JP2006502970A - レチノイン酸関連オーファンレセプターアルファ(ror−アルファ)のリガンド結合ドメインの結晶構造 - Google Patents
レチノイン酸関連オーファンレセプターアルファ(ror−アルファ)のリガンド結合ドメインの結晶構造 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006502970A JP2006502970A JP2004501451A JP2004501451A JP2006502970A JP 2006502970 A JP2006502970 A JP 2006502970A JP 2004501451 A JP2004501451 A JP 2004501451A JP 2004501451 A JP2004501451 A JP 2004501451A JP 2006502970 A JP2006502970 A JP 2006502970A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rorα
- cholesterol
- lbd
- diseases
- angstroms
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70567—Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- High Energy & Nuclear Physics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
Abstract
Description
本発明は、結晶化形態のRORαおよびその製造方法に関するものである。さらに本発明は、RORαの三次元モデルおよびRORαモジュレーターの設計手段を提供する。
レチノイン酸関連オーファンレセプターα(RORα)は、レセプター、たとえばレチノイン酸レセプター(RAR)、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター(PPAR)、エストロゲンレセプター(ER)、ビタミンDレセプター(VDR)および甲状腺レセプター(TR)が属する核レセプタータンパク質ファミリーの一オーファン構成員である。核レセプターファミリーの他の構成員と同様、RORαは、幾つかのドメイン、中でもDNA結合ドメイン(DBD)およびリガンド結合ドメイン(LBD)から成るモジュラー構造を呈する。後者は、X線構造が解明されているT3Rβ(25%)、VDR(24%)、RARα(24%)、PPARα(24%)およびRXRα(20%)のLBDと低い度合の相同性を表す。しかしながら、RORαのLBDを結晶化させる試みは現在までのところ失敗に帰しており、RORαのX線構造は全く入手できなかった。さらに、この点に加えてリガンドも現在までのところ全く同定されていない。レセプターの生理学的役割についての我々の理解は、天然リガンドの発見により大きく増すことになる。さらに、空間的構成が与えられれば、RORαのアゴニストおよびアンタゴニストの設計の助けとなる。
一局面において、本発明は、RORαの結晶性LBDを提供する。関連局面では、本発明は、リガンドと結合したRORαの結晶性LBDを提供する。別の局面において、本発明は、RORαのLBDの空間的構成を表す座標のセットを提供する。関連局面において、本発明は、RORαのLBDの構造を具体的に表す1セットの座標を含むRORαのLBDのモデルを提供する。別の関連局面において、本発明は、薬剤設計に有用な座標のセットを提供する。さらに別の関連局面において、本発明は、RORαのLBDに結合する物質の同定方法であって、RORαのLBDの構造を具体的に表すモデルを準備し、上記モデルと候補物質の相互作用を評価し、そしてRORαのLBDと相互作用すると予測される物質を選択する方法を提供する。この方法により同定される物質もまた提供される。
表1:コレステロールとの複合体におけるRORαのLBDの天然結晶データおよびX線データ統計値。
表4:RORαへのコレステロールの結合を阻止する突然変異の効果を示す。
表6:RORアルファ転写活性に対するコレステロールおよびコレステロール誘導体の効果。
図2は、RORα‐LBDおよびコレステロール間における複合体のX線構造表す概略図を示す。
本発明は、RORαのLBDの結晶を提供する。さらに、本発明は、X線結晶学による上記結晶の構造測定法を提供する。一実施態様において、結晶の構造は1.88オングストロームの分解能まで解明されている。驚くべきことに、結晶はRORαに結合したリガンドを含むことが見出された。リガンドは、コレステ−5−エン−3ベータ−オール(コレステロール)として同定された。すなわち、本発明は、たとえばインシリコ(コンピューター利用)スクリーニング、ドッキングおよび合理的薬剤設計に有用なRORαのLBDの空間的構成に関する情報だけでなく、リガンド結合に関与するアミノ酸の同定に有用であるRORαに結合しているリガンドとしてのコレステロールに関する情報も提供する。本発明にしたがって提供される情報は、下記で実例を挙げている通り、RORαのLBDに結合する化合物の設計基盤として使用され得る。本発明により提供されるRORαの結晶LBDは、いかなる結晶形態でもとり得るが、好ましくは単結晶である。さらに好ましい実施態様において、結晶は、a=55オングストローム±5オングストローム、b=50オングストローム±5オングストローム、c=60オングストローム±6オングストロームおよびβ=98.5°±9°の大きさを有する単位格子および空間群P21を含む。好ましくは、単位格子の大きさは、a=55.9オングストローム±2オングストローム、b=49.9オングストローム±2オングストローム、c=60.7オングストローム±2オングストロームおよびβ=98.7°±5°またはa=54.4オングストローム±2オングストローム、b=49.9オングストローム±2オングストローム、c=60.7オングストローム±2オングストローム、β=97.8°±5°である。別の好ましい実施態様において、RORαの結晶LBDはヒトに由来する。本発明によるRORαの結晶LBDは、好ましくは第二化学物質と会合している。かかる物質は天然または合成化学分子のいずれでもあり得、好ましいのは小分子であり、さらに好ましいのは小親油性分子である。コレステロールは、本発明にしたがって、この結合ポケットへ収まるリガンドとして同定されている。すなわち、特に好ましい実施態様において、かかる物質はコレステロールまたはコレステロール誘導体である。本明細書で使用されている「小分子」の語は、分子量が3000Da未満、さらに好ましくは1000Da未満、最も好ましくは500Da未満である、天然または合成化合物、好ましくは有機分子をいう。本明細書で使用されている「親油性」の語は、主として非極性であり、水に僅かしか溶けない化合物をいう。典型例には、脂肪酸、レチノイン酸、メラトニン、ステロイドホルモン、ビタミンD誘導体が含まれ得る。他の例には、タモキシフェンまたはラロキシフェンのような親油性分子が含まれ得る。本発明によると、特に好ましい親油性リガンドは、コレステロールおよびその誘導体である。本明細書で使用されている「コレステロール誘導体」は、コレステロールとの類似性、たとえば同じ全体構造を有するが、置換基が異なるかまたは不飽和結合の位置または立体異性体の差異を伴う分子をいう。上記コレステロール誘導体についての例は、たとえばhttp://www.steraloids.comにおいて見出され得る。
(His)6RORα-LBD304-556のクローニングおよび発現
ATGコドンまでのポリヘドリン(多角体タンパク質)プロモーターの一部をコード化するDNAフラグメントを、オリゴヌクレオチドRS365(5’-ACCATCTCGCAAATAAATAAG-3’)およびMG384(5’-ATGATGATGATGATGATGGC-TGCTGCCCATGGTGGGAACTCGAGGCCTGCAGGG-3’)を用いることによりpBAKPac8プラスミド(クロンテック)からのPCRにより増幅する。MG384は、鋳型DNAには存在しないが、ATGコドンの正面にあるコザック配列をコード化する5'伸長部分および最終遺伝子操作ベクターに存在するHis標識の一部を有する。第二PCR反応は、RORαタンパク質のリガンド結合ドメイン(aa304−aa556;SWISS−PROT P35398−1による番号付け)をコード化するプラスミド鋳型でのオリゴヌクレオチドMG383(5’-GCCATCATCATCATCATC-ATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGCAGAATTAGAACACCTTGC-3’)およびMG385(5’-GTACCAGATCTTCTAGATTCGTTACCCATCAATTTGCATTG-3’)により行なわれる。第一PCRフラグメントについては、オリゴヌクレオチドMG383は、第一PCRフラグメントに存在する伸長部と相補的であり、MG384によるフラグメントの伸長により付加された5'伸長部を有する。新たな両フラグメントを混合し、MG365およびRS365でのPCR増幅により、コザック配列、ATG、(His)6‐標識およびPreScissionプロテアーゼ開裂部位(Amersham Pharmacia)についての開裂部位をコード化する新たなフラグメントが、RORαリガンド結合ドメインの正面に導入される。この新しいフラグメントは、標的プラスミドpBAKPac8と共通した2つの相同性領域を両末端に有する。遺伝子操作を加えた遺伝子のクローニングベクターへの組込みは、前述の方法(Geiser et al.、BioTechniques 31 88−92、2001)を用いることにより行なわれる。生成したクローンのDNA配列解析により、クローンが意図された通りであることを確認する。このプラスミドをpXI338と称する。
(His)6RORα−LBD304−556を、標準方法にしたがってNi−NTAクロマトグラフィー、次いでアニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。20gの細胞ペーストから、15mg前後の(His)6RORα−LBD304−556が精製される。タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーでは単量体として振るまう。N−末端配列解析は、N−末端が遮断されていることを示す。質量分析計による解析は、アセチル‐デスMet−(His)6RORα−LBD304−556(Acet- GSSHHHHHHLEVLFQGPAELEH…MQIDG)に対応する31515.4の均一分子質量を示す。PreScission(登録商標)プロテアーゼによるN−末端6xHis標識のタンパク質加水分解的開裂により、有用な結晶を生じないが均一のタンパク質が生じる。対照的に、非開裂RORα−LBDは、X線回折解析に適切な結晶をもたらす。
50mMトリス‐HCl pH7.5、100mMのNaCl、5mMのDTT中の組換え体ヒトRORα−LBDを、14mg/mlに濃縮する。ハンプトン リサーチからのVDX結晶化プレートおよびシリコーン処理した顕微鏡カバーグラスと共に標準的蒸気拡散ハンギングドロップ設備を用いて結晶化を実施する。カバーグラス上で混合することにより結晶化小滴を作製する。2.0μlのタンパク質ストック溶液を2.0μlのレザーバー溶液と共に20℃で700μlのレザーバー溶液に対して平衡状態にする。市販のスクリーニングキットを用いて、予備的な結晶条件を見出す。精密条件で、結晶は、100mMトリス−HCl pH8.4、19%PEG6000、0.2MのCaCl2のレザーバーにより20℃で2週間以内に0.15×0.15×0.3mmのサイズに成長する。天然結晶の空間群はP21であり、単位格子パラメーターはa=55.9オングストローム、b=49.9オングストローム、c=60.7オングストローム、β=98.7°および空間群P21である。一非対称単位につき一単量体が存在する。結晶は、シンクロトロン(ESRFでのSNBL、グルノーブル)で少なくとも1.88オングストロームに回折する。
天然データ収集のため、上記要領で成長させた結晶を、約10秒間20%グリセリン(レザーバー組成物に加えて)を含む溶液5μlに移す。次いで、結晶を迅速にナイロン製クリオループ(ハンプトン リサーチ)に載せ、105KでのX線データ収集用に冷窒素気流中で直接冷凍する。European Synchrotron Radiation Facilityのスイス−ノルウェジアン ビームラインのmar345イメージプレートシステム(λ=0.8727オングストローム)により回折データを集める。各1.0°回転の合計230画像を、178mmの結晶〜検出器距離(180mmのリードアウトプレート直径を用いる)による時間モード(1フレームにつき15秒)で集める。未処理回折データを処理し、HKLプログラム総合ソフトウェアのバージョン1.96.6(OtwinowskiおよびMinor、1996)でスケールする。結晶データおよびネイティブデータのデータ収集統計を表4に示す。天然結晶の空間群はP21であり、単位格子パラメーターは、a=55.9オングストローム、b=49.9オングストローム、c=60.7オングストローム、β=98.7°である。1非対称単位当たり1単量体が存在する。ウィルソンプロットにより推定されるBファクターは20(オングストローム)2である。Hg誘導体データ収集については、4mMの酢酸メチル水銀を含む(レザーバー組成物に加えて)溶液5μlに結晶を予め1時間浸す。次いで、天然結晶の場合と同様に低温冷却を実施する。European Synchrotron Radiation Facilityのスイス‐ノルウェジアン ビームラインのmar345イメージプレートシステム(λ=0.8727オングストローム)により回折データを集める。各1.0°回転の合計287画像を、178mmの結晶〜検出器距離(180mmのリードアウトプレート直径を用いる)による時間モード(1フレームにつき15秒)で集める。未処理回折データを処理し、HKLプログラム総合ソフトウェアのバージョン1.96.6(OtwinowskiおよびMinor、1996)でスケールする。結晶データおよびHg−誘導体データのデータ収集統計を表2に示す。Hg誘導体結晶の空間群はP21であり、単位格子パラメーターは、a=55.6オングストローム、b=50.0オングストローム、c=60.1オングストローム、β=98.0°である。1非対称単位当たり1単量体が存在する。ウィルソンプロットにより推定されるBファクターは29(オングストローム)2である。
pbd−エントリ2lbd(hRARγ)または1bsx(hTRβ)の座標に基いた幾つかの異なるモデルを用いることによる、プログラムAmoRe(Navaza、1994)またはMOLREPバージョン6.2.5.(Vagin & Teplyakov、J.Appl.Cryst. 30、1022−1025、1997)による分子置換により構造を解明する試みは、成功していない。すなわち、水銀置換結晶に関する単波長実験からのデータを、SIRASによる初回位相決定についてのネイティブデータセットと一緒に使用する。異常分散差および同形差パターソン地図は、少なくとも1個の共通した主要ピークを示す。観察された異常分散差を用いるDREAR正規化(Blessing & Smith、J.Appl.Cryst.32、664−670、1999)と共にSnBバージョン2.1(Weeks & Miller、J.Appl.Cryst.32、120−124、1999)を用いて、4個のHg‐部位を決定する。それに続いて、MLPHAREバージョン4.1(CCP4、1994)を用いて、重原子パラメーターを精密化する。DM(CCP4、1994)による後続の密度修正により、優れた実験的SIRAS地図が得られる。mapmanプログラムでの骨格化により、Oバージョン7.0(Jones et al.、Acta Crystallogr.A47:110−19、1991)での連鎖トレーシングおよびモデルビルディングが可能となる。
タンパク質(残基His308−Phe544は可視電子密度を有していた)を構築し、112個の水分子を実験的SIRAS地図へ挿入した後、数回の精密化および手動再構築の交互サイクルにより、Rcryst=28.1%(8オングストローム‐1.88オングストローム)を有するモデルを作製することにより、LBPにおけるリガンドについての優れた2Fo−FcおよびFo−Fc地図が得られる。優れた品質の電子密度により、コレステ−5−エン−3ベータ−オール(コレステロール)であるものとしてリガンドが明白に同定され得る。次いで、コレステロールリガンドを電子密度へ構築し、X−PLORパラメーター‐および構造‐ファイルが、X−PLORパラメーター‐および構造‐ファイルの作成に使用され得るプログラムXPLO2D(Kleyewgt G.、CCP4/ESF−EACBM Newsletter on Protein Crystallography 31、45−50、1995)により作製され得る。さらに精密化および119個のさらなる水分子の挿入(合計231個の水分子となる)のサイクルにより、最終Rcryst=24.8%およびRfree=26.3%が得られる(シグマ カットオフ無し、8オングストローム〜1.8オングストローム、25592特有反射の作業セット、1279反射の試験セット)。一般に、電子密度は、弱い密度を有するループ493−498以外、優れた品質を有する(残基308−544は、モデルに含まれる)。精密化は、タンパク質についてのEnghおよびHuberの力場(Engh & Huber、Acta Crystallogr.A47:392−400、1991)を用いるX−PLOR3.1(A.Bruenger、X−PLORバージョン3.1:A system for X-ray Crystallography and NMR、Yale University Press, New Haven, CT, USA, 1992)で行なわれる。使用される連鎖識別子は、タンパク質についてのA(残基His308−Phe544、SWISS−PROT P35398−1による番号付け)、リガンドについてのL(コレステロール:残基1)および水分子についてのV(合計231)である。pdb−ファイルでリガンドコレステロールについて使用される原子数は、IUPAC−IUBによる原子数と同じではない。
RORα−LBDは、NR−LBDについての標準的な折りたたみ構造をとり(Wurtz et al.、Nat Struct Biol 3、206、1996)、加えて2個のらせんH2*およびH11*を有する。H12の位置により判断すると(図2および3も参照)、RORα−LBDはアゴニスト結合状態にある。この位置にあるH12は、H3−H4領域と一緒になって、補助活性化因子についての適切な相互作用表面、すなわち完全AF−2を形成する(Renaud & Moras、Cell.Mol.Life Sci.、57、1748−1769、2000で概説)。この結晶構造を得るために補助活性化因子ペプチドが付加されることはない。追加のH2*らせんはまた、ペルオキシソーム増殖因子−活性化レセプター(PPAR;Nolte et al.、Nature、395、137−143、1998)についてはH2およびH3間に見出される。H11*は、既知LBD構造の中でRORα−LBD(およびRORβ−LBD、Stehlin et al.、Embo J.、20、5822−5832、2001)に特有なものである。それは、RARのループ11−12の中間部分と概ね重なり合う。RORα−LBDの全体構造は、RORβ−LBDの一つと類似しているが(例、Stehlin et al.、同上、2001における図4により判断)、RORβ−LBDの座標は入手できないため、RORα−LBDとの定量的比較は為され得ない。RORα−LBDについては、リガンドについての推定エントランス部位(複合体の溶媒接近可能表面により判断)は、H2およびH3間に位置し、たとえばRAR−γについて仮定されているように(Renaud et al.、378、681−689、1995)、H12側ではない。結晶では、非対称単位のRORα−LBD分子は、近隣分子とは二量体を形成しない。これは、天然ゲルではRORα−LBDが単量体としてふるまうという発見と一致する。以下のCys残基は酢酸メチル水銀と反応した(Hg部位の分率座標については表2参照):Cys321(部位3)、Cys429(部位1)、Cys505(部位4)およびCys514(部位2)。すなわち、これらの反応性Cys残基はSerへの突然変異についての候補であり、その結果恐らくはE.coliでの可溶性発現が獲得される。結晶化セットアップに存在するタンパク質種は、以下の配列His6−標識およびPreScission(登録商標)開裂部位およびRORα−LBDの残基304−556:
CSD(エントリFIZDUN)からの26−OH−コレステロールの小分子X線構造は、この不偏電子密度への完全明白なフィット(26−OH基の除去およびC24−C25結合周囲での120°回転後)を示す。すなわち、高分解能の優れた品質により、リガンドはコレステ−5−エン−3ベータ−オール(コレステロール)として同定され得る。RORαのリガンド結合ポケットさらに精密に調べると、コレステロールの末端イソプロピル基のC27がTrp353の側鎖とvdW接触をもち、C26がIle360の側鎖とvdW接触をもっていることが判る。C26における置換基は、H12の位置に影響を及ぼす可能性を有する(例、C26における巨大置換基は、H12をそのアゴニスト位置から除去し得るため、コレステロールのアンタゴニスト的誘導体を誘導する)。この結晶構造におけるH12は、アゴニスト位置をとる。それは、OH−Tyr540(H12)およびNE2−His517(H11)間の水素結合(距離2.8オングストローム)によりアゴニスト位置で安定している。これら2残基は、RORのα−、β−およびγ−のイソ型間で変換される。
全般的に、LBPへのリガンドコレステロールのフィットは非常に良好である。にもかかわらず、リガンドのvdW‐表面と、LBPのvdW‐表面を比較すると、依然としてコレステロールの誘導体化についての可能性が僅かに存在し(図4および5)、親和力が増強され得ることが示される。追加の水素結合は、6位(OE1−Glu362への水を介した水素結合)、19位(CO−Tyr413への水素結合)または26位(OH−Tyr540および/またはNE2−His517への水素結合)に付加されたヒドロキシ基により得られる。かなりの静電気相互作用エネルギーが、3位に付加された荷電基、たとえばSO4−により得られる(NH1−Arg400、NH2−Arg403、NE−Arg403、NH−Gln322および/またはNH−Tyr323への水分子を介した水素結合および静電気相互作用)。さらなるvdW相互作用は、12位(Phe398、Met401の側鎖へのvdW接触)、18位(Val412、Phe398の側鎖へのvdW接触)、27位(Trp353、Cys429、Phe432の側鎖へのvdW接触)に付加された追加メチル基または21位(Phe424、Ile433、Val436、Phe437の側鎖へのvdW接触)に付加された追加エチル基により得られる。4および6位における修飾は、必要ならば、あまり親和力を変えることなく物理化学的または薬物動態パラメーターを修正するのに使用され得る。巨大置換基を伴う26位における誘導体は、H12をそのアゴニスト位置で脱安定化する可能性を有するため、誘導体にアンタゴニスト的活性を与える。
本X線構造は、以下の構造的作用機構を促す:コレステロール(または恐らくはコレステロール誘導体)はH2,H3側からLBPに入り、これは恐らくはArg400およびArg403から発生した静電界により導かれたと思われる。次いで、コレステロール(またはこの位置にある誘導体)のイソプロピル末端は、LBPの他端に影響を及ぼし、これがH12と接触をもつことにより、LXXLL−結合部位への補助活性化因子の結合を調節する。C26に巨大置換基を伴うコレステロール誘導体は、そのアゴニスト立体配座からH12を置換することにより、補助活性化因子結合を阻止し、さらにTyr540およびHis517間の水素結合を安定させるコレステロール誘導体はアゴニスト立体配座をさらに強化する。
RORα‐LBD X線構造からの座標を用いて、コレステロールの結合を阻止すべきLBPにおける一連の点突然変異が設計され、加えてTyr540(H12)およびHis517間の水素結合の喪失によりH12安定化を阻止/低減化すべき突然変異が提案される(Tyr540‐>Phe540突然変異)。突然変異の詳細は下記に包含される。
哺乳類細胞は、リポタンパク質(LDL−コレステロール)からの取込によりコレステロールを受け取り、メバロン酸塩経路を通じてコレステロールを合成することができる。細胞が本質的にステロール不含有の条件下で培養される状況において、主要転写因子、SREBPは、タンパク質加水分解的に開裂され、これが転写因子を核に放出する。この転写因子は、HMG‐CoAレダクターゼを転写活性化することができ、これがメバロン酸塩経路を通したコレステロール生合成における重大な段階である。高コレステロール状態についての既知薬剤であるスタチン類は、HMG‐CoAレダクターゼの特異的阻害剤である。細胞をステロール不含有培地で培養するとき、それらのHMG‐CoAレダクターゼは強く活性化される。この実験では、本質的にステロール不含有培地で培養された細胞を、フルバスタチンで処理する。RORα活性の明らかな減少が観察されることから、細胞内コレステロールレベルの低下は、RORα転写活性の減少により翻訳されるという結論に導かれる(表5)。U2OS細胞を、RORαについての共通応答エレメントをもつルシフェラーゼリポーター遺伝子(RORE−tk−luc)と一緒にRORα(ROR)用発現ベクターでトランスフェクションする。ルシフェラーゼ活性を6ウェルプレートからの細胞で検定し、フルバスタチン処理を伴うかまたは伴わなわずにトランスフェクションされた細胞での活性と関連づける。結果をタンパク質含有率に対して正規化する。
コレステロールサルフェート(表6における化合物番号12)を含む様々なコレステロール誘導体を、本質的にコレステロール不含有培地でRORαのROREへの結合についてスクリーニングする。RORαタンパク質は、バクロウイルス系で発現される。他の化合物は、番号2:5α−コレスタン−3−オン(ステラロイドC4550)、3:4−コレステン−3α−オール(C6090)、4:5−コレステン−3β,6−ジオール(C6418)、5:5−コレステン−3β,7α−ジオール7−ベンゾエート(C6425)、6:5−コレステン−3β,7β−ジオール7−ベンゾエート(C6438)、7:5−コレステン−3β,19−ジオール(C6470)、8:5−,25R−コレステン−3β,26−ジオール(C6570)、9:5−コレステン−24β−エチル−3β−オールアセテート(C6681)、10:5−コレステン−3α−オール(C6730)、11:5−コレステン−3β−オール(C6760)、12:5−コレステン−3β−オールサルフェート、ナトリウム塩(C6905)、13:7,(5α)−コレステン−3β−オール(C7400)、14:7−デヒドロコレステロール(フルカ30800)である。これは、X線構造により予測された通り、コレステロールサルフェートがコレステロールを置換できることを示している。
次に、我々は、コレステロールを部分的に枯渇させた真核生物細胞において、RORα転写活性がコレステロールを加えることにより再構成され得るか否かを確立する。したがって、我々は、細胞をヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(HPCD)、コレステロールシャトルとして機能することが知られているシクロデキストリン誘導体で処理する。HPCD処理は、細胞内コレステロールの部分枯渇を目指す実験で使用される。メバロン酸塩経路の活性化を通じて細胞内コレステロールの増加を阻止するため、同じく細胞をロバスタチンで処理し、LDL不含有血清を含む培地でそれらを培養する。HPCDおよびロバスタチンの組合せを用いることにより、ROREリポーターの転写は、コレステロール、エピコレステロールおよびコレスタノールに応答し、さらに高い度合でコレステロールサルフェートおよび7−デヒドロコレステロールにより刺激されることがわかった。対照的に、試験された全ヒドロキシコレステロールは、顕著な活性を示すことはなく、コレステロール誘導体5−コレステン−24β−エチル−3β−オール−アセテートは、賦形剤と比べてもRORα転写活性の増加を全く誘発しない(表6)。これらのデータは、我々のRORαのX線構造を用いたコレステロール誘導体に関するドッキング試験と十分な相関関係を示す。
(His)6RORα−LBD269−556を、Sf9細胞で製造し、Ni−NTAクロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。135μM濃度のトリス−HCl緩衝液中のタンパク質を、10倍モル過剰の25−ヒドロキシコレステロール(5−コレステン−3ベータ,25−ジオール)またはコレステロールサルフェート(5−コレステン−3ベータ−オール−サルフェート)と4℃で一晩インキュベーションする。質量分析前に、タンパク質を、製造業者の使用説明書にしたがって使い捨てCentri Spin20カラム(Princeton Separations, Adelphia, NJ)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより50mM酢酸アンモニウム(pH7.0)中での高速緩衝液交換にかける。マイクロマスZ型エレクトロスプレーイオン化ソース(ESI)を備えたQ−Tof(Micromass, Manchester, UK)四重極飛行時間型ハイブリッドタンデム質量分析計を用いて、質量分析法を実施する。捕捉質量範囲は、典型的には5秒でm/z1500〜4500である。質量分析法を調整することにより、非共有結合複合体の多価核種の検出が可能となる。ソース遮断温度および脱溶媒和温度をそれぞれ50℃および80℃に保つ。試料コーン電圧(Vc)を標準測定用の23ボルトにセットする。インソース誘導フラグメンテーション実験を、Vcを100ボルトまで高めることにより実施する。タンパク質溶液を10μL/分の流速で注入する。データを記録し、Masslynxソフトウェアを用いて処理する。MaxEnt分析ソフトウェア(マイクロマス、マンチェスター、英国)を用いて、スペクトルをデコンヴォルーションする。結果は、25−OHコレステロールおよびコレステロールサルフェートが両方ともROR−LBDに結合したコレステロールを完全に置換できることを示している。さらに、リガンド/ROR−LBD−複合体およびアポ−ROR−LBD(リガンド無し)間の様々なコーン電圧(Vc)での比較は、コレステロールおよび25−OHコレステロールがインソース衝突に対して類似した安定性を有することを示している。対照的に、コレステロールサルフェート/ROR−LBD複合体は、コレステロールまたは25−OHコレステロール複合体よりも安定している。
複合体ROR(アルファ)/コレステロールサルフェートに関する全アミノ酸残基(例、添付のコレステロールサルフェートとの複合体の座標、表9)を、SWISS−PROTエントリP35398(33を引いた図1に示されたSWISS−PROT P35398−1による所定のアミノ酸の番号に対応する)のスプライス変異型アルファ−1(すなわちP35398−2)にしたがって番号づけする。複合体ROR(アルファ)/コレステロールに関する全アミノ酸残基(例、添付のコレステロールとの複合体の座標、表8)を、SWISS−PROTエントリP35398のスプライス変異型アルファ−2(すなわちP35398−1)にしたがって番号づけするが、ただし、使用された番号づけがP35398−2にしたがっている図7〜11を除き、コレステロールサルフェート複合体との比較検討におけるものを除く。請求の範囲に明記されている全アミノ酸残基を、図1に示された、SWISS−PROTエントリP35398のスプライス変異型アルファ−2(すなわち、P35398−1)にしたがって番号づけする。
構築物(His)6RORα−LBD270−523の生成、発酵および精製は、上記要領で行なわれる。コレステロールサルフェートによるコレステロールの置換は37℃で行なわれ、MS分析により確認される。コレステロールサルフェートをDMSOに50mMで溶かし、73μMの(His)6RORα−LBD270−523溶液に1.0mM最終濃度で加える。生成した溶液を37℃で一晩インキュベーションし、SPX75カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した後、結晶化試験用に17.6mg/mlに濃縮する。天然複合体のMS測定を前記要領で行う(Kallen et al.、Structure、第10巻、1697−1707、2002)。同量のRORαLBDタンパク質を5%DMSOと同一条件下でインキュベーションすることにより、対照実験を行う。タンパク質濃度は、50mMのAcONH4(pH7.0)中約15μMである。Vc=20ボルトの同一条件下で両スペクトルを記録する。
結晶化に使用されるタンパク質は、100mMのNaCl、50mMのトリス−HCl(pH7.5)、5mMのDTT中17.6mg/mlである。結晶化条件について最初からの検索に取りかかる。ハンプトン リサーチ製のVDX結晶化プレートおよびシリコーン処理した顕微鏡カバーグラスによる、標準蒸気拡散ハンギングドロップ設備を用いて、試験を実施する。1.0μlのタンパク質ストック溶液を1.0μlの結晶化溶液とカバーグラス上で混合することにより、結晶化小滴を4℃でセットアップする。
表7:
図10は、コレステロールおよびコレステロールサルフェートとのROR(アルファ)複合体についての重ね合わせ(各LBDのCαを用いる)を示す。重ね合わせ後の残基Pro270−Phe511のCα原子についてのr.m.s.dは0.26オングストロームである。タンパク質部分における唯一の顕著な変化は、Ile327の側鎖およびループ1−2(残基Gln289およびTyr290)について生じる:Gln289およびTyr290についてのバックボーンNH原子は、硫酸基との相互作用を改善するために、硫酸基に向かって約0.8オングストロームほど移動する(各側鎖の同時移動を伴う)。Ile327の側鎖は、末端イソプロピル基との立体衝突を回避するために僅かに移動しなければならない(図9)。比較結果は、コレステロールサルフェートおよびコレステロールが類似した全般的結合モードを有するが、コレステロールサルフェートはLBPの親水性正荷電部分に向かって僅かに(例、対応するC3原子は0.85オングストロームおよび対応するC2原子は0.7オングストロームほど)置き換えられていることを示す(図9)。これは、硫酸基により為される静電気および水素結合相互作用の最適化により説明され得る。LBPの親水性部分におけるコレステロールについて存在する7個の整列した水分子は、コレステロールサルフェートとの複合体では置き換えられている(図10)。硫酸基およびNH1−Arg367およびO−Ala330間の相互作用を仲介する唯一保存された水分子は依然として存在している。硫酸基は、NH−Gln289、NH−Tyr290およびNH1−Arg370との直接水素結合相互作用を為す。これはドッキング仮説を確認するもので、コレステロールサルフェートの提案が導かれる。
Claims (29)
- RORαの結晶性LBD。
- RORαのLBDが小分子と会合している、請求項1記載のRORαの結晶性LBD。
- RORαのLBDが親油性物質と会合している、請求項1または2記載のRORαの結晶性LBD。
- RORαのLBDがコレステロールまたはコレステロールの誘導体と会合している、請求項1、2または3記載のRORαの結晶性LBD。
- 結晶が、a=55.9オングストローム±2オングストローム、b=49.9オングストローム±2オングストローム、c=60.7オングストローム±2オングストロームおよびβ=98.7°±5°の大きさを有する単位格子および空間群P2(1)を含む、請求項1〜4のいずれかに記載のRORαの結晶性LBD。
- RORαの結晶性LBDが表8または9の原子構造座標またはその一部を含む、請求項1〜5のいずれかに記載のRORαの結晶性LBD。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の結晶の重原子誘導体。
- 表8または9における原子座標の一つまたはそれ以上のセットを含むLBD RORαの構造を具体的に表すモデルを含むコンピューター読取可能媒体。
- RORαのLBDに結合する物質の同定方法であって、
(a)表8または9における原子座標の一つまたはそれ以上のセットを含むRORαのLBDの構造を具体的に表すモデルを提供し、
(b)上記モデルと候補物質の相互作用を評価し、そして
(c)RORαのLBDと相互作用すると予測される物質を選択する
ことを含む方法。 - 選択された物質をRORαのLBDとさらに接触させる、請求項9記載の方法。
- 物質が、Cys321、Gln322、Tyr323、Leu328、Trp353、Cys356、Ala357、Lys359、Ile360、Glu362、Ala363、Val397、Phe398、Arg400、Met401、Arg403、Ala404、Val412、Tyr413、Phe414、Phe424、Leu427、Cys429、Phe432、Ile433、Val436、His517、Lys520およびTyr540から成る群から選択される1個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用する、請求項9または10記載の方法。
- 物質が、Gln322、Tyr323、Arg400およびArg403から成る群から選択される1個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用する、請求項9または10記載の方法。
- 相同体が、1.5オングストローム以下のアミノ酸のバックボーン原子からの二乗平均偏差(derivation)を有する、上記モデルの相同体を用いる請求項9、10、11または12記載の方法。
- 物質が小分子である、請求項9、10、11、12または13記載の方法。
- 物質がコレステロールまたはコレステロール誘導体である、請求項14記載の方法。
- (a)表8または9に示された原子座標の一つまたはそれ以上のセットによる合理的な薬剤設計を実施することにより可能性のある化合物を選択し、ただし選択はコンピューターモデリングと連係的に実施するものとし、(b)可能性のある化合物をRORαのLBDと接触させ、そして(c)RORαの生物活性を測定することを含む、RORαのLBDに結合するアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法。
- 化合物が、Cys321、Gln322、Tyr323、Leu328、Trp353、Cys356、Ala357、Lys359、Ile360、Glu362、Ala363、Val397、Phe398、Arg400、Met401、Arg403、Ala404、Val412、Tyr413、Phe414、Phe424、Leu427、Cys429、Phe432、Ile433、Val436、His517、Lys520およびTyr540から成る群から選択される1個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用するように設計されている、請求項16記載の方法。
- 物質が、Gln322、Tyr323、Arg400およびArg403から成る群から選択される1個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用する、請求項17記載の方法。
- 化合物がアゴニスト位置におけるRORαのLBDのらせん12を安定化させる場合にはそれがRORαアゴニストとして選択される、請求項18記載の方法。
- 化合物がアゴニスト位置からRORαのLBDのらせん12を脱安定化させる場合にはそれがRORαアンタゴニストとして選択される、請求項19記載の方法。
- アゴニスト位置におけるRORαのらせん12を安定化させる化合物の治療有効量および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
- アゴニスト位置からRORαのらせん12を脱安定化させる化合物の治療有効量および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
- RORαと相互作用する化合物についてのスクリーニング方法であって、
(a)RORαを候補化合物と接触させ、(b)ステロールの不存在下で候補化合物およびRORα間における相互作用を測定し、そして(c)化合物がRORαと相互作用する場合にはそれを選択することを含む方法。 - コレステロール関連疾患の処置に有用な化合物についての請求項23記載のスクリーニング方法。
- 内分泌疾患、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患、代謝性疾患、たとえば肥満、炎症性疾患、皮膚病、CNSに関連した疾患、たとえばアルツハイマー病および腫瘍関連疾患の処置に有用な化合物についての請求項23記載のスクリーニング方法。
- コレステロール関連疾患の処置に有用な化合物を同定するための細胞スクリーニング検定法におけるRORαの使用。
- 内分泌疾患、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患、代謝性疾患、たとえば肥満、炎症性疾患、皮膚病、CNSに関連した疾患、たとえばアルツハイマー病および腫瘍関連疾患による化合物を同定するための細胞スクリーニング検定法におけるRORαの使用。
- RORαのLBDおよびコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む組成物。
- 組成物が結晶化し得る、請求項28記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US37642702P | 2002-04-29 | 2002-04-29 | |
PCT/EP2003/004433 WO2003093312A1 (en) | 2002-04-29 | 2003-04-28 | Crystal structure of the ligand binding domain of the retinoic acid-related orphan receptor alpha (ror-alpha) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006502970A true JP2006502970A (ja) | 2006-01-26 |
JP2006502970A5 JP2006502970A5 (ja) | 2006-06-22 |
Family
ID=29401346
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004501451A Pending JP2006502970A (ja) | 2002-04-29 | 2003-04-28 | レチノイン酸関連オーファンレセプターアルファ(ror−アルファ)のリガンド結合ドメインの結晶構造 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050165218A1 (ja) |
EP (1) | EP1501867A1 (ja) |
JP (1) | JP2006502970A (ja) |
AU (1) | AU2003227689A1 (ja) |
WO (1) | WO2003093312A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010540474A (ja) * | 2007-09-27 | 2010-12-24 | サノフィ−アベンティス | 制御可能な形態の核受容体のリガンド結合ドメイン及びそれを含む方法 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003292144A1 (en) * | 2002-11-27 | 2004-06-18 | Develogen Aktiengesellschaft Fur Entwicklungsbiologische Forschung | Proteins involved in the regulation of energy homeostasis |
WO2009026172A2 (en) * | 2007-08-17 | 2009-02-26 | The Regents Of The University Of California | New approach for designing diabetes drugs |
KR101085602B1 (ko) * | 2009-01-08 | 2011-11-22 | 서울대학교산학협력단 | RORα를 이용한 항암제 스크리닝 방법 |
WO2011115892A1 (en) * | 2010-03-15 | 2011-09-22 | Griffin Patrick R | Modulators of the retinoic acid receptor-related orphan receptors |
TWI728017B (zh) | 2015-12-15 | 2021-05-21 | 瑞典商阿斯特捷利康公司 | 異吲哚化合物、包含其之醫藥組成物及其用途 |
JP2020524660A (ja) | 2017-06-14 | 2020-08-20 | アストラゼネカ・アクチエボラーグAstrazeneca Aktiebolag | Ror−ガンマモジュレーターとして有用な2,3−ジヒドロイソインドール−1−カルボキサミド |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5958683A (en) * | 1994-03-30 | 1999-09-28 | Novartis Corporation | Screening method using the RZR receptor family |
FR2776388B1 (fr) * | 1998-03-20 | 2006-04-28 | Lipha | Utilisation de recepteurs de la famille ror pour le criblage de substances utiles pour le traitement de l'atherosclerose |
GB9924057D0 (en) * | 1999-10-11 | 1999-12-15 | Novartis Ag | Organic compounds |
US20040265809A1 (en) * | 2001-05-07 | 2004-12-30 | Dino Moras | Polypeptides derived from retinoic acid-related orphan receptor(ror) and their applications |
-
2003
- 2003-04-28 US US10/509,316 patent/US20050165218A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-28 EP EP03725112A patent/EP1501867A1/en not_active Withdrawn
- 2003-04-28 WO PCT/EP2003/004433 patent/WO2003093312A1/en not_active Application Discontinuation
- 2003-04-28 AU AU2003227689A patent/AU2003227689A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-28 JP JP2004501451A patent/JP2006502970A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010540474A (ja) * | 2007-09-27 | 2010-12-24 | サノフィ−アベンティス | 制御可能な形態の核受容体のリガンド結合ドメイン及びそれを含む方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2003227689A1 (en) | 2003-11-17 |
US20050165218A1 (en) | 2005-07-28 |
EP1501867A1 (en) | 2005-02-02 |
WO2003093312A1 (en) | 2003-11-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6795776B1 (en) | Crystallographic structure of the androgen receptor ligand binding domain | |
Hoerer et al. | Crystal structure of the human liver X receptor β ligand-binding domain in complex with a synthetic agonist | |
US20060160135A1 (en) | SF-1 and LRH-1 modulator development | |
MXPA00005241A (es) | Ligandos de receptores nucleares y dominios de union a ligando. | |
JP2002516983A (ja) | 核受容体活性を調節するための方法及び化合物 | |
JP2006502970A (ja) | レチノイン酸関連オーファンレセプターアルファ(ror−アルファ)のリガンド結合ドメインの結晶構造 | |
US20070020684A1 (en) | Structure of a glucocorticoid receptor ligand binding domain comprising an expanded binding pocket and methods employing same | |
US7217556B1 (en) | Crystallization and structure determination of glycosylated human beta secretase, an enzyme implicated in Alzheimer's disease | |
EP1385885B1 (en) | Fragments of the retinoic acid-related orphan receptor (ror) comprising the ligand binding domain (lbd), crystal structure of the lbd of ror-beta and their applications | |
JP2006502970A5 (ja) | ||
US20110039352A1 (en) | Methods to measure dissociation rates for ligands that form reversible covalent bonds | |
US8350007B2 (en) | Crystal structure of human mitoNEET protein | |
EP1265927B1 (en) | Crystal | |
US7252958B2 (en) | Modulation of tetraspanin function | |
CN101142235A (zh) | 雌激素受体结构 | |
US7199219B1 (en) | Polypeptides derived from vitamin D nuclear receptor, and their uses in particular for screening vitamin D analogues | |
US8187871B2 (en) | Co-crystallization of ERR-α with a ligand that forms a reversible covalent bond | |
US20090270506A1 (en) | Crystalline structure of oxidosqualene synthase | |
EP1470158A2 (en) | The ligand binding pocket peptide fragment of estrogen-related receptor 3 (err3), its crystal structure, and uses thereof | |
JP2003514579A5 (ja) | ||
WO2006117592A1 (en) | Methods of modulating nuclear receptors |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060323 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060425 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060425 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090428 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091006 |