KR101925676B1 - 에스트로겐성 화합물의 검출을 위한 유전자 변이 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법 - Google Patents

에스트로겐성 화합물의 검출을 위한 유전자 변이 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에스트로겐성 화합물의 검출을 위한 유전자 변이 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)와 상호작용하는 공동조절인자를 코딩하는 유전자가 λCI 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드 A; 및 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)를 코딩하는 유전자가 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 플라스미드 B에 의해서 형질전환된 (transformed), 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 인체로부터 유래된 에스트로겐 수용체 단백질을 기반으로 하기 때문에 친환경적이고, 비교적 단순한 공정에 의해서, 낮은 원가 및 노동력으로, 매우 짧은 검출시간을 갖는 에스트로겐성 화합물의 검출을 위한 유전자 변이 박테리아 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법을 제공할 수 있다.

Description

에스트로겐성 화합물의 검출을 위한 유전자 변이 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법 {Genetically modified bacterial strain for the detection of estrogenic compounds, and detection method for estrogenic compounds using the strain}
본 발명은 에스트로겐성 화합물의 검출을 위한 유전자 변이 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법에 관한 것이다.
내분비 교란 화합물 (Endocrine Disrupting Compounds, EDC)란, 호르몬의 생리적 작용을 모방하거나, 차단하고 또 교란하는 것에 의해 인간과 야생생물에 대해 유해 효과를 나타내는 일군의 화합물들을 의미한다. 미국 내분비학회는 내분비 교란물질이 남성 및 여성 생식, 가슴 발육 및 암, 전립선암, 신경내분비, 갑상선 활성, 대사, 비만 및 심혈관계 내분비에 영향을 줄 수 있다는 사실을 보고한 바 있으며, EDC가 공중 건강에 대해서 심각한 우려를 자아낼 수 있음을 경고하고 있다.
호르몬은 표적 세포의 수용체 (receptor)와 상호작용하여 성장, 발달, 거동 및 생식 등과 같은 다양한 반응 및 정상적인 생물학적 기능을 유발하는 기능을 수행한다. 그러나, 전술한 EDC와 같이 호르몬의 활성에 대해서 간섭을 초래하는 물질은 왜소 성장, 단기 기억 손상, 난관 임신, 낮은 정자 수치, 생식장애 및 면역계 손상을 비롯한 다양한 가역적 또는 비가역적 생물학적 손상을 초래할 수 있다.
일반적으로, EDC는 3개의 주요 그룹으로 분류될 수 있는 바, 안드로겐형 (천연 테스토스테론을 모방하거나 차단하는 화합물), 갑상선형 (갑상선에 대한 직접적 또는 간접 영향을 미치는 화합물) 및 에스트로겐형 (천연 에스트로겐을 모방하거나 또는 차단하는 화합물)로 분류될 수 있다. 특히, 그 중에서도 에스트로겐 화합물 (EC)은 성인 남여뿐 아니라 소아의 성 발달 및 장애, 암 발병 등과 밀접한 관련을 갖고 있다고 알려져 있으며, 일상 생활에서 사용되는 수천 가지의 제품에서 발견되기 때문에 그 심각도가 매우 위중하다.
에스트로겐을 포함하는 내분비 교란 화합물은 환경에서 아주 낮은 농도로 존재하는 것으로 널리 보고되어 있으나, 지방 용해도가 비교적 높아서 먹이 사슬에서 높은 위치에 있는 생물 및 동물의 지방에 축적되며, 비교적 낮은 농도에서도 현저한 생리적 반응을 초래하게 된다. 또한, 살충제, 제초제, 살진균제, 가소제, 플라스틱, 수지 및 세제와 같은 공업 화학제에서도 발견된다.
현재까지, 시료 중에서 에스트로겐 및 에스트로겐 유사 화합물을 검출하는 방법으로는, 고상 추출법 (SPE), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 액체 크로마토그래피/중량 분광광도계 (LC/MS) 또는 가스 크로마토그래피/중량 분광광도계 (GC/MS) 등의 분석 방법들이 알려져 있지만, 이러한 방법들은 장치 비용이 고가일 뿐 아니라, 분석과정이 복잡하기 때문에 비용과 시간이 많이 필요한 단점이 있다.
관련해서, 효모 단백질 잡종법 (Yeast two-hybrid system)은 단백질-단백질 상호작용 또는 단백질-DNA 상호작용을 검출하고자 할 때 사용되는 분자생물학적 기술로서, 상류 활성화 부위 (upstream activating sequence, UAS)에 전사인자가 결합하게 되면, 하류 보고 유전자 (downstream reporter gene)가 활성화되는 것을 기반으로 한다. 이때, 전사인자는 결합 도메인 (binding domain, BD)과 활성 도메인 (activating domain, AD)로 불리는 두 조각으로 나뉘고, 결합 도메인은 상류 활성화 부위에 결합하는 도메인, 활성 도메인은 전사활성을 하는 도메인이다.
종래에 이러한 효모 단백질 잡종법을 사용하여 에스트로겐성 화합물들의 에스트로겐 활성을 분석한 기술들이 보고된 바 있으나 (비특허문헌 1 및 2), 에스트로겐 및 환경 호르몬을 감지하기 위한 효모의 경우, 균주를 키우는데 많은 시간과 노력이 소요되고, 감지에 소요되는 시간도 상당하며, 안정성이 매우 낮다는 문제점을 보유하고 있다.
이에, 진핵생물인 효모 대신 박테리아를 사용한 박테리아 단백질 잡종법에 관한 기술도 보고된 바 있으며, 이는 단백질-단백질 상호작용을 조절할 수 있는 물질을 확인하는 방법으로서, 리포터 유전자, 제1 키메릭 유전자, 제2 키메릭 유전자 등을 구성요소로서 포함하는 유전적으로 변형된 원핵 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다 (특허문헌 1).
그러나, 현재까지 인간에게 영향을 줄 수 있는 다양한 에스트로겐성 물질들을 분석할 수 있도록 최적화되고, 종래 분자기반 센서에서는 검출이 불가능했던 다양한 물질들의 검출을 가능하게 하며, 효모 기반 센서의 불안정성 및 긴 검출시간 문제를 해결할 수 있는 기술에 대해서는 보고된 바가 없다.
특허문헌 1: 미국특허 제6,200,759호
비특허문헌 1: Journal of Health Science Vol. 46 (2000), No. 4, pages 282-298. 비특허문헌 2: Steroids, Vol. 62, Issue 4, April 1997, pages 365-372.
이에, 본 발명에서는 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자, 인체로부터 유래된 에스트로겐 수용체 단백질을 기반으로 하기 때문에 친환경적이고, 비교적 단순한 공정에 의해서, 낮은 원가 및 노동력으로, 매우 짧은 검출시간을 갖는 에스트로겐성 화합물의 검출을 위한 유전자 변이 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서,
에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)와 상호작용하는 공동조절인자를 코딩하는 유전자가 λCI 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드 A; 및
에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)를 코딩하는 유전자가 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 플라스미드 B에 의해서 형질전환된 (transformed),
에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 ER LBD와 상호작용하는 공동조절인자는 RIP140 단백질, TIF2 단백질, TIF1 단백질 및 SRC1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 ER LBD와 상호작용하는 공동조절인자를 코딩하는 유전자 또는 상기 ER LBD를 코딩하는 유전자는, 인간 게놈 DNA로부터 mRNA를 전사하고, 상기 mRNA에 대한 스플라이싱 과정을 통해서 인트론이 제거된 mRNA를 제조한 다음, 상기 인트론이 제거된 mRNA에 대한 역전사 과정을 통해서 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 RIP40 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 RIP140 단백질 및 상기 λCI 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 플라스미드 A는 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 ER LBD 및 상기 αNTD 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 플라스미드 B는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 박테리아 균주는 대장균 (Escherichia coli) 균주, 고초균 (Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 및 유산균으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 균주일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 에스트로겐성 화합물은 노레틸노드렐 (norethylnodrel), 5α-안드로스탄 (5α-androstane), 노닐페놀, 도데실페놀, 옥틸페놀, 비스페놀 A, 비스페놀 S, 비스페놀 F, 2-에틸헥실-4-히드록시벤조에이트 (2-ethylhexyl-4-hydroxybenzoate), 4,4'-디히드록시벤조페논, 2,4-디히드록시벤조페논, 디히드록시메톡시클로르올레핀, o,p'-DDT, 디히드록시메톡시클로르 (HPTE), 2',3',4',5'-테트라클로로-4-비페닐올, 노르디히드로구아이 아레틱산 (Nordihydroguaiaretic acid), 아우린 (aurin), 페놀프탈레인, 페놀 레드 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 다른 과제를 해결하기 위해서,
상기 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주를 제조하는 단계;
상기 박테리아 균주에 에스트로겐성 화합물을 함유한 시료를 첨가하고 배양하는 단계;
상기 배양된 박테리아 균주를 용균한 다음, 리포터 단백질의 발현 정도를 분석하는 단계를 포함하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 리포터 단백질은 베타-갈락토시다아제, 형광 발광 단백질 또는 항생제 내성 부여 단백질일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 형광 발광 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP) 또는 루시퍼라아제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 리포터 단백질의 발현 정도는 UV-VIS 스펙트로포토미터에 의해서 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 베타-갈락토시다아제의 발현 정도는 상기 용균 이후에, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해 주고, 발현 정도를 분석함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 인체로부터 유래된 에스트로겐 수용체 단백질을 기반으로 하기 때문에 친환경적이고, 비교적 단순한 공정에 의해서, 낮은 원가 및 노동력으로, 매우 짧은 검출시간을 갖는 에스트로겐성 화합물의 검출을 위한 유전자 변이 박테리아 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 박테리아에서 에스트로겐성 화합물이 존재하지 않아서 리포터 유전자가 발현되지 않는 경우 (도면 상단) 및 에스트로겐성 화합물이 ER LBD에 결합함으로써 리포터 유전자가 발현되는 경우 (도면 하단)를 설명해주는 개략적인 도면이다.
도 2a 및 2b는 대표적인 에스트로겐성 화합물인 17β-에스트라디올을 사용하여 본 발명에 따른 균주의 에스트로겐성 화합물 검출 능력을 확인한 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 에스트로겐성 화합물인 에스트리올 (estriol)과 에스트론 (estrone)에 대한 본 발명에 따른 균주의 검출 능력을 확인한 결과를 도시한 그래프이다.
도 4a 및 4b는 대표적 환경 호르몬인 비스페놀 A와 노닐페놀에 대한 본 발명에 따른 균주의 검출 능력을 확인한 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 실생활에서 접할 수 있는 다양한 용품들 중에 존재하는 환경 호르몬에 대한 본 발명에 따른 균주의 검출 능력을 확인한 결과를 도시한 그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명에서는, 에스트로겐 호르몬 및 다양한 에스트로겐성 화합물들의 검출을 위해서, 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)와 상호작용하는 공동조절인자와, 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD) 단백질 사이의 특정 결합에 의해서 리포터 유전자가 발현되는 원리를 이용하고자 하였다. 즉, 분석 대상이 되는 시료 중에 에스트로겐성 화합물들이 존재하는 경우, 해당 에스트로겐성 화합물이 상기 ER LBD에 결합하게 되고, 이러한 결합에 의해서 상기 두 단백질의 상호작용이 발생되며, 다시 이러한 상호작용에 의해서 리포터 유전자의 발현이 이루어지게 되는 것이다. 또한, 발현된 상기 리포터 유전자는 발색 시약에 의한 발색 반응을 야기하게 되고, 이러한 발색 반응 정도를 정량함으로써 시료 중 에스트로겐성 화합물의 농도를 정확하게 정량하는 것이 가능해지는 것이다.
이에, 본 발명에서는 에스트로겐성 화합물의 검출을 위한 유전자 변이 박테리아를 제공하며, 본 발명에 따른 박테리아는,
에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)와 상호작용하는 공동조절인자를 코딩하는 유전자가 λCI 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드 A; 및 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)를 코딩하는 유전자가 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 플라스미드 B에 의해서 형질전환된 (transformed), 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아이다.
전술한 바와 같이, 종래 효모 기반의 효모 단백질 잡종법 (Yeast two-hybrid system)이 단백질-단백질 상호작용 또는 단백질-DNA 상호작용을 검출하고자 할 때 사용된 바 있으나, 효모의 경우 박테리아에 비해서, 유전자 서열 면에서 사람과의 유사도가 매우 높다. 예를 들어, 인간의 DP97이나 REA 같은 공동활성인자 (coactivator)는 이와 유사한 단백질이 효모 내에도 존재하고 있다. 따라서, 이러한 단백질들은 효모 단백질 잡종법을 사용하여 실제 환경 호르몬을 감지할 때 에스트로겐 수용체와 결합하여 환경 호르몬에 대한 감지를 방해할 가능성이 있다. 더 나아가, 효모에는 전술한 DP97 또는 REA 이외에도, 에스트로겐 수용체와 결합할 가능성이 있는 단백질들이 추가로 존재할 가능성이 많다는 점에서, 본 발명에 따른 박테리아 기반의 검출 방법은 효모 단백질 잡종법에 비해서 장점을 보유하고 있다.
에스트로겐 수용체 단백질은 에스트로겐과 같은 리간드 화합물들과 결합하게 되면 단백질의 활성을 보조하거나 억제하는 공동조절 단백질 (coregulator protein)과 결합할 수 있게 된다. 즉, 본 발명에서는 리간드인 에스트로겐성 화합물과 결합하는 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)가 공동조절 단백질과 결합함으로써, 리포터 유전자의 발현을 야기하는 현상에 의해서 에스트로겐성 화합물을 검출할 수 있게 된다.
도 1에는 본 발명에 따른 박테리아에서 에스트로겐성 화합물이 존재하지 않아서 리포터 유전자가 발현되지 않는 경우 (도면 상단) 및 에스트로겐성 화합물이 ER LBD에 결합함으로써 리포터 유전자가 발현되는 경우 (도면 하단)를 설명해주는 도면을 도시하였다 (리포터의 유전자의 예로서, lacZ 또는 GFP 유전자를 예로 들었음).
본 발명에 따른 박테리아는 두 가지 종류의 플라스미드에 의해서 형질전환된 박테리아이며, 각각의 플라스미드는 리포터 유전자의 발현에 관여하는 단백질 세트들을 코딩한다. 먼저, 플라스미드 A는 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)와 상호작용하는 공동조절인자를 코딩하는 유전자 (도 1에서 "Coactivator"로 표시됨) 및 λCI 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 플라스미드 B는 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD) 및 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 박테리아는 상기 두 가지 플라스미드들에 의해서 생산되는 단백질 세트들에 의해서 리포터 유전자의 발현을 조절한다. 즉, 플라스미드 A에 의해서 발현되는 공동조절인자 단백질 및 λCI 단백질은 리포터 유전자의 업 스트림에 결합하며, 플라스미드 B에 의해서 발현되는 ER LBD 및 αNTD 단백질은 RNA 중합효소와 결합하게 된다. 이때, 리포터 유전자의 발현을 위해서는, 공동조절인자 단백질 및 λCI 단백질 세트와 ER LBD 및 αNTD 단백질 세트 사이에 상호작용이 존재하여야 한다. 도 1의 상단을 참조하면, 리간드로 작용하는 에스트로겐성 화합물이 존재하지 않는 경우에는 공동조절인자 단백질 및 λCI 단백질 세트와, ER LBD 및 αNTD 단백질 세트 사이에 상호작용이 존재하지 않고, 따라서 리포터 유전자가 발현되지 않는다. 한편, 도 1의 하단을 참조하면, 리간드인 에스트로겐성 화합물이 존재하는 경우에는 이러한 에스트로겐성 화합물이 ER LBD에 결합하게 되고, 상기 결합에 의해서 공동조절인자 단백질 및 λCI 단백질 세트와, ER LBD 및 αNTD 단백질 세트 사이에 상호작용이 발생하게 되고, 이는 궁극적으로 리포터 유전자의 발현을 야기한다. 따라서, 본 발명에 따른 박테리아는 분석 대상이 되는 시료 중에 에스트로겐성 화합물이 존재할 때에만, 리포터 유전자의 발현에 의한 단백질을 생산하게 되는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 공동조절인자 단백질로는, 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위와 상호작용을 할 수 있는 다양한 종류의 공동조절인자, 또는 공동활성인자 단백질들이 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어RIP140 단백질, TIF2 단백질, TIF1 단백질 및 SRC1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질을 고려할 수 있다.
상기 플라스미드 A 및 B에 포함되는, 상기 ER LBD와 상호작용하는 공동조절인자를 코딩하는 유전자 또는 상기 ER LBD를 코딩하는 유전자는, 인간 게놈 DNA로부터 mRNA를 전사하고, 상기 mRNA에 대한 스플라이싱 과정을 통해서 인트론이 제거된 mRNA를 제조한 다음, 상기 인트론이 제거된 mRNA에 대한 역전사 과정을 통해서 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭된 것일 수 있다.
또한, 상기 ER LBD와 상호작용하는 공동조절인자를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 추가적으로 상기 공동조절인자 단백질 및 상기 λCI 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합될 수 있으며, 마찬가지로, 상기 ER LBD를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 ER LBD 및 상기 αNTD 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합될 수 있다. 이러한 FLAG 서열의 접합에 의해서, 발현된 단백질만을 특이 항체로서 인식하는 웨스턴 블롯팅 등의 방법을 사용하여 확인할 수 있게 된다.
구체적으로, 공동조절인자로서 RIP140 단백질이 사용되는 경우, 상기 플라스미드 A는 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 플라스미드 B는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 1에 도시된 서열은 5'에서 3' 방향으로, λCI 단백질을 코딩하는 유전자, 링커 아미노산 서열, RIP140 단백질을 코딩하는 유전자 및 FLAG 서열을 포함하며, 서열번호 2에 도시된 서열은 5'에서 3' 방향으로, αNTD 단백질을 코딩하는 유전자, 링커 아미노산 서열, ER LBD를 코딩하는 유전자 및 FLAG 서열을 포함한다.
하기 실시예에서는 본 발명에 따른 플라스미드 A 및 B가 형질전환된 세포로서, 대장균 균주를 예로 들어 설명하였으나, 대상 균주가 반드시 대장균으로만 한정되는 것은 아니며, 이외에도 고초균, 바실러스 리체니포르미스, 유산균 등과 같이, 유전자 조작이 가능한 모든 박테리아 균주가 대상 균주로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 박테리아가 검출할 수 있는 대상 화합물들에는 인간 에스트로겐 호르몬을 비롯해서, 에스트로겐 수용체에 결합이 가능한 모든 종류의 호르몬 및 유사체에 대한 검출이 포함된다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다양한 스테로이드 계열 호르몬들 (Norethylnodrel,5α-Androstane 등), 알킬페놀 화합물 (Noynylphenol,Dodecylphenol,Octylphenol 등), 비스페놀 계열 화합물 (Bisphenol A, Bisphenol S, Bisphenol F 등), 방부제로 많이 사용되는 파라벤 계열 화합물 (2-Ethylhexyl 4-hydroxybenzoate, Heptyl 4-hydroxybenzoatea 등), 화장품 향 고정제 등으로 사용되는 벤조페논 계열 화합물 (4,4'-Dihydroxybenzophenone, 2,4-Dihydroxybenzophenone 등), 살충제에 들어가는 유기염소계 물질들 (Dihydroxymethoxychlor olefin, o,p'-DDT, Dihydroxymethoxychlor (HPTE), 2',3',4',5'-Tetrachloro-4-biphenylol 등), 산화방지제로 식품에도 첨가되는 Nordihydroguaiaretic acid, 산 염기 지시약으로 많이 사용되는 Aurin, Phenolphthalein, Phenol red 등의 화합물들을 본 발명에 의해서 검출해낼 수 있다.
한편, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 박테리아를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출방법을 제공하는 바, 본 발명에 따른 방법은,
본 발명에 따른 박테리아 균주를 제조하는 단계;
상기 박테리아 균주에 에스트로겐성 화합물을 함유한 시료를 첨가하고 배양하는 단계;
상기 배양된 박테리아 균주를 용균한 다음, 리포터 단백질의 발현 정도를 분석하는 단계를 포함한다.
즉, 본 발명에 따른 방법에서는, 전술한 본 발명에 따른 박테리아가 시료 중에 리간드인 에스트로겐성 화합물이 존재하여 ER LBD에 결합하는 경우에만 특정 단백질을 생산하는 특성을 이용하여 시료 중 에스트로겐성 화합물을 분석하게 된다.
따라서, 본 발명에 따른 방법에서는, 먼저 전술한 바와 같은 플라스미드 A 및 B에 의해서 형질전환된 박테리아 균주를 제조하고, 이를 분석 대상이 되는 시료와 함께 배양한 다음, 배양된 박테리아 균주를 용균 (lysis)시켜서, 박테리아에 의해서 발현된 리포터 단백질을 분석하게 된다. 이때, 시료 중에 에스트로겐성 화합물이 존재하는 경우에만 리포터 유전자에 의한 리포터 단백질이 생산되고, 생산된 리포터 단백질을 정량적으로 분석함으로써 시료 중 에스트로겐성 화합물을 검출할 수 있게 된다.
본 발명에 있어서, 발현되는 리포터 단백질의 종류에 따라서, 이러한 리포터 단백질에 대한 분석 방법이 달라질 수 있는 바, 예를 들어, 상기 리포터 단백질은 베타-갈락토시다아제, 형광 발광 단백질 또는 항생제 내성 부여 단백질일 수 있고, 상기 형광 발광 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP) 또는 루시퍼라아제일 수 있다. 상기 발색 또는 형광 단백질은 UV-VIS 스펙트로포토미터 등의 장비를 사용하여 정량적으로 분석이 가능하다.
또한, 리포터 단백질로서, 베타-갈락토시다아제를 사용하는 경우에는, 상기 용균 이후에, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해 주고, 발현 정도를 분석함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해주는 경우, 첨가된 ONPG는 β-갈락토시다아제에 의해서 분해되고, 분해산물로서 강한 황색 발광을 내는 오르쏘니트로페놀 (orthonitrophenol)이 생산된다. 이때, 황색 발광 정도는 시료 중 존재하는 에스트로겐성 화합물의 농도에 따라서 달라지므로, ONPG에 의한 발색 정도를 UV-VIS 스펙트로포토미터 등을 사용하여 측정하게 되면, 시료 중 존재하는 에스트로겐성 화합물의 농도를 정량적으로 분석하는 것이 가능하게 된다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 플라스미드 제작
전장 RIP140은 인간 유방암 세포주인 MCF-7의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR 방법에 의해서 증폭하였다. 증폭 시, 단백질 발현을 특이 항체로 확인할 수 있는 FLAG 서열을 태깅하였다. hERα LBD (N304~T553: 304번째 아미노산인 아스파라긴부터 553번째 아미노산인 쓰레오닌까지)는 인간 유방암 세포주인 MCF-7의 상보적 DNA를 주형으로 사용하여 PCR 방법에 의해서 증폭하였으며, 마찬가지로 증폭 시 FLAG 서열을 태깅하였다. 구체적인 PCR 증폭 반응 조건은 하기와 같다.
hERα LBD-FLAG 유전자는 Ex-Taq DNA 중합효소를 사용하여 처음 95℃ 에서 1분 반응 시킨 뒤, 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 30초 반응을 순서대로 총 30회 반복하였다. 이후, 마지막으로 72℃ 에서 5분 동안 반응 시켰다. RIP140-FLAG 유전자의 경우, 마찬가지로 Ex-Taq DNA 중합효소를 사용하였다. 처음 95℃에서 1분 반응 시킨 뒤, 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 2분 30초 반응을 순서대로 총 30회 반복하였다. 이 후 마지막으로 72℃ 에서 5분 동안 반응 시켰다.
증폭된 RIP140-FLAG 유전자는 제한효소인 Not I과 Bgl II 로 잘랐다. 이어서, Not I과 BamH I으로 절단된 pACλCI 벡터에 리가아제를 이용하여 pACλCI::RIP140-FLAG 플라스미드를 클로닝하였다 (RIP140 유전자 중간에 BamH I 부위가 존재하여 BamH I과 인식 서열은 다르지만, BamH I으로 잘린 부분과는 결합할 수 있는 다른 제한효소인 Bgl II를 사용). 증폭된 hERα LBD - FLAG 서열도 Not I과 BamH I으로 절단하였으며, 마찬가지로 Not I과 BamH I으로 절단된 pBRαNTD에 리가아제를 이용하여 pBRαNTD::hERα LBD -FLAG 서열을 클로닝하였다.
실시예 2. 대장균의 형질전환
먼저, λCI 오퍼레이터가 lacZ 리포터 -62 위치에 있는 F' 플라스미드가 들어있는 대장균 균주인 E. coli FW102 OL2-62 (addgene)의 수용 세포 (competent cell)을 제작하였다. OD600 (600 nm 광에서의 광학 밀도)~ 0.4까지 배양한 세포를 수득하였다. 이후, 100 mM CaCl2를 약 4시간 동안 처리하고, 처리한 세포를 다시 수득한 다음, 처음 배양 시 배지 부피의 1/50에 해당하는 부피의 100 mM CaCl2로 세포들을 풀어준 뒤 사용하였다.
제조된 수용 세포 50 μL에 pACλCI::RIP140-FLAG, pBRαNTD::hERα LBD -FLAG 각각의 플라스미드 (클로닝 후 E. coli DH5α (클로닝 호스트)에 옮겨져 증폭된 다음, 다시 분리된 플라스미드)를 1μL (약 100 ng) 첨가한 후, 0℃ 에서 약 30분 동안 보관하였다. 이후 42 ℃의 열을 1분 40초 동안 가해준 뒤, 바로 0℃에서 5분 동안 보관하였다. 이어서, LB 배지 1 mL를 넣고 1 시간 동안 37℃에서 배앙한 후, 선택 마커인 카나마이신 (Kanamycin) (F' 플라스미드 선택), 앰피실린 (ampicillin) (pBRαNTD::hERα LBD-FLAG 선택), 클로르암페니콜 (chloramphenicol) (pACλCI::RIP140-FLAG 선택)이 함유된 배지에 플레이팅 하였다.
실시예 3. β-갈락토시다아제 분석
E. coli FW102 OL2-62 pACλCI::RIP140-FLAG pBRαNTD::hERα LBD-FLAG 균주를 접종 후, OD600 ~ 0.4까지 배양하였다 (20 μM IPTG 첨가; λCI-RIP140-FLAG 및 αNTD-hERα LBD-FLAG 발현 위한 유도 물질). 이후, 각 농도에 해당하는 에스트로겐 및 EDCs를 넣고 30분 동안 추가로 배양하였다. 다음으로, 세포를 800 μL 수거하여 완충용액 (Na2HPO4 60 mM, NaH2PO4 40 mM, KCl 10 mM, MgSO47H2O 1 mM, 디티오쓰레이톨 400 μM) 800 μL에 풀어준 뒤, OD600 (세포 함량)을 측정하였다. 이후, 초음파처리를 통해서 세포를 용균시킨 다음, 4 mg/mL ONPG를 180 μL 처리하여 시료의 색상이 황색으로 변하는 시간을 확인하였다. 샘플이 황색으로 변화하면, 1M Na2CO3 400 μL로 반응을 중지시켰다. 이어서, OD550 (세포 잔류물)과 OD420 (황색 정도)을 측정한 다음, 밀러 단위 (miller unit) 공식 (1000 * (((OD420 - (1.75 * OD550))/(t * v * OD600)) 에 대입하여 활성 정도를 확인하였다.
도 2a 및 2b에는 대표적인 에스트로겐성 화합물인 17β-에스트라디올을 사용하여 균주의 검출 능력을 확인한 결과를 도시하였다. 에스트로겐 수용체 리간드 결합 부위와 RIP140 단백질은 이소프로필 1-티오-β-D-갈락토시드 (IPTG)에 의해서 발현되므로, IPTG를 첨가해주지 않은 경우 (-IPTG)에 나타나는 활성은 균주 자체로부터 기인한 내부 단백질에 의해서 야기된 것으로 추정할 수 있다. 따라서, IPTG를 첨가해준 경우 (+IPTG)의 활성에서 IPTG를 첨가해주지 않은 경우 (-IPTG)의 활성을 감해주게 되면, 유전자 조작을 통해서 도입된 단백질에 의해서 나타나는 활성만을 측정할 수 있게 된다. 도 2a 및 2b를 참조하면, 시료 중 17β-에스트라디올의 농도가 증가할수록 밀러 단위가 증가함을 확인할 수 있으며, 따라서 본 발명에 따른 대장균이 시료 중 17β-에스트라디올의 함량 측정에 유용하게 사용될 수 있다는 점을 알 수 있다.
또한, 도 3에는 또 다른 에스트로겐성 화합물인 에스트리올 (estriol)과 에스트론 (estrone)에 대한 본 발명에 따른 균주의 검출 능력을 확인한 결과를 도시하였으며, 도 3을 참조하면, 도 2a 및 2b의 결과와 마찬가지로, 시료 중 에스트로겐성 화합물의 농도에 비례하여 밀러 단위가 증가하는 사실을 알 수 있다.
더 나아가, 도 4a 및 4b에는 대표적 환경 호르몬인 비스페놀 A와 노닐페놀에 대한 본 발명에 따른 균주의 검출 능력을 확인한 결과를 도시하였으며, 도 4를 참조하면, 전술한 결과들과 마찬가지로, 시료 중 환경 호르몬의 농도가 증가함에 따라서 밀러 단위도 함께 증가하는 사실을 알 수 있다.
마지막으로, 도 5에는 실생활에서 접할 수 있는 다양한 용품들 중에 존재하는 환경 호르몬에 대한 본 발명에 따른 균주의 검출 능력을 확인한 결과를 도시하였다. 각각의 용품들은 가로 × 세로 (0.5 cm × 0.5 cm)의 조각을 균주 배양시 30분 동안 담갔다가 꺼냈으며, 샴푸의 경우는, 원액을 전체 균주 배양액 부피 대비 1/100로 사용하였다. 도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 균주는 다양한 용품들로부터도 성공적으로 환경 호르몬을 검출하는데 사용될 수 있다는 점을 알 수 있다.
종합하면, 본 발명에 따른 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출방법은, 비교적 단순한 공정에 의해서 매우 짧은 시간에 걸쳐서 다양한 시료들로부터 에스트로겐성 화합물들을 검출할 수 있다.
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gaaaaaaggg ctagtcctgc cacctcacct 3120 aaacctagtg ttgcttgtag ccagttagca ttacttctgt caagcgaagc ccatttgcag 3180 cagtattctc gagaacacgc tttaaaaacg caaaatgcaa atcaagcagc aagtgaaaga 3240 cttgctgcta tggccagatt gcaagaaaat ggccagaagg atgttggcag ttaccagctc 3300 ccaaaaggaa tgtcaagcca tcttaatggt caggcaagaa catcatcaag caaactgatg 3360 gctagcaaaa gtagtgctac agtgtttcaa aatccaatgg gtatcattcc ttcttcccct 3420 aaaaatgcag gttataagaa ctcactggaa agaaacaata taaaacaagc tgctaacaat 3480 agtttgcttt tacatcttct taaaagccag actataccta agccaatgaa tggacacagt 3540 cacagtgaga gaggaagcat ttttgaggaa agtagtacac ctacaactat tgatgaatat 3600 tcagataaca atcctagttt tacagatgac agcagtggtg atgaaagttc ttattccaac 3660 tgtgttccca tagacttgtc ttgcaaacac cgaactgaaa aatcagaatc tgaccaacct 3720 gtttccctgg ataacttcac tcaatccttg ctaaacactt gggatccaaa agtcccagat 3780 gtagatatca aagaagatca agatacctca aagaattcta agctaaactc acaccagaaa 3840 gtaacacttc ttcaattgct acttggccat aagaatgaag aaaatgtaga aaaaaacacc 3900 agccctcagg gagtacacaa tgatgtgagc aagttcaata cacaaaatta tgcaaggact 3960 tctgtgatag aaagccccag tacaaatcgg actactccag tgagcactcc acctttactt 4020 acatcaagca aagcagggtc tcccatcaat ctctctcaac actctctggt catcaaatgg 4080 aattccccac catatgtctg cagtactcag tctgaaaagc taacaaatac tgcatctaac 4140 cactcaatgg accttacaaa aagcaaagac ccaccaggag agaaaccagc ccaaaatgaa 4200 ggtgcacaga actctgcaac gtttagtgcc agtaagctgt tacaaaattt agcacaatgt 4260 ggaatgcagt catccatgtc agtggaagag cagagaccca gcaaacagct gttaactgga 4320 aacacagata aaccgatagg tatgattgat agattaaata gccctttgct ctcaaataaa 4380 acaaatgcag ttgaagaaaa taaagcattt agtagtcaac caacaggtcc tgaaccaggg 4440 ctttctggtt ctgaaataga aaatctgctt gaaagacgta ctgtcctcca gttgctcctg 4500 gggaacccca acaaagggaa gagtgaaaaa aaagagaaaa ctcccttaag agatgaaagt 4560 actcaggaac actcagagag agctttaagt gaacaaatac tgatggtgaa aataaaatct 4620 gagccttgtg atgacttaca aattcctaac acaaatgtgc acttgagcca tgatgctaag 4680 agtgccccat tcttgggtat ggctcctgct gtgcagagaa gcgcacctgc cttaccagtg 4740 tccgaagact ttaaatcgga gcctgtttca cctcaggatt tttctttctc caagaatggt 4800 ctgctaagtc gattgctaag acaaaatcaa gatagttacc tggcagatga ttcagacagg 4860 agtcacagaa ataatgaaat ggcacttcta gaatcaaaga atctttgcat ggtccctaag 4920 aaaaggaagc tttatactga gccattagaa aatccattta aaaagatgaa aaacaacatt 4980 gttgatgctg caaacaatca cagtgcccca gaagtactgt atgggtcctt gcttaaccag 5040 gaagagctga aatttagcag aaatgatctt gaatttaaat atcctgctgg tcatggctca 5100 gccagcgaaa gtgaacacag gagttgggcc agagagagca aaagctttaa tgttctgaaa 5160 cagctgcttc tctcagaaaa ctgtgtgcga gatttgtccc cgcacagaag taactctgtg 5220 gctgacagta aaaagaaagg acacaaaaat aatgtgacca acagcaaacc tgaatttagc 5280 atttcttctt taaatggact gatgtacagt tccactcagc ccagcagttg catggataac 5340 aggacatttt catacccagg tgtagtaaaa actcctgtga gtcctacttt ccctgagcac 5400 ttgggctgtg cagggtctag accagaatct gggcttttga atgggtgttc catgcccagt 5460 gagaaaggac ccattaagtg ggttatcact gatgcggaga agaatgagta tgaaaaagac 5520 tctccaagat tgaccaaaac caacccaata ctatattaca tgcttcaaaa aggaggcaat 5580 tctgttacca gtcgagaaac acaagacaag gacatttgga gggaggcttc atctgctgaa 5640 agtgtctcac aggtcacagc caaagaagag ttacttccta ctgcagaaac gaaagcttct 5700 ttctttaatt taagaagccc ttacaatagc catatgggaa ataatgcttc tcgcccacac 5760 agcgcaaatg gagaagttta tggacttctg ggaagcgtgc taacgataaa gaaagaatca 5820 gaagattata aagatgatga tgataaataa agatccttac cttacagatc tgcatcgcag 5880 gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc taaccgtttt 5940 tatcaggctc tgggaggcag aataaatgat catatcgtca attattacct ccacggggag 6000 agcctgagca aactggcctc aggcatttga gaagcacacg gtcacactgc ttccggtagt 6060 caataaaccg gtaaaccagc aatagacata agcggctatt taacgaccct gccctgaacc 6120 gacgaccggg tcgaatttgc tttcgaattt ctgccattca tccgcttatt atcacttatt 6180 caggcgtagc accaggcgtt taagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc 6240 cctgccactc atcgcagtac tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat 6300 cacagacggc atgatgaacc tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat 6360 aatatttgcc catggtgaaa acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat 6420 caaaactggt gaaactcacc cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc 6480 ctttagggaa ataggccagg ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta 6540 gaaactgccg gaaatcgtcg tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct 6600 catggaaaac ggtgtaacaa gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca 6660 ttgccatacg 6670 <210> 2 <211> 5874 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid B <400> 2 gcaataaaaa atcaaatcgg atttcactat ataatctcac tttatctaag atgaatccga 60 tggaagcatc ctgttttctc tcaatttttt tatctaaaac ccagcgttcg atgcttcttt 120 gagcgaacga tcaaaaataa gtgccttccc atcaaaaaaa tattgacaac ataaaaaact 180 ttgtgttata cttgtaacgc tacatggaga ttaactcaat ctagctagag aggctttaca 240 ctttatgctt ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 300 aaacagctat gaccatgatt acggattcac tggaactcta gaccaaagag aggacacaat 360 gcagggttct gtgacagagt ttctaaaacc gcgcctggtt gatatcgagc aagtgagttc 420 gacgcacgcc aaggtgaccc ttgagccttt agagcgtggc tttggccata ctctgggtaa 480 cgcactgcgc cgtattctgc tctcatcgat gccgggttgc gcggtgaccg aggttgagat 540 tgatggtgta ctacatgagt acagcaccaa agaaggcgtt caggaagata tcctggaaat 600 cctgctcaac ctgaaagggc tggcggtgag agttcagggc aaagatgaag ttattcttac 660 cttgaataaa tctggcattg gccctgtgac tgcagccgat atcacccacg acggtgatgt 720 cgaaatcgtc aagccgcagc acgtgatctg ccacctgacc gatgagaacg cgtctattag 780 catgcgtatc aaagttcagc gcggtcgtgg ttatgtgccg gcttctaccc gaattcattc 840 ggaagaagat gagcgcccaa tcggccgtct gctggtcgac gcatgctaca gccctgtgga 900 gcgtattgcc tacaatgttg aagcagcgcg tgtagaacag cgtaccgacc tggacaagct 960 ggtcatcgaa atggaaacca acggcacaat cgatcctgaa gaggcgattc gtcgtgcggc 1020 aaccattctg gctgaacaac tggaagcttt cgttgactta cgtgatgtac gtcagcctga 1080 agtgaaagaa gagaaaccag aggcggccgc aaacagcctg gccttgtccc tgacggccga 1140 ccagatggtc agtgccttgt tggatgctga gccccccata ctctattccg agtatgatcc 1200 taccagaccc ttcagtgaag cttcgatgat gggcttactg accaacctgg cagacaggga 1260 gctggttcac atgatcaact gggcgaagag ggtgccaggc tttgtggatt tgaccctcca 1320 tgatcaggtc caccttctag aatgtgcctg gctagagatc ctgatgattg gtctcgtctg 1380 gcgctccatg gagcacccag ggaagctact gtttgctcct aacttgctct tggacaggaa 1440 ccagggaaaa tgtgtagagg gcatggtgga gatcttcgac atgctgctgg ctacatcatc 1500 tcggttccgc atgatgaatc tgcagggaga ggagtttgtg tgcctcaaat ctattatttt 1560 gcttaattct ggagtgtaca catttctgtc cagcaccctg aagtctctgg aagagaagga 1620 ccatatccac cgagtcctgg acaagatcac agacactttg atccacctga tggccaaggc 1680 aggcctgacc ctgcagcagc agcaccagcg gctggcccag ctcctcctca tcctctccca 1740 catcaggcac atgagtaaca aaggcatgga gcatctgtac agcatgaagt gcaagaacgt 1800 ggtgcccctc tatgacctgc tgctggagat gctggacgcc caccgcctac atgcgcccac 1860 tgattataaa gatgatgatg ataaataagg atcctctacg ccggacgcat cgtggccggc 1920 atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa 1980 gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc 2040 cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg caccattcct tgcggcggcg 2100 gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa tgcaggagtc gcataaggga 2160 gagcgtcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg 2220 ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta tcatgcaact cgtaggacag 2280 gtgccggcag cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct ttcgctggag cgcgacgatg 2340 atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc tcgctcaagc cttcgtcact 2400 ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta tcgccggcat ggcggccgac 2460 gcgctgggct acgtcttgct ggcgttcgcg acgcgaggct ggatggcctt ccccattatg 2520 attcttctcg cttccggcgg catcgggatg cccgcgttgc aggccatgct gtccaggcag 2580 gtagatgacg accatcaggg acagcttcaa ggatcgctcg cggctcttac cagcctaact 2640 tcgatcactg gaccgctgat cgtcacggcg atttatgccg cctcggcgag cacatggaac 2700 gggttggcat ggattgtagg cgccgcccta taccttgtct gcctccccgc gttgcgtcgc 2760 ggtgcatgga gccgggccac ctcgacctga atggaagccg gcggcacctc gctaacggat 2820 tcaccactcc aagaattgga gccaatcaat tcttgcggag aactgtgaat gcgcaaacca 2880 acccttggca gaacatatcc atcgcgtccg ccatctccag cagccgcacg cggcgcatct 2940 cgggcagcgt tgggtcctgg ccacgggtgc gcatgatcgt gctcctgtcg ttgaggaccc 3000 ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt agcagaatga atcaccgata cgcgagcgaa 3060 cgtgaagcga ctgctgctgc aaaacgtctg cgacctgagc aacaacatga atggtcttcg 3120 gtttccgtgt ttcgtaaagt ctggaaacgc ggaagtcagc gccctgcacc attatgttcc 3180 ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac acctacatct gtattaacga 3240 agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc tctggtcccg ccgcatccat accgccagtt 3300 gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg catgttcatc atcagtaacc cgtatcgtga 3360 gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta cccccatgaa cagaaatccc ccttacacgg 3420 aggcatcagt gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt atcagaagcc 3480 agacattaac gcttctggag aaactcaacg agctggacgc ggatgaacag gcagacatct 3540 gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag ctgcctcgcg cgtttcggtg 3600 atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag 3660 cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg 3720 gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc 3780 atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 3840 aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 3900 ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 3960 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 4020 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 4080 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 4140 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 4200 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 4260 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 4320 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 4380 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 4440 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 4500 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 4560 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 4620 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 4680 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 4740 ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 4800 tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 4860 atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 4920 tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 4980 aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 5040 catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 5100 gcgcaacgtt gttgccattg ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 5160 ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 5220 aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 5280 atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 5340 cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 5400 gagttgctct tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 5460 agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 5520 gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 5580 caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 5640 ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 5700 tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 5760 aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat 5820 catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttggataac caga 5874

Claims (14)

  1. 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)와 상호작용하는 공동조절인자를 코딩하는 유전자가 λCI 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드 A; 및
    에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)를 코딩하는 유전자가 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 플라스미드 B에 의해서 형질전환 (transformed)되고,
    상기 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)와 상호작용하는 공동조절인자는 RIP140 단백질 또는 TIF2 단백질인,
    에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 RIP140 또는 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 상기 ER LBD를 코딩하는 유전자는, 인간 게놈 DNA로부터 mRNA를 전사하고, 상기 mRNA에 대한 스플라이싱 과정을 통해서 인트론이 제거된 mRNA를 제조한 다음, 상기 인트론이 제거된 mRNA에 대한 역전사 과정을 통해서 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 TIF2 단백질 및 상기 λCI 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 RIP140 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 RIP140 단백질 및 상기 λCI 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 플라스미드 A는 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위 (ER LBD)를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 ER LBD 및 상기 αNTD 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 플라스미드 B는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 박테리아 균주는 대장균 (Escherichia coli) 균주, 고초균 (Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 및 유산균으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 균주인 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 에스트로겐성 화합물은 노레틸노드렐 (norethylnodrel), 5α-안드로스탄 (5α-androstane), 노닐페놀, 도데실페놀, 옥틸페놀, 비스페놀 A, 비스페놀 S, 비스페놀 F, 2-에틸헥실-4-히드록시벤조에이트 (2-ethylhexyl-4-hydroxybenzoate), 4,4'-디히드록시벤조페논, 2,4-디히드록시벤조페논, 디히드록시메톡시클로르올레핀, o,p'-DDT, 디히드록시메톡시클로르 (HPTE), 2',3',4',5'-테트라클로로-4-비페닐올, 노르디히드로구아이 아레틱산 (Nordihydroguaiaretic acid), 아우린 (aurin), 페놀프탈레인, 페놀 레드 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주를 제조하는 단계;
    상기 박테리아 균주에 에스트로겐성 화합물을 함유한 시료를 첨가하고 배양하는 단계;
    상기 배양된 박테리아 균주를 용균한 다음, 리포터 단백질의 발현 정도를 분석하는 단계를 포함하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 리포터 단백질은 베타-갈락토시다아제, 형광 발광 단백질 또는 항생제 내성 부여 단백질인 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 형광 발광 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP) 또는 루시퍼라아제인 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 리포터 단백질의 발현 정도는 UV-VIS 스펙트로포토미터에 의해서 수행하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 베타-갈락토시다아제의 발현 정도는 상기 용균 이후에, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해 주고, 발현 정도를 분석함으로써 수행하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법.
KR1020160038444A 2016-03-30 2016-03-30 에스트로겐성 화합물의 검출을 위한 유전자 변이 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법 KR101925676B1 (ko)

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