
Figure 0005087274
Figure 0005087274
Figure 0005087274
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上にリストアップされた、ならびにその他の標的抗原のためのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、当業者には公知かつ入手可能である。組換えタンパク質を発現するための標準的な方法が、例えば標的抗原を結合する単一イムノグロブリン可変ドメインを抽出するために必要な場合に、これらおよびその他の抗原を表示しかつ精製するために当業者によって使用される。
機能解析
一の実施態様では、本願明細書において説明される抗体単一可変ドメイン(および単一ドメインの多量体)は、それらの標的抗原に対して中和活性(例えば拮抗活性)もしくは作動活性をもつ。本願明細書において説明される単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの活性(中和化または作動化)は、そのような活性に対する好適な検定法では、ポリペプチドが存在しない状態での標的抗原の活性と前記活性を比較する。例えば、標的抗原が酵素である場合に、その酵素の活性をモニターするin vivoもしくはin vitroの機能解析法が、抗体単一可変ドメインポリペプチドの活性もしくは効果をモニターするために用いられる。
例えば、標的抗原がレセプタ、例えばサイトカイン受容体である場合には、活性は単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの存在下において、このレセプタに結合しているリガンドの減少、または増加の観点から、あるいは、このレセプタによるシグナリング活性の減少または増加の観点から測定される。レセプターのシグナリング活性は、例えばレセプタ立体配座、コファクタまたはパートナー・ポリペプチド結合、GTP交換のためのGDP、カイネース、フォスファターゼもしくは活性化されたレセプタによって備えられる他の酵素活性などを監視することによって、あるいはそのような活性の結果（例えば遺伝子(リポーター遺伝子を含む)または例えば細胞死、DNA複製、細胞接着、もしくはレセプタ活性化の結果）を観察することによって、１つあるいはそれ以上の分子の分泌を含む他の効果の発現などを監視することによって測定される。
標的抗原が例えばサイトカインもしくは成長因子である場合には、活性は、サイトカインのレセプタに対する結合を測定することにより、あるいはレセプタの活性化をモニターすることにより、例えば上記のようにレセプタ・シグナリング活性をモニターすることで測定される。サイトカインにより引き起こされる症状を測定する機能分析検査の例は、当業界で公知(例えば米国特許第6,090,382号を参照のこと)の、TNF-α活性のためのL929細胞殺滅アッセイである。以下のL929細胞毒性分析検査は、本明細書において「基準となる」L929細胞毒性アッセイという。抗TNF単一イムノグロブリン可変ドメイン(「抗TNFdAbs」)は、マウスL929繊維芽細胞におけるTNFの細胞毒性活性を中性化する機能に対して試験される(Evans,To (2000) Molecular Biotechnology 15,243-248)。簡潔に述べると、マイクロタイター・プレートに平板培養されているL929細胞は、抗TNFdAbs、1OOpg/mlのTNFおよびｌmg/mlアクチノマイシンD(Sigma,Poole,UK)とともに一晩インキュベートされる。細胞生存率は、[3-(4、5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシ・メトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニール)-2H-テトラゾリウムと共にインキュベートした後に、490nmの吸光度を読みとることによって測定される(Promega, Madison, USA)。抗TNFdAb活性は、TNF細胞毒性を減少させることからTNF単独対照と比較して吸光度が増大する。本願明細書において説明される単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドは、この標準物質L929細胞分析検査において500nM以下、好ましくは50nM以下、5nM以下、500pM以下、200pM以下、100pM以下あるいは50pMであっても、TNF-αもしくはTNF-αレセプタに関して特異性を示すIC50を有する。
リガンド、例えばサイトカインによるレセプター結合に関する分析方法は、当業界において公知である。例として抗TNFdAbは、組換え型TNFレセプタ1(p55)へのTNFの結合を抑制する能力として評価することができる。簡潔に述べると、Maxisorpプレート上で、30mg/mlの抗ヒトFcマウス・モノクローナル抗体を一晩インキュベートする(Zymed,San Francisco,USA)。ウェルを、0.05％のTween-20を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)によって洗浄し、その後、100ng/ml TNFレセプタ1Fc融合タンパク質とともにインキュベートする前に、PBS中の1％BSAによってブロックする(R & DSystems, Minneapolis,USA)。抗TNF dAbをTNFと終末濃度が1Ong/mlになるように洗浄済みのウェルに添加して混合する。TNF結合を、0.2mg/mlのビオチン化抗TNF抗体(HyCult biotechnology,Uben, Netherlands)を用いて検出し、ストレプトアビジン(Amersham Biosciences,UK)及び標識されたワサビ・ペルオキシダーゼを500分の1に希釈し、そしてTMB基質(KPL,Gaithersburg,MD)と共にインキュベーションする。反応はHC1を添加して停止し、450nmにおける吸光度を読みとる。抗TNFdAb阻害活性は、TNF結合の減少として評価され、したがってTNF単独対照と比較すると吸光度が減少することとなる。
リガンド、例えばサイトカインによるレセプター結合の測定値のためのアッセイは、当業界において公知である。例えば、抗TNF受容体I dAbsは、組換え型TNF受容体1(p55)に対するTNFの結合を抑制する能力として試験されることができる。簡潔に述べると、Maxisorpプレート上で30mg/ml抗ヒトFcマウスモノクローナル抗体を一晩インキュベートする(Zymed,San Francisco,USA)。ウェルを、0.05％ Tween-20を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、それから1OOng/ml TNF受容体1Fc融合タンパク質とともにインキュベートする前に、PBS中で1％BSAによってブロックする(R & D Systems, Minneapolis,USA)。抗TNFレセプタＩdAbを最終濃度が3ng/mlになるようにプレートに添加し30分間インキュベートする。その後TNFを添加し60分間インキュベートする。検出工程の前にあらゆる結合していないプロテインを除去するためにプレートを洗浄する。TNF結合は、0.2mg/mlビオチン化された抗TNF抗体(HyCult biotechnology,Uben, Netherlands)を用いて検出し、ストレプトアビジン(Amersham Biosciences,UK)と標識されたワサビ・ペルオキシダーゼを500分の1に希釈し、それからTMB基質(KPL,Gaithersburg,MD)と共にインキュベートする。反応をHClの添加により停止し、450nmにおける吸光度を読みとる。抗TNFdAb阻害活性は、TNF結合の減少として評価され、したがってTNF単独対照と比較すると吸光度が減少することとなる。
この方法の代わりに、ｐ55 TNF-αレセプタにおける単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの効果を評価する場合に、HeLa細胞中にTNFがＩL-8を分泌させることに基づく以下のHｅLa細胞分析検査を使用することができる(方法としては、HUVECのＩL-1によるＩL-8の誘導を記述するAlceson,L.et al.(1996) Journal of Biological Chemistry 271,30517-30523を適用する。ここでは、本願発明者はヒトTNF-αによる誘導に注目し、HUVEC細胞系ではなくてHeLa細胞を用いた)。簡潔に述べると、マイクロタイター・プレート上でHeLa細胞を平板培養し、dAb及び300pg/ml TNFを一晩インキュベートする。インキュベートに続いて、上澄みをこの細胞から吸いとり、IL-8濃度はサンドイッチ方式のELISA(R & D Systems)により測定する。抗TNFR1 dAb活性は、TNF単独対照と比較すると上澄みの中へのＩL-8分泌が減少している。
代わりとして、p55 TNF-αレセプターに対する単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの効果を評価する場合に、MRC-5細胞においてTNFがIL-8を分泌させることに基づいた以下のMRC-5細胞分析検査を用いることができる(方法は、Alceson,L.et al.(1996) Journal of Biological Chemistry 271,30517-30523, describing the induction of IL-8 byIL-1 inHWECのそれから適応される。ここでは、本願発明者らはヒトTNF-αによる誘導に注目し、HUVEC細胞系ではなくてMRC-5細胞を使用した)。簡潔に述べると、マイクロタイター・プレートに平板培養されるMRC-5細胞は、dAbおよび300pg/ml TNFとともに一晩インキュベートされる。インキュベートに続いて、上澄みをこの細胞から採取し、IL-8濃度をサンドイッチ方式ELISA(R & D Systems)により測定する。抗TNFR1 dAb活性は、TNF単独対照と比較うると上澄みの中へのＩL-8分泌が減少している。
他のリガンド(サイトカイン、成長因子、その他)もしくはそれらのレセプターの活性に対する同様の機能的分析検査は、当業者に公知であり、単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドの拮抗効果又は作動効果を評価することに用いることができる。
本発明の一実施態様では、PEG化(PEGylated)dAbポリペプチド(単量体および/または多量体)は、非PEG化 (non-PEGylated)dAb単量体もしくは多量体と同様の活性を維持しており、活性は上記の通りに測定される。すなわち標的分子に対するPEG化dAbの親和性によって測定される。本発明のPEG化dAb単量体もしくは多量体は、非PEG連結抗体単一可変ドメインの活性レベルの少なくとも10％、好ましくは非PEG結合抗体単一可変ドメインの活性の少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％および90％まであるいはそれ以上の活性(例えば標的アフィニティ)レベルを維持する。そして活性は上記の通りに測定される。好ましい実施態様では、PEG化dAb単量体もしくは多量体は、非PEG化 (non-PEGylated)dAb単量体もしくは多量体の活性の少なくとも90％を維持し、さらに好ましくは、非PEG化 (non-PEGylated)dAb単量体もしくは多量体の活性の全て(100％)を維持する。
相同配列
本発明は、抗体単一可変ドメインのクローンと、それらに対して高い配列類似性あるいは相同性を有し、さらに標的抗原に対して高い親和性を有しかつ高濃度で溶けやすいクローン(および多量体中に組み込まれたそのような抗体単一可変ドメインクローン)を包含する。本願明細書中で用いているように、「かなりの」配列類似性あるいは相同性とは、少なくとも85％の類似性あるいは相同性である。
2つの配列間の「相同性」あるいは「配列同一性」(ここでは、これらの語は同義で用いる)の計算は、以下の通りに実行される。配列は、最適な比較のために整列配置される(例えば、ギャップは最適な整列配置のために、第１と第２のアミノ酸配列もしくは核酸配列の一方または両方に差し込まれてもよくて、かつ非相同性配列は比較の目的上、無視されてもよい)。好ましい実施態様では、比較の目的上整列配置される基準配列の長さは、この基準配列の長さの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも60％、およびさらにより好ましくは少なくとも70％、80％、90％、100％である。それから、対応するアミノ酸位置あるいはヌクレオチド位置で、アミノ酸残基あるいはヌクレオチドが比較される。第１の配列中で、ある１つの位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基、あるいはヌクレオチドで占められている場合には、それらの分子はその位置において同一である(本願明細書において用いられているように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」に等価である)。2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数、およびこれら2つの配列の最適な整列配置のために差し込まれることを必要とするそれぞれのギャップの長さを考慮に入れた両配列により共有される同一位置の数の関数である。
本願明細書において用いられているように、配列の「類似性」は、整列配置状態にある両配列の対応する位置においてアミノ酸配列が類似のアミノ酸残基を共有する度合いの尺度である。アミノ酸は、それらの側鎖が類似している場合には互いに類似である。具体的には、「類似性」は、互いに保存的置換(conservative substitutes)であるアミノ酸を包含する。「保存的」置換とは、ブロサム(blosum)62置換マトリックス中に正のスコアをもつ任意の置換である(Hentikoff and Hentikoff, 1992, Proc.Natl.Acad. Sci.USA 89:10915-10919)。「配列Aは配列Bにn％類似している」という文は、配列Aと配列Bの間で最適な広域アライメントの位置にあるn％が、同一のアミノ酸あるいは保存的置換を含むことを意味している。最適な広域アライメントは、Needleman-Wunsch整列配置アルゴリズムの以下のパラメータを使用して実行することができる：
ポリペチドに関して：
置換マトリックス：バイオサム(biosum)62
ギャップスコアリング関数：-A-B＊LG[式中、A＝11(ギャップペナルティ)、B＝1(ギャップ長さペナルティ)、およびLGはギャップの長さである
ヌクレオチド配列に関して：
置換マトリックス：適合に対して10、不適合に対しては0。
ギャップスコアリング関数：-A-B＊LG[式中、A＝50(ギャップギャップペナルティ)、B＝3(ギャップ長さペナルティ)、およびLGはギャップの長さである。
典型的な保存的置換は、Met、Val、LeuおよびIleの１つであり、SerおよびThrの１つであり、残基Asp、GluおよびAsnの１つであり、残基Gin、LysおよびArgの１つであり、または芳香族残基PheおよびTyrである。比較されている２つの分子の全長に関して、2つのポリペチド配列の間にある類似性の度合い(ほとんどの場合はパーセント)を計算するときに、2つのポリペチド配列の中で対応するアミノ酸残基の間に同一性もしくは類似性が認められる位置の数を考慮する。
あるいは配列の整列配置のために、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)アルゴリズムが、デフォルト値に設定されるパラメータとともに使用される。BLASTアルゴリズム「BLAST2配列」は、米国連邦政府(「.gov」)の(国立衛生研究所the National Institutes of Health)(「nih」)の国立医学図書館(the National Library of Medicine)(「.nlm」)の、the National Center for Biotechnology Information (".ncbi")のワールドワイド・ウェブサイト(「www」)における「/BLAST/」ディレクトリ、「bl2seq/bl2.html」サブディレクトリから入手可能である。このアルゴリズムは比較のために2つの配列を整列配置するものであり、Tatusova＆Madden、1999、FEMS Microbiol Lett.174：247-250に開示されている。
相同性あるいは類似性の更なる尺度は、高度に厳しいハイブリッド形成条件のもとにハイブリッド化する機能である。したがって、第1の配列が、高度に厳しいハイブリッド形成条件のもとでハイブリッド形成して第2の配列(またはそれの補体)になるならば(Sambrook et al.Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory Press, NewYork)によって説明されているそれらのように)、単一イムノグロブリン可変ドメインポリペプチドをエンコードしている第1の配列は、第2のエンコード配列に実質的に類似している。「高度に厳しいハイブリッド形成条件」とは、約45℃の6ｘSSCにおけるハイブリッド形成を言い、65℃において0.2ＸSSCの0.1％SDSによる１回あるいはそれ以上の洗剤がその後に続く。「極めて高度に厳しいハイブリッド形成条件」とは、65℃の0.5Mリン酸ナトリウムの7％SDSにおけるハイブリッド形成をいい、65℃における0.2XSSCの1％SDSによる1回あるいはそれ以上の洗剤がその後に続く。
dAbsのPEG化(PEGylation)
本発明は、非PEG化dAbsに対して活性(例えば結合能)の損失を伴うことなく、これらより長い半減期ならびに高い分解壊性を与えるPEG化dAb単量体および多量体を提供する。
本発明のdAb分子は、当業界において公知の方法を用いて、本発明によって包含される長い半減期ならびに分解耐性を実現するのに有用なポリマー分子(好ましくはPEG)に結合されていてもよい。本発明において利用されるポリマー成分は合成されたものでも、あるいは自然に生じるものであってもよくて、直鎖状もしくは分岐状鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン(polyalkenylene)、またはポリオキシアルキレン・ポリマー、またはホモ-もしくはヘテロ多糖のような分岐状もしくは分岐のない多糖類を包含しているが、ただしこれらに限定するものではない。本発明において用いられてもよい合成ポリマーの好ましい例としては、直鎖状もしくは分岐鎖状のポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(プロピレングリコール)、またはポリ(ビニルアルコール)ならびにそれらの誘導体もしくはこれらの置換形態をも包含する。本発明において有用な、とりわけ好ましい置換ポリマーとしは、メトキシ(ポリエチレングリコール)を置換したPEGを含む。PEGに加えて、またはそれの代わりとして本発明に従って用いられてもよい自然に生じるポリマー成分には、ラクトース、アミロース、デキストラン、あるいはグリコーゲンは勿論、当業者によって認識されるそれらの誘導体もある。本発明のポリマー分子の誘導体化された形態は、例えば、本願明細書において説明されるdAbポリペチドのアミノ酸残基と相互作用を行うことを可能とする付加的成分もしくはその中に存在する反応性基を有した誘導体を包含する。そのような誘導体には、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)活性エステル、スクシンイミジルプロピオン酸ポリマー、および例えばマレイミド、ビニルスルホン、およびチオールなどのスルフヒドリル選択反応剤などがある。とりわけ好ましい誘導体化されたポリマーとしては、以下の式： PEG-O-CH2CH2CH2-C02-NHS、PEG-O-CH2-NHS、PEG-O- CH2CH2-CO2-NHS、PEG-S-CH2CH2-CO-NHS、PEG-02CNH-CH(R)-CO2-NHS、PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS及びPEG-O-CH2-CO2-NHS ; [式中、Rは (CH2)4NHCO2（mPEG) である]をもつPEGポリマーがあるが、ただしこれらに限定するものではない。本発明において有用なPEGポリマーは、多数のPEG成分が単独重合体の状態で存在する線状分子であってもよく、あるいは分岐状であってもよい。本発明において有用ないくらかのとりわけ好ましいPEG誘導体には以下のものがあるが、ただしこれに限定するものではない：
Figure 0005087274
 反応基(例えばMAL、NHSSPA、VS、またはチオール)は、PEGポリマーに直接に付着していてもよく、あるいはリンカー分子を介してPEGに付着していてもよい。
本発明において有用なポリマーのサイズは、500 Da〜60kDa、例えば1000Da〜60kDa、10kDa〜60kDa、20kDa〜60kDa、30kDa〜60kDa、40kDa〜60kDa、および50kDa〜60kDaまでの範囲であってもよい。本発明において使用するポリマー、特にPEGは、直鎖状ポリマーであってもよくて、もしくは分岐状立体配座を備えていてもよい。分子量と立体配座の組み合わせにより、本発明において有用なポリマー分子は、dAb単量体もしくは多量体に付着する場合には24〜500kDaの平均的な流体力学的サイズをもつ分子を生じるであろう。本願明細書において用いられるポリマー分子の流体力学的サイズは、分子(例えばタンパク質分子)が、水溶液中への拡散に基づく見かけ上のサイズをいう。プロテインの溶液中の拡散あるいは運動が、そのプロテインの見かけ上のサイズを推論するために評価され、サイズはプロテイン粒子のストークス(Stokes)半径あるいは流体力学的半径として得ることができる。プロテインの「流体力学的サイズ」は、同じ分子量をもつ２つのプロテインがそのプロテインの全体的な立体配座に基づいて異なる流体力学的サイズを有してもよいように、質量と形(立体配座)の両方によって決まる。PEG結合抗体単一可変ドメイン(本願明細書において説明されている抗体の可変ドメイン多量体を包含する)の流体力学的サイズは、24kDa〜500kDa；30〜500kDa；40〜500kDa；50〜500kDa；100〜500kDa；150〜500kDa；200〜500kDa；250〜500kDa；300〜500kDa；350〜500kDa；400〜500kDaおよび450〜500kDaの範囲でもよい。本発明のPE化dAbの流体力学的サイズは、30〜40kDa；70〜80kDaまたは200〜300kDaであるのが好ましい。
本発明のPEG結合dAb単量体および多量体の流体力学的サイズは、当業界において公知の方法を用いて決定されてもよい。例えば、PEG結合dAbもしくは非-PEG結合dAb単量体もしくは多量体の流体力学的サイズを決定するために、ゲル上のdAbのバンドが分子量標準物質と比較されるゲル濾過を用いてもよい。流体力学的サイズの決定のための他の方法は、Superose12HR(Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)のようなSDS-PAGEサイズ排除クロマトグラフィカラムを包含するが、ただしこれに限定するものではない。本発明のPEG結合dAb又は非-PEG結合dAb単量体もしくは多量体の流体力学的サイズを決定するためのその他の方法は、当業者によって容易に理解されるであろう。一の実施態様では、本発明のPEG-もしくは他のポリマーが結合している抗体単一可変ドメインポリペチドの流体力学的サイズは、ゲル濾過マトリックスを用いて決定されてもよい。種々のPEGが結合している抗体単一可変ドメインポリペチドの流体力学的サイズを決定するために用いられるゲル濾過マトリックスは、高度に架橋しているアガロースでもよい。例えば、球状タンパク質のための２つのカラムの分画範囲は、Superose 12HR 1000-3ｘ105MrおよびSuperose 6 HR5000-5ｘ106Mrである。球状タンパク質サイズ排除限界は、Superose12HRでは2ｘ106Mrまでであり、Superose 6HRでは4ｘ107Mrまでである。
本発明のdAbまたはdAb多量体に付着するポリマー分子のサイズは、このようにして所望の製品に応じて変えることができる。例えばPEG化dAbが循環流動をやめて、末しょう組織に入ろうと意図される場合には、血流から血管外流出を容易にするために付着するポリマーのサイズを小さく留めておくことが好ましい。あるいは、PEG化dAbをより長い間循環流動内に存続させることを望む場合には、分子量のより大きいポリマー(例えば30〜60kDaのポリマー)を使用することができる。
本発明において有用なポリマー(PEG)分子は、当業界において公知の方法を使用してdAbポリペチド(およびポリペチド・多量体)に付着されてもよい。本発明のdAb単量体もしくは多量体に対するPEGもしくは他のポリマー成分を付着させることの第1のステップは、求電子物質を含んだ官能基によるPEGポリマーのヒドロキシル末端基の置換である。特にPEGポリマーは、本発明のdAb単量体もしくは多量体に存在するシステインもしくはリジン残基のどちらかに付着される。システインならびにリジン残基は自然に生じてもよくて、あるいはdAb分子中に設計されてもよい。例えば、システイン残基がdAbポリペチドのC末端に再結合的に設計されてもよいし、あるいはdAb中の溶媒のアクセス可能な特定の位置において残基がシステインもしくはリジンで置換されてもよい。好ましい実施態様では、PEG成分は、本発明のdAb単量体もしくは多量体のC末端におけるヒンジ領域に存在するシステイン残基に付着される。他の好ましい実施態様では、PEG成分または他のポリマーが、本発明の抗体単一可変ドメインポリペチドのN末端に自然に生じるか、もしくはそれに設計されるシステインまたはリジン残基に付着される。なお他の実施態様では、PEG成分または他のポリマーは、抗体単一可変ドメインポリペチドの(例えば内部から)C-および/またはN-末端から離れた少なくとも２つの残基であるシステイン残基あるいはリジン残基(自然に生じるかもしくは設計された)において、本発明による抗体単一可変ドメインに付着される。
一の実施態様では、PEGポリマーは、フレームワーク領域(FWs)に存在する１つあるいはそれ以上のシステイン残基またはリジン残基あるいは本発明の抗体単一可変ドメインの１つあるいはそれ以上の非相同CDRsに付着される。CDRsおよびフレームワーク領域は、イムノグロブリン可変ドメインの、イムノロジカル・インテレスト(Immunological Interest)のカバット・プロテイン配列データベース(Kabat database of Sequences of Proteins)で定義されているような領域である(Kabat et al.(1991) Sequences of proteins of im777unological interest,U.S. Department of Health and Human Services)。好ましい実施態様では、PEGポリマーは、VHフレームワーク・セグメントDP47またはVκフレームワークセグメントのDPK9においてシステイン残基またはリジン残基に結合される。本発明によるPEGに結合することができるDP47のシステインおよび/またはリジン残基は、配列番号2の位置22もしくは96にシステインを、および位置43、65、76もしくは98にリジンを含む(図13)。本発明によるPEGに結合するDPK9のシステインおよび/またはリジン残基は、配列番号4の位置23、もしくは88にシステイン残基を、および位置39、42、45、103、もしくは107にリジン残基を包含する(図14)。さらに、特異的なシステイン残基またはリジン残基が、VH正規フレームワーク領域DP38、あるいはDP45においてPEGに結合されてもよい。
さらに、システイン残基またはリジン残基が存在しない場合には、特異性を有する溶媒可接性dAb分子中の一部を、PEGポリマーに付着させるためにシステインまたはリジンに変異させることができる。所与のdAb単量体もしくは多量体における溶媒可接性残基は、(例えば所与dAbの結晶構造の分析等の)当業界で公知の方法を用いて決定することができる。例えば、VH dAb HEL4(配列番号5)の溶解性の結晶構造により、Gln-13、Pro-14、Gly-15、Pro-41、Gly-42、Lys-43、Asp-62、Lys-65、Arg-87、Ala-88、Glu-89、Gln-112、Leu-115、Thr-117、Ser-119、およびSer-120残基が溶媒可接性残査として同定された。そしてこれらは本発明のPEGポリマーが付着するシステイン残基またはリジン残基に変異させる残査の有力な候補となる。さらに、VκダミーdAb(配列番号6)の溶解された結晶構造に基づいて、Val-15、Pro-40、Gly-41、Ser-56、Gly-57、Ser-60、Pro-80、Glu-81、Gln-100、Lys-107、およびArg-108の残基が溶媒可接性残査として同定された。そしてこれらは本発明のPEGポリマーが付着するシステイン残基またはリジン残基へ変異させる残査の有力な候補となる。好ましくは、PEG成分または他のポリマーは、位置Glnｌ3、Pro41またはLeuｌ15の１つあるいはそれ以上の中に置換されるシステイン残基またはリジン残基もしくは本発明による他の抗体単一可変ドメインポリペチドにおいて類似の溶媒可接性残基に付着される。本発明の一の実施態様において、PEGポリマーは、多数の溶媒可接性システイン残基またはリジン残基に、もしくは溶媒可接性システイン残基またはリジン残基へ変異した残基に結合される。あるいは、溶媒可接性を有する残基が１つの場合は、特定のdAbが１の溶媒可接性システインまたはリジン(あるいはシステインまたはリジンに変更された残基)を有している位置において、もしくは特定の溶媒可接性残基がPEG化のためのいくつかのそのような残基の中から選択される位置においてPEGが結合する。
Figure 0005087274
 本発明に有用な複数の付着スキームは、Nektar (Sun Carlos CA)より提供される。例えば、PEGまたは他のポリマーをリジン残査へ付着させる場合には、スクシンイミジルプロピオン酸塩のようなN-ヒドロキシルスクシニミドによって誘導体化されたPEGポリマーの活性エステルを使用することが可能である。システイン残基への付着を目的とする場合には、マレイミド、ビニルスルホン、またはチオールのようなスルフヒドリル選択性試薬によって誘導体化されたPEGポリマーを使用することが可能である。PEG化dAbを生成するために本発明に使用することができるPEG誘導体の他の具体的な実施態様の例は、Nektar Catalog (WWW.nectar.comで入手可能)から入手できる。また、PEGポリマーの本発明のdAb単量体または多量体への付着を容易にするために、PEGのいくつかの誘導化形態を本発明に使用することが可能である。これらの非限定的な例として、PEG-スクシンイミジルコハク酸塩、ウレタン結合PEG、PEGフェニルカーボネート、PEGスクシンイミジルカーボネート、PEG-カルボキシメチルアジド、ジメチルマレイン酸無水物PEG、PEGジチオカーボネート誘導体、PEG-トレシレート(tresylate) (2,2,2-トリフルオロエタンスルホン酸塩)、mPEG イミドエステル、およびザリフスキ(Zalipsky)およびリー(Lee)が記載したものが挙げられる("Use of functionalized poly (ethylene glycol) s for modificationof peptides"in Poly (Ethylene Glycol) Chemista : Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed. , Plenum Press,NY)。
図6乃至11は、本発明のPEG化dAbおよびdAb多量体のいくつかの実施態様を示す。各図において「X」は、例えば、PEG-NHS、SPA、MAL、VS、チオールなどの化学的に活性化されたPEGを有するdAbにおけるアミノ酸の化学修飾を示す。この修飾アミノ酸は、dAbの如何なる残基であってもよいが、システインまたはリジンであることが好ましく、さらに溶媒接触可性残基であることが好ましい。図中に用いられる「PEG」は、直鎖、分鎖、フォーク型、および/または複数のアームを有するPEGを示す。「S」は、アミノ酸のシステインを示す。
図7は、種々の二量体dAbフォーマットを示し、この二量体はdAb構造内部のシステイン残基間におけるジスルフィド結合によって形成されるか、またはdAbのC末端に存在するシステイン残基間のジスルフィド結合によって形成される。一の実施態様において、このC末端システイン残基は、ヒンジ領域に存在する。dAb二量体は、dAb単量体の一方かまたは両方の内部(図7-5参照)でPEG化することができる。この代りに、dAb二量体は、各dAb単量体のC末端システインに結合する分鎖、フォーク型、または 複数のアームを有するPEGポリマー により形成されるか(図7-7)、または各dAb単量体内部のアミノ酸残基にPEGポリマーを結合させて形成してもよい(図7-11)。
図8は、dAb単量体が(Gly4Ser)nリンカー（n=1〜約10）、のようなリンカーペプチドによって二量体を形成するように結合したdAb単量体のdAbホモまたはヘテロ二量体の種々の実施態様を示す。dAb単量体が二量体を形成するように結合すると、誘導体化されたPEGポリマーは、それからシステインかまたはリジン残基において二量体にランダムに付着されるか、または特に本願明細書に記載のPEG結合部分（例えば、MAL、NHS、SPA、VS、又はチオール）のうちのいずれかを使用して、C末端またはdAb単量体の一方または両方にあるシステイン残基を標的として付着させることが可能である。この代りに、PEGポリマーをdAb単量体の結合に使用するリンカーペプチドに存在するチオール反応性残基に付着させてもよい（図8-15）。また、図8-17に示すように、リンカーペプチドを使用してそれぞれ形成した2つ以上のdAb二量体は、C末端ジスルフィド結合を経て結合することができる。図9は、リンカーペプチド内の、特に内部に存在する特定のシステイン残基への、またはdAb単量体の一方または両方のC末端における、PEGの付着の種々の実施態様を示す。
図10から明らかなように、ホモまたはヘテロ三量体dAbは、マルチアームのPEGポリマーが(システイン、リジンまたは他の溶媒可接性な残基を経て)dAb単量体のそれぞれのC末端に結合するように、一連のリンカーペプチド(例えば、Gly Serリンカー;図10-25、26、または27)か、またはマルチアームPEGポリマー(図10-23、24)を使用して、3つのdAb単量体を互いに結合することによって形成することができる。dAb単量体をリンカーペプチドを経て互いに結合する場合、PEGポリマーを三量体dAb のC末端システインに付着させることができ、または、上述のように1つ、2つ、または3つすべてのdAb単量体の他の溶媒可接性残基へMAL、NETS、SPA、VS、またはチオール部分を介して付着させてもよい。図10-27は、二重特異性のdAb三量体を含む本発明の一実施様態を示す。本実施態様では、1つ以上(すべてではない)のdAb単量体は、他のdAb単量体と異なる抗原に対する結合特異性を有する。この種の二重特異性の実施態様におけるdAb単量体は、図10-27に示すように、結合ペプチドを経て結合させることが可能であるが、代わりに分鎖または三量体の各単量体がPEG部分に結合されたマルチアームPEGを経て結合されていてもよい。図10-27に示される二重特異性の三量体の個々の単量体がリンカーペプチドによって結合している場合、この三量体は上で説明される機構のいずれかを経て1つ以上のPEGポリマーを結合させることが可能である。すなわち、PEGは、1つ以上のdAb単量体の、または1つ以上の単量体のC末端に存在する、さらには、三量体に含まれる1つ以上のdAb単量体上に設計されたシステインまたはリジン残基に結合させることが可能である。上述の、および図6乃至11に示される単量体、二量体、または三量体のdAbでは、PEGポリマーを既存のシステインまたはリジン残基に付着させるか、または1つ以上のdAb単量体に設計されたシステイン又はリジン残基に付着させるか、またはその代わりに1つ以上のリンカーペプチドに設計されたシステインまたはリジン残基に付着させることが可能である。
図11は、本発明のdAbヘテロまたはホモ四量体のPEG化の各実施態様を示す。dAb単量体は、1つ以上の結合ペプチドを経て結合することができるが(図11-29)、代わりにマルチアームまたは分鎖PEGポリマーを使用して四量体を形成してもよい(図11-28、30)。この代わりに、リンカーペプチドを介して2つの単量体から形成された2つ以上のdAb二量体のいずれかの単量体を、分鎖またはマルチアームPEGポリマーを用いて四量体を形成するようにその後に結合させることが可能であるが、ここで、このPEGポリマーは、dAb単量体に存在するか、dAb単量体のC末端において(図11-29)、またはリンカーペプチドに存在する(図11-31)リジンまたはシステイン残基に付着される。dAb単量体、二量体、および三量体に対して上述したように、1つ以上のPEGポリマーは、本発明のdAb四量体の所望の位置に付着させることができる。例えば、PEGポリマーは、C末端システインまたは他の残基に付着させるか、またはリンカーペプチドの1つ以上の残基に付着させるか、あるいは四量体に含まれるdAb単量体に存在または設計された任意のシステインまたはリジン残基に付着させることが可能である。
図12は、本発明により生成することが可能な高次PEG結合dAb多量体の例を示す。例えば、リンカーペプチド(図12-31に示す)によって結合させるか、または代わりに各二量体の単量体間をジスルフィド結合により結合させた複数のdAb二量体は、それら自身がマルチアームPEG重合体によって二量体の四量体を形成するように結合させるが、マルチアームPEGポリマーの各PEGは、各二量体組の単量体のうちの1つに存在するC末端システイン残基に結合する。図12-32は、代替的実施態様として、マルチアームPEGのPEGポリマーは各二量体のリンカーペプチドに存在するシステイン残基に結合させることも可能である。二量体、三量体および四量体を(例えば、リンカーペプチドまたはジスルフィド結合を使用して)形成する方法とともに、上述のPEG付着位置およびその方法は、例えば、本発明の八量体、十量体などの大きなPEG結合dAb多量体を形成するために変更することが可能である。例えば、大きなPEG結合dAb多量体を形成するための図12に示される方法に類似して、dAbの三量体または四量体を、大きなPEG結合dAb多量体を形成するために、例えば、マルチアームPEG、リンカーペプチド、またはジスルフィド結合によってそれら自身を互いに結合させてもよい。複数のdAb二量体、三量体、四量体などを、リンカーペプチド、またはジスルフィド結合(例えば、図12に示されるマルチアームPEGの使用に代えて)によって結合させる場合、PEGポリマーは、本願明細書に記載のいずれかの方法によって生じる多量体に結合させることができる。例えば、PEGポリマーを多量体に含まれるdAb単量体の1つ以上の表面にあるシステインまたはリジン残基に結合させてもよいし、PEGポリマーを多量体に含まれる1以上のdAb単量体のC末端システインに結合させてもよいし、またはPEGポリマーを多量体の成分を互いに結合させるいずれの結合ペプチド(すなわち、個々の単量体を結合させる結合ペプチド、および/または二量体、三量体、または四量体を互いに結合する結合ペプチド)に存在するシステインまたはリジン残基に結合させてもよい。
上述の実施態様のそれぞれにおいて、PEGポリマーはdAbペプチドに存在するいずれの修正可能な残基に付着させることができるが、好ましくは、1つ以上のdAbの残基をPEGポリマーの付着点として使用できるシステインまたはリジン残基に修飾または変異させてもよい。このように修飾される残基は、溶媒可接性残基であること、すなわち、dAbがその自然な折り畳み構造にある場合に、残基が水性環境および誘導体化PEGポリマーに接触可能であることが好ましい。1つ以上のこれらの残基を、本発明に基づくシステイン残基に変異させたとき、直鎖または分岐鎖MAL誘導体化PEG(MAL-PEG)を使用したPEGの付着に利用可能である。
一の実施態様では、本発明は単一可変ドメインの抗体およびPEGポリマーを含む単一可変ドメインの抗体を提供するが、PEGポリマーと単一可変ドメインの抗体との比率は、少なくとも0.25:1のモル比率である。別の実施態様では、PEGポリマーと単一可変ドメインの抗体との比率は、0.33:1またはそれ以上である。さらに別の実施態様では、PEGポリマーと単一可変ドメインの抗体との比率は、0.5:1またはそれ以上である。
半減期の増加
本発明のPEG化dAb単量体および多量体は、本発明のPEG化dAb分子が長い半減期を有するという点で、従来技術において示されるそれらのdAb分子に対して明瞭な利点を与える。本発明のdAb分子の半減期の増加は、PEGポリマーの付着がもたらすdAbの流体力学的サイズの増加によって与えられると考えられる。より詳しくは、2つのパラメータがPEG化dAbおよびdAb多量体の血清中の半減期に重要な役割を果たすと考えられる。第1の基準は、PEGの付着性質およびサイズであり、すなわち、使用されるポリマーが単なる直鎖または分岐鎖/フォーク型である場合、分岐鎖/フォーク型がより長い半減期を与えるということである。第2の基準は、最終的なフォーマット上でのdAbの位置、およびその分子がどのくらいの「遊離した」未修飾のPEGアームを有するかである。例えばサイズ排除クロマトグラフィによって推定されるPEG化dAbの結果として生じる流体力学的なサイズは、分子の血清半減期を反映する。したがって、PEG化分子の流体力学的なサイズが大きくなるほど、血清半減期も長くなる。
半減期の増加は、免疫グロブリン、特に抗体およびさらには小型の抗体フラグメントを生体内で用いる場合に有利である。このようなフラグメント(Fvs、Fabs、scFvs、dAbs)は、体内において急速な浄化作用を受ける。したがって、それらは体内の大部分に速やかに到達することができ、製造が容易で扱いやすいけれども、その一方でそれらは生体内での持続性が短時間であることから用途の制限を受けることになる。
一の側面では、本願明細書に記述された単一可変ドメインの抗体のポリペプチドは、dAbポリペプチドの流体力学的サイズを増すPEGなどの部分と融合することにより生体内で安定する。dAb半減期の薬物動態学的分析および判定方法は、当業者に公知である。詳細は、Kenneth, A et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals : A Handbook for Pharmacists and in Peters etal.,Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)に見出すことが可能である。また、tαおよびtβの半減期などの薬物動態学的パラメータおよび濃度曲線下面積(AUC)を記述した、"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by MarcelDekker,2 Rev. ex edition (1982)も参照のこと。
概して、本発明のPEG化dAb単量体または単量体の半減期は、非PEG化dAb(ここで、PEG化dAbおよび非PEG化dAbのdAbは同一である)と比較して、10%、20%、30%、40%、50%またはそれ以上増加する。2倍、3倍、4倍、5倍、7倍、10倍、20倍、30倍、40倍、および最大50倍またはそれ以上の範囲での半減期の増加が可能である。この代わりに、または加えて、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍の範囲での半減期の増加が可能である。
半減期(tl/2αおよびt1/2β)およびAUCは、リガンドの血清濃度対時間の曲線から特定することができる。WinNonlin分析パッケージ(Pharsightから入手可能)は、例えば、その曲線のモデル化に使用することができる。第1の段階(α段階)では、リガンドは、いくつかの除去を伴って主に患者に分配されている。第2の段階(β段階)は、リガンドが分配され、リガンドが患者から除去されたときに血清濃度が減少した場合の終末過程である。tα半減期は第一相の半減期であり、tβ半減期は第二相の半減期である。特に明記しない限り、本願明細書に使用される「半減期」は、(例えば、二相性モデリングと比較して)無隔壁モデリングによって特定される本発明の単一可変ドメインの抗体の全体的な半減期に関連する。半減期は、dAb単量体または多量体を投与された哺乳動物から取り除くのにかかる時間の測定値である。したがって、好都合に本発明は、例えば、0.25時間乃至6時間以上のtα半減期を有するdAb-エフェクタ群組成物である、dAb含有組成物を提供する。一実施態様では、その範囲の下端は、30分、45分、1時間、1.3時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間、または12時間である。加えて、または代わりに、dAb含有組成物は、12時間を含む範囲のtα半減期を有する。一実施態様では、範囲の上端は、11、10、9、8、7、6、または5時間である。好適な範囲の一例では、1.3乃至6時間、2乃至5時間または3乃至4時間である。
本発明は好都合に、1乃至170時間又はそれ以上の範囲のtβ半減期を有する本発明に基づくリガンドを含むdAb含有組成物を提供する。一実施態様では、範囲の下端は、2.5時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、または12時間である。加えて、または代わりに、例えばdAbエフェクタ群組成物などのdAb含有組成物は、21日を含む範囲のtβ半減期を有する。一実施態様では、範囲の上端は、12時間、24時間、2日、3日、5日、10日、15日、または20日である。好都合に、本発明に基づくdAb含有組成物は、2乃至100時間、4乃至80時間、および10乃至40時間の範囲の半減期を有することになる。別の実施態様では、tβ半減期は12乃至48時間の範囲である。さらに別の実施態様では、12乃至26時間の範囲である。本発明は、1乃至170時間以上の範囲の半減期を有する本発明に基づくリガンドを含むdAb含有組成物を提供する。一実施態様では、tβ半減期の範囲の下端は、1.3時間、2.5時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、または12時間である。加えて、または代わりに、例えばdAbエフェクタ群組成物などのdAb含有組成物は、21日を含む範囲の半減期を有する。一実施態様では、範囲の上端は、12時間、24時間、2日、3日、5日、10日、15日、または20日である。
上述の基準に加えて、または代わりに、本発明は、1mg.min/ml以上の範囲のAUC(濃度曲線下面積)値を有する本発明に基づくリガンドを含むdAb含有組成物を提供する。一実施態様では、この範囲の下端は、5、10、15、20、30、100、200、300mg.min/mlである。加えて、または代わりに、本発明に基づくリガンドまたは組成物は、最高600mg.min/mlの範囲のAUCを有する。一実施態様では、範囲の上端は、500、400、300、200、150、100、75、または50mg.min/mlである。好都合に、本発明に基づくリガンドは、以下からなる群から選択される範囲にAUCを有する:15乃至150mg.min/ml、15乃至100mg.min/ml、15乃至75mg.min/ml、および15乃至50mg.min/ml。
プロテアーゼ安定性の増加
本発明の更なる利点は、本願明細書に記載されたPEG化dAbおよびdAb多量体は、プロテアーゼの作用に対する安定性が増加していることである。環境にもよるが、一般にdAbは、プロテアーゼの作用に対して本来、安定性を有している。ペプシンの存在下では、タンパク質が酸性条件下で折りたたまれなくなることから、タンパク質がプロテアーゼ酵素に接触可能となり、多くのdAbがpH2で完全に分解される。本発明は、dAb多量体を含むPEG化dAb分子を提供するが、PEGポリマーは、PEGポリマーが主鎖を物理的に覆うことによりポリペプチド主鎖を保護し、それによってプロテアーゼがポリペプチド主鎖に接触しそれを分割することを防ぐと考えられる。好適な実施態様では、より大きな流体力学的サイズは、より小さな流体力学的サイズを有するPEG化dAbよりも、プロテアーゼによる分解から保護されるレベルが高いことから、より大きな流体力学的サイズ(例えば、200乃至500kDa)を有するPEG化dAbが本発明に基づいて生成される。一の実施態様では、ペプシン、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼの1つ以上に露出させる。ここでプロテアーゼがペプシンであり、pH2で30分間露出させた場合、およびプロテアーゼが1つ以上のトリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼであり、pH8で30分間露出させた場合、PEGまたは他の重合体を結合した単一可変ドメインの抗体の単量体または多量体は、10%しか分解されない。好適な実施態様では、PEGまたは他の重合体を結合したdAb単量体または多量体は、ペプシンにpH2.0で30分間露出させた場合に、10%しか分解されないが、5%未満が好ましく、さらには全く分解されないことが好ましい。別の好適な実施態様では、本発明のPEGまたは他のポリマーを結合したdAb多量体(例えば、ヘテロまたはホモ二量体、三量体、四量体、八量体、など)は、分解が5%未満であるが、pH2.0で30分間のペプシンの存在下で全く分解されないことが好ましい。好適な実施態様では、PEGまたは他の重合体を結合したdAb多量体は、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼにpH8.0で30分間露出させた場合に、10%しか分解されないが、5%未満が
好ましく、さらには全く分解されないことが好ましい。別の好適な実施態様では、本発明のPEGまたは他の重合体を結合したdAb多量体(例えば、ヘテロまたはホモ二量体、三量体、四量体、八量体、など)は、分解が5%未満であるが、pH2.0で30分間のトリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼの存在下でpH8.0で30分間露出させた場合に、全く分解されないことが好ましい。
プロテアーゼ対単一可変ドメインの抗体ポリペプチドの相対的な比率は、上述の所望の分解レベルを達成するために本発明に基づいて変更してもよい。例えば、この割合、すなわちプロテアーゼ対単一可変ドメインの抗体の割合は、約1:30から、約10:40、約20:50、約30:50、約40:50、約50:50、約50:40、約50:30、約50:20、約50:10、約50:1、約40:1、および約30:1までである。
したがって、本発明は、本願明細書に記載された実施態様のいずれか1つに基づいて、PEG重合体への単一可変ドメインの抗体の単量体または多量体を結合させてなる単一可変ドメインの抗体の分解を減少させる方法を提供する。本発明の本側面によれば、単一可変ドメインの抗体は、pH2.0で30分間のペプシンの存在下で10%しか分解されない。特に、PEG結合dAb多量体は、5%しか分解されないが、pH2.0で30分間のペプシンの存在下で全く分解されないことが好ましい。代わりの実施態様では、単一可変ドメインの抗体は、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼにpH8.0で30分間露出させた場合に、10%しか分解されないが、5%未満が好ましく、さらには全く分解されないことが好ましい。
本発明によるPEG結合dAb単量体および多量体の分解は、当業者に公知である方法を使用して測定してもよい。例えば、pH2.0で30分間のペプシンとのインキュベーション、またはpH8.0で30分間のトリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼとのインキュベーションに続けて、dAbのサンプルをゲル濾過によって分析することが可能であるが、ここでdAb単量体または多量体の分解は、非分解性dAb(すなわち、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼまたはカルボキシペプチダーゼによって処理されていない制御dAb)よりも小さい分子量のゲルバンドによって表される。このゲル上のdAbバンドの分子量は、バンドの移動距離を分子量ラダー（マーカー）の移動距離と比較することによって特定することが可能である(図5参照)。タンパク質分解についての他の測定方法は、従来技術において周知であり、本発明のPEG結合dAb単量体および多量体の評価に適応することが可能である。
単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの使用:
本願明細書において記載されたPEG化単一可変ドメインポリペプチドのPEG化抗体は、様々なin vivoおよびin vitro診断、および治療および予防用途に有用である。例えば、該ポリペプチドを、生物学的サンプル中にある標的抗原を検出するために、免疫測定(例えば、ELISA、RIAなど)に組み込むことができる。単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、例えば、ウエスタンブロット法の用途および親和性クロマトグラフィ法において使用することもできる。このような技術は、当業者に公知である。
単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを使用する非常に重要な分野は、標的抗原に関連した疾病または疾患の治療または予防である。
基本的に、抗体を治療又は予防に用いる疾病並びに疾患は、本願明細書に記載された単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドによる治療または予防の対象である。本願明細書に記載された高結合親和性を有し、ヒト配列オリジン、および小型かつ高溶解性の単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、例えばフルレングス抗体、さらには例えば人間の疾病の治療または予防のためのscFvよりも優れている。
本願明細書に記載された単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを使用して治療可能または予防可能な疾病または疾患には、例えば、炎症、敗血症(例えば、感染性ショック、エンドトキシンショック、グラム陰性菌敗血、および毒性ショック症候群を含む)、アレルギーの過敏症、癌または他の過増殖性障害、自己免疫不全(例えば、糖尿病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、橋本病、グレーブス病、シェーグレン症候群、ポリ内分泌の不全、白斑、周辺神経障害、対宿主性移植片病、自己免疫多腺性症候群Ｉ形、急性糸球体腎炎、アジソン病、成人発症型突発性副甲状腺機能低下症(AOIH)、完全脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、自己免疫無形成性貧血、自己免疫溶血性貧血、ベーチェット病、小児脂肪便病、慢性活動性肝炎、クレスト症候群、皮膚筋炎、拡大した心筋症、好酸球増加-筋痛症候群、後天性表皮水疱症(EBA)、巨細胞動脈炎、グッドパスチャー症候群、ギラン‐バレー症候群、血色素沈着症、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、突発性IgAネフロパシ、インシュリン依存性真性糖尿病(IDDM)、若年性慢性関節リウマチ、ランバート-イートン症候群、線状IgA皮膚病、心筋炎、ナルコレプシ、壊死性脈管炎、新生児狼瘡症候群(NLE)、ネフローゼ症候群、類天疱瘡、天疱瘡、多発性筋炎、原発性硬化性胆管炎、乾癬、急速進行性糸球体腎炎(RPGN)、ライター症候群、全身強直性症候群および甲状腺炎を含む)、伝染病(例えば、炎症、悪液質またはサイトカイン依存性組織障害を制限することによる)、移植片拒絶反応および移植片対宿主病、肺疾患(例えば、呼吸障害症候群、ショック肺、慢性的な肺炎症性疾患、肺類肉腫症、肺線維症および珪肺症)、心臓障害(例えば、心臓の虚血、心臓の機能不全)の影響、炎症性骨疾患および骨吸収疾患、肝炎(アルコール性肝炎およびウイルス性肝炎を含む)、凝固妨害、再潅流傷害、ケロイド形成、瘢痕組織形成および発熱、が挙げられる。
癌は、例えば、1つ以上の分子、例えば、腫瘍の成長および/または代謝活性のために必要なサイトカインまたは成長因子、細胞表面レセプタまたは抗原、または酵素によって、または例えば、連鎖細胞障害性または腫瘍細胞へのアポトーシス誘導作用剤を対象とする腫瘍特異性または腫瘍増量抗原に対して特異的な単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを使用することによって治療することができる。例えば、炎症性または自己免疫疾患などの他の疾病または疾患は、1つ以上の病状の媒体を対象とする本願明細書に記載された単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドによる同様な方法で治療することができる。最も一般的には、このような媒体は、例えば、炎症または他の組織障害を媒介する内在性サイトカイン(例えば、TNF-α)またはそれらのレセプタである。
医薬品組成物、投薬量および投与
本発明の単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、患者への投与に好適な医薬品組成物に組み込むことができる。
概して、医薬品組成物は、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む。本願明細書で使用している「薬学的に許容可能なキャリア」または「キャリア」には、生理的に相溶性のある、いずれかまたは全ての溶媒、分散媒体、被覆物、抗菌および抗真菌性の作用剤、等張性および吸収遅延作用剤などが挙げられる。「薬学的に許容可能なキャリア」という用語では、ウシまたはウマの血清を含む組織培養培地を除外する。薬学的に許容可能なキャリアの例には、1つ以上の水、食塩水、食塩加リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどとそれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合では、例えば、糖質類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、またはその組成物中の塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学的に許容可能な物質には、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの貯蔵寿命または有効性を高める、湿潤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの微量の補助物質が挙げられる。
本願明細書に記載された組成物は、様々な形態としてよい。これらには、例えば、液体溶液(例えば、注射可能なおよび注入可能な溶液)、分散液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソーム、および坐薬などの液体、半固体および固体の投薬形態が挙げられる。好適な形態は、対象とする投与様式および医療適用によって決まる。典型的な好適な組成物は、他の抗体をもつヒトの受動免疫に使用されるものと同様の組成物などの注射可能な、または注入可能な溶液の形態である。投与の好適な態様は、非経口的である(例えば、静脈内、皮下、腹膜内、筋肉内)。
治療組成物は、概して製造過程および貯蔵下で無菌かつ安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高薬剤濃度に好適な他の意図する構造として調整することができる。無菌注射可能な溶液は、上記列挙した成分の1つかまたは組み合わせた適切な溶媒に所要量の活性化合物を組み込むことによって調製することができ、必要に応じてその後に濾過殺菌を行う。一般に、分散液は、基本的な分散媒体および上記列挙したものからの成分を含む活性化合物を無菌の媒体に組み込むことによって調製する。無菌注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製の好適な方法は、真空乾燥およびフリーズドライであり、これらにより活性成分及び追加の所望の成分の粉末が、前の滅菌濾過された溶液から得られる。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用い、分散の場合は所要の粒径を保ち、かつ界面活性剤を用いることによって維持することができる。
本願明細書に記載された単一免疫グロブリン可変ドメインは、多くの治療用途に対して従来技術において周知の様々な方法によって投与することができるが、好適な経路/投与様式は静注または点滴である。ポリペプチドも、同様に筋肉または皮下注射によって投与することができる。本発明のPEG化免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、上述の代わりにまたは加えて遅延放出機構を介して投与してもよい。この遅延放出機構には、当業者に公知である好適なセルロースベースのポリマーを含むことが可能であり、さらに個々の哺乳動物に植設することが可能で、時間とともに徐々にPEG化可変ドメインポリペプチドを放出する浸透ポンプを更に備えることが可能である。本発明基づく浸透ポンプは、6週間で約0.5mlから2週間で0.1mlの放出速度を備える。放出速度は、4週間で約0.2mlであることが好ましい。所望の成果、またはポリペプチドを用いたPEG化可変ドメインに基づいて放出速度を変更することが可能であることは、当業者によって理解されよう。本発明による調製には、PEG化単一可変ドメインの抗体(またはPEG化多量体)の濃溶液、例えば、水溶液中(例えば、PBS)に少なくとも5mg/ml(〜417μM)の溶液を含み、また少なくとも10mg／ml(〜833μM)、20mg／ml(〜1.7mM)、25mg/ml （〜2.1mM）、30mg/ml(〜2.5mM)、35mg/ml(〜2.9mM)、40mg/ml(〜3.3mM)、45mg/ml(〜3.75mM)、50mg/ml(〜4.2mM)、55mg/ml(〜4.6mM)、60mg/ml(〜5.0mM)、65mg/ml(〜5.4mM)、70mg/ml(〜5.8mM)、75mg/ml(〜6.3mM)、100mg/ml(〜8.33mM)、150mg/ml(〜12.5mM)、200mg/ml(〜16.7mM)またはそれ以上であることが好ましい。いくつかの実施態様では、調製は、例えば、250mg/ml(〜20.8mM)、300mg/ml(〜25mM)、350mg/ml(29.2mM)、またはさらにそれ以上で行うことができるが、使用前に200mg/ml以下に希釈する。
当業者によって理解されるように、投与経路および/または投与様式は、所望の結果によって変化する。ある種の実施態様では、移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された配送システムを含む放出制御製剤のような、急速な放出から化合物を防護するような担体とともに調製することが可能である。単一免疫グロブリン可変ドメインは、一つには、しれらのサイズが小さいことから、容量あたりのモル数が、例えばフルサイズの抗体の投薬量よりも著しく多くなる。このことは持続放出調製品として十分に好適である。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生物分解性で生物学的適合性を有するポリマーを使用できる。注入可能な組成物の持続的な吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含ませることにより成すことができる。このような製剤の調製のための多くの方法は、特許権を得ているか、または一般に当業者に公知である。（Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照。）本発明に記載された単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの制御または持続放出に適用可能な追加的な方法は、例えば、米国特許第6,306,406号および6,346,274号とともに、米国特許出願US20020182254およびUS20020051808に開示されており、その全てを本願明細書に援用する。
ある種の実施態様では、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、例えば、不活性成分または食用担体とともに経口投与することが可能である。化合物(および必要に応じて他の成分)はまた、硬または軟シェルゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に圧縮するか、あるいは直接個人の食事に組み込むこんでもよい。経口の治療的投与のためには、化合物を、添加剤とともに組み込み、摂取できる錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシュ剤などの形態で用いてもよい。非経口投与以外の本発明の化合物を投与するためには、その不活性化を防ぐ材料による化合物の被覆か、または化合物の同時投与が必要となる場合がある。
本発明の別の実施態様は、細胞内部の受容体に対する少なくとも1つの単一ドメイン抗体へ共有結合または非共有結合によりポリペプチド構造を付着させることによって天然バリア全体を通過することができる治療用ポリペプチド、作用剤、または抗原を供給するための方法であり、前記構築物は前記受容体へ結合によって細胞内部に取り込まれる。本発明によれば、天然バリアには、血液脳、肺血液、腸血液、膣血液、直腸血液、および鼻血液関門が挙げられるがこれに限定されないが、。例えば、上気道および肺を経て供給されるペプチド構造を有する治療用ポリペプチドまたは作用剤は、肺管腔から血液への運搬に使用できる。この治療用ポリペプチドまたは作用剤は、細胞内在化を経た輸送の結果の粘膜表面(気管支の上皮細胞)上に存在する受容体へ結合する。別の例では、治療用ポリペプチドまたは作用剤は、腸壁上の血流に存在する内在化細胞受容体に対する少なくとも1つの単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構造に結合される。前記構造は、前記治療用ポリペプチドまたは作用剤の細胞内在化を経て、壁を通過する移動を誘導する。
本発明の単一可変ドメインの抗体のような化合物の配送および投与方法は、従来技術において周知であり、例えば、W0 04/041867の教示に見出すことが可能で、その内容はそれらの全体を参照することにより本願明細書に組み込まれる。
本発明はまた、どの単一可変ドメインの抗体ポリペプチド(例えば、dAb;VHH)が、例えば、経口、鼻、肺、皮膚を使用した投与によって天然バリアを経て血流へ入ったかを特定する方法も含む。非限定的な例では、この方法は、単純な、合成または免疫抗体単一可変ドメインのファージライブラリーをマウスなどの小動物に投与することを含む。投与後の異なる時間点で、血流中の能動的に移動するファージを回収するために血液を採取する。加えて、投与後に、器官を取り出し、結合ファージを回収することができる。肺管腔から血流への動的な運搬のための受容体以外の例では、FcレセプタＮ(FcRn)がある。したがって、本発明の方法は、能動的に血液に輸送されるだけでなく、特定の器官を対象とすることができる単一ドメイン抗体を識別することができる。この方法は、どの単一可変ドメインの抗体ポリペプチドが腸を経て血液に輸送されたか、舌を経て血液に入ったか、および皮膚を経て血液に入ったかなどを識別することが可能である。本発明の一の側面は、前記方法を使用して得られる単一のドメイン抗体である。どの単一可変ドメインの抗体ポリペプチドが、本発明による医薬品製剤の投与に最適であるのかを特定する方法は、WO04/041867に示され、その内容はそれらの全体を参照により本願明細書に援用する。
追加的な活性化合物を、組成物に組み込むこともできる。ある種の実施態様では、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、1つ以上の追加的な治療剤とともに同時に処方、および/または同時に投与される。例えば、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、他の対象(例えば、他のサイトカインまたは細胞表面分子を結合させる)を結合させる1つ以上の追加的な抗体または、例えば、1つ以上のサイトカインとともに同時に処方、および/または同時投与してもよい。このような併用療法は、投与治療剤の投薬量を低くすることが可能であり、したがって、種々の単独療法と関連する可能な毒性または合併症を防止する。
本発明の医薬品組成物は、「治療上有効量」または単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの「予防上有効量」を含むことができる。「治療上有効量」は、投薬および必要な期間で所望の治療結果を達成するための有効量に関連する。単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの治療上有効量は、個々の年齢、性別、および体重などの疾病状態、および個人において所望の反応を引き出す単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの能力によって変化することがある。治療上有効量は、治療上有効な効果が抗体または抗体一部のいずれの中毒性または不利益な影響を上回るものでもある。「予防上有効量」は、投薬および必要な期間で所望の予防結果を達成するための有効量に関連する。典型的に、予防上投与量は、病気になる前または病気の初期段階の患者に用いるので、予防上有効量は、治療上有効量より少ない。
投与計画は、最適な所望の反応(例えば治療または予防応答)を得るために調整することが可能である。例えば、単一の大型丸薬を投与することが可能であり、治療状況の緊急性によって複数に分割した用量を時間とともに投与するか、またはこの用量を比例的に増減させてもよい。これは、投与の容易さ、および投薬量の均一性のために投薬量単位形式の非経口組成物の調製に有益である。本願明細書で使用する投薬量ユニットは、治療する哺乳類の被術者に対する単一投薬量として適した物理的に別々のユニットに関連し、各ユニットは、所要の薬剤担体に関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物の所定の量を含む。
単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの治療上または予防上有効量の限定されない範囲は、0.1乃至20mg/kgであるが、1乃至10mg/kgが好ましい。投薬量の値は、緩和する状態の種類および程度によって変化する場合があることに留意されたい。さらに、いずれの特定の患者に対して、個々の必要性および投与する臨床医の専門的な判断に基づいて具体的な投与計画を調整しなければならないことを理解されたい。
本願明細書に記載された単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドによる治療の有効性は、熟練した臨床医が、疾病状態または治療する疾患の1つ以上の症状または指標の改善に基づいて判断する。改善は、20%、30%、40%、50%、75%、90%、または100%、または測定する指標によるが100%以上(例えば、2倍、3倍、10倍など、無病状態の達成まで含む)であることが好ましいが、1つ以上の臨床指標内に少なくとも10%(測定する指標によって増減する)の改善を「有効な治療」であるとみなす。指標は、例えば、酵素、サイトカイン、成長因子または代謝物質レベル、細胞成長または細胞死の率、または異常細胞の存在または量などの物理的測定とすることができる。また、例えば、疾病または疾患(例えば、多発性硬化症のような緩和/再発疾病)の症状の再発の間の時間の際を測定することができる。この代りに、痛みまたは不快が減少したという報告、または他の疾病状態の指標などの非物質的な測定を治療の有効性の評価として信頼することができる。非物質的な測定を行う場合、種々の臨床的に許容可能な尺度または指標を使用することができ、例えば、クローン病アクティビティインデックスまたはCDAI(Best et al., 1976, Gastroenterology 70: 439)では、疾病スコアを指定するために、特に腹部の痛みまたは筋けいれんの程度および一般的な健康問題などの患者報告要素とともに、ヘマトクリットおよび液状または軟便の便通回数などの物理的指標を組み合わせている。
本願明細書に使用されている用語として、本願明細書に記載された化合物を使用して行われる「予防」は、その化合物で治療していない同様な個人(ヒトまたは動物のモデル)における症状と比較して、1つ以上の症状の発症または程度が少なくとも10%遅延または低減、または消滅した場合に「有効」である。
認められたヒトの疾病動物モデルは、疾病または疾患の治療または予防のために本願明細書に記載されているように、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの有効性の評価に使用することができる。このような疾病モデルの例には、例えば:サボア(Savoie)他(Savoie et al., 1995, Am. J. Respir. Cell Biol. 13: 133-143)によって記載された、アレルギー性喘息のモルモットモデル、ルイスラット（(Feurer etal., 1985, J. Neuroimmunol. 10: 159-166)、ルイスウサギ（(Brenneret al., 1985, Isr. J. Med. Sci. 21: 945-949), ）、及びルイスマウス（(Zamvil etal., 1985, Nature 317: 355-358)；複数の生物種に誘導されうる多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の動物のモデル;例えば、非肥満性糖尿病(NOD)マウス(e. g. , Li etal., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91:11128-11132)、ＢＢ/ＤＰラット((Okwueze et al., 1994, Am. J. Physiol. 266: R572-R577)、ウィスター系肥満ラット(Jiao etal., 1991, Int. J. Obesity 15: 487-495)、およびズッカー糖尿病肥満ラット(Lee etal., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 10878-10882)などの、インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)および非インスリン依存性真性糖尿病(NIDDM)両方のモデルを含む、糖尿病の従来技術において周知の動物のモデル、前立腺疾病の動物モデル(Loweth et al., 1990, Vet. Pathol. 27: 347-353)、アテローム性動脈硬化症のモデル(Chao et al., 1994,J. Lipid Res. 35: 71-83; Yoshida etal., 1990, Lab. Anim. Sci. 40: 486-489; and Hara et al., 1990, Jpn. J. Exp. Med. 60: 315-318)を含む数多くのモデル;ネフローゼ症候群(Ogura etal., 1989, Lab. Anim. 23: 169-174);自己免疫甲状腺炎(Dietrich etal., 1989, Lab. Anim. 23: 345-352);高尿酸血症/痛風((Wu etal., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 742-746)、胃炎(Engstrand etal., 1990, Infect. Immunity 58: 1763-1768));蛋白尿/腎臓糸球体欠陥(Hyun et al., 1991, Lab. Anim. Sci. 41: 442-446);食物アレルギー(例えば、Ermel etal., 1997, Lab. Anim. Sci. 47: 40-49; Knippels et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 368-375; Adel-Patient etal., 2000, J. Immunol. Meth. 235: 21-32; Kitagawa etal.,1995, Am. J. Med. Sci. 310: 183-187; Panush etal., 1990, J. Rheumatol. 17: 285-290);リウマチ様疾患(Mauri etal., 1997, J. Immunol. 159: 5032-5041; Saegusa et al., 1997, J. Vet. Med. Sci. 59: 897-903;Takeshita et al., 1997, Exp. Anim. 46: 165-169);骨関節症(Rothschildet al., 1997, Clin. Exp.Rheumatol. 15:45-51 ; Matyas et al., 1995, Arthritis Rheum. 38: 420-425);狼瘡（Walker et al., 1983, Vet. Immunol. Immunopathol. 15: 97-104; Walker et al., 1978, J. Lab. Clin. Med. 92: 932-943）;およびクローン病(Dieleman et al., 1997, Scand. J. Gastroenterol. Supp. 223: 99-104; Anthony etal., 1995, Int. J. Exp. Pathol. 76: 215-224; Osborne etal., 1993, Br. J. Surg. 80 : 226-229)等が挙げられる。他の動物モデルは、当業者に既知である。
本願明細書に記載された単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは高い親和性でヒト抗原と結合しなければならないが、動物モデルにおいてその効果を評価する場合、ポリペプチドは、動物モデルにおいて好ましくは高い親和性で1つ以上の抗原と交差反応しなければならない。当業者は、所定の条件が、与えられた動物モデルおよび与えられた単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドに対する条件を満たすかどうかを容易に特定することができる。この条件を満たす場合、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの有効性は、それを疾病状態を模倣した動物モデルに投与し、少なくとも10%の改善に対するその疾病状態の1つ以上の指標を観察することによって検討することができる。
実施例
本願明細書に引用した全ての特許、特許出願および公開された参考文献は、それらの全体を参照することにより本願明細書に組み込まれるものとする。本発明は、その実施態様を参照して図とともに記載されているが、当業者は、添付の請求の範囲に包含された本発明の範囲内において、形態および詳細の種々の変更を行うことが可能であることを理解されよう。
要約
VHおよびVκdAb類の部位特異のマレイミド-PEG化は、この例ではC末端でタンパク質の表面に提供される溶媒可接性システインを必要とする。遊離したチオールを与えるために還元されたシステイン残基は、特にタンパク質をマレイミドまたはチオールPEG dAbに結合させるために使用することができる。異なるサイズおよび分鎖したフォーマットの広範囲にわたる化学修飾されたPEGは、Nektar(正式にはShearwaterとして既知)から入手可能である。これによって、基本的なdAb-システイン単量体を、例えば、PEG化単量体、二量体、三量体、四量体などの様々な方法でフォーマット化することができる。PEGのサイズは、kDaで示されるが、Kと称する(すなわち、「40K PEG」=40kDa PEG)。
1.0 実施例1:VkdAbTAR1-5-19のPEG化
1.1 TAR1-5-19cysのPCR構造
TAR1-5-19は、C末端システインのVk cLAb上へPEGを結合に関する一例として使用する(図6-3)。PEGの付着部位は、対象とするアミノ酸が溶媒可接性であり、結果のPEG化タンパク質が依然として抗原結合を維持している限り、dAb表面のいかなる場所に配置してもよい。したがって、TAR1-5-19をPEG化するためにdAbのフレームワーク1-4のうちのいずれか1つにシステインを設計し、抗原結合性を維持することも可能である。以下のオリゴヌクレオチドを、特にSallおよびBas7sHI部位を有するTAR1-5-19のクローニングのためのPCRに、及び、C末端にシステイン残基を導入するためにも使用した。下記の配列は、TAR1-5-19システインのDNA配列および修飾dAbを増幅するために使用したPCRプライマーである。
Figure 0005087274
 PCR反応(50 μL容量)を、次のように調製した。200μMのdNTP、0.4μMの各プライマー、5μLの10ｘPfu Turbo緩衝剤(Stratagene)、100ngのテンプレートプラスミド(TAR1-5-19)、1μLのPfu Turbo酵素(Stratagene)、及び、滅菌水を使用して全体を50μLに調整した。以下のPCR条件を使用した。第一段階の変性ステップを94℃で2分間、次いで94℃で30秒間、64℃で30秒間、および72℃で30秒間を25サイクル。最終的な伸長ステップでは、72℃で5分間も含む。PCR製品を精製し、SallおよびBamHIにより消化し、同じ制限酵素で切断したベクターに結さつした。適切なクローンを、DNA配列によって確認した。
1.2 TAR1-5-19システインの発現および精製
TAR1-5-19cysベクターは、メーカーのプロトコルに従い、化学的被感染能力を有する細胞(Novagen)であるBL21(DE3)pLysS内で形質転換した。dAbプラスミドを担持する細胞は、100μg/mLのカルベニシリンおよび37μg/mLのクロラムフェニコールを使用して選択した。培養液を、500mlのTerrific Broth(Sigma-Aldrich)、100μg/mLのカルベニシリン、および37μg/mLのクロラムフェニコールを含む2Lのバッフルフラスコに準備した。培養液を、30℃、200rpmでO.D.600にて1乃至1.5の細胞濃度になるまで成長させ、次いで1mM IPTG(Melford Laboratories社のイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイド)で誘導した。dAbの発現を、30℃で12乃至16時間継続した。大部分のdAbが培養基に存在することが判明した。したがって、細胞は遠心分離(8,000xgで30分間)によって媒体から分離させ、上澄み液をdAbへと精製するために用いた。上澄み液1リットルにつき、30mlのタンパク質Ｌアガロース(Affitech社)を添加し、2時間の攪拌してdAbをバッチに結合させた。次いで、樹脂を吸い上げる前にさらに1時間、樹脂を用いて重力下で沈殿させた。次いで、アガロースをXK50のカラム(Amersham Pharmacia社)にパックし、2xPBSの10のカラム量を洗浄した。結合dAbは、pH2.0の100mMのグリジンで抽出し、次いで留分を含むタンパク質は、pH8.0の1/5量の1M Trisを添加して中和した。培養上澄み液1リットルにつき、20乃至30mlの純粋なタンパク質を分離したが、これは50:50の比率で単量体とTAR1-5-19ジスルフィド二量体を含む(図7-4)。
1.3 MAL活性PEGを使用したTAR1-5-19システインのPEG化
1.3.1 単量体のPEG化
VHまたはVκ dAbの表面上へ加工されたシステイン残基は、単量体修飾タンパク質を与えるために、特に単一の線状または分鎖したPEG-MALを用いて修飾した。下記に単量体VHまたはVκdAbをPEG化するために使用することが可能な2つのmPEG-MALのフォーマットを示す。これらのPEGは、500から60,000(例えば、2,000から40,000)のMWを有する。
Figure 0005087274
 2.5mlの500μM TAR1-5-19システインを、5mMのジチオスレイトールで稀釈し、室温で20分間放置した。サンプルは、次いでPD-10カラム(Amersham Pharmacia)を用いて、バッファ交換した。カラムは、5mMのEDTA、20mMのリン酸ナトリウムpH6.5、及び10%のグリセロールを用いて平衡化し、メーカーのガイドラインに従って抽出したサンプルを付加した。サンプル(3.5mlの360μM dAb)は、用いる直前まで氷上に配置した。4倍モルの過剰な40K PEG-MAL(〜200mgs)を計量し、希釈したdAb溶液と混合する前に100%メタノールで可溶化した。反応を進行させるために室温で3時間放置した。
1.3.2 PEG化TAR1-5-19システイン単量体の精製
この例では、タンパク質の等電点(pI)を8.8までとして、陽イオン交換クロマトグラフィを使用してVκdAbを精製した。タンパク質のpIが、例えば4.0と低い場合は、次いで陰イオン交換クロマトグラフィを使用することになる。40μLの40%氷酢酸に、pHを4にするために、40K PEGTAR1-5-19システイン反応物を1mLごとに添加した。次いで、サンプルを1mLのResource5カチオン交換カラム(Amersham Pharmacia社)に付加した。このカラムはpH4.0の50mMのナトリウムアセテートで予め平衡化してある。PEG化物は、20倍のカラム容量において0から500mMまでの直線的な塩化ナトリウム勾配をかけることにより未修飾dAbから分離した。PEG化dAbのみを含む留分を、SDS-PAGEを使用して識別し、次いでプールし、pH8.0の1/5量の1M Trisを添加してpHを8.0まで上昇させた。
1.3.3 mPEG-IALsを使用したTA1-5-19システインの多量体化
dAbの多量体化は、dAbを共有結合で付着させることが可能な多重反応基で修飾した広範囲のフォーク型/分岐鎖PEGを使用することによって達成することができる(図7および10参照)。TNFなどのマルチサブユニット標的に関しては、dAb(二量体、三量体および四量体に対する)多量体化が、その抗原に対する結合活性の顕著な増加を有することを示す(表1参照)。
Figure 0005087274
 上記の構造は、VHおよびVκdAabを多量体化するために使用することが可能なmPEG-MALのフォーマットを示す。MPEGの MWは、500から60,000(例えば、2,000から40,000)の範囲である。dAb二量体は、mPEG(MAL)2またはmPEG2(MAL)2を使用して、三量体および四量体は、それぞれ3または4アームのPEGを使用して生成する。示されるマルチアームPEGは、dAbsの付着を可能とするためにMALによる修飾を必要とする。
多量体化dAbフォーマットを生成する実験的な手順は、PEG-MAL:dAbのモル比がフォーマットによって変化する以外は、単量体を生成するために使用したものと同一であった。例えば、mPEG2(MAL)2を使用してTAR1-5-19二量体(図7-7に示す)を生成するために使用したPEG-MAL:dAbのモル比は、0.5:1であった。PEG化二量体を精製するために再び陽イオン交換クロマトグラフィを使用したが、PEG化単量体に用いた手順と以下の点が異なる。使用した塩化ナトリウム勾配は、30カラム量にわたって0乃至250mMであった。3アームPEG-MALを使用してTAR1-5-19三量体(図10-23に示す)を生成するために使用したPEG-MAL:dAbのモル比は、0.33:1であった。PEG化三量体を精製するために、再び陽イオン交換クロマトグラフィを使用したが、PEG化単量体に用いた手順と以下の点が異なる。使用した塩化ナトリウム勾配は、30カラム量にわたって0乃至250mMであった。4アームPEG-MALを使用してTAR1-5-19四量体(図11-28に示す)を生成するために使用したPEG-MAL:dAbのモル比は、0.25:1であった。PEG化四量体を精製するために、再び陽イオン交換クロマトグラフィを使用したが、PEG化単量体に用いた手順と以下の点が異なる。使用した塩化ナトリウム勾配は、30カラム量にわたって0乃至250mMであった。TAR1-5-19PEG三量体および四量体に対しては、必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィによりサンプルをさらに精製した。Superose 6HRカラム(Amersham Pharmacia社)を、サンプル上を付加する前にリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で平衡化した。カラムの流速は、0.5ml/分であり、280nmで吸光度に従いタンパク質の溶出を観察した。PEG化dAbのみを含む留分を、SDS-PAGEを使用して識別し、次いでプールした。
2.0 実施例2:VH dAb TAR2-10-27のMAL-PEG化
2.1 TAR2-10-27cysのPCR構造
TAR2-10-27は、のVH dAb上のC末端システイン修飾の一例として使用する。VκdAbと同様に、PEGの結合部位は、対象とするアミノ酸が溶媒可接性であり、結果のPEG化タンパク質が抗原結合を維持している限り、dAbの表面上の他の場所に配置してもよい。以下のオリゴヌクレオチドを、特にSallおよびBas7sHI部位を有するPCR TAR1-5-19のクローニングのために、またC末端システイン残基を導入するためにも使用した。PCR反応条件およびクローニングは、使用したテンプレートをTAR2-10-27を含むプラスミドDNAに変更した以外は第1.1節で説明した手順と同様に行った。
Figure 0005087274
Figure 0005087274
2.2 TAR2-10-27cysの発現および精製
DOMlh-10-27システインの発現および精製は、以下の改質を伴う以外は第1.2節にて説明したとおりである。dAbがVHであるとき、培養上澄み液からタンパク質を精製するためにStreamline Protein Aを使用した。また、このタンパク質は、pH2.0の緩衝剤の代わりにpH3.0の100mM グリジンを使用して樹脂から抽出した。
2.3 TAR2-10-27cysのPEG化
TAR2-10-27システインの単量体のPEG化は、第1.3.1節に概説したとおりである。また、VH dAbは、1.3.3節に概説したPEGを使用して多量体化してもよい。PEG化TAR2-10-27システインの精製は、タンパク質のpIを8.5として、pH4.0で陽イオン交換クロマトグラフィ(1.3.2に概説)を使用して行った。
3.0 NHSおよびSPA修飾mPEGを使用したV H およびVκdAbのPEG化
PEG化の部位特異的方法を使用するとともに、タンパク質を共有結合で修飾するためによりランダムな方法を使用した。これは、NHSまたはSPA修飾PEGの使用に関するが、これらは、溶媒に曝されるdAbの表面にあるリジン残基と反応する。この方法は、複数のリジンがすでにVHおよびVκdAbの表面に存在しているので、dAbは如何なるタンパク質修飾をも必要としないという利点を有する。また、いずれのdAbのフォーマットは、事前の改質、例えば、TAR1-5-19ジスルフィド二量体(図7-5、6)または超親和性二量体(図8-13、8-14、8-15)を行わずにPEG化することができる(3.3節および5.0節参照)。MAL-PEGと同様に、以下に示すような各種線状/叉状および分鎖したSPAおよびNHS-PEGのフォーマットが利用可能である。
Figure 0005087274
実施例3: VkdAbTAR1-5-19のNHSおよびSPA-PEG化
3.1 TAR1-5-19のPCR構造
TAR1-5-19は、NetSおよびSPA-PEGを使用してPEG化したVkdAbの一例として使用する。TAR1-5-19は、以下および1.1節に概説したプライマーを使用して増幅およびクローン作成した。
Figure 0005087274
 3.2 TAR1-5-19の発現および精製
TAR1-5-19の発現および精製は、1.2節に概説したとおりである。精製後、存在するトリス/グリジン緩衝剤を取り除くためにPBSまたはバッファ交換(PD10)に対してタンパク質を透析する点のみを変更した。
3.3 NHSまたはSPA-PEGによる単量体およびTAR1-5-19ジスルフィド二量体のPEG化
PEG化反応は、PBS緩衝液あるいはpH7.0の50mMのリン酸ナトリウムにおいて行った。400μMのTAR1-5-19単量体を5乃至10モルの過剰の活性化PEGと混合した(NHSあるいはSPAを100%エタノールに溶解)。反応は、室温で2乃至4時間行い、次いでpH 3.0の1Mのグリジンを最終的濃度が20mMになるように添加して反応を停止させた。TAR1-5-19ジスルフィド二量体が発現(1.2節)する間に、上記の手順を使用してPEG化を行うことができることが判明した。これによって、PEG2-(MAL)2による改質に続けてDTTによる希釈を必要とせずにジスルフィド二量体のフォーマットPEG化できる。プロトコルに対しては（何のプロトコルか）、濃縮工程の間に起こる沈殿を防ぐために、10%グリセロールをdAb二量体に添加する点のみを変更した。
3.4 PEG化VkdAbの精製
単量体およびジスルフィド二量体PEG化dAbは、1.3.3節に概説したように、陽イオン交換クロマトグラフィを使用して精製した。
実施例4:VH dAb HEL4のNHSおよびSPA-PEG化
4.1 HEL4のPCR構造
HEL4は、NHSおよびSPA-PEGを使用してPEG化したVH dAbの一例として使用する。HEL4は、以下および1.1節に概説したプライマーを使用して増幅およびクローン作成したが、テンプレートDNAをHEL4DNA配列を含むプラスミドベクターとする点のみを変更した。
Figure 0005087274
Figure 0005087274
4.2 HEL4の発現および精製
VH dAbは、2.2節に概説したように発現および精製した。
4.3 HEL4のNHSおよびSPA-PEG化
NHSおよびSPA活性化PEGを使用した表面にあるリジン残基の修飾手順は、3.3節に説明したとおりである。この手順に対して、pH8.0の1MのTris緩衝液を最終濃度が20mMになるように添加して反応を停止させる点のみを変更した。
4.4 NHSまたはSPA-PEG化HEL4の精製
PEG化タンパク質の精製は、HEL4のpIを4として、陰イオン交換クロマトグラフィを使用して行った。使用したカラムは、1mlのResource Q column(Amersham Pharmacia)であり、pH8.0の50mM Trisによって平衡化した。サンプルのpHは、カラムに供給する前に8とした。pH8.0の50mM Trisにおける0から500mMまでの塩化ナトリウムの直線的な勾配を、PEG化タンパク質を未修飾dAbから分離するために使用した。
4.5 PEG化HEL4の結合親和性
PEG化dAbの機能を試験するために、HEL4の親和性ベースの樹脂(主成分となる抗原は、ニワトリ卵白リゾチームである)を生成した。リゾチームは、メーカーの指示に従ってNTES活性化Sepharose4B樹脂(Amersham Pharmacia)に結合させた。PEG化サンプル(5μg)は、次いで親和性樹脂(100μl)と混合し、室温で30分間PBS中で結合させた。次いで、結合していないタンパク質を取り除くために、PBS(3x lml)で樹脂を洗浄した。次いで、PEG化HEL4が樹脂に結合されたかどうかを判断するために、親和性樹脂に対してSDS-PAGEを行った(8.3節参照)。
実施例5:SPAおよびNHS活性化PEGを使用した超親和性二量体のPEG化
VHおよびVκは、(Gly4Ser)nリンカー(n=0乃至7)を使用して多量体化し、単一ポリペプチド鎖(例えば、超親和性二量体を与えるための2つのdAb;図8-12)を形成することが可能である。したがって、ホモ二量体の(VH1-VHlおよびVL1-VL1)またはヘテロ二量体の(VH1-VH2およびVL1-VL2)対合を形成することが可能である。同様に二量体を形成して、三量体(図10-27)または四量体(図11-32)などのより大きなタンパク質を生成すつために付加的にdAbを結合させてもよい。また、これらのより大きなフォーマットを形成するためにVHおよびVkdAbの組み合わせを使用することが可能なので、二重の特異的分子を作ることが可能である。例えば、より長い血清半減期を有し、TNFαを結合する能力を備えた1つのdAb三量体;TNFを二量体として結合する2つのTAR1-5-19 dAbに結合している血清アルブミン結合能力を有する1つのdAbである。超親和性二量体は、NHSおよびSPA-PEGを使用してPEG化されるとともに(図8-13、8-14、および8-15)、特にタンパク質のC末端においてMAL-PEGを受け入れるように設計される(実施例6aおよび6b)(図8-16)。この例では、超親和性二量体TAR1-5-19 Dimer4は、20K-SPAあるいは40K-NHSで修飾される。超親和性二量体TAR1-5-19 Dimer4のDNA配列を下記に示す。
Figure 0005087274
Figure 0005087274
Figure 0005087274
5.1 超親和性二量体TAR1-5-19 二量体4の発現および精製
二量体の発現は、1.2節にて説明したとおりであるが、プロトコルにおいて構造をTOP10F’細胞(Invitrogen)に変換し、カルベニシリンを100μg/mlの濃度で使用する点のみを変更した。
5.2 超親和性二量体TAR1-5-19 二量体4の20K SPAおよび40K NHS PEG化および精製
二量体は、20K SPA-PEGあるいは40K NHS PEGによって3.3節に概説したようにPEG化した。20K SPAおよび40K NHS PEG化二量体は、1.3.3節の例1aに説明したように、陽イオン交換クロマトグラフィによって精製した。
実施例6a:MAL活性化PEGを使用した超親和性二量体の部位特異のPEG化
C末端がシステインで修飾されているdAbと同様に、超親和性dAb二量体も同じように改質することができる(図8-16)。また、システイン-二量体は、より大きなdAbPEG化のフォーマットを作成するために、基本構造ブロックとして使用することが可能である(図8-17、および11-29、11-31)。(Gly4Ser)5リンカーシステイン(図8-16参照)を有するTAR1-5-19ホモ二量体を一例として使用する。TAR1-5-19システイン単量体と同様に、単量体の(すなわち二量体;図8-16)および二量体の(すなわち四量体;図8-17)のどちらも発現の間に溶液内に生成される。超親和性二量体TAR1-5-19ホモ二量体システインのDNA配列を下記に示す。
Figure 0005087274
Figure 0005087274
Figure 0005087274
6.1 超親和性二量体TAR1-5-19ホモ二量体システインの発現および精製
二量体の発現は、1.2節にて説明したとおりであるが、プロトコルにおいて構造をTOP10F’細胞(Invitrogen)に変換し、カルベニシリンを1001μg/mlの濃度で使用する点のみを変更した。
6.2 40K PEG2-(MAL)2によるTAR1-5-19ホモ二量体システインの二量体化および精製
TAR1-5-19ホモ二量体システインは、二量体を形成するために(すなわち合計4つのdAbを有する2xリンカー二量体;図11-29)、40K PEG2-(MAL)2を用いてPEG化した。反応および精製条件は、1.3.1節で説明したとおりであり、例1aで概説したように修飾した。
実施例6b:40K PEG2-(MAL)2を有するTAR1-5-19ホモ二量体システイン四量体化および精製
TAR1-5-19ホモ二量体システインは、二量体四量体(すなわち合計8つのdAbを有する4xリンカー二量体;図11-31)を形成するために、4アーム20K PEG MALによってPEG化した。反応および精製条件は、1.3.1節で説明したとおりであり、例1cで概説したように修飾した。
実施例7:より高い親和性フォーマットを作成するための低親和性結合dAb(VHまたはVκ)の多量体化
TAR1-5を、TNFの単量体として比較的低い結合親和性を有するVκdAbの一例として使用するが、dAbは多量体化を経てその親和性を増すためにフォーマット化することができる。また、C末端システインを、4アーム20K PEG MALを経てdAbを多量体化するために使用した。
7.1 TAR1-5システインのPCR構造
以下のオリゴヌクレオチドを、特にSaおよびBamHI部位を有するTAR1-5のPCRクローニングのために、またC末端システイン残基を導入するためにも使用した。TAR1-5システインのDNAおよび修飾したdAbを増幅するために使用したPCRプライマーを下記に示す。
Figure 0005087274
Figure 0005087274
使用した反応条件下は、1.1節にて説明したとおりである。
7.2 TAR1-5システインの発現および精製
dAbの発現および精製は、1.2節にて概説したとおりである。また、50:50混合の単量体およびTAR1-5ジスルフィド二量体を形成した。
7.3 PEG化を経た多量体化および4アーム20KのPEG-MAL TAR1-5の精製
PEG化および精製条件は、1.3.3の例1cにて説明したとおりである。細胞傷害性分析の結果を表1に示す。
実施例8:in vitro機能結合実験:TNF受容体分析および細胞分析
8.1 PEG化TAR1-5-19単量体およびTAR1-5-19システインの分析データ
ヒトTNFαのためのPEG化dAbの親和性は、TNF受容体結合(RBA)および細胞傷害性分析を使用して測定した(表1に要約)。図1は、少数選択したPEG化VkdAbのRBA分析による結果を示し、そのグラフからIC50を測定し、表1にまとめた。単量体のPEG化および未修飾形態とRBAの二量体との間にはほとんど差が見られないことがわかる。より大きな40K PEG-MALについても、IC 50は、影響を受けない。40K-NHSにはわずかな減少が観察されるが、これは、PEG化部位がCDRに近く、40K-MALはdAbのC末端に位置していることに起因するものである。これは、PEGがCDRから離れたところに配置されていると、PEG化が抗原結合にわずかな影響しか及ぼさないことを示している。同様に、単量体dAbを使用した3および4アームのPEG化フォーマットは、RBA中のTNFに対する親和性を改善することもわかる。図2は、細胞傷害性分析における同一のサンプルを示す。また、PEG化と未修飾サンプルとの間にはほとんど差異がなく、dAbの効力が維持されていることを示す。最も顕著な差異は、3および4アームPEGのサンプルによるものであるが、ND 50がそれぞれ100および30pMに減少することを示す。TAR1-5について、低親和性結合の単量体は、細胞分析において10μMまでのND 50を有することがわかる。二量体化によって、親和性は3μMまでに減少し、4アームPEGを使用して四量体化した場合、200nMのND 50に減少する。したがって、低親和性dAbも、それらの抗原のためのより大きな結合活性を有するフォーマットを作成するために多量体化することが可能である。
8.2 PEG化超親和性二量体TAR1-5-19二量体4およびTAR1-5-19ホモ二量体システインの分析データ
また、TAR1-5-19二量体4のSPAおよびNHSのPEG化は、ランダムな表面修飾のみが二量体の効力にほとんど影響を及ぼさないことを示す(表1参照)。TAR1-5-19ホモ二量体システインについては、四量体を形成するために二量体を二量体化することで3nMのND 50を維持することがわかった。八量体を形成するために4アームMAL-PEGを使用して二量体をさらに多量体化したときに、ND 50が100pMにシフトする顕著な減少が見られた。
これは、RBA分析の感度が比較的高く、高親和性のフォーマットは100pMに測定されることを反映している。
Figure 0005087274
Figure 0005087274
8.3 PEG化HEL4のリゾチーム親和性基質への結合
種々のPEG化HEL4のフォーマットについて、それらを修飾したときに抗原結合能力が維持されているかどうかを確かめるために試験を行った。図3は、結合実験の結果を示す。具体的には、リゾチームへの親和性結合を示すSDS PAGEゲルであり、そのレーンを以下に示す:1、4、7、10、13、16、および19は、30分間の結合バッチ後に上澄み液に残っているタンパク質を示す;レーン2、5、8、11、14、17、および20は、PBSの洗浄中に抽出されたタンパク質を示す;およびレーン3、6、9、12、15、18および、21は、リゾチーム親和性樹脂に結合したタンパク質を示す。
このゲルから、PEG化タンパク質が上澄み液から効率的に取り除かれ、PBSで数回洗浄した後でも樹脂に結合したままであることが明らかにわかる。したがって、dAbがチオールまたはMAL-PEGによってPEG化されたか、あるいは、SPAまたはNHS-PEGを用いて表面リジン残基を経てPEG化されたかどうかに関わらず、PEG化dAbがその抗原に対して特異性を維持することがわかる。
8.4 TAR2-10-27のPEG化
TAR2-10-27の結合効力は、TNF受容体結合実験を使用して測定することができる。未修飾単量体は、図4からわかるように、分析において3nMのIC 50を有した。40KのPEG化単量体は、20nMのIC 50を有する。
実施例9:VHおよびVk PEG化dAbのin vivo半減期における血清に対する流体力学的サイズの相関
in vivo血清半減期を増すためにPEG化タンパク質が用いられる。腎臓濾過分離サイズは約70kDaであるが、このことは未修飾dAb(VH-13乃至14kDaおよびVk-12kDa)タンパク質のサイズでは、血清半減期が比較的低くなる(10乃至30分のt1/2β)ことを意味する。dAbのPEG化で行われる機能は、dAb(VHあるいはVk)の血清半減期が使用するPEGのサイズおよび分鎖性質によって調節できることを示す。これは、例えば、何十時間もの長期にわたる半減期(例えば30時間以上)を所望する場合の薬物治療における重要な用途である;一方で、dAbがラベルされ、診断目的のための生体内撮像試薬として使用する場合には、数時間(3乃至6時間)という著しく短い残留時間が必要である。
発明者らは、2つのパラメータがPEG化dAbの血清半減期の測定に重要な役割を果たすということを示した。第一は、PEG付着の性質およびサイズ、すなわち、使用するポリマーが単に直鎖鎖または分鎖/叉状のいずれかであるかということである。第二は、最終的なフォーマット上でのdAbの位置、およびその分子がどのくらいの「遊離した」未修飾のPEGアームを有するかである。サイズ排除クロマトグラフィによって推定されるPEG化フォーマットの結果として生じる流体力学的なサイズは、分子の血清半減期を反映する。したがって、表2に示すように、PEG化分子の流体力学的なサイズが大きくなるほど、血清半減期も長くなる。
種々のPEG化タンパク質の流体力学的なサイズを測定するために使用するゲル濾過マトリクスは、高度に交差結合されたアガロースに基づく。球状タンパク質のための2つのカラムの分別範囲は;Superose 12HR 1000-3x105Mr、およびSuperose 6HR 5000-5x106Mrである。球状タンパク質のサイズ排除制限は、Superose 12HRは2x106、およびSuperose 6HRは4x107である。
Figure 0005087274
 したがって、表2から、TAR1-5-19の4アームPEGフォーマットが20KのPEGを含み、その分子量が20K SPA TAR1-5-19ジスルフィド二量体よりも大きい場合(60kDaと比較して95kDa)、腎臓分離が70kDaであることを考慮すれば、それらは同様な半減期を有するということがわかる。これは、4アームフォーマットにおいて、dAbが各PEG分子の端部に結合しており、したがって、分子全体がより小型(より小さい流体力学的なサイズ)であるという事実によるものかもしれない。すなわち、このフォーマットでは、単一の線状20K鎖しか有さないものと比べて分子のコアにおいてPEGが非常に高密度である。4アームフォーマットを使用する利点は、二量体の分子と比較して、TNFに対する親和性が顕著に増加することである(それぞれ3 pMに比較して30nM)。したがって、いくつかの用途において、高親和性の結合剤が必要であるが、短い血清半減期を所望する場合、分子は、存在するdAbの数および使用するPEGのサイズを変化させることによって所望の性質を有するように調整することができる。
実施例10:PEG化dAbのプロテアーゼ安定性
PEG化dAbの別の主な特徴は、プロテアーゼの動作に対する安定性の増加である。本質的にdAbは、試験条件によるが、プロテアーゼの動作に対して比較的安定している。例えば、TAR1-5-19は、5Mの尿素が存在してもトリプシンによって分解されない。これは、dAbが変性剤の存在かでも展開せず、一方で、タンパク質を酸性状態下で展開するときには、pH2のペプシンによって完全に分解されるからである。PEG化は、ポリマー鎖がdAbのほぼ全体を覆い、したがって、プロテアーゼがポリペプチド主鎖にアクセスし分割することを防ぐという利点を有する。タンパク質が低pHで部分的に変性した場合であっても、PEGがdAb上に存在することで、ペプシンの作用に対する耐性が著しく増加する(図5)。
図5は、TAR1-5-19および他のPEG化の変形のペプシン分解の結果を示す。反応は、250μgペプシンの存在下で、pH2.0、37℃で最高30分間行った。レーンは、以下の通りである：1:分子量マーカー；2:単量体(0分)；3:単量体(15分)；4:単量体(30分)；5:40 K MAL2 二量体(0分)；6:40 K MAL2 二量体(15分)；7:40 K MAL2 二量体(30分)；8:20K MAL単量体(0分)；9:20K MAL単量体(15分)；10:20K MAL単量体。ゲルは、未修飾dAbが低pHで非常に迅速に分解されることを示す。図5はまた、dAbの表面に存在するPEGの種類がプロテアーゼの動作に対する抵抗に顕著な効果を有することができることも示す。線状の20K PEGは、ある程度dAbを保護するが、30分後でもいくらかの分解が見られる(3kDaの位置のバンド、ゲルの結果から15乃至20%の分解と推定)。一方で、40K PEG MAL2二量体については、30分後でも分解はほとんど見られなかった(ゲルの結果より5%未満の分解と推定される)。これは、おそらくペプシンの作用からより大きな保護を提供するPEGの2x20Kフォーマットによるものである。これは、PEG化dAbがヒトの消化管に見られる広範囲のプロテアーゼの作用に対する抵抗性を有しており、また胃内の低pH環境においても機能を維持することができることを示唆する。したがって、PEG化dAbは、分解または機能の損失を防ぐための複雑な調製を必要とせずに、治療薬として経口的に投与することができる。PEG化dAbは、プロテアーゼの影響をより受けやすく、消化中に受ける極端なpHでの変性(したがって場合によっては、機能を損失する)をおこす可能性がある、IgG、scFV、またはFabなどの他のフォーマット対して利点を提供する。
実施例11:NHSまたはSPA活性化PEGを使用したVHまたはVkDabの部位特異PEG化
複数のリジン残基がdAb(VHまたはVκ)の表面上に存在するので、低比率のPEG:dAbを使用して、タンパク質に単一のNHS/SPA-PEGを結合させようとすることは比較的非効率的である。単一のPEG化物質を生成することができるが、通常10乃至20%の総タンパク質しかPEG化されない。常に活性化PEGの比率を増すと、結果として過剰なPEG化が生じる。このことによって、CDRがPEGによって損なわれるので、抗原結合性が損なわれる可能性が生じる。この問題に対する解決策は、これらの表面リジンを他のヒト抗体フレームワークにも存在するアミノ酸で置換することである。例えば、VκI(DPK9)は、フレームワーク2に3つのリジン残基を有する。これらの残基は、VκII(DPK18)(アルギニンおよびグルタミン残基)に見られるものに変更することができる。残基をヒトのフレームワークにすでに見られる別のものと置換することで、免疫原性の潜在的影響も減じる。VκdAbは、C末端リジン残基も有するが、それは部位特異のPEG化のために保持される。特定のリジンの設計も、VH dAbに対して行うことができる。また、表面リジンは、他の対応するヒトのVHフレームワークに見られる残基に置換することができるが、この場合、C末端セリンのリジンへの置換も必要になる。その結果、これによって単一のリジンのdAbへの部位特異の加工が可能となる(同一の方法はシステインによってすでに行われている)。唯一の要件は、リジンが溶媒可接性であって、PEG化によって抗原への結合を著しく減じないように配置しなければならないことである。
実施例12:VHおよびVkDab上の潜在的PEG化部位の識別
PEG化に対してVHおよびVκdAbのフレームワークにシステイン残基を加工するためには、複数の要素を考慮しなければならない。
・タンパク質の表面での配置に必要である、導入する残基の溶媒可接性性
・導入される部位がCDRに近いこと、及びこの残基がPEG化により抗原結合性にどれほど影響を与えるか
・システインへの置換が、タンパク質を不安定にしたり、結果として生じるdAbが効率的に発現できないように折り畳み経路へ影響を及ぼす等の本来の好ましい相互作用（水素結合等の）に対する阻害。
したがって、最適な表面のシステイン部位を評価するために、タンパク質発現を直接比較するPEG化および親和性結合分析を行った。このことにより、システイン残基(Serl20cys)を配置したC末端が、抗原親和性を維持しながらタンパク質の発現のための内部結合部位よりも実際に好ましいか評価する。
Swiss PDB Viewerを、表面アミノ酸残基の溶媒可接性性を計算するために使用し、したがって、システイン残基における加工のための潜在的部位を同定した。また、これらの残基は、CDRからの距離によって選択した。大きなPEG分子をCDRの近くに導入することは、確実に抗原結合性へ影響する。表3は、HEL4およびVkダミーを使用して識別した最適な部位を示す(配列を下記に示す)。PEG化のための潜在的部位がdAbの表面上の領域に互いに集まっていることがわかる。したがって、各々の群における変異体(群Vを除く)を1つだけ、発現のために選択した(太字で示す)。これらの部位は、抗原結合に顕著な損失なしに、加工したシステイン残基を収容できる可能性がある。
Figure 0005087274
Figure 0005087274
 12.1 部位特異的にPEG化するために表面へシステインを導入するTAR2-10-27のクイックチェンジ突然変異誘発
クイックチェンジ突然変異誘発法(Stratagene)を、部位特異PEG化のために表面残基を単一のシステインで置換するために使用した。高速変化の突然変異生成は、メーカーのプロトコルに従って行い、テンプレートおよび適切なプライマーペアとして野生型のTAR2-10-27のDNAを使用した(表4)。陽性クローンをDNA配列によって識別し、各変異体dAbを2.2節に説明したとおりに発現および精製した。フォーマット化されたタンパク質のPEG化および精製は、2.3節に説明したとおりに行った。
Figure 0005087274
 TAR2-10-27システイン変異体のそれぞれを発現および精製し、タンパク質の最終的な収率を表5に示す。
Figure 0005087274
 表5から、各変異体dAbの発現レベルは、システインのタンパク質の表面上の位置によって著しく変化することがわかる。例えば、変異体Leu115システインは、Serl 20システインよりも5.3倍大きな発現レベルを有する。したがって、PEG化部位の位置は、in vivo発現レベルに顕著な影響を有することができる。PEG化部位の位置がその抗原のためのdAbの親和性に影響を及ぼすかどうかを調べるために、各変異体を30K-MAL-PEGでPEG化し、イオン交換クロマトグラフィによって精製した。対照として、各変異体は、単量体タンパク質を生成するためにN-エチルマレイミドによってブロックされる表面システインを有した。全てのタンパク質は、DOM1受容体結合実験(RBA)及びMRC-5細胞分析により試験を行い、その結果を表6に示す。
Figure 0005087274
 PEG化部位の位置は、その抗原に対するdAbの親和性に実際に顕著な影響を有することが明らかにわかる。PEG化のために最良の部位は、位置Glnl 3、Pro 41、あるいはLeul 15(200乃至300nmのND 50)であると思われる。これらの構造の全ては、Serl 20システイン(600nMのND 50)のC末端PEG化と比較して、抗原に対して比較的高い親和性を維持するようである。したがって、C末端よりも内部PEG化部位を選択することは、次の理由でより好ましくなりうる;(i)タンパク質発現が著しく高いこと、および、(ii)抗原結合は影響を受けにくい。
実施例13:VHおよびVkPEG化dAbの生体内半減期に対する流体力学的なサイズの相関
種々のPEG化VHおよびVL dAbの本来の分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィを使用して測定した。Superose 6HRカラム(Amersham Biosciences)は、AKTA 100システム(Amersham Biosciences)を使用して5カラム容量のPBSで平衡した。カラムは、高および低分子量のタンパク質較正キット(Amersham Biosciences)を使用し、メーカーの支持に従って較正した。
100μlのPEG化タンパク質(1.5mg/ml)を0.5ml/分の流速で、カラムに付加した。タンパク質の溶出量は、280nmの吸光度により測定した。本プロセスは、それらの個々の溶出量を測定するために各PEG化dAbに対して繰り返した。カラムの校正曲線は、分子量対Kavのログをプロットすることによって作成し、ここでKaVは、
KaV=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)
Ve=タンパク質の溶出量(ml)
Vo=ボイド容量(青色デキストランの溶出量 7.7ml)
Vt=総カラム容量(アセトン溶出量 22ml)
各PEG化dAbの本来の分子量は、溶出量をKaVに変換することによって測定した。KaV対分子量標準のログの校正曲線図は、PEG化タンパク質の質量を推定するために使用した。
ゲル濾過カラムの校正曲線から、種々のPEG化dAbの推定サイズを推定し、表7に示した。フォーマットの全ての生体内血清半減期は、マウスにおいても測定した。
Figure 0005087274
 表7から明らかにわかることは、dAbの流体力学的なサイズがPEGの添加によって著しく増加できることである。また、PEGのサイズだけでなく、重合体の構造も流体力学的なサイズに大きな影響を及ぼす。例えば、2x20Kおよび4x10Kは、同じPEG含量を有するが、2x20Kは、4x10Kの3倍の流体力学的なサイズを有する。これは、4x10KフォーマットのPEGは、2x20K PEGと比較して分子のコアが密集して折りたたまれており、したがって、その流体力学的なサイズを著しく減じるという事実によるものと考えられる。同様に明らかであることは、タンパク質の本来の流体力学的な質量と生体内血清半減期との間に関係があるということである(図15参照)。したがって、ゲル濾過クロマトグラフィによって測定した流体力学的なサイズは、推定血清半減期を提供するために使用することができる。dAb（すなわち線形対分岐）を加工するために使用するPEGのフォーマットおよびサイズにかかわりなく、流体力学サイズがタンパク質を修正するために使用したポリマーの総量より、良い血清半減期のインジケータであることが分る。
したがって、ゲル濾過クロマトグラフィによって測定した流体力学的なサイズは、図15をにより推定血清半減期を提供するために使用することができる。
実施例14:PEG化dAbのプロテアーゼ安定性
未修飾およびPEG化タンパク質のプロテアーゼの安定性は、ELISAによる抗原結合に従って調査した。ELISAにおいてPEG化タンパク質のシグナルが低いことから、著しく高い濃度のdAbを使用しなければならなかった。0.4μM(5μg/ml)の単量体および25μM(300μg/ml)の40K PEG化TAR1-5-19を、全プロテアーゼに対して最終濃度が100μlになるように250μg/mlのプロテアーゼによって消化した。使用したプロテアーゼは、ブタペプシン、ウシ天然粘膜ペプチダーゼ、ブタ膵臓エラスターゼ、天然ウシ膵臓プロテアーゼ(I形)、およびネズミの腸粉末(Sigma)である。全ての消化は、pH2の20mMのHClで行ったペプシンを除いては、pH8の50mMのTris緩衝液でおこなった。各消化は、37℃で30分間加温し、次いでCompleteプロテアーゼ阻害剤(Roche)の10μlの10x液体酸素貯蔵液を添加して反応を停止させた。サンプルはそれから解析されるまで氷上に静置した。PBSの中で1μg/mlのTNFを用いて4℃で一晩放置することによりTNFでコートされたMaxisorbプレートを、室温で1時間、PBS(2%のTPBS)において2%のTween-20でブロックした。20μlの各プロテアーゼ試験サンプルは、2%のＴPBSを使用して200μlに希釈した。サンプルは、次いで抗原を被覆したプレートに移し、室温で1時間培養した。次いで、プレートを0.1%のTPBSで洗浄し、ウェルごとに100μlのタンパク質L-HRP溶液(Sigma)を添加し(2%のTPBSで1:2000で希釈)、1時間培養した。プレートは、発色させる前に0.1%のＴPBSで再び洗浄し、次いでPBSで洗浄した。ウェルごとに100μlのTMB溶液を添加し、反応を停止させるための100μlの1M HClを添加する前に発色させた。存在する結合したdAbのレベルは、Versamaxプレートリーダー(Molecular device)を使用して450nmでの吸収度を測定して間接的に測定した。プロテアーゼ処理後の残存する機能タンパク質のパーセンテージは、プロテアーゼ無添加対照と比較して450nm測定から判断した。
種々のプロテアーゼに対する単量体および40K PEG TAR1-5-19のプロテアーゼ安定性を図16に示す。未修飾単量体dAbが、ペプチダーゼ、エラスターゼおよびネズミの腸の粉末との抗原結合において50乃至70%の損失を有するプロテアーゼ耐性を示した、CPB処理による損失は90%であり、ペプシンおよびCPBで処理すると活性が全損ですることがわかる。プロテアーゼ耐性は、dAbの小型タンパク質の折り畳みに起因する可能性があるが、これは同様にプロテアーゼのペプチド主鎖への接触を得る能力を減じているかもしれない。未修飾dAbと比較して、40KのPEG化TAR1-5-19は、ペプシンを除く全てのプロテアーゼにより大きな安定度を示す。安定性の増加は、このような大きなモバイルポリマーによるdAbの表面修飾に起因する可能性がある。表面PEGはタンパク質を「被覆」し、プロテアーゼがペプチド主鎖の結合および分割を防ぎ、したがって、これらの酵素に対するdAbの安定性が向上する。
ペプシンに対する両フォーマットの全体の分解の理由は、dAbが分析中に露出される低pHの変性条件によるものと考えられる。より低いpHによって、タンパク質の折りたたみが解かれてペプシンが接触しやすくなる。
実施例15:Biacoreを使用したPEG化TAR2-10-27のKdおよびkaの割合の分析
Biacoreを使用してその抗原に対するTAR2-10-27の結合アフィニティに関するPEG化の影響を調査した。全てのPEG化フォーマットは、TAR2-10-27システインを使用して生成した(実施例2参照)。以下の手順は、抗原に対する各PEG化dAbフォーマットのオン/オフレートを測定するために使用した。ビオチン化されたヒトTNFRI(分子ごとに約1ビオチン)は、約400RUの密度でBiacoreストレプトアビジンセンサチップの単一の流れセル（シングルフローセル）上へ被覆した。各dAbまたはPEG化dAb(2.6μM、770nM、260nM、77nM、および2.6nM)の濃度系列は、TNFRI被覆流れセルおよび無被覆流れセル(ストレプトビアジン)の両方に逐次的に注入した(流速30μl/分で45μl注入)、(無被覆流れセル曲線をTNFRI流れセル曲線から減算することによって減算曲線を作成した)。pH3のグリシンを10mM注入して表面を再生した後の各サンプルの注入後5分間のオフレートを解析した。
Biacoreから作成したデータは、曲線適合ソフトウェア(Biaevaluation 3.2)を使用して適合させ、会合定数(ka)および解離定数(kd)を決定した(表8)。
Figure 0005087274
 表8から、PEG鎖のサイズが増すとKDが減少することが分かる。KDの変化は、Kaが減少することによるが、主にPEGのサイズが大きくなってもKdは相対的に変化しない。
実施例16:関節炎の予防モデルにおけるPEG化TAR1-5-19の有効性の研究
Tgl 97マウスは、ヒトTNF-globinハイブリッド遺伝子の遺伝形質転換であり、ヘテロ接合体は4乃至7週間目で慢性関節リウマチと共通する組織的特性を有する慢性的、漸進的多発関節炎を発現する(ケッファー(Keffer)、J.、カズラリス(Cazlaris)、H.、ゲオルゴポウロス(Georgopoulos)、S.、ケスラリス(Kaslaris)、E.、カイオシス(Kioussis)、D.、コリアス(Kollias)、G.(1991)。ヒト腫瘍壊死要素を発現する遺伝形質転換マウス:関節炎の遺伝子の予測モデル、EMBO J.、第10巻、4025-4031ページ) Keffer, J. , Probert, L.,Cazlaris, H. , Georgopoulos, S. , Kaslaris, E. , Kioussis, D. , Kollias, G.(1991). Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO J. , Vol. 10, pp.4025-4031.。
Tgl 97モデルの関節炎の防止におけるPEG化dAb(PEGフォーマットは2x20K (すなわち、40K mPEG2 MAL2)を付着させる2つの部位で分岐させ、dAbはTAR1-5-19である)の有効性を試験するために、異型の（ヘテロ接合体）遺伝形質転換マウスを、同数の雄および雌を有する10の動物群に分割した。治療は、毎週、テストアイテムを腹腔内に注射することにより3週齢の動物より開始した。TAR1-5-19システイン単量体の発現およびPEG化は、1.3.1節、実施例1に概説する。全てのタンパク質調製品は、食塩加リン酸緩衝液内にあり、エンドトキシンの許容可能なレベルで試験を行った。
本実験は、ブラインドで行った。毎週、動物の体重を測定し、以下の系統に基づいて関節炎のマクロ表現型の動向を記録した:0=関節炎なし(通常の外見および屈曲)、1=軽度の関節炎(関節のゆがみ)、2=中程度の関節炎(腫れ、関節の変形)、3=重度の関節炎(重い障害性の動作)。
この研究の結果は、生理食塩水を投与した対照と処置群との間に顕著な差異を伴って、10mg/kgのPEG化1-5-19が関節炎の発症を抑制することを明らかに実証している。1mg/kgというPEG化TAR1-5-19の用量はまた、生理食塩水を投与した対照群よりも統計学的に有意に低い中央値の関節炎スコアをもたらした(Wilcoxon Testに対する通常の近似を使用して、P<0.05%)。
実施例18:関節炎の治療用モデルにおけるPEG化TAR1-5-19の有効性の研究
Tgl 97モデルの関節炎の治療モデルにおけるPEG化dAbの有効性を試験するために、異型接合の遺伝形質転換マウスを、同数の雄および雌を有する10の動物群に分割した。治療は、動物が顕著な関節炎表現型を有した6週齢より始めた。治療は、週2回、テストアイテム4.6mg/kgを腹腔内に注射した。試料調製および疾病スコアは、実施例17に説明したとおりである。
関節炎スコアは、PEG化TAR1-5-19が治療モデルにおける関節炎の進行を抑制していることを明らかに実証している。4.6mg/kgというPEG化TAR1-5-19の用量は、第9週齢のマウスにおいて、生理食塩水を投与した対照群よりも統計学的に有意に低い関節炎スコアの中央値をもたらした(Wilcoxon Testに対する通常の近似を使用して、P<0.01%)。
実施例19:放出遅延フォーマットにおけるdAbの有効性
徐放フォーマットにおけるdAbの有効性を試験するために、小さいPEG分子を有するdAb(PEGは、C末端システイン残基にdAbの付着のための4つの部位を有する4x5KのPEGであり、dAbはTAR1-5-19(すなわち、20K PEG 4アームMAL))を0.2mlの浸透ポンプに供給した。4週間で0.2mlを放出するこのポンプを、上記のように６週齢のTgl 97疾患モデルマウスの皮下に埋め込んだ。食塩水を供給するポンプを埋め込んだマウスと比較した場合、これらの動物の関節炎スコアは明らかに遅い速度で上昇した。これは、放出遅延フォーマットから供給する場合にdAbが有効なことを実証している。
実施例20:TCEPを還元剤として使用したVHおよびVL dAbのPEG化
実施例1.3に概説した方法では、MAL-PEG化の前にdAb上の表面チオールを減じる（還元する？）ためにジチオスレイトール(DTT)を使用する。この方法は、DTTが迅速にマレイミド-PEGと反応ことから、ポリマー-dAb結合体の形成を防ぐ低pHにおいてもPEG化の前にゲル濾過または透析による還元剤の除去を必要とする。代替方式では、TCEPなどの還元剤を使用する。TCEPは、その還元電位により、また比較的ゆっくりと遊離したマレイミドと反応して選択的にチオールを還元するので、より低い濃度で使用することができる。したがって、dAbに存在する表面チオールは、直接反応混合物に添加されるTCEPおよびMAL-PEGによって減じることが可能である。PEG化の前にゲル濾過によってTCEPを取り除く必要はない。また、PEG化dAbの収率を著しく増加させるために、MAL-PEG添加に続けてＴＣＥＰを還元するサイクルを繰り返し行うことも可能である。
実施例21:VHおよびVL dAbのN末端PEG化
VHおよびVL dAbのPEG化の他の方法は、N末端をPEG化することである。これは、2つの方法で達成することができる。第一に、PEG-アルデヒドを使用することであるが、これは適切な反応条件下で選択的にタンパク質のN末端アミンを修飾するために使用することができる。これは、N末端アミンが6.5までという比較的に低いpKaを有するという事実によって達成することができる。第二に、システイン残基を、MAL-PEGを使用した部位特異PEG化のためにタンパク質のN-末端に修飾することが可能である。また、タンパク質は、所望のサイズのPEG-MALに結合させる前に、TCEPまたはDTT(実施例1.3参照)を使用して還元される。
図1は、TAR1-5-19のPEG化フォーマットの親和性の幅を示めすレセプター結合アッセイの結果を示す。 図2は、TAR1-5-19のPEG化フォーマットの親和性の幅を示めす細胞毒性アッセイの結果を示す。 図3は、HEL4 dAbの各種PEG化フォーマットのリゾザイムに対する結合アッセイの結果を示しているSDS-PAGEゲルである。レーンについては実施例において説明する。 図4は、TAR2-10-27及び40K PEG化単量体の親和性を示すレセプター結合アッセイの結果である。 図5は、pH2.0におけるペプシンの作用に対する、TAR1-5-16及びPEG化変異体のプロテアーゼ安定性を示す。 dAbのPEG化単量体の概略図である。図1-6は、修飾されていないVH又はVL dAbを示す。図6-2は、表面をPEG化したVH又はVLを示す。図6-3は、C末端にあるシステインにPEGが結合しているVH又はVL dAbを示す。 PEG化VH又はVLヘテロ-あるいはホモ二量体dAbの概略図である。図7-4は、C末端のジスルフィド結合により形成されたVH又はVLのジスルフィド二量体を示している。図7-5は、PEG化された1のサブユニットを有するVH又はVLジスルフィド二量体を示す。図7-6は、両サブユニットがPEG化されたVH又はVLジスルフィド二量体を示す。図7-7は、C末端のシステインを介して、分岐鎖/フォーク型/複数のアームを有するPEGで結合されたVH又はVL二量体を示す。図7-8は、dAbの表面のジスルフィド結合により形成したVH又はVLジスルフィド二量体を示す。図7-9は、一のサブユニットをPEG化したVH又はVLジスルフィド二量体を示す。図7-10は、両サブユニット上をPEG化したVH又はVL二量体を示す。図7-11は、表面のシステイン残基に結合している分岐鎖/フォーク型の/複数のアームを有するPEGで結合されたVH又はVL二量体を示す。 図8は、本発明のPEG化VH又はVLヘテロ-又はホモ二量体の概略図である。図8-12は、（Gly4Ser）n（n＝0-10）リンカーにより形成されたVH又はVLリンカー二量体を示す。図8-13は、一のサブユニット上をPEG化したVH又はVLリンカー二量体を示す。図8-14は、両サブユニット上をPEG化したVH又はVLリンカー二量体を示す。図8-15は、リンカーをPEG化したVH又はVLリンカー二量体を示す。図8-16は、C末端にシステイン残基を有するVH又はVLリンカー二量体を示す。図8-17は、ジスルフィド結合により会合した2のVH又はVLリンカー二量体を示す。 図9は、PEG化されたリンカーdAB二量体の概略図である。図9-18及び図9-19は、1のサブユニット上のC末端システイン残基をPEG化したVH又はVLリンカー二量体を示す。図9-20は、リンカーに存在するシステイン残基をPEG化したVH又はVLリンカー二量体を示す。図9-21は、1のサブユニット上に存在するシステインをPEG化したVH又はVL又はVLリンカー二量体を示す。図9-22は、両サブユニット上に存在するシステイン残基をPEG化したVH又はVLリンカー二量体を示す。 図10は、VH又はVLのヘテロ-又はホモdAbの PEG化を示す概略図である。図10-23及び図10-24は、3のアームを有するPEGを用いてC末端のアミノ酸を介した共有結合により三量体化されたPEG化dAb三量体を示す。図10-25は、dAb単量体の一の表面のPEG化を示す。この図においてdAB三量体は、リンカーペプチドを用いて形成した。図10-26はdAb三量体の1の単量体のC末端のPEG化を示す。図10-27は、二重特異性を有するdAb三量体を示す、このうちの2のdAb単量体は、TNFαに特性を有し、１の単量体は、血清アルブミンに特異性を有する。このフォーマットは、図10-25又は図10-26のいずれかに示すPEG化により形成する。 図11は、VH又はVLのヘテロー又はホモdAb四量体を示す概略図である。図11-28は、各dAb単量体のC末端システインに４のアームを有するPEGを結合して形成されたdAb四量体を示す。図11-29及び図11-31は、分岐鎖/複数のアームを有するPEGにより2のdAb二量体を結合することにより形成されるdAb四量体を示す。この図においてPEGは、C末端のシステイン（11-29）又はリンカーペプチド（11-13）のいずれかに結合している。図11-30は、各単量体のC末端システインに単一の分岐鎖PEGが結合することにより形成するdAb四量体を示す。図11-32は、各単量体がリンカーペプチドにより互いに結合されているdAb四量体を示す。このフォーマットは、図10-25又は図10-26に示す任意の手法を用いたPEG化により形成される。 図12は、本発明に有用なPEGが結合している他の多量体フォーマットを示す。図12-31は、各二量体の一の単量体に存在するC末端システイン残基にPEGが結合しており、この複数のアームを有するPEGにより四量体を形成するために各二量体が結合されているdAbリンカー二量体の四量体を示す。図12-32は、個々の二量体ペアのリンカーに存在するシステイン残基にPEGが結合しており、このPEGのが有する複数のアームにより四量体を形成するように結合されているdAbリンカー二量体の四量体を示す。 図13は、生殖細胞DP47-JH4bの配列（配列番号1、2）に基づくVHフレームワークの配列を示す。HCDRs1-3を下線で示す。 図14は、生殖細胞DPｋ9-Jk1の配列（配列番号3、4）に基づくVκフレームワークの配列を示す。LCDRs1-3を下線で示す。 図15は、dAbの本来の流体力学的サイズとマウスにおけるin vivoでの血漿中の半減期との相関を示す。表8で示したデータをグラフに示した。 図16は、単量体の、及び、40K PEG化TAR1-5-19のプロテアーゼに対する安定性のプロファイルを示す。相対的な活性はプロテアーゼ処理していない対照との比較において行う。用いたプロテアーゼは、ペプシン、ブタ腸粘膜由来のペプチダーゼ、エラスターゼ、未精製のウシ脾臓由来のプロテアーゼ（CBP）及びラット腸由来粉末（Rat In）である。

Claims (30)

  1. １又は２の抗体単一可変ドメインを含むＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、
    少なくとも２４ｋＤａの流体力学的サイズ及び少なくとも１．３時間の半減期を有することを特徴とし、各可変ドメインがフレームワーク領域を含み、抗原結合部位を有し、及び各可変ドメインがポリペプチド中の単一の抗体単一可変ドメインとして抗原に結合することを特徴とし、前記ＰＥＧに結合しているポリペプチドは、ＰＥＧに結合していない同じポリペプチドに対して少なくとも９０％の活性を保持していることを特徴とし、該活性が、標的リガンドに対する、ＰＥＧに結合しているポリペプチド又はＰＥＧに結合していないポリペプチドの親和性により測定されることを特徴とし、前記ポリペプチドが抗体単一可変ドメインのＶＨドメインからなる場合、キャバット（Ｋａｂａｔ）の配列データベースの番号付けに基づいて、１３、１４、１５、４１、４２、４３、６２、６５、８７、８８、８９、１１２、１１５、１１７、１１９及び１２０からなる群より選択される１以上の位置にあるシステインにおいて前記ＰＥＧと結合しており、及び／又は前記ポリペプチドが抗体単一可変ドメインのＶＬドメインからなる場合、キャバット（Ｋａｂａｔ）の配列データベースの番号付けに基づいて、１５、４０、４１、５６、５７、６０、８０、８１、１００、１０７、及び１０８からなる群より選択される１以上の位置にあるシステインにおいて前記ＰＥＧと結合していることを特徴とする、ポリペプチド。
  2. 請求項１のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、少なくとも２００ｋＤａの流体力学的サイズ及び２０から６０ｋＤａの総ＰＥＧサイズを有することを特徴とするポリペプチド。
  3. 請求項１のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、抗体単一可変ドメインの二量体を含み、総ＰＥＧサイズが２０から６０ｋＤａであることを特徴とするポリペプチド。
  4. 請求項１又は２のポリペプチドであって、各可変ドメインがユニバーサルフレームワークを含むことを特徴とするポリペプチド。
  5. 請求項４のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、各可変ドメインが、ＤＰ４７、ＤＰ４５及びＤＰ３８から成る群より選択されるＶＨフレームワーク又は、ＤＰＫ９であるＶＬフレームワークを含むことを特徴とするポリペプチド。
  6. 請求項１又は２のポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＴＮＦα特異性を有することを特徴とするポリペプチド。
  7. 請求項１のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、前記ＰＥＧは、Ｇｌｎ１３、Ｐｒｏ４１又はＬｅｕ１１５からなる群より選択される位置で置換されているシステイン残基を含む重鎖可変ドメインに結合していることを特徴とするポリペプチド。
  8. 請求項１のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、半減期が１．３から１７０時間の間であることを特徴とするポリペプチド。
  9. 請求項３のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、抗体単一可変ドメインのホモ二量体を含むポリペプチド。
  10. 請求項９のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、前記ホモ二量体が第一及び第二抗体単一可変ドメインを含むことを特徴とし、
    前記ホモ二量体の第一の抗体単一可変ドメインが、抗体単一可変ドメイン及び重鎖（ＣＨ１）定常領域を含むことを特徴とし、そして、
    前記ホモ二量体の第二の抗体単一可変ドメインが、抗体単一可変ドメイン及び軽鎖（ＣＬ）定常領域を含むことを特徴とするポリペプチド。
  11. 請求項３のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、抗体単一可変ドメインのヘテロ二量体を含むことを特徴とするポリペプチド。
  12. 請求項１１のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、前記へテロ二量体が、第一及び第二の抗体単一可変ドメインのみを含み、前記へテロ二量体の第一の抗体単一可変ドメインが、抗体単一可変ドメイン及び重鎖（ＣＨ１）定常領域を含み、そして、前記へテロ二量体の第二の抗体単一可変ドメインが、抗体単一可変ドメイン及び軽鎖（ＣＬ）定常領域を含むことを特徴とするポリペプチド。
  13. 請求項１から請求項１２のいずれか１請求項に記載のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、前記ＰＥＧ部分が分岐鎖ＰＥＧであることを特徴とするポリペプチド。
  14. 請求項１から請求項１３のいずれか１請求項に記載のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、８０ｎＭから３０ｐＭのＫｄで標的抗原に特異的に結合することを特徴とするポリペプチド。
  15. 請求項１から請求項１４のいずれか１請求項に記載のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、３ｎＭから３０ｐＭのＫｄで標的抗原に特異的に結合することを特徴とするポリペプチド。
  16. 請求項１から請求項１５のいずれか１請求項に記載のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、１００ｐＭから３０ｐＭのＫｄで標的抗原に特異的に結合することを特徴とするポリペプチド。
  17. 請求項１から請求項１２のいずれかに記載のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、表面プラスモン共鳴法で測定した場合に、５０ｎＭから２０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）、及び、５ｘ１０−１から１ｘ１０−７Ｓ−１のＫｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離することを特徴とするポリペプチド。
  18. 請求項１７のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、前記結合が、基準となる細胞アッセイにおいて、前記ＰＥＧ結合ポリペプチドのヒトＴＮＦα又はＴＮＦレセプター１を中和する能力として測定されることを特徴とするポリペプチド。
  19. 請求項１８のポリペプチドであって、前記ＰＥＧに結合しているポリペプチドが、基準となる細胞アッセイにおいて５００ｎＭから５０ｐＭのＮＤ５０でヒトＴＮＦα又はＴＮＦレセプター１を中和することを特徴とするポリペプチド。
  20. 請求項１から請求項１９のいずれか１請求項記載のポリペプチドであって、前記ＰＥＧが、マレイミド、ビニルスルホン及びチオールから成る群より選択されるスルフヒドリル基選択試薬により溶媒可接性システインに結合することを特徴とするポリペプチド。
  21. 請求項１から請求項２０のいずれか１請求項記載のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、２０から６０ｋＤａの総ＰＥＧサイズを有することを特徴とするポリペプチド。
  22. 請求項２１のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、２０から４０ｋＤａの総ＰＥＧサイズを有することを特徴とするポリペプチド。
  23. 請求項２１又は請求項２２のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、該ポリペプチドは、２０から４０ｋＤａの総ＰＥＧサイズを有することを特徴とするポリペプチド。
  24. 請求項２１、２２、又は２３のいずれか１請求項に記載のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、ＰＥＧが単一のポリマーとして提供されることを特徴とするポリペプチド。
  25. 請求項１から請求項２４のいずれか１請求項記載のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、
    ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カーディオトロフィン（Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１）、ＥＧＦ、ＥＧＦレセプター、ＥＮＡ−７８、エオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ）、エオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ）−２、エクソダス（Ｅｘｏｄｕｓ）−２、ＦＧＦ−酸性、ＦＧＦ−塩基性、線維芽細胞成長因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−β１、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−ｌα、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト成長因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンホタクチン（Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、ムレリアン（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ）阻害物質、単球コロニー阻止因子、単球誘引剤プロテイン、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ （６９ ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７ ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−ｌβ、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄性原種抑制剤因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュールツリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦｌα、ＳＤＦｌβ、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＡＣＥ認識部位、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ（ｐ５５）、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦレセプター１、ＶＥＧＦレセプター２、ＶＥＧＦレセプター３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１ＯＲ、およびＩＬ−１８Ｒ、の１に対して特異性を有することを特徴とするポリペプチド。
  26. 請求項１１に記載のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、二重特異性を有し、及び
    ＴＮＦ／ＴＧＦ−β、ＴＮＦ／ＩＬ−１、ＴＮＦ／ＩＬ−２、ＴＮＦ／ＩＬ−３、ＴＮＦ／ＩＬ−４、ＴＮＦ／ＩＬ−６、ＴＮＦ／ＩＬ−８、ＴＮＦ／ＩＬ−１０、ＴＮＦ／ＩＬ−１２、ＴＮＦ／ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１／ＩＬ−８、ＩＬ−１／ＩＬ−１０、ＩＬ−１／ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２／ＩＬ−３、ＩＬ−２／ＩＬ−４、ＩＬ−２／ＩＬ−５、ＩＬ−２／ＩＬ−６、ＩＬ−２／ＩＬ−７、ＩＬ−２／ＩＬ−１０、ＩＬ−２／ＩＬ−１２、ＩＬ−２／ＩＬ１５、ＩＬ−２／ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２／ＩＦＮ−α／β、ＩＬ−３／ＩＬ−４、ＩＬ−３／ＩＬ−５、ＩＬ−３／ＩＬ−６、ＩＬ−３／ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４／ＩＬ−５、ＩＬ−４／ＩＬ−６、ＩＬ−４／ＩＬ−１０、ＩＬ−４／ＩＬ−１２、ＩＬ−４／ＩＬ−１３、ＩＬ−４／ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４／ＣＳＦ、ＩＬ−５／ＩＬ−６、ＩＬ−５／ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６／ＩＬ−１０、ＩＬ−６／ＩＬ−１１、ＩＬ−６／ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２、ＩＬ−１０／ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２／ＩＬ−１８、ＩＬ−１２／ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８／ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１８／ＩＦＮ−γからなる群より選択される標的に結合することを特徴とするポリペプチド。
  27. 請求項２１から請求項２６のいずれか１請求項記載のＰＥＧに結合しているポリペプチドであって、各抗体単一可変ドメインがＴＮＦαに特異的な結合部位を有することを特徴とするポリペプチド。
  28. 請求項１から請求項２７のいずれか１請求項に記載のＰＥＧに結合しているポリペプチド及び担体を含む医薬品製剤。
  29. 請求項２８に記載の医薬品製剤であって、前記医薬品製剤が、経口投与に適しているか、あるいは、静脈内、筋肉内、又は皮内注射、移植、直腸及び経皮投与から成る群より選択されるルートを介する非経口投与に適していることを特徴とする医薬品製剤。
  30. 請求項２８に記載の医薬品製剤であって、前記医薬品製剤が、放出遅延機構を有する非経口投与製剤又は経口投与製剤であることを特徴とする医薬品製剤。
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