CN113278076A - 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明人成功地制作了一种抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：对在T细胞表面表达的分子和在其它免疫细胞表面表达的分子具有结合活性、但不同时结合的抗体可变区。通过本发明可以制作：能够避免在T细胞和其它免疫细胞交联时所产生的副作用的抗原结合分子，进而可以提供：作为医药品适合的抗原结合分子。

Description

含有改变了抗体可变区的抗原结合分子
本申请是申请日2014年11月11日，国际申请号PCT/JP2014/079785、中国申请号201480072799.3，发明名称为“多能细胞的诱导”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明提供一种抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：可与不同的2个抗原(第1抗原和第2抗原)结合但不同时与两抗原结合的抗体可变区、以及与不同于这些抗原的第3抗原结合的抗体可变区；含有该抗原结合分子的药物组合物；以及它们的制备方法。
背景技术
抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因而作为医药品受到关注(Nat.Biotechnol.(2005)23,1073-1078(非专利文献1)和Eur J Pharm Biopharm.(2005)59(3),389-396(非专利文献2))。抗体不仅诱导与抗原结合的作用、激动剂作用或拮抗作用，而且还诱导ADCC(Antibody Dependent Cytotoxicity：抗体依赖性细胞毒活性)、ADCP(Antibody Dependent Cell phagocytosis：抗体依存性细胞介导的吞噬作用)、CDC(补体依赖性细胞毒活性)等基于效应细胞的细胞毒活性(也称效应子功能)。特别是由于IgG1亚类的抗体对癌细胞发挥效应子功能，因此多种抗体医药品在癌症领域得以开发。
为了使抗体表达ADCC、ADCP、CDC，有必要使抗体的Fc区与存在于NK细胞或巨噬细胞等的效应细胞的抗体受体(FcγR)和各种补体成分相结合。对于人而言，作为FcγR的蛋白质家族，报道有FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb的同种型，也报道有各自的同种异型(Immunol.Lett.(2002)82,57-65(非专利文献3))。在这些同种型中，FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa在细胞内结构域中具有称为ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif，免疫受体酪氨酸活化模体)的结构域，来传递活化信号。另一方面，仅FcγRIIb在细胞内结构域中具有称为ITIM(Immunoreceptor Tyrosine-basedInhibitory Motif，免疫受体酪氨酸抑制模体)的结构域，来传递抑制信号。任一个FcγR也已知通过免疫复合体等得以交联，从而传递信号(Nat.Rev.Immunol.(2008)8,34-47(非专利文献4))。实际上，抗体对癌细胞发挥效应子功能时，在癌细胞膜上多个结合的抗体的Fc区内效应细胞膜上的FcγR集群，通过效应细胞传递活化信号。其结果，虽然可以发挥杀伤细胞效果，但此时FcγR的交联限定为存在于癌细胞附近的效应细胞，因此显示出免疫的活化只发生在癌细胞局部(Ann.Rev.Immunol.(1988).6.251-81(非专利文献5))。
天然型的免疫球蛋白在可变区与抗原结合，在恒定区与FcγR、FcRn、FcαR、FcεR等受体或补体结合。报道了：在IgG的Fc区相互作用的结合分子之一的FcRn，每1个分子与抗体的各重链结合，因此2分子的FcRn与1分子的IgG型抗体结合。然而，与FcRn等不同，FcγR在抗体的铰链区和CH2结构域相互作用，仅1分子的FcγR与1分子的IgG型抗体结合(J.Bio.Chem.,(20001)276,16469-16477)。此外，显示出：关于FcγR与抗体的Fc区的结合，抗体的铰链区和CH2结构域内的几个氨基酸残基和与CH2结构域结合的EU编号297位的Asn所添加的糖链是重要的(Chem.Immunol.(1997),65,88-110(非专利文献6)、Eur.J.Immunol.(1993)23,1098-1104(非专利文献7)、Immunol.(1995)86,319-324(非专利文献8))。围绕该结合位点，迄今为止研究了各种具有FcγR结合特性的Fc区的突变体，得到了对活化Fcγ受体具有更高结合活性的Fc区突变体(WO2000/042072(专利文献1)、WO2006/019447(专利文献2))。例如，Lazar等人通过将人IgG1的EU编号239位的Ser、330位的Ala、332位的Ile分别取代成Asp、Leu、Glu，成功地使人IgG1对人FcγRIIIa(V158)的结合活性增加到约370倍(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103,4005-4010(非专利文献9)、WO2006/019447(专利文献2))。该改变体与天然型相比，对FcγRIIIa和FcγRIIb的结合活性之比(A/I比)达到约9倍。此外，Shinkawa等人通过使EU编号297位的Asn所添加的糖链的岩藻糖缺失而成功地使对FcγRIIIa的结合活性增加到约100倍(J.Biol.Chem.(2003)278,3466-3473(非专利文献10))。通过这些方法，与天然型人IgG1比较，可以使人IgG1的ADCC活性大幅度地提高。
通常的天然型的IgG型抗体通过其可变区(Fab)识别并结合1个表位，因此只能与1个抗原结合。另一方面，在癌症或炎症中，已知有多种蛋白质的参与，蛋白质彼此之间可能存在串扰。例如在免疫疾病中，已知有几个炎症性细胞因子(TNF、IL1或IL6)的参与(Nat.Biotech.,(2011)28,502-10(非专利文献11))。此外还已知：作为在癌症中获得耐药的机理之一，是其它受体得以活化(Endocr Relat Cancer(2006)13,45-51(非专利文献12))。在这样的情况下，在识别1个表位的通常的抗体中无法抑制多种蛋白质。
作为抑制多个靶的分子，用1个分子与2种以上的抗原结合的抗体(称为双特异性抗体)得以研究。通过对天然型的IgG型抗体进行改良，能够对不同的2个抗原(第1抗原和第2抗原)赋予结合活性(MAbs.(2012)Mar 1,4(2))。因此，不仅具有将2种以上的抗原用1个分子进行中和的作用，还具有通过将持有细胞毒活性的细胞与癌细胞交联来提高抗肿瘤活性的作用。迄今为止，作为双特异性抗体的分子形态，报道了：在抗体的N末端或C末端添加了抗原结合部位的分子(DVD-Ig或scFv-IgG)、或者抗体的2个Fab区具有不同序列的分子(共同L链的双特异性抗体和杂交的杂交瘤)、1个Fab区识别2个抗原的分子(Two-in-one IgG)、将CH3区的环部位作为新的抗原结合部位的分子(Fcab)(Nat.Rev.(2010),10,301-316(非专利文献13)、Peds(2010),23(4),289-297(非专利文献14))。由于任一的双特异性抗体在Fc区均与FcγR相互作用，因而抗体的效应子功能得以保存。因此，对于双特异性抗体所识别的任一抗原，也与FcγR同时结合，对于表达抗原的细胞显示ADCC活性。
只要双特异性抗体所识别的抗原均为癌特异性表达的抗原，则与任一抗原结合都会对癌细胞显示细胞毒活性，因此可以期待比识别1个抗原的通常的抗体医药品更有效的抗癌效果。然而，在双特异性抗体所识别的抗原中，任意1个抗原在表达于正常组织的情况下或为表达于免疫细胞的细胞的情况下，由于与FcγR的交联也发生正常组织的伤害或细胞因子的释放(J.Immunol.(1999)Aug 1,163(3),1246-52(非专利文献15))。其结果，诱导较强的副作用。
例如，作为识别表达于T细胞的蛋白质和表达于癌细胞的蛋白质(癌抗原)的双特异性抗体，已知有Catumaxomab。Catumaxomab在2个Fab内分别与癌抗原(EpCAM)和表达于T细胞的CD3ε链结合。Catumaxomab通过与癌抗原和CD3ε同时结合，诱导T细胞介导的细胞毒活性，通过与癌抗原和FcγR同时结合，诱导NK细胞或巨噬细胞等抗原呈递细胞介导的细胞毒活性。通过利用2个细胞毒活性，Catumaxomab经腹腔内给予对恶性腹水显示出较高的治疗效果，在欧州已经得到认可(Cancer Treat Rev.(2010)Oct 36(6),458-67(非专利文献16))。进而，报道了：通过给予Catumaxomab出现了对癌细胞反应的抗体的实例，明确了获得性免疫得以诱导(Future Oncol.(2012)Jan8(1),73-85(非专利文献17))。根据其结果，持有T细胞介导的细胞毒活性和经由FcγR的NK细胞或巨噬细胞等的细胞介导的作用的两者的抗体(特别称为三功能抗体)可以期待较强的抗肿瘤效果和诱导获得性免疫，因此受到关注。
然而，三功能抗体在不存在癌抗原的情况下，也与CD3ε和FcγR同时结合，因此即使在不存在癌细胞的环境下，表达CD3ε的T细胞和表达FcγR的细胞也交联，大量地产生各种细胞因子。由于这样的癌抗原非依赖性的各种细胞因子的产生诱导，目前三功能抗体的给予限定于腹腔内(Cancer Treat Rev.2010Oct 36(6),458-67(非专利文献16))，由于严重的细胞因子风暴样的副作用，全身给予是极其困难的(Cancer ImmunolImmunother.2007Sep；56(9):1397-406(非专利文献18))。
此外，在以往技术的双特异性抗体中，作为第一个抗原的癌抗原(EpCAM)和作为第二个抗原的CD3ε的两方的抗原能够与FcγR同时结合，因此避免由FcγR和第二个抗原的CD3ε的同时结合而引起的这种副作用从分子结构的角度来说是不可能的。
近年来，通过使用降低了对于FcγR的结合活性的Fc区，提供了在避免副作用的同时引起T细胞介导的细胞毒活性的改良型抗体(WO2012/073985)。
然而，即使是这样的抗体，从分子结构的角度来说，也无法在与癌抗原结合的同时，也作用于CD3ε和FcγR的2个免疫受体。
迄今为止，未得知可以在避免副作用的同时，癌抗原特异性地使T细胞介导的细胞毒活性和T细胞以外细胞介导的细胞毒活性的两方发挥作用的抗体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2000/042072
专利文献2：WO2006/019447
非专利文献
非专利文献1：Nat.Biotechnol.(2005)23,1073-1078
非专利文献2：Eur J Pharm Biopharm.(2005)59(3),389-396
非专利文献3：Immunol.Lett.(2002)82,57-65
非专利文献4：Nat.Rev.Immunol.(2008)8,34-47
非专利文献5：Ann.Rev.Immunol.(1988).6.251-81
非专利文献6：Chem.Immunol.(1997),65,88-110
非专利文献7：Eur.J.Immunol.(1993)23,1098-1104
非专利文献8：Immunol.(1995)86,319-324
非专利文献9：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103,4005-4010
非专利文献10：J.Biol.Chem.(2003)278,3466-3473
非专利文献11：Nat.Biotech.,(2011)28,502-10
非专利文献12：Endocr Relat Cancer(2006)13,45-51
非专利文献13：Nat.Rev.(2010),10,301-316
非专利文献14：Peds(2010),23(4),289-297
非专利文献15：J.Immunol.(1999)Aug 1,163(3),1246-52
非专利文献16：Cancer Treat Rev.(2010)Oct 36(6),458-67
非专利文献17：Future Oncol.(2012)Jan 8(1),73-85
非专利文献18：Cancer Immunol Immunother.2007Sep；56(9):1397-406。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明基于上述状况而完成，其课题在于提供一种抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：1个可变区对于不同的2个抗原(第1抗原和第2抗原)具有结合活性但不同时与这些抗原结合的抗体可变区、和与不同于这些抗原的抗原(第3抗原)结合的可变区；含有该抗原结合分子的药物组合物；以及该抗原结合分子的制备方法。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题而进行了深入的研究。其结果是：本发明人制作了一种抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：1个可变区对于不同的2个抗原(第1抗原和第2抗原)具有结合活性但不同时与这些抗原结合的抗体可变区、和与不同于这些抗原的抗原(第3抗原)结合的可变区，通过利用该抗原结合分子对于3个不同抗原的结合活性，成功地使由抗原结合分子产生的活性增强。进而，成功地制作了一种抗原结合分子，所述抗原结合分子能够避免现有的多特异性抗原结合分子用作医药品时，被认为成为副作用原因的、由于与在不同细胞上表达的抗原结合而产生的该不同细胞间的交联。
更具体而言，本发明涉及以下内容。
[1]抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：
可与第1抗原和不同于该第1抗原的第2抗原结合，但不同时与第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区；以及
与不同于该第1抗原和第2抗原的第3抗原结合的可变区。
[2]抗原结合分子，所述抗原结合分子包含抗体可变区，所述抗体可变区的重链可变区的氨基酸改变成可与第1抗原和不同于该第1抗原的第2抗原结合、但不同时与第1抗原和第2抗原结合。
[3][1]或[2]所述的抗原结合分子，其中，不同时与第1抗原和第2抗原结合的可变区为不同时与分别在不同的细胞上表达的第1抗原和第2抗原结合的可变区。
[4][1]～[3]中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子还包含抗体的Fc区。
[5][4]所述的抗原结合分子，其中，Fc区是与天然型人IgG1抗体的Fc区相比对FcγR的结合活性有所降低的Fc区。
[6][1]～[5]中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子为多特异性抗体。
[7][1]～[6]中任一项所述的抗原结合分子，其中，可与第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区为至少导入了1个氨基酸改变的可变区。
[8][7]所述的抗原结合分子，其中，上述改变为至少1个氨基酸的取代或插入。
[9][7]或[8]所述的抗原结合分子，其中，上述改变是与第1抗原结合的可变区的氨基酸序列的一部分取代成与第2抗原结合的氨基酸序列、或者是在与第1抗原结合的可变区的氨基酸序列中插入与第2抗原结合的氨基酸序列。
[10][8]或[9]所述的抗原结合分子，其中，待插入的氨基酸数目为1～25个。
[11][7]～[10]中任一项所述的抗原结合分子，其中，待改变的氨基酸为抗体可变区的CDR1、CDR2、CDR3或FR3区的氨基酸。
[12][7]～[11]中任一项所述的抗原结合分子，其中，待改变的氨基酸为环区的氨基酸。
[13][7]～[11]中任一项所述的抗原结合分子，其中，待改变的氨基酸为选自抗体的H链可变区的Kabat编号31～35、50～65、71～74和95～102，L链可变区的Kabat编号24～34、50～56和89～97的至少1个氨基酸。
[14][1]～[13]中任一项所述的抗原结合分子，其中，第1抗原或第2抗原的任一个抗原为在T细胞表面特异性表达的分子，另一个抗原为在T细胞或其它免疫细胞表面表达的分子。
[15][14]所述的抗原结合分子，其中，第1抗原或第2抗原中的任一个抗原为CD3，而另一个抗原为FcγR、TLR、凝集素、IgA、免疫限制点分子、TNF超家族分子、TNFR超家族分子或NK受体分子。
[16][14]或[15]所述的抗原结合分子，其中，第3抗原为癌组织特异性表达的分子。
[17]药物组合物，所述药物组合物含有[1]～[16]中任一项所述的抗原结合分子和医学上可接受的载体。
[18]制备[1]～[16]中任一项所述的抗原结合分子的方法，所述方法包括下述步骤(i)～(iv)：
步骤(i)：制作抗原结合分子的文库，所述抗原结合分子为改变了与第1抗原或第2抗原结合的抗体可变区的至少1个氨基酸的抗原结合分子，其包含该所改变的可变区的至少1个氨基酸彼此不同的可变区；
步骤(ii)：从所制作的文库中选择包含对第1抗原和第2抗原具有结合活性、但不同时与该第1抗原和第2抗原结合的可变区的抗原结合分子；
步骤(iii)：培养含有编码通过步骤(ii)选择的抗原结合分子的该可变区的核酸、和/或编码与第3抗原结合的抗原结合分子的可变区的核酸的宿主细胞，使含有可与第1抗原和第2抗原结合但不同时与该第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区、和/或与第3抗原结合的可变区的抗原结合分子表达；以及
步骤(iv)：从上述宿主细胞培养物中回收抗原结合分子。
[19][18]所述的制备方法，其中，步骤(ii)中选择的抗原结合分子所含的、不同时与第1抗原和第2抗原结合的可变区为不同时与分别在不同的细胞上表达的第1抗原和第2抗原结合的可变区。
[20][18]或[19]所述的制备方法，其中，步骤(iii)中培养的宿主细胞还包含编码抗体Fc区的核酸。
[21][20]所述的制备方法，其中，Fc区是与天然型人IgG1抗体的Fc区相比对FcγR的结合活性有所降低的Fc区。
[22][18]～[21]中任一项所述的制备方法，其中，待制备的抗原结合分子为多特异性抗体。
[23][18]～[22]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(i)中的可变区的至少1个已改变的氨基酸为取代或插入的氨基酸。
[24][23]所述的制备方法，其中，所插入的氨基酸数目为1～25个。
[25][18]～[24]中任一项所述的制备方法，其中，改变是指抗体可变区的CDR1、CDR2、CDR3或FR3区的氨基酸的改变。
[26][18]～[25]中任一项所述的制备方法，其中，改变是指环区的氨基酸的改变。
[27][18]～[25]中任一项所述的制备方法，其中，改变是指选自抗体H链可变区的Kabat编号31～35、50～65、71～74和95～102、L链可变区的Kabat编号24～34、50～56和89～97的至少1个氨基酸的改变。
[28][18]～[27]中任一项所述的制备方法，其中，第1抗原或第2抗原中的任一个抗原为在T细胞表面特异性表达的分子，而另一个抗原为在T细胞或其它免疫细胞表面表达的分子。
[29][28]所述的制备方法，其中，第1抗原或第2抗原中的任一个抗原为CD3，而另一方抗原为FcγR、TLR、IgA、凝集素、免疫限制点分子、TNF超家族分子、TNFR超家族分子或NK受体分子。
[30][28]或[29]所述的制备方法，其中，第3抗原为癌组织特异性表达的分子。
[31]癌症的治疗方法，所述方法包括给予[1]～[16]中任一项所述的抗原结合分子的步骤。
[32]用于在癌症的治疗中使用的[1]～[16]中任一项所述的抗原结合分子。
[33][1]～[16]中任一项所述的抗原结合分子在制备癌症的治疗药中的应用。
[34]用于制备癌症的治疗药的方法，所述方法包括使用[1]～[16]中任一项所述的抗原结合分子的步骤。
[35]任意组合上述中所述的一个或多个方案而得的方案，只要根据本领域技术人员的技术常识不存在技术上的矛盾，也包含在本发明中，这是本领域技术人员当然可以理解的。
附图简述
图1：是与第1抗原和第2抗原结合、但不同时结合的抗体的概念图。
图2：是由于不同时与两个抗原结合而不引起交联的抗体的概念图。
图3：是即使与两个抗原同时结合、也不使两个细胞同时结合的抗体的概念图。
图4：是交联癌细胞和表达第一受体的T细胞的抗体的概念图。
图5：是交联癌细胞和表达第二受体的细胞的抗体的概念图。
图6：是交联癌细胞和免疫细胞、但不使免疫细胞彼此之间交联的抗体的概念图。
图7：是显示CE115对于CD3ε的细胞ELISA的结果的图。
图8：是显示EGFR_ERY22_CE115的分子形态的图。
图9：是显示EGFR_ERY22_CE115的TDCC结果(SK-pca13a)的图。
图10：是显示人源化CE115对于CD3ε的结合性的图。
图11：是显示检测RGD插入CE115与整联蛋白结合的ECL-ELISA的结果的图。
图12：是显示检测RGD插入CE115与CD3ε结合的ECL-ELISA的结果的图。
图13：是显示检测RGD插入CE115与整联蛋白和CD3ε同时结合的ECL-ELSIA的结果的图。显示同时结合的改变体的结果。
图14：是显示RGD插入CE115的同时结合ECL-ELISA的结果的图。显示不同时结合的改变体的结果。
图15：是显示检测TLR2结合肽插入CE115与TLR2结合的ECL-ELISA的结果的图。
图16：是显示检测TLR2结合肽插入CE115与CD3ε结合的ECL-ELISA的结果的图。
图17：是显示检测TLR2结合肽插入CE115与TLR2和CD3同时结合的ECL-ELISA的结果的图。
图18：是结合量之比为不足0.8的抗体的传感图的实例。纵轴为RU值(响应)、横轴为时间。
图19：是显示噬菌体所呈递的Fab结构域与CD3ε、IL6R结合的图。
图20：是显示噬菌体所呈递的Fab结构域与CD3ε、人IgA(hIgA)结合的图。NC表示与未固定抗原的板结合。
图21：是显示IgG化的克隆与CD3ε、人IgA(hIgA)结合的图。
图22：是显示IgG化的克隆与人IgA的结合被CD3ε抑制，因而该克隆无法同时与人IgA(hIgA)和CD3ε结合的图。
图23：是显示噬菌体所呈递的Fab结构域与CD3ε、人CD154结合的图。NC表示与未固定抗原的板结合。
图24：是显示IgG化的克隆与CD3ε、人CD154结合的图。
图25：是显示IgG化的克隆与人CD154的结合被CD3ε抑制，因而该克隆无法同时与人CD154和CD3ε结合的图。
具体实施方式
本发明中“抗体可变区”是指通常由4个框架区(FR)和夹在其中的3个互补决定区(complementarity-determining region；CDR)构成的区，只要具有与抗原的一部分或全部结合的活性，也包含其部分序列。特别优选含有抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)的区。本发明的抗体可变区可以是任意序列，例如小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体、和将这些非人抗体进行人源化的人源化抗体、以及人抗体等，可以是任意来源的抗体可变区。“人源化抗体”也被称为重构(reshaped)人抗体，是指将来源于人以外的哺乳动物的抗体、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR；complementarity determiningregion)移植到人抗体的CDR而得的抗体。用于鉴定CDR的方法是公知的(Kabat等人,Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987),National Institute ofHealth,Bethesda,Md.；Chothia等人,Nature(1989)342:877)。此外，其通常的基因重组方法也是公知的(参照欧州专利申请公开编号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。
本发明的“抗体可变区不同时与第1抗原和第2抗原结合”是指，本发明的抗体可变区在与第1抗原结合的状态下无法与第2抗原结合，相反，该可变区在与第2抗原结合的状态下无法与第1抗原结合。在此，在“不同时与第1抗原和第2抗原结合”中，也包含第1抗原表达细胞和第2抗原表达细胞的2个细胞不交联、或者与各自的细胞所表达的第1抗原和第2抗原不同时结合。进而还包含下述的情形：当第1抗原和第2抗原如可溶型蛋白那样不表达在细胞膜上、或者两方存在于同一细胞上时，可与第1抗原和第2抗原的两方同时结合，但在各自不同的细胞上表达时，无法同时结合的情形。作为这样的抗体可变区，只要具有该功能则没有特别限定，例如可举出：将IgG型抗体可变区的一部分氨基酸改变成与所期望的抗原结合的可变区。作为待改变的氨基酸，例如可在与第1抗原或第2抗原结合的抗体可变区中，选择通过氨基酸改变而不丧失与该抗原结合的氨基酸。
在此，“在不同的细胞上表达”只要是在各自的细胞上表达即可，作为这样的细胞组合，例如，可以是T细胞与其它T细胞这样的同一种类的细胞，或者可以是T细胞与NK细胞这样的不同种类的细胞。
本发明的氨基酸改变可以单独使用也可以多个组合来使用。
多个组合来使用的情况下，对组合的数目没有特别限定，可在能够实现发明目的的范围内适当设定，例如，为2个以上且30个以下、优选为2个以上且25个以下、2个以上且22个以下、2个以上且20个以下、2个以上且15个以下、2个以上且10个以下、2个以上且5个以下、2个以上且3个以下。
多个组合的情况下，可以将该氨基酸改变只加入到抗体的重链可变区或轻链可变区，也可以将该氨基酸改变适当分配加入到重链可变区和轻链可变区的双方。
待改变的氨基酸残基只要维持其抗原结合活性，则可以接受可变区中的1个或多个氨基酸残基的改变。改变可变区的氨基酸时，没有特别限定，但优选维持改变前的抗体的结合活性，例如，与改变前相比，优选具有50％以上、更优选具有80％以上、进一步优选具有100％以上的结合活性。而且，通过氨基酸改变，结合活性可以提高，例如结合活性与改变前相比可以为2倍、5倍、10倍等。
作为用于氨基酸改变的优选区，可举出：可变区中的溶剂暴露区和环区。其中，优选CDR1、CDR2、CDR3、FR3区、环区。具体而言，优选H链可变区的Kabat编号31～35、50～65、71～74、95～102、L链可变区的Kabat编号24～34、50～56、89～97，更优选H链可变区的Kabat编号31、52a～61、71～74、97～101、L链可变区的Kabat编号24～34、51～56、89～96。此外，在氨基酸改变时，可以将使与抗原的结合活性提高的氨基酸组合导入。
需要说明的是，在本发明中，“环区”是指不参与免疫球蛋白的β桶结构维持的残基所存在的区。
在本发明中，氨基酸的改变是指取代、缺失、添加、插入、或修饰的任一种、或者它们的组合。在本发明中，氨基酸的改变可称之为氨基酸的变异，以相同的含义来使用。
取代氨基酸残基时，通过取代成另外的氨基酸残基，例如以对下述的(a)～(c)这样的点进行改变为目的。
(a)折叠结构或螺旋结构的区域中的多肽的主链结构；
(b)靶位点中的电荷或疏水性；或
(c)侧链的大小。
氨基酸残基根据通常的侧链的特性被分类为以下的组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及
(6)芳族性：Trp、Tyr、Phe。
这些的在各组内的氨基酸残基的取代称为保守取代，而在其它组间彼此的氨基酸残基的取代称为非保守取代。
本发明中的取代可以是保守取代，也可以是非保守取代，还可以是保守取代与非保守取代的组合。
此外，在氨基酸残基中加入改变还包含下述情形：在与第1抗原或第2抗原结合的抗体可变区中，从通过氨基酸改变而随机地改变不丧失与该抗原结合的氨基酸之中，选择可与第1抗原和第2抗原结合、但无法同时结合的可变区、或者事先将已知对于所期望的抗原具有结合活性的肽插入上述区的改变。作为事先已知对于所期望的抗原具有结合活性的肽，例如可举出表1所示的肽。
[表1]
Figure BDA0003085543880000121
作为本发明的一个方案，提供一种抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：可与第1抗原和不同于该第1抗原的第2抗原结合、但不同时与第1抗原和第2抗原结合而改变了重链可变区的氨基酸的抗体可变区。例如，通过将上述的氨基酸改变(取代、缺失、添加、插入、或修饰的任一种、或者它们的组合)导入到重链可变区，可以制作可与第1抗原和不同于该第1抗原的第2抗原结合、但不同时与第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区。导入氨基酸改变的位置优选重链可变区，作为更优选的区，可举出：可变区中的溶剂暴露区和环区。其中，优选CDR1、CDR2、CDR3、FR3区、环区。具体而言，优选H链可变区的Kabat编号31～35、50～65、71～74、95～102，更优选H链可变区的Kabat编号31、52a～61、71～74、97～101。此外，在氨基酸改变时，可以将使与抗原的结合活性提高的氨基酸组合导入。
本发明的抗体可变区中，除了上述的改变之外，还可以组合公知的改变。例如，可变区的N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰基化而修饰成为焦谷氨酸是本领域技术人员熟知的修饰。因此，本发明的抗体，其重链的N末端为谷氨酰胺时，包含谷氨酰胺被修饰成焦谷氨酸的可变区。
此外，例如，对于这些抗体的可变区，为了改善与抗原的结合、药代动力学、稳定性、抗原性，可以是进一步导入有氨基酸改变的可变区。本发明的抗体可变区，可以是通过加入对于抗原具有pH依赖性的结合性的改变，从而对于抗原反复结合(WO/2009/125825)。
此外，例如，对于这些抗体与第3抗原结合的可变区，还可以根据靶组织特异性化合物的浓度加入对抗原的结合活性发生变化的氨基酸改变(WO2013/180200)。
进而，例如，可变区的改变可以是下述目的的改变：提高结合活性、改善特异性、降低pI、对抗原的结合赋予pH依赖性的性质、改善结合热稳定性、改善溶解性、对化学修饰的稳定性、改善来源于糖链的异质性、避免使用in silico预测而鉴定的或通过使用体外T细胞的分析而鉴定的使免疫原性降低的T细胞表位、或者导入将调节T细胞活化的T细胞表位等(mAbs 3:243-247,2011)。
本发明的抗体可变区是否“可与第1抗原和第2抗原结合”，可以使用公知的方法来测定。
例如，可以通过电化学发光法(ECL法)来测定(BMC Research Notes 2011,4:281)。
具体而言，例如，向经生物素标记的被测抗原结合分子可与第1抗原和第2抗原结合的区、例如由Fab区构成的低分子化的抗体或者一价性的抗体(缺少通常抗体所具有的2个Fab区中的1个的抗体)中混合用sulfo-tag(Ru络合物)标记的第1抗原或第2抗原，将所得混合物添加到链霉亲和素固定化板上。此时，经生物素标记的被测抗原结合分子与板上的链霉亲和素结合。使Sulfo-tag发光，利用Sector Imager 600、2400(MSD)等，通过检测其发光信号，可以确认第1抗原或第2抗原与被测抗原结合分子的上述区的结合。
此外，还可以通过ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting，荧光激活细胞分选术)、ALPHA筛选(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay，增强的发光接近均质测定)或利用了表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等来测定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。
具体而言，例如，可以使用作为利用了表面等离子共振(SPR)现象的相互作用分析仪器的Biacore(GE Healthcare)来测定。Biacore也包含Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、C等任一的机种。在传感器芯片上还可以使用CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA，Au芯片等的Biacore用传感器芯片的任一种。在传感器芯片上通过胺偶联、二硫醚偶联(disulfide coupling)、醛偶联等的偶联方法将补充本发明的抗原结合分子的蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗人IgG抗体、抗人IgG-Fab、抗人L链抗体、抗人Fc抗体、抗原蛋白、抗原肽等的补充用蛋白质固定。使第1抗原或第2抗原作为分析物在所述传感器芯片上流过，测定相互作用，获取传感图。此时的第1抗原或第2抗原的浓度可以根据待测定样本的KD等的相互作用的强度在数μM～数pM的范围内实施。
此外，还可以将第1抗原或第2抗原而并非抗原结合分子固定在传感器芯片上，使要评价的抗体样本与所述传感器芯片相互作用。根据由相互作用的传感图算出的解离常数(KD)值、或抗原结合分子样本作用前后的传感图的增加程度，可以判断本发明的抗原结合分子的抗体可变区是否具有对第1抗原或第2抗原的结合活性。
ALPHA筛选是通过使用供体和受体这2种珠的ALPHA技术，基于下述原理来实施的。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子发生生物学相互作用，仅在2种珠接近的状态时检测到发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周围的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散至供体珠周围，到达接近的受体珠时，引起珠内的化学发光反应，最终发出光。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单线态氧不会到达受体珠，因而不会引起化学发光反应。
将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感器芯片的金薄膜上，若从传感器芯片的背侧照射光以使在金薄膜和玻璃的界面发生全反射，则反射光的一部分会形成反射强度降低的部分(SPR信号)。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)流过传感器芯片的表面，配体和分析物若结合，则固定化配体分子的质量会增加，传感器芯片表面的溶剂的折射率会发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生移位(相反，若结合发生解离则信号的位置会返回)。Biacore系统将上述移位的量即传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化作为测定数据表示(传感图)。由传感图可求出分析物与补充到传感器芯片表面的配体的结合量(在分析物相互作用前后的传感图上的响应的变化量)。但是，由于结合量也取决于配体的量，因此在进行比较时，必须使配体的量在基本上相同量的条件下进行比较。此外，由传感图的曲线可求出动力学参数：结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，由该常数之比可求出亲和性(KD)。BIACORE法中还适合使用抑制测定法。抑制测定法的实例记载在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010中。
本发明的抗原结合分子是否“不同时与第1抗原和第2抗原结合”，可如下进行确认：在确认了对于第1抗原和第2抗原具有结合活性之后，事先使第1抗原或第2抗原的任一方与含有具有该结合活性的可变区的抗原结合分子结合后，使用上述方法测定对于剩余的一方是否具有结合活性。
此外，抗原结合分子与固定于ELISA板或传感器芯片上的第1抗原或第2抗原的任一方的结合，还可通过将另一方添加到溶液中测定是否被抑制来确认。
具体而言，例如，使用ECL法时，对于经生物素标记的被测抗原结合分子准备用sulfo-tag(Ru络合物)标记的第1抗原和未标记的第2抗原。被测抗原结合分子可与第1抗原和第2抗原结合、但不同时与第1抗原和第2抗原结合时，在未标记的第2抗原不存在下，将被测抗原结合分子与第1抗原的混合物添加到链霉亲和素固定化板上，若使Sulfo-tag发光，则可检测到其发光信号，但在第2抗原的存在下，发光信号会减少。通过定量该发光信号的减少可以确定相对的结合活性。
此外，ALPHA筛选的情况下，在竞争的第2抗原不存在下，被测抗原结合分子与第1抗原发生相互作用而产生520-620nm的信号。未经标签化的第2抗原与被测抗原结合分子竞争与第1抗原间的相互作用。通过对反映竞争结果的荧光的减少进行定量，可以确定相对的结合活性。使用Sulfo-NHS-生物素等将多肽生物素化是公知的。作为用GST将第1抗原标签化的方法，可适宜地采用将编码第1抗原的多核苷酸与编码GST的多核苷酸在保持有可表达框内融合而成的融合基因的载体的细胞等中表达，并利用谷胱甘肽柱纯化的方法等。所得的信号可以通过使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad社、San Diego)等软件，与利用非线性回归分析的单位点竞争(one-site competition)模型拟合而适宜地分析。此时，将第2抗原进行标签化，将第1抗原不进行标签化也可同样地分析。
此外，还可以使用利用了荧光共振能量转移(FRET，Fluorescence ResonanceEnergy Transfer)的方法。FRET是指，在接近的2个荧光分子之间，激发能量通过电子共振而直接转移的现象。若引起FRET，则供体(处于激发状态的荧光分子)的激发能量转移至受体(处于供体附近的另一个荧光分子)，因此从供体发射的荧光消失(准确而言，荧光寿命缩短)，而相反，从受体发射荧光。利用该现象可以分析是否为dual-Fab。例如，导入有荧光供体第1抗原和导入有荧光受体的第2抗原若与被测抗原结合分子同时结合，则供体的荧光消失，从受体发射荧光，因此引起荧光波长的变化。这样的抗体可判断为非dual-Fab。另一方面，将第1抗原、第2抗原、被测抗原结合分子混合时，如果不引起与第1抗原结合的荧光供体的荧光波长的变化，则可认为该被测抗原结合分子为dual-Fab。
此外，例如，在供体珠上经生物素标记的被测抗原结合分子与供体珠上的链霉亲和素结合，经谷胱甘肽S转移酶(GST)标签化的第1抗原与受体珠结合。在竞争的第2抗原不存在下，被测抗原结合分子与第1抗原发生相互作用而产生520-620nm的信号。未经标签化的第2抗原与被测抗原结合分子竞争与第1抗原间的相互作用。通过对反映竞争结果的荧光的减少进行定量，可以确定相对的结合活性。使用Sulfo-NHS-生物素等将多肽生物素化是公知的。作为用GST将第1抗原标签化的方法，可适宜地采用将编码第1抗原的多核苷酸与编码GST的多核苷酸在保持有可表达框内融合而成的融合基因的载体的细胞等中表达，并利用谷胱甘肽柱纯化的方法等。所得的信号可以通过使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad社、San Diego)等软件，与利用非线性回归分析的单位点竞争(one-site competition)模型拟合而适宜地分析。
需要说明的是，标签化不限于GST，可以是用组氨酸标签、MBP、CBP、Flag标签、HA标签、V5标签、c-myc标签等的任何标签进行标签化，没有限定。此外，关于被测抗原结合分子与供体珠的结合，不限于利用生物素-链霉亲和素反应的结合。特别是，被测抗原结合分子含有Fc的情况下，可考虑经由供体珠上的蛋白A、蛋白G等的Fc识别蛋白使被测抗原结合分子结合的方法。
此外，关于第1抗原和第2抗原如可溶型蛋白那样不表达在细胞膜上时或者两方存在于同一细胞上时可与第1抗原和第2抗原的两方同时结合、但在各自不同的细胞上表达时无法同时结合的情形，也可以通过使用公知的方法进行测定。
具体而言，即使在检测与第1抗原和第2抗原同时结合的ECL-ELISA中为阳性的情形，分别将表达第1抗原的细胞、表达第2抗原的细胞和被测抗原结合分子混合的情况下，如果这3者不同时结合，表达在不同细胞上的情况下，可以显示不同时结合。例如，可以通过使用细胞的ECL-ELISA法进行测定。事先将表达第1抗原的细胞固定到板上，使被测抗原结合分子结合之后，加入表达第2抗原的细胞。通过针对在表达第2抗原的细胞上仅表达的另外的抗原、使用sulfo-tag标记抗体进行检测，与表达在两个细胞上的两个抗原同时结合的情况下，观测到信号，不同时结合的情况下，观测不到信号。
或者，可通过alpha screen法(α筛选法)进行测定。将表达结合有供体珠的第1抗原的细胞、表达结合有受体珠的第2抗原的细胞和被测抗原结合分子混合时，与表达在两个细胞上的两个抗原同时结合的情况下，可观测到信号，不同时结合的情况下，观测不到信号。
或者，可通过使用Octet的相互作用分析法进行测定。首先，最初使表达添加有肽标签的第1抗原的细胞与识别肽标签的生物传感器结合。在加入了表达第2抗原的细胞和被测抗原结合分子的孔中进行相互作用分析时，与表达在两个细胞上的两个抗原同时结合的情况下，被测抗原结合分子和表达第2抗原的细胞与生物传感器结合，从而观测到较大的波长移位，不同时结合的情况下，仅被测抗原结合分子与生物传感器结合，从而观测到较小的波长移位。
或者，除了结合活性，也可以进行生物活性的测定。例如，将表达第1抗原的细胞、表达第2抗原的细胞和被测抗原结合分子进行混合培养时，与在两个细胞上表达的两个抗原同时结合的情况下，经由被测抗原结合分子而相互活化，因此可以检测到各自的抗原下游的磷酸化增加等的活化信号的变化。或者，作为活化的结果，诱导细胞因子的产生，因此通过测定细胞因子的产生量，也可以判断是否与两个细胞同时结合。
在本发明中，“Fc区”是指包含由抗体分子中的铰链部或其一部分、CH2、CH3结构域构成的片段的区。IgG类的Fc区是指以EU编号(在本说明书中也称为EU INDEX)表示、例如226位的半胱氨酸～C末端、或230位的脯氨酸～C末端，但不限于此。Fc区可通过下述方法适当地获取：将IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体等用胃蛋白酶等的蛋白水解酶部分消化之后，吸附于蛋白A柱或蛋白G柱，再洗脱所吸附的组分，从而获取。作为所述的蛋白水解酶，通过适当地设定pH等的酶的反应条件，只要能够消化全长抗体以限制性地产生Fab或F(ab’)2即可，没有特别限定，例如可示例：胃蛋白酶或番木瓜蛋白酶等。
本发明中的“抗原结合分子”只要是包含本发明的“抗体可变区”的分子则没有特别限定，进而，可以包含具有5个氨基酸左右以上的长度的肽或蛋白质。并不限于生物来源的肽或蛋白质，例如，可以是由人工设计的序列构成的多肽。而且，还可以是天然多肽、或合成多肽、重组多肽等的任一种。
作为本发明的抗原结合分子的优选实例，可举出：含有抗体的Fc区的抗原结合分子。
作为本发明的“Fc区”，例如，可以使用天然型IgG来源的Fc区。在此，天然型IgG是指包含与天然发现的IgG相同的氨基酸序列、属于由免疫球蛋白γ基因实质上编码的抗体类别的多肽。例如，天然型人IgG是指天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3、天然型人IgG4等。天然型IgG中还包含由此而自然产生的突变体等。作为人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4抗体的恒定区，基因多态性所致的多个的同种异型序列记载于Sequences ofproteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242中，本发明可以是其中的任一序列。特别是作为人IgG1的序列，EU编号356-358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。
作为抗体的Fc区，例如存在IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM类别的Fc区。本发明抗体的Fc区，例如可以使用天然型人IgG抗体来源的Fc区。作为本发明的Fc区，例如可以使用天然型IgG的恒定区来源的Fc区，具体而言，可以使用以天然型人IgG1为起源的恒定区(SEQ ID NO:1)、以天然型人IgG2为起源的恒定区(SEQ ID NO:2)、以天然型人IgG3为起源的恒定区(SEQ ID NO:3)、以天然型人IgG4为起源的恒定区(SEQ ID NO:4)来源的Fc区。天然型IgG的恒定区中还包含由此而自然产生的突变体等。
作为本发明的Fc区，特别优选对Fcγ受体的结合活性降低的Fc区。在此，Fcγ受体(在本说明书中，有时记载为Fcγ受体、FcγR或Fcγ受体)是指可以与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc区结合的受体，实质上还意指Fcγ受体基因所编码的蛋白质家族的任一成员。对于人而言，该家族还包括：含有同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；含有同种型FcγRIIa(含有同种异型H131(H型)和R131(R型))、FcγRIIb(含有FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；和含有同种型FcγRIIIa(含有同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(含有同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)；以及任意的未发现的人FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限定于此。FcγR包括来源于人、小鼠、大鼠、兔和猴的FcγR，但并不限定于此，可来源于任何生物。小鼠FcγR类中还包括：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任意的未发现的小鼠FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限定于此。作为这种Fcγ受体的优选实例，可举出：人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)和/或FcγRIIIb(CD16)。
FcγR中存在具有ITAM(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)的活性型受体和具有ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)的抑制型受体。FcγR被分类为FcγRI、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa、FcγRIIIb的活性型FcγR和FcγRIIb的抑制型FcγR。
FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于NM_000566.3和NP_000557.1中；FcγRIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于BC020823.1和AAH20823.1中；FcγRIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于BC146678.1和AAI46679.1中；FcγRIIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于BC033678.1和AAH33678.1中；以及FcγRIIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于BC128562.1和AAI28563.1中(RefSeq登录号)。此外，FcγRIIa中存在FcγRIIa的131位的氨基酸被组氨酸(H型)或精氨酸(R型)取代的两种基因多态性(J.Exp.Med,172,19-25,1990)。此外，FcγRIIb中存在FcγRIIb的232位的氨基酸被异亮氨酸(I型)或苏氨酸(T型)取代的两种基因多态性(Arthritis.Rheum.46:1242-1254(2002))。此外，FcγRIIIa中存在FcγRIIIa的158位的氨基酸被缬氨酸(V型)或苯丙氨酸(F型)取代的两种基因多态性(J.Clin.Invest.100(5):1059-1070(1997))。此外，FcγRIIIb中存在NA1型、NA2型的两种基因多态性(J.Clin.Invest.85:1287-1295(1990))。
对Fcγ受体的结合活性是否降低，可通过FACS、ELISA形式、ALPHA筛选(AmplifiedLuminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用了表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等熟知的方法来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。
ALPHA筛选是通过使用供体和受体这2种珠的ALPHA技术，基于下述原理来实施的。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子发生生物学相互作用，仅在2种珠接近的状态时检测到发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周围的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散至供体珠周围，到达接近的受体珠时，引起珠内的化学发光反应，最终发出光。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单线态氧不会到达受体珠，因而不会引起化学发光反应。
例如，经生物素标记的抗原结合分子与供体珠结合，经谷胱甘肽S转移酶(GST)标签化的Fcγ受体与受体珠结合。在具有竞争的变异Fc区的抗原结合分子的不存在下，具有天然型Fc区的抗原结合分子和Fcγ受体发生相互作用而产生520-620nm的信号。具有未经标签化的变异Fc区的抗原结合分子与具有天然型Fc区的抗原结合分子竞争与Fcγ受体间的相互作用。通过对反映竞争结果的荧光的减少进行定量，可以确定相对结合亲和性。使用Sulfo-NHS-生物素等来将抗体等抗原结合分子生物素化是公知的。作为用GST将Fcγ受体标签化的方法，可适宜地采用将编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸在保持有可表达框内融合而成的融合基因的载体的细胞等中表达，并利用谷胱甘肽柱纯化的方法等。所得的信号可以通过使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等软件，与利用非线性回归分析的单位点竞争(one-site competition)模型拟合而适宜地分析。
将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感器芯片的金薄膜上，若从传感器芯片的背侧照射光以使在金薄膜和玻璃的界面发生全反射，则反射光的一部分会形成反射强度降低的部分(SPR信号)。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)流过传感器芯片的表面，配体和分析物若结合，则固定化配体分子的质量会增加，传感器芯片表面的溶剂的折射率会发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生移位(相反，若结合发生解离则信号的位置会返回)。Biacore系统将上述移位的量即传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化作为测定数据表示(传感图)。由传感图的曲线可求出动力学参数：结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，由该常数之比可求出亲和性(KD)。BIACORE法中还适宜使用抑制测定法。抑制测定法的实例记载在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010中。
本说明书中，对Fcγ受体的结合活性降低是指，例如，根据上述的分析方法，与作为对照的含有Fc区的抗原结合分子的结合活性相比，被测抗原结合分子的结合活性显示出50％以下、优选45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、15％以下、特别优选10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下的结合活性。
作为对照的抗原结合分子，可以适宜地使用具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载于：SEQ ID NO:1(RefSeq登录号AAC82527.1的末端添加有A)、SEQ ID NO:2(RefSeq登录号AAB59393.1的末端添加有A)、SEQ ID NO:3(RefSeq登录号CAA27268.1的末端添加有A)、SEQ ID NO:4(RefSeq登录号AAB59394.1的末端添加有A)中。此外，将具有某特定同种型的抗体的Fc区突变体的抗原结合分子用作被测物质时，通过将具有该特定同种型的抗体的Fc区的抗原结合分子用作对照，可验证由于该突变体所具有的变异而导致的对Fcγ受体的结合活性的效果。如上所述，适宜地制作具有对Fcγ受体的结合活性降低被验证的Fc区的突变体的抗原结合分子。
作为这样的突变体的实例，作为按照EU编号特定的氨基酸的231A-238S的缺失(WO2009/011941)、C226S,C229S,P238S,(C220S)(J.Rheumatol(2007)34,11)、C226S,C229S(Hum.Antibod.Hybridomas(1990)1(1),47-54)、C226S,C229S,E233P,L234V,L235A(Blood(2007)109,1185-1192)等的突变体是公知的。
即，可优选举出具有下述Fc区的抗原结合分子，所述Fc区为：在构成特定的同种型抗体的Fc区的氨基酸中，按照EU编号特定的下述的任一个氨基酸：220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、332位被取代的Fc区。作为Fc区起源的抗体的同种型，没有特别限定，可适宜地利用以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体为起源的Fc区，优选利用以天然型人IgG1抗体为起源的Fc区。
例如，还可适宜地使用具有下述Fc区的抗原结合分子，所述Fc区为：在构成IgG1抗体的Fc区的氨基酸中，实施按照EU编号特定的下述的任一组取代(数字表示按照EU编号特定的氨基酸残基的位置，位于数字之前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基，位于数字之后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基)的Fc区，或者使231位～238位的氨基酸序列缺失的Fc区，
(a)L234F、L235E、P331S；
(b)C226S、C229S、P238S；
(c)C226S、C229S；
(d)C226S、C229S、E233P、L234V、L235A。
此外，还可适宜地使用具有下述Fc区的抗原结合分子，所述Fc区为：在构成IgG2抗体的Fc区的氨基酸中，实施按照EU编号特定的下述的任一组取代(数字表示按照EU编号特定的氨基酸残基的位置，位于数字之前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基，位于数字之后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基)的Fc区，
(e)H268Q、V309L、A330S、P331S；
(f)V234A；
(g)G237A；
(h)V234A、G237A；
(i)A235E、G237A；
(j)V234A、A235E、G237A。
此外，还可适宜地使用具有下述Fc区的抗原结合分子，所述Fc区为：在构成IgG3抗体的Fc区的氨基酸中，实施按照EU编号特定的下述的任一组取代(数字表示按照EU编号特定的氨基酸残基的位置，位于数字之前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基，位于数字之后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基)的Fc区，
(k)F241A；
(l)D265A；
(m)V264A。
此外，还可适宜地使用具有下述Fc区的抗原结合分子，所述Fc区为：在构成IgG4抗体的Fc区的氨基酸中，实施按照EU编号特定的下述的任一组取代(数字表示按照EU编号特定的氨基酸残基的位置，位于数字之前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基，位于数字之后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基)的Fc区，
(n)L235A、G237A、E318A；
(o)L235E；
(p)F234A、L235A。
作为其它优选的实例，可举出具有下述Fc区的抗原结合分子，所述Fc区为：在构成天然型人IgG1抗体的Fc区的氨基酸中，按照EU编号特定的下述的任一个氨基酸：233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、331位在所对应的IgG2或IgG4中取代成其EU编号所对应的氨基酸的Fc区。
作为其它优选的实例，可优选举出具有下述Fc区的抗原结合分子，所述Fc区为：在构成天然型人IgG1抗体的Fc区的氨基酸中，按照EU编号特定的下述的任一个或其以上的氨基酸：234位、235位、297位被其它氨基酸取代的Fc区。取代后所存在的氨基酸的种类没有特别限定，特别优选具有下述Fc区的抗原结合分子，所述Fc区为：234位、235位、297位的任一个或其以上的氨基酸取代成丙氨酸的Fc区。
作为其它优选的实例，可优选举出具有下述Fc区的抗原结合分子，所述Fc区为：在构成IgG1抗体的Fc区的氨基酸中，按照EU编号特定的下述的任一个氨基酸：265位被其它氨基酸取代的Fc区。取代后所存在的氨基酸的种类没有特别限定，特别优选具有下述Fc区的抗原结合分子，所述Fc区为：265位的氨基酸取代成丙氨酸的Fc区。
此外，作为本发明的“抗原结合分子”的优选方案之一，可举出：含有本发明抗体可变区的多特异性抗体。
在多特异性抗体的缔合化中，可以应用以下的技术：向抗体H链的第二恒定区(CH2)或H链的第三恒定区(CH3)的界面导入电荷排斥，以抑制非目标的H链彼此之间的缔合的技术(WO2006/106905)。
在向CH2或CH3的界面导入电荷排斥以抑制不期望的H链彼此之间的缔合的技术中，作为在H链的其它恒定区的界面进行接触的氨基酸残基，例如可举出：与CH3区中的EU编号356位的残基、EU编号439位的残基、EU编号357位的残基、EU编号370位的残基、EU编号399位的残基、EU编号409位的残基相对的区。
更具体而言，例如，在包含两种H链CH3区的抗体中，可以形成第1H链CH3区中的选自以下的(1)～(3)所示氨基酸残基组的1组～3组的氨基酸残基带有同种电荷的抗体：
(1)H链CH3区所包含的氨基酸残基且EU编号356位和439位的氨基酸残基；
(2)H链CH3区所包含的氨基酸残基且EU编号357位和370位的氨基酸残基；
(3)H链CH3区所包含的氨基酸残基且EU编号399位和409位的氨基酸残基。
进而，可以形成下述抗体：选自不同于上述第1H链CH3区的第2H链CH3区中的上述(1)～(3)所示氨基酸残基组的氨基酸残基组且在上述第1H链CH3区中带有同种电荷的对应于上述(1)～(3)所示氨基酸残基组的1组～3组氨基酸残基、与上述第1H链CH3区中的对应的氨基酸残基带有相反电荷的抗体。
上述(1)～(3)中记载的各自氨基酸残基在缔合时相互接近。关于所期望的H链CH3区或H链恒定区，本领域技术人员可以通过使用市售软件进行同源模建等，找到对应于上述(1)～(3)中记载的氨基酸残基的位点，可以使该位点的氨基酸残基适当地供于改变。
上述抗体中，“带有电荷的氨基酸残基”，例如优选选自以下的(a)或(b)任一组所包含的氨基酸残基：
(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。
上述抗体中，“带有同种的电荷”是指，例如，两个以上的氨基酸残基均具有上述(a)或(b)的任一组所包含的氨基酸残基。“带有相反的电荷”是指，例如，在两个以上的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基具有上述(a)或(b)的任一组所包含的氨基酸残基时，剩余的氨基酸残基具有不同组所包含的氨基酸残基。
在优选方案中，上述抗体的第1H链CH3区和第2H链CH3区可以通过二硫键进行交联。
本发明中，作为供于改变的氨基酸残基，不限于上述的抗体可变区或抗体恒定区的氨基酸残基。关于多肽突变体或异源多聚体，本领域技术人员可以通过使用市售软件进行同源模建等，找到形成界面的氨基酸残基，可以使该位点的氨基酸残基供于改变，以便控制缔合。
此外，在本发明的多特异性抗体的缔合化中，还可以应用其它的公知技术。将存在于抗体的一条H链的可变区的氨基酸侧链取代成更大的侧链(knob，突起)，将存在于另一条H链的相对可变区的氨基酸侧链取代成更小的侧链(hole，空隙)，从而使突起能够配置在空隙中，可以有效地引起含Fc区的具有不同氨基酸的多肽彼此之间的缔合化(WO1996/027011、Ridgway JB等人,Protein Engineering(1996)9,617-621、Merchant AM等人.Nature Biotechnology(1998)16,677-681)。
此外，在本发明的多特异性抗体的形成中，还可以应用其它的公知技术。通过使用以抗体的一条H链的CH3的一部分作为对应于该部分的IgA来源的序列、并向另一条H链的CH3的互补部分导入对应于该部分的IgA来源的序列的链交换工程化结构域CH3(strand-exchange engineered domain CH3)，从而可以通过CH3的互补性缔合化来有效地引起具有不同序列的多肽的缔合化(Protein Engineering Design&Selection,23；195-202,2010)。即使使用该公知技术也可以有效地形成目标多特异性抗体。
此外，在多特异性抗体的形成中，还可以使用下述的技术：WO2011/028952中记载的利用了抗体的CH1-CL缔合化、VH-VL缔合化的抗体制作技术；WO2008/119353或WO2011/131746中记载的使用分别调制的单克隆抗体伙伴来制作双特异性抗体的技术(Fab ArmExchange，Fab臂交换)；WO2012/058768或WO2013/063702中记载的控制抗体重链的CH3间的缔合的技术；WO2012/023053中记载的制作由二种轻链和一种重链构成的双特异性抗体的技术；Christoph等人(Nature Biotechnology Vol.31,p753-758(2013))中记载的利用分别表达由1条H链和1条L链构成的抗体的片链(half-molecule)的2个细菌细胞株来制作双特异性抗体的技术等。此外，除了上述的缔合技术之外，作为使形成结合于第一表位的可变区的轻链和形成结合于第二表位的可变区的轻链分别与形成结合于第一表位的可变区的重链和形成结合于第二表位的可变区的重链缔合的异种轻链的缔合技术而已知的CrossMab技术(Scaefer等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2011)108,11187-11192))，也可用于制作本发明所提供的多特异性或多互补位抗原结合分子。作为使用分别调制的单克隆抗体伙伴制作双特异性抗体的技术，可举出：通过将取代了存在于重链CH3区的特定氨基酸的单克隆抗体放置在还原条件下，促进抗体的异源化，从而获得所期望的双特异性抗体的方法。作为该方法中优选的氨基酸取代部位，例如可举出：CH3区中的EU编号392位的残基、EU编号397位的残基。进而，还可以利用第1H链CH3区中的选自以下的(1)～(3)所示氨基酸残基组的1组～3组的氨基酸残基带有同种电荷的抗体来制作二重特性抗体：(1)H链CH3区所包含的氨基酸残基且EU编号356位和439位的氨基酸残基；(2)H链CH3区所包含的氨基酸残基且EU编号357位和370位的氨基酸残基；(3)H链CH3区所包含的氨基酸残基且EU编号399位和409位的氨基酸残基。进而，还可以利用下述的抗体来制作二重特性抗体：选自不同于上述第1H链CH3区的第2H链CH3区中的上述(1)～(3)所示氨基酸残基组的氨基酸残基组且在上述第1H链CH3区中带有同种电荷的对应于上述(1)～(3)所示氨基酸残基组的1组～3组氨基酸残基、与上述第1H链CH3区中的对应的氨基酸残基带有相反电荷。
此外，即使在无法有效地形成目标多特异性抗体的情况下，从所产生的抗体中分离、纯化目标多特异性抗体也可获得本发明的多特异性抗体。例如，报道了：通过向两种H链的可变区导入氨基酸取代来赋予等电点的差异，可将两种同源二聚体和目标异源二聚体抗体用离子交换柱层析进行纯化的方法(WO2007114325)。此外，作为纯化异源二聚体的方法，迄今为止报道了：将由结合于蛋白A的小鼠IgG2a的H链和不结合于蛋白A的大鼠IgG2b的H链构成的异源二聚化抗体使用蛋白A进行纯化的方法(WO98050431、WO95033844)。进而，通过使用将作为IgG与蛋白A的结合部位的EU编号435位和436位的氨基酸残基取代成Tyr、His等的与蛋白A的结合能力不同的氨基酸的H链，使各H链与蛋白A的相互作用发生变化，通过使用蛋白A柱，还可以有效地仅纯化异源二聚化抗体。
还可以将这些技术多个、例如2个以上组合使用。此外，这些技术还可以适宜地分别适用于期待缔合的两个H链。需要说明的是，本发明的抗原结合分子，以加入了上述改变为基准，还可以另外制作具有相同氨基酸序列的抗原结合分子。
氨基酸序列的改变可以通过该领域中公知的多种方法来进行。这些方法中，不限于以下的方法，但可通过下述的方法来进行：位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,and Nakagawa,M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis.Gene 152,271-275；Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNAfragments cloned into M13vectors.Methods Enzymol.100,468-500；Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984)The gapped duplex DNAapproach to oligonucleotide-directed mutation construction.Nucleic AcidsRes.12,9441-9456；Kramer W,and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directedconstruction of mutations via gapped duplex DNA Methods.Enzymol.154,350-367；Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A.82,488-492)、PCR诱变法、盒式诱变法等。
此外，本发明的“抗原结合分子”可以是在单一的多肽链内含有形成本发明“抗体可变区”的重链和轻链的两方、但缺乏恒定区的抗体片段。作为这样的抗体片段，例如可以是双链抗体(diabody；Db)、单链抗体、sc(Fab’)2。
Db是由两条多肽链构成的二聚体(Holliger P等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)；EP404,097号；W093/11161号等)，各自的多肽链由较短(在相同链中L链可变区(VL)和H链可变区(VH)不能相互结合)的、例如5个残基左右的接头进行结合。
编码于同一多肽链上的VL和VH，由于其间的接头较短，无法形成单链可变区片段，通过进行二聚体化，而形成2个抗原结合部位。
作为单链抗体，例如可举出sc(Fv)2。sc(Fv)2是2个VL和2个VH的4个可变区通过肽接头等的接头连接而构成单链的单链抗体(J Immunol.Methods(1999)231(1-2),177-189)。该2个的VH和VL也可以来源于不同的单克隆抗体。例如也可优选举出：如Journal ofImmunology(1994)152(11),5368-5374中公开的识别存在于同一抗原中的二种表位的双特异性(bispecific sc(Fv)2)。sc(Fv)2可通过本领域技术人员公知的方法来制作。例如，可通过将scFv用肽接头等的接头连接来制作。
作为本说明书中的构成sc(Fv)2的抗原结合结构域的构成，可举出以下述的顺序排列为特征的抗体：两个VH和两个VL以单链多肽的N末端侧为基点按照VH、VL、VH、VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])的顺序排列，两个VH和两个VL的顺序不特别限于上述的构成，可以以任何的顺序排列。例如，还可举出如以下顺序的构成。
[VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]
[VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]
[VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]
[VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]
[VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]
关于sc(Fv)2的分子形式，也详细地记载于WO2006/132352中，本领域技术人员根据这些记载，可以适宜地制作所期望的sc(Fv)2，以制作本说明书中公开的抗原结合分子。
此外，本发明的抗原结合分子可共轭PEG等载体高分子或抗癌剂等有机化合物。此外，插入糖链添加序列，糖链以获得所期望的效果为目的而优选添加。
作为结合抗体可变区的接头，可使用能通过基因工程导入的任意的肽接头或合成化合物接头(例如，参照Protein Engineering,9(3),299-305,1996)中公开的接头等，本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可根据目的适宜选择，优选的长度为5个氨基酸以上(上限没有特别限定，通常为30个氨基酸以下、优选20个氨基酸以下)，特别优选为15个氨基酸。sc(Fv)2包含3个肽接头的情况下，可以全部使用相同长度的肽接头，也可以使用不同长度的肽接头。
例如，肽接头的情形，优选可举出：
Ser Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:5)
Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:6)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:7)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:8)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:9)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:10)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:11)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:12)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:7))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:8))n
[n为1以上的整数]等。其中，本领域技术人员可根据目的适宜选择肽接头的长度或序列。
合成化学物接头(化学交联剂)是肽的交联中通常所用的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂有市售。
将4个抗体可变区结合时，通常需要3个接头，可以全部使用相同的接头，也可以使用不同的接头。
F(ab’)2包含二条轻链和二条重链，所述重链包含恒定区(CH1结构域和CH2结构域的一部分)使链间的二硫键在两个重链间形成。本说明书中公开的构成多肽缔合体的F(ab’)2，可通过下述的方法适宜地获取：将具有所期望的抗原结合结构域的全长单克隆抗体等用胃蛋白酶等的蛋白水解酶进行部分消化后，通过使Fc片段吸附于蛋白A柱而去除。作为所述的蛋白水解酶，通过适当地设定pH等的酶的反应条件，只要能够消化全长抗体以限制性地产生F(ab’)2即可，没有特别限定，例如可示例：胃蛋白酶或无花果蛋白酶等。
此外，本发明的抗原结合分子中除了上述的氨基酸改变之外还可以包含附加性的改变。附加性的改变，例如可以从氨基酸的取代、缺失、或修饰的任一种、或者它们的组合中选择。
例如，本发明的抗原结合分子中，在该分子的目标功能不产生实质性变化的范围内，还可以任意地加入改变。例如，这样的变异可以通过氨基酸残基的保守取代来进行。此外，即使是本发明的抗原结合分子的目标功能产生变化的改变，只要该功能的变化在本发明的目标范围内也可以进行这样的改变。
本发明的氨基酸序列的改变中也包含翻译后修饰。作为具体的翻译后修饰，可以显示糖链的添加或缺失。例如，本发明的抗原结合分子具有IgG1型的恒定区时，EU编号297位的氨基酸残基可以是被糖链修饰的氨基酸残基。对修饰的糖链结构没有限定。通常，在真核细胞中表达的抗体，其恒定区包含糖链修饰。因此，在以下的细胞中表达的抗体通常可被某些糖链修饰。
·哺乳动物的抗体产生细胞
·由含有编码抗体的DNA的表达载体转化的真核细胞
在此所示的真核细胞中包含酵母或动物细胞。例如CHO细胞或HEK293H细胞是用于由含有编码抗体的DNA的表达载体进行转化的代表性的动物细胞。另一方面，在该位点没有糖链修饰的抗体也包含在本发明的抗体中。恒定区没有被糖链修饰的抗体可通过使编码抗体的基因在大肠杆菌等原核细胞中表达来获得。
本发明中，作为附加性的改变，更具体而言，也可以是例如向Fc区的糖链添加唾液酸的改变(MAbs.2010Sep-Oct；2(5):519-27.)。
此外，本发明的抗原结合分子具有Fc区部分时，例如可以加入使对FcRn的结合活性提高的氨基酸取代(J Immunol.2006Jan 1；176(1):346-56、J Biol Chem.2006Aug18；281(33):23514-24.、Int Immunol.2006Dec；18(12):1759-69.、Nat Biotechnol.2010Feb；28(2):157-9.、WO/2006/019447、WO/2006/053301、WO/2009/086320)、用于使抗体的异质性或稳定性提高的氨基酸取代((WO/2009/041613))。
进而，本发明中的“抗体”的术语以最广泛的含义使用，只要显示出所期望的生物学活性即可，还包含单克隆抗体(包含全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体突变体、抗体片段、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体等任何的抗体。
本发明的抗体不限于抗原的种类、抗体的来源等，可以是任何抗体。作为抗体的来源，没有特别限定，可举出：人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体等。
制作抗体的方法是本领域技术人员熟知的，例如单克隆抗体的情形，可通过杂交瘤法(Kohler and Milstein,Nature 256:495(1975))、重组方法(美国专利第4,816,567号)来制备。此外，可从噬菌体抗体文库中分离(Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991))。此外，可从单一的B细胞克隆中分离(N.Biotechnol.28(5):253-457(2011))。
人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，例如重叠延伸PCR是公知的。
将编码3个CDR和4个FR连接得到的抗体可变区的DNA和编码人抗体恒定区的DNA以进行框内融合的方式插入表达载体中，由此可以制作人源化抗体表达用载体。将该整合载体(重组载体)导入宿主建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧州专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576)。
根据需要，也可以按照重构人抗体CDR形成合适抗原结合部位的方式来取代FR的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠CDR移植到人FR中所使用的PCR法，向FR导入氨基酸序列的突变。
将具有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，可以通过DNA免疫获取所期望的人抗体。
进而，使用人抗体文库通过淘选获取人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的V区以单链抗体(scFv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对所选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，将该V区序列与所期望的人抗体C区序列框内融合后，插入适当的表达载体，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述列举的适当的表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达，可以获取该人抗体。这些方法已经公知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
构成本发明抗体的可变区可以是识别任意抗原的可变区。
本说明书中，对“抗原”没有特别限定，可以是任何抗原。作为抗原的实例，可举出：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressins)、脂联素、ADP核糖基环化酶-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、变应原、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶、α-突触核蛋白、α-V/β-1拮抗剂、层连蛋白(aminin)、支链淀粉、淀粉样蛋白β、淀粉样免疫球蛋白重链可变区、淀粉样免疫球蛋白轻链可变区、雄激素、ANG、血管紧张素原、促血管生成素配体-2、抗-Id、抗凝血酶III、炭疽、APAF-1、APE、APJ、载脂蛋白A1、载脂蛋白血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、ASPARTIC、心房钠尿因子、心房钠尿肽、心房钠尿肽A、心房钠尿肽B、心房钠尿肽C、av/b3整联蛋白、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)防御抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、BcI、BCMA、BDNF、b-ECGF、β-2-微球蛋白、β内酰胺酶、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、B淋巴细胞刺激因子(BIyS)、BMP、BMP-2(BMP-2a)、BMP-3(成骨蛋白(Osteogenin))、BMP-4(BMP-2b)、BMP-5、BMP-6(Vgr-1)、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BMPR-II(BRK-3)、BMPs、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子(Bone-derivedneurotrophic factor)、牛生长激素、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、B-淋巴细胞粘附分子、C10、C1抑制剂因子、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a(补体5a)、CA125、CAD-8、钙黏蛋白-3、降钙素、cAMP、碳酸酐酶-IX、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原(carcinoma-associated antigen)、心肌营养因子-1、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/嗜酸粒细胞趋化蛋白、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3-α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/嗜酸粒细胞趋化蛋白-2、CCL25/TECK、CCL26/嗜酸粒细胞趋化蛋白-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-α、CCL3Ll/LD-78-β、CCL4/MIP-l-β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-γ、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受体、CINC、CKb8-1、封闭蛋白18、CLC、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)毒素、难辨梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)毒素、产气荚膜杆菌(Clostridium Perfringens)毒素、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、补体因子3(C3)、补体因子D、皮质类固醇结合球蛋白、集落刺激因子-1受体、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/断裂因子、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-α、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-l-α/β、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/Lungkine.CXCL16、CXCL16、CXCL2/Gro-βCXCL3/Gro-γ、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCLlO/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、胱抑素C、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体抑制因子(衰变促进因子)、δ样蛋白(Delta-likeprotein)配体4、脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、DHICA氧化酶、Dickkopf-1、地高辛、二肽基肽酶IV、DKl、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、含EGF样结构域的蛋白7(EGF like domain containing protein 7)、弹性蛋白酶、弹性蛋白、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、内皮唾液酸蛋白(Endosialin)、内皮素受体、内毒素、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸粒细胞趋化蛋白、嗜酸粒细胞趋化蛋白-2、eotaxini、EpCAM、酪氨酸蛋白激酶(Ephrin)B2/EphB4、Epha2酪氨酸激酶受体、上皮生长因子受体(EGFR)、ErbB2受体、ErbB3酪氨酸激酶受体、ERCC、EREG、促红细胞生成素(EPO)、促红细胞生成素受体、E-选择素、ET-1、Exodus-2、RSV的F蛋白、F10、F11、F12、F13、F5、F9、第Ia因子、第IX因子、第Xa因子、第VII因子、第VIII因子、第VIIIc因子、Fas、FcαR、FcεRI、FcγIIb、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受体、FGF-3、FGF-8、酸性FGF(FGF-acidic)、碱性FGF(FGF-basic)、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-10、纤连蛋白、FL、FLIP、Flt-3、FLT3配体、叶酸受体、促卵泡激素(FSH)、分形趋化因子(CX3C)、游离型重链、游离型轻链、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受体、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15(MIC-1)、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14/CDMP-1)、GDF-6(BMP-13/CDMP-2)、GDF-7(BMP-12/CDMP-3)、GDF-8(Myostatin，肌肉生长抑制素)、GDF-9、GDNF、凝溶胶蛋白、GFAP、GF-CSF、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GF-β1、gH包膜糖蛋白、GITR、胰高血糖素、胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽1受体、Glut 4、谷氨酸羧肽酶II、糖蛋白激素受体、糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM-CSF、GM-CSF受体、gp130、gp140、gp72、粒细胞-CSF(G-CSF)、GRO/MGSA、生长激素释放因子、GRO-β、GRO-γ、幽门螺旋杆菌(H.pylori)、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMVgB包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(Hemopoietic growth factor)(HGF)、Hep Bgp120、乙酰肝素酶、肝素辅因子II、肝细胞生长因子、炭疽杆菌防御抗原、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、戊型肝炎、铁调素、Her1、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HGF、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(High molecular weightmelanoma-associated antigen)(HMW-MAA)、HIV包膜蛋白如GP120、HIV MIB gp 120V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMGB-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖蛋白、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(hGH)、人血清白蛋白、人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、亨廷顿蛋白、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IgA、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1、IGF-1R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受体、IL-11、IL-11受体、IL-12、IL-12受体、IL-13、IL-13受体、IL-15、IL-15受体、IL-16、IL-16受体、IL-17、IL-17受体、IL-18(IGIF)、IL-18受体、IL-1α、IL-1β、IL-1受体、IL-2、IL-2受体、IL-20、IL-20受体、IL-21、IL-21受体、IL-23、IL-23受体、IL-2受体、IL-3、IL-3受体、IL-31、IL-31受体、IL-3受体、IL-4、IL-4受体、IL-5、IL-5受体、IL-6、IL-6受体、IL-7、IL-7受体、IL-8、IL-8受体、IL-9、IL-9受体、免疫球蛋白免疫复合体、免疫球蛋白、INF-α、INF-α受体、INF-β、INF-β受体、INF-γ、INF-γ受体、IFN type-I、IFN type-I受体、流感病毒、抑制素、抑制素α、抑制素β、iNOS、胰岛素、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2、胰岛素样生长因子结合蛋白、整联蛋白、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α-V/β-3、整联蛋白α-V/β-6、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α5/β6、整联蛋白ασ(αV)、整联蛋白αθ、整联蛋白β1、整联蛋白β2、整联蛋白β3(GPIIb-IIIa)、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、激肽释放酶结合蛋白、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、kit配体(KL)、Kit酪氨酸激酶、层连蛋白5、LAMP、LAPP(支链淀粉、胰岛淀粉样多肽)、LAP(TGF-1)、潜伏期相关多肽、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受体、LECT2、Lefty、瘦蛋白、促黄体激素(leutinizing hormone)(LH)、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受体、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性剂、促黄体激素、淋巴细胞趋化因子、淋巴毒素β受体、溶性鞘脂受体、Mac-1、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、maspin、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I(MCAF)、M-CSF、MDC、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、megsin、Mer、MET酪氨酸激酶受体家族、金属蛋白酶、膜糖蛋白OX2、间皮蛋白、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、微生物蛋白(microbial protein)、MIF、MIG、MIP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、单核细胞趋化蛋白(monocyte attractant protein)、单核细胞集落抑制因子(monocyte colony inhibitory factor)、小鼠促性腺激素相关(gonadotropin-associated)多肽、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、粘蛋白(Mud)、缪勒氏管抑制物质(MIS)、Mug、MuSK、髓鞘相关糖蛋白、骨髓前体细胞抑制因子-1(MPIF-I)、NAIP、纳米体(Nanobody)、NAP、NAP-2、NCA 90、NCAD、N-钙黏蛋白、NCAM、脑啡肽酶、神经细胞粘附分子、神经丝氨酸蛋白酶抑制剂(neroserpin)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-6、神经毡蛋白1、Neurturin、NGF-β、NGFR、NKG20、N-甲硫氨酰人生长激素、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受体、丙型肝炎病毒衍生的非结构蛋白3型(NS3)、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、制癌蛋白M、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受体、骨诱导因子(osteoinductive factor)、骨桥蛋白、OX40L、OX40R、氧化型LDL、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏蛋白、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受体、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盘生长因子、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、胎盘催乳激素、纤溶酶原活化因子抑制因子-1、血小板生长因子(platelet-growth factor)、plgR、PLP、不同大小的聚乙二醇链(polyglycol chain)(例如、PEG-20、PEG-30、PEG40)、PP14、前激肽释放酶原、朊病毒蛋白、降钙素原、程序性细胞死亡蛋白1、胰岛素原、催乳素、蛋白转换酶PC9、松弛素原(prorelaxin)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、蛋白A、蛋白C、蛋白D、蛋白S、蛋白Z、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-选择素糖蛋白配体-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、松弛素、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞体病毒(RSV)F、Ret、reticulon 4、类风湿因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL SCGF、Sclerostin、SDF-1、SDF1α、SDF1β、SERINE、血清淀粉样蛋白P、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、志贺样毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、鞘氨醇1-磷酸受体1、葡萄球菌的脂磷壁酸、Stat、STEAP、STEAP-II、干细胞因子(SCF)、链激酶、过氧化物歧化酶、黏结蛋白聚糖-1、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TB、TCA-3、T细胞受体α/β、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、生腱蛋白、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性(TGF-βPanSpecific)、TGF-β RII、TGF-β RIIb、TGF-β RIII、TGF-β Rl(ALK-5)、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TGF-I、凝血酶、血小板生成素(TPO)、胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphoprotein)受体、胸腺Ck-1、促甲状腺激素(TSH)、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、组织因子蛋白酶抑制剂、组织因子蛋白、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受体I、TNF受体II、TNF-α、TNF-β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2/DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2/TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R/TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF/TR1)、TNFRSF12(TWEAK RFN14)、TNFRSF12A、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ/TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF Rl CD120a/p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b/p75-80)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRSF25(DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNFRIII/TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35/TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1/APT1/CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68/TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BBCD137/ILA)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体/TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF/OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体/DR3配体)、TNFSF13(APRILTALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体/LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体/TL6)、TNFSF1A(TNF-aConectin/DIF/TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa/TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC/p33)、TNFSF4(OX40配体gp34/TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体/APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒性代谢产物(toxic metabolite)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TGF-α和TGF-β等转化生长因子(TGF)、跨膜型糖蛋白NMB、运甲状腺素蛋白、TRF、Trk、TROP-2、滋养层糖蛋白、TSG、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤相关抗原CA 125、表达Lewis Y相关糖的肿瘤相关抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VAP-1、血管内皮生长因子(VEGF)、vaspin、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEFGR-2、VEGF受体(VEGFR)、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、维生素B12受体、玻连蛋白受体、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德因子(vWF)、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-l-β、XCLl/淋巴细胞趋化肽、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD等。
本发明的抗原结合分子所含的抗体的两个可变区中，作为能够与不同的两个抗原结合但无法同时与这些抗原结合的可变区所结合的“第1抗原”和“第2抗原”，例如优选：在免疫细胞表面分子(例如，T细胞表面分子、NK细胞表面分子、树突状细胞表面分子、B细胞表面分子、NKT细胞表面分子、MDSC细胞表面分子、巨噬细胞类表面分子)、肿瘤细胞、肿瘤的血管、基质细胞等中表达，但在正常组织中也表达的抗原(整联蛋白、组织因子、VEGFR、PDGFR、EGFR、IGFR、MET趋化因子受体、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、CD44、纤连蛋白、DR5、TNFRSF等)，作为“第1抗原”和“第2抗原”的组合，第1抗原和第2抗原的任一方优选为例如在T细胞上特异性地表达的分子、另一方的抗原优选为在T细胞或其它免疫细胞表面表达的分子。作为另外的方案，作为“第1抗原”和“第2抗原”的组合，第1抗原和第2抗原的任一方优选为例如在T细胞上特异性地表达的分子、另一方的抗原优选在免疫细胞上表达、与在前选择的抗原为不同分子。具体而言，例如，作为在T细胞上特异性地表达的分子，可举出：CD3、T细胞受体。特别优选为CD3。作为本发明的抗原结合分子所结合的、CD3的部位，例如，人CD3的情况下，只要是存在于构成人CD3的γ链、δ链或ε链序列的表位即可，可以与任一表位结合。特别优选存在于人CD3复合体的ε链的胞外区的表位。构成CD3的γ链、δ链或ε链的结构，其多核苷酸序列记载于SEQ ID NO:83(NM_000073.2)、85(NM_000732.4)和87(NM_000733.3)中、其多肽序列记载于SEQ ID NO:84(NP_000064.1)、86(NP_000723.1)和88(NP_000724.1)中(括号内显示RefSeq登录号)。进而，作为另一方的抗原，可举出：Fcγ受体、TLR、凝集素、IgA、免疫限制点分子、TNF超家族分子、TNFR超家族分子、NK受体分子。
此外，本发明的抗原结合分子所含的抗体的两个可变区中，作为另一方的可变区所结合的、与在前的“第1抗原”和“第2抗原”不同的“第3抗原”，例如优选肿瘤细胞特异性的抗原，除了伴随细胞的恶性化而表达的抗原之外，还包含细胞癌化时呈现在细胞表面或蛋白质分子上的异常糖链。具体而言，例如可举出：ALK受体(多效生长因子受体)、多效生长因子、KS 1/4胰脏癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸性磷酸、前列腺特异性抗原(PSA)、黑色素瘤相关抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺特异性膜抗原、癌性胚抗原(CEA)、多形上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球抗原、CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1和LEA等的结肠直肠肿瘤相关抗原、伯基特氏淋巴瘤抗原-38.13、CD19、人B淋巴瘤抗原-CD20、CD33、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3等的黑色素瘤特异性抗原、肿瘤特异性移植型细胞表面抗原(TSTA)、T抗原、由DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原等的病毒诱导的肿瘤抗原、结肠的CEA、5T4癌胎儿滋养层糖蛋白和膀胱肿瘤癌胎儿抗原等的癌胎儿抗原α-胎蛋白、人肺癌抗原L6和L20等的分化抗原、纤维肉瘤抗原、人白血病T细胞抗原-Gp37、新生糖蛋白、鞘脂、EGFR(上皮增殖因子受体)等的乳癌抗原、NY-BR-16、NY-BR-16和HER2抗原(p185HER2)、多形上皮粘蛋白(PEM)、恶性人淋巴球抗原-APO-1、胎儿红细胞可见的I抗原等的分化抗原、成人红细胞可见的原始内胚层I抗原、移植前的胚、胃癌可见的I(Ma)、乳腺上皮可见的M18、M39、骨髓细胞可见的SSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、结肠直肠癌可见的D156-22、TRA-1-85(血液群H)、睾丸和卵巢癌可见的SCP-1、结肠癌可见的C14、肺癌可见的F3、胃癌可见的AH6、Y半抗原、胚性癌细胞可见的Ley、TL5(血液群A)、A431细胞可见的EGF受体、胰脏癌可见的E1系列(血液群B)、胚性癌细胞可见的FC10.2、胃癌抗原、腺癌可见的CO-514(血液群Lea)、腺癌可见的NS-10、CO-43(血液群Leb)、A431细胞的EGF受体可见的G49、结肠癌可见的MH2(血液群ALeb/Ley)、结肠癌可见的19.9、胃癌粘蛋白、骨髓细胞可见的T5A7、黑色素瘤可见的R24、胚性癌细胞可见的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、和M1:22:25:8以及4～8细胞阶段的胚可见的SSEA-3和SSEA-4、皮下T细胞淋巴瘤抗原、MART-1抗原、唾液酸化Tn(STn)抗原、结肠癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12突变体A、腺癌抗原ART1、肿瘤伴随性相关脑-睾丸癌抗原(癌神经元抗原MA2、肿瘤伴随性神经元抗原)、神经癌腹部抗原2(NOVA2)、血液细胞癌抗原基因520、肿瘤相关抗原CO-029、肿瘤相关抗原MAGE-C1(癌/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b和MAGE-X2、癌睾丸抗原(NY-EOS-1)、YKL-40和上述多肽的任意片段或对它们进行修饰的结构等(上述的修饰磷酸基或糖链等)、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、唾液酸化SSEA-1(SLX)、HER2、PSMA、CEA、CLEC12A等。
本发明的抗原结合分子可通过本领域技术人员公知的方法来制备。例如，抗体可通过以下的方法来制作，但不限于此。用于将编码所分离的多肽的基因导入适当的宿主来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达体系均可用于分离本发明的抗原结合分子。将真核细胞用作宿主细胞时，可适宜使用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。具体而言，动物细胞可示例下述的细胞。
(1)哺乳类细胞：CHO(Chinese hamster ovary cell line)、COS(Monkey kidneycell line)、骨髓瘤细胞(Sp2/O、NS0等)、BHK(baby hamster kidney cell line)、HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus(Ad)5DNA)、PER.C6细胞(human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5(Ad5)E1A and E1Bgenes)、Hela、Vero等(Current Protocols in Protein Science(May,2001,Unit 5.9,Table5.9.1))
(2)两栖类细胞：非洲爪蟾卵母细胞等
(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等
此外，抗体也可利用大肠杆菌(mAbs 2012 Mar-Apr；4(2):217-225.)或酵母(WO2000023579)来制作。利用大肠杆菌制作的抗体没有添加糖链。而利用酵母制作的抗体添加有糖链。
使编码抗体重链的DNA且编码可变区中的1个或多个氨基酸残基取代成目标的其它氨基酸的重链的DNA和编码抗体轻链的DNA表达。编码可变区中的1个或多个氨基酸残基取代成目标的其它氨基酸的重链或轻链的DNA，例如可如下获得：获取编码针对某种抗原使用公知的方法而制作的抗体可变区的DNA，通过导入适宜取代使该区中编码特定氨基酸的密码子编码目标的其它氨基酸而获得。
此外，事先设计编码针对某种抗原使用公知的方法而制作的抗体可变区中的1个或多个氨基酸残基取代成目标的其它氨基酸的蛋白质的DNA，通过化学性地合成该DNA，也可获得编码可变区中的1个或多个氨基酸残基取代成目标的其它氨基酸的重链的DNA。作为氨基酸的取代部位、取代种类，没有特别限定。作为用于氨基酸改变的优选区，可举出：可变区中的溶剂暴露区和环区。其中，优选CDR1、CDR2、CDR3、FR3区、环区。具体而言，优选H链可变区的Kabat编号31～35、50～65、71～74、95～102，L链可变区的Kabat编号24～34、50～56、89～97，更优选H链可变区的Kabat编号31、52a～61、71～74、97～101，L链可变区的Kabat编号24～34、51～56、89～96。
此外，氨基酸改变不限于取代，可以是缺失、添加、插入、或修饰的任一种、或者它们的组合。
此外，编码可变区中的1种或多个氨基酸残基取代成目标的其它氨基酸的重链的DNA，可区分为部分DNA进行制备。作为部分DNA的组合，例如可举出：编码可变区的DNA和编码恒定区的DNA、或者编码Fab区的DNA和编码Fc区的DNA等，但不限于这些组合。此外，编码轻链的DNA也同样地可区分为部分DNA进行制备。
作为使上述DNA表达的方法，可举出以下的方法。例如，将编码重链可变区的DNA与编码重链恒定区的DNA一起整合(重组)至表达载体中，来构建重链表达载体。同样地，将编码轻链可变区的DNA与编码轻链恒定区的DNA一起整合至表达载体中，来构建轻链表达载体。也可以将这些重链、轻链的基因整合至单一的载体中。
将编码目标抗体的DNA整合至表达载体时，使其在表达控制区、例如增强子、启动子的控制下表达而整合至表达载体中。其次，用该表达载体转化宿主细胞而使抗体表达。此时，可以使用适当的宿主和表达载体的组合。
作为载体的实例，可举出：M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。此外，以cDNA的亚克隆、切除为目的的情况下，除了上述载体之外，还可以使用：例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。
以生产本发明的抗体为目的而使用载体的情况下，表达载体特别有用。作为表达载体，例如，以宿主为JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等的大肠杆菌的情况下，在大肠杆菌中持有可有效表达的启动子、例如lacZ启动子(Ward等人,Nature(1989)341,544-546；FASEBJ.(1992)6,2422-2427，其全部内容作为参照结合到本说明书中)、araB启动子(Better等人,Science(1988)240,1041-1043，其全部内容作为参照结合到本说明书中)、或T7启动子等是不可缺少的。作为这样的载体，除了上述载体之外，可举出：pGEX-5X-1(Pharmacia公司制造)、“QIAexpress system”(QIAGEN公司制造)、pEGFP、或pET(在该情况下，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。
此外，在载体中还可以包含用于多肽分泌的信号序列。作为用于多肽分泌的信号序列，在大肠杆菌的周质中产生的情况下，可以使用pelB信号序列(Lei,S.P.等人J.Bacteriol.(1987)169,4397，其全部内容作为参照结合到本说明书中)。向宿主细胞中导入载体可以使用例如脂质体法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法来进行。
除了大肠杆菌表达载体之外，例如，作为本发明的用于制备多肽的载体，可举出：来源于哺乳动物的表达载体(例如，pcDNA3(Invitrogen公司制造)或、pEGF-BOS(NucleicAcids.Res.1990,18(17),p5322，其全部内容作为参照结合到本说明书中)、pEF、pCDM8)、来源于昆虫细胞的表达载体(例如，“Bac-to-BAC baculovirus expression system)(GIBCOBRL公司制造)、pBacPAK8)、来源于植物的表达载体(例如，pMH1、pMH2)、来源于动物病毒的表达载体(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、来源于反转录酶病毒的表达载体(例如，pZIPneo)、来源于酵母的表达载体(例如，“Pichia Expression Kit”(Invitrogen公司制造)、pNV11、SP-Q01)、来源于枯草菌的表达载体(例如，pPL608、pKTH50)。
以在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞、HEK293细胞等动物细胞中的表达为目的的情况下，在细胞内持有用于表达所必要的启动子、例如SV40启动子(Mulligan等人,Nature(1979)277,108，其全部内容作为参照结合到本说明书中)、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人,Nucleic Acids Res.(1990)18,5322，其全部内容作为参照结合到本说明书中)、CAG启动子(Gene.(1991)108,193，其全部内容作为参照结合到本说明书中)、CMV启动子等是不可缺少的，进一步优选可具有用于筛选转化细胞的基因(例如，通过药物(新霉素、G418等)能够判别的耐药基因)。作为具有这样特性的载体，例如可举出：pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。进而，也有以增加基因的拷贝数为目的而使EBNA1蛋白共表达的情况，在该情况下，使用具有复制起点OriP的载体(Biotechnol Bioeng.2001Oct20；75(2):197-203.、Biotechnol Bioeng.2005Sep 20；91(6):670-7.)。
进而，在以使基因稳定地表达、且在细胞内的基因拷贝数的扩增为目的的情况下，可举出：向缺失核酸合成途径的CHO细胞中导入具有与其互补的DHFR基因的载体(例如，pCHOI等)，通过甲氨蝶呤(MTX)进行扩增的方法，此外，以基因的瞬时表达为目的的情况下，可举出：使用在染色体上持有表达SV40 T抗原的基因的COS细胞，用持有SV40的复制起点的载体(pcD等)进行转化的方法。作为复制起点，还可以使用来源于多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。进而，为了在宿主细胞系内进行基因拷贝数的扩增，表达载体作为选择标记，可以含有氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
抗体的回收例如可以通过在培养已转化的细胞后，从进行了分子转化的细胞的细胞内或培养液中分离来进行。在抗体的分离、纯化中，可以适当地组合离心、硫酸铵分级、盐析、超滤、C1q、FcRn、蛋白A柱、蛋白G柱、亲和性柱层析、离子交换柱层析、凝胶过滤层析等方法来进行。
作为多特异性抗体的有效制作方法，可以采用Knobs-into-holes技术(WO1996/027011、Ridgway JB等人.,Protein Engineering(1996)9,617-621、Merchant AM等人.Nature Biotechnology(1998)16,677-681)或导入电荷排斥以抑制非目标的H链彼此之间的缔合的技术(WO2006/106905)等的上述技术。
进而，本发明提供本发明的抗原结合分子的制备方法，所述抗原结合分子包含：可与两个不同的第1抗原和第2抗原结合且不同时与第1抗原和第2抗原结合的可变区(第1可变区)、和与不同于该第1抗原和第2抗原的第3抗原结合的可变区(第2可变区)，该方法包括：制作该第1可变区的氨基酸序列多样化的抗原结合分子文库的步骤。
例如可举出包括以下步骤的制备方法：
步骤(i)：制作抗原结合分子的文库，所述抗原结合分子为改变了与第1抗原或第2抗原结合的抗体可变区的至少1个氨基酸的抗原结合分子，其包含该所改变的可变区的至少1个氨基酸彼此不同的可变区；
步骤(ii)：从所制作的文库中选择包含对第1抗原和第2抗原具有结合活性、但不同时与该第1抗原和第2抗原结合的可变区的抗原结合分子；
步骤(iii)：培养含有编码通过步骤(ii)选择的抗原结合分子的该可变区的核酸、和/或编码与第3抗原结合的抗原结合分子的可变区的核酸的宿主细胞，使含有可与第1抗原和第2抗原结合但不同时与该第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区、和/或与第3抗原结合的可变区的抗原结合分子表达；以及
步骤(iv)：从上述宿主细胞培养物中回收抗原结合分子。
需要说明的是，在本制备方法中，步骤(ii)可以是以下的选择步骤：
步骤(v)：从所制作的文库中选择包含对于第1抗原和第2抗原具有结合活性但不同时与在各自不同细胞上表达的第1抗原和第2抗原结合的可变区的抗原结合分子。
上述步骤(i)使用的抗原结合分子只要含有抗体可变区则没有特别限定，可以是Fv、Fab、Fab’等的抗体片段，也可以是含有Fc区的抗体。
作为待改变的氨基酸，例如，在与第1抗原或第2抗原结合的抗体可变区中，选择通过氨基酸改变而不丧失与该抗原结合的氨基酸。
本发明的氨基酸改变可以单独使用，也可以多个组合来使用。
多个组合来使用的情况下，组合的数目没有特别限定，例如为2个以上30个以下、优选2个以上25个以下、2个以上22个以下、2个以上20个以下、2个以上15个以下、2个以上10个以下、2个以上5个以下、2个以上3个以下。
多个组合的情况下，也可以只对抗体的重链可变区或轻链可变区加入该氨基酸的改变，也可以将该氨基酸改变适当分配添加到重链可变区和轻链可变区的双方作为用于氨基酸改变的优选区，可举出：可变区中的溶剂暴露区和环区。其中，优选CDR1、CDR2、CDR3、FR3区、环区。具体而言，优选H链可变区的Kabat编号31～35、50～65、71～74、95～102，L链可变区的Kabat编号24～34、50～56、89～97，更优选H链可变区的Kabat编号31、52a～61、71～74、97～101，L链可变区的Kabat编号24～34、51～56、89～96。
此外，在氨基酸残基中加入改变还包括下述情形：在与第1抗原或第2抗原结合的抗体可变区中，随机地改变上述的区的氨基酸，或者，在上述区中插入事先已知对所期望的抗原具有结合活性的肽。如此操作，从加入了改变的抗原结合分子中选择可与第1抗原和第2抗原结合、但无法同时与这些抗原结合的可变区，从而可以获得本发明的抗原结合分子。作为事先已知对所期望的抗原具有结合活性的肽的实例，可举出上述表1所示的肽。
是否是可与第1抗原和第2抗原结合、但无法同时与这些抗原结合的可变区，以及，是否是在第1抗原和第2抗原的任意一方存在于细胞上而另一方单独存在的情况下、两方单独存在的情况下、或者两方存在于同一细胞上的情况下可同时与第1抗原和第2抗原这两方结合、但在各自在不同的细胞上表达的情况下无法同时与这两方结合的可变区，可以按照上述方法同样地进行确认。
进而，本发明还提供制备本发明的抗原结合分子的方法，所述抗原结合分子包含：可与不同的两个第1抗原和第2抗原结合、且不同时与第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区(第1可变区)，该制备方法包括：制作该第1可变区的氨基酸序列多样化的抗原结合分子文库的步骤。
作为这样的抗原结合分子的制备方法，例如可举出包括以下步骤的制备方法：
步骤(i)：制作抗原结合分子的文库，所述抗原结合分子为改变了与第1抗原或第2抗原结合的抗体可变区的至少1个氨基酸的抗原结合分子，其包含该所改变的可变区的至少1个氨基酸彼此不同的可变区；
步骤(ii)：从所制作的文库中选择包含对第1抗原和第2抗原具有结合活性、但不同时与该第1抗原和第2抗原结合的可变区的抗原结合分子；
步骤(iii)：培养含有编码通过步骤(ii)选择的抗原结合分子的该可变区的核酸，使含有可与第1抗原和第2抗原结合但不同时与该第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区的抗原结合分子表达；以及
步骤(iv)：从上述宿主细胞培养物中回收抗原结合分子。
需要说明的是，作为用于上述氨基酸改变的优选区，可举出重链可变区。进一步优选可举出：可变区中的溶剂暴露区和环区。其中，优选CDR1、CDR2、CDR3、FR3区、环区。具体而言，优选H链可变区的Kabat编号31～35、50～65、71～74、95～102，L链可变区的Kabat编号24～34、50～56、89～97，更优选H链可变区的Kabat编号31、52a～61、71～74、97～101，L链可变区的Kabat编号24～34、51～56、89～96。
需要说明的是，在本制备方法中，上述步骤(ii)可以是以下的选择步骤：
步骤(v)：从所制作的文库中选择含有对于第1抗原和第2抗原具有结合活性但不同时与在各自不同细胞上表达的第1抗原和第2抗原结合的可变区的抗原结合分子。
上述步骤(i)中使用的抗原结合分子只要含有抗体可变区则没有特别限定，可以是Fv、Fab、Fab’等的抗体片段，也可以是含有Fc区的抗体。
作为待改变的氨基酸，例如，在与第1抗原或第2抗原结合的抗体可变区中，选择通过氨基酸改变而不丧失与该抗原结合的氨基酸。
本发明的氨基酸改变可以单独使用，也可以多个组合来使用。
多个组合来使用的情况下，组合的数目没有特别限定，例如为2个以上30个以下、优选2个以上25个以下、2个以上22个以下、2个以上20个以下、2个以上15个以下、2个以上10个以下、2个以上5个以下、2个以上3个以下。
多个组合的情况下，也可以只对抗体的重链可变区或轻链可变区的任一方加入该氨基酸的改变，也可以将该氨基酸改变适当分配添加到重链可变区和轻链可变区的双方。
此外，在氨基酸残基中加入改变还包括下述情形：在与第1抗原或第2抗原结合的抗体的可变区中，随机改变上述的区的氨基酸；或者，在上述区中插入事先已知对所期望的抗原具有结合活性的肽。如此操作，从加入了改变的抗原结合分子中选择可与第1抗原和第2抗原结合、但无法同时与这些抗原结合的可变区，从而可以获得本发明的抗原结合分子。作为事先已知对所期望的抗原具有结合活性的肽的实例，可举出上述表1所示的肽。
是否是可与第1抗原和第2抗原结合、但无法同时与这些抗原结合的可变区，以及，是否是在第1抗原和第2抗原的任意一方存在于细胞上而另一方单独存在的情况下、两方单独存在的情况下、或者两方存在于同一细胞上的情况下可同时与第1抗原和第2抗原这两方结合、但在各自在不同的细胞上表达的情况下无法同时与这两方结合的可变区，可以按照上述方法同样地进行确认。
进而，通过该制备方法制备的抗原结合分子与包含在本发明中。
对通过本方法导入的氨基酸改变的种类或范围没有特别限定。
作为本发明文库的一个非限定性的一个方案，可举出：选择CD3(当为人CD3时，是指构成人CD3的γ链、δ链或ε链)作为第1抗原，由与CD3和任意的第2抗原结合的抗原结合分子构成的文库。
在本说明书中，“文库(library)”是指，多个抗原结合分子或含有抗原结合分子的多个融合多肽、或者编码这些序列的核酸、多核苷酸。文库中所含的多个抗原结合分子或含有抗原结合分子的多个融合多肽的序列不是单一序列，是序列互不相同的抗原结合分子或含有抗原结合分子的融合多肽。
在本发明的一个实施方案中，能够制作本发明的抗原结合分子与异种多肽的融合多肽。在某一实施方式中，融合多肽能够与病毒外壳蛋白、例如选自pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI及其突变体的病毒外壳蛋白的至少一部分融合。
在某一实施方式中，本发明的抗原结合分子可以是ScFv、Fab片段、F(ab)2或F(ab’)2，因此在另一个实施方式中提供一种文库，所述文库主要由身为这些抗原结合分子与异种多肽的融合多肽且序列互不相同的多种融合多肽构成。具体而言，提供一种主要由这些抗原结合分子与病毒外壳蛋白、例如选自pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI及其突变体的病毒外壳蛋白的至少一部分融合获得的且序列互不相同的多种融合多肽构成的文库。本发明的抗原结合分子还可以包含二聚体化结构域。在某一实施方式中，上述二聚体化结构域可存在于抗体的重链或轻链的可变区与至少一部分病毒外壳蛋白之间。在该二聚体化结构域中，可以包含至少一个二聚体化序列、和/或含1个或多个半胱氨酸残基的序列。该二聚体化结构域优选能够与重链可变区或恒定区的C末端连接。根据是否是以与病毒的外壳蛋白成分形成的融合多肽成分的形式制作了上述抗体可变区(在二聚体化结构域的后面没有琥珀终止密码子)，或者，根据是否是主要不含病毒外壳蛋白成分而制作了上述抗体可变区(例如，在二聚体化结构域的后面具有琥珀终止密码子)，二聚体化结构域可以形成各种结构。主要以与病毒的外壳蛋白成分形成的融合多肽的形式制作上述抗体可变区时，通过1个或多个二硫键和/或单一的二聚体化序列实现二价提示。
在本说明书中，序列互不相同的多种抗原结合分子的记载中的“序列互不相同”这一术语意指文库中的各抗原结合分子的序列互不相同。即，文库中的互不相同的序列的数目反映文库中序列不同的独立克隆的数目，有时也被视为“文库大小”。普通的噬菌体展示文库为106至1012，通过使用核糖体展示法等公知的技术，可将文库大小放大至1014。然而，噬菌体文库的淘选选择时使用的噬菌体颗粒的实际数目通常比文库大小大10至10,000倍。该过量倍数也称为“文库当量数”，表示能够存在10至10,000个具有相同氨基酸序列的各克隆。因此，本发明中的“序列互不相同”这一术语意指文库当量数除外的文库中的各抗原结合分子的序列彼此相同，更具体意指存在106至1014个、优选107至1012个、进一步优选108至1011个、特别优选108至1010个序列互不相同的抗原结合分子。
进而，本发明的主要由多个抗原结合分子形成的文库的记载中的“主要由...形成”的表述反映出文库中序列不同的独立克隆的数目中，抗原结合分子对于第1和/或第2抗原的结合活性不同的抗原结合分子的数目。具体而言，优选显示出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在104个分子。此外，更优选本发明提供显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在105分子的文库。进一步优选本发明提供显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在106个分子的文库。特别优选本发明提供显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在107个分子的文库。还优选本发明提供显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在108个分子的文库。在其它的表述中，也可适宜地表述为文库中的序列不同的独立克隆的数目中，抗原结合分子对于第一和/或第2抗原的结合活性不同的抗原结合分子的比例。具体而言，本发明提供显示出这种结合活性的抗原结合分子占文库中序列不同的独立克隆的数目的0.1％～80％、优选0.5％～60％、更优选1％～40％、进一步优选2％～20％、特别优选4％～10％的文库。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也与上述相同，可以用分子的数目或全部分子中的比例来表述。此外，病毒的情形也与上述相同，可以用病毒个体的数目或全部个体中的比例来表述。
在本说明书中，“噬菌体展示”是指以在噬菌体、例如丝状噬菌体的颗粒表面与至少一部分外壳蛋白融合而获得的蛋白的形式呈递突变体多肽的方法。噬菌体展示的有效性在于：可以从随机化蛋白突变体的大的文库中迅速、有效地挑选以高亲和性与对象抗原结合的序列。噬菌体上的肽和蛋白质文库的呈递被用于涉及特异性结合特性来筛选上百万个多肽。多价噬菌体展示方法被用于通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII的融合来呈递小的随机肽和小蛋白(Wells和Lowman(Curr.Opin.Struct.Biol.(1992)3,355-362)和其中的引用文献)。在一价噬菌体展示中，蛋白质或肽的文库与基因III或其一部分融合，在天然型基因III蛋白质的存在下以低水平表达，使噬菌体颗粒呈递融合蛋白的1个或0个拷贝。与多价噬菌体相比亲和效果降低，因此在挑选时根据内源性配体亲和性使用噬菌粒载体，但该载体会使DNA操作简化(Lowman和Wells、Methods：A Companion to Methods inEnzymology(1991)3,205-216)。
“噬菌粒”是指具有细菌的复制起点、例如ColE1和噬菌体的基因间区的拷贝的质粒载体。噬菌粒还可以适当使用任何公知的噬菌体、例如丝状噬菌体和λ型噬菌体的噬菌粒。质粒通常还包含抗生素耐性的选择标记。克隆到这些载体中的DNA片段能够作为质粒进行增殖。当导入有这些载体的细胞具备生产噬菌体颗粒所必需的全部基因时，质粒的复制方式变化为滚环式复制，生成质粒DNA的一个链的拷贝和包装噬菌体颗粒。噬菌粒能够形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。此术语包括一种噬菌粒，该噬菌粒包含以异种多肽在噬菌体颗粒表面呈递的方式进行基因融合而与此异种多肽的基因结合了的噬菌体外壳蛋白基因或其片段。
术语“噬菌体载体”是指含有异种基因且能够复制的噬菌体的双链复制型。噬菌体载体具有可以复制噬菌体和形成噬菌体颗粒的噬菌体复制起点。噬菌体优选丝状噬菌体、例如M13、f1、fd、Pf3噬菌体或其衍生物、或λ型噬菌体、例如λ、21、phi80、phi81、82、424、434、其它、或其衍生物。
“寡核苷酸”是指通过公知的方法(例如，固相法、例如采用了EP266032中记载的方法的磷酸三酯、亚磷酸盐、或亚磷酰胺化学、或通过Froeshler等人(Nucl.Acids.Res.(1986)14,5399-5407)中记载的脱氧核苷酸H-膦酸盐中间体的方法)化学合成的较短的单链或双链多脱氧核苷酸。在其它方法中，包括以下记载的聚合酶链反应和其它的自动引物法、和固体载体上的寡核苷酸合成。所有的这些方法均记载在Engels等人(Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.(1989)28,716-734)中。如果基因的全部核酸序列都是公知的、或者如果可以利用与编码链互补的核酸序列，则采用这些方法。或者，如果对象氨基酸序列是公知的，则各氨基酸残基是公知的，使用优选的编码残基，能够适当推测可能的核酸序列。寡核苷酸可以通过聚丙烯酰胺凝胶或者分子填料柱、或者通过沉淀法进行纯化。
术语“融合蛋白”和“融合多肽”是指具有通过共价键相互结合的两个部分的多肽，各部分具有不同的特性。该特性例如可以是体外或体内活性等生物学性质。此外，该特性甚至还可以是单一的化学或物理性质、例如与对象抗原的结合、反应的催化等。这两个部分可以通过单一的肽键直接结合、或者经由包含1个或多个氨基酸残基的肽接头进行结合。通常，这两个部分和接头存在于相同的读取框中。优选多肽的两个部分由异种或不同的多肽获得。
术语“外壳蛋白”是指蛋白中至少其中一部分存在于病毒颗粒表面的蛋白。从功能方面考虑，外壳蛋白是在宿主细胞中的病毒的构建过程中与病毒颗粒结合的任意蛋白，病毒与其结合直至感染其它的宿主细胞。外壳蛋白既可以是主要外壳蛋白，也可以是次要外壳蛋白。次要外壳蛋白通常是指存在于病毒外壳的外壳蛋白，优选每1个毒粒中存在至少约5个、更优选至少约7个、更优选至少约10个或其以上的蛋白的拷贝。主要外壳蛋白在每一毒粒中可以存在数十、数百或数千个拷贝。作为主要外壳蛋白的实例，可举出丝状噬菌体的p8蛋白。
作为本发明的一个非限定性方案，示例以下6种制作文库的方法。
方法1：向与第1抗原结合的抗原结合分子中插入与第2抗原结合的肽(该术语以包含多肽和蛋白的方式使用)；
方法2：制作文库使各种氨基酸呈现在可将抗原结合分子中的环改长(延长)的位点，以抗原结合活性为指标，从文库中获取对任意的第2抗原具有结合活性的抗原结合分子；
方法3：利用通过位点定向诱变法制作的抗体，从事先已知与第1抗原结合的抗原结合分子中鉴定维持与第1抗原的结合活性的氨基酸，再以抗原结合活性为指标，从所鉴定的呈现氨基酸的文库中获取对任意的第2抗原具有结合活性的抗原结合分子；
方法4：在方法3中，进一步制作抗体文库使各种氨基酸呈现在可使抗原结合分子中的环改长(延长)的位点，以抗原结合活性为指标，从文库中获取对任意的第2抗原具有结合活性的抗原结合分子；
方法5：在方法1、2、3或4中，进行改变使添加有糖链的序列(例如NxS、NxT，其中x为P以外的氨基酸)呈现，并添加糖链受体所识别的糖链(例如，添加高甘露糖型糖链，其被高甘露糖受体识别。已知高甘露糖型糖链通过在抗体表达时添加几夫碱而获得(MAbs.2012Jul-Aug；4(4):475-87))；
方法6：在方法1、2、3或4中，在环位点或可改变成各种氨基酸的位点插入或取代Cys、Lys或非天然氨基酸，再通过共价键添加与第2抗原结合的结构域(这是一种抗体药物缀合物所代表的方法，是通过共价键与Cys、Lys或非天然氨基酸结合的方法(mAbs6:1,34-45；January/February 2014；WO2009/134891A2；Bioconjug Chem.2014Feb 19；25(2):351-61))
需要说明的是，在上述示例的6个文库制作方法中，取代抗原结合分子中的氨基酸的位点或向抗原结合分子中插入肽的位点，优选抗原结合分子的Fab或可变区部分。作为优选区，可举出：可变区中的溶剂暴露区和环区。其中，优选CDR1、CDR2、CDR3、FR3区、环区。具体而言，优选H链可变区的Kabat编号31～35、50～65、71～74、95～102，L链可变区的Kabat编号24～34、50～56、89～97，更优选H链可变区的Kabat编号31、52a～61、71～74、97～101，L链可变区的Kabat编号24～34、51～56、89～96。
作为上述方法1.中记载的、向与第1抗原结合的抗原结合分子中插入与第2抗原结合的肽的方法的一个方案，还可举出：如Angew Chem Int Ed Engl.2013Aug 5；52(32):8295-8中所示例插入G-CSF的方法。作为另一方案，待插入的肽可从呈递有肽的文库中获取，还可利用天然存在的蛋白全体或其一部分。
为了鉴定维持与作为第1抗原的CD3(当为人CD3时，是指构成人CD3的γ链、δ链或ε链)的结合活性的氨基酸，例如，可以进行被认为参与抗原结合的位点的氨基酸改变，制作1个氨基酸改变抗体以进行判断。在1个氨基酸改变抗体的CD3结合评价中，可以适宜选择本领域技术人员所公知的方法，例如，可通过ELISA或FACS(fluorescence activated cellsorting)、ALPHA筛选(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用了表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等来测定。
在鉴定维持与CD3的结合活性的氨基酸时，对于改变前的抗体，可以采用例如各种改变体的结合量的比例的结果。即，可以采用以改变前的抗体的结合量为X、以1个氨基酸改变体的结合量为Y时的Z(结合量的比例)＝Y/X的值。Z(结合量的比例)为0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、0.9以上、优选0.8以上时，可以认为维持与改变前的抗体的结合。可以制造抗体文库，以呈现维持这些结合的氨基酸。
ECM(Extracellular matrix；细胞外基质)是细胞外的构成成分之一，存在于生物体内的各部位。因此，已知与ECM强力结合的抗体的血中动力学会变差(半衰期变短)(WO2012093704A1)。于是，关于在抗体文库中呈现的氨基酸，也优选不增强ECM结合的氨基酸。
在选择ECM结合未增强的氨基酸时，例如，按照参考实施例2的方法评价了ECM结合，可以采用用各改变体的ECM结合值(ECL response；ECL响应值)除以MRA(H链SEQ ID NO:57、L链SEQ ID NO:58)的抗体ECM结合值而得到的值。考虑到多个改变所产生的ECM结合增强效果，该值可以采用5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、直至30倍作为有效值，但优选采用最多10倍作为有效值用于文库。可以制作抗体文库，以呈现如此选择的氨基酸。
需要说明的是，虽然并不限于此，但在CDR3中的肽插入为6个氨基酸的情况下，若在CDR3伸长的环内包含多个侧链具有正电荷的氨基酸时，与ECM的结合增强，因此优选在环内不呈现侧链具有3个以上的正电荷的氨基酸。
本发明的文库，为了增加文库的多样性可以在可变区插入肽。作为用于肽插入的优选区，可举出：可变区中的溶剂暴露区和环区。其中，优选CDR1、CDR2、CDR3、FR3区、环区。具体而言，优选H链可变区的Kabat编号31～35、50～65、71～74、95～102，L链可变区的Kabat编号24～34、50～56、89～97，更优选H链可变区的Kabat编号31、52a～61、71～74、97～101，L链可变区的Kabat编号24～34、51～56、89～96。进一步优选H链可变区的Kabat编号99-100的区。此外，在氨基酸改变时，可以将使与抗原的结合活性提高的氨基酸组合导入。
作为本发明的非限定的一个方案，待插入的肽的长度可举出：1～3个氨基酸、4～6个氨基酸、7～9个氨基酸、10～12个氨基酸、13～15个氨基酸、15～20个氨基酸、21～25个氨基酸，但优选为1～3个氨基酸、4～6个氨基酸、7～9个氨基酸。
用于增强文库的多样性的肽的插入位点和长度的研究，可通过制作插入有肽的分子，并评价该分子与CD3的结合来实施。评价中可适宜选择本领域技术人员公知的方法，例如，可通过ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)、ALPHA筛选(AmplifiedLuminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用了表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等来测定。
作为本发明非限定的一个方案，用于获取与CD3和第2抗原结合的抗体的抗体文库可如下进行设计。
步骤1：选择保持着CD3结合能力的氨基酸(CD3结合量为未改变抗体的80％以上)
例如，可以制作使步骤1中选择的氨基酸呈现、用于获取与CD3和第2抗原结合的抗体的文库。
作为本发明非限定的一个方案，用于获取与CD3和第2抗原结合的抗体的抗体文库可如下进行设计。
步骤1：选择保持着CD3结合能力的氨基酸(CD3结合量为未改变抗体的80％以上)
步骤2：在H链CDR3的99-100(Kabat编号)之间插入氨基酸例如，除了步骤1之外，通过在步骤2中向CDR3区插入氨基酸，可以制作增强了文库的多样性的用于获取与CD3和第2抗原结合的抗体的文库。
作为本发明的非限定的一个方案，用于获取与CD3和第2抗原结合的抗体的抗体文库可如下进行设计。
步骤1：选择保持着CD3结合能力的氨基酸(CD3结合量为未改变抗体的80％以上)；
步骤2：选择与改变前相比ECM结合为MRA结合的10倍以内的氨基酸；
步骤3：在H链CDR3的99-100(Kabat编号)之间插入氨基酸。
例如，除了步骤1和3之外，通过加入步骤2，在文库中呈现的氨基酸，也可选择ECM结合未增强的氨基酸，但不限于该方法。此外，即使是不经过步骤2的文库设计，也可以对从文库中获取的抗原结合分子测定ECM结合并进行评价。
作为本发明的非限定的一个方案，使用VH区CE115HA000(SEQ ID NO:52)作为CD3(CD3ε)结合抗体的模板序列的情况下，作为用于文库设计的氨基酸，可示例：重链可变区中包含的Kabat编号11位、31位、52a位、52b位、52c位、53位、54位、56位、57位、61位、72位、78位、98位、99位、100位、100a位、100b位、100c位、100d位、100e位、100f位、100g位、101位中任一个以上的氨基酸等。
优选向VH区CE115HA000(SEQ ID NO:52)中加入V11L/L78I氨基酸改变的上述文库，但不限于此。进而，优选向VH区CE115HA000(SEQ ID NO:52)中加入V11L/D72A/L78I/D101Q氨基酸改变的上述文库，但不限于此。
作为本发明的非限定的一个方案，在使用VL区GLS3000(SEQ ID NO:53)作为CD3(CD3ε)结合抗体的模板序列的情况下，作为用于文库设计的氨基酸，可示例：轻链可变区中包含的Kabat编号24位、25位、26位、27位、27a位、27b位、27c位、27e位、30位、31位、33位、34位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、74位、77位、89位、90位、92位、93位、94位、96位、107位中任一个以上的氨基酸等。
本发明中的设计(design)文库包含：利用例如NNK或TRIM Library等(Gonzalez-Munoz A等人,MAbs 2012,Lee CV等人,J Mol Biol.2004,Knappik A.等人,JMolBiol.2000,Tiller T等人,MAbs 2013)的公知的文库技术，设计包含特定部位的氨基酸改变成所期望的氨基酸的抗原结合结构域、或包含含有抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的文库，不特别限定于该方案。
本发明中的“1个或多个氨基酸”不特别限定氨基酸的数目，可以是2种以上的氨基酸、5种以上的氨基酸、10种以上的氨基酸、15种以上的氨基酸或20种的氨基酸。
关于融合多肽的呈递，抗原结合分子的可变区的融合多肽可以通过各种方案在细胞、病毒或噬菌粒颗粒的表面上呈递。这些方案中包含单链Fv片段(scFv)、F(ab)片段和这些片段的多价形态。多价形态优选为ScFv、Fab或F(ab’)的二聚体，这些二聚体在本说明书中分别指(ScFv)2、F(ab)2和F(ab’)2。多价形态的呈递所优选的理由之一在于以下方面：通过多价形式的呈递，通常可鉴定低亲和性的克隆；或者可更有效地选择在选择过程中稀有的克隆的具有多个抗原结合部位。
在噬菌体的表面使含有抗体片段的融合多肽呈递的方法在该技术领域是公知的，例如记载于WO1992001047和本说明书中。此外，在WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236和1993019172中也记载了相关的方法，本领域技术人员可以适宜使用这些方法。在其它的公知文献(H.R.Hoogenboom&G.Winter(1992)J.Mol.Biol.227,381-388、WO1993006213和WO1993011236)中，显示出：使用人工重排的可变区基因全部组成成分鉴定针对在噬菌体表面呈递的各种抗原的抗体。
在用于scFv方案中的呈递而构建载体的情况下，编码抗原结合分子的轻链可变区和重链可变区的核酸序列包含在该载体中。通常，编码抗原结合分子的重链可变区的核酸序列与病毒外壳蛋白构成成分融合。编码抗原结合分子的轻链可变区的核酸序列通过编码肽接头的核酸序列与抗原结合分子的重链可变区连接。肽接头通常含有约5～15个氨基酸。例如对纯化或检测有利的编码标记的其它序列可任选与编码抗原结合分子的轻链可变区或抗原结合分子的重链可变区的任一方或两方的核酸序列的3’末端融合。
在用于F(ab)方案中的呈递而构建载体的情况下，编码抗原结合分子的可变区和抗原结合分子的恒定区的核酸序列包含在该载体中。编码轻链可变区的核酸序列与编码轻链恒定区的核酸序列融合。编码抗原结合分子的重链可变区的核酸序列与编码重链恒定CH1区的核酸序列融合。通常，编码重链可变区和恒定区的核酸序列与编码病毒外壳蛋白的全部或一部分的核酸序列融合。重链可变区和恒定区优选以与病毒外壳蛋白的至少一部分的融合体的形式表达，轻链可变区和恒定区与重链病毒外壳融合蛋白分别表达。重链和轻链的相互结合，该结合可以是共价键也可以是非共价键。例如对纯化或检测有利的编码多肽标记的其它序列可任选与编码抗原结合分子的轻链恒定区的核酸序列的3’末端或编码抗原结合分子的重链恒定区的核酸序列的3’末端的任一方或两方融合。
关于向宿主细胞中导入载体，上述构建的载体为了扩增和/或表达而导入到宿主细胞中。载体可通过包含电穿孔、磷酸钙沉淀等在内的公知转化法导入到宿主细胞中。载体为病毒之类的感染性颗粒的情况下，载体本身侵入到宿主细胞中。通过用插入有编码融合蛋白的多核苷酸的能够复制的表达载体转染宿主细胞和用公知的方法生产噬菌体颗粒，可使融合蛋白呈递于噬菌体颗粒的表面。
能够复制的表达载体使用各种方法可导入到宿主细胞中。在非限定的一个实施方案中，载体如WO2000106717中所记载可使用电穿孔法导入到细胞中。细胞在标准培养液中、37℃下任意培养约6～48小时(或者，使OD600nm达到0.6～0.8)，接下来，通过离心分离培养液(例如，通过倾析)取出培养上清。在纯化的初期阶段，优选使细胞团块再悬浮于缓冲液(例如，1.0mM的HEPES(pH7.4))中。接下来，通过再次的离心分离从悬浮液中取出上清。所得的细胞团块再悬浮于例如稀释成5-20％V/V的甘油中。通过再次离心分离从悬浮液中去除上清，从而获得细胞团块。通过将该细胞团块再悬浮于水或稀释的甘油之中，根据所得悬浮液的菌体浓度的测定值，使用水或稀释的甘油，使最终的菌体浓度调制成所期望的浓度。
例如，作为优选的受体细胞，可举出：能够应答电穿孔的大肠杆菌株SS320(Sidhu等人(Methods Enzymol.(2000)328,333-363))。大肠杆菌株SS320如下进行制备：在将能育性附加体(fertility episome)(F’质粒)或XL1-BLUE转移至MC1061细胞的充分条件下，使MC1061细胞与XL1-BLUE细胞交配(交接)来制备。对于在ATCC(10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia)中保藏的大肠杆菌株SS320，其保藏号为98795。该菌株中的可复制噬菌体的任何F’附加体均可在本发明中使用。适合的附加体可从ATCC保藏的菌株中获取，或者也可从市售品中获取(TG1,CJ236、CSH18、DHF’、ER2738、JM101、JM103、JM105、JM107、JM109、JM110、KS1000、XL1-BLUE、71-18等)。
在电穿孔中，若使用更高的DNA浓度(约10倍)，则转化率提高，向宿主细胞中转化的DNA量增加。使用高的菌体浓度也提高效率(约10倍)。通过增加转移的DNA量，可以制作具有更大多样性、序列不同的独立克隆的数目更大的文库。就转化细胞而言，通常，通过在含有抗生物质的培养基上是否增殖来选择。
进而，本发明提供编码本发明的抗原结合分子的核酸。本发明的该核酸可以是DNA、RNA等、任何的形式。
进而，本发明提供含有上述本发明的核酸的载体。就载体的种类而言，本领域技术人员可以根据载体导入的宿主细胞进行适宜选择，例如可以使用上述的载体。
进而，本发明涉及通过上述本发明的载体而转化的宿主细胞。作为宿主细胞，本领域技术人员可以适宜选择，例如可以使用上述的宿主细胞。
此外，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明的抗原结合分子和医学上可接受的载体。本发明的药物组合物可以导入本发明的抗原结合分子和药学上可接受的载体按照公知的方法制成制剂。例如，可以以与水或水以外的药学上可接受的液体的无菌性溶液或悬浮液剂的注射剂形式非口服地使用。例如，可以适宜组合药理学上可接受的载体或介质，具体而言，适宜组合无菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、溶剂、防腐剂、粘合剂等，以通常所认可的制药实施所要求的单位用量形式进行混合，由此进行制剂。具体而言，作为载体，可举出：轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲醚纤维素钙、羧甲醚纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯乙缩醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。设定这些制剂中的有效成分量，以便得到所指示范围的适当容量。
用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水之类的溶剂按照通常的制剂实施来进行配制。作为注射用水溶液，可举出：例如生理盐水、含有葡萄糖或其他辅药(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠)的等渗液。可以与适当的溶解助剂、例如醇(具体而言，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50)并用。
作为油性液，可举出芝麻油、大豆油，还可以并用苯甲酸苄酯和/或苯甲醇作为溶解助剂。此外，还可以与缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如，盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如，苯甲醇和苯酚)、抗氧化剂配合。所调制的注射液通常填充于适当的安瓿中。给予优选为非口服给予，具体而言，可举出：注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、经皮给予型等。作为注射剂型的实例，例如通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等可全身或局部给予。
此外，可以根据患者的年龄、症状来选择适宜的给予方法。含有多肽或编码多肽的多核苷酸的药物组合物的给予量可选择：例如，0.0001mg～1000mg/kg体重/次的范围。或者，其给予量可选择：例如，每个患者为0.001～100000mg/身体的范围，但并不受这些数值的限制。给予量、给予方法根据患者的体重、年龄、症状等而改变，本领域技术人员可以适宜选择。
此外，本发明提供：癌症的治疗方法，所述方法包括给予本发明的抗原结合分子的步骤；用于在癌症的治疗中使用的本发明的抗原结合分子；本发明的抗原结合分子在制备癌症的治疗药中的应用；以及，用于制备癌症的治疗药的方法，所述方法包括使用本发明的抗原结合分子的步骤。
需要说明的是，本说明书中所用的氨基酸的三字母标记和单字母表记的对应如下所示：
丙氨酸：Ala：A
精氨酸：Arg：R
天冬酰胺：Asn：N
天冬氨酸：Asp：D
半胱氨酸：Cys：C
谷氨酰胺：Gln：Q
谷氨酸：Glu：E
甘氨酸：Gly：G
组氨酸：His：H
异亮氨酸：Ile：I
亮氨酸：Leu：L
赖氨酸：Lys：K
蛋氨酸：Met：M
苯丙氨酸：Phe：F
脯氨酸：Pro：P
丝氨酸：Ser：S
苏氨酸：Thr：T
色氨酸：Trp：W
酪氨酸：Tyr：Y
缬氨酸：Val：V
任意地组合本说明书中所记载的1个或多个方案而得的方案，只要基于本领域技术人员的技术常识在技术上不矛盾，也包含在本发明中，这是本领域技术人员当然可以理解的。
需要说明的是，本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参照结合到本说明书中。
本发明通过以下的实施例进一步示例，但不受下述实施例的限制。
实施例
[实施例1]与CD3(第1抗原)和其他抗原(第2抗原)结合、且不同时与不同细胞上的CD3(第1抗原)和该其他抗原(第2抗原)结合的改变免疫球蛋白可变(Fab)区的概念认为在因免疫球蛋白同时与2分子以上的活性型FcγR结合、或者同时与其他抗原和活性型FcγR结合而发生活化FcγR的交联反应时，有可能传递FcγR的ITAM信号、并发生免疫细胞的活化。如上所述，由于1分子的IgG型抗体只能与1分子的FcγR结合，因此只有在抗原存在下，2分子以上的活性型FcγR才发生交联，发生免疫细胞的活化。
此外，当IgG型抗体通过可变区(Fab)与抗原结合时，其可以同时通过Fc区与1分子的FcγR结合，因此发生表达该抗原的细胞与FcγR表达细胞间的交联。根据表达抗原的细胞，还存在抗原与FcγR的交联不理想的情形。具体而言，例如在抗原为CD3的情况下，因T细胞与FcγR表达细胞交联，而发生细胞因子释放等的免疫活化(J.Immunol.(1999)Aug 1,163(3),1246-52)。这样的情况下，通过向Fc区导入改变，消除了与FcγR的结合活性，可防止抗原与FcγR的交联反应(Advanced Drug Delivery Reviews(2006)58,640-656)。同样，在IgG型抗体的抗原为CD40、OX40、CD27等TNFR超家族分子、CD3和TLR2、TLR4、TLR8、TLR9等TLR等的情况下，当经由FcγR发生交联时，会在全身产生免疫的活化，因此不优选同时与在其他细胞中表达的这些分子结合。
另一方面，虽然现有的多特异性抗体同时与多个抗原结合，但根据抗原的组合，有时也不优选同时与多个抗原结合。例如，已知作为粘附分子而已知的整联蛋白αvβ3在多种癌细胞和肿瘤周围的血管中表达，因此可用作靶向肿瘤的靶分子(R.Haubner,PLoS Med.,2,e70(2005))，但另一方面，其还在各种正常细胞中表达(Thromb Haemost.1998Nov；80(5):726-34.)。因此，认为若多特异性抗体同时与CD3和整联蛋白αvβ3两方结合，则有可能使正常细胞受到由T细胞产生的强细胞毒活性的伤害。
因此，作为控制这样的不优选的交联反应的方法，认为有：在一个可变(Fab)区中，通过其中一部分与第1抗原结合、并通过不参与该结合的该可变(Fab)区的其他部分与第2抗原结合的可变区(Dual Binding Fab，双结合Fab)(图1)。此时，如图1所示，当一个可变(Fab)区中的接近的两个部分为与各抗原的结合所必须时，若第1抗原结合，则第2抗原的结合受到抑制，同样，若第2抗原结合，则第1抗原的结合受到抑制。因此，具有这样的双结合Fab的性质的改良抗体无法同时与第1抗原和第2抗原结合，所以认为不会发生第1抗原和第2抗原的交联反应(图2)。此外，当第1抗原和第2抗原如可溶型蛋白一样不在细胞膜上表达、或者两方存在于同一细胞上时，可同时与第1抗原和第2抗原两方结合，但各自在不同的细胞上表达时，不会同时结合、且两个细胞不会交联，认为这样的情形也是双结合Fab(图3)。另一方面，认为另一方与可变(Fab)区结合的抗原(第3抗原)与第1抗原发生交联反应(图4)、而且还与第2抗原发生交联反应(图5)。作为该抗体的恒定区，既可以使用与FcγR结合的Fc区，也可以使用降低与FcγR的结合活性的Fc区。
利用这样的双结合Fab的性质时，例如在通过经由抗体重定向T细胞来杀伤表达癌抗原的癌细胞的技术中，通过在癌组织中进一步具有整联蛋白的靶向功能，可以进一步提高癌特异性。
即，当改良可变(Fab)区以形成双结合Fab，从而可以赋予以下的性质时，可以研制具有图1所示的作用的抗体。
1.具有针对第1抗原的结合活性；
2.具有针对第2抗原的结合活性；
3.不同时与第1抗原和第2抗原结合。
需要说明的是，“不同时与第1抗原和第2抗原结合”还包括以下情形：表达第1抗原的细胞和表达第2抗原的细胞这两个细胞不交联、或者不同时与分别在各自的细胞上表达的第1抗原和第2抗原结合；以及第1抗原和第2抗原如可溶型蛋白一样不在细胞膜上表达，或者，当两方存在于同一细胞上时，可同时与第1抗原和第2抗原这两方结合，当各自在不同的细胞上表达时，无法同时结合。
同样，当改良可变(Fab)区以形成双结合Fab，从而可以赋予以下的性质时，例如可以研制具有图6所示的作用的抗体。
1.具有针对T细胞上的第1抗原的结合活性；
2.具有针对抗原呈递细胞上的第2抗原的结合活性；
3.不同时与第1抗原和第2抗原结合。
[实施例2]抗人、食蟹猴CD3ε抗体CE115的制作
(2-1)使用表达人CD3、食蟹猴CD3的细胞免疫大鼠来制作杂交瘤
如下所述，用人CD3εγ或食蟹猴CD3εγ表达Ba/F3细胞对SD大鼠(雌、免疫开始时为6周岁、日本Charles River)进行了免疫。以初次免疫时作为第0天，在第0天将弗氏完全佐剂(Difco)和5×107个人CD3εγ表达Ba/F3细胞一起进行了腹腔内给药。在第14天将弗氏不完全佐剂(Difco)和5×107个食蟹猴CD3εγ表达Ba/F3细胞一起进行腹腔内给药，之后，间隔一周将5×107个人或食蟹猴CD3εγ表达Ba/F3细胞交替进行腹腔内给药共计4次。在CD3εγ的最终给药1周后(第49天)，静脉内给予人CD3εγ表达Ba/F3细胞作为加强免疫，在其3天后，按照使用了PEG1500(Roche Diagnostics)的常规方法将大鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行了细胞融合。融合细胞、即杂交瘤用包含10％FBS的RPMI1640培养基(以下，称作10％FBS/RPMI1640)进行了培养。
融合后的第二天，(1)将融合细胞悬浮于半流动培养基(StemCells)中，进行杂交瘤的选择培养，同时实施了杂交瘤的集落化。
在融合后的第9天或第10天拾取杂交瘤的集落，在加入了HAT选择培养基(10％FBS/RPMI1640、2vol％HAT 50×浓缩液(大日本制药)、5vol％BM-Condimed H1(RocheDiagnostics))的96-孔板的每孔中接种1个集落。培养3～4天后，回收各孔的培养上清，测定了培养上清中的大鼠IgG浓度。对于可以确认到大鼠IgG的培养上清，通过附着有人CD3εγ表达Ba/F3细胞、或不表达人CD3εγ的Ba/F3的cell-ELISA选择产生特异性地与人CD3εγ结合的抗体的克隆(图7)。再通过进行附着有食蟹猴CD3εγ表达Ba/F3细胞的cell-ELISA，评价了相对于猴CD3εγ的交叉性(图7)。
(2-2)抗人、猴CD3ε嵌合抗体的制作
使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)从杂交瘤细胞中提取总RNA，利用SMART RACEcDNA扩增试剂盒(BD Biosciences)合成了cDNA。使用所制作的cDNA，通过PCR将抗体可变区基因插入克隆载体中。使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems)，利用DNA测序仪ABI PRISM 3700DNA Sequencer(Applied Biosystems)，按照所附说明书中记载的方法确定了各DNA片段的核苷酸序列。CE115 H链可变区(SEQ ID NO:13)和CE115 L链可变区(SEQ ID NO:14)的CDR、FR的确定按照Kabat编号来进行。
将上述大鼠抗体H链可变区与人抗体IgG1链恒定区结合而成的嵌合抗体H链、和上述大鼠抗体L链可变区与人抗体Kappa链恒定区结合而成的嵌合抗体L链基因插入动物细胞表达载体中。使用所制作的表达载体，进行了CE115嵌合抗体的表达和纯化(参考实施例1)。
(2-3)EGFR_ERY22_CE115的制作
接下来，以抗癌抗原(EGFR)的IgG作为基本骨架，制作了将单方的Fab取代成了对于CD3ε的结合结构域的形式的分子。此时，与上述情形一样，作为基本骨架的IgG的Fc使用了与FcgR(Fcγ受体)的结合性有所减弱的沉默型Fc。作为对于EGFR的结合结构域，使用了作为西妥昔单抗可变区的西妥昔单抗-VH(SEQ ID NO:15)、西妥昔单抗-VL(SEQ ID NO:16)。作为抗体H链恒定区，使用除去了IgG1的C末端的Gly和Lys而得到的G1d、向G1d中导入D356K和H435R的变异而得到的A5、以及向G1d中导入K439E的变异而得到的B3，按照参考实施例1的方法分别调制了与西妥昔单抗-VH组合的西妥昔单抗-VH-G1d(SEQ ID NO:17)、西妥昔单抗-VH-A5(SEQ ID NO:18)、西妥昔单抗-VH-B3(SEQ ID NO:19)。需要说明的是，以H1作为抗体H链恒定区的名称时，可变区中具有西妥昔单抗-VH的抗体的H链所对应的序列显示为西妥昔单抗-VH-H1。
这里，当显示氨基酸的改变时，显示为D356K。最初的字母(相当于D356K的D)是指以单字母表记改变前的氨基酸残基时的字母，其后续的数字(相当于D356K的356)是指其改变位点的EU编号，最后的字母(相当于D356K的K)是指以单字母表记改变后的氨基酸残基时的字母。
制作了取代抗EGFR的Fab的VH结构域和VL结构域而得到的EGFR_ERY22_CE115(图8)。即，利用与上述方法相同的、使用了添加有适当序列的引物的PCR法等本领域技术人员所公知的方法，制作了一系列插入有分别编码EGFR ERY22_Hk(SEQ ID NO:20)、EGFRERY22_L(SEQ ID NO:21)、CE115_ERY22_Hh(SEQ ID NO:22)、CE115_ERY22_L(SEQ ID NO:23)的多核苷酸的表达载体。
将以下所示组合的表达载体导入FreeStyle293-F细胞中，使各目标分子瞬时表达。
·目标分子：EGFR_ERY22_CE115；
·由插入表达载体中的多核苷酸编码的多肽：EGFR_ERY22_Hk、EGFR_ERY22_L、CE115_ERY22_Hh、CE115_ERY22_L。
(2-4)EGFR_ERY22_CE115的纯化
将所得的培养上清添加在抗FLAG M2柱(Sigma公司)上，清洗该柱，之后利用0.1mg/mL的FLAG肽(Sigma公司)进行了洗脱。将包含目标分子的组分添加在HisTrap HP柱(GE Healthcare公司)上，清洗该柱，之后利用咪唑的浓度梯度进行了洗脱。通过超滤使包含目标分子的组分浓缩，之后将该组分添加在Superdex 200柱(GE Healthcare公司)上，仅回收洗脱液的单体组分，从而得到了已纯化的各目标分子。
(2-5)使用人外周血单核细胞进行的细胞毒活性测定
(2-5-1)人外周血单核细胞(PBMC：Peripheral Blood Mononuclear Cell)溶液的调制
使用事先注入了100μL 1,000单位/mL的肝素溶液(5千单位的注射用Novo-Heparin，Novo Nordisk公司)的注射器，由健康人志愿者(成人)采集50mL外周血。用PBS(-)稀释2倍后进行4等分，将所得外周血加入到事先注入了15mL的Ficoll-Paque PLUS并进行了离心操作的Leucosep淋巴细胞分离管(Cat.No.227290、Greiner bio-one公司)中。将该分离管离心分离(2,150rpm、10分钟、室温)后，分离收集单核细胞组分层。用包含10％FBS的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(SIGMA公司、以下记作10％FBS/D-MEM)清洗单核细胞组分的细胞1次，之后使用10％FBS/D-MEM调制该细胞，使其细胞密度达到了4×106/mL。将如此调制的细胞溶液作为人PBMC溶液用于以后的试验。
(2-5-2)细胞毒活性的测定
使用xCELLigence实时细胞分析仪(Roche Diagnostics公司)，根据细胞增殖抑制率对细胞毒活性进行了评价。靶细胞使用了使人EGFR在SK-HEP-1细胞株中强制表达而建立的SK-pca13a细胞株。从培养皿上剥离SK-pca13a，以100μL/孔接种在E-Plate 96板(RocheDiagnostics公司)上使达到1×104细胞/孔，使用xCELLigence实时细胞分析仪开始测定活细胞。第二天，从xCELLigence实时细胞分析仪中取出板，向该板上添加50μL调整至各浓度(0.004、0.04、0.4、4nM)的各抗体。使之在室温下反应15分钟，之后加入50μL(2-5-1)中制备的人PBMC溶液(2×105细胞/孔)，将该板再次放在xCELLigence实时细胞分析仪中，从而开始测定活细胞。反应在5％二氧化碳、37℃的条件下进行，通过下式由添加人PBMC 72小时后的Cell Index值求出细胞增殖抑制率(％)。需要说明的是，计算中使用的Cell Index值采用了以即将添加抗体前的Cell Index值作为1的方式进行了标准化后的数值。
细胞增殖抑制率(％)＝(A-B)×100/(A-1)
A显示未添加抗体的孔的Cell Index值的平均值(只有靶细胞和人PBMC)，B显示各孔的Cell Index值的平均值。试验按一式三份进行。
以由人血液调制的PBMC作为效应细胞，使用CE115来测定EGFR_ERY22_CE115的细胞毒活性时，确认到了极强的活性(图9)。
[实施例3]虽然与CD3和人整联蛋白αvβ3结合但不同时与两方结合的抗体的制作
如图1～6所示，双结合Fab是指通过可变(Fab)区与CD3(第1抗原)和目标抗原(第2抗原)结合、但不同时与CD3(第1抗原)和目标抗原(第2抗原)结合的分子。为了与第2抗原结合而向与CD3(第1抗原)结合的抗体的Fab区导入氨基酸改变时，通常是向两个H链或两个L链中导入氨基酸改变。然而，在向两个H链或两个L链中导入改变时，抗体的两个Fab分别与两个抗原结合，从而两个Fab有可能同时与CD3(第1抗原)和目标抗原(第2抗原)结合并交联。因此，以抗体的一个Fab作为与第3抗原结合、或者不与任何物质结合的Fab，以另一个Fab作为双结合Fab，使不会发生CD3(第1抗原)和目标抗原(第2抗原)的交联反应。
(3-1)虽然与CD3和人整联蛋白αvβ3结合但不同时与两方结合的抗体的制作作为粘附分子而已知的整联蛋白αvβ3在许多癌细胞和肿瘤周围的血管中表达，因此其可作为靶向肿瘤的靶分子，但另一方面，已知其还在各种正常细胞中表达(ThrombHaemost.1998Nov；80(5):726-34.)。因此，认为若同时与CD3和整联蛋白αvβ3结合，则有可能使正常细胞受到由T细胞产生的强细胞毒活性的伤害。于是，认为如果能够制作不同时与CD3和整联蛋白αvβ3结合的分子，则可以使抗EGFR抗体分子靶向表达整联蛋白αvβ3的肿瘤细胞，而不会对正常细胞造成伤害。即，研究了获取一种双结合Fab分子，该双结合Fab分子通过一侧的可变区(Fab)与EGFR结合、并通过另外的可变区与作为第1抗原的CD3结合、而且还与作为第2抗原的整联蛋白αvβ3结合，并且，不同时与CD3和整联蛋白αvβ3结合。
可谓是，如果能够显示“作为在不存在整联蛋白αvβ3的条件下CD3与Fab区结合、在不存在CD3的条件下整联蛋白αvβ3与Fab区结合的分子，与CD3结合了的分子不与整联蛋白αvβ3结合，或者，与整联蛋白αvβ3结合了的分子不与CD3结合”，则可以研制出目标的具有双结合Fab的特性(即，可以与CD3和第2抗原结合、并且不同时与CD3和第2抗原结合)的双结合Fab分子。
(3-2)具有与整联蛋白αvβ3结合的Fab区的抗体的获得
作为获得双结合Fab分子的方法，考虑到了利用文库的方法、和插入已知对蛋白具有结合活性的肽的方法。作为对整联蛋白αvβ3具有结合活性的肽，已知有RGD(Arg-Gly-Asp)肽。于是，按照参考实施例1制作了一种在作为与CD3ε结合的抗体的CE115(重链可变区SEQ ID NO:13、轻链可变区SEQ ID NO:14)的重链的环部分插入了RGD肽而得到的异源二聚化抗体，该异源二聚化抗体以一侧的Fab作为EGFR结合结构域以另一侧的Fab作为CD3结合结构域和整联蛋白αvβ3结合结构域。即，制作了一系列同时插入有分别编码EGFR ERY22_Hk(SEQ ID NO:20)、EGFR ERY22_L(SEQ ID NO:21)和CE115_ERY22_L(SEQ ID NO:23)的多核苷酸和编码以下的任一种片段的多核苷酸的表达载体：
·CE115_2ERY22_Hh(SEQ ID NO:24、将Kabat编号52b-53分别取代成K和N)、
·CE115_4ERY22_Hh(SEQ ID NO:25、将Kabat编号52b-54分别取代成S和N)、
·CE115_9ERY22_Hh(SEQ ID NO:26、在Kabat编号52a-52b之间插入RGD)、
·CE115_10ERY22_Hh(SEQ ID NO:27、在Kabat编号52b-52c之间插入RGD)、
·CE115_12ERY22_Hh(SEQ ID NO:28、在Kabat编号72-73之间插入RGD)、
·CE115_17ERY22_Hh(SEQ ID NO:29、将Kabat编号52b-52c分别取代成K和S)、
·CE115_47ERY22_Hh(SEQ ID NO:30、在Kabat编号98-99之间插入RGD)、
·CE115_48ERY22_Hh(SEQ ID NO:31、中Kabat编号99-100之间插入RGD)、
·CE115_49ERY22_Hh(SEQ ID NO:32、在Kabat编号100-100a之间插入RGD)。
此外，作为对照，按照参考实施例1制作了在J.Biotech,155,193-202,2011所报道的抗体的CH3区中插入了RGD(Arg-Gly-Asp)肽的抗体(EH240-Kn125/EH240-Hl076/L73；SEQID NO:33/34/35)。认为经由CH3区与整联蛋白αvβ3结合的该分子可以同时与CD3和整联蛋白αvβ3结合。
(3-3)确认整联蛋白αvβ3与抗体的结合
通过电化学发光法(ECL法)判定了在Fab区插入有RGD(Arg-Gly-Asp)肽的分子是否与整联蛋白αvβ3结合。具体而言，在Nunc-Immuno(tm)MicroWell(tm)96孔圆板(Nunc)的各孔中分别添加25μL的用包含0.1％的BSA、0.1g/L的氯化钙和0.1g/L的氯化镁的TBS溶液(记作稀释(+)溶液)稀释了的生物素-抗人IgG Ab(Southern biotech)、调整成5μg/mL或1μg/mL的抗体溶液和添加了sulfo-tag的整联蛋白αvβ3(R&D Systems)进行混合，之后在4℃下孵育一夜，形成了抗体抗原复合体。在链霉亲和素板(MSD)各孔中分别加入150μL包含0.5％的BSA和0.1g/L的氯化钙和0.1g/L的氯化镁的TBS溶液(记作封闭(+)溶液)，在4℃下孵育一夜。除去封闭溶液后，用250μL包含0.1g/L的氯化钙和0.1g/L的氯化镁的TBS溶液(记作TBS(+)溶液)清洗3次。在各孔中分别添加75μL的抗体抗原复合体溶液，在室温下孵育2小时，使生物素-抗人IgG Ab与链霉亲和素板结合。除去抗体抗原复合体溶液后，用TBS(+)溶液清洗3次，在各孔中分别加入150μL READ缓冲液(MSD)，通过Sector Imager 2400(MSD)检测了sulfo-tag的发光信号。
其结果见图11。作为亲本抗体的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115ERY22_Hh/CE115_ERY22_L对整联蛋白αvβ3完全没有显示出结合活性，相对于此，在EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_2ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_4ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_9ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_10ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_12ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_17ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_47ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_48ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFRERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_49ERY22_Hh/CE115_ERY22_L中均观察到了与整联蛋白αvβ3的结合。
(3-4)确认CD3(CD3ε)与抗体的结合
接下来，通过ECL法判定了前项中制作的通过Fab区与整联蛋白αvβ3结合的抗体是否保持对CD3的结合活性。具体而言，在Nunc-Immuno(tm)MicroWell(tm)96孔圆板(Nunc)的各孔中分别添加25μL用包含0.1％的BSA的TBS溶液(记作稀释(-)溶液)稀释了的生物素-抗人IgG Ab(Southern biotech)、调整成5μg/mL或1μg/mL的抗体溶液、和附加有sulfo-tag的CD3ε同源二聚体蛋白进行混合，之后在4℃下孵育一夜，形成了抗体抗原复合体。向链霉亲和素板(MSD)各孔中分别加入150μL含有0.5％BSA的TBS溶液(记作封闭(-)溶液)，在4℃下孵育一夜。除去封闭液后，用250μL TBS溶液(-)溶液洗涤3次。在各孔中分别添加75μL抗体抗原复合体溶液，在室温下孵育2小时，使生物素-抗人IgG Ab与链霉亲和素板结合。除去抗体抗原复合体溶液后，用TBS(-)溶液清洗3次，在各孔中分别加入150μL READ缓冲液(MSD)，通过Sector Imager 2400(MSD)检测了sulfo-tag的发光信号。
其结果见图12。除了作为亲本抗体的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115ERY22_Hh/CE115_ERY22_L以外，在EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_2ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_4ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_9ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_10ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_12ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_17ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFRERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_47ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFRERY22_L/CE115_48ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_49ERY22_Hh/CE115_ERY22_L中也均观察到了与CD3的结合。
(3-5)通过ECL法确认整联蛋白αvβ3和CD3不同时与Fab区结合
由到前项为止的结果，得到了对整联蛋白αvβ3具有结合活性、并且对CD3也具有结合活性的分子。接下来，判定到前项为止所制作的Fab区是否同时与CD3(CD3ε)和整联蛋白αvβ3结合。
在Fab区插入有RGD(Arg-Gly-Asp)肽的分子同时与整联蛋白αvβ3和CD3结合的情况下，若向抗体溶液中加入整联蛋白αvβ3和附加有生物素的CD3，则与这两方的抗原结合，因此可以通过ECL法进行检测。具体而言，在Nunc-Immuno(tm)MicroWell(tm)96孔圆板(Nunc)的各孔中分别添加25μL用稀释(+)溶液稀释了的附加有生物素的人CD3ε同源二聚体蛋白、和调整成10μg/mL或5μg/mL的抗体溶液、和附加有sulfo-tag的整联蛋白αvβ3(R&DSystems)进行混合，之后在4℃下孵育一夜，形成了抗体抗原复合体。向链霉亲和素板(MSD)的各孔中分别加入150μL封闭(+)液，在4℃下孵育一夜。除去封闭液后，用250μL包含0.1g/L的氯化钙和0.1g/L的氯化镁的TBS(+)溶液清洗3次。在各孔中分别添加75μL抗体抗原复合体溶液，在室温下孵育2小时，使生物素-抗人IgG Ab与链霉亲和素板结合。除去抗体抗原复合体溶液后，用TBS(+)溶液清洗3次，在各孔中分别加入150μL READ缓冲液(MSD)，通过Sector Imager 2400(MSD)检测了sulfo-tag的发光信号。
其结果见图13、图14。Fab区中插入有RGD(Arg-Gly-Asp)肽的EGFR ERY22_Hk/EGFRERY22_L/CE115_2ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_12ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_17ERY22_Hh/CE115_ERY22_L均同时与整联蛋白αvβ3和CD3结合，从而在ECL测定中检测到了强的信号。另一方面，在EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_9ERY22_Hh/CE115_ERY22_L和EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_48ERY22_Hh/CE115_ERY22_L中，其信号弱(图13)。此外，EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_4ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_10ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_47ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_49ERY22_Hh/CE115_ERY22_L在ECL测定中均几乎没有检测到信号(图14)。即，结果暗示：若这些抗体与CD3结合，则不与整联蛋白αvβ3结合。
(3-6)利用ECL法考察整联蛋白αvβ3和CD3不同时与Fab区结合
根据上述结果，可以研制具有通过一个Fab分别与CD3(CD3ε)、整联蛋白αvβ3结合、并且不同时与CD3(CD3ε)和整联蛋白αvβ3结合的双结合Fab分子特性的抗体。在该实施例中，对于具有与作为第1抗原的CD3结合的可变区的抗体，通过向Fab中插入在该可变区与作为第2抗原的整联蛋白αvβ3结合的RGD肽，可以获得被赋予了对第2抗原的结合活性、并且不同时与CD3和第2抗原结合的分子。按照同样的方法，通过在Fab中的环中插入如WO2006036834所示例的对蛋白具有结合活性的肽，可以获得对任意的第2抗原具有结合活性的双结合Fab分子。此外，对蛋白显示出结合活性的肽可以通过利用本领域技术人员所公知的方法制作肽文库、并选择具有所期望的活性的肽而获得(Pasqualini R.,Nature,1996,380(6572):364-6)。进而认为：通过使用如实施例5中记载的将Fab中的环改长(延长)了的抗原结合分子的文库，可以研制对任意的第2抗原具有结合活性的双结合Fab分子。由于抗第1抗原的可变区可以通过本领域技术人员所公知的各种方法来获得，因此认为：通过使用这样的文库，可以研制对任意的第1抗原和任意的第2抗原具有结合活性、并且无法同时与该第1抗原和该第2抗原结合的双结合Fab分子。
以上的结果显示：EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_4ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_10ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_47ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_49ERY22_Hh/CE115_ERY22_L与CD3和整联蛋白αvβ3结合，但不同时与CD3和整联蛋白αvβ3结合。即，明确了：EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_4ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_10ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFRERY22_L/CE115_47ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_49ERY22_Hh/CE115_ERY22_L是具有双结合Fab的分子，可以研制这样的分子。
[实施例4]与CD3和人toll样受体2(TLR2)结合、但不同时与两方结合的抗体的制作
(4-1)与CD3和人TLR2结合、但不同时与两方结合的抗体的制作
作为模式识别受体而已知的TLR2主要在巨噬细胞、树突状细胞或B细胞等免疫细胞中表达，可用作活化免疫细胞的靶分子。此外，已知TLR2还在上皮细胞或内皮细胞等除免疫细胞以外的正常细胞中表达。通过同时结合癌抗原和CD3，征集在肿瘤环境中表达CD3的T细胞，用T细胞杀伤癌细胞，但认为通过同时结合癌抗原和TLR2，也可以征集并活化在肿瘤环境中表达TLR2的免疫细胞。由TLR2征集的免疫细胞摄入被T细胞杀伤的癌细胞，对抗原进行加工并呈递给HLA，从而可以活化T细胞，因此在更强效地活化T细胞的同时，还有可能可以诱导获得性免疫。然而，认为若同时结合CD3和TLR2，则有可能使免疫细胞和正常细胞受到由T细胞产生的强细胞毒活性的伤害。因此，认为如果能够制作不同时与CD3和TLR2结合的分子，则可以征集表达TLR2的免疫细胞和正常细胞，而不对这些细胞造成伤害。即，研究了获得一种双结合Fab分子，所述双结合Fab分子通过一侧的可变区(Fab)与EGFR结合，通过其他的可变区与作为第1抗原的CD3结合，而且还与作为第2抗原的TLR2结合，并且不同时与CD3和TLR2结合。
可谓是，如果可以显示“作为在不存在TLR2的条件下CD3与Fab区结合、在不存在CD3的条件下TLR2与Fab区结合的分子，与CD3结合了的分子不与TLR2结合，或者，与TLR2结合了的分子不与CD3结合”，则可以研制目标的具有双结合Fab的特性(即，可以与CD3和第2抗原结合、并且不同时与CD3和第2抗原结合)的双结合Fab分子。
(4-2)具有与TLR2结合的Fab区的抗体的获得
作为对人TLR2具有结合活性的肽，已知有RWGYHLRDRKYKGVRSHKGVPR肽(SEQ IDNO:36)。于是，按照参考实施例1制作了在作为与CD3ε结合的抗体的CE115(重链可变区为SEQ ID NO:13、轻链可变区为SEQ ID NO:14)的重链的环部分插入有TRL2结合肽的异源二聚化抗体，该异源二聚化抗体以一侧的Fab作为EGFR结合结构域，以另一侧的Fab作为CD3结合结构域和TLR2结合结构域。即，制作了一系列同时插入有分别编码EGFR ERY22_Hk(SEQID NO:20)、EGFR ERY22_L(SEQ ID NO:21)和CE115_ERY22_L(SEQ ID NO:23)的多核苷酸和编码以下的任一种片段的多核苷酸的表达载体：
·CE115_DU21 ERY22_Hh(SEQ ID NO:37、在Kabat编号52b-52c之间插入TRL2结合肽)、
·CE115_DU22 ERY22_Hh(SEQ ID NO:38、在Kabat编号52b-52c之间插入TRL2结合肽)、
·CE115_DU26 ERY22_Hh(SEQ ID NO:39、在Kabat编号72-73之间插入TRL2结合肽)、
·CE115_DU27 ERY22_Hh(SEQ ID NO:40、在Kabat编号72-73之间插入TRL2结合肽)。
此外，作为对照，按照参考实施例1制作了在CH3区C末端附加有TLR2结合肽的抗体(CE115_ERY22_DU42_Hh,SEQ ID NO:41)、和在CH3区C末端附加有在TLR2结合肽两端具有Cys残基的肽的抗体(CE115_ERY22_DU43_Hh,SEQ ID NO:42)。认为经由CH3区与TLR2结合的该分子可以同时与CD3和TLR2结合。
(4-3)确认TLR2与抗体的结合
通过电化学发光法(ECL法)判定在Fab区插入有TLR2结合肽的分子是否与TLR2结合。具体而言，在Nunc-Immuno(tm)MicroWell(tm)96孔圆板(Nunc)的各孔中分别添加25μL用包含0.1％BSA的TBS溶液(记作稀释(-)溶液)稀释了的生物素-抗人IgG Ab(Southernbiotech)、调整成5μg/mL或1μg/mL的抗体溶液、和附加有sulfo-tag的TLR2(abnova)进行混合，之后在4℃下孵育一夜，形成了抗体抗原复合体。向链霉亲和素板(MSD)各孔中分别加入150μL含有0.5％BSA的TBS溶液(记作封闭(-)液)，在4℃下孵育一夜。除去封闭液后，用250μL TBS(-)溶液清洗3次。在各孔中分别添加75μL抗体抗原复合体溶液，在室温下孵育2小时，使生物素-抗人IgG Ab与链霉亲和素板结合。除去抗体抗原复合体溶液后，用TBS(-)溶液清洗3次，在各孔中分别加入150μL READ缓冲液(MSD)，通过Sector Imager 2400(MSD)检测了sulfo-tag的发光信号。
其结果见图15。作为亲本抗体的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115ERY22_Hh/CE115_ERY22_L对TLR2完全没有显示出结合活性，相对于此，在EGFR ERY22_Hk/EGFRERY22_L/CE115_DU21 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU22 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU26 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU27 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L中均观察到了与TLR2的结合。
(4-4)确认CD3(CD3ε)与抗体的结合
接下来，通过ECL法判定了前项中制作的通过Fab区与TLR2结合的抗体是否保持对CD3(CD3ε)的结合活性。具体而言，在Nunc-Immuno(tm)MicroWell(tm)96孔圆板(Nunc)的各孔中分别添加25μL用包含0.1％BSA的TBS溶液(记作稀释(-)溶液)稀释了的生物素-抗人IgG Ab(Southern biotech)、调整成5μg/mL或1μg/mL的抗体溶液、和附加有sulfo-tag的CD3ε同源二聚体蛋白进行混合，之后在4℃下孵育一夜，形成了抗体抗原复合体。向链霉亲和素板(MSD)的各孔中分别加入150μL含有0.5％BSA的TBS溶液(记作封闭(-)液)，在4℃下孵育一夜。除去封闭液后，用250μL TBS溶液(-)溶液清洗3次。在各孔中分别添加75μL抗体抗原复合体溶液，在室温下孵育2小时，使生物素-抗人IgG Ab与链霉亲和素板结合。除去抗体抗原复合体溶液后，用TBS(-)溶液清洗3次，在各孔中分别加入150μL READ缓冲液(MSD)，通过Sector Imager 2400(MSD)检测了sulfo-tag的发光信号。
其结果见图16。除了作为亲本抗体的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115ERY22_Hh/CE115_ERY22_L以外，在EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU21ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU22ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFRERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU26ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFRERY22_L/CE115_DU27ERY22_Hh/CE115_ERY22_L中也均观察到了与CD3的结合。
(4-5)通过ECL法确认TLR2和CD3不同时与Fab区结合根据到前项为止的结果，得到了对TLR2具有结合活性、并且对CD3具有结合活性的分子。接下来，判定了到前项为止所制作的Fab区是否同时与CD3和TLR2结合。
在Fab区中插入有TLR2结合肽的分子同时与TLR2和CD3结合的情况下，若向抗体溶液中加入TLR2和附加有生物素的CD3，则会与这两方的抗原结合，因此可以通过ECL法机进行检测。具体而言，在Nunc-Immuno(tm)Micro Well(tm)96孔圆板(Nunc)的各孔中分别添加25μL用稀释(-)溶液稀释了的附加有生物素的人CD3ε同源二聚体蛋白、调整成10μg/mL或5μg/mL的抗体溶液、和附加有sulfo-tag的TLR2(R&D Systems)进行混合，之后在4℃下孵育一夜，形成了抗体抗原复合体。向链霉亲和素板(MSD)的各孔中分别加入150μL封闭(-)液，在4℃下孵育一夜。除去封闭液后，用250μL包含0.1g/L的氯化钙和0.1g/L的氯化镁的TBS(-)溶液清洗3次。在各孔中分别添加75μL抗体抗原复合体溶液，在室温下孵育2小时，使生物素-抗人IgG Ab与链霉亲和素板结合。除去抗体抗原复合体溶液后，用TBS(-)溶液清洗3次，在各孔中分别加入150μL READ缓冲液(MSD)，通过Sector Imager 2400(MSD)检测了sulfo-tag的发光信号。
其结果见图17。由于在CH3区附加有TLR2结合肽的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU42 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU43ERY22_Hh/CE115_ERY22_L同时与TLR2和CD3结合，从而在ECL测定中检测到了强信号。另一方面，EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU21 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU22 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU26 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU27ERY22_Hh/CE115_ERY22_L在ECL测定中均几乎没有检测到信号。即，结果暗示：若这些抗体与CD3结合，则不会与TLR2结合。
(4-6)通过ECL法考察TLR2和CD3不同时与Fab区结合
由上述结果可知：可以研制具有通过一个Fab分别与CD3、TLR2结合、并且不同时与CD3和TLR2结合的双结合Fab分子特性的抗体。在该实施例中，对于具有与作为第1抗原的CD3结合的可变区的抗体，通过在Fab中插入在该可变区与作为第2抗原的TLR2结合的RWGYHLRDRKYKGVRSHKGVPR肽，可以获得被赋予对第2抗原的结合活性、并且不同时与CD3和第2抗原结合的分子。利用同样的方法，通过在Fab中的环中插入如WO2006036834中所示例的对蛋白具有结合活性的肽，可以获得对任意的第2抗原具有结合活性的双结合Fab分子。此外，对蛋白显示出结合活性的肽可以通过利用本领域技术人员所公知的方法制作肽文库、并选择具有所期望的活性的肽而获得(Pasqualini R.,Nature,1996,380(6572):364-6))。进而认为：通过使用如实施例5中记载的将Fab中的环改长(延长)了的抗原结合分子的文库，可以研制对任意的第2抗原具有结合活性的双结合Fab分子。抗第1抗原的可变区可以通过本领域技术人员所公知的各种方法来获得，因此可以说：通过使用这样的文库，可以研制对任意的第1抗原和任意的第2抗原具有结合活性、且无法同时与该第1抗原和该第2抗原结合的双结合Fab分子。
以上的结果显示：EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU21ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU22ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFRERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU26ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFRERY22_L/CE115_DU27ERY22_Hh/CE115_ERY22_L与CD3和TLR2结合、且不同时与CD3和TLR2结合。即，明确了：EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU21ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFRERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU22ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFRERY22_L/CE115_DU26ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_DU27ERY22_Hh/CE115_ERY22_L是具有双结合Fab的分子，可以研制这样的分子。
[实施例5]用于制作与CD3和第2抗原结合的抗体的抗体改变
(5-1)能与第2抗原结合的肽的插入位点和长度的研究
研究了获得一种双结合Fab分子，所述双结合Fab分子通过一侧的可变区(Fab)与癌抗原结合，通过另一方可变区与作为第1抗原的CD3结合、还与第2抗原结合，并且不同时与CD3和第2抗原结合。按照参考实施例1制作了在作为与CD3ε结合的抗体的CE115的重链的环部分插入有GGS肽的异源二聚化抗体，该异源二聚化抗体以一侧的Fab作为EGFR结合结构域，以另一侧的Fab作为CD3结合结构域。
即，制作了在CDR2中的K52B和S52c之间插入了GGS的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE31 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L((SEQ ID NO:20/21/43/23)、插入了GGSGGS肽(SEQ ID NO:90)的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE32 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L((SEQ ID NO:20/21/44/23)、插入了GGSGGSGGS肽(SEQ ID NO:91)的EGFR ERY22_Hk/EGFRERY22_L/CE115_CE33ERY22_Hh/CE115_ERY22_L((SEQ ID NO:20/21/45/23)。同样地制作了在框架3中的环状位点即D72和D73之间插入了GGS的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE34 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L((SEQ ID NO:20/21/46/23)、插入了GGSGGS肽(SEQ ID NO:90)的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE35ERY22_Hh/CE115_ERY22_L((SEQ ID NO:20/21/47/23)、插入了GGSGGSGGS肽(SEQ ID NO:91)的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE36ERY22_Hh/CE115_ERY22_L((SEQ ID NO:20/21/48/23)。此外，制作了在CDR3中的A99和Y100之间插入了GGS的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE37ERY22_Hh/CE115_ERY22_L((SEQ ID NO:20/21/49/23)、插入了GGSGGS肽的EGFR ERY22_Hk/EGFRERY22_L/CE115_CE38 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L((SEQ ID NO:20/21/50/23)、插入了GGSGGSGGS肽的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE39 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L((SEQ ID NO:20/21/51/23)。
(5-2)确认插入有GGS肽的CE115抗体与CD3ε的结合
通过Biacore T100确认了所制作的各种抗体是否维持对CD3ε的结合性。经由链霉亲和素使生物素化CD3ε表位肽与CM5芯片结合，使所制作的抗体以分析物形式流过，分析了结合亲和性。
其结果见表2。CE35、CE36、CE37、CE38、CE39对CD3ε的结合亲和性与作为亲本抗体的CE115相等。由此显示：在这些环中，可以插入与第2抗原结合的肽。此外，即使在插入了GGSGGSGGS的CE36或CE39中，结合亲和性也没有降低，由此显示：在这些位点插入至少9个氨基酸为止的肽也不会给CD3ε结合性带来影响。
[表2]
Figure BDA0003085543880000711
即，结果显示：通过使用这样的插入有肽的CE115来获得与第2抗原结合的抗体，可以制作可与CD3和第2抗原结合但不是同时结合的抗体。
这里，按照位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知的方法随机改变待插入或取代的肽的氨基酸序列，并按照上述方法比较各改变体的结合活性等，以确定即使改变氨基酸序列也可显示出目标活性的插入、取代位点或其氨基酸的种类、长度，从而可以制作文库。
[实施例6]用于获取与CD3和第2抗原结合的抗体的文库设计
(6-1)关于为了获取与CD3和第2抗原结合的抗体的抗体文库(也称作Dual Fab文库)选择CD3(CD3ε)作为第1抗原，作为获取与CD3(CD3ε)和任意的第2抗原结合的抗体的方法，可示例以下的6种方法。
方法1：在与第1抗原结合的Fab结构域中插入与第2抗原结合的肽或多肽(在该方法中，除了实施例3和4所示的肽插入以外，还如Angew Chem Int Ed Engl.2013Aug 5；52(32):8295-8所示例的插入G-CSF。)，其中，待结合的肽或多肽可以由呈递肽或多肽的文库获取，但也可以使用天然存在的蛋白全体或其一部分；
方法2：制作如实施例5中所示在可以改长(延长)Fab中的环的位点呈现各种氨基酸这样的抗体文库，以对抗原的结合活性为指标，由抗体文库中获取对任意的第2抗原具有结合活性的Fab；
方法3：使用事先通过位点特异性诱变法由已知与CD3结合的Fab结构域制作的抗体，鉴定维持与CD3的结合活性的氨基酸，以与抗原的结合活性为指标，由呈现所鉴定的氨基酸这样的抗体文库中获取对任意的第2抗原具有结合活性的Fab；
方法4：在方法3中，进一步制作如在可以改长(延长)Fab中的环的位点呈现各种氨基酸这样的抗体文库，以与抗原的结合活性为指标，由抗体文库中获取对任意的第2抗原具有结合活性的Fab；
方法5：在方法1、2、3、4中，以呈现糖链添加序列(例如NxS、NxT，其中x为P以外的氨基酸)的方式进行改变，添加糖链受体所识别的糖链(例如，添加高甘露糖型糖链，由高甘露糖受体识别。已知高甘露糖型糖链可通过在抗体表达时添加几夫碱而获得(MAbs.2012Jul-Aug；4(4):475-87))；
方法6：在方法1、2、3、4中，在环部位或可以改变各种氨基酸的位点插入或取代Cys、Lys或非天然氨基酸，通过共价键添加与第2抗原结合的结构域(多肽或糖链、TLR激动剂所代表的核酸)(抗体药物缀合物所代表的方法，通过共价键与Cys、Lys或非天然氨基酸结合的方法、记载在mAbs 6:1,34-45；January/February 2014、WO2009/134891A2、Bioconjug Chem.2014Feb 19；25(2):351-61中)；
利用上述方法获得与第1抗原和第二抗原结合、且彼此不同时结合的双结合Fab，再通过本领域技术人员所公知的方法、例如共同L链、Cross mab、Fab臂交换(Fab armexchange)法将其和与任意的第3抗原结合的结构域(将其称作另一方可变区，记载在实施例1中)组合。
(6-2)利用位点特异性诱变法制作CD3(CD3ε)结合抗体的一氨基酸改变抗体作为CD3(CD3ε)结合抗体的模板序列，VH区选定CE115HA000(SEQ ID NO:52)、VL区选定GLS3000(SEQ ID NO:53)。按照参考实施例1在认为参与抗原结合的位点分别进行了氨基酸改变。此外，H链恒定区使用pE22Hh(在天然IgG1的CH1以后的序列中加入L234A、L235A、N297A、D356C、T366S、L368A、Y407V的改变，使C末端的GK序列缺失，并添加了DYKDDDDK序列(SEQ IDNO:89)而得到的序列；SEQ ID NO:54)，L链恒定区使用Kappa链(SEQ ID NO:55)。进行了改变的位点如表3所示。为了评价CD3(CD3ε)结合活性，以一臂抗体(在天然型IgG中缺失了单方的Fab结构域的抗体)的形式获取了一氨基酸改变抗体。具体而言，在改变H链的情况下，使用所改变的H链与恒定区pE22Hh连接而成的链和Kn010G3(在天然型IgG1的216位以后的氨基酸序列中加入了C220S、Y349C、T366W、H435R的改变而得到的序列、SEQ ID NO:56)作为H链，使用在3’侧连接有kappa链的GLS3000作为L链；在改变L链的情况下，使用在所改变的L链的3’侧连接有Kappa链的序列作为L链，使用在3’侧连接有pE22Hh的CE115HA000和Kn010G3作为H链，在FreeStyle293细胞中进行了表达和纯化(使用了参考实施例1的方法)。
[表3]
Figure BDA0003085543880000741
(6-3)评价一氨基酸改变抗体与CD3的结合
使用Biacore T200(GE Healthcare)对(6-2)中构建和表达纯化的一氨基酸改变体进行了评价。通过胺偶联法在传感器芯片CM4(GE Healthcare)上固定适量的CD3ε同源二聚体蛋白后，注射适当浓度的抗体作为分析物，使其与传感器芯片上的CD3ε同源二聚体蛋白发生相互作用。之后，注射10mmol/L的甘氨酸-HCl(pH1.5)，使传感器芯片再生。测定在25℃下进行，运行缓冲液使用HBS-EP+(GE Healthcare)。根据测定的结果，针对结合量和通过测定得到的传感图，使用单循环动力学模型(1:1结合RI＝0)算出了解离常数KD(M)。在各参数的计算中使用了Biacore T200评估软件(GE Healthcare)。
(6-3-1)H链的改变
对于作为改变前的抗体的CE115HA000，各种H链改变体的结合量的比例的结果见表4。即，以包含CE115HA000的抗体的结合量为X、以H链一氨基酸改变体的结合量为Y时的Z(结合量的比例)＝Y/X的值。此时，如图18所示，在Z不足0.8的情况下，由传感图确认到结合量非常少，暗示着有可能无法正确地算出解离常数KD(M)。接下来，对于CE115HA000，各种H链改变体的解离常数KD(M)的比例(＝CE115HA000的KD值/改变体的KD值)见表5。
当表4所示的Z为0.8以上时，认为维持着与作为改变前的抗体的CE115HA000的结合，因此以呈现这些氨基酸的方式设计的抗体文库能够作为Dual Fab文库。
[表4]
Figure BDA0003085543880000761
[表5]
Figure BDA0003085543880000771
(6-3-2)L链的改变
相对于作为改变前的抗体的GLS3000，各种L链改变体的结合量的比例的结果见表6。即，以包含GLS3000的抗体的结合量为X、以L链一氨基酸改变体的结合量为Y时的Z(结合量的比例)＝Y/X的值。此时，如图18所示，当Z不足0.8时，由传感图确认到结合量非常少，暗示着有可能无法正确算出解离常数KD(M)。接下来，相对于GLS3000，各种L链改变体的解离常数KD(M)的比例见表7。
当表6所示的Z为0.8以上时，认为维持着与作为改变前的抗体的GLS3000的结合，因此以呈现这些氨基酸的方式设计的抗体文库能够作为Dual Fab文库。
[表6]
Figure BDA0003085543880000781
[表7]
Figure BDA0003085543880000791
(6-4)评价一氨基酸改变抗体与ECM(Extracellular matrix；细胞外基质)的结合
ECM(Extracellular matrix；细胞外基质)是细胞外的构成成分之一，存在于生物体内的各部位。因此，已知与ECM强力结合的抗体的血中动力学变差(半衰期变短)(WO2012093704A1)。于是，关于在抗体文库中呈现的氨基酸，也优选选择与ECM的结合没有增强的氨基酸。
关于各H链或L链改变体，按照(6-2)所示的方法获取了抗体。接下来，按照参考实施例2的方法对ECM结合进行了评价。用各改变体的ECM结合值(ECL response；ECL响应值)除以同一板内或同一实施日的MRA(H链SEQ ID NO:57、L链SEQ ID NO:58)的抗体ECM结合值而得到的值见表8(H链)、表9(L链)。如表8和表9所示，在几个改变中确认到了增强ECM结合的倾向。
在表8(H链)、表9(L链)所示的值中，考虑到由多个改变产生的ECM结合增强的效果，在Dual Fab文库中采用最高10倍作为有效值。
[表8]
Figure BDA0003085543880000811
[表9]
Figure BDA0003085543880000821
(6-5)用于增强文库的多样性的肽的插入位点和长度的研究
实施例5中显示出：使用GGS序列可以在各位点中插入肽，而不会丧失与CD3(CD3ε)的结合。认为在Dual Fab文库中，如果可以延长环，则也会形成包含更多种分子(还表述为多样性大)的文库，可以获取与各种第2抗原结合的Fab结构域。于是，设想结合活性会随着肽的插入而降低，因此在CE115HA000序列中以与CD3ε的结合活性变高的方式加入V11L/D72A/L78I/D101Q改变并连接pE22Hh而得到一种序列，与实施例5一样，制作了在所得序列中插入了GGS接头的分子，评价了该分子与CD3的结合。GGS序列被插在Kabat编号99-100之间。抗体分子以一臂抗体的形式进行表达。具体而言，采用包含GGS接头的上述H链和Kn010G3(SEQ ID NO：56)作为H链，采用连接有Kappa序列(SEQ ID NO：55)的GLS3000(SEQID NO：53)作为L链，按照参考实施例1进行了表达纯化。
(6-6)确认插入有GGS肽的CE115抗体与CD3的结合
按照实施例6所记载的方法，使用Biacore进行了插入有GGS肽的改变抗体与CD3ε的结合。其结果，如表10所示，明确了在环位点可以插入GGS接头。特别是，在对抗原结合而言较为重要的H链CDR3区可以插入GGS接头，即使插入任意的3个、6个或9个氨基酸，也可维持与CD3ε的结合。在该研究中，使用GGS接头进行了研究，但认为也可以是呈现各种氨基酸而不是呈现GGS的抗体文库。
[表10]
插入氨基酸序列(99-100) CD3_KD[M]
GGS 6.31E-08
GGSGGS(SEQ ID NO：90) 3.46E-08
GGSGGS(SEQ ID NO：90) 3.105E-08
GGSGGGS(SEQ ID NO：92) 4.352E-08
GGSGGGS(SEQ ID NO：92) 3.429E-08
GGGSGGGS(SEQ ID NO：93) 4.129E-08
GGGSGGGS(SEQ ID NO：93) 3.753E-08
GGSGGSGGS(SEQ ID NO：91) 4.39E-08
GGSGGSGGS(SEQ ID NO：91) 3.537E-08
无插入 6.961E-09
CE115HA000 1.097E-07
(6-7)使用NNS核苷酸来研究向H链CDR3中插入文库
(6-6)中显示使用GGS接头可以插入3、6、9个氨基酸，认为只要制作插入有3、6、9个氨基酸的文库、并采用如通常的噬菌体展示法所代表的抗体获取法，就可以获取与第2抗原结合的抗体。于是，研究了在向CDR3中插入6个氨基酸时，即使在使用NNS核苷酸(呈现各种氨基酸)插入6个氨基酸的位点呈现各种氨基酸，也能否依然保持与CD3的结合。因预料到结合活性会降低，因此使用NNS核苷酸设计了引物，使在CD3ε结合活性比CE115HA000高的CE115HA340序列(SEQ ID NO：59)的CDR3中的99-100(Kabat编号)之间插入6个氨基酸。抗体分子以一臂抗体的形式进行表达。具体而言，采用包含上述改变的上述H链和Kn010G3(SEQID NO：56)作为H链，采用连接有Kappa序列(SEQ ID NO：55)的GLS3000(SEQ ID NO：53)作为L链，按照参考实施例1进行了表达纯化。关于所获取的改变抗体，按照(6-3)中记载的方法进行了结合评价。其结果见表11。明确了：即使在延长了氨基酸的位点呈现各种氨基酸的情况下，也可保持与CD3(CD3ε)的结合性。再通过参考实施例2所示的方法评价了非特异性结合是否增强，结果见表12。其结果，当在CDR3伸长了的环内包含许多侧链带有正电荷的氨基酸时与ECM的结合增强，因此希望在环内不呈现侧链带有3个以上的正电荷的氨基酸。
[表11]
Figure BDA0003085543880000841
[表12]
Figure BDA0003085543880000851
(6-7)Dual Fab文库的设计和构建
根据实施例6所记载的研究，如下设计了用于获取与CD3和第2抗原结合的抗体的抗体文库(Dual Fab文库)。
步骤1：选择保持着CD3(CD3ε)结合能力的氨基酸(CD3结合量为CE115HA000的80％以上)；
步骤2：选择与改变前相比ECM结合为MRA结合的10倍以内的氨基酸；
步骤3：在H链CDR3的99-100(Kabat编号)之间插入6个氨基酸。
需要说明的是，由于仅通过步骤1就可使Fab的抗原结合位点多样化，因此能够成为鉴定与第2抗原结合的抗原结合分子的文库。此外，由于仅通过步骤1和3就可使Fab的抗原结合位点多样化，因此能够成为鉴定与第2抗原结合的抗原结合分子的文库。即使是未经过步骤2的文库设计，也可以对所获取的分子测定ECM结合并进行评价。
由上述结果可知：在Dual Fab文库的H链中，对于在CE115HA000的FR(框架)中加入了V11L/L78I变异而得到的序列，如表13所示，作为CDR进行了多样化，在L链中如表14所示使GLS3000的CDR多样化。关于这些抗体文库片段，通过本领域技术人员所公知的DNA合成方法可以合成该文库片段。作为Dual Fab文库，可以制作下述文库：(1)将H链如表13所示进行了多样化、并将L链固定为原始序列GLS3000或实施例6所记载的CD3ε结合有所增强的L链的文库；(2)将H链固定为原始序列(CE115HA000)或实施例6所记载的CD3ε结合有所增强的H链、并将L链如表14所示进行了多样化的文库；(3)将H链如表13所示进行了多样化、并将L链如表14所示进行了多样化的文库。将在CE115HA000的FR(框架)中加入了V11L/L78I变异并如表13所示将CDR多样化而得到的H链文库序列委托给DNA2.0的DNA合成会社，获取了抗体文库片段(DNA片段)。所获取的抗体文库片段通过PCR法扩增后，插入到噬菌体展示用噬菌粒中。此时，作为L链，选择了GLS3000。再将所构建的噬菌体展示用噬菌粒通过电穿孔法导入大肠杆菌中，制作了保留有抗体文库片段的大肠杆菌。
[表13]
Figure BDA0003085543880000871
[表14]
Figure BDA0003085543880000881
[实施例7]由Dual Fab文库获取与CD3和第2抗原(IL6R)结合的Fab结构域
(7-1)获取与人IL6R结合的Fab结构域
根据实施例6中设计和构建的Dual Fab文库，鉴定了与人IL6R结合的Fab结构域(抗体片段)。使用经生物素标记的人IL6R作为抗原，进行了对人IL6R具有结合能力的抗体片段的浓缩。
由所构建的保持有噬菌体展示用噬菌粒的大肠杆菌产生噬菌体。将通过在产生了噬菌体的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG而沉淀的噬菌体集团用TBS进行稀释，从而获得了噬菌体文库溶液。接下来，在噬菌体文库溶液中添加BSA使终浓度达到4％BSA。作为筛选方法，参照了作为常规方法的、使用了固定在磁珠上的抗原的筛选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9；J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203；Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20；Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。作为磁珠，使用NeutrAvidin包被的磁珠(NeutrAvidin包被的Sera-Mag SpeedBeads)或链霉亲和素包被的磁珠(Dynabeads M-280链霉亲和素)。
具体而言，通过在所调制的噬菌体文库溶液中加入250pmol的生物素标记抗原，使该噬菌体文库溶液在室温下与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原-噬菌体复合体与磁珠在室温下结合15分钟。磁珠用TBST(含有0.1％Tween20的TBS,TBS由TaKaRa公司制造)清洗3次，之后再用1mL的TBS清洗2次。之后，将加入有0.5mL 1mg/mL的胰蛋白酶的磁珠在室温下悬浮15分钟，之后立刻使用磁性台架分离磁珠，回收了噬菌体溶液。将所回收的噬菌体溶液添加在10mL处于对数生长期(OD600为0.4-0.5)的大肠杆菌株ER2738中。在37℃下缓慢进行1小时的上述大肠杆菌的搅拌培养，使噬菌体感染了大肠杆菌。将所感染的大肠杆菌接种在225mm×225mm的板上。接下来，通过从所接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，调制了噬菌体文库溶液。将此循环称为筛选，并多次进行重复。需要说明的是，在第2次以后的筛选中使用了40pmol的生物素标记抗原。此外，在第4次筛选中，以对CD3的结合性为指标进行了噬菌体的浓缩。具体而言，通过在所调制的噬菌体文库溶液中加入250pmol的生物素标记CD3ε肽抗原(氨基酸序列SEQ ID NO:60)，使噬菌体文库在室温下与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原-噬菌体复合体与磁珠在室温下结合15分钟。磁珠用1mL包含0.1％Tween20的TBS和TBS进行清洗。将加入了0.5mL 1mg/mL的胰蛋白酶的磁珠在室温下悬浮15分钟，之后立即使用磁性台架分离磁珠，回收了噬菌体溶液。从进行了胰蛋白酶处理的噬菌体溶液中回收的噬菌体被添加在10mL处于对数生长期(OD600为0.4-0.7)的大肠杆菌株ER2738中。在37℃下缓慢进行1小时的上述大肠杆菌的搅拌培养，从而使噬菌体感染了大肠杆菌。将所感染的大肠杆菌接种在225mm×225mm的板上。接下来，从所接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，从而回收了噬菌体文库溶液。
而且，为了防止多个噬菌体感染一个大肠杆菌，对于由通过第5次筛选回收的噬菌体所感染的大肠杆菌调制的噬菌体文库溶液再次进行了100,000倍的稀释，使所得的噬菌体液感染大肠杆菌，获得了单一菌落。
(7-2)噬菌体所呈递的Fab结构域与CD3或IL6R的结合(噬菌体ELISA法)按照常规方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，由通过上述方法获得的大肠杆菌的单一菌落回收含噬菌体的培养上清。将添加了BSA使终浓度达到4％BSA的含噬菌体的培养上清按照以下的顺序供给ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用100μL包含生物素标记抗原(生物素化CD3ε肽或生物素化人IL6R)的PBS在4℃下包被一夜、或者在室温下包被1小时。通过用PBST清洗该板的各孔来除去抗原，之后用250μL的4％BSA-TBS封闭该孔达1小时以上。将在除去了4％BSA-TBS的各孔中加入了所调制的培养上清的该板在室温下静置1小时，从而使呈递噬菌体的抗体与各孔中所存在的抗原结合。用TBST清洗各孔，之后添加终浓度为4％BSA的经TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)，孵育1小时。用TBST清洗后，通过添加硫酸使添加有TMB单一溶液(ZYMED)的各孔中的溶液的显色反应停止，之后根据450nm的吸光度测定了该显色。其结果见图19。结果显示出：克隆#50和#62对CD3ε和人IL6R具有结合性。即，通过使用Dual Fab文库，可以选择对第2抗原(在实施例7中为人IL6R)显示出结合性的克隆。进一步增加评价数，选定显示出结合性的克隆并进行IgG化(将克隆所具有的VH和VL序列分别与人H链或L链恒定区连接)，可以评价其与CD3ε和第2抗原(人IL6R)的结合性。进而，通过实施例3或4中记载的方法或竞争法，可以研究是否同时与CD3ε和第2抗原(人IL6R)结合。在竞争法中显示：例如与抗体单独存在时相比，在存在第2抗原的情况下，该克隆与CD3ε的结合降低，因此不会同时进行结合。
[实施例8]由Dual Fab文库获取与CD3和第2抗原(人IgA)结合的Fab结构域
(8-1)获取与人IgA结合的Fab结构域
IgA是体内大量存在的抗体的同种型，作为参与肠道或粘膜表面的生物体防御的分子而已知，已知其与FcαR(Fcα受体)结合(J.Pathol.208:270-282,2006)。
由实施例6中设计和构建的Dual Fab文库鉴定了与人IgA结合的Fab结构域(抗体片段)。使用经生物素标记的人IgA(记载在参考实施例3中。)作为抗原，进行了对人IgA具有结合能力的抗体片段的浓缩。
由所构建的保持有噬菌体展示用噬菌粒的大肠杆菌产生了噬菌体。将通过在产生了噬菌体的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG而沉淀的噬菌体集团用TBS进行稀释，获得了噬菌体文库溶液。接下来，在噬菌体文库溶液中添加BSA，使终浓度达到4％BSA。作为筛选方法，参照作为常规方法的、使用了固定在磁珠上的抗原的筛选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9；J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203；Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20；Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。作为磁珠，使用NeutrAvidin包被的磁珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或链霉亲和素包被的磁珠(Dynabeads M-280链霉亲和素)。
具体而言，通过在所调制的噬菌体文库溶液中加入250pmol的生物素标记抗原，使该噬菌体文库溶液在室温下与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原-噬菌体复合体与磁珠在室温下结合15分钟。磁珠用TBST(含0.1％Tween20的TBS，TBS由TaKaRa公司制造)清洗3次，之后再用1mL的TBS清洗2次。之后，将加入有0.5mL 1mg/mL的胰蛋白酶的磁珠在室温下悬浮15分钟，之后立即使用磁性台架分离磁珠，回收了噬菌体溶液。所回收的噬菌体溶液添加在10mL处于对数生长期(OD600为0.4-0.5)的大肠杆菌株ER2738中。在37℃下缓慢进行1小时的上述大肠杆菌的搅拌培养，使噬菌体感染了大肠杆菌。将所感染的大肠杆菌接着在225mm×225mm板上。接下来，通过从所接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，调制了噬菌体文库溶液。将此循环称为筛选，并重复进行了4次。需要说明的是，在第2次以后的筛选中人IgA设为40pmol。
(8-2)噬菌体所呈递的Fab结构域与CD3或人IgA的结合
按照常规方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，由通过上述方法获得的大肠杆菌的单一菌落回收了含噬菌体的培养上清。将加入有BSA使终浓度达到4％BSA的含噬菌体的培养上清按照以下的顺序供给ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用100μL含生物素标记抗原(生物素标记CD3ε肽或生物素标记人IgA，参考实施例3)的PBS在4℃下包被一夜、或者在室温下包被1小时。通过用PBST清洗该板的各孔来除去抗原，之后用250μL的0.1×TBS/150mM NaCl/0.02％脱脂乳封闭该孔达1小时以上。将在除去0.1×TBS/150mM NaCl/0.02％脱脂乳后的各孔中加入了所调制的培养上清的该板在室温下静置1小时，从而使噬菌体所呈递的抗体与各孔中所存在的抗原结合。用0.1×TBS/150mM NaCl/0.01％Tween20清洗各孔，之后添加经0.1×TBS/150mM NaCl/0.01％Tween20稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)，孵育1小时。用TBST清洗后，通过添加硫酸，使添加有TMB single溶液(ZYMED)的各孔中的溶液的显色反应停止，之后根据450nm的吸光度测定了该显色。其结果见图20。如图20所示，显示了存在与CD3和人IgA结合的克隆，通过使用Dual Fab文库，可以选择对第2抗原(在实施例8中为人IgA)显示出结合性的克隆。
(8-3)具有所获取的Fab结构域的IgG与CD3或人IgA的结合
对于在(8-2)中显示出与CD3和人IgA的结合的克隆，使用特异性地与Dual Fab文库的H链结合的引物，通过PCR法由具有上述克隆的序列的大肠杆菌扩增了VH片段。增幅后的VH片段按照参考实施例1的方法插入到插入有pE22Hh的动物细胞表达用质粒中，与实施例6(6-2)一样，以一臂抗体的形式进行了表达和纯化。克隆名称和H链序列的SEQ ID NO(序列编号)见表15。即，采用将表15所示的H链、Kn010G3(SEQ ID NO：56)、作为L链的GLS3000(SEQ ID NO：53)和Kappa序列(SEQ ID NO：55)连接而成的序列，按照参考实施例1进行了表达纯化。
[表15]
样品名称 SEQ ID NO
IGAR4C09#1 61
IGAR4C12#4 62
IGAR6(2)B02#1 63
通过电化学发光法(ECL法)判定了具有所获取的Fab区的抗体分子是否与CD3ε、人IgA结合。具体而言，在Nunc-Immuno(tm)MicroWell(tm)96孔圆板(Nunc)的各孔中分别添加25μL的经TBST溶液(TaKaRa公司制造，在TBS中加入了0.1％Tween20而得到的溶液)稀释的生物素标记CD3ε肽(记载在实施例7中)或生物素标记人IgA(参考实施例3)、调制成2μg/mL的抗体溶液、和添加有sulfo-tag的抗人IgG抗体(Invitrogen#628400)进行混合，之后一边避光一边在室温下孵育1小时以上，形成了抗体抗原复合体。向链霉亲和素板(MSD)的各孔中分别加入150μL含0.5％BSA的TBST溶液(标记为封闭液)，在室温下孵育1小时以上。除去封闭液后，用250μL TBS(-)溶液清洗3次。在各孔中分别添加50μL抗体抗原复合体溶液，在室温下孵育1小时，经由生物素化抗原使生物素化抗原-抗体-检测用sulfo-tag抗体的复合体溶液与链霉亲和素板结合。除去抗体抗原复合体溶液后，用TBST溶液清洗3次，在各孔中分别加入150μL将4×READ缓冲液(MSD)用水稀释2倍而得到的溶液，通过Sector Imager2400(MSD)检测了sulfo-tag的发光信号。
其结果见图21。结果显示出：在将通过噬菌体ELISA确认到了结合的克隆(包含含有一部分氨基酸变异的克隆在内)进行IgG化时，即使通过噬菌体ELISA确认到了结合的序列已形成了IgG，这些序列也会与CD3ε和人IgA结合。
该结果显示出：可由Dual Fab文库获取与第2抗原结合的抗体，可以浓缩(富集)在使用普通噬菌体文库进行的淘选中虽然只有Fab结构域、但即使形成包含Fc区的IgG也会确认到结合的克隆。因此，认为Dual Fab文库是可以获取保持与CD3的结合能力、同时具有与第2抗原的结合能力的Fab结构域的文库。
(8-4)评价具有所获取的Fab结构域的IgG同时与CD3(CD3ε)和人IgA结合(8-3)中显示出：由Dual Fab文库获得的克隆即使形成IgG也具有结合活性。接下来，通过竞争法(电化学发光法(ECL法))判定了所得的IgG是否同时与CD3(CD3ε)和人IgA结合。当同时与CD3(CD3ε)和人IgA结合时，即使在与IgA结合的抗体中加入CD3(CD3ε)，ECL信号也没有变化，但在无法同时结合的情况下，若加入CD3(CD3ε)，则一部分抗体与CD3(CD3ε)结合，ECL信号应该降低。
具体而言，在Nunc-Immuno(tm)MicroWell(tm)96孔圆板(Nunc)的各孔中添加25μL经TBST溶液稀释的生物素化人IgA、12.5μL调制成1μg/mL的抗体溶液、12.5μL的TBST或用于竞争的CD3ε同源二聚体蛋白(9.4pmol/μL)、和25μL添加有sulfo-tag的抗人IgG抗体(Invitrogen#628400)进行混合，之后一边避光一边在室温下孵育1小时以上，形成了抗体抗原复合体。向链霉亲和素板(MSD)的各孔中分别加入150μL含0.5％BSA的TBST溶液(标记为封闭液。TBST溶液是在TaKaRa公司制造的TBS中加入了0.1％Tween20而得到的溶液)，在室温下孵育1小时以上。除去封闭液后，用250μL TBST溶液清洗3次。向各孔中分别添加50μL抗体抗原复合体溶液，在室温下孵育1小时，经由生物素化抗原使生物素化抗原-抗体-检测用sulfo-tag抗体的复合体溶液与链霉亲和素板结合。除去抗体抗原复合体溶液后，用TBST溶液清洗3次，向各孔中分别加入150μL将该4×READ缓冲液(MSD)用水稀释2倍而得到的溶液，通过Sector Imager 2400(MSD)检测了sulfo-tag的发光信号。
其结果见图22。在加入了用于竞争的CD3ε同源二聚体蛋白时，与加入TBST时相比，确认到了ECL信号减弱。该结果显示出：通过该研究发现的与CD3和人IgA结合的分子是若与CD3结合则无法与人IgA结合的Dual Fab分子。该结果显示出：由Dual Fab文库可以获取具有与第2抗原的结合能力的抗体，其中，可以获取若与CD3结合则无法与第2抗原结合(或者，若与第2抗原结合则无法与CD3结合)的无法同时与多个抗原结合的Dual Fab分子。
在(8-2)中当由使用噬菌体进行的结合活性评价发现结合分子时，通过增加评价数，可以增加结合分子的序列的多样性，这为本领域技术人员所自明，因此由以上结果可知：Dual Fab文库是可以获取在保持对CD3的结合能力的同时还具有与第2抗原的结合能力的Fab结构域的文库。此外，在本实施例中，虽然使用了只将H链进行了多样化的Dual Fab文库，但通常文库大小(也称作多样性，是指文库中包含各种序列)大者更能够获取抗原结合分子，因此与本实施例所示的情形一样，将L链也进行了多样化的Dual Fab文库也可用于获取Dual Fab分子。
如实施例8所示，如果可以制作Dual Fab分子，则可以利用本领域技术人员所公知的方法、例如杂交瘤法或由抗体文库筛选结合抗体(或结合结构域)的方法鉴定与第3抗原结合的Fab或抗原结合结构域，关于具有所鉴定的与第3抗原结合的抗原结合结构域(例如Fab)和Dual Fab分子的Fab结构域的抗体，可以通过本领域技术人员所公知的多特异性抗体的制作方法、例如将L链共同化以制作两条H链不同的抗体的方法(控制Fc区的各结构域的界面的技术)、Cross Mab法、Fab臂交换法获取多特异性抗体。即，如果可以鉴定Dual Fab分子，则可以通过本领域技术人员所公知的方法，将与第3抗原结合的Fab和实施例8所示的与第1抗原和第2抗原结合的Dual Fab组合，获取所期望的多特异性抗体。
(8-5)关于CD3/人IgA Dual Fab分子
实施例8中显示出：可获得与CD3ε和人IgA结合、且不同时与CD3ε和人IgA结合的Dual Fab分子。而且，通过本领域技术人员所公知的方法，还可以添加与第3抗原结合的抗原结合结构域。
近年来，研究显示出：改变成了与作为癌抗原之一的EGFR结合的IgA分子在表达EGFR的癌细胞中诱导细胞死亡(J Immunol 2007；179:2936-2943)。有报道称，其原理在于：作为IgA受体的FcαR在多形核细胞中表达，在癌细胞中诱导自噬(JImmunol 2011；187:726-732)。通过本实施例明确了可以构建与CD3和IgA结合的Dual Fab分子，但在通过本领域技术人员所公知的方法(例如ELISA或ECL法)探索经由IgA与FcαR结合的分子时，可以期待由FcαR介导的抗肿瘤效果。即，该Dual Fab在表达任意的第3抗原的细胞中通过与CD3ε结合可以诱导由T细胞产生的细胞毒活性，并经由与IgA的结合诱导由表达FcαR的细胞产生的细胞毒活性，可以期待强细胞毒活性。
[实施例9]由Dual Fab文库获取与CD3和第2抗原(人CD154)结合的Fab结构域
(9-1)获取与人CD154结合的Fab结构域
根据实施例6中设计和构建的Dual Fab文库，鉴定了与人CD154结合的Fab结构域(抗体片段)。使用经生物素标记的人CD154作为抗原，进行了对人CD154具有结合能力的抗体片段的浓缩。
由所构建的保持有噬菌体展示用噬菌粒的大肠杆菌产生了噬菌体。将通过在产生了噬菌体的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG而沉淀的噬菌体群用TBS进行稀释，获得了噬菌体文库溶液。接下来，在噬菌体文库溶液中添加BSA使终浓度达到4％BSA。作为筛选方法，参照作为常规方法的、使用了固定在磁珠上的抗原的筛选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9；J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203；Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20；Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。作为磁珠，使用NeutrAvidin包被的磁珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或链霉亲和素包被的磁珠(Dynabeads M-280链霉亲和素)。
具体而言，通过在所调制的噬菌体文库溶液中加入250pmol的生物素标记抗原，使该噬菌体文库溶液在室温下与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原-噬菌体复合体与磁珠在室温下结合15分钟。磁珠用TBST(含0.1％Tween20的TBS,TBS由TaKaRa公司制造)清洗3次，之后再用1mL的TBS清洗2次。之后，将加入有0.5mL1mg/mL的胰蛋白酶的磁珠在室温下悬浮15分钟后，立即使用磁性台架分离磁珠，回收了噬菌体溶液。将所回收的噬菌体溶液添加在10mL处于对数生长期(OD600为0.4-0.5)的大肠杆菌株ER2738中。在37℃下缓慢进行1小时的上述大肠杆菌的搅拌培养，从而使噬菌体感染了大肠杆菌。将所感染的大肠杆菌接种在225mm×225mm的板上。接下来，通过从所接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，调制了噬菌体文库溶液。将此循环称为筛选，并重复进行了5次。需要说明的是，在第2次以后的筛选中人CD154设为40pmol。
(9-2)噬菌体所呈递的Fab结构域与CD3或人CD154的结合
按照常规方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，由通过上述方法获得的大肠杆菌的单一菌落回收了含噬菌体的培养上清。将加入了BSA使终浓度达到4％BSA的含噬菌体的培养上清按照以下的顺序供给ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用100μL含生物素标记抗原(生物素标记CD3ε肽、生物素标记CD154)的PBS在4℃下包被一夜、或者在室温下包被1小时。通过用PBST清洗该板的各孔以除去抗原，之后将该孔用250μL的0.1×TBS/150mM NaCl/0.02％脱脂乳封闭1小时以上。在除去0.1×TBS/150mM NaCl/0.02％脱脂乳后的各孔中加入了所调制的培养上清的该板在室温下静置1小时，使呈递噬菌体的抗体与各孔中存在的抗原结合。用0.1×TBS/150mM NaCl/0.01％Tween20清洗各孔，之后添加经0.1×TBS/150mM NaCl/0.01％Tween20稀释的HRP结合抗M13抗体(AmershamPharmacia Biotech)，孵育1小时。用TBST清洗后，通过添加硫酸，使添加有TMB单一溶液(ZYMED)的各孔中的溶液的显色反应停止，之后根据450nm的吸光度测定了该显色。其结果见图23。如图23所示，显示了存在与CD3和CD154结合的克隆，通过使用Dual Fab文库，可以选择对第2抗原(在实施例9中为人CD154)显示出结合性的克隆。此外，如实施例7、8、9所示，对于不同的3个抗原，可以获取结合Fab结构域，由此显示出：Dual Fab文库起到用于获取与第2抗原结合的分子的文库的作用。
(9-3)具有所获取的Fab结构域的IgG与CD3或人CD154的结合
对于在(9-2)中显示为与CD3和人CD154结合的克隆，使用与Dual Fab文库的H链特异性地结合的引物，通过PCR由具有上述克隆的序列的大肠杆菌扩增了VH片段。将所增幅的VH片段按照参考实施例1的方法插入到插入有pE22Hh的动物细胞表达用质粒中，与实施例6(6-2)一样，以一臂抗体的形式进行了表达和纯化。所得的序列名称和H链序列的SEQ ID NO(序列编号)记载在表16中。具体而言，采用将表16中记载的H链和Kn010G3(SEQ ID NO:56)与作为L链的GLS3000(SEQ ID NO:53)和Kappa序列(SEQ ID NO:55)连接而成的序列，按照参考实施例1进行了表达纯化。
[表16]
Figure BDA0003085543880000971
通过电化学发光法(ECL法)判定了具有在(9-2)中根据噬菌体ELISA法显示为与CD3和人CD154结合的Fab区的抗体分子是否与CD3、人CD154结合。具体而言，在Nunc-Immuno(tm)MicroWell(tm)96孔圆板(Nunc)的各孔中添加25μL经TBST溶液稀释的生物素化CD3或生物素化人CD154、25μL调制成2μg/mL的抗体溶液、和25μL添加有sulfo-tag的抗人IgG抗体(Invitrogen#628400)进行混合，之后一边避光一边在室温下孵育1小时以上，形成了抗体抗原复合体。向链霉亲和素板(MSD)的各孔中分别加入150μL含0.5％BSA的TBST溶液(标记为封闭液。TBST溶液是在TaKaRa公司制造的TBS中加入了0.1％Tween20而得到的溶液)，在室温下孵育1小时以上。除去封闭液后，用250μL的TBST溶液清洗3次。向各孔中分别添加50μL抗体抗原复合体溶液，在室温下孵育1小时，经由生物素化抗原使生物素化抗原-抗体-检测用sulfo-tag抗体的复合体溶液与链霉亲和素板结合。除去抗体抗原复合体溶液后，用TBST溶液清洗3次，在各孔中分别加入150μL将4×READ缓冲液(MSD)用水稀释2倍而得到的溶液，通过Sector Imager 2400(MSD)检测了sulfo-tag的发光信号。
其结果见图24。结果显示出：在由通过噬菌体ELISA确认到了结合的克隆(包含含有一部分氨基酸变异的克隆在内)进行IgG化时，即使通过噬菌体ELISA确认到了结合的序列已形成了IgG，这些序列也会与CD3ε和人CD154结合。
由该结果显示出：由Dual Fab文库可以获取与第2抗原结合的抗体，在使用普通噬菌体文库进行的淘选中，虽然只是Fab结构域，但即使形成包含Fc区的IgG也可确认到结合的克隆的浓缩不仅可以为人IgA也可以为人CD154。因此，认为Dual Fab文库是可以获取在保持与CD3的结合能力的同时还具有与第2抗原的结合能力的Fab结构域的文库。
(9-4)评价具有所获取的Fab结构域的IgG同时与CD3ε和人CD154结合(9-3)中显示出：由Dual Fab文库获得的克隆即使形成IgG也存在结合。接下来，通过竞争法(电化学发光法(ECL法))判定了所得的IgG是否同时与CD3和人CD154结合。当同时与CD3和人CD154结合时，即使在与CD154结合的抗体中加入CD3，ECL信号也没有变化，但在无法同时结合的情况下，若加入CD3，则一部分抗体与CD3结合，ECL信号应该降低。
具体而言，在Nunc-Immuno(tm)MicroWell(tm)96孔圆板(Nunc)的各孔中添加25μL经TBST溶液稀释的生物素化人CD154、12.5μL调制成1μg/mL的抗体溶液、12.5μL TBST或用于竞争的CD3ε同源二聚体蛋白(9.4pmol/μL)、和25μL添加有sulfo-tag的抗人IgG抗体(Invitrogen#628400)进行混合，之后一边避光一边在室温下孵育1小时以上，形成了抗体抗原复合体。向链霉亲和素板(MSD)的各孔中分别加入150μL含0.5％BSA的TBST溶液(标记为封闭液。TBST溶液是在TaKaRa公司制造的TBS中加入了0.1％Tween20而得到的溶液)，在室温下孵育1小时以上。除去封闭液后，用250μL TBST溶液清洗3次。向各孔中分别添加50μL抗体抗原复合体溶液，在室温下孵育1小时，经由生物素化抗原使生物素化抗原-抗体-检测用sulfo-tag抗体的复合体溶液与链霉亲和素板结合。除去抗体抗原复合体溶液后，用TBST溶液清洗3次，向各孔分别加入150μL将4×READ缓冲液(MSD)用水稀释2倍而得到的溶液，通过Sector Imager 2400(MSD)检测了sulfo-tag的发光信号。
其结果见图25。当加入了用于竞争的CD3ε同源二聚体蛋白时，与加入TBST时相比，确认到ECL信号减弱。由该结果显示出：通过本研究发现的与CD3ε和人CD154结合的分子是若与CD3结合则无法与人CD154结合的Dual Fab分子。由该结果显示出：由Dual Fab文库可以获取与第2抗原结合的抗体，其中，可以获取若与CD3结合则无法与第2抗原结合(或者，若与第2抗原结合，则无法与CD3结合)的无法同时与多种抗原结合的Dual Fab分子。
在(9-2)中，当通过使用噬菌体进行的结合活性评价发现结合分子时，通过增加评价数，可以增加结合分子的序列的多样性，这为本领域技术人员所自明，因此由以上的结果可知：Dual Fab文库是可以获取在保持与CD3的结合能力的同时还具有与第2抗原的结合能力的Fab结构域的文库。此外，在本实施例中，虽然使用了仅将H链多样化的Dual Fab文库，但通常文库大小(也称作多样性，是指文库中包含各种序列)大者更可以获取抗原结合分子，因此将L链也进行了多样化的Dual Fab文库也可以如本实施例中所示的情形一样地用于获取Dual Fab分子。
如实施例9所示，如果可以制作Dual Fab分子，则可以采用本领域技术人员所公知的方法、例如杂交瘤法或由抗体文库筛选结合抗体或抗原结合结构域的方法鉴定与第3抗原结合的Fab或抗原结合结构域，关于具有所鉴定的与第3抗原结合的抗原结合结构域(例如Fab)和Dual Fab分子的Fab结构域的抗体，通过本领域技术人员所公知的多特异性抗体的制作方法、例如将L链共同化以制作两条H链不同的抗体的方法(控制Fc区的各结构域的界面的技术)、Cross Mab法、Fab臂交换法，可以获取多特异性抗体。即，如果可以鉴定DualFab分子，则通过本领域技术人员所公知的方法，将与第3抗原结合的Fab和实施例9中所示的与第1抗原和第2抗原结合的Dual Fab组合，可以获取所期望的多特异性抗体。由以上的实施例显示：通过对多种抗原应用Dual Fab文库，可以获取与CD3ε和第2抗原结合的分子，而且，通过实施例8和9可以获取虽然与第1抗原(CD3ε)和第2抗原结合、但不同时与第1抗原和第2抗原结合的分子。如上所述，鉴定与第3抗原结合的Fab可以通过本领域技术人员所公知的方法进行，因此通过使用Dual Fab文库，可以获取实施例1中记载的所期望的抗体。
(9-5)关于CD3/人CD154 Dual Fab分子
实施例9中显示出：可获得与CD3ε和人CD154结合、且不同时与CD3ε和人CD154结合的Dual Fab分子。而且，与第3抗原结合的抗原结合结构域的添加也可以通过本领域技术人员所公知方法来实施。
近年来，研究显示出：作为CD154受体的CD40的激动性抗体在移入癌抗原反应性T细胞的方法中增强抗肿瘤活性(J Immunother.2012Apr；35(3):276-82.)。明确了通过本实施例可以构建与CD3和CD154结合的Dual Fab分子，在选定经由CD154对CD40显示出激动活性的抗体时，可以期待由CD40介导的抗肿瘤效果。即可以期待着该Dual Fab在表达任意的第3抗原的细胞中通过与CD3ε结合来增强由T细胞产生的细胞毒活性、通过与CD154结合来增强由CD40的激动信号介导的抗肿瘤效果。
[参考实施例]
[参考实施例1]抗体的表达载体的制作和抗体的表达与纯化
使用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)、PCR或In fusion AdvantagePCR克隆试剂盒(TAKARA)等，按照本领域技术人员所公知的方法导入氨基酸取代，构建了表达载体。所得的表达载体的核苷酸序列通过本领域技术人员所公知的方法进行确定。将所制作的质粒瞬时导入来源于人胚肾癌细胞的HEK293H细胞株(Invitrogen)或FreeStyle293细胞(Invitrogen)中，进行了抗体的表达。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GEHealthcare)，按照本领域技术人员所公知的方法，由所得的培养上清纯化出抗体。关于纯化抗体浓度，使用分光光度计测定280nm下的吸光度，由所得的值通过PACE法算出吸光系数，再使用该吸光系数算出了抗体浓度(Protein Science 1995；4:2411-2423)。
[参考实施例2]抗体与ECM(Extracellular matrix；细胞外基质)的结合评价
参考WO2012093704A1，按以下顺序实施了抗体与ECM(Extracellular matrix，细胞外基质)的结合评价。将不含酚红的ECM(BD Matrigel#356237)用TBS稀释至2mg/mL，向在冰上冷却后的ECL测定用板(L15XB-3、MSD high bind)的各孔的正中央滴加5μL。之后，用封板条盖好，在4℃下静置一夜。将固定有ECM的板恢复至室温，在各孔中加入150μL ECL封闭缓冲液(在PBS中加入0.5％BSA和0.05％Tween20而得到的溶液)，在室温下静置2小时以上、或者在4℃下静置一夜。接下来，使用PBS-T(在PBS中加入0.05％Tween20而得到的溶液)将抗体样品稀释至9μg/mL。使用ECLDB(在PBS中加入0.1％BSA和0.01％Tween20而得到的溶液)将二次抗体稀释至2μg/mL，向在各孔中分别注入有10μL ECLDB的圆底板中加入20μL抗体溶液、30μL二次抗体溶液，避光下在室温下搅拌1小时。从加入有ECL封闭缓冲液的ECM板中倾倒除去ECL封闭缓冲液，在该板上加入各50μL的上述抗体、二次抗体的混合溶液。之后在避光下在室温下静置1小时。倾倒除去样品后，在各孔中分别加入150μL READ缓冲液(MSD)，通过Sector Imager 2400(MSD)检测了sulfo-tag的发光信号。
[参考实施例3]人IgA的制备
作为人IgA，使用了天然存在的人IgA序列中的Fc部分(人IgA-Fc)。为了在人IgA-Fc的C末端添加生物素，经由接头连接通过生物素连接酶添加了生物素的编码特异性序列(AviTag序列、SEQ ID NO:79)的基因片段。将编码连接有人IgA-Fc和AviTag序列的蛋白(SEQ ID NO:80)的基因片段插入动物细胞表达用载体中，将所构建的质粒载体利用293Fectin(Invitrogen)导入到FreeStyle293细胞(Invitrogen)中。此时，同时导入了表达EBNA1(SEQ ID NO:81)的基因和表达生物素连接酶(BirA、SEQ ID NO:82)的基因，再添加生物素以对人IgA-Fc进行生物素标记。将按照上述顺序导入了基因的细胞在37℃、8％的CO2中培养6天，使目标蛋白分泌到培养上清中。
将含有目标人IgA-Fc的细胞培养液用0.22μm的瓶顶过滤器进行过滤，获得了培养上清。将用相同溶液稀释的培养上清加载到用20mM的Tris-HCl、pH7.4平衡好的HiTrap QHP(GE Healthcare)上，通过NaCl的浓度梯度洗脱目标人IgA-Fc。接下来，将用相同溶液稀释的上述HiTrap Q HP洗脱液加载到用50mM的Tris-HCl、pH8.0平衡好的SoftLink Avidin柱(Promega)上，用5mM的生物素、150mM的NaCl、50mM的Tris-HCl、pH8.0洗脱目标人IgA-Fc。之后，通过使用了Superdex200(GE Healthcare)的凝胶过滤层析，除去作为目标外杂质的缔合体，将缓冲液换成了20mM的组氨酸-HCl、150mM的NaCl、pH6.0，得到了纯化人IgA-Fc。
产业实用性
根据本发明，提供一种多肽，所述多肽可以增强由抗原结合分子产生的活性，同时可以避免认为是副作用的原因的、通过与在不同细胞上表达的抗原结合而发生的该不同细胞间的交联，其适合用作医药品。
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Claims (83)

1.抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：
可与第1抗原和不同于该第1抗原的第2抗原结合，但不同时与第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区；以及
与不同于该第1抗原和第2抗原的第3抗原结合的可变区。
2.抗原结合分子，所述抗原结合分子包含抗体可变区，所述抗体可变区的重链可变结构域的氨基酸改变成使得所述可变区可与第1抗原和不同于该第1抗原的第2抗原结合、但不同时与第1抗原和第2抗原结合。
3.权利要求1或2所述的抗原结合分子，其中，不同时与第1抗原和第2抗原结合的可变区为不同时与分别在不同的细胞上表达的第1抗原和第2抗原结合的可变区。
4.权利要求1～3中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子还包含抗体的Fc区。
5.权利要求4所述的抗原结合分子，其中，Fc区是与天然型人IgG1抗体的Fc区相比对FcγR的结合活性降低的Fc区。
6.权利要求1～5中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子为多特异性抗体。
7.权利要求1～6中任一项所述的抗原结合分子，其中，可与第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区为至少具有1个氨基酸改变的可变区。
8.权利要求7所述的抗原结合分子，其中，所述改变为至少1个氨基酸的取代或插入。
9.权利要求7或8所述的抗原结合分子，其中，所述改变是与第1抗原结合的可变区的氨基酸序列的一部分取代成与第2抗原结合的氨基酸序列、或者是在与第1抗原结合的可变区的氨基酸序列中插入与第2抗原结合的氨基酸序列。
10.权利要求8或9所述的抗原结合分子，其中，待插入的氨基酸数目为1～25个。
11.权利要求7～10中任一项所述的抗原结合分子，其中，待改变的氨基酸为抗体可变区的CDR1、CDR2、CDR3或FR3区中的氨基酸。
12.权利要求7～11中任一项所述的抗原结合分子，其中，待改变的氨基酸为环区的氨基酸。
13.权利要求7～11中任一项所述的抗原结合分子，其中，待改变的氨基酸为选自抗体H链可变结构域中的Kabat编号位置31～35、50～65、71～74和95～102、L链可变结构域中的Kabat编号位置24～34、50～56和89～97的至少1个氨基酸。
14.权利要求1～13中任一项所述的抗原结合分子，其中，第1抗原或第2抗原的任一个抗原为在T细胞表面特异性表达的分子，另一个抗原为在T细胞或其它免疫细胞表面表达的分子。
15.权利要求14所述的抗原结合分子，其中，第1抗原或第2抗原中的任一个抗原为CD3，而另一个抗原为FcγR、TLR、凝集素、IgA、免疫限制点分子、TNF超家族分子、TNFR超家族分子或NK受体分子。
16.权利要求14或15所述的抗原结合分子，其中，第3抗原为癌组织中特异性表达的分子。
17.药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1～16中任一项所述的抗原结合分子和医学上可接受的载体。
18.筛选抗原结合分子的方法，所述方法包括下述步骤(i)～(ii)：
步骤(i)：制作抗原结合分子的文库，所述抗原结合分子为改变了与第1抗原或第2抗原结合的抗体可变区的至少1个氨基酸的抗原结合分子，其中所述改变的可变区的至少1个氨基酸彼此不同；
步骤(ii)：从所制作的文库中选择包含对第1抗原和第2抗原具有结合活性、但不同时与该第1抗原和第2抗原结合的可变区的抗原结合分子。
19.权利要求18所述的方法，其中，步骤(ii)中选择的抗原结合分子所含的、不同时与第1抗原和第2抗原结合的可变区为不同时与分别在不同的细胞上表达的第1抗原和第2抗原结合的可变区。
20.权利要求18或19所述的方法，其中，步骤(iii)中培养的宿主细胞还包含编码抗体Fc区的核酸。
21.权利要求20所述的方法，其中，Fc区是与天然型人IgG1抗体的Fc区相比对FcγR的结合活性降低的Fc区。
22.权利要求18～21中任一项所述的方法，其中，待制备的抗原结合分子为多特异性抗体。
23.权利要求18～22中任一项所述的方法，其中，步骤(i)中的可变区的至少1个已改变的氨基酸为取代或插入的氨基酸。
24.权利要求23所述的方法，其中，所插入的氨基酸数目为1～25个。
25.权利要求18～24中任一项所述的方法，其中，所述改变是抗体可变区的CDR1、CDR2、CDR3或FR3区的氨基酸的改变。
26.权利要求18～25中任一项所述的方法，其中，所述改变是环区的氨基酸的改变。
27.权利要求18～25中任一项所述的方法，其中，所述改变是选自抗体H链可变区的Kabat编号位置31～35、50～65、71～74和95～102、L链可变区的Kabat编号位置24～34、50～56和89～97的至少1个氨基酸的改变。
28.权利要求18～27中任一项所述的方法，其中，第1抗原和第2抗原中的任一个抗原为在T细胞表面特异性表达的分子，而另一个抗原为在T细胞或其它免疫细胞表面表达的分子。
29.权利要求28所述的方法，其中，第1抗原和第2抗原中的任一个抗原为CD3，而另一方抗原为FcγR、TLR、IgA、凝集素、免疫限制点分子、TNF超家族分子、TNFR超家族分子或NK受体分子。
30.权利要求28或29所述的方法，其中，第3抗原为癌组织中特异性表达的分子。
31.制备抗原结合分子的方法，所述方法包括下述步骤(i)～(iv)：
步骤(i)：制作抗原结合分子的文库，所述抗原结合分子为改变了与第1抗原或第2抗原结合的抗体可变区的至少1个氨基酸的抗原结合分子，其中所述改变的可变区的至少1个氨基酸彼此不同；
步骤(ii)：从所制作的文库中选择包含对第1抗原和第2抗原具有结合活性、但不同时与该第1抗原和第2抗原结合的可变区的抗原结合分子；
步骤(iii)：培养含有编码通过步骤(ii)选择的抗原结合分子的该可变区的核酸、和/或编码与第3抗原结合的抗原结合分子的可变区的核酸的宿主细胞，使含有可与第1抗原和第2抗原结合但不同时与该第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区、和/或与第3抗原结合的可变区的抗原结合分子表达；以及
步骤(iv)：从上述宿主细胞培养物中回收抗原结合分子。
32.权利要求31所述的方法，其中，步骤(ii)中选择的抗原结合分子所含的、不同时与第1抗原和第2抗原结合的可变区为不同时与分别在不同的细胞上表达的第1抗原和第2抗原结合的可变区。
33.权利要求30或31所述的方法，其中，步骤(iii)中培养的宿主细胞还包含编码抗体Fc区的核酸。
34.权利要求33所述的方法，其中，Fc区是与天然型人IgG1抗体的Fc区相比对FcγR的结合活性降低的Fc区。
35.权利要求31～34中任一项所述的方法，其中，待制备的抗原结合分子为多特异性抗体。
36.权利要求31～35中任一项所述的方法，其中，步骤(i)中的可变区的至少1个已改变的氨基酸为取代或插入的氨基酸。
37.权利要求36所述的方法，其中，所插入的氨基酸数目为1～25个。
38.权利要求31～37中任一项所述的方法，其中，所述改变是抗体可变区的CDR1、CDR2、CDR3或FR3区中的氨基酸的改变。
39.权利要求31～38中任一项所述的方法，其中，所述改变是环区的氨基酸的改变。
40.权利要求31～38中任一项所述的方法，其中，所述改变是选自抗体H链可变区的Kabat编号位置31～35、50～65、71～74和95～102、L链可变区的Kabat编号位置24～34、50～56和89～97的至少1个氨基酸的改变。
41.权利要求31～40中任一项所述的方法，其中，第1抗原和第2抗原中的任一个抗原为在T细胞表面特异性表达的分子，而另一个抗原为在T细胞或任何其它免疫细胞表面表达的分子。
42.权利要求41所述的方法，其中，第1抗原和第2抗原中的任一个抗原为CD3，而另一方抗原为FcγR、TLR、IgA、凝集素、免疫限制点分子、TNF超家族分子、TNFR超家族分子或NK受体分子。
43.权利要求41或42所述的方法，其中，第3抗原为癌组织中特异性表达的分子。
44.抗原结合分子在制备用于治疗疾病的治疗剂中的用途，其中所述抗原结合分子包含：
可与第1抗原和不同于该第1抗原的第2抗原结合，但不同时与第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区；以及
与不同于该第1抗原和第2抗原的第3抗原结合的可变区。
45.抗原结合分子在制备用于治疗疾病的治疗剂中的用途，其中所述抗原结合分子包含抗体可变区，所述抗体可变区的重链可变区的氨基酸改变使得所述可变区可与第1抗原和不同于该第1抗原的第2抗原结合、但不同时与第1抗原和第2抗原结合。
46.权利要求44或45所述的用途，其中，不同时与第1抗原和第2抗原结合的可变区为不同时与分别在不同的细胞上表达的第1抗原和第2抗原结合的可变区。
47.权利要求44～46中任一项所述的用途，其中，所述抗原结合分子还包含抗体的Fc区。
48.权利要求47所述的用途，其中，所述Fc区是与天然型人IgG1抗体的Fc区相比对FcγR的结合活性降低的Fc区。
49.权利要求44～48中任一项所述的用途，其中，所述抗原结合分子为多特异性抗体。
50.权利要求44～49中任一项所述的用途，其中，可与第1抗原和第2抗原结合的抗体可变区为至少1个氨基酸改变的可变区。
51.权利要求50所述的用途，其中，所述改变为至少1个氨基酸的取代或插入。
52.权利要求50或51所述的用途，其中，所述改变是与第1抗原结合的可变区的氨基酸序列的一部分取代成与第2抗原结合的氨基酸序列、或者是在与第1抗原结合的可变区的氨基酸序列中插入与第2抗原结合的氨基酸序列。
53.权利要求51或52所述的用途，其中，待插入的氨基酸数目为1～25个。
54.权利要求50～53中任一项所述的用途，其中，待改变的氨基酸为抗体可变区的CDR1、CDR2、CDR3或FR3区的氨基酸。
55.权利要求50～54中任一项所述的用途，其中，待改变的氨基酸为环区的氨基酸。
56.权利要求50～54中任一项所述的用途，其中，待改变的氨基酸为选自抗体H链可变结构域的Kabat编号位置31～35、50～65、71～74和95～102、L链可变结构域的Kabat编号位置24～34、50～56和89～97的至少1个氨基酸。
57.权利要求44～56中任一项所述的用途，其中，第1抗原和第2抗原的任一个抗原为在T细胞表面特异性表达的分子，另一个抗原为在T细胞或任何其它免疫细胞表面上表达的分子。
58.权利要求57所述的用途，其中，第1抗原和第2抗原中的任一个抗原为CD3，而另一个抗原为FcγR、TLR、凝集素、IgA、免疫限制点分子、TNF超家族分子、TNFR超家族分子或NK受体分子。
59.权利要求57或58所述的用途，其中，第3抗原为癌组织中特异性表达的分子，并且所述疾病是癌症，其特征是具有所述分子的表达。
60.抗原结合分子，其包含
(1)第一抗体可变区，其包含第一抗原结合位点和第二抗原结合位点，其中
(a)第一抗原结合位点识别为人CD3的第一抗原，
(b)第二抗原结合位点(i)识别不是人CD3的第二抗原，并且(ii)不识别人CD3，
(c)当第二抗原结合位点与第二抗原结合时，第一抗原结合位点不能与第一抗原结合；和
(d)当第一抗原结合位点与第一抗原结合时，第二抗原结合位点不能与第二抗原结合；和
(2)包含第三抗原结合位点的第二抗体可变区，其中第三抗原结合位点识别不同于第一抗原和第二抗原的第三抗原。
61.抗原结合分子，其包含
(1)第一抗体可变区，其包含第一抗原结合位点和第二抗原结合位点，其中
(a)第一抗原结合位点识别为人CD3的第一抗原，
(b)第二抗原结合位点识别不是人CD3的第二抗原，并且不识别人CD3，
(c)与第一抗原结合位点不与第一抗原结合时相比，当第一抗原结合位点与第一抗原结合时，第二抗原结合位点与第二抗原结合的能力降低，和
(d)与第二抗原结合位点不与第二抗原结合时相比，当第二抗原结合位点与第二抗原结合时，第一抗原结合位点与第一抗原结合的能力降低；和
(2)包含第三抗原结合位点的第二抗体可变区，其中第三抗原结合位点识别不同于第一抗原和第二抗原的第三抗原。
62.根据权利要求60或权利要求61所述的抗原结合分子，其中所述第一抗原在第一类型的细胞上表达，所述第二抗原在不同类型的细胞上表达。
63.根据权利要求60或权利要求61所述的抗原结合分子，其中所述第二抗原结合位点位于所述第一抗原结合位点的环区或CDR1，CDR2，CDR3或FR3区内。
64.根据权利要求60或权利要求61所述的抗原结合分子，其中所述第二抗原结合位点包含氨基酸残基或肽，所述氨基酸残基或肽被插入在选自以下对的一对位置之间的第一抗体可变区中(全部通过Kabat编号)：
重链可变结构域位置52b和52c，
重链可变结构域位置72和73，
重链可变结构域位置98和99，
重链可变结构域位置100和100a。
65.根据权利要求60或61所述的抗原结合分子，其中所述第二抗原结合位点位于所述第一抗原结合位点的CDR3内。
66.根据权利要求60或权利要求61所述的抗原结合分子，其进一步包含抗体Fc区。
67.根据权利要求66所述的抗原结合分子，其中，与天然型的人IgG1抗体的Fc区相比，所述Fc区域显示与FcγR的结合减少。
68.根据权利要求60或权利要求61所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子是多特异性抗体。
69.根据权利要求60或权利要求61所述的抗原结合分子，其中，第一抗原或第二抗原中的任一个是在T细胞的表面上特异性表达的分子，并且第一抗原和第二抗原中的另一个是在T细胞或任何其他免疫细胞的表面上表达的分子。
70.根据权利要求69所述的抗原结合分子，其中所述第一或第二抗原的任一个是CD3，并且所述第一和第二抗原中的另一个选自由FcγR，TLR，凝集素，IgA，免疫限制点分子，TNF超家族分子，TNFR超家族分子和NK受体分子组成的组。
71.根据权利要求60或权利要求61所述的抗原结合分子，其中所述第二抗原结合位点是肽。
72.根据权利要求71所述的抗原结合分子，其中，所述肽与选自由血管内皮生长因子受体(VEGFR)，肿瘤坏死因子受体(TNFR)，toll样受体(TLR)5，TLR4，TLR2，T细胞极晚期抗原(VLA)受体，血小板衍生生长因子受体(PDGFR)，Naip5 Nod样受体(NLR)，整联蛋白，FcγRIIa，表皮生长因子受体(EGFR)，死亡受体(DR)5激动剂，4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)，分化簇(CD)40和CD154组成的组的抗原结合。
73.根据权利要求60或权利要求61所述的抗原结合分子，其中所述第二抗原结合位点位于所述抗原结合分子的第一抗体可变区中选自重链可变结构域Kabat编号位置31至35、50至65、71至74，和95至102，以及轻链可变结构域Kabat编号位置24至34、50至56和89至97的一个或多个位置。
74.根据权利要求60或权利要求61所述的抗原结合分子，其中，所述第三抗原是在癌组织中特异性表达的分子。
75.根据权利要求60或权利要求61所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子是sc(Fv)2。
76.根据权利要求60或权利要求61所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子与PEG或抗癌剂缀合。
77.药物组合物，其包含根据权利要求60或权利要求61的抗原结合分子和药学上可接受的载体。
78.一种文库，其包含氨基酸序列彼此不同的多种抗原结合分子，其中每种抗原结合分子均包含可与第一抗原和第二抗原结合但不同时结合的抗体可变区；
所述抗原之一是CD3；另一种抗原是在天然型的免疫细胞表面上表达的分子并且不是CD3。
79.权利要求78所述的文库，其中，所述多种抗原结合分子的抗体可变区的氨基酸序列彼此不同；每个抗体可变区包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)；和
序列的不同在氨基酸位置，其：
(a)可能从一个抗体可变区到另一个抗体可变区不同，和
(b)在选自VH互补决定区1(CDR1)，VH CDR2，VH CDR3，VH框架区3(FR3)，VL CDR1，VLCDR2，VL CDR3和VL FR3的一个或多个区域内。
80.权利要求79所述的文库，其中至少一些抗体可变区之间的序列的不同包括存在于VH环中的肽，所述环在VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3或VH FR3的一部分或全部内或包含所述一部分或全部，其中所述肽结合所述抗原之一。
81.根据权利要求80所述的文库，其中所述肽存在于至少一些抗体可变区的VH CDR3内。
82.权利要求78的文库，其中各种抗原结合分子的抗体可变区的氨基酸序列彼此不同；每个抗体可变区包含VH和VL；并且序列的不同在一个或多个氨基酸位置，其：
(a)可能从一个抗体可变区到另一个抗体可变区不同，和
(b)选自单独的VH位置31至35、50至65、71至74，和95至102，以及单独的VL位置24至34、50至56，和89至97(所有位置均由Kabat编号系统编号)。
83.权利要求78所述的文库，其中所述不是CD3的抗原选自由以下组成的组：
FcγR，toll样受体(TLR)，凝集素，免疫限制点分子，肿瘤坏死家族受体(TNFR)超家族分子，和自然杀伤(NK)细胞受体分子。
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