CN103946242A - 抗cd22嵌合抗原受体 - Google Patents

Abstract

本公开的内容提供一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含a)HA22的抗原结合结构域，跨膜结构域，和细胞内T细胞信号传导结构域；或b)BL22的抗原结合结构域，跨膜结构域，和包含CD28和／或CD137的细胞内T细胞信号传导结构域。公开了与CAR相关的核酸，重组表达载体，宿主细胞，细胞群，抗体或其抗原结合部分，和药物组合物。还公开了检测哺乳动物中癌症存在的方法和治疗或预防哺乳动物中癌症的方法。

Description

抗CD22嵌合抗原受体

对相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2011年10月20日提出的美国临时专利申请No.61／549，516的权益，其在此以其整体通过引用并入。

电子提交材料通过引用并入

在此以其整体通过引用并入的是与此同时提交的计算机可读核苷酸／氨基酸序列表并确定为以下文件：一个名为“711021_ST25.txt，，日期为2012年10月18日的69，127字节的ASCII(文本)文件。

发明背景

癌症是公共卫生问题。尽管在治疗如化疗方面有进步，但对于很多癌症(包括血液恶性肿瘤)的预后可能是差的。例如,已估计2000年在美国多于45，000的死亡预期由非霍奇金淋巴瘤和白血病导致(Greenlee等，CA癌症J.Clin.，50∶7-33(2000))。因此，存在未满足的对癌症尤其是血液恶性肿瘤的另外的治疗的需求。

发明概要

本发明提供嵌合抗原受体(CAR)，其包含∶a)HA22的抗原结合结构域，跨膜结构域，和细胞内T细胞信号传导结构域;或b)BL22的抗原结合结构域，跨膜结构域，和包含i)CD28和／或ii)CD137的细胞内T细胞信号传导结构域.

本发明的进一步实施方案提供与本发明的CAR有关的相关核酸，重组表达载体，宿主细胞，细胞群，抗体或其抗原结合部分，和药物组合物。

本发明另外的实施方案提供检测哺乳动物中癌症的存在的方法和治疗或预防哺乳动物中癌症的方法。

附图的一些视图的简述

图1为显示在不同的效应物对靶比(E∶T)比率下，由转导有下列CAR的一个的效应人T细胞导致的靶⁵¹Cr标记的白血病细胞的溶解％的图表：HA22-第二代，版本1(■；闭合正方形，SEQ ID NO∶15)，HA22-第三代(□；开放正方形，SEQ ID NO∶16)，BL22-第二代，版本1(●;闭合圆形，SEQ IDNO∶19)，BL22-第三代(○；开放圆形，SEQ ID NO∶20)，HA22-SH-第二代，版本1(▲；闭合三角形，SEQ ID NO∶17)，HA22-SH-第三代(△；开放三角形，SEQ ID NO∶18)，模拟品转导(未转导的，X)，或CD19-特异的CAR(*)。E∶T比率显示在x-轴且靶的溶解％在y-轴。该图说明SEM细胞系的直接分析并代表对其它测试细胞系观察到的溶解概况。

图2A-2B为显示在不同E∶T比率下由转导有如下三种不同的第二代，版本1抗CD22CAR构建体之一的效应细胞导致的靶白血病细胞系KOPN8(A)或NALM6(B)的溶解百分数图表：HA22-CH2CH3(■；正方形，SEQ ID NO∶15)，BL22-CH2CH3，(▲；；角形，SEQ ID NO∶19)，或HA22-SH(短免疫球蛋白恒定结构域序列；X，SEQ ID NO∶17)。包括抗CD19CAR(◆；菱形)作为对照。y-轴指示靶细胞的溶解百分数。x-轴显示E∶T比率，所述比率已如在实施例4中描述的，根据每个个体CAR构建体的转导百分数标准化。使用Excel(Microsoft)中的对数曲线拟合划线。

图3A-3B为显示在不同的E∶T比率下由转导有如下三种不同的第二代，版本1抗CD22CAR构建体之一的效应细胞导致的靶白血病细胞系REH(A)或SEM(B)的溶解百分数的图表∶HA22-CH2CH3(■；正方形，SEQ ID NO∶15)，BL22-CH2CH3，(▲;三角形，SEQ ID NO∶19)，或HA22-SH(短免疫球蛋白恒定结构域序列，X，SEQ ID NO∶17)。包括抗CD19CAR(◆；菱形)作为对照。y-轴指示靶细胞的溶解百分数。x-轴显示E∶T比率，所述比率已如在实施例4中描述的，根据每个个体CAR构建体的转导百分数标准化。使用Excel(Microsoft)中的对数曲线拟合划线。

图4为显示由转导有表达如下不同CAR构建体的一个的逆转录病毒载体的效应T-细胞导致的靶细胞系K562(暗灰)REH(黑)，SEM(白)，或NALM6(亮灰)的溶解百分数的图表∶HA2ND(SEQ ID NO∶15)；HA3RD(SEQ ID NO∶16)；HASH2ND(SEQ ID NO∶17)；或HASH3RD(SEQ IDNO∶18)。x-轴描述每个测试的转染细胞群。模拟品∶激活并培养为其它组但未暴露于包含CAR载体的(未转导的)逆转录病毒上清(s／n)的T细胞。抗CD19CAR用作对照。

图5A和5B为显示在不同E∶T比率下由效应物未转导的T细胞(A，“模拟品”)或转导有第二代，版本1HASH22CAR(SEQ ID NO∶17)(B，“HASH28z”)的效应细胞导致的表达CD22的白血病靶细胞系，REH(菱形)，SEM(正方形)，NALM6(三角形)，KOPN8(X)，Daudi(圆形)，Raji(|)，或CD22-阴性对照靶细胞系K562(*)的溶解百分数的图表。

图6A-6D显示在不同E∶T比率下由效应物未转导的T细胞(三角形，“模拟品”)或转导有第二代，版本1HA22CAR(圆形，HA2228z，SEQ IDNO∶15)或第二代，版本1BL22CAR(正方形，BL2228z，SEQ ID NO∶19)的效应细胞导致的表达CD22的白血病靶细胞系，REH(A)，SEM(B)，NALM-6(C)，或KOPN-8(D)的溶解百分数的图表。

图6E-6H为显示在不同E；T比率由效应物未转导的T细胞(三角形，“模拟品”)或转导有第三代HA22CAR(圆形，HA2228BBz，SEQ ID NO∶16)或第三代BL22CAR(正方形，BL2228BBz，SEQ ID NO∶20)的效应细胞导致的表达CD22的白血病靶细胞系，REH(E)，SEM(F)，NALM-6(G)，或KOPN-8(H)的溶解百分数的图表。

图6I-6L为显示在不同E∶T比率下由效应物未转导的T细胞(三角形，“模拟品”)或转导有具有(圆形，HA2228z，SEQ ID NO∶15)或不具有(正方形，HASH2228z，SEQ ID NO∶17)CH2CH3结构域的第二代，版本1HA22CAR的效应细胞导致的表达CD22的白血病靶细胞系，REH(I)，SEM(J)，NALM-6(K)，或KOPN-8(L)的溶解百分数的图表。

图7A为显示由荧光素酶(转染入白血病细胞，所述细胞注射入小鼠)与荧光素(其注射入小鼠)的反应产生，在30天的时限内测量的生物荧光信号(光子／s／cm²／sr)的图表。小鼠用对照T细胞(“模拟品，”未转导的，)或转导有HASH22CAR-第二代，版本1(SEQ ID NO∶17，闭合正方形)，HASH22CAR-第三代(SEQ ID NO∶18，▲)，或HA22SH-CAR-第二代，版本2(SEQ ID NO∶32，开放正方形)的T细胞处理。更高的光子／s／cm2／sr值指示更大的肿瘤负荷。

图7B为显示用对照T细胞（“模拟品，”未转导的，圆形)或转导有HASH22CAR-第二代，版本1(SEQ ID NO∶17，正方形)，HASH22CAR-第三代(SEQ ID NO∶18，△)，或HA22SH第二代，版本2(SEQ ID NO∶32，)T细胞处理的小鼠在30天内的存活百分数的图表。(模拟品对比HA22SH28z，P＝0.001；模拟品对比HA22SH28BBz，P＝0.004；模拟品对比HA22SHBBz，p＝0.001；HA22SH28Z对HA22SH28BBz，p＝0.03，HA22SH28z对HA22SH BBz，不显著)。

图8A-8D为显示描述的对与靶细胞REH(A)，SEM(B)，NALM-6(C)，或KOPN-8(D)共培养的转导有HA2228z(SEQ ID NO∶15)，HA2228BBz(SEQ ID NO∶16)，BL2228z(SEQ ID NO∶19)，BL2228BBz(SEQ ID NO∶20)，HASH2228z(SEQ ID NO∶17)，或HASH2228BBz(SEQ ID NO∶18)之一的效应细胞，如在实施例4中描述所计算的溶解单位图表。

图9A-9C为显示与白血病细胞系NALM6-GL(CD22低表达)(A)，Raji(CD22高表达)(B)，或K562(CD22-阴性)(C)共培养的，由未转导的(模拟品)或转导有以下CAR之一的T细胞分泌的干扰素(IFN)-γ的量(pg／ml)的图表∶抗CD19，HASH22-第二代版本1(HA22SH-28Z)，HASH22-第二代版本2(HA22SH-BBZ)，或HASH22-第三代(HA22SH-28BBZ)。

图9D-9F为显示由与白血病细胞系NALM6-GL(CD22低表达)(A)，Raji(CD22高表达)(B)，或K562(CD22-阴性)(C)共培养的，未转导的(模拟品)或转导有以下CAR之一的T细胞分泌的白介素(IL)-2的量(pg/ml)的图表∶抗CD19，HASH22-第二代版本1，HASH22-第二代版本2，或HASH22-第三代。

图9G-9I为显示由与白血病细胞系NALM6-GL(CD22低表达)(A)，Raji(CD22高表达)(B)，或K562(CD22-阴性)(C)共培养的，未转导的(模拟品)或转导有以下CAR之一的T细胞分泌的肿瘤坏死因子(TNF)-α的量(pg/ml)的图表∶抗CD19，HASH22-第二代版本1，HASH22-第二代版本2，或HASH22-第三代。

发明详述

本发明的一个实施方案提供嵌合抗原受体(CAR)，其包含∶a)HA22的抗原结合结构域，跨膜结构域，和细胞内T细胞信号传导结构域；或b)BL22的抗原结合结构域，跨膜结构域，和包含i)CD28和／或ii)CD137的细胞内T细胞信号传导结构域。

嵌合抗原受体(CAR)是人工构建的杂合蛋白或多肽，其包含连接于T-细胞信号传导结构域的抗体(例如，单链可变片段(scFv))的抗原结合结构域。CAR的特征包括其以非MHC限制的方式向选择的靶重定向T细胞特异性和反应性的能力，开发单克隆抗体的抗原结合性质。非MHC限制的抗原识别给予T细胞表达的CAR不依赖抗原加工识别抗原的能力，因此绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当表达于T细胞时，CAR有利地不与内源的T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。

如在此使用的，短语“具有抗原特异性”和“诱导抗原*特异的应答”意思是CAR可以特异结合和免疫识别抗原，这样以至于CAR对抗原的结合诱导免疫应答。

本发明的CAR具有对CD22的抗原特异性。CD22是谱系限制的B细胞抗原，属于免疫球蛋白(Ig)超家族。CD22表达在60-70％的B细胞淋巴瘤和白血病中(例如，B-慢性淋巴细胞白血病，多毛细胞白血病，急性淋巴细胞白血病(ALL)，和伯基特淋巴瘤)并且在B细胞发育早期的细胞表面或干细胞上不存在。Vaickus等，Crit.Rev.Oncol.／Hematol.，11∶267-297(1991)；Bang等，Clin.Cancer Res.，11∶1545-50(2005)。

未束缚于特定的理论或机制，相信通过诱导针对CD22的抗原-特异应答，发明的CAR提供以下的一个或多个∶靶向和破坏表达CD22的癌症细胞，减少或除去癌症细胞，促进免疫细胞向肿瘤位点的浸润，并增强／扩充抗癌反应。因为CD22在B细胞发育的早期或在干细胞上不表达，认为发明的CAR有利地基本上避免靶向／破坏干细胞和／或在发育早期的B细胞。

本发明提供CAR，其包含免疫毒素HA22或BL22的抗原结合结构域。所述免疫毒素BL22和HA22是治疗剂，其包含融合于细菌毒素的特异于CD22的scFv。所述免疫毒素结合到癌细胞的表面并杀死癌细胞。BL22包含抗CD22抗体的二硫键稳定的，单链可变片段(dsFv)，RFB4，所述RFB4融合于假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A的38-kDa的截短的形式(Bang等，Clin.Cancer Res.，11∶1545-50(2005))。HA22(CAT8015，moxetumomab pasudotox)为BL22的突变的，高亲和力版本(Ho等，J.Biol.Chem.，280(1)∶607-17(2005))。

HA22和BL22的抗原结合结构域特异地结合CD22。HA22和BL22的抗原结合结构域的合适的序列公开在，例如，美国专利7,541,034；7,355,012；和7,982,011中，其因此在此以其整体通过引用并入。在这点上，本发明的一个优选的实施方案提供CAR，其包含抗原-结合结构域，所述抗原结合结构域包含HA22或BL22的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)，由HA22或BL22的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)组成，或基本由HA22或BL22的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)组成。

HA22和BL22抗原结合结构域每个包含轻链可变区和重链可变区。HA22或BL22的轻链可变区可以分别包含SEQ ID NO∶1或2，由SEQ IDNO∶1或2组成，或基本由SEQ ID NO∶1或2组成。HA22或BL22的重链可变区可以分别包含SEQ ID NO∶3或4，由SEQ ID NO∶3或4组成，或基本由SEQ ID NO∶3或4组成。因此，在本发明的一个实施方案中，抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO∶1或2的轻链可变区和／或包含SEQ IDNO∶3或4的重链可变区。

在本发明的一个实施方案中，轻链可变区和重链可变区可以通过接头连接。所述接头可以包含任何合适的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，接头可以包含SEQ ID NO∶37，由SEQ ID NO∶37组成，或基本由SEQ ID NO∶37组成。

在一个实施方案中，所述抗原结合结构域可以包含轻链可变区和重链可变区。在这点上，HA22或BL22抗原结合结构域，各自包含分别包含SEQ ID NO∶5或6，由SEQ ID NO∶5或6组成，或基本由SEQ ID NO∶5或6组成轻链可变区和重链可变区。

在一个实施方案中，所述抗原结合结构域包含前导序列。所述前导序列可以位于轻链可变区的氨基端。所述前导序列可以包含任何合适的前导序列。在一个实施方案中，所述前导序列是人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体序列。在这点上，所述抗原结合结构域包含含有SEQ IDNO∶7，由SEQ ID NO∶7组成，或基本由SEQ ID NO∶7组成的前导序列。在本发明的一个实施方案中，尽管前导序列可以促进CAR在细胞表面的表达，为了使CAR行使功能，在表达的CAR中前导序列的存在不是必需的。在本发明的一个实施方案中，当CAR在细胞表面表达时，前导序列可以从CAR切除。因此，在本发明的一个实施方案中，CAR缺少前导序列.

在一个实施方案中，CAR包含免疫球蛋白结构域。优选，所述免疫球蛋白结构域是人免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白结构域包含免疫球蛋白CH2和CH3免疫球蛋白G(IgGl)结构域序列(CH2CH3)。在这点上，CAR包含含有SEQ ID NO∶8，由SEQ ID NO∶8组成，或基本由SEQ ID NO∶8组成的免疫球蛋白结构域。在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白结构域可以包含短的免疫球蛋白恒定结构域序列。在这点上，CAR包含含有SEQ ID NO∶9或36，由SEQ ID NO∶9或36组成，或基本由SEQ ID NO∶9或36组成的免疫球蛋白结构域。未束缚于特定的理论，相信CH2CH3结构域向远离表达CAR的细胞膜延伸了scFv的结合基序并可以更精确地模拟天然TCR的大小和结构域结构。

在本发明的一个实施方案中，CAR包含跨膜结构域。在本发明的一个实施方案中，跨膜结构域包含i)CD8和／或ii)CD28。在一个优选的实施方案中，CD8和CD28是人的。CD8或CD28可以分别包含小于完整的CD8或CD28。在这点上，CAR包含a)CD8跨膜结构域，其包含SEQ ID NO∶10或33，由SEQ ID NO∶10或33组成，或基本由SEQ ID NO∶10或33组成和／或b)CD28跨膜结构域，其包含SEQ ID NO∶11，由SEQ ID NO∶11组成，或基本由SEQ ID NO∶11组成。

在本发明的一个实施方案中，CAR包含细胞内T细胞信号传导结构域，所述细胞内T细胞信号传导结构域包含i)CD28，ii)CD137，和iii)CD3zeta(ζ)的一个或多个。在一个优选的实施方案中，CD28，CD137，和CD3ζ的一个或多个是人的。CD28是T细胞标记，在T细胞共刺激中是重要的。CD137，也即4-1BB，向T细胞传导有效的共刺激信号，促进分化和加强T淋巴细胞的长期存活。CD3ζ联合TCR以产生信号并包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。CD28，CD137，和CD3ζ的一个或多个可以分别包含小于完整的CD28，CD137，或CD3ζ。在这点上，细胞内T细胞信号传导结构域包含一个或多个的包含SEQ ID NO∶12，由SEQ ID NO∶12组成，或基本由SEQ ID NO∶12组成的CD28氨基酸序列；包含SEQ ID NO∶13或34，由SEQ ID NO∶13或34组成，或基本由SEQ ID NO∶13或34组成的CD137氨基酸序列；和／或包含SEQ ID NO∶14或35，由SEQ ID NO∶14或35组成，或基本由SEQ ID NO∶14或35组成的CD3ζ氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，CAR包含含有CD28的跨膜结构域和包含CD28和CD3ζ的细胞内T细胞信号传导结构域。在这点上，CAR可以包含SEQ ID NO∶11，12，和14中的每个。优选的，CAR包含a)SEQ ID NO∶1,3,8,11,12,和14中的每个；b)SEQ ID NO∶2,4,8,11,12,和14中的每个；或c)SEQ ID NO∶1,3,9,11,12,和14中的每个。

在本发明的一个实施方案中，CAR包含含有CD8的跨膜结构域和包含CD28，CD137,和CD3ζ细胞内T细胞信号传导结构域。在这点上,CAR可以包含SEQ ID NO∶10,12,13,和14中的每个。优选的,CAR包含a)SEQID NO∶1,3,8,10,12,13,和14中的每个；b)SEQ ID NO∶2,4,8,10,12,13,和14中的每个；或c)SEQ ID NO∶1,3,9,10,12,13,和14中的每个。

在本发明的一个实施方案中，CAR包含含有CD8的跨膜结构域和包含CD137和CD3ζ的细胞内T细胞信号传导结构域。在这点上,CAR可以包含SEQ ID NO∶33-35中的每个。优选,CAR包含SEQ ID NO∶1,3，和33-36中的每个。

本发明的另外的实施方案提供CAR，其包含列在表1中的任何氨基酸序列，由列在表1中的任何氨基酸序列组成，或基本由列在表1中的任何氨基酸序列组成。

表1

包括在本发明范围内的是在此描述的发明的CAR的功能部分。术语“功能部分”当用于提到的CAR时，指本发明的CAR的任何部分或片段，该部分或片段保留CAR的生物活性，它是CAR的部分(母体CAR)。功能部分包括，例如，保留识别靶细胞的能力，或如母体CAR以类似的程度，相同的程度或到更高的程度检测，治疗，或预防疾病的那些CAR的部分。关于母体CAR，所述功能部分可以包含，例如，母体CAR的约10％，25％，30％，50％，68％，80％，90％，95％，或更多。

所述功能部分可以在所述部分的氨基或羧基端或在两端包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸在母体CAR的氨基酸序列中找不到。理想的，所述另外的氨基酸不妨碍功能部分的生物功能，例如，识别靶细胞，检测癌症，治疗或预防癌症，等。更理想的，当与母体CAR的生物活性相比时，所述另外的氨基酸增强生物活性。

包括在本发明范围内的是在此描述的发明的CAR的功能变体。如在此使用的，术语“功能变体”指具有与母体CAR基本上的或显著的序列同一性或相似性的CAR，多肽，或蛋白，所述功能变体保留CAR的生物活性，其是CAR的变体。功能变体包括，例如，在此描述的CAR(母体CAR)的那些保留如母体CAR的类似程度，相同程度或更高程度的识别靶细胞的能力的变体。根据母体CAR，功能变体可以，例如，为与母体CAR在氨基酸序列上至少约30％，约50％，约75％，约80％，约85％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或以上相同。

功能变体可以，例如，包含具有至少一个保守氨基酸置换的母体CAR氨基酸序列的。备选的或另外的，所述功能变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸置换的母体CAR氨基酸序列。在该情况下，优选非保守氨基酸置换以不妨碍或抑制所述功能变体的生物活性。非保守氨基酸置换可以增强所述功能变体的生物活性，这样以至于所述功能变体的生物活性当与母体CAR相比时是增加的。

发明的CAR的氨基酸置换优选保守氨基酸置换。保守氨基酸置换在本领域中是已知的，并包括其中一个具有某些物理和／或化学性质的氨基酸以另一个具有相同或相似化学或物理性质的氨基酸交换的氨基酸置换。例如，所述保守氨基酸置换可以是酸性／带负电荷的极性氨基酸置换以另一个酸性／带负电荷的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)，具有非极性侧链的氨基酸置换以另一个具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala，Gly，Val,Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Trp，Cys，Val，等)，碱性／带正电荷的极性氨基酸置换以另一个碱性／带正电荷的极性氨基酸(例如Lys，His，Arg，等)，具有极性侧链的不带电荷的氨基酸另一个置换以具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如，Asn，Gln，Ser，Thr，Tyr，等)，具有β-分枝侧链的氨基酸置换以另一个具有β-分枝侧链的氨基酸(例如，Ile，Thr，和Val)，具有芳族侧链的氨基酸置换以另一个具有芳族侧链的氨基酸(例如，His，Phe，Trp，和Tyr)，等。

CAR可以基本由本文描述的指定的一个或多个氨基酸序列组成，这样以至于其它组分，例如，其它氨基酸，不实质改变所述功能变体的生物活性。

本发明实施方案的CAR(包括功能部分和功能变体)可以是任意长度，即，可以包含任何数量的氨基酸，只要CAR(或其功能部分或功能变体)保留其生物活性，例如，特异结合抗原，检测哺乳动物中的患病细胞，或治疗或预防哺乳动物中的疾病的能力，等。例如，CAR可以是约50到约5000个氨基酸长，例如50，70，75，100，125，150，175，200，300，400，500，600，700，800，900，1000或更多氨基酸长。

本发明实施方案的CAR(包括本发明的功能部分和功能变体)可以包含合成的氨基酸代替一个或多个天然存在的氨基酸。此种合成的氨基酸在本领域中已知，并且包括，例如，环已胺羧酸，正亮氨酸，α-氨基n-癸酸，高丝氨酸，S-乙酰氨甲基-半胱氨酸，反式-3-和反式-4-羟脯氨酸，4-氨基苯丙氨酸，4-硝基苯丙氨酸，4-氯苯丙氨酸，4-羧基苯丙氨酸，β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸，苯基甘氨酸，α-萘基丙氨酸，环己基丙氨酸，环己基甘氨酸，二氢吲哚-2-羧酸，1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸，氨基丙二酸，氨基丙二酸单酰胺，N’-苄基-N'-甲基赖氨酸，N’，N’-二苄基赖氨酸，6-羟基赖氨酸，鸟氨酸，α-氨基环戊烷羧酸，α-氨基环己烷羧酸，α-氨基环庚烷羧酸，α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸，α，γ-二氨基丁酸，α，β-二氨基丙酸，高苯丙氨酸，和α-叔丁基甘氨酸。

本发明实施方案的CAR(包括功能部分和功能变体)可以通过，例如，二硫桥键，或转变为加酸盐和／或任选的二聚化或多聚化，或缀合进行糖基化，酰胺化，羧化，磷酸化，酯化，N-酰化，环化。

本发明实施方案的CAR(包括其功能部分和功能变体)可以通过本领域中的已知方法获得。CAR可以通过制备多肽或蛋白的任何合适方法制备。从头合成多肽和蛋白的合适方法在参考文献中描述，例如Chan等，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，Oxford University Press，Oxford，UnitedKingdom，2000；Peptide and Protein Drug Analysis，ed.Reid，R.，MarcelDekker，Inc.，2000；Epitope Mapping，ed.Westwood等，Oxford UniversityPress，Oxford，United Kingdom，2001；和美国专利5，449，752。并且，多肽和蛋白可以使用在此描述的核酸利用标准重组方法重组生产。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning∶A Laboratory Manual，第三版，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY2001；和Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons，NY，1994。此外，一些本发明的CAR(包括功能部分和其功能变体)可以从来源(例如植物，细菌，昆虫，哺乳动物(例如，大鼠，人))等分离和／或纯化。分离和纯化方法是在本领域中公知的。备选的，在此描述的CAR(包括其功能部分和功能变体)可以由公司商业合成，所述公司例如Synpep(Dublin，CA)，Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg，MD)，和Multiple Peptide Systems(San Diego，CA)。在这方面，发明的CAR可以是合成的，重组的，分离的，和／或纯化的。

本发明的实施方案进一步提供抗体或其抗原结合部分，其特异结合本发明的CAR的表位。所述抗体可以是任意形式的在本领域中已知的免疫球蛋白。例如，所述抗体可以是任意同种型的，例如，IgA，IgD，IgE，IgG，IgM，等。所述抗体可以是单克隆的或多克隆的。所述抗体可以是天然存在的抗体，例如，分离和／或纯化自哺乳动物(例如，小鼠，兔，山羊，马，鸡，仓鼠，人，等)的抗体。备选的，所述抗体可以是遗传工程抗体，例如，人源化抗体或嵌合抗体。所述抗体可以是单体或多聚形式。所述抗体也可以对于发明的CAR的功能部分具有任何水平的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)。

结合发明的CAR的任何功能部分的能力的测试抗体方法在本领域中已知并且包括任何抗体-抗原结合测定，像，例如，放射性免疫测定(RIA)，ELISA，蛋白印迹，免疫沉淀，和竞争性抑制测定(参见，例如，Janeway等，在下文,和美国专利申请公开号2002／0197266A1)。

制备抗体的合适方法在本领域中已知。例如，标准杂交瘤方法描述于，例如，和Milstein，Eur.J.Immunol.，5，511-519(1976)，Harlow和Lane(eds.)，Antibody∶A Laboratory Manual，CSH Press(1988)，和C.A.Janeway等(eds.)，Immunobiology，第五版，Garland Publishing，New York，NY(2001))。备选的，其它方法，例如EBV-杂交瘤方法(Haskard and Archer，J.Immunol.Methods，74(2)，361-67(1984)，和Roder等，Methods Enzymol.，121，140-67(1986))，和噬菌体载体表达系统(参见，例如，Huse等，Science，246，1275-81(1989))在本领域中已知。进一步，在非人动物中生产抗体的方法描述载，例如，美国专利5,545,806,5,569,825，和5,714,352，和美国专利申请公开号2002／0197266A1)。

噬菌体展示此外可以用于产生抗体。在这点上，编码抗体的抗原-结合可变(V)结构域的噬菌体文库可以使用标准的分子生物学和重组DNA技术产生(参见，例如，Sambrook等，见上文，和Ausubel等，见上文)。编码具有想要的特异性的可变区的噬菌体选作特异结合于想要的抗原，且重组包含选择的可变结构域的完全的或部分抗体。编码所述重组抗体的核酸序列引入合适的细胞系，例如骨髓瘤细胞用于杂交瘤生产，这样以至具有单克隆抗体特征的抗体由所述细胞分泌(参见，例如，Janeway等，见上文，Huse等，见上文，和美国专利6,265,150)。

抗体可以由对特异的重和轻链免疫球蛋白基因基因改造的转基因小鼠生产。此种方法在本领域中已知并描述于，例如美国专利5,545,806和5,569,825，和Janeway等，见上文中。

用于产生人源化抗体的方法在本领域中公知并详细描述于，例如，Janeway等，见上文，美国专利5,225,539,5,585,089和5,693,761,欧洲专利号0239400B1，和英国专利号2188638中。人源化抗体还可以使用描述于美国专利5,639,641和Pedersen等，J.Mol.Biol.，235，959-973(1994)中的抗体表面重塑技术产生。

本发明的一个实施方案还提供在此描述的任何所述抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位点的任何部分，例如Fab，F(ab')₂，dsFv，sFv，双体(diabodies)，和三体(triabodies)。

单链可变区片段(sFv)抗体片段，其是截短的Fab片段，包括通过合成的肽连接于轻抗体链的V结构域抗体重链的可变(V)结构域，可以使用常规重组DNA技术方法产生(参见，例如，Janeway等，见上文)。类似地，二硫键稳定的可变区片段(dsFv)可以通过重组DNA技术制备(参见，例如，Reiter等，Protein Engineering，7，697-704(1994))。然而，本发明的抗体片段不限于这些典型类型的抗体片段。

并且，所述抗体或其抗原结合部分，可以修饰以包含可检测标签，像，例如，放射性同位素，荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)，藻红蛋白(PE))，酶(例如，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶)，和元素颗粒(例如，金颗粒)。

由本发明的一个实施方案进一步提供的是包含编码任何在此描述的CAR(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列的核酸。本发明的核酸可以包含编码在此描述的前导序列，抗原结合结构域，免疫球蛋白结构域，跨膜结构域，和／或细胞内T细胞信号传导结构域的任一个的核苷酸序列。

本发明的一个实施方案提供包含编码前导序列，BL22或HA22的抗原结合结构域(包括轻链可变区和重链可变区)，和CH2CH3的核苷酸序列的核酸。在这点上，所述核酸可以分别包含SEQ ID NO∶21或22，由SEQID NO∶21或22组成，或基本由SEQ ID NO∶21或22组成。本发明的一个其它实施方案提供包含编码前导序列，HA22的抗原结合结构域(包括轻链可变区和重链可变区)，和短的免疫球蛋白恒定结构域序列的核苷酸序列的核酸。在这点上，所述核酸可以包含SEQ ID NO∶23或38，由SEQ IDNO∶23或38组成，或基本由SEQ ID NO∶23或38组成。

本发明的核酸可以包含编码任何在此描述的跨膜结构域和／或细胞内T细胞信号传导结构域的核苷酸序列。本发明的一个实施方案提供包含编码跨膜结构域(包含CD28)，细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD28)，和细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD3ζ)的核苷酸序列的核酸。在这点上，所述核酸可以包含SEQ ID NO∶24，由SEQ ID NO∶24组成，或基本由SEQID NO∶24组成。本发明的一个其它实施方案提供包含编码跨膜结构域(包含CD8)，细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD28)，细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD137)，和细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD3ζ)的核苷酸序列的核酸。在这点上，所述核酸可以包含SEQ ID NO∶25，由SEQID NO∶25组成,或基本由SEQ ID NO∶25组成。本发明一个进一步的其它实施方案提供包含编码跨膜结构域(包含CD8)，细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD137)，和细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD3ζ)的核苷酸序列的核酸。在这点上，所述核酸可以包含SEQ ID NO∶39，由SEQ ID NO∶39组成，或基本由SEQ ID NO∶39组成。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述包含编码前导序列，BL22或HA22的抗原结合结构域(包括轻链可变区和重链可变区)，CH2CH3，跨膜结构域(包含CD28)，细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD28)，和细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD3ζ)的核苷酸序列的核酸。在这点上，所述核酸可以包含SEQ ID NO∶21和24二者，由SEQ ID NO∶21和24二者组成，或基本由SEQ ID NO∶21和24二者组成，或包含SEQ ID NO∶22和24二者，由SEQ ID NO∶22和24二者组成，或基本由SEQ ID NO∶22和24二者组成。

在一个其它优选的实施方案中，所述核酸包含编码前导序列，HA22的抗原结合结构域(包括轻链可变区和重链可变区)，短的免疫球蛋白恒定结构域序列，跨膜结构域(包含CD28)，细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD28)，和细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD3ζ)的核苷酸序列。在这点上，所述核酸可以包含SEQ ID NO∶23和24二者，由SEQ ID NO∶23和24二者组成，或基本由SEQ ID NO∶23和24二者组成。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述核酸包含编码前导序列，BL22或HA22的抗原结合结构域(包括轻链可变区和重链可变区)，CH2CH3，跨膜结构域(包含CD8)，细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD28)，细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD137)，和细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD3ζ)的核苷酸序列。在这点上，所述核酸可以包含SEQID NO∶21和25二者或SEQ ID NO∶22和25二者，由SEQ ID NO∶21和25二者或SEQ ID NO∶22和25二者组成，或基本由SEQ ID NO∶21和25二者或SEQ ID NO∶22和25二者组成。

在其它优选的实施方案中，所述核酸包含编码前导序列，HA22的抗原结合结构域(包括轻链可变区和重链可变区)，短免疫球蛋白恒定结构域序列，跨膜结构域(包含CD8)，细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD28)，细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD137)，和细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD3ζ)的核苷酸序列。在这点上，所述核酸可以包含SEQ ID NO∶23和25二者，由SEQ ID NO∶23和25二者组成，或基本由SEQ ID NO∶23和25二者组成。

在进一步的一个其它优选的实施方案中，所述核酸包含编码前导序列，HA22的抗原结合结构域(包括轻链可变区和重链可变区)，短免疫球蛋白恒定结构域序列，跨膜结构域(包含CD8)，细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD137)，和细胞内T细胞信号传导结构域(包含CD3ζ)的核苷酸序列。在这点上，所述核酸可以包含SEQ ID NO∶38和39二者，由SEQ IDNO∶38和39二者组成，或基本由SEQ ID NO∶38和39二者组成。

如在此使用的“核酸”包括“多聚核苷酸，”“寡核苷酸，”和“核酸分子，”并且一般意味DNA或RNA的聚合体，所述聚合体可以是单链的或双链的，合成的或获得(例如，分离的和／或纯化的)自天然来源，所述天然来源可以包含天然的,非天然的或改变的核苷酸，并且其可以包含天然的，非天然的或改变的核苷酸间连接，例如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接，替代建立在未修饰寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。在一些实施方案中，所述核酸不包含任何插入，缺失，反转，和／或置换。然而，如在此讨论的，在一些实例中，对于所述核酸，包含一个或多个插入，缺失，反转，和／或置换，其可以是合适的。在一些实施方案中，，述核酸可以编码另外的不影响CAR的功能和可以或可能在由宿主细胞表达所述核酸时不翻译的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO∶31)。

本发明的一个实施方案的核酸可以是重组的。如在此使用的，术语“重组的”指(i)在活细胞外构建通过连接天然的或合成的核酸片段于可以在活细胞中复制的核酸分子构建的分子，，(ii)由那些描述于上述(i)中的复制产生的分子。为了在此的目的，所述复制可以是体外复制或体内复制。

重组的核酸可以是具有不是天然存在的序列或具有由两个不同的序列分离片人工化合制备的序列的核酸。该人工化合通常由化学合成或，更通常由人工操作分离的核酸片段，例如，，遗传工程技术，像描述于Sambrook等，见上文中的那些一样完成。所述核酸可以基于使用在本领域中已知的工艺的化学合成和／或酶连接反应构建。参见，例如，Sambrook等，，上文，和Ausubel等，见上文。例如，核酸可以使用天然存在的核苷酸或设计以增加分子的生物稳定性或以增加杂交时形成的双链的物理稳定性的不同修饰的核苷酸(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶代核苷酸)化学合成。可以用于产生核酸的修饰的核苷酸的实例包括，但不限于，5-氟脲嘧啶，5-溴脲嘧啶，5-氯脲嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基甲胺基-2-尿苷，5-羧甲基甲胺基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖基queosine，肌苷，N⁶-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N⁶-取代腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶，β-D-甘露糖基queosine，5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶,5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N⁶-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-羟乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，和2，6-二氨基嘌呤。备选的，本发明的核酸的一个或多个可从公司购买，例如Macromolecular Resources(FortCollins，CO)和Synthegen(Houston，TX)。

所述核酸可以包含任何分离的或纯化的编码任何所述CAR或功能部分或功能变体的核苷酸序列。备选的，所述核苷酸序列可以包含简并于所述序列的核苷酸序列或简并序列的组合。

本发明的一个实施方案还提供分离的或纯化的核酸，所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列互补于任何在此描述的核酸或在严格条件下与任何在此描述的核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的核苷酸序列。

在严格条件下杂交的核苷酸序列可以在高度严格条件下杂交。由“高度严格条件”意思是以比非特异杂交检测更强的量特异杂交于靶序列(任何在此描述的核酸的核苷酸序列)的核苷酸序列。高度严格条件包括将区别多聚核苷酸于精确互补序列或包含偶然具有几个匹配所述核苷酸序列小的区域(例如，3-10个碱基)的随机序列中仅有少数分散的错配的序列的条件。互补性的此种小的区域比14-17或更多碱基的全长互补区更容易融入且高度严格杂交使他们易于区别。相对高度严格条件将包括，例如，低盐和／或高温条件，例如由约0.02-0.1M NaCl或相当的，在温度为约50-70℃下提供。此种高度严格条件允许核苷酸序列和模板或靶链之间很少的(如果有)错配并且尤其对于检测任何发明的CAR的表达是合适的。基本上理解条件可以通过加入增加量的甲酰胺使变得更严格。

本发明还提供包含至少约70％或更多，例如，约80％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，或约99％与任何在此描述的核酸的核苷酸序列的核酸相同。

在一个实施方案中,本发明的核酸能插入重组表达载体。在这点上，本发明的一个实施方案提供包含任何本发明的核酸的重组表达载体。为了在此的目的，术语“重组表达载体”意为当所述包含编码mRNA，蛋白，多肽，或肽，和载体的核苷酸序列的构建体在足以具有在细胞内表达的mRNA，蛋白，多肽，或肽的条件下与细胞关联时的遗传修饰的寡核苷酸或多聚核苷酸构建体，所述构建体允许由宿主细胞表达mRNA，蛋白，多肽，或肽。本发明的载体不是以整体天然存在的。然而，载体的部分可以是天然存在的。发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括，但不限于DNA和RNA，其可以是单链的或双链的，合成的或部分获自天然来源，并且，其可以包含天然的，非天然的或改变的核苷酸。所述重组表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间连接，或两种类型的连接。优选的，非天然存在或改变的核苷酸或核苷酸间连接不阻碍载体的转录或复制。

在一个实施方案中，本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并可以用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计用于增殖和放大或用于表达或两者都有的那些，例如质粒和病毒。所述载体可选自由pUC系列(Fermentas Life Sciences，Glen Burnie，MD)，pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，CA)，pET系列(Novagen，Madison，WI)，pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，和pEX系列(Clontech，Palo Alto，CA)组成的组。也可以使用噬菌体载体，例如λGT10，λGT11，λZapII(Stratagene)，λEMBL4，和λNM1149。植物表达载体的实例包括pBI01，pBI101.2，pBI101.3，pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-C1，pMAM，和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如，逆转录病毒载体。

许多转染技术在本领域中是普遍已知的(参见，例如，Graham等，Virology，52∶456-467(1973)；Sambrook等，见上文；Davis等，BasicMethods in Molecular Biology，Elsevier(1986)；和Chu等，Gene，13∶97(1981)。转染方法包括磷酸钙共沉淀(参见，例如，Graham等，见上文)，直接微注射入培养的细胞(参见，例如，Capecchi，Cell，22∶479-488(1980))，电穿孔(参见，例如，Shigekawa等，Biotechniques，6∶742-751(1988))，脂质体介导的基因转移(参见，例如，Mannino等，Biotechniques，6∶682-690(1988))，脂类介导的转导(参见，例如，Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84∶7413-7417(1987))，和使用高速微弹射击法的核酸递送(参见，例如，Klein等，Nature，327∶70-73(1987))。

在一个实施方案中，本发明的重组表达载体可以使用描述于，例如，Sambrook等，见上文，和Ausubel等，见上文的标准重组DNA技术制备。环形或线性表达载体的构建体可以制备以包含在原核或真核宿主细胞中行使功能的复制系统。复制系统可以源自，例如，ColE1，2μ质粒，λ，SV40，牛乳头瘤病毒，诸如此类。

重组表达载体可以包含调控序列，例如，特异于宿主细胞类型(例如，细菌，真菌，植物，或动物)的转录和翻译起始和终止密码子，载体酌情引入其中并考虑是否载体是基于DNA或RNA的。序列的实例包括包括SEQID NO∶29和30的终止密码子。重组表达载体可以包含限制位点以利于克隆。序列的实例包括包括SEQ ID NO∶26-28的限制位点。

所述重组表达载体可以包括一个或多个标记基因，所述标植物基因允许用于转化或转染的宿主细胞的筛选。标记基因包括抗微生物剂抗性，例如，对抗生素，重金属的抗性，等，在营养缺陷的宿主中互补以提供原营养，诸如此类。用于本发明的表达载体的合适的标记基因包括，例如，新霉素／G418抗性基因，潮霉素抗性基因，组胺醇抗性基因，四环素抗性基因，和氨苄青霉素抗性基因。

所述重组表达载体可以包含可操作地连接于编码所述CAR(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列，或连接于互补于或杂交于编码所述CAR的核苷酸序列的核苷酸序列的天然或非天然的启动子。启动子的选择，例如，强，弱，可诱导，组织特异的和发育特异的，在技术人员的普通技术内。类似地，核苷酸序列与启动子的结合也在技术人员的技术中。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子，SV40启动子，RSV启动子，或发现于鼠肝细胞病毒中的长终端重复中的启动子。

本发明的重组表达载体可以设计为或者瞬时表达，或者稳定表达，或者两者都有。同样，所述重组表达载体可以制备为组成型表达或诱导型表达。

进一步的，所述重组表达载体可以制备以包括自杀基因。如在此使用的，术语“自杀基因”指引起表达所述自杀基因以死亡的基因。所述自杀基因可以是使具有对试剂(例如药物)的敏感性的基因，当在细胞中所述基因表达并当细胞与试剂接触或暴露于试剂时引起细胞死亡。自杀基因是在本领域中已知的(参见，例如，Suicide Gend Therapy∶Methods and Reviews，Springer，Caroline J.(Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics atthe Institute of Cancer Research，Sutton，Surrey，UK)，Humana Press，2004)和包括，例如，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因，胞嘧啶脱氨酶(daminase)，嘌呤核苷酸磷酸化酶，和硝基还原酶。

包括在本发明范围内的是缀合物，例如，包含任何本发明的CAR(包括任何其功能部分或变体)，核酸，重组表达载体，宿主细胞，宿主细胞群，或抗体或其抗原结合部分的生物缀合物。缀合物，和通常合成缀合物的方法在本领域中已知(参见，例如，Hudecz，F.，Methods Mol.Biol.298∶209-223(2005)和Kirin等，Inorg Chem.44(15)∶5405-5415(2005))。

本发明的一个实施方案进一步提供包含在此描述的任何所述重组表达载体的宿主细胞。如在此使用的，术语“宿主细胞”指可以包含本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。所述宿主细胞可以是真核细胞，例如,植物，动物，真菌，或藻类，或可以是原核细胞，例如，细菌或原生动物。所述宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即，直接分离自有机体，例如，人。所述宿主细胞可以是粘着细胞或悬浮细胞，即，在悬液中生长的细胞。合适的宿主细胞在本领域中已知且包括，例如，DH5α大肠杆菌(E.coli)细胞，中国仓鼠卵巢细胞，猴VERO细胞，COS细胞，HEK293细胞，诸如此类。为了放大或复制所述重组表达载体，所述宿主细胞可以是原核细胞，例如，DH5α。为了生产重组的CAR，所述宿主细胞可以是哺乳动物细胞。所述宿主细胞可以是人细胞。同时所述宿主细胞可以是任何细胞类型，可以源自任何类型的组织，且可以是任何发育阶段的，所述宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。所述宿主细胞可以是T细胞。

为了在此的目的，所述T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如，原代T细胞，或源自培养的T细胞系的T细胞，例如，Jurkat，SupT1，等，或获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物，所述T细胞可以获得自许多来源，包括但不限于血液，骨髓，淋巴结，胸腺，或其它组织或液体。T细胞还可以是富集的或纯化的。所述T细胞可以是人T细胞。所述T细胞可以是分离子人的T细胞。所述T细胞可以是任何类型的T细胞和可以是任何发育发育阶段的，包括但不限于，CD4^＋／CD8^＋双阳性T细胞，CD4^＋辅助T细胞，例如，Th₁和Th₂细胞，CD8^＋T细胞(例如，细胞毒性T细胞)，肿瘤侵润细胞，记忆T细胞，天然T细胞，诸如此类。所述T细胞可以是CD8^＋T细胞或CD4^＋T细胞.

还由本发明的一个实施方案提供的是包含至少一种在此描述的宿主细胞的细胞群。所述细胞群可以是包含含有任何描述的所述重组表达载体的宿主细胞的异质群体，除了至少一种其它例如，不包含任何所述重组表达载体的宿主细胞(例如，T细胞)，或除了T细胞，例如，B细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，红细胞，肝细胞，内皮细胞，上皮细胞，肌肉细胞，脑细胞，等的细胞。备选的，细胞群可以是基本上同质群体，其中所述群体组要包含含有所述重组表达载体宿主细胞(例如，基本由包含所述重组表达载体宿主细胞组成)。所述群体还可以是克隆的细胞群,其中所述群体的所有细胞是包含重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，这样以至于所述群体的所有细胞包含所述重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，所述细胞群包含含有在此如描述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。

所有的CAR(包括其功能部分和变体)，核酸，重组表达载体,宿主细胞(包括其群体)，和抗体(包括其抗原结合部分)在下文中共同指作“发明的CAR材料”，其可以是分离的和／或纯化的。如在此使用的，术语“分离的”意为已从其天然环境中移开。术语“纯化的”或“分离的”不需要绝对纯或分离；反而其用来作为相对的术语。因此，例如，纯化的(或分离的)宿主细胞制备物是所述宿主细胞比在其体内的天然环境中的细胞更纯的细胞。可以使用例如标准纯化技术生产此种宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞的制备物是纯化的，这样以至于所述宿主细胞表示制备物的总细胞含量的至少约50％，例如至少约70％。例如，纯度可以是至少约50％，可是大于约60％，约70％或约80％，或可以是约100％。

本发明的CAR材料可以配制为组合物，例如药物组合物。在这点上，本发明的一个实施方案提供药物组合物，所述药物组合物包含任何所述CAR，功能部分，功能变体，核酸，表达载体，宿主细胞(包括其群体)，和抗体(包括其抗原结合部分)，和药学上可接受的载体。本发明的药物组合物包含任何本发明的CAR材料，所述CAR材料可以包含多于一种发明的CAR材料，例如，CAR和核酸，或两种或更多不同的CAR。备选的，所述药物组合物可以包含发明的CAR材料与其它药学活性试剂或药物(例如化学治疗剂)的组合，所述化学治疗剂例如，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟脲嘧啶，吉西他滨，羟基脲，氨甲喋呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，长春新碱，等。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包含本发明的宿主细胞或其群体。

本发明的CAR材料可以以盐的形式提供，例如，药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的酸式盐包括源自无机酸的那些，所述无机酸例如盐酸，氢溴酸，磷酸，偏磷酸，硝酸和硫酸，和有机酸，例如酒石酸，醋酸，柠檬酸，苹果酸，富马酸，苯甲酸，乙二酸，葡糖酸，琥珀酸，和芳基磺酸，例如，p-甲苯磺酸。

关于药物组合物，药学上可接受的载体可以是任何常规使用的那些且仅由化学-物理的考虑(例如溶解度和与活性试剂的反应性的缺失)和给药方式限制。在此描述的所述药学上可接受的载体,例如，载体，佐剂，赋形剂和稀释剂对那些本领域技术人员公知的并且公众容易获得。优选所述药学上可接受的载体为对活性试剂为化学惰性的载体和在使用条件下无有害副作用或毒性的载体。

载体的选择部分由特定的发明的CAR材料和由用于施用本发明的CAR材料特定的方法决定。因此，存在多种合适的本发明药物组合物的制剂。可以使用防腐剂。合适的防腐剂可以包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯，对羟苯甲酸丙酯，苯甲酸钠，和苯扎氯铵。可以使用任选的两种或更多防腐及的混合物。所述防腐剂或其混合物典型的提供以占总组合物的重量计为约0.0001％到约2％的量。

合适的缓冲剂可以包括，例如，柠檬酸，柠檬酸钠，磷酸，磷酸钾，和各种其它的酸和盐。可以使用任选的两种或更多缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物典型的提供以占总组合物的重量计为约0.001％到约4％的量。

发明的CAR材料在药物制剂中的浓度可以改变，例如，以重量计从小于约1％，通常为或至少约10％，到差不多约20％到约50％或更多，且可以由液体体积，和粘性依照选择的特定给药模式初步筛选。

制备可施用(例如，肠胃外可施用)组合物的方法是已知的或对于那些本领域技术人员是显而易见的并更详细描述于，例如，Remington∶TheScience and Practice of Pharmacy，Lippincott Williams&Wilkins；第21版.(2005年5月1日)中。

以下用于口服，气溶胶，肠胃外(例如，皮下的，静脉内的，动脉内的，肌肉的，皮内的，腹膜内的和鞘内的)的和局部给药的制剂仅是示例性的，且绝不是限制性的。多于一种途径可以用于施用本发明的CAR材料，且在一些实例中，特定的途径可以提供比其它途径更直接和更有效的反应。

适于口腔给药的制剂可以包含以下成分或由以下成分组成(a)液体溶液，例如溶于稀释剂的有效量的本发明的CAR材料，例如水，盐水，或橙汁；(b)胶囊剂，袋剂，片剂(tablets)，锭剂，和片剂(troches)，每种包含预定量的活性成分，如固体或料粒；(c)粉末；(d)在合适液体中的悬液；和(e)合适的乳状液。液体制剂可以包括稀释剂，例如水和酒精，例如，乙醇，苯甲醇，和聚乙烯醇，或者加入，或者不加入药学上可接受的表面活性剂。胶囊形式可以是普通硬度的或软壳明胶型的，其包含，例如，表面活性剂，润滑剂，和惰性填料，例如乳糖，蔗糖，磷酸钙，和玉米淀粉。片剂形式可以包括乳糖，蔗糖，甘露糖，玉米淀粉，马铃薯淀粉，海藻酸，微晶纤维素钠，阿拉伯胶，明胶，瓜尔胶，胶体二氧化硅，交联羧甲基纤维素钠，滑石，硬脂酸镁，硬脂酸钙，硬脂酸锌，硬脂酸，和其它赋形剂，着色剂，稀释剂，缓冲剂，崩解剂，防腐剂，调味剂和其它药学相容的赋形剂的一种或更多。锭剂形式可以包含本发明的CAR材料于香料，通常蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶，和包含本发明的CAR材料于惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶，乳状液，凝胶，诸如此类包含此外的如在本领域中已知的此种赋形剂的锭剂。

适于肠胃外给药的制剂包括水的或非水的等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂，和使制剂等渗于目标接受者的血液的溶质，和可以包括悬浮剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂和防腐剂的水和非水的无菌悬液。本发明的CAR材料可以于药学载体以生理可接受的稀释剂给药，所述药学载体例如无菌液体或液体混合物，包括水，盐水，含水葡萄糖和相关糖溶液，酒精，例如乙醇或十六醇，乙二醇(例如丙烯乙二醇或聚乙二醇)，二甲基亚砜，甘油，缩酮(例如2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醇，乙醚，聚(乙烯乙二醇)400，油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯，其中加或不加入药学上可接受的表面活性剂(例如脂肪酸盐或去污剂)，悬浮剂，例如果胶，卡波姆，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素，或乳化剂和其它药学佐剂。

可以用于肠胃外制剂中的油包括石油，动物，植物，或合成油。油的特定的实例包括花生，大豆，芝麻，棉籽，玉米，橄榄，石蜡油，和矿物。用于肠胃外制剂的合适的脂肪酸包括油酸，硬脂酸，和异硬脂酸。油酸乙酯和豆蔻酰异丙脂是合适的脂肪酸酯的实例。

用于肠胃外制剂的合适的脂肪酸盐包括脂肪碱金属，铵和三乙醇铵，且合适的去污剂包括(a)阳离子去污剂像，例如，二甲基二烷基卤化铵,和烷基吡啶卤化物，(b)阴离子去污剂，像，例如，烷基，芳基，和烯属磺酸酯，烷基，烯，醚，和单酸甘油酯硫酸盐，和磺基琥珀酸酯，(c)非离子去污剂像,例如，脂肪胺氧化物，脂肪酸链烷醇酰胺，和聚氧乙稀聚丙烯共聚物，(d)两性去污剂像，例如，烷基-β-氨基丙酸盐，和2-烷基-咪唑啉季铵盐,和(e)其混合物。

肠胃外制剂典型地包含，例如，以重量计从约0.5％到约25％本发明的CAR材料于溶液中。可以使用防腐剂和缓冲液。为了最小化或消除在注射位点的刺激，此种组合物可以包含一个或多个非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂具有，例如，亲水亲油平衡(HLB)为从约12到约17。在此种制剂中表面活性剂的量将典型的在，例如，以重量计从约5％到约15％的范围内。合适的表面活性剂包括聚乙二醇山梨聚糖脂肪酸酯，例如山梨聚糖单油酸酯和通过环氧丙烷与丙二醇的缩合形成的环氧乙烷与疏水性基质的高分子量加合物。所述肠胃外制剂可以提供于单剂量或多剂量的容器中，例如安瓿瓶或小瓶，并可以储存于冻干(冻干)条件，所述冻干条件仅需要在使用前马上加入无菌液体赋形剂，例如，用于注射的水。临时的注射溶液和悬液可以从之前描述的种类的无菌粉末，料粒和片剂制备。

可注射制剂根据本发明的一个实施方案。对用于可注射组合物的有效的药学载体的需求对于那些本领域普通技术人员是公知的(参见，例如，Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers，eds.,第238-250页(1982)，和ASHP Handbook onInjectable Drugs，Toissel，第四版，第622-630页(1986))。

典型的制剂，包括用于穿过表皮的药物释放的，那些本领域技术人员公知的和在本发明的实施方案用于应用于皮肤的情况下为合适的那些。单独或与其它合适的组分联合的本发明的CAR材料，可以制成气溶胶制剂以通过吸入给药。这些气溶胶制剂可以置于加压的可接受的推进剂中，所述推进剂例如二氯二氟甲烷，丙烷，氮，诸如此类。它们还可以配制为用于非加压制备物的药物，例如在喷雾器(nebulizer)或雾化器中(atomizer)。此种喷雾制剂还可以用于喷射粘液。

“有效量”或“治疗有效量”指在个体中足以预防或治疗癌症的剂量。对于治疗或预防用途有效的量将依赖于，例如，疾病的阶段和严重度或所治疗的病症，年龄，体重，和患者的一般健康状况，和处方医生的判断。剂量的规格也将由选择的活性剂，给药的方法，给药的时限和频率，可能伴随特定活性剂的给药的任何不利的副反应的存在，性质和程度，和想要的生理效应。一个本领域技术人员将理解不同疾病或病症可能需要延长的治疗，所述延长的治疗包括多次给药，在每次或不同轮次的给药中可能使用本发明的CAR材料。经由实施例且不意在限制本发明，本发明的CAR材料的剂量可以是约0.001到约1000mg／kg治疗的受试者的体重／天，从约0.01到约10mg／kg体重／天，约0.01mg到约1mg／kg体重／天。当本发明的CAR材料为宿主细胞时，宿主细胞的典型剂量可以是最小为一百万个细胞(1mg细胞／剂)。当本发明的CAR材料是包装在病毒中的核酸时，病毒的典型剂量可以是1ng／剂。

为了本发明，给药的本发明的CAR材料的量或剂量应该在受试者或动物中，在合理的时间范围内，足以达到治疗或预防反应。例如，本发明的CAR材料的剂量应该从给药时间开始，在从约2小时或更长，例如，约12到约24或更多小时的时期内，足以结合抗原，或检测，治疗或预防疾病。在一些实施方案中，时限甚至可以更长。剂量将由特定的发明的CAR材料的功效，和将要治疗的动物(例如，人)的体重决定。

为了本发明，可以使用测定法以确定施用于哺乳动物的起始剂量，所述测定法包含，例如，一组每个给予不同剂量的T细胞的哺乳动物中，当施用给定剂量的此种T细胞于哺乳动物时，比较靶细胞溶解和／或由表达本发明的CAR的T细胞分泌的IFN-γ的程度。当施用一定剂量时，靶细胞溶解和／或分泌IFN-γ的程度可以由在本领域中已知的方法测试。

除了在前描述的药物组合物外，本发明的CAR材料可以配制为包合络合物(inclusion complex)，例如环糊精包合络合物，或脂质体。脂质体可以用来靶向本发明的CAR材料到特定的组织。脂质体还可以用于增加本发明的CAR材料的半衰期。如描述于，例如，Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9，467(1980)和美国专利4,235,871,4,501,728,4,837,028,和5,019,369中的，很多方法可用于制备脂质体。

在本发明的实施方案的情况下有用的给药系统可以包括限时释放的，延时释放和持续释放的给药系统，这样以至于本发明的组合物的给药发生在治疗位点敏化之前和具有足够的时间已导致治疗位点敏化。本发明的组合物可以与其它治疗剂或疗法联合。此种系统可以避免本发明的组合物的重复给药，从而增加对于受试者和医生的便利性并，可以尤其适于本发明的一些组合物实施方案。

很多类型的释放给药系统是可用的且对于那些本领域普通技术人员已知。它们包括聚合物基质系统例如聚(交酯-乙交酯)，共聚草酸酯，聚己酸内酯，聚酰胺酯，聚原酸酯，聚羟基丁酸，和聚酐。前述包含药物的聚合物的微胶囊描述于，例如,美国专利5,075,109中。给药系统还包括非聚合物系统，所述系统为脂类(包括甾醇，例如胆固醇,胆固醇酯，和脂肪酸或中性脂肪，例如甘油单酯，甘油二酯和甘油三酯)；水凝胶释放系统；sylastic系统；基于肽的系统；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合植入物；诸如此类。特定的实例包括,但不限于∶(a)侵蚀系统，其中活性组合物以在基质内的形式包含，例如描述于美国专利4,452,775,4,667,014,4,748,034,和5,239,660中的那些和(b)扩散系统，其中活性组分以受控的速率从聚合物渗透，例如描述于美国专利3,832,253和3,854,480中的。此外，可以使用基于泵的硬件给药系统，其中的一些适于移植。

一个在本领域中的普通技术人员将容易理解本发明的发明的CAR材料可以以许多方式修饰，这样以至于本发明的CAR材料的治疗或预防效果通过修饰增加。例如，本发明的CAR材料可以或者直接或者通过桥间接偶联于靶向部分。对于靶向部分，偶联化合物的实践，例如，发明的CAR材料，在本领域中已知。参见，例如，Wadwa等，J.Drug Targeting3∶111(1995)和美国专利5,087,616。

备选的，本发明的CAR材料可以修饰为储臧的形式，这样以至于本发明的CAR材料释放入施用的身体内的方法相对于时间和体内位置是受控的。(参见，例如，美国专利4,450,150)。发明的CAR材料的储藏形式可以是，例如，植入组合物包含本发明的CAR材料和多孔的或非多孔的材料(例如聚合物)，其中本发明的CAR材料由材料形成胶囊或分散于整个材料形成胶囊和／或非多孔材料的降解物。储存物随后移植于身体内想要的部位，且本发明的CAR材料以预定的速率从移植物中释放。

当本发明的CAR材料与一个或多个另外的治疗剂施用时，一个或多个另外的治疗剂可以共施用于哺乳动物。由“共施用”意为在时间上十分近地施用一个或多个另外的治疗剂和本发明的CAR材料，这样以至于本发明的CAR材料可以增强一个或多个另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在这点上,本发明的CAR材料可以首先施用且所述一个或多个另外的治疗剂可以其次施用，或反之亦然。备选的，本发明的CAR材料和所述一个或多个另外的治疗剂可以同时施用。典型的可以与所述CAR材料共施用的治疗剂是IL-2。相信IL-2增强本发明的CAR材料的治疗效果。为了本发明的方法，其中宿主细胞或细胞群体施用于哺乳动物，所述细胞可以是与哺乳动物异源或自体同源的细胞。

预期本发明的药物组合物，CAR，核酸，重组表达载体，宿主细胞，或细胞群体可以用于治疗或预防哺乳动物中的疾病的方法中。未束缚于特定的理论或机制，本发明的CAR具有生物活性，例如，识别抗原(例如，CD22)的能力，这样以至于所述CAR当由细胞表达时能够介导针对表达抗原(例如，所述CAR特异的CD22)的细胞的免疫应答。在这点上，本发明的一个实施方案提供治疗或预防哺乳动物中癌症的方法，包含以有效治疗或预防哺乳动物中的癌症的量施用于哺乳动物所述CAR，所述核酸，所述重组表达载体，所述宿主细胞，所述细胞群，所述抗体和／或其抗原结合部分，和／或本发明的药物组合物。

本发明的一个实施方案进一步包含在施用本发明的CAR材料之间对哺乳动物淋巴排除。淋巴排除的实例包括，但可以不限于，非清髓性淋巴排除化学疗法，清髓性淋巴排除化学疗法，全身辐照，等

为了本发明的方法，其中施用宿主细胞或细胞群体，所述细胞可以是是与哺乳动物异源或自体同源的细胞。优选的，所述细胞是与哺乳动物自体同源的细胞。

哺乳动物在此指可以是任何哺乳动物。如在此使用的，术语“哺乳动物”指任何哺乳动物，包括，但不限于，啮齿目的哺乳动物，例如小鼠和仓鼠，和兔目的哺乳动物，例如兔。所述哺乳动物可以源自食肉目，包括猫科的(猫)和犬科的(狗)。所述哺乳动物可以源自偶蹄目，包括牛科的(母牛)和猪科的(猪)或奇蹄目的，包括马科的(马)。所述哺乳动物可以是灵长类的，Ceboids，或Simoids(猴)或类人目的(人和猿)。优选的，所述哺乳动物为人。

关于本发明的方法，所述癌症可以是任何癌症，包括急性淋巴细胞癌症，急性髓细胞样白血病，腺泡状横纹肌肉瘤，膀胱癌(例如，膀胱癌)，骨癌，脑癌(例如，成神经管细胞瘤)，乳腺癌，肛门、肛门管或肛门直肠部的癌症，眼部癌症，肝内胆管的癌症，关节的癌症，颈部、胆囊或胸膜的癌症，鼻、鼻腔或中耳的癌症，口腔的癌症，阴户的癌症，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓样癌，结肠癌，食道癌，宫颈癌，纤维肉瘤，胃与肠的类癌瘤，头和颈部癌症(例如，头和颈鳞状细胞癌)，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，肾癌，喉癌，白血病，血液肿瘤，肝癌，肺癌(例如，非小细胞肺癌)，淋巴瘤，恶性间皮瘤，肥大细胞瘤，黑色素瘤，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，非霍奇金淋巴瘤，B-慢性淋巴细胞白血病，多毛细胞白血病，急性淋巴细胞白血病(ALL)，和伯基特淋巴瘤，卵巢癌，胰腺癌，腹膜，网膜和肠系膜癌症，咽癌，前列腺癌，直肠癌，肾癌，皮肤癌，小肠癌，软组织癌，实体瘤，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，和输尿管癌的任一种。优选的，所述癌症为恶性血液肿瘤(例如，白血病或淋巴瘤，包括但不限于霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，急性淋巴细胞癌症，急性髓细胞样白血病，B-慢性淋巴细胞白血病，多毛细胞白血病，急性淋巴细胞白血病(ALL)，和伯基特淋巴瘤)。优选的，所述癌症由CD22的表达表征。

如在此使用的，术语“治疗，”和“预防”和从其中衍生的词不一定意为100％或完全的治疗或预防。反而，存在变化的治疗或预防程度，所述程度为本领域普通技术人员接受具有潜在的好处或治疗效果。在这方面,本发明的方法可以提供哺乳动物中癌症的任何水平的治疗或预防的量。此外，由本发明的方法提供的治疗或预防可以包括疾病(例如，治疗或预防的癌症)的一个或多个病状或症状的治疗或预防。并且，为了在此的目的，“预防”可以包括延迟疾病或其症状或病状的开始。

本发明的一个其它实施方案提供本发明的CAR，核酸，重组表达载体，宿主细胞，细胞群体，抗体或其抗原结合部分，或药物组合物，用于哺乳动物中癌症的治疗或预防的用途。

本发明的一个其它实施方案提供检测哺乳动物中癌症的存在的方法，包含∶(a)将包含一个或多个源自哺乳动物的细胞与本发明的所述CAR，所述核酸，所述重组表达载体，所述宿主细胞，所述细胞群，所述抗体，和／或其抗原结合部分接触，从而形成复合物，(b)并检测所述复合物，其中复合物的检出表明哺乳动物中癌症的存在。

所述样品可以由任何合适的方法获得，例如，活组织检查或尸体解剖。活组织检查为从个体移出组织和／或细胞。此种移出可以是从个体收集组织和／或细胞以便在移出的组织和／或细胞上进行实验。此种实验可以包括用以确定是否个体具有和／或患有一定的病状或疾病状态的实验。所述病状或疾病可以是，例如，癌症。

关于本发明的一个实施方案的检测哺乳动物中癌症的存在的方法，所述包含哺乳动物细胞样品可以是包含完整细胞，其溶胞产物，或全细胞溶胞产物的部分(例如，核的或细胞质部分，全部蛋白部分，或核酸部分)的样品。如果样品包含完整细胞，所述细胞可以是哺乳动物的任何细胞，例如，器官或组织的细胞，包括血液细胞或内皮细胞。

为了本发明的检测方法，所述接触可以发生在相对于哺乳动物的体外或体内。优选的，所述接触是体外的。

此外，复合物检测可以通过在本领域中已知的很多方式发生。例如，在此描述的本发明的TCR，多肽，蛋白，核酸，重组表达载体，宿主细胞，细胞群体，或抗体或其抗原结合部分可以用可检测标签标记，所述标签像，例如，放射性同位素，荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)，藻红蛋白(PE))，酶(例如，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶)，和元素颗粒(例如，金颗粒)。

测试CAR识别靶细胞和抗原特异性的能力的方法在本领域中已知。例如，Clay等，J.Immunol.，163；507-513(1999)，教导了测量细胞因子(例如，干扰素-γ，粒细胞／单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF-α)或白介素2(IL-2))的释放的方法。此外，CAR功能可以由如描述于Zhao等，J.Immunol.，174∶4415-4423(2005)中的细胞的细胞毒性的测量评估。

以下实施例进一步说明本发明，但当然不应理解为以任何方式限制其范围。

实施例1

该实施例证明抗CD22CAR的合成，用抗CD22CAR对PBMC的转导，和在转导的PBMC上的CAR表面表达的分析。

编码CAR的序列使用密码子优化算法(Mr.Gene GmBH，Regensburg，Germany)合成且如描述于(zhao等，J.Immunol.，183(9)∶5563-74(2009))中的亚克隆入编码第二代，版本1(CD28跨膜和细胞内T细胞信号传导结构域和CD3-ζ链细胞内T细胞信号传导结构域)；第二代，版本2(连接于CD137和CD3-ζ细胞内T细胞信号传导结构域的CD8跨膜结构域)；或第三代(CD8跨膜结构域，其连接于CD28，CD137，和CD3-ζ细胞内T细胞信号传导结构域)序列(如在以上表1中显示的)的“目标”载体。

逆转录病毒载体上清液由用编码CAR逆转录病毒载体和RD114包膜糖蛋白的质粒转染293GP细胞，48-72小时后收集培养上清液(s／n)产生。冷冻培养上清液或如之前描述于Y Zhao等，J.Immunol.，183∶5563(2009)中的，立即使用培养上清液使用“平板上”方法转导OKT3和IL-2激活的人PBMC2个连续日(在包被有预暴露于包含s／n的载体的稀释液的RECTRONECTIN(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)的平板上的淋巴细胞的培养)。同样用于本研究的是包含源自永久生产细胞系的CD19-特异的CAR的逆转录病毒s／n(Kochenderfer等，Blood，116∶4099(2010))。

转导的T细胞上的CAR表达用流式细胞术测定。为了检测非-CH2CH3编码CAR，转导的T细胞与CD22-Fc(R&D System，Minneapolis，MN)孵育，继之以特异于人IgG-Fc的FITC-F(ab’)₂(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)孵育。为了检测根据CH2CH3结构域的表达CAR的细胞，使用山羊抗人IgG(H&L)。HA22SH CAR表达短的免疫球蛋白恒定结构域序列，而非CH2CH3。CD19-特异的CAR不包含Ig区域且使用蛋白L检测。生物素化的蛋白L(50ng／ul，Thermo Scientific，Waltham，MA)结合，洗涤细胞，随后用SA-FITC(4ug／ml，BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)检测。使用包含逆转录病毒载体的上清液的两个稀释度(1∶4和1∶8)。为了比较，还评估CD19-CAR载体s／n。流式细胞术实验确定列于表1的所述CAR在转导的T细胞上的CAR表达。

实施例2

该实施例证明在白血病细胞系上CD22和CD19抗原的表达。

使用QUANTI-BRITE PE珠子(BD Biosciences)和PE-标记的抗CD19和抗CD22抗体评估人白血病细胞系(REH，SEM，NALM-6，KOPN-8，Daudi，Raji，和K562)中CD19和CD22在细胞表面的表达水平(表2)。“每个细胞中的受体数量”指在每个指定的细胞系中，每个细胞中分子的近似绝对数量。使用CELLQUEST软件(BD)数据分析工具，根据制造商的使用说明，通过测定结合与每个细胞的抗体(ABC)计算出数据。

表2

白血病细胞系	每个细胞中的受体数量
		REH CD19	15,100
SEM CD19	50,800
		NALM-6CD19	50,500
KOPN-8CD19	60,800
		Daudi CD19	15,000
Raji CD19	50,000
		K562CD19	＜100
REH CD22	7,000
		SEM CD22	7,000
NALM-6CD22	8,000
		KOPN-8CD22	15,300
Daudi CD22	8,000
		Raji CD22	60,800
K562CD22	＜200

实施例3

该实施例证明信号传导基序和CH2CH3对CAR体外活性的影响。

为了测定是否提供的第二代或第第三代CAR构建体增加溶解活性，白血病细胞系用⁵¹Cr标记且用作CTL测定中的靶。效应细胞为转导有以下CAR之一的人T细胞∶HA22-第二代(SEQ ID NO∶15)，HA22-第三代(SEQ ID NO∶16)，BL22-第二代(SEQ ID NO∶19)，BL22-第三代(SEQ ID NO∶20)，HA22-SH-第二代(SEQ ID NO∶17)，HA22-SH-第三代(SEQ ID NO∶18)，模拟品转导(未转导的)，和CD19-特异的CAR。效应细胞与靶细胞在不同的效应物相对靶(E∶T)的比率共培养。结果显示在图1和6A-6L中。如显示于图1和6A-6H中的，当与第三代CAR相比时，第二代CAR展示优异的溶解活性。此外，如在图6I-6L中显示的，在体外实验中，加入来自IgG1的CH2CH3不影响CAR功能。

实施例4

该实施例证明当分析不同的CAR构建体时，溶解单位可以用于标准化转导效率。

为了标准化每个CAR的转导效率，分析效应T细胞中CAR表达的百分数。随后校正E∶T比率为每孔中效应物的实际数量(即，如果转导百分数为50％，E∶T比率从10∶1减少到5∶1)。随后建立校正的E∶T比率对比溶解百分数的曲线。一个溶解单位定义为在E∶T比率为10∶1情况下30％溶解靶细胞。该功能性“单位”定义量化了在每个比较的转导的效应细胞群中溶解活性的量。溶解单位表示对于构建体之间转导效率方面的差异的标准化的E∶T比率。图8A-8D显示对于CARHA2228z(SEQ ID NO∶15)；HA2228BBz(SEQ ID NO∶16)；BL2228z(SEQ ID NO∶19)；BL2228BBz(SEQ IDNO∶20)；HASH2228z(SEQ ID NO∶17)；或HASH2228BBz(SEQ ID NO∶18)相对于细胞系REH，SEM，NALM-6，或KOPN-8的溶解活性。

实施例5

该实施例证明基于HA22和BL22的抗CD22CAR的溶解活性。

为了测定是否对于CD22的亲和力方面的差异对CAR溶解活性有影响，在使用描述于实施例2中四株白血病细胞系为靶的⁵¹Cr释放CTL测定中，比较HA22和BL22scFv序列编码CAR∶KOPN8(图2A)，NALM6(图2B)，REH(图3A)，和SEM(图3B)。比较三个不同的第二代，版本1抗CD22CAR构建体∶HA22-CH2CH3(SEQ ID NO∶15)，BL22-CH2CH3(SEQ ID NO∶19)，和HA22-SH(短的免疫球蛋白恒定结构域序列)(SEQ IDNO∶17)。包括高活性的抗CD19CAR用作对照。如描述于实施例4的，根据每个个体的CAR构建体的转导百分数标准化E∶T比率，并因此溶解值可直接比较。如显示于图2A中的，细胞系KOPN8明显地展示出基于scFv亲和力的溶解活性的差异。当个体E∶T比率用Student氏t检验(不成对的，双尾的)比较所有比率大于1∶1的时，BL22活性显著低于HA22(p＜0.04)或HASH(p＜0.005)。该实施例证明在一些白血病细胞系中高亲和力scFV当用于CAR构建体时，产出更有效的靶细胞溶解，且这种差异不表现出与CD22表达水平相关。

实施例6

该实施例证明基于HA22的抗CD22CAR的溶解活性。

T淋巴细胞用OKT3和IL-2激活两天，用空载体(模拟品)或表达如下CAR构建体的逆转录病毒载体转导∶HA22(第二代，版本1)(SEQ ID NO∶15)，HA22(第三代)(SEQ ID NO∶16)，抗CD19CAR，HASH22(第二代，版本1，短的免疫球蛋白恒定结构域序列)(SEQ ID NO∶17)，或HASH22(第三代，短的免疫球蛋白恒定结构域序列)(SEQ ID NO∶18)。转导的细胞随后测试溶解表达CD22的白血病细胞系，REH，SEM，和NALM6的能力(图4)(八小时⁵¹Cr释放测定)。这三种细胞系还表达抗原CD19。效应物对靶的比率为30∶1。K562细胞系用作抗原阴性对照。K562细胞系用作抗原阴性对照。如显示于图4中的，抗CD22CAR有效地溶解白血病细胞系REH，SEM，和NALM6。

实施例7

该实施例证明第二代，版本1HASH22CAR的溶解活性。

编码第二代HASH22CAR(SEQ ID NO∶17)的核苷酸序列用于产生包含逆转录病毒载体的上清液。这些上清液用于转导人T淋巴细胞，且检测转导的T淋巴细胞溶解具有CD22抗原的细胞系的能力。

T淋巴细胞用OKT3和IL-2激活两天，用上清液包含所述逆转录病毒的CAR载体转导，且随后测试其溶解表达CD22的白血病细胞系，REH，SEM，NALM6，KOPN8，Daudi，Raji和CD22阴性对照细胞系K562的能力。作为对照(模拟品)，T细胞以同样的方式孵育和培养，但不暴露于包含所述CAR载体(未转导的)的逆转录病毒的上清液。

结果显示于图5A和5B。对于对照细胞，观察到很少到没有肿瘤靶的溶解(图5A)。对于HASH22CAR-转导的细胞，观察到REH，SEM，和KOPN8细胞系的溶解(图5B)。

实施例8

该实施例证明转导有基于HA22的CAR的细胞延迟疾病的进展和延长体内存活的持续时间。

NSG(NOD scid gamma)，在第0天用设计以表达荧光素酶(0.5x10⁶NALM6-GL(用荧光素酶转染的NAML6))的CD22-阳性的人白血病免疫缺陷小鼠。在第3天，小鼠用1x10⁷对照T细胞(“模拟品，”未转导的)或1x10⁷转导有HASH22CAR-第二代，版本1(SEQ ID NO∶17)，HASH22CAR-第三代(SEQ ID NO∶18)，或HASH22CAR-第二代，版本2(SEQ ID NO∶32)T细胞处理。在30天的时期内使用Xenogen IVIS仪器以生物荧光成像测定肿瘤负荷。用3mg D-荧光素(Caliper Life Sciences，Inc.)腹膜内注射(i.p.)小鼠，且注射后4分钟以30秒的曝光时间成像麻醉的小鼠。使用LIVINGIMAGE软件以光子／s／cm²／sr分析生物荧光信号每一只小鼠。Kaplan-Meier曲线显示于图7A中。

如显示于图7A中的，所述小鼠在第三天具有相当疾病。当与用对照细胞处理的小鼠比较时，用转导有HASH22CAR-第二代，版本1(SEQ IDNO∶17)，HASH22CAR-第三代(SEQ ID NO∶18)，或HASH22CAR-第二代，版本2(SEQ ID NO∶32)的T细胞处理的小鼠减少了小鼠中的肿瘤负荷。

测定小鼠的存活30天，使用Log-rank(Mantel-Cox)分析计算存活统计学，且存活结果显示于图7B中。如显示于图7B中的,当与用对照细胞处理的小鼠相比时，转导有HASH22CAR-第二代,版本1(SEQ ID NO∶17)，HASH22CAR-第三代(SEQ ID NO∶18)，或HASH22CAR-第二代，版本2(SEQ ID NO∶32)的T细胞处理的小鼠展示出增加的存活。

在此饮用的所有参考文献，包括出版物，专利申请，和专利，因此像每个参考文献单独和特异地指出以通过引用并入一样，以相同的程度通过引用并入，且在此以其整体列出。

在描述本发明的上下文中(尤其在以下的权利要求的上下文中)，术语“一个(a)”和“一个(an)”和“那个(the)”和类似的指示物的使用将理解为覆盖单数和复数二者，除非在此另有陈述或与上下文明显抵触。术语“包含(comprising)，”“具有(having)，”“包括(including)”和“包含(containing)”将理解为开放的术语(即，意为“包括，但不限于”)，除非另有说明。在此，值的范围的叙述仅意在用作单独指在范围内中的每个分离的值的简写方法，

除非在此另有陈述，且每个分离的值像其在此单独陈述一样引入说明书。

所有在此描述的方法可以以任何合适的顺序进行，除非在此另有陈述或与上下文明显抵触。在此提供的任何或所有实施例，或典型术语(例如，“例如(such as)”)的使用，仅意在更好阐明本发明且不造成对本发明范围的限制，除非另有要求。说明书中没有术语应该理解为指示任何非要求的作为对本发明的实践必要的成分。

本发明优选的实施方案在此描述，包括对于发明人来说用于实现本发明的最好的方式。在阅读上文描述时，那些优选的实施方案的改变可以变成对于本领域技术人员来讲显而易见的。发明人预期熟练技术人员酌情使用此种改变，且发明人意在除了如在此详细描述之外，使本发明付诸实践。因此，本发明包括在如由适用的法律允许的附于此的权利要求中陈述的主题的所有改变和相等物。此外，以上描述的成分的以其所有可能的改变形式的任何组合由本发明包括，除非在此另有陈述或与上下文明显抵触。

Claims (25)

1.嵌合抗原受体(CAR)，其包含∶

a)HA22的抗原结合结构域，跨膜结构域，和细胞内T细胞信号传导结构域；或

b)BL22的抗原结合结构域，跨膜结构域，和包含i)CD28和／或ii)CD137的细胞内T细胞信号传导结构域。

2.根据权利要求1的CAR，其中所述抗原结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO∶1或2的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2的CAR，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含含有SEQ ID NO∶3或4的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项的CAR，其中所述抗原结合结构域包含含有SEQ1D NO∶5或6的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-4任一项的CAR，进一步包含含有SEQ ID NO∶7的前导序列。

6.根据权利要求1-5任一项的CAR，进一步包含免疫球蛋白结构域。

7.根据权利要求6的CAR，其中所述免疫球蛋白结构域包含含有SEQID NO∶8，9或36的氨基酸序列。

8.根据权利要求1-7任一项的CAR，其中所述跨膜结构域包含i)CD8和／或ii)CD28。

9.根据权利要求1-8任一项的CAR，其中所述跨膜结构域包含a)包含SEQ ID NO∶10或33的CD8氨基酸序列和／或b)包含SEQ ID NO∶11的CD28氨基酸序列。

10.根据权利要求1-9任一项的CAR，其中所述细胞内T细胞信号传导结构域包含i)CD28，ii)CD137，和iii)CD3ζ中的一个或多个。

11.根据权利要求1-10任一项的CAR，其中所述细胞内T细胞信号传导结构域包含含有SEQ ID NO∶12的CD28氨基酸序列。

12.根据权利要求1-11任一项的CAR，其中所述细胞内T细胞信号传导结构域包含含有SEQ ID NO∶13或34的CD137氨基酸序列。

13.根据权利要求1-12任一项的CAR，其中细胞内T细胞信号传导结构域包含含有SEQ ID NO∶14或35的CD3ζ氨基酸序列。

14.根据权利要求1-10任一项的CAR，其包含含有SEQ ID NO∶15-20和32任一个的氨基酸序列。

15.核酸，其包含编码根据权利要求1-14任一项的CAR的核苷酸序列。

16.根据权利要求15的核酸，其包含选自由SEQ ID NO∶21-23和38组成的组的核苷酸序列。

17.根据权利要求16的核酸，进一步包含选自由SEQ ID NO∶24-25和39组成的组的核苷酸序列。

18.重组表达载体，其包含权利要求15-17任一项的核酸。

19.分离的宿主细胞，其包含权利要求18的重组表达载体。

20.细胞群，其包含至少一个权利要求19的宿主细胞。

21.抗体，或其抗原结合部分，其特异结合根据权利要求1-14任一项的CAR。

22.药物组合物，其包含权利要求1-14任一项的CAR，权利要求15-17任一项的核酸，权利要求18的重组表达载体，权利要求19的宿主细胞，权利要求20的细胞群，或权利要求21的抗体或其抗原结合部分，和药学上可接受的载体。

23.检测哺乳动物中癌症的存在的方法，其包括∶

(a)将包含一个或多个源自哺乳动物的细胞的样品与权利要求1-14任一项的CAR，权利要求15-17任一项的核酸，权利要求18的重组表达载体，权利要求19的宿主细胞，权利要求20的细胞群，或权利要求21的抗体或其抗原结合部分接触，从而形成复合物，和

(b)检测所述复合物，其中复合物的检测表明哺乳动物中癌症的存在。

24.治疗或预防哺乳动物中癌症的方法，其包括以有效治疗或预防哺乳动物中的癌症的量施用权利要求1-14任一项的CAR，权利要求15-17任一项的核酸，权利要求18的重组表达载体，权利要求19的宿主细胞，权利要求20的细胞群，权利要求21的抗体或其抗原结合部分，或权利要求22的药物组合物。

25.权利要求1-14任一项的CAR，权利要求15-17任一项的核酸，权利要求18的重组表达载体，权利要求19的宿主细胞，权利要求20的细胞群，权利要求21的抗体或其抗原结合部分，或权利要求22的药物组合物，其用于治疗或预防哺乳动物中癌症。