KR102109820B1

KR102109820B1 - 비스페놀 a와의 결합력이 향상된 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질 및 이를 이용한 박테리아 균주

Info

Publication number: KR102109820B1
Application number: KR1020180069808A
Authority: KR
Inventors: 이진원; 계명찬; 김영필; 유수현
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-06-18
Publication date: 2020-05-12
Also published as: KR20190120683A

Abstract

본 발명은 아미노산 치환을 통해 비스페놀 A와의 결합력을 향상시킨 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질 및 이를 이용한 박테리아 균주에 관한 것으로, 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질은 아미노산 치환을 통해 비스페놀 A에 대한 리간드 결합력을 증가시킨 것으로, 이를 이용하여 형질전환한 박테리아 균주는 기존 박테리아 균주보다 비스페놀 A에 대한 검출 능력이 우수하여 더 효과적으로 다른 에스트로겐성 화합물들과 함께 비스페놀 A를 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질은 인체로부터 유래된 에스트로겐 수용체 단백질을 기반으로 하기 때문에 친환경적이고, 비교적 단순한 공정에 의해서 낮은 원가 및 노동력으로 제조될 수 있으며 검출 시간 또한 매우 짧다.

Description

비스페놀 A와의 결합력이 향상된 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질 및 이를 이용한 박테리아 균주{Mutant estrogen receptor protein having improved binding capacity for Bisphenol A and bacterial strain using the same}

본 발명은 아미노산 서열의 치환을 통해 비스페놀 A와의 결합력을 향상시킨 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질 및 이를 이용한 박테리아 균주에 관한 것이다.

내분비 교란 화합물(Endocrine Disrupting Compounds, EDC)이란, 호르몬의 생리적 작용을 모방하거나, 차단하고 또 교란하는 것에 의해 인간과 야생생물에 대해 유해 효과를 나타내는 일군의 화합물들을 의미한다. 미국 내분비학회는 내분비 교란물질이 남성 및 여성 생식, 가슴 발육 및 암, 전립선암, 신경내분비, 갑상선 활성, 대사, 비만 및 심혈관계 내분비에 영향을 줄 수 있다는 사실을 보고한 바 있으며, EDC가 공중 건강에 대해서 심각한 우려를 자아낼 수 있음을 경고하고 있다.

호르몬은 표적 세포의 수용체(receptor)와 상호작용하여 성장, 발달, 거동 및 생식 등과 같은 다양한 반응 및 정상적인 생물학적 기능을 유발하는 기능을 수행한다. 그러나, 전술한 EDC와 같이 호르몬의 활성에 대해서 간섭을 초래하는 물질은 왜소 성장, 단기 기억 손상, 난관 임신, 낮은 정자 수치, 생식장애 및 면역계 손상을 비롯한 다양한 가역적 또는 비가역적 생물학적 손상을 초래할 수 있다.

일반적으로, EDC는 3개의 주요 그룹으로 분류될 수 있으며, 안드로겐형(천연 테스토스테론을 모방하거나 차단하는 화합물), 갑상선형(갑상선에 대한 직접적 또는 간접 영향을 미치는 화합물) 및 에스트로겐형(천연 에스트로겐을 모방하거나 또는 차단하는 화합물)로 분류될 수 있다. 특히, 그 중에서도 에스트로겐 화합물(EC)은 성인 남녀뿐 아니라 소아의 성 발달 및 장애, 암 발병 등과 밀접한 관련을 갖고 있다고 알려져 있으며, 일상 생활에서 사용되는 수천 가지의 제품에서 발견되기 때문에 그 심각도가 매우 위중하다.

에스트로겐을 포함하는 내분비 교란 화합물은 환경에서 아주 낮은 농도로 존재하는 것으로 널리 보고되어 있으나, 지방 용해도가 비교적 높아서 먹이 사슬에서 높은 위치에 있는 생물 및 동물의 지방에 축적되며, 비교적 낮은 농도에서도 현저한 생리적 반응을 초래하게 된다. 또한, 살충제, 제초제, 살진균제, 가소제, 플라스틱, 수지 및 세제와 같은 공업용 화학제에서도 발견된다.

한편, 대한민국 공개특허 제10-2017-0112017호는 에스트로겐성 화합물의 검출을 위한 유전자 변이 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법에 관하여 개시하고 있으나, 상기 박테리아 균주를 이용한 센서는 에스트로겐성 화합물 중 하나인 Bisphenol A에 대한 검출 성능이 수 μM 수준에 불과하여 매우 낮다는 문제가 있다. 또한, 현재까지 낮은 농도의 Bisphenol A를 분석할 수 있는 기술에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명에서는 상기 종래기술인 대한민국 공개특허 제10-2017-0112017호의 문제점을 해결하고자, 상기 종래기술의 에스트로겐 수용체 단백질을 돌연변이화하여 낮은 농도의 비스페놀 A도 검출할 수 있도록, 비스페놀 A(Bisphenol A)와의 결합력을 향상시킨 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 개발하고, 이를 이용하여 제조한 친환경적이고 비스페놀 A에 대한 검출성능이 뛰어난 박테리아 균주를 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서,

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 에스트로겐 수용체 단백질의 421번째 아미노산인 메티오닌을 류신으로 치환하고 521번째 아미노산인 글리신을 알라닌으로 치환한 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질은 비스페놀 A에 대한 특이적 결합능을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 부위(hERα(M421L,G521A) LBD)를 코딩하는 유전자가 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드 및 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 λCI 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드에 의해서 형질전환된(transformed), 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 부위(hERα(M421L,G521A) LBD)를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 hERα(M421L,G521A) LBD 및 αNTD 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 TIF2 단백질 및 상기 λCI 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 hERα(M421L,G521A) LBD를 코딩하는 유전자가 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열은 서열번호 5의 염기서열일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 λCI 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열은 서열번호 6의 염기서열일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 hERα(M421L,G521A) LBD 단백질을 코딩하는 유전자는, 인간 게놈 DNA로부터 mRNA를 전사하고, 상기 mRNA에 대한 스플라이싱 과정을 통해서 인트론이 제거된 mRNA를 제조한 다음, 상기 인트론이 제거된 mRNA에 대한 역전사 과정을 통해서 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 박테리아 균주는 대장균(Escherichia coli) 균주, 고초균(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 및 유산균으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 균주일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 에스트로겐성 화합물은 에스트라디올, 노레틸노드렐, 5α-안드로스탄, 도데실페놀, 옥틸페놀, 비스페놀 A, 비스페놀 S, 비스페놀 F, 2-에틸헥실-4-히드록시벤조에이트, 4,4'-디히드록시벤조페논, 2,4-디히드록시벤조페논, 디히드록시메톡시클로르올레핀, o,p'-DDT, 디히드록시메톡시클로르, 2',3',4',5'-테트라클로로-4-비페닐올, 노르디히드로구아이 아레틱산, 아우린, 페놀프탈레인 및 페놀 레드로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 바람직하게는 에스트라디올, 비스페놀 S, 비스페놀 F 및 노닐페놀이며, 보다 바람직하게는 비스페놀 A이다.

본 발명은 또 다른 하나의 양태로, 상기 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 제조하는 단계, 상기 박테리아 균주에 에스트로겐성 화합물을 함유한 시료를 첨가하고 배양하는 단계, 및 상기 배양된 박테리아 균주를 용균한 다음, 리포터 단백질의 발현 정도를 분석하는 단계를 포함하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 리포터 단백질은 베타-갈락토시다아제, 형광 발광 단백질 또는 항생제 내성 부여 단백질일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 형광 발광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 적색 형광 단백질(RFP) 또는 루시퍼라아제일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 리포터 단백질의 발현 정도는 UV-VIS 스펙트로포토미터에 의해서 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 다르면, 상기 베타-갈락토시다아제의 발현 정도는 상기 용균 이후에, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해 주고, 발현 정도를 분석함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질은 아미노산 치환을 통해 비스페놀 A에 대한 리간드 결합력을 증가시킨 것으로, 이를 이용하여 형질전환한 박테리아 균주는 기존 박테리아 균주보다 비스페놀 A에 대한 검출 능력이 우수하여 더 효과적으로 다른 에스트로겐성 화합물들과 함께 비스페놀 A를 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질은 인체로부터 유래된 에스트로겐 수용체 단백질을 기반으로 하기 때문에 친환경적이고, 비교적 단순한 공정에 의해서 낮은 원가 및 노동력으로 제조될 수 있으며 검출 시간 또한 매우 짧다.

도 1은 에스트로겐 수용체 단백질 알파의 리간드 결합 부위와 에스트로겐 수용체 단백질 감마의 리간드 결합 부위의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서의 비스페놀 A 검출 능력을 확인하기 위한 베타 갈락토시다아제 분석 실험 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서의 에스트라디올(estradiol) 검출 능력을 확인하기 위한 베타 갈락토시다아제 분석 실험 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서의 비스페놀 S, 비스페놀 F 및 노닐페놀 검출 능력을 확인하기 위한 베타 갈락토시다아제 분석 실험 결과 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다

본 발명에서 "돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질(hERα(M421L,G521A))"은 인간 에스트로겐 수용체 알파 단백질의 아미노산 서열의 421번째 아미노산인 메티오닌을 류신으로 치환하고 521번째 아미노산인 글리신을 알라닌으로 치환한 단백질이다.

하나의 구체적인 실시예로, 상기 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

다른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 에스트로겐 수용체 단백질은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 유전자에 의해 코딩될 수 있다.

또 다른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질은 서열번호 4의 염기서열을 갖는 유전자에 의해 코딩될 수 있다.

본 발명의 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질(hERα(M421L,G521A))은 상기와 같은 아미노산 서열 또는 염기서열의 치환을 통해 비스페놀 A와의 결합성을 강화한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 부위(hERα(M421L,G521A) LBD)를 코딩하는 유전자가 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드 및 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 λCI 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드에 의해서 형질전환된(transformed), 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 박테리아 균주는 비스페놀 A에 대한 검출능이 기존의 박테리아 균주에 비하여 현저히 우수하다.

본 발명에서는 에스트로겐 호르몬 및 다양한 에스트로겐성 화합물들의 검출을 위해서, 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 부위(hERα(M421L,G521A) LBD)와 상호작용하는 공동조절인자와, 돌연변이 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 부위(hERα(M421L,G521A) LBD) 단백질 사이의 특정 결합에 의해서 리포터 유전자가 발현되는 원리를 이용하고자 하였다. 즉, 분석 대상이 되는 시료 중에 에스트로겐성 화합물들이 존재하는 경우, 해당 에스트로겐성 화합물이 상기 hERα(M421L,G521A) LBD에 결합하게 되고, 이러한 결합에 의해서 상기 두 단백질의 상호작용이 발생되며, 다시 이러한 상호작용에 의해서 리포터 유전자의 발현이 이루어지게 된다. 또한, 발현된 상기 리포터 유전자는 발색 시약에 의한 발색 반응을 야기하게 되고, 이러한 발색 반응 정도를 정량함으로써 시료 중 에스트로겐성 화합물의 농도를 정확하게 정량할 수 있는데, 특히, 본 발명에 따른 박테리아 균주는 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질(hERα(M421L,G521A))에 의해 형질 변환되었기 때문에 비스페놀 A를 정확하게 검출할 수 있다.

하나의 구체적인 실시예로, 본 발명의 상기 박테리아 균주는 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 부위(hERα(M421L,G521A) LBD)를 코딩하는 유전자가 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드 및 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 λCI 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드에 의해서 형질전환된(transformed), 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주이다.

본 발명에 따른 박테리아 균주는 상기 플라스미드에 의해서 형질전환된 것이며, 상기 플라스미드는 리포터 유전자의 발현에 관여하는 단백질 세트들을 코딩한다.

본 발명에 있어서, 상기 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 부위(hERα(M421L,G521A) LBD)를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 (hERα(M421L,G521A) LBD) 및 상기 αNTD 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합될 수 있다. 마찬가지로, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 TIF2 단백질 및 상기 λCI 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합될 수 있다. 이러한 FLAG 서열의 접합에 의해서, 발현된 단백질만을 특이 항체로서 인식하는 웨스턴 블롯팅 등의 방법을 사용하여 확인할 수 있게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 hERα(M421L,G521A) LBD를 코딩하는 유전자는, 인간 게놈 DNA로부터 mRNA를 전사하고, 상기 mRNA에 대한 스플라이싱 과정을 통해서 인트론이 제거된 mRNA를 제조한 다음, 상기 인트론이 제거된 mRNA에 대한 역전사 과정을 통해서 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭된 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 hERα(M421L,G521A) LBD를 코딩하는 유전자가 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열은 서열번호 5의 염기서열일 수 있다. 서열번호 5에 도시된 서열은 5'에서 3' 방향으로, αNTD 단백질을 코딩하는 유전자, 링커 아미노산 서열, hERα(M421L,G521A) LBD 단백질을 코딩하는 유전자 및 FLAG 서열을 포함한다.

상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 λCI 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열은 서열번호 6의 염기서열일 수 있다. 서열번호 6에 도시된 서열은 5'에서 3' 방향으로, λCI 단백질을 코딩하는 유전자, 링커 아미노산 서열, TIF2 단백질을 코딩하는 유전자 및 FLAG 서열을 포함한다.

하기 실시예에서는 본 발명에 따른 염기서열을 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 세포로서, 하기 실시예에서는 대장균 균주를 예로 들어 설명하였으나, 대상 균주가 반드시 대장균으로만 한정되는 것은 아니며, 이외에도 고초균, 바실러스 리체니포르미스, 유산균 등과 같이 유전자 조작이 가능한 모든 박테리아 균주가 대상 균주로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 박테리아가 검출할 수 있는 대상 화합물들에는 인간 에스트로겐 호르몬을 비롯해서, 에스트로겐 수용체에 결합이 가능한 모든 종류의 호르몬 및 유사체에 대한 검출이 포함된다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다양한 스테로이드 계열 호르몬들 (Norethylnodrel,5α-Androstane 등), 알킬페놀 화합물 (Dodecylphenol,Octylphenol 등), 비스페놀 계열 화합물 (Bisphenol A, Bisphenol S, Bisphenol F 등), 방부제로 많이 사용되는 파라벤 계열 화합물 (2-Ethylhexyl 4-hydroxybenzoate, Heptyl 4-hydroxybenzoatea 등), 화장품 향 고정제 등으로 사용되는 벤조페논 계열 화합물 (4,4'-Dihydroxybenzophenone, 2,4-Dihydroxybenzophenone 등), 살충제에 들어가는 유기염소계 물질들 (Dihydroxymethoxychlor olefin, o,p'-DDT, Dihydroxymethoxychlor (HPTE), 2',3',4',5'-Tetrachloro-4-biphenylol 등), 산화방지제로 식품에도 첨가되는 Nordihydroguaiaretic acid, 산 염기 지시약으로 많이 사용되는 Aurin, Phenolphthalein, Phenol red 등의 화합물들을 본 발명에 의해서 검출해낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 박테리아 균주의 비스페놀 A 검출 능력을 확인하기 위하여 베타 갈락토시다아제 분석 실험을 실시 하였고, 기존 박테리아 균주를 이용한 센서보다 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서가 비스페놀 A를 검출능이 현저히 우수함을 확인하였다(실시예 4-2.).

본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서의 에스트라디올(estradiol) 검출 능력을 확인하였고, 기존 박테리아 균주를 이용한 센서와 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서는 에스트라디올(estradiol) 검출 능력에 차이가 없음을 확인하였다(실시예 4-3).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서의 비스페놀 S, 비스페놀 F 및 노닐페놀 검출 능력을 확인하였고, β-갈락토시다아제를 사용하여 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이즈 기반의 박테리아 균주의 에스트로겐성 화합물에 대한 검출능력을 실험하였고, 기존 박테리아 균주를 이용한 센서와 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서는 비스페놀 S, 비스페놀 F 및 노닐페놀 검출 능력에 차이가 없음을 확인하였다(실시예 4-4).

상기 실시예들의 결과로부터 본 발명에 따른 박테리아 균주는 에스트로겐성 화합물에 대한 검출능이 기존의 박테리아 균주를 이용한 센서와 차이가 없고, 특히 비스페놀 A에 대한 검출능이 현저히 우수하여, 에스트로겐성 화합물을 검출하는 센서에 유용하게 적용될 수 있음을 알 수 있다.

이에 본 발명은 또한 본 발명에 따른 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물의 검출센서를 제공한다.

본 발명은 또한 박테리아 균주를 제조하는 단계; 상기 박테리아 균주에 에스트로겐성 화합물을 함유한 시료를 첨가하고 배양하는 단계; 상기 배양된 박테리아 균주를 용균한 다음, 리포터 단백질의 발현 정도를 분석하는 단계를 포함하는 박테리아 균주를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 검출방법은 본 발명에 따른 박테리아 균주를 제조하고, 이를 분석 대상이 되는 시료와 함께 배양한 다음, 배양된 박테리아 균주를 용균(lysis)시켜서, 박테리아에 의해서 발현된 리포터 단백질을 분석하는 것이다. 이때, 시료 중에 에스트로겐성 화합물이 존재하는 경우에만 리포터 유전자에 의한 리포터 단백질이 생산되고, 생산된 리포터 단백질을 정량적으로 분석함으로써 시료 중 에스트로겐성 화합물을 검출할 수 있게 된다.

즉, 본 발명에 따른 방법은 전술한 바와 같이 시료 중에 존재하는 에스트로겐성 화합물이 리간드로 작용하여 hERα(M421L,G521A) LBD에 결합하는 경우에만 특정 단백질을 생산하는 특성을 이용하여 시료 중 에스트로겐성 화합물을 분석하게 된다.

본 발명은 발현되는 리포터 단백질의 종류에 따라서, 분석 방법이 달라질 수 있는 바, 예를 들어, 상기 리포터 단백질은 β-갈락토시다아제, 형광 발광 단백질 또는 항생제 내성 부여 단백질일 수 있고, 상기 형광 발광 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP) 또는 루시퍼라아제일 수 있다. 상기 발색 또는 형광 단백질은 UV-VIS 스펙트로포토미터 등의 장비를 사용하여 정량적으로 분석이 가능하다.

또한, 리포터 단백질로서, β-갈락토시다아제를 사용하는 경우에는, 상기 용균 이후에, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해 주고, 발현 정도를 분석함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해주는 경우, 첨가된 ONPG는 β-갈락토시다아제에 의해서 분해되고, 분해산물로서 강한 황색 발광을 내는 오르쏘니트로페놀 (orthonitrophenol)이 생산된다. 이때, 황색 발광 정도는 시료 중 존재하는 에스트로겐성 화합물의 농도에 따라서 달라지므로, ONPG에 의한 발색 정도를 UV-VIS 스펙트로포토미터 등을 사용하여 측정하게 되면, 시료 중 존재하는 에스트로겐성 화합물의 농도를 정량적으로 분석하는 것이 가능하게 된다.

실시예 1. 비스페놀 A 결합 관여 아미노산 서열 검토

에스트로겐 수용체 단백질 알파의 리간드 결합 부위 아미노산 서열 중에서 비스페놀 A와의 결합에 관여하는 서열을 찾기 위한 실험을 실시하였다. 우선, 에스트로겐 수용체 단백질 알파의 리간드 결합 부위 아미노산 서열과 에스트로겐 수용체 관련 단백질 감마의 리간드 결합 부위 아미노산 서열을 비교하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 것처럼 리간드 결합에 직접적으로 연관 있는 아미노산들을 녹색 박스로 표시하였고, 그 중 비스페놀 A의 결합에 관여한다고 알려진 아미노산들을 빨간 점으로 표시하였다. 빨간 점으로 표시된 아미노산들 중 에스트로겐 수용체 단백질 알파의 아미노산 서열의 421번째 아미노산인 메티오닌을 류신으로 치환하고 521번째 아미노산인 글리신을 알라닌으로 치환하였다.

실시예 2. 아미노산 치환을 위한 뉴클레오티드 돌연변이 플라스미드의 제작

비스페놀 A와의 결합력이 향상된 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 제작하였다.

뉴클레오티드 돌연변이를 위해 pJL2326(pBRαNTD::hERα LBD-FLAG)을 주형으로 사용하여 위치지정 돌연변이법(site-directed mutagenesis) PCR을 진행하였다. 해당 플라스미드 1 μL(약 100 ng)과 치환하고자 하는 염기서열을 포함한 프라이머(forward & reverse) 1 μL(10 μM), 10X pfu 버퍼 2 μL, 10 mM dNTP mix 0.5 μL, pfu turbo polymerase(Agilent) 0.5 μL, dH2O 14 μL로 총 20μL를 PCR 하였다. 대조군(Control)으로는 폴리머라제(polymerase)를 넣지 않은 조건으로 실시였다. PCR 조건은 예비 변성 95℃/1분, 변성 95℃/30초, 풀림 50℃/30초, 확장 68℃/6분, 최종 확장 68℃/6분으로 하여 변성(denaturation), 풀림(annealing) 및 확장(extension) 구간을 16회 반복하여 진행하였다. 이어서. PCR 생성물 10 μL을 젤 전기영동으로 확인한 다음, 나머지 10 μL에 주형 플라스미드를 분해하기 위한 제한효소인 Dpn I을 0.3 μL 처리한 후, 37 ℃에서 1시간 동안 배양(incubation)하였다. 이 후 Dpn I을 처리한 생성물 5μL을 E. coli DH5α 수용성 세포 50 μL에 섞어 0℃에 약 30분 보관 후 42℃의 열을 1분 40초간 가한 뒤 바로 0℃에 5분간 보관하였다. 이 후 선택 플레이트인 암피실린(ampicillin) 플레이트에 플레이팅(plating) 후 37℃로 밤새 배양하였다.(overnight incubation). 추후 획득한 콜로니에서 플라스미드를 준비(preparation)하고 순서화(sequencing)하여 돌연변이 플라스미드를 확인하였다.

실시예 3. 대장균 형질전환

본 발명에 따른 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주를 제조하였다.

먼저, λCI 오퍼레이터가 lacZ 리포터 -62 위치에 있는 F'플라스미드가 들어있는 대장균 균주인 E. coli FW102 OL2-62 (Addgene)의 수용 세포를 제작하였다. OD₆₀₀ (600nm 광에서의 광학밀도)~ 0.4까지 배양한 세포를 수득하였다. 이후 100 mM CaCl₂를 약 4시간 동안 처리하고. 처리한 세포를 다시 수득한 다음, 처음 배양 시 배지 부피의 1/50에 해당하는 부피의 100 mM CaCl₂로 세포들을 풀어준 뒤 사용하였다.

제조된 수용 세포 50μL에 pACλCI::TIF2 BD-FLAG, pBRαNTD::hERα LBD-FLAG 각각의 돌연변이 플라스미드를 1 μL(약 100 ng) 첨가한 후, 0℃에서 약 30분 동안 보관하였다. 이후 42℃의 열을 1분 40초 동안 가해준 뒤 바로 0℃에서 5분 동안 보관하였다. 이어서, LB 배지 1 mL을 넣고 1 시간 동안 37℃에서 배양한 후 선택 마커인 카나마이신(kanamycin) (F'플라스미드 선택), 엠피실린(ampicillin) (pBRαNTD::hERα LBD-FLAG 선택), 클로르암페니콜(chloramphenicol) (pACλCI::TIF2 BD-FLAG selection)이 함유된 배지에 플레이팅 하였다.

실시예 4. β-갈락토시다아제 분석

실시예 4-1. β-갈락토시다아제 분석 방법

본 발명에 따른 박테리아 균주의 에스트로겐성 화합물에 대한 검출능을 측정하기 위해 다음과 같은 시험을 실시하였다.

E. coli FW102 OL2-62 pACλCI::TIF2 BD-FLAG pBRαNTD::hERα LBD-FLAG 각각의 돌연변이 플라스미드 균주를 접종한 후, OD₆₀₀ ~ 0.4까지 배양하였다(20μM IPTG 첨가; λCI-TIF2 BD-FLAG 및 αNTD-hERα LBD -FLAG 발현 위한 유도 물질). 이후, 각 농도에 해당하는 에스트로겐 및 EDCs를 넣고 30분 동안 추가로 배양하였다. 다음으로, 세포를 800 μL 수거하여 완충용액 (Na₂HPO₄ 60 mM, NaH₂PO₄ 40 mM, KCl 10 mM, MgSO₄7H₂O 1 mM, 디티오쓰레이톨 400 μM) 800 μL에 풀어준 뒤, OD600 (세포 함량)을 측정하였다. 이후, 초음파처리를 통해서 세포를 용균시킨 다음, 4 mg/mL ONPG를 160 μL 처리하여 시료의 색상이 황색으로 변하는 시간을 확인하였다. 샘플이 황색으로 변화하면, 1M Na₂CO₃ 400 μL로 반응을 중지시켰다. 이어서, OD₅₅₀ (세포 잔류물)과 OD₄₂₀(황색 정도)을 측정한 다음, 밀러 단위(miller unit) 공식 (1000 * (((OD₄₂₀ - (1.75 * OD550))/(t * v * OD₆₀₀)) 에 대입하여 활성 정도를 확인하였다.

실시예 4-2. 본 발명에 따른 박테리아 균주의 비스페놀 A 검출능 측정

본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 박테리아 균주의 비스페놀 A 검출 능력을 확인하기 위하여 베타 갈락토시다아제 분석 실험을 실시 하였다.

여러 아미노산 치환 돌연변이 중에서 비스페놀 A에 대한 검출 능력이 향상된 것으로 나타났던, 에스트로겐 수용체 단백질의 421번째 아미노산인 메티오닌을 류신으로, 521번째 아미노산인 글리신을 알라닌으로 치환한 LE7341(E. coli FW102 OL2-62 pBRαNTD::hERα(M421L,G521A) LBD-FLAG pACλCI::TIF2 BD-FLAG)과 LE7197(E. coli FW102 OL2-62 pBRαNTD::hERα LBD-FLAG pACλCI::TIF2 BD-FLAG)의 비스페놀 A 검출 능력을 비교하였다. 해당 균주들은 지수기(exponential phase) 지점까지 배양되어 각각 농도에 해당하는 비스페놀 A가 처리되었다. 이후 베타 갈락토시다아제 분석을 통해 리포터 유전자인 lacZ 유전자의 발현을 밀러 단위(miller unit)로 환산하여 표시하였다.

그 결과를 도 2에 나타난 바와 같이, 기존 센서(LE7197)의 경우 100 nM 비스페놀 A가 검출되지 않았지만 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서(LE7341)의 경우 비스페놀 A를 검출할 수 있음을 확인하였고, 1μM 이하 nM 수준의 농도에서도 노이즈 대비 검출 신호가 더 높은 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4-3. 본 발명에 따른 박테리아 균주의 에스트라디올 검출능 측정

본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서의 에스트라디올(estradiol) 검출 능력을 확인하기 위한 베타 갈락토시다아제 분석 실험을 실시하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 에스트로겐 수용체 단백질의 아미노산 치환으로 인해 야기될 수 있는 에스트라디올과의 결합 변화를 확인하기 위해 베타 갈락토시다아제 분석 실험을 진행하였다. 실험 결과 기존의 센서(LE7197)와 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서(LE7341)는 에스트라디올에 대한 검출 능력이 차이가 없음을 확인하였다.

실시예 4-4. 본 발명에 따른 박테리아 균주의 비스페놀 S, 비스페놀 F 및 노닐페놀 검출능 측정

본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서(LE7341)의 비스페놀 S, 비스페놀 F 및 노닐페놀 검출 능력을 확인하기 위한 베타 갈락토시다아제 분석 실험을 실시하였다. 에스트로겐 수용체 단백질의 아미노산 치환으로 인해 다른 환경호르몬 검출 성능에 줄 수 있는 영향을 확인하기 위한 실험을 진행하였고,

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 기존의 센서(LE7197)와 본 발명에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질을 도입한 센서(LE7341)는 비스페놀 S, 비스페놀 F, 그리고 노닐페놀 검출에 큰 차이가 없음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY <120> Mutant estrogen receptor protein having improved binding capacity for Bisphenol A and bacterial strain using the same <130> PD18-035-P1 <150> KR 10-2018-0043812 <151> 2018-04-16 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 595 <212> PRT <213> human estrogen receptor alpha <400> 1 Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His 1 5 10 15 Gln Ile Gln Gly Asn Glu Leu Glu Pro Leu Asn Arg Pro Gln Leu Lys 20 25 30 Ile Pro Leu Glu Arg Pro Leu Gly Glu Val Tyr Leu Asp Ser Ser Lys 35 40 45 Pro Ala Val Tyr Asn Tyr Pro Glu Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Asn Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Asn Ala Gln Val Tyr Gly Gln Thr Gly Leu Pro Tyr 65 70 75 80 Gly Pro Gly Ser Glu Ala Ala Ala Phe Gly Ser Asn Gly Leu Gly Gly 85 90 95 Phe Pro Pro Leu Asn Ser Val Ser Pro Ser Pro Leu Met Leu Leu His 100 105 110 Pro Pro Pro Gln Leu Ser Pro Phe Leu Gln Pro His Gly Gln Gln Val 115 120 125 Pro Tyr Tyr Leu Glu Asn Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Val 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Ala Phe Tyr Arg Pro Asn Ser Asp Asn Arg Arg Gln Gly 145 150 155 160 Gly Arg Glu Arg Leu Ala Ser Thr Asn Asp Lys Gly Ser Met Ala Met 165 170 175 Glu Ser Ala Lys Glu Thr Arg Tyr Cys Ala Val Cys Asn Asp Tyr Ala 180 185 190 Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe 195 200 205 Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala Thr 210 215 220 Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys 225 230 235 240 Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly Gly Ile Arg 245 250 255 Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp 260 265 270 Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala 275 280 285 Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn 290 295 300 Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu 305 310 315 320 Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro 325 330 335 Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg 340 345 350 Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val 355 360 365 Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu 370 375 380 Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly 385 390 395 400 Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys 405 410 415 Cys Val Glu Gly Leu Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser 420 425 430 Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu 435 440 445 Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser 450 455 460 Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp 465 470 475 480 Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr 485 490 495 Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser 500 505 510 His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Ala Met Glu His Leu Tyr Ser Met 515 520 525 Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu 530 535 540 Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val 545 550 555 560 Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser 565 570 575 His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro 580 585 590 Ala Thr Val 595 <210> 3 <211> 1788 <212> DNA <213> human estrogen receptor alpha <400> 3 atgaccatga ccctccacac caaagcatct gggatggccc tactgcatca gatccaaggg 60 aacgagctgg agcccctgaa ccgtccgcag ctcaagatcc ccctggagcg gcccctgggc 120 gaggtgtacc tggacagcag caagcccgcc gtgtacaact accccgaggg cgccgcctac 180 gagttcaacg ccgcggccgc cgccaacgcg caggtctacg gtcagaccgg cctcccctac 240 ggccccgggt ctgaggctgc ggcgttcggc tccaacggcc tggggggttt ccccccactc 300 aacagcgtgt ctccgagccc gctgatgcta ctgcacccgc cgccgcagct gtcgcctttc 360 ctgcagcccc acggccagca ggtgccctac tacctggaga acgagcccag cggctacacg 420 gtgcgcgagg ccggcccgcc ggcattctac aggccaaatt cagataatcg acgccagggt 480 ggcagagaaa gattggccag taccaatgac aagggaagta tggctatgga atctgccaag 540 gagactcgct actgtgcagt gtgcaatgac tatgcttcag gctaccatta tggagtctgg 600 tcctgtgagg gctgcaaggc cttcttcaag agaagtattc aaggacataa cgactatatg 660 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cagataatcg acgccagggt 480 ggcagagaaa gattggccag taccaatgac aagggaagta tggctatgga atctgccaag 540 gagactcgct actgtgcagt gtgcaatgac tatgcttcag gctaccatta tggagtctgg 600 tcctgtgagg gctgcaaggc cttcttcaag agaagtattc aaggacataa cgactatatg 660 tgtccagcca ccaaccagtg caccattgat aaaaacagga ggaagagctg ccaggcctgc 720 cggctccgta aatgctacga agtgggaatg atgaaaggtg ggatacgaaa agaccgaaga 780 ggagggagaa tgttgaaaca caagcgccag agagatgatg gggagggcag gggtgaagtg 840 gggtctgctg gagacatgag agctgccaac ctttggccaa gcccgctcat gatcaaacgc 900 tctaagaaga acagcctggc cttgtccctg acggccgacc agatggtcag tgccttgttg 960 gatgctgagc ccccgatact ctattccgag tatgatccta ccagaccctt cagtgaagct 1020 tcgatgatgg gcttactgac caacctggca gacagggagc tggttcacat gatcaactgg 1080 gcgaagaggg tgccaggctt tgtggatttg accctccatg atcaggtcca ccttctagaa 1140 tgtgcctggc tagagatcct gatgattggt ctcgtctggc gctccatgga gcacccaggg 1200 aagctactgt ttgctcctaa cttgctcttg gacaggaacc agggaaaatg tgtagagggc 1260 ttggtggaga tcttcgacat gctgctggct acatcatctc ggttccgcat 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gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa 1980 gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc 2040 cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg caccattcct tgcggcggcg 2100 gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa tgcaggagtc gcataaggga 2160 gagcgtcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg 2220 ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta tcatgcaact cgtaggacag 2280 gtgccggcag cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct ttcgctggag cgcgacgatg 2340 atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc tcgctcaagc cttcgtcact 2400 ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta tcgccggcat ggcggccgac 2460 gcgctgggct acgtcttgct ggcgttcgcg acgcgaggct ggatggcctt ccccattatg 2520 attcttctcg cttccggcgg catcgggatg cccgcgttgc aggccatgct gtccaggcag 2580 gtagatgacg accatcaggg acagcttcaa ggatcgctcg cggctcttac cagcctaact 2640 tcgatcactg gaccgctgat cgtcacggcg atttatgccg cctcggcgag cacatggaac 2700 gggttggcat ggattgtagg cgccgcccta taccttgtct gcctccccgc gttgcgtcgc 2760 ggtgcatgga gccgggccac ctcgacctga atggaagccg gcggcacctc gctaacggat 2820 tcaccactcc aagaattgga gccaatcaat tcttgcggag aactgtgaat gcgcaaacca 2880 acccttggca gaacatatcc atcgcgtccg ccatctccag cagccgcacg cggcgcatct 2940 cgggcagcgt tgggtcctgg ccacgggtgc gcatgatcgt gctcctgtcg ttgaggaccc 3000 ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt agcagaatga atcaccgata cgcgagcgaa 3060 cgtgaagcga ctgctgctgc aaaacgtctg cgacctgagc aacaacatga atggtcttcg 3120 gtttccgtgt ttcgtaaagt ctggaaacgc ggaagtcagc gccctgcacc attatgttcc 3180 ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac acctacatct gtattaacga 3240 agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc tctggtcccg ccgcatccat accgccagtt 3300 gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg catgttcatc atcagtaacc cgtatcgtga 3360 gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta cccccatgaa cagaaatccc ccttacacgg 3420 aggcatcagt gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt atcagaagcc 3480 agacattaac gcttctggag aaactcaacg agctggacgc ggatgaacag gcagacatct 3540 gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag ctgcctcgcg cgtttcggtg 3600 atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag 3660 cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg 3720 gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc 3780 atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 3840 aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 3900 ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 3960 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 4020 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 4080 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 4140 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 4200 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 4260 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 4320 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 4380 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 4440 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 4500 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 4560 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 4620 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 4680 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 4740 ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 4800 tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 4860 atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 4920 tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 4980 aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 5040 catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 5100 gcgcaacgtt gttgccattg ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 5160 ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 5220 aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 5280 atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 5340 cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 5400 gagttgctct tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 5460 agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 5520 gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 5580 caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 5640 ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 5700 tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 5760 aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat 5820 catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttggataac caga 5874 <210> 6 <211> 3934 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAClCI::TIF2 BD-FLAG sequence <400> 6 gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60 gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120 ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180 tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240 aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300 ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360 ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420 ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgaatg ctgccaactt actgattagt gtatgatggt 480 gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540 acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 600 ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 660 aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 720 actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 780 ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 840 agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc 900 agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttcccctg gcggctccct 960 cgtgcgctct cctgttcctg cctttcggtt taccggtgtc attccgctgt tatggccgcg 1020 tttgtctcat tccacgcctg acactcagtt ccgggtaggc agttcgctcc aagctggact 1080 gtatgcacga accccccgtt cagtccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 1140 agtccaaccc ggaaagacat gcaaaagcac cactggcagc agccactggt aattgattta 1200 gaggagttag tcttgaagtc atgcgccggt taaggctaaa ctgaaaggac aagttttggt 1260 gactgcgctc ctccaagcca gttacctcgg ttcaaagagt tggtagctca gagaaccttc 1320 gaaaaaccgc cctgcaaggc ggttttttcg ttttcagagc aagagattac gcgcagacca 1380 aaacgatctc aagaagatca tcttattaat cagataaaat atttctagat ttcagtgcaa 1440 tttatctctt caaatgtagc acctgaagtc agccccatac gatataagtt gtaattctca 1500 tgtttgacag cttatcatcg ataagctaat tctcactcat taggcacccc aggctttaca 1560 ctttatgctt ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 1620 aaacagcgta tgagcacaaa aaagaaacca ttaacacaag agcagcttga ggacgcacgt 1680 cgccttaaag caatttatga aaaaaagaaa aatgaacttg gcttatccca ggaatctgtc 1740 gcagacaaga tggggatggg gcagtcaggc gttggtgctt tatttaatgg catcaatgca 1800 ttaaatgctt ataacgccgc attgcttgca aaaattctca aagttagcgt tgaagaattt 1860 agcccttcaa tcgccagaga aatctacgag atgtatgaag cggttagtat gcagccgtca 1920 cttagaagtg agtatgagta ccctgttttt tctcatgttc aggcagggat gttctcacct 1980 gagcttagaa cctttaccaa aggtgatgcg gagagatggg taagcacaac caaaaaagcc 2040 agtgattctg cattctggct tgaggttgaa ggtaattcca tgaccgcacc aacaggctcc 2100 aagccaagct ttcctgacgg aatgttaatt ctcgttgacc ctgagcaggc tgttgagcca 2160 ggtgatttct gcatagccag acttgggggt gatgagttta ccttcaagaa actgatcagg 2220 gatagcggtc aggtgttttt acaaccacta aacccacagt acccaatgat cccatgcaat 2280 gagagttgtt ccgttgtggg gaaagttatc gctagtcagt ggcctgaaga gacgtttggc 2340 gcggccgcag agagagctga cgggcagagc agactgcatg acagcaaagg gcagaccaaa 2400 ctcctgcagc tgctgaccac caaatctgat cagatggagc cctcgccctt agccagctct 2460 ttgtcggata caaacaaaga ctccacaggt agcttgcctg gttctgggtc tacacatgga 2520 acctcgctca aggagaagca taaaattttg cacagactct tgcaggacag cagttcccct 2580 gtggacttgg ccaagttaac agcagaagcc acaggcaaag acctgagcca ggagtccagc 2640 agcacagctc ctggatcaga agtgactatt aaacaagagc cggtgagccc caagaagaaa 2700 gagaatgcac tacttcgcta tttgctagat aaagatgata ctaaagatat tggtttacca 2760 gaaataaccc ccaaacttga gagactggac agtaagacag atcctgccag taacacaaaa 2820 ttaatagcaa tgaaaactga gaaggaggag atgagctttg agcctggtga ccagcctggc 2880 agtgagctgg acaacttgga ggagattttg gatgatttgc agaatagtca attaccacag 2940 cttttcccag acacgaggcc aggcgcccct gctggatcag ttgacaagca agccatcatc 3000 aatgacctca tgcaactcac agctgaaaac agccctgtca cacctgttgg agcccagaaa 3060 acagcactgc gaatttcaca gagcactgat tataaagatg atgatgataa ataaggatcc 3120 ttaccttaca gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg 3180 tattaacgaa gcgctaaccg tttttatcag gctctgggag gcagaataaa tgatcatatc 3240 gtcaattatt acctccacgg ggagagcctg agcaaactgg cctcaggcat ttgagaagca 3300 cacggtcaca ctgcttccgg tagtcaataa accggtaaac cagcaataga cataagcggc 3360 tatttaacga ccctgccctg aaccgacgac cgggtcgaat ttgctttcga atttctgcca 3420 ttcatccgct tattatcact tattcaggcg tagcaccagg cgtttaaggg caccaataac 3480 tgccttaaaa aaattacgcc ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt aattcattaa 3540 gcattctgcc gacatggaag ccatcacaga cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca 3600 tcagcacctt gtcgccttgc gtataatatt tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt 3660 tgtccatatt ggccacgttt aaatcaaaac tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga 3720 cgaaaaacat attctcaata aaccctttag ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg 3780 ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga 3840 gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga aaacggtgta acaagggtga acactatccc 3900 atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca tacg 3934

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 에스트로겐 수용체 단백질의 421번째 메티오닌을 류신으로 치환하고 521번째 글리신을 알라닌으로 치환한 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질.
제 1 항에 있어서,
상기 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질.
제 1 항에 있어서,
상기 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질은 비스페놀 A 특이적 결합능을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질.
제 1 항에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 부위(hERα(M421L,G521A) LBD)를 코딩하는 유전자가 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드; 및
TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 λCI 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드;
에 의해서 형질전환된(transformed), 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
제 4 항에 있어서,
상기 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 부위(hERα(M421L,G521A) LBD)를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 에스트로겐 수용체 단백질(hERα LBD(M421L,G521A)) 및 상기 αNTD 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
제 5 항에 있어서,
상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 TIF2 단백질 및 상기 λCI 단백질의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
제 4 항에 있어서,
상기 제1항에 따른 돌연변이 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 부위(hERα(M421L,G521A) LBD)를 코딩하는 유전자가 αNTD 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
제 4 항에 있어서,
상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 λCI 단백질을 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주.
제 4 항에 있어서,
상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 hERα(M421L,G521A) LBD 단백질을 코딩하는 유전자는, 인간 게놈 DNA로부터 mRNA를 전사하고, 상기 mRNA에 대한 스플라이싱 과정을 통해서 인트론이 제거된 mRNA를 제조한 다음, 상기 인트론이 제거된 mRNA에 대한 역전사 과정을 통해서 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주.
제 4 항에 있어서,
상기 박테리아 균주는 대장균(Escherichia coli) 균주, 고초균(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 및 유산균으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 균주인 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주.
제 4 항에 있어서,
상기 에스트로겐성 화합물은 노레틸노드렐, 5α-안드로스탄, 도데실페놀, 옥틸페놀, 비스페놀 A, 비스페놀 S, 비스페놀 F, 2-에틸헥실-4-히드록시벤조에이트, 4,4'-디히드록시벤조페논, 2,4-디히드록시벤조페논, 디히드록시메톡시클로르올레핀, o,p'-DDT, 디히드록시메톡시클로르, 2',3',4',5'-테트라클로로-4-비페닐올, 노르디히드로구아이 아레틱산, 아우린, 페놀프탈레인 및 페놀 레드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주.
제 4 항에 따른 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 박테리아 균주를 제조하는 단계;
상기 박테리아 균주에 에스트로겐성 화합물을 함유한 시료를 첨가하고 배양하는 단계; 및
상기 배양된 박테리아 균주를 용균한 다음, 리포터 단백질의 발현 정도를 분석하는 단계;
를 포함하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법.
제 12 항에 있어서,
상기 리포터 단백질은 베타-갈락토시다아제, 형광 발광 단백질 또는 항생제 내성 부여 단백질인 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법.
제 12 항에 있어서,
상기 리포터 단백질의 발현 정도는 UV-VIS 스펙트로포토미터에 의해서 수행하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법.
제 13 항에 있어서,
상기 형광 발광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 적색 형광 단백질(RFP) 또는 루시퍼라아제인 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법.
제13항에 있어서,
상기 베타-갈락토시다아제의 발현 정도는 상기 용균 이후에, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해 주고, 발현 정도를 분석함으로써 수행하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법.