KR20100075856A - 조절가능한 형태의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인 및 이를 포함하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조절가능한 형태의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 분리된 단백질, 이를 제조하는 방법, 리간드 동정을 위한 이의 용도, 분리된 단백질을 포함하는 시험 시스템 및 시험 시스템을 사용하여 핵 수용체에 대한 리간드를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

조절가능한 형태의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인 및 이를 포함하는 방법{Ligand binding domains of nuclear receptors in controllable form and methods involving the same}

본 발명은 조절가능한 형태의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 분리된 단백질, 이를 제조하는 방법, 리간드 동정을 위한 이의 용도, 분리된 단백질을 포함하는 시험 시스템 및 시험 시스템을 사용하여 핵 수용체에 대한 리간드를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

핵 수용체는 세포내에서 발견되고 호르몬 및 비타민과 같은 리간드의 시그날을 유도하는 상위계열의 단백질이다. 반응시 효능제 활성화된 핵 수용체는 보통 일반적으로 다른 단백질과 함께 활성화 즉시 특이적 유전자의 발현을 증가시킨다.

따라서, 핵 수용체는 효능제 유도된 전사 인자로서 작용하고 이는 직접적으로 단량체, 동종이량체 또는 이종이량체로서 시그날 전달 경로를 통해서 뿐만 아니라 표적 유전자의 DNA 반응 요소와 작용한다. 막 수용체 및 막 연합 수용체와는 대조적으로 핵 수용체는 세포내에, 세포질 또는 핵내에 위치한다. 따라서, 핵 수용체는 진핵세포에서 발견되는 세포간 가용성 리간드 조절 인자 부류를 포함한다. 핵 수용체는 직접 DNA에 결합하여 인접한 유전자들의 발현을 조절하는 능력을 갖고 따라서 이들 수용체는 전사 인자로서 분류된다. 상기된 바와 같이, 핵 수용체에 의한 유전자 발현의 조절은 리간드 의존성이고 이때, 핵 수용체는 통상적으로 효능제의 존재하에서만 활성이다. 핵 수용체에 결합하는 리간드는 수용체내 형태 변화를 유발하고 이는 다시 수용체를 활성화시켜 일반적으로 유전자 발현을 상향 조절한다.

직접적으로 작용하여 게놈 DNA의 발현을 조절하는 이들의 독특한 능력으로 인해, 핵 수용체는 유기체의 발달 및 항상성에서 주요 역할을 수행한다.

상위계열의 핵 수용체의 구성원은 4개의 모듈 도메인의 전체 구조적 모티프를 나타낸다:

- 가변성 아미노 말단 도메인(또한 N-말단 조절 도메인으로서 언급됨)은 활성화 기능 1(AF-1)을 함유하고 이의 작용은 리간드의 존재와는 무관하다. AF-1의 전사 활성화는 통상적으로 약하지만 AF-2와 공동상승 작용하여 유전자 발현을 상향조절한다. 당해 도메인은 다양한 핵 수용체간의 서열에 있어서 매우 가변성이다.

- 고도로 보존된 DNA 결합 도메인(DBD)는 2개의 아연 핑거를 함유하고 호르몬 반응 요소(HRE)와 결합한다.

- 덜 보존된 리간드 결합 도메인(LBD)은 서열에 있어서 단지 중간정도로 보존되어 있지만 다양한 핵 수용체간의 구조에 있어서 고도로 보존되어 있다. LBD의 구조는 알파-나선 샌드위치 폴드로서 언급된다. 리간드 결합 공극은 "샌드위치 필링(filling)"을 형성하는 3개의 역평행 알파 나선 바로 아래 LBD의 내부에 있다. DBD와 함께 LBD는 수용체의 이량체화 접지면에 기여하고 추가로 보조-활성화인자 및 보조-리프레서 단백질에 결합한다. 추가로, 이것은 활성화 기능 2(AF-2)를 함유하고 이의 활성화는 결합된 리간드의 존재에 의존하고 AF-1(상기 참조)과 공동상승작용한다.

- 가변성 카복시 말단 도메인은 다양한 핵 수용체간의 서열에 있어서 가변성이다.

일례로서, RORα1의 구조는 도 1A에 나타낸다.

이들의 작용 기작 및 리간드 부재하에 세포내 분포에 따라 핵 수용체(NR)은 4가지 부류로 분류된다.

I형 NR은 사이토졸에 위치한 핵 수용체이다. 리간드의 I형 NR로의 결합은 열 쇼크 단백질을 해리시키고 동종 이량체화하고 핵으로 이동시켜 다양한 길이의 DNA에 의해 분리되어 있고 제2 절반 부위가 제1 절반 부위로부터 역위된 서열(역위 반복체)을 갖는 2개의 절반 부위로 이루어진 HRE와 결합한다. 핵 수용체/DNA 복합체의 형성 후 HRE의 다운스트림 DNA를 mRNA로 전사하는 기타 단백질이 보충되고 당해 단백질은 궁극적으로 세포 기능에 변화를 유발하는 단백질이다.

II형 NR은 리간드의 존재 및 부재하에 핵내에 유지된다. 이들은 이종이량체로서(통상적으로 RXR과 함께) DNA에 결합한다. 리간드의 부재하에 II형 NR은 흔히 보조-리프레서 단백질과 복합체화된다. 핵 수용체에 결합하는 리간드는 보조-리프레서를 해리시키고 보조-활성화인자 단백질과 DNA의 mRNA로의 해독을 수행하는 RNA 폴리머라제를 포함하는 추가의 단백질을 다시 사용하게 한다.

III형 핵 수용체는 I형 NR과 유사하지만 역위된 반복체 대신에 직접적인 반복체에 결합한다.

IV형 NR은 단량체 또는 이량체로서 결합하지만 수용체의 단일 DNA 결합 도메인이 절반 부위 HRE에 결합한다.

상기 상세히 기재된 바와 같이, 리간드 결합 즉시 활성화되고 HRE에 결합된 핵 수용체는 연합된 표적 유전자의 mRNA로의 전사를 변형시키는 상당수의 다른 단백질을 동원한다. 이들 전사 보조 조절인자의 기능은 다양하고 표적 유전자를 다소 전사에 근접하도록 하거나 다른 보조 조절 단백질의 결합을 안정화시키기 위한 기능을 브릿징하기 위한 크로마틴 리모델링을 포함한다. 보조 조절 단백질(또한 보조 인자로서 언급됨)은 보조 활성화 인자일 수 있고 이는 흔히 고유 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 활성을 갖고 이러한 활성은 히스톤의 DNA로의 연합을 약화시키고 따라서 히스톤을 촉진시킨다. 이와는 대조적으로 바람직하게 효능제의 결합시 NR에 결합되는 보조-리프레서는 히스톤의 DNA로의 연합을 촉진시키는 히스톤 데아세틸라제(HDAC)를 동원하고 따라서 전사를 억제한다.

핵 수용체 상위계열의 구성원은 글루코코르티코이드(GR), 안드로겐(AR), 미네랄로코르티코이드(MR), 프로게스틴(PR), 에스트로겐(ER), 갑상선 호르몬(TR), 비타민 D (VDR), 레티노이드(RAR 및 RXR), 퍼옥시좀(XPAR 및 PPAR) 및 이코사노이드(IR)에 대한 수용체와 같은 수용체를 포함한다.

발달 및 항상성에서의 이들 역할로 인해, 핵 수용체는 특정 기능에서의 이들의 관여를 연구하기 위한 흥미로운 표적이다. 추가로, 핵 수용체의 일부는 이의 천연 리간드가 아직 공지되지 않은 소위 "오판(orphan) 수용체"이다. 따라서, 아직 공지되지 않은 천연 리간드를 동정하는 것이 특정 관심 대상이다. 추가로, 신체의 생리학적 및 병리 생리학적 기능에서 이들의 관여로 인해, 핵 수용체는 약리학적 과학 분야에서 흥미로운 표적이다. 핵 수용체와 보조 조절인자 간의 기능성 상호작용에 대한 데이터는 광범위한 질환에 대해 신규한 약제학적 치료제의 개발에 새로운 기회를 부여한다. 스테로이드 수용체와 함께 세포 증식에 관여하는 보조 활성화 인자 및 보조-리프레서의 역할을 밝히는 임상학적 전략은 예를 들어, 암에 대한 새로운 치료를 부여할 수 있다. 추가로, 에너지 대사에 관여하는 보조 조절인자 및 시그날 전달 수용체의 기능적 중요성은 손상된 에너지 대사를 갖는 질환에 대한 새로운 기회를 부여할 수 있다.

그러나, 조절가능한 형태의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는, 특히 ROR알파에 대한 단백질을 분리할 수 없었다.

놀랍게도, 본 발명자는 조절가능한 형태의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 분리된 단백질을 제공하는데 성공했다. 당해 단백질은 적합한 조건하에 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하고 세포 배양물로부터 단백질을 분리함에 의해 제조될 수 있다. 이후, 분리된 단백질은 세제, 특히 리튬 도데실 설페이트(LDS)와 접촉시켜 분리된 단백질의 조절능을 복구시켰다.

따라서, 본 발명의 제1 측면은 조절가능한 형태의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 분리된 단백질에 관한 것이다.

핵 수용체의 리간드 결합 도메인(또한 상기 참조)은 리간드 결합에 반응하여 작용하는 핵 수용체의 도메인이고 이는 핵 수용체에서 형태적 변화를 유발하여 반응을 유도함으로써 분자 스위치로서 전사 활성을 가동시키는 작용을 한다. 리간드 결합 도메인은 유연한 단위체이고 여기서 리간드의 결합은 이의 형태를 안정화시켜 보조 인자 결합이 수용체 활성을 변형시키도록 한다. 보조 활성화 인자는 리간드 결합 도메인의 동일한 말단에서 활성화 인자 기능 2(AF-2)에 결합할 수 있다. 상이한 리간드의 결합은 리간드 결합 도메인의 형태를 변형시켜 궁극적으로 핵 수용체의 DNA 결합 도메인의 DNA 결합 특이성에 영향을 준다. 다양한 핵 수용체의 리간드 결합 도메인은 당업계에서 널리 공지되어 있고 예를 들어, EMBL-EBI(www.ebi.ac.uk) 또는 InterPro: IPR000536 (참조: http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz? [interpro-AccNumber : EPR000536]+-e)에 요약되어 있다.

적합한 리간드 결합 도메인의 예는 다음을 포함한다:

- 레티노산 수용체 관련 오판 수용체 알파 1(ROR 알파 1)의 271번 내지 523번 아미노산

- 레티노산 수용체 관련 오판 수용체 베타(ROR 베타)의 267번 내지 459번 아미노산

- 레티노산 수용체 관련 오판 수용체 감마(ROR 감마)의 325번 내지 318번 아미노산,

- 간세포 핵 인자 알파 1(HNF4 알파 1)의 192번 내지 464번 아미노산

- 간세포 핵 인자 알파 2(HNF4 알파 2)의 192번 내지 474번 아미노산

- 에스트로겐 관련 수용체 알파(ERR 알파)의 233번 내지 423번 아미노산

- 에스트로겐 관련 수용체 베타(ERR 베타)의 248번 내지 500번 아미노산

- 에스트로겐 관련 수용체 감마(ERR 감마)의 250번 내지 435번 아미노산

핵 수용체는 임의의 공지된 핵 수용체일 수 있다. 이들의 서열 상동성에 따라 핵 수용체는 7개의 하위 계열로 나누어진다.

하위계열 1은 갑상선 호르몬 수용체-α 및 -β, 레티노산 수용체-α, -β 및 -γ, 퍼옥시좀 증식 인자-활성화된 수용체-α, -β/δ, γ, Rev-ErbA-α 및 -β, RAR 관련 오판 수용체 α, β 및 γ, 간 X 수용체 α형 및 β형, 파르네소이드 X 수용체, 비타민 D 수용체, 프레그난 X 수용체 및 구성적 안드로스탄 수용체를 포함하는 갑상선 호르몬 수용체를 포함한다.

하위계열 2는 예를 들어 간세포 핵 수용체-4 (α 및 γ), 레티노산 X 수용체(α, β 및 γ), 고환 수용체(2 및 4), 드로소필라 꼬리없는 유전자의 사람 동족체, 광수용체 세포 특이적 핵 수용체, 닭 난알부민 업스트림 프로모터-전사 인자(I 및 II) 및 관련 V-erbA를 포함하는 레티노산 X 수용체형에 관한 것이다.

하위계열 3은 무엇보다 에스트로겐 수용체(α 및 β), 에스트로겐 관련 수용체(α, β 및 γ), 코르티코이드 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 프로게스테론 수용체 및 안드로겐 수용체를 포함하는 에스트로겐 수용체형에 관한 것이다.

하위계열 4는 신경 성장 인자 IB, 핵 수용체 관련 1 및 뉴런 유래 오판 수용체 1과 같은 수용체를 포함하는 신경 성장 인자 IB형에 관한 것이다.

하위계열 5는 예를 들어, 스테로이드성 인자 1 및 간 수용체 동족체-1을 포함하는 스테로이드성 인자형에 관한 것이다.

하위계열 6은 생식 세포 핵 인자를 포함하는 생식 세포 핵 인자형에 관한 것이다.

하위계열 0으로서 언급되는 추가의 하위계열은 X 염색체상의 용량 민감성 성 반전, 아드레날린 형성저하증 중요 영역, 유전자 1 (DAXl), 2개의 DNA 결합 도메인(2DBD-NR)을 갖는 소형 이종이량체 파트너 및 핵 수용체와 같은 기타 수용체를 포함한다.

본 발명에 따라, 핵 수용체의 리간드 결합 도메인은 분리된 단백질내에 포함된다. 본 발명에 따라 분리된 단백질은 천연 환경에 있지 않는 단백질에 관한 것이다. 따라서, "분리된 단백질"은 단백질과 연합되어 있지 않고 통상적으로 천연에서 발견되거나 이것이 존재하는 세포로부터 분리되거나 이를 암호화하는 핵산이 발현되는 세포로부터 분리되거나 동일한 세포 공급원으로부터 기타 단백질이 필수적으로 없는 세포로부터 분리된 것이다. 당해 단백질은 천연적으로 존재하는 단백질, 바람직하게는 천연적으로 존재하는 핵 수용체 또는 이의 일부일 수 있고 이때 당해 일부는 리간드 결합 도메인을 포함한다. 그러나, 당해 단백질은 또한 인공일 수 있고 이것은 천연적으로 존재하지 않거나 리간드 결합 도메인에 천연적으로 결합되어 있지 않은 하나 이상의 섹션을 포함할 수 있는, 예를 들어, 핵 수용체의 리간드 결합 도메인 및 예를 들어, 정제 또는 검출 목적을 위해 사용되는 제2 도메인과 같은 추가의 단백질을 포함하거나 이들로 이루어진 융합 단백질이다.

바람직하게, 용어 "분리된 단백질"은 필수적으로 천연 환경의 기타 세포 성분으로부터 분리된 단백질 분자를 의미한다. 그러나, 단백질의 분리 후, 세포 성분은 다시 예를 들어, 시그날 전달 경로를 측정하기 위해 첨가될 수 있다. 추가로, 당업자는 분리된 단백질이 분리된 단백질의 활성을 허용하는 적합한 조건(예를 들어, 적합한 완충제, pH 값, 이온 등)하에서 유지되어야만 하는 것으로 이해한다.

핵 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 분리된 단백질의 언급에서 "조절가능한 형태"는 효능제가 리간드 결합 도메인에 결합하는 즉시 여전히 활성화될 수 있는 단백질에 대한 것이다. 상기된 바와 같이, LBD는 효능제 리간드가 당해 리간드 결합 도메인에 결합하는 즉시 활성화되고 이는 표적 유전자의 유전자 발현을 변형시킨다. 그러나, 지금까지 제어되거나 조절될 수 있는 핵 수용체의 LBD를 포함하는 ROR알파 단백질 또는 많은 다른 분리된 단백질을 제조할 수 없었다. 즉, 각각의 LBD에 대한 효능제 리간드의 존재 또는 부재하에 활성에는 어떠한 유의적인 차이가 없거나 거의 차이가 없었다.

따라서, 조절가능한 형태의 본 발명의 분리된 단백질은 각각의 LBD에 대한 효능제 리간드의 존재 또는 부재하의 활성을 비교함에 의해 검출될 수 있다. LBD의 활성은 임의의 적합한 방식, 예를 들어, 각각의 시그날 전달 경로의 임의의 다운스트림 성분, 예를 들어, 보조 조절인자 및/또는 표적 DNA에 결합하는 것과 같은 각각의 시그날 전달 경로의 다운스트림 요소에 대한 영향력을 결정함에 의해 결정될 수 있다. 당해 작업의 예는 실시예 2에 기재되어 있고 도 1C에서 설명하고 있다.

바람직하게, 조절가능한 형태의 NR의 LBD를 포함하는 분리된 단백질의 활성은, 효능제 리간드의 존재하의 활성이 각각의 LBD에 대한 효능제 리간드의 부재하의 활성과 비교되는 경우 1.2 이상, 보다 바람직하게는 1.5 이상, 보다 더 바람직하게는 2, 3, 4 또는 5 이상 및 가장 바람직하게는 10 이상이다. 본 발명의 분리된 단백질은 특히 조절가능한 형태의 NR의 리간드 결합 도메인을 포함하는 분리된 단백질에 관한 것이고 이때 당해 단백질은 항상성으로 활성이지 않고 이는 당해 단백질이 각각의 LBD에 대한 효능제 리간드의 부재하에서 활성이지 않음을 의미한다.

본 발명의 하나의 양태에서, 분리된 단백질은 천연적으로 존재하는 핵 수용체의 완전한 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 또는, 분리된 단백질은 천연적으로 존재하는 핵 수용체의 일부를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있고, 단 LBD는 여전히 핵 수용체의 일부 중에 존재한다.

당해 분리된 단백질은 상기된 바와 같은 핵 수용체를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 핵 수용체는 분리된 단배질일 수 있고 이는 예를 들어, 단백질의 정제를 용이하게 하거나 단백질을 검출하거나 단백질의 활성을 측정하기 위해 추가의 도메인에 융합될 수 있다.

상기된 바와 같이, 분리된 단백질은 또한 핵 수용체의 LBD가 단백질의 일부인 이상 핵 수용체의 일부를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 따라서, 분리된 단백질은 또한 아미노 말단 조절 도메인, DNA 결합 도메인, DNA 결합 도메인과 리간드 결합 도메인을 연결하는 힌지 영역 및/또는 핵 수용체의 카복시-말단 도메인을 포함할 수 있다. 추가의 도메인 및 영역은 서로 무관할 수 있고 LBD로서 동일한 핵 수용체로부터 유래되거나 하나 이상의 핵 수용체로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 핵 수용체는 레티노산 수용체-관련 오판 수용체(ROR), 특히 RORα, RORβ 또는 RORγ, 특히 RORα이다.

오판 수용체 ROR은 또한 RZR로서 언급되고 처음에 어떠한 리간드도 동정되지 않은 하위계열의 핵 수용체를 구성한다. 현재, 3가지 서브타입의 ROR 수용체, 즉 RORα, RORβ 및 RORγ가 동정되었다. ROR 수용체는 단량체 또는 이량체로 각각 PuGGTCA 형의 서열에 선행하는 A/T가 풍부한 서열로 이루어진 특이적 반응 요소에 결합하고 표적 유전자의 전사를 조절한다.

선택적 스플라이싱 후, RORα 유전자는 4개의 이소형 α1, α2, α3 및 α4 RZRA을 유도하고 이들은 N-말단 도메인이 상이하며 DNA 인지 및 독특한 트랜스활성화 성질을 보여준다.

핵 수용체에 대하여 임의의 포유동물 ROR 수용체가 바람직하고 사람 ROR 수용체는 보다 더 바람직하다.

RORα(또한 RAR 관련 오판 수용체 A, RZRA, ROR1, ROR2, ROR3, NR1F1으로서도 언급됨)는 서열 분석되었으며 이의 서열은 기관 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 데이터 뱅크로부터 기탁 번호 U04897하에 입수가능하며 이는 사람 mRNA 및 단백질 서열을 제공한다. RORα에 대한 공지된 효능제 리간드는 콜레스테롤, 이의 유도체 및 능히 멜라토닌을 포함한다.

RORβ(또한 RAR 관련 오판 수용체 B, RZRB, NR1F2로서도 언급됨)는 서열 분석되었으며 이의 서열은 기관 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 데이터 뱅크로부터 기탁 번호 Y08639하에 입수가능하며 이는 사람 mRNA 및 단백질 서열을 제공한다. RORβ에 대한 공지된 효능제 리간드는 레티노산이다.

RORγ(또한 RAR 관련 오판 수용체 C, RZRG, RORG, NR1F3, TOR로서도 언급됨)는 서열 분석되었으며 이의 서열은 기관 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 데이터 뱅크로부터 기탁 번호 U16997하에 입수가능하며 이는 사람 mRNA 및 단백질 서열을 제공한다.

ROR의 3가지 형태는 다음을 포함하는 다수의 중요한 역할을 수행한다:

- RORα: 소뇌의 발육, 골 유지, 림프절 발육, 면역 반응, 골격근의 발육, 평활근 세포의 분화, 지질 대사(질환: 예를 들어, 소뇌 퇴화, 골다공증, 허혈 유도된 혈관형성, 죽상동맥경화증, 염증 질환)

- RORβ: 중추신경계

- RORγ: 면역 반응, 골격근, 지방세포 분화

특히, 조절가능한 형태의 RORα의 리간드 결합 도메인을 포함하는 분리된 단백질이 바람직하다. 완전한 길이의 RORα 단백질은 523개 아미노산으로 이루어지고, 여기서 271번 내지 523번의 아미노산은 리간드 결합 도메인을 암호화하고 있다. 특히 바람직한 단백질은 서열번호 1에 나타낸다:

(서열번호 1)

태그 및 절단 부위 뿐만 아니라 상기 도메인을 포함하는 예시적인 서열은 다음과 같다:

(서열번호 2)

분리된 단백질은 His-태그(HHHHHH; 서열번호 3)와 RORα1의 270번 아미노산에 삽입된 PreScission 절단 부위(LEVLFQGP; 서열번호 4)와 함께 서열번호 1의 도메인을 포함한다. 그러나, His-태그는 또 다른 적합한 태그(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 및 또 다른 적합한 절단 부위(예를 들어, 하기에 기재된 바와 같은)로 대체될 수 있다. 이들의 예는 도 1B에 나타낸다.

본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 분리된 단백질은 마커, 특히 태그를 포함한다.

본 발명에서 마커는 용이하게 검출될 수 있는 임의의 종류의 분자일 수 있다. 본 발명에서, 당해 분자는 분리된 단백질에 결합하고 따라서 마커의 존재는 분리된 단백질의 존재를 나타낸다. 마커(또한 표지로서도 언급됨)는 당업자에게 공지되어 있고 예를 들어, 방사선표지(예를 들어 ³H, ³²P, ³⁵S 또는 ¹⁴C), 형광 마커(예를 들어, 플루오레세인, 녹색 형광 단백질, 또는 DyLight 488), 효소(예를 들어, 서양고추냉이 옥시다제, β-락타마제, 알칼리성 포스파타제 또는 β-글루코시다제) 또는 적합한 항체 또는 항체 단편에 의해 검출될 수 있는 항원을 포함한다.

바람직하게, 마커는 태그이다. 태그는 일반적으로 생화학적 지시기로서 사용되는 단백질이다. 이들은 재조합 발현된 단백질과 같은 단백질에 포함될 수 있고 여러 목적으로 사용될 수 있다. 바람직하게, 이들은 특정 태그를 위해 적합한 표준 조건을 사용하여 이들이 부착된 단백질을 정제하기 위해 사용된다. 그러나, 당해 태그는 또한 특정 단백질의 존재를 검출하기 위한 지시기로서 사용될 수 있다.

다수의 (친화성) 태그는 현재에 공지되어 있다. 이들은 일반적으로 이들의 크기에 따라 3가지 부류로 나누어진다: 소형 태그는 최대 12개의 아미노산을 갖고 중간 크기의 태그는 최대 60개 아미노산을 갖고 대형 태그는 60개 초과의 아미노산을 갖는다. 소형 태그는 Arg-태그, His-태그, Strep-태그, Flag-태그, T7-태그, V5-펩타이드-태그 및 c-Myc-태그를 포함하고, 중간 크기의 태그는 S-태그, HAT-태그, 칼모듈린-결합 펩타이드, 키틴-결합 펩타이드 및 몇몇 셀룰로스 결합 도메인을 포함한다. 후자는 189개 이하의 아미노산을 함유하고 GST-(글루타티온-S-트랜스퍼라제) 및 MBP-태그(말토스 결합 단백질-태그)와 같이 대형 친화성 태그로서 간주된다.

특히 순수한 단백질을 제조하기 위해, 소위 이중 태그 또는 반복 태그가 개발되었다. 이 경우에 당해 단백질은 2개의 별도의 크로마토그래피 단계로 정제되고 각각의 경우 제1 태그의 친화성에 이어서 제2 태그의 친화성을 사용한다. 당해 이중 또는 반복 태그의 예는 GST-His-태그 (폴리히스티딘-태그에 융합된 글루타티온-S-트랜스퍼라제), 6xHis-Strep-태그 (Strep-태그에 융합된 6개의 히스티딘 잔기), 6xHis-태그l00-태그 (포유동물 MAP-키나제 2의 12개 아미노산 단백질에 융합된 6개 히스티딘), 8xHis-HA-태그 (헤마글루티닌-에피토프-태그에 융합된 8 히스티딘 잔기), His-MBP (말토스-결합 단백질에 융합된 His-태그), FLAG-HA-태그(헤마글루티닌-에피토프-태그에 융합된 FLAG-태그), 및 FLAG-Strep-태그이다.

바람직하게, 본 발명의 분리된 단백질은 His-태그, Arg-태그, Strep-태그, Flag-태그, T7-태그, V5-펩타이드-태그, c-Myc-태그, S-태그, HAT-태그, 칼로듈린-결합 펩타이드-태그, 키틴-결합 펩타이드-태그, GST-태그 및 MBP-태그로 이루어진 그룹으로부터 선택된 태그를 포함한다. 그러나, 임의의 다른 태그가 또한 사용될 수 있지만 His-태그, Arg-태그, Strep-태그, Flag-태그 또는 GST-태그와 같은 몇몇 태그가 바람직하다.

본 발명의 하나의 양태에서 분리된 단백질은 마커 또는 태그를 포함하고 이때 마커 또는 태그는 특이적 절단 부위, 예를 들어, 효소를 위한 절단 부위에서 단백질 분해 절단에 의해 단백질로부터 제거될 수 있다. 이것은 LBD와 마커 또는 태그 사이에 위치할 수 있다. 절단 부위는 예를 들어, 프로테아제 절단 부위일 수 있다. 프로테아제의 예는 키모트립신, 트립신, 엘라스타제 및 플라스민이고; 상응하는 절단 부위는 당업자에게 공지되어 있다. 정제될 분자가 단백질이기 때문에, 특이적 프로테아제, 특히 정상적으로 식물을 공격하는 바이러스 기원의 프로테아제가 바람직하다. 적합한 특이적 프로테아제의 예는 트롬빈, 인자 Xa, 이가제, "타바코 에치 바이러스(Tobacco Etch Virus)" 기원의 TEV-프로테아제, 프로테아제 PreScission (사람 리노바이러스 3C 프로테아제(Human Rhinovirus 3C Protease)), 엔테로키나제 또는 Kex2이다. TEV-프로테아제 및 PreScission이 특히 바람직하다.

LBD, His-태그 및 정확한 절단 부위를 포함하는 단백질의 예는 서열번호 2에 기재되어 있다. 당해 단백질을 암호화하는 적합한 핵산 및 벡터는 각각 서열번호 5 및 서열번호 6에 나타낸다. 추가로, 본 발명의 예시적인 분리된 단백질은 도 1B에 도시되어 있다.

서열번호 6의 벡터의 뉴클레오타이드 4021번 내지 5040번:

- 상부 핵산 서열: 암호화 쇄(서열번호 5)

- 하부 핵산 서열: 주형 쇄

- 아미노산 서열: His-태그 및 PreScission 절단 부위(서열번호 2)를 갖는 LBD (서열번호 1에 정의된 바와 같은):

- □ : 클로닝 부위(특정된 바와 같이)

- ATG 및 TAA: 개시/종료 (각각은 클로닝 부위에 인접해 있다)

- CATCATCATCATCATCATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC : His-태그 및 PreScission 절단 부위

벡터 (세부사항에 대해 상기 참조) (서열번호 6):

_ _ _ _ _ : 벡터 삽입물

본 발명의 추가의 측면은,

a) 단백질의 제조를 위한 조건하에서 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,

b) 세포 배양물로부터 단백질을 분리하는 단계 및

c) 단계 b)의 분리된 단백질을 세제와, 특히 포화된 비측쇄 C6-C20 알킬 설페이트 또는 카보네이트, 또는 이소프레닐 염과 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 분리된 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 본 발명의 방법의 단계 a) 및 b)는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 그러나, 하기에서, 이들은 예시에 의해 간략하게 요약되고 설명될 것이다. 당업자는 당해 기재된 방법이 분리될 본 발명의 각각의 단백질, 세포 배양에 사용될 세포 등에 따라 변형될 수 있음을 이해할 것이다.

재조합 단백질의 제조를 위해, 즉 생존 세포에서 엑소젠(exogene) 유전자 생성물의 합성을 위해 다수의 발현 시스템이 유용하다. 이들은 일련의 널리 공지된 유기체 및 세포주(세균, 곤충 세포, 효모, 포유동물 세포 등) 뿐만 아니라 상이한 프로모터, 선별 마커 및 임의의 융합 파트너를 갖는 다양한 발현 벡터를 포함한다. 재조합 단백질의 제조는 일반적으로 암호화 유전자의 플라스미드 또는 임의의 다른 적합한 벡터로의 도입을 포함한다. 일반적으로, 적합한 벡터 또는 플라스미드의 선택은 의도된 숙주 세포에 의존한다. 이어서 당해 벡터를 선택된 표적 세포로 도입하고(형질전환 또는 형질감염) 표적 세포를 배양한다. 프로모터에 따라 유전자의 발현은 배양 기간 전체에 걸쳐 발생할 수 있거나 외부 신호에 의해 유도될 수 있다.

상기된 바와 같이, 본 발명의 단백질을 암호화하는 적합한 핵산 또는 이를 포함하는 벡터를 제조할 필요가 있을 수 있다.

본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산은 핵수용체를 암호화하는 천연에 존재하는 유전자일 수 있거나 이것은 상기 정의된 바와 같은 핵 수용체를 암호화하는 이의 일부일 수 있다. 천연에 존재하는 단백질을 암호화하는 핵산 또는 이의 일부의 분리는 당업자에게 널리 공지되어 있고 적합한 프로브 및 분리 방법을 사용한 분리를 포함할 수 있거나 핵산은 상업적 공급업체로부터 유래될 수 있다. 천연에 존재하는 유전자가 포함하지 않는 핵산(예를 들어, 완전하거나 부분적인 NR 및 태그를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산)이 사용되는 경우, 융합 단백질을 암호화하는 각각의 핵산은 유전자 조작의 널리 공지된 방법을 포함하는, 표준 과정에 따라 제조될 수 있다. 일반적으로, 적합한 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 특정 부위에서 DNA를 절단한다. 제한 효소에 의해 형성된 단편은 리가제에 의해 함께 연결될 수 있다. 이후, 당해 DNA는 유전학적 물질을 세포로 전달하기 위해 적합한 벡터에 도입될 수 있다. 당해 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터일 수 있다. 적합한 벡터는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등을 포함한다. 상업적으로 유용한 벡터의 예는 pBR322, pUC 계열, pBluescript, pTZ, pSP 및 pGEM이다. 또는, 누출된 DNA는 세포에 도입될 수 있다. 핵산, 즉, DNA 또는 RNA가 벡터 없이 사용되는 경우, 형질감염은 이를 양이온성 지질과 혼합하여 리포좀을 생성시킴으로써 수행될 수 있고, 당해 리포좀은 세포막과 융합하고 세포 내부에 핵산을 침적시킨다. 형질감염은 또한 인산칼슘에 의해 수행될 수 있고, 이때, 예를 들어 포스페이트 이온을 함유하는 HEPES-완충 식염 용액은 형질감염될 DNA를 함유하는 염화칼슘 용액과 배합된다. 2개의 용액이 배합되는 경우, 인산칼슘의 미세 침전물이 형성되고 이의 표면상에 형질감염될 DNA가 결합한다. 침전물의 현탁액은 이어서 형질감염될 세포(일반적으로 단일층으로 증식하는 세포 배양물)에 첨가된다. 형질감염을 위한 기타 방법은 전기 천공, 열 쇼크, 마그네토펙션(magnetofection), 뉴클레오펙션(nucleofection) 및 형질감염 제제(예를 들어, 리포펙타민(Lipofectamine), 푸겐(Fugene) 등)의 사용을 포함한다. 추가의 방법은 "유전자 총"이고 여기서, DNA는 불활성 고체(일반적으로 금)의 나노입자에 결합되어 있고 이는 이어서 표적 세포내로 주입된다.

세포의 형질감염은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 형질감염 과정동안에 세포내로 도입된 핵산이 핵 게놈내로 삽입되지 않은 경우, 외래 핵산은 세포가 유사분열을 진행하는 경우 후기에 상실될 수 있다. 이것은 일시적 형질감염으로 불리운다. 보다 바람직하게, 형질감염은 안정한 형질감염이고 이때 핵산은 세포의 게놈내에 유지된다. 안정한 형질감염을 달성하기 위해 일반적으로 선별 기술이 사용되고 이때, 핵산은 또 다른 유전자와 동시 형질감염되고 선택적 선별을 제공한다. 추가의 유전자는 특정 조건 또는 물질, 예를 들어, 항생제 또는 대사 결핍에 대해 내성을 부여할 수 있다. 적합한 유전자의 예는 네오마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 등을 포함한다.

본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산을 숙주 내부로 도입한 후, 당해 세포를 적합한 조건하에서 성장시킨다. 단백질의 제조를 위한 일련의 상이한 숙주 세포는 세균, 곤충 세포, 효모 및 포유동물 세포를 포함하고 당업자에게 공지되어 있다. 당해 세포의 예는 Sf9, Sf21, HEK 293 세포, CHO 세포, HeLa 세포, CaCo 세포 또는 NIH 3T3 세포이다.

숙주 세포는 1차 세포이거나 세포주일 수 있고 여기서, 세포주가 바람직하다.

본 발명의 핵산을 포함하는 세포는 세포의 제조를 위한 조건하에서 성장시키고 유지시킨다. 이것은 임의로 세포 배양기내에 적당한 온도 및 기체 혼합물(전형적으로 37℃, 5 % CO₂)을 포함한다. 배양 조건은 각각의 세포 유형에 따라 광범위하게 다양할 수 있고 당업자에게 공지되어 있다. 당해 발현은 예를 들어, 적합한 배큘로바이러스 벡터 시스템으로 형질전환시킨 후 곤충 세포에서 일어날 수 있다. 이러한 경우에 당해 온도는 26℃에서 유지되는 반면 CO₂의 조절은 요구되지 않는다.

온도 및 기체 혼합물을 제외하고 세포 배양 시스템에서 가장 공통적으로 다양한 인자는 성장 배지이다. 성장 배지에 대한 조성은 무엇보다 pH, 글루코스 농도, 성장 인자 및 다른 영양 성분의 존재에 있어서 다양할 수 있다. 보충 배지를 위해 사용되는 성장 인자는 흔히 소 혈청과 같은 동물 혈액으로부터 유래된다.

당업자는 유전자 코드를 고려하여 단백질 서열로부터 DNA 또는 RNA일 수 있는 핵산 서열을 유도하는 방법을 알고 있다. 당업자는 또한 분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 당해 핵산 서열을 제조하는 방법을 알고 있다. 이것은 예를 들어, 제한 효소를 사용한 기존의 서열을 사용하고 조합하여 달성될 수 있다. 핵산은 적합하게 또한 추가의 요소, 예를 들어, 프로모터 및 전사 개시 및 종료 시그날 및 해독 개시 및 종료 시그날을 포함한다.

단계 a) 후, 단백질은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 분리 또는 정제 방법에 의해 세포 배양물로부터 분리될 수 있다. 충분한 양의 표적 단백질이 배지로 분비되는 경우 분리는 동일하게 계속할 수 있다. 또는, 세포를 파쇄시킬 필요가 있을 수 있다. 이것은 예를 들어, 세포의 용해, 예를 들어, 초음파 또는 고장성 배지 또는 전단에 의해 수행될 수 있다. 불용성 성분을 제거하기 위해 당해 샘플은 예를 들어 특히 10,000 x g 내지 15,000 x g에서 원심분리될 수 있고 수득된 상청액은 단계 c)를 위해 사용되거나 추가로 정제되거나 농축될 수 있다.

단계 b)의 분리는 택일적으로 또는 추가로 추출, 침전, 전기영동 방법, 크로마토그래피 방법등과 같은 널리 공지된 정제 농축 단계를 포함할 수 있다. 이들의 예는 세포 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피, 특히 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 포함할 수 있다.

본 발명의 단백질이 상기 정의된 바와 같은 적합한 마커 또는 태그를 포함하는 경우, 특히 친화성 정제가 고려된다. 친화성 정제는 특별한 형태의 흡착 정제이고 이때 담체상에는 높은 친화성을 갖는 그룹(결합 파트너)이 있고 따라서 2개의 도메인 중 하나에 높은 결합 강도가 있어 이들은 우선적으로 흡착될 수 있으므로 다른 물질로부터 분리될 수 있다. 제1 및 제2 태그(예를 들어, His-태그 및 GST-태그)를 사용하여 정제를 수행할 수 있다. 정제는 적합한 결합 파트너에 특이적 결합에 의해 수행한다. 결합 파트너는 바람직하게 고체 상에 결합된다. 고체상은 통상적인 담체 물질, 예를 들어, 세파로스, 슈퍼플로우, 마크로프렙, POROS 20 또는 POROS 50일 수 있다. 이어서 분리는 예를 들어, 중력, HPLC 또는 FPLC에 의해 크로마토그래피적으로 수행될 수 있다. 목적하는 단백질은 조건을 변화시켜 변화된 조건(예를 들어, pH 값 또는 이온 강도의 변화)이 친화성 마커 또는 태그와 결합 파트너간에 더이상 결합이 허용되지 않도록 함으로써 또는 결합 파트너에 결합된 도메인으로부터 분자를 분리시킴에 의해 고체 상으로부터 용출될 수 있다. 분리는 예를 들어, 상기된 바와 같이 화학적 수단에 의해 또는 특이적 효소를 사용하여 분자와 결합 파트너간의 결합을 절단하여 수행될 수 있다. 또는, 과량으로 첨가되는 특이적 경쟁인자를 사용할 수 있다. 또는, 결합 파트너는 비드, 특히 자기 비드에 결합될 수 있다. 비드를 샘플에 첨가한 후, 파트너 도메인과 상응하는 결합 파트너간에 결합이 발생한다. 이어서 당해 현탁액은 예를 들어 표지된 분자가 비드와 함께 침강하고 다른 성분은 상청액에 잔류하도록 하여 상청액으로부터 제거될 수 있도록 원심분리될 수 있다. 또는, 당해 현탁액은 비드의 자기 성질을 사용하여 분리된다. 하나의 양태에서, 당해 현탁액은 자기장에 위치하는 칼럼에 적용된다. 이들에 결합된 자기 비드 및 분자가 자기장에 유지됨으로써 당해 샘플의 다른 성분은 여러 세척 작업으로 세척될 수 있다. 이어서 목적하는 분자는 예를 들어, 적합한 용출 완충액을 사용하여 비드로부터 세척될 수 있거나 예를 들어, LBD와 태그 또는 마커간에 절단 부위에서 효소적 절단에 의해 비드로부터 분리될 수 있다.

단계 b) 후, 분리된 단백질은 세제와 접촉시켜 조절가능한 형태의 LBD를 제공한다. 생물학적 관점에서의 세제는 세포의 양극성 지질막을 파괴시켜 막 결합된 단백질을 유리시키고 가용화시키는데 공통적으로 사용되는 막 활성 물질이다. 세제의 가치는 이들의 양쪽성 성질로부터 유래한다. 각 세제 분자는 친수성 "헤드" 영역 및 소수성 "꼬리" 영역을 특징으로 한다. 당해 특징의 결과는 수성 매질에서 소수성 코어와 함께 열역학적으로 안정한 마이셀이 형성된다는 것이다. 소수성 코어는 단백질의 소수성 분자 또는 도메인을 해리시키는 환경을 제공한다. 당해 세제는 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비이온성일 수 있다. 음이온성 및 양이온성 세제는 전형적으로 다른 2개 부류 보다 더 크게 단백질 구조를 변형시킨다. 변형 정도는 개개의 단백질 및 특정 세제에 따라 다양한다. 이온성 세제는 또한 pH, 이온 강도 및 역이온의 성질에 보다 민감하고 전하 기반 분석 방법을 방해할 수 있다. 또는, 대부분의 비이온성 세제는 비-변성력이어서 단백질 응집을 붕괴시키는데 덜 효과적이다. 양쪽성 세제는 유일하게, 몇몇 응용에서 비이온성 세제의 낮은 변성력 및 총 제로 전하 특성을 제공하는 다른 3가지 세제 유형보다 우수한 몇몇 중간 부류의 성질을 제공한다. 양쪽성은 또한 효율적으로 단백질 응집을 붕괴시킨다.

바람직하게, 당해 세제는 포화 비측쇄 C6-C20 알킬 설페이트 또는 카보네이트의 알칼리 염이거나 이소프레닐 염이다. 알칼리 염으로부터 리튬, 나트륨 및 칼륨 염, 특히 리튬 염이 바람직하다.

포화 비측쇄 C6-C20 알킬 설페이트는 n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, n-운데실, n-도데실, n-트리데실, n-테트라데실, n-펜타데실, n-헥사데실, n- 헵타데실, n-옥타데실, n-노나데실, n-이코사일 설페이트일 수 있다. 포화 비측쇄 C6-C20 알킬 카보네이트는 n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, n-운데실, n-도데실, n- 트리데실, n-테트라데실, n-펜타데실, n-헥사데실, n-헵타데실, n-옥타데실, n-노나데실, n-이코사일 카보네이트일 수 있다.

본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 알칼리 염은 리튬 염, 바람직하게는 n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, n-운데실, n-도데실, n-트리데실, n-테트라데실, n-펜타데실, n-헥사데실, n-헵타데실, n-옥타데실, n-노나데실, n-이코사일 설페이트의 리튬 염 또는 n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, n-운데실, n-도데실, n-트리데실, n-테트라데실, n-펜타데실, n-헥사데실, n-헵타데실, n-옥타데실, n-노나데실, n-이코사일 카보네이트의 리튬 염이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명의 분리된 단백질을 제조하는 방법은 추가로 단계 b) 또는 단계 c) 후 마커 또는 태그를 제거함을 포함한다. 마커의 제거는 예를 들어, 마커를 절단함에 의해 수행될 수 있다. 당해 마커는 특이적 절단 부위에서 특이적으로 단백질을 절단하는 적합한 효소에 의해 절단될 수 있다. 절단 부위는 프로테아제 절단 부위일 수 있고 이는 마커 또는 태그와 LBD 사이의 스페이서에 위치할 수 있다. 프로테아제의 예는 키모트립신, 트립신, 엘라스타제 및 플라스미드이고; 상응하는 절단 부위는 당업자에게 공지되어 있다. 정제될 분자는 단백질이기 때문에, 특이적 프로테아제, 특히 정상적으로 식물에 침입하는 바이러스 기원의 프로테아제가 바람직하다. 적합한 특이적 프로테아제의 예는 트롬빈, 인자 Xa, 이가제, 타바코 에치 바이러스 기원의 TEV-프로테아제, 프로테아제 PreScission (사람 리노바이러스 3C 프로테아제), 엔테로키나제 또는 Kex2 TEV-프로테아제이고 PreScission이 특히 바람직하다.

본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 포화 비측쇄 C6-C20 알킬 설페이트 또는 카보네이트의 알칼리 염은 포화 비측쇄 C9-C15 알킬 설페이트의 알칼리 염, 바람직하게는 도데실 설페이트의 알칼리 염, 보다 바람직하게는 리튬 도데실 설페이트(LDS)의 알칼리 염이다. 이에 따라, 포화 비측쇄 C9-C15 알킬 설페이트는 n-노닐 설페이트, n-데실 설페이트, n-운데실 설페이트, n-도데실 설페이트, n-트리데실 설페이트, n-테트라데실 설페이트 또는 n-펜타데실 설페이트의 리튬, 나트륨 또는 칼륨 염일 수 있고, 특히 리튬 n-노닐 설페이트, 리튬 n-데실 설페이트, 리튬 n-운데실 설페이트, 리튬 n-도데실 설페이트, 리튬 n-트리데실 설페이트, 리튬 n-테트라데실 설페이트, 또는 리튬 n-펜타데실 설페이트, 보다 특히 리튬 도데실 설페이트, 나트륨 도데실 설페이트, 칼륨 도데실 설페이트, 특히 리튬 도데실 설페이트이다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 당해 세제는 이소프레닐 염이다. 이소프레닐 염은 이소프렌의 임의의 염, 예를 들어, 이소프레닐 아세테이트, 이소프레닐 디포스페이트, 이소프레닐 피로포스페이트일 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 당해 세제는 1 내지 4개의 이소프레닐-단위체 및 하이드록실 그룹으로 이루어진 테르펜, 또는 상응하는 카보네이트, 설페이트, 포스페이트 또는 피로포스페이트, 특히 게라니올, 파르네솔, 게라닐피로포스페이트, 파르네실피로포스페이트 또는 게라닐게라닐피로포스페이트의 알칼리 또는 암모늄 염이다.

본 발명의 추가의 양태에서, 단계 b) 및/또는 c)는 LBD에 대한 효능제의 존재하에 수행될 수 있다. 당해 효능제는 천연에 존재하는 효능제 또는 이의 기능적 활성 유도체일 수 있거나 이것은 천연에 존재하는 효능제와는 상이한 효능제일 수 있다. 핵 수용체에 결합하여 이를 활성화시키는 천연에 존재하는 효능제 리간드는 친지성 물질, 예를 들어, 내인성 호르몬, 비타민 A 및 비타민 B 및 생체 이물의 내분비 교란물질을 포함한다. 예를 들어, 갑상선 호르몬 수용체는 갑상선 호르몬, 특히, 티록신(T₄)의 결합에 의해 활성화된다. 레티노산 수용체에 대해 천연에 존재하는 리간드는 모두-트랜스 레티노산 및 9-시스 레티노산이다. 퍼옥시좀 증식인자 활성화된 수용체의 리간드는 유리 지방산 및 에이코사노이드이고; PPARγ는 PGJ₂ (프로스타글란딘)에 의해 활성화되고 PPARα는 류코트리엔 B₄에 의해 활성화된다. 간 X 수용체 α 및 β는 절대적 파트너 RXR과 이종이량체를 형성한다. 당해 이종이량체는 또한 LXR 효능제(예를 들어, 옥시스테롤) 또는 RXR 효능제(예를 들어, 9-시스 레티노산)로 활성화될 수 있다. 옥시스테롤은 콜레스테롤의 산화된 유도체, 예를 들어, 22 (R)-하이드록시 콜레스테롤, 24 (S)-하이드록시스테롤, 27-하이드록시 스테롤 및 콜레스테노산이다. 다른 효능제는 비타민 D (비타민 D 수용체), 스테로이드(에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체), 코르티졸(글루코코르티코이드 수용체), 알도스테론(무기물 코르티코이드 수용체) 또는 지방산(간세포 핵 인자 4)일 수 있다. 천연에 존재하지 않는 효능제 리간드는 글루코코르티코이드 수용체에 대한 덱사메타손 또는 에스트로겐 수용체에 대한 디에틸스틸베스트롤(DES)를 포함한다. ROR 계열의 구성원에 대해 적합한 효능제 리간드는 콜레스테롤 및 이의 유도체, 예를 들어, 콜레스테롤 설페이트 또는 멜라토닌을 포함한다.

상기된 바와 같이, 본 발명의 분리된 단백질은 단백질 생산에 적합한 조건하에 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양함에 의해 생성된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 당해 세포는 동물 세포, 식물 세포 및 효모 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 동물 세포의 적합한 세포는 포유동물 세포, 특히, 사람 세포를 포함한다. 당해 세포의 예는 상기 언급된다. 또는, 당해 세포는 효모 세포일 수 있고, 예를 들어, 이.콜라이 세포 또는 곤충 세포일 수 있다.

본 발명의 분리된 단백질을 제조하기 위한 예시적 방법은 실시예 1에 기재되어 있다.

본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 방법에 따라 제조된 조절가능한 형태의 핵 수용체의 리간드 도메인을 포함하는 분리된 단백질에 관한 것이다.

당업자는 분리된 단백질이 본 발명의 임의의 양태, 특히 본 발명의 바람직한 양태에서 상기 정의된 바와 같을 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명의 추가의 측면은 핵 수용체의 리간드 결합 도메인에 대한 리간드, 특히 효능제 또는 길항제, 특히 효능제의 동정을 위한 분리된 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 본 발명의 분리된 단백질은 다운스트림 시그날 전달을 가동하거나 정지시킴에 의해 핵 수용체의 LBD에 대한 리간드, 특히 효능제 또는 길항제의 동정을 위해 사용될 수 있다. 이에 따라, 임의의 다운스트림 시그날은 리간드의 결합을 검출하기 위해 검출되거나 평가될 수 있다. 효능제에 대해 검색되는 경우, 효능제는 다운스트림 시그날 경로의 활성화에 의해 동정될 수 있다. 한편, 길항제는 다운스트림 시그날 전달을 정지시킴에 의해 동정될 수 있다. 길항제의 경우에, 길항제에 의한 효능제 유도된 시그날 전달의 불활성화를 검출하기 위해 효능제와 잠재적인 길항제의 배합물을 사용할 필요가 있을 수 있다. 상기된 바와 같이, 일반적으로 핵 수용체의 시그날 전달은 다량체, 특히 이량체의 형성, 보조 활성화인자 및/또는 보조-리프레서의 결합 또는 유전자 전사의 변화, 흔히 유전자 전사의 유도, 따라서 mRNA 및 단백질의 생성 및 이에 따라 변화된 세포 기능을 포함한다.

상기된 시그날 전달에 따라 변화된 시그날 전달은 제2 단백질(예를 들어, 보조 활성화인자 또는 보조-리프레서)에 목적하는 단백질의 결합, 표적 유전자로의 결합, mRNA 또는 단백질 양의 측정, 변화된 세포 기능을 포함하는 시그날 전달의 각 단계에서 평가될 수 있다. 추가의 단백질 또는 표적 유전자로의 단백질의 결합을 결정하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고 본원에 정의된 것들을 포함한다. mRNA 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 또한 당업자에게 널리 공지되어 있다. 변화된 세포 기능을 관찰하는 방법은 대체로 세포 기능의 유형에 의존하고 또한 당업자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명의 추가의 측면은 다음을 포함하는 시험 시스템에 관한 것이다:

- 본 발명의 분리된 단백질,

- 보조 인자, 및

- 리간드, 특히 효능제의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인으로의 결합 즉시 단백질과 보조 인자간의 상호작용을 검출하기 위한 수단.

본 발명에 따라, 본 발명의 분리된 단백질은 상기 측면 및 양태, 특히 바람직한 양태에서 구체화된 바와 같은 임의의 단백질일 수 있다. 추가로, 보조 인자(또한 보조 활성화인자 또는 보조 리프레서를 포함하는 보조-조절인자, 보조 조절 단백질 또는 전사 보조 조절 인자로 언급됨; 또한 상기 참조)는 효능제 리간드의 결합에 의해 활성화되는 핵 수용체에 의해 결합되는 반면, 보조 리프레서는 길항제 리간드의 결합 즉시 핵 수용체에 의해 결합된다. 핵 수용체 보조 활성화인자의 공통된 특징은 이들이 NR(핵 수용체) 박스로서 언급되는 하나 이상의 LXXLL 결합 모티프(연속적인 5개 아미노산 서열, 여기서, L= 류신이고 X= 임의의 아미노산이다)를 함유한다는 것이다. LXXLL 결합 모티프는 핵 수용체의 LBD의 표면상의 구조에 결합하는 것으로 나타났다. 이의 예는 다음을 포함한다:

- NCOA-1 (핵 수용체 보조 활성화인자 1) / SRC-1 (스테로이드 수용체 보조 활성화인자-1)

- NCOA-2 (핵 수용체 보조 활성화인자 2) / GRIP-1 (글루코코르티코이드 수용체 상호작용 단백질 1)

- NCOA-3 (핵 수용체 보조 활성화인자 3) / AIB-1 (유방에서 증폭됨)

- NCOA-4 (핵 수용체 보조 활성화인자 4) / ARA 70 (안드로겐 수용체 연관 단백질 70)

- NCOA-5 (핵 수용체 보조 활성화인자 5)

- NCOA-6 (핵 수용체 보조 활성화인자 6)

- NCOA-7 (핵 수용체 보조 활성화인자 7)

- PGC-1 (증식인자 활성화된 수용체 γ 보조 활성화인자 1)

- CBP (cAMP 반응성 요소-결합 (CREB) 단백질-결합 단백질)

- PCAF (p300/CBP 연합 인자)

- ARA 54 (안드로겐 수용체 연합 단백질 54)

- ARA 55 (안드로겐 수용체 연합 단백질 55)

보조 리프레서 단백질은 또한 핵 수용체의 리간드 결합 도메인의 표면에 결합하지만 아미노산의 LXXXIXXX (I/L) 모티프(여기서, L = 류신, I = 이소류신 및 X = 임의의 아미노산)를 통해서 결합한다. 추가로, 보조 리프레서는 바람직하게 효능제 부재의 불활성화된 형태 또는 능히 길항제 결합된 형태로 핵 수용체에 결합한다. 보조 수용체의 예는 다음을 포함한다:

- NCOR-1 (핵 수용체 보조 리프레서)

- NCOR-2 (핵 수용체 보조 리프레서) / SMRT (레티노이드 및 갑상선 호르몬 수용체에 대한 사일런싱 매개인자(보조 리프레서))

- LCoR (리간드-의존성 보조 리프레서)

- RCOR (REST 보조 리프레서)

- CtBP 602618

- Rb (망막아종 단백질)

- SIN3 (SIN3a, SIN3b)

이중 기능성 활성화인자/리프레서와 함께 보조 인자는 다음을 포함한다:

- PELP-1 (프롤린, 글루탐산 및 류신 풍부 단백질 1)

- NSD-1

- RIP-14 (RXR-상호작용 단백질 14)

보조 활성화인자는 본 발명에 따른 분리된 단백질에 포함되는 LBD에 따라 선택될 수 있다. 당업자는 보조 인자가 핵 수용체의 시그날 전달에 의존하고 LBD가 당해 핵 수용체로부터 유도된 것임을 이해할 것이고 당업자는 보조 인자와, 리간드의 결합시 LBD를 포함하는 분리된 단백질간의 상호작용을 검출하기 위해 본 발명의 시험 시스템에 적합한 보조 인자를 선택할 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 보조 인자는 글루코코르티코이드 수용체-불활성화 단백질-1 (GRIP-1) 또는 스테로이드 수용체 보조 활성화인자-1(SRC-1)이고 임의로 마커, 바람직하게는 태그로 표지된다.

GRIP-1은 여러개의 핵 수용체 상호작용 도메인 및 고유 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 함유하는 전사 보조 조절 단백질이다. GRIP-1은 예를 들어, ROR, 특히 RORα와 같은 리간드 활성화된 핵 수용체에 의한 DNA 촉진 부위로 모인다. GRIP-1은 이어서 DNA 전사를 촉진시키는 히스톤을 아세틸화한다. GRIP-1은 또한 SRC-2(스테로이드 수용체 보조 활성화인자-2) 또는 전사 매개인자/중간 인자 2(TIF-2) 또는 핵 수용체 보조 활성화인자 2(NCOA2)로서 언급된다.

SCR-1은 또한 여러 개의 핵 수용체 상호작용 도메인 및 고유 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 함유하는 전사 보조 조절 단백질이다. SRC-1은 리간드 활성화된 핵 수용체에 의해 DNA 촉진 부위로 모이고 이어서 히스톤을 아세틸화하여 다운스트림 DNA 전사를 촉진시킨다. SRC-1은 또한 핵 수용체 보조 활성화인자-1(NCOA-1)로서 언급된다.

본 발명의 하나의 양태에서, 보조 인자는 마커로, 바람직하게는 태그로 표지될 수 있다. 당해 마커 또는 태그는 상기 정의된 바와 같을 수 있다. 마커는 보조 인자의 정제를 위해 사용될 수 있거나 이것은 분리된 단백질과 보조 인자간의 상호작용을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 마커는 항체, 항원, 효소, 방사선표지 등을 포함한다. 그러나 이것은 보조 인자가 시험 시스템의 다른 성분과 상호작용하여 분리된 단백질과 보조 인자간의 상호작용을 나타내는 시그날이 여전히 검출될 수 있게 하는 방식으로 표지되어야만 하는 것으로 이해되어야만 한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 시험 시스템은 보조 인자로의 단백질의 근접이 검출가능한 시그날을 유도하는 방식으로 디자인된다. 분리된 단백질과 보조 인자의 근접은 분리된 단백질이 보조 인자에 결합함에 의해 도달될 수 있다. 시그날의 유도는 성분 각각을 표지시켜 수행될 수 있고, 이때, 표지의 근접은 검출가능한 시그날을 유도한다. 유도된 검출가능한 시그날은 화학발광 시그날, 색상 변화, 형광 시그날, 방사선 또는 임의의 다른 적합한 시그날일 수 있다. 당해 시그날은 2개 표지의 상호작용에 의해 유도될 수 있고 이때 각각의 표지는 시험 시스템의 하나의 성분, 즉 분리된 단백질 및 보조 인자에 결합된다. 당해 시그날은 섬광 계수기(섬광 근접 분석)에서 근접을 검출하기 위해 방사선 표지, 예를 들어, ¹²⁵I 및 다른 한편으로는 적합한 켄처를 포함한다. 당해 성분은 FRET(형광 공명 에너지 전달, 하기 참조)를 검출하는 방식으로 표지된 항체에 근접할 수 있는 항원을 포함할 수 있다. 또 다르게는 단백질의 하나가 이의 표면으로 키나제에 의해 인산화할 수 있는 생분자에 결합되고 다른 성분은 이의 표면으로 착화된 예를 들어, 니트릴로트리아세트산, 이미노디아세트산 또는 적당히 치환된 N-함유 헤테로사이클, 예를 들어, 트리아조헤테로사이클, 예를 들어, 트리아조사이클로노난에오노난, 예를 들어, 1-프로필아미노-4-아세테이토-1,4,7-트리아자사이클로노난과 같은 적합한 링커를 통해 착화된 3가 금속 이온을 갖는다. 화학발광 시그날은 공여체 및 수용체 입자가 근접해 있는 경우 생성되고 이는 단백질이 보조 인자에 결합하는 즉시 발생한다(발광 근접 분석).

본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, 단백질과 보조 인자와의 상호작용을 검출하기 위한 수단은 단백질 또는 보조 인자를 위해 특이적인 하나 이상의 항체를 포함한다. 상기된 바와 같이, 분리된 단백질은 특이적 항체에 대해서 및 항체의 검출을 위해 항원을 포함할 수 있다. 본 발명의 보다 더 바람직한 양태에서, 시험 시스템은 2개의 항체를 포함하고, 이때 제1 항체는 단백질에 특이적이고 제2 항체는 보조 인자에 특이적이다. 당해 항체는 적합한 마커로 표지될 수 있고 이는 각각의 성분의 존재를 나타낸다. 또는, 상기 언급된 1차 항체는 1차 항체에 대하여 지시된 적합한 2차 항체에 의해 검출될 수 있다. 2차 항체는 예를 들어, 2차 항체에 결합되는 경우 1차 항체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 1차 또는 2차 항체는 상기 정의된 바와 같은 마커, 예를 들어, 효소, 방사선표지, 형광 마커, 화학발광 마커 등으로 표지될 수 있다. 또는, 당해 성분(단백질 및/또는 보조 인자)은 적합한 항체로 검출가능한 태그를 포함할 수 있다.

당해 시험 시스템은 복합체의 하나 이상의 성분의 분리를 위한 정제 시스템이 사용되고 단백질과 보조 인자의 복합체의 성분들 각각의 존재 또는 복합체의 존재 검출되는 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 당해 복합체는 겔 전기영동, 칼럼 크로마토그래피, 친화성 정제 등에 의해 정제될 수 있고 당해 복합체는 복합체중 하나의 성분 또는 당해 복합체의 2개 성분을 나타내는 하나의 시그날 또는 2개의 시그날의 존재에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 성분의 하나의 복합체에 대해 특이적인 분리 기술이 사용되는 경우, 검출 방법은 다른 성분으로 제한될 수 있다. 또한, 정제 방법(예를 들어, 겔 전기영동)은 성분 중 하나에 대해 특이적이지 않을 수 있고 복합체의 형성은 2개의 시그날, 예를 들어, 구분가능한 형광 마커로 표지된 2개의 항체에 의해 검출될 수 있고 이때, 겔의 동일 면적에서 2개의 형광 마커의 존재는 복합체를 나타낸다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 시험 시스템은,

a) 제1 항체가 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 위한 공여체 잔기로 표지되고 제2 항체가 FRET을 위한 수용체 잔기로 표지되거나 또는 그 반대로 표지되거나;

b) 제1 항체가 시간 분해 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET)을 위한 공여체 잔기로 표지되고 제2 항체가 TR-FRET을 위한 수용체 잔기로 표지되거나 또는 그 반대로 표지되거나;

c) 제1 항체가 증폭된 발광 근접 균일 분석(ALPHA)을 위한 공여체 잔기로 표지되고 제2 항체가 ALPHA를 위한 수용체 잔기로 표지되거나 또는 그 반대로 표지됨을 특징으로 한다.

형광 공명 에너지 전달(FRET)는 2개의 발색단간의 방사선 부재 에너지 전달을 나타낸다. 이의 여기된 상태에서 공여체 발색단은 비-방사선 긴 범위의 쌍극-쌍극 커플링 기작에 의해 근접한(전형적으로 10nm 미만) 수용체 발색단으로 에너지를 전달할 수 있다. 2개의 분자가 형광성이기 때문에 에너지 전달은 흔히 "형광 공명 에너지 전달"을 언급하지만 당해 에너지는 실질적으로 형광에 의해 전달되지 않는다. FRET는 단백질-단백질 상호작용, 단백질-DNA 상호작용 및 단백질 형태적 변화를 검출하고 정량하기 위해 유용한 도구이다. 하나의 단백질의 또 다른 단백질로의 결합 또는 하나의 단백질의 DNA로의 결합을 모니터링하기 위해, 분자중 하나는 공여체로 표지되고 다른 분자는 수용체로 표지되며 이들 형광단 표지된 분자는 혼합된다. 이들이 미결합된 상태로 존재하는 경우, 공여체 방사는 공여체 여기 즉시 검출된다. 분자의 결합 시, 공여체 및 수용체는 근접하게 되고 수용체 방사가 주로 관찰되는데 이는 공여체로부터 수용체로의 상호분자 FRET 때문이다. FRET에 대해 적합한 근접 물질들은 당업계에 공지되어 있고 당업자는 항체 둘다에 대한 적합한 조합을 선택할 수 있다. 공여체 및 상응하는 수용체와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, "상응하는"은 공여체의 여기 스펙트럼과 중첩하는 방사 스펙트럼을 갖는 수용체 형광 잔기를 언급한다. 그러나, 시그날 둘다는 서로로부터 분리될 수 있어야만 한다. 따라서, 수용체의 방사 스펙트럼의 최대 파장은 공여체의 여기 스펙트럼의 최대 파장보다 바람직하게 30nm 이상, 보다 바람직하게는 50nm 이상, 예를 들어, 80nm 이상, 100nm 이상 또는 150nm 이상이어야 한다.

FRET 기술에서 다양한 수용체 형광 잔기로 사용될 수 있는 대표적인 공여체 형광 잔기는 플루오레세인, 루시퍼 옐로우, B-피코에리트린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 옐로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'- 디설폰산, 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린, 석신이미딜 1-피렌부티레이트 및 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산 유도체를 포함한다. 대표적인 수용체 형광 잔기는 사용되는 공여체 형광 잔기에 따라 상이하고 LC-Red 610, LC -Red 640, LC-Red 670, LC -Red 705, Cy5, Cy5.5, 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 x 이소티오시아네이트, 에리트로신 이소티오시아네이트, 플루오레세인, 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트 또는 란탄계 이온의 다른 킬레이트(예를 들어, 유로퓸 또는 테르븀)을 포함한다. 공여체 및 수용체 형광 잔기는 예를 들어, 제조회사[Molecular Probes (Junction City, OR) 또는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)]로부터 수득할 수 있다.

또는, 시간-분해 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET)은 본 발명의 시험 시스템을 위해 사용될 수 있다. TR-FRET는 TRF(시간-분해 형광)와 FRET 원리를 통합한 것이다. 당해 조합은 TRF의 낮은 배경 이득과 FRET의 균일한 분석 포맷을 조합한 것이다. FRET는 이미 상기되었고, TRF는 란탄계 또는 반감기가 긴 임의의 다른 공여체의 독특한 성질을 이용한다. TR-FRET를 위해 적합한 공여체는 무엇보다 란탄계 킬레이트(크립테이트) 및 몇몇 다른 금속 리간드 착물을 포함하고 이들은 마이크로 내지 밀리초 시간 범위의 형광성 반감기를 가질 수 있고 따라서 또한 에너지 전달은 마이크로 내지 밀리초 측정에서 발생되도록 한다. 형광 란탄계 킬레이트는 70년대 후반에 에너지 공여체로서 사용되었다. 공통적으로 사용되는 란탄계는 사마륨(Sm), 유로퓸 (Eu), 테르븀 (Tb) 및 디스프로슘 (Dy)을 포함한다. 이들의 특이적 광물리학적 및 분광 성질 때문에, 란탄계의 착물이 생물학에서 형광 응용을 위해 주요 관심 대상이다. 구체적으로, 이들은 보다 통상적인 형광단과 비교하여 큰 스트로크 쉬프트를 갖고 방사 반감기(마이크로초 내지 밀리초)가 길다.

통상적으로, 유기 발색단이 수용체로서 사용된다. 이들은 알로피코시아닌(APC)을 포함한다. 수용체 뿐만 아니라 TR-FRET에 대해 적합한 세부 사항은 WO 98/15830에 기재되어 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 시험 시스템은 증폭된 발광 근접 균일 분석(ALPHA)에 적합하다. ALPHA는 본래 제조사[Packard BioScience]에 의해 개발된 용액 기반 분석이다. ALPHA는 발광 기반 근접 분석이고 이때 하나의 상호작용 파트너는 공여체 비드에 부착되고 다른 하나는 수용체 비드에 커플링되며, 당해 비드 2개의 직경은 단지 약 250nm이다. 감광제 화합물을 공여체 비드에 매립시킨다. 약 680nm의 파장에서 레이저 광으로 발광 즉시 당해 화합물과 함께 주위 산소는 에너지가 풍부한 단명 활성 산소(short-life singlet oxygen)로 전환된다. 어떠한 수용체 비드가 근접해 있지 않은 경우, 활성 산소는 시그날을 생성하지 않고 쇠퇴한다. 공여체 및 수용체 비드가 접착된 생분자의 생물학적 상호작용에 의해 함께 근접(약 250nm)하는 경우, 공여체 비드에 의해 방출된 활성 산소는 인접한 수용체 비드에서 발광/형광 캐스케이드를 개시하여 520 내지 620nm 범위의 고도로 증폭된 시그날을 유도한다. 발광 시그날은 적합한 판독기에서 검출된다. ALPHA 기술에 대한 보다 세부 사항은 문헌[참조: Ullman et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 91, 5426-5430]을 참조한다.

예시적인 시험 시스템 및 이의 용도는 실시예 2에 기재되어 있고 도 1C에 도시되어 있다.

본 발명의 추가의 측면은,

a) 본 발명에 따른 시험 시스템을 물질과 접촉시키는 단계 및

b) 물질이 리간드 결합 도메인에 결합하는 즉시 측정 가능한 시그날을 검출하여 리간드 결합 도메인에 대한 리간드로서 물질을 동정하는 단계

를 포함하는 핵 수용체의 리간드 결합 도메인에 대한 리간드를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라, 당해 시험 시스템은 본 발명의 명세서에 상세히 기재된 바와 같이, 특히 바람직한 양태에서 상세히 기재된 바와 같이 특정될 수 있다. 당해 시험 시스템은 세포에 포함될 수 있거나 세포 부재 시스템일 수 있다. 세포 부재 시스템이 바람직하다. 당해 시험 시스템은 측정 가능한 시그날을 검출하기 위해 적합한 조건하에서 시험 물질과 접촉될 수 있다. 이것은 물질의 적합한 농도 및 적당한 접촉 시간 뿐만 아니라 적합한 온도, 화학적 환경(완충액, pH 값 등)을 포함한다.

접촉 후 또는 접촉과 동시에 시그날이 관찰되고 이때 시그날의 검출은 LBD에 대한 리간드를 나타낸다. 당해 시그날은 본 발명의 시험 시스템 및 본 발명의 분리된 단백질의 용도에서 상세히 기재된 바와 같은 임의의 시그날일 수 있다.

본 발명의 방법의 바람직한 양태에서, 당해 시험 시스템은 FRET 또는 TR-FRET에 대한 공여체로 표지된 제1 항체 및 FRET 또는 T-FRET의 수용체 잔기로 표지된 제2 항체, 또는 그 반대로 표지된 항체를 포함한다. 추가로, FRET의 존재는 효능제를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 스크리닝 방법은 관상 동맥 질환(CAD), 죽상동맥경화증, 이상지질혈증, 신경퇴행성 질환, 수면 장애, 일주기 리듬 질환(disease of circadian rhythmicity) 또는 골다공증을 예방하고/하거나 치료하기 위한 약물을 스크리닝하기 위해 사용된다.

상기 언급된 질환은 ROR, 특히 RORα을 포함한다. 따라서, ROR, 특히 RORα LBD의 효능제 또는 길항제가 당해 질환에 대해 이로운 영향을 가질 것이고 따라서 당해 질환을 예방하거나 치료하기 위해 사용될 수 있을 것으로 추정된다.

하기에서, 본 발명은 도면 및 실시예에 의해 설명되고 이것은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

도면

도 1A는 RORα1을 도시한 것이고 핵 수용체의 다양한 도메인을 나타낸다.

도 1B는 본 발명의 다양한 작제물을 보여주고, 이때 RORα1의 LBD는 절단 부위 (TEV 또는 PreScission (PreSci)), His-태그 (His) 및 임의로 글루타티온-S-트랜스퍼라제-태그(GST)에 연결되어 있다.

도 1C는 본 발명에 따른 FRET 분석을 예시적으로 도시한 것이다. 본 분석에서, RORα는 FRET 공여체 유로퓸(Eu)에 결합된 특이적 항체에 의해 검출된다. 보조 활성화 인자(CA)는 비오틴 표지되어 있다. 비오틴 표지는 스트렙타비딘에 의해 검출되고 이는 FRET 수용체 알로피코시아닌(APC) 마커를 포함한다. 효능제가 RORα에 결합되는 경우, 당해 NR은 CA가 NR에 결합하여 활성화된다. 따라서, APC는 Eu에 근접하게 되어 검출 FRET 시그날을 유도한다(왼쪽 패널). 길항제의 존재에서, CA는 RORα에 결합하지 않고, 따라서 어떠한 FRET 시그날도 생성되지 않는다(오른쪽 패널).

도 2는 실시예 2의 분석 결과를 보여준다. 콜레스테롤 및 콜레스테롤 설페이트는 용량 의존적으로 형광 공명 에너지 전달 분석에서 형광 강도 비율의 증가에 의해 측정되는 바와 같이 RORα로의 보조 활성화인자 펩타이드 SRC1-NR1+2의 결합을 유도한다. 위쪽 라인(+)은 증가하는 농도의 콜레스테롤 설페이트의 존재하에 분석 수행을 나타내는 반면, 중간 라인(O)은 증가하는 농도의 콜레스테롤의 존재하에 수행되는 분석을 보여준다. 아래쪽 라인(□ 및 Δ)은 단지 용매의 존재하에 수행되는 실험을 나타낸다.

실시예

실시예 1 : ROR α - 발현, 정제 및 AD

ROR알파 단백질의 발현 및 정제는 문헌[참조: Kallen et al.. 2002, Structure, 10 (1697)]에 따라 수행하였다.

발현 및 정제를 위해, 리간드 결합 도메인(LBD, 아미노산 271-523)을 포함하는 RORα1의 DNA를, 6개의 연속 히스티딘 잔기의 N-말단 스트레치 및 HRV 3C 프로테아제에 대한 인지 서열을 갖는 pVL1393 벡터에 클로닝하였다. Sf9 곤충 세포에서 바이러스 생성 및 발현은 표준 과정 후 수행하였다. 감염된 세포는 감염 72시간 후 수거하였고 세포 펠릿을 -8O℃에서 보관하였다.

동결된 세포 펠릿을 500 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8.0, 5 mM β-머캅토에탄올 중에 재현탁시켰다. 프로테아제 억제제(완전한 EDTA-부재, Roche Diagnostics) 및 벤조나제(Novagen)을 첨가하였다. 당해 용해물을 빙상에서 30분동안 교반하고 세포를 최종적으로 초음파에 의해 분쇄하였다. 원심분리 후, 세정된 용해물을 500 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8.0으로 평형화된 Ni^{2 +}-충전된 HisTrap FF (GE Healthcare) 칼럼상으로 로딩하였다. 30 CV에 걸쳐 500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 8.0까지의 선형 농도 구배로 용출을 수행하였다. 분획을 SDS-PAGE로 분석하고 상응하는 분획을 모으고 30 mM Hepes, pH 7.0, 20 mM NaCl, 2 mM DTT, 5% 글리세롤에 대해 투석하였다.

추가의 정제를 위해, 단백질을 30 mM Hepes, pH 7.0, 20 mM NaCl, 2 mM DTT로 평형화된 HiTrap Q FF 음이온 교환 칼럼(GE Healthcare)상으로 로딩하였다. 단백질을 30 mM Hepes, pH 7.0, 1 M NaCl, 2 mM DTT까지의 20 CV 농도구배에 걸쳐 용출하였다. 상응하는 분획물을 모으고 추가로 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 50 mM Tris, pH 7.5로 평형화된 Superdex 200 26/60 겔여과 칼럼(GE Healthcare)상에서 정제하였다. RORαLBD를 함유하는 분획물을 모으고 농축시켰다. 따라서 단백질 분획물의 순도는 SDS-PAGE 및 모세관 전기영동(Agilent 2100 Bioanalyzer)에 의해 측정된 바와 같이 95% 이상이다.

단백질(2.3 mg/ml)을 분액화하고 -8O℃에서 저장하였다. 시험관내 분석을 위한 사용 전에, 단백질을 실온에서 8시간동안 20 mM Tris, pH 7.5에 대해 투석하였다. 리튬 도데실설페이트(LDS)를 3mM의 최종 농도로 첨가하고 혼합물을 밤새 약하게 교반하면서 실온에서 추가로 항온처리하였다. 단백질을 분액화하고 -80℃에서 저장하였다.

당해 정제되고 LDS 처리된 RORα LBD 단백질은 보조 인자 적용 형광 공명 에너지 전달 분석(FRET)에서 글루코코르티코이드 수용체-상호작용 단백질 1 (GRIP1) 및 스테로이드 수용체 보조 활성화인자 1 (SRC1)와 상호작용하는 것으로 나타났다. 구체적으로 2개의 보조 인자의 상이한 핵 수용체 박스(NR)로부터 유래된 당해 펩타이드 GRIP1-NR1, GRIP1-NR2 및 SRC1-NR1+2-는 RORα와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다.

모든 3가지 경우에, 콜레스테롤 설페이트는 EC_5O이 22μM인 용량 의존적으로 결합하는 보조 인자를 유도할 수 있었다. 동몰량의 형광 항-6xHis 항체로 표지된 20 nM RORα LBD 단백질은 2시간동안 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM DTT 및 0.1 % BSA를 함유하는 완충액중에서 각각의 비오틴 표지된 펩타이드 400nM과 동몰량의 스트렙타비딘 태그된 형광단으로 항온처리하였다. 665nm 및 612nm에서 형광 비율의 시간 분해 측정은 콜레스테롤 설페이트 및 콜레스테롤과 같이 공지된 효능제에 의한 용량 의존적 보조 인자 적용을 보여주었다.

실시예 2: LXXLL 펩타이드 SRC1-NR1+2와의 ROR알파LBD 상호작용을 측정하는 TR-FRET 분석

TR - FTET 분석을 위해 하기의 재료를 사용하였다:

단백질:

- 6xHis-ROR알파:

공급원: 3mM LDS로 처리된 단백질 제조(Lab. Thomas Langer), 1.5mg/ml의 스톡 용액, -20℃에서 저장, 실온에서 피펫팅, 47.5 μM (MW 31.6 kD)에 상응함, 분석 농도 = 20 nM

- SRC1-NR1+2:

공급원: JPT Peptide Technologies, 250 μM의 스톡 용액, -20℃에서 저장, 분석 농도 = 400 nM

형광단/표지 :

- 항-6xHis 항체:

공급원: Perkin Elmer # AD0110, 스톡 용액은 각각 배치에서 농도가 다양하고, -20℃에서 저장, 분석 농도 = 20 nM

- strep-APC:

공급원: Perkin Elmer # AD0201, 스톡 용액은 각각의 배치에서 농도가 다양하고 재구성 후 +4℃에서 저장, 분석 농도 = 200 nM (스트렙타비딘을 기준으로)

효능제:

- 콜레스테롤 설페이트:

공급원: SIGMA #C9523, DMSO (30 mM)중에서 스톡 용액, -20℃에서 저장

완충액:

- 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 % 소 혈청 알부민(매일 신선한 BSA를 첨가), pH를 7.4로 조정

플레이트:

시험 플레이트: CORNING Costar # 3639 (96 웰 반 면적)

당해 분석을 다음과 같이 수행하였다:

모든 단백질, 표지 및 화합물을 분석 셋업 바로 전에 분석 완충액 중에서 희석시켰다. 당해 분석은 96웰 반 면적 플레이트에서 수행하였다. 최종 시험 용적은 20 ㎕이었다. 이것을 2회 피펫팅 단계로 나눈다:

먼저, 6xHis-ROR알파LBD 단백질, 비오틴SRC1-NR1+2 펩타이드, 항-6xHis 항체 및 strep-APC를 함유하는 혼합물을 하기의 농도로 빙상에서 제조하였다:

시험 농도(최종):

6xHis-ROR알파LBD 27 nM 2O nM

비오틴SRC1-NR1+2 533 nM 40O nM

항-6xHis 항체 27 nM 2O nM

strep-APC 267 nM 20O nM

⇒ 15㎕의 당해 혼합물을 백색 96 웰 플레이트에 사전에 피펫팅한다

제2 단계에서, 5㎕의 효능제 화합물을 4배 농축된 용액으로서 첨가하였다. 콜레스테롤 설페이트를 전형적으로 2배 희석 단계로 300 μM 최종 화합물 농도로부터 하향 희석시키고 EC_5O은 약 10 μM이다. 플레이트를 밀봉하여 증발을 막는다.

당해 플레이트를 실온에서 약한 빛에서 2시간동안 항온처리하고 실온에서 340nm 여기 및 유로퓸 표준으로서 612nm 및 APC FRET 시그날로서 665nm를 사용하여 ULTRA상에서 판독한다. 당해 시험 결과는 도 2에 나타낸다.

<110> Sanofi-Aventis <120> Ligand binding domains of nuclear receptors in controllable form and methods involving the same <130> 104SAN0704 <150> EP 07291163.9 <151> 2007-09-27 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 253 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Glu Leu Glu His Leu Ala Gln Asn Ile Ser Lys Ser His Leu Glu 1 5 10 15 Thr Cys Gln Tyr Leu Arg Glu Glu Leu Gln Gln Ile Thr Trp Gln Thr 20 25 30 Phe Leu Gln Glu Glu Ile Glu Asn Tyr Gln Asn Lys Gln Arg Glu Val 35 40 45 Met Trp Gln Leu Cys Ala Ile Lys Ile Thr Glu Ala Ile Gln Tyr Val 50 55 60 Val Glu Phe Ala Lys Arg Ile Asp Gly Phe Met Glu Leu Cys Gln Asn 65 70 75 80 Asp Gln Ile Val Leu Leu Lys Ala Gly Ser Leu Glu Val Val Phe Ile 85 90 95 Arg Met Cys Arg Ala Phe Asp Ser Gln Asn Asn Thr Val Tyr Phe Asp 100 105 110 Gly Lys Tyr Ala Ser Pro Asp Val Phe Lys Ser Leu Gly Cys Glu Asp 115 120 125 Phe Ile Ser Phe Val Phe Glu Phe Gly Lys Ser Leu Cys Ser Met His 130 135 140 Leu Thr Glu Asp Glu Ile Ala Leu Phe Ser Ala Phe Val Leu Met Ser 145 150 155 160 Ala Asp Arg Ser Trp Leu Gln Glu Lys Val Lys Ile Glu Lys Leu Gln 165 170 175 Gln Lys Ile Gln Leu Ala Leu Gln His Val Leu Gln Lys Asn His Arg 180 185 190 Glu Asp Gly Ile Leu Thr Lys Leu Ile Cys Lys Val Ser Thr Leu Arg 195 200 205 Ala Leu Cys Gly Arg His Thr Glu Lys Leu Met Ala Phe Lys Ala Ile 210 215 220 Tyr Pro Asp Ile Val Arg Leu His Phe Pro Pro Leu Tyr Lys Glu Leu 225 230 235 240 Phe Thr Ser Glu Phe Glu Pro Ala Met Gln Ile Asp Gly 245 250 <210> 2 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RORalpha domain with His-tag and PreScission cleavage site <400> 2 Met Gly Ser Ser His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln 1 5 10 15 Gly Pro Ala Glu Leu Glu His Leu Ala Gln Asn Ile Ser Lys Ser His 20 25 30 Leu Glu Thr Cys Gln Tyr Leu Arg Glu Glu Leu Gln Gln Ile Thr Trp 35 40 45 Gln Thr Phe Leu Gln Glu Glu Ile Glu Asn Tyr Gln Asn Lys Gln Arg 50 55 60 Glu Val Met Trp Gln Leu Cys Ala Ile Lys Ile Thr Glu Ala Ile Gln 65 70 75 80 Tyr Val Val Glu Phe Ala Lys Arg Ile Asp Gly Phe Met Glu Leu Cys 85 90 95 Gln Asn Asp Gln Ile Val Leu Leu Lys Ala Gly Ser Leu Glu Val Val 100 105 110 Phe Ile Arg Met Cys Arg Ala Phe Asp Ser Gln Asn Asn Thr Val Tyr 115 120 125 Phe Asp Gly Lys Tyr Ala Ser Pro Asp Val Phe Lys Ser Leu Gly Cys 130 135 140 Glu Asp Phe Ile Ser Phe Val Phe Glu Phe Gly Lys Ser Leu Cys Ser 145 150 155 160 Met His Leu Thr Glu Asp Glu Ile Ala Leu Phe Ser Ala Phe Val Leu 165 170 175 Met Ser Ala Asp Arg Ser Trp Leu Gln Glu Lys Val Lys Ile Glu Lys 180 185 190 Leu Gln Gln Lys Ile Gln Leu Ala Leu Gln His Val Leu Gln Lys Asn 195 200 205 His Arg Glu Asp Gly Ile Leu Thr Lys Leu Ile Cys Lys Val Ser Thr 210 215 220 Leu Arg Ala Leu Cys Gly Arg His Thr Glu Lys Leu Met Ala Phe Lys 225 230 235 240 Ala Ile Tyr Pro Asp Ile Val Arg Leu His Phe Pro Pro Leu Tyr Lys 245 250 255 Glu Leu Phe Thr Ser Glu Phe Glu Pro Ala Met Gln Ile Asp Gly 260 265 270 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> His-tag <400> 3 His His His His His His 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PreScission cleavage site <400> 4 Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 5 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA coding for ROR alpha domain withe His-tag and PreScission cleavage site (coding strand) <400> 5 gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa 60 aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atccatggga 120 agtagccatc atcatcatca tcatctggaa gttctgttcc aggggcccgc agaattagaa 180 caccttgcac agaatatatc taaatcgcat ctggaaacct gccaatactt gagagaagag 240 ctccagcaga taacgtggca gaccttttta caggaagaaa ttgagaacta tcaaaacaag 300 cagcgggagg tgatgtggca attgtgtgcc atcaaaatta cagaagctat acagtatgtg 360 gtggagtttg ccaaacgcat tgatggattt atggaactgt gtcaaaatga tcaaattgtg 420 cttctaaaag caggttctct agaggtggtg tttatcagaa tgtgccgtgc ctttgactct 480 cagaacaaca ccgtgtactt tgatgggaag tatgccagcc ccgacgtctt caaatcctta 540 ggttgtgaag actttattag ctttgtgttt gaatttggaa agagtttatg ttctatgcac 600 ctgactgaag atgaaattgc attattttct gcatttgtac tgatgtcagc agatcgctca 660 tggctgcaag aaaaggtaaa aattgaaaaa ctgcaacaga aaattcagct agctcttcaa 720 cacgtcctac agaagaatca ccgagaagat ggaatactaa caaagttaat atgcaaggtg 780 tctacattaa gagccttatg tggacgacat acagaaaagc taatggcatt taaagcaata 840 tacccagaca ttgtgcgact tcattttcct ccattataca aggagttgtt cacttcagaa 900 tttgagccag caatgcaaat tgatgggtaa gaattccgga gcggccgctg cagatctgat 960 cctttcctgg gacccggcaa gaaccaaaaa ctcactctct tcaaggaaat ccgtaatgtt 1020 <210> 6 <211> 10435 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> vector <400> 6 aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60 gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120 ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180 gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240 ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg 300 gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata 360 gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg 420 ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg 480 cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac 540 aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc 600 tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta 660 tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag 720 gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt 780 ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca 840 cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat 900 ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt 960 tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg 1020 tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa 1080 actcttgttt tttaacaagt tcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg 1140 tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt 1200 gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa 1260 gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc 1320 cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga 1380 cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat 1440 tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt 1500 ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat 1560 cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat 1620 tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa 1680 tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc 1740 ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag 1800 tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt 1860 atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc 1920 cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg 1980 cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt 2040 ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg 2100 cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat 2160 tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca 2220 atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca 2280 gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc 2340 aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac 2400 acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag cttgcgacgc aacgtgcacg 2460 atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca 2520 tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt 2580 atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa tcaggaccgc 2640 tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt 2700 agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat 2760 aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc 2820 ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc 2880 aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa 2940 aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg 3000 aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta 3060 aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag 3120 gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta 3180 atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag 3240 ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata 3300 aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa 3360 catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa 3420 aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac 3480 tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa 3540 aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt 3600 tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc 3660 tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta 3720 aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt 3780 acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt 3840 ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt 3900 ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat 3960 atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat 4020 gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa 4080 aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atccatggga 4140 agtagccatc atcatcatca tcatctggaa gttctgttcc aggggcccgc agaattagaa 4200 caccttgcac agaatatatc taaatcgcat ctggaaacct gccaatactt gagagaagag 4260 ctccagcaga taacgtggca gaccttttta caggaagaaa ttgagaacta tcaaaacaag 4320 cagcgggagg tgatgtggca attgtgtgcc atcaaaatta cagaagctat acagtatgtg 4380 gtggagtttg ccaaacgcat tgatggattt atggaactgt gtcaaaatga tcaaattgtg 4440 cttctaaaag caggttctct agaggtggtg tttatcagaa tgtgccgtgc ctttgactct 4500 cagaacaaca ccgtgtactt tgatgggaag tatgccagcc ccgacgtctt caaatcctta 4560 ggttgtgaag actttattag ctttgtgttt gaatttggaa agagtttatg ttctatgcac 4620 ctgactgaag atgaaattgc attattttct gcatttgtac tgatgtcagc agatcgctca 4680 tggctgcaag aaaaggtaaa aattgaaaaa ctgcaacaga aaattcagct agctcttcaa 4740 cacgtcctac agaagaatca ccgagaagat ggaatactaa caaagttaat atgcaaggtg 4800 tctacattaa gagccttatg tggacgacat acagaaaagc taatggcatt taaagcaata 4860 tacccagaca ttgtgcgact tcattttcct ccattataca aggagttgtt cacttcagaa 4920 tttgagccag caatgcaaat tgatgggtaa gaattccgga gcggccgctg cagatctgat 4980 cctttcctgg gacccggcaa gaaccaaaaa ctcactctct tcaaggaaat ccgtaatgtt 5040 aaacccgaca cgatgaagct tgtcgttgga tggaaaggaa aagagttcta cagggaaact 5100 tggacccgct tcatggaaga cagcttcccc attgttaacg accaagaagt gatggatgtt 5160 ttccttgttg tcaacatgcg tcccactaga cccaaccgtt gttacaaatt cctggcccaa 5220 cacgctctgc gttgcgaccc cgactatgta cctcatgacg tgattaggat cgtcgagcct 5280 tcatgggtgg gcagcaacaa cgagtaccgc atcagcctgg ctaagaaggg cggcggctgc 5340 ccaataatga accttcactc tgagtacacc aactcgttcg aacagttcat cgatcgtgtc 5400 atctgggaga acttctacaa gcccatcgtt tacatcggta ccgactctgc tgaagaggag 5460 gaaattctcc ttgaagtttc cctggtgttc aaagtaaagg agtttgcacc agacgcacct 5520 ctgttcactg gtccggcgta ttaaaacacg atacattgtt attagtacat ttattaagcg 5580 ctagattctg tgcgttgttg atttacagac aattgttgta cgtattttaa taattcatta 5640 aatttataat ctttagggtg gtatgttaga gcgaaaatca aatgattttc agcgtcttta 5700 tatctgaatt taaatattaa atcctcaata gatttgtaaa ataggtttcg attagtttca 5760 aacaagggtt gtttttccga accgatggct ggactatcta atggattttc gctcaacgcc 5820 acaaaacttg ccaaatcttg tagcagcaat ctagctttgt cgatattcgt ttgtgttttg 5880 ttttgtaata aaggttcgac gtcgttcaaa atattatgcg cttttgtatt tctttcatca 5940 ctgtcgttag tgtacaattg actcgacgta aacacgttaa ataaagcttg gacatattta 6000 acatcgggcg tgttagcttt attaggccga ttatcgtcgt cgtcccaacc ctcgtcgtta 6060 gaagttgctt ccgaagacga ttttgccata gccacacgac gcctattaat tgtgtcggct 6120 aacacgtccg cgatcaaatt tgtagttgag ctttttggaa ttatttctga ttgcgggcgt 6180 ttttgggcgg gtttcaatct aactgtgccc gattttaatt cagacaacac gttagaaagc 6240 gatggtgcag gcggtggtaa catttcagac ggcaaatcta ctaatggcgg cggtggtgga 6300 gctgatgata aatctaccat cggtggaggc gcaggcgggg ctggcggcgg aggcggaggc 6360 ggaggtggtg gcggtgatgc agacggcggt ttaggctcaa atgtctcttt aggcaacaca 6420 gtcggcacct caactattgt actggtttcg ggcgccgttt ttggtttgac cggtctgaga 6480 cgagtgcgat ttttttcgtt tctaatagct tccaacaatt gttgtctgtc gtctaaaggt 6540 gcagcgggtt gaggttccgt cggcattggt ggagcgggcg gcaattcaga catcgatggt 6600 ggtggtggtg gtggaggcgc tggaatgtta ggcacgggag aaggtggtgg cggcggtgcc 6660 gccggtataa tttgttctgg tttagtttgt tcgcgcacga ttgtgggcac cggcgcaggc 6720 gccgctggct gcacaacgga aggtcgtctg cttcgaggca gcgcttgggg tggtggcaat 6780 tcaatattat aattggaata caaatcgtaa aaatctgcta taagcattgt aatttcgcta 6840 tcgtttaccg tgccgatatt taacaaccgc tcaatgtaag caattgtatt gtaaagagat 6900 tgtctcaagc tcgccgcacg ccgataacaa gccttttcat ttttactaca gcattgtagt 6960 ggcgagacac ttcgctgtcg tcgacgtaca tgtatgcttt gttgtcaaaa acgtcgttgg 7020 caagctttaa aatatttaaa agaacatctc tgttcagcac cactgtgttg tcgtaaatgt 7080 tgtttttgat aatttgcgct tccgcagtat cgacacgttc aaaaaattga tgcgcatcaa 7140 ttttgttgtt cctattattg aataaataag attgtacaga ttcatatcta cgattcgtca 7200 tggccaccac aaatgctacg ctgcaaacgc tggtacaatt ttacgaaaac tgcaaaaacg 7260 tcaaaactcg gtataaaata atcaacgggc gctttggcaa aatatctatt ttatcgcaca 7320 agcccactag caaattgtat ttgcagaaaa caatttcggc gcacaatttt aacgctgacg 7380 aaataaaagt tcaccagtta atgagcgacc acccaaattt tataaaaatc tattttaatc 7440 acggttccat caacaaccaa gtgatcgtga tggactacat tgactgtccc gatttatttg 7500 aaacactaca aattaaaggc gagctttcgt accaacttgt tagcaatatt attagacagc 7560 tgtgtgaagc gctcaacgat ttgcacaagc acaatttcat acacaacgac ataaaactcg 7620 aaaatgtctt atatttcgaa gcacttgatc gcgtgtatgt ttgcgattac ggattgtgca 7680 aacacgaaaa ctcacttagc gtgcacgacg gcacgttgga gtattttagt ccggaaaaaa 7740 ttcgacacac aactatgcac gtttcgtttg actggtacgc ggcgtgttaa catacaagtt 7800 gctaacgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 7860 acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 7920 actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 7980 gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 8040 cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 8100 tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 8160 gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 8220 ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 8280 aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 8340 tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 8400 ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 8460 gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 8520 tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 8580 caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 8640 ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 8700 cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 8760 ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 8820 cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 8880 gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 8940 aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 9000 acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 9060 gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 9120 cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 9180 cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 9240 tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 9300 cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 9360 gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 9420 cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 9480 ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 9540 gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 9600 taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 9660 gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 9720 acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 9780 aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 9840 cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 9900 atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 9960 gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat 10020 cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 10080 gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 10140 gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca 10200 gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 10260 ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 10320 gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 10380 ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgcc 10435

Claims (23)

1. 조절 가능한 형태의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 분리된 단백질.
2. 제1항에 있어서, 핵 수용체가 레티노산 수용체-관련된 오판 수용체(ROR), 특히, RORα, RORβ 또는 RORγ, 특히 RORα인 분리된 단백질.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 효능제의 리간드 결합 도메인으로의 결합 즉시 활성화될 수 있는 분리된 단백질.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 마커, 특히 태그를 추가로 포함하는 분리된 단백질.
5. 제4항에 있어서, 태그가 His-태그, Arg-태그, Strep-태그, Flag-태그, T7-태그, V5-펩타이드-태그, c-Myc-태그, S-태그, HAT-태그, 칼모듈린-결합 펩타이드-태그, 키틴-결합 펩타이드-태그, GST-태그 및 MBP-태그로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분리된 단백질.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 마커 또는 태그가 특이적 절단 부위에서 단백질분해 절단에 의해 단백질로부터 제거될 수 있는 분리된 단백질.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 분리된 단백질.
8. a) 단백질의 제조에 적합한 조건하에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
   b) 세포 배양물로부터 단백질을 분리하는 단계, 및
   c) 단계 b)의 분리된 단백질을 세제, 특히 포화 비측쇄 C6 내지 C20 알킬 설페이트 또는 카보네이트의 알칼리 염 또는 이소프레닐 염과 접촉시키는 단계
   를 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 분리된 단백질을 제조하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 단계 b) 후 마커 또는 태그를 제거함을 추가로 포함하는 방법.
10. 제9항 또는 제10항에 있어서, 포화 비측쇄 C6 내지 C20 알킬 설페이트 또는 카보네이트의 알칼리 염이 포화 비측쇄 C9 내지 C15 알킬 설페이트의 알칼리 염, 바람직하게는 도데실 설페이트의 알칼리 염, 보다 바람직하게는 리튬 도데실 설페이트(LDS)인 방법.
11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 및/또는 c)가 리간드 결합 도메인에 대한 효능제의 존재하에 수행되는 방법.
12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 동물 세포, 식물 세포 및 효모 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히 세포가 곤충 세포 또는 이.콜라이 세포인 방법.
13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 제조된 조절 가능한 형태의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 분리된 단백질.
14. 핵 수용체의 리간드 결합 도메인에 대한 리간드, 특히 효능제 또는 길항제, 특히 효능제의 동정을 위한, 제1항 내지 제7항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 분리된 단백질의 용도.
15. - 제1항 내지 제7항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 분리된 단백질,
    - 보조 인자 및
    - 핵 수용체의 리간드 결합 도메인으로의 리간드, 특히 효능제의 결합 즉시 상기 단백질과 상기 보조 인자간의 상호작용을 검출하기 위한 수단
    을 포함하는 시험 시스템.
16. 제15항에 있어서, 보조 인자가 마커, 바람직하게는 태그로 임의로 표지된 글루코코르티코이드 수용체-불활성화 단백질-1 (GRIP-1) 또는 스테로이드 수용체 보조 활성화인자 1 (SRC1)인 시험 시스템.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 단백질의 보조 활성화인자로의 근접이 검출가능한 시그날을 유도하는 시험 시스템.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질과 보조 인자간의 상호작용을 검출하기 위한 수단이 상기 단백질 또는 상기 보조 인자에 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하는 시험 시스템.
19. 제18항에 있어서, 2개의 항체를 포함하고, 제1 항체는 단백질에 특이적이고 제2 항체는 보조 인자에 특이적인 시험 시스템.
20. 제19항에 있어서,
    (a) 제1 항체가 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 위한 공여체 잔기로 표지되고 제2 항체가 FRET을 위한 수용체 잔기로 표지되거나 또는 그 반대로 표지되거나;
    (b) 제1 항체가 시간 분해 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET)을 위한 공여체 잔기로 표지되고 제2 항체가 TR-FRET을 위한 수용체 잔기로 표지되거나 또는 그 반대로 표지되거나;
    (c) 제1 항체가 증폭된 발광 근접 균일 분석(ALPHA)을 위한 공여체 잔기로 표지되고 제2 항체가 ALPHA를 위한 수용체 잔기로 표지되거나 또는 그 반대로 표지된 시험 시스템.
21. a) 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 시험 시스템을 물질과 접촉시키는 단계 및
    b) 상기 물질의 리간드 결합 도메인으로의 결합 즉시 측정가능한 시그날을 검출하여, 상기 리간드 결합 도메인에 대한 리간드로서 상기 물질을 동정하는 단계
    를 포함하는, 핵 수용체의 리간드 결합 도메인에 대한 리간드를 스크리닝하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 시험 시스템이 제20항에 정의된 바와 같고 FRET의 존재가 효능제를 나타내는 방법.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 관상 동맥 질환(CAD), 죽상동맥경화증, 이상지질혈증, 신경퇴행성 질환, 수면 장애, 일주기 리듬 질환(disease of circadian rhythmicity) 또는 골다공증을 예방하고/하거나 치료하기 위한 약물을 스크리닝하기 위해 사용되는 방법.

Images