CN113481328B - 用于检测临床样本中gi.5型诺如病毒的试剂盒及专用引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测临床样本中GI.5型诺如病毒的试剂盒及专用引物。本发明提供了引物对，由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。本发明提供了一种高效、快速、准确地检测GI.5型诺如病毒的方法以及试剂盒。通过本发明提供的方法或试剂盒，可以快速、及时地获得临床样本中诺如病毒的分型信息，时间短且准确性高，可以帮助推断传播途径，有助于疫情的调查。本发明可用于直接检测粪便中的GI.5型诺如病毒，可以极大地缩短检测的时间，减少检测的费用。本发明应用前景广阔，为检测样本诺如病毒分型信息提供了新的思路。

Description

用于检测临床样本中GI.5型诺如病毒的试剂盒及专用引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于检测临床样本中GI.5型诺如病毒的试剂盒及专用引物。

背景技术

诺如病毒(norovirus)属于杯状病毒科，是一类单正链RNA病毒，基因组大小为7.5-7.7k，直径约为27-37nm，无囊膜。诺如病毒的基因组包含3个开放阅读框(openreading frame，ORF)，ORF1编码包含RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)在内的非结构多聚蛋白，ORF2编码主要衣壳蛋白(VP1)，ORF3编码次要衣壳蛋白(VP2)。根据诺如病毒主要结构蛋白VP1的氨基酸同源性的不同，将其划分为10个基因型(GI-GX)，引起人类感染的主要是GI和GII型。不同的基因型又可以进一步划分为不同的亚型，其中GI型划分为9个亚型(GI.1-GI.9)，GII型划分为27个亚型(GII.1-GII.27)。

诺如病毒是一种传染性极强的消化道病毒，随着多个国家轮状病毒疫苗计划免疫的逐步推广，诺如病毒已经取代轮状病毒，成为引起急性肠胃炎的主要病原体，对食品安全和公共卫生造成了很大的威胁。诺如病毒主要经粪-口途径传播，可通过食物、水、呕吐物形成的气溶胶及环境污染等引发疫情，容易在幼儿园、中小学、养老院、酒店及轮船等人口聚集且空间相对封闭的环境爆发流行，临床症状主要表现为恶心、呕吐、发热、腹痛和腹泻等。诺如病毒可以感染各个年龄阶段的人群，其所引起的感染是一种自限性疾病，但在免疫低下的人群、老年人和儿童可以引起严重的并发症。

到目前为止，由于没有有效的方式成功培养诺如病毒，分子水平上的检测是临床上检测诺如病毒的主要方法。不同基因分型的诺如病毒传播方式有所不同，及时得到诺如病毒的分型信息，可以帮助推断传播途径，有助于疫情的调查。目前，获得诺如病毒亚型分型信息主要基于诺如病毒全基因组的获得，耗时长并且费用高，并且市场上没有可以直接获得诺如病毒亚型分型信息的试剂盒，直接检测到诺如病毒的亚型，可以极大地缩短检测的时间，减少检测的费用。

发明内容

本发明一个目的是提供一种引物对。

本发明提供的引物对，由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。

上述引物对中2条引物的摩尔比为1:1。

含有上述引物对的PCR试剂也是本发明保护的范围。

上述PCR试剂中，所述引物对的每条引物的浓度为0.4μM。

含有上述引物对或上述的PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

具体的，所述试剂盒还包括：DreamTaq Green PCR Master Mix(2X)。

具体的，所述试剂盒还包括：KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)。

上述引物对或上述的PCR试剂或上述试剂盒在制备具有如下至少一种功能产品中的应用也是本发明保护的范围：

(a)鉴定或辅助鉴定GI.5型诺如病毒；

(b)从诺如病毒中鉴别GI.5型诺如病毒；

(c)鉴定临床样本中是否含有GI.5型诺如病毒；

(d)筛查GI.5型诺如病毒感染者。

上述引物对或上述的PCR试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定GI.5型诺如病毒中的应用也是本发明保护的范围。

上述引物对或上述的PCR试剂或上述试剂盒在从诺如病毒中鉴别GI.5型诺如病毒中的应用也是本发明保护的范围。

上述引物对或上述的PCR试剂或上述试剂盒在鉴定临床样本中是否含有GI.5型诺如病毒中的应用也是本发明保护的范围。

上述引物对或上述的PCR试剂或上述试剂盒在筛查GI.5型诺如病毒感染者中的应用也是本发明保护的范围。

引物对的应用中，如果采用引物对进行PCR扩增显示特异扩增产物(150bp)或者采用引物对进行qPCR扩增显示扩增曲线且Ct值为阈值以下，即判断为GI.5型诺如病毒阳性。所述阈值具体可为Ct值为30。

本发明提供了一种高效、快速、准确地检测GI.5型诺如病毒的方法以及试剂盒。通过本发明提供的方法或试剂盒，可以快速、及时地获得临床样本中诺如病毒的分型信息，时间短且准确性高，可以帮助推断传播途径，有助于疫情的调查。本发明可用于直接检测粪便中的GI.5型诺如病毒，可以极大地缩短检测的时间，减少检测的费用。本发明应用前景广阔，为检测样本诺如病毒分型信息提供了新的思路。

附图说明

图1为诺如病毒GI.5型阳性质粒PCR扩增结果的电泳检测图谱，M：100bp的Maker；P为GI.5阳性质粒，NTC为阴性对照。

图2为诺如病毒阳性样本PCR扩增结果的电泳检测图谱，M：100bp的Maker；1-8为样本编号，NTC为阴性对照。

图3为实施例2中PCR产物测序结果，a、b、c、d分别对应3、4、7、8号样本。

图4为诺如病毒阳性粪便样本GI.5型诺如病毒qPCR检测结果。

图5为引物对的线性检出范围。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、GI.5型诺如病毒检测专用引物的获得

经过大量序列分析设计多种引物，分别通过预实验验证引物性能，最终得到用于鉴定GI.5型诺如病毒的性能最佳的引物对。

GI.5型诺如病毒检测引物对组成如下，扩增靶序列大小为150bp：

上游引物F：ACCAATCGGAACCTGGGTGA(序列1)，

下游引物R：TCCCACAGGCTTGAGTTGAT(序列2)。

分别人工合成上述各条引物。

实施例2、应用引物对检测阳性质粒

一、制备阳性质粒

人工合成携带GI.5型诺如病毒核酸片段的质粒(序列3，其中第182-331个核苷酸为诺如病毒GI.5基因片段)，作为阳性质粒，其可用作PCR模板进行引物验证。

二、应用引物对检测阳性质粒

1、将阳性质粒用双蒸水进行稀释，得到模板溶液；模板溶液中，阳性质粒的浓度为4.043×10⁸copies/μL。

2、取模板溶液，进行PCR扩增，然后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。

PCR扩增的反应体系(25μL)：DreamTaq Green PCR Master Mix(2X)12.5μL，上游引物F1μL，下游引物R1μL，模板溶液1μL，灭菌水9.5μL。上游引物在体系中的工作浓度为0.4μM，下游引物在体系中的工作浓度为0.4μM。

设置用双蒸水代替模板溶液的阴性对照。

PCR扩增的反应条件：95℃预变性3min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸7min。

电泳条件：120V，40min。

琼脂糖凝胶电泳见图1，M：100bp的Maker；P为GI.5阳性质粒，NTC为阴性对照，可以看出，引物的扩增产物大小为100～200bp。与primer-blast结果和预期结果相同，这说明设计的引物能够用于GI.5型诺如病毒的检测。

三、检出限

1、将阳性质粒用双蒸水进行10倍梯度稀释，得到模板溶液。

2、取模板溶液，进行qPCR扩增。

qPCR的反应体系(20μL)：KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)10μL，上下引物F0.4μL，下游引物R0.4μL，模板溶液1μL，无菌水7.8μL，ROX染料0.4μL。上游引物在体系中的工作浓度为0.2μM，下游引物在体系中的工作浓度为0.2μM。

qPCR的反应程序：95℃预变性3min；95℃15s，55℃30s，40个循环；95℃15s；60℃1min；95℃30s；60℃15s。

Ct值≤30判断为阳性。

结果如图5所示，上述引物对的的线性检出范围是4.043X10⁴～4.043X10⁹copies/μL，最低检出浓度是4.043X10⁴copies/μL。

实施例3、粪便样本GI.5型诺如病毒的PCR检测

人粪便样本：样本1-8为诺如病毒阳性粪便样本来源于海淀医院肠道门诊。样本1-8使用市面上已有的诺如病毒检测试剂盒检测均为阳性。

一、制备模板溶液

取人粪便样本，采用试剂盒(QIAGEN RNeasyPowerMicrobiome Kit)提取总RNA，反转录得到cDNA。cDNA为溶液形式，即为模板溶液。

二、进行检测

取上述一得到的模板溶液，分别采用实施例1制备的引物对进行PCR扩增，然后进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳。

PCR扩增的反应体系(25μL)：DreamTaq Green PCR Master Mix(2X)12.5μL，上游引物F1μL，下游引物R1μL，模板溶液1μL，灭菌水9.5μL。上游引物在体系中的工作浓度为0.4μM，下游引物在体系中的工作浓度为0.4μM。

设置用双蒸水代替模板溶液的阴性对照(NTC)。

PCR扩增的反应条件：95℃预变性3min；95℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环；72℃延伸7min。

电泳条件：120V，40min。

电泳图见图2，M：100bp的Maker；1-8为样本编号，NTC为阴性对照，可以看出，阳性样本3、4、7、8得到目的片段，其他样本没有扩增产物，可以看出，引物能够扩增粪便样本中的诺如病毒，目的片段在100～200bp之间。

三、结果验证

完成步骤二后，回收样本3、4、7、8号样本的扩增产物，进行测序。测序结果见图3。测序结果表明，样本3、4、7确实为GI.5型诺如病毒阳性样本。8号样本经后期比对为GI.3型。

因样本核酸较少，所以1、2号样本不能确定具体是哪个基因型的诺如病毒，5、6号样本为GI.6型。用于扩增GI.6型的引物：F：5'-GATGTYAATCAGTCAGTCCAGTT-3'；R：5'-TACCCCTAATCTTGCAYAGTTG-3'。

因此，本发明的引物可用于鉴定GI.5型诺如病毒阳性样本。

实施例4、粪便样本GI.5型诺如病毒的qPCR检测

人粪便样本：样本A1-A4为已鉴定诺如病毒阳性的人粪便样本，来源于海淀医院肠道门诊；样本B1为已鉴定诺如病毒阳性的人粪便样本，来源于海淀医院肠道门诊。

一、制备模板溶液

取粪便样本，采用试剂盒(QIAGEN RNeasyPowerMicrobiome Kit)提取总RNA，反转录得到cDNA。

cDNA为溶液形式，即为模板溶液。

二、进行检测

取上述一得到的模板溶液，采用实施例1制备的引物对进行qPCR。

qPCR的反应体系(20μL)：KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)10μL，上游引物F0.4μL，下游引物R0.4μL，模板溶液1μL，无菌水7.8μL，ROX染料0.4μL。上游引物在体系中的工作浓度为0.2μM，下游引物在体系中的工作浓度为0.2μM。

设置用双蒸水代替模板溶液的阴性对照。

qPCR的反应程序：95℃预变性3min；95℃15s，55℃30s，40个循环；95℃15s；60℃1min；95℃30s；60℃15s。

Ct值≤30判断为阳性。

结果见图4，A1-A4对应已鉴定诺如病毒阳性的人粪便样本，B1对应已鉴定诺如病毒阳性的人粪便样本，C对应阴性对照。可以看出，设计的专一性引物能够通过qPCR的方式检测出诺如病毒GI.5型样本，诺如病毒GI.5阳性样本A1-A4的C_T值分别为28.77、24.77、24.09、21.63。

结果表明，本发明所建立的PCR方法能够快速，准确地检测出样本中GI.5型诺如病毒，具有很好的应用前景。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院微生物研究所

<120> 用于检测临床样本中GI.5型诺如病毒的试剂盒及专用引物

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

accaatcgga acctgggtga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tcccacaggc ttgagttgat 20

<210> 3

<211> 2256

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 60

gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 120

tgtaaaacga cggccagtcg aaccacgcaa tgcgtctcga tccgcagtgt cttgcgtctc 180

taccaatcgg aacctgggtg aatttaaatt gtaccctgag ggttttatta cttgtgtccc 240

taatggcaca ggccctcagc agcttcccct aaatggtgtc tttgtctttt cttcctgggt 300

gtcaagattt tatcaactca agcctgtggg agagacggag tcactgccaa ccgagacggt 360

catagctgtt tcctgtgtgc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 420

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttacccac agaatcaggg 480

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 540

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 600

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 660

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 720

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 780

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 840

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 900

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 960

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 1020

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 1080

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 1140

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 1200

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 1260

taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 1320

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tctttcgttc atccatagtt 1380

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 1440

gctgcaataa taccgcggga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 1500

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 1560

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 1620

gttgccatcg ctacaggcat cgtggtatca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 1680

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgcgcaa aaaagcggtt 1740

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgccgtgtt atcactcatg 1800

gttatggcag cactacataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 1860

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 1920

tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 1980

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 2040

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 2100

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 2160

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 2220

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttag 2256

Claims (6)

1.引物对，由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物对中2条引物的摩尔比为1:1。

3.含有权利要求1或2所述引物对的PCR试剂。

4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于：所述PCR试剂中，所述引物对的每条引物的浓度为0.4μM。

5.含有权利要求1或2所述引物对或权利要求3或4所述的PCR试剂的试剂盒。

6.权利要求1或2所述引物对或权利要求3或4所述的PCR试剂或权利要求5所述试剂盒在制备具有鉴定或辅助鉴定GI.5型诺如病毒功能产品中的应用；

所述应用为采用权利要求1或2所述引物对进行PCR扩增显示特异扩增产物150bp或者采用权利要求1或2所述引物对进行qPCR扩增显示扩增曲线且Ct值为阈值以下，判断为GI.5型诺如病毒阳性，所述阈值具体为Ct值为30。