CN109022363A - 一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法 - Google Patents

一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及CD‑133‑CAR‑T系统构建技术，特别是涉及一种基于PiggyBac载体的CD‑133‑CAR‑T系统构建方法，其是通过设计合成CD‑133‑CAR基因片段，然后将CD‑133‑CAR基因片段连接到Piggybac载体上得到Piggybac‑CAR‑CD‑133，再将Piggybac‑CAR‑CD‑133转入大肠杆菌中进行扩增，然后从大肠杆菌中提取质粒，并加入到人血清中分离的淋巴细胞中进行扩展培养，采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac‑CAR‑CD‑133和Piggybac Transposase到T淋巴细胞，得到带有CD‑133‑CAR基因片段的T淋巴细胞。本发明采用非病毒类载体PiggyBac系统，避免了使用病毒载体存在的安全隐患，具有更高的安全性和有效性，更加适用于临床治疗；采用的Nucleofector细胞核技术，能够将外源基因直接导入到细胞核，克服了脂质体转染和普通电穿孔，必须依赖细胞分裂时才有可能使外源基因入核表达的缺陷，细胞具有更高的存活率和增殖效率。

Description

一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法
技术领域
本发明涉及CD-133-CAR-T系统构建技术，特别是涉及一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法。
背景技术
CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法）是近年来发展起来的新的过继免疫细胞治疗手段，通过基因工程手段修饰T细胞，使其表达嵌合抗原受体，嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。CAR分子大致可分为5代演变：I代，特异性T细胞激活；II代，增加共刺激因子，提高细胞毒性；III代，同时具有两个共刺激因子，提高T细胞增殖能力与杀伤毒性；IV代，整合自杀基因，精确调控，细胞因子释放（如IL-7，IL-15）激活等；V代，通用型CAR。与普通的免疫细胞治疗相比，CAR-T技术具有许多独特的优势，如CAR能非MHC依赖性识别肿瘤抗原，不需要经过APC。肿瘤表面蛋白类和脂类抗原都可以作为靶点；有共刺激分子，能有效增强T细胞增殖。因此该技术被认为是有望彻底攻克人类癌症的独特方法。
CD133是五肽跨膜糖蛋白成员之一，首次在CD34 birght造血干细胞和小鼠的神经上皮干细胞中发现并分离，之后的研究发现肿瘤起始细胞群里含有大量的CD133阳性的细胞，同时CD133在干细胞和多种组织肿瘤干细胞表面作为独立表达的特异标记分子，其中包括脑瘤、胰腺癌、胆管细胞型肝癌（CCA），非小细胞肺癌(NSCLC)，小细胞肺癌（SCLC）、结肠癌和肝癌等。众多研究表明，CD133高表达与肿瘤的自我更新、分化潜能、信号转导调控、药物耐受、复发和预后等均有相关性。由于以上特性，CD133抗原是以抗体为基础的CAR-T免疫治疗的理想靶点。有报告显示，针对超过90%的肿瘤细胞表达CD133蛋白的胆管细胞型肝癌（CCA）患者，采取CAR-T-CD133 T细胞免疫治疗疗效显著，该名患者的腹膜和腹腔转移灶出现明显萎缩和消失，无进展生存期（Progress Free Survival ,PFS）达到4.5个月。
尽管如此，该治疗仍有许多环节需要改进，如能否找到更好的受体、更好的载体、更好的协同刺激分子等，其中转染载体的安全性和有效性对于临床治疗尤为关键。现今，CAR主要的转染模式包括，慢病毒、逆转录病毒、电转染等方式，病毒载体尽管具有较好的转染效率，但存在因基因组整合引起插入突变的风险，因此，利用非病毒载体结合电转技术，不需要病毒的介入，可获得与病毒感染效率相当甚至更高的转染结果，避免了病毒核酸随机插入宿主细胞，影响细胞正常生长以及后续可能的病变，是提升CAR-T细胞疗法的安全性的重要环节。
PiggyBac (PB) 系统是利用PB转座子特有的“剪切和粘贴”机制，使DNA片段在载体和基因组之间“自由”的转移，从而有效介导外源DNA片段对基因组的整合。转座时，转座酶有效的识别特异的转座子序列(ITRs)，与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，“剪切”后脱离，“粘贴”至基因组的TTAA位点。作为一种新的转基因手段，PiggyBac系统具有许多优势：(1)、与病毒载体相比有安全性高、操作方便、成本低等优点；(2)、整合效率高及更高的目的基因表达概率；(3)、负载容量大，更大的目的片段的插入，可实现多基因的共表达；(4)、转基因可长期稳定地表达，转座后没有引起染色体重排等不稳定现象；(5)、更“精确”拷贝数的插入；(6)、再次转座后可自由移除插入片段，实现精确切离；(7)、可用非损伤性的可见标记代替PCR等传统方法在活体中跟踪转基因；(8)、宿主范围广，转座效率高，且基本不依赖于宿主因子。因此，PB转座系统不仅可作为哺乳动物及培养细胞的转基因工具，也是一种较为理想的非病毒类基因治疗载体。基于上述的优势，利用PiggyBac载体构建CD-133-CAR-T势在必行。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法；本发明的另一个目的是提供一种基于PiggyBac载体构建的CD-133-CAR-T系统在制备用于治疗癌症药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的的第一个方面是提供一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法，其是通过设计合成CD-133-CAR基因片段，然后将CD-133-CAR基因片段连接到Piggybac载体上得到Piggybac-CAR-CD-133，再将Piggybac-CAR-CD-133转入大肠杆菌中进行扩增，然后从大肠杆菌中提取质粒，并加入到人血清中分离的淋巴细胞中进行扩展培养，采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac-CAR-CD-133和PiggybacTransposase到T淋巴细胞，所述方法包括以下步骤：
步骤一，CD-133-CAR基因片段设计合成，查找CD-133的单链抗体可变区基因片段序列，并根据PiggyBac载体的的特性，设计合成包括对CD-133抗原具有特异性的单链抗体片段scFv、myc-tag、CD8来源的跨膜铰链、共刺激因子CD28和4-1BB 片段，及细胞内传递信号CD3ζ来源的基因片段，得到CD-133-CAR基因片段；
步骤二，带有CD-133-CAR片段的PiggyBac载体构建，采用酶切、连接和转化的方法，将步骤一得到的CD-133-CAR基因片段连接到PiggyBac载体上，得到带CD-133-CAR基因片段的Piggybac-CAR-CD-133；
步骤三，CD-133-CAR基因检测和筛选，通过基因测序的方法来检测步骤二合成的得到带CD-133-CAR基因片段的Piggybac载体，CD-133-CAR基因序列是否正确，得到带，CD-133-CAR基因的Piggybac-CAR-CD-133；
步骤四，带有CD-133-CAR基因的Piggybac-CAR-CD-133扩增，将步骤三得到的带有CD-133-CAR基因的Piggybac载体转入到大肠杆菌中，使带有CD-133-CAR基因的Piggybac-CAR-CD-133在大肠杆菌中大量扩增；
步骤五，大肠杆菌中质粒提取，采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取步骤四中大肠杆菌的质粒DNA；
步骤六，带有CD-133-CAR基因的T淋巴细胞构建，从人血清中分离淋巴细胞，并加入T淋巴细胞培养液，INF-γ，OKT-3、hIL-2和步骤五得到的质粒DNA进行扩展培养，采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac-CAR-CD-133和PiggybacTransposase到T细胞中，得到带有CD-133-CAR基因的T淋巴细胞。
优选地，所述Piggybac载体为pMD 18-T simple vector。
优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌感受态TOP10。
优选地，所述CD-133-CAR基因片段的序列为SEQ ID NO.2。
优选地，所述Piggybac-CAR-CD-133的基因序列为SEQ ID NO.1。
本发明的另一个方面是提供一种基于PiggyBac载体构建CD-133-CAR-T系统在制备用于治疗癌症药物中的应用。
优选地，所述癌症包括脑瘤、胰腺癌、胆管细胞型肝癌、非小细胞肺癌、结肠癌和肝癌
与现有技术相比，本发明的有益效果：
（1）采用非病毒类载体PiggyBac系统，避免了使用病毒载体存在的安全隐患，具有更高的安全性和有效性，更加适用于临床治疗。
（2）采用的Nucleofector细胞核技术，能够将外源基因直接导入到细胞核，克服了脂质体转染和普通电穿孔，必须依赖细胞分裂时才有可能使外源基因入核表达的缺陷，细胞具有更高的存活率和增殖效率。
附图说明
图1为本发明构建后的基因时序图；
图2 为本发明构建的 CD133特异性CAR；
图3为本发明构建后挑选阳性克隆进行酶切鉴定图；
图4为本发明基因序列的验证图；
图5为本发明转染Jurkat细胞后，CAR表达的验证图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例1
(1)实验准备
试验中，淋巴细胞分离液，T淋巴细胞培养液为 美 国 Invitrogen 公 司 产 品，Nucleofector细胞转染试剂购自Lonza公司，INF-γ，OKT-3和hIL-2抗体购自PeproTech公司，Myc-tag抗体购自Cell signaling公司，无内毒素质粒大抽试剂盒和凝胶回收试剂盒均购自美国Zymo research公司，PCR试剂购自宝生物工程（大连）有 限公司，各种内切酶和T4连接酶均购自NEB 公司。
(2)实验过程
根据PiggyBac载体的的特性，查找CD133的单链抗体可变区（scFv）基因片段序列，并设计合成包括来源于CD133抗原特异性的抗体重链和轻链可变区片段由中间连接分子相连组成的单链抗体（single-chain variable fragment, scFv），中间片段由CD8来源的连接和穿膜片段组成，膜内片段由传递信号的效应分子如CD3ζ组成。将合成的目的基因连接到pMD18-T simple vector 上，采用酶切、连接和转化的方法，将目的基因连接到PiggyBac载体上，使用载体特异性引物进行PCR扩增并测序来检测合成的目的基因序列是否正确，接着将连接产物转入到大肠杆菌感受态TOP10中，使含有目的片段的PiggyBac载体在大肠杆菌中大量扩增。所述片段设计合成方法为：通过设计合成CD133-CAR片段，该片段主要包括对CD133抗原具有特异性的单链抗体片段scFv，myc-tag，CD8来源的跨膜铰链，共刺激因子CD28和4-1BB片段，及细胞内传递信号CD3ζ，然后将CD133-CAR连接到Piggybac载体上。
构建成功后采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取质粒。取人血清，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，并加入T淋巴细胞培养液，INF-γ，OKT-3和hIL-2进行扩展培养。采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac-CAR-CD133和PiggybacTransposase到T细胞，48小时后，收集细胞，myc-tag荧光抗体标记，使用流式细胞仪坚持CD133-CAR的表达。
（3）实验结果分析
构建后的基因时序图如图1所示，实验证明基因序列与设计合成的基因序列完全一致（SEQ ID NO.1）。图2 为本发明构建的 CD133特异性CAR的结构组成图。图3是构建后挑选阳性克隆进行酶切鉴定图。图4为验证的部分基因序列（SEQ ID NO.2）。图5是CAR-CD133在患者T细胞表面表达和鉴定。
以上所述仅为发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的简单修改或变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 马晓冬
<120> 一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法
<141> 2018-08-01
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7857
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120
agtgccacct aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 180
atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 240
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gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc 600
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cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcctcgttca ttcacgtttt tgaacccgtg 780
gaggacgggc agactcgcgg tgcaaatgtg ttttacagcg tgatggagca gatgaagatg 840
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aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag 1800
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tgtaaccaca gaaataggag caaacgctcc cgactgctgc attccgacta catgaacatg 3060
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ttcgcagcct atcggagccg gttcagcgtc gtgaaaaggg ggcgcaagaa actgctgtac 3180
atcttcaagc agccttttat gcgcccagtg cagacaactc aggaggaaga cggatgctct 3240
tgtcggttcc cagaggagga ggaaggaggc tgcgagctga gagtgaagtt cagccggagc 3300
gccgatgcac cagcatatca gcagggacag aatcagctgt acaacgagct gaatctgggc 3360
aggcgcgagg aatatgacgt gctggataag cgacgaggac gggaccccga aatgggagga 3420
aaacccagaa ggaagaaccc tcaggagggg ctgtataatg aactgcagaa agacaagatg 3480
gctgaggcat acagcgaaat tggaatgaaa ggagagcgcc gacgggggaa gggacacgat 3540
gggctgtacc agggactgtc aaccgccact aaagatacct acgacgcact gcacatgcag 3600
gctctgcccc caagagaatt cgaaggatcc gcggccgctg agggcagagg aagtcttcta 3660
acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc ccttccggga tgaccgagta caagcccacg 3720
gtgcgcctcg ccacccgcga cgacgtcccc agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc 3780
gccgactacc ccgccacgcg ccacaccgtc gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc 3840
gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg 3900
gacgacggcg ccgcggtggc ggtctggacc acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg 3960
ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa 4020
cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc 4080
gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga 4140
gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac 4200
ctccccttct acgagcggct cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga 4260
ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc ggtgcctgaa tctaggtcga caatcaacct 4320
ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg 4380
ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcgt taactaaact tgtttattgc 4440
agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 4500
ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggaa 4560
ttgactcaaa tgatgtcaat tagtctatca gaagctcatc tggtctccct tccgggggac 4620
aagacatccc tgtttaatat ttaaacagca gtgttcccaa actgggttct tatatccctt 4680
gctctggtca accaggttgc agggtttcct gtcctcacag gaacgaagtc cctaaagaaa 4740
cagtggcagc caggtttagc cccggaattg actggattcc ttttttaggg cccattggta 4800
tggctttttc cccgtatccc cccaggtgtc tgcaggctca aagagcagcg agaagcgttc 4860
agaggaaagc gatcccgtgc caccttcccc gtgcccgggc tgtccccgca cgctgccggc 4920
tcggggatgc ggggggagcg ccggaccgga gcggagcccc gggcggctcg ctgctgcccc 4980
ctagcggggg agggacgtaa ttacatccct gggggctttg ggggggggct gtccctgata 5040
tctataacaa gaaaatatat atataataag ttatcacgta agtagaacat gaaataacaa 5100
tataattatc gtatgagtta aatcttaaaa gtcacgtaaa agataatcat gcgtcatttt 5160
gactcacgcg gtcgttatag ttcaaaatca gtgacactta ccgcattgac aagcacgcct 5220
cacgggagct ccaagcggcg actgagatgt cctaaatgca cagcgacgga ttcgcgctat 5280
ttagaaagag agagcaatat ttcaagaatg catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc 5340
tagggttaat ctagctgcat caggatcata tcgtcgggtc ttttttccgg ctcagtcatc 5400
gcccaagctg gcgctatctg ggcatcgggg aggaagaagc ccgtgccttt tcccgcgagg 5460
ttgaagcggc atggaaagag tttgccgagg atgactgctg ctgcattgac gttgagcgaa 5520
aacgcacgtt taccatgatg attcgggaag gtgtggccat gcacgccttt aacggtgaac 5580
tgttcgttca ggccacctgg gataccagtt cgtcgcggct tttccggaca cagttccgga 5640
tggtcagccc gaagcgcatc agcaacccga acaataccgg cgacagccgg aactgccgtg 5700
ccggtgtgca gattaatgac agcggtgcgg cgctgggata ttacgtcagc gaggacgggt 5760
atcctggctg gatgccgcag aaatggacat ggataccccg tgagttaccc ggcgggcgcg 5820
cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 5880
acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 5940
actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 6000
gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 6060
cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 6120
tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 6180
gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 6240
ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 6300
aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 6360
tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 6420
ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 6480
gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 6540
tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 6600
caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 6660
ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 6720
cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 6780
ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 6840
cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 6900
gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 6960
aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 7020
acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 7080
gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 7140
cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 7200
cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 7260
tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 7320
cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 7380
gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 7440
cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 7500
ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 7560
gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 7620
taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 7680
gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 7740
acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 7800
aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcat 7857
<210> 2
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tctagagcca ccatgctgct gctggtcact tctctgctgc tgtgcgaact gccccacccc 60
gcctttctgc tgattcccca ggtccagctg cagcagtctg gagctgagct ggtcagaccc 120
ggcgcatcag tgaaactgag ctgcaaggct tccggctata ctttctccga ctttgagatg 180
cactgggtca agcagacccc agtgcatggc ctggaatgga tcggggacat tgatcccggc 240
actggggaca ccgcctataa cctgaagttc aaaggcaagg ctaccctgac cacagataag 300
agctcctcta cagcctacat ggagctgagg tctctgacta gtgaagattc agcagtctac 360
tattgcacac tgggggcctt cgtgtactgg ggacagggca cactggtc 408

Claims (8)

1.一种基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法，其特征在于，其是通过设计合成CD-133-CAR基因片段，然后将CD-133-CAR基因片段连接到Piggybac载体上得到Piggybac-CAR-CD-133，再将Piggybac-CAR-CD-133转入大肠杆菌中进行扩增，然后从大肠杆菌中提取质粒，并加入到人血清中分离的淋巴细胞中进行扩展培养，采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac-CAR-CD-133和Piggybac Transposase到T淋巴细胞，得到带有CD-133-CAR基因片段的T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一，CD-133-CAR基因片段设计合成，查找CD-133的单链抗体可变区基因片段序列，并根据PiggyBac载体的的特性，设计合成包括对CD-133抗原具有特异性的单链抗体片段scFv、myc-tag、CD8来源的跨膜铰链、共刺激因子CD28和4-1BB 片段，及细胞内传递信号CD3ζ来源的基因片段，得到CD-133-CAR基因片段；
步骤二，带有CD-133-CAR片段的PiggyBac载体构建，采用酶切、连接和转化的方法，将步骤一得到的CD-133-CAR基因片段连接到PiggyBac载体上，得到带CD-133-CAR基因片段的Piggybac-CAR-CD-133；
步骤三，CD-133-CAR基因检测和筛选，通过基因测序的方法来检测步骤二合成的得到带CD-133-CAR基因片段的Piggybac载体，CD-133-CAR基因序列是否正确，得到带，CD-133-CAR基因的Piggybac-CAR-CD-133；
步骤四，带有CD-133-CAR基因的Piggybac-CAR-CD-133扩增，将步骤三得到的带有CD-133-CAR基因的Piggybac载体转入到大肠杆菌中，使带有CD-133-CAR基因的Piggybac-CAR-CD-133在大肠杆菌中大量扩增；
步骤五，大肠杆菌中质粒提取，采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取步骤四中大肠杆菌的质粒DNA；
步骤六，带有CD-133-CAR基因的T淋巴细胞构建，从人血清中分离淋巴细胞，并加入T淋巴细胞培养液，INF-γ，OKT-3、hIL-2和步骤五得到的质粒DNA进行扩展培养，采用Nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒Piggybac-CAR-CD-133和PiggybacTransposase到T细胞中，得到带有CD-133-CAR基因的T淋巴细胞。
3.根据权利要求1或2所述的基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法，其特征在于，所述Piggybac载体为pMD 18-T simple vector。
4.根据权利要求1或2所述的基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌感受态TOP10。
5.根据权利要求1或2所述的基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法，其特征在于，所述CD-133-CAR基因片段的序列为SEQ ID NO.2。
6.根据权利要求1或2所述的基于PiggyBac载体的CD-133-CAR-T系统构建方法，其特征在于，所述Piggybac-CAR-CD-133的基因序列为SEQ ID NO.1。
7.一种基于PiggyBac载体构建的CD-133-CAR-T系统在制备用于治疗癌症药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述癌症包括脑瘤、胰腺癌、胆管细胞型肝癌、非小细胞肺癌、结肠癌和肝癌。
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