CN111663187A - 一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法，所述构建方法包括：（一）质粒构建：先构建质粒骨架和转座子，再合成完整pSATn21质粒；（二）质粒转化：将pSATn21质粒转入DC10B修饰后再转入金葡菌Newman标准菌株；（三）诱导转座：将上一步所得菌株经培养基培养、转座和洗脱，获得文库；（四）文库验证：在mmeⅠ酶切位点切割该位点下游一定数量的核苷酸序列，得到一段带有转座子片段及一定数量来自于金葡菌Newman基因组的融合片段，通过加接头PCR富集的方式，进行高通量测序。本发明构建方法随机性更高，转座子随机插入至金黄色葡萄球菌基因组的TA位点中，且无偏嗜性；构建的文库为后期高通量筛选细菌耐药、不同条件下的生存能力等奠定基础。

Description

一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus)也称“金葡菌”，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病微生物。该菌最适宜生长温度为37℃，pH为7.4，耐高盐，可在盐浓度接近10%的环境中生长。金黄色葡萄球菌常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口中，空气、污水等环境中也可存在。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，中国每年发生的此类中毒事件也非常多。然而耐药性的产生与广泛传播严重干扰着金葡菌的临床防治，使得近年来金葡菌感染逐步呈现发病率高、耐药性强、治疗困难、病死率高的态势。基于金葡菌在临床感染性疾病中的重要地位，探寻金葡菌的形成机制对于有效控制金葡菌感染具有重要意义。

探寻金葡菌的形成机制，关键在于分离鉴定与金葡菌形成相关的基因。而文库筛选是鉴定持留相关基因的最常用方法。DNA转座子 (Transposon) 是一类能在真核生物染色体上不断移动位置的功能性DNA片段，对发现新基因和分析基因功能具有重要的作用，被认为是导致真核生物遗传变异的主要原因之一。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法。

为了达到上述目的，本发明技术方案如下：

一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，包括以下步骤：

（一）质粒构建：先构建质粒骨架和转座子，再合成完整pSATn21质粒；

（二）质粒转化：将上一步所得pSATn21质粒转入DC10B修饰后转入金葡菌Newman标准菌株；

（三）诱导转座：将上一步所得菌株经培养基培养、转座和洗脱，获得文库；

（四）文库验证：在mmeⅠ酶切位点切割该位点下游一定数量的核苷酸序列，通过酶切后将得到一段带有转座子片段及一定数量来自于金葡菌Newman基因组的融合片段，通过加接头PCR富集的方式，进行高通量测序。

进一步的，所述构建质粒骨架，包括：

S101）克隆青霉素耐药基因、pRB322质粒复制元件、金葡菌温敏质粒元件（pKOR1），获取片段；

S102）氯霉素耐药基因cat（pKOR1），获取片段；

S103）脱水四环素诱导启动子（pRAB11），获取片段；

S104）基于NCBI公布序列合成marine转座酶及其基因下游47bp，获取片段；

S105）使用吉布森装配即无缝克隆将S101）至S104）获得四个片段依次装配成一个完整质粒骨架。

进一步的，所述构建转座子，使用带有IRTs（反向重复序列）的引物从转座子Tn917中扩增红霉素耐药基因形成转座子；同时该反向重复序列中加入了后续用于构建Tnseq方法的mmeⅠ酶切位点，使得该文库可用于Tnseq转座子测序。

进一步的，所述合成完整质粒，包括：

S301）使用sacⅡ限制性内切酶消化构建的质粒骨架，并去磷酸化；

S302）使用sacⅡ限制性内切酶消化构建的转座子；

S303）将S301）的S302）获得的两片段使用T4DNA连接酶连接形成完整pSATn21质粒。

进一步的，所述步骤（三）诱导转座，具体过程：

S31）将质粒转化所得的菌株放入30℃，氯霉素10 μg/ml的培养基中培养过夜；

S32）再将所得菌株加入红霉素5 μg g/ml，脱水四环素150 ng/ml，43℃诱导转座，该转座效率约为10-6左右，每个平板10……8cfu，约得到100-300个突变文库菌株；

S33）洗脱500个平板上单克隆菌株，约得到100,000个克隆的文库。

本发明还提供了一种通过上述方法构建的金黄色葡萄球菌转座子测序文库。

有益效果：较之前有报道构建的Tn917转座子突变文库，本发明金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法随机性更高，转座子随机插入至金黄色葡萄球菌基因组的TA位点中，且无偏嗜性。通过以上方法收集的100,000个转座子构建的突变文库基本可以覆盖金葡菌全基因组，为后鉴定表型相关基因提供了强有力的支持。不仅如此，本发明构建的突变文库，转座子末端带有特殊的MmmeⅠ酶切位点，通过酶切加接头再PCR富集，进行高通量测序，其获得产物带有16bp的金黄色葡萄球菌基因组序列可以用来鉴定转座子插入位点，该文库的构建为后期高通量筛选细菌耐药、不同条件下的生存能力等奠定基础。

附图说明

图1为本发明的所用pSATn21质粒图谱；

图2为选取20个转座子分析结果。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，包括以下步骤：

（一）质粒构建

（1）构建质粒骨架：

S101）克隆青霉素耐药基因、pRB322质粒复制元件、金葡菌温敏质粒元件（pKOR1），获得片段：

F：5’- AACGCAGGAAAGAACATGTGAGC -3’

R：5’- GGTAACCAAGATAACAAAGAATAC -3’；

S102）氯霉素耐药基因cat（pKOR1），获得片段：

F：5’-TATTCTTTGTTATCTTGGTTACCCGTCTTCTTAATATGCGTAA-3’

R：5’-TCGATACCGTCGACCTGCAGTCTCCGCGGATGGATATCCCCGTATAGTGAGT-3’；

S103）脱水四环素诱导启动子（pRAB11），获得片段：

F：5’-CAGGTCGACGGTATCGA-3’

R：5’-CCATAACTAACACCTCTTTCTTTTTAGAGATCTGTTAACGGTACCAT-3’；

S104）基于NCBI公布序列合成marine转座酶及其基因下游47bp，获得片段：

F：5’-AGAAAGAGGTGTTAGTTATGGAAAAAAAGGAATTTCG-3’

R：5’-CACATGTTCTTTCCTGCGTTGCATGCCTGCAGATCCGGTC-3’；

S105）使用吉布森装配即无缝克隆将S101）至S104）获得四个片段依次装配成一个完整质粒骨架；

（2）构建转座子：

使用带有IRTs（反向重复序列）的引物从转座子Tn917中扩增红霉素耐药基因形成转座子；

F: 5’-TCCGCGGTAACAGGTTGGATGATAAGTCCCCGGTCTAACAAAGAAAAAC

ACATTTTTTTGTTAAAATTCGTTTTAGATCTATACCCGCCCTTCCCCGTAGGCGCTAGGG-3’

R: 5’-GACCAATCACTCTCGGACAAGGGCGGGAATCATTTGAAGGTTGGTACTA

TATAAAAATAATATGCATTTAATACTAGCGACGCCATCTATGTGTCAGACCGGGGACTTATCATCCAACCTGTTACCGCGGA-3’；

该反向重复序列中加入了后续用于构建Tnseq方法的mmeⅠ酶切位点，使得该文库可用于Tnseq转座子测序；

（3）合成完整质粒：

S301）使用sacⅡ限制性内切酶消化第（1）步构建的质粒骨架，并去磷酸化；

S302）使用sacⅡ限制性内切酶消化第（2）步构建的转座子；

S303）将S301）的S302）获得的两片段使用T4DNA连接酶连接形成完整质粒，如图1所示的pSATn21质粒图和如序列表所示的pSATn21质粒具体序列。

（二）质粒转化

将步骤（一）所得质粒转入DC10B修饰后转入金葡菌Newman标准菌株。

（三）诱导转座：

S31）将步骤（二）所得菌株放入30℃，氯霉素10 μg/ml的培养基中培养过夜；

S32）再将所得菌株加入红霉素5 μg/ml，脱水四环素150 ng/ml，43℃诱导转座，该转座效率约为10-6左右，每个平板10……8cfu，约得到100-300个突变文库菌株；

S33）洗脱500个平板上单克隆菌株，约得到100,000个克隆的文库。

（四）文库验证

初步验证：随机选取20个单克隆分析，如图2所示，mmeⅠ酶切位点切割该位点下游20bp的核苷酸序列，通过酶切后将得到一段带有转座子片段及16bp来自于金葡菌Newman基因组的融合片段，通过加接头PCR富集的方式，进行高通量测序。

序列表

<110> 南昌大学第一附属医院

<120> 一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9177

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400> 1

ctgcagaacg gattgttgat gattacgaaa atattaagag cacagactat tacacagaaa 60

atcaagaatt aaaaaaacgt agagagagtt tgaaagaagt agtgaataca tggaaagagg 120

ggtatcacga aaaaagtaaa gaggttaata aattaaagcg agagaatgat agtttgaatg 180

agcagttgaa tgtatcagag aaatttcaag ctagtacagt gactttatat cgtgctgcga 240

gggcgaattt ccctgggttt gagaaagggt ttaataggct taaagagaaa ttctttaatg 300

attccaaatt tgagcgtgtg ggacagttta tggatgttgt acaggataat gtccagaagg 360

tcgatagaaa gcgtgagaaa cagcgtacag acgatttaga gatgtagagg tacttttatg 420

ccgagaaaac tttttgcgtg tgacagtcct taaaatatac ttagagcgta agcgaaagta 480

gtagcgacag ctattaactt tcggttgcaa agctctagga tttttaatgg acgcagcgca 540

tcacacgcaa aaaggaaatt ggaataaatg cgaaatttga gatgttaatt aaagaccttt 600

ttgaggtctt tttttcttag atttttgggg ttatttaggg gagaaaacat aggggggtac 660

tacgacctcc cccctaggtg tccattgtcc attgtccaaa caaataaata aatattgggt 720

ttttaatgtt aaaaggttgt tttttatgtt aaagtgaaaa aaacagatgt tgggaggtac 780

agtgatagtt gtagatagaa aagaagagaa aaaagttgct gttactttaa gacttacaac 840

agaagaaaat gagatattaa atagaatcaa agaaaaatat aatattagca aatcagatgc 900

aaccggtatt ctaataaaaa aatatgcaaa ggaggaatac ggtgcatttt aaacaaaaaa 960

agatagacag cactggcatg ctgcctatct atgactaaat tttgttaaat gtattagcac 1020

cgttattata tcatgagcga aaatgtaata aaagaaactg aaaacaagaa aaattcaaga 1080

ggacgtaatt ggacatttgt tttatatcca gaatcagcaa aagccgagtg gttagagtat 1140

ttaaaagagt tacacattca atttgtagtg tctccattac atgataggga tactgataca 1200

gaagatagga tgaaaaaaga gcattatcat attctagtga tgtatgaggg taataaatct 1260

tatgaacaga taaaaataat taacagaaga attgaatgcg actattccgc agattgcagg 1320

aagtgtgaaa ggtcttgtga gatatatgct tcacatggac gatcctaata aatttaaata 1380

tcaaaaagaa gatatgatag tttatggcgg tgtagatgtt gatgaattat taaagaaaac 1440

aacaacagat agatataaat taattaaaga aatgattgag tttattgatg aacaaggaat 1500

cgtagaattt aagagtttaa tggattatgc aatgaagttt aaatttgatg attggttccc 1560

gcttttatgt gataactcgg cgtatgttat tcaagaatat ataaaatcaa atcggtataa 1620

atctgaccga tagattttga atttaagagt gtcacaagac actctttttt cgcaccagcg 1680

aaaactggtt taagccgact gcgcaaaaga cataatcgat tcacaaaaaa taggcacacg 1740

aaaaacaagt taagggatgc agtttatgca tcccttaact tacttattaa ataatttata 1800

gctattgaaa agagataaga attgttcaaa gctaatattg tttaaatcgt caattcctgc 1860

atgttttaag gaattgttaa attgattttt tgtaaatatt ttcttgtatt ctttgttatc 1920

ttggttaccc gtcttcttaa tatgcgtaat tgcatctact ctaaatccat caatgccttt 1980

atcaaaccac cagttcatca tttcaaatac agcatctcta acttccggat taccccaatt 2040

caaatcaggt tgttttttac tgaataaatg gaaataatat tgctcagtat tagcatcata 2100

ttcccgcgcg ccaattgagc tcccctttct atgtatgttt tttactagtc atttaaaacg 2160

atacattaat aggtacgaaa aagcaacttt ttttgcgctt aaaaccagtc ataccaataa 2220

cttaagggta actagcctcg ccggcaatag ttacccttat tatcaagata agaaagaaaa 2280

ggatttttcg ctacgctcaa atcctttaaa aaaacacaaa agaccacatt ttttaatgtg 2340

gtcttttatt cttcaactaa agcacccatt agttcaacaa acgaaaattg gataaagtgg 2400

gatattttta aaatatatat ttatgttaca gtaatattga cttttaaaaa aggattgatt 2460

ctaatgaaga aagcagacaa gtaagcctcc taaattcact ttagataaaa atttaggagg 2520

catatcaaat gaaatttaat aaaattgatt tagacaattg gaagagaaaa gagatattta 2580

atcattattt gaaccaacaa acgactttta gtataaccac agaaattgat attagtgttt 2640

tataccgaaa cataaaacaa gaaggatata aattttaccc tgcatttatt ttcttagtga 2700

caagggtgat aaactcaaat acagctttta gaactggtta caatagcgac ggagagttag 2760

gttattggga taagttagag ccactttata caatttttga tggtgtatct aaaacattct 2820

ctggtatttg gactcctgta aagaatgact tcaaagagtt ttatgattta tacctttctg 2880

atgtagagaa atataatggt tcggggaaat tgtttcccaa aacacctata cctgaaaatg 2940

ctttttctct ttctattatt ccatggactt catttactgg gtttaactta aatatcaata 3000

ataatagtaa ttaccttcta cccattatta cagcaggaaa attcattaat aaaggtaatt 3060

caatatattt accgctatct ttacaggtac atcattctgt ttgtgatggt tatcatgcag 3120

gattgtttat gaactctatt caggaattgt cagataggcc taatgactgg cttttataat 3180

atgagataat gccgactgta ctttttacag tcggttttct aatgtcacta acctgccccg 3240

ttagttgaag aaggttttta tattacagct ccagatccat atccttcttt ttctgaaccg 3300

acttctcctt tttcgcttct ttattccaat tgctttattg acgttgagcc tcggaaccgg 3360

tacccaggaa acagctatga ccatgtaata cgactcacta tacggggata tccatccgcg 3420

gtaacaggtt ggatgataag tccccggtct aacaaagaaa aacacatttt tttgttaaaa 3480

ttcgttttag atctataccc gcccttcccc gtaggcgcta gggacctctt tagctccttg 3540

gaagctgtca gtagtatacc taataattta tctacattcc ctttagtaac gtgtaacttt 3600

ccaaatttac aaaagcgact catagaatta tttcctcccg ttaaataata gataactatt 3660

aaaaatagac aatacttgct cataagtaac ggtacttaaa ttgtttactt tggcgtgttt 3720

cattgcttga tgaaactgat ttttagtaaa cagttgacga tattctcgat tgacccattt 3780

tgaaacaaag tacgtatata gcttccaata tttatctgga acatctgtgg tatggcgggt 3840

aagttttatt aagacactgt ttacttttgg tttaggatga aagcattccg ctggcagctt 3900

aagcaattgc tgaatcgaga cttgagtgtg caagagcaac cctagtgttc ggtgaatatc 3960

caaggtacgc ttgtagaatc cttcttcaac aatcagatag atgtcagacg catggctttc 4020

aaaaaccact tttttaataa tttgtgtgct taaatggtaa ggaatattcc caacaatttt 4080

atacctctgt ttgttaggga attgaaactg tagaatatct tggtgaatta aagtgacacg 4140

aatgttcagt tttaattttt ctgacgataa gttgaataga tgactgtcta attcaataga 4200

cgttacctgt ttacttattt tagccagttt cgtcgttaaa tgccctttac ctgttccaat 4260

ttcgtaaacg gtatcggttt cttttaaatt caattgtttt attatttggt tgagtacttt 4320

ttcactcgtt aaaaagtttt gagaatattt tatatttttg ttcatgtaat cactcctgaa 4380

gtgattatat ctataaataa atacagaagt taaacgattt gtttgtaatt ttagttatct 4440

gtttaaaaag tcataagatt agtcactggt aggaattaat ctaacgtatt tatttatctg 4500

cgtaatcact gtttttagtc tgtttcaaaa cagtagatgt tttatctaca ttacgcattt 4560

ggaataccaa catgacgaat ccctccttct taattacaaa tttttagcat ctaatttaac 4620

ttcaattcct attatacaaa attttaagat aatgcactat caacacactc ttaagtttgc 4680

ttctaagtct tatttccata actttagggt taaccatacg caagaccaat cactctcgga 4740

caagggcggg aatcatttga aggttggtac tatataaaaa taatatgcat ttaatactag 4800

cgacgccatc tatgtgtcag accggggact tatcatccaa cctgttaccg cggagactgc 4860

aggtcgacgg tatcgataac tcgacatctt ggttaccgtg aagttaccat cacggaaaaa 4920

ggttatgctg cttttaagac ccactttcac atttaagttg tttttctaat ccgcatatga 4980

tcaattcaag gccgaataag aaggctggct ctgcaccttg gtgatcaaat aattcgatag 5040

cttgtcgtaa taatggcggc atactatcag tagtaggtgt ttccctttct tctttagcga 5100

cttgatgctc ttgatcttcc aatacgcaac ctaaagtaaa atgccccaca gcgctgagtg 5160

catataatgc attctctagt gaaaaacctt gttggcataa aaaggctaat tgattttcga 5220

gagtttcata ctgtttttct gtaggccgtg tacctaaatg tacttttgct ccatcgcgat 5280

gacttagtaa agcacatcta aaacttttag cgttattacg taaaaaatct tgccagcttt 5340

ccccttctaa agggcaaaag tgagtatggt gcctatctaa catctcaatg gctaaggcgt 5400

cgagcaaagc ccgcttattt tttacatgcc aatacaatgt aggctgctct acacctagct 5460

tctgggcgag tttacgggtt gttaaacctt cgattccgac ctcattaagc agctctaatg 5520

cgctgttaat cactttactt ttatctaatc tagacatcat taattcctcc tttttgttga 5580

cattatatca ttgatagagt tatttgtcaa actagttttt tatttggatc ccctcgagtt 5640

catgaaaaac taaaaaaaat attgacactc tatcattgat agagtataat taaaataagc 5700

tctctatcat tgatagagta tgatggtacc gttaacagat ctctaaaaag aaagaggtgt 5760

tagttatgga aaaaaaggaa tttcgtgttt tgataaaata ctgttttctg aagggaaaaa 5820

atacagtgga agcaaaaact tggcttgata atgagtttcc ggactctgcc ccagggaaat 5880

caacaataat tgattggtat gcaaaattca agcgtggtga aatgagcacg gaggacggtg 5940

aacgcagtgg acgcccgaaa gaggtggtta ccgacgaaaa catcaaaaaa atccacaaaa 6000

tgattttgaa tgaccgtaaa atgaagttga tcgagatagc agaggcctta aagatatcaa 6060

aggaacgtgt tggtcatatc attcatcaat atttggatat gcggaagctc tgtgcgaaat 6120

gggtgccgcg cgagctcaca tttgaccaaa aacaacgacg tgttgatgat tctaagcggt 6180

gtttgcagct gttaactcgt aatacacccg agtttttccg tcgatatgtg acaatggatg 6240

aaacatggct ccatcactac actcctgagt ccaatcgaca gtcggctgag tggacagcga 6300

ccggtgaacc gtctccgaag cgtggaaaga ctcaaaagtc cgctggcaaa gtaatggcct 6360

ctgttttttg ggatgcgcat ggaataattt ttatcgatta tcttgagaag ggaaaaacca 6420

tcaacagtga ctattatatg gcgttattgg agcgtttgaa ggtcgaaatc gcggcaaaac 6480

ggccccacat gaagaagaaa aaagtgttgt tccaccaaga caacgcaccg tgccacaagt 6540

cattgagaac gatggcaaaa attcatgaat tgggcttcga attgcttccc cacccgccgt 6600

attctccaga tctggccccc agcgactttt tcttgttctc agacctcaaa aggatgctcg 6660

cagggaaaaa atttggctgc aatgaagagg tgatcgccga aactgaggcc tattttgagg 6720

caaaaccgaa ggagtactac caaaatggta tcaaaaaatt ggaaggtcgt tataatcgtt 6780

gtatcgctct tgaagggaac tatgttgaat aataaaaacg aattttcaca aaaaaatgtg 6840

tttttctttg ttagaccgga tctgcaggca tgcaacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 6900

ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 6960

cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 7020

ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 7080

accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 7140

catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 7200

gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 7260

tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 7320

agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 7380

actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 7440

gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 7500

aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 7560

gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 7620

aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 7680

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 7740

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 7800

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 7860

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 7920

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 7980

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 8040

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 8100

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 8160

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 8220

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 8280

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 8340

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 8400

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 8460

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 8520

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 8580

caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 8640

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac 8700

gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc 8760

tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 8820

acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 8880

gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg 8940

agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 9000

aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 9060

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 9120

ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct tgcatgc 9177

Claims (6)

1.一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（一）质粒构建：先构建质粒骨架和转座子，再合成完整pSATn21质粒；

（二）质粒转化：将上一步所得pSATn21质粒转入DC10B修饰后再转入金葡菌Newman标准菌株；

（三）诱导转座：将上一步所得菌株经培养基培养、诱导转座和洗脱，获得文库；

（四）文库验证：在mmeⅠ酶切位点切割该位点下游一定数量的核苷酸序列，通过酶切后将得到一段带有转座子片段及一定数量来自于金葡菌Newman基因组的融合片段，通过加接头PCR富集的方式，进行高通量测序。

2.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建质粒骨架，包括：

S101）克隆青霉素耐药基因、pRB322质粒复制元件、金葡菌温敏质粒元件，获取片段；

S102）氯霉素耐药基因cat，获取片段；

S103）脱水四环素诱导启动子，获取片段；

S104）基于NCBI公布序列合成marine转座酶及其基因下游47bp，获取片段；

S105）使用Gibson装配即无缝克隆将S101）至S104）获得四个片段依次装配成一个完整质粒骨架。

3.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建转座子，使用带有IRTs即反向重复序列的引物从转座子Tn917中扩增红霉素耐药基因形成转座子；同时该反向重复序列中加入了后续用于构建Tnseq方法的mmeⅠ酶切位点，使得该文库可用于Tnseq转座子测序。

4.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，其特征在于，所述合成完整质粒，包括：

S301）使用sacⅡ限制性内切酶消化构建的质粒骨架，并去磷酸化；

S302）使用sacⅡ限制性内切酶消化构建的转座子；

S303）将S301）的S302）获得的两片段使用T4DNA连接酶连接形成完整pSATn21质粒。

5.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，其特征在于，所述步骤（三）诱导转座，具体过程：

S31）将pSATn21转化所得的菌株放入30℃，氯霉素10 μg/ml的培养基中培养过夜；

S32）再将所得菌株加入红霉素5 μg/ml，脱水四环素150 ng/ml，43℃诱导转座，该转座效率约为10-6左右，每个平板10……8cfu，约得到100-300个突变文库菌株；

S33）洗脱500个平板上单克隆菌株，约得到100,000个克隆的文库。

6.一种通过如权利要求1至5任一所述的金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法构建的金黄色葡萄球菌转座子测序文库。

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